CN112457370B

CN112457370B - 基因重组细胞穿膜肽rtp及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112457370B
Application number: CN202011138826.6A
Authority: CN
Inventors: 马义
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2040-10-22
Also published as: CN112457370A

Abstract

本发明公开一种基因重组细胞穿膜肽RTP及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。通过基因重组得到的细胞穿膜肽RTP，与其他皮肤促渗剂相比，分子量小、制备容易且具有更高的细胞穿透效率和更低的细胞毒性，生物活性高，更易透过皮肤上皮组织，使其所运载药物等更易透皮吸收利用，是生物大分子、亲水性药物经皮转运方面的高效促渗剂，且安全性更佳，无明显的毒副作用，可用于美容及化妆品等领域，应用范围广泛，具有良好的产业化应用价值和产业化前景。本发明的制备方法安全、简易高效、产率高、生产成本低，生产的短肽稳定性高，应用前景广阔。

Description

基因重组细胞穿膜肽RTP及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种基因重组细胞穿膜肽RTP及其制备方法与应用。

背景技术

细胞穿膜肽，顾名思义是一类可以穿透细胞膜或组织屏障的多肽。第一种被报道的细胞穿膜肽是1988年发现的人类免疫缺陷病毒(HIV)的反式转录激活因子(TAT)，可以穿透细胞膜进入到细胞内。接下来的数十年间各研究团队又发现了许多不同种类的多肽具有穿越细胞膜的能力，此类多肽被命名为细胞穿膜肽。细胞穿膜肽的定义为由几个至四十几个氨基酸组成的多肽分子，具有不需要依赖细胞膜表面受体而独立穿过细胞膜的能力。近些年来，细胞穿膜肽的发现和发展显著拓宽了生物大分子活性物质的使用范围。生物活性物质如抗体、生物大分子药物等的使用限制于其穿过细胞膜的入胞转运技术，而细胞穿膜肽则成为帮助其穿过细胞膜，进入细胞内运输的强有力的载体工具。

不同种类的细胞穿膜肽其穿膜的能力各有差异。常见的细胞穿膜肽类型有阳离子型细胞穿膜肽、两亲型细胞穿膜肽以及疏水性细胞穿膜肽。以TAT为例，TAT为阳离子型细胞穿膜肽，由9个氨基酸组成的穿膜肽序列中含有6个精氨酸，且决定其穿膜能力差异的与精氨酸的数量和排列顺序有关。而两亲型的细胞穿膜肽则同时包含极性基团和非极性基团，从而同时具备亲水性和疏水性。与阳离子型细胞穿膜肽不同的地方是，决定两亲型细胞穿膜肽穿膜进入细胞转运的机制不是其携带的正电基团的数量，而是其两亲性。疏水性细胞穿膜肽主要依靠其疏水性基团发挥其穿膜的作用，但是对疏水性细胞穿膜肽的报道相对较少，具体机制尚不清晰。对于细胞穿膜肽的入胞机制已有相对较多的研究进展，但部分机制假说尚有争议。通常认为，细胞穿膜肽的入胞机制大致分为两类，一是胞吞途径介导的穿透，二是非能量依赖、非受体依赖的直接穿透。不同的细胞穿膜肽可能还具有多种细胞穿膜途径以应对由PH值、离子强度、温度等变化造成的不同环境的影响。

细胞穿膜肽的功能和应用：细胞穿膜肽因其具有高效的细胞膜穿透效率，且其本身为蛋白质具有良好的生物相容性，基本无细胞毒性，同时还可以携带各种生物活性物质如抗体、生物大分子药物等入膜等优点，得到了研究者们的青睐。细胞穿膜肽以共价键或非共价键与受载物形成稳定的复合物，复合物可透过皮肤转运，促进药物的跨膜转运而不会改变转运物质的生物活性或造成细胞损伤，是一种新型促进药物转运的载体工具。在大分子亲水性药物经皮转运方面具有常规促渗剂无可比拟的优势，也常用于皮肤美容与化妆品等行业。

目前，细胞穿膜肽生产主要有化学合成及基因重组制备技术。化学合成细胞穿膜肽的成本高；基因重组技术具有产率高、成本低、生产的多肽活性高、无病毒隐患等优势，使得基因重组小分子细胞穿膜肽具有良好的产业化前景，特别是高效基因重组细胞穿膜肽，具有巨大的市场应用潜力。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基因重组高效细胞穿膜肽RTP。该细胞穿膜肽RTP具有更高的细胞穿透效率和更低的细胞毒性。

本发明的另一目的在于提供所述基因重组高效细胞穿膜肽RTP的制备方法。该制备方法根据细胞穿膜肽RTP的氨基酸序列及大肠杆菌密码子的偏好性，设计细胞穿膜肽RTP在原核表达系统的基因序列，采用基因重组技术并结合亲和层析纯化实现细胞穿膜肽RTP的高效制备；该制备方法安全高效、产率高、生产成本低。

本发明的再一目的在于提供所述基因重组高效细胞穿膜肽RTP的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基因重组高效细胞穿膜肽RTP，其肽段设计及筛选依据为既有极性基团也有非极性氨基酸的两亲性穿膜肽，其氨基酸序列如下所示：CSSQPSK，核苷酸序列为：TGCAGCAGCCAGCCCAGCAAG。

细胞穿膜肽RTP与pET-32a载体构建后的融合蛋白Trx-6His-RTP的核苷酸序列如下：

融合蛋白Trx-6His-RTP的氨基酸序列如下所示：

MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKCSSQPSK。

所述的基因重组高效细胞穿膜肽RTP的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计并合成RTP基因：

采用一对互补引物PCR反应合成RTP基因：

引物1：

引物2：

GGTACC为KpnI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点；

(2)构建重组载体pET32a-RTP：

用KpnI酶和XhoI酶分别对质粒pET32a和步骤(1)制得的RTP基因进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶连接双酶切后的RTP基因和双酶切后的质粒pET32a，得到重组质粒pET32a-RTP；

(3)制备表达工程菌pET32a-RTP/BL21(DE3)：

用重组质粒pET32a-RTP转化表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到表达工程菌pET32a-RTP/BL21(DE3)；

(4)表达和纯化：

①诱导表达工程菌pET32a-RTP/BL21(DE3)表达由Trx标签蛋白、His标签蛋白和细胞穿膜肽RTP等组成的融合蛋白；

②表达的带His标签的融合蛋白用镍柱进行纯化：在蛋白上样后，带有His标签的融合蛋白特异性结合镍柱，其他的杂蛋白因不能特异性结合镍柱而流出；用咪唑梯度洗脱，因咪唑与Ni²⁺结合可竞争性结合镍柱，进而释放融合蛋白，收集洗脱液；

③融合蛋白的酶切及细胞穿膜肽RTP的纯化；

④利用高效液相色谱技术纯化制备细胞穿膜肽RTP，得到高纯度基因重组高效细胞穿膜肽RTP。

步骤(1)中所述的PCR反应的条件优选为：95℃，5min；95℃，1min；56℃，1min；72℃，1min；30个循环；72℃，10min；

步骤(4)②纯化所用的平衡缓冲液、洗涤缓冲液的组成如下：

Lysis平衡缓冲液(LE Buffer)：50mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，pH＝8.0；

洗涤缓冲液：50mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，10～50mM imidazole(咪唑)，pH＝8.0；

步骤(4)②中所述的洗脱镍柱的溶液的组成优选如下：50mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，250mM imidazole(咪唑)，pH＝8.0；

步骤(4)③中所述融合蛋白的酶切及细胞穿膜肽RTP的纯化步骤如下：

1)将融合蛋白洗脱液置于1×PBS(pH 7.6)缓冲液中透析，透析后融合蛋白溶液加入肠激酶(EK，5IU/μL)，加入量为每500μg融合蛋白加入5U肠激酶，酶切条件是：25℃条件下酶切6h。

2)将酶切后的溶液体系过平衡好的Ni-NTA纯化柱，收集穿透液，用含250mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱柱子上的标签结合蛋白和其他结合杂蛋白，洗脱总体积为柱床的5倍，再生Ni-NTA纯化柱。收集的穿透液即为含有细胞穿膜肽RTP的初步纯化产物。

步骤(4)④中所述的利用高效液相色谱技术纯化细胞穿膜肽RTP的步骤如下：

A、流动相A为在体积百分比100％乙腈中添加三氟乙酸(TFA)得到，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流动相B为100％水中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流速1.0mL/min，20min线性梯度洗脱；

B、线性梯度洗脱中流动相B由55％～80％(v/v)，收集细胞穿膜肽RTP的洗脱峰，光吸收检测波长为218nm；并进行质谱鉴定。

所述的基因重组高效细胞穿膜肽RTP应用于制备美容化妆品，具有如下作用：辅助药物更好的渗入皮肤表皮并促进细胞内吸收及转运，达到良好的护肤美容效果。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明设计的细胞穿膜肽RTP是全新的短肽序列，长度小于现有报道的细胞穿膜肽，分子量小、制备容易且穿透效率高，生物活性高，更易透过皮肤上皮组织，使其所运载药物等更易透皮吸收利用，是生物大分子、亲水性药物经皮转运方面的高效促渗剂。

(2)本发明所述基因重组高效细胞穿膜肽RTP的原核表达体系及纯化制备方法安全、简易高效、成本低，生产的短肽稳定性高，应用前景广阔。

(3)本发明方法所制备的基因重组高效细胞穿膜肽RTP，无细胞毒性、无明显的毒副作用，与其他皮肤促渗剂相比生物安全性更佳；可用于美容及化妆品等领域，应用范围广泛，具有良好的产业化应用价值和产业化前景。

附图说明

图1是质粒pET-32a及重组表达质粒pET-32a-RTP双酶切示意图。

图2是SDS-PAGE检测融合蛋白Trx-6His-RTP纯化的鉴定图；其中，泳道1是纯化前菌体破碎上清液；泳道2上柱样品流出液；泳道3是250mM咪唑纯化后的蛋白。

图3是制备的基因重组人细胞穿膜肽RTP的质谱鉴定图。

图4为制备的基因重组人细胞穿膜肽RTP与对照穿膜肽TAT 47-57的细胞穿膜活性荧光强度检测结果图；其中，**p<0.01，不同浓度RTP组与TAT 47-57组比较。

图5为制备的基因重组人细胞穿膜肽RTP与对照穿膜肽TAT 47-57的细胞毒性检测存活率结果图。

图6为制备的基因重组人细胞穿膜肽RTP与壳聚糖/胶原混合物及其对照组对小鼠表皮创面愈合率结果图；其中，*p<0.05，**p<0.01，各实验组与对照组相比较。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

表达工程菌pET32a-RTP/BL21(DE3)的构建和表达

具体步骤如下：

(1)利用PCR技术合成RTP基因：

采用一对互补引物PCR反应合成RTP基因：

引物设计：

引物1：

引物2：

GGTACC为KpnI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点。

退火各个成分的用量：(引物浓度为1OD溶于400μL ddH₂O，反应体系：20μL)

引物1 2μL、引物2 2μL、T4 PNK 1μL(10U)、ATP 20mM、ddH₂O补水至20μL；

PCR反应程序：95℃，5min；95℃，1min；56℃，1min；72℃，1min；30个循环；72℃，10min；

自然冷却至室温，PCR产物备用。

(2)构建重组载体pET32a-RTP：

用KpnI酶和XhoI酶分别对质粒pET32a(购自上海生工生物工程有限公司)和步骤(1)制得的RTP基因进行双酶切，酶切反应体系：pET-32a 2μg、10×FD Buffer 5μL、KpnI 1μL(10U/μL)、XhoI 1μL(10U/μL)、ddH₂O 42μL，以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h；再将双酶切后得到的RTP基因和双酶切后的质粒pET32a连接，连接体系20μL：RTP基因的双酶切产物2μL、酶切载体pET-32a 4μL、10×T4 DNAligase Buffer 2μL、T4 DNAligase 1μL(5U/μL)、ddH₂O补充至20μL，上述连接混合液放在16℃恒温2h，得到重组表达质粒pET32a-RTP，重组表达质粒pET32a-RTP酶切鉴定如图1所示；

(3)制备表达工程菌pET32a-RTP/BL21(DE3)：

用重组表达质粒pET32a-RTP转化表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(购自上海生工生物工程有限公司)，得到表达工程菌pET32a-RTP/BL21(DE3)；

(4)表达和纯化：

从保种的EP管中取50μL表达工程菌菌液于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，35℃、220rpm摇菌培养过夜，再取培养液以体积比为1：100的比例接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，35℃、220rpm摇菌至OD₆₀₀为0.8，加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.8mM，35℃诱导表达7h。8000rpm离心25min收集菌体，将菌体重悬于10mLLysis平衡缓冲液(50mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，pH＝8.0)中，然后超声破碎细胞，在冰上进行操作，超声3秒，间隔10秒，总时间为35分钟。破碎产物在4℃，12000rpm离心20mim，收集上清，该上清称为破碎上清液。SDS-PAGE检测融合蛋白Trx-6His-RTP的表达，鉴定结果如图2所示。表明融合蛋白表达成功，且以上清表达为主。

实施例2

基因重组人细胞穿膜肽RTP的纯化、制备和鉴定

吸取混匀的2mL的介质(Ni-NTA柱，金斯瑞生物科技有限公司)加入到管柱中(10mL管柱体积)，加入4倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析介质；用破碎上清液以1.0mL/min的流速上柱；用8倍柱体积的洗涤缓冲液(50mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，10～50mM imidazole，pH＝8.0)以1.0mL/min过柱，以洗去杂蛋白或未亲和结合的融合蛋白，用10倍柱体积的洗脱缓冲液以1.0mL/min过柱，收集洗脱液，取样品流出液、洗涤流出液、洗脱流出液进行SDS-PAGE电泳检测融合蛋白Trx-6His-RTP的纯化效果(结果如图2所示)，实验结果表明，在250mM咪唑洗脱液中得到了除去了大部分杂蛋白的融合蛋白。

对融合蛋白的酶切及细胞穿膜肽RTP的纯化，步骤如下：

2)将酶切后的溶液体系过平衡好的Ni-NTA纯化柱，收集穿透液，用含250mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱柱子上的标签结合蛋白和其他结合杂蛋白，洗脱总体积为柱床的5倍，再生Ni-NTA纯化柱。收集的穿透液即为含有细胞穿膜肽RTP的初步纯化产物。

3)利用高效液相色谱技术纯化细胞穿膜肽RTP，步骤如下：

B、线性梯度洗脱中流动相B由55％～80％(v/v)，收集细胞穿膜肽RTP的洗脱峰，光吸收检测波长为218nm，制备得到了纯度为质量百分比99.5％的细胞穿膜肽RTP。

制备的细胞穿膜肽RTP进行质谱鉴定(结果如图3所示)，质谱检测分子量为0.74kDa.，其与理论值一致。

实施例3

基因重组人细胞穿膜肽RTP的细胞穿膜活性荧光强度检测

培养HEK-293A细胞(购自中国科学院昆明细胞库)，调整至5×10⁴/mL，接种于12孔板，每孔1mL，在细胞培养箱培养至细胞长至80％～90％汇合时弃去旧培养基，加入无血清的细胞培养基，在12孔板中分别加入基因重组人细胞穿膜肽RTP和按N/P比为40加入质粒pEGFP复合物的培养基，RTP的浓度为25、50、75、100μM，穿膜肽TAT 47-57(其氨基酸序列：YGRKKRRQRRR)作为对照组按照上述同样条件处理。孵育4h后，经酶标仪检测得到各组荧光定量结果，见图4。实验结果表明，不同浓度RTP与质粒pEGFP结合物组的荧光强度均强于TAT47-57，且在100μM时，荧光强度最强，说明RTP穿膜效率比TAT 47-57更高，基因重组人细胞穿膜肽RTP的细胞穿膜效率约是穿膜肽TAT 47-57的4倍。

实施例4

基因重组人细胞穿膜肽RTP的细胞毒性检测

培养人皮肤成纤维细胞株HSF(购自中国科学院上海生命科学研究院)，调整浓度至5×10⁴/mL，接种于96孔板，每孔0.1mL。培养箱培养24h，细胞分组分别用基因重组人细胞穿膜肽RTP(或TAT 47-57)浓度为25～200μM处理，空白对照组(control)用生理盐水处理，再培养箱中继续培养24h后换无血清培养基并加入CCK8(1：10细胞培养液)，培养箱中继续培养1h，在酶标仪波长546nm测吸收数值。细胞存活率按照以下公式计算：

细胞存活率＝[OD]_test/[OD]_control×100％

实验结果如图5，与TAT 47-57相比，基因重组人细胞穿膜肽RTP对人皮肤成纤维细胞HSF的毒性很小，细胞的存活率在90％以上。

实施例5

基因重组人细胞穿膜肽RTP与壳聚糖/胶原复合物促进小鼠组织创面愈合

3wt％胶原溶液制备：称取3g鱼皮胶原蛋白粉，溶于100mL 0.02mol/L稀醋酸溶液，缓慢搅拌直至完全溶解。

2wt％壳聚糖溶液制备：称取4g壳聚糖粉末，溶于200mL 0.1mol/L稀醋酸溶液中，缓慢搅拌3h直至完全溶解。

壳聚糖/胶原溶液的混合液制备：将50mL 3wt％胶原溶液加入100mL 2wt％壳聚糖溶液中。

壳聚糖/胶原/细胞穿膜肽RTP混合液制备：称取0.1g细胞穿膜肽RTP溶于50mL3wt％胶原溶液中，缓慢搅拌，28℃恒温箱保温30min后取出自然冷却，加入10mL 2wt％壳聚糖溶液，冰浴搅拌10min。

构建动物模型：正常喂养C57/BL6小鼠(C57/BL6小鼠购自广东省实验动物中心)，制备小鼠表皮创伤模型，动物分为4组，每组6只。1为空白对照组，2为壳聚糖溶液组，3为壳聚糖/胶原溶液组，4为壳聚糖/胶原/细胞穿膜肽RTP组。各组小鼠用10％水合氯醛麻醉剂按3mL/kg进行麻醉后，背部脱毛。用75％乙醇进行常规消毒，然后在其颈部和胸部交界上方切一个1cm²面积的伤口，深达筋膜。术后止血及伤口消毒。动物1组直接用无菌纱布覆盖并用医用胶带固定，每日消毒并更换无菌纱布；2～4组分别将创伤面涂抹2wt％壳聚糖溶液、壳聚糖/胶原溶液以及壳聚糖/胶原/细胞穿膜肽RTP溶液，用无菌纱布覆盖，并用医用胶带固定，1次/天。各组小鼠均在清洁笼内饲养，清洁饮水、自由饮食。

术后第3，7，14天观察小鼠创面皮肤愈合情况，采用透明薄膜测量法计算修复面积。如图6所示，同一时间创面愈合率最高的组为壳聚糖/胶原/细胞穿膜肽RTP组，其次是壳聚糖/胶原溶液组，再次是壳聚糖溶液组，最低的是对照组。实验结果表明，细胞穿膜肽RTP的运用能优化壳聚糖/胶原复合材料的性能，增加渗透作用，加快创面修复过程，缩短创面愈合时间。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 基因重组高效细胞穿膜肽RTP及其制备方法与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 基因重组高效细胞穿膜肽RTP

<400> 1

Cys Ser Ser Gln Pro Ser Lys

1 5

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码基因重组高效细胞穿膜肽RTP的核苷酸序列

<400> 2

tgcagcagcc agcccagcaa g 21

<210> 3

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白Trx-6His-RTP的核苷酸序列

<400> 3

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caagtgcagc 480

agccagccca gcaagtaact cgag 504

<210> 4

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 融合蛋白Trx-6His-RTP的氨基酸序列

<400> 4

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Cys Ser

145 150 155 160

Ser Gln Pro Ser Lys

165

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物1

<400> 5

cgacgacgac gacaagtgca gcagccagcc cagcaagtaa c 41

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物2

<400> 6

tcgagttact tgctgggctg gctgctgcac ttgtcgtcgt cgtcggtac 49

Claims

1.一种基因重组细胞穿膜肽RTP，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述的基因重组细胞穿膜肽RTP的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于：编码所述的基因重组细胞穿膜肽RTP的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种基因重组细胞穿膜肽RTP的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)设计并合成RTP基因：

采用一对互补引物PCR反应合成RTP基因：

引物1：

引物2：

GGTACC为KpnI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点；

(2)构建重组载体pET32a-RTP：

用KpnI酶和XhoI酶分别对质粒pET32a和步骤(1)制得的RTP基因进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切后的RTP基因和双酶切后的质粒pET32a，得到重组质粒pET32a-RTP；

(3)制备表达工程菌pET32a-RTP/BL21(DE3)：

(4)表达和纯化：

①诱导表达工程菌pET32a-RTP/BL21(DE3)表达由Trx标签蛋白、His标签蛋白和细胞穿膜肽RTP组成的融合蛋白；

②表达的带His标签的融合蛋白用镍柱进行纯化：在蛋白上样后，带有His标签的融合蛋白特异性结合镍柱，其他的杂蛋白因不能特异性结合镍柱而流出；用咪唑梯度洗脱，因咪唑与Ni²⁺结合能竞争性结合镍柱，进而释放融合蛋白，收集洗脱液；

③融合蛋白的酶切及细胞穿膜肽RTP的纯化；

④利用高效液相色谱技术纯化制备细胞穿膜肽RTP，得到高纯度基因重组细胞穿膜肽RTP。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的PCR反应的条件为：95℃，5min；95℃，1min；56℃，1min；72℃，1min；30个循环；72℃，10min。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

步骤(4)②纯化所用的平衡缓冲液、洗涤缓冲液的组成如下：

Lysis平衡缓冲液：50mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，pH＝8.0；

洗涤缓冲液：50mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，10～50mM咪唑，pH＝8.0；

步骤(4)②中，洗脱镍柱的溶液的组成如下：50mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，250mM咪唑，pH＝8.0。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

1)将融合蛋白洗脱液置于pH 7.6的1×PBS缓冲液中透析，透析后融合蛋白溶液加入肠激酶，加入量为每500μg融合蛋白加入5U肠激酶，酶切条件是：25℃条件下酶切6h；

2)将酶切后的溶液体系过平衡好的Ni-NTA纯化柱，收集穿透液，用含250mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱柱子上的标签结合蛋白和其他结合杂蛋白，洗脱总体积为柱床的5倍，再生Ni-NTA纯化柱；收集的穿透液即为含有细胞穿膜肽RTP的初步纯化产物。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

A、流动相A为在体积百分比100％乙腈中添加TFA得到，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流动相B为100％水中添加TFA，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流速1.0mL/min，20min线性梯度洗脱；

B、线性梯度洗脱中流动相B由55％～80％v/v，收集细胞穿膜肽RTP的洗脱峰，光吸收检测波长为218nm；并进行质谱鉴定。

9.权利要求1所述的基因重组细胞穿膜肽RTP在制备化妆品中的应用，其特征在于：所述的化妆品，具有如下作用：辅助胶原蛋白渗入皮肤表皮并促进细胞内吸收及转运。