JP4625419B2 - 神経細胞生長発育及び神経幹細胞生成促進化合物 - Google Patents
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Description
請求項3の発明は、請求項1記載の神経細胞生長を促進する化合物において、該化合物中のR4は式二或いは式三に示されるゲラニル基とされ、R1、R2、R3、R5、R6及びR7 はそれぞれ独立に、水素基(−H)、水酸基(−OH)、炭素数1〜3個の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基、或いは、イソプレン基とされることを特徴とする、神経細胞生長を促進する化合物としている。
請求項4の発明は、請求項1記載の神経細胞生長を促進する化合物において、該化合物中のR5は式(2)或いは式(3)に示されるゲラニル基とされ、R1、R2、R3、R4、R6及びR7 はそれぞれ独立に、水素基(−H)、水酸基(−OH)、炭素数1〜3個の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基、或いは、イソプレン基とされることを特徴とする、神経細胞生長を促進する化合物としている。
請求項5の発明は、請求項1記載の神経細胞生長を促進する化合物において、該化合物中のR6は式二或いは式三に示されるゲラニル基とされ、R1、R2、R3、R4、R5及びR7 はそれぞれ独立に、水素基(−H)、水酸基(−OH)、炭素数1〜3個の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基、或いは、イソプレン基とされることを特徴とする、神経細胞生長を促進する化合物としている。
請求項6の発明は、請求項1記載の神経細胞生長を促進する化合物において、該化合物は神経幹細胞を刺激して分化させ神経元細胞となし得ることを特徴とする、神経細胞生長を促進する化合物としている。
請求項7の発明は、請求項1記載の神経細胞生長を促進する化合物を包含したことを特徴とする、培養基の添加物としている。
請求項8の発明は、請求項7記載の培養基の添加物において、該培養基は細胞培養の培養基とされることを特徴とする、培養基の添加物としている。
請求項9の発明は、請求項8記載の培養基の添加物において、該細胞は神経幹細胞とされることを特徴とする、培養基の添加物としている。
請求項10の発明は、請求項7記載の培養基の添加物において、該培養基が更に成長因子を含有したことを特徴とする、培養基の添加物としている。
請求項11の発明は、請求項10記載の培養基の添加物において、該成長因子は上皮成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、及び神経成長因子からなる群より選択されることを特徴とする、培養基の添加物としている。
請求項12の発明は、請求項1記載の神経細胞生長を促進する化合物を含有したことを特徴とする、神経幹細胞の分化を刺激、促進神経元細胞生長及発育する医薬組成物としている。
(1)本発明の化合物を低密度(160cells/mm2以下)神経細胞の培養条件下で、顕著に神経細胞(例えば、脳皮質神経細胞)の生長を促進し、これにより神経細胞の生存率を高めることができる。したがって本発明の化合物は神経細胞を培養する理想的な添加剤を含まれる。
(2)神経細胞の生長と発育に対する影響上、本発明の化合物は塩基性線維芽細胞成長因子或いは上皮成長因子で処理したものに較べ、比較的太く、長く、さらに多く分岐した神経繊維を獲得できる。本発明の化合物はこのような効能を有するため、神経退化性疾病における細胞の損傷或いは死亡に対する修復及び再生に応用でき、神経退化型疾病、例えばアルツハイマー病(Alzheimer)、パーキンソン病(Parkinson)、脳卒中、ルー・ゲーリック病(Lou Gehrig’s)など、及びミエリン(myelin)損傷または異常の疾病、例えば多発性硬化症(multiple sclerosis)の治療に役立つ。本発明の化合物は単独または他の化合物と組み合わせて使用することができる。
(3)神経幹細胞の生成の促進に関して、本発明の化合物で処理すると、塩基性線維芽細胞成長因子或いは上皮成長因子で処理したものに較べ、より神経幹細胞の生成を促進し、並びにこのような球状特性を維持し体外培養の状況下で少なくとも30日、生存させ、本発明物は成長因子と較べてより優れた培養基添加剤であることが分かる。このような神経幹細胞は誘導分化され神経元細胞、星状膠細胞及びオリゴデンドロサイトに分化誘導される。本発明の化合物は神経幹細胞の移植前と移植後の生存率を改善するにも拘らず、神経幹細胞をさらに効能的な神経細胞に変化させることができる。
(4)本発明の化合物は神経元幹細胞(neuronal stem cells)を主とする神経幹細胞(neural stem cell)を誘導生成するのに用いられ、並びにこれら幹細胞を更に分化させて神経元細胞(neurons)となす可達到60%以上,この数は従来の技術では達成できないのである(従来技術のベスト値は僅20−30%)。このほか、本発明の化合物は周知の成長因子とは異なり、これにより応用上、塩基性線維芽細胞成長因子と合併使用することにより、神経幹細胞を増殖させて有効に神経幹細胞を量子化し、これにより大量に神経元幹細胞を獲得でき、将来的な退化性神経疾病を治療する細胞療法に応用可能である。或いは従来の技術を用い、本発明の化合物により大量の裸のnaked神経幹細胞を生産、収穫及び純化し、移植治療に使われるのである。
神経幹細胞を培養する生長培養基を製造する。それは、B−27無血清神経細胞培養基(B−27 supplemented neurobasal medium,Gibco)中にペニシリンG(penicillin G)、硫酸スプレプトマイシン(streptomycin sulphate)及び0.5mMのL−グルタミン(L−glutamine)を添加したものとする。
麻酔状態下で、妊娠16日の雌鼠(Wistar)の腹腔中より胎嚢中の未出生胎鼠を乗り出す。胎鼠大脳組織を取り出し、0.1%のトリプシン溶液摂氏25度下で1分間作用させる。りん酸塩バッファ溶液(PBS solution)で3回洗った後、周知の機械方式で上下に混合してその細胞を分散させる。その後、前述の胎鼠大脳組織細胞を含有する溶液に70μmナイロン細胞ストレーナー(nylon cell strainer,Falcon)を通過させ、脳細胞を溶液中に釈放する。その後、この溶液を1000rpmの回転速度で10分間遠心分離し、さらに前述の神経幹細胞を培養する生長培養基で置換し、これにより、神経幹細胞の細胞群を含有する懸濁液を獲得できる。
前述の脳細胞の懸濁液を約150,000cells/mLのうち10mLを取り出して細胞量直径10cmでペトリ皿(Petri dish)上に放置し、並びにそれを摂氏37度、5%CO2、及び相対湿度95%の環境下で培養し、脳細胞を培養する。細胞培養の生長培養基は三日ごとに二回交換し、毎回半分の培養液を交換する。
実験を行う時は、ペトリ皿培養細胞で、対照グループの生長培養基中に上皮生長因子(5ng/mL)、塩基性線維芽細胞成長因子(5ng/mL)或いは神経成長因子(5ng/mL)を添加する。実験グループの生長培養基中にはそれぞれ本発明の化合物A〜Hを加える。ブランクコントロールグループの生長培養基中には5μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加える。その後、以上の培養条件で培養し、並びに7日培養後に顕微鏡で懸濁液した神経幹細胞の大きさ、外形と生存率を観察する。得られた結果は図1に示される。
結果が示すように、本発明の化合物A〜H、上皮成長因子、神経成長因子はいずれも神経幹細胞を集中させて球状(体性神経幹(前駆)細胞)となし、且つブランクコントロールグループの形成する体性神経幹(前駆)細胞より大きい。これから明らかに、本発明の化合物は周知の成長因子と同じく神経幹細胞の生長の目的を達成することがわかる。また即ち、本発明の化合物は神経幹細胞球状物の増殖に対して促進の効果を有する。
実施例1で得られた細胞懸濁液を300cells/mm2の細胞量で30μg/mLのポリDリジン(poly−D−lysine,Sigma)を吸着した6孔培養トレイ中で培養し、摂氏37度、5%CO2、及び相対湿度95%の環境下で培養する。
10μMの化合物A、化合物B、化合物D、化合物E、化合物F、化合物G、及び化合物Hを含有する生長培養基中でそれぞれ培養し。このほか、コントロールグループの生長培養基中に5μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加える。培養分化してなる細胞は大脳皮質神経細胞(cortical neurons)と総称される、三重複試験を行う。5日培養後、周知の活細胞数計数の方法で細胞を計数(MTTassay)し、並びに540nm吸光値で結果を判読し、結果を図2に示した。
図2の結果に示されるように、実験グループの吸光値はブランクコントロールグループよりも明らかに高く、そのうち、化合物A、DとGでの効果が最も良好であった。この結果は本発明の化合物が確実に顕著に大脳皮質神経細胞の生存率を増すことを示す。
実施例1で得られた細胞懸濁液を異なる細胞密度(150,300cells/mm2)の細胞量ですでに30μg/mLのポリDリジン(poly−D−lysine,Sigma)を吸着した6孔培養トレイ中で培養し、摂氏37度、5%CO2、及び相対湿度95%の環境下で培養する。
化合物A、化合物B、化合物D、化合物Gを含有する生長培養基中でそれぞれ培養し。このほか、生長培養基中に5μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加えてコントロールグループとなす。培養分化してなる細胞は大脳皮質神経細胞(cortical neurons)と総称される、三重複試験を行う。5日培養後、周知の活細胞数計数の方法で細胞を計数(MTT assay)し、並びに540nm吸光値で結果を判読し、結果を図3に示した。
周知の大脳皮質神経細胞を640cells/mm2の細胞密度で生長培養基中で培養する時、細胞の生存率は90%より高く、160cells/mm2の細胞密度で培養する時、細胞の生存率は約50%に下がる。これにより、培養時の細胞密度が160cells/mm2より低い時、適時にいずれかの生長因子を添加することがなければ、細胞の死亡率は大幅に増加する。これはこのような状況下では、細胞数が少なすぎて細胞と細胞の間の距離が相互に遠くなりすぎ、このため細胞と細胞の間で生長因子の伝送が行われにくくなるためである。
図3の結果からわかるように、本発明の化合物を添加した実験グループ中、培養開始の細胞密度がどのようであっても、得られる吸光値はいずれもコントロールグループより顕著に高くなり、この結果は、本発明の化合物の添加が、低細胞密度下で培養される神経細胞の生存率を顕著に改善することを示す。
実施例1で得られた細胞を38cells/mm2の細胞量で、すでに30μg/mLのポリDリジン(poly−D−lysine,Sigma)を吸着した6孔培養トレイ中で培養し、摂氏37度、5%CO2、及び相対湿度95%の環境下で培養する化合物A、化合物B、化合物D、化合物Gを含有する生長培養基中でそれぞれ培養し。このほか、生長培養基中に5μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加えてコントロールグループとなす。培養分化してなる細胞は大脳皮質神経細胞(cortical neurons)と総称される、三重複試験を行う。5日培養後、顕微鏡で細胞を観察し並びに神経繊維(neurite)長さを計算し、得られた結果を図4に示した。
図4に示されるように、完全にいかなる成長因子も加えないブランクコントロールグループは、顕微鏡下で、その神経元細胞体(soma)の萎縮、神経細胞の完全な死亡の状況が観察され(図4の(A))、ゆえに測定される神経繊維の長さはゼロとなる。しかし、実験グループにそれぞれ化合物A 2.5μM、化合物B 5μM、化合物D 5μM、化合物G 5μMを加えた後、顕微鏡下で実験グループ中の神経元細胞は続けて生長し、且つ神経繊維は外向きの伸長し、並びに一つの神経元細胞体から少なくとも3本の神経繊維が伸出し、且つそのうち1本は長く且つ後端が分岐して複数の神経突起となる。神経繊維長さを分析すると、化合物Aを加えた後、神経繊維L1長さは236μm、神経繊維L2長さは161μm(図4の(B))、化合物Bを加えた後、神経繊維L1長さは235μm(図4の(C))、図D中に化合物Dを加えた後、神経繊維L1の長さは211μm(図4の(D))、図E中に化合物Gを加えた後、神経繊維L1の長さは316μmとなり、神経繊維L2の長さは216μmとなった(図4の(E))。
この結果からわかるように、本発明の化合物は低細胞濃度(38cells/mm2)下で、神経細胞の生存を促進し、並びにその神経繊維を伸長させ、且つ発育させて成熟した神経元細胞となす。
実施例1神経幹細胞を培養し始める時、培養基中化合物A或いはEGFを加え、三日後、細胞が集まり神経球となる。この細胞懸濁液中より100μLを取り出し、それを希釈して1mLとなす。続いて、250μLの体性神経幹(前駆)細胞を含有する上澄み液を吸い取り、既に30μg/mLのポリDリジン(poly−D−lysine,Sigma)を吸着したスライドグラス上で培養し、培養基を取り除き、化合物A又はEGFを添加したもの或いは成長因子を添加しないものを培養し、前述同じ培養環境において再び三日培養すると、大脳皮質神経細胞となす。一次抗体に結合された神経元細胞が二次抗体で認識された後に、神経元細胞は蛍光の励起下で蛍光を発生する。
図5を参照されたい。左列は蛍光励起下の写真(白光のものは神経細胞、図中の陰影部分は死亡した細胞或いは非神経細胞であり、右列は可視光下の細胞形態であり、それはこの視野間の全ての細胞を現出している。これにより図5の結果より実際に観察できることは、神経幹細胞培養開始時に化合物Aを加えると、後に細胞が分化して大脳皮質神経細胞となる時に化合物Aを加えても加えなくても、いずれも神経幹細胞は分化して神経元細胞となり(図5の(A)、(B))、細胞に上皮成長因子を加えた時、神経細胞は増殖(図5の(C))するが、その成長してなるものはほとんどが非神経元細胞であり、後に上皮成長因子を加えないと、細胞が成長してなる非神経細胞は継続して加えたものに較べて少なくなる。これからわかるように上皮成長因子は神経細胞の増殖を促進してその生存率を増すが、ただしその増殖させる細胞のほとんどは非神経元細胞の前駆細胞であり、一方、本発明の化合物は神経幹細胞の生存を増すほか、その分化に影響し、それを神経元細胞へと発展させる。
実施例5と同じ実験操作を行うが、神経幹細胞の培養開始時に、化合物Dを添加し並びに上皮成長因子と合併使用し、その後、幹細胞を取り出してスライドグラス上に載せ、その後、全ての細胞をスライドグラス上に貼り付けた後、細胞液を除去して新たに、化合物D、或いは上皮成長因子を含有するか、或いは成長因子を含有しない培養液を加えるか、或いは化合物Dを加え並びに上皮成長因子と合併使用し、3日培養した後に免疫蛍光染色で細胞形態を観察した。
図6を参照されたい。左列は蛍光励起下での写真(白光のものは神経細胞、図中の陰影部分は死亡した細胞或いは非神経細胞であり)、右列は可視光下の細胞形態であり、それはこの視野間の全ての細胞を現出している。これにより図6の結果より実際に観察できることは、神経幹細胞培養開始及びスライドグラスに貼り付けた時に化合物Dを加え並びに上皮成長因子を合併すると、神経幹細胞の顕著な増殖の状況が観察され、並びに分化後には神経元細胞に向けて発展する(図6の(A))。細胞をスライドグラスに貼り付けた後、上皮成長因子のみを加えたものは、その細胞が分化して非神経元細胞となり(図6の(C))、化合物Dを含有したものは、その神経幹細胞が分化して神経元細胞となる(図6の(B))。このほか、細胞をスライドグラスに貼り付けた後に、成長因子を加えないと、神経幹細胞は分化して神経元細胞となるが、その神経細胞の数量は更に化合物Dを加えたものに較べて少ない(図6の(D))。これからわかるように、上皮成長因子は神経細胞の増殖を促進し、本発明の化合物を合併使用すると、これにより比較的多くの細胞が神経元細胞に向けて発展する。この実験結果からわかるように、神経元幹細胞の発育時に本発明の化合物を加えることで、神経幹細胞を神経元幹細胞(neuronal stem cells)に向けて発展させることができ、細胞分化後神経元細胞となる。
実施例1中の化合物Aで培養した神経幹細胞を続けて培養し、7日ごとに一度培養基を交換する。このほか、ジメチルスルホキシドでブランクコントロールグループとなす。第30日培養した時、100μLの神経幹細胞の細胞液を吸い出し、それを希釈して1mLとなす。その後、250μLの上澄み液を吸い取り、それを既に30μg/mLのポリDリジン(poly−D−lysine,Sigma)を吸着したスライドグラス上で培養し、顕微鏡で神経幹細胞の外観形態を観察し、得られた結果を図7に示した。
図7を参照されたい。図7より、全く成長因子を加えないコントロールグループ(図7の(A))には生存する細胞がほぼなく、且つ正常神経幹細胞が集中して球状となる特性を現出できず、細胞懸濁培養時にすでに萎縮の状態を現出することがわかる。化合物Aを加えて培養した神経幹細胞はその集中して球状となる特性を維持可能で(図7の(B))、並びにこの細胞を続けて三日培養した後に実施例5と同じ免疫蛍光染色法を用いて染色し、顕微鏡下で神経幹細胞が正常に分化して神経元細胞となり、並びに続けて神経繊維の生長を続けることがわかる(図7の(C))。
Claims (5)
- 下記化合物から成る群から選択される化合物の1個または任意の組み合わせを含み、神経細胞生長を促進することを特徴とする、神経細胞培養用培養基の添加物:
- 該細胞が神経幹細胞である、請求項1に記載の培養基の添加物。
- 該培養基が更に成長因子を含有する、請求項1に記載の培養基の添加物。
- 該成長因子が上皮成長因子(EGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、及び神経成長因子(NGF)からなる群より選択される、請求項3に記載の培養基の添加物。
- 下記化合物から成る群から選択される化合物の1個または任意の組み合わせを含む、神経退化性疾病の処置のための医薬組成物:
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