CN103333915B - 一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液，利用镶嵌于油体表面的油体蛋白与碱性成纤维细胞生长因子的融合表达产物可直接作为活性成分用于护肤品的开发，简化了生长因子与乳化剂（或保护剂）混合的加工工艺，降低了生产成本。同时可以保护碱性成纤维细胞生长因子蛋白的生物活性，将碱性成纤维细胞生长因子活性多肽利用油体蛋白的特性，通过植物油体包裹，定位在油体表面，通过乳化均质技术，可以使碱性成纤维细胞生长因子蛋白很均匀地分布在护肤乳液中，通过油体的透皮吸收作用，使其容易发挥作用。本发明工艺简单，功效显著，成本降低。

Description

一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液

技术领域

本发明属于生物技术和化妆品技术领域，尤其是涉及含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体及一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液。

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是人体中一种含量非常少的蛋白多肽，对人的生命活动具有非常重要的作用，在医疗方面也有巨大的作用。在19世纪40年代，Hoffman及其同事研究发现在垂体和脑中含有的物质能够刺激成纤维细胞的生长。1974年，Gospodarowiez等人首次从牛垂体中分离并纯化出该活性物质，由于它能够明显的促进成纤维细胞的分裂生长，故给其命名为成纤维细胞生长因子。

bFGF在临床方面的应用：

在人体的神经纤维、皮肤、软骨组织、和血管等细胞中含有丰富的bFGF受体，bFGF能够促进表皮细胞、神经元细胞等各种细胞的生长，具有非常广泛的临床应用前景。最早在国内用于临床的是bFGF生长因子，开始时是研究性的应用，直至90年代中期，bFGF被大规模的应用于临床。国内医院的bFGF临床试验结果，在国内和国外的专业杂志上都有刊登，80年代初，世界上一些先进的生物公司把bFGF批量生产，并投巨资研究开发bFGF治疗组织创伤、缺血性心脏病等多种疾病的方法，使bFGF更广泛的应用于临床。

在神经疾病中的应用 bFGF能够增加神经元的存活率、促使神经元轴突分支再生，增强突触传递，所以有保护神经的作用，并且能够影响神经疾病的发生。对此，人们一直想利用其来治疗一些脑疾病，但其可操作性具有一定的困难需要解决。利用bFGF治疗脑疾病时，将其直接注射到脑内不可行，为解决此问题，人们将含有bFGF的泡沫植入脑中，用于进行性神经退化症的治疗。虽然在血脑屏障中，大分子蛋白质不能通过，但是实验报道指出静脉注射bFGF可有效地减少神经元损伤。现在人们正在研究全身给药来治疗脑疾病，并取得了一定的效果。其次，如果人自身增强脑内源性bFGF表达和释放，就不需再直接给药治疗，人们正早研究一种可增强其自身表达量的方法。神经移植手术在神经疾病治疗中前景广阔，但是被移植的神经细胞的成活率不高，有报道称在神经细胞移植前，先用bFGF将其预处理可使其成活率升高。人们在利用bFGF来治疗脑疾病的研究已有一些进展，相信随着科学技术的不断进步，人们可以利用bFGF来治疗一般药物无法治愈的神经性疾病。

在软组织修复中的应用 在治疗烧烫伤时，bFGF能够促进形成肉芽组织 ，加快创面上皮化进程，明显缩短创伤皮肤的愈合时间。王世岭等研究证明：利用bFGF对烧烫伤病人进行治疗，可使伤口愈合时间提前4~5天，明显改善皮肤的愈合质量，使病患的痛苦减轻并无任何副作用。在中国，通过国家鉴定的hbFGF产品，大量的应用于化妆品和外用药。现阶段，临床上创面修复的难题是各种急、慢性溃疡，如糖尿病溃疡等。有研究报道bFGF处理由糖尿病引起的溃疡创口，能有效促进肉芽组织形成和血管生成，在新生组织不易形成疤痕，因为它没有引起细胞的过度增殖[70]。研究表明，bFGF可以在糖尿病条件下明显缩短胃溃疡的治愈时间，bFGF可以显著地缩短胃溃疡的治愈时间，并且不影响血糖浓度。

在皮肤病中的应用 大多的皮肤病伴有皮肤糜烂。表皮能够抵御病原体的感染，如果表皮脱落，暴露在外的真皮就容易受到病原体的感染。因此，皮肤病治疗的关键是加速表皮愈合，防止感染。董娜等研究，给白癜风患者配合bFGF辅助治疗效果明显优于仅是自体表皮移植的患者，这为治疗白癜风这一医学顽症提供了有效途径[71]。

在骨组织修复中的应用 bFGF是软骨细胞的形态发生因子和有丝分裂原，bFGF对如软骨组织具有相当重要的生理功能。在骨折时，骨愈合是关键的修复过程，它的实质是骨细胞的再生，是骨组织的再形成。Nagai等人利用小鼠做实验，发现给小鼠静脉注射bFGF能明显促进化骨形成。Nakamura等在股骨末端注入bFGF，发现注射点周围矿物质浓度明显升高，从而促进骨细胞增殖[72]。bFGF还能提高骨细胞中的骨钙素含量，能够有效的治疗骨折。

bFGF除用于医疗以外，还被大量的用于美容和整形，现在采用特殊的生产工艺，生产出来的bFGF产品在常温下能够保存一年而其生物活性不变。

bFGF在美容整形中的应用：

bFGF在美容中的作用可以表现在以下几个方面：1、护肤、修复作用。bFGF能够改善细胞生长的微环境，促进弹性纤维和胶原蛋白的合成，使肌肤富有弹性，使皮肤处于滑嫩的状态。2、抗皱、防衰老作用。能够促进成纤维细胞的生长发育，不断以新的细胞取代老化细胞，因此产生防皱、祛皱作用。3、美白、祛斑作用。更新衰老细胞，从而降低皮肤细胞中的黑色素和有色细胞的含量，减轻皮肤色素的沉着。4、防晒及晒后修复作用。能迅速修复受损细胞，减轻紫外线辐射对皮肤造成的伤害。5、防粉刺、祛疤痕作用。刺激皮肤肉芽组织的形成和促进肉芽组织的上皮化，还可调节胶原降解及更新，从而缩短创伤愈合时间以及减少疤痕形成的作用。

近年来，生物基因工程技术长足发展并且影响到了生命科学的方方面面，同时也给美容化妆品行业都带来了全新的发展机遇，化妆品已经从传统的化学美容、植物美容向生物美容与基因美容发展。例如，传统的皮肤护理仅局限于油膜覆盖与保持水分等物理方法，而现在美容护肤理念开始转向细胞水平的护理，因此含高亲和力的生物因子物质的化妆品应运而生。如今，国际上越来越多的医药及生物工程技术专家投身于该研究领域，许多国家也都瞄准生物化妆品这一巨大市场，开发生物美容产品。将以生物工程技术制得的生长因子、透明质酸和核酸等应用于化妆品，这一新的研究动态也使人们认识到生物化妆品将给化妆品品质带来根本性的变化。

生物化妆品是指应用生物工程技术及其制品制得的化妆品，其主要成分生物活性多肽大部分是细胞生长因子，它们在体内含量极微，但生物活性极高，对多种细胞生理功能和代谢活动发挥生物调节作用，直接或间接地影响多种类型细胞的生长、分裂、分化、增殖和迁移，在美容护肤、整形外科、烧伤溃疡以及各种皮肤病的伤口修复与愈合中有重要作用。细胞生长因子经过稳定的结构修饰或特殊的的保护处理后，以一定的有效浓度添加到化妆品中，可以有效的与皮肤细胞发生作用，促进上皮细胞营养代谢，保护皮肤，预防由于各种原因导致的皮肤损伤。正常护肤品种添加活性细胞生长因子还可以有效促进皮下胶原细胞的功能，加速皮肤胶原细胞的生长，使细胞加速分泌胶原，从而达到抗皱及延缓衰老的作用。

发明内容

本发明目的是提供植物油体特异表达载体pOBT-bFGF。

一种表达载体质粒pOBT-bFGF，它是由下述方法制备的：

1）以p1301为基本骨架，将其T-DNA区进行改造，除了保留有T-DNA区的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替换，以pEGAD质粒为模板，利用35S-F上游引物cggggtaccAtccgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctact和Bar-R下游引物cggaattcactagttcagatctcggtgacgggcaggaccggacggggcggaacc进行PCR，扩增得到35S-Bar基因，利用kpnI和SpeI酶切位点将其插入到pCAMBIA1301载体T-DNA区的NOS基因前，构建了p1301-35S-Bar-NOS基本质粒，简写为pO质粒；

2）用pstI和NcoI分别酶切并连接pO质粒和序列表SEQ ID NO.2所示基因，得中间载体pOB；

3）用HindⅢ和kpnI分别酶切并连接中间载体pOB和序列表SEQ ID NO.3所示基因，得植物特异表达载体pOBT；

4）用NcoI与HindⅢ分别酶切并连接植物特异表达载体pOBT和序列表SEQ ID NO.5所示基因，得表达载体质粒pOBT-bFGF。

本发明的另一个目的是提供一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体。

一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体，它是将其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示的基因插入植物表达载体中，获得的表达载体质粒，转化至油料作物中，收获种子提取油体；

所述的表达载体质粒为表达载体质粒pOBT-bFGF；

所述的油料作物为拟南芥。

本发明的又一目的是提供一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液及其制备方法。

一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的护肤乳液，它是由下述组份的重量百分比组成：5%-25%红花油体，10%甘油，10%-25%羧乙基纤维素，1.5%-6%PEG600，0.05%-0.5%防腐剂，1%-10%含有碱性成纤维细胞生长因子蛋白的拟南芥油体和5%-20%维生素C，余量为去离子水；

优选为： 10%红花油体，10%甘油，10%羧乙基纤维素，3% PEG600，0.25%防腐剂， 4%含有碱性成纤维细胞生长因子蛋白的拟南芥油体，5%维生素C；

所述的防腐剂为尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液。

一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液的制备方法，包括以下步骤：按上述配比，首先将将水加入到红花油体中，混合均匀；然后逐级加入甘油和乳化剂羧乙基纤维素，偶合剂PEG600，搅拌均匀，高剪切在1000rpm-30000rpm下乳化，在均质机中乳化10-20min；搅拌均匀后再加入防腐剂、一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体和维生素C，搅拌均匀。

本发明是利用镶嵌于油体表面的油体蛋白与碱性成纤维细胞生长因子的融合表达产物可直接作为活性成分用于护肤品的开发，简化了生长因子与乳化剂（或保护剂）混合的加工工艺，降低了生产成本。同时可以保护碱性成纤维细胞生长因子蛋白的生物活性，将碱性成纤维细胞生长因子活性多肽利用油体蛋白的特性，通过植物油体包裹，定位在油体表面，通过乳化均质技术，可以使碱性成纤维细胞生长因子蛋白很均匀地分布在护肤乳液中，通过油体的透皮吸收作用，使其容易发挥作用。本发明工艺简单，功效显著，成本降低。

附图说明

图1  油体表达碱性成纤维细胞生长因子bFGF基因的载体示意图；

图2  红花油体显微图；

图3  含有碱性成纤维细胞生长因子bFGF蛋白的拟南芥油体的直观图；

图4  含有碱性成纤维细胞生长因子bFGF蛋白的拟南芥油体的活性检测；

图5  含有bFGF植物油体的乳液直观图。

具体实施方式

实施例1  碱性成纤维细胞生长因子基因的合成

根据植物密码子的偏好性对从GENBANK中找到的碱性成纤维细胞生长因子bFGF的核苷酸序列进行改造，将植物中含量较少的稀有氨基酸密码子替换成植物偏好的密码子。根据密码子的简并性消除在本实验中所用到的酶切位点，送去上海生工生物工程有限公司进行人工合成重组碱性成纤维细胞生长因子基因（SEQ ID NO.1）。

实施例2：克隆菜豆种子特异启动子与终止子

克隆菜豆启动子和终止子基因，为了从菜豆基因组序列中克隆种子特异启动子与终止子，利用引物，采用标准的多聚酶链式反应（PCR），从菜豆基因组DNA中扩增得到1548bp和1220bp的DNA片段，扩增的片段经限制性内切酶消化，克隆到pUC57克隆载体中，保存备用。经测序，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

菜豆启动子引物

Primer5F:  GAATTCATTGTACTCCCAG

Primer5R：AGTAGAGTAGTATTGAATATGAG

菜豆终止子引物

tem5F: AATAAGTATGAACTAAAATGC

tem5R: TTAGTTGGTAGGGTGCTAGGAA

实施例3：构建植物特异表达载体pOBT

将pUC57-菜豆启动子的克隆载体用限制性内切酶pstI和NcoI消化，回收目的片段菜豆启动子序列，同时用pstI和NcoI消化基本质粒pO（以p1301为基本骨架，将其T-DNA区进行改造，除了保留有T-DNA区的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替换，以pEGAD质粒为模板，利用35S-F上游引物47bp cggggtaccAtccgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtctact和Bar-R下游引物54bp cggaattcactagttcagatctcggtgacgggcaggaccggacggggcggaacc进行PCR，扩增得到35S-Bar基因，利用kpnI和SpeI酶切位点将其插入到pCAMBIA1301载体T-DNA区的NOS基因前，构建了p1301-35S-Bar-NOS基本质粒，简写为pO质粒），将菜豆启动子（用来启动油体蛋白与碱性成纤维细胞生长因子的融合基因）与基本质粒pO连接，转化大肠杆菌，获得pOB中间载体；将pUC57-终止子的克隆载体用HindIII和kpnI消化，回收目的片段菜豆终止子，同时用这两个酶消化pOB中间载体，将终止子与酶切后的pOB载体连接，转化大肠杆菌，获得植物特异表达载体pOBT。

实施例4：拟南芥油体蛋白基因的克隆

取拟南芥种子，提取DNA基因组，用引物：

1：CCATGGCGGATACAGCTAGAGG

2：CACCGGGTGGAGTAGTGTGCTGG

进行扩增拟南芥油体蛋白基因，经测序，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示；扩增的片段经限制性内切酶（NcoI酶和EcoRI酶）消化，克隆到pUC57克隆载体中，保存备用。

实施例5：构建含有拟南芥油体蛋白与碱性成纤维细胞生长因子融合基因的植物油体特异表达载体pOBT-bFGF

以克隆得到的拟南芥油体蛋白基因和重组碱性成纤维细胞生长因子基因为模板，设计融合基因引物，通过融合PCR技术，获得oleosin-bFGF融合基因，经测序，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示。将融合基因用限制性内切酶NcoI与HindIII进行酶切，同时用这两个酶对pOBT载体进行酶切，然后将融合基因与酶切后的pOBT载体连接，转化大肠杆菌，产生pOBT-bFGF植物油体表达载体。

拟南芥油体蛋白与碱性成纤维细胞生长因子融合基因引物

1：CCATGGCGGATACAGCTAGAGG

2：AAGCTGGCATAGTAGTGTG

3：GCACACTACTATGCCAGCTT

4：CCAAGCTTAAGACTTAGCAGACA

实施例6：Flora dip方法进行的遗传转化

首先，侵染前一天将野生型拟南芥和亚麻芥植株浇水浇透；将农杆菌工程菌株接种至50ml含有三抗（100 μg/ml Rif、50 μg/ml Str和50 μg/ml Kan)的YEP液体培养基中，进行预培养（180rpm/min，28℃）；取预培养的农杆菌7ml加入到含有三抗的YEP液体培养基中，进行扩大培养，直至OD5900=1.0~1.2；把农杆菌菌液移到离心管中，20℃，4000rpm离心20min，收集菌体，去除三抗培养基。用Floral-Dip Buffer重悬菌体，使其OD590达到0.8~0.9。转化前剪掉种荚、开花和露白的花芽。在钵体四周插上适当高度的竹签，以便支撑倒过来进行侵染的钵体。将拟南芥的茎部和叶片基部浸入重悬的农杆菌菌液中，静置7分钟，然后吸弃过多的菌液。平放转化后的钵体，用塑料薄膜等保湿过夜，第二天可稍露一小缝，第三天正常放置。一周后可进行第二次侵染。待种子成熟后，可隔天采摘发黄成熟的荚，收获种子。

实施例7：筛选表达量高的转基因株系

转基因株系在温室或大田经生长与发育，然后开花结籽，形成转基因T1代种子，当T1代种子收获后，每株转基因植株取200-1000mg，在提取液中抽提油体蛋白与碱性成纤维细胞生长因子的融合蛋白，经酶联免疫技术检测重组碱性成纤维细胞生长因子的表达量，筛选出高表达的转基因株系，高表达的株系表达量达到105.4ng/ml。

实施例8：含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的油体制备

从含有碱性成纤维细胞生长因子蛋白的转基因油料作物种子中提取含有碱性成纤维细胞生长因子蛋白的油体，保存备用，具体方法如下：（1）取0.1mg转基因种子， 放入研钵中，加入1ml PBS，用研棒充分研磨。直至溶液变浑浊，看不见种粒。放入离心机10000rpm ，4℃，离心10min； （2）离心后溶液分为三层，即表层为白色油状层，中间层液体，和底层沉淀。将上层油体部分和液体部分混合均匀，全部吸出，注意不要吸出底层沉淀，将吸出的液体转移至另一离心管中，加PBS，离心10000rpm，4℃，10min，重复1、2步骤，3~4次。（3）将重复1、2步骤离心后吸出的液体加500μl的PBS混匀，在离心机中4℃， 10000rpm，离心10min。（4）此时离心后分为两层，为上层油脂部分和下层液体部分，将下层液体吸出，弃掉。再重复3、4步骤，3~4次。

实施例9 油体中碱性成纤维细胞生长因子蛋白的含量测定

转基因株系在温室或大田经生长与发育，然后开花结籽，形成转基因T1代种子，当T1代种子收获后，每株转基因植株取200-1000mg，在提取液中抽提油体蛋白与碱性成纤维细胞生长因子蛋白的融合蛋白，采用ELISA法，按照ELISA试剂盒（长春百金生物科技有限公司）说明书操作，检测油体中碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达量，经计算，拟南芥油体中碱性成纤维细胞生长因子的表达量为105.4ng/ml。

实施例10油体中碱性成纤维细胞生长因子蛋白的活性检测

1、收集对数期细胞NIH3T3细胞使用细胞计数板计数，96孔平底板中每孔加入100ul细胞液，细胞数为6000个左右。

2.、37℃，5%CO2培养24h，置显微镜下观察细胞单层铺满孔底。此时，轻倒出96孔板中的完全培养基，每孔加入100ul的饥饿培养基。

3.、5%CO2，37℃培养24小时，设7个梯度加药，每孔100ul，设2个复孔。同时使用纯品蛋白bFGF作为阳性对照，野生型拟南芥种子油体作为阴性对照。

4、5%CO2，37℃培养48小时，每孔加25ul浓度为0.5%的MTT溶液，

5、5%CO2，37℃继续培养4h后终止培养，弃培养液。

6、每孔加入120ulDMSO，低速振荡10min，紫色结晶充分溶解后用酶联免疫检测仪在570nm波长下测定。结果见图4。

实施例11  红花油体的提取

（1）取200~1000mg野生型红花种子， 放入研钵中，加入1ml Buffer A，用研棒充分研磨。直至溶液变浑浊，看不见种粒。放入离心机12000rpm ，4℃，离心30min；

（2）离心后溶液分为三层，即表层为白色油状层，中间层液体，和底层沉淀。将上层油体部分和液体部分混合均匀，全部吸出，注意不要吸出底层沉淀，将吸出的液体转移至另一离心管中，加BufferB，离心18000rpm，4℃，10min，重复1、2步骤，3~4次。

（3）将重复1、2步骤离心后吸出的液体加500μl的Buffer C混匀，在离心机中4℃， 18000rpm，离心10min。

（4）此时离心后分为两层，为上层油脂部分和下层液体部分，将下层液体吸出，弃掉。再重复3、4步骤，3~4次。

Buffer A：0.6M Sucrose，0.5M NaCl，0.05M Tris-HCl(pH=7.0)；

Buffer B：0.4M Sucrose，0.5M NaCl，0.05M Tris-HCl(pH=7.0)；

Buffer C：20 mM Na₂HPO₄，20 mM NaCl(pH=7.0)。

实施例12  护肤乳液配方筛选

一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的护肤乳液，由以下重量份的原料制成：5%-25%保湿剂（红花油体），10%甘油，10%-25%乳化剂（羧乙基纤维素），1.5%-6%偶合剂（PEG600），0.05%-0.5%防腐剂（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液），1%-10%营养添加剂（含有碱性成纤维细胞生长因子蛋白的拟南芥油体）和5%-20%维生素C，适量香精，其余为去离子水，本发明设计了正交实验，通过稳定性实验和活性检测，确定出最佳的乳液配方为10%油性原料（红花油体），10%甘油，10%乳化剂（羧乙基纤维素），3%偶合剂（PEG600），0.25%防腐剂（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液），0.5%香精，4%营养添加剂（含有碱性成纤维细胞生长因子蛋白的拟南芥油体），5%维生素C。

实施例13  护肤乳液制备方法

  本发明制备一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽护肤乳液的制备方法，包括以下步骤进行制备：首先将植物油体提取出来，然后将水加入到油体中，混合均匀；然后逐级加入甘油和乳化剂羧乙基纤维素，偶合剂PEG600，搅拌均匀，高剪切在1000rpm-30000rpm下乳化，在均质机中乳化10-20min；最后，搅拌均匀后再加入防腐剂尼泊金甲酯和尼泊金丙酯的混合液和营养添加剂含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体和维生素C以及藏红花香精，搅拌均匀后即成本发明品。

实施例14  护肤乳液稳定性实验

（1）在40℃ 电热恒温培养箱中放置30-50天，恢复室温后观察，并没有分层现象，稳定性良好；

（2）24小时之内，在 0℃-50℃ 之 间来回频繁变化,如此反复操作15-30天，恢复室温后观察，没有分层现象，稳定性良好；

（3）在-5℃ 冰箱和40℃ 的电热恒温培养箱中各放1天，如此反复操作5-7天，恢复室温后观察，没有出现分层现象，稳定性良好；

（4）在40℃的电热恒温培养箱中放置5-7天，然后在0℃-5℃ 冰箱中放置5-7天，接下来再放入40℃-50℃ 的电热恒温培养箱中放置30天，恢复室温后观察，稳定性良好。

通过上述实验观察，油性原料10%，甘油10%，乳化剂10%，偶合剂3%，防腐剂0.25%，香精0.5%，营养添加剂4%，维生素C5%，这一乳液配方的稳定性较好。

实施例15 含有碱性成纤维细胞生长因子油体的护肤乳液功效

首先对护肤乳液进行抗氧化功效检测，选用邻苯三酚法检测对超氧阴离子自由基的清除作用，结晶紫法检测对轻自由基的清除作用，DPH法检测对总自由基的清除作用。

然后对美白功效进行检测，采用酪氨酸酶抑制法，取4支试管分别编号为C 1、C2、T1、T2，按照表1的顺序在各管中加入相应的试剂，C1、T1 在加入酪氨酸酶之前先放入37℃水浴锅内10min，然后再加入酪氨酸酶, 然后将C1、C2、T1、T2共同放入共同放入37 ℃水浴锅内10min，取出分别测定C1、C2、T1、T2各管在475nm处的吸光度值，做三次平行。见表1

采用上述这种方法测定以下不同配方的护肤品的超氧阴离子自由基的清除率、羟自由基清除率、总自由基清除率、酪氨酸酶抑制率。

组成1（本发明）：油性原料（红花油体）10%，甘油10%，乳化剂（羧乙基纤维素）10%，偶合剂（PEG600）3%，防腐剂（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液）0.25%，香精（藏红花香精）0.5%，营养添加剂（含有421.6ng碱性成纤维细胞生长因子蛋白的拟南芥油体）4%，维生素C5%；

组成2：油性原料（红花油体）10%，甘油10%，乳化剂（羧乙基纤维素）10%，偶合剂（PEG600）3%，防腐剂（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液）0.25%，香精（藏红花香精）0.5%，维生素C5%；

组成3：油性原料（甘油）20%，乳化剂（羧乙基纤维素）10%，偶合剂（PEG600）3%，防腐剂（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液）0.25%，香精（藏红花香精）0.5%，营养添加剂（含有421.6ng碱性成纤维细胞生长因子蛋白的拟南芥油体）4%，维生素C5%；

组成4：油性原料（甘油）20%，乳化剂（羧乙基纤维素）10%，偶合剂（PEG600）3%，防腐剂（尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液）0.25%，香精（藏红花香精）0.5%，营养添加剂（421.6ngbFGF冻干粉），维生素C5%；

比较这四种组成配方的护肤品对超氧阴离子自由基的清除率、羟自由基清除率、总自由基清除率、酪氨酸酶抑制率，结果见表2。

实施例16 含有碱性成纤维细胞生长因子油体护肤品的透皮吸收速率

先将磁搅拌子放在接受池内，再将制备的离体鼠皮平放在接受池上端，角质层面向上，然后将释放池用夹子固定于接受池上。取检测药品0.2ml均匀涂抹在皮肤角质层上，用注射器通过取样管接受液注入接受池，排净空气，使皮肤另一面与接受液紧密接触。将低频电磁复合脉冲仪的电极固定于仪器组和促透组的鼠皮表面。定速搅拌，分别于1、2、4、8、16h抽取接受液1.0ml，再补加1.0ml新鲜接受液。实验中所用扩散池的容积为7.0ml，取样量为1.0ml，渗透面积为2.92cm²，根据测得的透皮接受液中各组成配方的油体含量和bFGF含量，依照下列公式计算累计渗透量（Q）：

<110> 吉林农业大学

 

<120>一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液

 

<160>  1    

 

<210>  1

<211>  444

<212>  DNA

<213>  人工

 

<400>  1

atgccagctt tgccagagga tggaggatct ggagctttcc caccaggaca tttcaaggac    60

ccaaagagat tgtactgcaa gaacggagga ttcttcttga gaatccatcc agatggaaga   120

gttgatggag ttagagagaa gtctgatcca catattaagt tgcaattgca agctgaggag   180

agaggagttg tttctattaa gggagtttgc gctaacagat acttggctat gaaggaggat   240

ggaagattgt tggcttctaa gtgcgttact gatgagtgct tcttcttcga gagattggag   300

tctaacaact acaacactta cagatcaaga aagtacactt cttggtacgt tgctttgaag   360

agaactggac aatacaagtt gggatctaag actggaccag gacaaaaggc tattttgttc   420

ttgccaatgt ctgctaagtc ttaa                                          444

 

 

<210>  2

<211>  1548

<212>  DNA

<213>  人工

 

<400>  2

 

 

gaattcattg tactcccagt atcattatag tgaaagtttt ggctctctcg ccggtggttt    60

tttacctcta tttaaagggg ttttccacct aaaaattctg gtatcattct cactttactt   120

gttactttaa tttctcataa tctttggttg aaattatcac gcttccgcac acgatatccc   180

tacaaattta ttatttgtta aacattttca aaccgcataa aattttatga agtcccgtct   240

atctttaatg tagtctaaca ttttcatatt gaaatatata atttacttaa ttttagcgtt   300

ggtagaaagc ataatgattt attcttattc ttcttcatat aaatgtttaa tatacaatat   360

aaacaaattc tttaccttaa gaaggatttc ccattttata ttttaaaaat atatttatca   420

aatatttttc aaccacgtaa atctcataat aataagttgt ttcaaaagta ataaaattta   480

actccataat ttttttattc gactgatctt aaagcaacac ccagtgacac aactagccat   540

ttttttcttt gaataaaaaa atccaattat cattgtattt tttttataca atgaaaattt   600

caccaaacaa tcatttgtgg tatttctgaa gcaagtcatg ttatgcaaaa ttctataatt   660

cccatttgac actacggaag taactgaaga tctgctttta catgcgagac acatcttcta   720

aagtaatttt aataatagtt actatattca agatttcata tatcaaatac tcaatattac   780

ttctaaaaaa ttaattagat ataattaaaa tattactttt ttaattttaa gtttaattgt   840

tgaatttgtg actattgatt tattattcta ctatgtttaa attgttttat agatagttta   900

aagtaaatat aagtaatgta gtagagtgtt agagtgttac cctaaaccat aaactataag   960

atttatggtg gactaatttt catatatttc ttattgcttt taccttttct tggtatgtaa  1020

gtccgtaact ggaattactg tgggttgcca tggcactctg tggtcttttg gttcatgcat  1080

ggatgcttgc gcaagaaaaa gacaaagaac aaagaaaaaa gacaaaacag agagacaaaa  1140

cgcaatcaca caaccaactc aaattagtca ctggctgatc aagatcgccg cgtccatgta  1200

tgtctaaatg ccatgcaaag caacacgtgc ttaacatgca ctttaaatgg ctcacccatc  1260

tcaacccaca cacaaacaca ttgccttttt cttcatcatc accacaacca cctgtatata  1320

ttcattctct tccgccacct caatttcttc acttcaacac acgtcaacct gcatatgcgt  1380

gtcatcccat gcccaaatct ccatgcatgt tccaaccacc ttctctctta tataatacct  1440

ataaatacct ctaatatcac tcacttcttt catcatccat ccatccagag tactactact  1500

ctactactat aataccccaa cccaactcat attcaatact actctact               1548

 

<210>  3

<211>  1220

<212>  DNA

<213>  人工

 

<400>  3

 

aataagtatg aactaaaatg catgtaggtg taagagctca tggagagcat ggaatattgt    60

atccgaccat gtaacagtat aataactgag ctccatctca cttcttctat gaataaacaa   120

aggatgttat gatatattaa cactctatct atgcacctta ttgttctatg ataaatttcc   180

tcttattatt ataaatcatc tgaatcgtga cggcttatgg aatgcttcaa atagtacaaa   240

aacaaatgtg tactataaga ctttctaaac aattctaact ttagcattgt gaacgagaca   300

taagtgttaa gaagacataa caattataat ggaagaagtt tgtctccatt tatatattat   360

atattaccca cttatgtatt atattaggat gttaaggaga cataacaatt ataaagagag   420

aagtttgtat ccatttatat attatatact acccatttat atattatact tatccactta   480

tttaatgtct ttataaggtt tgatccatga tatttctaat attttagttg atatgtatat   540

gaaagggtac tatttgaact ctcttactct gtataaaggt tggatcatcc ttaaagtggg   600

tctatttaat tttattgctt cttacagata aaaaaaaaat tatgagttgg tttgataaaa   660

tattgaagga tttaaaataa taataaataa taaataacat ataatatatg tatataaatt   720

tattataata taacatttat ctataaaaaa gtaaatattg tcataaatct atacaatcgt   780

ttagccttgc tggacgactc tcaattattt aaacgagagt aaacatattt gactttttgg   840

ttatttaaca aattattatt taacactata tgaaattttt tttttttatc ggcaaggaaa   900

taaaattaaa ttaggaggga caatggtgtg tcccaatcct tatacaacca acttccacag   960

gaaggtcagg tcggggacaa caaaaaaaca ggcaagggaa attttttaat ttgggttgtc  1020

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aataaaatga gacacttcag ggatgtttca acccttatac aaaaccccaa aaacaagttt  1200

cctagcaccc taccaactaa                                              1220

 

 

<210>  4

<211>  762

<212>  DNA

<213>  人工

 

<400>  4

 

atggcggata cagctagagg aacccatcac gatatcatcg gcagagacca gtacccgatg    60

atgggccgag accgagacca gtaccagatg tccggacgag gatctgacta ctccaagtct   120

aggcagattg ctaaagctgc aactgctgtc acagctggtg gttccctcct tgttctctcc   180

agccttaccc ttgttggaac tgtcatagct ttgactgttg caacacctct gctcgttatc   240

ttcagcccaa tccttgtccc ggctctcatc acagttgcac tcctcatcac cggttttctt   300

tcctctggag ggtttggcat tgccgctata accgttttct cttggattta caagtaagca   360

cacatttatc atcttacttc ataattttgt gcaatatgtg catgcatgtg ttgagccagt   420

agctttggat caattttttt ggtcgaataa caaatgtaac aataagaaat tgcaaattct   480

agggaacatt tggttaacta aatacgaaat ttgacctagc tagcttgaat gtgtctgtgt   540

atatcatcta tataggtaaa atgcttggta tgatacctat tgattgtgaa taggtacgca   600

acgggagagc acccacaggg atcagacaag ttggacagtg caaggatgaa gttgggaagc   660

aaagctcagg atctgaaaga cagagctcag tactacggac agcaacatac tggtggggaa   720

catgaccgtg accgtactcg tggtggccag cacactactt aa                      762

 

<210>  5

<211>  1203

<212>  DNA

<213>  人工

 

<400>  5

 

atggcggata cagctagagg aacccatcac gatatcatcg gcagagacca gtacccgatg    60

atgggccgag accgagacca gtaccagatg tccggacgag gatctgacta ctccaagtct   120

aggcagattg ctaaagctgc aactgctgtc acagctggtg gttccctcct tgttctctcc   180

agccttaccc ttgttggaac tgtcatagct ttgactgttg caacacctct gctcgttatc   240

ttcagcccaa tccttgtccc ggctctcatc acagttgcac tcctcatcac cggttttctt   300

tcctctggag ggtttggcat tgccgctata accgttttct cttggattta caagtaagca   360

cacatttatc atcttacttc ataattttgt gcaatatgtg catgcatgtg ttgagccagt   420

agctttggat caattttttt ggtcgaataa caaatgtaac aataagaaat tgcaaattct   480

agggaacatt tggttaacta aatacgaaat ttgacctagc tagcttgaat gtgtctgtgt   540

atatcatcta tataggtaaa atgcttggta tgatacctat tgattgtgaa taggtacgca   600

acgggagagc acccacaggg atcagacaag ttggacagtg caaggatgaa gttgggaagc   660

aaagctcagg atctgaaaga cagagctcag tactacggac agcaacatac tggtggggaa   720

catgaccgtg accgtactcg tggtggccag cacactacta tgccagcttt gccagaggat   780

ggaggatctg gagctttccc accaggacat ttcaaggacc caaagagatt gtactgcaag   840

aacggaggat tcttcttgag aatccatcca gatggaagag ttgatggagt tagagagaag   900

tctgatccac atattaagtt gcaattgcaa gctgaggaga gaggagttgt ttctattaag   960

ggagtttgcg ctaacagata cttggctatg aaggaggatg gaagattgtt ggcttctaag  1020

tgcgttactg atgagtgctt cttcttcgag agattggagt ctaacaacta caacacttac  1080

agatcaagaa agtacacttc ttggtacgtt gctttgaaga gaactggaca atacaagttg  1140

ggatctaaga ctggaccagg acaaaaggct attttgttct tgccaatgtc tgctaagtct  1200

taa                                                                1203

Claims (7)

1.一种表达载体质粒pOBT-bFGF，它是由下述方法制备的：

1）以p1301为基本骨架，将其T-DNA区进行改造，除了保留有T-DNA区的NOS基因外其余基因均被35S和Bar基因替换，以pEGAD质粒为模板，利用35S-F上游引物CGGGGTACCATCCGTCAACATGGTGGAGCACGACACGCTTGTCTACT和Bar-R下游引物CGGAATTCACTAGTTCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACCGGACGGGGCGGAACC进行PCR，扩增得到35S-Bar基因，利用kpnI和SpeI酶切位点将其插入到pCAMBIA1301载体T-DNA区的NOS基因前，构建了p1301-35S-Bar-NOS基本质粒，简写为pO质粒；

2）用pstI和NcoI分别酶切并连接pO质粒和序列表SEQ ID NO.2所示基因，得中间载体pOB；

3）用HindⅢ和kpnI分别酶切并连接中间载体pOB和序列表SEQ ID NO.3所示基因，得植物特异表达载体pOBT；

4）用NcoI与HindⅢ分别酶切并连接植物特异表达载体pOBT和序列表SEQ ID NO.5所示基因，得表达载体质粒pOBT-bFGF。

2.一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体，它是将权利要求1所述的一种表达载体质粒pOBT-bFGF转化至油料作物中，收获种子提取油体。

3.根据权利要求2所述的一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体，其特征在于：所述的油料作物为拟南芥。

4.一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的护肤乳液，它是由下述组份的重量百分比组成：5%-25%红花油体，10%甘油，10%-25%羧乙基纤维素，1.5%-6%PEG600，0.05%-0.5%防腐剂，1%-10%含有碱性成纤维细胞生长因子蛋白的拟南芥油体和5%-20%维生素C，余量为去离子水；所述的含有碱性成纤维细胞生长因子蛋白的拟南芥油体为权利要求3所述的一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体。

5.根据权利要求4所述的一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的护肤乳液，其特征在于： 10%红花油体，10%甘油，10%羧乙基纤维素，3% PEG600，0.25%防腐剂， 4%含有碱性成纤维细胞生长因子蛋白的拟南芥油体，5%维生素C。

6.根据权利要求4或5所述的一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的护肤乳液，其特征在于：所述的防腐剂为尼泊金甲酯和尼泊金丙酯混合液。

7.一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液的制备方法，包括以下步骤：按权利要求4所述的一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的护肤乳液配比，首先将水加入到红花油体中，混合均匀；然后逐级加入甘油和乳化剂羧乙基纤维素，偶合剂PEG600，搅拌均匀，高剪切在1000rpm-30000rpm下乳化，在均质机中乳化10-20min；搅拌均匀后再加入防腐剂、一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体和维生素C，搅拌均匀。