CN109771699A - 功能化神经再生胶原支架、其制法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种功能化神经再生胶原支架、其制法及应用。所述功能化神经再生胶原支架包括：引导神经再生的线性、有序的胶原纤维支架，以及与所述胶原纤维支架结合的、具有胶原结合能力的CBD‑SDF。本发明提供的功能化神经再生胶原支架一方面可以缓慢释放CBD‑SDF提高募集内源性神经干细胞的效率，又能为细胞粘附、轴突生长与延伸提供良好的微环境，还可以抑制胶质瘢痕形成。另外，本发明将功能化神经再生胶原支架与VPA联合应用，可以促进脊髓损伤后内源性神经干细胞向损伤位置归巢并调控其向神经元分化、促进神经再生和突触形成，抑制胶质瘢痕形成，最终促进脊髓损伤修复和运动功能改善。

Description

功能化神经再生胶原支架、其制法及应用

技术领域

本发明具体涉及一种生物支架材料，特别涉及一种具有募集内源性神经干细胞功能的功能化神经再生胶原支架、其制法及在脊髓损伤修复中的应用，属于生物医学材料技术领域。

背景技术

脊髓损伤一种由外伤或疾病引起的中枢神经系统损伤，损伤发生以后大量神经元死亡、胶质瘢痕形成、神经传导中断，造成损伤平面以下功能受损或丧失，主要表现为运动功能(不同程度的瘫痪)、泌尿功能、感觉传导功能障碍。目前临床上仅可通过减压、控制炎症等方法减轻病人的痛苦，并不能使神经元再生，给个人和社会带来沉重的医疗负担。

干细胞与再生医学的发展为脊髓损伤的治疗提供了新的思路和方法。神经干细胞是治疗脊髓损伤的理想种子细胞，其可通过分泌营养因子，分化为神经元、少突胶质细胞细胞和星形胶质细胞，抑制瘢痕和炎症等作用促进脊髓损伤修复。但是神经干细胞来源有限并且有免疫原性，因此通过神经干细胞移植治疗脊髓损伤难以在临床大规模应用与转化。实际上成年个体脊髓内存在内源性神经干细胞，脊髓损伤发生后这些内源性的神经干细胞在SDF-CXCR4反应轴的作用下向损伤部位迁移与归巢。因此，通过在脊髓损伤部位释放SDF促进内源性神经干细胞归巢可以促进脊髓损伤修复。但是天然SDF(native SDF，NAT-SDF)在体内弥散和降解速度太快，降低了其局部浓度和治疗效果，还会产生一些副作用；且大部分内源性神经干细胞在损伤微环境下都分化成了星形胶质细胞并形成胶质瘢痕，不利于神经元的存活和轴突生长与延伸。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种功能化神经再生胶原支架、其制备方法及在脊髓损伤修复中的应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种功能化神经再生胶原支架在制备修复脊髓损伤的产品中的应用，

所述功能化神经再生胶原支架包括：引导神经再生的线性有序胶原纤维支架(linearly ordered collagen scaffold,LOCS)；以及，与所述胶原纤维支架结合的、具有胶原结合能力的CBD-SDF。

进一步的，所述CBD-SDF修饰于所述胶原纤维支架的内部和表面。

进一步的，所述CBD-SDF包括CBD-SDF-1α，所述CBD-SDF-1α包含SDF-1α的成熟肽序列和具有胶原结合功能的胶原结合区域(collagen-bingdingdomain,CBD)，在体外可以促进神经干细胞迁移与粘附。

进一步的，所述胶原纤维支架包括复数个有序排列的线性胶原纤维丝，可根据不同应用要求剪切成不同长度。该胶原纤维支架可根据脊髓损伤的程度制备成不同长度和直径，在大鼠T8全横断脊髓损伤模型中，所用胶原纤维支架长度为2mm～1cm，直径为1mm～5mm。

进一步的，所述产品至少具有在体内募集内源性神经干细胞并促进内源性神经干细胞向神经元分化的功能。

进一步的，所述产品至少具有促进神经再生和突触形成并抑制胶质瘢痕形成的功能。

进一步的，所述产品至少具有修复脊髓损伤的功能。

进一步的，所述产品还包括丙戊酸。所述功能化神经再生胶原支架在体内可以募集内源性神经干细胞，并且该功能化神经再生胶原支架与临床上治疗癫痫的药物丙戊酸(valproic acid，VPA)联合应用，可以促进脊髓损伤后神经干细胞向损伤位置归巢并调控其向神经元分化、促进神经再生和突触形成，抑制胶质疤痕形成，最终促进脊髓损伤修复和运动功能改善。

本发明实施例还提供了一种功能化神经再生胶原支架，其包括：引导神经再生的线性有序胶原纤维支架(linearly ordered collagen scaffold,LOCS)；以及，与所述胶原纤维支架结合的、具有胶原结合能力的CBD-SDF。

进一步的，所述CBD-SDF修饰于所述胶原纤维支架的内部和表面。

进一步的，所述CBD-SDF包括CBD-SDF-1α，所述CBD-SDF-1α包含SDF-1α的成熟肽序列和具有胶原结合功能的胶原结合区域(collagen-bingdingdomain,CBD)，在体外可以促进神经干细胞迁移与粘附。

进一步的，所述胶原纤维支架包括复数个有序排列的线性胶原纤维丝，可根据不同应用要求剪切成不同长度。

本发明实施例还提供了前述的功能化神经再生胶原支架的制备方法，其包括：

提供引导神经再生的线性有序胶原纤维支架，使所述胶原纤维支架与具有胶原结合能力的CBD-SDF结合，之后于37℃孵育30min～2h，获得所述功能化神经再生胶原支架。

进一步的，所述胶原纤维支架的制备方法包括：

将胶原溶于选定溶剂中形成浓度为0.2～0.3g/mL的胶原溶液；

将所述胶原溶液加入到注射器中，通过微量注射泵控制流速为0.2～0.5mL/h，利用静电纺丝方法，在纺丝头与接收平台间施加高压静电场，电压为10～15kV，纺丝头与接收平台间距离为10～15cm，获得线性有序胶原纤维支架。

本发明实施例还提供了一种修复脊髓损伤的功能产品，其包含前述的功能化神经再生胶原支架。

较之现有技术，本发明的有益效果在于：

1)本发明提供的功能化神经再生胶原支架一方面可以缓慢释放CBD-SDF提高募集内源性神经干细胞的效率，又能为细胞粘附、轴突生长与延伸提供良好的微环境，还可以抑制胶质瘢痕形成。该功能化胶原支架可以通过募集内源性神经干细胞促进脊髓损伤修复，无需外源性干细胞移植，可以避免外源性神经干细胞移植所受的细胞来源有限、免疫排斥、病原传播、伦理以及细胞制品注册审批困难等问题的限制，更容易在临床转化与应用。

2)本发明利用抗癫痫药物丙戊酸(valproic acid，VPA)具有调控神经干细胞向神经元分化，抑制其向星形胶质细胞分化的功能，在大鼠脊髓全横断损伤模型中将功能化神经再生胶原支架与VPA联合应用，既可提高募集内源性神经干细胞的效率，又可以提高脊髓损伤修复的效率，可以促进脊髓损伤后内源性神经干细胞向损伤位置归巢并调控其向神经元分化、促进神经再生和突触形成，抑制胶质瘢痕形成，从而可以引导神经和脊髓损伤修复，最终促进脊髓损伤修复和运动功能改善。无需外源性干细胞移植和临床上已经批准的小分子药物的使用，比外源性干细胞移植在临床应用与转化方面具有无可比拟的优越性，减少了临床应用与转化的障碍和困难，更容易通过注册审批，应用于临床。

附图说明

图1A是本发明一实施方案中NAT-SDF和CBD-SDF的构建示意图。

图1B是本发明一实施方案中Tricine SDS-PAGE对纯化的NAT-SDF和CBD-SDF进行鉴定的示意图。

图1C是本发明一实施方案中Western blot对纯化的NAT-SDF和CBD-SDF进行鉴定的示意图。

图2A是本发明一实施方案中NAT-SDF和CBD-SDF与胶原的结合曲线图。

图2B是本发明一实施方案中NAT-SDF和CBD-SDF与胶原的解离曲线图。

图2C是本发明一实施方案中NAT-SDF和CBD-SDF与胶原的释放曲线图。

图3A1是本发明一实施方案中一种胶原纤维支架的照片示意图。

图3A2-图3A3是本发明一实施方案中一种胶原纤维支架的电子扫描显微镜照片。

图4是本发明一实施方案中一种功能性神经再生胶原支架的构建过程示意图。

图5A是本发明一实施方案中nestin和CXCR4在神经干细胞上共表达示意图。

图5B是本发明一实施方案中神经干细胞的标志物nestin的示意图。

图5C是本发明一实施方案中SDF的受体CXCR4的示意图。

图5D是本发明一实施方案中DAPI染的细胞核的示意图。

图5E是本发明一实施方案中神经干细胞生长形成的神经球在光镜下的照片。

图6A是本发明一实施方案中神经干细胞在不同修饰的胶原界面的粘附情况示意图。

图6B是本发明一实施方案中粘附到胶原上的神经干细胞的统计分析示意图。

图6C是本发明一实施方案中NAT-SDF和CBD-SDF介导神经干细胞迁移示意图。

图7A是本发明一实施方案中或VPA调控诱导下神经干细胞分化的免疫荧光染色示意图。

图7B是本发明一实施方案中神经干细胞不同分化条件下向神经元分化比例的统计分析示意图。

图7C是本发明一实施方案中神经干细胞在不同分化条件下向星形胶质细胞分化比例的统计分析示意图。

图8A是本发明一实施方案中脊髓标本神经干细胞标志物nestin免疫荧光染色共聚焦显微镜扫描拍摄拼接的全景图。

图8B是本发明一实施方案中损伤中心位置内源性干细胞染色结果示意图。

图8C是本发明一实施方案中各组损伤中心位置内源性神经干细胞数量的统计分析结果示意图。

图9A是本发明一实施方案中功能化神经再生胶原支架联合VPA治疗促进神经元再生时术后8周各治疗组损伤区神经元标志物Tuj-1免疫荧光染色，共聚焦显微镜扫描拍摄拼接的全景图。

图9B是本发明一实施方案中功能化神经再生胶原支架联合VPA治疗促进神经元再生时治疗8周后各组损伤中心位置Tuj-1⁺免疫荧光染色结果示意图。

图9C是本发明一实施方案中功能化神经再生胶原支架联合VPA治疗促进神经元再生时损伤中心位置Tuj-1⁺免疫荧光染色的统计分析结果示意图。

图10A是本发明一实施方案中功能化神经再生胶原支架联合VPA治疗促进成熟神经再生时术后8周各治疗组中成熟神经元标志物MAP2免疫荧光染色，共聚焦显微镜扫描拍摄拼接的全景图。

图10B是本发明一实施方案中功能化神经再生胶原支架联合VPA治疗促进成熟神经再生时各治疗组损伤中心位置MAP2免疫荧光染色结果示意图。

图10C是本发明一实施方案中功能化神经再生胶原支架联合VPA治疗促进成熟神经再生时各治疗组损伤中心位置MAP2⁺阳性染色统计分析结果示意图。

图11A是本发明一实施方案中功能化神经再生胶原支架联合VPA治疗促进功能性神经元再生和神经突触形成时各治疗组损伤区胆碱能神经元标志物乙酰胆碱转移酶(ChAT)的免疫荧光染色结果示意图。

图11B是本发明一实施方案中功能化神经再生胶原支架联合VPA治疗促进功能性神经元再生和神经突触形成时各治疗组损伤区运动神经元标志物5-羟色胺(5-HT)的免疫荧光染色结果示意图。

图11C是本发明一实施方案中功能化神经再生胶原支架联合VPA治疗促进功能性神经元再生和神经突触形成时各治疗组损伤区神经元标志物神经核(NeuN)的免疫荧光染色结果示意图。

图11D是本发明一实施方案中功能化神经再生胶原支架联合VPA治疗促进功能性神经元再生和神经突触形成时各治疗组损伤区神经突触标志物突触素(Syn)的免疫荧光染色结果示意图。

图11E是本发明一实施方案中ChAT染色结果统计分析示意图。

图11F是本发明一实施方案中5-HT染色结果统计分析示意图。

图11G是本发明一实施方案中NeuN染色结果统计分析示意图。

图11H是本发明一实施方案中Syn染色结果统计分析示意图。

图12A是本发明一实施方案中功能化神经再生胶原支架联合VPA可以抑制瘢痕形成，促进运动功能改善，胶质瘢痕标志物硫酸软骨素蛋白多糖(CsPG)免疫荧光染色结果示意图。

图12B是本发明一实施方案中功能化神经再生胶原支架联合VPA可以抑制瘢痕形成，促进运动功能改善，CsPG免疫荧光染色统计分析结果示意图。

图12C是本发明一实施方案中功能化神经再生胶原支架联合VPA可以抑制瘢痕形成，促进运动功能改善，术后1～8周根据BBB系统评分法则对大鼠后肢运动功能进行评分的统计分析结果示意图。

图12D是本发明一实施方案中功能化神经再生胶原支架联合VPA可以抑制瘢痕形成，促进运动功能改善，术后第8周，动物处死前BBB评分的统计分析结果示意图。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，研制了具有胶原结合能力的CBD-SDF，制备了引导神经再生的线性、有序的胶原纤维支架，用CBD-SDF修饰胶原纤维支架构建功能化的神经再生胶原支架。该功能化神经再生胶原支架一方面可以缓慢释放CBD-SDF提高募集内源性神经干细胞的效率，又能为细胞粘附、轴突生长与延伸提供良好的微环境，还可以抑制胶质瘢痕形成。另外，本发明利用抗癫痫药物VPA具有调控神经干细胞向神经元分化，抑制其向星形胶质细胞分化的功能，在大鼠脊髓全横断损伤模型中将功能化神经再生胶原支架与VPA联合应用，既可提高募集内源性神经干细胞的效率，又能促进内源性神经干细胞向神经元分化，抑制胶质瘢痕形成，从而可以引导神经和脊髓损伤修复。

以下结合附图及典型实施案例对本发明的技术方案作进一步的详细说明。

1.CBD-SDF表达载体的构建、表达及纯化

从人成纤维细胞的mRNA扩增出天然SDF-1α成熟肽的编码序列，通过PCR的方法将CBD序列及linker序列拼接到SDF-1α序列的C-末端(参阅图1A)。在引物中引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，通过双酶切的方法将CBD-SDF编码基因插入到pET28a载体中。将表达CBD-SDF的重组载体转入到BL21(DE3)大肠杆菌中。用终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达。包涵体变性溶解后用Ni柱亲和层析纯化，纯化蛋白用tricine SDS-PAGE和western blot进行鉴定。ELISA方法检测CBD-SDF在体外与胶原的结合与释放能力。结果显示，获得了纯化的NAT-SDF和CBD-SDF(参阅图1B和图1C)；CBD-SDF能与胶原特异性结合并缓慢释放，请参阅图2A-图2C所示。其中，图2A示出了NAT-SDF和CBD-SDF与胶原的结合曲线图，结果显示CBD-SDF与胶原具有较强的结合能力。图2B示出了NAT-SDF和CBD-SDF与胶原结合的解离曲线图，图2C示出了NAT-SDF和CBD-SDF与胶原结合的释放曲线图。

2.功能化神经再生胶原支架中胶原纤维支架的制备

利用静电纺丝方法，以六氟异丙醇为溶剂溶解胶原，充分搅拌，胶原溶液浓度为0.2～0.3g/mL。将胶原溶液加入到注射器中，通过微量注射泵控制流速为0.2～0.5mL/h；在纺丝头与接收平台间施加高压静电场，电压为10～15kV，纺丝头与接收平台间距离为10～15cm，获得有序排列的线性胶原纤维支架(参阅图3A1-图3A3)。其中，图3A1是本实施例中制备的丝状、有序的胶原纤维支架材料，可根据不同应用要求剪切成不同长度；图3A2和图3A3是不同放大倍数的胶原支架电子扫描显微镜照片，显示其是由线性、有序排列的胶原纤维丝组成。CBD-SDF结合到胶原支架上即构建了功能化的神经再生胶原支架，用于募集神经干细胞和引导神经再生。

3.功能化神经再生胶原支架的制备

将上述获得的胶原纤维支架捆扎成束，直径约2mm，截取长度约为4mm。在术前将2.0nmol的CBD-SDF滴加到胶原支架上，37℃孵育30min，即为功能化神经再生胶原支架。通过CBD-SDF从胶原支架缓慢释放提高内源性神经干细胞的募集效率，在体内与临床药物VPA连用可在募集内源性干细胞的同时促进神经干细胞分化为神经元(参阅图4)。

本实施例通过制备具有胶原结合能力的CBD-SDF和线性、有序的胶原纤维支架，用CBD-SDF修饰胶原支架构建功能化的神经再生胶原支架。将该功能化胶原支架移植到脊髓损伤位置，通过缓慢释放CBD-SDF提高内源性神经干细胞的募集效率。另外，功能化神经再生胶原支架与临床药物VPA联用，可以实现在募集内源性神经干细胞的同时，调控其向神经元分化，从而促进脊髓损伤修复。

4.原代神经干细胞的培养及传代

分离新生24h内的SD大鼠端脑，在体视镜下剥离脑膜和血管，然后将端脑组织剪碎，加入10mL的TryplE在37℃细胞培养箱中进行消化，每隔5min吹打一次。细胞悬液先过80目细胞筛，然后再过400目细胞筛。500g离心5min收集细胞，然后用神经干细胞增殖培养基重悬细胞，接种于T-25的细胞培养瓶中，在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中进行。3天换一次培养液，培养至第6天时备用。

5.nestin和CXCR4在神经干细胞共表达

200g离心5min收集神经球，用PBS洗3遍，4％多聚甲醛固定；经0.05％Triton X-100透膜室温透膜后用5％的BSA室温封闭1h。加入检测神经干细胞标志物nestin的mouseanti-nestin抗体(1:500)和SDF-1α受体CXCR4的rabbit anti-CXCR4抗体(1:300)的混合液，4℃孵育过夜。PBS洗3遍，加入Alexa 488标记的anti-mouse IgG(1:800)和Alexa 564标记的anti-rabbit IgG(1:800)二抗混合液，室温、避光孵育1h。PBS洗3遍，加入DAPI(0.1μg/mL)室温孵育15min染细胞核，再用PBS洗3遍。加入少量PBS重悬神经球，然后滴到载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察，并拍摄荧光照片，结果显示nestin和CXCR4在神经干细胞共表达(请参阅图5A)。其中，图5A中绿色荧光代表神经干细胞的标志物nestin(参阅图5B)，图5A中红色荧光代表SDF的受体CXCR4(参阅图5C)，图5A蓝色为DAPI染的细胞核(参阅图5D)，图5E示出了神经干细胞生长形成的神经球的光镜下的照片。

6.CBD-SDF修饰的胶原有利于神经干细胞粘附

用鼠尾胶原溶液包被48孔细胞培养板，每孔加入150μL浓度为20μM的NAT-SDF或CBD-SDF蛋白溶液，37℃孵育1h。每孔接种3×10⁵个细胞神经干细胞，将细胞培养板放在水平摇床上，设置转速为80rpm模拟体内体液的流动，在于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养4h后，弃去未贴壁的细胞，PBS轻轻洗涤3遍，然后用4％的多聚甲醛对细胞进行固定。募集到的NSC经0.05％Triton X-100透膜，5％BSA封闭后，加入anti-nestin抗体，4℃孵育过夜，PBS洗3遍；加入Alexa 564标记的anti-mouse IgG二抗，室温避光孵育1h，PBS洗3遍，然后用DAPI共染细胞核。结果显示CBD-SDF修饰的胶原更有利于神经干细胞的粘附(请参阅图6A和图6B)。其中，图6A示出了神经干细胞在不同修饰的胶原界面的粘附情况，红色荧光代表神经干细胞的标志物nestin，蓝色代表DAPI染的细胞核。图6B示出了粘附到胶原上的神经干细胞的统计分析示意图；^*P<0.05，^**P<0.01。

7.CBD-SDF介导神经干细胞迁移的研究

在transwell系统的下室中加入600μL含NAT-SDF或CBD-SDF浓度为100ng/mL的DMEM/F12培养基；在上室加入200μL上述细胞悬液(1×10⁵个细胞/孔)，放入CO₂培养箱中培养12h。将小室取出，弃去上室中的液体，用PBS洗3遍；用棉签擦净小室内的细胞，4％多聚甲醛固定30min，然后用结晶紫进行染色。将小室倒扣在载玻片上，用正置显微镜进行拍照，image J软件计数每个视野的细胞数，迁移效率＝诱导组的细胞数/对照组的细胞数。结果显示CBD-SDF可以介导神经干细胞迁移，其生物学活性与天然SDF无统计学差异(参阅图6C)。图6C示出了NAT-SDF和CBD-SDF均可介导神经干细胞迁移，两者的生物学活性无统计学差异，^**P<0.01。

8.VPA对神经干细胞分化的影响

用多聚赖氨酸溶液包被48孔板中，每孔接种3×10⁵个神经干细胞，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养过夜。弃去培养基，用PBS洗3遍彻底洗净残留的血清；然后加入不含或含有0.5mM VPA的神经干细胞分化培养基，隔天换液。分化至第10天时，弃去培养基，用PBS洗3遍，4％多聚甲醛室温固定30min；然后用0.05％Triton X-100透膜10min，5％BSA室温封闭1h。分别加入anti-Tuj-1和anti-GFAP一抗，4℃孵育过夜，PBS洗3遍；然后加入Alexa 488标记的二抗，室温避光孵育1h，PBS洗3遍；DAPI复染细胞核后激光共聚焦显微镜拍照，统计神经元和星形胶质细胞的分化比例。结果显示VPA可以促进神经干细胞向神经元分化，抑制其向星形胶质细胞分化(参阅图7A-图7C)。其中，图7A示出了神经干细胞在自发或VPA诱导下分化的免疫荧光染色示意图，Tuj-1为神经元标志物，GFAP为星形胶质细胞的标志物，DAPI染细胞核。图7B示出了神经干细胞不同分化条件下向神经元分化比例的统计分析结果，^**P<0.01。图7C示出了神经干细胞在不同分化条件下向星形胶质细胞分化比例的统计分析结果，^**P<0.01。

9.大鼠脊髓全横断损伤模型的建立

SPF级雌性SD大鼠，体重在200～220g，购自苏州大学实验动物中心；腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)进行麻醉。在T7-T10位置切开皮肤和筋膜，沿棘突切开双侧肌肉，用持针器撬开并剔除T8位置的椎板，暴露出脊髓。显微持针器夹住脊髓，用显微剪立即在前后端各剪一刀，去除一段约4mm的脊髓组织；立即将明胶止血海绵填塞损伤处，压紧止血。停止流血后，取出明胶海绵，将不同修饰的胶原支架材料(CBD-SDF)植入到缺损部位。术后第5天评价内源性神经干细胞的募集情况；术后第8周评价CBD-SDF修饰的胶原支架材料联合VPA促进脊髓损伤修复的效果。实验分组：

A.对照组(control)：仅造成4mm的脊髓缺损，不植入支架材料；

B.材料组(scaffold)：植入未加任何生长因子修饰的支架材料；

C.支架材料+NAT-SDF组(S-N)：植入NAT-SDF修饰的LOCS材料；

D.支架材料+CBD-SDF组(S-C)：植入CBD-SDF修饰的LOCS材料；

E.S-C联合VPA治疗组(S-C-V)：术后每天腹腔注射VPA(150mg/kg)，连续10天。

术后所有大鼠饲养于SPF级的实验动物房内，每天腹腔注射抗生素，连续1周；每天挤压辅助排尿两次，直至能自主排尿。

10.功能化神经再生胶原支架在体内促进内源性神经干细胞募集

将空白的支架材料、NAT-SDF修饰的支架材料以及CBD-SDF修饰的支架材料移植到大鼠脊髓全横断损伤模型中，在术后第5天分离损伤位置组织进行冰冻切片。用神经干细胞标志物nestin的抗体检测内源性干细胞向损伤位置归巢的情况，结果显示空白支架和NAT-SDF修饰的支架材料募集到内源性神经干细胞数量较少，而CBD-SDF修饰的支架材料可以有效的募集内源性干细胞，且神经干细胞可以迁移到损伤的中心位置，即功能化神经再生支架材料促进内源性神经干细胞归巢(参阅图8A-图8C)。其中，图8A示出了脊髓标本神经干细胞标志物nestin免疫荧光染色(红色)共聚焦显微镜扫描拍摄拼接的全景图(蓝色为DAPI复染的细胞核)，可见在CBD-SDF修饰的LOCS材料组(S-C组)内源性干细胞分布的面积明显大于其它各组。图8B示出了损伤中心位置内源性干细胞染色结果。图8C示出了各组损伤中心位置内源性神经干细胞数量的统计分析结果，^**P<0.01。

11.功能化神经再生胶原支架联合VPA在脊髓损伤位置促进神经元再生

在术后第8周，通过神经元标志物Tuj-1和成熟神经元标志物MAP2检测脊髓损伤位置神经元的再生情况。免疫荧光染色结果显示：功能化神经再生支架联合VPA不仅能促进神经元再生而且可以促进神经元成熟(参阅图9A-图9C以及图10A-图10C)。

其中，图9A示出了术后8周各治疗组损伤区神经元标志物Tuj-1免疫荧光染色，共聚焦显微镜扫描拍摄拼接的全景图。图9B示出了治疗8周后各组损伤中心位置Tuj-1⁺免疫荧光染色结果。图9C示出了损伤中心位置Tuj-1⁺免疫荧光染色的统计分析结果；^*P<0.05，^**P<0.01。以上结果显示CBD-SDF修饰的LOCS材料联合VPA可以促进脊髓损伤区域神经元再生。

图10A-图10C示出了功能化神经再生支架材料联合VPA治疗促进成熟神经再生。图10A示出了术后8周各治疗组中成熟神经元标志物MAP2免疫荧光染色，共聚焦显微镜扫描拍摄拼接的全景图。图10B示出了各治疗组损伤中心位置MAP2免疫荧光染色结果。图10C示出了各治疗组损伤中心位置MAP2⁺阳性染色统计分析结果；^**P<0.01，S-C-V组与其它各组相比，S-C组与control和Scaffold组相比。

12.功能化神经再生胶原支架联合VPA在脊髓损伤位置促进功能性神经元再生、突触形成和内源性神经干细胞向神经元分化

通过对乙酰胆碱能神经元标志物(ChAT)和运动神经元标志物5-羟色胺(5-HT)免疫荧光染色检测脊髓损伤位置功能神经元的再生情况，结果显示功能化神经再生支架材料联合VPA可以促进胆碱能神经元的再生(参阅图11A和图11E，示出了各治疗组损伤区胆碱能神经元标志物乙酰胆碱转移酶(ChAT)的免疫荧光染色结果和统计分析结果)和运动神经元(参阅图11B和图11F，示出了各治疗组损伤区运动神经元标志物5-羟色胺(5-HT)的免疫荧光染色结果和统计分析结果)。我们对神经元细胞核的标志物神经核(NeuN)进行染色，结果显示联合治疗组有大量NeuN阳性细胞染色，说明功能化神经再生支架材料联合VPA在体内促进内源性干细胞募集的同时还可以促进神经干细胞分化为神经元(参阅图11C和图11G，各治疗组损伤区神经元标志物神经核(NeuN)的免疫荧光染色结果和统计分析结果，说明内源性神经干细胞分化成神经元)。另外，通过对突触标志物突触素(Syn)的染色检测功能化神经再生支架材料联合VPA对突触形成的影响，结果显示两者的联合应用可以促进脊髓损伤位置神经突触的形成(参阅图11D和图11H，示出了各治疗组损伤区神经突触标志物突触素(Syn)的免疫荧光染色结果和统计分析结果)，^*P<0.05,^**P<0.01。

13.功能化神经再生支架材料联合VPA抑制胶质瘢痕的形成

通过对损伤位置脊髓组织进行胶质瘢痕的标志物硫酸软骨素蛋白多糖(CsPG)免疫荧光染色，结果显示空白的神经再生支架材料、功能化神经再生支架材料及功能化神经再生支架材料联合VPA均能限制抑制胶质瘢痕的形成(参阅图12A和图12B)，其中图12A示出了胶质瘢痕标志物硫酸软骨素蛋白多糖(CsPG)免疫荧光染色结果。图12B示出了CsPG免疫荧光染色统计分析结果，^**P<0.01。

14.功能化神经再生支架材料联合VPA促进运动功能恢复

从术后第一周开始，采用双盲的方式，将大鼠放入开口的盆中，轻轻敲击盆壁，观察大鼠行走、躯干运动及协调情况；按照Basso,Beattie&Bresnahan运动评分规则，评价术后运动功能改善情况。结果显示，功能化神经再生胶原支架联合VPA治疗从术后第3周开始明显促进大鼠后肢运动功能改善，功能化神经再生支架材料也要优于空白支架和对照组(参阅图12C和图12D)，其中，图12C示出了术后1～8周根据BBB系统评分法则对大鼠后肢运动功能进行评分的统计分析结果(^*P<0.05,^**P<0.01)。图12D示出了术后第8周，动物处死前BBB评分的统计分析结果(^*P<0.05,^**P<0.01)。

综上所述，本发明制备的功能化神经再生胶原支架在体外有利于神经干细胞的粘附，在体内有利于募集内源性神经干细胞。该功能化神经再生胶原支架联合VPA在体内既可以募集内源性干细胞，又能调控其向神经元分化，从而促进脊髓损伤修复和运动功能改善。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种功能化神经再生胶原支架在制备修复脊髓损伤的产品中的应用；所述功能化神经再生胶原支架包括：引导神经再生的线性有序胶原纤维支架；以及，与所述胶原纤维支架结合的、具有胶原结合能力的CBD-SDF。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述CBD-SDF修饰于所述胶原纤维支架的内部和表面。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述CBD-SDF包括CBD-SDF-1α，所述CBD-SDF-1α包含SDF-1α的成熟肽序列和具有胶原结合功能的胶原结合区域。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述胶原纤维支架包括复数个有序排列的线性胶原纤维丝；优选的，所述胶原纤维支架的长度为2mm～1cm，直径为1mm～5mm。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品至少具有在体内募集内源性神经干细胞并促进内源性神经干细胞向神经元分化的功能。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品至少具有促进神经再生和突触形成并抑制胶质瘢痕形成的功能。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品至少具有修复脊髓损伤的功能。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品还包括丙戊酸。

9.一种功能化神经再生胶原支架，其特征在于包括：引导神经再生的线性有序胶纤维原支架；以及，与所述胶原纤维支架结合的、具有胶原结合能力的CBD-SDF。

10.根据权利要求9所述的功能化神经再生胶原支架，其特征在于：所述CBD-SDF修饰于所述胶原纤维支架的内部和表面。

11.根据权利要求9或10所述的功能化神经再生胶原支架，其特征在于：所述CBD-SDF包括CBD-SDF-1α，所述CBD-SDF-1α包含SDF-1α的成熟肽序列和具有胶原结合功能的胶原结合区域。

12.根据权利要求9或10所述的功能化神经再生胶原支架，其特征在于：所述胶原纤维支架包括复数个线性、有序排列的胶原纤维丝。

13.权利要求9-12中任一项所述的功能化神经再生胶原支架的制备方法，其特征在于包括：提供引导神经再生的线性有序胶原纤维支架，使所述胶原纤维支架与具有胶原结合能力的CBD-SDF结合，之后于37℃孵育30min～2h，获得所述功能化神经再生胶原支架。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述胶原纤维支架的制备方法包括：

将胶原溶于选定溶剂中形成浓度为0.2～0.3g/mL的胶原溶液；

将所述胶原溶液加入到注射器中，通过微量注射泵控制流速为0.2～0.5mL/h，利用静电纺丝方法，在纺丝头与接收平台间施加高压静电场，电压为10～15kV，纺丝头与接收平台间距离为10～15cm，获得线性有序胶原纤维支架。

15.一种修复脊髓损伤的功能产品，其特征在于包含权利要求9-12中任一项所述的功能化神经再生胶原支架。