JP2010195762A - プレニルフラバノン化合物およびその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】癌及び多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変成疾患を治療するためのＨＤＡＣ阻害剤の提供。
【解決手段】プロポリスから単離される５，７，３’，４’−テトラヒドロキシ−６−ファルネシルフラボン（“プロポリンＩ”と称される）と、５，７，４’−トリヒドロキシ−６−ゲラニルフラボン（“プロポリンＪ”と称される）。
【選択図】なし

Description

発明の背景
本発明は、新規プレニルフラバノン化合物およびその使用に関する。

プロポリスは、木の芽、フルーツ、樹液または他の植物源から蜜蜂が集める樹脂性混合物である。それは様々な活性成分を含み、抗腫瘍活性^（３）、抗酸化活性^（４）、抗細菌活性^（５）、抗ウイルス活性^（６）、抗真菌活性^（７）、および抗炎症活性^（８）を含む広範囲の生物学的活性を示すことが報告されている。異なる地域由来のプロポリスは、異なる活性成分を含み得る。

本発明者らは、下記の式１から８によりそれぞれ示される台湾製プロポリスから単離された８種のプレニルフラバノンを以前報告した。

これらのプロポリスは、抗癌活性^{（１０−１５）}、抗酸化活性^{（１０−１６）}および抗菌活性^（１６）を含む、広範囲の生物学的活性を示すことが報告されている。加えて、最近の研究により、沖縄製プロポリスが台湾製プロポリスと同じ活性成分を含むことが証明された^{（１７−１８）}。

ヒストン脱アセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、ヒストンのＮ末端においてリシンアミノ酸残基のε−アミノ基の脱アセチル化を触媒する酵素である。あるＨＤＡＣ阻害剤は、前臨床および臨床段階の異なるタイプの癌を有する患者に対して治療的効果を有することが発見および証明されている^{（１９−２１）}。ＨＤＡＣ阻害剤の抗癌機構の現在のモデルによると、該阻害剤は、コアヒストンの高アセチル化をもたらし、故に、クロマチン再構築を誘発し、腫瘍抑制遺伝子のようなサイレント遺伝子を発現させ、その結果、腫瘍細胞増殖の阻害をもたらす^{（２６−２７）}。

多機能性プロポリス由来の新規化合物の発見およびそれらの有用な生理的活性の評価が必要とされている。

文献
(1) Burdock, G. A. Review of the biological properties and toxicity of bee propolis (propolis). Food Chem Toxicol. 1998, 36, 347−363.
(2) Teixeira, E. W.; Negri, G.; Meira, R. M.; Message, D.; Salatino, A. Plant Origin of Green Propolis: Bee Behavior, Plant Anatomy and Chemistry. Evid Based Complement Alternat Med. 2005, 2, 85−92.
(3) Ahn, M. R.; Kunimasa, K.; Ohta, T.; Kumazawa, S.; Kamihira, M.; Kaji, K.; Uto, Y.; Hori, H.; Nagasawa, H.; Nakayama, T. Suppression of tumor−induced angiogenesis by Brazilian propolis: major component artepillin C inhibits in vitro tube formation and endothelial cell proliferation. Cancer Lett. 2007, 252, 235−243.
(4) Altug, M. E.; Serarslan, Y.; Bal, R.; Kontas, T.; Ekici, F.; Melek, I. M.; Aslan, H.; Duman, T. Caffeic acid phenethyl ester protects rabbit brains against permanent focal ischemia by antioxidant action: a biochemical and planimetric study. Brain Res. 2008, 1201, 135−142.
(5) Drago, L.; De Vecchi, E.; Nicola, L.; Gismondo, M. R. In vitro antimicrobial activity of a novel propolis formulation (Actichelated propolis). J Appl Microbiol. 2007, 103, 1914−1921.
(6) Shimizu, T.; Hino, A.; Tsutsumi, A.; Park, Y. K.; Watanabe, W.; Kurokawa, M. Anti−influenza virus activity of propolis in vitro and its efficacy against influenza infection in mice. Antivir Chem Chemother. 2008, 19, 7−13.
(7) Silici, S.; Koc, N. A.; Ayangil, D.; Cankaya, S. Antifungal activities of propolis collected by different races of honeybees against yeasts isolated from patients with superficial mycoses. J Pharmacol Sci. 2005, 99, 39−44.
(8) Grunberger, D.; Banerjee, R.; Eisinger, K.; Oltz, E. M.; Efros, L.; Caldwell, M.; Estevez, V.; Nakanishi, K. Preferential cytotoxicity on tumor cells by caffeic acid phenethyl ester isolated from propolis. Experientia 1988, 44, 230−232.
(9) Medana, C.; Carbone, F.; Aigotti, R.; Appendino, G.; Baiocchi, C. Selective analysis of phenolic compounds in propolis by HPLC−MS/MS. Phytochem Anal. 2008, 19, 32−39.
(10) Chen, C. N.; Wu, C. L.; Shy, H. S.; Lin, J. K. Cytotoxic prenylflavanones from Taiwanese propolis. J. Nat. Prod. 2003, 66, 503-506.
(11) Chen, C. N.; Wu, C. L.; Lin, J. K. Propolin C from propolis induces apoptosis through activating caspases, Bid and cytochrome c release in human melanoma cells. Biochem. Pharmacol. 2004, 67, 53-66.
(12) Chen, C. N.; Weng, M. S.; Wu, C. L.; Lin, J. K. Comparison of radical scavenging activity, cytotoxic effects and apoptosis induction in human melanoma cells by Taiwanese propolis from different sources. Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2004, 1, 175−185.
(13) Chen, C. N.; Wu, C. L.; Lin, J. K. Apoptosis of human melanoma cells induced by the novel compounds propolin A and propolin B from Taiwanese propolis. Cancer Lett. Cancer Lett. 2007, 245, 218−231.
(14) Huang, W. J.; Huang, C. H.; Wu, C. L.; Lin, J. K.; Chen, Y. W.; Lin, C. L.; Chuang, S. E.; Huang, C. Y.; Chen, C. N. Propolin G, a prenylflavanone, isolated from Taiwanese propolis, induces caspase−dependent apoptosis in brain cancer cells. J. Agric. Food. Chem. 2007, 55, 7366−7376.
(15) Weng, M. S; Liao, C. H.; Chen, C. N.; Wu, C. L.; Lin, J. K. Propolin H from Taiwanese propolis induces G1 arrest in human lung carcinoma cells. J. Agric. Food. Chem. 2007, 55, 5289−5298.
(16) Chen, Y. W.; Wu, S. W.; Ho, K. K.; Lin, S. B.; Huang, C. Y.; Chen, C. N. Characterization of Taiwanese propolis collected from different seasons and locations. J. Sci. Food Agric. 2008, 88, 412−419.
(17) Kumazawa, S.; Goto, H., Hamasaka, T., Fukumoto, S., Fujimoto, T., Nakayama, T. A. A new prenylated flavonoid from propolis collected in Okinawa, Japan. Biosci., Biotechnol. Biochem. 2004, 68, 260−262.
(18) Kumazawa, S.; Ueda, R., Hamasaka, T., Fukumoto, S., Fujimoto, T., Nakayama, T. Antioxidant prenylated flavonoids from propolis collected in Okinawa, Japan. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 7722−7725.
(19) Duvic, M.; Vu, J. Vorinostat: a new oral histone deacetylase inhibitor approved for cutaneous T−cell lymphoma. Expert Opin Investig Drugs. 2007, 16, 1111−1120.
(20) Atmaca, A.; Al−Batran, S. E.; Maurer, A.; Neumann, A.; Heinzel, T.; Hentsch, B.; Schwarz, S. E.; Hoevelmann, S.; Goettlicher, M.; Knuth, A.; Jaeger, E. Valproic acid (VPA) in patients with refractory advanced cancer: a dose escalating phase I clinical trial. Br J Cancer. 2007, 97, 177−182.
(21) Gojo, I.; Jiemjit, A.; Trepel, J. B.; Sparreboom, A.; Figg, W. D.; Rollins, S.; Tidwell, M. L.; Greer, J.; Chung, E. J.; Lee, M. J.; Gore, S. D.; Sausville, E. A.; Zwiebel, J.; Karp, J. E. Phase 1 and pharmacologic study of MS−275, a histone deacetylase inhibitor, in adults with refractory and relapsed acute leukemias. Blood. 2007, 109, 2781−2790.
(22) Hadnagy, A.; Beaulieu, R.; Balicki, D. Histone tail modifications and noncanonical functions of histones: perspectives in cancer epigenetics. Mol Cancer Ther. 2008, 7, 740−748.
(23) Mariadason, J. M. HDACs and HDAC inhibitors in colon cancer. Epigenetics. 2008, 3, 28−37.
(24) McLaughlin, F.; La Thangue, N. B. Histone deacetylase inhibitors open new doors in cancer therapy. Biochem Pharmacol. 2004, 68, 1139−1144.
(25) Villar−Garea, A.; Esteller, M. Histone deacetylase inhibitors: understanding a new wave of anticancer agents. Int J Cancer 2004, 112, 171−178.
(26) Shankar, S.; Srivastava, R. K. Histone deacetylase inhibitors: mechanisms and clinical significance in cancer: HDAC inhibitor−induced apoptosis. Adv Exp Med Biol. 2008, 615, 261−298.
(27) Pan, L. N.; Lu, J.; Huang, B. HDAC inhibitors: a potential new category of anti−tumor agents. Cell Mol Immunol. 2007, 4, 337−343.
(28) Cao, G.; Sofic, E.; Prior, R. L. Free Radic. Biol. Med. 1997, 22, 749−760.
(29) Chen, Y. W. et al., J. Sci. Food Agric. 2007, DOI: 1002/jsfa.
(30) Wu, X. et al., Int J Neuropsychopharmacol. 2008 Jul 9:1−12.
(31) Leng Y. et al., J Neurosci. 2008 Mar 5;28(10):2576−88.
(32) Gray SG and Dangond F. Epigenetics. 2006 Apr−Jun;1(2):67−75. Epub 2006 Mar 5.
(33) Sandri−Vakili G. et al., Hum Mol Genet. 2007 Jun 1;16(11):1293−306. Epub 2007.
(34) Hahnen E. et al., J Neurochem. 2006 Jul;98(1):193−202.
(35) Riessland M. et al., Hum Genet. 2006 Aug;120(1):101−10. Epub 2006 May.
(36) Kernochan LE et al., Hum Mol Genet. 2005 May 1;14(9):1171−82. Epub 2005 Mar.
(37) Minamiyama M et al., Hum Mol Genet. 2004 Jun 1;13(11):1183−92. Epub 2004 Apr.
(38) Corcoran LJ et al., Curr Biol. 2004 Mar 23;14(6):488−92.
(39) Hockly E et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Feb 18;100(4):2041−6. Epub 2003.
(40) Sadri−Vakili G et al., Hum Mol Genet. 2007 Jun 1;16(11):1293−306. Epub 2007 Apr.

発明の簡単な概要
一局面において、本発明は、

からなる群から選択される式により示される、新規プレニルフラバノン化合物を提供する。

別の局面において、本発明は、上記のプレニルフラバノン化合物の少なくとも１個を含む医薬組成物を提供する。

さらに別の局面において、本発明は、疾患または状態を処置する方法またはそれを必要とする対象に所望の効果を与える方法であって、少なくとも１個の上記の化合物または上記の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法を提供する。

発明の詳細な説明
他に特に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術および科学用語は、当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。

一局面において、本発明は、台湾製プロポリスから単離されたプレニルフラバノン化合物を提供する。

該プレニルフラバノン化合物の一態様は、下記の式：

で示される、５，７，３’，４’−テトラヒドロキシ−６−ファルネシルフラボン（“プロポリンＩ”と称される）である。

式Ｉの化合物は、分子式Ｃ_３０Ｈ_３６Ｏ_６および分子量４９２．２５Ｄａを有する。

プレニルフラバノン化合物の別の態様は、下記の式：

で示される、５，７，４’−トリヒドロキシ−６−ゲラニルフラボン（“プロポリンＪ”と称される）である。

式ＩＩの化合物は、式Ｃ_２５Ｈ_２８Ｏ_５および分子量４０８．１９Ｄａを有する。

上記の本発明のプレニルフラバノン化合物は、ＨＤＡＣ酵素活性および癌細胞、好ましくは乳癌細胞の増殖に対して阻害効果を有する。

従って、別の局面において、本発明は、本発明の化合物の少なくとも１個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、ＨＤＡＣ阻害剤としての医薬組成物を提供する。

さらに別の局面において、本発明は、本発明の化合物の少なくとの１個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、癌細胞増殖を阻止するための医薬組成物を提供する。

本発明はまた、本発明の化合物の少なくとも１個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、ヒストン脱アセチル化と関係する疾患の処置のための医薬組成物を提供する。

さらに、公知のＨＤＡＣ阻害剤の多くは、ＨＤＡＣ阻害剤が神経変性疾患の処置に有用であることを示す、神経保護効果^{（３０，３１）}を有することが証明されている。神経変性疾患の例は、多発性硬化症（ＭＳ）^（３２）、ハンチントン病（ＨＤ）^{（３３，３９，４０）}、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）^{（３４，３５，３６）}、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）^（３７）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）^（３８）であるが、これらに限定されない。

従って、本発明は、本発明の化合物の少なくとも１個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、神経保護効果を有する医薬組成物に関する。

本発明はまた、本発明の化合物の少なくとも１個および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、神経変性疾患を処置するための医薬組成物に関する。好ましくは、該神経変性疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。

本発明の組成物の製造において、活性成分としての本発明の化合物は通常、賦形剤を用いて希釈されるか、またはカプセル剤、カシェ剤(sachet)、ペーパーまたは他の容器の形態であり得る担体中に入れられる。用いる賦形剤は、典型的に、ヒト対象または他の哺乳動物への投与に適する賦形剤である。適する賦形剤のいくつかの例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン類、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸類、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、およびメチルセルロースが含まれるが、これらに限定されない。加えて、本発明の組成物は、錠剤、ピル、粉末、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル（固体として、または液体媒体中）、軟膏、カプセル、または滅菌包装粉末の形態であり得る。

該組成物は、ヒト、サル、イヌなどを含む対象に、例えば経口投与により投与され得るか、または注射製剤の形態で非経腸投与により投与され得る。典型的には、本発明の組成物は、約１２５ないし約２５０ｍｇの本発明の化合物（プロポリンＩもしくはＪ、または両方）を含む。成人への投与量は、好ましくは１日当たり約５００ないし約１０００ｍｇであり、それは単一用量または分割用量の形態で投与され得る。

別の局面において、本発明は、疾患または状態を処置する方法またはそれを必要とする対象に所望の効果を与える方法であって、少なくとも１個の上記の化合物または上記の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法を提供する。

本明細書に記載の本発明の処置を必要とする対象には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物が含まれる。非ヒト哺乳動物は、ネコ、イヌなどのペット動物およびウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜動物が含まれるが、これらに限定されない。

特に、上記の本発明の方法は、対象における癌細胞増殖の阻止に有用である。とりわけ、本発明の方法は、対象における乳癌細胞増殖の阻止に有用である。

加えて、本発明の方法は、ヒストン脱アセチル化と関係する疾患の処置に有用である。さらに、本発明の方法は、対象において神経保護効果を供し得る。

さらに、本発明の方法は、対象における神経変性疾患の処置に有用である。具体的には、該神経変性疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択される。

本発明は、本明細書中、限定ではなく説明を目的として提供される下記の態様を参照してより具体的に記載され得る。

多角的な図面の簡単な説明
上記の発明の概要、ならびに上記の本発明の詳細な説明は、添付の図面を併用して読むとき、より理解され得る。本発明の説明を目的として、現在好ましい態様を図面に示す。しかしながら、本発明は、示した好ましい態様に限定されないことが理解されるべきである。

図１は、プロポリンＩのＨとＣの重要なＨＭＢＣ相関を示す。 図２は、プロポリンＪのＨとＣの重要なＨＭＢＣ相関を示す。 図３は、実施例２の逆相分取ＨＰＬＣのピークを示す。 図４Ａは、種々の濃度の異なるプロポリンで２４時間処理したＭＣＦ−７細胞の染色結果を示し、ここで（ａ）は、対照処理であり；（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、それぞれ５、１０および１５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＦ処理であり；（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）は、それぞれ２．５、５．０および７．５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＩ処理であり；そして、（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）は、それぞれ５、１０および１５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＪ処理である。 図４Ｂは、種々の濃度の異なるプロポリンで２４時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の染色結果を示し、ここで（ａ）は、対照処理であり；（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、それぞれ５、１０および１５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＦ処理であり；（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）は、それぞれ２．５、５．０および７．５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＩ処理であり；そして、（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）は、それぞれ５、１０および１５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＪ処理である。 図４Ｃは、種々の濃度の異なるプロポリンで７２時間処理したＭＣＦ−７細胞の染色結果を示し、ここで（ａ）は、対照処理であり；（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、それぞれ５、１０および１５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＦ処理であり；（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）は、それぞれ２．５、５．０および７．５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＩ処理であり；そして、（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）は、それぞれ５、１０および１５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＪ処理である。 図４Ｄは、種々の濃度の異なるプロポリンで７２時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の染色結果を示し、ここで（ａ）は、対照処理であり；（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ１０および１５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＦ処理であり；そして（ｄ）および（ｅ）は、それぞれ５．０および７．５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＩ処理であり；そして、（ｆ）および（ｇ）は、それぞれ１０および１５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＪ処理である。 図４Ｅは、種々の濃度の異なるプロポリンで７２時間処理したＭＣＦ−７細胞の数を示す。 図５Ａは、種々の濃度の異なるプロポリンで７２時間処理したＭＣＦ−７細胞についてのフローサイトメトリー分析の結果を示し、ここで、（ａ）は、対照処理であり；（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、それぞれ５、１０および１５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＦ処理であり；（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）は、それぞれ２．５、５．０および７．５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＩ処理であり；そして、（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）は、それぞれ５、１０および１５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＪ処理である。 図５Ｂは、様々な濃度の異なるプロポリンで２４時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞についてのフローサイロメトリー分析の結果を示し、ここで、（ａ）は、対照処理であり；（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、それぞれ５、１０および１５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＦ処理であり；（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）は、それぞれ２．５、５．０および７．５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＩ処理であり；そして、（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）は、それぞれ５、１０および１５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＪ処理である。 図５Ｃは、種々の濃度の異なるプロポリンで７２時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞についてのフローサイロメトリー分析の結果を示し、ここで、（ａ）は、対照処理であり；（ｂ）および（ｃ）は、それぞれ１０および１５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＦ処理であり；そして（ｄ）および（ｅ）は、それぞれ５．０および７．５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＩ処理であり；そして、（ｆ）および（ｇ）は、それぞれ１０および１５μｇ／ｍＬ濃度のプロポリンＪ処理である。 図６Ａは、実施例６の免疫細胞化学実験の結果を示す。 図６Ｂは、実施例６のウェスタンブロット分析の結果を示す。

実施例１：一次抽出
２００ｇのＴＷ−Ｉ等級の台湾製プロポリス（hives located in Tainan, Taiwanから入手）^（２９）を、低温で撹拌により均質化した。その後、均質化したサンプルを１．０Ｌの脱イオン水で３回洗浄し、残渣を９５％エタノールで３回抽出した。濾過したエタノール抽出物を減圧下で蒸発乾固し、褐色粉末（１３５．６ｇ）を得て、それをさらなる精製まで−２０℃で貯蔵した。

実施例２：化合物の単離および精製
エタノール抽出物から得られた褐色粉末をメタノール中に溶解し、Sephadex LH−20カラム（Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）に適用して溶出溶媒として９５％エタノールを用いた。再クロマトグラフィーにより得られた画分を含む全ての溶出物を、ヒト乳癌増殖に対するそれらの効果について分析し、活性画分を、Sephadex LH−20カラムのクロマトグラフィーにより９５％エタノールを溶出剤として用いて再び分離した。次に、該活性画分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Kiesel gel 60, E. Merck, Darmstadt 1, Germany）に付してｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ溶媒系を用いた。

最も活性な画分の精製を、逆相分取ＨＰＬＣ（ｎ−ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、３０：７０）により行った。実験条件は、下記の通りであった：カラムは、Luna Phenomenex （Ｃ１８、２５０×４．６ｍｍ）であり；溶媒系は、メタノール／水（８：２）であり；流速は、１ｍＬ／分であり；そして、検出は、ＵＶ２８０ｎｍで行った。保持時間１９．０分（プロポリンＩ）および１０．５分（プロポリンＪ）の画分を集め、それによりプロポリンＩ（淡黄色粉末）およびプロポリンＪ（淡黄色液体）をそれぞれ単離した。図３は、逆相分取ＨＰＬＣのピークを示す。

実施例３：プロポリンＩおよびプロポリンＪの同定
プロポリンＩおよびＪそれぞれの構造を、下記の装置：参照基準として溶媒ピーク（ＭｅＯＨ−ｄ３）を用いて、Perkin Elmer 1760−X IR−FT分光計；日立 150−20 UV；Jasco J−710 分光偏光計；Finnigan MAT−95XL質量分光計（ＥＩ）；および、Bruker AV−500 分光計、を用いて分析した。

プロポリンＩ
プロポリンＩの物理化学的データを下記に示す：
［□］^２０ _Ｄ＋３．８（ｃ ０．２６、ＣＨ_３ＯＨ）；ＩＲ νｍａｘ（フィルム）３７４７、３３９０、２９２３、１６３６ｃｍ^−１；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λｍａｘ ｎｍ（ｌｏｇε）２０７．０（１．６５）、２９１（０．７３）；ＣＤ（ＭｅＯＨ）３４７ｎｍ（Δε＋３．１９）、２９４ｎｍ（Δε−３．９８）；ＨＲＥＩＭＳ ｍ／ｚ４９２．２５１２（Ｃ_３０Ｈ_３６Ｏ_６の計算値４９２．２５１２）；^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲ。

^１Ｈ ＮＭＲスペクトルから、４個のオレフィンメチル基（δ_Ｈ １．５２、１．５６、１．６３、１．７４）、８個のメチレンプロトン（δ_Ｈ １．８７、１．９５、２．０５）、２個のベンジルメチレンプロトン（δ_Ｈ ３．２０）および２個のビニルプロトン（δ_Ｈ ５．０４、５．１８）の存在が確認され、それはファルネシル基の存在を示した。また、^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、４個のメチル基（δ_ｃ １６．１、１６．２、１７．８、２５．９）、５個のメチレン炭素（δ_ｃ ２１．８、２７．３、２７．８、４０．８、４０．９）、３個の第三級オレフィン炭素（δ_ｃ １２４．１、１２５．３、１２５．６）および３個の第四級オレフィン炭素（δ_ｃ １３２．０、１３４．９、１３５．８）の存在を示し、それはファルネシル基の存在をさらに支持した。さらに、δ_Ｈ ５．２１（１Ｈ, ｄｄ, Ｊ＝３．０, １３．０Ｈｚ）、２．６５（１Ｈ, ｄｄ, Ｊ＝３．０, １７．０Ｈｚ）、および３．０２（１Ｈ, ｄｄ, Ｊ＝１３．０, １７．０Ｈｚ）でのＡＢＸ系は、Ｈ−２およびＨ−３位それぞれでフラバノン骨格に特徴的なパターンを示した。

加えて、全体の^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲ配置および結合（connectivity）は、^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、およびＨＭＢＣデータの推論に基づいて決定された。プロポリンＩのＨＭＢＣスペクトルは、δ_Ｈ ３．２０（Ｈ−１”）でのメチレンシグナルが、Ｃ−５（δ_ｃ １６２．５）およびＣ−７（δ_ｃ １６５．９）それぞれと相関したことを明らかにし、それはファルネシル基がＣ−６に結合したことを示唆した（図１）。加えて、そのＣＤスペクトルは、Ｃ−２配座がＳ形であることを示した。

従って、プロポリンＩは、上記の式Ｉにより示される５，７，３’，４’−テトラヒドロキシ−６−ファルネシルフラバノンとして同定された。この化合物は初めて単離され、既刊文献に開示されていなかった。

プロポリンＪ
プロポリンＪの物理化学的データを下記に示す：
［□］^２０ _Ｄ＋２．４（ｃ ０．４１、ＣＨ_３ＯＨ）；ＩＲ νｍａｘ（フィルム）３７４７、３３９３、２９２５、２３６１、１６３７ｃｍ^−１；ＵＶ（ＥｔＯＨ）λｍａｘ ｎｍ（ｌｏｇε）２０９．０（１．８２）、２９３（０．９２）；ＣＤ（ＭｅＯＨ）３２８．９ｎｍ（Δε＋２．３７）、２８９ｎｍ（Δε−３．９８）；ＨＲＥＩＭＳ ｍ／ｚ ４０８．１９４４（Ｃ_２５Ｈ_２８Ｏ_５の計算値４０８．１９３７）；^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲ。

^１Ｈ ＮＭＲスペクトルから、３個のオレフィンメチル基（δ_Ｈ １．５５、１．６１、１．７４）、４個のメチレンプロトン（δ_Ｈ １．９３、２．０４）、２個のベンジルメチレンプロトン（δ_Ｈ ３．１８）および２個のビニルプロトン（δ_Ｈ ５．０５、５．１８）の存在が確認され、それはゲラニル基の存在を示した。また、^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、３個のメチル基（δ_ｃ １６．２、１７．７、２５．９）、３個のメチレン炭素（δ_ｃ ２１．８、２７．７、４０．９）、２個の第三級オレフィン炭素（δ_ｃ １２３．９、１２５．５）、および２個の第四級オレフィン炭素（δ_ｃ １３２．０、１３５．３）の存在を示し、それはゲラニル基の存在をさらに支持した。さらに、δ_Ｈ ５．２９（１Ｈ, ｄｄ, Ｊ＝２．７, １３．０Ｈｚ）、２．６７（１Ｈ, ｄｄ, Ｊ＝２．７, １７．０Ｈｚ）、および３．０８（１Ｈ, ｄｄ, Ｊ＝１３．０, １７．０Ｈｚ）でのＡＢＸ系は、Ｈ−２およびＨ−３位それぞれでフラバノン骨格に特徴的なパターンを示した。

加えて、全体の^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲ配置および結合は、^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、およびＨＭＢＣデータの推論に基づいて決定された。プロポリンＪのＨＭＢＣスペクトルは、δ_Ｈ ３．１８（Ｈ−１”）でのメチレンシグナルが、Ｃ−５（δ_ｃ １６２．５）およびＣ−７（δ_ｃ １６６．０）それぞれと相関したことを明らかにし、それはゲラニル基がＣ−６に結合したことを示唆した（図２）。加えて、そのＣＤスペクトルは、Ｃ−２配座がＳ形であることを示した。

従って、プロポリンＪは、上記の式ＩＩにより示される５，７，４’−トリヒドロキシ−６−ゲラニルフラバノンとして同定された。この化合物は初めて単離され、既刊文献に開示されていなかった。

表１は、プロポリンＩおよびＪの物理化学的データを列記する。

実施例４：細胞培養および細胞毒性分析
ヒト乳癌ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、Food Industry Research and Development Institute（Hsinchu, Taiwan）から購入した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン希釈液、および２ｍＭグルタミンを含むダルベッコの修飾イーグルス培地（Gibco）中で培養した。細胞を、９５％大気および５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下、３７℃で維持した。しかしながら、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン希釈液、および２ｍＭグルタミンを含むＬ−１５培地（Gibco）中で培養した。細胞を、１００％大気および０％ＣＯ_２の加湿雰囲気下、３７℃で維持した。

プロポリンＦ、ＩおよびＪをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの一定濃度で調製した。細胞（ディッシュ当たり１．５×１０^６）を、１００ｍｍディッシュ中で培養して１４時間インキュベートし、その後ＤＭＳＯまたは異なる濃度のプロポリン（２．５、５．０、１０および２０．０μｇ／ｍＬ）で４８時間処理した。プロポリンは、４０８−４９２Ｄａの範囲の分子量を有する小さい化合物である。これらの値は、それぞれのモル濃度に変換された。

細胞を計測し、それらの生存率をトリパンブルー排除分析により決定した。活性は、ＩＣ_５０値（５０％細胞毒性をもたらすのに必要な濃度）として示され、平均値を３つのデータ点から得た。

表２は、本発明のプロポリンＩおよびＪのＩＣ_５０（μＭ）値、および細胞毒性分析で得られた対照としてプロポリンＦのＩＣ_５０（μＭ）値を示す。

従って、本発明の化合物（プロポリンＩおよびＪ）は、ヒト乳癌細胞に対して細胞毒性活性を有することが見出されている。

実施例５：癌細胞増殖に対するプロポリンＩおよびＪの阻害効果
細胞染色
２タイプの乳癌細胞株、ＭＣＦ−７（ＥＲ受容体陽性）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＥＲ受容体陰性）を、実施例５に記載の条件で培養した。細胞を、様々な濃度の異なるプロポリンで２４時間または７２時間処理した。処理した細胞をトリパンブルーで染色し、生存率を評価した。

図４Ａは、種々の濃度のプロポリンで２４時間処理したＭＣＦ−７細胞の染色結果を示す。図４Ｂは、種々の濃度のプロポリンで２４時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の染色結果を示す。図４Ｃは、種々の濃度のプロポリンで７２時間処理したＭＣＦ−７細胞の染色結果を示す。図４Ｄは、種々の濃度のプロポリンで７２時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の染色結果を示す。図４Ｅは、種々の濃度のプロポリンで７２時間処理したＭＣＦ−７細胞の細胞数を示す。

フローサイロメトリー分析
１００ｍｍディッシュ中、ヒト乳癌ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１．５×１０^６）を、種々の濃度のプロポリンＦ、Ｉ、およびＪで２４時間または７２時間処理した。細胞をトリプシン処理し、氷冷ＰＢＳで集めた。細胞を２００μＬのＰＢＳ中に再懸濁し、８００μＬの氷１００％エタノールを添加して固定し、その後−２０℃で一晩インキュベートした。細胞ペレットを遠心により集め、１ｍＬの低張緩衝液（ＰＢＳ中０．５％トライトンＸ−１００および１μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ）中に再懸濁し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。その後、１ｍＬのＰＩ溶液（５０μｇ／ｍＬ）を添加し、混合物を３０分間４℃で放置した。その後、細胞のＤＮＡ含有量をＦＡＣＳｃａｎサイトメトリー（Becton Dickinson）により分析した。

図５Ａは、種々の濃度のプロポリンで７２時間処理したＭＣＦ−７細胞の結果を示す。図５Ｂは、種々の濃度のプロポリンで２４時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の結果を示す。図５Ｃは、種々の濃度のプロポリンで２４時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の結果を示す。

図４および５に示す通り、本発明の化合物は、癌細胞の増殖に阻害効果を有することが証明された。

ウェスタンブロットアッセイ
１００ｍｍディッシュ中、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞（１．５×１０^６）を、様々な濃度のプロポリンＦ、Ｉ、およびＪで２４時間処理した。処理後、細胞を集め、１００μＬの溶解緩衝液中に再懸濁した。等量のタンパク質（３０μｇ）を２×サンプル緩衝液で混合し、β−アクチン、Ｂｉｄ、ｐ２１、Ａｃ−ヒストン３、ＣＴＰＳ、およびゲルゾリン検出のために１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させた。タンパク質をimmobilon膜（ＰＶＤＦ； Millipore Corp.）に電気的に移動させ、当量のタンパク質充填を、可逆的色素のアミドブラック（Sigma Chemical Co.）で膜を染色して確認した。次いで、これを一晩、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ トゥイーン２０、および３％ＢＳＡを含む溶液でブロッキングした。用いた特異的抗体は、抗ヒトＢｉｄ（１：５００のウサギポリクローナル； Cell Signaling Technology, Inc.）、抗Ａｃ−ヒストン３（１：１０００のウサギポリクローナル；Cell Signaling Technology, Inc.）、抗ｐ２１（１：１０００のマウスモノクローナル；BD Pharmingen Technology, Inc.）抗ＣＴＰＳ（１：１０００のマウスモノクローナル；ABNOVA TAIWAN Corporation）、ゲルゾリン（１：１０００のマウスモノクローナル； Sigma Chemical Co.）、および抗−β−アクチン（１：５０００のマウスモノクローナル；Cell Signaling Technology, Inc.）であった。これらのタンパク質を化学発光（ECL, Amersham）により検出した。

実施例６：ＨＤＡＣ酵素活性分析
免疫細胞化学実験
ＭＣＦ−７細胞を６ウェルの培養スライド上で培養し、プロポリンＦ、ＩおよびＪで６時間処理した。ＨＤＡＣ阻害剤として公知のＳＡＨＡを陽性対照として用いた。スライドを室温で８０％メタノール溶液中３０分間固定し、その後、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を室温で０．３％トライトンＸ−１００で３０分間透過処理し、次いでＰＢＳ中１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で１時間、室温でブロッキングし、その後、４℃で一晩、１：５００希釈した抗アセチル化ヒストンＨ３（Cell Signaling）と共にインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、スライドを抗ウサギＩｇＧ−結合二次抗体で１．０時間染色し、その後、ＰＢＳで３回洗浄し、封入剤（Sigma）でマウントした。対照実験と並行して、一次抗体の脱落が、染色を排除することが観察された。スライドを、Olympus PM30 カメラを備える蛍光顕微鏡（Melville, NY）を用いて分析した。図６Ａは、免疫細胞化学実験の結果を示す。

ウェスタンブロッティング分析
ウェスタンブロティング分析を、実施例６に記載の方法に従い、Ａｃ−ヒストン３、ｐ２１、ゲルゾリン、ＣＴＰＳおよびβ−アクチンについて行った。図６Ｂは、ウェスタンブロティング分析の結果を示す。

図６ＡおよびＢに示す通り、本発明の化合物は、ＨＤＡＣ酵素活性に対する阻害効果を有することが証明された。

Claims (15)

1. 下記の式
   

   

   
   からなる群から選択される式により示される化合物。
2. 少なくとも１個の請求項１記載の化合物および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、ＨＤＡＣ阻害剤としての医薬組成物。
3. ＨＤＡＣ阻害剤として有用な、請求項２記載の医薬組成物。
4. 癌細胞増殖の阻止に有用な、請求項２記載の医薬組成物。
5. 乳癌細胞の増殖を阻止するのに有効な、請求項２記載の医薬組成物。
6. ヒストン脱アセチル化と関係する疾患を処置するのに有用な、請求項２記載の医薬組成物。
7. 神経保護効果を供し得る、請求項２記載の医薬組成物。
8. 神経変性疾患を処置するのに有用な、請求項２記載の医薬組成物。
9. 該神経変性疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択される、請求項８記載の医薬組成物。
10. 癌細胞増殖を阻止する方法であって、それを必要とする対象において、請求項１記載の化合物または請求項２記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
11. 乳癌細胞の増殖を阻止する方法であって、それを必要とする対象において、請求項１記載の化合物または請求項２記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
12. ヒストン脱アセチル化と関係する疾患の処置方法であって、それを必要とする対象において、請求項１記載の化合物または請求項２記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
13. 神経保護効果を提供する方法であって、それを必要とする対象において、請求項１記載の化合物または請求項２記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
14. 神経変性疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象において、請求項１記載の化合物または請求項２記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法。
15. 該神経変性疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択される、請求項１４記載の方法。

Images