CN109847069A - 用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物及制备方法 - Google Patents
用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体涉及用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF‑1α过表达慢病毒载体复合物及制备方法。该用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF‑1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,包括步骤一,HIF‑1α过表达慢病毒载体的合成;步骤二,水凝胶原液的制备;步骤三,水凝胶与HIF‑1α过表达慢病毒载体复合物的制备。该制备方法制得的水凝胶包裹HIF‑1α过表达慢病毒载体复合物,能实现HIF‑1α过表达慢病毒载体的局部递送、缓释的作用,并为BPA后神经再生修复和血运重建提供有利影响,并实现BPA损伤局部HIF‑1α基因的过表达,有效促进BPA损伤修复,促进血管新生及运动功能恢复。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物及其制备方法。
背景技术
臂丛神经根性撕脱(Brachial Plexus Avulsion,BPA)是一种严重的中枢- 外周神经系统交界性损伤,随着现代交通的日益发达,事故导致的臂丛神经根性撕脱伤患者日渐增多。神经根从脊髓离断后,常伴有大量运动神经元(motor neurons,MNs)丢失死亡,导致上肢运动感觉功能障碍,极大地影响患者的生活质量(Wang et al.,2015)。由于BPA病情复杂,且解剖位置特殊,目前对于此类患者的治疗重点多集中在神经损伤的治疗。外科多采用神经根移植即将撕脱的神经根或移植神经桥接再植入脊髓,促进中枢神经元轴突再生和神经环路重建,虽可不同程度促进神经功能恢复,但疗效仍不令人满意(Bertelli andMira,1994,Gu et al.,2004)。BPA的治疗常忽略对损伤血管的修复,据文献报导,充足的血供是神经移植成功的关键,血管化神经移植相较无血管化神经移植,肌肉再支配速度快20%(Breidenbach and Terzis, 1984,Bertelli et al.,1996)。因此,保证足够的血供以改善BPA损伤局部缺血缺氧抑制性病理微环境,可为临床治疗BPA损伤提供更有力的理论依据。
低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是一种具有转录活性的核蛋白,其有相当广泛的靶基因谱,其中包括与缺氧适应、炎症发展等相关的近100种靶基因,在帕金森、新生儿脑损伤等疾病中起关键作用(Huang et al.,1998,Scholz andTaylor,2013,Feng et al.,2014,Sun et al.,2017)。已有大量研究证实,HIF-1α参与调控缺血缺氧性损伤的过程(Fan et al.,2009)。 BPA损伤后伴随的血管损伤不仅会延缓神经再生的速度,且加速受损神经支配的靶肌肉萎缩,不利于功能恢复。因此,对BPA运动功能的恢复而言,尽早修复受损血管、恢复血供极为重要。HIF-1α可诱导激活血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,参与血管新生 (Kizaka-Kondohet al.,2003,Gessi et al.,2013,Shan et al.,2013,Li et al., 2017)。文献显示,HIF-1α可通过独立机制对缺血再灌注损伤的神经元产生保护作用(Li et al.,2011)。
此外,臂丛神经根性撕脱导致的局部血运循环障碍,如通过体循环输送的药物在损伤部位不易达到有效药物浓度。为解决这一难题,有研究者尝试将锂或脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)等药物直接注入受损部位(Chen etal.,2013,Fang et al.,2016)。然而,因臂丛神经根撕脱部位隐蔽、狭窄且形状不规则的特点,采用直接注射的方式难以使药物输送至损伤部位且药物流失率高。因此,将药物高效准确释放到损伤局部对BPA的治疗具有重要意义。Pluronic F-127(PF-127)是一种温敏性水凝胶(在适当温度范围内可由液态变成凝胶态),因其生物相容性良好且基本不具有生物毒性,已获美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准上市并广泛应用于组织工程研究(Pandit and McGowan,1998,Hao et al.,2014,Shen et al.,2015)。
目前,临床治疗BPA最常见的方法是神经移植,而单纯进行神经移植手术的疗效往往不令人满意。研究显示,大鼠臂丛神经根撕脱再植后,通过 ISP(细胞内西格玛肽)作为载体全身递送硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs) 的神经受体蛋白酪氨酸磷酸酶-σ(PTPσ),可显著促进神经再生和功能恢复。现阶段研究者尝试采用不同因子对BPA进行治疗,例如神经营养因子如神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和脑源性神经营养因子 (BDNF)等。基于上述研究,神经营养因子虽有益于运动神经元存活,但大剂量的神经营养因子却会阻碍存活神经元轴突再生。HIF-1α基因已被研究者在缺血缺氧损伤方面进行过深入研究,但尚未发现其应用于臂丛撕脱损伤修复的相关报道。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术的不足,提供用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,该制备方法所制得的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物能实现BPA损伤局部HIF-1α基因的过表达,有效促进BPA损伤修复,促进血管新生及运动功能恢复。
本发明的目的之二在于针对现有技术的不足,提供用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物,该用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物能实现BPA损伤局部 HIF-1α基因的过表达,有效促进BPA损伤修复,促进血管新生及运动功能恢复。
为了实现上述目的之一,本发明采用如下技术方案:
提供用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,它包括以下步骤:
步骤一,HIF-1α过表达慢病毒载体的合成:选用由汉恒生物技术有限公司 (中国上海)合成的pHBLV-CMVIE-IRES-Puro作为慢病毒载体用于HIF-1α的过表达,其中,HIF-1α引物序列如下:ggatctatttttggggtgaattcgccaccATGGA GGGCGCCGGCG(正向引物);tagaactagtctcgaggaattcTC AGTTAACTTGATCCAAA(反向引物);
步骤二,水凝胶原液的制备:将PF-127无菌粉末与水配置成一定质量体积比的混悬液,然后对所述混悬液进行振摇直至水凝胶充分溶解得到混合液,然后将所述混合液通过滤膜进行过滤除菌后,得到无菌PF-127水凝胶原液;
步骤三,水凝胶与HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备:将步骤一合成的HIF-1α过表达慢病毒载体与步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液充分搅拌使其混合均匀,并达到一定的浓度,即制得所述用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物。
上述技术方案中,所述步骤一中,所述慢病毒载体的滴度为2×108TU/ mL。
上述技术方案中,所述步骤二中,所述水为去离子水。
上述技术方案中,所述步骤二中,所述混悬液的质量体积比为15%~25%。
上述技术方案中,所述步骤二中,将所述混悬液置于0℃~4℃的水平摇床以60转/分钟~70转/分钟的速度振摇10h~24h直至水凝胶充分溶解得到混合液。
上述技术方案中,所述步骤二中,对混合液进行过滤除菌具体是:取0.20 μm孔径的瓶盖式过滤器套于50mL离心管管口,并将所述瓶盖式过滤器连接上50mL注射器,将上述混合液倒入所述注射器后,利用注射器缓慢推出所述混合液以通过所述瓶盖式过滤器的滤膜进行过滤除菌,过滤除菌后的滤液流入所述离心管,得到无菌PF-127水凝胶原液,并将无菌PF-127水凝胶原液放置于4℃下备用。
上述技术方案中,所述步骤三中,将步骤一合成的HIF-1α过表达慢病毒载体与步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液在0℃~4℃下充分搅拌使其混合均匀,并达到的浓度为2×107TU/mL。
上述技术方案中,所述步骤三中,所制得的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物置于-80℃超低温冰箱或液氮中储存备用。
上述技术方案中,所述步骤二与所述步骤三之间,还包括成胶化性能检测步骤:将装有无菌PF-127水凝胶原液的离心管放置37℃水浴锅中5min,观察无菌PF-127水凝胶原液是否成胶冻状,如能成胶冻状,则说明步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液能用于与HIF-1α过表达慢病毒载体复合。
为了实现上述目的之二,本发明采用如下技术方案:
提供用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物,是由上述所述的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法所制得的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物。
本发明与现有技术相比较,有益效果在于:
(1)本发明提供的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物,实现HIF-1α过表达慢病毒载体的局部递送、缓释的作用,并为BPA后神经再生修复和血运重建提供有利影响。鉴于HIF-1α对血管新生、神经元存活和缺血缺氧适应的积极影响,因此,本发明所制得的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物在臂丛撕脱损伤局部实现HIF-1α过表达将对BPA具有治疗潜力。
(2)本发明提供的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,能实现BPA损伤局部HIF-1α基因的过表达,促进血管新生及运动功能恢复,有望为BPA的治疗带来新希望,并具有工艺方法简单,并能够适用于工业化大规模生产的特点。
(3)目前,临床对BPA的治疗多采用神经根移植的方法,注重神经损伤治疗而忽视了局部血管修复。目前尚未发现联合组织工程及HIF-1α基因修饰治疗BPA的相关研究。因HIF-1α在缺氧适应性及血管新生中等的有利作用,本发明选择PF-127水凝胶作为载体将HIF-1α过表达慢病毒输送至损伤部位,以促进BPA损伤后的神经再生和功能恢复,可达到缓控释作用以提高疗效。本发明可有效促进BPA损伤后神经元存活、神经通路重建、血管新生及运动功能恢复。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
HIF-1是一种异源二聚体,主要由120kD的HIF-1α和91~94kD的HIF-1β两个亚单位组成。HIF-1α基因受缺氧信号的调控,是HIF-1的活性亚基。作为活性亚基的HIF-1α,由826个氨基酸构成,其两个末端是感受缺氧信号的活性调控区域,可见HIF-1α亚基受缺氧调控并调节HIF-1的活性。HIF-1调节的靶基因包括血管内皮生长因子(VEGF)编码基因,其可在体内诱导血管新生。由于BPA损伤部位狭窄隐蔽,为防止注射药物流失,需借助载体将药物输送至损伤局部以达到更好的治疗效果。PF-127水凝胶经美国食品药品监督管理局批准,现已应用于临床眼科或烫伤等疾病的治疗,起到缓控制释放的作用。本发明选用PF-127 作为载体,将HIF-1α过表达慢病毒基因药物缓控释放于BPA损伤局部,实施结果表明,移植该复合物至损伤局部后可有效促进神经元存活、神经通路重建、血管新生及功能恢复,为BPA提供新的治疗思路。
实施例1。
用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,它包括以下步骤:
步骤一,HIF-1α过表达慢病毒载体的合成:选用由汉恒生物技术有限公司 (中国上海)合成的pHBLV-CMVIE-IRES-Puro作为慢病毒载体用于HIF-1α的过表达,其中,HIF-1α引物序列如下:ggatctatttttggggtgaattcgccaccATGGA GGGCGCCGGCG(正向引物);tagaactagtctcgaggaattcTC AGTTAACTTGATCCAAA(反向引物);
步骤二,水凝胶原液的制备:将PF-127无菌粉末与水配置成一定质量体积比的混悬液,然后对所述混悬液进行振摇直至水凝胶充分溶解得到混合液,然后将所述混合液通过滤膜进行过滤除菌后,得到无菌PF-127水凝胶原液;
步骤三,水凝胶与HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备:将步骤一合成的HIF-1α过表达慢病毒载体与步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液充分搅拌使其混合均匀,并达到一定的浓度,即制得所述用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物。
实施例2。
用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,它包括以下步骤:
步骤一,HIF-1α过表达慢病毒载体的合成:选用由汉恒生物技术有限公司 (中国上海)合成的pHBLV-CMVIE-IRES-Puro作为慢病毒载体用于HIF-1α的过表达,其中,HIF-1α引物序列如下:ggatctatttttggggtgaattcgccaccATGGA GGGCGCCGGCG(正向引物);tagaactagtctcgaggaattcTC AGTTAACTTGATCCAAA(反向引物);本实施例中,慢病毒载体的滴度为2 ×108TU/mL。
步骤二,水凝胶原液的制备:将PF-127无菌粉末与去离子水配置成质量体积比为20%的混悬液,然后将所述混悬液置于2℃的水平摇床以65转/分钟的速度振摇18h直至水凝胶充分溶解得到混合液,然后将所述混合液通过滤膜进行过滤除菌后,得到无菌PF-127水凝胶原液;本实施例中,对混合液进行过滤除菌具体是:取0.20μm孔径的瓶盖式过滤器套于50mL离心管管口,并将所述瓶盖式过滤器连接上50mL注射器,将上述混合液倒入所述注射器后,利用注射器缓慢推出所述混合液以通过所述瓶盖式过滤器的滤膜进行过滤除菌,过滤除菌后的滤液流入所述离心管,得到无菌PF-127水凝胶原液,并将无菌PF-127 水凝胶原液放置于4℃下备用。
步骤三,水凝胶与HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备:将步骤一合成的HIF-1α过表达慢病毒载体与步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液在0℃~4℃下充分搅拌使其混合均匀,并达到的浓度为2×107TU/mL,即制得所述用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物。本实施例中,所制得的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物置于-80℃超低温冰箱中储存备用。
其中,步骤二与所述步骤三之间,还包括成胶化性能检测步骤:将装有无菌PF-127水凝胶原液的离心管放置37℃水浴锅中5min,观察无菌PF-127水凝胶原液是否成胶冻状,如能成胶冻状,则说明步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液能用于与HIF-1α过表达慢病毒载体复合。
其中,本实施例制得的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物能实现HIF-1α过表达慢病毒载体的局部递送、缓释的作用,并为BPA后神经再生修复和血运重建提供有利影响。
实施例3。
用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,它包括以下步骤:
步骤一,HIF-1α过表达慢病毒载体的合成:选用由汉恒生物技术有限公司 (中国上海)合成的pHBLV-CMVIE-IRES-Puro作为慢病毒载体用于HIF-1α的过表达,其中,HIF-1α引物序列如下:ggatctatttttggggtgaattcgccaccATGGA GGGCGCCGGCG(正向引物);tagaactagtctcgaggaattcTC AGTTAACTTGATCCAAA(反向引物);本实施例中,慢病毒载体的滴度为2 ×108TU/mL。
步骤二,水凝胶原液的制备:将PF-127无菌粉末与去离子水配置成质量体积比为15%的混悬液,然后将所述混悬液置于0℃的水平摇床以60转/分钟的速度振摇24h直至水凝胶充分溶解得到混合液,然后将所述混合液通过滤膜进行过滤除菌后,得到无菌PF-127水凝胶原液;本实施例中,对混合液进行过滤除菌具体是:取0.20μm孔径的瓶盖式过滤器套于50mL离心管管口,并将所述瓶盖式过滤器连接上50mL注射器,将上述混合液倒入所述注射器后,利用注射器缓慢推出所述混合液以通过所述瓶盖式过滤器的滤膜进行过滤除菌,过滤除菌后的滤液流入所述离心管,得到无菌PF-127水凝胶原液,并将无菌PF-127 水凝胶原液放置于4℃下备用。
步骤三,水凝胶与HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备:将步骤一合成的HIF-1α过表达慢病毒载体与步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液在0℃~4℃下充分搅拌使其混合均匀,并达到的浓度为2×107TU/mL,即制得所述用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物。本实施例中,所制得的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物置于液氮中储存备用。
其中,步骤二与所述步骤三之间,还包括成胶化性能检测步骤:将装有无菌PF-127水凝胶原液的离心管放置37℃水浴锅中5min,观察无菌PF-127水凝胶原液是否成胶冻状,如能成胶冻状,则说明步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液能用于与HIF-1α过表达慢病毒载体复合。
其中,本实施例制得的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物能实现HIF-1α过表达慢病毒载体的局部递送、缓释的作用,并为BPA后神经再生修复和血运重建提供有利影响。
实施例4。
用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,它包括以下步骤:
步骤一,HIF-1α过表达慢病毒载体的合成:选用由汉恒生物技术有限公司 (中国上海)合成的pHBLV-CMVIE-IRES-Puro作为慢病毒载体用于HIF-1α的过表达,其中,HIF-1α引物序列如下:ggatctatttttggggtgaattcgccaccATGGA GGGCGCCGGCG(正向引物);tagaactagtctcgaggaattcTC AGTTAACTTGATCCAAA(反向引物);本实施例中,慢病毒载体的滴度为2 ×108TU/mL。
步骤二,水凝胶原液的制备:将PF-127无菌粉末与去离子水配置成质量体积比为25%的混悬液,然后将所述混悬液置于4℃的水平摇床以70转/分钟的速度振摇10h直至水凝胶充分溶解得到混合液,然后将所述混合液通过滤膜进行过滤除菌后,得到无菌PF-127水凝胶原液;本实施例中,对混合液进行过滤除菌具体是:取0.20μm孔径的瓶盖式过滤器套于50mL离心管管口,并将所述瓶盖式过滤器连接上50mL注射器,将上述混合液倒入所述注射器后,利用注射器缓慢推出所述混合液以通过所述瓶盖式过滤器的滤膜进行过滤除菌,过滤除菌后的滤液流入所述离心管,得到无菌PF-127水凝胶原液,并将无菌PF-127 水凝胶原液放置于4℃下备用。
步骤三,水凝胶与HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备:将步骤一合成的HIF-1α过表达慢病毒载体与步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液在0℃~4℃下充分搅拌使其混合均匀,并达到的浓度为2×107TU/mL,即制得所述用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物。本实施例中,所制得的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物置于-80℃超低温冰箱中储存备用。
其中,步骤二与所述步骤三之间,还包括成胶化性能检测步骤:将装有无菌PF-127水凝胶原液的离心管放置37℃水浴锅中5min,观察无菌PF-127水凝胶原液是否成胶冻状,如能成胶冻状,则说明步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液能用于与HIF-1α过表达慢病毒载体复合。
其中,本实施例制得的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物能实现HIF-1α过表达慢病毒载体的局部递送、缓释的作用,并为BPA后神经再生修复和血运重建提供有利影响。
实施例5。
用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,它包括以下步骤:
步骤一,HIF-1α过表达慢病毒载体的合成:选用由汉恒生物技术有限公司 (中国上海)合成的pHBLV-CMVIE-IRES-Puro作为慢病毒载体用于HIF-1α的过表达,其中,HIF-1α引物序列如下:ggatctatttttggggtgaattcgccaccATGGA GGGCGCCGGCG(正向引物);tagaactagtctcgaggaattcTC AGTTAACTTGATCCAAA(反向引物);本实施例中,慢病毒载体的滴度为2 ×108TU/mL。
步骤二,水凝胶原液的制备:将PF-127无菌粉末与去离子水配置成质量体积比为18%的混悬液,然后将所述混悬液置于1℃的水平摇床以62转/分钟的速度振摇20h直至水凝胶充分溶解得到混合液,然后将所述混合液通过滤膜进行过滤除菌后,得到无菌PF-127水凝胶原液;本实施例中,对混合液进行过滤除菌具体是:取0.20μm孔径的瓶盖式过滤器套于50mL离心管管口,并将所述瓶盖式过滤器连接上50mL注射器,将上述混合液倒入所述注射器后,利用注射器缓慢推出所述混合液以通过所述瓶盖式过滤器的滤膜进行过滤除菌,过滤除菌后的滤液流入所述离心管,得到无菌PF-127水凝胶原液,并将无菌PF-127 水凝胶原液放置于4℃下备用。
步骤三,水凝胶与HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备:将步骤一合成的HIF-1α过表达慢病毒载体与步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液在0℃~4℃下充分搅拌使其混合均匀,并达到的浓度为2×107TU/mL,即制得所述用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物。本实施例中,所制得的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物置于液氮中储存备用。
其中,步骤二与所述步骤三之间,还包括成胶化性能检测步骤:将装有无菌PF-127水凝胶原液的离心管放置37℃水浴锅中5min,观察无菌PF-127水凝胶原液是否成胶冻状,如能成胶冻状,则说明步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液能用于与HIF-1α过表达慢病毒载体复合。
其中,本实施例制得的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物能实现HIF-1α过表达慢病毒载体的局部递送、缓释的作用,并为BPA后神经再生修复和血运重建提供有利影响。
动物实验:
该动物实验旨在检测本发明制得的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物对臂丛神经根性撕脱大鼠模型BPA损伤修复的影响。
其中,要将水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物共移植入臂丛撕脱伤损伤部位,首先要构建HIF-1α过表达慢病毒载体并对其过表达效率进行验证成功构建臂丛神经根性撕脱再植模型后将水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物注射到撕脱部位。提取实验组及对照组大鼠C5-C7脊髓节段,检测造模注药后7天HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平。qRT-PCR 的结果显示,Gel+HIF-1α处理后HIF-1α的mRNA水平相比PBS组显着增加(P<0.001)。Western Blotting实验结果也显示出相似趋势(P<0.001),表明HIF-1α过表达慢病毒载体可有效上调HIF-1α的表达。
神经根性撕脱伤通常会导致大量运动神经元变性和死亡,这对随后的神经再生和组织修复产生十分不利的影响。为了研究Gel+HIF-1α联合对运动神经元存活的影响,我们通过对运动神经元特异性标记物ChAT进行免疫荧光染色观察C5-C7脊髓节段中的存活运动神经元数量。联合移植组中有 80%的ChAT阳性运动神经元,而对照组ChAT阳性细胞仅为65%左右(P <0.01)。结果表明,Gel+HIF-1α过表达慢病毒可有效提高运动神经元的存活率。运动神经元可为肌纤维提供营养支持以维持神经所支配肌肉的正常形态和功能。臂丛神经根撕脱后造成神经支配靶肌肉的萎缩,进而丧失运动功能。用本发明干预6周后,对各组BPA大鼠进行灌注取材。通过对大体标本的观察,患侧C5和C7神经根完全撕脱,C6再植入脊髓腹外侧表面,各组患侧与健侧肱二头肌进行对比可发现患侧肌肉明显萎缩,显示造模成功。通过统计分析,Gel+HIF-1α组双侧肱二头肌干重比例为66.73%±8.5,而对照组为43.4%±8.0。通过HE染色进一步观察分析肱二头肌的结构,发现对照组中肌肉纤维直径较小,纤维母细胞核数目较多,。相反,在Gel+ HIF-1α组中,检测到具有清晰肌细胞核细胞,且肌肉纤维直径较大。通过统计同侧肱二头肌中的成纤维细胞核与对侧的成纤维细胞核的比率和肌纤维直径大小来评估肌纤维化及萎缩程度,发现对照组纤维母细胞核比例为 1.69±0.10,Gel+HIF-1α组为1.00±0.13;Gel+HIF-1α组中53%的肌纤维直径大于30um,而对照组中只有20%的肌纤维具有相当大小。结果证实, Gel+HIF-1α可有效减轻肌肉纤维化程度,改善肌肉萎缩情况。
运动功能恢复是BPA大鼠损伤修复最直观的表现。目前国际公认的运动评分方法为Terzis理毛实验(Terzis grooming test,TGT)。从第2周到第6周实验终点,Gel+HIF-1α组大鼠与对照组相比显示出更高的TGT评分。 Gel+HIF-1α组和PBS组中TGT得分大于或等于4的百分比分别为91.7%和 41.7%。实验数据表明,Gel+HIF-1α组的运动功能恢复明显优于PBS组。
电生理检测在临床上为周围神经病变提供了失神经支配和神经束形成提供可靠证据(Mills,2005)。通过对各组动作电位潜伏期进行测量统计,得出Gel+HIF-1α组动作电位潜伏期较对照组短,分别为1.13±0.03ms和1.27 ±0.03ms。Gel+HIF-1α组动作电位的振幅也高于对照组。此外,我们还进行了荧光金逆行示踪实验(Fluoro Gold(FG)retrogradetracing),探索运动神经元的轴突再生。结果表明在对照组中,少量神经元惩恶FG阳性,而在 Gel+HIF-1α组中观察到约1.5倍的FG标记的神经元(P<0.001)。实验结果表明Gel+HIF-1α可有效促进运动神经元轴突再生并在一定程度上促进神经通路的重建,从而有利于运动功能的恢复。
此外,BPA导致血管完整性破坏,在继发性损伤反应中扮演重要角色并影响功能恢复程度(Benton et al.,2008,Cibert-Goton et al.,2015)。因此,早期血运重建对神经再生和功能恢复具有重要意义。为研究Gel+HIF-1α对血管新生的影响,我们进行了血管内皮细胞标志物CD31的免疫荧光染色,并用NeuN(神经元的特异性标记物)进行复染。在对照组中,观察到神经元周围的新生血管较少,而Gel+HIF-1α组神经元周围出现较多新生血管。Gel+HIF-1α组中神经血管的平均分布面积(P<0.001)几乎是对照组的三倍。免疫荧光结果表明,Gel+HIF-1α化合物可有效促进血管新生,有利于神经元存活。
综上所述,Gel+HIF-1α可有效促进臂丛撕脱大鼠神经元存活,神经通路重建、血管新生以及运动功能恢复,有望对臂丛撕脱伤的治疗提供新的治疗思路。
本发明制得的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物用于修复臂丛撕脱神经损伤的应用,具体的应用方法如下:
1)臂丛神经根性撕脱大鼠模型制备
成年雌性SD大鼠用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉,暴露右侧C4-T2脊髓节段,行C4-C7椎板切除术,分离出右侧臂丛神经的C5~C7 脊神经根,用精细玻璃挂钩轻撕脱C5~C7神经根,并切除与C5和C7神经根相连的一段脊神经,使神经与脊髓间留下大概5mm的间隙,随后将C6 前根重置回原位,逐层间断缝合肌肉和皮肤。将大鼠放置于动物专用电热毯上进行保暖,待动物苏醒后运送至清洁级动物饲养房进行常规护理。术后每只大鼠给予1ml的青霉素链霉素混合液注射预防感染,每日2次,连续注射3天。
2)移植Gel+HIF-1α复合物至臂丛撕脱损伤部位
用微量注射器吸取本发明具体实施方式(1)所得的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物10ul,匀速注射于臂丛神经撕脱大鼠模型C6神经根损伤原位空隙。注射完毕后,静置大鼠约5分钟,待药物充分吸收后依次逐层缝合肌肉和皮肤,标准条件下常规饲养。
3)Gel+HIF-1α复合物修复大鼠臂丛撕脱伤试验
实验组:用微量注射器缓慢吸取10ul水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物,在臂丛神经撕脱大鼠模型C6神经根损伤原位空隙以正常速度注射。注射完毕后,静置大鼠约5分钟,待药物充分吸收后依次逐层缝合肌肉和皮肤,并于标准条件下常规饲养。
对照组:给予同等剂量PBS。
①HE染色观察肌肉形态和纤维化程度
将肱二头肌横向石蜡切片进行HE染色,将切片在二甲苯中脱蜡2次(每次5分钟);在一系列梯度乙醇中再水合后,将切片在蒸馏水中洗涤2分钟;苏木精溶液染色10分钟,在1%盐酸乙醇中分化30秒,流水洗涤并用伊红溶液复染30-60秒。流水洗涤5分钟后,将组织样品再次在梯度乙醇中脱水(每次5分钟),在二甲苯中透化(Ⅰ,Ⅱ;每次5分钟)并用中性树脂封片。每个肱二头肌随机拍摄6个以上的视野,统计肌肉纤维的直径以及患侧肌纤维细胞与健侧之间纤维母细胞核的比率。
表1肌纤维直径、患侧与健侧纤维母细胞核比率(x±s)
如表1所示,实验组大鼠肌纤维直径相较对照组较大,纤维化程度也优于对照组。
②行为学测试
参照Bertelli JA等人提出的Terzis grooming test对臂丛撕脱模型大鼠进行右前肢的运动功能评估。在安静环境中,用注射器往大鼠头颈部喷射约 10ml左右的水以引出其前肢的理毛行为,观察并依据该评定标准对其右前肢的运动功能进行等级评分。该评定标准分为0-5级:右前肢无反应为0分,右前肢可弯曲并能到达耳部及耳后为5分。术前对动物检查为5级,术后第二天对动物右上肢功能评定为功能丧失,评分0级,纳入评分标准。术后第二周开始对不同处理组动物进行运动功能等级评分,每周一次,连续4周。测试结果(见表2)显示,实验组动物右前肢的运动功能评分明显高于对照组,且有统计学差异(P<0.05)。
表2臂丛神经根撕脱运动功能评分(x±s)
如表2所示,实验组大鼠在2、3、4、5W的运动功能评分均优于对照组。
③荧光金逆行标记
取材前3-4天,常规麻醉动物后暴露右侧肌皮神经,于肌皮神经入肱二头肌肌点近端5mm处进针,注射1.0ul荧光金。标记后2天进行4%多聚甲醛心脏灌注,取出C5-C7脊髓节段,放入30%蔗糖脱水48h后切成20um冰冻切片。于荧光显微镜下观察C5-C7脊髓内荧光金标记的神经细胞数(见表3),以观察C6回植后神经轴突是否重新延伸至肱二头肌。
表3荧光金标记的神经细胞计数(x±s)
如表3所示,实验组荧光金标记的神经细胞数高于对照组,说明移植 Gel+HIF-1α复合物可有效促进轴突再生。
④免疫荧光染色检测ChAT的表达
各组动物模型1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉,4℃多聚甲醛进行灌注,取C5-C7脊髓节段,固定好后置30%蔗糖溶液脱水,OCT包埋并切成20um厚的冰冻纵切片,运动神经元标志性抗体ChAT染色, Hoechst33342染核,于荧光显微镜下观察,统计患侧ChAT阳性细胞数与健侧的比例。
表4 ChAT阳性细胞比率(x±s)
如表4所示,患侧ChAT阳性细胞数与健侧的比例高于对照组,说明移植 Gel+HIF-1α复合物可减少神经元的死亡。
⑤运动终板检测
取材固定后肱二头肌切成14um厚的纵向冰冻切片,0.2mg/L的α-环蛇毒素(α-Bungarotoxin,α-BtX)染色30min。于荧光显微镜下计数运动终板的数目,并利用Image J图像处理软件计算其面积大小(见表4)。
表5运动终板检测(x±s)
如表5所示,实验组运动终板面积大于对照组,说明移植Gel+HIF-1α复合物对神经肌接头具有保护作用。
⑥免疫荧光染色检测CD31的表达
各组动物模型1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉,4℃多聚甲醛进行灌注,取C5-C7脊髓节段,固定好后置30%蔗糖溶液脱水,OCT包埋并切成20um厚的冰冻纵切片,采用血管内皮细胞表面标志物CD31进行染色,DAPI染核,于荧光显微镜下观察,利用Image J图像处理软件计算血管面积大小。
表6血管再生的面积(x±s)
如表6所示,实验组中血管再生面积大于对照组,说明移植Gel+HIF-1α复合物可促进血管再生。
基于其在缺血缺氧环境中起到的不可忽视作用,通过尝试将基因修饰和组织工程相结合的方法,将PF-127水凝胶混合HIF-1α过表达慢病毒载体制备成复合物,移植入BPA损伤局部,通过对神经元存活、神经通路重建、运动功能恢复以及血管新生的检测,均发现本申请制得的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物可有效促进BPA损伤修复,有望为BPA的治疗提供新思路。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,其特征在于:它包括以下步骤:
步骤一,HIF-1α过表达慢病毒载体的合成:选用由汉恒生物技术有限公司(中国上海)合成的pHBLV-CMVIE-IRES-Puro作为慢病毒载体用于HIF-1α的过表达,其中,HIF-1α引物序列如下:ggatctatttttggggtgaattcgccaccATGGAGGGCGCCGGCG(正向引物);tagaactagtctcgaggaattcTCAGTTAACTTGATCCAAA(反向引物);
步骤二,水凝胶原液的制备:将PF-127无菌粉末与水配置成一定质量体积比的混悬液,然后对所述混悬液进行振摇直至水凝胶充分溶解得到混合液,然后将所述混合液通过滤膜进行过滤除菌后,得到无菌PF-127水凝胶原液;
步骤三,水凝胶与HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备:将步骤一合成的HIF-1α过表达慢病毒载体与步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液充分搅拌使其混合均匀,并达到一定的浓度,即制得所述用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物。
2.根据权利要求1所述的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,其特征在于:所述步骤一中,所述慢病毒载体的滴度为2×108TU/mL。
3.根据权利要求1所述的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,其特征在于:所述步骤二中,所述水为去离子水。
4.根据权利要求1所述的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,其特征在于:所述步骤二中,所述混悬液的质量体积比为15%~25%。
5.根据权利要求1所述的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,其特征在于:所述步骤二中,将所述混悬液置于0℃~4℃的水平摇床以60转/分钟~70转/分钟的速度振摇10h~24h直至水凝胶充分溶解得到混合液。
6.根据权利要求1所述的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,其特征在于:所述步骤二中,对混合液进行过滤除菌具体是:取0.20μm孔径的瓶盖式过滤器套于50mL离心管管口,并将所述瓶盖式过滤器连接上50mL注射器,将上述混合液倒入所述注射器后,利用注射器缓慢推出所述混合液以通过所述瓶盖式过滤器的滤膜进行过滤除菌,过滤除菌后的滤液流入所述离心管,得到无菌PF-127水凝胶原液,并将无菌PF-127水凝胶原液放置于4℃下备用。
7.根据权利要求1所述的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,其特征在于:所述步骤三中,将步骤一合成的HIF-1α过表达慢病毒载体与步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液在0℃~4℃下充分搅拌使其混合均匀,并达到的浓度为2×107TU/mL。
8.根据权利要求1所述的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,其特征在于:所述步骤三中,所制得的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物置于-80℃超低温冰箱或液氮中储存备用。
9.根据权利要求1所述的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法,其特征在于:所述步骤二与所述步骤三之间,还包括成胶化性能检测步骤:将装有无菌PF-127水凝胶原液的离心管放置37℃水浴锅中5min,观察无菌PF-127水凝胶原液是否成胶冻状,如能成胶冻状,则说明步骤二制得的无菌PF-127水凝胶原液能用于与HIF-1α过表达慢病毒载体复合。
10.用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物,其特征在于:是由权利要求1至9任意一项所述的用于修复臂丛撕脱神经损伤的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物的制备方法所制得的水凝胶包裹HIF-1α过表达慢病毒载体复合物。
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