CN111057144A - 基因重组高稳定性胶原寡肽mys-1及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基因重组高稳定性胶原寡肽MYS‑1及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。通过基因重组得到的胶原寡肽MYS‑1，与天然胶原蛋白或胶原样肽相比，分子量小、制备容易且效率高，具有更高的稳定性、更好的透皮吸收率和更高的生物活性，其生物相容性和生物安全性均佳，具有良好的抗氧化、抗衰老、促修复、抑制黑色素生成等生物活性，可显著促进皮肤的氧化损伤修复、减少黑色素的生成及抵抗衰老，且无明显的毒副作用；可用于食品、保健品、化妆品等，应用范围广泛，具有良好的产业化应用价值和前景。本发明的制备方法安全高效、生产效率高，生产成本低，生产的寡肽稳定性高，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种基因重组高稳定性人胶原寡肽MYS-1及其制备方法与应用。
背景技术
胶原(Collagen)是动物机体中的一类结构蛋白，占人体总蛋白质含量的25％至35％。它是细胞外基质的主要成分，在维护细胞、组织、器官的正常生理功能以及修复损伤等方面发挥着重要作用。胶原具有极低的免疫原性、可降解性、生物相容性、生物吸收性、机械性、止血性、无毒性和细胞生长促进等功能，在医学临床、生物材料、生物医药、食品化工以及化妆品行业研究应用十分广泛。研究表明，胶原蛋白是调节皮肤水含量和PH值、调节黑色素形成及修复受损细胞的关键功能因子，可有效改善组织细胞微环境，进而令肌肤亮泽、光白、水嫩而富有活力。
胶原在生物体中的表达十分复杂，首先胶原蛋白基因在细胞核中转录；然后原胶原α链被共翻译运输到内质网腔中经过脯氨酸羟化酶、赖氨酸羟化酶、蛋白质酶修饰形成带有N端和C端的原胶原蛋白三螺旋，然后通过原胶原蛋白N端及C端蛋白酶作用将两端的肽链切除，胶原蛋白分子再规则地按四分之一错位相接，自组装成胶原蛋白微纤维，最后在赖氨酸氧化酶的作用下，共价交联形成胶原纤维。
已经研究表明表皮和真皮中的多种生物学过程可以由不同多肽调节，胶原作为一种大分子化合物，代谢时在体内被胶原酶切割解旋，再被系列蛋白酶裂解为小分子短肽而发挥其生物学功能，胶原水解多肽、寡肽可被用于医美产品及化妆品中，发挥其抗衰、美白等生物学功效，而对于其他大多数生物大分子或化合物而言，这种可及性不易实现。
目前，胶原蛋白生产主要有传统提取、化学合成及基因重组制备技术。传统提取技术通过水解天然胶原得到系列水解产物，但其免疫原性的应用风险难以避免；化学合成胶原蛋白的成本高；基因重组技术具有产率高、成本低、生产的蛋白、多肽或寡肽活性高、无病毒隐患等优势，使得基因重组小分子胶原多肽具有良好的产业化前景，特别是具有高稳定性的基因重组胶原寡肽，具有巨大的市场应用潜力。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1。该胶原寡肽MYS-1具有更高的稳定性、生理活性和透皮吸收效率。
本发明的另一目的在于提供所述基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1的制备方法。该制备方法根据胶原寡肽MYS-1的氨基酸序列及大肠杆菌密码子的偏好性，设计胶原寡肽MYS-1在原核表达系统的基因序列，采用基因重组技术并结合亲和层析纯化实现胶原寡肽MYS-1的高效制备；该制备方法安全高效、产率高、生产成本低。
本发明的再一目的在于提供所述基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1，其肽段设计及筛选依据III型胶原α1链结构特征并综合寡肽的稳定性、生理活性及透皮吸收效率，在保留天然胶原域结构特征及生理活性的基础上，可比野生胶原蛋白及水解肽具有更高的稳定性及更强的络合Cu2+的生物学作用，可更有效减少Cu2+与酪氨酸酶的结合，进而更有效抑制黑色素的生成。其氨基酸序列如下所示：GERGQPGHKGNP。
优化后编码所述的基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1的核苷酸序列为：
GGTGAACGTGGCCAGCCAGGTCACAAAGGCAATCCG。
胶原寡肽MYS-1与pET-32a载体构建后的融合蛋白Trx-6His-MYS-1的核苷酸序列如下：
融合蛋白Trx-6His-MYS-1的氨基酸序列如下所示：
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKGERGQPGHKGNP
所述的基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1的制备方法，包括以下步骤：
(1)设计并合成MYS-1基因：
采用一对互补引物PCR反应合成MYS-1基因：
引物设计：
引物1：
引物2：
GGTACC为KpnI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点。
(2)构建重组载体pET32a-MYS-1：
用KpnI酶和XhoI酶分别对质粒pET32a和步骤(1)制得的MYS-1基因进行双酶切，然后将双酶切后的MYS-1基因和双酶切后的质粒pET32a，得到重组质粒pET32a-MYS-1；
(3)制备表达工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)：
用重组质粒pET32a-MYS-1转化表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到表达工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)；
(4)表达和纯化：
①诱导表达工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)表达由Trx标签蛋白、His标签蛋白和胶原寡肽MYS-1等组成的融合蛋白；
②表达的带His标签的融合蛋白用镍柱进行纯化：在蛋白上样后，带有His标签的融合蛋白特异性结合镍柱，其他的杂蛋白因不特异性结合镍柱而流出；用咪唑梯度洗脱，因咪唑与Ni2+结合可竞争性结合镍柱，进而释放融合蛋白，收集洗脱液；
③融合蛋白的酶切及目的多肽MYS-1的纯化；
④利用高效液相色谱技术纯化制备胶原寡肽MYS-1，得到高纯度基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1。
步骤(1)中所述的PCR反应的条件优选为：95℃，5min；95℃、1min，56℃、1min，72℃、1min，30个循环；72℃，10min；
步骤(4)②纯化所用的平衡缓冲液、洗涤缓冲液的组成如下：
Lysis平衡缓冲液(LE Buffer)：50mM Na2HPO4，0.3M NaCl，pH＝8.0；
洗涤缓冲液：50mM Na2HPO4，0.3M NaCl，10～50mM imidazole，pH＝8.0；
步骤(4)②中所述的洗脱镍柱的溶液的组成优选如下：50mM Na2HPO4，0.3M NaCl，250mM imidazole，pH＝8.0；
步骤(4)③中所述融合蛋白的酶切及目的多肽MYS-1的纯化步骤如下：
1)将融合蛋白洗脱液置于1×PBS(pH 7.6)缓冲液中透析，透析后融合蛋白溶液加入肠激酶(EK，5IU/μL)，加入量为每500μg融合蛋白加入5U肠激酶，酶切条件是：25℃条件下酶切6h。
2)将酶切后的溶液体系过平衡好的Ni-NTA纯化柱，收集穿透液，用含250mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱柱子上的标签蛋白和其他结合杂蛋白，洗脱总体积为柱床的5倍，再生Ni-NTA纯化柱。收集的穿透液即为含有胶原寡肽MYS-1的初步纯化产物。
步骤(4)④中所述的利用高效液相色谱技术纯化胶原寡肽MYS-1的步骤如下：
A、流动相A为在体积百分比100％乙腈中添加三氟乙酸(TFA)得到，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流动相B为100％水中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流速1.0mL/min，20min线性梯度洗脱；
B、线性梯度洗脱中流动相B由55％～80％(v/v)，收集胶原寡肽MYS-1的洗脱峰，光吸收检测波长为218nm；并进行质谱鉴定。
所述的基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1应用于制备美容化妆品、保健品或食品原料，有如下作用：抑制黑色素合成、抗氧化、抗衰老、抑制真皮成纤维细胞凋亡等功能。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明设计的胶原寡肽MYS-1是全新的寡肽序列，长度远小于天然人胶原蛋白及相关水解多肽，分子量小、制备容易且效率高，生物活性高，皮肤更易吸收利用，具有更显著的促进皮肤组织细胞氧化损伤修复和抗衰老的生物学作用；
(2)本发明所述基因重组人高稳定性胶原寡肽MYS-1的原核表达体系及纯化制备方法简易高效、成本低，应用前景广阔。
(3)本发明方法所制备的基因重组高稳定性人胶原寡肽MYS-1，与动物来源的天然胶原蛋白或胶原样肽相比较，其生物相容性和生物安全性更佳，具有良好的抗氧化、抗衰老、促修复、抑制黑色素生成等生物活性，可显著促进皮肤的氧化损伤修复、减少黑色素的生成及抵抗衰老，且无明显的毒副作用；可用于食品、保健品、化妆品等领域，应用范围广泛，具有良好的产业化应用价值。
附图说明
图1是质粒pET32a及重组表达质粒pET-32a-MYS-1双酶切示意图。
图2是SDS-PAGE检测融合蛋白Trx-6His-MYS-1纯化的鉴定图；其中，泳道1是纯化前菌体破碎上清液；泳道2上柱样品流出液；泳道3是250mM咪唑纯化后的蛋白。
图3是制备的基因重组人胶原寡肽MYS-1的质谱鉴定图。
图4是制备的基因重组人胶原寡肽MYS-1体外稳定性检测结果图。
图5是制备的基因重组人胶原寡肽MYS-1对DPPH自由基清除作用检测结果图。
图6是基因重组人胶原寡肽MYS-1抑制人黑色素瘤A375细胞的黑素生成检测结果图，其中，**p<0.01，不同浓度MYS-1组与空白组比较。
图7是基因重组人胶原寡肽MYS-1抑制人黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶活性检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
表达工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)的构建和表达
具体步骤如下：
(1)利用PCR技术合成MYS-1基因：
引物设计：
引物1：
引物2：
GGTACC为KpnI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点。
退火各个成分的用量：(引物浓度为1OD溶于400μL ddH2O，反应体系：20μL)
引物1：2μL、引物2：2μL、T4 PNK 1μL(10U)、ATP 20mM、ddH2O补水至20μL；
PCR反应程序：95℃，5min；95℃、1min，56℃、1min，72℃、1min，30个循环；72℃，10min；
自然冷却至室温，PCR产物备用。
(2)构建重组载体pET32a-MYS-1：
用KpnI酶和XhoI酶分别对质粒pET32a(购自上海生工生物工程有限公司)和步骤(1)制得的MYS-1基因进行双酶切，酶切反应体系：pET32a 2μg、10×FD Buffer 5μL、KpnI 1μL(10U/μL)、XhoI 1μL(10U/μL)、ddH2O 42μL，以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h；再将双酶切后得到的MYS-1基因和双酶切后的质粒pET32a连接，连接体系20μL：MYS-1基因的双酶切产物2μL、酶切载体pET32a 4μL、10×T4 DNAligase Buffer 2μL、T4 DNAligase 1μL(5U/μL)、ddH2O补充至20μL，上述连接混合液放在16℃恒温2h，得到重组表达质粒pET32a-MYS-1，重组表达质粒pET32a-MYS-1酶切鉴定如图1所示；
(3)制备表达工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)：
用重组表达质粒pET32a-MYS-1转化表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(购自上海生工生物工程有限公司)，得到表达工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)；
(4)表达和纯化：
从保种的EP管中取50μL表达工程菌菌液于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，35℃、220rpm摇菌培养过夜，再取培养液以体积比为1：100的比例接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，35℃、220rpm摇菌至OD600为0.8，加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.8mmol/L，35℃诱导表达7h。8000rpm离心25min收集菌体，将菌体重悬于10mL Lysis平衡缓冲液(50mM Na2HPO4，0.3M NaCl，pH＝8.0)中，然后超声破碎细胞，在冰上进行操作，超声3秒，间隔10秒，总时间为35分钟。破碎产物在4℃，12000rpm离心20mim，收集上清，该上清称为破碎上清液。SDS-PAGE检测融合蛋白Trx-6His-MYS-1的表达，鉴定结果如图2所示。表明融合蛋白表达成功，且以上清表达为主。
实施例2
基因重组人胶原寡肽MYS-1的纯化、制备和鉴定
吸取混匀的2mL的介质加入到管柱中(Ni-NTA柱，金斯瑞生物科技有限公司，10mL管柱体积)，加入4倍柱体积的Lysis平衡缓冲液平衡层析介质；用破碎上清液以1.0mL/min的流速上柱；用8倍柱体积的洗涤缓冲液(50mM Na2HPO4，0.3M NaCl，10～50mM imidazole，pH＝8.0)以1.0mL/min过柱，以洗去杂蛋白或未亲和结合的融合蛋白，用10倍柱体积的洗脱缓冲液以1.0mL/min过柱，收集洗脱液，取样品流出液、洗涤流出液、洗脱流出液进行SDS-PAGE电泳检测融合蛋白Trx-6His-MYS-1的纯化效果(结果如图2所示)，实验结果表明，在250mM咪唑洗脱液中得到了除去了大部分杂蛋白的融合蛋白。
对融合蛋白的酶切及目的多肽MYS-1的纯化，步骤如下：
1)将融合蛋白洗脱液置于1×PBS(pH 7.6)缓冲液中透析，透析后融合蛋白溶液加入肠激酶(EK，5IU/μL)，加入量为每500μg融合蛋白加入5U肠激酶，酶切条件是：25℃条件下酶切6h。
2)将酶切后的溶液体系过平衡好的Ni-NTA纯化柱，收集穿透液，用含250mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱柱子上的标签蛋白和其他结合杂蛋白，洗脱总体积为柱床的5倍，再生Ni-NTA纯化柱。收集的穿透液即为含有胶原寡肽MYS-1的初步纯化产物。
3)利用高效液相色谱技术纯化目的多肽MYS-1，步骤如下：
A、流动相A为在体积百分比100％乙腈中添加三氟乙酸(TFA)得到，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流动相B为100％水中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流速1.0mL/min，20min线性梯度洗脱；
B、线性梯度洗脱中流动相B由55％～80％(v/v)，收集目的多肽MYS-1的洗脱峰，光吸收检测波长为218nm，制备得到了纯度为质量百分比99.5％的目的多肽MYS-1。
制备的目的多肽MYS-1进行质谱鉴定(结果如图3所示)，质谱检测分子量为1.233kDa.，其与理论值一致。
实施例3
基因重组人胶原寡肽MYS-1的稳定性检测
基因重组人胶原寡肽MYS-1以1mg/mL的浓度溶解在20mM磷酸钠缓冲液(含150mM氯化钠)(pH 8.0)，在37℃条件下孵育，利用液相色谱-质谱联用系统(LC-MS)检测重组人胶原寡肽MYS-1随时间(1～6周)在溶液中的存流量，计算MYS-1随时间的消减率，以海洋胶原肽(MCP)和基因重组胶原样肽MJLGG-34作为对照。所述的基因重组胶原样肽MJLGG-34在“201811505180.3、基因重组胶原样肽MJLGG-34及其制备方法与应用”中公开。
如图4所示，孵育1周时，MCP消减22.1％，孵育4周时，MCP消减66.7％；基因重组胶原样肽MJLGG-34孵育2周时，消减14.0％，孵育4周和6周时，分别消减18.9％和24.0％；而基因重组人胶原寡肽MYS-1孵育2周时，仅消减1.7％，孵育4周和6周时，仅分别消减4.0％和5.7％。实验结果表明，基因重组人胶原寡肽MYS-1的稳定性比MCP和基因重组胶原样肽MJLGG-34分别提高约20倍和5倍。
实施例4
基因重组人胶原寡肽MYS-1的抗氧化能力
取MYS-1适量用PBS(pH7.5，0.02M)溶解成6mM溶液。分别取0～250μL样品于1.5mL离心管中，按浓度梯度分别加入250～500μL乙醇溶液，再加入1mL 0.1mM DPPH·乙醇溶液，混匀，暗处放置30min，不断震荡，测定517nm处的吸光值，以抗坏血酸作为阳性对照组。
DPPH·清除能力计算公式为：DPPH·抑制率(％)＝(Ao-A1)/Ao×100
其中Ao为未加样品的空白的吸光值，A1为加入样品后的吸光值。
实验结果如图5所示，抗氧化剂抗坏血酸随着浓度的升高，其清除DPPH·的能力逐渐增强，在浓度为1.00mM时，清除率达到71.3％。而基因重组人胶原寡肽MYS-1也具有显著的抗氧化能力，随着MYS-1浓度的升高，其清除DPPH·的能力逐渐增强且显示出一定剂量依赖性，在浓度为1.00mM时，清除率达到62.1％。
实施例5
基因重组人胶原寡肽MYS-1抑制人黑色素瘤A375细胞的黑色素生成
调整人黑素瘤细胞A375(购自中国科学院昆明细胞库)浓度至1×106/mL，接种于6孔板，每孔2mL。贴壁后细胞分组分别用25～200μM的MYS-1处理(Polypeptide)，空白对照组(control)用生理盐水处理，48h后用预冷的PBS洗涤3次刮下收集于无菌EP管中。黑色素含量的测定采用Tsuboi(1998)的方法，1500rpm离心5min弃上清，以0.5mL含10％DMSO的1MNaOH溶液裂解细胞，超声波破碎30min，90℃水浴2h，使细胞团块完全裂解后，3000rpm离心20min，取上清至96孔板于酶标仪450nm处测A值，计算细胞黑色素相对含量。
黑素合成相对含量(％)＝A1/A0×100
式中Al是样品组的吸光度，A0是空白对照组的吸光值
如图6所示，25～200μM范围内的基因重组人胶原寡肽MYS-1孵育黑素瘤细胞48h后，呈浓度依赖性抑制黑素细胞中的黑素合成，而200μM MYS-1对黑素合成抑制作用最强，与空白组相比，黑素含量减少约26.62％。
实施例6
基因重组人胶原寡肽MYS-1抑制人黑色素瘤A375细胞酪氨酸酶活性
调整人黑素瘤细胞A375(中国科学院昆明细胞库)浓度至1×105cell/ml，接种于6孔板，每孔2mL。贴壁后细胞分组分别用25～200μM的MYS-1处理，空白对照组(Control)用PBS处理，48h后用预冷的PBS洗涤3次，每孔加入300μL含5％(v/v)的TritonX-100的缓冲液，震荡，反复冻融，冰浴中超声破碎。5000rpm离心10min，将2mL上清液于37℃预冷10min，即刻加入0.1％L-DOPA(左旋多巴)溶液500μL，振摇后在分光光度计475nm波长处测0min和30min的吸光值。
计算酪氨酸酶相对活性：酪氨酸酶相对活性(％)＝(A1'-A0')/(A1-A0)×100％
式中Al、A0分别是样品组和空白组在0min处的吸光值，Al'、A0'分别是样品组和空白组在30min处的吸光值。
如图7所示，实验结果表明，25～200μM范围内的MYS-1孵育黑素细胞48h后，200μMMYS-1对酪氨酸酶活性显示出一定的抑制作用，与空白对照组相比，吸光度值减少约14.1％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广州暨大美塑生物科技有限公司
<120> 基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1及其制备方法与应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1
<400> 1
Gly Glu Arg Gly Gln Pro Gly His Lys Gly Asn Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码所述的基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1的核苷酸序列
<400> 2
ggtgaacgtg gccagccagg tcacaaaggc aatccg 36
<210> 3
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白Trx-6His-MYS-1的核苷酸序列
<400> 3
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360
catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caagggtgaa 480
cgtggccagc caggtcacaa aggcaatccg taactcgag 519
<210> 4
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白Trx-6His-MYS-1的氨基酸序列
<400> 4
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Gly Glu
145 150 155 160
Arg Gly Gln Pro Gly His Lys Gly Asn Pro
165 170
<210> 5
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物1
<400> 5
cgacgacgac gacaagggtg aacgtggcca gccaggtcac aaaggcaatc cgtaac 56
<210> 6
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物2
<400> 6
tcgagttacg gattgccttt gtgacctggc tggccacgtt cacccttgtc gtcgtcgtcg 60
gtac 64
Claims (10)
1.一种基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.编码权利要求1所述的基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于：编码所述的基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.一种基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)设计并合成MYS-1基因：
采用一对互补引物PCR反应合成MYS-1基因：
引物设计：
引物1：
引物2：
GGTACC为KpnI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点；
(2)构建重组载体pET32a-MYS-1：
用KpnI酶和XhoI酶分别对质粒pET32a和步骤(1)制得的MYS-1基因进行双酶切，然后将双酶切后的MYS-1基因和双酶切后的质粒pET32a，得到重组质粒pET32a-MYS-1；
(3)制备表达工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)：
用重组质粒pET32a-MYS-1转化表达宿主大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，得到表达工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)；
(4)表达和纯化：
①诱导表达工程菌pET32a-MYS-1/BL21(DE3)表达由Trx标签蛋白、His标签蛋白和胶原寡肽MYS-1组成的融合蛋白；
②表达的带His标签的融合蛋白用镍柱进行纯化：在蛋白上样后，带有His标签的融合蛋白特异性结合镍柱，其他的杂蛋白因不特异性结合镍柱而流出；用咪唑梯度洗脱，因咪唑与Ni2+结合能竞争性结合镍柱，进而释放融合蛋白，收集洗脱液；
③融合蛋白的酶切及目的多肽MYS-1的纯化；
④利用高效液相色谱技术纯化制备胶原寡肽MYS-1，得到高纯度基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的PCR反应的条件为：95℃，5min；95℃、1min，56℃、1min，72℃、1min，30个循环；72℃，10min。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
步骤(4)②纯化所用的平衡缓冲液、洗涤缓冲液的组成如下：
Lysis平衡缓冲液：50mM Na2HPO4，0.3M NaCl，pH＝8.0；
洗涤缓冲液：50mM Na2HPO4，0.3M NaCl，10～50mM imidazole，pH＝8.0；
步骤(4)②中所述的洗脱镍柱的溶液的组成如下：50mM Na2HPO4，0.3M NaCl，250mMimidazole，pH＝8.0。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
步骤(4)③中所述融合蛋白的酶切及目的多肽MYS-1的纯化步骤如下：
1)将融合蛋白洗脱液置于pH 7.6的1×PBS缓冲液中透析，透析后融合蛋白溶液加入肠激酶，加入量为每500μg融合蛋白加入5U肠激酶，酶切条件是：25℃条件下酶切6h；
2)将酶切后的溶液体系过平衡好的Ni-NTA纯化柱，收集穿透液，用含250mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱柱子上的标签蛋白和其他结合杂蛋白，洗脱总体积为柱床的5倍，再生Ni-NTA纯化柱；收集的穿透液即为含有胶原寡肽MYS-1的初步纯化产物。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
步骤(4)④中所述的利用高效液相色谱技术纯化胶原寡肽MYS-1的步骤如下：
A、流动相A为在体积百分比100％乙腈中添加TFA得到，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流动相B为100％水中添加TFA，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流速1.0mL/min，20min线性梯度洗脱；
B、线性梯度洗脱中流动相B由55％～80％v/v，收集胶原寡肽MYS-1的洗脱峰，光吸收检测波长为218nm；并进行质谱鉴定。
9.权利要求1所述的基因重组高稳定性胶原寡肽MYS-1在制备美容化妆品、保健品或食品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述的美容化妆品、保健品或食品，具有如下作用：抑制黑色素合成、抗氧化、抗衰老、抑制真皮成纤维细胞凋亡。
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