KR101016214B1 - 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조영제 - Google Patents

근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조영제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체 나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조영제에 관한 것으로서, 상세하게 자가 면역 반응(autoimmune response)에 의한 염증으로 유발되는 신생 혈관의 높은 투과성으로 인하여 염증 부위에 선택적으로 축적이 가능한 담즙산-글라이콜키토산 복합체가 근적외선 형광체와 결합된 나노입자 복합체로서 근적외선 투시를 이용하여 류마티스 관절염의 조기 진단 및 질환 증상의 정도에 대한 비침투적 영상이 가능하다.
또한, 상기 근적외선 형광체와 담즙산-글라이콜키토산 나노입자의 복합체내에 약물 또는 바이오 의약품을 봉입할 수 있어 이를 투여할 경우 면역반응을 조절함으로써 자가면역질환의 증상 완화 및 치료 과정을 비침투적 영상으로 스크리닝이 가능하다.
류마티스 관절염, 조영제, 근적외선 형광체

Description

근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체 나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조영제{A CONTRAST MEDIUM COMPRISING NANOPARTICLES FORMED WITH BILE ACID-GLYCOL CHITOSAN COMPLEX BINDING A NEAR-INFRARED FLUOROCHROME FOR DIAGNOSING RHEUMATOID ARTHRITIS}
본 발명은 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체 나노입자를 포함하여 생체 내 염증 부위를 비침투적으로 영상화하는 신규 류마티스 관절염 진단용 조영제에 관한 것이다.
류마티스 관절염은 초기단계에 새로운 혈관이 관절 부위에 생성되며 여기에서 염증반응을 일으키는 세포들이 관절부위로 들어온다. 침투한 면역세포들이 염증반응을 유발하는 싸이토카인 (예로, TNF-alpha, Interleukin-1, Interleukin-6)들을 분비하여 활액섬유세포 (synovial fibroblast)를 활성화시켜 결과적으로 활액세포 (synovial cell)들이 증식하여 굳은 막을 형성함으로써 판누스 (Pannus) 파괴적인 조직을 만들어 뼈의 파괴가 진행하게 되는 질환이다.
현재까지 류마티스성 관절염의 진단은 혈청학적 시험 [예, C-reactive protein, Erythrocyte sedimentation rate (ESR), Rheumatoid factor (RF), Matrix-metalloproteinase-3 (MMP-3)], X-선 촬영, 자기공명영상 (Magnetic Resonance Imaging, MRI), Ultrasound scanning에 의한 방법으로 진단하고 있다.
그러나 상기 방법들은 채혈한 혈액으로부터 혈청을 분리한 뒤 혈청검사를 하거나, 인체에 유해한 x-ray 및 조영제를 사용하기 때문에 부작용이 야기될 수 있다. 따라서, 류마티스 관절염 진단에 있어서 인체에 무해하며 단시간 내에 간단한 방법으로 진단하는 방법의 필요성이 대두되었다. 류마티스 관절염은 조기에 류마티스 관절염을 발견, 진단하여 증상을 평가한 후 적절한 약물요법을 병행하면 치료 효율 및 완치율이 높으며, 외과적 수술을 최소화하여 삶의 질을 높일 수 있기에 조기 진단이 중요하다.
최근 질병 조기 진단 분야에서 광학 분자 영상 기술의 중요성이 대두되었다. 특히, 근적외선 파장 (650nm-900nm)의 스펙트럼 범위 내에서 흡수 및 형광 최대치를 갖고, 물에 대한 용해도가 높고 생체 적합성이 우수한 근적외선 형광체의 개발에 의해서, 생체 내 흡수가 최소화되고, 근적외선 투시에서 조직 내로 몇 센티미터를 통과할 수 있기 때문에, 다양한 광학 분자 영상 장치, 즉 형광내시경, CCD 카메라, 형광 단층 촬영 (fluorescence-mediated tomography; FMT)으로 류마티스 관절염 조직의 영상이 가능하다.
현재까지 근적외선 투시에 의한 류마티스 관절염 영상법은 기존의 X-ray 또는 MRI 진단기술과 비교하여, 생체에 대한 낮은 독성, 고해상도의 영상, 저렴한 비용 등의 장점을 가지고 있다.
그러나 자가면역질환의 조기 진단을 위한 가장 효율적인 방법은 자가면역질 환 조직에 선택적으로 근적외선 투시가 가능한 근적외선 형광체를 많이 전달하여, 질환 조직에서 높은 형광 세기를 나타내는 방법이 요구되어 진다.
이에 본 발명자들은 자가면역질환 조직의 신생 혈관의 높은 투과율에 의해서 질환 조직에 선택적으로 축적이 되는 고분자에 근적외선 투시가 가능한 근적외선 형광체를 화학적으로 결합하여 자가면역질환을 조기진단을 위한 고분자 나노입자형 신규 조영제를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체 나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조영제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체 나노입자에 소수성 약물이 봉입된 류마티스 관절염 치료용 약물전달체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체 나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조영제를 제공한다.
양친성 고분자는 친수성 고분자에 소수성 물질이 결합된 것으로서, 상기 친수성 고분자는 덱스트란 (dextran), 키토산 (chitosan), 글라이콜 키토산 (glycol chitosan), 헤파린 (heparin), 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine) 또는 폴리아스파르트산 (poly-aspartic acid)로부터 선택되는 생체고분자; 또는 폴리(N-2-(하이드록시프로필)메타아크릴아마이드)(poly(N-2-(hydroxypropyl)methacrylamide), 폴리(디비닐 에테르-코-말레익 언하이드라이드)(poly(divinyl ehter-co-maleic anhydride)), 폴리(스틸렌-코-말레익 언하이드라이드)(poly(styrene-co-maleic anhydride)) 또는 폴리(에틸렌 글라이콜)(poly(ethylene glycol))로부터 선택되는 합성 고분자이며, 이중에서 글라이콜키토산이 바람직하다.
상기 소수성 물질은 담즙산, 디옥시콜린산 (deoxycholic acid), 리소콜릭산 (Lithocholic acid), 타우로디옥시콜린산(taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산 (taurocholic acid) 또는 글리코케노디옥시콜린산 (glycochenodeoxyhoclic acid)로부터 선택되는 담즙산 유도체; 또는 스테아린산(steric acid), 올레인산(olelic acid), 콜레스테롤 (cholesterol) 및 팔미틱 산 (palmitic acid)로부터 선택되는 지방산 유도체이며, 이 중에서 담즙산이 바람직하다.
또한, 상기 근적외선 형광체는 시아닌, 알로피코시아닌 (allophycocyanin), 플루오레신(fluorescein), 테트라메틸로드아민(tetramethylrhodamine), 보디피(BODIPY) 또는 알렉사(Alexa)이며, 시아닌 또는 알로피코시아닌이 바람직하다.
상기 조영제는 방사선 동위원소, 양자점(quantum dot) 또는 MRI 조영제를 추가로 포함할 수 있으며, 자가면역질환은 류마티스 관절염 (Rheumatoid arthritis), 전신성 경피증 (Progressive systemic sclerosis), 췌장세포 항체에 의한 인슐린 의존성 소아기 당뇨병, 만성 갑상선 염, 궤양성 대장염, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 자가면역성 뇌척수염 또는 섬유조직염 (Fibromyalgia syndrome) 등 이다.
또한, 본 발명은 상기 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체 나노입자에 소수성 약물이 봉입된 약물전달체를 제공한다.
상기 소수성 약물은 항류마티스제, 항염증제 또는 생체이물이 봉입될 수 있으며, 항 류마티스제의 예로는 메소트렉세이트 (Methotrexate), (cyclosporin A), D-페니실아민 금염 (D-penicillamine gold salt), 히드록시클로로퀴닌 (hydroxychloroquinin), 레플루노미드 (leflunomide) 등이 있으며, 면역억제제로는 사이클로스포린 A이 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 근적외선 형광체가 결합된 양친성 고분자 나노 입자는 자가면역질환으로 인한 염증 조직에 선택적으로 축적이 가능하여, 근적외선 조사 시 자가면역질환의 조기 진단 및 증상 판별도 가능하므로, 본 발명의 조영제는 자가면역질환의 조기 진단에 아주 유용한 발명이다.
또한 본 발명의 양친성 고분자 나노입자는 약물전달체로 사용할 수 있으며, 이를 인체에 주입할 경우 다양한 조직에서 발생하는 자가면역질환 조직 치료에 사용이 가능하며 근적외선 투시로 비침습적 방법으로 영상이 가능함으로써 자가면역질환 치료 효과 및 약물전달체의 효능을 평가하는 스크리닝 기술에 활용할 수 있는 아주 유용한 발명이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체 나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조영제를 제공한다.
상기 고분자 나노 입자는 소수성과 친수성의 균형을 통해 나노 크기의 자기조립체 (self-assemblｙ)　혹은 자기 집합체 (self-aggregate)를 형성할 수 있으며, 자가면역질환 조직에 선택적으로 축적될 수 있다. 또한, 본 발명의 고분자 나노 입자는 근적외선 투시가 가능한 근적외선 형광체의 화학적 개질에 용이하며, 근 적외선 투시에 의해 자가면역질환 조직의 선택적인 강한 근적외선 형광을 나타낼 수 있다.
상기 고분자는 생체적합성/생분해성을 갖는 친수성 고분자는 모두 사용될 수 있으며, 특히 자가면역질환 조직에 대한 축적 효율이 높고 소수성 항류마티스제, 항염증제 및 생체이물의 약물 전달체로서 사용되는 생체고분자인 덱스트란 (dextran), 키토산 (chitosan), 글라이콜 키토산 (glycol chitosan), 헤파린 (heparin), 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine), 폴리아스파틱산 (poly-aspartic acid) 등이 사용될 수 있다. 또한 생체 고분자 이외에 폴리(N-2-(하이드록시프로필)메타아크릴아마이드) (poly(N-2-(hydroxypropyl)methacrylamide), 폴리(디비닐 에테르-코-말레익 어하이드라이드) (poly(divinyl ether-co-maleic anhydride)), 폴리(스틸렌-코-말레익 언하이드라이드)(poly(styrene-co-maleic anhydride)) 또는 폴리(에틸렌 글라이콜) (poly(ethylene glycol))등의 합성 고분자도 사용될 수 있다. 상기 고분자 중에서 글라이콜 키토산이 가장 바람직하며, 글라이콜 키토산은 고분자 사슬 내에 양전자를 많이 함유하고 있어 나노 입자를 제조할 경우, 자가면역질환 조직에 축척 효율이 현저히 탁월하며, 글라이콜 키토산의 아민기는 소수성 물질 및 근적외선 형광체의 화학적 개질 유도에 가장 적합하다.
상기 고분자 나노 입자는 생체 내에서 생체적합성/생분해성이 우수하며, 생체내의 안정성이 우수하여 혈액 내에서의 생체 분포도가 높아서 충분한 시간 동안 자가면역질환의 염증 부위에 축적이 되는 특성이 있다.
상기 친수성 고분자에 결합되는 소수성 물질은 담즙산 및 디옥시콜릭산 (deoxycholic acid), 리소콜릭산 (lithocholic acid), 타우로디옥시콜릭산(taurodeoxycholic acid), 타우로콜릭산 (taurocholic acid), 글리코케노디옥시콜릭산 (glycochenodeoxyhoclic acid) 등의 담즙산 유도체; 스테아릭산(stearic acid), 콜레스테롤 (cholesterol), 팔미틱산 (palmitic acid), 올레익산(olelic acid) 등의 지방산 유도체가 사용될 수 있으며, 담즙산을 사용하는 것이 바람직하다.
생체 내 광학 투시를 위해서 상기 양친성 고분자에 시아닌, 알로피코시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민, 보디피, 알렉사 등과 같은 형광체가 화학적으로 도입된다. 상기 형광체는 양친성 고분자 내의 소수성 물질에 결합하게 된다. 형광체 중에서 시아닌계는 근적외선 빛을 방출 및 흡수하므로 세포, 혈액 및 생체 조직 등과 간섭이 낮아 가장 바람직하며, 좋은 예는 Cy5.5이다. 근적외선 형광체로 개질된 고분자 나노입자는 근적외선 조사를 이용하여 생체 내 자가면역질환 조직의 영상화가 가능하며, 방사선 동위원소, 양자점(quantum dot), MRI 조영제를 동시에 도입할 경우 다양한 복합 분자영상이 가능하다.
본 발명의 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체 나노입자는 수계에서 안정한 나노입자 구조를 가지며, 자가면역질환의 염증 부위에 축적 효율이 높은 것이 바람직하다. 또한, 근적외선 투시가 자가면역질환 조직 표적성을 갖는 높은 근적외선 형광 세기를 나타내는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체 나노입자에 소수성 항류마티스제, 항염증제 및 생체이물의 봉입된 약물전달체를 제 공한다.
상기 약물은 메소트렉세이트 (Methotrexate), 사이클로스포린 A (cyclosporin A), D-페니실아민 금염 (D-penicillamine gold salt), 히드록시클로로퀴닌 (hydroxychloroquinin) 또는 레플루노미드 (leflunomide)이다.
따라서, 본 발명의 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체 나노입자는 류마티스 관절염 진단용 조영제 뿐만 아니라 약물전달체로도 이용될 수 있어, 류마티스 관절염 진단과 치료를 동시에 수행할 수 있는 이점을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구체예로서, 키토산 고분자인 친수성 글라이콜 키토산에 소수성 물질로서 담즙산을 도입시켜 양친성 키토산 유도체를 제조한 후, 근적외선 형광체로서 Cy5.5를 화학적으로 결합시킨 것이다. 이와 같은 고분자 나노 입자를 형성하는 담즙산-키토산-Cy5.5 복합체는 하기의 일반식 (1)로 나타낼 수 있다.
Figure 112008027823307-pat00001
일반식 (1)
상기 일반식 (Ⅰ)에서 A와 B는 글라이콜 키토산 고분자의 반복 구조인 N-아세틸글루코사민(N-aceylglucosamine)과 N-글루코사민(N-glucosamine) 유도체를 의미하며, C는 N-글루코사민 유도체의 아민기에 결합된 소수성 담즙산, 지방산 등의 소수성 물질을 의미하며, D는 나노 입자의 생체 내 영상을 위하여 N-글루코사민 유도체의 아민기에 결합된 근적외선 형광체, 방사성 동위원소, 양자점 등을 의미한 다.
또한, a와 b는 글라이콜 키토산의 분자량에 따라서 수 100에서 수 10,000 값을 가지는 것으로서, 글라이콜 키토산의 분자량의 범위에 제한받지 않고, c는 글라이콜 키토산의 나노입자를 제조하기 위하여 20 내지 100의 값을 가지며, d는 10-30이다.
상기의 일반식 (1)을 기초로 친수성 고분자는 키토산으로, 소수성 물질은 담즙산으로, 근적외선 형광체는 Cy5.5으로 하여 제조된 담즙산-키토산-Cy5.5 복합체는 자기조립형 또는 자기응집된 형태의 나노 입자로 제조되며 그 크기는 수십에서 수백 나노미터의 크기를 갖는다. 상기 고분자 나노입자의 복합체는 생체적합성이 우수하고 자가면역질환 조직 내의 축적 효율이 우수하며, 근적외선, PET/SPECT 및 CCD 카메라에 의해서 생체 내에서 영상이 가능하다.
특히, 담즙산-키토산-Cy5.5 나노입자 내에 소수성 약물인 메소트렉세이트 (Methotrexate), 사이클로스포린 A (cyclosporin A), D-페니실아민 금염 (D-penicillamine gold salt), 히드록시클로로퀴닌 (hydroxychloroquinin), 레플루노미드 (leflunomide) 등의 약물 봉입이 가능하여 조기 진단 및 치료가 가능하다.
또한, 상기 담즙산-키토산-Cy5.5 복합체는 일반 저분자량의 조영제에 비하여 염증 조직의 EPR 효과에 의해 염증 조직에 대한 선택성이 높아 자가면역질환 조직의 축적 효율이 현저히 탁월하며, 생체 내의 체류 기간이 저분자량의 조영제보다 크게 증가되어 자가면역질환 조직의 장기적인 영상이 가능하다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시일뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 의하여 제한되지는 않는다.
실시예 1. 담즙산 - 글라이콜키토산 - Cy5 .5 복합체의 제조
500mg의 글라이콜 키토산을 60㎖의 물에 용해시키고 90㎖의 메탄올을 가한 후, 100㎖의 메탄올에 담즙산(5-β-cholanic acid) 260mg을 용해시켜 글리콜 키토산 용액에 천천히 적하하였고, 280mg의 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필) 카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide; EDC)와 420mg의 N-하이드로숙신이미드(N-hydrosuccinimide;NHS)를 50㎖의 메탄올에 녹여 반응액에 가한 다음 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 반응액을 2일 동안 투석하여 미반응 담즙산을 제거한 후 동결 건조하여, 담즙산-글라이콜 키토산 복합체를 제조하였다.
상기에서 제조된 담즙산-글라이콜 키토산 복합체 100mg를 20㎖의 물에 녹이고 20㎖의 DMSO을 가한 후, 2mg의 근적외선 형광체 Cy-5.5-NHS(monoreactive hydroxysuccimimide ester of Cy5.5)를 첨가하여 6시간 동안 반응시킨 후, 용액을 2일 동안 투석하여 미반응 Cy5.5를 제거하고, 동결 건조하여, 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5 복합체를 제조하였으며, 이의 제조과정은 하기 반응식 1에서 보는 바와 같다.
Figure 112008027823307-pat00002
실험예 1. 담즙산 - 글라이콜키토산 - Cy5 .5의 류마티스 관절염 조직에 축적효과 평가
1-1. 류마티스성 관절염 마우스 모델
자가면역질환 중 하나인 류마티스 관절염 동물 모델은 DAB1/J 마우스에 Type II 콜라겐을 마우스 꼬리 근육에 주사하여 관절염을 유도하였으며, 류마티스 관절염 마우스 모델의 각 다리를 관찰하였다. 류마티스 관절염 마우스의 증상으로는 붉어짐, 부풀기 등이 있다.
도 2의 류마티스 관절염 모델 마우스의 각 다리를 보면, 다리 부위의 관절 및 발목 부위에서 심하게 부풀림과 붉어짐 등의 증상이 나타남을 확인할 수 있었 다.
1-2. 답즙산 - 글라이콜키토산 - Cy5 .5의 류마티스 관절염 조직에 축적효과 평가
상기 실시예 1에서 제조한 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5의 나노입자 용액 100㎕를 상기 실험예 1-1의 류마티스 관절염 마우스에 정맥 주사한 후, 근적외선 조사를 실시하였다. 류마티스 관절염이 유발된 마우스에 본 발명의 나노 입자를 주입하고, 10분, 45분, 90분, 3시간, 12시간 및 24시간 후에 근적외선 조사를 실시하여 류마티스 관절염 조직의 영상을 획득하였다.
상기 실험 수행의 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5의 나노 입자를 투여하여 류마티스 관절염 조직의 근적외선 투시 영상을 보면, 류마티스 관절염 마우스의 관절 및 발목 부위에서 강한 형광이 나타났으며, 류마티스 관절염 조직의 영상이 가능함을 확인할 수 있었다. 또한, 시간이 지남에 따라 발목 및 관절 부위에서 형광의 세기가 점차 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 4에서는 본 발명의 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5의 나노 입자를 주입 후 45분 뒤에 각 류마티스 관절염 마우스의 다리를 확대하여 얻은 근적외선 영상을 보여준다. 류마티스 관절염 마우스에 본 발명의 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5 나노입자를 투여하기 전과 비교하여, 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5 나노입자를 투여한 후에 심하게 부풀어 오른 발목 부위 및 관절 부위에서 강한 형광이 나타남을 확인하였다.
또한, 도 5에서는 류마티스 관절염 마우스에 본 발명의 담즙산-글라이콜 키 토산-Cy5.5 나노입자를 투여한 후 상기의 시간마다 마우스에 근적외선을 투시하여 얻은 근적외선 이미지로부터, 관절염 부위와 몸에서 발광되는 형광세기의 비율을 정량화한 것을 보여준다. 류마티스 관절염 마우스에 투여된 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5 나노입자는 시간이 지남에 따라, 점차적으로 류마티스 관절염 조직에서 분해되서 몸 밖으로 배출되는 것을 알 수 있었다. 가장 중요한 점은, 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5 나노입자를 사용하면, 투여하자마자 단시간 내에 류마티스 관절염 조직을 영상화 할 수 있다는 것이다.
실험예 2. 담즙산 - 글라이콜키토산 - Cy5 .5의 류마티스 관절염 증상 평가
상기 실시예 1의 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5의 나노입자를 류마티스 관절염 마우스에 정맥주사한 후, 근적외선 조사를 실시하여 고분자 나노입자를 이용하여 류마티스 관절염 증상을 판별할 수 있는지를 실험하였다.
도 6는 토모그래피(tomography)(GE Health Care, eXplore Optix, Pre-clinical Optical Imaging System)를 이용한 근적외선 이미지를 수득하기 위하여 류마티스 관절염 마우스 각 다리 부위의 부풀림 정도를 보여준다. 마우스의 각 다리 부위의 부풀림 정도가 다름을 확인할 수 있었으며, 부풀림, 붉어짐 정도로 류마티스 관절염의 정도를 알 수 있었다. 근적외선을 조사할 수 있는 토모그래피(Tomography) 영상장비를 이용하여, 발목 및 관절 부위에 류마티스 관절염 정도를 토모그래피를 영상장비로 얻은 근적외선 이미지로부터 류마티즘 증상을 평가하고자 하였다.
상기 실험 수행의 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 본 발명의 나노입자를 투여하고 약 1시간 후에 토모그래피 영상장비를 사용하여 얻은 근적외선 이미지로부터 나노입자가 류마티스 관절염 조직에 축적됨을 확인할 수 있었다. 또한, 각 다리 조직에서 얻어진 근적외선 영상으로부터, 류마티스 관절염이 심한 다리 부위에서 강한 형광세기를 볼 수 있었다. 또한, 왼쪽 뒷다리 근적외선 이미지에서 보는 바와 같이 발목 부위 보다는 발가락 부위의 관절부분에서 강한 신호가 나타나는 것으로 보아 발가락 부위의 염증이 관절부위보다 증상이 심각하다는 것을 평가할 수 있다.
실험예 3. 담즙산 - 글라이콜키토산 - Cy5 .5의 류마티스 관절염의 진행정도 영상화
상기 실시예 1에서와 같이 DAB1/J 마우스에 Type II collagen을 꼬리 근육에 주사하여 관절염을 유도하였다. 관절염을 유도한 뒤에 1 주, 3주, 5주, 7주가 되었을 때, 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5의 나노입자를 류마티스 관절염 마우스에 정맥주사한 후, 광학영상장비를 이용하여 관절염 증상의 진행 정도를 관찰 및 판별할 수 있는지를 실험하였다.
도 8(a)는 류마티스 관절염 진행정도를 토모그래피(tomography)를(GE Health Care, eXplore Optix, Pre-clinical Optical Imaging System) 이용하여 얻은 근적외선 이미지이다. 마우스에서 류마티스 관절염이 증상이 진행됨에 따라 마우스 다리부분에서 나오는 형광의 세기가 점차적으로 증가함을 알 수 있었으며, 도 8(b)에 나타난 바와 같이, 마우스의 류마티스 관절염의 초기에서 점차적으로 관절염 증상 이 심해질수록 형광의 세기가 비례적으로 증가하였다. 관절염의 증상이 심해짐에 따라 형광의 세기가 비례적으로 증가하는 것은, 도 8(c)에서와 같이 관절염의 증상 지수가 증가하는 것과 깊은 상관관계가 있음을 보여주고 있다. 따라서, 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5의 나노입자는 류마티스 관절염 발달 진행정도를 판별할 수 있으며, 류마티스 관절염 조기 진단에서 응용이 가능하다.
실험예 4. 담즙산 - 글라이콜키토산 - Cy5 . 5을 이용한 류마티스 관절염 치료제의 치료효능 평가
상기 실시예 1에서와 같이 DAB1/J 마우스에 Type II collagen을 꼬리 근육에 주사하여 관절염을 유도하였다. 관절염을 유도한 뒤에 마우스를 세 개의 군으로 분류한다. 그룹 1은 류마티스 관절염 마우스 그룹, 그룹 2은 류마티스 관절염 마우스에 관절염 치료제인 메토트렉세이트 (Methotrexate, MTX)를 0.5 mg/kg로 투여한 그룹, 그룹 3은 류마티스 관절염 마우스에 관절염 치료제인 메토트렉세이트 (Methotrexate, MTX)를 10 mg/kg로 투여한 그룹이다. 관절염 유도 후, 4주와 8주째에 실시예 1에 따라 제조된 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5의 나노입자를 류마티스 관절염 마우스에 정맥주사한 후, 광학영상장비를 이용하여 관절염 치료제의 치료효능 평가를 할 수 있는지를 실험하였다.
도 9(a)는 류마티스 관절염 마우스에 관절염 치료제를 투여한 후, 류마티스 관절염 치료 효능을 평가할 수 있는지를 토모그래피(tomography)를(GE Health Care, eXplore Optix, Pre-clinical Optical Imaging System) 이용하여 얻은 근적 외선 이미지이다. 관절염 치료제를 투여하지 않은 그룹과는 달리, MTX를 투여한 그룹 마우스의 관절부분에서 형광의 세기가 감소하였으며, 특히 MTX를 10mg/kg로 투여한 그룹에서는 형광의 세기가 더 감소함을 알 수 있었다. 도 9(b)에서와 같이 MTX 투여 용량에 따라 형광의 세기가 감소함을 정량화하여 담즙산-글라이콜 키토산-Cy5.5의 나노입자로 관절염치료제의 치료 효능을 평가할 수 있음을 보여 주었으며, 도 9(c)에서 보듯이 MTX 치료 용량에 따라 관절염 증상 지수가 감소되는 것이 형광의 감소와 깊은 상관관계가 있음을 확인하였다. 상기의 결과에서 보듯이, 글라이콜 키토산-Cy5.5의 나노입자를 이용하여 류마티스 관절염 치료제의 관절염 치료효능을 평가할 수 있음을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 담즙산-키토산-Cy5.5 나노 입자 제조 방법의 개략도이다.
도 2는 류마티스성 관절염 마우스 모델의 각 다리를 보여주는 사진이다.
도 3은 류마티스성 관절염 마우스에 본 발명의 담즙산-키토산-Cy5.5 나노 입자를 투여한 후, 류마티스 관절염 쥐의 몸 전체를 각 시간별로 측정한 근적외선 이미지이다.
도 4는 류마티스 관절염 마우스에 본 발명의 담즙산-키토산-Cy5.5 나노 입자를 투여기 전과 투여한 후 45분에 얻은 각 다리 부위의 근적외선 이미지이다.
도 5는 본 발명의 담즙산-키토산-Cy5.5 나노입자를 주입한 후 각 다리 부위에서 시간별 형광세기를 보여주는 그래프이다.
도 6는 토모그래피 (Tomography)를 이용하여 근적외선 이미지를 얻기 위해 사용된 관절염 마우스의 각 다리 부위의 부풀기를 보여주는 사진이다.
도 7은 본 발명의 담즙산-키토산-Cy5.5 나노입자를 주입한 후 토모그래피 (Tomography)를 사용하여 얻은 근적외선 이미지이다.
도 8은 본 발명의 담즙산-키토산-Cy5.5 나노입자를 주입한 후 류마티스 관절염 진행정도를 토모그래피(tomography)를 이용하여 얻은 근적외선 이미지이다
도 9는 류마티스 관절염 마우스에 관절염 치료제를 투여한 후, 류마티스 관절염 치료 효능을 평가할 수 있는지를 토모그래피(tomography)를 이용하여 얻은 근적외선 이미지이다.

Claims (4)

  1. 시아닌, 알로피코시아닌 (allophycocyanin), 플루오레신(fluorescein), 테트라메틸로드아민(tetramethylrhodamine), 보디피(BODIPY) 및 알렉사(Alexa)로 구성되는 군에서 선택되는 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체 나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조영제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조영제에 방사선 동위원소, 양자점(quantum dot) 또는 MRI 조영제를 더 포함하는 것인 류마티스 관절염 진단용 조영제.
  3. 제1항의 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체 나노입자에 소수성 약물이 봉입된 류마티스 관절염 치료용 약물전달체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 소수성 약물은 메소트렉세이트 (Methotrexate), 사이클로스포린 A (cyclosporin A), D-페니실아민 금염 (D-penicillamine gold salt), 히드록시클로로퀴닌 (hydroxychloroquinin) 또는 레플루노미드 (leflunomide)인 것인 류마티스 관절염 치료용 약물전달체.
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