CN101810564A - 含有环状结构的难溶性中药制成水溶性纳米制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了含有环状结构的难溶性中药制成水溶性纳米制剂的方法，将含有环状结构的难溶性中药与含胆汁酸疏水基团的两亲性壳聚糖衍生物通过疏水增溶作用而制得水溶性中药纳米制剂。本发明的方法简便可行，易于推广，所需设备及原材料廉价、容易获取，制得的水溶性纳米载药体系具有较好的生物相容，能起到缓释中药的作用，可产生较好的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种水溶性纳米中药制剂的制备方法，具体是指一种将含有环状结构的难溶性中药与含胆汁酸疏水基团的两亲性壳聚糖衍生物胶束通过疏水增溶作用形成水溶性载药纳米粒的制备方法，可广泛用于中药制药行业以及其它制药行业。
背景技术
中药是我国传统文化的瑰宝，经过几千年来的实践，已形成一套完整的理论体系，至今仍在我国的医疗保健事业中起着极其重要的作用。但是，传统中药存在剂型落后、服用剂量大、稳定性差等问题，特别是一些含有环状结构的难溶性中药(如下式i)水溶性差，因此很难通过传统的煎熬方式获得，并且这些中药经口服后溶出速率低、肠胃道吸收差，从而严重制约了其药效的发挥。
灯盏花甲素 灯盏花乙素 紫杉醇
喜树碱 姜黄素 冬凌草甲素
式i含有环状结构的难溶性中药
近期研究表明(Park E.K.et al.，Biomaterials，2005，26，1053-1061；Journalof Controlled Release，2005，109，158-168)，一些难溶于水的药物能与两亲性聚合物相互作用形成水溶性纳米载药胶束。这不仅可以提高难溶性药物的水溶性、生物利用度，而且能够提高药物运输的靶向性、改变药物的透膜能力、控制药物释放、提高药物的稳定性、降低药物的毒副作用。值得注意的是一些含有环状疏水基团(如苯基)的两亲性聚合物可将紫杉醇的载药量提高至37.4％，这是因为根据“相似相容”原理，聚合物上的环状疏水基团与紫杉醇的环状结构类似，使得紫杉醇更容易进入聚合物胶束的疏水性微区，从而提高了胶束的载药量(Huh K.M.et al.，Journal of Controlled Release，2005，101，59-68)。
甲壳素广泛地存在于蟹、虾以及藻类、真菌等低等动植物中，含量极其丰富，是仅次于纤维素的第二大多糖。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，具有很好的生物相容性、安全性和生物可降解性，因而是一类理想的药物载体原材料。目前已有文献(Jiang G.，et al.，Molecular Pharmaceutics，2006，3，152-160)和部分专利报道，在壳聚糖或其衍生物分子链上偶联一些疏水性长链烷基可合成出两亲性壳聚糖衍生物，作为难溶性药物的增溶载体，其中研究较多的是对紫杉醇的增溶作用。
然而，上述两亲性聚合物和两亲性壳聚糖衍生物链上的疏水基团-苯基和长链烷基的生物相容性较差。相比之下，胆汁酸是一种存在于人体中的天然物质，不仅具有刚性甾环结构和疏水特点，而且生物相容性好。通过化学反应，在亲水性壳聚糖主链上偶联疏水性脱氧胆汁酸基团，可合成出生物相容性较好的两亲性壳聚糖衍生物(如下式ii)，用于制备水溶性的纳米载药胶束(Lee K.Y.et al，Macromolecules，1998，31，378-383)。但到目前为止，尚未见此类两亲性壳聚糖衍生物用于水溶性纳米中药制剂的研究报道。
式ii含胆汁酸疏水基团的两亲性壳聚糖衍生物的化学结构
发明内容
为了提高含有环状结构的难溶性中药的药效，本发明的目的在于提供一种将含有环状结构的难溶性中药制成水溶性纳米制剂的方法。
实现本发明的目的是由下述具体技术方案实现的：
含有环状结构的难溶性中药制成水溶性纳米制剂的方法，包括如下步骤：
(1)在含胆汁酸疏水基团的两亲性壳聚糖衍生物(Chit-BA)中加入水溶液，不断搅拌使Chit-BA溶胀、溶解；
(2)将含有环状结构的难溶性中药溶解于有机溶剂中，制备成中药溶液；
(3)将步骤(2)得到的中药溶液在搅拌下滴加到步骤(1)的溶液中，再滴加水溶液，滴加完毕后继续搅拌；
(4)将步骤(3)得到的溶液进行减压蒸馏，除去有机溶剂；
(5)将步骤(4)得到的悬浮液进行离心，上清液为负载中药的纳米载药胶束溶液，沉淀为未被负载的中药。
为了更好地实现本发明，所述步骤(1)中Chit-BA的重量为1～10克。采用分子量为45万的壳聚糖原料(上海伯奥生物有限公司，脱乙酰度≥90.0％)，根据文献报道的方法合成Chit-BA(Lee K.Y.et al，Macromolecules，1998，31，378-383)，其化学结构如式ii所示。
FTIR：3403，2925，2876，1659，1626，1565，1405，1377，1311，1156，1970，898，674cm-1.
1H NMR(500MHz，D2O)：5.0-3.0(氨基葡萄糖单元质子)，2.8，2.2，2.1，1.9，1.0(脱氧胆汁酸基质子).
根据1HNMR中质子的积分面积可以计算出脱氧胆酸基团为5％。通过芘荧光探针法测定出Chit-BA在水中自聚集形成胶束的临界聚集浓度(CAC)为0.32mg/mL。
仪器：FTIR红外光谱仪(Nicolet/Nexus 670，美国)，KBr压片；Varian INOVA500NB超导核磁共振谱仪(美国Varian公司)；荧光分光光度计(RF-530XPC，日本岛津公司)。
所述步骤(1)和步骤(3)中的水溶液为去离子水、蒸馏水、生理盐水、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3.0～4.8)、磷酸盐缓冲液(pH4.9～7.0)、Tris-盐酸缓冲液(pH7.1～8.0)、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH8.6～9.4)中的一种。
所述步骤(1)中的水溶液体积为50～500毫升，搅拌温度为15～35℃。
步骤(2)中，所述难溶性中药为如式i所示的含有环状结构的难溶性中药，如灯盏花素(灯盏花素是从天然植物灯盏花中提取的黄酮类活性成分，为灯盏花甲素、灯盏花乙素的混合物，主要为灯盏花乙素)、姜黄素、紫杉醇、喜树碱、冬凌草甲素，但不局限于这几种中药，本申请中以灯盏花素和姜黄素为例。
所述步骤(2)中的难溶性中药的重量为0.5～5.0克，有机溶剂体积为10～50毫升，其中，有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃中的一种。
所述步骤(3)中水溶液体积为300～3000毫升，搅拌速度为100～1000转/分，滴加完毕后继续搅拌的时间为12～48小时。
所述步骤(4)中减压蒸馏的温度为35～50℃，减压蒸馏的真空度为10～30mmHg。
所述步骤(5)中离心的转速为1000～6000转/分，时间为10～60分。
本发明的原理是，含有环状结构的难溶性中药含有疏水性较强的环状基团，它们通过与两亲性壳聚糖衍生物中脱氧胆酸基团之间较强的疏水相互作用，自组装形成纳米载药胶束，从而制得可溶于水的纳米中药制剂。本发明工艺简便，制备出的纳米载药体系具有较好的生物相容，并且能起到缓释中药的作用。本发明不仅广泛用于中药制药行业，有利于促进中药现代化的发展，还可推广用于提高非中药类、难溶性中药的水溶性。
本发明与现有制备水溶性载药纳米粒的方法相比，具有如下优点和有益效果：
(1)本发明中Chit-BA含有生物相容性较好的脱氧胆汁酸基团，与两亲性聚合物和两亲性壳聚糖衍生物中的苯基和长链烷基相比，不仅具有刚性甾环结构和疏水特点，而且生物相容性好，具有更好的生物膜穿透性，使得Chit-BA载药胶束容易通过细胞膜而进入细胞，参见图1。
(2)本发明采用减压蒸馏方法除去有机溶剂，与溶剂挥发法相比更有利于保护环境，比透析法更加节约时间，并且更有利于实现工业化生产。
(3)与微乳液聚合法以及制备脂质体纳米粒的膜-超声分散法相比，本发明工艺简单，操作方便，所需设备及原材料廉价、容易获取，可产生较好的社会效益和经济效益。
(4)本发明以载药效果较佳的灯盏花素和姜黄素两种难溶性中药为例，制备出的两种水溶性纳米载药胶束的粒径均小于500nm，且随着载药量的增加而粒径不断增大(图2a和图2b)。两种纳米载药胶束与不含中药的Chit-BA胶束相比，具有更高的Zeta电位(见表1)，说明纳米载药胶束具有较好的稳定性。
(5)本发明制备出高载药量的水溶性纳米中药制剂，能够显著提高难溶性中药的水溶性。Chit-BA负载灯盏花素和姜黄素前后的参数显示(见表1)，灯盏花素/Chit-BA和姜黄素/Chit-BA纳米载药胶束的载药量分别高达30-43％和27-30％，它们分别将灯盏花素在水中的溶解度由0.06g/L提高至0.7-1.18g/L、姜黄素在水中的溶解度由0.02g/L提高至0.53-0.78g/L。因此，负载灯盏花素或姜黄素的纳米载药胶束溶液有可能用作医用注射液。
(6)本发明中两种纳米载药制剂具有缓慢释放中药的功效，将有利于提高难溶性中药的治疗效果。
表1.
a，b纳米载药胶束载药量及负载率的测定方法：通过紫外-可见分光光度法测定未被负载的中药含量，根据公式(1)和(2)计算纳米载药胶束载药量及负载效率：
载药量＝(A-B)/C×100％ (1)
负载率＝(A-B)/A×100％ (2)
A：加入的中药重量
B：未被负载的中药重量
C：加入的Chit-BA重量。
附图说明
图1为负载荧光染色试剂-异硫氰酸荧光素(FTIC)的Chit-BA胶束与人体视网膜色素上皮细胞(hRPE)作用不同时间后的图：(a-1)、(b-1)和(c-1)为细胞的倒置荧光显微镜图，(a-2)、(b-2)和(c-2)为相应的细胞显微镜图；
图2为Chit-BA负载中药前后的透射电镜图：(a)负载灯盏花素的Chit-BA胶束(载药量为42％)，(b)负载姜黄素的Chit-BA胶束(载药量为28％)，(c)Chit-BA胶束；
图3为实施例2制得的载药灯盏花素在PBS(pH6.2)的释放曲线图；
图4为实施例8制得的载药姜黄素在PBS(pH6.2)/乙醇(4/1，v/v)的释放曲线图；
图5为本发明制备水溶性中药纳米制剂的工艺流程图。
具体实施方式
本发明以两种含有环状结构的难溶于水的中药-灯盏花素和姜黄素为例，结合以下实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所用仪器：尼康倒置荧光显微镜仪(日本Nikon，TI-DH)，JEM-2010HR透射电镜仪(日本JEOL)，紫外可见分光光度计(日本岛津)，Zeta电位分析仪(美国Brooken Haven)。
首先，采用分子量为45万的壳聚糖原料(上海伯奥生物有限公司，脱乙酰度≥90.0％)，根据文献报道的方法合成Chit-BA(Lee K.Y.et al，Macromolecules，1998，31，378-383)，其化学结构如式ii所示。由图1的倒置荧光显微镜图可见，第1天，Chit-BA胶束聚集在细胞膜附近；第3天，Chit-BA胶束穿过细胞膜，进入细胞；第5天，Chit-BA胶束中的FTIC逐渐被释放出来，使整个细胞出现荧光现象。
实施例1
如图5所示，难溶性中药灯盏花素制备水溶性纳米制剂的方法如下：
(1)将3克Chit-BA置于圆底烧瓶，加入200毫升Tris-盐酸缓冲液(pH7.6)，于35℃下不断搅拌使Chit-BA溶胀、溶解。
(2)将1.0克灯盏花素(西昌杰象药物原料有限公司)溶解于25毫升丙酮中，制备成溶液。
(3)将步骤(2)得到的溶液在搅拌下(500转/分)滴加到步骤(1)的溶液中，再滴加1000毫升Tris-盐酸缓冲液(pH7.6)，滴加完毕后继续搅拌24小时。
(4)将步骤(3)得到的溶液升温至50℃，于30mmHg真空度减压蒸馏除去丙酮。
(5)将步骤(4)得到的悬浮液进行离心(2000转/分)40分钟，上清液为负载灯盏花素的纳米载药胶束溶液，沉淀为未被负载的灯盏花素。
通过紫外-可见分光光度法测定未被负载的中药含量，计算纳米载药胶束载药量为33％，负载率为100％；通过透射电镜观察到载药胶束的粒径为200-300nm，其Zeta电位为26.8mV，灯盏花素在水中的溶解度为0.83g/L，它在PBS(pH6.2)溶液中的缓释时间约为12小时。
实施例2
如图5所示，难溶性中药灯盏花素制备水溶性纳米制剂的方法如下：
(1)将10克Chit-BA置于圆底烧瓶，加入500毫升蒸馏水，于25℃下不断搅拌使Chit-BA溶胀、溶解。
(2)将5.0克灯盏花素(西昌杰象药物原料有限公司)溶解于50毫升甲醇中，制备成溶液。
(3)将步骤(2)得到的溶液在搅拌下(800转/分)滴加到步骤(1)的溶液中，再滴加3000毫升蒸馏水，滴加完毕后继续搅拌48小时。
(4)将步骤(3)得到的溶液升温至45℃，于10mmHg真空度减压蒸馏除去甲醇。
(5)将步骤(4)得到的悬浮液进行离心(1000转/分)60分钟，上清液为负载灯盏花素的纳米载药胶束溶液，沉淀为未被负载的灯盏花素。
通过透射电镜观察到载药胶束的粒径为300-500nm，其Zeta电位为29.2mV，载药量为42％，负载率为83％；灯盏花素在水中的溶解度为1.18g/L，它在PBS(pH6.2)溶液中的缓释时间约为12小时。
实施例3
如图5所示，难溶性中药灯盏花素制备水溶性纳米制剂的方法如下：
(1)将5克Chit-BA置于圆底烧瓶，加入150毫升磷酸盐缓冲液(pH6.2)，于15℃下不断搅拌使Chit-BA溶胀、溶解。
(2)将1.5克灯盏花素(西昌杰象药物原料有限公司)溶解于35毫升乙醇中，制备成溶液。
(3)将步骤(2)得到的溶液在搅拌下(100转/分)滴加到步骤(1)的溶液中，再滴加2000毫升磷酸盐缓冲液(pH6.2)，滴加完毕后继续搅拌16小时。
(4)将步骤(3)得到的溶液升温至40℃，于20mmHg真空度减压蒸馏除去乙醇。
(5)将步骤(4)得到的悬浮液进行离心(6000转/分)10分钟，上清液为负载灯盏花素的纳米载药胶束溶液，沉淀为未被负载的灯盏花素。
通过透射电镜观察到载药胶束的粒径为100-200nm，其Zeta电位为25.6mV，载药量为30％，负载率为100％；灯盏花素在水中的溶解度为0.70g/L，它在PBS(pH6.2)溶液中的缓释时间约为12小时。
实施例4
如图5所示，难溶性中药灯盏花素制备水溶性纳米制剂的方法如下：
(1)将1克Chit-BA置于圆底烧瓶，加入50毫升去离子水，于20℃下不断搅拌使Chit-BA溶胀、溶解。
(2)将0.5克灯盏花素(西昌杰象药物原料有限公司)溶解于10毫升四氢呋喃中，制备成溶液。
(3)将步骤(2)得到的溶液在搅拌下(300转/分)滴加到步骤(1)的溶液中，再滴加300毫升去离子水，滴加完毕后继续搅拌12小时。
(4)将步骤(3)得到的溶液升温至40℃，于15mmHg真空度减压蒸馏除去四氢呋喃。
(5)将步骤(4)得到的悬浮液进行离心(2500转/分)30分钟，上清液为负载灯盏花素的纳米载药胶束溶液，沉淀为未被负载的灯盏花素。
通过透射电镜观察到载药胶束的粒径为300-500nm，其Zeta电位为29.0mV，载药量为40％，负载率为80％；灯盏花素在水中的溶解度为1.14g/L，它在PBS(pH6.2)溶液中的缓释时间约为12小时。
实施例5
如图5所示，难溶性中药灯盏花素制备水溶性纳米制剂的方法如下：
(1)将8克Chit-BA置于圆底烧瓶，加入500毫升甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH8.6)，于25℃下不断搅拌使Chit-BA溶胀、溶解。
(2)将4克灯盏花素(西昌杰象药物原料有限公司)溶解于40毫升异丙醇中，制备成溶液。
(3)将步骤(2)得到的溶液在搅拌下(1000转/分)滴加到步骤(1)的溶液中，再滴加2500毫升甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH8.6)，滴加完毕后继续搅拌36小时。
(4)将步骤(3)得到的溶液升温至45℃，于20mmHg真空度减压蒸馏除去异丙醇。
(5)将步骤(4)得到的悬浮液进行离心(3000转/分)20分钟，上清液为负载灯盏花素的纳米载药胶束溶液，沉淀为未被负载的灯盏花素。
通过透射电镜观察到载药胶束的粒径为400-500nm，其Zeta电位为30.3mV，载药量为43％，负载率为85％；灯盏花素在水中的溶解度为1.13g/L，它在PBS(pH6.2)溶液中的缓释时间约为12小时。
实施例6
如图5所示，难溶性中药姜黄素制备水溶性纳米制剂的方法如下：
(1)将4克Chit-BA置于圆底烧瓶，加入150毫升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.8)，于30℃下不断搅拌使Chit-BA溶胀、溶解。
(2)将2.0克姜黄素(Sigma-Aldrich公司)溶解于30毫升异丙醇中，制备成溶液。
(3)将步骤(2)得到的溶液在搅拌下(600转/分)滴加到步骤(1)的溶液中，再滴加1500毫升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.8)，滴加完毕后继续搅拌20小时。
(4)将步骤(3)得到的溶液升温至40℃，于15mmHg真空度减压蒸馏除去异丙醇。
(5)将步骤(4)得到的悬浮液进行离心(1500转/分)50分钟，上清液为负载姜黄素的纳米载药胶束溶液，沉淀为未被负载的姜黄素。通过透射电镜观察到载药胶束的粒径为100-150nm，其Zeta电位为27.2mV，载药量为30％，负载率为60％；姜黄素在水中的溶解度为0.73g/L，它在PBS(pH6.2)/乙醇(4/1，v/v)溶液中的缓释时间约为150小时。
实施例7
如图5所示，难溶性中药姜黄素制备水溶性纳米制剂的方法如下：
(1)将9克Chit-BA置于圆底烧瓶，加入400毫升生理盐水，于25℃下不断搅拌使Chit-BA溶胀、溶解。
(2)将4克姜黄素(Sigma-Aldrich公司)溶解于45毫升四氢呋喃中，制备成溶液。
(3)将步骤(2)得到的溶液在搅拌下(250转/分)滴加到步骤(1)的溶液中，再滴加2800毫升生理盐水，滴加完毕后继续搅拌30小时。
(4)将步骤(3)得到的溶液升温至45℃，于20mmHg真空度减压蒸馏除去四氢呋喃。
(5)将步骤(4)得到的悬浮液进行离心(3000转/分)30分钟，上清液为负载姜黄素的纳米载药胶束溶液，沉淀为未被负载的姜黄素。
通过透射电镜观察到载药胶束的粒径为50-100nm，其Zeta电位为26.5mV，载药量为27％，负载率为60％；姜黄素在水中的溶解度为0.75g/L，它在PBS(pH6.2)/乙醇(4/1，v/v)溶液中的缓释时间约为140小时。
实施例8
如图5所示，难溶性中药姜黄素制备水溶性纳米制剂的方法如下：
(1)将5克Chit-BA置于圆底烧瓶，加入200毫升去离子水于15℃下不断搅拌使Chit-BA溶胀、溶解。
(2)将3克姜黄素(Sigma-Aldrich公司)溶解于40毫升乙醇中，制备成溶液。
(3)将步骤(2)得到的溶液在搅拌下(500转/分)滴加到步骤(1)的溶液中，再滴加1800毫升去离子水，滴加完毕后继续搅拌36小时。
(4)将步骤(3)得到的溶液升温至40℃，于20mmHg真空度减压蒸馏除去乙醇。
(5)将步骤(4)得到的悬浮液进行离心(5500转/分)30分钟，上清液为负载姜黄素的纳米载药胶束溶液，沉淀为未被负载的姜黄素。
通过透射电镜观察到载药胶束的粒径为100-150nm，其Zeta电位为27.0mV，载药量为30％，负载率为50％；姜黄素在水中的溶解度为0.75g/L，它在PBS(pH6.2)/乙醇(4/1，v/v)溶液中的缓释时间约为150小时。
实施例9
如图5所示，难溶性中药姜黄素制备水溶性纳米制剂的方法如下：
(1)将2克Chit-BA置于圆底烧瓶，加入150毫升磷酸盐缓冲液(pH5.8)，于28℃下不断搅拌使Chit-BA溶胀、溶解。
(2)将1克姜黄素(Sigma-Aldrich公司)溶解于30毫升甲醇中，制备成溶液。
(3)将步骤(2)得到的溶液在搅拌下(800转/分)滴加到步骤(1)的溶液中，再滴加850毫升磷酸盐缓冲液(pH5.8)，滴加完毕后继续搅拌24小时。
(4)将步骤(3)得到的溶液升温至45℃，于15mmHg真空度减压蒸馏除去甲醇。
(5)将步骤(4)得到的悬浮液进行离心(6000转/分)20分钟，上清液为负载姜黄素的纳米载药胶束溶液，沉淀为未被负载的姜黄素。
通过透射电镜观察到载药胶束的粒径为50-100nm，其Zeta电位为26.2mV，载药量为27％，负载率为53％；姜黄素在水中的溶解度为0.53g/L，它在PBS(pH6.2)/乙醇(4/1，v/v)溶液中的缓释时间约为140小时。
实施例10
如图5所示，难溶性中药姜黄素制备水溶性纳米制剂的方法如下：
(1)将7克Chit-BA置于圆底烧瓶，加入250毫升蒸馏水，于30℃下不断搅拌使Chit-BA溶胀、溶解。
(2)将3.5克姜黄素(Sigma-Aldrich公司)溶解于35毫升丙酮中，制备成溶液。
(3)将步骤(2)得到的溶液在搅拌下(500转/分)滴加到步骤(1)的溶液中，再滴加2200毫升蒸馏水，滴加完毕后继续搅拌30小时。
(4)将步骤(3)得到的溶液升温至35℃，于20mmHg真空度减压蒸馏除去丙酮。
(5)将步骤(4)得到的悬浮液进行离心(4500转/分)40分钟，上清液为负载姜黄素的纳米载药胶束溶液，沉淀为未被负载的姜黄素。
通过透射电镜观察到载药胶束的粒径为50-100nm，其Zeta电位为26.4mV，载药量为28％，负载率为55％；姜黄素在水中的溶解度为0.78g/L，它在PBS(pH6.2)/乙醇(4/1，v/v)溶液中的缓释时间约为144小时。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.含有环状结构的难溶性中药制备水溶性纳米制剂的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)在含胆汁酸疏水基团的两亲性壳聚糖衍生物中加入水溶液，不断搅拌使之溶胀、溶解；
(2)将含有环状结构的难溶性中药溶解于有机溶剂中，制备成中药溶液；
(3)将步骤(2)得到的中药溶液在搅拌下滴加到步骤(1)的溶液中，再滴加水溶液，滴加完毕后继续搅拌；
(4)将步骤(3)得到的溶液进行减压蒸馏，除去有机溶剂；
(5)将步骤(4)得到的悬浮液进行离心，上清液为负载中药的纳米载药胶束溶液，沉淀为未被负载的中药。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述两亲性壳聚糖衍生物中脱氧胆酸基团为5％，通过芘荧光探针法测定该壳聚糖衍生物在水中自聚集形成胶束的临界聚集浓度为0.32mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述两亲性壳聚糖衍生物的重量为1～10克，水溶液体积为50～500毫升，搅拌温度为15～35℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)和(3)中，所述水溶液为去离子水、蒸馏水、生理盐水、pH3.0～4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH4.9～7.0的磷酸盐缓冲液、pH7.1～8.0的Tris-盐酸缓冲液、pH8.6～9.4的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述难溶性中药的重量为0.5～5.0克，有机溶剂体积为10～50毫升。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮和四氢呋喃中的一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述难溶性中药为灯盏花素、姜黄素、紫杉醇、喜树碱和冬凌草甲素中的一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述水溶液体积为300～3000毫升，搅拌速度为100～1000转/分；所述滴加完毕后继续搅拌12～48小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述减压蒸馏温度为35～50℃，真空度为10～30mmHg。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述离心条件是转速为1000～6000转/分，时间为10～60分。
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|---|---|
| CN (1) | CN101810564A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102241790A (zh) * | 2011-06-13 | 2011-11-16 | 中山大学 | 一种两亲性壳聚糖衍生物及其制备方法和应用 |
| CN102657874A (zh) * | 2012-02-15 | 2012-09-12 | 中山大学 | 用于修复神经损伤的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物及其制备方法 |
| CN102961322A (zh) * | 2012-10-12 | 2013-03-13 | 杭州普施康生物科技有限公司 | 一种载药混合胶束 |
| CN107638388A (zh) * | 2017-09-21 | 2018-01-30 | 浙江省医学科学院 | 一种积雪草酸壳聚糖去氧胆酸嫁接物胶束及制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050008323A (ko) * | 2003-07-15 | 2005-01-21 | 주식회사 자광 | 소수성기를 함유한 키토산 복합체 및 그의 제조방법 |
| WO2007086651A1 (en) * | 2006-01-26 | 2007-08-02 | Jae-Woon Nah | Anti-cancer agent loaded hydrophobic bile acid conjugated hydrophilic chitosan oligosaccharide nanoparticles and preparation method thereof |
| DE102006035618A1 (de) * | 2006-07-31 | 2008-02-07 | Curevac Gmbh | Nukleinsäure der Formel (I): GlXmGn, insbesondere als immunstimulierendes Adjuvanz |
| KR20080095183A (ko) * | 2007-04-23 | 2008-10-28 | 한국과학기술연구원 | 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조영제 |
-
2010
- 2010-03-29 CN CN 201010138683 patent/CN101810564A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050008323A (ko) * | 2003-07-15 | 2005-01-21 | 주식회사 자광 | 소수성기를 함유한 키토산 복합체 및 그의 제조방법 |
| WO2007086651A1 (en) * | 2006-01-26 | 2007-08-02 | Jae-Woon Nah | Anti-cancer agent loaded hydrophobic bile acid conjugated hydrophilic chitosan oligosaccharide nanoparticles and preparation method thereof |
| DE102006035618A1 (de) * | 2006-07-31 | 2008-02-07 | Curevac Gmbh | Nukleinsäure der Formel (I): GlXmGn, insbesondere als immunstimulierendes Adjuvanz |
| KR20080095183A (ko) * | 2007-04-23 | 2008-10-28 | 한국과학기술연구원 | 근적외선 형광체가 결합된 담즙산-글라이콜키토산 복합체나노입자를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조영제 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102241790A (zh) * | 2011-06-13 | 2011-11-16 | 中山大学 | 一种两亲性壳聚糖衍生物及其制备方法和应用 |
| CN102657874A (zh) * | 2012-02-15 | 2012-09-12 | 中山大学 | 用于修复神经损伤的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物及其制备方法 |
| CN102961322A (zh) * | 2012-10-12 | 2013-03-13 | 杭州普施康生物科技有限公司 | 一种载药混合胶束 |
| CN107638388A (zh) * | 2017-09-21 | 2018-01-30 | 浙江省医学科学院 | 一种积雪草酸壳聚糖去氧胆酸嫁接物胶束及制备方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20100825 |