KR100896983B1

KR100896983B1 - 펩티드-기재 화합물

Info

Publication number: KR100896983B1
Application number: KR1020037004291A
Authority: KR
Inventors: 알란 쿠트베르트손
Original assignee: 지이 헬스케어 에이에스
Priority date: 2000-09-26
Filing date: 2001-09-25
Publication date: 2009-05-14
Also published as: US8258101B2; CN101531704A; EP1358206A2; AU2001292456B2; AU9245601A; WO2002026776A3; NO20031323L; WO2002026776A2; US20030176639A1; KR20030061811A; CN1462276A; EP1358206B1; JP4948742B2; JP2004509975A; US20100256330A1; NO331535B1; NO20004795D0; NO20031323D0; CA2420577A1; ATE519776T1

Abstract

본 발명은 새로운 펩티드-기재 화합물 및 진단용 촬영 기술 및 치료학적으로 유효한 처치에서의 그의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 혈관신생과 관련된 수용체, 특히 ανβ3 인테그린 수용체에 결합하는 표적화 벡터로서 사용되는 그러한 펩티드-기재 화합물의 용도에 관한 것이다. 따라서, 그러한 조영제는, 예를 들면 악성 질환, 심장 질환, 염증 관련 질환, 류머티스성 관절염 및 카포시 육종의 진단에 사용될 수 있다. 또한, 그러한 화합물은 이들 질환의 치료학적 처치에 사용될 수 있다.

펩티드-기재 화합물, ανβ3 인테그린 수용체, 표적화 벡터, 조영제, 혈관신생, 진단용 촬영 기법.

Description

펩티드-기재 화합물 {Peptide-Based Compounds}

새로운 혈관은 두 가지 다른 기전, 즉 혈관형성 또는 혈관신생에 의해 형성될 수 있다. 혈관신생은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 분기되어 형성되는 것이다. 이러한 과정에 대한 일차적 자극은 조직 내 세포로의 영양분 및 산소의 부적절한 공급(저산소증)일 수 있다. 이들 세포는 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)로서 불리우는 것이 한 예인 여러가지 혈관신생 인자를 분비함으로써 반응할 수 있다. 이들 인자는 기저막의 단백질을 분해하는 단백질분해 효소 뿐만 아니라 잠재적으로 유해한 이들 효소의 작용을 제한하는 억제제의 분비를 개시한다. 혈관신생 인자의 다른 두드러진 효과는 내피 세포의 이동 및 분열을 일으키는 것이다. 관강 반대쪽에서 혈관 둘레에 연속 시트를 형성하는 기저막에 부착된 내피 세포는 유사 분열을 겪지 않는다. 혈관신생 인자에 대한 수용체로부터의 시그날과 부착력 소실이 합쳐진 효과는 내피 세포의 이동, 증식 및 자체 재배열을 일으키고, 최종적으로 새로운 혈관 주위에 기저막을 합성하는 것이다.

혈관신생은 상처 치유 및 염증 과정을 포함하는, 조직의 성장 및 리모델링에서 두드러진다. 종양은 성장 속도를 유지하기 위해서는 밀리미터 크기에 도달하면 혈관신생을 개시해야 한다. 혈관신생은 내피 세포 및 그 주변의 특징적인 변화를 수반한다. 이들 세포의 표면은 이동에 대비하여 리모델링되며, 단백질분해를 실시하고 조절하는 것에 관련된 각종 단백질 이외에, 기저막이 분해되는 곳에서 잠재 구조가 노출된다. 종양의 경우에, 결과적으로 혈관 네트워크는 일반적으로 예리한 킹크(kink) 및 동정맥 션트(shunt)의 형성과 함께 탈조직화된다. 혈관신생의 억제도 또한 항종양 요법에서 유망한 전략으로 여겨진다. 혈관신생에 수반하는 형질전환은 악성 질환 등의 진단을 위해 매우 유망한 것이지만 그 개념은 염증, 및 아테롬성동맥경화증(초기 아테롬성동맥경화증 병변의 대식세포가 혈관신생 인자의 잠재적인 생산원임)을 비롯한 각종 염증 관련 질환에서도 장래성을 보인다. 이 인자는 또한 단시간 내에 협착이 해제될 때 일어나는, 심근 경색 부분의 재혈관화에 관련된다.

새로운 혈관의 발생 또는 증식인 신혈관신생 또는 혈관신생과 관련된 바람직하지 못한 상태의 다른 예는 하기 표 1에 나열되어 있다. WO98/47541 참조.

혈관신생과 관련된 질환 및 징후는, 예를 들면 다른 형태의 암 및 전이, 예를 들면 유방암, 피부암, 결장직장암, 췌장암, 전립선암, 폐암 또는 난소암이다.

다른 질환 및 징후는 염증(예를 들면, 만성), 아테롬성동맥경화증, 류머티스성 관절염 및 치은염이다.

혈관신생과 관련된 또다른 질환 및 징후는 동정맥 알포메이션, 신경교성상세포종, 융모막암, 신경교아세포종, 신경교종, 혈관종(소아기, 모세관), 간암, 과형성성 자궁내막, 허혈성 심근, 카포시 육종, 황반 변성, 흑색종, 신경아세포종, 폐쇄성 말초 동맥 질환, 골관절염, 건선, 망막증(당뇨병, 증식성), 공피증, 정상피종 고형암 형성물 및 궤양성 대장염이다.

혈관신생은 내피 세포에 특이적인 수용체와 관련있다. 인테그린 ανβ3은 혈관신생과 관련된 것으로 알려진 수용체 중의 하나이다. ανβ3 인테그린 수용체/리간드 상호작용의 길항제는 세포소멸을 유도하고 혈관 성장을 억제하므로, 자극된 내피 세포가 혈관신생 과정의 결정적인 주기 동안에 생존을 위해 이 수용체에 의존하는 것으로 보인다.

인테그린 ανβ3 은 세포들이 통과하여 세포외 매트릭스에 유착될 수 있는 수용체로서 작용하는 경막 단백질 군에 속한다. 인테그린은 α- 및 β-서브유닛이 세포막 지질 이중층에 투과한 헤테로다이머 분자이다. α- 서브유닛은 그의 세포외 사슬 상에 4개의 Ca²⁺ 결합 도메인을 가지며, β-서브유닛은 다수의 세포외 시스테인 풍부 도메인을 갖는다.

세포 유착에 관련된 많은 리간드(예를 들면, 피브로넥틴)는 트리펩티드 서열 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)을 함유한다. RGD 서열은 이 서열이 나타내는 리간드와 세포 표면 상의 수용체 사이의 1차 인식 부위로서 작용하는 것으로 보인다. 일반적으로, 리간드와 수용체 사이의 2차 상호작용은 상호작용의 특이성을 향상시키는 것으로 생각된다. 이들 2차 상호작용은 RGD 서열에 바로 인접한, 또는 RGD 서열과 구분되는 부위에 있는, 리간드와 수용체의 부분 사이에서 일어난다.

RGD 펩티드는 광범위한 인테그린 수용체에 결합하는 것으로 알려져 있으며 임상적 상황에서 중요하게 이용되는 다수의 세포성 경과를 조절하는 능력을 갖는다 [Ruoslahti, J. Clin. Invest., 87: 1-5(1991)]. 아마도, RGD 펩티드 및 그의 의사체의 가장 광범위하게 연구된 효과는 혈소판 인테그린 GpIIbIIIa를 표적화하는 항혈전제로서의 그의 용도에 관한 것이다.

ανβ3 또는 ανβ5 길항제의 투여에 의한 조직에서의 혈관신생의 억제는 예를 들어 항체 또는 RGD 함유 펩티드를 이용하는 WO97/06791 및 WO95/25543에 기술되어 있다. EP578083에는 일련의 단환식 RGD 함유 펩티드가 기재되어 있고, WO90/14103에는 RGD-항체가 기술되어 있다. 하우브너(Haubner) 등의 문헌[J. Nucl. Med.(1999); 40: 1061-1071]에는 단환식 RGD 함유 펩티드를 기재로 한 종양 표적화를 위한 새로운 부류의 트레이서가 기술되어 있다. 그러나, 전신 자동방사선사진 촬영을 이용한 생체분포 연구는 ¹²⁵I-표지된 펩티드가 매우 신속한 혈액 청소율 및 주로 간담도 배출 경로를 가져서 고도의 백그라운드 수치(backgroud noise)가 형성되게 함을 밝혀냈다.

RGD 잔기가 트리펩티드 서열의 말단을 가로지르는 가교에 의해 억제된 환식 RGD 펩티드는 또한 WO98/54347 및 WO95/14714에 기술되어 있다. 생체내 바이오패닝(biopanning)으로부터 유도된 펩티드(WO97/10507)는 각종 표적화 용도에 사용되어 왔다. 가교 위치가 미확인된 서열 CDCRGDCFC(RGD-4C)는 약물, 예를 들면 독시루비신(WO98/10795), 핵산 및 아데노바이러스를 세포에 대해 표적화하는데 사용되어 왔다(WO99/40214, WO99/39734, WO98/54347, WO98/54346, US 5846782 참조).

생체내 혈관신생과 관련된 인테그린 수용체의 효율적인 표적화 및 촬영에는 화학적으로 강하고 안정한 선택적인 고친화력 RGD 기재 벡터가 필요하다. 또한 백그라운드에 의한 문제점을 줄이기 위해 조영제를 설계할 때 배출 경로는 중요한 요소이다. 이들 엄격한 조건은 본 발명에 기술되는 분리된 가교를 함유하는 구조물에 의해 충족된다.

한 면에서 보면, 본 발명은 화학식 I에 의해 정의되는 새로운 펩티드-기재 화합물을 제공한다. 이들 화합물은 인테그린 ανβ3에 대해 친화력을 가지며, 하나 또는 모두 이황화 가교인 2개의 분리된 가교에 의해 플랭크(flank)된 선형 RGD 서열을 포함하는 벡터로서 유용성을 갖는다. 이러한 벡터는 공지된 선형 RGD 펩티드에 비해 개선된 결합/효능으로 예상치 못한 활성을 나타낸다. 이 새로운 펩티드-기재 화합물은 치료학적으로 유효한 처치 뿐만 아니라, 촬영 목적으로도 사용될 수 있다.

따라서, 화학식 I은 인테그린 ανβ3에 대해 친화력을 갖는 벡터(V)로서 사용되는 펩티드-기재 화합물을 정의한다. 그러나, R₁ 및 X_1-8에 따라 화학식 I은 또 한 화학식 I에 의해 특징지워지는 화학식 "V-L-R"의 화합물을 포함할 수 있으며, 여기서, V는 벡터이고, L은 링커 부분 또는 결합이고, R은 검출가능한, 예를 들면 인간 또는 혈관 분포된 비인간 동물 신체(예를 들면, 포유류, 조류 또는 파충류 신체)의 생체내 촬영과 같은 촬영 절차에서 검출가능한 부분(리포터)이다.

상기 식에서,

r은 0 또는 1이고,

p는 0 또는 1이고,

r+p는 1이며,

r이 0이면, R₁은 -(CH₂)_n-CO- 또는 -(CH₂)_n-C₆H₄-CO-(여기서, n은 1, 2, 3, 4 또는 5임)이고,

r이 1이면, R₁은 하나 이상의 가교-형성 아미노산, 바람직하게는 시스테인이며, 바람직하게는 R₁ 및 X₂ 사이의 가교가 티오에테르 또는 이황화 결합을 함유하고,

r이 1이면(따라서, p가 0이면), R₁은 특히 바람직하게는 시스테인이고, X₂와 이황화 가교를 형성하며,

X₁은 결합 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산, 또는 탄수화물 부분으로 유도체화된 아미노산, 또는 스페이서 또는 링커로 관능화된 아미노산 및(또는) 생체내 촬영에 적합한 리포터, 바람직하게는 금속 방사성핵종에 결합되거나, 결합될 수 있는 킬레이트이고,

바람직하게는 X₁은 아스파르트산, 티로신, 티로신-아스파르트산 또는 리신이고,

X₂ 및 X₄은 독립적으로 시스테인, 호모시스테인 또는 아스파르트산 및 리신과 같은 고리화 결합을 형성할 수 있는 다른 아미노산이고,

X₃은 아르기닌, N-메틸아르기닌 또는 아르기닌 의사체이고,

X₅는 소수성 아미노산, 바람직하게는 페닐알라닌, 티로신, 요오도티로신(가장 바람직하게는 3-요오도-티로신), 디요오도티로신 또는 나프틸알라닌이고,

X₆은 고리화 결합을 형성할 수 있는 아미노산, 바람직하게는 시스테인 또는 호모시스테인이고,

X₇은 결합 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산, 바람직하게는 글리신이거나, 또는 임의로는 X₈로서 정의되는 다수의 킬레이트를 이용한 표지화가 가능하고, 임의로는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 단위 또는 다른 스페이서 성분을 포함하는 스페이서 또는 링커이며,

X₈은 금속 방사성핵종 또는 생체내 촬영에 적합한 임의의 다른 리포터에 결 합되거나 또는 결합될 수 있는 킬레이트이거나 또는 -NH₂이거나 또는 부재하며,

q는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고,

가교(R₁ 및 X₂ 사이 또는 X₄ 및 X₆ 사이) 중 하나는 이황화 결합을 포함한다.

본원에 기술된 벡터-킬레이트 접합체의 벡터 성분은 본 발명의 특정 면에서 아미노-말단 또는 카르복시-말단이 없다. 이러한 말단은 이들 화합물에 효소 분해에 대한 내성의 상당한 증가를 일으키며, 그 결과 이들 화합물은 많은 공지된 유리 펩티드에 비해 생체내 안정성이 증가한다.

본 발명은 바람직하게는 화학식 II에 의해 더 정의되는 화학식 I의 화합물에 관한 것이다.

상기 식에서,

Cys는 시스테인이고,

X₁'은 1, 2 또는 3개의 아미노산, 가장 바람직하게는 아스파르트산, 티로신, 티로신-아스파르트산, 리신 또는 아세틸-리신이고,

X₃은 화학식 I에서 정의한 바와 같고,

X₅'는 페닐알라닌, 티로신, 3-요오도-티로신 또는 나프틸알라닌이고,

X₇'은 결합, 글리신 또는 O-비스(아미노에틸) 에틸렌 글리콜 스페이서이고, 바람직하게는 X₇'은 글리신이고,

X₈'은 구조가

또는

인, 금속 방사성핵종에 결합된 킬레이트이거나, 또는 이들 킬레이트의 임의의 다른 N₃S 또는 비스-옥심 유형이고,

화학식 II에 나타난 바와 같이, 하나의 가교는 티오 결합을 포함하고, 다른 가교는 이황화 결합을 포함한다.

화학식 II의 화합물의 특히 바람직한 실시양태에서, X₃은 N-메틸-아르기닌 이고(거나), X₅'는 나프틸알라닌이다.

리포터, R은 X₁ 및(또는) X₇ 내의 임의의 적합한 지점에서(L을 통해) V에 부착될 수 있다. 바람직하게는, 부착 지점은 표적에 대한 V의 생물학적 활성 또는 V의 결합 친화력이(R이 없는 V의 생물학적 활성 또는 V의 결합 친화력에 비해) 실질적으로 감소되지 않거나 또는 상당히 감소되지 않도록 선택된다. 가장 바람직하게는, R은 X₁ 및(또는) X₇을 통해 V에 부착된다.

본원에 사용되는 용어 '아미노산'은 그의 가장 광범위한 의미로는 단백질형성 L-아미노산, D-아미노산, 화학적으로 개질된 아미노산, N-메틸, C-메틸 및 아미노산 측쇄 의사체 및 비천연 아미노산, 예를 들면 나프틸알라닌을 가리킨다.

'고리화 결합'이라는 용어는 가교의 도입을 허용하는 관능기가 있는 아미노산들(또는 아미노산과 -(CH₂)_n-CO- 또는 -(CH₂)_n-C₆H ₄-CO-)의 임의의 결합을 가리킨다. 바람직한 특정 예는 이황화물, 이황화물 의사체, 예를 들어 -(CH₂)₄- 카르바 가교, 티오아세탈, 티오에테르 가교(시스타티온 또는 란티오닌) 및 에스테르 및 에테르를 함유하는 가교이다.

화학식 I의 화합물의 바람직한 특정 실시양태가 하기 화합물 1 내지 5로 예시되어 있다.

화합물 1:

화합물 2: 벡터

화합물 3: 화학식 I의 V-L-R 화합물의 예

화합물 4: 화학식 II의 화합물의 예

화합물 5: 예를 들어 ^99mTc에 결합될 수 있는 식의 화합물의 예.

대부분의 경우에, 벡터 V 내의 아미노산은 L-형태인 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 일부 실시양태에서, 벡터 V 내의 아미노산 중 1, 2, 3개 또는 그 이상은 바람직하게는 D-형태이다. 그러한 D-형태 아미노산의 포함은 벡터의 혈청 안 정성에 상당한 효과를 나타낼 수 있다. 이에 관해서는 특히 위치 X₁에서 D-티로신을 갖는 벡터를 참고로 한다.

본 발명은 또한 유효량(예를 들어, 생체내 촬영에서 영상 콘트라스트 향상 및(또는) 치료학적 처치에 효과적인 양)의 화학식 I의 화합물 또는 그의 산 부가 염을, 하나 이상의 제약학상 허용되는 보조제, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

상기한 바와 같이, 화학식 I의 화합물은 벡터, 링커 및 리포터 부분을 포함할 수 있다. 링커 부분은 하나의 벡터를 하나의 리포터에 연결시키는 작용을 할 수 있고; 또한 그것은 하나를 초과하는 벡터 및(또는) 하나를 초과하는 리포터를 함께 연결시킬 수 있다. 마찬가지로, 리포터 또는 벡터는 하나를 초과하는 링커에 연결될 수 있다. 다수의 리포터의 이런 식의 사용(한 벡터에 부착된 수개의 링커-리포터 부분 또는 한 벡터에 부착된 하나의 링커에 부착된 수개의 리포터)은(예를 들어 그것의 방사선비투과, 에코발생도 또는 이완성을 증가시킴으로써) 조영제의 검출능력이 증가되도록 할 수 있거나, 또는 조영제를 두 가지 이상의 촬영 기법으로 검출되도록 할 수 있다. 다수의 벡터의 이런 식의 사용은 조영제의 표적화 효율을 증가시킬 수 있거나 또는 조영제가 수용체 다양성을 갖는 제제에 대해 하나를 넘는 부위, 예를 들면 다른 수용체를 표적화하도록 할 수 있다.

<링커>

생분해성 링커 및 생체중합체를 포함한 광범위한 링커가 사용될 수 있다.

조영제의 링커 성분은 가장 간단하게는 벡터와 리포터 부분 사이의 결합이다. 그러나, 더욱 일반적으로 링커는 하나 이상의 벡터를 하나 이상의 리포터에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결시키는 단- 또는 다-분자 골격, 예를 들면 선형, 환형, 분지 또는 망상 분자 골격, 또는 벡터 및 리포터 부분과 공유적으로 또는 비공유적으로, 예를 들면 배위적으로 결합하거나 또는 그러한 부분을 피포하거나, 포획하거나 또는 정착시키는 인-빌트(in-built) 또는 펜던트(pendant) 기와의 분자 집합체를 제공할 것이다.

따라서, 리포터 단위를 목적하는 벡터에 연결시키는 것은, 일반적으로 리포터 및(또는) 벡터 상에 위치된 하나 이상의 관능기와의 상호작용을 포함한, 공유 또는 비공유 수단에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 목적에 이용될 수 있는 화학적으로 반응성인 관능기의 예는 아미노, 히드록실, 술프히드릴, 카르복실 및 카르보닐 기, 및 탄수화물 기, 인근 디올, 티오에테르, 2-아미노알코올, 2-아미노티올, 구아니디닐, 이미다졸릴 및 페놀기를 포함한다.

리포터 및(또는) 벡터 내의 관능기는 필요시 예를 들면 추가의 반응성 또는 선택성을 부여하기 위해 반응 전에 다른 관능기로 전환될 수 있다.

벡터-리포터 커플링은 제로-길이 가교제로서 효소를 사용하여 이루어질 수 있으며, 따라서 예를 들어 글루타민전이효소, 과산화효소 및 크산틴 산화효소가 가교 생성물을 제조하는데 사용되어 왔다. 역전 단백질분해가 또한 아미드 결합 형성을 통한 가교에 사용될 수 있다.

비공유 벡터-리포터 커플링은 예를 들어 정전하 상호작용에 의해, 안정한 금 속 착물 형태의 킬레이트화를 통해, 또는 고친화력 결합 상호작용을 통해 실시될 수 있다.

막 삽입을 매개할 수 있는 요소를 함유하는 펩티드, 리포-올리고당류또는 리포펩티드 링커에 커플링된 벡터가 또한 유용할 수도 있다.

커플링은 또한 비오틴에 대한 4개의 고친화력 결합 부위가 있는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 사용하여 실시될 수 있다. 따라서, 아비딘은 벡터 및 리포터가 모두 비오티닐화될 경우 리포터에 대한 접합 벡터로 사용될 수 있다.

추가의 연결 물질을 도입하지 않고 두 반응성 화학기의 직접적인 공유 결합을 유도하는 소위 제로 길이 연결제가 필요시에 본 발명에 따라서 이용될 수 있다.

그러나, 대부분 연결제는 예를 들면 상기한 바와 같이 스페이서 요소에 의해 연결된 2개 이상의 반응성 부분을 포함할 것이다. 그러한 스페이서의 존재는 이관능성 링커가 분자 내의 또는 2개의 다른 분자 사이의 특정 관능기와 반응하도록 하여, 이들 2개 성분 사이에 결합을 형성하고 외성 링커-유도된 물질을 리포터-벡터 접합체로 도입하게 된다.

연결제에 의해 도입되는 외성 재료의 특성은 최종 생성물의 표적화 능력, 약물동력학 및 일반적인 안정성과 결정적인 관련이 있을 수 있다. 따라서, 예를 들면 생분해성이거나 또는 화학적으로 민감하거나 또는 효소적 분해 부위를 포함하는 스페이서 암(spacer arm)을 함유하는 불안정한 연결을 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로, 스페이서는 예를 들면, 계면활성제로서 작용하고 제제의 안정성을 향상시키기 위해 중합체 성분을 포함할 수 있다. 스페이서는 또한 표면 가교를 향상시키기 위하여 예를 들면 상기한 바와 같은 반응성 부분을 함유할 수 있다.

스페이서 요소는 또한 덱스트란 및 일반적으로 PEG로 언급되는 폴리(에틸렌글리콜)과 같은 거대분자 구조를 포함할 수도 있다. 스페이서 요소 이외에, PEG는 벡터의 생체내 특성을 개질시키는데 이용될 수 있다.

세망내피계(RES)의 세포에 의한 입자의 흡착을 위한 주된 기전은 혈액 중의 혈장 단백질에 의한 옵소닌작용이며, RES에 의해 흡수된 외부 입자들은 혈장 단백질에 의해 표지된다. 본 발명에 따라 사용된 PEG 스페이서 요소의 생물학적 특성은 PEG화된 리포솜에서 관찰되는 것과 유사한 방식으로 제제의 순환 시간을 증가시키는 작용을 한다. 관심 영역에 대한 증가된 커플링 효율은 또한 PEG 스페이서의 말단에 결합된 항체를 사용하여 달성될 수도 있다.

다른 대표적인 스페이서 요소는 효소 절단 부위를 함유할 수 있거나 또는 함유하지 않을 수 있는, 구조형 다당류, 저장형 다당류, 폴리아미노산 및 그의 메틸 및 에틸 에스테르, 및 폴리펩티드, 올리고당류 및 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

바람직한 연결기는 제한되는 것은 아니지만, 다음 기로부터 선택된 벡터 반응성기로부터 유도된다:

벡터 상에서 카르복시, 알데히드, 아민(NHR), 알코올, 술프히드릴기, 활성화 메틸렌 등과 직접 반응할 기, 예를 들면 활성 할로겐 함유 기,

벡터 반응성 기를 함유하는 개질된 벡터 분자, 즉 예를 들어 벡터의 알데히드 또는 카르복실산으로의 산화에 의해 반응성 기를 함유하도록 개질된 반응성 기를 함유하는 벡터와 쉽게 반응할 수 있는 기, 및

가교제의 사용에 의해 반응성 기를 함유하는 벡터 또는 상기한 바와 같은 개질된 벡터에 결합될 수 있는 기.

바람직한 유용한 연결기는 문헌 [Pierce Chemical Company Immunotechnology Catalog - Protein Modification Section(1995 and 1996)]에 기록된 것과 같은 각종 헤테로이관능성 가교 시약으로부터 유도된다.

상기 설명 이외에, 연결기는 전체적으로 또는 부분적으로, 천연적으로 발생된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 잔기 및 개질된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 잔기의 상보적 서열, 바람직하게는 비자기결합성(non-self-associating) 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고 그로부터 유래될 수도 있다.

본 발명에 따라서 사용되는 연결제는 일반적으로 어느 정도의 특이성을 갖고 벡터의 리포터로의 결합 또는 리포터의 리포터로의 결합을 일으킬 것이며, 또한 하나 이상의 치료학적 활성제를 부착시키는데 사용될 수도 있다.

본 출원에 사용될 수 있는 링커의 추가적인 예는 본원에 그의 전문이 참고로 인용된 WO98/47541의 32 내지 54 면에 제공되어 있다. 상기 면에 개시된 각각의 또는 모든 링커 또는 그의 일부는 이 출원에 포함된 본 발명의 설명의 일부인 것으로 간주되어야 한다.

<리포터>

본 발명의 조영제의 리포터 부분은 생체내 진단용 촬영 절차에서 직접적으로 또는 간접적으로 검출할 수 있는 임의의 부분, 예를 들면(예를 들어 방사성 붕괴, 형광 여기, 스핀 공명 여기 등에 의해) 검출가능한 방사선을 방출하거나 또는 방출 을 야기시킬 수 있는 부분, 국소 전자기장에 영향을 미치는 부분(예를 들면, 상자성, 초상자성, 준강자성 또는 강자성 종), 방사선 에너지를 흡수하거나 또는 산란시키는 부분(예를 들면, 발색단 및 형광발색단), 입자(소포 함유 액체를 포함함), 중원소 및 그의 화합물, 및 검출가능한 물질을 발생시키는 부분 등일 수 있다.

진단용 촬영 기법에 의해 검출가능한 아주 광범위한 재료가 당업계에 공지되어 있으며, 리포터는 사용될 촬영 기법에 따라서 선택될 것이다. 따라서, 예를 들면 초음파 촬영의 경우 반향성 물질 또는 반향성 물질을 발생시킬 수 있는 재료가 선택될 것이다. 벡터는 가스 충전된 미세기포로의 혼입을 위해 링커를 통해 적합한 지질 리포터/캐리어에 커플링될 수 있다. 그러한 미세기포는 표적화 초음파 촬영에 사용될 수 있다.

X-선 촬영의 경우, 리포터는 일반적으로(예를 들면, 원자량 38 이상의) 중원자이거나 또는 중원자를 함유할 것이고; MR 촬영의 경우, 리포터는 논 제로 핵 스핀(non zero nuclear spin) 동위원소(예를 들면, ¹⁹F) 또는 홀전자 스핀을 가져서 상자성, 초상자성, 준강자성 또는 강자성 특성을 갖는 물질일 것이다. 광 촬영의 경우, 리포터는 광 산란제(예를 들면, 착색된 또는 비착색된 입자), 흡광제 또는 광 방출제일 것이다. 자기력 촬영의 경우, 리포터는 검출가능한 자기 특성을 가질 것이다. 전기 임피던스 촬영의 경우, 리포터는 전기 임피던스에 영향을 미칠 것이다. 신티그램, SPECT, PET 등의 경우 리포터는 방사성핵종일 것이다.

자기 철 산화물 입자, X-선 조영제 함유 소포, 킬레이트화된 상자성 금속(예 를 들면, Gd, Dy, Mn, Fe 등)과 같은 적합한 리포터의 예는 진단용 촬영 관련 문헌에 널리 알려져 있다. 예를 들어, US-A-4647447, PCT/GB97/00067, US-A-4863715, US-A-4770183, WO96/09840, WO85/02772, WO92/17212, PCT/GB97/00459, EP-A-554213, US-A-5228446, WO91/15243, WO93/05818, WO96/23524, WO96/17628, US-A-5387080, WO95/26205, GB9624918.0 등을 참조하라. WO98/47541(63-66면 및 70-86면)을 또한 참조하라.

Gd, Dy, Fe 및 Mn과 같은 킬레이트화된 상자성 금속 이온이, 특히 거대환식 킬런트 기에 의해 킬레이트화될 경우, 리포터로서 특히 바람직하다.

일반적으로 말하면, 리포터는(1) 킬레이트화 가능한 금속 또는 다원자 금속 함유 이온(즉, TcO 등)(여기서, 금속은 높은 원자 번호 금속(예컨대 원자 번호가 37을 넘음), 상자성 종(예컨대, 전이 금속 또는 란탄족) 또는 방사성 동위원소임),(2) 홀전자 부위인 공유 결합된 비금속종(예컨대, 안정된 자유 라디칼의 산소 또는 탄소), 높은 원자 번호 비금속 또는 방사성동위원소,(3) 협력적인 자기 거동(예컨대 초상자성, 준강자성 또는 강자성)을 나타내거나 또는 방사성핵종을 함유하는, 원자 번호가 높은 원자를 함유하는 다원자 집단 또는 결정,(4) 발색단(이 용어는 형광 또는 인광인 종을 포함함), 예를 들면, 무기 또는 유기 구조, 특히 광범위한 비편재화된 전자계를 가진 유기기 또는 착화된 금속 이온 또는(5) 광범위한 비편재화된 전자계에 의해 전기 임피던스 가변 특성을 갖는 구조 또는 기일 수 있다.

특히 바람직한 리포터 기의 예는 아래에 더욱 상세히 기재되어 있다.

킬레이트화된 금속 리포터: 금속 방사성핵종, 상자성 금속 이온, 형광 금속 이온, 중금속 이온 및 집단 이온.

바람직한 금속 방사성핵종은 ⁹⁰Y, ^99mTc, ¹¹¹In, ⁴⁷Sc, ⁶⁷Ga, ⁵¹Cr, ^177mSn, ⁶⁷Cu, ¹⁶⁷Tm, ⁹⁷Ru, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu, ¹⁹⁹Au, ²⁰³Pb 및 ¹⁴¹Ce를 포함한다.

바람직한 상자성 금속 이온은 전이 및 란탄족 금속(예를 들면, 6 내지 9, 21-29, 42, 43, 44 또는 57-71의 원자 번호를 갖는 금속)의 이온, 특히 Cr, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb 및 Lu, 특히 Mn, Cr, Fe, Gd 및 Dy, 더욱 특히 Gd의 이온을 포함한다.

금속 이온은 바람직하게는 링커 부분 위의 또는 입자(예를 들면, 소포 또는 다공성 또는 비다공성 무기 또는 유기 고체) 내 또는 위의 킬런트 기, 특히 선형, 거대환식, 터피리딘 및 N₂S₂ 킬런트, 예를 들면 DTPA, DTPA-BMA, EDTA, D03A 및 TMT에 의해 킬레이트화된다. 적합한 킬런트 기의 또다른 예는 US-A-4647447, WO89/00557, US-A-5367080, US-A-5364613 등에 개시되어 있다.

링커 부분 또는 입자는(예를 들면, 다른 촬영 기법에서 검출가능한 리포터를 제공하기 위해) 필요시에 하나를 넘는 금속 종에 의해 금속화된 그러한 킬런트 기를 하나 이상 함유할 수 있다.

킬레이트화제의 다른 적합한 잔기는 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제5078985호에 기술된 테크네튬 및 레늄과 같은 금속의 킬레이트화를 위해 개질된 단백질을 포함한다.

존재하는 임의의 킬레이트화제의 금속화 방법은 업계의 기술 수준 내에 든다. 금속은 3가지의 일반적인 방법, 즉 직접 혼입, 주형 합성 및(또는) 금속 교환 반응 중 어느 하나에 의해 킬런트 부분으로 혼입될 수 있다. 직접 혼입이 바람직하다.

따라서, 금속 이온은, 예를 들면 킬레이트화제 함유 부분의 수용액을 바람직하게는 pH가 약 4 내지 약 11인 수용액의 금속 염과 혼합하거나 또는 단순히 노출시킴으로써 킬레이트화제로 용이하게 착화시키는 것이 바람직하다. 염은 임의의 염일 수 있지만, 바람직하게는 염은 할로겐 염과 같은 금속의 수용성 염이며, 더욱 바람직하게는 그러한 염은 금속 이온과 킬레이트화제와의 결합을 방해하지 않도록 선택된다. 킬레이트화제 함유 부분은 바람직하게는 약 5 내지 약 9의 pH, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 약 8의 pH에서 수용액 상태이다. 킬레이트화제 함유 부분은 최적의 pH를 형성하도록 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트 및 보레이트와 같은 완충염과 혼합될 수 있다. 바람직하게는, 완충염은 이후의 금속 이온의 킬레이트화제로의 결합을 방해하지 않도록 선택된다.

진단용 촬영에서, 벡터-링커-리포터(VLR) 구조물은 바람직하게는 그러한 진단용 쵤영 용도에 효과적인 비의 금속 방사성핵종 이온 대 킬레이트화제를 함유한다. 바람직한 실시양태에서, 킬레이트화제 당 금속 이온의 몰비는 약 1:1,000 내지 약 1:1이다.

방사선치료 용도에서, VLR은 바람직하게는 그러한 치료 용도에서 효과적인 비의 금속 방사성핵종 이온 대 킬레이트화제를 함유한다. 바람직한 실시양태에서, 킬레이트화제 당 금속 이온의 몰비는 약 1:100 내지 약 1:1이다. 방사성핵종은, 예를 들면 Sc, Fe, Pb, Ga, Y, Bi, Mn, Cu, Cr, Zn, Ge, Mo, Ru, Sn, Sr, Sm, Lu, Sb, W, Re, Po, Ta 및 Tl의 방사성동위원소로부터 선택될 수 있다. 바람직한 방사성핵종은 ⁴⁴Sc, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ²¹²Pb, ⁶⁸Ga, ⁹⁰Y, ¹⁶³Sm, ²¹²Bi, ¹⁸⁶Re 및 ¹⁸⁸Re를 포함한다. 이중에서, 특히 바람직한 것은 ⁹⁰Y이다. 이 방사성동위원소는 원자이거나 또는 바람직하게는 이온일 수 있다.

다음 동위원소 또는 동위원소쌍은 방사표지 방법 또는 킬레이터를 변화시키지 않고 촬영 및 치료에 사용될 수 있다: ⁴⁷Sc₂₁; ¹⁴¹Ce₅₈; ¹⁶⁶Re₇₅; ¹⁷⁷Lu₇₁; ¹⁹⁹Au₇₉; ⁴⁷Sc₂₁; ¹³¹I₅₃; ⁶⁷Cu₂₉; ¹³¹I ₅₃ 및 ¹²³I₅₃; ¹⁸⁸Re₇₅ 및 ^99mTc₄₃; ⁹⁰Y₃₉ 및 ⁸⁷Y₃₉; ⁴⁷Sc₂₁ 및 ⁴⁴Sc₂₁; ⁹⁰Y₃₉ 및 ¹²³I₅₃; ¹⁴⁶Sm₆₂ 및 ¹⁵³Sm₆₂; 및 ⁹⁰Y₃₉ 및 ¹¹¹In₄₉.

링커 부분은 또한 복수의 킬런트기에 대한 커플링을 허용할 수 있다. 그러한 폴리킬런트 링커 내의 킬런트 부분은 킬런트의 골격 관능기화를 통해 또는 킬런트의 하나 이상의 금속 배위기의 이용에 의해, 또는 예를 들면 폴리리신-폴리DTPA, 폴리리신-폴리DOTA, 및 소위 매그니파이어 폴리킬런트(PCT/EP96/00565)에서와 같이, 산 킬런트와 아민 또는 히드록실 함유 링커 골격 사이의 아미드 또는 에테르 결합 형성에 의해 부착될 수 있다. 그러한 폴리킬런트 링커는 직접(예를 들면, 폴리킬런트 링커 내의 아민, 산 또는 히드록실기를 이용) 또는 모노킬런트 링커에 대 해 상기한 바와 같이 이관능성 링커 화합물을 통해 하나 이상의 벡터 기에 접합될 수 있다.

킬레이트화 종이 입상(또는 분자 집합체, 예를 들면 소포성) 링커에 의해 담지될 때, 킬레이트는 예를 들어 입자에 내포된 비부착된 모노 또는 폴리킬레이트(예를 들면, Gd DTPA-BMA 또는 Gd HP-DO3A)일 수 있거나 또는 그것은 공유 결합에 의해 또는 모노/폴리킬레이트 상의 정착 기(예를 들면, 친유성 기)와 소포의 막의 상호작용에 의해 입자에 접합된 모노 또는 폴리킬레이트일 수 있다(예를 들면 PCT/GB95/02378 참조).

바람직한 비금속 원자 리포터는 ¹²³I 및 ¹³¹I와 같은 방사성동위원소 뿐만 아니라 ¹⁹F와 같은 논 제로 핵 스핀 원자 및 I와 같은 중원자를 포함한다.

바람직하게는 복수의, 예를 들면 2 내지 200개의 그러한 리포터는 통상의 화학 합성 기술을 이용하여 직접, 또는 지지 기, 예를 들면 트리요오도페닐기를 통해 링커 골격에 공유 결합될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 요오드의 방사성동위원소의 사용이 특히 예상된다. 예를 들면, 벡터 또는 링커가 공유 결합 형성 반응에서 요오드에 의해 화학적으로 치환될 수 있는 치환체, 예를 들면 히드록시페닐 관능기를 함유하는 치환체를 포함한다면, 그러한 치환체는 당업계에 공지된 방법에 의해 요오드의 방사성동위원소로 표지될 수 있다. 이 요오드 종은 치료용 및 진단용 촬영술 용도에 사용될 수 있다. 한편, 동시에, 동일한 벡터-링커 상의 킬레이트화제의 금속이 치료용 및 진 단용 촬영술 용도에 사용될 수도 있다. 상기 논의된 금속 킬런트와 같이, 그러한 금속 원자 리포터는 링커에 결합되거나 또는 입상 링커, 예를 들면 소포 내에 또는 위에 담지될 수 있다(예를 들면, WO95/26205 및 GB 9624918.0 참조).

금속 리포터와 관련된 상기 유형의 링커는 비금속 원자 리포터에 대해 사용될 수 있으며, 이때 비금속 원자 리포터 또는 그러한 리포터를 갖는 기는 킬런트 기의 일부 또는 전부를 대신한다.

바람직하게는, 본 발명의 V-L-R 제제는 예를 들면 공유 결합된 요오드 방사성동위원소와 함께 리포터에 직접 또는 간접적으로 커플링된 수용체 표적화 벡터를 가질 것이며, 금속 킬레이트는 입상 리포터 또는 링커-리포터, 예를 들면 초상자성 결정(예를 들면, PCT/GB97/00067에서와 같이 임의로 코팅됨) 또는 소포, 예를 들면 요오드화된 조영제를 함유하는 미셀 또는 리포좀에 직접 또는 유기 링커 기를 통해 부착되거나 또는 커플링될 것이다.

간략하게는, MRI, X-선, 광 촬영, 핵 촬영, 자기단층촬영 및 전기 임피던스 단층촬영의 촬영 기법에 있어서, 바람직한 리포터는 하기와 같다.

MRI	일반적으로 입자 크기가 약 80 nm보다 작은 초상자성 산화철 입자, 특히 크기가 20 nm 미만인 것. 특히 여러자리전해질이온, PEG, 전분 및 가수분해된 전분과 같은 다양한 코팅재로 코팅된 산화철이 바람직하다. 킬레이트 및 입자 물질을 모두 포함하는 상자성 금속 물질도 또한 유용하다.
광 촬영	임의의 광 촬영 리포터 기. 초점은 근적외선 범위를 흡수하는 물질에 맞추어야 한다.
핵 의학	⁹⁹Tc 또는¹¹¹In을 포함하는 방사성 킬레이트 뿐만 아니라,¹²³I,¹²⁵I,¹³¹I_, ⁷⁵Br 또는⁷⁷Br과 같은 방사표지된 할로겐 치환체를 갖는,직접 방사표지된 벡터.
자기단층촬영	상기한 바와 같은 초상자성 산화철 입자
전기 임피던스 단층촬영	다중이온 종, 예를 들어 반복 단위에 이온기가 있는 중합체.

본 발명의 바람직한 실시양태는 특히 종양 촬영에 사용하기 위한, 화학식 I 의 방사표지 제제에 관한 것이다.

본 발명의 진단 제제는 특정 촬영술로 원하는 콘트라스트를 나타내기에 충분한 양으로 촬영을 위해 환자에게 투여될 수 있다. 리포터가 금속인 경우, 일반적으로 환자 체중 1 ㎏ 당 킬레이트화된 조영제 금속 이온 0.001 내지 5.0 mmol의 투여량이 적절하게 콘트라스트를 향상시키는데 효과적이다. 대부분의 MRI 용도에서 촬용 금속 이온의 바람직한 투여량은 체중 1 kg 당 0.02 내지 1.2 mmol 범위인 반면, X-선 용도에서는 0.05 내지 2.0 mmol/kg의 투여량이 일반적으로 X-선 감쇠를 달성하는데 효과적이다. 대부분의 X-선 용도에 바람직한 투여량은 체중 1 kg 당 란탄족 원소 또는 중금속 화합물 0.1 내지 1.2 mmol이다. 리포터가 방사성핵종인 경우, 체중 70 ㎏ 당 0.01 내지 100 mCi, 바람직하게는 0.1 내지 50 mCi의 투여량이 충분할 것이다. 리포터가 초상자성 입자일 경우, 투여량은 일반적으로 0.5 내지 30 mgFe/kg체중일 것이다.

치료 용도를 위한 본 발명의 화합물의 투여량은 치료될 상태에 따라 좌우될 것이지만, 일반적으로 체중 1 kg 당 1 pmol 내지 1 mmol 정도일 것이다.

본 발명에 따른 화합물은 당업계의 기술 범위 내의 방법으로 생리학적으로 적합한 담체 또는 부형제를 이용하여 투여용으로 제제화될 수 있다. 예를 들면, 임의로 제약학상 허용되는 부형제를 첨가한 화합물은 수성 매질에 현탁되거나 또는 용해될 수 있으며, 그후에 생성된 용액 또는 현탁액은 멸균된다.

화학식 I의 제제는 생체내 촬영에서 검출가능할 뿐만 아니라 질환의 치료에서 치료학적으로 효과적일 수 있다. 따라서, 예를 들면 VLR 화합물의 벡터는 예를 들면 방사성핵종 리포터의 방사선치료 효과, 발색단(또는 형광물질) 리포터의 광역학 치료에서의 효능 또는 벡터 부분의 화학치료 효과에 의해 치료 효능을 가질 수 있다.

치료 조성물의 제조 및 치료 또는 예방적 처치, 바람직하게는 인간 또는 비인간 동물 신체의 치료 방법에서의 화학식 I의 제제의 용도는 본 발명의 또다른 면을 나타내는 것으로 고려된다.

또다른 면에서, 본 발명은 조영 매질을 생물 대상에게 투여하고 상기 대상의 적어도 일부의 영상을 얻는 것을 포함하는 진단 방법에 사용하기 위한 조영 매질의 제조를 위한 화학식 I의 제제의 용도를 제공한다.

또다른 면에서, 본 발명은 조영제를 살아있는 인간 또는 비인간(바람직하게는 포유류 또는 조류) 동물 대상에게 혈관계 등으로 투여하고 조영제가 분포된 상기 대상의 적어도 일부의 영상을 X-선, MR, 초음파, 신티그래피, PET, SPECT, 전기 임피던스, 광 또는 자기력 촬영 기법 등에 의해 얻는 것을 포함하며, 상기 조영제로서 화학식 I의 제제를 사용함을 특징으로 하는, 살아있는 인간 또는 비인간(바람직하게는 포유류 또는 조류) 동물 대상의 영상을 얻는 방법을 제공한다.

또다른 면에서, 본 발명은 화학식 I의 제제를 인간 또는 비인간 동물 대상에게 투여하고 내피세포 수용체, 특히 ανβ3 수용체에 의한 상기 제제의 흡수를 검출하는 것을 포함하며, 임의적이나 바람직하게는 상기 투여 및 검출을 혈관신생에 연관된 상태를 극복하도록 하는 약물, 예를 들어 세포 살상제에 의한 처치 전, 중 및 후에 반복적으로 실시하는, 혈관신생에 연관된 상태를 극복하도록 하는 약물, 예를 들어 세포 살상제로 인간 또는 비인간 동물 대상을 처치한 효과를 모니터하는 방법을 제공한다.

또다른 면에서, 본 발명은 벡터 V를 진단용 촬영 절차에서 검출가능한 화합물에 또는 킬런트 화합물에 접합시키고, 필요시 형성된 접합체 내의 킬런트 기를 진단용 촬영 절차에서 검출가능한 금속 이온으로 금속화하는 것을 포함하는, 화학식 I의 제제의 제조 방법을 제공한다.

또다른 면에서, 본 발명은 벡터 V를 질환의 처치에 치료학적으로 효과적인 화합물에 접합시키는 것을 포함하는, 치료학적 처치를 위한 화학식 I의 제제의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 벡터는 모든 공지된 화학적 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있지만, 자동 펩티드 합성기를 이용하는 메리필드(Merrifield)의 고체상 방법이 특히 유용하다 [J. Am. Chem. Soc., 85: 2149(1964)]. 다수의 이황화 가교를 함유하는 벡터는 구별되는 시스테인 보호기를 이용하여 합성되므로 벡터의 최종 폴딩된 형태에 관해 불명료한 것은 없다. 펩티드 및 펩티드 킬레이트는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 정제될 수 있고, 시험관내 스크린에서 시험하기 전에 질량 분광법 및 분석용 HPLC에 의해 분석할 수 있다.

일련의 비제한적 실시예를 하기한다.

<실시예 1>

화합물 1의 합성

테크네튬 킬레이트 - Pn216의 합성

a) 클로로-니트로소 중간체(3-클로로-3-메틸-2-니트로소부탄)

2-메틸부트-2-엔(18.5 ㎖) 및 이소아밀 니트레이트(19.5 ㎖)의 혼합물을 교반하고, -10℃로 냉각시키고, 진한 염산(17.5 ㎖)을 온도가 0℃ 미만으로 유지되도록 주의깊게 첨가하였다. 반응물을 이 온도에서 30분 동안 교반하였다. 형성된 침전물을 여과에 의해 회수하고, 4 ×5 ㎖ 에탄올(-20℃)로 수세하고, 진공하에서 건조시켜 3-클로로-3-메틸-2-니트로소부탄을 백색 고체로서 수득하였다.

b) Pn216 -(3,3,11,11-테트라메틸-7-아미노에틸-4,7,10,트리아자트리데칸-2,12-디온디옥심)

아세토니트릴 중의 트리스-(2-아미노에틸) 아민의 용액(20 ㎖)에 중탄산나트륨(2.2 g, 26 mmol)을 첨가하였다. 무수 아세토니트릴 중의 3-클로로-3-메틸-2-니트로소부탄(1.8 g, 13 mmol)의 용액을 0℃에서 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고 여과하였다. 여액을 아세토니트릴로 수세하고, 여액을 증발시켰다. 조생성물을 아세토니트릴에 용해시키고, HPLC로 정제하여 Pn216을 수득하였다. 수율: 0.88 g, 19％

c) Pn216-숙신산 중간체의 합성

444

숙신산 무수물(100)

Pn216(358)

테트라플루오로티오페놀(182)

DCCI(206)

Pn216(0.5 g, 1.4 mmol)을 DMF(5 ㎖)에 용해시키고, DMF(10 ㎖) 중의 숙신산 무수물(0.015 g, 1.5 mmol)을 교반하면서 조금씩 첨가하였다. 반응을 16 시간 동안 교반하여 목적하는 생성물로 완전히 전환시켰다. HPLC 크로마토그래피 후 양호한 수율로 순수한 산을 수득하였다.

d) Pn216-숙신산의 테트라플루오로티오페놀 에스테르 유도체의 합성

HATU [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트] - Mwt = 380

Pn216-NH-CO-(CH₂)₂-COOH - Mwt = 458

NMM - N-메틸모르폴린 - Mwt = 101

TFTP - 테트라플루오로티오페놀 - Mwt = 182

DMF(1.0 ㎖) 중의 Pn216 산(10 mg, 0.022 mmol)에 HATU(8.3 mg, 0.022 mmol) 및 NMM(0.007 ㎖, 0.066 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 교반한 후 TFTP(0.022 mmol, 4 mg)을 첨가하였다. 용액을 30분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 20％ 아세토니트릴/H₂O(3 ㎖)로 희석하고, 생성물을 역상 크로마토그래피로 정제하였고, 동결건조 후 목적하는 생성물 6 mg을 수득하였다.

e) Cys 2 및 4, Cys 8 및 10을 연결하는 이황화 결합이 있는 펩티드 벡터 NH₂-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-OH의 합성

ABI 433A 자동 펩티드 합성기에서, Fmoc-Gly-왕(Wang) 수지(노바바이오켐(Novabiochem))로부터 출발하여 1 mmol 아미노산 카트리지를 사용하여 0.1 mmol 스케일로 펩티드를 합성하였다. 시스테인 잔기 2 및 4를 트리틸 보호를 사용하여 S-보호한 반면, 8 및 10은 아세트아미도메틸(Acm) 보호로 보호하였다. 커플링 전에 HBTU를 사용하여 아미노산을 예비활성화시켰다. 수지로부터 펩티드 및 측쇄 보호기(Acm 제외)의 동시 제거는 TIS(5％), H₂O(5％) 및 페놀(2.5％)을 함유하는 TFA 중에서 2 시간 동안 실시하였다.

후처리 후, 부분적으로 보호된 펩티드 조생성물 100 mg을 수득하였다(분석용 HPLC: 그래디언트, A = H₂O/0.1％ TFA, B = CH₃CN/0.1％ TFA, 20분 동안 0 - 30％ B; 칼럼, VYDAC C18 218TP54; 검출기, UV 214 nm; 생성물 체류 시간, 16.7분). 그 후에, 조생성물 부분(25 mg)을 예비 HPLC Vydac 칼럼으로 정제하여 부분적으로 보호된 순수 펩티드 12.5 mg을 수득하였다.

순수한 중간체를 2.5％ DMSO/TFA 용액에 용해시켜 Cys 2 및 Cys 4 사이의 첫번째 이황화 결합을 형성하였다. 40분 후, 산화된 생성물에 상응하는 새로운 피크가 나타났다. 그 후에, 펩티드 용액에 아니솔(0.02 ㎖)을 첨가하고, 용액을 50분 동안 60℃로 가온하였다. 그 후에, 잉여 TFA를 진공에서 제거하고, 생성물을 디에틸 에테르의 첨가로 침전시켰다. 추가적인 예비 HPLC 단계를 실시하였고, 순수한 생성물을 회수하여 동결건조하였다. MALDI-TOF 분석을 사용하여 분자량을 확인하고, 2개의 다른 가능한 이황화 이성체와 함께 동시주입하여 동일함을 확인하였다.

f) 화합물 1의 합성:

상기 절 e)로부터의 펩티드를 상기 절 d)로부터의 Pn216 활성 에스테르와 함께 DMF 중에 1:2의 비(w:w)로 용해시켰다. 반응물을 2일간 교반시킨 후, 혼합물을 물로 희석시키고, 목적하는 생성물을 역상 HPLC에 의해 정제하였다.

<실시예 2>

[Cys^{2-4, 8-10}] 동족체

a) ClCH₂CO-Lys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys(tBu)-Gly-Gly-OH의 합성

ABI 433A 자동 펩티드 합성기에서, Fmoc-Gly-왕 수지로부터 출발하여 1 mmol 아미노산 카트리지를 사용하여 0.25 mmol 스케일로 펩티드를 제조하였다. 커플링 전에 HBTU를 사용하여 아미노산을 예비활성화시켰다. DMF 중의 클로로아세트산 무수물 용액을 사용하여 30분 동안 최종 N-말단 클로로아세틸화를 수행하였다.

수지로부터의 펩티드 및 측쇄 보호기(tBu 제외)의 동시 제거는 TIS(5％), H₂O(5％) 및 페놀(2.5％)를 함유하는 TFA 중에서 2시간 동안 실시하였다.

후처리 후, 펩티드 조생성물 260 mg을 수득하였다(분석용 HPLC: 그래디언트, A = H₂O/0.1％ TFA, B = CH₃CN/0.1％ TFA, 10분 동안 5 - 50％ B; 칼럼, 페노메넥스 루나(Fenomenex Luna) 3 μ C18(2) 50 ×4.6 mm; 유속, 2 ㎖/분; 검출, UV 214 nm; 생성물 체류 시간, 6.5분. 추가적인 생성물 분석은 질량 분광기를 사용하여 실시하였음: M+H 예상치 1348.5, 실측치 1348.5).

b) 시클로[CH₂CO-Lys-Asp-Cys]-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys(tBu)-Gly-Gly- OH의 합성

ClCH₂CO-Lys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys(tBu)-Gly-Gly-OH 100 mg을 물/아세토니트릴에 용해시켰다. 암모니아 용액을 이용하여 혼합물을 pH 8로 조정하고, 24시간 동안 교반하였다.

후처리 후, 펩티드 조생성물을 수득하였다(분석용 HPLC: 그래디언트, A = H₂O/0.1％ TFA, B = CH₃CN/0.1％ TFA, 10분 동안 5 - 50％ B; 칼럼, 페노메넥스 루나 3 μC18(2) 50 ×4.6 mm; 유속 2 ㎖/분; 검출 UV 214 nm; 생성물 체류 시간, 6.32분. 추가적인 생성물 분석은 질량 분광기를 사용하여 실시하였음: M+H 예상치 1312.5, 실측치 1312.6).

c) [Cys^7-9] 시클로[CH₂CO-Lys-Asp-Cys]-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-OH의 합성

시클로[CH₂CO-Lys-Asp-Cys]-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys(tBu)-Gly-Gly-OH 40 mg을 아니솔(200 ㎕), DMSO(1 ㎖) 및 TFA(50 ㎖)의 용액으로 30분 동안 처리한 후, TFA를 진공에서 제거하고, 디에틸 에테르를 첨가하여 펩티드를 침전시켰다.

예비 HPLC(페노메넥스 루나 5 μC18(2) 250 ×21.20 mm 칼럼)에 의한 조물질(40 mg)의 정제는 40분 동안 0 - 30％의 B를 사용하여(여기서, A = H₂O/0.1％ TFA이고, B = CH₃CN/0.1％ TFA임) 10 ㎖/분의 유속으로 실시하였다. 동결건조 후, 순수한 물질 14.3 mg을 수득하였다(분석용 HPLC: 그래디언트, A = H₂O/0.1％ TFA, B = CH₃CN/0.1％ TFA, 10분 동안 0 - 30％ B; 칼럼, 페노메넥스 루나 3 μC18(2) 50 ×4.6 mm; 유속 2 ㎖/분; 검출 UV 214 nm; 생성물 체류 시간, 6.10분. 추가적인 생성물 분석은 질량 분광기를 사용하여 실시하였음: M+H 예상치 1198.4, 실측치 1198.5).

d) [Cys^7-9] 시클로[CH₂CO-Lys-Asp-Cys]-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-OH 및 Pn216-숙신산의 접합

[Cys^7-9] 시클로[CH₂CO-Lys-Asp-Cys]-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-OH, Pn216 킬레이트 활성 에스테르 및 N-메틸모르폴린을 DMF에 용해시켰다. RP-HPLC에 의해 완전한 접합이 관찰될 때까지 혼합물을 교반하였다.

예비 RP-HPLC에 의한 반응 혼합물의 정제를 실시하였고, 동결건조 후 순수한 물질을 수득하였다. 생성물 분석은 RP-HPLC 및 질량 분광기를 사용하여 실시하였다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물.

<화학식 I>

상기 식에서,

r은 0 또는 1이고,

p는 0 또는 1이고,

r+p는 1이며,

r이 0이면, R₁은 -(CH₂)_n-CO- 또는 -(CH₂)_n-C₆H₄-CO-(여기서, n은 1, 2, 3, 4 또는 5임)이고,

r이 1이면, R₁은 시스테인 또는 하나 이상의 가교-형성 아미노산이고, 이때 R₁과 X₂ 사이의 가교는 티오에테르 또는 이황화 결합을 함유하며,

X₁은 결합이거나, 또는 아스파르트산, 티로신, 티로신-아스파르트산, 리신, 아세틸-리신 및 글리신으로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산이고, 이때 상기 아미노산은 탄수화물 잔기로 유도체화될 수 있거나, 또는 스페이서(spacer), 링커(linker) 및 생체내 촬영에 적합한 리포터(reporter)에 결합되거나 또는 결합될 수 있는 킬레이트 중 하나 이상으로 관능화될 수 있으며,

X₂ 및 X₄은 독립적으로 시스테인, 호모시스테인, 또는 아스파르트산 및 리신과 같은 고리화 결합을 형성할 수 있는 다른 아미노산이고,

X₃은 아르기닌, N-메틸아르기닌 또는 아르기닌 의사체이고,

X₅는 소수성 아미노산이고,

X₆은 시스테인, 호모시스테인, 아스파르트산 또는 리신이고,

X₇은 결합이거나, 또는 글리신 및 알라닌으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이거나, 또는 X₈로서 정의되는 다수의 킬레이트를 이용한 표지화를 가능하게 할 수 있고 하나 이상의 에틸렌 글리콜 단위 또는 다른 스페이서 성분을 포함할 수 있는 스페이서 또는 링커이고,

X₈은 금속 방사성핵종 또는 생체내 촬영에 적합한 리포터에 결합되거나 결합될 수 있는 킬레이트이거나, 또는 -NH₂이거나, 또는 부재하며,

q는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고,

가교(R₁ 및 X₂사이 또는 X₄ 및 X₆ 사이) 중 하나는 이황화 결합을 포함한다.
삭제
삭제
제1항에 있어서, X₅이 페닐알라닌, 티로신, 요오도티로신, 디요오도티로신 또는 나프틸알라닌인 화합물.
제1항에 있어서, 화학식 II에 의해 정의되는 화합물.

<화학식 II>

상기 식에서,

Cys는 시스테인이고,

X₁'은 아스파르트산, 티로신, 티로신-아스파르트산, 리신 및 아세틸-리신으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 아미노산이고,

X₃은 화학식 I에서 정의한 바와 같고,

X₅'는 페닐알라닌, 티로신, 3-요오도-티로신 또는 나프틸알라닌이고,

X₇'은 결합이거나, 또는 글리신 또는 O-비스(아미노에틸) 에틸렌 글리콜 스페이서이고,

X₈'은 금속 방사성핵종에 결합된 화학식
또는
의 킬레이트이고,

상기 화학식 II에 나타난 바와 같이, 하나의 가교는 티오 결합을 포함하고, 다른 가교는 이황화 결합을 포함한다.
삭제
제5항에 있어서, X₇'이 글리신인 화합물.
생체내 촬영에서의 영상 콘트라스트의 향상에 효과적인 양의 화학식 I의 화합물 또는 그의 산 부가 염을 하나 이상의 제약학상 허용되는 보조제, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는, 영상 콘트라스트 향상을 위한 제약 조성물.
제8항의 제약 조성물을 비인간 동물 신체에 투여하고 상기 신체의 적어도 일부의 영상을 얻는 것을 포함하는, 비인간 동물 신체의 향상된 영상을 얻는 방법.
화학식 I의 화합물을 비인간 동물 대상에게 투여하고 상기 화합물의 흡수를 검출하는 것을 포함하며, 상기 투여 및 검출을 혈관신생에 연관된 상태를 극복하도록 하는 약물에 의한 처치 전, 중 및 후에 반복적으로 실시할 수 있는, 혈관신생에 연관된 상태를 극복하도록 하는 약물로 비인간 동물 대상을 처치한 효과를 모니터하는 방법.
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벡터 V를 진단용 촬영 절차에서 검출가능한 화합물에 접합시키거나, 또는 킬레이트화제에 접합시키고, 필요시 생성된 접합체의 킬런트 기를 진단용 촬영 절차에서 검출가능한 금속 이온으로 금속화하는 것을 포함하는, 화학식 I의 화합물의 제조 방법.