CN102625707A - Hip/pap或其衍生物的新应用 - Google Patents

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CN102625707A CN2010800351012A CN201080035101A CN102625707A CN 102625707 A CN102625707 A CN 102625707A CN 2010800351012 A CN2010800351012 A CN 2010800351012A CN 201080035101 A CN201080035101 A CN 201080035101A CN 102625707 A CN102625707 A CN 102625707A
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G·阿穆亚尔
P·阿穆亚尔
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Abstract

本发明由HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于制备预防或治疗选自以下疾病的药物的用途组成：新生儿脑损伤，其包括脑缺氧引起的新生儿脑损伤；成人或儿童脑损伤，其包括脑缺氧引起的成人或儿童脑损伤；成人或儿童或新生儿外伤性脑损伤；小脑疾病或病症，和涉及Gap-43的产生或磷酸化中缺陷的疾病。

Description

HIP/PAP或其衍生物的新应用
发明领域
本发明涉及神经学领域，其包括新生儿、儿童和成人神经学。
本发明更具体涉及新生儿脑损伤领域。
发明背景
新生儿脑损伤构成医学研究的特定领域，因为参与新生儿神经损伤的过程不同于导致成人患者神经损伤的那些过程。
尽管具有改善的产科护理和新生儿护理，两类新生儿仍然具有发生具有永久性神经学损伤的围产期脑损伤的风险，称为具有主要白质损伤的早产儿和具有含缺氧缺血性脑损伤的足月窒息婴儿。除缺氧缺血外，导致兴奋性中毒细胞死亡的谷氨酸的增加释放和活性氧类别(ROS)的产生在这两组的脑损伤过程中是重要的。
新生儿窒息，也称为缺氧缺血(HI)，是婴儿在早产发生、生产、分娩或直接产后期过程中因氧气摄取不足引起的状况。新生儿窒息仍然是新生儿中慢性神经发病率和急性死亡率的主要原因，并通常引起缺氧缺血性脑病。现有研究已经显示，短至六分钟的新生儿缺氧可导致永久性神经损伤。大约14.6％的所有出生死亡均是由新生儿缺氧引起的。在西方国家，约0.9％的新生儿患有新生儿缺氧。约15-20％的新生儿死亡，并且在存活者中，因长期并发症，如智力迟钝、脑性麻痹、痉挛、学习困难或癫痫，25％的新生儿严重残疾。此外，越来越多地认识到，即使轻度缺氧的儿童开始时看起来可以恢复而没有并发症，但在儿童期也会具有行为问题，这可追溯到这种新生儿损伤。
一般地，新生儿脑损伤的开始和发展是复杂的过程，其具有多种作用机制和途径，导致早期和延迟损伤。研究已经集中在了这些过程的多个方面，包括氧化应激、炎症和兴奋性中毒，其在成熟或未成熟脑中非常不同(Gonzalez等，2008，Pharmacology and Therapeutics，120卷：43-53)。
目前，除作为重症监护的一部分提供的支持疗法和干预治疗外，没有用于与新生儿HI相关脑损伤的经批准治疗法。然而，具有大量有希望的研究途径，以在跟随已经用于检测临床应用但失败了的治疗中改善干预并发现新的策略。失败治疗的实例包括在复苏过程中补充葡萄糖、换气过度、咪达唑仑、巴比妥酸盐、地塞米松和其他糖皮质激素、钙通道阻滞剂、硫酸镁、吲哚美辛、缀合聚乙二醇的超氧化物歧化酶/过氧化氢酶、MK-801、右美沙芬、和胱天蛋白酶抑制剂。新生儿大脑HI的处理包括支持疗法，以提供充分换气、精确的流体处理、避免低血压和低血糖，和对发作的治疗。实际上，已经假设，改善婴儿在HI后复苏的方式是迈向改善结果并减少残疾至关重要的第一步。复苏过程中使用的氧气浓度可影响HI后的脑损伤。已经在患有HI的新生儿和局部缺血性中风的啮齿动物模型中尝试了高压氧，并获得了一些成功。需要进一步的研究来澄清氧气在中风新生儿中的作用，所述新生儿也具有患氧自由基疾病的风险。
除了改善重症监护，已经进行了许多研究来鉴定新的治疗选项和可能的干预，以改善进行性脑损伤的过程。简言之，已经发展了多种策略，包括检测抗氧化剂、抗炎剂、细胞死亡抑制剂、生长因子、干细胞治疗或低体温。已经研究了多种抗炎症化合物。因其副作用谱和一些失败的试验，几种干预，如别嘌醇/奥昔嘌醇、去铁敏和褪黑激素尝试降低因自由基引起的HI诱导的脑损伤已经不能引起临床兴趣了。近期有希望的治疗法包括促红细胞生成素和N-乙酰半胱氨酸。促红细胞生成素是具有抗细胞凋亡、antinitrosative和血管生成性质的抗氧化剂。也已经报道了促红细胞生成素通过改变细胞命运决定而促进神经保护和神经发生，并在未成熟大鼠中风后改善功能结果。众所周知的抗氧化剂和自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸可穿过胎盘和血脑屏障(BBB)，并在怀孕期具有良好的安全谱。除在窒息后观察到的改善的心肾恢复外，已经显示N-乙酰半胱氨酸降低氧化应激、恢复细胞内谷胱甘肽水平、清除氧自由基、提高细胞氧化还原电位并减少细胞凋亡和新生儿脑的炎症。氢治疗可能也代表了待开发的治疗策略。此外，已经尝试了通过脑室内注射神经干细胞/祖细胞与软骨素酶ABC在新生缺氧缺血大鼠中减轻脑损伤(Sato等，2008，Reprod Sci，15(n°6)卷：613-620)。
在引起极大医学关注的脑外伤中，当外部力量损伤脑时发生外伤性脑损伤(TBI)。TBI是全世界死亡和残疾，特别是儿童和青年人死亡和残疾的主要原因。TBI定义为因外部机械力，如快速加速或减速、撞击、冲击波、或发射物穿透引起的脑损伤。脑外伤引起继发性损伤，其包括脑血流量和颅骨内压力改变。TBI可引起许多身体、认知、情绪和行为影响。TBI结果可在完全恢复到永久性残疾或死亡范围内。20世纪已经在诊断和治疗中看到了关键性的进展，其已经降低了死亡率并改善了结果。这些包括成像技术，如计算机层析X射线照相术和磁共振成像。受TBI影响的人应该在损伤后所谓的“黄金时间”内立即进行急救。患有中等到重度损伤的人在神经外科病房后可能在重病监护病房接受治疗。治疗依赖于患者的恢复阶段。在急性期，主要目标是稳定患者并集中在预防进一步的损伤上，因为很难逆转外伤引起的最初损伤。主要的医学关注是保证适当的氧供应，维持充足的脑血流量，并控制升高的颅内压。目前进行研究以设计可能的医学治疗，其可以帮助患者的神经保护。然而，测试可阻止脑细胞损伤的试剂的临床试验大多数都失败了。
例如，在低温冷却受伤的大脑以限制TBI损伤中存在兴趣，但临床试验显示其在治疗TBI中没有用。这些失败可能是由于这样的因素，所述因素包括试验设计中的错误或单一试剂不足以防止继发性损伤中涉及到的系列损伤过程。
已经评估高压氧疗法(HBO)为TBI之后的辅助治疗，总结了Cochrane综述，即其用途不能判定用于TBI的HBO仍然有争议，因为研究已经寻找了改善机制，并且进一步的证据显示其具有治疗潜力。
先前的评论表明，迄今为止，非常需要医学进步来治疗患有外伤性脑损伤的患者。
本领域中需要鉴定有效治疗新生儿脑损伤的其他化合物。
本领域还需要鉴定用于治疗外伤性脑损伤(TBI)的化合物，所述外伤性脑损伤引起神经元细胞死亡，并且目前很少有用于此的治疗方法。
本领域还需要鉴定用于治疗小脑疾病的化合物，所述小脑疾病包括小脑遗传疾病，以及环境性小脑疾病。
本领域还需要鉴定用于治疗阿尔茨海默氏病以及阿尔茨海默氏病特定症状之前的意识认知缺损的化合物。
发明概述
本发明提供用于预防或治疗多种类型脑损伤的其他化合物。
本发明涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗新生儿脑损伤的用途，所述新生儿脑损伤包括脑缺氧引起的新生儿脑损伤。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗外伤性脑损伤(TBI)的用途。
本发明涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗脑缺氧引起的脑损伤的用途。
本发明特别涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗由脑缺氧引起的新生儿脑损伤组成的脑损伤的用途。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗由脑缺氧引起的儿童脑损伤组成的脑损伤的用途。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗由脑缺氧引起的成人脑损伤组成的脑损伤的用途。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗由脑血管事故或外伤性脑损伤组成的脑损伤的用途，所述脑损伤包括中风，并且其中中风优选选自缺血性中风和出血性中风。
本发明特别涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗由小脑疾病或小脑病症(其包括小脑性共济失调)的用途。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于体外或体内调节、增强或改善神经元生长或可塑性的用途。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于调节神经元细胞的结构重塑或可塑性的用途。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于保护神经元细胞免于细胞凋亡或细胞死亡的用途。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗病症或疾病的用途，所述病症或疾病涉及Gap-43产生的去调节或缺陷，或Gap-43磷酸化的去调节或缺陷。
本发明还具有HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于体外培养神经元细胞的用途的主题。
本发明还涉及用于神经元细胞的培养基，其包含HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物。
附图简述
图1图解了HIP/PAP对来自GAP 43+/+小鼠的皮质神经元细胞的细胞凋亡的保护作用。纵坐标：TUNEL阳性细胞的百分比；横坐标：从左到右，与(1)对照培养基，(2)NMDA，(3)NMDA和HIP/PAP，和(4)单独NMDA温育的细胞。′#″：与对照相比显著的；″*″：与NMDA相比显著的。
图2图解了HIP/PAP对来自GAP 43+/+小鼠的皮质神经元细胞中的初级轴突的数量的影响。纵坐标：具有特定数量的初级轴突的细胞的百分比。横坐标：四组条形，从左到右分别是：(1)具有0个初级轴突的细胞，(2)具有1个初级轴突的细胞，(3)具有2个初级轴突的细胞，(4)具有3个或更多初级轴突的细胞；每组条形图解了从左到右，利用(a)对照培养基，(b)NMDA，(c)NMDA和HIP/PAP，和(d)单独HIP/PAP获得的结果；′#″：与对照相比显著的；″*″：与NMDA相比显著的。
图3图解了HIP/PAP对小鼠皮质神经元细胞中的二级轴突的数量的影响。纵坐标：具有二级轴突的细胞的百分比。横坐标：四组条形，从左到右分别是：(1)对照培养基，(2)NMDA，(3)NMDA和HIP/PAP，和(4)单独HIP/PAP；每组条形图解了利用来自以下小鼠皮质细胞获得的结果，从左到右是：(a)GAP 43+/+小鼠，(b)GAP 43+/-小鼠和(c)GAP 43-/-小鼠；′#″：与对照相比显著的；″*″：与NMDA相比显著的。
图4图解了HIP/PAP对小鼠皮质神经元细胞中的三级轴突的数量的影响。纵坐标：具有三级轴突的细胞的百分比。横坐标：四组条形，从左到右分别是：(1)对照培养基，(2)NMDA，(3)NMDA和HIP/PAP，和(4)单独HIP/PAP；每组条形图解了利用来自以下小鼠皮质细胞获得的结果，从左到右是：(a)GAP 43+/+小鼠，(b)GAP 43+/-小鼠和(c)GAP 43-/-小鼠；′#″：与对照相比显著的；″*″：与NMDA相比显著的。
图5图解了HIP/PAP对来自GAP 43+/+小鼠的皮质神经元细胞中的分支点的数量的影响。纵坐标：具有特定数量的分支点的细胞的百分比。横坐标：三组条形，从左到右分别是：(1)具有1个分支点的细胞，(2)具有2个分支点的细胞，(3)具有3个或更多分支点的细胞；每组条形图解了从左到右，利用(a)对照培养基，(b)NMDA，(c)NMDA和HIP/PAP，和(d)单独HIP/PAP获得的结果；′#″：与对照相比显著的；″*″：与NMDA相比显著的。
图6图解了HIP/PAP对来自GAP 43+/+小鼠的皮质神经元细胞中的轴突长度的影响。纵坐标：具有特定的轴突长度范围的细胞的百分比。横坐标：四组条形，从左到右分别是：(1)轴突长度范围在0到10μm的细胞，(2)轴突长度范围在11到25μm的细胞，(3)轴突长度范围在25到40μm的细胞，和(4)轴突长度大于40μm的细胞；每组条形图解了从左到右，利用(a)对照培养基，(b)NMDA，(c)NMDA和HIP/PAP，和(d)单独HIP/PAP获得的结果；′#″：与对照相比显著的；″*″：与NMDA相比显著的。
发明详述
此处已经发现，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物能够保护免于神经元细胞死亡，尤其免于在脑损伤中发生的神经元细胞死亡，所述脑损伤包括新生儿脑损伤、儿童脑损伤和成人脑损伤。
此处让人想起的是，HIP/PAP蛋白先前在本领域中称为肝细胞的促有丝分裂因子。先前也已知HIP/PAP(Reg IIIa)基因在炎性脑疾病(称为实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE))的小鼠实验模型中上调，并且显示HIP/PAP蛋白可能在小鼠EAE上发挥预防效应。这些初步数据已经导致以前的读者断言Reg III蛋白对于治疗成人患者非常多种的炎性或神经疾病，包括多发性硬化、视神经炎、视神经脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、肾上腺脊髓神经病、脊髓损伤、肌萎缩性脊髓侧索硬化、炎性肠病或脓毒具有有益影响(参阅美国专利申请n°US 2005/0277593)。此处让人想起的是，EAE由脑炎症的动物模型组成，模拟中枢神经系统的炎性脱髓鞘疾病，像多发性硬化和急性播散性脑脊髓炎(ADEM)。一般而言，EAE也是T细胞介导的自身免疫疾病的原型。也让人想起的是，髓鞘由神经胶质细胞的向外生长组成，并且施万细胞为外周神经元提供髓鞘，然而，少突神经胶质细胞，尤其是束中类型的少突神经胶质细胞使中枢神经系统的轴突髓鞘化。脱髓鞘病基本上包括多发性硬化、急性播散性脑脊髓炎、横贯性脊髓炎、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、吉-巴综合征、中央脑桥脂肪髓磷脂化、家族黑矇性白痴，以及遗传性脱髓鞘性病，如leucodistrophy和CharcotMarie Tooth。不需要说的是，疾病，像脓毒、肌萎缩性脊髓侧索硬化、脊髓损伤、炎性肠病、阿尔茨海默氏病、痴呆、血管炎或局部缺血损伤不由最初因脱髓鞘引起的疾病组成。结果，通过抑制EAE症状的物质对这些后面疾病的预防或治疗缺乏对本领域技术人员而言任何技术可靠性。
本领域中也显示，在HIP/PAP基因的基因组序列的等位基因多态性与多发性硬化发生之间存在相关性(参阅PCT申请n°WO 2007/071437)。最终，本领域中也显示，Reg家族成员将是受损神经元与神经胶质细胞之间的介体，并可能在神经再生过程中起作用(参阅Namikawa等，2005，Biochem Biophys Res Commun，332卷(n°1)：126-134)。
根据本发明已经发现，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物在脑损伤过程中具有神经保护性质。已经发现，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物在新生儿脑损伤过程中，因此在早期发育中发生的脑损伤过程中具有神经保护性质，所述早期发育中发生的脑损伤完全不同于成人已发育的脑发生的脑损伤。
更精确的是，此处已经发现HIP/PAP在脑损伤的实验模型中，尤其在新生儿脑损伤的实验模型中具有体外和体内神经保护效应。
本发明涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于保护神经元细胞免于细胞凋亡或细胞死亡的用途。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗新生儿、儿童和成人脑损伤的用途。
本发明一般涉及HIP/PAP或其蛋白衍生物，其用于预防或治疗胎儿、新生儿、儿童和成人外伤性脑损伤(TBI)。
一般而言，当此处详细说明HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗病理学状态，包括创伤、疾病和病症的用途时，这也表示本发明的方面涉及HIP/PAP或其蛋白衍生物，其用于预防或治疗所述病理学状态。
一般而言，当此处详细说明HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗病理学状态，包括创伤、疾病和病症的用途时，这也表示本发明的方面涉及HIP/PAP或其蛋白衍生物用于制备预防或治疗所述病理学状态的药物的用途。
一般而言，当此处详细说明HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗病理学状态，包括创伤、疾病和病症的用途时，这也表示本发明的方面涉及用于预防或治疗所述病理学状态的方法，其包括向需要预防或治疗的患者施用HIP/PAP或其蛋白衍生物的步骤。
如此处所用，在医学上根据Glascow Coma Scale(GCS)确定并划分外伤性脑损伤，根据所述Glascow Coma Scale(GCS)，基于对刺激的言语、行动和睁眼反应将人的意识水平在3到15的等级上分级(参阅Marion DW(1999).″Introduction″，in Marion DW.Traumatic Brain Injury.Stuttgart：Thieme)。
本发明涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗选自新生儿脑损伤和成人或儿童脑损伤，包括脑缺氧引起的成人或儿童脑损伤的疾病的用途。
其因此涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于制备预防或治疗选自新生儿脑损伤和成人或儿童脑损伤，包括脑缺氧引起的成人或儿童脑损伤的疾病的药物的用途。
本发明涉及用于预防或治疗脑损伤，尤其是新生儿脑损伤的实验模型中的脑损伤的方法，其中所述方法包括向需要预防或治疗的患者施用适当量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的步骤。
本发明还提供用于预防或治疗胎儿、新生儿、儿童和成人外伤性脑损伤(TBI)的方法，其中所述方法包括向需要预防或治疗的患者施用适当量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的步骤。
其还涉及用于预防或治疗选自新生儿脑损伤和成人或儿童脑损伤，包括脑缺氧引起的成人或儿童脑损伤的疾病的方法，其中所述方法包括向需要预防或治疗的患者施用适当量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的步骤。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗胎儿、新生儿、儿童和成人外伤性脑损伤(TBI)的用途。
本发明包括HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗新生儿脑损伤的用途。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于制备预防或治疗胎儿、新生儿、儿童和成人外伤性脑损伤(TBI)的药物的用途。
其因此涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于制备预防或治疗新生儿脑损伤的药物的用途。
其也涉及用于预防或治疗新生儿脑损伤的方法，其中所述方法包括向需要预防或治疗的患者施用适当量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的步骤。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗用于预防或治疗小脑疾病或病症，包括新生儿、儿童和成人个体中小脑疾病或病症的用途。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗在Gap-43产生或磷酸化中具有缺陷的疾病的用途。
在本说明书中描述的预防性或治疗性方法的大多数实施方案中，所述HIP/PAP蛋白或所述其蛋白衍生物与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合，以形成药物组合物。
药学上可接受的赋形剂优选由美国药典或欧洲药典中认可或列举的那些组成。
本发明通过提供新的保护组合物针对任何脑损伤/外伤/变性的神经元保护提供新线索。
“HIP/PAP蛋白”此处指包含SEQ ID N°1的氨基酸序列的蛋白质。HIP/PAP蛋白的特定实施方案包括这样的蛋白质，其包含选自SEQ ID N°2和SEQ ID N°3的氨基酸序列。SEQ ID N°3的HIP/PAP蛋白由此处实施例中更明确阐明的HIP/PAP蛋白组成，其中其也可称为“ALF5755”。如此处的实施例中所阐明，可在大肠杆菌(E.coli)中重组产生SEQ ID N°3的HIP/PAP蛋白。SEQ ID N°3的HIP/PAP蛋白包含12个氨基酸的N末端前肽部分，在体内切割所述N末端前肽部分，用于释放所述HIP/PAP蛋白的生物活性部分。所述HIP/PAP蛋白的所述生物活性部分定位在SEQID N°3的13位异亮氨酸残基到150位天冬氨酸残基之间。类似地，所述HIP/PAP蛋白的所述生物活性部分定位在SEQ ID N°2的12位色氨酸残基到149位天冬氨酸残基之间。
优选地，HIP/PAP蛋白的任何实施方案，以及其衍生物的任何实施方案由重组蛋白质，例如在细菌或动物细胞(包括昆虫细胞和哺乳动物细胞)中重组产生的蛋白质组成。
本发明人已经表明HIP/PAP蛋白显著降低兴奋性中毒脑损伤的新生小鼠模型中的神经元死亡或凋亡。
本发明还通过HIP/PAP的抗氧化能力提供针对氧化应激的治疗工具，所述氧化应激是神经元异常和变性的主要因素，如下文进一步详细说明。此外且有趣的是，当在CNS外周施用，而不是直接向CNS递送时，也观察到HIP/PAP蛋白的效果。最后，HIP/PAP蛋白的保护作用包括预防神经元死亡并诱导神经元可塑性。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于调节神经元细胞结构重塑或可塑性的用途。
如此处实施例所示，HIP/PAP蛋白在小鼠神经元原代培养中防止体外N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的神经元细胞死亡。此处还显示，HIP/PAP蛋白在原代小鼠神经元培养物中挽救了体外N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的神经元细胞死亡。
同样，本发明显示，HIP/PAP蛋白防止正发育的小鼠脑中谷氨酸能类似物鹅膏蕈氨酸引起的体内兴奋性中毒损伤。
此外，实施例中呈现的结果公开了HIP/PAP蛋白对正发育的小鼠脑中谷氨酸能类似物鹅膏蕈氨酸引起的兴奋性中毒损伤具有体内挽救效应。
此外，根据本发明已经发现，HIP/PAP蛋白对新生儿脑损伤的预防性和治疗性体内效应可能是HIP/PAP的多效活性的结果，即HIP/PAP参与多种神经元挽救生理学途径的结果。
作为HIP/PAP在预防或治疗新生儿脑损伤中的多效活性的阐明，此处还显示HIP/PAP影响针对活性氧类别，像过氧化氢(H2O2)诱导的新生儿神经元细胞死亡的神经保护。
作为HIP/PAP在预防或治疗新生儿脑损伤中的多效活性的进一步说明，此处还显示在新生儿脑损伤的体外和体内模型中，HIP/PAP诱导GAP-43或磷酸化GAP-43的产生、磷酸化和分布的改变，本领域中已知其为参与轴突生长和神经元可塑性的蛋白质。
值得注意的是，HIP/PAP诱导GAP-43标记的神经元过程的束状分布。
同样，HIP/PAP诱导GAP-43蛋白的磷酸化形式的增强表达，即在GAP-43氨基酸序列的41位定位的丝氨酸残基(S41)上磷酸化的GAP-43形式的增强表达。HIP/PAP更诱导GAP-43总细胞量的减少，同时诱导磷酸(S41)-GAP-43的增加。
不希望受任何特定理论的束缚，本发明人相信HIP/PAP对GAP-43的生物学效应对预防或治疗脑缺氧引起的脑损伤重要，尤其对预防或治疗新生儿脑损伤重要。在该上下文中，本发明人相信HIP/PAP对GAP-43产生和代谢的作用缓解某些神经元细胞死亡或凋亡的后果。
然而，已经在此处的实施例中显示，HIP/PAP对神经元细胞死亡或神经元细胞凋亡的保护效应不受HIP/PAP对GAP-43作用的强制介导，因为在不产生GAP-43蛋白(GAP43-/-)的哺乳动物中维持了HIP/PAP的所述保护效应。
此外，此处实施例中显示，HIP/PAP甚至在不产生GAP-43的哺乳动物(GAP43-/-)中诱导或增加神经可塑性。
在此处实施例中通过HIP/PAP产生增加数量的轴突，以及产生具有高复杂性的轴突(存在一级、二级和三级轴突，以及具有增加数量分支点的轴突)的能力阐明HIP/PAP引起的增加的神经元可塑性。
在此处实施例中也通过HIP/PAP逆转毒性剂，像NMDA对轴突生长的有害效应的能力阐明HIP/PAP引起的增加的神经元可塑性。
如此处所用，可与此处的术语“脑可塑性”互换使用的术语“神经可塑性”指脑在成熟、学习、环境攻击或病理，包括外伤性事件，像也可称为颅内损伤的外伤性脑损伤(TBI)过程中改变其结构和功能的能力。
HIP/PAP引起的增加的神经可塑性特别在治疗经历不利事件的患者的方法中具有治疗有用性，所述不利事件引起血液向脑的供应中断，其包括外伤性脑损伤和中风。实际上，在突触、细胞和网络水平上充分记载了局部缺血损伤后大脑皮质和皮质下结构中发生的可塑性现象。先前的工作显示，神经可塑性在人中风存活者中局部缺血后脑的神经康复过程中起关键作用。
上述实验结果支持HIP/PAP蛋白在体外和体内调节、增强或改善神经元生长或神经元可塑性的有用性，神经元生长或神经元可塑性的所述调节或所述改善受Gap-43调节或不受Gap-43调节。
此外，如此处实施例所述，HIP/PAP蛋白防止小鼠小脑粒细胞的原代培养物中体外兴奋性中毒诱导的细胞死亡和氧化细胞死亡。这些结果支持HIP/PAP蛋白用于预防和治疗小脑状况，如脊髓小脑性共济失调的有用性。
这些实验结果还支持HIP/PAP蛋白针对多种神经元细胞类型，尤其是皮质和小脑中存在的那些类型的神经保护活性。
如此处所用，脑缺氧包括这样的情况，其中脑损伤由向脑，尤其是向神经元细胞的氧供应减少引起，并且其中脑缺氧引起神经元细胞死亡或凋亡。认为当血管阻塞和/或当在脑组织中发生任何其他原因的氧气耗尽，尤其是窒息时发生脑缺氧。
如此处所用，“新生儿”脑损伤包括对胎儿(也称为胎儿脑损伤)、早产新生儿、足月新生儿和过期产新生儿，以及小于1岁的儿童的脑引起的任何损伤。因此，新生儿脑损伤包括通常称为《围产期的》的脑损伤(其在分娩之前和之后立即发生)，以及通常称为新生儿脑损伤的脑损伤(其在长达四周的围产期时发生)。新生儿脑损伤包括中风、产伤、代谢或遗传病症、癫痫持续状态，和导致缺氧和局部缺血(HI)的多种窒息事件。HI通常导致早产婴儿中脑室周白质损伤，而足月儿发生皮质/皮质下损伤。一般地，本领域承认的是，在独特形式脑病基础上识别新生儿脑损伤，所述脑病在生命前三天内从昏睡发展到兴奋性过度到木僵。Ferriero公开了诊断新生儿脑损伤的可用方法的综述，本领域技术人员可参考所述综述，此处公开了其完整内容(Ferriero，204，New England Journal of Medicine，351卷(n °19)：1985-1995)。
在胎儿生命中，新生儿脑损伤可由以下引起：(i)因低动脉血氧分压诱导的血流灌注不足的缺氧缺血性紊乱或(ii)严重的低氧血症，其导致心肌功能障碍，随后大脑血流灌注不足，导致神经元局部缺血。
新生儿脑损伤包括胎儿低氧血症，其通常是胎盘机能不全的结果。
新生儿脑损伤也包括围产期低氧血症，其通常是呼吸或心肌机能不全单独或组合引起的出生后低氧血症。
新生儿脑损伤包括胎儿局部缺血。
新生儿脑损伤包括围产期局部缺血，其为出生后局部缺血，这可能是由于严重的心脏收缩功能障碍，其导致大脑血流灌注不足和脑血管调节丧失。循环功能不全可能起因于严重的出生前或出生后出血或新生儿脓毒。
新生儿脑损伤也包括压力被动脑循环引起的损伤，其中脑循环的自身调节受到损伤并且诱导了低氧血症。
新生儿脑损伤也包括由于灌注不足的新生儿缺氧，所述灌注不足影响沟的深度并产生对低血压损伤的增强的敏感性。
实际上，新生儿损伤包括新生儿脑缺氧期间的过度释放或兴奋性神经递质。
根据本发明，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物可用于预防或治疗新生儿脑损伤，根据用于划分脑缺氧缺血性脑病(HIE)的Sarnat的常规分级系统，所述新生儿脑损伤等级划分在阶段1到阶段3范围内。
Sarnat分级系统的阶段1依赖于早期综合征的发现和脑电图(EEG)的发现，所述早期综合征的特征在于高度警觉和交感神经激活、对刺激的过度反应、正常音调的弱吮吸。该阶段持续少于24小时，并且保持在阶段1的患者具有正常的神经学结果。
进行到Sarnat分级系统阶段2的患者具有轻微的张力减退，是昏睡或迟钝的(例如，对感觉刺激具有延迟的和不完整的响应)、临床发作、具有瞳孔缩小(甚至在暗光中)的副交感神经激活、心率缓慢(＜120bpm)、蠕动增加和分泌物丰富。早期开始时，EEG显示相对低电压振幅(在缓慢θ和δ范围内＜25μV)。第二天，EEG在失眠或迟钝(其在睡眠期间恶化)期间显示了爆发模式和具有中央或暂时优势的多病灶低频率(1-到1.5-Hz)EEG发作。如果EEG在5天内恢复，其再次变得完全正常。如果在多于5天内发生恢复，观察到低振幅的减缓。阶段2持续2-14天。5天内的临床和EEG恢复与良好的预后相关。如果爆发间间隔是完全等电位的，或如果爆发频率低于每6秒钟一次，并且爆发模式(每3-6秒)持续多于7天，那么周期性EEG可能指示预后不良。
Sarnat分级系统的阶段3的特征在于仅对强烈刺激响应的木僵、具有退缩或去大脑体态、严重的张力减退(例如，肌肉松弛)和深度肌腱反射的抑制、初级(例如，莫罗、紧张性颈、吮吸)反射，和脑干(例如，角膜、眼脑、咽)反射。临床发作在阶段3比在阶段2中发生频率低。患者具有全身交感或副交感神经自主功能障碍，具有异常呼吸和对光反应弱的小或中间位置的瞳孔。EEG显示加深的周期性模式，其具有增加的爆发幅度和降低的爆发频率(每6-12秒)。图像的进一步恶化导致非常低的电压或等电位EEG。
如此处所用，“儿童”脑损伤，尤其是儿童外伤性脑损伤包括，或由脑损伤，尤其是外伤性脑损伤组成，其发生在大于一岁到十二岁范围内的个体中。
如此处所用，“成人”脑损伤，尤其是成人外伤性脑损伤包括，或由脑损伤，尤其是外伤性脑损伤组成，其发生在大于十二岁到死亡年龄范围内的个体中。
如此处所用，HIP/PAP蛋白的“衍生物”包括这样的多肽，其包含与选自SEQ ID N°1到3的多肽具有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
用于本说明书时，认为包含及其语法变型表示所述特征、整数、步骤或其组分或组的存在，但不排除一种或多种其他特征、整数、步骤或其组分或组的存在或添加。
HIP/PAP蛋白衍生物包括这样的蛋白质，其包含与选自SEQ ID N°1到3的多肽有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高氨基酸同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HIP/PAP蛋白衍生物包括这样的蛋白质，其与选自SEQ ID N°1-3的HIP/PAP蛋白具有强氨基酸同一性，并与参考HIP/PAP蛋白相比具有一个或多个氨基酸残基添加、替换或缺失。根据这些实施方案，所述HIP/PAP蛋白衍生物与参考HIP/PAP蛋白的氨基酸序列相比，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多氨基酸残基添加、替换或缺失。根据这些实施方案，所述HIP/PAP蛋白与参考HIP/PAP蛋白的氨基酸序列相比，具有不超过25个氨基酸残基添加、替换或缺失。
如此处预期，HIP/PAP蛋白衍生物具有生物学活性。如此处预期，HIP/PAP蛋白衍生物具有HIP/PAP蛋白的生物学活性部分。
HIP/PAP蛋白的“生物学活性”衍生物包括HIP/PAP衍生的肽，其具有以下一种或多种生物学活性：
-(i)在小鼠神经元原代培养中，尤其在小鼠皮质神经元原代培养和小鼠小脑颗粒细胞原代培养中防止体外N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的神经元细胞死亡，
-(ii)在正发育的脑，例如小鼠正发育的脑中防止谷氨酸能类似物鹅膏蕈氨酸引起的体内兴奋性中毒损伤；
-(iii)在正发育的脑，例如小鼠正发育的脑中对谷氨酸能类似物鹅膏蕈氨酸引起的体内兴奋性中毒损伤具有体内挽救效应；
-(iv)引起针对活性氧类别，像过氧化氢(H2O2)诱导的新生儿神经元细胞死亡的神经保护；
-(v)防止体外H2O2诱导的原代小鼠小脑颗粒细胞损伤和
-(vi)诱导Gap-43的产生、磷酸化和分布的改变。
具有选自上述(i)-(v)的生物学活性的HIP/PAP蛋白的“生物学活性”衍生物不必赋予相同数量级的所述生物学活性，只要使用在此处实施例中公开的测定中，所述HIP/PAP蛋白衍生物具有可检测水平的上述一种或多种生物学活性(i)-(iv)。
在一些实施方案中，可通过适当的纯化方案，使用标准的蛋白质纯化技术从细胞或组织来源中分离HIP/PAP蛋白或其衍生物，包括如上所述的HIP/PAP的生物学活性部分。
在其他实施方案中，可通过本领域技术人员熟悉的重组DNA技术产生HIP/PAP蛋白或其衍生物，包括如上所述的HIP/PAP的生物学活性部分。
根据其他实施方案，可使用标准肽合成技术化学合成HIP/PAP蛋白或其衍生物，包括如上所述的HIP/PAP的生物学活性部分。
分离的或纯化的HIP/PAP蛋白或其衍生物，包括如上所述的HIP/PAP的生物学活性部分基本没有来自细胞或组织来源(所述蛋白质来自所述细胞或组织来源)的细胞物质或其他污染蛋白质，或当化学合成时基本没有化学前体。
HIP/PAP蛋白衍生物也包括HIP/PAP嵌合或融合蛋白。如此处所用，嵌合蛋白或融合蛋白包含融合到非HIP/PAP多肽的上文引用的多肽。在融合蛋白中，HIP/PAP多肽和非HIP/PAP多肽彼此融合。非HIP/PAP多肽可融合到HIP/PAP多肽的N末端或C末端上。
例如，在一个实施方案中，融合蛋白是GST-HIP/PAP融合蛋白，其中HIP/PAP序列融合到GST序列的C末端。该融合蛋白可利于重组HIP/PAP的纯化。
在所有情况下，根据此处该表述的前述定义，本发明的融合蛋白是具有“生物学活性的”，其包括所述融合蛋白与SEQ ID N°3的HIP/PAP具有相同生物学活性。
为了本发明目的测定两条氨基酸序列的百分比同一性，比对序列用于最佳比较目的。例如，可在第一条和第二条氨基酸序列的一条或两条中引入空位用于最佳比对，并且可忽略非同源序列用于比较目的。
为了最佳比较目的，可利用CLUSTAL W(版本1.82)，用以下参数实现两条氨基酸序列的百分比同一性：(1)CPU MODE＝ClustalW mp；(2)ALIGNMENT＝《全长》；(3)OUTPUT FORMAT＝《aln w/numbers》；(4)OUTPUT ORDER＝《比对》；(5)COLOR ALIGNMENT＝《无》；(6)KTUP(字大小)＝《默认》；(7)WINDOW LENGTH＝《默认》；(8)SCORETYPE＝《百分比》；(9)TOPDIAG＝《默认》；(10)PAIRGAP＝《默认》；(11)PHYLOGENETIC TREE/TREETYPE＝《无》；(12)MATRIX＝《默认》；(13)GAP OPEN＝《默认》；(14)END GAPS＝《默认》；(15)GAPEXTENSION＝《默认》；(16)GAP DISTANCE S＝《默认》；(17)TREETYPE＝《进化树》et(18)TREE GRAP DISTANCES＝《隐藏》。
HIP/PAP的生物学活性部分包括这样的肽，其包含与SEQ ID N°1到3任何一项的HIP/PAP的全长氨基酸序列充分同源的氨基酸序列，其包括与相应的全长HIP/PAP相同数量的氨基酸，并显示与HIP/PAP至少相同的生物学活性。
HIP/PAP的生物学活性部分包括其他这样的肽，其包含与SEQ ID N°1到3任何一项的HIP/PAP的全长氨基酸序列充分同源的氨基酸序列，其比相应的全长HIP/PAP包括更多的氨基酸，并显示与HIP/PAP至少相同的生物学活性。
除了在哺乳动物中存在的HIP/PAP序列的生物学活性部分的天然发生的等位变体外，本领域技术人员还理解，可通过在SEQ ID N°1到3任何一项的核苷酸序列中突变引入改变，由此导致HIP/PAP的氨基酸序列改变，但不改变HIP/PAP的生物学活性。
此外，可在对应于HIP/PAP蛋白的序列中进行非必需氨基酸的替换。“非必需”氨基酸残基是可从HIP/PAP的野生型序列中改变但不改变生物学活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基为生物学活性所需。
一般地，HIP/PAP蛋白衍生物包括这样的物质，其包含HIP/PAP蛋白或其HIP/PAP生物学活性部分。
在这些HIP/PAP蛋白衍生物的某些实施方案中，HIP/PAP蛋白或其HIP/PAP生物学活性部分可通过非共价键与其非HIP/PAP部分组合或结合。示例性实施方案包括这样的脂质体，其包含HIP/PAP蛋白或其HIP/PAP生物学活性部分，其中其非HIP/PAP部分由脂质体颗粒本身组成。根据考虑的脂质体的类型，或根据用于制备所述脂质体的方法，HIP/PAP蛋白或其生物学活性部分可定位在脂质体表面(例如，暴露于脂质体外部环境中)或包被在其中。
在这些HIP/PAP蛋白衍生物的某些其他实施方案中，HIP/PAP蛋白或其HIP/PAP生物学活性部分可通过非共价键与其非HIP/PAP部分组合或结合。示例性地，HIP/PAP PAP蛋白或其生物学活性部分可共价结合选自蛋白质或非蛋白质化合物(像聚乙二醇分子)的HIP/PAP部分，其中最终的HIP/PAP衍生物由聚乙二醇化的HIP/PAP或聚乙二醇化的其生物学活性部分组成。
在向需要所述HIP/PAP蛋白衍生物的患者施用之前的状态考虑的HIP/PAP蛋白衍生物中，所述蛋白衍生物可以不是“生物学活性的”，只要所述HIP/PAP蛋白一旦向所述患者施用后具有生物学活性。
同样，在向需要所述HIP/PAP蛋白衍生物的患者施用之前状态考虑的HIP/PAP蛋白衍生物中，所述蛋白衍生物可以是已有“生物学活性的”。
一般地，当用于预防或治疗脑损伤，或此处公开的任何其他HIP/PAP用途时，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物与一种或多种生理学上可接受的赋形剂组合以有效量包含在药物组合物中。
不希望受任何特定理论束缚，本发明人相信序列SEQ ID N°2的完整HIP/PAP蛋白，即包含CRD序列的多肽和前肽导致所述蛋白质的最佳折叠，特别是当在已经转染了编码所述蛋白质的表达盒的真核细胞中通过DNA重组技术产生所述蛋白质时。偶然的是，与包含仅部分蛋白质的组合物相比，药学上活性的HIP/PAP的正确折叠可提高包含所述蛋白质的药物组合物的生物学效率，用于预防或治疗缺氧引起的脑损伤。
然而，HIP/PAP蛋白的其他形式，包括SEQ ID N°1和2的多肽形式，以及本说明书中描述的任何一种HIP/PAP衍生物可在体外和体内使用，即使这些多肽不必由本发明的最优选实施方案组成。
如本说明书中先前详细说明，本发明主要涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗成人或儿童脑损伤，包括脑缺氧引起的那些脑损伤的用途。本发明因此涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗脑缺氧引起的脑损伤的用途。
在更一般方面，本发明涉及HIP/PAP蛋白在治疗脑缺氧引起的脑损伤方法中的用途。不希望受任何特定理论的束缚，本发明人相信此处公开的HIP/PAP蛋白对体外和体内新生儿脑损伤的多种影响也可用于成人或儿童脑的非常特殊的病理生理学情况，其选自脑血管意外。
因此，在本发明的某些实施方案中，所述成人或儿童脑损伤由脑血管意外(其也称为中风)组成。
脑血管意外或中风由因血管向脑供应血液紊乱引起的脑功能快速丧失组成。脑血管意外包括(i)血栓形成或栓塞引起的局部缺血，其也称为“缺血性中风”和(ii)因出血引起的局部缺血，其也称为“出血性中风”。像新生儿脑损伤，脑血管意外或中风可引起永久性神经损伤并可导致死亡。根据世界卫生组织，脑室意外或中风由脑血管原因的神经学缺陷组成，其持续超过24小时或在24小时内截至死亡为止。
脑血管意外或中风包括血栓形成中风、栓塞性中风、心脏功能异常引起的局部缺血、全身性血流灌注不足、静脉血栓形成和大脑内出血。
外伤性脑损伤一般引起因大脑出血、血肿或水肿引起的脑氧气流受损。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗成人或儿童外伤性脑损伤的用途。
在一些实施方案中，成人或儿童外伤性脑损伤属于缺氧引起的脑损伤。
当物理性外伤损伤脑时发生外伤性脑损伤(TBI)，并且根据意识丧失、记忆力丧失的程度，和损伤后神经学尺度上的得分，一般划分为温和的、中等的或严重的。通常通过选自Glascow Coma Scale(GCS)(Arlinghaus等，2005，Textbook of Traumatic Brain Injury，Washington，DC：American Psychiatric Association，第59-62页)的方法，测定外伤后遗忘症(PTA)的方法和衡量意识丧失的方法(LOC)(Rao等，2000，Psychosomatics，卷41(n°2)：95-103)的方法进行外伤性脑损伤的诊断和衡量。一般承认，GCS为13或更高的TBI是温和的，而GCS为9到12是中等的，GCS为8或更低是严重的。示例性地，这样的人其GCS得分测定为13到15，该人外伤后遗忘症(PTA)持续时间少于24小时并且意识丧失(LOC)的持续时间在0到30分钟范围内。仍然示例性的说，这样的人其GCS得分测定为9到12，其外伤后遗忘症(PTA)持续时间在1到7天范围内并且意识丧失(LOC)的持续时间在30分钟到24小时范围内。仍然示例性的说，这样的人其GCS得分测定为3到8，其外伤后遗忘症(PTA)持续时间多于7天并且意识丧失(LOC)的持续时间多于24小时。
在外伤性脑损伤和新生儿脑损伤之间的生理学相似性中，因血管破裂引起的出血伴随着TBI，其引起缺氧。
根据本发明，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物可用于预防或治疗GCS分类得分在3到15之间的外伤性脑损伤。因此，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物可用于预防或治疗这样的外伤性脑损伤，其选自“温和”TBI(GSC得分在13到15之间)、中等TBI(GCS得分在9到12之间)和严重TBI(GSC得分在3到8之间)。通常，温和TBI具有13到15之间的GCS得分，低于1小时的PTA得分和低于30分钟的LOC得分。通常，中等TBI具有9到12之间的GCS得分，30分钟到24小时之间的PTA得分和1到24小时之间的LOC得分。通常，严重TBI具有3到8之间的GCS得分，高于1天的PTA得分和高于1天的LOC得分。
根据本发明，相信HIP/PAP蛋白将证明在治疗上一般可用于治疗TBI的方法中，不管为待治疗患者测定的GSC得分如何。
HIP/PAP治疗TBI的治疗有用性包括治疗直接外伤性小脑损伤，比额部的或颞颥的TBIs更不常见。然而，小脑经常受到影响，即使当初始损伤不直接涉及该结构时。这种间接损伤可诱导大量神经学病症，包括体位不稳定、震颤、平衡和精细运动技能的损伤和认知缺陷。即使未完全理解幕上外伤引起的间接小脑损伤的原因，若干研究揭示了兴奋性中毒(神经递质谷氨酸的过量释放)参与损伤向小脑的传递(Potts等，Cerebellum，2009，(8)，211-221)。
不希望受任何特定理论束缚，本发明人相信，HIP/PAP蛋白或其衍生物可通过保护小脑细胞免于兴奋性中毒从而保护儿童或成人患者中小脑神经元免于TBI引起的间接小脑损伤。
因此，在一些实施方案中，本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其衍生物用于治疗或预防TBI引起的间接外伤性小脑损伤的用途。
根据本发明，相信HIP/PAP蛋白应该在急性期内向受TBI影响的患者施用，尽管其也可以在慢性期内施用。
根据本发明，TBI包括病灶性或弥散性TBI。弥散性TBI包括水肿和弥散性轴突损伤，其对轴突，包括白质束和向皮质的突出具有广泛性损伤。弥散性TBI也包括震荡和弥散性轴突损伤，对包括白质和大脑半球的区域中的轴突具有广泛扩散性损伤。
对于病灶性TBI，在穿透性TBI中具有病灶性损伤的最常见区域是眶额皮质和前颞叶，其由参与社会行为、情感调节、嗅觉和决策的区域组成。一种类型的病灶性损伤--脑撕裂伤在脑组织被切割或撕裂时发生。
外伤性脑损伤包括，但不限于额TBI、颞TBI、直接小脑TBI和间接小脑TBI。
如本说明书中早已提及，HIP/PAP蛋白或其衍生物可保护体外小脑神经元免于兴奋性中毒死亡和氧化死亡。
不希望受任何特定理论束缚，本发明人相信HIP/PAP蛋白或其衍生物可保护小脑神经元免于多种小脑病症，如小脑性共济失调中发生的死亡。
在这种情况下，可观察到小脑萎缩。
因此，本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其衍生物用于治疗或预防小脑性共济失调的用途。
如此处所用，小脑性共济失调指小脑的功能异常。小脑性共济失调可引起多种初级神经缺陷，如拮抗剂张力减退、协同不能、辨距障碍、dyschronometria和轮替运动障碍。
小脑性共济失调包括遗传性脊髓小脑性共济失调和获得性小脑性共济失调。
在一些实施方案中，本发明涉及HIP/PAP蛋白或其衍生物用于治疗遗传性脊髓小脑性共济失调的用途。
遗传性脊髓小脑性共济失调包括，但不限于常染色体显性脊髓小脑性共济失调(SCAs)和常染色体隐性脊髓小脑性共济失调。
常染色体显性脊髓小脑性共济失调的实例包括SCA1(常染色体显性类型1)、SCA2、SCA3、SCA4、SCA6、SCA7、SCA8、SCA9、SCA10、SCA11、SCA12、SCA13，周期性共济失调类型1(EA-1)和周期性共济失调类型2(EA-2)。
染色体隐性脊髓小脑性共济失调包括，但不限于，弗里德赖希氏共济失调、运动失调性毛细血管扩张症和婴儿发病期的脊髓小脑共济失调。
在一些实施方案中，本发明涉及HIP/PAP蛋白或其衍生物用于治疗和预防获得性小脑性共济失调的用途。
获得性小脑性共济失调包括，但不限于，瘤外综合征、醉酒诱导的小脑性共济失调、感染性共济失调和脉管小脑性共济失调。
可由暴露于毒素，如溶剂、汽油和重金属中，摄入产物，如醇、巴比妥类或锂和细胞毒性化学治疗药物引起中毒诱导的小脑性共济失调。
感染性共济失调包括病毒、细菌或朊病毒感染引起的共济失调。
例如，病毒感染性小脑性共济失调可由病毒和病毒后脑病引起。
细菌感染性小脑性共济失调包括，但不限于，脑膜血管性梅毒或莱姆病引起的共济失调。
脉管共济失调包括，但不限于，局部缺血脑血管意外，包括小脑梗塞、出血或硬脑膜下血肿引起的共济失调。
如此处所用，不考虑所述脑损伤是否由新生儿脑损伤、儿童脑损伤或成人脑损伤组成，“脑损伤”不包括开始时由神经元细胞脱髓鞘引起的脑损伤。换言之，“脑损伤”不包括脱髓鞘病引起的脑损伤，不考虑脱髓鞘病的类型，例如自身免疫性或遗传性疾病。因此，如此处预期，“脑损伤”不包括以下疾病引起的脑损伤：多发性硬化、急性播散性脑脊髓炎、横贯性脊髓炎、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、吉-巴综合征、中央脑桥脂肪髓磷脂化、家族黑矇性白痴，以及遗传性脱髓鞘病，如脑白质病和Charcot MarieTooth。如此处所用，脑白质病包括肾上腺脑白质营养不良(WHO分类#E71.3)，肾上腺脊髓神经病(WHO分类#E71.3)、变色反应脑白质病(WHO分类#E75.2)、克拉伯病(WHO分类#E75.2)、佩-梅病(WHO分类#E75.2)、卡纳万病、具有中央低髓鞘形成的儿童共济失调(CACH)、具有白质消失的白质脑病、亚力山大病、雷夫叙姆病(WHO分类#G60.1)、泽韦格病、Aicardi-Goutieres综合征、巨脑脑白质病和脑腱黄瘤病。
如本说明书中早已提及，因为此处已经显示在Gap-43产生或磷酸化上的HIP/PAP活性，HIP/PAP蛋白或其衍生物也可用于体外和体内调节、增强或改善Gap-43介导的神经元生长或可塑性，所述Gap-43是神经元生长相关的蛋白质。
本发明因此还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗病症或疾病的用途，所述病症或疾病涉及Gap-43产生的缺陷或下调或Gap-43磷酸化的缺陷或失调，其包括阿尔茨海默氏病。
值得提及的是，在本领域中早已断定HIP/PAP相关蛋白质可用于作用于阿尔茨海默氏病，但没有在技术上支持该活性断言的任何初始实验结果。
相反，HIP/PAP蛋白对Gap-43蛋白产生或磷酸化的生物学活性第一次支持所述HIP/PAP蛋白预防或治疗阿尔茨海默氏病的有用性。
实际上，本领域技术人员熟知的是，在阿尔茨海默氏病中发生Gap-43蛋白产生或磷酸化的缺陷。值得注意的是，本领域中已经显示在受阿尔茨海默氏病影响的患者中涉及无活性Gap-43蛋白的产生。同样，先前已经在本领域中显示了受阿尔茨海默氏病影响的患者中Gap-43的改变的磷酸化。
因此，本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其衍生物用于预防或治疗阿尔茨海默氏病的用途。
本发明还涉及用于预防或治疗阿尔茨海默氏病的方法，其包括向需要预防或治疗的患者施用HIP/PAP蛋白或其衍生物的步骤。
本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗在阿尔茨海默氏病本身发生前的病理学状态的用途，所述病理学状态包括精神认知功能损害。
换言之，本发明还涉及HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗在阿尔茨海默氏病本身发生之前的精神认知功能损害的用途。
因为此处实施例中已经显示HIP/PAP蛋白具有在体外挽救神经元细胞的能力，那么也已经证明HIP/PAP蛋白或其衍生物可用作维持或改善培养的神经元细胞的存活力或生长的试剂。然后，此处实施例的结果支持HIP/PAP蛋白或其衍生物作为可加入神经元细胞培养基中的神经元细胞培养剂的有用性。
本发明还包括HIP/PAP蛋白用于体外培养神经元细胞，包括神经元细胞的原代培养和神经元细胞系的培养的用途。
本发明还涉及用于神经元细胞的培养基，其包含HIP/PAP蛋白或其衍生物。除了存在HIP/PAP蛋白或其衍生物，本领域技术人员容易地测定适当培养基的定性和定量组成。示例性的说，HIP/PAP蛋白或其衍生物可简单地加入到适合于神经元细胞的已知培养基中，例如RPMI 199培养基中。
所述培养基包括有效量的所述HIP/PAP蛋白或其所述衍生物。培养基中HIP/PAP蛋白或其衍生物的最终浓度优选在1ng/mL到10mg/ml范围内。
根据本发明，对于体内用途，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物作为活性成分优选包含在药物组合物中。
所述药物组合物包含HIP/PAP蛋白，或其蛋白衍生物，和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
所述药物组合物包含有效量的HIP/PAP蛋白，或其蛋白衍生物。
通常，根据本发明使用的药物组合物基于药物组合物总重量，包含以重量计0.1％至99.9％的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物。因此，本发明的药物组合物基于药物组合物总重量，包含以重量计0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物。同样，本发明的药物组合物基于药物组合物总重量，包含以重量计10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或少于一种或多种药学上可接受的赋形剂。
HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的治疗有效剂量当然依赖于这样的因素变化，如待治疗(包括预防)的病理学状态、施用方法、用于治疗的化合物的类型、涉及的任何共治疗、患者的年龄、体重、一般医疗条件、医疗史等，并且其测定为从业医师所熟知。因此，治疗者有必要根据需要滴定剂量并修改施用途径，以获得最佳治疗效果。临床医师会施用HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物，直至达到这样的剂量，所述剂量实现治疗所讨论的状况的预期效应。
待治疗的状况指在本申请中描述的一种病理学状况，如缺氧引起的新生儿脑损伤、缺氧引起的成人或儿童脑损伤，如脑血管意外、TBIs和小脑病症。
如此处所用，术语“患者”指新生儿患者、儿童患者，或成人患者，后者包括怀孕患者。
如此处更特别所用，有效量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物由这样量的HIP/PAP蛋白或其衍生物组成，其可至少部分逆转新生儿脑损伤过程中引起脑的物理损伤。特别的是，有效量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物由这样量的HIP/PAP蛋白或其衍生物组成，其减少或阻止新生儿脑损伤过程中发生的神经元细胞死亡。
从此处实施例中所示的结果开始，有效量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物可以在约0.1μg/kg体重到约100mg/kg体重范围内。因此，根据本发明，有效量的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物包括至少1μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、4μg/kg、5μg/kg、6μg/kg、7μg/kg、8μg/kg、9μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg、50μg/kg、60μg/kg、70μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、500μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、1mg/kg或以上患者体重的量。
在新生儿损伤的情况下，术语“患者”指新生儿患者，包括胎儿以及怀孕患者。
为了预防或治疗胎儿身体的新生儿脑损伤，本发明的药物组合物优选向怀孕的成人身体施用。然而，在一些实施方案中，可使用特定的内窥镜检查医疗仪器直接向胎儿身体施用所述药物组合物。
为了预防或治疗分娩或分娩后新生儿的新生儿脑损伤，以及预防或治疗成人的脑损伤，分别向新生儿身体或成人身体施用本发明的药物组合物。
在某些实施方案中，全身施用本发明的药物组合物。
在某些其他实施方案中，经过颅内途径，尤其向胎儿身体或颅骨形成未停止的新生儿身体中局部施用本发明的药物组合物。
HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的施用途径与已知方法一致，例如通过静脉内、肌内、大脑内、腹膜内、脑脊内、皮下注射或输注、口腔、局部或吸入途径，或通过下文指出的缓释系统。
在一些实施方案中，以单次剂量施用HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物，或含有它们的药物组合物。
在一些其他实施方案中，在确定的时间间隔，例如从脑损伤诊断开始或从脑损伤预期诊断开始，直至所治疗的身体脱离危险为止，以多次剂量施用HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物，或含有它们的药物组合物。
在本发明药物组合物的某些实施方案中，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物可与一种或多种其他活性成分组合，所述活性成分可用于预防或治疗脑缺氧引起的脑损伤，包括本领域中已知用于预防或治疗新生儿脑损伤的一种或多种活性成分。
可通过混和具有适当纯度的想要的分子与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编辑(1980))以冻干制剂或水溶液的形式制备本发明的治疗组合物用于储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且其包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八基二甲基苯甲基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间-甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶，或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖，和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖，或糊精；鳌合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成对抗离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN.TM.，PLURONICS.TM.或聚乙二醇(PEG)。
此类载体的额外实例包括离子交换剂、矾土、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白，如人血清白蛋白，缓冲物质，如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐，或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质，和聚乙二醇。根据本发明HIP/PAP或其衍生物物质的局部或基于凝胶形式的载体包括多糖，如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇，和木蜡醇。对于所有施用，适当使用常规贮库形式。这些形式包括，例如微囊、纳米胶囊、脂质体、膏药、吸入形式、鼻喷雾剂、舌下片剂，和缓释制剂。HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物通常以约0.1mg/ml到100mg/ml的浓度在这些媒介物中配制。
待用于体内施用的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物必须无菌。这可在冻干和重构之前或之后通过无菌过滤膜过滤容易地完成。如果全身施用，通常可以冻干形式或在溶液中储存HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物。如果在是冻干形式，HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物通常与其他成分组合配制，用于在使用时以适当的稀释剂重构。HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的液体制剂的实例是填充在单次剂量小瓶中用于皮下注射的无菌、透明、无色、无防腐剂溶液。主要根据多肽的适应症和类型，适合于重复使用的防腐药物组合物可含有例如：
a)HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物；
b)能够维持溶液中多肽或其他分子的pH在最大稳定性范围内，优选约4-8的缓冲剂；
c)主要稳定多肽或分子免于搅动诱导的聚集的去污剂/表面活性剂；
d)等渗剂；
e)选自苯酚、苯甲醇和卤化苄乙氧铵，例如氯化苄乙氧铵的防腐剂；和
f)水。
如果所用的去污剂是非离子型的，其可以是例如聚山梨醇酯80(例如，PolysorbateTween
Figure BDA0000134443330000292
)20、80等)或泊洛沙姆(例如，Poloxamer
Figure BDA0000134443330000293
188)。非离子型表面活性剂的用途允许制剂暴露于剪切表面应力，但不引起多肽变性。此外，可在气溶胶装置，如用于肺施用和无针头喷射注射器中使用的那些装置中使用这些含表面活性剂的制剂(参阅例如，EP 257,956)。
可存在等渗剂以保证HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的液体制剂的等渗性，并且所述等渗剂包括多羟基糖醇，优选三羟基糖醇或高级糖醇，如甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇。可单独或组合使用这些糖醇。或者，可使用氯化钠或其他合适的无机盐使溶液等渗。
根据想要的pH，缓冲液可以是例如，乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐缓冲液。本发明一种类型液体制剂的pH缓冲在约4到8的范围内，优选在约生理pH处。
防腐剂苯酚、苯甲醇和卤化苄乙氧铵，例如氯化苄乙氧铵是可以使用的已知抗微生物剂。
治疗性HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的组合物一般置于具有无菌入口的容器中，例如具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或瓶。制剂优选作为重复的静脉内(静脉)、皮下(皮下)，或肌内(肌内)注射，或适合于鼻内或肺内递送(对于肺内递送，参阅例如EP 257,956)的气溶胶制剂来施用。
也可以缓释制剂的形式施用HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物。缓释制剂的合适实例包括含有蛋白质的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质是成形物品形式，例如薄膜或微囊。缓释基质的实例包括聚酯、Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982)描述的水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯))、或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3,773,919、EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers，22：547-556(1983))、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯(Langer等，上文)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如Lupron Depot.TM.(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。
当聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100天时，某些水凝胶释放蛋白质更短的时间。当被膜蛋白质长时间保留在体内时，它们可因在37℃暴露于水分中而变性或聚集，导致生物学活性丧失和免疫原性可能发生改变。可根据涉及的机制，设计合理的策略用于蛋白质稳定。例如，如果发现聚集机制是通过硫-二硫化物交换形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂并开发特定的聚合物基质组合物实现稳定。
缓释的HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物也包括脂质体包被的多肽。通过本身已知的方法制备含有目的多肽的脂质体：DE 3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688-3692(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利号4,485,045和4,544,545；和EP 102,324。通常，脂质体是小的(约200-800埃)单层类型，其中脂类含量高于约30摩尔％胆固醇，调整所选比例用于最佳治疗。
HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的治疗有效量将当然根据这样的因素而变化，如待治疗(包括预防)的病理学状况、施用方法、用于治疗的化合物的类型、涉及的任何共治疗、患者的年龄、体重、一般医疗条件、医疗史等，并且其测定为开业医师所熟知。因此，治疗者有必要根据需要滴定剂量并修改施用途径，以获得最大治疗效果。临床医师会施用HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物，直至达到这样的剂量，所述剂量实现治疗正在讨论的状况的预期效果。
施用途径根据已知方法，例如通过静脉内、肌内、大脑内、腹膜内、脑脊内、皮下、眼内、关节内、滑膜内、鞘内注射或输注、口腔、局部或吸入途径来施用，或通过下文指出的缓释系统来施用。也可通过损伤内或损伤周围途径适当地施用HIP/PAP或其蛋白衍生物，以发挥局部和全身治疗效果。形成盐并在下文中有用的分子的药理学上可接受的盐的实例包括碱金属盐(例如钠盐、钾盐)、碱土金属盐(例如，钙盐、镁盐)、铵盐、有机碱盐(例如，吡啶盐、三乙胺盐)、无机酸盐(例如，盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐)，和有机酸的盐(例如，乙酸盐、草酸盐、对-甲苯磺酸盐)。
HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物也可包被在微囊中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳状液中分别通过例如凝聚技术或通过界面聚合，例如通过羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸酯)微囊制备所述微囊。在Remington′sPharmaceutical Sciences，上文中公开了此类技术。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质是成形物品形式，例如薄膜或微囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)、或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOT.TM.(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸共聚物能够释放分子超过100天时，某些水凝胶释放蛋白质更短的时间。当被膜蛋白质长时间保留在体内时，它们可因暴露在37℃水分中而变性或聚集，导致生物学活性丧失。可根据涉及的变性机制设计合理的稳定策略。可通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂并开发特定的聚合物基质组合物实现这些策略。
通过，但不限于以下实施例进一步阐明本发明。
实施例
在大肠杆菌细菌系统中产生重组人HIP/PAP蛋白，然后进行纯化。所得产物称为ALF-5755。与HIP/PAP SEQ ID N°2相比，SEQ ID N°3的ALF-5755在NH2末端具有一个单独的额外氨基酸甲硫氨酸。
实施例1：新生儿脑损伤模型中HIP/PAP蛋白的体外影响
A.材料和方法
皮质神经元培养
从E14.5胚胎小鼠中制备原代皮质神经元培养物。简言之，从子宫中取出胎儿并置于无菌培养皿中。切开脑并置于含1M HEPES的HBSS 1x(Invitrogen)中。使用解剖显微镜，解剖出脑、脑脊膜、基底神经节和海马，并将新皮质置于含有B27补充剂的Neurobasal培养基(Invitrogen)中。然后，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA分离新皮质并与DNase 1(SigmaSt-Quentin Fallavier，France)温育。在包被了聚-DL-鸟苷酸(SigmaSt-Quentin Fallavier，France)的96孔板中以80000细胞/孔密度接种细胞与MEM1X和10％马血清。接种后2到3小时，去除培养基并用Neurobasalplus B27代替。3天后，用5μM的AraC(阿糖胞苷)处理细胞，以抑制神经胶质增殖。在DIV10和DIV12之间，用任何一种或另一种以下物质处理神经元8小时：
(i)：PBS；
(ii)：3μg/ml或5μg/ml的ALF-5755；
(iii)：300μM的NMDA；
(iv)：300μM的NMDA加10μM的MK801或
(v)：300μM的NMDA和3μg/ml或5μg/ml的ALF-5755。
细胞成活力的测定使用MTS/甲
Figure BDA0000134443330000331
测定(CellTiter 96Aqueous One Solution CellProliferation Assay；Promega，Charbonnieres，France)监测细胞成活力。
Western印迹分析
从处理的神经元培养物(见下文)和幼鼠的右新皮质中提取总蛋白质，所述幼鼠在P5接受了PBS、10μg的鹅膏蕈氨酸、0.3μg的ALF-5755(已经测定为ALF-5755的最有效浓度)或10μg鹅膏蕈氨酸与0.3μg的ALF-5755的实质内注射。在药物施用后4、24、48或120小时杀死幼鼠。根据市售试剂盒(Cell Signaling Technology)的方案提取蛋白质。
以1/1000的浓度使用抗总Gap43和抗Ser41-Phospho-Gap43。为了标准化样品间的蛋白质表达，我们以1/10000的浓度使用抗b微管蛋白山羊抗体(Santa Cruz Biotechnology)。一式两份进行Western印迹实验。使用ImageJ评估样品间的蛋白质浓度差异。
免疫细胞化学
对于总Gap43、PhosphoGap43和生长锥(2G13)检测，在4％PFA中固定处理的细胞培养物，并将其与抗总Gap43抗体(Interchim；1/200)、兔抗Ser41-PhosphoGap43抗体(Novus Biologicals 1/200)、鼠抗生长锥2G13抗体(Novus Biologicals 1/200)反应。用Cy3缀合的驴抗鸡抗体、AMCA缀合的驴抗兔抗体和Alexa488缀合的驴抗小鼠抗体(JacksonImmunoresearch)进行标记抗原的检测。
统计学分析
为了研究各处理的效果，利用Kruskal-Wallis检验分析数据。
B.结果
在大肠杆菌细菌系统中产生重组人HIP/PAP蛋白，然后进行纯化。所得产物称为ALF-5755。与HIP/PAP SEQ ID N°2相比，SEQ ID N°3的ALF-5755在NH2末端具有一个单独的额外氨基酸甲硫氨酸。
已经进行了ALF-5755的生物化学、生物学和功能研究。他们确定ALF-5755显示出与先前证明属于几种不同动物模型中的HIP/PAP的相同的生物学活性，尤其是促有丝分裂和抗细胞凋亡活性。
在原代小鼠皮质神经元培养中已经研究了ALF-5755体外针对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的细胞死亡的神经保护功效。
已经使用原代神经元培养物的良好建立的模型(来自暴露于NMDA的E14Swiss小鼠的大脑半球的神经元)评估了ALF-5755体外神经保护性质。从培养开始第8天到第12天之间进行实验。通过300μM的NMDA或10、30、100μM的H2O2进行8小时中毒开始后立即或开始后3小时向培养基中加入多剂量的HIP/PAP(150ng/ml到10μg/ml范围内)。然后使用MTT测定来测量细胞的成活力。
单独暴露于NMDA(不加ALF-5755处理)后的神经元死亡是神经元的60％。利用ALF-5755处理引起神经元死亡的比例显著剂量依赖型降低。当损伤开始后立即加入时，神经元死亡的减少在5μg/mL的ALF-5755处是最大的(相对于不加ALF-5755时的45％，35％的神经元死亡)。当在损伤开始后3小时加入时，也观察到了ALF-5755的神经保护效应。
单独暴露于H2O2通过氧化损伤诱导细胞存活的剂量依赖性降低，其在100μM暴露处最大(64％的神经元死亡)。ALF-5755处理完全或部分逆转H2O2的毒性。3μg/ml的ALF-5755的这种保护效应是最大的。ALF-5755的保护效应与利用过氧化氢酶观察到的那些保护效应是相当的。无论在H2O2后立即加入还是损伤后3小时加入药物，都能观察到ALF-5755的保护效应。ALF-5755显示抗氧化性质。在神经元培养物上进行免疫细胞化学(ICC)研究和western印迹(WB)分析，以测定ALF-5755对GAP-43的产生、41位丝氨酸(S41)上的磷酸化状态和分布的影响，所述GAP-43是参与轴突生长和神经元可塑性的蛋白质。
当在NMDA后立即加入时，ICC证明ALF-5755诱导GAP-43标记神经元过程的束状分布。这种影响在5μg/ml处最佳，而在对照培养物，利用NMDA或H2O2处理的培养物，或在H2O2和ALF-5755处理的培养物中没有观察到。此外，ICC显示，当与对照培养物或单独用NMDA或H2O2处理的培养物相比时，ALF-5755诱导神经元过程中磷酸-GAP-43的增加的表达。
来自培养的神经元的提取物的western印迹分析允许定量总GAP-43和磷酸-GAP-43水平的改变。NMDA不诱导GAP-43量的任何显著改变。相反，ALF-5755单独诱导总GAP-43的剂量依赖性降低，但诱导磷酸化GAP-43的比例(磷酸-GAP-43/总GAP-43)的显著增加。ALF-5755对GAP-43的影响在暴露于NMDA的培养物中仍然更显著。ALF-5755诱导的GAP-43的磷酸化状态的这些改变可以解释暴露于ALF-5755的培养物中观察到的成束现象。
总之，这些数据支持ALF-5755防止体外兴奋性中毒和氧化神经元细胞死亡的假说。此外，ALF-5755诱导可塑性样改变，包括GAP-43磷酸化和成束现象。
实施例2：新生儿脑损伤模型中HIP/PAP蛋白的体内效应
A.材料和方法
动物
两种性别的Swiss小鼠用于该研究中。实验方案为公共机构观察委员会所批准并遵循′Institut National de Ia Santéet de Ia Recherche Médicale′的指导方针。
药物
在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释鹅膏蕈氨酸(Sigma，St-QuentinFallavier，France)、ALF-5755、NMDA(Tocris，Bristol，UK)和MK801(Sigma，St-Quentin Fallavier，France)。
施用兴奋性中毒药物
如先前所述，通过向发育中的小鼠脑中注射鹅膏蕈氨酸来诱导兴奋性中毒的脑损伤(Marret等，1995；Gressens等，1997，1998；Bac等，1998；Dommergues等，2000；Tahraoui等，2001；Laudenbach等，2001，2002；Husson等，2002)。简言之，在第P5天大脑内(向新皮质实质组织内)注射幼鼠。利用安装在标有刻度的微型分配器上的50μl Hamilton注射器上的25号注射针进行实质组织内注射。针插入到右半球的额顶骨区中头皮的外表面下2mm，离侧向-中间平面中线2mm，和首尾平面冠矢点前3mm。以20秒间隔注射两次1μl剂量的鹅膏蕈氨酸或鹅膏蕈氨酸加ALF-5755或PBS。第一次快速浓注对应于白质内定位的注射，而第二次快速浓注代表了皮质注射。向各幼鼠施用10μg的鹅膏蕈氨酸或10μg的鹅膏蕈氨酸加ALF-5755(范围：0.0015μg-0.15μg)或PBS。
对于一些幼鼠，不同浓度(从0.0015μg到1.5μg)的鹅膏蕈氨酸注射后立即或3小时后腹膜内注射ALF-5755。
实验组
来自至少两个不同窝的幼鼠用于各实验组中，并从两组或多组连续实验中获得数据。
根据怎样注射ALF-5755(与鹅膏蕈氨酸实质内共同施用，鹅膏蕈氨酸注射后1到5小时立即腹膜内注射)，组成三个不同组。
第一个P5幼鼠组接受鹅膏蕈氨酸与PBS(媒介物对照)或0.003、0.015、0.03或0.3μg的ALF-5755的实质内注射。
在设计用于比较ALF-5755的实质内注射与腹膜内注射的第二组实验中，P5幼鼠接受鹅膏蕈氨酸与PBS的实质内注射，然后接受几种浓度(0.0015、0.0075、0.015、0.075、0.15、0.75或1.5μg的ALF-5755)的ALF-5755的腹膜内注射。
为了知道ALF-5755是否可以修复，而非防止鹅膏蕈氨酸损伤，第三个P5小鼠幼鼠组在实质内注射鹅膏蕈氨酸后3小时接受0.75或1.5μg的ALF-5755的延迟腹膜内注射。鹅膏蕈氨酸注射后1或5小时，腹膜内检测单一ALF-5755浓度(1.5μg)。
损伤大小的测定
12只小鼠幼鼠用于各实验组中。在兴奋性中毒攻击后120小时通过断头杀死小鼠幼鼠。立即在4％福尔马林中固定脑至少4天。包埋在石蜡中后，我们切下20μm厚的头颅切片。用甲酚紫染色每三个切片。先前的研究(Marret等，1995；Gressens等，1997；Husson等，2002)已经显示了在兴奋性中毒损伤的侧向-中间和额枕轴中损伤的最大尺寸之间完美的相关性。这允许精确并可重复地测定损伤的最大额枕直径，其等于损伤存在的切片数目乘以20μm。
B.结果
通过新生儿兴奋性中毒脑损伤的小鼠模型评估体内ALF-5755的神经保护潜能，所述小鼠模型模拟与脑瘫相关的脑损伤。
通过鹅膏蕈氨酸诱导脑损伤，所述鹅膏蕈氨酸是作用于NMDA和促代谢型谷氨酸受体上的谷氨酸能激动剂。当在出生后第(P)5天向小鼠新皮质注射时，鹅膏蕈氨酸在新皮质中产生显著的神经元损失，并且大的脑室周白质包囊与在室周白质软化(leukomalacia)中看到的那些相似，其为在许多人类早产新生儿中出现的损伤。
ALF-5755在P5时与鹅膏蕈氨酸大脑内共注射，或在鹅膏蕈氨酸后立即或3小时后腹膜内注射ALF-5755。在P10进行脑损伤的分析。
对于150ng的ALF-5755的剂量而言，ALF-5755与鹅膏蕈氨酸共注射分别降低了白质和皮质灰质损伤37％和67％(与仅用鹅膏蕈氨酸处理的幼鼠相比)。当在损伤后立即或3小时后腹膜内进行ALF-5755注射时，也观察到良好的(大脑损伤大小50％的减少)神经保护。这确定了ALF-5755通过全身途径单次注射的功效，即使有所延迟。这也表明大脑内或外周施用ALF5755可在神经学疾病和上文定义的相关疾病中显示治疗效果。
进一步验证了体外数据，western印迹分析显示与对照或鹅膏蕈氨酸单独注射的动物相比时，ALF-5755单独或与鹅膏蕈氨酸组合诱导了总GAP-43的显著降低，但磷酸化的GAP-43的比例显著并且非常大量的增加。
实施例3：在小鼠幼鼠的发育中的小脑中HIP/PAP蛋白的体内表达和小脑损伤模型中ALF-5755蛋白的体外效应
A.材料和方法
定量RT-PCR
使用RNeasy小试剂盒(Quiagen)从P0、P5-7和P60swiss小鼠小脑、P5皮质和成体子宫中提取RNAs。以600ng的总RNAs进行反转录，以获得HIP/PAP和HPRT cDNAs。利用Biorad系统引出HIP/PAP和HPRT转录物的定量PCR(利用适当的引物，94℃变性30秒，58℃杂交30秒，72℃聚合30秒，45个循环)。通过将HIP/PAP针对HPRT转录物进行合理化(相关的Biorad软件)获得多种年龄的幼鼠小脑中HIP/PAP表达的定量，以校准RT PCR并比较随时间HIP/PAP表达的水平。
小脑颗粒神经元培养
粒细胞代表大多数小脑神经元。从P7小鼠幼鼠制备原代颗粒神经元培养物。简言之，解剖脑并置于HHGN(含有1M HEPES和4.45％葡萄糖的HBSS 1x；Invitrogen)中。去除脑脊膜，以避免星形细胞的大量污染。分离后，在HHGN中洗涤小脑，切成小块，并用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA分离细胞并且与DNA酶1(Sigma St-Quentin Fallavier，France)温育。在聚-L-鸟苷酸(Sigma)包被的24孔板中以2千2百万细胞/孔的密度在MEM1X和10％马血清中平板接种细胞。接种后24小时，向培养基中加入10μM的AraC(阿糖胞苷)，以抑制神经胶质细胞增殖。体外7天(DIV7)后，通过处理细胞1小时并允许随后用以下诱导物恢复8、16或24小时来诱导神经死亡：
(i)：H2O20.01到1mM，以诱导氧化应激并实现随后60％的细胞死亡，
(ii)：0.3到3mM NMDA，以诱导兴奋性中毒并实现随后约40％的细胞死亡。
在两种情况下，存在0.3mM的H2O2浓度或存在1mM的NMDA时在5和10μg/ml处估计ALF-5755神经保护效应。
免疫细胞化学
对于GFAP(星形细胞检测)、NeuN(神经元检测)、Zic1(成熟的粒细胞检测)、MAP2(神经元检测)和切割的(clived)胱天蛋白酶3(活性胱天蛋白酶3检测)染色，处理的细胞培养物在4％PFA中固定，并与抗GFAP(Dako，1/500)、抗NeuN(Millipore，1/100)、抗Zic1(Abeam 1/100)、抗MAP2(Abcam，1/2000)和抗-切割的胱天蛋白酶3(Cell Signaling Technology，1/100)抗体反应。根据实验，分别用在多个波长处发荧光的二级抗体：Cy3缀合的驴抗小鼠抗体(1/1000，Jackson Immunoresearch)和488缀合的驴抗兔抗体(1/1000，Molecular Probes)进行标记抗原的检测。然后用Dapi(1/1000)复染细胞核。
统计学分析
用Graphpad软件进行统计学分析。
B.结果
出生后发育过程中HIP/PAP的小脑表达：
到目前为止，从未记载过出生后发育的小鼠的皮质和小脑中有HIP/PAP表达。这里，我们报道了HIP/PAP在P5以低但可比较的水平在两个区域内表达HIP/PAP。HIP/PAP水平在小脑中随时间增加，与P5小鼠比较时在成年小鼠中达到20倍强度。其他结构中的表达正在研究中。
评估ALF-5755对H2O2诱导的细胞死亡的保护效应：
显示暴露在浓度为0.3mM的H2O2中1小时并随后恢复16小时诱导约61％的细胞死亡。
观察到细胞H2O2暴露不诱导胱天蛋白酶3的切割。结果，H2O2诱导的细胞不依赖于胱天蛋白酶3途径。
5或10μg/mL(μM)的ALF-5755处理不影响切割的胱天蛋白酶3水平或AIF定位。然而，暴露在5或10μg/ml的ALF-5755中的细胞当与对照细胞相比时显示改善的形态。用ALF-5755处理的细胞具有比对照细胞较不高级的致密方面，因为染色质浓缩较不重要。
因此，该结果显示ALF-5755蛋白可保护小脑粒细胞免于H2O2诱导的细胞死亡。
评估ALF-5755对NMDA诱导的细胞死亡的保护效应：
浓度为1mM的NMDA处理1小时并恢复16小时诱导约34％的细胞死亡。观察到细胞NMDA暴露诱导胱天蛋白酶3的切割。结果，NMDA诱导的细胞死亡通过激活胱天蛋白酶途径而发出信号。
用5或10μM的ALF-5755处理显著减少了致密细胞的出现：在对照样品中，约80％的细胞显示致密方面，而存在5μM或10μM的ALF-5755时，致密细胞的百分比不超过40％。因此，显示ALF-5755保护粒细胞神经元免于NMDA诱导的细胞死亡。
总之，这些结果强烈地提示，ALF-5755可防止小脑粒细胞免于兴奋性中毒和氧化死亡。
实施例4：HIP/PAP蛋白针对皮质神经元细胞的凋亡的保护效应
A.材料和方法
A.1.皮质培养物
通过低温处死P0幼鼠；在CMF-Tyrode溶液中无菌条件下解剖它们的皮质。去除脑脊膜，将组织剁成更小的块并在CMF-Tyrode中收集。用胰蛋白酶-DNA酶处理这些，然后通过研磨在相同溶液中分离，以制备单个细胞悬浮液，沉淀并在含有15mM HEPES、L-谷氨酰胺、盐酸吡哆醇(pyroxidine hydrochloride)(Invitrogen，Carlsbad，CA)、N2补充剂(Invitrogen)、10％胎牛血清、25mM KCl和青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基-F-12(DMEM-F-12)中重悬浮。
将细胞以2x 104细胞/cm2的密度接种到聚-D-赖氨酸-包被的Labtek室中(Nunc，Roskilde，DK)。在37℃下5％CO2中温育24小时后，去除含血清的培养基。然后在无血清培养基中培养细胞12个小时，其后开始用NMDA(终浓度为0.3mM)和HIP(终浓度为18.3ng)进行处理。处理持续24小时，其后用1X PBS洗涤细胞，然后在4％PFA中固定。
A.2.TUNEL测定
从Roche购买TUNEL试剂盒并根据制造商的建议进行测定。简言之，在0.02％Triton-X中透化细胞30分钟，在由末端核苷酸转移酶和经标记的核苷酸混合物组成的标记混合物中37℃下潮湿的室中温育1小时。通过计数两个孔中各自共10个随机视野的TUNEL阳性细胞进行培养物中TUNEL阳性细胞的定量。
B.结果
在图1中概述了结果，其中通过测定TUNEL阳性细胞的百分比评估皮质细胞凋亡的水平。
如图1所示，HIP/PAP蛋白发挥皮质神经元细胞的保护作用，即使当单独使用时(见图1最右边部分的″HIP″条形)。这些结果表示，HIP/PAP蛋白单独诱导对体外细胞培养的基线效应的保护作用。
最重要的是，图1显示HIP/PAP蛋白发挥针对NMDA诱导的皮质神经元细胞凋亡的强保护作用(将″NMDA″条形与″NMDA+HIP″条形比较)。
从来自对野生型GAP 43基因纯合的小鼠(GAP43+/+)的皮质细胞体外培养物中获得图1中显示的结果。
尽管未显示，通过使用皮质细胞的体外培养物获得了相同的结果，所述皮质细胞来自(i)GAP43+/-小鼠或(ii)GAP43-/-小鼠。
后面的结果提示，所看到的HIP/PAP蛋白的保护效应不需要GAP43蛋白的存在。
实施例5：HIP/PAP蛋白对神经元细胞可塑性的影响
A.材料和方法
A.1.皮质培养物
通过低温处死P0幼鼠；在CMF-Tyrode溶液中无菌条件下解剖它们的皮质。去除脑脊膜，将组织剁成更小的块并在CMF-Tyrode中收集。用胰蛋白酶-DNA酶处理这些，然后通过研磨在相同溶液中分离，以制备单个细胞悬浮液，沉淀并在含有15mM HEPES、L-谷氨酰胺、盐酸吡哆醇(Invitrogen，Carlsbad，CA)、N2补充剂(Invitrogen)、10％胎牛血清、25mMKCl和青霉素-链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基-F-12(DMEM-F-12)中重悬浮。
将细胞以2x 104细胞/cm2的密度接种到聚-D-赖氨酸-包被的Labtek室中(Nunc，Roskilde，DK)。在37℃下5％CO2中温育24小时后，去除含血清的培养基。然后在无血清培养基中培养细胞12个小时，其后开始用NMDA(终浓度为0.3mM)和HIP(终浓度为18.3ng)处理。处理持续24小时，其后用1X PBS洗涤细胞，然后在4％PFA中固定。
A.2.显微镜检查法
在Zeiss Axioplan 2显微镜上使用Axio Cam HRC CCD照相机捕获图像，并使用Zeiss KS 4003.0软件完成分析。图像需要稍微调整对比度和亮度。不需要额外的图像改变。
A.3.轴突长度分析
除了观察分支点的数量，还观察一级、二级和三级轴突的数量。βIII微管蛋白用作标记物(在实施例中未显示数据)。在Zeiss Axioplan II上捕获图像。使用IM50软件获得轴突长度。
B.结果
分别在图2到6中描述了结果。
图2到5的结果显示，HIP/PAP蛋白，即使单独使用时也在神经可塑性中产生增加，因为所述HIP/PAP蛋白(i)增加一级轴突的数量(图2)，以及具有二级和三级轴突的细胞的数量(分别见图3和4)。
图6中描述的结果显示，HIP/PAP蛋白具有保护神经元细胞免于NMDA在轴突生长上引起的不利作用的能力。更精确地，图6中呈现的结果显示HIP/PAP，当加入与NMDA温育的神经元细胞时，恢复轴突生长的水平，在与单独培养基温育的对照神经元细胞培养物中测量所述轴突生长水平。
此外，已经显示HIP/PAP蛋白具有恢复皮质神经元细胞神经可塑性的能力，所述皮质神经元细胞与细胞毒性量的NMDA进行温育。
从来自对野生型GAP 43基因纯合的小鼠(GAP43+/+)的皮质细胞的体外培养物中获得图2、5和6中显示的结果。
尽管未显示，通过使用皮质细胞的体外培养物获得了相同的结果，所述皮质细胞来自(i)GAP43+/-小鼠或(ii)GAP43-/-小鼠。
后面的结果提示，所看到的HIP/PAP蛋白对神经可塑性的保护效应不需要GAP43蛋白的存在。
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Figure IDA0000134443410000041

Claims (12)

1.HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物用于预防或治疗选自以下组成的组的疾病的用途
-新生儿脑损伤，其包括脑缺氧引起的新生儿脑损伤，
-成人或儿童脑损伤，其包括脑缺氧引起的成人或儿童脑损伤，
-成人或儿童或新生儿外伤性脑损伤，
-小脑疾病或病症，和
-涉及Gap-43的产生或磷酸化中的缺陷的疾病。
2.权利要求1的用途，其中新生儿脑损伤包括选自胎儿低氧血、围产期低氧血、胎儿局部缺血、围产期局部缺血，和兴奋性神经递质过度释放的病理学状态。
3.权利要求1的用途，其中所述新生儿、成人或儿童脑损伤由脑血管意外组成，其包括中风。
4.权利要求1的用途，其中所述新生儿、成人或儿童脑损伤选自缺血性中风和出血性中风。
5.权利要求1的用途，其中所述小脑疾病或病症是小脑性共济失调。
6.权利要求1的用途，其中涉及Gap-43的产生或磷酸化中缺陷的所述疾病由阿尔茨海默氏病组成。
7.权利要求1至6任何一项的用途，其中所述HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物调节神经元细胞的结构重塑或可塑性。
8.权利要求1至7任何一项的用途，其中所述HIP/PAP蛋白或其蛋白衍生物发挥针对神经元细胞凋亡或针对神经元细胞死亡的保护效应。
9.权利要求1至6任何一项的用途，其中所述HIP/PAP蛋白或其衍生物包含与选自SEQ ID N°1到3的多肽的多肽具有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列。
10.权利要求1至9任何一项的用途，其中所述HIP/PAP蛋白衍生物选自HIP/PAP蛋白的生物学活性部分和HIP/PAP嵌合或融合蛋白。
11.HIP/PAP蛋白用于体外培养神经元细胞的用途。
12.用于神经元细胞的培养基，其包含HIP/PAP蛋白或其衍生物。
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