CN106279429A - 与胶原特异结合的基质细胞衍生因子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与胶原特异结合的基质细胞衍生因子(CBD‑SDF‑1α)及其应用。该CBD‑SDF‑1α主要由基质细胞衍化生长因子1α(SDF1α)与具有胶原特异结合能力的多肽融合表达形成，并具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还公开了该CBD‑SDF‑1α的编码基因、表达载体和转化体等。本发明的CBD‑SDF‑1α可以与胶原特异性结合并且缓慢释放，并具有与天然的SDF‑1α在趋化MSC及HSC迁移方面相近的生物学活性，能够作为MSC及HSC等表达CXCR4干细胞的特异性捕捉试剂，并可还可作为心肌梗死的高效治疗药物，此外还可以用于神经、骨头及皮肤等其它组织的修复或者构建不同的功能化生物活性支架材料并用于组织再生和修复。

Description

与胶原特异结合的基质细胞衍生因子及其应用

技术领域

本发明涉及一种基质细胞衍生因子，特别涉及一种与胶原特异结合的基质细胞衍生因子及其应用。

背景技术

心肌梗死是全球范围内死亡率极高的一种疾病，其发病主要是由于心脏动脉血管堵塞，导致心肌细胞因缺血缺氧而坏死，进而引起纤维化使心脏功能受损。心肌组织再生能力较弱，一旦发生坏死或凋亡很难修复，心脏功能受到不可逆转的损坏，严重影响病人的寿命和生活质量。目前临床上主要通过冠状动脉搭桥的救治方法，但是这种方法仅能缓解病人的痛苦，并不能使已经因缺血坏死的心肌组织重新再生，因此不能从根本上解决心脏功能受损的问题。

随着干细胞与再生医学的发展，干细胞治疗作为一种新的治疗方案，在许多疾病中发挥重要作用。干细胞是一种具有自我更新能力并且具有多向分化潜能的细胞群体，根据其分化潜能又可分为全能干细胞和多能干细胞。全能干细胞主要指胚胎干细胞，其可分化为全身各种类型的组织细胞甚至是完整的个体；而多能干细胞也是成体干细胞可定向分化为特定组织的几种功能细胞。随着对干细胞的深入研究发现，体内各种组织内都存在特异的组织干细胞，比如造血干细胞，间充质干细胞、神经干细胞以及心肌干细胞等，这些干细胞在维持组织再生及损伤后修复过程中发挥重要作用。在通常情况下，这些干细胞处于静息状态，一旦组织受损，在各种信号的刺激下，这些干细胞会立即活化并向受损组织迁移，通过分泌各种营养因子及分化为组织特异性的功能细胞来促进组织的修复。

对于一些再生能力较强的组织来说，其干细胞数量较多，一旦组织受损，可以尽快分化成功能细胞，替换坏死的细胞。但是像心肌、神经等再生能力较弱的组织，其组织内干细胞的数量较少，难以达到组织修复的目的。近年研究发现，通过移植外源性干细胞到受损的心肌组织，对心肌梗死的治疗有一定的效果。但是移植外源干细胞存在许多问题，主要包括外源干细胞移植到心肌梗死部位存活率较低、流失掉、感染以及免疫排斥等问题，并且外源干细胞难以分化成心肌细胞及与内源性心肌细胞形成功能连接。

因此，通过动员内源性干细胞向受损组织迁移及募集，可以避免移植外源干细胞带来的风险，提高干细胞的利用效率。SDF-1α是一种趋化因子，其特异性受体CXCR4是一种G蛋白偶联受体，表达于多种干细胞膜表面，如：造血干细胞(HSC)，间充质干细胞(MSC)、心肌干细胞及神经干细胞等成体干细胞。SDF-1α-CXCR4反应轴可以促进干细胞的迁移、增殖及具有抗凋亡的效应，并且SDF-1α会促进干细胞分泌多种生长因子如VEGF、EGF、FGF等，以及促进血管新生。

研究发现心肌以及神经等组织受损以后，SDF-1α的表达会上调，动员内源性干细胞向受损部位迁移，促进组织修复及血管再生。通过在受损组织内注射天然的SDF-1α，也可以提高干细胞向受损组织迁移的数量从而促进组织修复。但是，天然的SDF-1α在组织内受体液的冲刷很快会弥散掉，降低损伤部位的局部有效浓度从而降低其治疗效果；另外，弥散掉的SDF-1α会被迅速降解，对周围组织产生一定的副作用。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的主要目的在于提供一种与胶原特异结合的基质细胞衍生因子(如下简称CBD-SDF-1α)及其制备方法与应用。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

一种与胶原特异结合的基质细胞衍生因子，其包含基质细胞衍化生长因子1α(SDF1α)及具有胶原特异结合能力的多肽，并具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

该氨基酸序列具体如下：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMKPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNKGSAGSAAGSGGTKKTLRT。

编码所述与胶原特异结合的基质细胞衍生因子的多核苷酸。

进一步的，所述多核苷酸还具有SEQ ID NO：1所示的序列。

一种包含所述多核苷酸的表达载体。

进一步的，所述表达载体优选自但不限于pET28a载体。

在本说明书中，术语“表达载体”是能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白或靶RNA的载体。本发明的核苷酸序列可存在于载体中，其中该核苷酸序列可操作地连接至能够提供用于通过适合的宿主细胞表达该核苷酸序列的调节序列。在表达载体范畴中，术语“可操作地连接”意指感兴趣的核苷酸序列以允许核苷酸表达的方式连接至(一个或多个)调节序列。术语“调节序列(或调控序列)”意在包括启动子、增强子以及其它表达控制元件。与表达载体的这种可操作连接能够通过本领域中已知的常规基因重组技术实现。

用于本发明的表达载体可包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体等，但并不局限于此。用于本发明中的表达载体可包含用于膜靶向或分泌的信号序列或前导序列、以及调节序列如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷化信号、增强子等。启动子可以是组成性或诱导性启动子。而且，表达载体可包括一个或多个用于选择包含该表达载体的宿主细胞的可选择标记基因，并且可进一步包括使得该载体能够在所讨论的宿主细胞中进行复制的核苷酸序列。

一种包含所述表达载体的转化体。

进一步的，所述转化体包括大肠杆菌BL21，但不限于此。

一种生产与胶原特异结合的基质细胞衍生因子的方法，其包括：培养所述的转化体。

具体而言，本发明可以通过在适合的条件下在适合的介质中培养转化体，用于在引入到该转化体中的表达载体中表达所述CBD-SDF-1α而实施。通过培养转化体而表达重组蛋白的方法在本领域中已熟知，例如可以通过在适于转化体生长的介质(或培养基)中接种转化体(或转化株)、进行传代培养(subculture)、将其转移至主要培养基中、在适合的条件下培养，例如补充有基因表达诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，从而诱导重组蛋白表达而得以实施。在培养完成后，可以从培养液中获得“基本上纯的”重组蛋白。前述“基本上纯的”是指本发明的重组蛋白和编码其的多核苷酸在实施和使用它们的计划用途的程度上基本上没有在天然或体内系统中可以发现的其它物质。

如上获得的本发明的重组蛋白可以从宿主细胞内部或外部(例如，介质)分离，并纯化为基本上纯的同源性多肽。用于多肽分离和纯化的方法不局限于任何特定的方法。实际上，可以使用任何标准方法。例如，色谱(或层析)法、过滤器、超滤、盐析溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳、透析和结晶可以适当地进行选择和组合以分离和纯化多肽。关于色谱法，例如可以使用亲和性色谱、离子交换色谱、疏水性色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、吸附色谱等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1982；Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2d Ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989；Guide to Protein PurificationMethodsEnzymology vol.182.Academic Press.Inc.，San Diego，CA，1990)。

所述与胶原特异结合的基质细胞衍生因子于制备生物功能材料、细胞捕捉试剂、细胞检测试剂或药物中的应用。

所述与胶原特异结合的基质细胞衍生因子作为心机梗死治疗药物的用途。

一种细胞捕捉试剂，其包含所述的与胶原特异结合的基质细胞衍生因子。

一种细胞检测试剂，其包含所述的与胶原特异结合的基质细胞衍生因子。

所述的细胞，包括含有特异性受体CXCR4的各类细胞，特别是干细胞膜，例如造血干细胞(HSC)，间充质干细胞(MSC)、心肌干细胞及神经干细胞等成体干细胞。

一种生物工程组织材料，其包含所述的与胶原特异结合的基质细胞衍生因子。

所述生物工程组织材料包括生物组织修复材料，人工生物组织等等。

所述与胶原特异结合的基质细胞衍生因子在制备心机梗死治疗药物中的应用。

所述与胶原特异结合的基质细胞衍生因子在制备刺激血管再生的药物中的应用。

所述与胶原特异结合的基质细胞衍生因子在制备促进心脏组织修复的药物中的应用。

一种药物组合物，包含作为有效成分的所述与胶原特异结合的基质细胞衍生因子。

进一步的，所述药物组合物还可包含药学可接受的载体。

本说明书中所述的“药用载体”具有本领域人员熟知的含义，其可包括任何及所有的溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘结剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、类似物质及它们的组合。

本发明的药物组合物可以采用多种形式给药，例如可以通过注射给药，优选的，本发明的所述CBD-SDF-1α可配制在水溶液，特别是生理兼容性缓冲液或生理盐水缓冲液中。这些注射制剂可以通过常规方法利用一种或多种分散剂、润湿剂和悬浮剂进行配制。

本发明CBD-SDF-1α的总有效量能够以单一剂量给予患者或者通过分开的治疗方案进行给药，其中多个剂量在更长的一段时间内进行给药。尽管在本发明的药物组合物中CBD-SDF-1α的量可依赖于疾病的严重程度可变化。一般来说，本发明的药物组合物中重组蛋白的适合剂量可取决于多种因素，如患者的年龄、体重、健康状态、性别、疾病严重程度、饮食和排泄，以及给药途径和待给药的治疗数目。鉴于上述因素，本领域中的任何技术人员可确定作为药物有效成分的CBD-SDF-1α的有效剂量。

本发明通过基因工程的方法构建表达CBD(胶原结合域，Collagen-binding domain，一种来源于胶原酶的、可与胶原特异性结合的多肽)与SDF-1α融合蛋白的表达载体，并且在大肠杆菌中表达，由此所获CBD-SDF-1α在体外可以与胶原特异性结合并且缓慢释放，并具有与天然的SDF-1α在趋化MSC及HSC迁移方面相近的生物学活性，且在体外与胶原结合后，可以捕获更多的MSC及HSC。例如，在心肌梗死模型中，CBD-SDF-1α注射到心肌梗死部位后，可以特异性结合到心肌梗死部位并且缓慢释放，提高了其局部治疗浓度，避免了扩散导致的副作用，节省药物用量及费用；CBD-SDF-1α可以促进内源性干细胞向心肌梗死部位迁移、促进梗死区域血管再生及改善心肌梗死后的心脏功能。除此之外，本发明的CBD-SDF-1α还可以用于神经、骨头及皮肤等其它组织的修复，另外可以用于修饰不同的胶原支架材料或者构建不同的功能化生物活性支架材料。

附图说明

图1A是本发明一典型实施例中CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α的构建示意图，其中胶原结合区(collagen binding domain，CBD)通过一个linker连接融合到SDF-1α的C-末端。

图1B-图1C分别是本发明一典型实施例中采用Tricine-SDS-PAGE方法和Western blot方法对纯化获得的CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α的体外鉴定图。

图1D是本发明一典型实施例中CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α与胶原的结合曲线图。

图1E是本发明一典型实施例中CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α的解离曲线图。

图1F是本发明一典型实施例中CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α从胶原的缓释曲线图。

图2A-图2B分别是本发明一典型实施例中CBD-SDF-1α与NAT-SDF-1α趋化MSC和HSC迁移的生物活性比较图，图2A示出CBD-SDF-1α可以趋化MSC的迁移，其活性与NAT-SDF-1α无显著性差异，图2B示出CBD-SDF-1α可以趋化HSC的迁移，其活性与NAT-SDF-1α无显著性差异。

图3A-图3D分别是本发明一典型实施例中CBD-SDF-1α修饰胶原凝胶对MSC和HSC的粘附能力的荧光照片及统计分析图。

图4A-图4C分别是本发明一典型实施例中CBD-SDF-1α在心肌梗死区域结合并且缓慢释放的测视图，其中图4A及图4B(Western blot测试)显示，在注射3h和6h时，仍有大量的CBD-SDF-1α结合在心肌梗死部位,局部浓度较高；而NAT-SDF-1α在三小时时已经大量弥散掉，在6小时时几乎检测不到，图4C示出了在3h和6h检测各组血清中SDF-1α的浓度，可以发现NAT-SDF-1α组比CBD-SDF-1α组血清中SDF-1α的浓度高很多，说明NAT-SDF-1α注射到梗死区后因不能与胶原结合，迅速弥散掉并进入外周血。

图5A-图5B分别是本发明一典型实施例中CBD-SDF-1α可促进c-kit⁺的内源性干细胞向心肌梗死区域迁移的荧光测试图及统计图，其中图5A示出注射细胞因子4d后c-kit⁺干细胞的免疫荧光染色，可以发现CBD-SDF-1α组c-kit⁺干细胞数量比NAT-SDF-1α组多，说明CBD-SDF-1α与胶原结合并缓慢释放可增强内源性干细胞的募集效果，图5B显示CBD-SDF-1α募集的内源性干细胞的数量大约是NAT-SDF-1α组的两倍。

图6A-图6C是本发明一典型实施例中治疗后梗死区域的面积及心肌壁的厚度的Masson染色图及统计图，可以看出CBD-SDF-1α治疗组梗死区域纤维化程度明显减少，心肌壁的厚度有所增加。

图7A-图7B是本发明一典型实施例中梗死区域血管的再生清关的vWF免疫组化染色图及统计图，CBD-SDF-1α组比NAT-SDF-1α组微血管的数量要多，说明CBD-SDF-1α可以促进血管新生。

注：图1A-图1F中，^**P<0.01。

具体实施方式

本发明通过将可与胶原结合的特异性多肽和基质细胞衍生因子进行融合表达，获得了可与胶原特异性结合的基质细胞衍生因子(CBD-SDF-1α)，体外实验结果证明，CBD-SDF-1α可与胶原特异性结合并且缓慢释放；并且CBD-SDF-1α和天然的SDF-1α具有相同的生物学活性，可以趋化干细胞的迁移；例如，通过大鼠心肌梗死模型研究表明，CBD-SDF-1α可以与心肌梗死部位结合，并且缓慢释放，提高了损伤部位的SDF-1α浓度；CBD-SDF-1α可以促进内源性干细胞向心肌梗死部位迁移、改善梗死部位的纤维化状态、促进梗死部位血管再生以及改善心脏功能。

如下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1.CBD-SDF-1α在大肠杆菌中的高效表达及纯化

CBD-SDF-1α表达载体的构建、鉴定及转化

参阅图1A，从Genbank中查找获得人SDF-1α的成熟肽基因序列，从人成纤维细胞总mRNA中扩增获得SDF-1α成熟肽基因，通过PCR的方法将CBD序列及linker序列拼接到SDF-1α序列的C-末端，在引物中引入Nco Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，通过双酶切的方法将CBD-SDF-1α基因插入到pET28a载体中，连接产物转化DH5α大肠杆菌，涂布到含有卡那霉素(Kana)抗性的LB平板上，挑选阳性克隆，通过基因测序的方法鉴定阳性克隆，抽提质粒备用。将测序正确的质粒转化到表达菌株大肠杆菌BL21中，通过Kana抗性的LB平板筛选阳性克隆。挑选阳性克隆放到含Kana抗性的5ml LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中，以200rpm的转速培养12h后，加入终浓度为10％的甘油，-80℃冻存保种。

CBD-SDF-1α的表达及纯化

将表达CBD-SDF-1α的BL21表达菌种涂布到Kana抗性的LB平板上，挑选阳性克隆到Kana抗性的5ml LB液体培养中，在37℃的恒温摇床中以200rpm的转速培养12小时；然后将这5ml菌液转接到含kana抗性的200mL LB液体培养基的三角瓶中放大培养，以同样的温度和转速在恒温摇床中进行培养，待培养至菌液OD值达到0.6～0.8之间时，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，继续培养5h后，10000g、4℃离心10min收集菌体。用20mlPBS重选菌体，然后在冰上以150w的功率，超声20min破碎菌体，12000g、4℃离心20min收集包涵体。将包涵体重悬于20ml的包涵体洗涤液中(2M urea,20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,2％Triton-X 100，pH 8.0)，在相同的超声条件下超声5min,重复三次，充分洗涤包涵体。将洗净的包涵体溶解后，通过AKTA prime plus 5.0系统利用镍亲和层析柱(His-Trap affinitycolumns，GE)采用柱上复性的方法对进行纯化。纯化获得的目的蛋白通过Tricine-SDS-PAGE及Western blot的方法进行鉴定。洗脱的蛋白在PBS中充分透析后，通过超滤浓缩的方法进行浓缩(超滤膜分子量5kDa)，然后BCA试剂盒测定其浓度，0.22μm滤膜过滤除菌后分装冻存于-80℃；24小时后在冻干机中冻干过夜，冻干粉保存于-80℃。图1B-图1C中为冻干粉重新溶解后的CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α(同样方法制备的天然的SDF-1α)的电泳(图1B)及WB(图1C)鉴定图，可见获得了纯度较高的CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α。

实施例2CBD-SDF-1α体外活性的鉴定

CBD-SDF-1α与胶原特异性结合及缓慢释放

将浓度为100μg/mL的鼠尾胶原溶液加入到96孔中(100μL/孔)，置于4℃冰箱中过夜，弃去多余的胶原，将96孔板在超净台中晾干，用预冷的PBS洗三遍后备用。分别将不同浓度的NAT-SDF-1α和CBD-SDF-1α加入到96孔板中(100μL/孔)，37℃孵育2h,PBS洗3遍；加入mouse anti-polyhistine单克隆抗体(1:2000，abcam)，4℃孵育2h,然后用预冷的PBS洗三遍；加入HRP标记的anti-mouse IgG(1:10000，abcam),37℃孵育1h，PBS洗三遍。然后加入100μL TMB显色底物，反应30min,最后加入100μL的1M H₂SO₄，酶联仪450nm测吸光度。结果使用GraphPad Prism 5.0软件分析，绘制结合解离曲线(图1D，图1E)。NAT-SDF-1α和CBD-SDF-1α解离常数分别为：1.339mM和0.254μM，说明CBD-SDF-1α与胶原具有更强的结合能力。

按照结合实验的方法，先将NAT-SDF-1α和CBD-SDF-1α与胶原包被的96孔板进行结合反应，然后在96孔板中加入PBS(200μL/孔)，放在37℃培养箱中轻柔摇晃，每隔24h取样，然后再加入新的PBS，持续8天，用人SDF-1α试剂盒检测样品中SDF-1α的浓度，并且绘制释放曲线。从图1F中可以看到，NAT-SDF-1α会很快释放掉，而CBD-SDF-1α可以缓慢释放，到第8天滞留在胶原上的CBD-SDF-1α仍有56.1％，而NAT-SDF-1α仅剩10.1％，以上数据说明CBD-SDF-1α可以与胶原特异性结合并且缓慢释放。

CBD-SDF-1α对MSC及HSC的趋化迁移效应

通过Transwell(孔径为8μm)的方法检测CBD-SDF-1α对MSC及HSC的趋化迁移能力，将200μL细胞浓度为2×10⁴/mL的细胞悬液加入到transwell的上室中，在下室中加入含NAT-SDF-1α或CBD-SDF-1α终浓度为100ng/mL的基础培养基600μL，37℃，CO₂培养箱中静置5h，取出小室，用棉签擦去上室中的细胞，然后用4％多聚甲醛固定小室，结晶紫染色迁移的细胞，在正置显微镜下观察并计数迁移的细胞。从图2A-图2B可以看到，CBD-SDF-1α与NAT-SDF-1α在趋化MSC和HSC迁移方面具有相似的生物学活力，说明CBD-SDF-1α在增加胶原结合能力的同时，并未影响其趋化因子的生物学活性。

CBD-SDF-1α与胶原结合后对干细胞的捕捉作用

首先用胶原溶液包被24孔板，然后分别将浓度为100ug/mL的NAT-SDF-1α或CBD-SDF-1α溶液加入到24孔板中(200μL/孔)，37℃静置2h后，用PBS充分洗涤多余的蛋白，然后将细胞浓度为2×10⁴/mL的MSC或HSC细胞悬液加入到24孔板中，置于37℃，CO₂培养箱中轻轻摇晃1h,取出培养板，弃去培养基，PBS轻轻洗涤后用4％多聚甲醛固定，然后用DAPI标记粘附在24孔板中的细胞，荧光倒置显微镜观察并计数。从图3A-图3D可以看出，CBD-SDF-1α与捕获的MSC和HSC分别是NAT-SDF-1α的7.07倍(图3C)和13.29倍(图3D)，说明CBD-SDF-1α与胶原结合后可以捕获更多的MSC和HSC。

实施例3CBD-SDF-1α对心肌梗死的治疗作用

CBD-SDF-1α结合在心肌梗死部位并缓慢释放

首先，通过结扎SD大鼠冠状动脉左前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型，在结扎后30min分别将1.0nmol的NAT-SDF-1α或CBD-SDF-1α注射到心肌梗死边缘的5个位点；分别于注射后3h和6h用人SDF-1αELISA试剂盒检测大鼠血清中SDF-1α的浓度；同时取心肌梗死边缘的组织，提取蛋白，通过WB的方法检测结合在心肌梗死部位的SDF-1α，用anti-polyhistine抗体区别内源性SDF-1α与外源性SDF-1α。从图4A-图4B中可以看出，CBD-SDF-1α在心肌梗死部位的浓度较高，到血清中的量较少(图4C)，而NAT-SDF-1α在心肌梗死部位的浓度较低，血清中的量较高。这些数据表明，CBD-SDF-1α因具有胶原结合能力，可以很好的结合在心肌梗死部位，减少弥散，提高局部治疗浓度，达到了缓慢释放的效果。

CBD-SDF-1α募集内源性干细胞向心肌梗死部位迁移

在CBD-SDF-1α注射后4d，分离心肌梗死区域的心肌组织，用OCT包埋，进行冰冻切片，通过免疫荧光的方法检测内源性干细胞向心肌梗死部位的迁移情况。首先，冰冻切片与mouse anti-c-kit抗体(1:200，abcam)在4℃孵育过夜，PBS洗3遍，然后与FITC标记的Donkeyanti-mouse IgG(1:500,abcam)室温反应2h,PBS洗3遍，最后用DAPI标记细胞核，倒置荧光显微镜观察并计数。从图5A-图5B可以看出，CBD-SDF-1α比NAT-SDF-1α可以募集更多的c-kit阳性的内源性干细胞向心肌梗死部位迁移，大约NAT-SDF-1α组的2倍，这些干细胞在心肌再生过程中将发挥重要作用。

CBD-SDF-1α减少梗死部位纤维化程度及增加心室壁的厚度

术后90d，收取各组的心脏，根据结扎部位辨认心肌梗死部位，进行纵切，4％多聚甲醛固定24h后进行石蜡切片，然后进行Masson染色，对治疗后心肌梗死部位的纤维化程度及心肌壁的厚度进行分析。从图6A-图6C可以看出，CBD-SDF-1α治疗组疤痕组织的比例是18.7±4.62％，心肌壁的厚度是2.73±0.39mm，而NAT-SDF-1α治疗组疤痕组织的比例是31.83±6.75％，心肌壁的厚度是1.52±0.31mm,因此CBD-SDF-1α可以更好的促进心肌的修复，减少疤痕组织的形成，增加心肌壁的厚度。

CBD-SDF-1α促进梗死部位血管的再生

心肌组织及心肌细胞的长期存活，必须要有血管为其提供营养，因此又对上述石蜡切片进行vWF染色，检测治疗后梗死心肌组织的血管再生情况。从图7A-图7B可以发现CBD-SDF-1α组的微血管密度(275.61±18.25mm²)比NAT-SDF-1α组的微血管密度(183.28±20.36/mm²)要高，说明CBD-SDF-1α可以更有效的促进血管新生。

应当理解，在本说明书中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

又及，对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明技术方案和技术构思做出其它各种相应的改变和变形，而这些改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所

<120> 与胶原特异结合的基质细胞衍生因子及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atgaagcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc 120

agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta 180

gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag 240

gagtacctgg agaaagcttt aaacaagggt agcgcgggca gtgctgcggg ttctggcggt 300

actaagaaaa ccctgcgtac ttga 324

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His

20

Met Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala

40

Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val

60

Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln

80

Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Gly

100

Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr

107

Claims (17)

1.一种与胶原特异结合的基质细胞衍生因子，其特征在于包含基质细胞衍化生长因子1α (SDF1α)及具有胶原特异结合能力的多肽，并具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述与胶原特异结合的基质细胞衍生因子的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其具有SEQ ID NO：1所示的序列。

4.一种包含如权利要求2或3所述多核苷酸的表达载体。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于它包括pET28a载体。

6.一种包含权利要求4或5所述表达载体的转化体。

7.如权利要求6所述的转化体，其特征在于它包括大肠杆菌BL21。

8.一种生产与胶原特异结合的基质细胞衍生因子的方法，其特征在于包括培养权利要求4或5所述的转化体。

9.权利要求1所述的与胶原特异结合的基质细胞衍生因子于制备生物功能材料、细胞捕捉试剂、细胞检测试剂或药物中的应用。

10.如权利要求1所述的与胶原特异结合的基质细胞衍生因子在制备心机梗死治疗药物中的应用。

11.如权利要求1所述的与胶原特异结合的基质细胞衍生因子在制备刺激血管再生的药物中的应用。

12.如权利要求1所述的与胶原特异结合的基质细胞衍生因子在制备促进心脏组织修复的药物中的应用。

13.一种细胞捕捉试剂，其特征在于包含如权利要求1所述的与胶原特异结合的基质细胞衍生因子。

14.一种细胞检测试剂，其特征在于包含如权利要求1所述的与胶原特异结合的基质细胞衍生因子。

15.一种生物工程组织材料，其特征在于包含如权利要求1所述的与胶原特异结合的基质细胞衍生因子。

16.一种药物组合物，其特征在于包含作为有效成分的如权利要求1所述的与胶原特异结合的基质细胞衍生因子。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其特征在于还包含药学可接受的载体。