CN102061296A - 一种溶水性vi人胶原蛋白多肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法。将VI人胶原蛋白多肽编码基因连入克隆载体，转化大肠肝菌，构建工程菌，诱导工程菌表达VI人胶原蛋白多肽，分别建立工程菌发酵和目的蛋白纯化工艺。经过蛋白质电泳分析和活性鉴定后，表明VI型人胶原蛋白多肽分子量为46kDa，可溶于上清，具有良好的水溶性，以单体或多聚物形式存在；在体外能保护细胞免受紫外线伤害，消炎及滋润保湿作用。本发明实现了规模制备一种溶水性VI人胶原蛋白多肽的基因工程制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法，具体涉及通过基因工程制备一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的方法。
背景技术
胶原蛋白是结缔组织结构中极其重要的蛋白。在人体中主要存在于皮肤、骨、软骨、牙齿、肌键、韧带和血管中，由于胶原蛋白固有的生物相容性、生物可降解性以及促进细胞生长等功能，使其在医药、美容、化妆品、食品等领域的用途不断拓大。
当前生产胶原蛋白主要的方法是利用酸、碱水解法从动物结缔组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮等)中提取，而且提取过程中易丧失部分生物活性，提取的产品成份也非常复杂，也有很多病毒隐患，从而极大地限制了胶原蛋白在医药等诸多领域的广泛应用。科学家们曾想法从人胎盘中获取胶原蛋白，但是，该研究受到世界人权组织及FDA的阻止。其次，利用化学法合成的胶原蛋白往往不具有生物活性结构，并且技术较为复杂，成本较高。
为了能充分利用胶原蛋白的优良性能，并避免动物源的病毒高风险，诸多学者利用基因工程技术，选用各种宿主细胞，如转基因鼠、昆虫、转基因蚕、转基因烟草、大肠杆菌、酵母等生产重组人胶原蛋白，其胶原蛋白产品具有安全性好、重现性好、质量稳定等优点，解决了传统提取方法存在的如疯牛病阮病毒隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排斥性等。可见利用基因工程技术生产重组胶原蛋白是近几年来该方面的热点研究领域。
目前人胶原蛋白的生产主要集中在I型、II型、III型和IV型，对于VI型胶原蛋白报道仅限于其结构和性质等方面的研究。VI型胶原蛋白是Chung等于1976年从人大动脉的胃蛋白酶水解物中首次发现，其显著特征是分子量大，半胱氨酸含量高[1]。有研究表明，VI型胶原蛋白的mRNA水平在皮肤的松弛成纤维细胞系中表达量会提高，VI型胶原蛋白可能与皮肤松弛的变化有关[2]。Furuto和Miller从胎盘组织中分离了VI型胶原蛋白并对其结构进行了初步描述[3]。目前，VI型人胶原蛋白的的生产未见有报道，胎盘组织方法由于病原微生物的易感染及低提取率和原料的不易获得大大限制了胶原蛋白的大规模制备。(参考文献[1].将挺大，张春萍。胶原蛋白【M】北京：化学工业出版社，2001[2].AtsushiHatamochi，Masami Arakawa，Kenichi Mori，Yasuji Mori，Hiroaki Ueki，Hidekatsu Yoshiokab.Increased expression of type VI collagen genesin cutis laxa fibroblasts.Journal of Dermatological Science 11(1996)97-103[3]王荣春，徐德昌，胶原蛋白与VI型胶原蛋白的结构概述，生物信息学2004，4，30-34)
发明内容
为了解决VI型人胶原蛋白现有制备技术存在的问题，本发明旨在提供一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法，采用基因工程技术制备溶水性VI型人胶原蛋白多肽，包括将溶水性VI型人胶原蛋白多肽编码基因连入表达载体；重组表达载体转染大肠杆菌宿主细胞构建工程菌；诱导工程菌表达含有VI型人胶原多肽的蛋白产物；分别建立大肠肝菌工程菌发酵及目的蛋白纯化工艺。
本发明通过如下方法实现：
I.以含有人COLVIA2 mRNA基因序列的质粒pCMV-SPORT6为模板，应用PCR克隆出溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因
(1)从含有质粒pCMV-SPORT6的大肠杆菌中制备质粒DNA：遵循Omega公司的质粒提取试剂盒的说明书来提取制备。
(2)根据基因库编号BC065509.1的人类胶原蛋白VIA2型全长mRNA序列，设计带酶切位点ECORI，SalI的上下游引物如下：
P1 COL6A2ECORI为5’atcGAATTCGGCAACAAAGGAGCCAAG3’
P2 COL6A2SalI为5’atcGTCGACGTTCTTGACAGCCTCCTT3’
PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃再延伸7min。
PCR反应体系为：5×PS buffer 10μL；dNTP 2μL，其中，dATP、dGTP、dTTP、dCTP的浓度均为2.5mM；P1 1μL，其浓度为10μM；P2 1μL，其浓度为10μM；Taq DNA polymerase 2U；COLVIA2 mRNA200ng；加水至反应总体积为50μL。
其中，Taq DNA Polymerase简称Taq酶，是TAKARA的DNA聚合酶；dNTP为三磷酸脱氧核糖核苷，包括dATP，dGTP，dTTP，dCTP；
所用试剂为TAKARA的DNA Polymerase试剂盒里的试剂。
经PCR获得目的基因，用1.2％(g/mL)浓度的琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离，利用DNA凝胶回收试剂盒纯化后得到溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因。
上述含有人COLVIA2 mRNA氨基酸序列的质粒pCMV-SPORT6为-80℃条件下保存；
克隆得到的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因序列如下：
GGCAACAAAGGAGCCAAGGGAGACCGAGGCTTGCCTGGACCCAGAGGCCCCCAGGGAGCTCTTGGGGAGCCCGGAAAGCAGGGATCTCGGGGAGACCCCGGTGATGCAGGACCCCGTGGAGACTCAGGACAGCCAGGCCCCAAGGGAGACCCCGGCAGGCCTGGATTCAGCTACCCAGGACCCCGAGGAGCACCCGGAGAAAAAGGCGAGCCCGGCCCACGCGGCCCCGAGGGAGGCCGAGGCGACTTTGGCTTGAAAGGAGAACCTGGGAGGAAAGGAGAGAAAGGAGAGCCTGCGGATCCTGGTCCCCCTGGTGAGCCAGGCCCTCGGGGGCCAAGAGGAGTCCCAGGACCCGAGGGTGAGCCCGGCCCCCCTGGAGACCCCGGTCTCACGGAGTGTGACGTCATGACCTACGTGAGGGAGACCTGCGGGTGCTGCGACTGTGAGAAGCGCTGTGGCGCCCTGGACGTGGTCTTCGTCATCGACAGCTCCGAGAGCATTGGGTACACCAACTTCACACTGGAGAAGAACTTCGTCATCAACGTGGTCAACAGGCTGGGTGCCATCGCTAAGGACCCCAAGTCCGAGACAGGGACGCGTGTGGGCGTGGTGCAGTACAGCCACGAGGGCACCTTTGAGGCCATCCAGCTGGACGACGAACGTATCGACTCCCTGTCGAGCTTCAAGGAGGCTGTCAAGAAC
II.将克隆得到的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因经过ECORI和SalI限制性酶处理后并连入表达质粒pET-32a，获得重组载体
(1)用Omega公司的质粒提取试剂盒抽提质粒载体pET-32a，用限性内切酶ECORI和SalI分别对纯化好的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因和质粒载体pET-32a进行双酶切。
溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因双酶切反应体系是：溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因30μL，10×PS buffer 5μL，ECORI2.5μL，SalI 2.5μL，ddH2O 10μL，总体积50μL，37℃酶切5h。
质粒载体双酶切反应体系是：pET-32a 30μL，10×PS buffer5μL，ECORI 2.5μL，SalI 2.5μL，ddH2O 10μL，总体积50μL，37℃酶切5h。
反应结束，用Omega纯化试剂盒纯化酶切产物，分别用20mL的ddH2O回溶。
(2)将克隆得到的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因与质粒pET-32a连接，用TAKARA的E.coli DNA Ligase连接酶在16℃水浴中反应1至3h，得到重组载体。
III.将重组载体质粒转入到大肠杆菌宿主菌中筛选阳性克隆和测序鉴定
将重组载体转化到大肠杆菌DH5α感受态，转化方法如下：将重组载体15μL加入到大肠杆菌DH5α感受态菌μL中，混匀，冰浴30min；然后42℃热休克90s，再迅速转移至冰上2min，然后升温至37℃；将反应菌液涂在含有氨苄抗生素的LB固体培养基上，恒温37℃条件下培养8小时；挑选阳性克隆至含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃，200rmp过夜培养；然后提取质粒，送测序公司进行测序，测序结果分析显示，插入片段的氨基酸序列与Genebank上收录的COLVIA2 mRNA氨基酸序列完全一致。
IV.转染大肠杆菌宿主细胞后诱导表达和分析
取测序后正确的重组质粒转染大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含有氨苄的LB固体培养基中37℃培养8h，随机挑取单菌落转至氨苄的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6～0.7时，加异丙基硫代β-半乳糖苷至终浓度为1mmol/L，28℃下诱导7h后收集菌液进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明在相对分子量46kDa处有明显特异性条带，与预期的VI型人胶原蛋白多肽相对分子量相符，并且该蛋白为水溶性蛋白。
VI型人胶原蛋白多肽序列如下：
GNK GAK GDR GLP GPR GPQ GAL GEP GKQ GSR GDP GDA GPR GDS GQP GPK
GDP GRP GFS YPG PRG APG EKG EPG PRG PEG GRG DFG LKG EPG RKG EKG
EPA DPG PPG EPG PRG PRG VPG PEG EPG PPG DPG LTE CDV MTY VRE TCG
CCG SEV SPV PPD DPA TPP DCE KRC GAL DVV FVI DSS ESI GYT NFT LEK
NFV INV VNR LGA IAK DPK SET GTR VGV VQY SHE GTF EAI QLD DER IDS
LSS FKE AVK N
所述的VI型人胶原蛋白多肽，其分子量为46kDa，氨基酸组成为250个，线性多肽单链。
V.重组表达载体转染大肠杆菌宿主细胞后得到工程菌，工程菌的培养基和培养条件
培养基成份为：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH6.5-7.0。
培养条件：培养温度37℃，pH 6.8，转速为150r/min，接种量为每100mL的LB液体培养基接种4mL菌液，氨苄青霉素(ampicillin)100μg/mL，培养至OD600为0.6～0.7时，加异丙基硫代β-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，28℃条件下诱导7h后收集菌液。
VI.水溶性VI型人胶原蛋白多肽的纯化条件
(1)把步骤V收集的菌液，按每100mL培养基所得菌体加入4mL缓冲液，缓冲液与培养基的体积比为1∶25，重悬于冰浴预冷的1×结合缓冲液，将重悬菌液进行超声波破碎。
(2)在13000r/min条件下，4℃离心20分钟，上清为澄清的细胞粗提物。蛋白电泳显示VI型人胶原多肽的蛋白溶于上清液中，该粗提物经镍柱亲和层析，然后冷冻干燥，收集水溶性VI型人胶原蛋白多肽。
纯化所用的缓冲液为Novagen公司Ni-NTA缓冲液试剂盒(Ni-NTABuffer Kit)提供。
VII.用免疫印迹法分析纯化的可溶性VI型人胶原蛋白多肽的特异性
取纯化后的可溶性VI型人胶原蛋白多肽，进行Western-blotting检测，结果如图4，在46KDa处左右出现一条蛋白染色带，证明VI型人胶原蛋白多肽得到表达，且具有良好的特异性和免疫反应性。
有益效果：本发明将VI型人胶原蛋白多肽编码基因连入克隆载体，转化大肠肝菌，构建工程菌，诱导工程菌表达VI型人胶原蛋白多肽，分别建立工程菌发酵和目的蛋白纯化工艺。经过蛋白质电泳分析和活性鉴定后，表明VI型人胶原蛋白多肽可溶于上清，具有良好的水溶性；VI型人胶原蛋白多肽分子量为46KD，以单体或多聚物形式存在；在体外能保护细胞免受紫外线伤害。
附图说明
图1为本发明的目的基因的电泳图，M为marker；1为目的基因。
图2重组原核表达质粒pET32a-COL6A2的构建示意图。
图3为实施例的VI型人胶原蛋白多肽的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。图中：M-蛋白质marker；1-空白对照；2-诱导总液；3-诱导上清；4-诱导沉淀；5诱导上清；6-诱导沉淀。
图4为实施例的VI型人胶原蛋白多肽的免疫印迹试验(Western-Blotting)图，特异性条带即为目的蛋白。
具体实施方式
实施例1一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法：
I.以含有人COLVIA2 mRNA基因序列的质粒pCMV-SPORT6为模板，应用PCR克隆出溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因
(1)从含有质粒pCMV-SPORT6的大肠杆菌中制备质粒DNA：遵循Omega公司的质粒提取试剂盒的说明书来提取制备；
(2)根据基因库(Genebank)编号BC065509.1的人类胶原蛋白VIA2型(Human Collagen type VIA2 AccessionNumber：BC065509.1)全长mRNA序列，设计带酶切位点ECORI，SalI的上下游引物如下：
COL6A2ECORI为5’atcGAATTCGGCAACAAAGGAGCCAAG3’
COL6A2SalI为5’atcGTCGACGTTCTTGACAGCCTCCTT3’
PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃再延伸7min。
PCR反应体系为：5×PS buffer 10μL；dNTP 2μL，其中，dATP，dGTP，dTTP，dCTP的浓度均为2.5mM；P11μL，其浓度均为10μM；P21μL，其浓度均为10μM)；Taq DNA polymerase 2U；COLVIA2 mRNA 200ng；加水至反应总体积为50μL。
其中，Taq DNA Polymerase简称Taq酶，是TAKARA的DNA聚合酶；
dNTP为三磷酸脱氧核糖核苷，包括dATP，dGTP，dTTP，dCTP；
所用试剂为TAKARA的DNA Polymerase试剂盒里的试剂。
经PCR获得目的基因，用1.2％(g/mL)浓度的琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离(如图1)，利用DNA凝胶回收试剂盒纯化后得到溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因。
上述含有人COLVIA2 mRNA氨基酸序列的质粒pCMV-SPORT6为-80℃条件下保存；
克隆得到的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因序列如下：
GGCAACAAAGGAGCCAAGGGAGACCGAGGCTTGCCTGGACCCAGAGGCCCCCAGGGAGCTCTTGGGGAGCCCGGAAAGCAGGGATCTCGGGGAGACCCCGGTGATGCAGGACCCCGTGGAGACTCAGGACAGCCAGGCCCCAAGGGAGACCCCGGCAGGCCTGGATTCAGCTACCCAGGACCCCGAGGAGCACCCGGAGAAAAAGGCGAGCCCGGCCCACGCGGCCCCGAGGGAGGCCGAGGCGACTTTGGCTTGAAAGGAGAACCTGGGAGGAAAGGAGAGAAAGGAGAGCCTGCGGATCCTGGTCCCCCTGGTGAGCCAGGCCCTCGGGGGCCAAGAGGAGTCCCAGGACCCGAGGGTGAGCCCGGCCCCCCTGGAGACCCCGGTCTCACGGAGTGTGACGTCATGACCTACGTGAGGGAGACCTGCGGGTGCTGCGACTGTGAGAAGCGCTGTGGCGCCCTGGACGTGGTCTTCGTCATCGACAGCTCCGAGAGCATTGGGTACACCAACTTCACACTGGAGAAGAACTTCGTCATCAACGTGGTCAACAGGCTGGGTGCCATCGCTAAGGACCCCAAGTCCGAGACAGGGACGCGTGTGGGCGTGGTGCAGTACAGCCACGAGGGCACCTTTGAGGCCATCCAGCTGGACGACGAACGTATCGACTCCCTGTCGAGCTTCAAGGAGGCTGTCAAGAAC
II.将克隆得到的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因经过ECORI和SalI限制性酶处理后并连入表达质粒pET-32a，获得重组载体(如图2)
(1)用Omega公司的质粒提取试剂盒抽提质粒载体pET-32a，用限性内切酶ECORI和SalI分别对纯化好的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因和质粒载体pET-32a进行双酶切。
溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因双酶切反应体系是：溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因30μL，10×PS buffer 5μL，ECORI2.5μL，SalI 2.5μL，ddH2O 10μL，总体积50μL，37℃酶切5h。
质粒载体双酶切反应体系是：pET-32a 30μL，10×PS buffer5μL，ECORI 2.5μL，SalI 2.5μL，ddH2O 10μL，总体积50μL，37℃酶切5h。
反应结束，用Omega纯化试剂盒纯化酶切产物，分别用20mL的ddH2O回溶。
(2)将克隆得到的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因与质粒pET-32a连接，用TAKARA的E.coli DNA Ligase连接酶在16℃水浴中反应1h，得到重组载体。
III.将重组载体质粒转入到大肠杆菌宿主菌中筛选阳性克隆和测序鉴定；
将重组载体转化到大肠杆菌DH5α感受态，转化方法如下：将重组载体15μL加入至密度为1X105/ml的大肠杆菌DH5α感受态菌100μL中，混匀，冰浴30min；然后42℃热休克90s，再迅速转移至冰上2min，然后升温至37℃；将反应菌液涂在含有氨苄抗生素的LB固体培养基上，恒温37℃培养8小时；挑选阳性克隆至含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃，200rmp过夜培养，提取质粒，送测序公司进行测序，测序结果分析显示，插入片段的氨基酸序列与Genebank上收录的COLVIA2mRNA氨基酸序列完全一致。
IV.转染大肠杆菌宿主细胞后诱导表达和分析
取测序后的重组质粒转染大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含有氨苄的LB固体培养基中，37℃培养8小时，随机挑取单菌落转至含有氨苄的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6～0.7时，加异丙基硫代β-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，28℃诱导7h后收集菌液进行SDS-PAGE电泳分析(SDS-PAGE为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)(如图3)，结果表明在相对分子量46kDa处均有明显特异性条带，与预期的VI型人胶原蛋白多肽相对分子量相符，并且该蛋白为水溶性蛋白。
VI型人胶原蛋白多肽序列如下：
GNK GAK GDR GLP GPR GPQ GAL GEP GKQ GSR GDP GDA GPR GDS GQP GPK
GDP GRP GFS YPG PRG APG EKG EPG PRG PEG GRG DFG LKG EPG RKG EKG
EPA DPG PPG EPG PRG PRG VPG PEG EPG PPG DPG LTE CDV MTY VRE TCG
CCG SEV SPV PPD DPA TPP DCE KRC GAL DVV FVI DSS ESI GYT NFT LEK
NFV INV VNR LGA IAK DPK SET GTR VGV VQY SHE GTF EAI QLD DER IDS
LSS FKE AVK N
VI型人胶原蛋白多肽分子量为46kDa，氨基酸组成为250个，线性多肽单链。
V.重组表达载体转染大肠杆菌宿主细胞后得到工程菌，工程菌的培养基和培养条件
培养基成份为：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH6.5-7.0。
培养条件：培养温度37℃，pH 6.8，转速为150r/min，接种量为每100mL的LB液体培养基接种4mL菌液，氨苄青霉素(ampicillin)100μg/mL，培养至OD600为0.6～0.7时，加异丙基硫代β-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，28℃条件下诱导7h后收集菌液。
VI.水溶性VI型人胶原蛋白多肽的纯化条件
(1)把步骤V收集的菌液，按每100mL培养基所得菌体加入4mL缓冲液，缓冲液与培养基的体积比为1∶25，重悬于冰浴预冷的1×结合缓冲液，将重悬菌液进行超声波破碎。
(2)在13000r/min条件下，4℃离心20分钟，上清为澄清的细胞粗提物。蛋白电泳显示型人胶原多肽的蛋白溶于上清液中，该粗提物经镍柱亲和层析，然后冷冻干燥，收集水溶性VI型人胶原蛋白多肽。
纯化所用的缓冲液为Novagen公司Ni-NTA缓冲液试剂盒(Ni-NTABuffer Kit)提供。
VII.用免疫印迹法分析纯化的可溶性VI型人胶原蛋白多肽的特异性
取纯化后的可溶性VI型人胶原蛋白多肽，进行Western-blotting检测，结果如图4，在46KDa处左右出现一条蛋白染色带，证明VI型人胶原蛋白多肽得到表达，且具有良好的特异性和免疫反应性。
用MTT法检测纯化的VI型人胶原蛋白多肽对人胚皮肤成纤维细胞(HSF)的细胞增殖的影响。
取对数生长期的人胚皮肤成纤维细胞(HSF)，胰酶消化后，制备细胞悬浮液调整浓度为2×105/mL，每孔200μL加入到96孔培养板中，在37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时，吸弃每孔的培养上清液，用D-Hanks液清洗两遍，并在其中加入100μL的D-Hanks液，将其置于UVA紫外光源下照射，照射剂量为8J/cm2；照射结束立即吸弃D-Hanks液，加入新鲜的DMEM完全培养基，并在孔中加入2μL，4μL，6μL，8μL不同剂量的VI型人胶原蛋白多肽(CW)，每个实验组设3个重复孔，将96孔培养板置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后，进行MTT实验，在酶标仪490nm处测定光密度值OD，观测细胞增殖变化结果见表1。
表1 mtt实验结果
实验组 OD1 OD2 OD3 OD平均值
空白 0.671 0.683 0.651 0.668333333
照射UVB 0.478 0.465 0.419 0.454
2μl的CW 0.474 0.457 0.436 0.455666667
4μl的CW 0.481 0.509 0.477 0.489
6μl的CW 0.524 0.566 0.508 0.532666667
8μl的CW 0.58 0.608 0.591 0.593
结果显示，VI型人胶原蛋白多肽(CW)能促进UVA照射的人胚皮肤成纤维细胞(HSF)的增殖，减轻对细胞增殖活性的损伤，剂量越大作用越强。
实施例2一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法，所述的步骤II的(2)将溶水性VI型人胶原蛋白目的基因与质粒pET-32a连接，用TAKARA的E.coli DNA Ligase连接酶在16℃水浴中反应2h，得到重组载体；其余的步骤和条件同实施例1。
实施例3一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法，所述的步骤II的(2)将溶水性VI型人胶原蛋白目的基因与质粒pET-32a连接，用TAKARA的E.coli DNA Ligase连接酶在16℃水浴中反应3h，得到重组载体；其余的步骤和条件同实施例1。
实施例4一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法，所述的步骤所述的步骤VI的(2)在13000r/min条件下，4℃离心30分钟；其余的步骤和条件同实施例1。
溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因序列表
溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因序列如下：
GGCAACAAAGGAGCCAAGGGAGACCGAGGCTTGCCTG
GACCCAGAGGCCCCCAGGGAGCTCTTGGGGAGCCCGG
AAAGCAGGGATCTCGGGGAGACCCCGGTGATGCAGGAC
CCCGTGGAGACTCAGGACAGCCAGGCCCCAAGGGAGA
CCCCGGCAGGCCTGGATTCAGCTACCCAGGACCCCGAG
GAGCACCCGGAGAAAAAGGCGAGCCCGGCCCACGCG
GCCCCGAGGGAGGCCGAGGCGACTTTGGCTTGAAAGGA
GAACCTGGGAGGAAAGGAGAGAAAGGAGAGCCTGCGG
ATCCTGGTCCCCCTGGTGAGCCAGGCCCTCGGGGGCCA
AGAGGAGTCCCAGGACCCGAGGGTGAGCCCGGCCCCC
CTGGAGACCCCGGTCTCACGGAGTGTGACGTCATGACCTA
CGTGAGGGAGACCTGCGGGTGCTGCGACTGTGAGAAGC
GCTGTGGCGCCCTGGACGTGGTCTTCGTCATCGACAGCTC
CGAGAGCATTGGGTACACCAACTTCACACTGGAGAAGAA
CTTCGTCATCAACGTGGTCAACAGGCTGGGTGCCATCGCTA
AGGACCCCAAGTCCGAGACAGGGACGCGTGTGGGCGT
GGTGCAGTACAGCCACGAGGGCACCTTTGAGGCCATCCA
GCTGGACGACGAACGTATCGACTCCCTGTCGAGCTTCAAG
GAGGCTGTCAAGAAC
VI型人胶原蛋白多肽序列表
VI型人胶原蛋白多肽序列如下：
GNK GAK GDR GLP GPR GPQ GAL GEP GKQ GSR GDP GDA
GPR GDS GQP GPK GDP GRP GFS YPG PRG APG EKG EPG
PRG PEG GRG DFG LKG EPG RKG EKG EPA DPG PPG EPG
PRG PRG VPG PEG EPG PPG DPG LTE CDV MTY VRE TCG CCG
SEV SPV PPD DPA TPP DCE KRC GAL DVV FVI DSS ESI GYT NFT
LEK NFV INV VNR LGA IAK DPK SET GTR VGV VQY SHE GTF EAI
QLD DER IDS LSS FKE AVK N
Claims (4)
1.一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤和条件如下：
I.以含有人COLVIA2 mRNA基因序列的质粒pCMV-SPORT6为模板，应用PCR克隆出溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因
(1)从含有质粒pCMV-SPORT6的大肠杆菌中制备质粒DNA：遵循Omega公司的质粒提取试剂盒的说明书来提取制备；
(2)根据基因库编号BC065509.1的人类胶原蛋白VIA2型全长mRNA序列，设计带酶切位点ECORI，SalI的上下游引物如下：
P1 COL6A2ECORI为5’atcGAATTCGGCAACAAAGGAGCCAAG3’
P2 COL6A2SalI为5’atcGTCGACGTTCTTGACAGCCTCCTT3’
PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃再延伸7min；
PCR反应体系为：5×PS buffer 10μL；dNTP 2μL，其中，dATP、dGTP、dTTP、dCTP的浓度均为2.5mM；P1 1μL，其浓度为10μM；P2 1μL，其浓度为10μM；Taq DNA polymerase 2U；COLVIA2 mRNA200ng；加水至反应总体积为50μL；
其中，Taq DNA Polymerase简称Taq酶，是TAKARA的DNA聚合酶；dNTP为三磷酸脱氧核糖核苷，包括dATP，dGTP，dTTP，dCTP；
所用试剂为TAKARA的DNA Polymerase试剂盒里的试剂；
经PCR获得目的基因，用1.2％(g/mL)浓度的琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离，利用DNA凝胶回收试剂盒纯化后得到溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因；
上述含有人COLVIA2 mRNA氨基酸序列的质粒pCMV-SPORT6为-80℃条件下保存；
克隆得到的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因序列如下：
GGCAACAAAGGAGCCAAGGGAGACCGAGGCTTGCCTGGACCCAGAGGCCCCCAGGGAGCTCTTGGGGAGCCCGGAAAGCAGGGATCTCGGGGAGACCCCGGTGATGCAGGACCCCGTGGAGACTCAGGACAGCCAGGCCCCAAGGGAGACCCCGGCAGGCCTGGATTCAGCTACCCAGGACCCCGAGGAGCACCCGGAGAAAAAGGCGAGCCCGGCCCACGCGGCCCCGAGGGAGGCCGAGGCGACTTTGGCTTGAAAGGAGAACCTGGGAGGAAAGGAGAGAAAGGAGAGCCTGCGGATCCTGGTCCCCCTGGTGAGCCAGGCCCTCGGGGGCCAAGAGGAGTCCCAGGACCCGAGGGTGAGCCCGGCCCCCCTGGAGACCCCGGTCTCACGGAGTGTGACGTCATGACCTACGTGAGGGAGACCTGCGGGTGCTGCGACTGTGAGAAGCGCTGTGGCGCCCTGGACGTGGTCTTCGTCATCGACAGCTCCGAGAGCATTGGGTACACCAACTTCACACTGGAGAAGAACTTCGTCATCAACGTGGTCAACAGGCTGGGTGCCATCGCTAAGGACCCCAAGTCCGAGACAGGGACGCGTGTGGGCGTGGTGCAGTACAGCCACGAGGGCACCTTTGAGGCCATCCAGCTGGACGACGAACGTATCGACTCCCTGTCGAGCTTCAAGGAGGCTGTCAAGAAC
II.将克隆得到的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因经过ECORI和SalI限制性酶处理后并连入表达质粒pET-32a，获得重组载体
(1)用Omega公司的质粒提取试剂盒抽提质粒载体pET-32a，用限性内切酶ECORI和SalI分别对纯化好的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因和质粒载体pET-32a进行双酶切；
溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因双酶切反应体系是：溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因30μL，10×PS buffer 5μL，ECORI2.5μL，SalI 2.5μL，ddH2O 10μL，总体积50μL，37℃酶切5h；
质粒载体双酶切反应体系是：pET-32a 30μL，10×PS buffer5μL，ECORI 2.5μL，SalI 2.5μL，ddH2O 10μL，总体积50μL，37℃酶切5h；
反应结束，用Omega纯化试剂盒纯化酶切产物，分别用20mL的ddH2O回溶；
(2)将克隆得到的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因与质粒pET-32a连接，用TAKARA的E.coli DNA Ligase连接酶在16℃水浴中反应1至3h，得到重组载体；
III.将重组载体质粒转入到大肠杆菌宿主菌中筛选阳性克隆和测序鉴定
将重组载体转化到大肠杆菌DH5α感受态，转化方法如下：将重组载体15μL加入到大肠杆菌DH5α感受态菌μL中，混匀，冰浴30min；然后42℃热休克90s，再迅速转移至冰上2min，然后升温至37℃；将反应菌液涂在含有氨苄抗生素的LB固体培养基上，恒温37℃条件下培养8小时；挑选阳性克隆至含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃，200rmp过夜培养；然后提取质粒，送测序公司进行测序，测序结果分析显示，插入片段的氨基酸序列与Genebank上收录的COLVIA2 mRNA氨基酸序列完全一致；
IV.转染大肠杆菌宿主细胞后诱导表达和分析
取测序后正确的重组质粒转染大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含有氨苄的LB固体培养基中37℃培养8h，随机挑取单菌落转至氨苄的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6～0.7时，加异丙基硫代β-半乳糖苷至终浓度为1mmol/L，28℃下诱导7h后收集菌液进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明在相对分子量46kDa处有明显特异性条带，与预期的VI型人胶原蛋白多肽相对分子量相符，并且该蛋白为水溶性蛋白；
VI型人胶原蛋白多肽序列如下：
GNK GAK GDR GLP GPR GPQ GAL GEP GKQ GSR GDP GDA GPR GDS GQP GPK
GDP GRP GFS YPG PRG APG EKG EPG PRG PEG GRG DFG LKG EPG RKG EKG
EPA DPG PPG EPG PRG PRG VPG PEG EPG PPG DPG LTE CDV MTY VRE TCG
CCG SEV SPV PPD DPA TPP DCE KRC GAL DVV FVI DSS ESI GYT NFT LEK
NFV INV VNR LGA IAK DPK SET GTR VGV VQY SHE GTF EAI QLD DER IDS
LSS FKE AVK N
所述的VI型人胶原蛋白多肽，其分子量为46kDa，氨基酸组成为250个，线性多肽单链；
V.重组表达载体转染大肠杆菌宿主细胞后得到工程菌，工程菌的培养基和培养条件
培养基成份为：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH6.5-7.0；
培养条件：培养温度37℃，pH 6.8，转速为150r/min，接种量为每100mL的LB液体培养基接种4mL菌液，氨苄青霉素100μg/mL，培养至OD600为0.6～0.7时，加异丙基硫代β-半乳糖苷至终浓度为1mmol/L，28℃条件下诱导7h后收集菌液；
VI.水溶性VI型人胶原蛋白多肽的纯化条件
(1)把步骤V收集的菌液，按每100mL培养基所得菌体加入4mL缓冲液，缓冲液与培养基的体积比为1∶25，重悬于冰浴预冷的1×结合缓冲液，将重悬菌液进行超声波破碎；
(2)在13000r/min条件下，4℃离心20分钟，上清为澄清的细胞粗提物，蛋白电泳显示VI型人胶原多肽的蛋白溶于上清液中，该粗提物经镍柱亲和层析，然后冷冻干燥，收集水溶性VI型人胶原蛋白多肽；
纯化所用的缓冲液为Novagen公司Ni-NTA缓冲液试剂盒(Ni-NTABuffer Kit)提供；
VII.用免疫印迹法分析纯化的可溶性VI型人胶原蛋白多肽的特异性
取纯化后的可溶性VI型人胶原蛋白多肽，进行Western-blotting检测，在46KDa处左右出现一条蛋白染色带，证明VI型人胶原蛋白多肽得到表达，且具有良好的特异性和免疫反应性。
2.如权利要求1所述的一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述的步骤II的(2)将克隆得到的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因与质粒pET-32a连接，用TAKARA的E.coli DNA Ligase连接酶在16℃水浴中反应2h，得到重组载体；其余的步骤和条件同权利要求1。
3.如权利要求1所述的一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述的步骤II的(2)将克隆得到的溶水性VI型人胶原蛋白多肽目的基因与质粒pET-32a连接，用TAKARA的E.coli DNA Ligase连接酶在16℃水浴中反应3h，得到重组载体；其余的步骤和条件同权利要求1。
4.如权利要求1所述的一种溶水性VI型人胶原蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述的步骤VI的(2)在13000r/min条件下，4℃离心30分钟；其余的步骤和条件同权利要求1。
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