CN107987129B - 一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用，所述细胞穿膜肽包括如下序列：PRTLRRRRAAQRCG。且所述细胞穿膜肽安全，穿膜效果显著。

Description

一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及电子生物医学领域，尤其涉及一种人源性细胞穿膜肽及其制备方法、应用。

背景技术

机体细胞膜屏障仅仅允许分子量小于600Da的非脂溶性分子进入活细胞，虽对机体有重要的保护作用，但也使许多有应用前景的药物被摒弃。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)，是一些小于30个氨基酸的短肽，能够携带分子量比自身大许多倍的分子进入细胞。细胞穿膜肽有多种分类方式，根据理化性质可以分为阳离子、双亲性和疏水性穿膜肽。

Green和Frankel首次观察到来自HIV-1反式激活因子的TAT序列可以被不同类型的细胞高效吸收，但由于来源于病毒的TAT在临床因安全性方面存在风险，人源性的穿膜肽正不断受到人们的关注。

发明内容

针对上述现有技术中的缺陷，本发明提供了一种人源性细胞穿膜肽及其制备方法、应用，且所述细胞穿膜肽安全，穿膜效果显著。

本发明为解决上述技术问题所提供的技术方案如下：

一方面，提供一种细胞穿膜肽，所述细胞穿膜肽包括如下序列：RRTLRRRRAAQRCG。

另一方面，提供一种上述细胞穿膜肽的制备方法，其包括如下步骤：

S1、提供树脂，且将所述树脂在第一溶剂中浸泡至所述树脂溶胀；

S2、将氨基酸、缩合剂溶于第二溶剂中，形成混合物；

S3、在所述混合物加入溶胀的树脂中形成反应体系，反应时间为1-4h；

S4、去除反应后所述反应体系中的溶液，对残留物洗涤1-5次，气体鼓动，抽干；

S5、在所述残留物中加入脱帽液，气体鼓动，抽干；

S6、去除经由步骤S5后的反应体系中的溶液，洗涤1-10次，气体鼓动，抽干，由此获得合成的多肽链；

S7、在所述多肽链中加入切割液，在4-30℃下搅拌1-4h，过滤得滤液，且洗涤所述滤液；

S8、对经洗涤过的滤液进行萃取，离心得到细胞穿膜肽粗品；

以及S9、对所述细胞穿膜肽粗品进行鉴定和纯化。

优选的，所述树脂包括Fmoc-Wang树脂。

优选的，在步骤S2中，所述缩合剂包括苯并三唑鎓盐型缩合剂；在步骤S1中，所述第一溶剂包括：二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷及四氢呋喃中的一种或几种；在步骤S5中，所述脱帽液包括：DFM溶液，以及溶解于二甲基甲酰胺溶液中的6％W/V的哌嗪和0.1MHOBT；在步骤S7中，所述切割液包括：以重量百分数计，95％的TFA、2％的TIS以及3％的H₂O。

优选的，所述苯并三唑鎓盐型缩合剂包括O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐中的一种或几种。

优选的，每种氨基酸与所述树脂的投料摩尔量比例为(1:1)-(10:1)；所述缩合剂与所述树脂的投料摩尔量比例为(1:1)-(10:1)。

优选的，所述步骤S8中，所述萃取包括：在经洗涤过的滤液中加入无水乙醚，放置1-4h；且所述无水乙醚与滤液的体积比为(5:1)-(60:1)。

另一方面，还提供一种上述细胞穿膜肽的应用方法，所述细胞穿膜肽用于在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。

优选的，携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞的过程包括：所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA。

优选的，所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA的过程包括如下步骤：

S1、将质粒DNA与所述细胞穿膜肽各自混合于磷酸盐缓冲液中；

S2、调整所述质粒DNA与所述细胞穿膜肽两者间的N/P比为0-80；

S3、培养过夜的细胞，用无血清的培养基洗涤，将含有所述质粒DNA和细胞穿膜肽的磷酸盐缓冲液加入到培养基中；

以及S4、4-6h后去掉培养基，添加含有10-15％FCS的培养基，静置1-4h。

本发明技术方案所带来的效果：

本发明的人源性细胞穿膜肽穿膜效果显著，穿膜效率高；且免疫原性低，安全低毒；制备方法操作简单且便于进行质量管控。

附图说明

图1为本发明的细胞穿膜肽与质粒DNA结合后最优N/P比的实验结果图。

图2为本发明的细胞穿膜肽用于BHK21细胞转染结果示意图。

图3为本发明的细胞穿膜肽用于B16细胞转染结果示意图。

图4a为本发明的细胞穿膜肽用于BHK21转染得到的荧光值。

图4b为本发明的细胞穿膜肽用于B16转染得到的荧光值。

图5为本发明的细胞穿膜肽用于BHK21MTT结果示意图。

图6为本发明的细胞穿膜肽用于B16MTT结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一：

发明人通过对人类蛋白质数据库进行检索分析，发现人类的3-磷酸肌醇依赖蛋白激酶1突变体(3-phosphoinositide dependent protein kinase-1 variant)的一段长14个氨基酸的短肽(RRTLRRRRAAQRCG)具有双亲性，推测这段短肽可能是一个新型的具有自主穿膜功能的人源性双亲性穿膜肽，由此提供了本实施例中的人源性细胞穿膜肽(简称PDPK1)，其包括如下序列：RRTLRRRRAAQRCG，其氨基酸序列如序列表所示；其中，所述P选自脯氨酸残基，所述R选自精氨酸残基，所述T选自苏氨酸残基，所述L选自亮氨酸残基，所述A选自丙氨酸残基，所述Q选自谷氨酰胺残基，所述C选自半胱氨酸残基，所述G选自甘氨酸残基。

进一步的，上述细胞穿膜肽的制备方法包括如下步骤：

S1、称取树脂(如Fmoc-Wang树脂)，倒入反应器中，加入第一溶剂(包括二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷及四氢呋喃中的一种或几种)浸泡，直至所述树脂在第一溶剂中浸泡至所述树脂溶胀，再向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时(优选为1.5h)，抽干，再向反应器中加入适量DMF，通氮气鼓动，抽干；重复上述加脱保护液、通氮气鼓动、抽干以及加适量DMF、通氮气鼓动、抽干的操作1-10次(优选为5次)；

S2、称取氨基酸以及缩合剂，且每种氨基酸(包括脯氨酸、甘氨酸、精氨酸及赖氨酸)的摩尔量均为所述树脂摩尔量的1倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的3倍；优选的，所述缩合剂包括苯并三唑鎓盐型缩合剂，且所述苯并三唑鎓盐型缩合剂包括O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐中的一种或几种；再且将氨基酸、缩合剂溶于盛装于反应器内的第二溶剂中，形成混合物；

S3、在所述混合物加入溶胀的树脂中形成反应体系，反应时间为1-4h(优选为3h)，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；

S4、抽干去除反应后所述反应体系中的溶液，加适量DMF对残留物洗涤1-5次(优选为3次)，通氮气鼓动，抽干；

S5、在所述残留物中加入脱帽液，通氮气鼓动1-3h(优选为2h)，抽干，直至茚三酮法检测呈阳性；优选的，所述脱帽液包括：DFM溶液，以及溶解于所述二甲基甲酰胺溶液中的6％W/V的哌嗪和0.1M HOBT；

S6、抽干去除经由步骤S5后的反应体系中的溶液，加适量DMF洗涤1-10次，通氮气鼓动，抽干，由此获得含Arg-Arg-Thr-Leu-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Gln-Arg-Cys-Gly的多肽链；

S7、(8)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，在所述多肽链中加入切割液，在4-30℃(优选为18℃)下恒温机械搅拌1-4h(优选为3h)，过滤得滤液，且用TFA洗涤所述滤液；所述切割液包括：以重量百分数计，95％的TFA、2％的TIS以及3％的H₂O；

S8、过滤所述滤液，将滤液全部收集到烧瓶中；对经洗涤过的滤液进行萃取，高速离心得到细胞穿膜肽粗品；所述萃取包括：在经洗涤过的滤液中加入无水乙醚，放置1-4h(优选为3h)；且所述无水乙醚与滤液的体积比为(5:1)-(60:1)(优选为30:1)；

以及S9、运用HPLC/MS或超滤法或高效毛细管电泳法进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽。

此外，本实施例还提供一种上述细胞穿膜肽的应用方法，具体的，所述细胞穿膜肽用于在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。本实施例中，所述标记物选自荧光素、生物素以及亲和基团中的一种或几种；所述载物分子选自糖类、多肽、蛋白、药物分子前体、纳米粒子及纳米微球中的一种或几种。

其中，携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞的过程包括：所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA；本实施例中，所述质粒选自pEGFP或PdsRED。

具体的，所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA的过程包括如下步骤：

S1、将质粒DNA与所述细胞穿膜肽各自混合于磷酸盐缓冲液中；

S2、调整所述质粒DNA与所述细胞穿膜肽两者间的N/P(即NH⁺³/PO^-4)比为0-80；优选的，调整两者间N/P比分别为0、1、2、5、10、20、40、80；将上述调整好N/P比的质粒DNA与所述细胞穿膜肽混合液进行琼脂糖电泳实验，确定最优N/P比，结果如图1所示，N/P在5左右时，质粒DNA与细胞穿膜肽结合较好，因此，上述两者间N/P比可进一步优选为5；

S3、培养过夜的细胞，用无血清的培养基洗涤，将含有所述质粒DNA和细胞穿膜肽的磷酸盐缓冲液加入到培养基中；

以及S4、4-6h(优选为5h)后去掉培养基，添加含有10-15％FCS(即胎牛血清)的培养基，静置1-4h(优选为3h)。

实施例二：

本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中，每种氨基酸(包括脯氨酸、甘氨酸、精氨酸及赖氨酸)的摩尔量均为所述树脂摩尔量的5倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的10倍。

实施例三：

本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中，每种氨基酸(包括脯氨酸、甘氨酸、精氨酸及赖氨酸)的摩尔量均为所述树脂摩尔量的1倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的10倍。

实施例四：

本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中，每种氨基酸(包括脯氨酸、甘氨酸、精氨酸及赖氨酸)的摩尔量均为所述树脂摩尔量的5倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的1倍。

实施例五：

本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中，每种氨基酸(包括脯氨酸、甘氨酸、精氨酸及赖氨酸)的摩尔量均为所述树脂摩尔量的10倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的10倍。

实施例六：

本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中，种氨基酸(包括脯氨酸、甘氨酸、精氨酸及赖氨酸)的摩尔量均为所述树脂摩尔量的7倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的5倍。

如下示出了本发明的细胞穿膜肽PDPK1与质粒DNA结合后的穿膜效果实验过程，其具体包括如下步骤：

(1)实验组为本发明的细胞穿膜肽，将本发明的细胞穿膜肽PDPK1和pEGFP(或PdsRED)按0、10、20、40、80的N/P比混合，室温或者37℃孵育半个小时或一个小时；对照组为穿膜肽Tat，同样分别与pEGFP(或PdsRED)按0、10、20、40、80的N/P比混合，孵育时间以及温度条件与实验组相同，阳性对照组使用

2000，实验方法按照说明书所示；

(2)培养细胞(分别为BHK21和B16细胞系)过夜，用没有血清的培养基洗两次；实验组中，在细胞中加入质粒DNA和细胞穿膜肽PDPK1，形成实验组混合物，再取所述实验组混合物500μl加入到培养基中；

(3)6小时后去掉原培养基，添加含有10％胎牛血清的新鲜培养基；

(4)1-4小时后显微镜观察；如图2所示，在BHK21细胞系中，本发明的细胞穿膜肽PDPK1与质粒DNA在N/P比为10的条件下结合时，其已能将质粒DNA带入胞内，在N/P比为20时，其穿膜效率即可超过

2000的穿膜效率，且在N/P比为80时，其穿膜效率最高，远高

2000的穿膜效率，同样的，在N/P比为10、20、40、80时，其穿膜效率也都远高于Tat的穿膜效率。类似的，如图3所示，在B16细胞系中，本发明的细胞穿膜肽PDPK1与质粒DNA在N/P比为20的条件下结合时，其已能将质粒DNA带入胞内，在N/P比为80时，其穿膜效率最高；且在N/P比为20、40、80时，其穿膜效率都远高于Tat的穿膜效率。

(5)BHK21或B16细胞系细胞经上述处理4h后经酶标仪检测，得到荧光定量结果，如图4a-4b所示，在BHK21及B16细胞系中，本发明的细胞穿膜肽PDPK1在各个浓度值上，其荧光强度均强于Tat的荧光强度，且均在10μM时，荧光强度最强。

如下示出了本发明的细胞穿膜肽PDPK1细胞毒性实验过程，其具体包括如下步骤：

(1)取对数生长期培养细胞BHK21和B16，以每孔1×10⁴个细胞接种于96孔板，37℃下于5％二氧化碳培养箱中培养24小时，使细胞贴壁；

(2)达到对数生长期时换成无血清的培养液，继续培养1小时；

(3)配置不同浓度的细胞穿膜肽PDPK1，同时设置三个阴性对照孔及阳性对照孔(

2000)，阳性对照孔(

2000)按照说明书操作进行实验；37℃下于5％二氧化碳培养箱培养1-24h；

(4)孵育时间结束后，每孔均加入PBS洗涤；

(5)贴壁细胞每孔加入20μl MTT(0.5％)，继续孵育4-6h之后弃掉培养液，每孔加入150μl DMSO(二甲基亚砜)，震荡10min；

(6)比色：选择490nm或570nm波长，在酶标仪免疫检测仪上测定光吸收值，处理数据得到细胞存活率；结果如图5所示，对于BHK21细胞系，本发明细胞穿膜肽PDPK1在0-27μmol/L的浓度范围内，细胞存活率与阳性对照组无明显差别；如图6所示对于B16细胞系，本发明细胞穿膜肽PDPK1在0-27μmol/L的浓度范围内，细胞存活率与阳性对照组无明显差别；上述实验结果证明本发明涉及的细胞穿膜肽安全低毒，其毒性与

2000无差别，且各浓度的毒性变化不大，无浓度依赖性。

综上所述，本发明的细胞穿膜肽PDPK1具有如下优点：分子量小，氨基酸残基个数少，穿膜效果显著，效率明显高于穿膜肽Tat及

2000转染试剂；免疫原性低，安全低毒，毒性与

2000无差别；可由固相合成方法而得，所述合成方法既可以在实验室水平也可在工业水平进行，操作简单且便于质量管控。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 肽泽（武汉）生物科技有限公司

<120> 一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用

<130> 2017

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Arg Arg Thr Leu Arg Arg Arg Arg Ala Ala Gln Arg Cys Gly

1 5 10

Claims (4)

1.一种细胞穿膜肽，其特征在于：所述细胞穿膜肽为如下序列：

RRTLRRRRAAQRCG。

2.一种如权利要求1所述的细胞穿膜肽的应用方法，其特征在于，所述细胞穿膜肽用于在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。

3.如权利要求2所述的应用方法，其特征在于，携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞的过程包括：所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA。

4.如权利要求3任一项所述的应用方法，其特征在于，所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA的过程包括如下步骤：

S1、将质粒DNA与所述细胞穿膜肽各自混合于磷酸盐缓冲液中；

S2、调整所述质粒DNA与所述细胞穿膜肽两者间的N/P比为0-80，不包括0；

S3、培养过夜的细胞，用无血清的培养基洗涤，将含有所述质粒DNA和细胞穿膜肽的磷酸盐缓冲液加入到培养基中；

以及S4、4-6h后去掉培养基，添加含有10-15％FCS的培养基，静置1-4h。

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