KR101750994B1 - 황금 추출물을 유효성분으로 함유하는 sasp 억제를 통한 노화관련 만성질환 치료 및 예방제 - Google Patents

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Abstract

황금 추출물부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하며, SASP 억제를 통한 노화관련 만성질환 치료 및 예방제가 제공된다.

Description

황금 추출물을 유효성분으로 함유하는 SASP 억제를 통한 노화관련 만성질환 치료 및 예방제{A composition containing extract of Scutellariae radix via suppression of SASP}
본 발명은 황금 추출물을 유효성분으로 함유하는 SASP 억제를 통한 노화관련 만성질환 치료 및 예방제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포 노화자체에는 영향이 없고, 노화 세포 자체에서 분비되는 SASP들의 생성만을 저해하여 노화작용 억제에 따른 부작용을 최소화할 수 있는 황금 추출물을 유효성분으로 함유하는 SASP 억제를 통한 노화관련 만성질환 치료 및 예방제에 관한 것이다.
암, 당뇨병, 동맥경화증, 알츠하이머병등과 같은 만성질환은 많은 부분 세포 노화로 인해 발생하며, low-grade 혹은 sterile inflammation으로 불리는 지속적인 만성 염증에 길게는 수십 년 이상 노출되어 증상이 악화된다. 이러한 만성 염증은 정상적인 노화과정 중에 발생할 수 있으며, 실제 50세 이상 사람의 혈액내 IL-6와 TNF-α 같은 염증성 인자들이 2-4배 증가되어있다는 보고가 있다 (Bruunsgaard, Dan Med Bull. 53: 285-309, 2006).
이처럼 만성염증성 질환들의 발병과 증상 악화는 노화와 밀접한 관계가 있다고 밝혀지고 있지만, 만성염증의 특성상 정확한 연결고리를 찾는 것이 어려웠다. 하지만 최근 직접적인 매개체로서 노화가 진행된 세포에서 분비되는 노화세포의 분비활성(senescence-associated secretory phenotype, 이하 SASP)들이 주목받기 시작하면서 이와 관련된 다양한 연구들이 진행되고 있다.
세포 노화시 세포 성장 및 분열은 제한되지만, 대사 활성은 유지됨에 따라 SASP이라고 불리는 다양한 싸이토카인(cytokine)이나 케모카인(chemokine), ECM 분해 프로테아제(protease), 성장인자(growth factor) 등이 생성되어 세포 밖으로 분비되는데 세포 종류에 따라 40-80개의 인자들이 이에 해당된다. 이렇게 분비된 SASP들은 여러 세포나 다양한 조직에서 만성염증성 질환을 유발시키거나 증상을 악화시키는 원인으로 작용한다.
정상적인 세포 노화 작용은 노화세포 자체의 성장지연(growth arrest)으로 인해 암 발생을 억제시키고, SASP의 분비를 통해 면역세포들을 활성화시켜서 주변 조직의 노화세포나 이상세포들을 제거하는 역할을 하는 순기능을 가지는 반면에, 조직내에서 이러한 노화세포로부터 분비되는 낮은 농도의 SASP들에 장기간 지속적으로 노출된다면 주변의 정상조직이나 세포가 파괴되어 만성질환이 유발되거나 증상이 악화될 수 있고, 암세포가 발생 혹은 전이의 가능성을 높일 수 있다 (Campisi, Cell. 120: 513-522, 2005; Collado et al., Cell. 130: 223-233, 2007).
또한 나이가 들면서 이러한 SASP를 분비하는 노화세포 수가 많아짐에 따라 이러한 암 발생을 비롯한 만성염증성 질환의 위험성 역시 증가되는 것이다. 즉 노화와 관련된 만성질환 치료에 있어서 노화작용 자체를 차단하는 방법은 노화의 복잡성 및 노화자체의 암 억제기능 같은 순기능을 저해할 수 있기 때문에 이러한 접근방법보다는, 세포 노화 자체에는 영향이 적고 노화세포가 분비하는 SASP의 발현만을 억제하여 만성염증을 완화시키는 방법이 앞으로의 만성염증성 질환 치료제 개발에 이상적일 것으로 사료된다.
동맥경화증과 같은 혈관 질환과 관련하여 IL-1β등이 노화된 혈관 내피세포에 염증작용에 관여하며 (Suzuki et al., Scientific World Journal. 2013: 754735, 2013), 당뇨병 경우 세포노화로 인한 인슐린분비 및 인슐린 저항성 이상이 초래되어 제2형 당뇨병 발생 위험이 증가하는데, IL-1β, IL-6, MCP-1등과 같은 SASP들이 인슐린 저항성과 관련되어 있으므로 SASP과 당뇨병과의 연관성을 추측해볼 수 있다 (Daniele et al., Acta Diabetol. 51: 123-131, 2014; Handa et al., Obesity (Silver Spring). 21: 306-309, 2013; Sarvas et al., Physiol Rep. 2: e12064, 2013). 알츠하이머병 역시 노화가 진행된 성상세포에서 분비되는 IL-6, IL-8, MMP등과 같은 SASP 분비 증가로 만성 염증성 자극이 유발되는데, 이는 결국 알츠하이머병의 증상을 악화시킬 수 있다 (Bhat et al., PLoS One. 7: e45069, 2012).
이처럼 노화로 인한 만성염증성 질환의 발생과 악화는 다양한 SASP 인자들의 분비와 밀접하게 연관되어있다. 그러므로, 세포의 정상적인 노화 작용 자체에는 영향이 적고, SASP 인자들의 생성만을 저해하는 부작용이 적은 유도체가 유망하며, 본 발명자는 최근 수종의 플라보노이드 유도체들이 SASP 저해작용이 있음을 최초로 보고하였다(Lim et al., Biochem Pharmacol. 96: 337-348, 2015). 하지만, 보다 효과적인 SASP 저해작용이 있는 새로운 물질의 발견과 연구가 필요한 상황이다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 SASP 저해작용이 있는 새로운 물질을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 황금 추출물부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하며, SASP 억제를 통한 노화관련 만성질환 치료 및 예방제를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화합물은 하기 식 1의 화합물이다.
Figure 112016011042212-pat00001
(1)
(상기 식에서 A 내지 F는 H, OH, OCH3 글루코스,
Figure 112016011042212-pat00002
로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)
본 발명의 일 실시예에서, 상기 식의 A는 OH이며, 상기 C는 OCH3이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 황금 추출물은 물 또는 수용성 알콜을 이용하여 황금으로부터 추출된 추출물이다.
본 발명은 SASP 억제를 통한 노화관련 만성질환 치료 및 예방 효과를 가진 황금으로부터 분리된 플라노보이드 유도체로서, 하기 식 2의 화합물 중 어느 하나인 SASP 억제를 통한 노화관련 만성질환 치료 및 예방제를 제공한다.
Figure 112016011042212-pat00003
(2)
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화합물은 하기 식 3의 화합물 중 어느 하나이다.
Figure 112016011042212-pat00004
(3)
본 발명의 일 실시예에서, 상기 노화관련 만성질환 치료 및 예방제는 세포 노화에는 영향을 주지 않고, SASP를 선택적으로 억제한다.
본 발명으로부터 황금 추출물 및 위 구조의 구성성분을 주요성분으로 하는 조성물을 기반으로 하는 SASP 저해제와 이에 따른 노화로부터 발생하는 만성질환의 치료 및 예방제를 제공한다. 본 발명에 따른 만성질환의 치료 및 예방제는 황금 추출물 및 위 유도체들은 세포 노화자체에는 영향이 없고, 노화 세포 자체에서 분비되는 SASP들의 생성만을 저해하여 노화작용 억제에 따른 부작용을 최소화할 수 있다. 따라서, 노화로 인한 만성염증성질환의 예방 및 증상 개선에 보다 안전하고 효과적인 제제 개발이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 황금 추출물로 분획된 화합물의 구조식이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 황금 추출물의 블레오마이신에 의한 IL-6와 IL-8 생성 억제에 관한 실험결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 황금 추출물의 블레오마이신에 의한 BrdU uptake에 대한 영향에 관한 실험결과이다.
도 4는 플라보노이드 유도체들의 IL-6 생성 억제에 관한 실험결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라 황금으로부터 분리한 유도체들의 다양한 SASP 유전자들의 발현 억제에 관한 실험결과이다.
도 6은 BrdU uptake 실험결과이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명은 SASP 저해제를 연구하던 중 황금 및 그 성분들에서 SASP 저해 활성이 있을 뿐만 아니라, 그 작용이 강력하다는 것을 최초로 발견하였다.
황금은 여러해살이 풀인 속썩은풀 (Scutellaria baicalensis George)의 뿌리를 말린 것으로, 청열, 조습, 해독, 안태 등의 효능이 있고, 예로부터 황달, 설사, 소염성 해열, 출혈성 염증등에 사용해왔다. 황금의 주요성분은 바이칼린(baicalin), 바이칼레인(baicalein), 워고닌(wogonin), 워고노사이드(wogonoside), 네오바이칼레인(neobaicalein), β-시토스테롤(β-sitosterol)들로 구성되어있다.
황금 추출물과 주요 성분들의 항박테리아, 항염증, 항암효능이 알려져 있다. 예를 들면, 황금 물 추출물 및 부탄올 분획의 항염증 효능은 LPS 유도 RAW264.7 세포와 지모산(zymosan) 유도 mouse air-pouch 모델에서 증명되었고 (Kim et al., J Ethnopharmacol. 126: 320-331, 2009; Yoon et al., J Ethnopharmacol. 125: 286-290, 2009),
뇌보호 효능 또한 in vitro 및 in vivo 모델에서 보고된 바 있다 (Yune et al., J Neurochem. 110: 1276-1287. 2009). 또한 마우스에서 TLR4와 NF-κB p65 신호 전달 기전을 저해함으로써 대장염의 증상을 완화시키며 (Feng et al., Int J Clin Exp Med. 7: 4063-4072, 2014), rat 뇌출혈 모델에서 IL-1β, IL-6, MMP-9 생성 감소와 NF-κB 기전 저해를 통해 염증을 억제하고 부종을 감소시켰고 (Zhou et al., Inflammation. 37: 107-115, 2014), 마우스 아쥬반트 유도 류마티스 관절염 모델에서 ICAM-1, VCAM-1, IL-6, TNF-α mRNA 발현을 저해함으로써 염증을 완화시켰다 (Yang et al., Clin Dev Immunol. 2013: 268065, 2013). 이처럼 황금 추출물과 성분들의 항염증작용에 관한 보고는 이미 여러 세포에서 증명되었다. 또한 대한민국 공개특허 2004-0097407호 는 도파민 작용을 억제하는 황금의 의학적 효과를 개시하고 있으며, 2015-0059554호는 황금 추출물이 갖는 암 전이 또는 재발 억제 효과를 개시하고 있다.
황금 추출물 및 구성 성분들의 노화억제와 관련된 수종의 논문이 있다. 즉, 황금 에탄올 추출물은 신경염증을 억제하고, 노화 마우스 모델에서 기억력 장애를 완화시켰다 (Jeong et al., J Biomed Sci. 18: 14, 2011; Shang et al., Acta Pharmacol Sin. 22: 1078-1083, 2001). 또한, 바이칼레인(baicalein)이 C. elegans에서 수명 연장 활성을 보였다 (Havermann et al., J Agric Food Chem. 61: 2158-2164, 2013). 그러나, 노화로 인해 유도되는 만성염증의 억제를 통한 질병억제, 특히 SASP 발현의 억제를 통한 노화관련 질병 억제에 미치는 영향 연구는 보고된 바 없다.
이에 본 발명자는 황금을 대상으로 노화세포로부터 분비되는 SASP 저해 활성을 연구하였고, 그 결과 황금 추출물 및 주요성분인 플라보노이드 유도체들의 강력한 SASP 저해 활성을 확인하였고, 구조-활성 관계를 증명하였다. 황금 추출물 및 구성 성분과 관련하여 노화로 인해 발생하는 다양한 SASP 분비 저해에 관한 연구는 현재까지 보고된 바 없으며, 특히 황금 추출물로부터 분리된 플라보노이드 유도체들의 SASP 저해 활성과 구조-활성 관계를 통한 최적구조의 SASP 저해물질 개발은 최초의 발견으로서 향후 만성 염증성 질환 예방 및 치료제 개발에 향후 사용될 수 있다. 본 명세서에서 만성 염증성 질환이라 함은 노화로 인하여 발생하는 다양한 질환을 모두 포함하며, , 당뇨병, 심장질환, 뇌신경질환, 피부질환 등이 그 예가 될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 플라노보이드 유도체는 노화에 영향을 주지 않으면서 SASP만을 선택적을 억제하며, 하기 화학식 1의 구조를 갖는다.
Figure 112016011042212-pat00005
(1)
(상기 식에서 A 내지 F는 H, OH, OCH3 글루코스,
Figure 112016011042212-pat00006
로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)
특히 본 발명자는 화학식 1의 구조 중 A가 OH인 경우, C가 OCH3인 경우, SASP 저해 효과가 크게 증가되는 특이한 효과를 발견하였는데, 이는 다음에 보다 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 물 또는 수용성 알콜 추출액을 이용하여 수득된 황금 추출물로 분획된 화합물의 구조식이며, 도 1에서 각 구조식 아래의 숫자는 하기 설명하는 화합물 1 내지 18을 의미한다. 도 1의 화합물은 상기 화학식 1의 구조식 범위에 모두 포함되며, 본 발명의 범위는 도 1의 화합물로 한정되지 않는다.
이하 본 발명의 일 실시예를 보다 상세히 설명한다.
실시예 1
황금추출물 및 분획물의 제조
황금은 ㈜서륭상사에서 수입한 중국산을 춘천 대광약업사에서 구입하여 사용하였다. 황금 5.4 kg을 1 kg당 2 L의 80% EtOH을 가하고 80℃의 수욕상에서 3회 환류추출하였으며 추출액을 여과한 후 여액을 40℃에서 감압농축하여 80% EtOH 추출물 2.8 kg을 얻었고 이것을 증류수에 현탁시켜 n-헥산, EtOAc 및 n-BuOH로 각각 분획하고 각 분획물을 감압농축하여 n-헥산 가용성 분획물 (38.7 g), EtOAc 가용성 분획물 (84.4 g) 및 n-BuOH 가용성 분획물 (106 g)을 각각 얻었다.
실시예 2
황금으로부터 플라보노이드 분리 및 구조결정
황금 EtOAc 가용성 분획물 80 g을 실리카 겔 (Merck No. 7734, 1 kg) 칼럼 (15 ㅧ 50 cm)에 걸고 CHCl3 : MeOH = 9 : 1을 용매로 용출시킨 후 TLC 분석을 실시하여 6 개의 소분획 (S-1 ~ S-6)으로 나누었다. 소분획 S-1 (12.9 g)을 Buchi MPLC, 실리카겔 (Merck No. 7734, 400 g) 칼럼 크로마토그래피, ODS 칼럼 크로마토그래피를 연속적으로 실시하여, 화합물 1 (70 mg), 화합물 2 (110 mg) 및 화합물 3 (160 mg)을 얻었다.
소분획 S-2 (25 g)을 실리카겔 (500 g) 칼럼 (15 ㅧ 50 cm), Buchi MPLC, ODS 플래쉬 (Redisep ODS 120g) 칼럼 크로마토그래피를 실시하여, 화합물 4 (65 mg), 화합물 5 (5 mg), 화합물 6 (20 mg), 7 (7 mg), 화합물 8 (6 mg), 화합물 9 (2.4 mg), 화합물 10 (4.2 mg), 화합물 11 (4 mg)과 12 (2.4 mg)을 각각 얻었다.
소분획 S-3 (19 g)을 실리카 (Merck No. 7734, 500 g) 칼럼 (10 ㅧ 50 cm), ODS (YMC Gel ODS-A, 350 g)를 이용하여 칼럼 (10 ㅧ 50 cm)에 걸어 정제하여 화합물 13 (350 mg)을 얻었다. 소분획 (1.7 g)을 대상으로 40% MeOH을 용매로 ODS 플래쉬 (Retrieve combiflash 130 g) 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물 14 (1.3 g)을 얻었다.
소분획 S-4 (11 g)을 대상으로 실리카겔 플래쉬 (Redisep silica gel, 120 g) 칼럼 크로마토그래피, ODS (YMC Gel ODS-A, 350 g)를 이용하여 칼럼 (10 ㅧ 50 cm)에 걸고 정제하여 화합물 15 (365 mg)와 화합물 16 (2.3 g)을 얻었다.
n-BuOH 가용성 분획 (30 g)을 silica gel (Merck No. 7734, 500 g) 칼럼 (7 ㅧ 50 cm)에 걸고 EtOAc: MeOH: H2O = 8 : 1.5 : 0.5를 용매로 용출시켜 3 개의 소분획 (SB-1 ~ SB-3)으로 나누었다. 이 중 소분획 SB-3 (9.5 g)을 MeOH에 용해시켜 가용부와 비가용부로 나눈 후 비가용부를 정제하여 화합물 17 (40 mg)을 얻었고, 가용부는 2.5 g 만을 취하여 실리카겔 (Merck No. 9385, 100 g) 칼럼 (4 ㅧ 50 cm)에 걸고 CHCl3 : MeOH : H2O = 2.5 : 1 : 0.1을 용매로 용출시켜 화합물 18 (1.98 g)을 얻었다.
본 발명에 따라 황금 추출물로부터 분획된 화합물의 NMR 정보는 다음과 같다.
화합물 1 (oroxylin A)
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) : δ 12.92 (1H, s, 5-OH), 8.06 (2H, m, H-2′, H-6′), 7.59 (3H, m, H-3′, H-4′, H-5′), 6.96 (1H, s, H-3), 6.65 (1H, s, H-8), 3.76 (3H, s, OCH 3 ); 13C-NMR (100MHz, DMSO-d6) : δ 182.63 (C-4), 163.58 (C-2), 157.97 (C-7), 153.11 (C-5), 152.93 (C-9), 132.37 (C-4′), 131.85 (C-6), 131.11 (C-1′), 129.50 (C-3′,C-5′), 126.76 (C-2′, C-4′), 105.03 (C-3), 104.72 (C-10), 94.78 (C-8), 60.33 (OCH3)
화합물 2 (wogonin)
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) : δ 12.50 (1H, s, 5-OH), 8.07 (2H, m, H-2′, H-6′), 7.60 (3H, m, H-3′, H-4′, H-5′), 6.98 (1H, s, H-3), 6.31 (1H, s, H-6), 3.86 (3H, s, OCH 3 ); 13C-NMR (100MHz, DMSO-d6) : δ 182.89 (C-4), 163.86 (C-2), 158.35 (C-7), 157.10 (C-5), 150.48 (C-9), 132.94 (C-4′), 131.72 (C-1′), 130.13 (C-3′,C-5′), 128.67 (C-8), 127.14 (C-2′, C-4′), 105.91 (C-3), 104.58 (C-10), 100.04 (C-6), 61.91 (OCH3)
화합물 3 (skullcapflavone II)
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) : δ 12.65 (1H, s, 5-OH), 7.33 (1H, t, J=8.3Hz, H-4′), 6.63 (2H, d, J=8.3Hz, H-3′, H-5′), 6.34 (1H, s, H-3), 4.01 (3H, s, OCH 3 ), 3.82 (3H, s, OCH 3 ), 3.80 (3H, s, OCH 3 ), 3.75 (3H, s, OCH 3 ); 13C-NMR (100MHz, DMSO-d6) : δ 183.39 (C-4), 163.25 (C-7), 159.19 (C-5), 157.51 (C-9), 153.45 (C-2), 149.42 (C-2′), 147.13 (C-6′), 136.68 (C-6), 133.44 (C-4′), 112.80 (C-3′), 109.77 (C-1′), 109.66 (C-5′), 107.17 (C-3), 103.14 (C-10), 62.61 (OCH3), 62.37 (OCH3), 61.47 (OCH3), 56.77 (OCH3)
화합물 4 (2',6',5,7-tetrahydroxyflavanone)
1H-NMR (600MHz, MeOH-d4) : δ 6.98 (1H, t, J=8.2Hz, H-4′), 6.34 (2H, d, J=8.2Hz, H-3′, H-5′), 5.94 (1H, dd, J=14.0, 3.0Hz, H-2), 5.88 (1H, d, J=2.2Hz, H-8), 5.87 (1H, d, J=2.2Hz, H-6), 3.92 (1H, dd, J=17.3, 14.0Hz, H-3), 2.43 (1H, dd, J=14.0, 3.0Hz, H-3); 13C-NMR (150MHz, MeOH-d4) : δ 197.98 (C-4), 166.68 (C-7), 164.38 (C-5), 164.19 (C-9), 157.03 (C-2′, C-6′), 129.78 (C-4′), 110.16 (C-1′), 106.81 (C-3′, C-5′), 101.87 (C-10), 95.42 (C-6), 94.69 (C-8), 72.40 (C-2), 39.33 (C-3)
화합물 5 (5,7,2',6'-tetrahydroxy-8-methoxyflavone)
1H-NMR (600MHz, MeOH-d4) : δ 7.12 (1H, t, J=8.2Hz, H-4′), 6.52 (1H, s, H-6), 6.42 (2H, d, J=8.2Hz, H-2′, H-6′), 6.33 (1H, s, H-3), 3.93 (3H, s, OCH 3 ), 3.82 (3H, s, OCH 3 ); 13C-NMR (150MHz, MeOH-d4) : δ 183.06 (C-4), 163.29 (C-2), 158.67 (C-7), 157.23 (C-5), 156.82 (C-2′, C-6′), 150.42 (C-9), 131.91 (C-4′), 128.82 (C-8), 111.60 (C-3), 108.33 (C-1′), 106.48 (C-3′, C-5′), 104.35 (C-10), 95.23 (C-6), 60.69 (8-OCH3), 55.51 (7-OCH3)
화합물 6 (2',5,7-trihydroxy-6',8-dimethoxyflavone)
1H-NMR (600MHz, MeOH-d4) : δ 7.24 (1H, t, J=8.4Hz, H-4′), 6.60 (1H, d, J=8.4Hz, H-5′), 6.56 (1H, d, J=8.4Hz, H-3′), 6.28 (1H, s, H-3), 6.24 (1H, s, H-6), 3.82 (3H, s, OCH 3 ), 3.79 (3H, s, OCH 3 ); 13C-NMR (150MHz, MeOH-d4) : δ 182.75 (C-4), 162.32 (C-2), 158.78 (C-7), 157.03 (C-6′), 156.82 (C-5), 156.64 (C-2′), 150.87 (C-9), 132.13 (C-4′), 127.77 (C-8), 111.87 (C-3), 109.32 (C-1′), 108.35 (C-3′), 104.24 (C-10), 102.03 (C-5′), 98.64 (C-6), 60.60 (8-OCH3), 55.04 (6′-OCH3)
화합물 7 (2',5,7-trihydroxy-6'-methoxyflavone)
1H-NMR (600MHz, MeOH-d4) : δ 7.27 (1, t, J=8.4Hz, H-4′), 6.58 (1H, d, J=8.4Hz, H-5′), 6.55 (1H, d, J=8.4Hz, H-3′), 6.32 (1H, d, J=2.2Hz, H-8), 6.21 (1H, d, J=2.2Hz, H-6), 6.20 (1H, s, H-3), 3.79 (OCH 3 ); 13C-NMR (150MHz, MeOH-d4) : δ 182.66 (C-4), 164.60 (C-7), 162.59 (C-2), 161.84 (C-5), 159.11 (C-9), 158.71 (C-6′), 156.51 (C-2′), 132.00 (C-4′), 111.83 (C-3), 108.24 (C-3′), 104.14 (C-1′), 101.94 (C-5′), 98.60 (C-6), 93.67 (C-8), 55.04 (OCH3)
화합물 8 (2',5,7-trihydroxyflavone)
1H-NMR (600MHz, MeOH-d4) : δ 7.87 (1H, dd, J=8.0, 1.7Hz, H-6′), 7.35 (1H, m, H-4′), 7.18 (1H, s, H-3), 6.97 (2H, m, H-3′, H-5′), 6.44 (1H, d, J=2.2Hz, H-8), 6.21 (1H, d, J=2.2Hz, H-6); 13C-NMR (150MHz, MeOH-d4) : δ 182.95 (C-4), 164.83 (C-7), 162.08 (C-2), 161.78 (C-5), 158.24 (C-9), 156.85 (C-2′), 132.42 (C-4′), 128.24 (C-6′), 119.42 (C-5′), 117.60 (C-1′), 116.46 (C-3′), 109.03 (C-3), 103.94 (C-10), 98.63 (C-6), 93.56 (C-8)
화합물 9 (4',5,7-trihydroxy-8-methoxyflavone)
1H-NMR (600MHz, MeOH-d4) : δ 7.89 (2H, d, J=8.2Hz, H-2′, H-6′), 6.94 (2H, d, J=8.2Hz, H-3′, H-5′), 6.59 (1H, s, H-3), 6.24 (1H, s, H-6), 3.91 (3H, s, OCH 3 ); 13C-NMR (150MHz, MeOH-d4) : δ 182.44 (C-4), 164.48 (C-2), 161.51 (C-4′), 158.78 (C-7), 156.88 (C-9), 149.87 (C-5), 128.24 (C-8), 127.99 (C-2′, C-6′), 121.90 (C-1′), 115.72 (C-3′, C-5′), 103.27 (C-10), 102.16 (C-3), 99.32 (C-6)
화합물 10 (norwogonin)
1H-NMR (600MHz, MeOH-d4) : δ 8.08 (2H, m, H-2′, H-6′), 7.56 (3H, m, H-3′, H-4′, H-5′), 6.72 (1H, s, H-3), 6.30 (1H, s, H-6); 13C-NMR (150MHz, MeOH-d4) : δ 182.91 (C-4), 164.21 (C-2), 153.93 (C-7), 153.85 (C-9), 145.92 (C-5), 131.61 (C-4′), 131.30 (C-1′), 128.74 (C-3′, C-5′), 126.24 (C-2′, C-6′), 125.09 (C-8), 104.13 (C-3), 103.73 (C-10), 98.47 (C-6)
화합물 11 (2',5,7-trihydroxy-8-methoxyflavone)
1H-NMR (600MHz, MeOH-d4) : δ 7.95 (1H, dd, J=7.7, 1.3Hz, H-6′), 7.38 (1H, m, 4′), 7.21 (1H, s, H-3), 7.00 (2H, m, H-3′, H-5′), 6.27 (1H, s, H-6), 3.91 (3H, s, OCH 3 ); 13C-NMR (150MHz, MeOH-d4) : δ 183.09 (C-4), 161.99 (C-2), 157.37 (C-7), 156.98 (C-2′), 156.82 (C-5), 150.03 (C-9), 132.06 (C-4′), 128.16 (C-6′), 127.85 (C-8), 119.51 (C-5′), 117.62 (C-1′), 116.54 (C-3′), 108.93 (C-3), 103.84 (C-10), 98.67 (C-6), 60.58 (OCH3)
화합물 12 (2',5,7-trihydroxy-6-methoxyflavone)
1H-NMR (600MHz, MeOH-d4) : δ 7.87 (1H, dd, J=8.0, 1.3Hz, H-6′), 7.35 (1H, m, H-4′), 7.19 (H, s, H-3), 6.97 (2H, m, H-3′, H-5′), 6.55 (1H, s, H-8), 3.88 (3H, s, OCH 3 ); 13C-NMR (150MHz, MeOH-d4) : δ 183.33 (C-4), 162.22 (C-2), 157.58 (C-7), 156.84 (C-2′), 153.51 (C-5), 152.50 (C-9), 132.44 (C-4′), 131.39 (C-6), 128.26 (C-6′), 119.43 (C-5′), 117.60 (C-1′), 116.46 (C-3′), 108.57 (C-3), 104.39 (C-10), 93.85 (C-8), 59.53 (OCH3)
화합물 13 (baicalein)
1H-NMR (600MHz, DMSO-d6) : δ 12.65 (1H, s, 5-OH), 10.56 (1H, s, 7-OH), 8.80 (1H, s, 6-OH), 8.04 (2H, d, J=7.1Hz, H-2′, H-6′), 7.58 (3H, m, H-3′, H-4′, H-5′), 6.91 (1H, s, H-3), 6.62 (1H, s, H-8); 13C-NMR (150MHz, DMSO-d6) : δ 182.60 (C-4), 163.38 (C-2), 154.10 (C-7), 150.47 (C-9), 147.43 (C-5), 132.30 (C-4′), 131.43 (C-1′), 129.79 (C-6), 129.58 (C-3′, C-5′), 126.77 (C-2′, C-6′), 104.95 (C-3), 104.75 (C-10), 94.48 (C-8)
화합물 14 (3,6',5,7-tetrahydroxy-2',8-dimethoxyflavone)
1H-NMR (600MHz, DMSO-d6) : δ 12.55 (1H, s, 5-OH), 10.77 (1H, s, 7-OH), 9.44 (1H, s, 2′-OH), 9.04 (1H, s, 5′-OH), 6.89 (1H, d, J=8.9Hz, H-4′), 6.58 (1H, d, J=8.9Hz, H-3′), 6.33 (1H, s, H-3), 6.28 (1H, s, H-6), 3.74 (3H, s, OCH 3 ), 3.72 (3H, s, OCH 3 ); 13C-NMR (150MHz, DMSO-d6) : δ 182.25 (C-4), 162.25 (C-2), 157.62 (C-7), 156.76 (C-5), 150.85 (C-2′), 148.73 (C-9), 146.44 (C-6′), 142.93 (C-5′), 128.06 (C-8), 120.31 (C-4′), 115.30 (C-1′), 112.06 (C-3′), 111.62 (C-3), 104.11 (C-10), 99.51 (C-6), 61.34 (OCH3), 60.93 (OCH3)
화합물 15 (2',6',3,5,7-pentahydroxyflavone)
1H-NMR (600MHz, DMSO-d6) : δ 12.62 (1H, s, 5-OH), 7.09 (1H, t, J=8.2Hz, H-4′), 6.38 (2H, d, J=8.2Hz, H-3′, H-5′), 6.30 (1H, d, J=2.2Hz, H-8), 6.19 (1H, d, J=2.2Hz, H-8); 13C-NMR (150MHz, DMSO-d6) : δ 176.87 (C-4), 164.09 (C-7), 161.49 (C-5), 157.81 (C-9), 157.28 (C-2′, C-6′), 146.85 (C-2), 138.62 (C-3), 131.85 (C-4′), 106.75 (C-3′, C-5′), 104.29 (C-10), 98.43 (C-6), 93.83 (C-8)
화합물 16 (2',6',3,5,7-pentahydroxyflavanone)
1H-NMR (600MHz, DMSO-d6) : δ 12.05 (1H, s, 5-OH), 10.75 (1H, s, 7-OH), 9.56 (2H, s, 2′-OH, 6′-OH), 6.96 (1H, t, J=8.1Hz, H-4′), 6.33 (2H, d, J=8.1Hz, H-3′, H-5′), 5.89 (1H, d, J=2.1Hz, H-8), 5.83 (1H, d, J=2.1Hz, H-6), 5.66 (1H, d, J=6.0Hz, 3-OH), 5.59 (1H, d, J=12.0Hz, H-2), 5.29 (1H, dd, J=12.0, 6.0Hz, H-3); D2O exchanged 1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) : δ 6.97 (1H, t, J=8.1Hz, H-4′), 6.33 (2H, d, J=8.1Hz, H-3′, H-5′), 6.12 (1H, d, J=2.1Hz, H-8), 5.83 (1H, d, J=2.1Hz, H-6), 5.57 (1H, d, J=12.0, H-2), 5.36 (1H, d, J=12.0Hz, H-3); 13C-NMR (150MHz, DMSO-d6) : δ 199.61 (C-4), 166.96 (C-7), 164.06 (C-5), 163.96 (C-9), 158.38 (C-2′, C-6′), 130.33 (C-4′), 109.81 (C-1′), 107.15 (C-3′, C-5′), 100.82 (C-10), 96.13 (C-6), 95.23 (C-8), 75.91 (C-2), 69.13 (C-3)
화합물 17 (baicalin)
1H-NMR (600MHz, DMSO-d6) : δ 12.55 (1H, s, 5-OH), 8.07 (2H, d. J=7.0Hz, H-2′, H-6′), 7.61 (3H, m, H-3′, H-4′, H-5′), 7.04 (1H, s, H-8), 6.99 (1H, s, H-3), 5.04 (1H, d, J=7.4Hz, H-1″); 13C-NMR (150MHz, DMSO-d6) : δ 183.02 (C-4), 172.51 (C-6″), 163.90 (C-2), 152.31 (C-9), 149.61 (C-7), 147.10 (C-5), 132.48 (C-4′), 131.34 (C-1′), 131.27 (C-6), 129.63 (C-3′, C-5′), 126.82 (C-2′, C-6′), 106.55 (C-10), 105.13 (C-3), 101.27 (C-1″), 94.80 (C-8), 76.30 (C-5″), 74.56 (C-3″), 73.39 (C-2″), 72.43 (C-4″)
화합물 18 (wogonoside)
1H-NMR (600MHz, DMSO-d6) : δ 12.52 (1H, s, 5-OH), 8.08 (2H, d. J=7.0Hz, H-2′, H-6′), 7.60 (3H, m, H-3′, H-4′, H-5′), 7.04 (1H, s, H-6), 6.69 (1H, s, H-3), 5.09 (1H, d, J=6.8Hz, H-1″), 3.90 (3H, s, OCH 3 ); 13C-NMR (150MHz, DMSO-d6) : δ 182.81 (C-4), 172.69 (C-6″), 163.95 (C-2), 157.06 (C-7), 156.45 (C-5), 149.55 (C-9), 132.70 (C-4′), 131.20 (C-1′), 129.74 (C-3′. C-5′), 129.61 (C-8), 126.84 (C-2′, C-6′), 105.66 (C-10), 100.73 (C-1″), 99.53 (C-6), 77.03 (C-5″), 74.39 (C-3″), 73.54 (C-2″), 72.32 (C-4″), 61.85 (OCH3)
실시예 3
블레오마이신 처리에 의한 DNA 손상 유도 노화 유발
BJ 세포 (human foreskin fibroblast)를 대상으로 DNA 손상을 유도하는 블레오마이신(블레오마이)을 처리하여 세포의 노화를 유도하는 실험법을 사용하였다. 블레오마이신을 50 μg/ml로 24시간 처리하고, 6일째 되는 날 블레오마이신 처리군의 BrdU uptake 비율이 음성 대조군 그룹의 10% 이내로 감소하여 노화가 되었음을 확인하였다 (Laberge et al., Glucocorticoids suppress selected components of the senescence-associated secretory phenotype. Aging Cell. 11: 569-578, 2012). 또한 SA β- 갈락토시다아제(galactosidase) 법을 이용해서 현미경 하에서 노화된 세포를 확인하였다. SASP 분비 및 생성 확인은 대표적인 SASP 인자인 IL-6, IL-8 양을 세포 상등액에서 ELISA법으로 정량하였고, IL-1α, IL-1β, GM-CSF, CXCL1, MCP-2, MMP-3은 실시간 PCR 법으로 mRNA의 발현을 확인하였다.
실시예 4
황금 추출물의 노화에 의한 SASP 생성 억제
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 황금 추출물의 블레오마이에 의한 IL-6와 IL-8 생성 억제에 관한 실험결과이고, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 황금 추출물의 블레오마이에 의한 BrdU uptake에 대한 영향에 관한 실험결과이다.
본 실험에서는 황금 추출물의 노화에 의한 SASP 유도 억제 활성을 확인하기 위해 BJ 섬유아세포를 대상으로 블레오마이신에 의한 in vitro DNA 손상 유도 노화 실험을 진행하였다.
도 2를 참조하면, 먼저 이미 노화가 진행된 세포의 SASP 유도 억제활성을 확인하기 위해 블레오마이신을 50 μg/ml로 24시간 처리한 후 5일째 되는 날 황금 80% 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 후 상등액에서 대표적인 SASP 인자인 IL-6의 생성을 ELISA 실험법으로 확인한 결과 농도 의존적으로 IL-6의 생성이 억제되었다. 또한 황금 추출물을 블레오마이신과 동시에 지속적으로 처리하였을 때 역시 추출물의 농도 의존적으로 IL-6와 IL-8의 생성이 강력히 억제되는 것을 알 수 있다.
도 3을 참조하면, 황금 추출물의 위 처리 농도에서는 모두 세포 독성을 보이지 않았으며 (MTT 실험결과), 세포 노화 자체에는 영향이 없었다 (BrdU uptake 실험결과). 즉 도 2 및 3의 결과로부터 황금 추출물은 세포노화 자체에는 영향을 주지 않고, 노화에 의한 IL-6와 IL-8의 생성을 억제시킨다는 것을 알 수 있다.
실시예 5
황금으로부터 분리한 플라보노이드 유도체들의 SASP 억제
도 4는 플라보노이드 유도체들의 IL-6 생성 억제에 관한 실험결과이다.
본 실험에서는 황금 추출물로부터 분리한 플라보노이드 유도체들의 SAPS 생성 억제를 확인하기 위해 10 μM 농도의 유도체들을 블레오마이과 함께 동시처리를 진행한 후 6일째 되는 날 상등액에서 IL-6의 생성을 확인하였다.
도 4를 참조하면, 화합물 1 (Oroxylin A; 5,7-dihydroxy-6-methoxyflavone), 5 (2',6',5,7-tetrahydroxy-8-methoxyflavone), 8 (2',5,7-trihydroxyflavone), 11 (2',5,7-trihydroxy-8-methoxyflavone), 12번 (2',5,7-trihydroxy-6-methoxyflavone)과 같은 여러 플라보노이드 유도체들의 강력한 IL-6 생성 억제 활성을 확인할 수 있다.
하기 화학식 1은 본 발명에 따른 황금 추출물로부터 분획한 화합물의 기본 구조이다.
Figure 112016011042212-pat00007
(상기 식에서 A 내지 F는 H, OH, OCH3 글루코스,
Figure 112016011042212-pat00008
로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나임)
이 중 A-고리 5,7번 위치(화학식 1의 B, D)에 결합한 OH, B-고리 2' 위치(화학식 1의 A)에 결합한 OH 치환기를 가진 8번이 IL-6의 생성을 100% 이상 저해함으로써 가장 강력한 활성을 보였다. 특히 8, 11, 12번의 억제 활성이 매우 강력하였는데 이들은 모두 B-고리의 2' 위치에 결합한 OH 치환기를 가진 유도체들이라는 것이다. 또한 12번 유도체는 1번 (oroxylin A) 구조에다 B-ring의 2'-OH기가 추가된 구조를 가지는데, 1번보다 12번의 활성이 조금 더 강하였다. 따라서, A는 OH인 경우, C는 OCH3인 경우가 바람직하다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 황금으로부터 분리한 유도체들의 다양한 SASP 유전자들의 발현 억제에 관한 실험결과이다.
도 5를 참조하면, 본 발명에 따른 유도체 중 화학식 1중 A가 OH인 화합물이 다른 SASP들의 mRNA 발현 억제 결과에서도 비슷한 활성결과를 나타내며, 이는, 화학식 1의 구조 중 A 위치에서의 OH 치환이 SASP 억제 활성에 매우 중요한 구조임을 나타낸다.
A-고리 5,7-OH 외에 6번 위치(화학식 1의 C)에 OCH3 치환된 구조를 가지고 있는 1번과 12번 유도체는 둘 다 강력한 IL-6 생성 저해 활성을 가지는 반면, 1번과 13번 (바이칼레인)의 활성을 비교해보면 A-고리 6번 위치에 -OCH3 대신 -OH기를 가진 13번은 IL-6 생성을 거의 저해하지 못했다. 즉 A-고리 6-OCH3 치환이 SASP 생성 저해에 매우 중요한 구조임을 알 수 있으며 이들 발견들은 이전에 보고된 바 없는 최초의 발견이다.
따라서, 화학식 1의 구조식 중 A, B, D 중 적어도 어느 하나는 OH이며, 특히 A가 OH인 경우 IL-6 생성 저해 활성이 우수하며, 반면 C는 OH가 아니어야 하며, 바람직하게는 OCH3이다.
위 결과를 바탕으로 강력한 IL-6 생성 억제 활성을 보이는 1, 5, 8, 11, 12번을 대상으로 IL-6외에 다른 SASP mRNA의 발현 저해 활성을 확인하기 위해 real-time PCR을 시행하였다 (도 5). 그 결과 IL-6외에 다른 SASP 인자인 IL-8, IL-1α, IL-1β, GM-CSF, CXCL1, MCP-2, MMP-3의 mRNA 발현을 모두 억제하였으며, 그 중 8번과 12번 유도체의 활성이 가장 강력하였고 이는 도 4의 IL-6 ELISA 결과와 일치한다.
이 중 8번과 12번은 강력한 SASP 생성 저해 화합물로 밝혀진 아피제닌(apigenin)(Lim et al., Effects of flavonoids on senescence-associated secretory phenotype formation from bleomycin-induced senescence in BJ fibroblasts. Biochem Pharmacol. 96: 337-348, 2015)과 비슷한 정도의 활성을 보였다. 8번과 12번은 10 μM에서 MTT 실험결과 세포독성을 보이지 않았으며, BrdU uptake에도 차이가 없는 것으로 보아 세포 노화 자체에는 영향이 없는 것으로 보인다(도 6 참조).
이상의 실시예의 결과, 황금 추출물은 블레오마이신 유도 노화 BJ 세포에서 분비되는 IL-6를 비롯한 SASP들의 생성을 강력하게 억제하였으며, 추출물에서 분리한 화합물들의 강력한 SASP 억제 활성을 확인하였다. 이들 유도체 중에서 B-고리 2’-OH와 A-ring 6-OCH3 구조가 SASP 생성 저해에 중요한 구조임을 최초로 발견하였다. 따라서, 본 발명으로부터 황금 추출물 및 위 구조의 구성성분을 주요성분으로 하는 조성물을 기반으로 하는 SASP 저해제 개발이 가능하다. 또한 황금 추출물 및 위 유도체들은 세포 노화자체에는 영향이 없고, 노화 세포 자체에서 분비되는 SASP들의 생성만을 저해하여 노화작용 억제에 따른 부작용을 최소화할 수 있다. 즉 노화로 인한 만성염증성질환의 예방 및 증상 개선에 보다 안전하고 효과적인 제제 개발이 가능하다.

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  7. 황금 추출물부터 분리된 하기 식 3의 플라노보이드 유도체 중 어느 하나인 화합물을 유효성분으로 포함하는, 암, 동맥경화, 알츠하이머, 관절염 또는 당뇨병으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로,
    상기 황금 추출물은 물 또는 수용성 알콜을 이용하여 황금으로부터 추출된 것을 특징으로 하고,
    상기 화합물은 세포 노화에는 영향을 주지 않고, SASP를 선택적으로 억제함으로써 노화관련 만성질환인 암, 동맥경화, 알츠하이머, 관절염 또는 당뇨병으로부터 선택되는 질환을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는,
    암, 동맥경화, 알츠하이머, 관절염 또는 당뇨병으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [식 3]
    Figure 112016116765962-pat00012
  8. 삭제
KR1020160012742A 2016-02-02 2016-02-02 황금 추출물을 유효성분으로 함유하는 sasp 억제를 통한 노화관련 만성질환 치료 및 예방제 KR101750994B1 (ko)

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