WO2023191106A1 - 老化細胞もしくはｓａｓｐを標的とした治療薬／予防薬、老化細胞を検出するデータの取得方法及び治療薬／予防薬のスクリーニング方法 - Google Patents

老化細胞もしくはｓａｓｐを標的とした治療薬／予防薬、老化細胞を検出するデータの取得方法及び治療薬／予防薬のスクリーニング方法 Download PDF

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憲一 宮田
暁子 高橋
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Definitions

  • senescent cells that accumulate in the body highly express various inflammatory proteins and secrete SASP (senescence-associated secretory phenotype) into surrounding tissues, which induces chronic inflammation, leading to cancer, neurodegenerative diseases, and arteriosclerosis.
  • SASP seenescent-associated secretory phenotype
  • senescent cells or SASP in the body may lead to suppression of disease onset or treatment.
  • Senomorphic drugs have the potential to extend healthy life expectancy, and are attracting attention as a preventive and therapeutic method for the onset and progression of age-related pathologies.
  • Patent Document 1 discloses a complex that suppresses cell aging by removing dysfunctional mitochondria and co-delivering a mitochondrial membrane potential lowering agent and a p53 inhibitor to target cells to suppress SASP.
  • Patent Document 2 discloses a cell aging inhibitor capable of suppressing cell aging of stem cells.
  • Patent Document 1 since the complex described in Patent Document 1 is aimed at removing dysfunctional mitochondria associated with cellular aging, it does not lead to complete removal of senescent cells. Further, although the cell aging inhibitor described in Patent Document 2 has an antioxidant effect, it is considered that it cannot eliminate cell aging.
  • RNAs which are not expressed in normal cells, are highly expressed in senescent cells and control the expression of inflammatory genes. . Furthermore, they discovered that cell death can be induced in senescent cells by controlling the expression of untranslated RNA. Therefore, we provide a therapeutic agent that targets this untranslated RNA, suppresses harmful SASP, and induces cell death in senescent cells to eliminate them, and provide Seno-therapy, a new treatment method targeting cellular senescence. The task is to do so. They also discovered that the state of cellular aging in a subject can be detected at an early stage by examining the target untranslated RNA, molecules whose expression changes accordingly, and the epigenome of the relevant gene region.
  • the present invention relates to the following therapeutic agents, data acquisition methods, and therapeutic agent screening methods.
  • a pharmaceutical composition that is a therapeutic and/or preventive agent for diseases caused by senescent cells, and is characterized by suppressing hSATII RNA expression or inhibiting activity and/or increasing CTCF expression. Since increases in hSATII RNA expression and decreases in CTCF expression are deeply related to cellular senescence, substances that can regulate these can treat diseases caused by cellular senescence.
  • composition according to (1) wherein the pharmaceutical composition is a nucleic acid drug that suppresses expression or inhibits activity of hSATII RNA and/or increases CTCF expression.
  • nucleic acids or compounds that regulate the expression or activity of hSATII RNA or CTCF are effective as medicines.
  • a method for acquiring data on whether cellular aging has occurred in a subject comprising detecting any one of hSATII RNA, CTCF expression, and epigenomic changes in genomic DNA in a sample.
  • changes in the expression and activity of hSATII RNA and CTCF are phenomena specific to cell aging, it is possible to detect senescent cells by capturing these changes in expression and activity.
  • swelling of the hSATII DNA region and chromatin formation occur prior to an increase in hSATII RNA expression and/or a decrease in CTCF expression.
  • a testing method for detecting this can be an effective testing method for early detection of senescent cells.
  • a method for screening therapeutic and/or preventive drugs for diseases caused by senescent cells in which a candidate compound is added to a senescent cell culture medium to reduce hSATII RNA expression, inhibit hSATII RNA function, and increase CTCF expression. , a decrease in the expression of a SASP factor, a contraction of the hSATII DNA region, and a decrease in chromatin accessibility as an indicator for selecting a candidate compound.
  • New pharmaceutical compositions can be screened by using changes specific to cellular aging as indicators.
  • epigenomic changes such as increased expression of hSATII RNA and inflammatory SASP-related genes, decreased CTCF expression, swelling of the hSATII DNA region, and increased chromatin accessibility are phenomena specific to aging cells.
  • Senolytic drugs and senomorphic drugs can be screened by detecting changes.
  • a method for treating a disease caused by senescent cells which involves determining whether the disease is caused by senescent cells, by acquiring data using the method described in (3) or (4), and determining whether the disease is caused by senescent cells. 2) A method of treating a disease by administering the therapeutic agent described above. (7) A method for treating a disease caused by senescent cells, which comprises administering a compound that suppresses the expression or inhibits the activity of hSATII RNA and/or increases the expression of CTCF.
  • Results from two biological replicates are shown. For ATAC-seq and RNA-seq, the top two rows show the results obtained with IMR-90 cells in the proliferative phase, and the bottom two rows show the results obtained with IMR-90 cells after induction of cellular senescence.
  • hSAT ⁇ centromere-derived untranslated RNA
  • hSATII pericentromere-derived untranslated RNA
  • the figure shows the results of performing hSAT ⁇ or hSATII RNA pull-down assay using SVts8 cell lysate and analyzing the binding to CTCF by Western blotting.
  • FLAG-tagged CTCF wild type
  • CTCF ⁇ ZF1-11 mutant type
  • CTCF ⁇ ZF3-6 mutant type
  • Figure shown A diagram showing the results of RIP-qPCR analysis of the binding of FLAG-tagged CTCF WT, CTCF ⁇ ZF1-11, or ⁇ ZF3-6 expressed in HEK-293T cells to hSATII RNA.
  • NS Not significant, ***P ⁇ 0.001.
  • the relative expression level indicates the value normalized from the value of vector-expressing cells. *P ⁇ 0.05, **P ⁇ 0.01, ***P ⁇ 0.001.
  • the expression level of each gene shows the value normalized to the expression level at the early stage of passage. ***P ⁇ 0.001.
  • the figure shows the results of Western blotting analysis of the decrease in CTCF protein and the expression of cell senescence marker proteins in TIG-3 cells in which cell senescence was induced through subculture. Venn diagram showing changes in CTCF binding peaks by ChIP-seq analysis.
  • NS Not significant, *P ⁇ 0.05.
  • a diagram showing the results of karyotype analysis (n 20) of MEFs overexpressing MajSAT RNA. ***P ⁇ 0.001.
  • MEFs overexpressing MajSAT RNA were subcutaneously transplanted into nude mice, and on the 20th day (MEF/MajSAT RNA #2) or the 30th day (MEF/Vector, MEF/MajSAT RNA #1, MEF/MajSAT RN).
  • a # The weight (left) and photograph (right) of the tumor in 3) are shown. **P ⁇ 0.01.
  • Results of RT-qPCR analysis of hSATII and hSAT ⁇ RNA contained in extracellular vesicles derived from RPE-1/hTERT cells. *P ⁇ 0.05, ***P ⁇ 0.001.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing one aspect of screening.
  • Age-related diseases and pathological conditions may include all diseases and pathological conditions that develop with aging.
  • cancers such as breast cancer, colorectal cancer, and pancreatic cancer, whose number of patients increases with age, especially inflammatory cancers, cardiovascular diseases, neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease, osteoporosis, Knee osteoarthritis, ocular degenerative diseases such as glaucoma, cataracts, and macular degeneration, chronic obstructive pulmonary disease, chronic kidney disease, autoimmune diseases, inflammatory diseases such as psoriasis, sarcopenia, fatty liver caused by obesity, and liver cirrhosis These include liver disease, diabetes, and prostate enlargement.
  • infectious diseases that accompany inflammation such as inflammation caused by infections such as COVID-19, and improving the efficiency of stem cell transplantation by suppressing cell aging
  • the therapeutic drugs listed below target untranslated RNA expressed in senescent cells, they can suppress not only diseases that have already developed but also the onset of diseases caused by cellular aging. Therefore, it is also effective in preventing disease onset and recurrence.
  • the administration method it can be administered according to the administration method commonly used for each disease.
  • Cellular senescence (or simply senescence) is a state in which normal cells irreversibly stop growing due to a continuous DNA damage response. Cells undergoing cellular aging are called senescent cells and secrete SASP factors such as inflammatory proteins and extracellular vesicles. Furthermore, “cell senescence-like” is a state in which the expression of inflammatory genes increases in normal cells or senescent cells, and secretes inflammatory proteins, extracellular vesicles, etc. Cellular aging and aging of individuals such as humans and animals are different concepts. Aging of an individual is physical age, but cellular senescence is biological aging, and the number of senescent cells increases depending on how much stress the cells receive.
  • Substances secreted as SASP factors include inflammatory cytokines, chemokines, matrix degrading enzymes, inflammatory proteins such as growth factors, and extracellular vesicles such as exosomes.
  • the inflammatory proteins include inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1, and IL-6, CC chemokines identified as CCL1 to CCL28, CXC chemokines identified as CXCL1 to CXCL17, These include C chemokines such as XCL1 and XCL2, CX3C chemokines such as CX3CL1, matrix degrading enzymes that have been identified from MMP1 to MMP28, and growth factors such as TGF- ⁇ , BMP, FGF, PDGF, and HGF.
  • various substances secreted along with inflammation may also be included.
  • whether the disease or pathological condition is effective for the therapeutic agent of the present invention can be determined by the tests described in detail below. Performing a test in advance to determine whether this therapeutic drug is effective is not only important for selecting an appropriate treatment for the patient, but also from a medical economic perspective.
  • ATAC-seq assay for transposase-accessible chromatin sequencing was performed using human normal diploid fibroblasts IMR-90 (obtained from ATCC) in the proliferative phase and cells in which cellular senescence was induced by X-rays. It became clear that the 16325 region (false discovery rate ⁇ 0.05) changed during the process of cell aging (FIG. 1A, (a)).
  • the expression levels of these 652 transcripts were reanalyzed using publicly available data (GSE130727, Non-Patent Document 1) (FIG. 1A, (c)).
  • the expression level was analyzed using RNA-seq data (GSE130727) of IMR-90 cells in the proliferative phase and in which cell senescence was induced by X-rays.
  • RNA-seq data Integrating ATAC-seq data and RNA-seq data (GSE130727) of IMR-90 cells in the proliferative phase and senescence induced by X-rays, we found that chromatin accessibility at the hSATII locus is higher in senescent cells than in proliferating cells; Transcription was also increased (Fig. 1B). Although data are not shown here, cell senescence induction by subculturing, IMR-90 cells expressing oncogene H-Ras V12 , and normal diploid fibroblast TIG- cells subcultured for a long period of time. 3, expression of hSATII RNA was also detected with cell aging.
  • Non-Patent Document 2 enhanced RNA transcription has been observed in pancreatic cancer cells (Non-Patent Document 2), and it is also highly expressed in many cancers such as colorectal cancer, Parkinson's disease, and viral infections. It has also been reported that it can be a candidate for a diagnostic marker for cancer (Non-patent Documents 3 to 9). Furthermore, it has been shown that the growth of cancer cells and tumors can be suppressed using LNA targeting hSATII RNA (Non-Patent Documents 10 to 11). However, the present inventors discovered for the first time that hSATII is expressed in senescent cells and controls the expression of inflammatory genes.
  • hSATII RNA was overexpressed using SVts8 cells (a cell line in which temperature-sensitive SV40-Large T antigen was introduced into TIG-3 cells), which is an immortalized human fibroblast cell line.
  • SVts8 cells a cell line in which temperature-sensitive SV40-Large T antigen was introduced into TIG-3 cells
  • hSAT ⁇ human satellite ⁇ RNA
  • hSATII RNA overexpression was shown to open up regions of inflammatory gene clusters, but hSAT ⁇ RNA did not (Fig. 2B).
  • hSATII RNA increases the expression of SASP-like inflammatory genes (Fig. 2C).
  • hSATII RNA was knocked down using siRNA in SVts8 cells in the proliferative phase and in which cell senescence was induced by X-rays, and the expression of SASP-related genes CXCL10, IL1A, and IFNB1 was analyzed.
  • Knockdown of hSATII RNA was performed by introducing siRNA into SVts8 cells using Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientific). Transfection was performed using the following siRNA sequences at a concentration of 20 nM, and two days later, the expression of each gene was analyzed by RT-qPCR.
  • hSATII siRNA #1 5'-UUUCCAUUCC AUUCCAUUC-3' (SEQ ID NO: 1) #2: 5'-AAUCAUCGAA UGGUCUCGA-3' (SEQ ID NO: 2) Control 5'-AUGAACGUGA AUUGCUCAA-3' (SEQ ID NO: 3)
  • hSATII Forward 5'-AATCATCGAA TGGTCTCGAT-3' (SEQ ID NO: 4) Reverse: 5'-ATAATTCCAT TCGATTCCAC-3' (SEQ ID NO: 5) CXCL10 Forward: 5'-CCAGAATCGAAGGCCATCAA-3' (SEQ ID NO: 6) Reverse: 5'-CATTTCCTTGCTAACTGCTTTCAG-3' (SEQ ID NO: 7) IL1A Forward: 5'-AACCAGTGCTGCTGAAGGA-3' (SEQ ID NO: 8) Reverse: 5'-TTCTTAGTGCCGTGAGTTTCC-3' (SEQ ID NO: 9) IFNB1 Forward: 5'-AAACTCATGAGCAGTCTGCA-3' (SEQ ID NO: 10) Reverse: 5'-AGGAGATCTTCAGTTTCGGAGG-3' (SEQ ID NO: 11)
  • FIG. 2D shows the relative expression level as fold change (FC), with the expression in proliferating cells treated with control siRNA being 1. Furthermore, although not shown here, similar results were also shown in senescent cells obtained by subculture of IMR-90 cells. These data suggest that hSATII RNA controls the expression of SASP-like inflammation-related genes by changing chromatin accessibility as cells age.
  • Werner syndrome is a genetic disease, and is one of the premature aging syndromes in which various signs of aging such as gray hair and cataracts appear after puberty, and lifespans are short due to the onset of various age-related diseases.
  • Werner syndrome patient's skin-derived fibroblasts (WF1A) and healthy subjects' skin-derived fibroblasts (Ctrl) were passaged as Day-1, and on day 0, which is the day after passage, and day 2.
  • hSATII siRNA was introduced to suppress SATII expression, and on the fourth day, RNA was extracted from the cells and the expression of IL-8 and CXCL10 was analyzed by RT-qPCR ( Figure 3A). By suppressing hSATII expression, the expression of IL-8 and CXCL10 was significantly suppressed.
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • vascular endothelial cell model in which cellular senescence can be induced by oxidative stress.
  • the day HUVEC was passaged was designated as Day-1, and on the next day (day 0), 400 ⁇ M hydrogen peroxide was added and cultured for 2 hours while applying oxidative stress. After that, hydrogen peroxide was removed, and the culture was again passaged on the 4th day. I do.
  • day 5 culture was performed with 400 ⁇ M hydrogen peroxide for 2 hours to remove hydrogen peroxide, and the next day (day 6) hSATII siRNA was introduced to suppress SATII expression, and 1 day later (day 7).
  • oxidative stress is applied to induce cellular senescence
  • the expression of SATII RNA increases, and when the expression is inhibited by siRNA, the expression of SASP-like inflammation-related genes such as IL-8 and CXCL10 and the cellular senescence marker p16 are significantly suppressed. It had been.
  • Werner syndrome where cellular senescence is thought to occur; suppression of SATII suppresses the expression of SASP-like inflammation-related genes even in cells that have been induced with oxidative stress. was shown to be in control.
  • chromatin-binding proteins (GO:0003682) through gene ontology analysis, which were found to have high intensity scores by mass spectrometry and numerous reports that contribute to the maintenance of chromatin three-dimensional structure.
  • CTCF Fig. 4A
  • hSATII RNA and CTCF were bound by RNA pull-down assay.
  • SVts8 cell lysates were analyzed by Western blotting after RNA pulldown assay. It was confirmed that hSATII RNA was bound to CTCF, but hSAT ⁇ RNA was not bound (FIG. 4B).
  • CTCF is also an RNA-binding protein
  • RNA immunoprecipitation was performed (Fig. 4D). Wild-type CTCF (WT), CTCF ZF (Zinc Finger)-deficient mutants ⁇ ZF1-11, and ⁇ ZF3-6 were expressed in HEK293T cells (FIG. 4C). hSATII RNA was observed to bind to wild-type CTCF, but not to CTCF mutants ⁇ ZF1-11 and ⁇ ZF3-6 (FIG. 4D).
  • CTCF has 11 ZF domains, and binding of ZF1 or ZF10 to RNA is said to be important for forming chromatin loops and controlling gene expression.
  • ZF3-ZF6 deletion mutant of CTCF (CTCF ⁇ ZF3-6), which is known as a DNA-binding domain, cannot bind to hSATII RNA, indicating that ZF3-ZF6 is important for binding to hSATII RNA.
  • hSATII RNA Since the ZF3-ZF6 DNA-binding domain of CTCF was associated with binding to hSATII RNA, we hypothesized that hSATII RNA might change its DNA-binding ability by directly binding to the ZF domain of CTCF. The following considerations were made. hSATII RNA was expressed and ChIP-Seq assay was performed (Fig. 6A, B). As expected, overexpression of hSATII RNA resulted in changes in the distribution of CTCF binding peaks.
  • CTCF binding control region located between IGF2 and H19, which is a typical binding site of CTCF
  • EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay
  • hSATII RNA changes the interaction between CTCF and chromatin through DNA binding. Therefore, it is suggested that it may be important for maintaining the proper three-dimensional structure of the genome. Therefore, hSATII RNA was expressed and a chromosome conformation capture (3C) assay near the CXCL10/CXCL11 gene locus, which is a SASP gene, was performed. The results revealed that overexpression of hSATII RNA significantly attenuated the interaction in the T2 and T22 regions. Furthermore, ATAC-seq analysis revealed increased chromatin accessibility within the gene locus and increased expression of SASP-related inflammatory genes. A similar phenomenon was also observed in senescent cells induced by X-rays (Fig. 6E, F).
  • hSATII RNA and CTCF were forced to be expressed in SVts8 cells, and the percentage of multipolarized cells was analyzed in the same manner as in FIG. 7B.
  • RNA-seq data has reported that hSATII RNA is detected in extracellular vesicles (exosomes) secreted from human colon cancer cell lines. From these facts, it is inferred that hSATII RNA derived from aged stromal cells is transferred to surrounding cells via extracellular vesicles and functions as a SASP-like inflammatory factor. Although data are not shown here, the present inventors have confirmed that extracellular vesicles derived from senescent cells induce anchorage-independent proliferation and chromosomal instability in normal cells.
  • Non-patent Document 12 a synthetic biological method using an EXOtic device (EXOsomal transfer into cells) (Non-patent Document 12) was used to generate designer exosomes containing hSATII RNA. was established. The prepared designer exosomes were taken into SVts8 cells, and the expression of inflammation-related genes was analyzed by RT-qPCR. Designer exosomes containing hSATII RNA were found to promote the expression of SASP-like inflammation-related genes ( Figure 9B). That is, it was found that the produced designer exosomes have tumorigenic activity similar to that of extracellular vesicles derived from senescent cells. Therefore, hSATII RNA contained in exosomes secreted from senescent cells has been shown to promote SASP-like inflammation-related gene expression and chromosomal instability in stromal cells in the tumor microenvironment.
  • RNA-ISH RNA in situ hybridization
  • hSATII siRNA was introduced into normal pancreatic stromal cells hPSC (obtained from ScienCell), and the expression was analyzed by RT-qPCR. When gemcitabine was added to the culture solution to induce cellular senescence, the expression of hSATII RNA increased (Fig. 10A upper panel).
  • hSATII RNA expression induces cell death or growth suppression not only in cancer cells but also in senescent cells and immortalized cells.
  • hSATII expression was suppressed by siRNA in normal cells TIG3, immortalized cells HEK-293T, colon cancer cells LoVo, and normal cells IMR90, which were senescent cells that had been induced to undergo cellular senescence by X-ray irradiation.
  • a micrograph of cells 3 days after siRNA introduction is shown (FIG. 10B). Although no change in proliferation was observed in normal TIG-3 cells, clear proliferation inhibition was observed in HEK-293T cells and senescent IMR-90 cells, and cell death was induced in LoVo cells. This was recognized.
  • the present inventors detected the hSATII DNA region by DNA-FISH during the process of inducing cell senescence in TIG-3 cells by passage culture, and found that the hSATII DNA region swells prior to the expression of hSATII RNA. We found that (Fig. 11A). Although DNA-FISH was performed using the probe of SEQ ID NO: 12, any probe that can detect the hSATII DNA region may be used. Furthermore, when we analyzed the chromatin accessibility of the hSATII DNA region from DNaseI sequence data of multiple cancer cell lines, we found that chromatin accessibility was clearly increased in cancer cells compared to normal fibroblasts ( Figure 11B).
  • hSATII RNA which is untranslated RNA of pericentromeres.
  • a drug that suppresses hSATII RNA expression by administering a drug that suppresses hSATII RNA expression, senescent cells can be eliminated and secretion of SASP factors can be suppressed.
  • substances that target hSATII RNA expression and suppress its expression can serve as new therapeutic agents.
  • hSATII RNA can be reduced by nucleic acid drugs such as siRNA and LNA.
  • siRNA represented by SEQ ID NOs: 1 and 2 are useful because they can efficiently deplete hSATII RNA.
  • the present invention is not limited to this, and LNA or siRNA may be newly designed and used.
  • compounds that target hSATII RNA expression can be screened for use.
  • hSATII RNA expression can be confirmed using the primer set shown in SEQ ID NOs: 4 and 5. It is also possible to detect by RNA-ISH using tissue samples. Since hSATII RNA is also contained in extracellular vesicles such as exosomes, it is also possible to detect the amount of hSATII RNA in extracellular vesicles using body fluids such as blood, urine, and ascites. Alternatively, a SASP factor whose expression is promoted by hSATII RNA expression may be measured.
  • RNA expression may be measured, or protein amount or secreted amount may be measured by ELISA.
  • the sample used may be tissue from a diseased site, for example, tissue collected by biopsy in the case of cancer, or extracellular vesicles derived from body fluids.
  • a decrease in CTCF expression may be tested. If a decrease in hSATII RNA expression, SASP factor expression, or CTCF expression is observed, treatment can be performed using the above-mentioned pharmaceutical composition that suppresses hSATII RNA expression.
  • hSATII RNA Prior to the expression of hSATII RNA, the hSATII DNA region swells and chromatin accessibility increases, so epigenomic analysis such as DNA-FISH analysis and ATAC sequence analysis, analysis using genomic DNA fragments in body fluids and extracellular vesicles is recommended. Therefore, it may be possible to predict and diagnose diseases.
  • compounds can be screened using epigenomic changes such as suppression of hSATII RNA expression, suppression of SASP factor expression, increased CTCF expression, shrinkage of the hSATII DNA region, and decreased chromatin accessibility as indicators.
  • epigenomic changes such as suppression of hSATII RNA expression, suppression of SASP factor expression, increased CTCF expression, shrinkage of the hSATII DNA region, and decreased chromatin accessibility as indicators.
  • FRET assay low molecular weight compounds can be screened with high sensitivity.
  • hSATII RNA was bound to beads labeled with a fluorescent substance as a donor, and beads labeled with a fluorescent substance as an acceptor were bound to CTCF via a specific binding substance such as an antibody. (Fig. 12).
  • senescent cells are cultured with a candidate compound and the candidate compound suppresses hSATII RNA expression, increases CTCF expression, shrinks the hSATII DNA region, or reduces chromatin accessibility, it will function as a therapeutic agent for diseases caused by aging. It is possible.
  • Senescent cells can be treated by cell senescence induction methods commonly used in this field, such as passage culture, X-ray irradiation, and doxorubicin exposure as shown in the Examples.
  • hSATII RNA and CTCF expression can be analyzed using well-known methods such as RT-qPCR and RNA-ISH. It can also be monitored by gene expression analysis and secretion of the SASP factor group.
  • hSATII RNA As shown above, the mechanism of SASP induction by hSATII RNA and its involvement in the survival of senescent cells were clarified. In aging cells, the pericentromere region of the chromosome opens, and hSATII RNA, which is untranslated RNA, is actively transcribed from this region. It has been revealed that hSATII RNA binds to CTCF, which plays an important function in maintaining chromosome structure, and inhibits its function, thereby changing the chromosomal interaction and inducing the transcription of inflammatory genes. did. Senescent cells with active transcription of inflammatory genes are involved in the onset and exacerbation of age-related diseases.
  • Seno-therapy which targets hSATII RNA as a new target and has both a Senomorphic function that suppresses the expression of inflammatory SASP-related genes and a Senolytic function that selectively induces cell death in senescent cells, prevents age-related diseases. Or maybe it can be treated.
  • hSATII RNA expression, CTCF expression, and epigenomic changes in genomic DNA occur from the early stages of cellular aging, so by detecting these, senescent cells, which are the cause of age-related diseases, can be detected at an early stage. (Figure 13).

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Abstract

ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡが、染色体構造を維持するために重要なＣＴＣＦと結合することによって、その機能を阻害し、染色体相互作用を変化させ、炎症関連遺伝子群の転写を誘導することを明らかにした。また、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現の抑制により、老化細胞とがん細胞に選択的に細胞死を誘導できることを明らかにした。得られた結果から、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを抑制する物質、あるいはＣＴＣＦ発現を増加させる物質により細胞老化に起因する疾患の治療を行うことができる。また、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡやＣＴＣＦ発現、ｈＳＡＴＩＩ　ＤＮＡ領域のエピゲノム変化を測定することによって、細胞老化に起因する疾患であるかを診断することができる。したがって、細胞老化に起因する疾患の治療薬及びそのスクリーニング方法、さらに老化に起因する疾患を検出するためのデータの取得方法を提供することができる。

Description

老化細胞もしくはＳＡＳＰを標的とした治療薬／予防薬、老化細胞を検出するデータの取得方法及び治療薬／予防薬のスクリーニング方法
　老化した細胞で発現する非翻訳ＲＮＡを標的とする炎症関連遺伝子発現の抑制もしくは細胞生存制御を介した老化細胞に起因する疾患を治療する薬剤、対象に老化細胞を検出するデータを取得する方法、及び治療薬／予防薬をスクリーニングする方法に関する。
　細胞に、活性酸素種などによる酸化ストレス、放射線・抗がん剤等によるＤＮＡ損傷、がん遺伝子の活性化など種々のストレスが加わると、不可逆的に細胞周期が停止する「細胞老化」という状態が生じる。細胞老化は、ＤＮＡ修復機構やアポトーシスと並び、ＤＮＡ損傷やミトコンドリア障害による遺伝子変異の蓄積から生じるがん抑制機構として機能している。しかし、体内に蓄積した老化細胞は、様々な炎症性タンパク質を高発現し、周囲の組織に分泌するＳＡＳＰ（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）によって慢性炎症を誘発し、がん・神経変性疾患・動脈硬化・アルツハイマー・肺線維症・骨粗鬆症・自己免疫疾患をはじめとする加齢に伴う多くの疾患および病態を引き起こすことが知られている。したがって、体内の老化細胞もしくはＳＡＳＰを制御することは、疾患発症の抑制、あるいは治療に繋がる可能性がある。
　細胞老化の誘導や制御機構の全貌は未だ明らかになっていないものの、老化細胞に選択的に細胞死を誘導するセノリティックドラッグ（Ｓｅｎｏｌｙｔｉｃ　ｄｒｕｇｓ）や、老化細胞の分泌するＳＡＳＰを抑制するセノモルフィックドラッグ（Ｓｅｎｏｍｏｒｐｈｉｃ　ｄｒｕｇｓ）は、健康寿命を延ばす可能性があり、加齢に伴う病態の発症や進行の予防・治療法として期待を集めている。
　特許文献１には、機能不全ミトコンドリアを除去して、ＳＡＳＰを抑制するためのミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための細胞老化を抑制する複合体が開示されている。特許文献２には、幹細胞の細胞老化を抑制可能な細胞老化抑制剤が開示されている。
　しかしながら、特許文献１に記載の複合体は、細胞老化に伴う機能不全ミトコンドリアの除去を目的としていることから、老化細胞の完全な除去にはつながらない。また、特許文献２に記載の細胞老化抑制剤は、抗酸化作用は認められるものの、細胞老化を排除することまではできないと考えられている。
特開２０２１－２４８５２号公報 特開２０１８－５２８７９号公報
CasellaG et al. Nucleic Acids Res 2019, Vol47(14), pp.7294-7305. Ting T et al, Science,2011, Vol.6017, pp.593-596. doi: 10.1126/science.1200801. Epub2011 Jan 13. Kishikawa T et al,  JCI Insight. 2016,Jun 2;1(8):e86646. doi: 10.1172/jci.insight.86646. Solovyov A  Cell Rep, 2018, Vol.23(2),pp.512-521. doi: 10.1016/j.celrep.2018.03.042. Franses J W et al, Oncologist. 2018, Vol. 23(1):pp. 121-127, Published online 2017 Aug 31, doi:10.1634/theoncologist.2017-0234. Billingsley K J,Scientific Reports 2019, volume 9, Article number: 4369. Oezguer　E et al. Clin Chim Acta. 2021, Vol.514,pp.74-79. doi: 10.1016/j.cca.2020.12.008. Epub 2020 Dec 31. Cambier L et al,Scientific Reports, 2021, vol. 11, Article number: 94. Nogalski,M T et al, Nature Communications. 2019,vol. 10, Article number: 90. Bersani F et al, PNAS, 2015, 112(49),pp.11548-15153. https://doi.org/10.1073/pnas.1518008112. Nogalski,M T et al, PNAS, 2020,Vol. 117 (50),pp. 31891-31901, https://doi.org/10.1073/pnas.2017734117. KojimaR et al., Nature Communications, 2018, vol.9,Article number: 1305(2018), DOI:10.1038/s41467-018-03733-8.
　以下に詳述するように、本発明者らは、正常細胞では発現が見られない非翻訳ＲＮＡが老化細胞で高発現しており、炎症性遺伝子群の発現を制御していることを見出した。さらに、非翻訳ＲＮＡの発現を制御することで老化細胞に細胞死を誘導できることを見出した。そこで、この非翻訳ＲＮＡを標的とし、有害なＳＡＳＰを抑制し、さらに老化細胞に細胞死を誘導し排除し得る治療薬を提供し、細胞老化を標的とした新しい治療法、Ｓｅｎｏ－ｔｈｅｒａｐｙを提供することを課題とする。また、標的である非翻訳ＲＮＡやそれに伴って発現が変化する分子や当該遺伝子領域のエピゲノムを検査することにより対象において細胞老化状態を初期に検出できることを見出した。そこで、これを検出することによって、老化細胞を検出し、ひいては老化細胞に起因する疾患の診断につなげるデータの取得方法を提供することを課題とする。また、老化細胞の生存とＳＡＳＰ制御の新たな標的分子を見出したことから、これを用いた治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
　本発明は以下の治療薬、データの取得方法、及び治療薬のスクリーニング方法に関する。
（１）老化細胞に起因する疾患の治療薬及び／又は予防薬であって、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現抑制もしくは活性阻害、及び／又はＣＴＣＦ発現を増加させることを特徴とする医薬組成物。
　ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現の増加、ＣＴＣＦ発現の減少が細胞老化と深く関連していることから、これらを調節可能な物質は細胞老化に起因する疾患を治療することができる。
（２）前記医薬組成物がｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現抑制もしくは活性阻害及び／又はＣＴＣＦ発現を増加させる核酸医薬であることを特徴とする（１）記載の医薬組成物。
　特に、本明細書で例示したように、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡやＣＴＣＦの発現や活性を調節する核酸もしくは化合物は医薬として有効である。
（３）対象に細胞老化が生じているかデータを取得する方法であって、試料中のｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ、ＣＴＣＦ発現、ゲノムＤＮＡのエピゲノム変化のいずれか１つを検出することを特徴とするデータ取得方法。
　ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡやＣＴＣＦの発現や活性の変化は細胞老化に特異的な現象であるから、これらの発現や活性変化を捉えることによって、老化細胞を検出することが可能である。また、正常細胞に細胞老化誘導時もしくはがん細胞に細胞老化様の表現型が誘導される過程で、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現増加及び／又はＣＴＣＦ発現の減少に先立って、ｈＳＡＴＩＩ　ＤＮＡ領域の膨潤化とクロマチンアクセシビリティ上昇などのエピゲノム変化がおこる。したがって、それを検出する検査方法は、老化細胞を早期に検出する有効な検査方法となり得る。
（４）老化細胞に起因する疾患を検査に使用することを特徴とする（３）記載のデータ取得方法。
　老化細胞が深く関わっている疾患であることが分かれば、対症療法だけではなく、（１）や（２）に記載の医薬組成物が高い効果を奏することが期待できる。疾患が老化細胞に起因するものであるかを検査することにより、最適な治療薬を提供することが可能となる。
（５）老化細胞に起因する疾患の治療薬及び／又は予防薬をスクリーニングする方法であって、老化細胞の培地に候補化合物を添加し、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現減少、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ機能阻害、ＣＴＣＦ発現の増加、ＳＡＳＰ因子の発現減少、ｈＳＡＴＩＩ　ＤＮＡ領域の収縮、クロマチンアクセシビリティの低下の少なくともいずれか１つを指標として、候補化合物を選択することを特徴とする医薬のスクリーニング方法。
　細胞老化に特異的な変化を指標とすることにより、新規の医薬組成物をスクリーニングすることができる。特に、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡと炎症性ＳＡＳＰ関連遺伝子群の発現上昇、ＣＴＣＦ発現の低下や、ｈＳＡＴＩＩ　ＤＮＡ領域の膨潤化、クロマチンアクセシビリティの上昇などのエピゲノム変化は老化細胞に特異的な現象であることから、その変化を検出することでセノリティックドラッグ、セノモルフィックドラッグをスクリーニングすることができる。
（６）老化細胞に起因する疾患の治療法であって、疾患が老化細胞に起因するものであるか、（３）又は（４）に記載の方法でデータを取得し、（１）又は（２）記載の治療薬を投与することにより疾患を治療する方法。
（７）老化細胞に起因する疾患の治療法であって、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現抑制もしくは活性阻害及び／又はＣＴＣＦ発現を増加させる化合物を投与することを特徴とする疾患の治療方法。
クロマチンのアクセシビリティの増加に関連した転写産物のスクリーニングのスキーム（ａ）、増殖期及びＸ線により細胞老化を誘導したＩＭＲ－９０細胞におけるＡＴＡＣ－ｓｅｑピークの変化を示すボルケーノプロット（ｂ）、ＲＮＡ－ｓｅｑデータ（ＧＳＥ１３０７２７）のボルケーノプロットにおいて（ｂ）に示したクロマチンのアクセシビリティが変化している６５２の転写産物（ｃ）を示す。（ｂ）、（ｃ）において、横軸ＦＣは倍率変化（ｆｏｌｄ　ｃｈｎａｇｅ）、縦軸はＦＤＲを示す。 増殖期とＸ線により細胞老化を誘導したＩＭＲ－９０細胞のｈＳＡＴＩＩ遺伝子座におけるＡＴＡＣ－ｓｅｑ及びＲＮＡ－ｓｅｑ（ＧＳＥ１３０７２７）データのピークを示す。２つの生物学的反復による結果を示している。ＡＴＡＣ－ｓｅｑ、ＲＮＡ－ｓｅｑにおいて、上２列が増殖期、下２列が細胞老化誘導後のＩＭＲ－９０細胞で得た結果を示す。 セントロメア由来の非翻訳ＲＮＡ（ｈＳＡＴα）又はペリセントロメア由来の非翻訳ＲＮＡ（ｈＳＡＴＩＩ）を過剰発現させたＳＶｔｓ８細胞およびＸ線誘導老化ＳＶｔｓ８細胞におけるＳＡＳＰ関連遺伝子発現のヒートマップ。 ｈＳＡＴα（ｘ軸）またはｈＳＡＴＩＩ（ｙ軸）ＲＮＡ過剰発現ＳＶｔｓ８細胞において、ベクター発現細胞と比較したクロマチンのアクセシビリティの変化を示す散布図。 ｈＳＡＴα又はｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを過剰発現させたＳＶｔｓ８細胞における老化（上）および炎症反応（下）に関連する遺伝子セットのエンリッチメント解析。 増殖中又はＸ線により細胞老化を誘導したＳＶｔｓ８細胞におけるＳＡＳＰ遺伝子発現に対するｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡノックダウンの影響をＲＴ－ｑＰＣＲで解析した結果を示す図。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 健常者もしくはＷｅｒｎｅｒ症候群患者由来皮膚の線維芽細胞を用いて、ＳＡＳＰ遺伝子発現に対するｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡノックダウンの影響を解析した結果を示す図。 ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いて、酸化ストレス誘導性の老化細胞に置いてＳＡＳＰ遺伝子発現に対するｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡノックダウンの影響を解析した結果を示す図。 質量分析により同定された２８０個のｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ結合タンパク質の遺伝子オントロジー解析結果（左）。このうち２６のタンパク質がクロマチン結合（ＧＯ：０００３６８２）に分類された。上位１０位の遺伝子とユニークペプチド数を右側にまとめている。 ＳＶｔｓ８細胞溶解物を用いてｈＳＡＴα又はｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡプルダウンアッセイを行い、ウェスタンブロッティングによりＣＴＣＦとの結合を解析した結果を示す図。 ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞において、ＦＬＡＧタグを付加したＣＴＣＦ（野生型）、ＣＴＣＦ　ΔＺＦ１－１１（変異型）、ＣＴＣＦ　ΔＺＦ３－６（変異型）を発現させ、各分子の発現をウェスタンブロットにより解析した結果を示す図。 ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞で発現させたＦＬＡＧタグ付きＣＴＣＦ　ＷＴ、ＣＴＣＦ　ΔＺＦ１－１１、又はΔＺＦ３－６のｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡへの結合をＲＩＰ－ｑＰＣＲにより解析した結果を示す図。ＮＳ：Ｎｏt　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＣＴＣＦ強制発現ＳＶｔｓ８細胞において、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現がＳＡＳＰ様炎症関連遺伝子の発現へ及ぼす効果をＲＴ－ｑＰＣＲ解析した結果を示す図。相対発現量は、ベクター発現細胞の値から正規化した値を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＣＴＣＦをｓｉＲＮＡにより発現抑制したＳＶｔｓ８細胞におけるＳＡＳＰ様炎症関連遺伝子の発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより解析した結果を示す図。相対発現量は、コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞の数値から正規化している。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 継代培養で細胞老化を誘導したＴＩＧ－３細胞におけるｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ、ＣＴＣＦ、細胞老化と炎症関連遺伝子群の発現をＲＴ－ｑＰＣＲで解析した結果を示す図。各遺伝子の発現量は、継代初期の発現量に対して正規化した値を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 継代培養で細胞老化を誘導したＴＩＧ－３細胞におけるＣＴＣＦタンパク質の減少及び細胞老化マーカータンパク質の発現をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す図。 ＣｈＩＰ－ｓｅｑ解析により、ＣＴＣＦ結合ピークの変化を示すベン図。 ＣｈＩＰ－ｓｅｑ解析で得られたピークのうち、中心±２ｋｂ領域のシグナルのプロファイルプロット（左）及びｋ－ｍｅａｎｓアルゴリズムを用いて２つのクラスタに分割したヒートマップ（右）。ウィルコクソンの順位和検定のＰ値を示す。 ＩＧＦ２とＨ１９の間に位置するＩＣＲに結合するＣＴＣＦへのｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの影響をＣｈＩＰ－ｑＰＣＲで解析した結果を示す図。 ゲノムＤＮＡへのＣＴＣＦの結合に及ぼすｈＳＡＴαまたはｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの影響をＥＭＳＡによって解析した結果を示す図。 代表的なＳＡＳＰ因子であるＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１の遺伝子座のＲＮＡ－ｓｅｑ、ＣＴＣＦ　ＣｈＩＰ－ｓｅｑ及びＡＴＡＣ－ｓｅｑプロファイルを示す図。 ３Ｃ－ｑＰＣＲアッセイでｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡがクロマチン相互作用を減弱させたことを示す図。コンスタント領域（Ｃ）と各ターゲット領域（Ｔ）の相対相互作用が示されている。ＮＳ：Ｎｏt　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ、＊Ｐ＜０．０５。 ＳＶｔｓ８細胞にレトロウイルスにより導入されたｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現をＲＴ－ＰＣＲによって確認した結果を示す図。 左：ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現により、多極化した細胞が増加していることを示す図。顕微鏡像及び多極細胞の割合を示す。＊＊Ｐ＜０．０１。右：ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現により、染色体ブリッジが生じる細胞が増加していることを示す図。顕微鏡像及び多極細胞の割合を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを過剰発現させたＳＶｔｓ８細胞の核型分析（ｎ＝２０）の結果を示す図。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを過剰発現させたＳＶｔｓ８細胞の足場非依存性増殖能を示す図。＊Ｐ＜０．０５。 左：ＣＴＣＦを過剰発現させたＳＶｔｓ８細胞におけるｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現の多極化に対する効果を示す免疫染色像。右：ＣＴＣＦを過剰発現させたＳＶｔｓ８細胞において、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現によって生じた多極細胞の割合を示す図。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 マウス胎児線維芽細胞ＭＥＦｓにレトロウイルスにより導入されたＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡの発現をＲＴ－ＰＣＲによって検証した結果を示す図。 左：ＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡの発現により、多極化した細胞が増加していることを示す図。顕微鏡像及び多極細胞の割合を示す。＊Ｐ＜０．０５。右：ＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡの発現により、染色体ブリッジが生じる細胞が増加していることを示す図。顕微鏡像及び染色体架橋が生じた細胞の割合を示す。＊Ｐ＜０．０５。 ＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡを過剰発現させたＭＥＦｓの足場非依存性増殖能を示す図。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡを過剰発現させたＭＥＦｓの核型分析（ｎ＝２０）の結果を示す図。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡを過剰発現させたＭＥＦｓをヌードマウスの皮下に移植し、２０日目（ＭＥＦ／ＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡ　＃２）、あるいは３０日目（ＭＥＦ／Ｖｅｃｔｏｒ、ＭＥＦ／ＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡ　＃１、ＭＥＦ／ＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡ　＃３）の腫瘍の重量（左）及び写真（右）を示す。＊＊Ｐ＜０．０１。 ＲＰＥ－１／ｈＴＥＲＴ細胞由来の細胞外小胞に含まれているｈＳＡＴＩＩとｈＳＡＴα　ＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲによる解析結果。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＥＸＯｔｉｃデバイスで生成されたデザイナーエクソソームによるＳＡＳＰ様炎症関連遺伝子の発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより評価した。各値はＥＸＯｔｉｃ－Ｎｌｕｃ処理した細胞により正規化した。 大腸がん検体におけるｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡプローブを用いたＲＮＡ－ＩＳＨの結果を定量化したボックスプロット。正常上皮細胞と腫瘍細胞（左）、及び正常線維芽細胞とがん関連線維芽細胞（右）におけるｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ陽性細胞率が示されている。上下のヒンジはそれぞれ第３、又は第１四分位、上下のひげは、四分位範囲の１．５倍以内の最高値と最低値を、ボックス内の水平線は中央値を示す。ボックス内の水平線は中央値。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 細胞老化に伴うペリセントロメア由来ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現増加が、ＳＡＳＰ関連性炎症遺伝子の発現を誘発する機構を模式的に示す図。 細胞老化を誘導したヒト膵間質細胞でｓｉＲＮＡによりｈＳＡＴＩＩ発現を抑制し、効果を解析した結果を示す図。 ｈＳＡＴＩＩ発現が高い老化線維芽細胞、不死化細胞、がん細胞では、ｈＳＡＴＩＩ発現を抑制することにより、細胞死もしくは増殖抑制が誘導されることを示す図。 ＴＩＧ－３細胞に継代培養により細胞老化を誘導する際の、各継代数でのｈＳＡＴＩＩ　ＤＮＡ領域の開き具合と遺伝子発現をＤＮＡ－ＦＩＳＨとＲＴ－ｑＰＣＲで比較した解析結果。ＮＳ：Ｎｏt　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 各種がん細胞株のＤＮａｓｅＩシーケンスデータからｈＳＡＴＩＩ　ＤＮＡ領域のクロマチンアクセシビリティをプロットした散布図。 スクリーニングの一態様を模式的に示す図。 ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの機能と、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを標的とするＳｅｎｏ－ｔｈｅｒａｐｙの概念を模式的に示す図。
　以下にデータを示しながら具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　以下に示す治療薬は、加齢性疾患、炎症性疾患や病態に対して効果を有する。加齢性疾患や病態とは、加齢に伴い発症するあらゆる疾患・病態を含み得る。例えば、加齢によって患者数が増加する乳がん、大腸がん、膵臓がんをはじめとするがん、特に炎症性のがんや、心血管疾患、アルツハイマー病、パーキンソンなどの神経変性疾患、骨粗鬆症、変形性膝関節症、緑内障・白内障・黄斑変性症などの眼変性疾患、慢性閉塞性肺疾患、慢性腎疾患、自己免疫疾患、乾癬などの炎症性疾患、サルコペニア、肥満により発症する脂肪肝、肝硬変などの肝疾患、糖尿病、前立腺肥大が挙げられる。また、加齢に伴って発症する炎症性疾患や病態だけではなく、炎症を伴う感染症、例えばＣＯＶＩＤ－１９などの感染症による炎症、さらに細胞老化を抑制することによる幹細胞移植時の効率化などに対しても効果を有する。
　以下に示す治療薬は、老化細胞で発現している非翻訳ＲＮＡを標的としていることから、すでに発症している疾患だけではなく、細胞老化による疾患の発症を抑制することができる。したがって、疾患発症の予防、再発防止等においても効果を奏する。投与法については、各疾患において通常用いられている投与法に準じて投与を行うことができる。
「細胞老化（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ、あるいは単にｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅと言う。）」とは、正常な細胞が継続的なＤＮＡ損傷応答により不可逆的に増殖を停止した状態である。細胞老化が生じている細胞を老化細胞といい、炎症性タンパク質や細胞外小胞などのＳＡＳＰ因子を分泌する。また、「細胞老化様」とは、正常細胞もしくは老化細胞において炎症性遺伝子群の発現が上昇し、炎症性タンパク質群や細胞外小胞などを分泌する状態である。細胞老化とヒトや動物の個体の老化（ａｇｉｎｇ）は、異なる概念である。個体の老化は物理学的な年齢であるが、細胞老化は生物学的加齢であり、細胞がどれだけストレスを受けたかによって老化細胞が増加するものである。
　ＳＡＳＰ因子として分泌される物質には、炎症性サイトカイン、ケモカイン、マトリックス分解酵素、増殖因子などの炎症性タンパク質やエクソソームなどの細胞外小胞が含まれる。炎症性タンパク質としては、具体的には、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－６などの炎症性サイトカイン、ＣＣＬ１～ＣＣＬ２８まで同定されているＣＣケモカイン、ＣＸＣＬ１～ＣＸＣＬ１７まで同定されているＣＸＣケモカイン、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２のＣケモカイン、ＣＸ３ＣＬ１のＣＸ３Ｃケモカイン、ＭＭＰ１～ＭＭＰ２８まで同定されているマトリックス分解酵素、ＴＧＦ-β、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦなどの増殖因子が含まれる。また、これ以外にも、炎症に伴って分泌される種々の物質が含まれ得る。
　また、本発明の治療薬が効果を奏する疾患あるいは病態であるかは、以下で詳細に示す検査によって判断することができる。予め検査を行い、本治療薬が効果を奏するかを判断することは、患者に対して適切な治療法を選択するだけではなく、医療経済上も重要なこととなる。
[老化細胞において発現が変化している転写産物の解析]
　以下でデータを示しながら、細胞老化の治療標的について説明する。なお、以下で用いているアッセイ法等の実験手法は、特に断らない限り当分野で通常行われている方法に拠っている。
　細胞老化をおこした細胞は異常な核形態を示し、炎症性遺伝子の発現が細胞質核酸認識機構の活性化を介して誘導されることが報告されている。さらに、細胞老化によりクロマチン構造に劇的な変化が誘導され、遺伝子発現が変化することが知られている。そこで、細胞老化の過程におけるクロマチン構造と遺伝子発現の変化の機構を明らかにする目的で、老化細胞と正常細胞におけるクロマチンのアクセシビリティとＲＮＡの発現変化を比較した。
　ヒト正常二倍体線維芽細胞ＩＭＲ－９０（ＡＴＣＣより入手）の増殖期及びＸ線によって細胞老化を誘導した細胞を用い、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ（ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ-ａｃｃｅｓｉｂｌｅ　ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。細胞老化の過程で、１６３２５の領域（ｆａｌｓｅ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ＜０．０５）が変化していることが明らかとなった（図１Ａ、（ａ））。
　ＡＴＡＣ－ｓｅｑの結果、Ｘ線により細胞老化を誘導したＩＭＲ－９０において、クロマチンのアクセシビリティが増加した１４３５６のピークと、減少した１９６９のピークがあった（図１Ａ、（ｂ））。クロマチンのアクセシビリティに変化のあった１６３２５領域に関し、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９及びＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒを含むデータベースを使用して６５２の転写産物についてアノテーションを行った。
　この６５２の転写産物について、その発現レベルを公開されているデータ（ＧＳＥ１３０７２７、非特許文献１）を用いて再解析を行った（図１Ａ、（ｃ））。増殖期及びＸ線により細胞老化を誘導したＩＭＲ－９０細胞のＲＮＡ－ｓｅｑデータ（ＧＳＥ１３０７２７）を用いて、発現レベルを解析した。その結果、ペリセントロメア領域に存在する反復配列であるｈＳＡＴＩＩ（ｈｕｍａｎ　ｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ＩＩ）遺伝子座は、Ｘ線で細胞老化が誘導されたＩＭＲ－９０細胞では、アクセシビリティが高く（図１Ａ、（ｂ））、また、その発現が増殖期の細胞に比べて著しく増加していることが明らかとなった（ｌｏｇ１０　ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ＝２．８、図１Ａ、（ｃ））。
　増殖期及びＸ線により細胞老化を誘導したＩＭＲ－９０細胞のＡＴＡＣ－ｓｅｑデータとＲＮＡ－ｓｅｑ　データ（ＧＳＥ１３０７２７）とを統合すると老化細胞では増殖細胞に対して　ｈＳＡＴＩＩ遺伝子座でのクロマチンアクセシビリティが高く、転写も増加していた（図１Ｂ）。ここではデータを示さないが、継代培養による細胞老化誘導や、がん遺伝子Ｈ－ＲａｓＶ１２を発現させたＩＭＲ－９０細胞、長期にわたって継代培養を続けた正常二倍体線維芽細胞ＴＩＧ－３においても、細胞老化に伴ってｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現が検出された。
　ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡについては、膵臓がん細胞では、ＲＮＡ転写の亢進が認められることをはじめとして（非特許文献２）、大腸がんなどの多くのがんやパーキンソン病、ウイルス感染症においても高発現していることが報告され、がんの診断マーカーの候補となり得ることも開示されている（非特許文献３～９）。さらに、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを標的としたＬＮＡを用いて、がん細胞や腫瘍の増殖が抑制されることも示されている（非特許文献１０～１１）。しかしながら、ｈＳＡＴＩＩが老化細胞で発現し炎症性遺伝子群の発現を制御していることは、本発明者らが初めて見出したことである。
[ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現が与える変化]
　ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現が生物学的にどのような影響を与えるか解析を行った。不死化ヒト繊維芽細胞株であるＳＶｔｓ８細胞（ＴＩＧ－３細胞に温度感受性ＳＶ４０－Ｌａｒｇｅ　Ｔ抗原を遺伝子導入した細胞株）を用い、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを過剰発現させた。ＲＮＡ－Ｓｅｑの結果、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの過剰発現は、ＳＡＳＰ様の炎症性遺伝子群の発現を誘導した。一方、セントロメア領域に位置するヒトサテライトα　ＲＮＡ（ｈＳＡＴα）の過剰発現では、炎症性遺伝子群の発現は見られなかった（図２Ａ）。また、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの過剰発現により炎症性遺伝子群の領域がオープンになることが示されたが、ｈＳＡＴα　ＲＮＡではおこらなかった（図２Ｂ）。炎症反応とＳＡＳＰに関連する遺伝子群の発現解析においても、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの過剰発現が、ＳＡＳＰ様の炎症性遺伝子発現を増加させていることが示唆された（図２Ｃ）。
　さらに、増殖期及びＸ線で細胞老化を誘導したＳＶｔｓ８細胞において、ｓｉＲＮＡを用いてｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡをノックダウンし、ＳＡＳＰ関連遺伝子であるＣＸＣＬ１０、ＩＬ１Ａ、ＩＦＮＢ１の発現を解析した。ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡのノックダウンは、ｓｉＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりＳＶｔｓ８細胞に導入して行った。以下のｓｉＲＮＡ配列を用い、２０ｎＭ濃度でトランスフェクションし、２日後に各遺伝子の発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより解析した。
ｈＳＡＴＩＩ　ｓｉＲＮＡ
＃１：５’－ＵＵＵＣＣＡＵＵＣＣ　ＡＵＵＣＣＡＵＵＣ－３’（配列番号１）
＃２：５’－ＡＡＵＣＡＵＣＧＡＡ　ＵＧＧＵＣＵＣＧＡ－３’（配列番号２）
コントロール
５’－ＡＵＧＡＡＣＧＵＧＡ　ＡＵＵＧＣＵＣＡＡ－３’（配列番号３）
　また、ｈＳＡＴＩＩ、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ１Ａ、ＩＦＮＢ１の発現量は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって解析した。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により抽出し、ＴＵＲＢＯ　ＤＮＡ－ｆｒｅｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、夾雑するＤＮＡを除去した後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ）によって逆転写を行い、ＲＴ－ｑＰＣＲはＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて、ＳｔｅｐＯｎｅ　Ｐｌｕｓ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。プライマーは以下の配列を用いた。
ｈＳＡＴＩＩ
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡ　ＴＧＧＴＣＴＣＧＡＴ－３’（配列番号４）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＡＴＡＡＴＴＣＣＡＴ　ＴＣＧＡＴＴＣＣＡＣ－３’（配列番号５）
ＣＸＣＬ１０
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＣＣＡＧＡＡＴＣＧＡＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡ－３’（配列番号６）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＣＴＡＡＣＴＧＣＴＴＴＣＡＧ－３’（配列番号７）
ＩＬ１Ａ
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＡＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡ－３’（配列番号８）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＴＴＣＴＴＡＧＴＧＣＣＧＴＧＡＧＴＴＴＣＣ－３’（配列番号９）
ＩＦＮＢ１
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＡＡＡＣＴＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡ－３’（配列番号１０）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＡＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＧＧＡＧＧ－３’（配列番号１１）
　ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡをノックダウンすると、老化細胞において、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ１Ａ、ＩＮＦＢ１の発現が低下した。図２Ｄは、コントロールｓｉＲＮＡで処理した増殖細胞での発現を１として相対発現量を倍率変化（ＦＣ）で示している。また、ここでは示さないが、ＩＭＲ－９０細胞の継代培養による老化細胞でも同様の結果が示された。これらのデータは、細胞老化に伴ってｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡがクロマチンアクセシビリティを変化させることにより、ＳＡＳＰ様炎症関連遺伝子の発現を制御していることを示唆している。
　細胞老化に起因する疾患や疾患モデルにおいても、ｈＳＡＴＩＩ発現が炎症性遺伝子発現の制御を行っているか解析した。Ｗｅｒｎｅｒ症候群は、遺伝性疾患であり、思春期以降に、白髪、白内障など様々な老化徴候が出現し、様々な加齢性疾患の発症により寿命が短い早老症候群の一つである。Ｗｅｒｎｅｒ症候群患者の皮膚由来線維芽細胞（ＷＦ１Ａ）と健常者の皮膚由来線維芽細胞（Ｃｔｒｌ）に、継代した日をＤａｙ－１とし、継代翌日である０日目、及び２日目にｈＳＡＴＩＩ　ｓｉＲＮＡを導入し、ＳＡＴＩＩ発現を抑制し、４日目に細胞からＲＮＡを抽出しＲＴ－ｑＰＣＲにより、ＩＬ－８、ＣＸＣＬ１０の発現の解析を行った（図３Ａ）。ｈＳＡＴＩＩ発現を抑制することにより、ＩＬ－８、ＣＸＣＬ１０の発現が有意に抑制されていた。
　ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）は、酸化ストレスにより細胞老化が誘導できる血管内皮細胞モデルとして知られている。ＨＵＶＥＣは継代した日をＤａｙ－１とし、翌日（０日目）に４００μＭ過酸化水素を加え酸化ストレスをあたえながら２時間培養した後、過酸化水素を除去し、４日目に再度継代を行う。継代翌日（５日目）に、４００μＭ過酸化水素で２時間培養し、過酸化水素を除去し、翌日（６日目）ｈＳＡＴＩＩ　ｓｉＲＮＡを導入し、ＳＡＴＩＩ発現を抑制し、１日後（７日目）に、細胞からＲＮＡを抽出しＲＴ－ｑＰＣＲにより、ＩＬ－８、ＣＸＣＬ１０、ｐ１６発現の解析を行った（図３Ｂ）。酸化ストレスを与えて細胞老化を誘導すると、ＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現は増加し、ｓｉＲＮＡにより発現を抑制すると、ＩＬ－８、ＣＸＣＬ１０といったＳＡＳＰ様炎症関連遺伝子の発現と細胞老化マーカーであるｐ１６は有意に抑制されていた。細胞老化が生じていると考えられるＷｅｒｎｅｒ症候群、酸化ストレスを誘導した細胞においてもＳＡＴＩＩの抑制により、ＳＡＳＰ様炎症関連遺伝子の発現が抑制されることから、ＳＡＴＩＩが老化細胞において炎症関連遺伝子群の発現を制御していることが示された。
[ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡによる炎症関連遺伝子の制御機構]
　ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡによるＳＡＳＰ様炎症関連遺伝子の発現促進機構を解析するために、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ結合タンパク質の同定を試みた。セントロメア領域に位置するｈＳＡＴα　ＲＮＡと特定のタンパク質との関連については報告されているが、ペリセントロメア領域に位置するｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡについては報告されていない。そこで、ＲＮＡプルダウンと質量分析を行い、２８０種のｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ結合タンパク質を同定した。
　これらのタンパク質の中から、遺伝子オントロジー解析により２６のクロマチン結合タンパク質（ＧＯ：０００３６８２）を同定したが、質量分析による強度スコアの高さ、及びクロマチン立体構造の維持に寄与している多数の報告からＣＴＣＦに焦点を当てて解析することとした（図４Ａ）。ＲＮＡプルダウンアッセイによりｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡとＣＴＣＦが結合しているか確認を行った。ＳＶｔｓ８細胞溶解物をＲＮＡプルダウンアッセイの後、ウェスタンブロッティングにより解析した。ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡはＣＴＣＦに結合しているが、ｈＳＡＴα　ＲＮＡは結合していないことが確認された（図４Ｂ）。
　ＣＴＣＦのゲノムＤＮＡへの結合はゲノムの適切な立体構造の維持に重要であることが知られている。ＣＴＣＦはＲＮＡ結合タンパク質でもあることから、ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）を行った（図４Ｄ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に野生型ＣＴＣＦ（ＷＴ）、ＣＴＣＦのＺＦ（Ｚｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ）を欠損させた変異体ΔＺＦ１－１１、及びΔＺＦ３－６を発現させた（図４Ｃ）。ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡは、野生型ＣＴＣＦとの結合は認められるものの、ＣＴＣＦ変異体ΔＺＦ１－１１、及びΔＺＦ３－６との結合は認められなかった（図４Ｄ）。ＣＴＣＦにはＺＦドメインが１１あるが、ＺＦ１またはＺＦ１０とＲＮＡとの結合が、クロマチンループを形成して遺伝子発現を制御するために重要であると言われている。しかし、ここではデータを示さないが、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡはＺＦ１にもＺＦ１０にも結合しないことがわかった。ＤＮＡ結合ドメインとして知られるＣＴＣＦのＺＦ３－ＺＦ６欠損変異体（ＣＴＣＦ　ΔＺＦ３－６）はｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡと結合できないことから、ＺＦ３－ＺＦ６がｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡとの結合に重要であることが明らかとなった。
　ＣＴＣＦを強制発現させ、さらにｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを過剰発現させたＳＶｔｓ８細胞において、炎症関連遺伝子群の発現をＲＴ－ｑＰＣＲで解析した（図５Ａ）。ＣＴＣＦが過剰に発現している状況では、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡが発現していてもその効果が失われ、炎症関連遺伝子の発現の増強が見られなかった。さらに、増殖細胞においてＣＴＣＦ　ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＨＳＳ１１６４５５、＃ＨＳＳ１１６４５６、Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｄｕｐｌｅｘ　Ｈｉｇｈ　ＧＣ　Ｄｕｐｌｅｘ）ｓｉＲＮＡ、＃４６－２０００）を用いて、ＣＴＣＦをノックダウンし、炎症関連遺伝子群の発現を解析した（図５Ｂ）。ＣＴＣＦをノックダウンすると、炎症関連遺伝子の発現が増強した。予期せぬことに、ＣＴＣＦのノックダウンによって、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現も上昇することが明らかとなった。これらの結果から、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡによって誘導される炎症関連遺伝子群の発現は、ＣＴＣＦの機能阻害に依存している可能性が高く、ＣＴＣＦは細胞老化の過程でｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現を制御していることが示唆された。そこで、ＴＩＧ－３細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）に継代培養により老化を誘導し、ＣＴＣＦ発現量をＲＴ－ｑＰＣＲ及びウェスタンブロッティングで解析した（図５Ｃ、Ｄ）。継代培養が進むとＣＴＣＦの発現量は低下し（図５Ｃ、Ｄ）、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡや炎症関連遺伝子の発現量は増加していた（図５Ｃ）。したがって、ＣＴＣＦは細胞老化の過程で、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現を制御していることが示唆された。
　さらに、ここではデータを示さないが、ヒトｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡと同様に、マウスのペリセントロメア領域に位置するｍａｊｏｒ　ｓａｔｅｌｌｉｔｅ　（ＭａｊＳＡＴ）ＲＮＡの発現を解析した。マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）にドキソルビシンによりＤＮＡ損傷を生じさせ、細胞老化を誘導したところ、ＳＡＳＰ関連炎症遺伝子群とともにＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡの発現増加が見られた。すなわち、マウスでもＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡの誘導はＣＴＣＦの発現と負の相関があることが示された。さらに、ＣＴＣＦはマウスのセントロメアに存在するマイナーサテライト（ＭｉｎＳＡＴ）ＲＮＡではなく、ペリセントロメアに存在するＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡに結合し、ＳＡＳＰ関連炎症遺伝子群の発現を上昇させた。これらの知見から、ＣＴＣＦは細胞老化の際に、ペリセントロメアのサテライトＲＮＡとＳＡＳＰ関連炎症遺伝子群の発現制御に重要であることが示された。
［ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの作用機序］
　ＣＴＣＦのＺＦ３－ＺＦ６　ＤＮＡ結合ドメインが、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡとの結合に関連していたことから、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡがＣＴＣＦのＺＦドメインへ直接結合することによって、ＤＮＡ結合能を変化させるのではないかと仮定し、以下の検討を行った。ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを発現させ、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑアッセイを行った（図６Ａ、Ｂ）。予想通り、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの過剰発現により、ＣＴＣＦの結合ピークの分布に変化が見られた。そこで、ＣＴＣＦの代表的な結合部位であるＩＧＦ２とＨ１９の間に位置するＩＣＲ（ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｉｏｎ）へのＣＴＣＦの結合能をＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ及びＥＭＳＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　Ｍｏｂｉｌｉｔｙ　Ｓｈｉｆｔ　Ａｓｓａｙ）で解析した（図６Ｃ、Ｄ）。ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現により、ＣＴＣＦのＤＮＡ結合能の低下が認められ、また、ｈＳＡＴＩＩのＲＮＡの濃度依存的にその結合が阻害されることが明らかとなった。
　ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡは、ＣＴＣＦとＤＮＡの結合を介したクロマチンとの相互作用を変化させる。したがって、ゲノムの適切な立体構造の維持に重要である可能性が示唆される。そこで、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを発現させ、ＳＡＳＰ遺伝子であるＣＸＣＬ１０／ＣＸＣＬ１１遺伝子座近傍の染色体コンフォメーションキャプチャー（３Ｃ）アッセイを行った。その結果、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの過剰発現により、Ｔ２及びＴ２２領域での相互作用が著しく減弱することが明らかとなった。さらに、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ解析によって、遺伝子座内のクロマチンアクセシビリティが増大し、ＳＡＳＰ関連炎症遺伝子群の発現上昇が認められた。また、Ｘ線により誘導した老化細胞でも同様の現象が認められた（図６Ｅ、Ｆ）。これらの結果から、老化細胞におけるｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現上昇は、ＳＡＳＰ遺伝子座においてクロマチン構造のコンフォメーション変化を引き起こすことが示唆された。これまで細胞老化におけるＣＴＣＦの制御とＳＡＳＰ遺伝子発現との関連性の分子機構は解明されていなかったが、ペリセントロメアのｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡがＣＴＣＦの機能を阻害することでクロマチン相互作用に影響を与え、ＳＡＳＰ関連炎症関連遺伝子の発現に変化をもたらすことが明らかになった。
［ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの腫瘍に対する効果］
　ヒトやマウスのサテライトＲＮＡは、染色体不安定性を誘導し、腫瘍形成につながる可能性が報告されている。そこで、ＳＶｔｓ８細胞にＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを強制発現させ（図７Ａ）、染色体不安定性の典型的な特徴である多極化と染色体ブリッジの形成を免疫染色により解析した（図７Ｂ）。抗α－チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）により微小管を、ペリセントリン（Ａｂｃａｍ）により中心体を、ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりＤＮＡの染色を行った。多極化した細胞の割合は、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを強制発現させた細胞で有意に増加していた（図７Ｂ左）。また、染色体ブリッジを生じている細胞もｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを強制発現させた細胞で有意に増加していた（図７Ｂ右）。
　さらに、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを強制発現させた細胞は、染色体数の異常や足場非依存性増殖など、腫瘍細胞に見られる表現型を示していた。核型解析を行ったところ、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを強制発現させた細胞では、異常な染色体数を示す細胞が有意に増加していた（図７Ｃ）。また、軟寒天コロニー形成アッセイにより、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現により、足場非依存性増殖が生じるか解析した。ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現によって、足場非依存性増殖を示すコロニーが有意に増加していた（図７Ｄ）。
　次に、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡとＣＴＣＦを同時に過剰に発現させて、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡによって誘導される染色体不安定性に影響が生じるか検討した。ＳＶｔｓ８細胞にｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡとＣＴＣＦを強制発現させ、多極化した細胞の割合を図７Ｂと同様にして解析した。その結果、ＣＴＣＦを発現させると、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡによって誘導される染色体不安定性が消失することが明らかとなった（図７Ｅ）。したがって、ＣＴＣＦがｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡによって誘導される染色体不安定性に関与しており、腫瘍発生の危険因子であることが示唆された。
　マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）を用いてＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡを異所性に発現させた結果を示す。図７と同様にして、ＭＥＦｓにＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡを強制発現させ（図８Ａ）、多極化及び染色体ブリッジ形成（図８Ｂ）を顕微鏡により観察した。いずれも、ＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡを強制的に発現させることによって、有意に増加していた。さらに、足場非依存性増殖（図８Ｃ）、核型（図８Ｄ）についても解析を行ったところ、ＭａｊＳＡＴ　ＲＮＡ発現により、足場非依存性増殖を示す形質転換細胞や染色体の数の異常が有意に増加していた。さらに、これらの細胞をヌードマウスの皮下に移植したところ、腫瘍形成能を示した（図８Ｅ）。したがって、ペリセントロメアのサテライトＲＮＡは、発がんを促進する可能性があると結論づけられる。
　次に、腫瘍の微小環境におけるｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの機能に着目し解析した。がん細胞や老化した間質細胞から分泌される細胞外小胞が、がん微小環境において、腫瘍の発生や進行に関与していることが知られている。ＲＰＥ－１／ｈＴＥＲＴ細胞（ＡＴＣＣより入手）に、ドキソルビシン（ＤＸＲ）、又は４０－ｇｒａｙのＸ線照射（ＸＲＡ）を行い、細胞老化を誘導した。これら細胞から細胞外小胞を回収してＲＴ－ｑＰＣＲを行ったところ、老化細胞由来の細胞外小胞には、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ量が、増殖細胞由来の細胞外小胞よりも有意に多く含まれていた。しかし、ｈＳＡＴα　ＲＮＡ量は増加が認められなかった（図９Ａ）。
　ＲＮＡ－ｓｅｑデータの解析から、ヒト大腸がん細胞株から分泌される細胞外小胞（エクソソーム）から、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡが検出されることが報告されている。これらのことから、老化した間質細胞由来のｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡは、細胞外小胞を介して周囲の細胞に移行し、ＳＡＳＰ様炎症因子として機能することが推論される。ここではデータを示さないが、本発明者らは、老化細胞由来の細胞外小胞が、正常細胞の足場非依存性増殖と染色体不安定性を誘導することを確認している。そこで、細胞外小胞に含まれるｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの関与を評価するために、ＥＸＯｔｉｃデバイス（ＥＸＯｓｏｍａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎｔｏ　ｃｅｌｌｓ）を用いた合成生物学的手法（非特許文献１２）によって、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを含むデザイナーエクソソームを樹立した。作製したデザイナーエクソソームを、ＳＶｔｓ８細胞に取り込ませ、炎症関連遺伝子の発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより解析した。ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを含むデザイナーエクソソームによって、ＳＡＳＰ様の炎症関連遺伝子の発現の促進が認められた（図９Ｂ）。すなわち、作製したデザイナーエクソソームは、老化細胞由来の細胞外小胞と同様の腫瘍形成活性を有することを見出した。したがって、老化細胞から分泌されるエクソソームに含まれるｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡは、腫瘍微小環境中の間質細胞においてＳＡＳＰ様炎症関連遺伝子発現及び染色体不安定性を促進することを示している。
　腫瘍の微小環境におけるｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現を原発性大腸癌患者の外科切除標本を用い、ＲＮＡ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＲＮＡ－ＩＳＨ）法により解析した。その結果、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを発現している大腸がん細胞が、正常上皮細胞に比べ、有意に多く存在していた（図９Ｃ左）。また、がん関連線維芽細胞は、正常間質組織の線維芽細胞よりもｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ陽性細胞の割合が有意に高かった（図９Ｃ右）。したがって、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを発現する細胞老化した間質細胞は、ＳＡＳＰ様炎症因子とｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを含む細胞外小胞の分泌を介して、腫瘍微小環境において腫瘍形成を促進していることが示唆される（図９Ｄ）。
　上記で示したように、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを発現する老化した間質細胞は、がん微小環境を形成し、腫瘍形成を促進しているものと考えられる。そこで、ｈＳＡＴＩＩ発現を抑制することが、間質細胞の増殖抑制に影響を与えるか解析を行った。正常膵間質細胞ｈＰＳＣ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌより入手）に、ｈＳＡＴＩＩのｓｉＲＮＡを導入し、発現をＲＴ―ｑＰＣＲによって解析した。培養液にゲムシタビンを添加し細胞老化を誘導すると、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現が増加した（図１０Ａ上段）。同時に細胞生存アッセイＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（プロメガ）を行うと、正常膵間質細胞ではｈＳＡＴＩＩノックダウンの影響を受けないものの、ゲムシタビンで細胞老化を誘導した膵間質細胞ではｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現をｓｉＲＮＡによって抑制すると、細胞死が誘導される（図１０Ａ下段）。この結果は、抗がん剤を投与し、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現を抑制した場合には、がん細胞だけではなく、がん微小環境を形成していた間質細胞も細胞死が誘導されることを意味する。
　次に、がん細胞だけではなく、老化細胞、不死化細胞でも、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現を抑制すると、細胞死もしくは増殖抑制が誘導されることを示す。正常細胞ＴＩＧ３、不死化細胞ＨＥＫ－２９３Ｔ、大腸がん細胞ＬｏＶｏ、正常細胞であるＩＭＲ９０をＸ線照射により細胞老化を誘導した老化細胞に、ｓｉＲＮＡによりｈＳＡＴＩＩ発現を抑制した。ｓｉＲＮＡ導入後３日後の細胞の顕微鏡写真を示す（図１０Ｂ）。正常細胞であるＴＩＧ－３細胞は増殖に変化は認められないものの、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、老化を誘導したＩＭＲ－９０細胞では明らかな増殖抑制が認められ、ＬｏＶｏ細胞では細胞死が誘導されていることが認められた。これらの結果は、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現を抑制することにより老化細胞に細胞死が誘導され排除される、もしくは不死化細胞やがん細胞の増殖が抑制されることを意味し、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現の抑制により、細胞老化に起因する疾患を治療できる可能性を示している。
　本発明者らは、ＴＩＧ－３細胞に継代培養により細胞老化を誘導する過程でｈＳＡＴＩＩ　ＤＮＡ領域をＤＮＡ―ＦＩＳＨで検出することで、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現に先立ってｈＳＡＴＩＩ　ＤＮＡ領域が膨潤化することを見出した（図１１Ａ）。なお、ＤＮＡ－ＦＩＳＨは、配列番号１２のプローブを用いて行っているが、ｈＳＡＴＩＩ　ＤＮＡ領域を検出することができるプローブであれば、どのような配列を用いてもよい。さらに、複数のがん細胞株のＤＮａｓｅＩシーケンスデータからｈＳＡＴＩＩ　ＤＮＡ領域のクロマチンアクセシビリティを解析したところ、正常な線維芽細胞に比べてがん細胞で明らかにクロマチンアクセシビリティが上昇していた（図１１Ｂ）。
　以上の結果から、ペリセントロメアの非翻訳ＲＮＡであるｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを減少させることにより、細胞老化、及びこれに伴う疾患を抑制、あるいは予防することができる。具体的には、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現を抑制する薬剤を投与することによって、老化細胞を排除するとともに、ＳＡＳＰ因子の分泌を抑制することができる。上記で示してきたように、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現を標的として、その発現を抑制する物質は新しい治療薬となり得る。具体的には、上記で示したようにｓｉＲＮＡ、ＬＮＡなどの核酸医薬によって、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを減少させることができる。例えば、配列番号１及び２で表すｓｉＲＮＡは、効率よく、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを枯渇させることができるため有用である。また、これに限らず、ＬＮＡやｓｉＲＮＡを新たにデザインして使用してもよい。さらに、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現を標的とする化合物をスクリーニングして用いることもできる。
　疾患が細胞老化に起因しているかは、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現を検査することによって、確認することができる。例えば、配列番号４及び５で示すプライマーセットを使用すれば、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現を確認することができる。組織サンプルを用いてＲＮＡ－ＩＳＨで検出することも可能である。ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡはエクソソームなどの細胞外小胞にも含まれることから、血液・尿・腹水などの体液を用いて細胞外小胞内のｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの量を検出することも可能である。また、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現によって、発現が促進されるＳＡＳＰ因子を測定しても構わない。ＳＡＳＰ因子は、ＲＮＡ発現を測定してもよいし、タンパク質量や分泌された量をＥＬＩＳＡで測定してもよい。用いる試料は、疾患部位の組織、例えば、がんであれば生検によって採取した組織であってもよいし、体液由来の細胞外小胞を用いてもよい。また、ＣＴＣＦ発現の低下を検査してもよい。ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現、ＳＡＳＰ因子の発現、ＣＴＣＦの発現減少が認められた場合には、上述のｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現を抑制する医薬組成物を用いて治療を行うことができる。ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現に先立ってｈＳＡＴＩＩ　ＤＮＡ領域が膨潤化しクロマチンアクセシビリティが増すことから、ＤＮＡ―ＦＩＳＨ解析やＡＴＡＣシーケンス解析のようなエピゲノム解析や、体液中のゲノムＤＮＡ断片や細胞外小胞を用いた解析から、疾患の予測・診断を可能とする可能性がある。
　さらに、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現抑制、ＳＡＳＰ因子の発現抑制、あるいはＣＴＣＦ発現増加、ｈＳＡＴＩＩ　ＤＮＡ領域の収縮やクロマチンアクセシビリティ低下などのエピゲノム変化を指標として、化合物をスクリーニングすることもできる。例えば、ＦＲＥＴアッセイを用いた系を構築することにより、感度良く低分子化合物をスクリーニングすることができる。具体的には、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡには、ドナーとなる蛍光物質で標識されたビーズを、ＣＴＣＦに抗体などの特異的結合物質を介してアクセプターとなる蛍光物質で標識されたビーズを結合させた系を構築することができる（図１２）。ライブラリー化合物を添加し、特定の蛍光波長で励起すれば、ＳＡＴＩＩ　ＲＮＡとＣＴＣＦが近接した状態にあるかを判定することができる。あるいは、老化細胞を候補化合物とともに培養し、候補化合物によって、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現が抑制、あるいはＣＴＣＦ発現増加、ｈＳＡＴＩＩ　ＤＮＡ領域の収縮やクロマチンアクセシビリティ低下がおこれば、老化に起因する疾患の治療薬として機能し得る。老化細胞は実施例で示したような継代培養、Ｘ線照射、ドキソルビシン暴露等、通常この分野で用いられている細胞老化誘導法を用いることができる。ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ、ＣＴＣＦ発現は、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡ－ＩＳＨ等、これも周知の方法で解析することができる。また、ＳＡＳＰ因子群の遺伝子発現解析や分泌によってもモニターすることができる。
　以上、示したように、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡによるＳＡＳＰ誘導の機序と老化細胞の生存への関与を明らかにした。老化細胞では染色体のペリセントロメア領域が開いて、この領域から非翻訳ＲＮＡであるｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡがさかんに転写されている。ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡが染色体構造を維持するために重要な機能を担っているＣＴＣＦと結合し、その機能を阻害することにより染色体相互作用を変化させ、炎症性遺伝子群の転写が誘導されることを明らかにした。炎症性遺伝子群の転写がさかんな老化細胞は加齢性疾患の発症や病態の増悪に関与する。したがって、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡを新たな標的とし、炎症性ＳＡＳＰ関連遺伝子群の発現を抑制するＳｅｎｏｍｏｒｐｈｉｃ機能と老化細胞に選択的に細胞死を誘導するＳｅｎｏｌｙｔｉｃ機能を併せ持つＳｅｎｏ－ｔｈｅｒａｐｙにより、加齢性疾患を予防もしくは治療できる可能性がある。また、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現、ＣＴＣＦ発現、ゲノムＤＮＡのエピゲノム変化は細胞老化の初期の段階から生じることであるから、これを検出することにより、加齢性疾患の原因となる老化細胞を早期に検出することができる（図１３）。

Claims (5)

  1. 　細胞老化に起因する疾患の治療薬及び／又は予防薬であって、
    　ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現抑制もしくは活性阻害、及び／又はＣＴＣＦ発現を増加させることを特徴とする医薬組成物。
  2. 　前記医薬組成物がｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡの発現抑制もしくは活性阻害及び／又はＣＴＣＦ発現を増加させる核酸医薬であることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
  3. 　対象に細胞老化が生じているかデータを取得する方法であって、
    　試料中のｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ、ＣＴＣＦ発現、ゲノムＤＮＡのエピゲノム変化のいずれか１つを検出することを特徴とするデータ取得方法。
  4. 　老化細胞に起因する疾患を検査に使用することを特徴とする請求項３記載のデータ取得方法。
  5. 　老化細胞に起因する疾患の治療薬及び／又は予防薬をスクリーニングする方法であって、
    　老化細胞の培地に候補化合物を添加し、
    　ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ発現減少、ｈＳＡＴＩＩ　ＲＮＡ機能阻害、ＣＴＣＦ発現の増加、ＳＡＳＰ因子の発現減少、ｈＳＡＴＩＩ　ＤＮＡ領域の収縮、クロマチンアクセシビリティの低下の少なくともいずれか１つを指標として、
    　候補化合物を選択することを特徴とする医薬のスクリーニング方法。
     
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