CN102863516B - 细胞穿膜肽hPP10的生产及其介导质粒DNA转染的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学领域，具体讲，涉及一种新型人源性细胞穿膜肽hPP10的生产及其介导质粒DNA转染的方法。hPP10是源于人类细胞核蛋白，赖氨酸特异性去甲基酶4A的一段多肽序列，具有穿透细胞膜功能，并可携带蛋白，核酸（DNA质粒）跨膜进入多种细胞，是一种极具开发前景的蛋白、核酸等生物活性分子的跨膜运输载体。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体讲，涉及一种新型人源性细胞穿膜肽hPP10的生产及其介导质粒DNA转染的方法。
背景技术
随着人类基因组计划的完成和蛋白质组学的兴起，人们发现越来越多的生物分子比如蛋白质、多肽、核酸等均有可能成为治疗药物。但是与传统药物不同的是，这些治疗分子在体内稳定性低、需要在胞内发挥功能的分子难以进入细胞，因而会限制其作为药物的推广应用。故开发能有效携带这些治疗性生物大分子进入靶细胞、经济、安全的载体系统是亟需解决的问题。
近年来，非病毒药物运输载体以其安全性、低毒性、低免疫反应等优点被寄予厚望。迄今比较常用的生物大分子细胞内导入方式有如电穿孔、脂质体转染和有机高分子纳米颗粒等可能存在着安全隐患如对细胞的毒性作用、胞内释放困难、难于组装及操作和用于体内等这样那样的缺点。因此寻找新型的理想的非病毒药物输送系统引起了学者们的广泛兴趣（图18）。
在过去的20多年间，将核酸、多肽、蛋白等具有治疗作用的生物活性大分子跨膜转运入细胞内的技术取得了突破性进展。国内外学者在对一些病毒感染特性的研究中相继发现了一类蛋白结构域，如：HIV-1 Tat（48～60）、VP22 (267～300)，以及果蝇蛋白ANTP（43～58）等具有介导异源蛋白、寡聚核酸、金属螯合物等生物活性大分子直接跨过细胞膜进入胞浆和核内的功能，这一类富含阳离子、具有穿膜功能的短肽被称之为细胞膜穿透肽（cell-penetrating peptides，CPPs）、穿膜肽或蛋白转导域（proteintransduction domains，PTDs）。1988年Green和Frankel等首次发现TAT——人免疫缺陷病毒（HIV）的转录调节蛋白可以穿透细胞膜/核膜进入细胞浆/细胞核，随后的研究发现，该蛋白第48-60位氨基酸残基（YGRKKRRQRRR）形成的肽段即可完全发挥其穿膜功能。以后又相继发现了多个源自病毒或其他生物的CPP，如I型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus type 1,HSV-1）蛋白的VP22、果蝇同源触角蛋白（drosophila hemeoprotein antennapedia transcription protein,ANTP）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的前S抗原等。依据其来源不同可将已经发现的CPP大致分为两类：一类为如上面提及的TAT、VP22、ANTP和前S抗原来源于病毒的短肽等；另一类为根据天然CPPs的特点人工合成的短肽如多聚精氨酸、MPG、PEP-1、MAP、transportan和各种基于不同信号序列合成的肽段等。CPPs能在体外或体内作为载药多肽，介导一系列生物活性分子如DNA、siRNA、多肽、蛋白质甚至纳米颗粒等进入细胞，发挥各自的生物学效应。这些CPPs因基本无毒副作用、不干扰所携带生物大分子活性，而被广泛用于体外或/和体内向细胞内运送生物活性分子，尤其是在抗肿瘤治疗的应用研究方面更是引人注目。CPPs研究在基础生物学和应用研究上都具有极大意义，作为一种有效的胞内运载工具，有着广泛的应用前景（图19）。
然而来源于病毒或其他种属生物蛋白结构域的CPP，在临床应用上可能仍然存在一定的安全隐患，比如可能的细胞毒性和免疫原性问题。人们对TAT作为CPP进行了大量研究，腹腔注射Tat-β-半乳糖苷酶，能进入小鼠各种脏器组织，甚至可以透过血脑屏障进入脑组织。但由于TAT源于HIV病毒蛋白而恐存有安全忧患，一直未能用于临床研究。另有报道称，应用TAT携带药物的上呼吸道喷雾引发了严重的肺部病理反应。可见，针对不同治疗需要，开发更为安全的、新型穿膜肽－－人源性穿膜肽（hCPP）是非常必要的。
2002年，Beck-Sickinger AG小组开创性地发现了第一个人源性穿膜肽－来源于人降血钙素（hCT）的第9-32的残基。随后相继报道的人源性穿膜肽还有来自于hCLOCK蛋白（一种与生物节律调节有关的蛋白，2004年）、Hph-1(一种人源转录因子，2006年)、Bag-1蛋白（一种可与Bcl-2相互作用的激活糖皮质激素受体的蛋白，2006年）、p14ARF蛋白（一种人抑癌基因蛋白，2008年）、人乳铁蛋白（2009年）、人Cytc77-101及Cytc86-101（2010年）和TCTP蛋白（来源于人翻译控制肿瘤蛋白氨基末端10个氨基酸残基，2011年）的CPPs。与其他生物来源的CPPs相比，人源性CPPs引起人体的免疫反应的可能性比较小，潜在的不安全因素相对较少。因此，作为临床应用的药物分子载体有着更广阔的应用前景。
2001年,Futaki S等发现穿膜肽的穿膜能力与多肽序列中精氨酸残基的数量有很大的相关性。我们在从事细胞穿膜肽研究中，通过对蛋白数据库中一级结构的检索、分析发现人源性的赖氨酸特异性去甲基化转移酶4A内的一段长为20个氨基酸的短肽的一级结构富含Arg、Lys类碱性氨基酸，分布着很强的正电荷，这与大多数已知的CPPs的结构特点很相似，继而分析其二级结构，发现它可形成经典的α-螺旋构象。推测这段短肽可能是具有自主穿膜功能的新型的人源性穿膜肽。我们继而合成了这段短肽并命名为hPP10，观察了其对培养细胞的穿膜效率，对培养细胞毒性及穿膜机制，同时还观察、评估了其递送绿色荧光蛋白（GFP）和质粒DNA的效果，为hPP10作为一种新型人源性药物运输载体的开发提供了科学依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型人源性细胞穿膜肽hPP10的生产及其介导质粒DNA转染的方法。
一方面，本发明提供了一种新型人源性细胞穿膜肽hPP10的生产方法，可以在实验室水平或工业水平进行合成，生产方法包括化学合成和基因工程表达法。
1.化学合成方法：此种方法是选择羧基树脂（Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin），采用固相Fmoc法合成。具体合成步骤如下：
（1）用Fmoc基团对α-氨基进行保护的赖氨酸通过一个支臂连结到不溶性载体王氏树脂（Wang resin）上；
（2）用TFA(三氟乙酸)溶液洗涤赖氨酸―支臂―树脂，使α-氨基脱保护；
（3）将第二个预先用适当的缩合剂DCC活化的α-氨基保护的异亮氨酸通过耦联反应与赖氨酸形成共酯连接上去；
（4）用TFA(三氟乙酸)溶液洗涤异亮氨酸―支臂―树脂，使α-氨基脱保护；
（5）将第三个预先用适当的缩合剂DCC活化的α-氨基保护的脯氨酸通过耦联反应与异亮氨酸形成共酯连接上去；重复进行上述脱保护、耦联，直到耦合上最后一个氨基酸——精氨酸，脱去Fmoc保护基团，合成完成；
（6）将切割试剂加入到肽——树脂中，把肽链从树脂上切割下来，同时也将各个氨基酸上的侧链保护基团从肽链上切割下来，加入乙醚，沉淀多肽，获得多肽粗品；
（7）运用HPLC/MS进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽。
2.基因工程表达法，采用原核表达方法，包括以下步骤：
（1）设计编码hPP10的两条单链cDNA，两侧带有NdeI和XhoI酶切位点，交由上海生工公司合成单链寡聚核苷酸链，再将两条单链DNA等量加入水溶液中，经95℃，5分钟，自然冷却至室温使其完成退火，形成互补的双链DNA片段（hPP10）；
（2）利用NdeI/XhoI两种限制性内切酶进行双酶切，37℃温育两小时，将表达质粒pET15b(购自Novagen)线性化；
（3）进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪的长波紫外光照射下，切胶回收含线性化质粒pET15b的条带；瞬时离心，将凝胶集中至管底，依切胶回收试剂盒内的操作说明完成切胶回收；
（4）将回收、纯化的线性化质粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段（hPP10）分别进行琼脂糖凝胶电泳，确定连接比例，置于16℃水浴箱中温育过夜连接；
（5）CaCl2法制备DH5ａ感受态细胞；运用热休克法以上述连接产物pET15b-hPP10转化感受态细胞，经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜筛选后，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；
（6）离心沉淀收集扩增转化细菌，用碱裂解法提取重组质粒，筛选成功构建的阳性克隆pET15b-hPP10，酶切并测序验证；
（7）将验证正确的重组原核质粒pET15b-hPP10转化Rosetta感受态细菌；经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜；
（8）挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素LB培养基，37℃振荡培养过夜；
（9）用15ml无菌离心管装3.8ml Amp(+)LB液体培养基，接种0.2ml对数生长期的菌悬液（1:20）；37℃，250rpm继续培养3h；
（10）于对数生长期细菌培养物中加入40μl 0.1M IPTG至终浓度1.0mM，37℃，250rpm继续培养；
（11）在加入IPTG后6h取样200μl菌悬液；
（12）离心收集沉淀，用等体积1×Sample Buffer重悬，沸水浴5min；制备菌体全蛋白裂解液样品；
（13）上样，SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况如图3。所述SDS-PAGE分析所表达的融合蛋白，在小于14.4KD处出现一条强表达带。确认目的肽hPP10(含6xHis标签)的表达及纯化。
（14）确认目的肽hPP10-6xHis表达正确后，大量培养转化菌，裂解，镍柱纯化，制备hPP10-6xHis。融合肽的纯化是利用6×His标签，通过Ni-NTA亲和层析得到有效纯化，融合蛋白的纯度大于80%。六聚组氨酸（6xHis）标签用于hPP10的纯化，但是并不需要从成品hPP10上剪切下来，因为6xHis将有助于细胞穿膜肽的穿膜，提高穿膜效率。
另一方面，本发明提供了一种新型人源性细胞穿膜肽hPP10介导的质粒DNA转染方法，包括两方面的内容。
1.hPP10介导红色荧光素酶表达质粒pDsRed（购自Clontech公司）转染的方法，包括以下步骤：
（1）取对数生长期培养细胞ECV-304，以1×105个细胞/孔的接种密度接种于12孔板常规培养，同时设置相应的阳性和阴性孔；
（2）置37℃5%CO2培养箱中，培养24h，至细胞密度达到70%-80%时，将培养液换成无血清的RPMI-1640培养液，继续培养1小时；
（3）与此同时准备转染样品：
a.取终浓度为10μM hPP10加入含50μl Opti-MEM的离心管中，轻轻混匀后在室温下孵育5min；
b.取0.8μg的质粒加入含50μl Opti-MEM的另外一个离心管中，轻轻混匀后在室温下孵育5min；
c.将b缓慢地加入到a中，混匀后室温静置30min；
（4）将上述hPP10+质粒DNA混合溶液均匀地加入到相应的培养细胞孔中，轻摇混匀，以市售脂质体Lipofectamine 2000作为转染实验阳性对照；
（5）置细胞于二氧化碳培养箱中37℃继续温育4-6h后，置换成含小牛血清正常培养液，继续培养24-48h；
（6）倒置荧光显微镜下观察转染效果，以脂质体Lipofectamine 2000转染试剂转染细胞，TAT介导转染细胞作为阳性对照，拍照记录hPP10介导的质粒DNA转染效果。
ECV-304细胞经hPP10介导转染质粒pDsRed的效果见图8。
由图8结果可见，细胞中有明显红色荧光蛋白表达。证明hPP10能介导质粒DNA转染。
再一方面，本发明提供了一种人源性细胞穿膜肽hPP10介导质粒pcDNA3.1-Gluc转染的方法，包括以下步骤：
（1）取对数生长期培养细胞ECV-304，以1×105个细胞/孔的接种密度接种于12孔板常规培养，同时设置相应的阳性和阴性孔；
（2）置37℃5%CO2培养箱中，培养20~24h，至细胞密度达到70%-80%时，将培养液换成无血清的RPMI-1640培养液，继续培养1小时；
（3）与此同时准备转染样品：
a.取终浓度为10μM hPP10加入含50μl Opti-MEM的离心管中，轻轻混匀后在室温下孵育5min；
b.取0.8μg的质粒加入含50μl Opti-MEM的另外一个离心管中，轻轻混匀后在室温下孵育5min
c.将b缓慢地加入到a中，混匀后室温静置30min；
（4）将hPP10+质粒混合物均匀的加入到相应的培养细胞孔中，轻摇混匀。以市售脂质体Lipofectamine 2000作为转染实验阳性对照；
（5）在5%CO2培养箱中，37℃继续温育4-6h后，置换成含小牛血清正常培养液，继续培养24-48h；
（6）取200μl培养液上清（含分泌型荧光素酶）置于1.5ml离心管中，5000rpm离心3min，依分泌型荧光素酶试剂盒使用说明，运用荧光微孔测定仪，检测培养上清荧光素酶活性，以脂质体Lipofectamine 2000转染试剂阳性对照，TAT和无意义肽NCO作为穿膜肽阳性和阴性对照，各处理样品中荧光素酶活性结果见图11。
图11可见，hPP10成功介导了分泌型荧光素酶质粒pcDNA3.1-Gluc转染，细胞表达了较高水平的荧光素酶蛋白，且其活性随着hPP10浓度的增高而逐步增强。
本发明的优点在于，与其他生物来源的CPPs相比，人源性CPPs—hPP10引起人体的免疫反应的可能性比较小，潜在的不安全因素相对较少。因此，作为临床应用的药物分子载体有着更广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明新型人源性穿膜肽hPP10的二级轮状结构示意图。
图2是本发明新型人源性穿膜肽hPP10的二级结构中存在的螺旋及叠折分析示意图。
图3是hPP10的基因工程表达及纯化图。
M:蛋白分子量标志；
1：pET15b-hPP10质粒转化细菌IPTG诱导前裂解液；
2：pET15b-hPP10质粒转化细菌IPTG诱导后裂解液；
3：纯化后的hPP10-6xHis。
图4是hPP10-FITC穿膜进入不同细胞后胞内荧光分布情况。
图5表示不同浓度hPP10-FITC的穿膜效率。A：ECV-304胞内荧光镜下观；B：ECV-304胞内荧光定量。
图6表示孵育时间对hPP10-FITC入胞的影响。
A：hPP10-FITC短时间孵育后的荧光定量；
B：TAT-FITC短时间孵育后的荧光定量；
C：hPP10-FITC长时间孵育后的荧光定量；
D：TAT-FITC长时间孵育后的荧光定量。
图7表示血清对hPP10-FITC穿膜效率的影响。
图8表示不同细胞经5%DMSO预处理对hPP10-FITC穿膜效率的影响。A：DMSO预处理各种不同类型细胞后胞内荧光分布情况；B：DMSO预处理不同培养细胞后的胞内荧光定量。
图9表示hPP10介导质粒pDsRed转染的效果。
图10表示pcDNA3.1-Gluc重组质粒提取和BamH I/Xbal I的双酶切鉴定。
泳道1：pcDNA3.1-Gluc；泳道2：pcDNA3.1-Gluc的Nco I/BamH I的双酶切。
图11表示hPP10介导质粒pcDNA3.1-Gluc转染的效果。
图12表示pET15b-hPP10-GFP重组质粒提取和Nde I/BamH I的双酶切鉴定。
泳道1：pET15b-hPP10-GFP；泳道2：pET15b-hPP10-GFP的Nde I/BamH I的双酶切。
图13表示SDS-PAGE分析pET15b-GFP、pET15b-hPP10-GFP在Rosetta中的诱导表达及纯化。
泳道3和4分别为：纯化的GFP和hPP10-GFP融合蛋白；
泳道2和5分别为：IPTG诱导后GFP和hPP10-GFP表达质粒转化细菌裂解液；
泳道1和6分别为：未经IPTG诱导GFP和hPP10-GFP表达质粒转化细菌裂解液。
图14表示hPP10-GFP融合蛋白处理L929细胞株后的穿膜情况。
图15表示MTT检测hPP10-FITC处理后对细胞活力的影响。
图16表示不同温度下DMSO预处理后荧光短肽在胞内的含量。
图17表示不同内吞抑制剂对hPP10穿膜效率影响。
A：肝素处理各种不同类型细胞后胞内荧光强度；
B：氯喹预处理不同培养细胞后胞内荧光强度；
C：氯丙嗪处理不同培养细胞后的胞内荧光强度。
图18是新型治疗分子胞内递送策略示意图。
图19是细胞穿膜肽（CPP）及其可携带入胞的生物药物的工作原理示意图。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的方案做更详细的说明。
实施例1、CPPs一级结构、二级结构分析，预测、鉴定新型人源性CPPs：
二级结构分析采用了emboss的在线分析程序（其分析程序请参见网页：http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/pepwheel在线分析多肽的轮状结构；http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/在线分析二级结构的螺旋、叠折等）。hPP10的轮状结构示意图，螺旋、叠折结构示意图分别如图1和图2所示。
首先，人工合成绿色荧光标记的hPP10：
FITC-
Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg（hPP10-FITC）
和无绿色荧光标记hPP10：
Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg(hPP10)
纯化定量、冷冻保存备用。
hPP10的生产途径有两种：1）化学合成；2）基因工程表达。
hPP10源于自然蛋白，可以在实验室水平或工业水平进行合成的方法。1）化学合成方法：是采用固相合成法，即采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法。以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来。经过HPLC纯化等处理，即得所要的多肽。此种方法是选择羧基树脂（Fmoc-Tyr(tBu)-Wangresin），采用固相Fmoc法合成。
具体合成步骤如下：
（1）用Fmoc基团对α-氨基进行保护的赖氨酸通过一个支臂连结到不溶性载体王氏树脂（Wang resin）上；
（2）用TFA(三氟乙酸)溶液洗涤赖氨酸―支臂―树脂，使α-氨基脱保护；
（3）将第二个预先用适当的缩合剂DCC活化的α-氨基保护的异亮氨酸通过耦联反应与赖氨酸形成共酯连接上去；
（4）用TFA(三氟乙酸)溶液洗涤异亮氨酸―支臂―树脂，使α-氨基脱保护；
（5）将第三个预先用适当的缩合剂DCC活化的α-氨基保护的脯氨酸通过耦联反应与异亮氨酸形成共酯连接上去；重复进行上述脱保护、耦联，直到耦合上最后一个氨基酸——精氨酸，脱去Fmoc保护基团，合成完成；
（6）将切割试剂加入到肽——树脂中，把肽链从树脂上切割下来，同时也将各个氨基酸上的侧链保护基团从肽链上切割下来，加入乙醚，沉淀多肽，获得多肽粗品；
（7）运用HPLC/MS进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽。
2）基因工程表达法：我们采用的是原核表达方法，即将编码hPP10的cDNA插入到pET原核表达质粒的多克隆位点，起始编码ATG下游，转化大肠杆菌，经过扩增培养大肠杆菌，IPTG诱导表达，纯化制备而成。
具体包括以下步骤：
（1）设计编码hPP10的两条单链cDNA，两侧带有NdeI和XhoI酶切位点，交由上海生工公司合成单链寡聚核苷酸链，再将两条单链DNA等量加入水溶液中，经95℃，5分钟，自然冷却至室温使其完成退火，形成互补的双链DNA片段（hPP10）；
（2）利用NdeI/XhoI两种限制性内切酶进行双酶切，37℃温育两小时，将表达质粒pET15b(购自Novagen)线性化；
（3）进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪的长波紫外光照射下，切胶回收含线性化质粒pET15b的条带；瞬时离心，将凝胶集中至管底，依切胶回收试剂盒内的操作说明完成切胶回收；
（4）将回收、纯化的线性化质粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段（hPP10）分别进行琼脂糖凝胶电泳，确定连接比例，置于16℃水浴箱中温育过夜连接；
（5）用CaCl2法制备DH5ａ感受态细胞，用热休克法以上述连接产物pET15b-hPP10转化感受态细胞，经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜筛选后，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；
（6）离心沉淀收集扩增转化细菌，用碱裂解法提取重组质粒，筛选成功构建的阳性克隆pET15b-hPP10，酶切并测序验证;
（7）将验证正确的重组原核质粒pET15b-hPP10转化Rosetta感受态细菌；经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜；
（8）挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素LB培养基，37℃振荡培养过夜；
（9）用15ml无菌离心管装3.8ml Amp (+)LB液体培养基，接种0.2ml对数生长期的菌悬液（1:20）；37℃，250rpm继续培养3h；
（10）于对数生长期细菌培养物中加入40μl 0.1M IPTG至终浓度1.0mM，37℃，250rpm继续培养；
（11）在加入IPTG后6h取样200μl菌悬液；
（12）离心收集沉淀，用等体积1×Sample Buffer重悬，沸水浴5min；制备的菌体全蛋白上样样品；
（13）SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况如图3。SDS-PAGE分析所表达的融合肽，在小于14.4KD处出现一条强表达带。确认目的肽hPP10(含6xHis标签)的表达及纯化。
（14）确认目的肽hPP10-6xHis表达正确后，大量培养转化菌，裂解，镍柱纯化，制备hPP10-6xHis。融合肽的纯化是利用6×His标签，通过Ni-NTA亲和层析得到有效纯化，融合蛋白的纯度大于80%。六聚组氨酸（6xHis）标签用于hPP10的纯化，但是并不需要从成品hPP10上剪切下来，因为6xHis将有助于细胞穿膜肽的穿膜，提高穿膜效率。
1.hPP10具有很强穿膜效能:
1.1hPP10-FITC在胞内分布均匀，具有显著穿膜特征
取对数生长期的四种培养细胞：ECV-304、HeLa、HepG2、PC3，依1×105个细胞/孔的密度接种于12孔板常规培养，设实验组及对照组；
至对数生长期（80%密度）时，换成无血清的RPMI-1640培养液继续培养1小时；
加入终浓度10μM hPP10-FITC，常规培养1小时；
弃去孵育液，PBS洗涤3次；
荧光显微镜下观察培养细胞内荧光及其胞内定位情况。
参见图4，荧光显微镜观察发现，未经hPP10-FITC处理的各种细胞内不见绿色荧光。在经hPP10-FITC处理组胞后，可见到明显的绿色荧光，且这四种不同来源的细胞均有荧光，提示hPP10穿膜进入细胞没有明显嗜向性。
1.2hPP 10-FITC穿膜进入细胞具有浓度依赖性
ECV-304细胞在经无血清的RPMI-1640处理1h后，加入浓度梯度的hPP10-FITC（2.5μM、5.0μM、7.5μM、10.0μM）孵育1h后，PBS清洗3次，观察培养细胞内荧光情况。对于测荧光数值，我们采用荧光酶标仪进行检测，具体方法如下：在不同浓度hPP10-FITC孵育结束后，PBS清洗3次，按300μl/孔加入0.1M NaOH，室温裂解细胞10min，1000rpm离心3min。取细胞裂解液上清50μl到96孔板于荧光酶标仪，于490nm/520nm下测定荧光吸光值。实验重复3次取平均值。在实验中，采用公认的经典穿膜肽TAT-FITC作为阳性对照。
图5A显示，胞内荧光强度随hPP10-FITC浓度升高而增强，并且可见胞内hPP10-FITC荧光比TAT-FITC强。图5B直方图中可见，当短肽浓度为5μM时，其荧光强度已经较高，随着hPP10-FITC浓度的进一步升高，其荧光值也随之增强。提示hPP10-FITC穿膜进入细胞具有浓度依赖性。在后续实验中均选用了5μM的hPP10-FITC作为终浓度进行实验。
1.3hPP10胞内持续时间显著长于TAT
使用不同的培养细胞，COS7、ECV-304、PC3、HeLa在经无血清的RPMI-1640培养处理1h后，加入终浓度为5μM的hPP10-FITC分别孵育0.5h、1.0h、2.0h及4.0h后，PBS清洗3次，依上述方法用荧光酶标仪检测490nm/520nm处荧光吸光值。随后延长孵育时间至5h、10h、20h及30h后，检测ECV-304、PC3和HeLa这三种细胞的荧光吸光值。实验均重复3次取平均值。
由图6A可见，不同的培养细胞随着hPP10-FITC孵育时间的延长，其荧光值均有所增强，至4h其荧光值为最高。而图6B则显示，TAT-FITC在1h时，其荧光强度为最大，随着孵育时间的进一步延长，其荧光值相应减弱。为了进一步确定hPP10-FITC荧光强度在胞内维持时间，将孵育时间延长至30h。图6C是hPP10-FITC在ECV-304、PC3和HeLa三种细胞中，5h、10h、20h及30h的荧光强度；而图6D是TAT-FITC在ECV-304、PC3和HeLa三种细胞5h、10h、20h及30h胞内荧光强度。结果提示，hPP10-FITC在胞内可以维持很高的荧光强度至30小时无明显减弱；而TAT-FITC在胞内的荧光强度随着时间推移急剧下降，于10小时时胞内荧光已经非常微弱，20小时时则检测不到荧光。本研究显示新型人源性穿膜肽hPP10在胞内维持时间至少可达30小时，而TAT在胞内仅能维持短短几小时时间，显著小于hPP10。
1.4血清降低hPP10-FITC穿膜效率
培养细胞HepG2、ECV-304及B16分别在经有血清和无血清的RPMI-1640培养1h后，加入终浓度为5μM的hPP10-FITC继续孵育1h后，PBS清洗3次，裂解细胞，取其上清液用荧光酶标仪检测490nm/520nm波长处荧光吸光值。实验重复3次取平均值。
参见图7，一般情况下血清的存在会影响细胞对短肽的内吞摄取。通过荧光定量检测发现，血清的存在对短肽穿膜入胞有很大影响。无血清组hPP10穿膜效率明显高于有血清组(P＜0.05)。结果显示血清的存在影响hPP10的穿膜效率。
1.5DMSO预处理促进hPP10穿膜效率
取对数生长期贴壁细胞HSC-T6、Caski、ECV-304、悬浮培养细胞THP1及原代培养纤维细胞，按照1×105个细胞/孔的接种密度接种于12孔板进行常规培养。每种细胞均分设实验组及对照组；
至对数生长期（80%密度）时，换为无血清的RPMI-1640培养液，再培养1小时；
每孔加入终浓度为5%的DMSO，继续常规培养1小时。加入终浓度为5μM的hPP10-FITC/TAT-FITC后，孵育1小时；
弃去以上孵育液，PBS洗涤3次；
荧光显微镜下观察HSC-T6、Caski、ECV-304、悬浮培养细胞THP1及原代培养纤维细胞胞内荧光及其胞内定位情况，或按300μl/孔加0.1M NaOH，室温分别裂解ECV-304，Caski或B16细胞10分钟，1000rpm离心3分钟。取细胞裂解液上清50μl到96孔板于荧光酶标仪，于490nm/520nm下测定荧光吸光值。实验重复3次取平均值。
本发明人前期工作研究发现DMSO可以明显增强TAT穿膜效率，在此，我们也观察了DMSO对新型人源性穿膜肽膜hPP10的穿膜影响。通过荧光显微镜观察发现，DMSO对hPP10-FITC穿膜具有明显增强效果。与经过DMSO预处理后TAT-FITC穿膜效率相比，DMSO预处理细胞后hPP10-FITC穿膜效率与TAT相当或略强于TAT-FITC（图8A）。经DMSO预处理后，hPP10-FITC在胞内显示很强绿色荧光，胞浆和胞核荧光分布均匀，即使是悬浮细胞和原代细胞hPP10-FITC也具有理想的穿膜效果。荧光定量检测发现，5%DMSO预处理后，hPP10-FITC和TAT-FITC的胞内荧光强度较未经DMSO预处理细胞强（图8B），hPP10-FITC的胞内荧光强度明显强于TAT-FITC。提示5%DMSO预处理细胞明显存进了hPP10和TAT的穿膜效率，DMSO对CPPs穿膜效率增强作用无细胞特异性(图8)。
实施例2、hPP10介导质粒DNA转染
1.hPP10介导红色荧光素酶表达质粒pDsRed（购自Clontech公司）转染的方法，包括以下步骤：
（1）取对数生长期培养细胞ECV-304，以1×105个细胞/孔的接种密度接种于12孔板常规培养，同时设置相应的阳性和阴性孔；
（2）置37℃5%CO2培养箱中，培养24h，至细胞密度达到70%-80%时，将培养液换成无血清的RPMI-1640培养液，继续培养1小时；
（3）与此同时准备转染样品：
a.取终浓度为10μM hPP10加入含50μl Opti-MEM的离心管中，轻轻混匀后在室温下孵育5min；
b.取0.8μg的质粒加入含50μl Opti-MEM的另外一个离心管中，轻轻混匀后在室温下孵育5min；
c.将b缓慢地加入到a中，混匀后室温静置30min；
（4）将上述hPP10+质粒DNA混合溶液均匀地加入到相应的培养细胞孔中，轻摇混匀，以市售脂质体Lipofectamine 2000作为转染实验阳性对照；
（5）置细胞于二氧化碳培养箱中37℃继续温育4-6h后，置换成含小牛血清正常培养液，继续培养24-48h；
（6）倒置荧光显微镜下观察转染效果，以脂质体Lipofectamine 2000转染试剂转染细胞，TAT介导转染细胞作为阳性对照，拍照记录hPP10介导的质粒DNA转染效果。
ECV-304细胞经hPP10介导转染质粒pDsRed的效果见图9。
由图9结果可见，细胞中有明显红色荧光蛋白表达。证明hPP10能介导质粒DNA转染。
再一方面，本发明提供了一种人源性细胞穿膜肽hPP10介导质粒pcDNA3.1-Gluc转染的方法，包括以下步骤：
（1）取对数生长期培养细胞ECV-304，以1×105个细胞/孔的接种密度接种于12孔板常规培养，同时设置相应的阳性和阴性孔；
（2）置37℃5%CO2培养箱中，培养20~24h，至细胞密度达到70%-80%时，将培养液换成无血清的RPMI-1640培养液，继续培养1小时；
（3）与此同时准备转染样品：
a.取终浓度为10μM hPP10加入含50μl Opti-MEM的离心管中，轻轻混匀后在室温下孵育5min；
b.取0.8μg的质粒加入含50μl Opti-MEM的另外一个离心管中，轻轻混匀后在室温下孵育5min
c.将b缓慢地加入到a中，混匀后室温静置30min；
（4）将hPP10+质粒混合物均匀的加入到相应的培养细胞孔中，轻摇混匀。以市售脂质体Lipofectamine 2000作为转染实验阳性对照；
（5）在5%CO2培养箱中，37℃继续温育4-6h后，置换成含小牛血清正常培养液，继续培养24-48h；
（6）取200μl培养液上清（含分泌型荧光素酶）置于1.5ml离心管中，5000rpm离心3min，依分泌型荧光素酶试剂盒使用说明，运用荧光微孔测定仪，检测培养上清荧光素酶活性，以脂质体Lipofectamine 2000转染试剂阳性对照，TAT和无意义肽NCO作为穿膜肽阳性和阴性对照，各处理样品中荧光素酶活性结果见图11。
图11可见，hPP10成功介导了分泌型荧光素酶质粒pcDNA3.1-Gluc转染，细胞表达了较高水平的荧光素酶蛋白，且其活性随着hPP10浓度的增高而逐步增强。
本研究成功利用hPP10介导了质粒DNA（pDsRed和pcDNA3.1-Gluc）的转染，但是其转染效率与商用试剂Lipofectamin 2000相比显得较低，仍需我们继续优化其转染条件，以期提高hPP10的转染效率。hPP10成功介导DNA质粒的转染将为体外和体内的基因转染提供强有力工具，可应用到科研和基因治疗的临床应用。
实施例3、hPP10-GFP融合蛋白的表达及纯化和其穿膜功效的研究
基因工程表达法，采用原核表达方法，包括以下步骤：
（1）设计编码hPP10的两条单链cDNA，两侧带有NdeI和XhoI酶切位点，交由上海生工公司合成单链寡聚核苷酸链，再将两条单链DNA等量加入水溶液中，经95℃，5分钟，自然冷却至室温使其完成退火，形成互补的双链DNA片段（hPP10）；同时设计一对引物以pEGFP(购自Clontech公司)为模板，PCR获得GFP蛋白基因片段，两侧分别有XhoI和BamHI酶切位点，纯化PCR产物备用；
（2）利用BamHI/NdeI两种限制性内切酶进行双酶切，37℃温育两小时，将表达质粒pET15b(购自Novagen)线性化；
（3）进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪的长波紫外光照射下，切胶回收含线性化质粒pET15b的条带；瞬时离心，将凝胶集中至管底，依切胶回收试剂盒内的操作说明完成切胶回收；
（4）将回收、纯化的线性化质粒DNA片段和退火后的穿膜肽cDNA片段（hPP10）、以及GFP基因片段分别进行琼脂糖凝胶电泳，确定连接比例，置于16℃水浴箱中温育过夜连接；
（5）用CaCl2法制备DH5ａ感受态细胞，用热休克法以上述连接产物pET15b-hPP10转化感受态细胞，经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜筛选后，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；
（6）离心沉淀收集扩增转化细菌，用碱裂解法提取重组质粒，筛选成功构建的阳性克隆pET15b-hPP10-GFP，酶切并测序验证；
（7）将验证正确的重组原核质粒pET15b-hPP10-GFP转化Rosetta感受态细菌；经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜；
（8）挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素LB培养基，37℃振荡培养过夜；
（9）用15ml无菌离心管装3.8ml Amp(+)LB液体培养基，接种0.2ml对数生长期的菌悬液（1:20）；37℃，250rpm继续培养3h；
（10）于对数生长期细菌培养物中加入40μl 0.1M IPTG至终浓度1.0mM，37℃，250rpm继续培养；
（11）在加入IPTG后6h取样200μl菌悬液；
（12）离心收集沉淀，用等体积1×Sample Buffer重悬，沸水浴5min；制备菌体全蛋白裂解样品；
（13）SDS-PAGE检测重组蛋白hPP10-GFP的表达情况如图13。确认的表达及纯化。
阳性克隆pET15b-hPP10-GFP提取质粒后，利用Nde I/BamH I双酶切得到产物理论值为795bp，切出片段与预期大小一致；之后重组质粒经测序无PCR引起的突变。说明原核表达质粒pET15b-hPP10-GFP构建成功（图12）。
同时构建pET15b-GFP原核表达质粒，表达GFP蛋白作为阴性对照；GFP和hPP10-GFP相对分子质量分别为27KD和30KD，阳性克隆在1mM IPTG诱导6小时后，经SDS-PAGE分析所表达的融合蛋白，在35KD和27KD附近出现一条强表达带，符合预期分子质量大小，融合蛋白的纯化是利用6×His标签，通过Ni-NTA亲和层析得到有效纯化，融合蛋白的纯度大于80%。带有His标签的融合蛋白有助于突破内涵体释放进入细胞浆。
融合蛋白穿膜功效的研究
（1）取对数生长期培养细胞L929，按照1×105个细胞/孔的接种密度接种于12孔板常规培养。每种细胞均分设实验组及对照组；
（2）待细胞生长至80%融合时，换为无血清的培养液，继续培养1小时；
（3）每孔加入终浓度为5%DMSO，继续常规培养1小时；
（4）实验组加入终浓度为5μM的融合蛋白hPP10-GFP，对照组则加入相同浓度的蛋白GFP，37℃培养箱孵育1小时；
（5）弃去以上清培养液，PBS洗涤三次；
（6）置于荧光显微镜下观察hPP10-GFP融合蛋白穿膜及胞内定位情况。
L929细胞株经5%DMSO预处理1h后，培养基中加入hPP10-GFP融合蛋白，继续孵育1h后，荧光显微镜下观察到细胞内呈现出清晰明亮的绿色荧光，胞内荧光分布均匀，其荧光强度略微强于TAT-GFP；单独GFP则不能进入细胞；未经DMSO预处理只有融合蛋白hPP10-GFP孵育的对照组中，胞内荧光较弱(图14)。显示5%DMSO预处理细胞后，hPP10自身并携带大分子（绿色荧光蛋白）高效穿膜进入细胞，在胞内均匀分布。提示hPP10不仅自身可以穿膜进入细胞，也可通过融合蛋白形式携带大分子蛋白跨膜进入细胞，为将来开发由hPP10作为载体向细胞内递送大分子蛋白药物提供了基础。
实施例4、hPP10对细胞活力影响甚微
（1）取对数生长期培养细胞ECV-304和HepG2，以1×104个细胞/孔的接种密度接种于96孔板常规培养，每孔100μl，每种细胞设3个复孔，37℃培养；
（2）至对数生长期，培养液换成无血清的RPMI-1640培养液，继续培养1小时；
（3）分别换成hPP10浓度梯度为10μM、20μM、30μM、40μM及50μM无血清的RPMI-1640培养液，继续培养24小时；
（4）孵育时间结束后按每孔100μl加入PBS洗涤，2min×3次；
（5）每孔加入80μl含血清的正常培养液及20μl MTT（母液浓度5mg/ml，即0.5%MTT）溶液，于37℃继续培养4h，终止培养后吸去培养液。以200μl/孔加入二甲基亚砜，振荡10min至结晶物充分溶解后用全波长酶标仪上检测波长为570nm的吸光值A，每组取3个复孔的平均值。测定OD490。重复3次，计算细胞存活率。
（6）细胞生存率的计算如下：
细胞生存率＝（实验孔OD值－对照孔OD值－空白孔OD值）／（对照孔OD值－空白孔OD值）×100%。
为明确hPP10处理细胞是否会影响其活力，本实验采用MTT法测定不同浓度hPP10处理24h后对细胞活力的影响情况。ECV-304和HepG2细胞经不同浓度hPP10-FITC处理后MTT分析数据显示，远远高于有效浓度（5μm）的hPP10-FITC（达20μm）长时间处理细胞后细胞依然保持在75%以上，对细胞的活力影响甚微（图15）。提示我们使用范围内hPP10-FITC并不影响细胞活力。
实施例5、hPP10穿膜机制
5.1低温轻度抑制hPP10-FITC穿膜
使用不同的培养细胞，如ECV-304、Caski及HeLa在经无血清的RPMI-1640处理1h后，加入终浓度为5μM的hPP10-FITC分别在4℃和37℃两个条件下孵育1h后，PBS清洗3次，依前述方法裂解细胞取其上清检测490nm/520nm波长处的荧光吸光值。实验重复3次取平均值。
一般认为细胞内吞途径是能量依赖的，低温时细胞的能量代谢几乎停滞，也即低温能够阻断细胞内吞途径。若hPP10穿膜方式是通过内吞途径实现，那么温度的变化必然会影响胞内荧光含量。本实验选用在4℃和37℃两个条件探索温度是否影响其穿膜方式。直方图表明，低温对hPP10穿膜影响甚微，没有显著意义（图16）。与迄今大多数报道结果一致。
5.2内吞抑制剂显著降低hPP10穿膜作用
观察三种内吞抑制剂对hPP10-FITC的穿膜影响，肝素钠(PBS溶解,终浓度10μM)、氯喹(PBS溶解，终浓度10μM)、氯丙嗪(PBS溶解，终浓度30μM)配成母液，0.22μm滤膜过滤灭菌。四种不同的培养细胞COS7、ECV-304、PC3和HeLa在用无血清的RPMI-1640培养1h后，相应加入终浓度的三种内吞抑制剂，与细胞孵育30min，加入终浓度为5μM的hPP10-FITC孵育1h，吸出含有抑制剂和短肽的培养基，PBS清洗3次，依上述方法置于荧光酶标仪中，检测490nm/520nm的荧光吸光值。实验重复3次取平均值。
实验通过培养细胞与不同的内吞抑制剂孵育，考察内吞抑制剂对hPP10入胞情况的影响。其中肝素为细胞膜表面硫酸蛋白聚糖的竞争抑制剂；氯喹为抑制内含体酸化的内吞调节剂；氯丙嗪为笼型蛋白依赖的内吞抑制剂。从图17A中看出，在加入肝素后，细胞对hPP10的摄取大幅度降低。提示肝素能显著抑制hPP10被摄取进入细胞，细胞膜表面的硫酸蛋白聚糖对hPP10穿膜进入细胞发挥着重要作用。图17B和17C显示，氯喹和氯丙嗪对hPP10穿膜进入细胞的影响均不明显。提示hPP10穿膜进入细胞的过程中可能不依赖内含体酸化和笼型蛋白依赖的内吞机制。
结论：我们在对现有CPPs结构进行系统分析的基础上，通过对蛋白质数据库进行检索，预测和二级结构分析等方法，发现一全新的人源性细胞膜穿透肽（hCPP），命名为hPP10。人工合成hPP10以及原核表达其与绿色荧光蛋白的融合蛋白（hPP10-GFP）进行了一系列体外实验研究。发现hPP10具有很强的穿膜能力，并可携带大分子GFP，质粒DNA跨膜进入包括肿瘤细胞，原代细胞，悬浮细胞等多种培养细胞，而不影响所携带生物活性分子的功能，对细胞基本无毒副作用。显示hPP10将能作为一种新的人源性细胞穿膜肽，用于体外和体内向细胞内运送生物活性分子（如蛋白质、多肽，基因等药物）。hPP10的开发将为科研（体外培养细胞基因转染）和临床治疗（向细胞内递送蛋白或基因药物）提供又一新型胞内运输工具。
Claims (5)
1.一种人源性细胞穿膜肽hPP10的化学合成方法，包括以下步骤：
（1）用Fmoc基团对α-氨基进行保护的赖氨酸通过一个支臂连结到不溶性载体树脂上；
（2）用三氟乙酸TFA溶液洗涤赖氨酸―支臂―树脂，使α-氨基脱保护；
（3）将第二个预先用适当的缩合剂DCC活化的α-氨基保护的异亮氨酸通过耦联反应与赖氨酸形成共酯连接上去；
（4）用TFA溶液洗涤异亮氨酸―支臂―树脂，使α-氨基脱保护；
（5）将第三个预先用适当的缩合剂DCC活化的α-氨基保护的脯氨酸通过耦联反应与异亮氨酸形成共酯连接上去；重复进行上述脱保护、耦联，直到耦合上最后一个氨基酸精氨酸，脱去Fmoc保护基团，合成完成；
（6）将切割试剂加入到肽-树脂中，把肽链从树脂上切割下来，同时也将各个氨基酸上的侧链保护基团从肽链上切割下来，加入乙醚，沉淀多肽，获得多肽粗品；
（7）运用HPLC/MS进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽，所述hPP10的多肽序列为：
Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述树脂是Fmoc-Tyr(tBu)-Wangresin羧基树脂，合成方法为Fmoc固相合成法。
3.一种人源性细胞穿膜肽hPP10的基因工程表达法，采用原核表达方法，包括以下步骤：
（1）设计编码hPP10的两条单链cDNA，两侧带有NdeI和XhoI酶切位点，合成单链寡聚核苷酸链，再将两条单链DNA等量加入水溶液中，经95℃，5分钟，自然冷却至室温使其完成退火，形成hPP10的互补双链DNA片段；
（2）利用NdeI/XhoI两种限制性内切酶进行双酶切，37℃温育两小时，将表达质粒pET15b线性化；
（3）进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪的长波紫外光照射下，切胶回收含线性化质粒pET15b的条带；瞬时离心，将凝胶集中至管底，依切胶回收试剂盒内的操作说明完成切胶回收；
（4）将回收、纯化的线性化质粒DNA片段和退火后的穿膜肽hPP10的cDNA片段分别进行琼脂糖凝胶电泳，确定连接比例，将混合连接体系置于16℃水浴箱中温育过夜连接；
（5）CaCl2法制备DH5ａ感受态细胞，运用热休克法以上述连接产物pET15b-hPP10转化感受态细胞，经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜筛选后，挑取单菌落接种于含氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；
（6）离心沉淀收集扩增转化细菌，用碱裂解法提取重组质粒，筛选成功构建的阳性克隆pET15b-hPP10，酶切并测序验证；
（7）将验证正确的重组原核质粒pET15b-hPP10转化Rosetta感受态细菌；经0.1g/L氨苄青霉素琼脂平板37℃过夜；
（8）挑取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素LB培养基，37℃振荡培养过夜；
（9）用15ml无菌离心管装3.8ml Amp(+)LB液体培养基，按照1:20的比例接种0.2ml对数生长期的菌悬液，37℃，250rpm继续培养3h；
（10）于对数生长期细菌培养物中加入40μl0.1M IPTG至终浓度1.0mM，37℃，250rpm继续培养；
（11）于加入IPTG后6h取样200μl菌悬液；
（12）离心收菌体集沉淀，用等体积1×Sample Buffer重悬，沸水浴5min，制备全蛋白裂解液；
（13）上样，SDS-PAGE检测、鉴定目的肽hPP10表达情况，所述hPP10的多肽序列为：
Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg。
4.一种人源性细胞穿膜肽hPP10介导红色荧光素酶表达质粒pDsRed转染的方法，包括以下步骤：
（1）取对数生长期培养细胞ECV-304，以1×105个细胞/孔的接种密度接种于12孔板常规培养，同时设置相应的阳性和阴性孔；
（2）置37℃5%CO2培养箱中，培养24h，至细胞密度达到70%-80%时，将培养液换成无血清的RPMI-1640培养液，继续培养1小时；
（3）与此同时准备转染样品；
（4）将上述hPP10+质粒DNA混合溶液均匀地加入到相应的培养细胞孔中，轻摇混匀，以市售脂质体Lipofectamine2000作为转染实验阳性对照；
（5）置细胞于二氧化碳培养箱中37℃继续温育4-6h后，置换成含小牛血清正常培养液，继续培养24-48h；
（6）倒置荧光显微镜下观察转染效果，以脂质体Lipofectamine2000转染试剂转染细胞，TAT介导转染细胞作为阳性对照，拍照记录hPP10介导的质粒DNA转染效果，所述hPP10的多肽序列为：
Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述准备转染样品包括以下步骤：
a.取终浓度为10μM hPP10加入含50μl Opti-MEM的离心管中，轻轻混匀后在室温下孵育5min；
b.取0.8μg的质粒pDsRed加入含50μl Opti-MEM的另外一个离心管中，轻轻混匀后在室温下孵育5min；
c.将b缓慢地加入到a中，混匀后室温静置30min。
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