CN102657874A - 用于修复神经损伤的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物及其制备方法 - Google Patents
用于修复神经损伤的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种用于修复神经损伤的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物，采用Lingo-1 RNAi联合水凝胶生物支架及释放的策略，RNAi干扰Lingo-1协同水凝胶促进脊髓损伤轴突再生，为脊髓损伤修复提供了新的治疗途径。本发明还公开了所述水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的制备方法，所述方法操作方便，易于实现。同时，本发明又公开了所述水凝胶包裹慢病毒Lingo-1RNAi复合物在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种水凝胶和慢病毒Lingo-1 RNAi的复合物及其制备方法，尤其是一种水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物及其制备方法。
背景技术
根据可靠的流行病统计，美国约有脊髓损伤病人25万，且年增1.1万名新患者，每年新发病率为十万分之四。据此推算，全世界至少年新增24万名脊髓损伤病人。
我国是世界人口大国，脊髓损伤病人数量也居世界第一。根据我国国家生产安全委员会的初步统计，每年由于生产事故所造成的脊髓损伤患者就达5-6万人，因交通事故造成的脊髓损伤病人多达7-8万人。据有关资料，我国脊髓损伤患者已达100万人。对于这些患者来说，即使通过治疗能够使患者的生命得以延续，但脊髓损伤导致的终身残疾给家庭及社会造成沉重的负担，也严重地影响患者的生活质量。在世界上，神经损伤后的再生修复一直是神经科学研究中的一项重要课题，脊髓损伤修复的研究已有近百年的历史。解决脊髓损伤后的中枢神经修复和功能重建，是各国医学界普遍关注并投入巨资广泛研究的重大难题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种对脊髓损伤修复具有显著效果的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物；同时，本发明还提供一种所述水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种水凝胶包裹慢病毒Lingo-1RNAi复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)慢病毒Lingo-1 RNAi的构建；
(2)水凝胶的制备：将水凝胶与去离子水在无菌条件下配制成质量比为20％～25％的混悬液，将混悬液置于2-8℃至水凝胶充分溶解，过滤除菌，得水凝胶原液；
(3)将步骤(1)构建的慢病毒Lingo-1 RNAi与步骤(2)制备的水凝胶原液在2～8℃以每毫升水凝胶原液中含1×107TU的慢病毒Lingo-1 RNAi的浓度混合，搅拌使其充分混合，得混合液；
(4)取步骤(3)得到的混合液以200μL每孔加至24孔板，使其平铺孔底，放置于25℃～37℃培养箱温育3-5min，取出后，孔底形成不透明薄胶状物，即得水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物。
所述慢病毒Lingo-1 RNAi与水凝胶原液的混合液在温度＞25℃、≤37℃即可形成凝胶(成胶化)，因此该混合物在液体状态下移植在体内温度下易于随损伤部位裂隙形状胶化成形，并对局部缺损脊髓起固定力学支撑作用，有效防止瘢痕形成和扩大。采用上述方法得到的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物胶化后内部形成三维孔洞，为神经再生延伸及突触形成提供了有利条件。同时，该复合物负载慢病毒Lingo-1 RNAi局部胶化后可有效防止慢病毒Lingo-1 RNAi流失，并持续释放，有效维持局部感染病毒滴度，阻抑髓鞘抑制因子抑制性信号转导，促进神经再生和髓鞘形成。
上述方法中所述水凝胶原液一般情况下储存于2-8℃的环境(如医用冰箱、冷藏柜等)，所述慢病毒Lingo-1 RNAi储存于液氮或-80℃环境，制备所述复合物时，将水凝胶原液和慢病毒Lingo-1 RNAi按一定比例混合，搅拌使充分混合即可。上述方法中所用水凝胶原液、慢病毒Lingo-1 RNAi及制备所得水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物，储存及运输方便。
步骤(4)中在孔底形成不透明薄胶状物，即水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi混合液成胶化，荧光显微镜下观察有绿色小颗粒或点状物质均匀分布于水凝胶中，即证明包裹成功。以上步骤均在无菌条件下操作。
慢病毒Lingo-1 RNAi的构建方法参见文献Mi S，Miller RH，Lee X，et a1.LINGO-1 negatively regulatesmyelination by oligodendrocytes.Nat Neurosci，2005，8(6)：745-751。其中绿色荧光蛋白(GFP)标记慢病毒改用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记。
作为本发明所述水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的制备方法的优选实施方式，所述RNAi的核苷酸序列为：
UCGAGAAAAAAAAGCACAACAUCGAAAUUGAAUCUCUUGAAUUCAAUUUCGAUGUUGUGCUUA。
RNAi的核苷酸序列：
RNAi的核苷酸序列设计细节：
| gene | 物种 | TargetSeq | GC％ |
| Lingo1 | rat | GCACAACAUCGAAAUUGAA | 36.84％ |
与现有公开的RNAi的核苷酸序列相比，采用上述序列的RNAi时，其中GC含量低，针对靶点特异性高，能有效消减抑制Lingo-1基因的表达。
作为本发明所述水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的制备方法的优选实施方式，所述水凝胶为Pluronic F-127水凝胶。
温敏型水凝胶是一种具有智能性质的新型水凝胶，能对环境温度变化产生响应，在一定温度条件下可由液态转变为多孔三维结构的凝胶态，兼具药物和生物分子释放递送系统以及生物支架的双重作用，并已在脊髓损伤动物模型得到应用。Pluronic F127温敏型水凝胶是近年国际上应用和发展势头良好的一种新型智能生物材料，它是一种人工合成的温度敏感性水凝胶，其特点是无毒，生物相容性好，可生物降解吸收，已经美国FDA批准在人类使用。Pluronic F-127已广泛用于药物输送和控释应用，并有研究使用Pluronic F-127在动物体内构建组织工程软骨和肺，并可在体外作为干细胞三维培养诱导分化的生物支架。采用Pluronic F-127水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi形成的复合物，胶化后内部形成三维孔洞，为神经再生延伸及突触形成提供了有利条件。
作为本发明所述水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，将混悬液置于4℃至水凝胶充分溶解后，采用0.22μm孔径的瓶盖式过滤器过滤除菌。
本发明还提供一种采用上述方法制备而成的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1RNAi复合物，所述复合物由水凝胶原液和慢病毒Lingo-1 RNAi的混合液制备而成，每毫升水凝胶原液中含1×107TU的慢病毒Lingo-1 RNAi，所述水凝胶原液中含有的水凝胶与去离子水的质量比为20％～25％。
作为本发明所述水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的优选实施方式，所述RNAi的核苷酸序列为：
UCGAGAAAAAAAAGCACAACAUCGAAAUUGAAUCUCUUGAAUUCAAUUUCGAUGUUGUGCUUA。
作为本发明所述水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的优选实施方式，所述水凝胶为Pluronic F-127水凝胶。
Pluronic F127水凝胶具有较佳的生物相容性，且有稳定性好，可降解等优点，可作为脊髓损伤模型轴突生长的生物支架。Pluronic F127是一种中性的无毒的水溶性的聚合物，它有良好的材料结晶性能、力学性能以及生物相容性，降低了细胞毒性，还体现出对温度的敏感性，可控制释放负载物质，还可以作为桥接支架，促进移植细胞和再生轴突的生长。用Pluronic F127水凝胶复合负载递送慢病毒Lingo-1 RNAi，既能利用水凝胶的生物支架作用，填补脊髓损伤裂隙，为轴突生长提供三维空间和一定的力学支撑，又可利用水凝胶的递送控释而实现慢病毒Lingo-1 RNAi精确化递送于损伤局部，容易达到有效浓度，预期能达到较高的转染成功率和明显基因沉默效果。
本发明还提供一种水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用，所述复合物采用上述方法制备而成。采用上述方法制备的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物胶化后内部形成三维孔洞，而且该复合物负载慢病毒Lingo-1 RNAi局部胶化后可有效防止慢病毒Lingo-1 RNAi流失，并持续释放，为神经再生延伸及突触形成提供了有利条件，可有效用于因坠落、车祸、工伤、体育运动等意外或事故造成的脊柱脊髓损伤患者。
作为本发明所述水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物在制备治疗脊髓损伤药物中的应用的优选实施方式，所述RNAi的核苷酸序列为：
UCGAGAAAAAAAAGCACAACAUCGAAAUUGAAUCUCUUGAAUUCAAUUUCGAUGUUGUGCUUA。
作为本发明所述水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物在制备治疗脊髓损伤药物中的应用的优选实施方式，所述水凝胶为Pluronic F-127水凝胶。
目前拮抗Lingo-1基因的策略有：Lingo-1显性失活、基因敲除、RNA干扰Lingo-1及可溶性Lingo-1-Fc等的多种选择，其中基因敲除和显性失活等措施只能限制在实验室研究用。应用可溶性Lingo-1-Fc拮抗Lingo-1是一个很有前景的领域，美国Biogen Idec公司以首席科学家Sha Mi为首的课题组正在联合攻关研发对抗Lingo-1治疗多发性硬化的抗体药物。目前可溶性Lingo-1-Fc主要是从CHO细胞株制备单克隆抗体而获得，但抗体用于脊髓损伤的不足是需微泵持续鞘内注射给药，无论在动物研究还是在临床应用中都存在操作不便、经过一段时间后需要更换微泵、易引起外源性感染等问题，且疗效维持时间短。不足为奇的是，在用抗体治疗的预临床和临床的研究中存在着效率低的困难，单克隆抗体因其分子量大，比起小分子来，更不易侵入组织与相应抗原结合达到理想的拮抗效果。鉴于可溶性Lingo-1-Fc重组抗体在实际应用中的不足，我们认为在体内用RNA干扰Lingo-1以促进脊髓损伤神经修复可能是更具应用潜力的方向。但是这并不意味着在体内用RNA干扰Lingo-1即能取得立竿见影的效果，实际上体内RNAi的最大难题是递送，即如何有效将siRNA传递到目标细胞内。一个好的递送系统应能将siRNA导向指定的靶器官和靶细胞，有效的转染细胞，并且还要解决好毒性和靶向的问题。为解决这个问题，我们采用温敏型水凝胶负载Lingo-1 RNAi协同修复脊髓损伤，使慢病毒Lingo-1 RNAi被水凝胶包裹而定位植入作用于损伤局部，持续释放，达到在水凝胶植入同时局部维持Lingo-1RNAi慢病毒有效转染浓度的要求，避免其他递送途径很难保证在损伤局部达到足够浓度实现有效转染的缺点。
本发明所述水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物，采用Lingo-1 RNAi联合水凝胶生物支架及释放的策略，RNAi干扰Lingo-1协同水凝胶促进脊髓损伤轴突再生，为脊髓损伤修复提供了新的治疗途径。
附图说明
图1为对照组采用荧光免疫染色法观察目的基因Lingo-1蛋白表达的荧光显微镜像图。
图2为实验组采用荧光免疫染色法观察目的基因Lingo-1蛋白表达的荧光显微镜像图。
图3为对照组采用尼氏染色观察神经元的显微镜像图。
图4为实验组采用尼氏染色观察神经元的显微镜像图。
图5为对照组采用电镜观察髓鞘形成的超微结果镜像图。
图6为实验组采用电镜观察髓鞘形成的超微结构镜像图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述。
实施例1水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的制备
(1)慢病毒Lingo-1 RNAi的构建：慢病毒Lingo-1 RNAi的构建方法参见文献Mi S，Miller RH，Lee X，et al.LINGO-1 negatively regulatesmyelination byoligodendrocytes.Nat Neurosci，2005，8(6)：745-751.其中绿色荧光蛋白(GFP)标记慢病毒改用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记；
(2)水凝胶的制备：将水凝胶与去离子水在无菌条件下配制成质量比为20％～25％的混悬液，将混悬液置于2～8℃至水凝胶充分溶解，用0.22μm孔径的瓶盖式过滤器过滤除菌，得水凝胶原液；
(3)将步骤(1)构建的慢病毒Lingo-1 RNAi与步骤(2)制备的水凝胶原液在2～8℃以每毫升水凝胶原液中含1×107TU的慢病毒Lingo-1 RNAi的浓度混合，搅拌使其充分混合，得混合液；
(4)取步骤(3)得到的混合液以200μL每孔加至24孔板，使其平铺孔底，放置于温度25℃～37℃培养箱温育3-5min，取出后，孔底形成不透明薄胶状物，即得水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物。
上述RNAi的核苷酸序列为：
UCGAGAAAAAAAAGCACAACAUCGAAAUUGAAUCUCUUGAAUUCAAUUUCGAUGUUGUGCUUA；
上述水凝胶采用Pluronic F-127水凝胶；以上操作均在无菌条件下进行。
实施例2水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的制备
本实施例与实施例1所述的方法相同，区别仅在于：本实施例采用的水凝胶为PNIPAm水凝胶。
实施例3水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物对脊髓损伤的修复试验
1、脊髓全横断损伤大鼠模型制备
在雌性成年SD大鼠腹腔内注射1％戊巴比妥钠(30mg/kg)施行麻醉暴露T8-T10两侧椎板去除T9椎板暴露T10脊髓段用尖刃(11号)手术刀快速全横断脊髓距离此刀口2mm处再次用手术刀全横断脊髓用尖镊将两刀口之间的脊髓组织轻轻夹出，充分止血，依肌层皮下组织和皮肤顺序逐层缝合伤口。每只动物肌肉注射青霉素16万单位1ml/d硫酸庆大霉素25万单位0.5ml/d连续3d人工排尿23次/d。常温条件下定时给予鼠粮、清水喂饲。
2、水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物局部注射
采用本发明实施例1制备所得水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物，用微量注射器吸取10μ所述水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物，在脊髓全横断损伤大鼠模型损伤原位空隙注射，注射速度正常，注射完毕后，静置大鼠10分钟左右，再逐层缝合，标准条件饲养。
3、水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物感染效果观察
大鼠模型局部注射水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi混合物3d后，用4℃预冷的0.01mol/LPBS左心室灌注，取损伤部位上下共约1cm脊髓，置20％蔗糖溶液脱水，待标本沉底后再取出置于30％蔗糖溶液脱水，再行冰冻切片，纵切，片厚5μm，Hoechst33342染核，于荧光显微镜下观察到从断段沿纵切面有绿色荧光点分布，结合Hoechst33342染核结果，部分已感染细胞，部分在细胞间质，感染成功。
4、水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物修复大鼠脊髓损伤试验
实验组：采用本发明实施例1制备所得水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi混合液，37℃水浴温育3-5min至形成不透明胶冻物，即水凝胶包裹慢病毒Lingo-1RNAi复合物，用微量注射器吸取，在脊髓全横断损伤大鼠模型损伤原位空隙注射，注射速度正常，注射完毕后，静置大鼠10分钟左右，再逐层缝合，标准条件饲养。
对照组：给予同等剂量的PBS。
(1)荧光免疫染色法观察目的基因Lingo-1的蛋白表达
各组动物模型麻醉后用4℃预冷的0.01mol/LPBS左心室灌注，取损伤部位上下共约1cm脊髓，置20％蔗糖溶液脱水，待标本沉底后再取出置于30％蔗糖溶液脱水，再行冰冻切片，纵切，片厚5μm，Hoechst33342染核，于荧光显微镜下观察。结果显示对照组脊髓损伤后损伤局部附近脊髓细胞Lingo-1(红色)阳性表达较多(见附图1)；实验组Pluronic F-127水凝胶与慢病毒Lingo-1 RNAi复合物植入脊髓全横断大鼠模型后脊髓损伤局部附近脊髓细胞Lingo-1(红色)基本检测不到表达(见附图2)。
由附图1和2所示可看出，Pluronic F-127水凝胶负载慢病毒Lingo-1 RNAi植入能有效抑制受损脊髓局部Lingo-1分子的表达。
(2)尼氏染色观察神经元
各组动物模型麻醉后用4℃预冷的0.01mol/LPBS左心室灌注，取损伤部位上下共约1cm脊髓，置20％蔗糖溶液脱水，待标本沉底后再取出置于30％蔗糖溶液脱水，再行冰冻切片，分别行横切(用于观察脊髓横截面脊髓前角运动神经元)，纵切(用于观察脊髓纵切面神经元)，片厚5μm，存-20度冰箱。用时从-20度冰箱取出片子以后，用PBS洗涤3次后，由低到高再到低浓度梯度酒精，每次数分钟，目的是脱脂。然后在60度0.5％的甲苯氨蓝中染色30分钟，然后梯度酒精脱水。显微镜下观察脊髓横截面脊髓前角运动神经元计数实验组数量明显多于对照组，有明显差异(表1)。显微镜下观察脊髓纵切面神经元对照组脊髓损伤后损伤局部神经元数量较少，多数胞体内尼氏小体消失(见附图3)；实验组Pluronic F-127水凝胶与慢病毒Lingo-1 RNAi复合物植入脊髓全横断大鼠模型后，局部神经元数量多，细胞内可见较清晰的尼氏小体(见附图4)。
表1前角运动神经元数量(个)(x±s)
| 实验组 | 对照组 | |
| 神经元计数 | 20.4±0.82 | 10.3±0.45 |
P＜0.01
由表1可看出，实验组运动神经元数量明显多于对照组，结合附图3和4可知，Pluronic F-127水凝胶与慢病毒Lingo-1 RNAi复合物移植对脊髓损伤大鼠脊髓神经元存活有显著保护作用。
(3)BBB评分
参照Basso等提出的大鼠SCI后功能评价标准(简称BBB评分法)对各组实验动物后肢的运动功能进行评分。BBB评分标准是美国Ohio大学研究人员于1995年正式提出了一种新的神经功能评定法——BBB评分法。它将大鼠后肢运动分为22个等级。后肢全瘫为0分，完全正常为21分。因其评分设计科学，易于操作，故常用于评价脊髓损伤后大鼠的运动功能恢复情况。脊髓损伤后1、7、14、28d对不同处理组大鼠运动功能恢复进行BBB评分，结果显示实验组在7、14、28d其运动功能恢复BBB评分均明显优于对照组，有明显差异(p＜0.01)(结果见表2)。
表2脊髓损伤不同处理组BBB评分(x±s)
| 对照组 | 实验组 | |
| 1d | 0±0.32 | 0±0.35 |
| 7d | 5.8±0.25 | 7.5±0.14* |
| 14d | 7.4±0.42 | 10.6±0.54* |
| 28d | 9.8±0.52 | 13.0±0.29* |
*p＜0.01
由表2可看出，实验组在7、14、28d其运动功能恢复BBB评分均明显优于对照组，有明显差异(p＜0.01)，由此可看出，水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物对脊髓损伤大鼠运动功能恢复有明显改善作用。
(4)电镜观测髓鞘形成
3.5％水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉动物，打开胸腔暴露其心脏进行灌流固定，用4％戊二醛再固定4h，1％锇酸后固定1小时，逐级酒精丙酮梯度脱水，环氧树脂618#包埋，超薄切片，片厚50nm，橘掾酸铅、醋酸铀双重染色，透射电镜观察超微结构变化。脊髓损伤后利用电镜观察不同处理组脊髓超微结构，对照组脊髓损伤后轴突髓鞘板层松散、厚度变薄、分布稀疏、线粒体膨大，见附图5所示；实验组Pluronic F-127水凝胶与慢病毒Lingo-1 RNAi复合物植入脊髓全横断大鼠模型后，轴突髓鞘较致密，厚度正常，见附图6所示。由附图5和附图6可知，水凝胶与慢病毒Lingo-1 RNAi复合物植入对脊髓受损局部神经轴突及髓鞘等超微结构有保护作用。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种用于修复神经损伤的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)慢病毒Lingo-1 RNAi的构建；
(2)水凝胶的制备：将水凝胶与去离子水在无菌条件下配制成质量比为20％～25％的混悬液，将混悬液置于2-8℃至水凝胶充分溶解，过滤除菌，得水凝胶原液；
(3)将步骤(1)构建的慢病毒Lingo-1 RNAi与步骤(2)制备的水凝胶原液在2～8℃以每毫升水凝胶原液中含1×107TU的慢病毒Lingo-1 RNAi的浓度混合，搅拌使其充分混合，得混合液；
(4)取步骤(3)得到的混合液以200μL每孔加至24孔板，使其平铺孔底，放置于25℃～37℃培养箱温育3-5min，取出后，孔底形成不透明薄胶状物，即得水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物。
2.如权利要求1所述的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的制备方法，其特征在于，所述RNAi的核苷酸序列为：
UCGAGAAAAAAAAGCACAACAUCGAAAUUGAAUCUCUUGAAUUCAAUUUCGAUGUUGUGCUUA。
3.如权利要求1所述的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的制备方法，其特征在于，所述水凝胶为Pluronic F-127水凝胶。
4.如权利要求1所述的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将混悬液置于4℃至水凝胶充分溶解后，采用0.22μm孔径的瓶盖式过滤器过滤除菌。
5.一种采用如权利要求1所述方法制备得到的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1RNAi复合物，其特征在于，所述复合物由水凝胶原液和慢病毒Lingo-1 RNAi的混合液制备而成，每毫升水凝胶原液中含1×107TU的慢病毒Lingo-1 RNAi，所述水凝胶原液中含有的水凝胶与去离子水的质量比为20％～25％。
6.如权利要求5所述的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物，其特征在于，所述RNAi的核苷酸序列为：
UCGAGAAAAAAAAGCACAACAUCGAAAUUGAAUCUCUUGAAUUCAAUUUCGAUGUUGUGCUUA。
7.如权利要求5所述的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物，其特征在于，所述水凝胶为Pluronic F-127水凝胶。
8.一种采用如权利要求1所述方法制备得到的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1RNAi复合物在制备治疗脊髓损伤的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的应用，其特征在于，所述RNAi的核苷酸序列为：
UCGAGAAAAAAAAGCACAACAUCGAAAUUGAAUCUCUUGAAUUCAAUUUCGAUGUUGUGCUUA。
10.如权利要求8所述的水凝胶包裹慢病毒Lingo-1 RNAi复合物的应用，其特征在于，所述水凝胶为Pluronic F-127水凝胶。
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