CN108059655B - 一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用，所述细胞穿膜肽包括如下序列：PGRKRRRRRRKG。且所述细胞穿膜肽安全，穿膜效果显著。

Description

一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种人源性细胞穿膜肽及其制备方法、应用。

背景技术

细胞膜作为屏障，使得细胞与周围环境分离开来，仅允许小分子化合物进入细胞。由于许多药物为亲水大分子，生物屏障限制了生物分子如核苷酸、多肽或蛋白质的临床应用。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)，通常由多个氨基酸构成的短肽，能够作为运输载体，通过细胞膜屏障携带物质进入到细胞。CPPs可作为新型非病毒行载体，转运多种生物分子通过生物屏障。这一重要发现为具有治疗效应的生物大分子提供了一个有效的载体，在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运、临床药效评价及细胞免疫学等研究领域均具有良好的应用前景。

现阶段，研究及应用最多的CPPs是来源于人免疫缺陷病毒(HIV-1)的转录活性因子(Trans-activating transcriptional activator TAT)是第一条被发现的穿膜肽，属于典型的阳离子穿膜肽。

目前虽已证实TAT可穿透细胞膜进入细胞内，但其穿膜效率并不理想，不能有效的携带物质转运入细胞内部。而且由于这些蛋白与病毒转染相关，所以可能对人体有潜在致病性，一直未能用于临床。因此，开发更为安全的人源性穿膜肽是非常有必要的。

发明内容

针对上述现有技术中的缺陷，本发明提供了一种人源性细胞穿膜肽及其制备方法、应用，且所述细胞穿膜肽安全，穿膜效果显著。

本实施新型为解决上述技术问题所提供的技术方案如下：

一方面，提供了一种细胞穿膜肽，所述细胞穿膜肽包括如下序列：PGRKRRRRRRKG。

另一方面，还提供一种上述细胞穿膜肽的制备方法，其包括如下步骤：

S1、提供树脂，且将所述树脂在第一溶剂中浸泡至所述树脂溶胀；

S2、将氨基酸、缩合剂溶于第二溶剂中，形成混合物；

S3、在所述混合物加入溶胀的树脂中形成反应体系，反应时间为1-4h；

S4、去除反应后所述反应体系中的溶液，对残留物洗涤1-5次，气体鼓动，抽干；

S5、在所述残留物中加入脱帽液，气体鼓动，抽干；

S6、去除经由步骤S5后的反应体系中的溶液，洗涤1-10次，气体鼓动，抽干，由此获得合成的多肽链；

S7、在所述多肽链中加入切割液，在4-30℃下搅拌1-4h，过滤得滤液，且洗涤所述滤液；

S8、对经洗涤过的滤液进行萃取，离心得到细胞穿膜肽粗品；

以及S9、对所述细胞穿膜肽粗品进行鉴定和纯化。

优选的，在步骤S1中，所述树脂包括Fmoc-Wang树脂。

优选的，在步骤S2中，所述缩合剂包括苯并三唑鎓盐型缩合剂；在步骤S1中，所述第一溶剂包括：二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷及四氢呋喃中的一种或几种；在步骤S5中，所述脱帽液包括：DFM溶液，以及溶解于二甲基甲酰胺溶液中的6％W/V的哌嗪和0.1MHOBT；在步骤S7中，所述切割液包括：以重量百分数计，95％的TFA、2％的TIS以及3％的H₂O。

优选的，所述苯并三唑鎓盐型缩合剂包括O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐中的一种或几种。

优选的，每种氨基酸与所述树脂的投料摩尔量比例均为(1:1)-(10:1)；所述缩合剂与所述树脂的投料摩尔量比例为(1:1)-(10:1)。

优选的，所述步骤S8中，所述萃取步骤包括：在经洗涤过的滤液中加入无水乙醚，放置1-4h；且所述无水乙醚与滤液的体积比为(5:1)-(60:1)。

另一方面，还提供一种上述细胞穿膜肽的应用方法，所述细胞穿膜肽用于在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。

优选的，携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞的过程包括：所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA。

优选的，所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA的过程包括如下步骤：

S1、将质粒DNA与所述细胞穿膜肽各自混合于磷酸盐缓冲液中；

S2、调整所述质粒DNA与所述细胞穿膜肽两者间的N/P比为0-80；

S3、培养过夜的细胞，用无血清的培养基洗涤，将含有所述质粒DNA和细胞穿膜肽的磷酸盐缓冲液加入到培养基中；

以及S4、4-6h后去掉培养基，添加含有10-15％FCS的培养基，静置1-4h。

本发明技术方案所带来的效果：

本发明的人源性细胞穿膜肽穿膜效果显著，穿膜效率高；且免疫原性低，安全低毒；制备方法操作简单且便于进行质量管控。

附图说明

图1为本发明的细胞穿膜肽与质粒DNA结合后最优N/P比的实验结果图。

图2为本发明的细胞穿膜肽用于BHK21细胞转染结果示意图。

图3为本发明的细胞穿膜肽用于B16细胞转染结果示意图。

图4a为本发明的细胞穿膜肽用于BHK21转染得到的荧光值。

图4b为本发明的细胞穿膜肽用于B16转染得到的荧光值。

图5为本发明的细胞穿膜肽用于BHK21MTT结果示意图。

图6为本发明的细胞穿膜肽用于B16MTT结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一：

发明人通过对人类蛋白质数据库进行检索分析，发现人类的MyoD家族抑制子带结构域蛋白异构体c(MyoD family inhibitor domain-containing protein isoform c)的一段长12个氨基酸的短肽(PGRKRRRRRRKG)富含精氨酸，具有很强的正电荷，推测这段短肽可能是一个新型的人源性穿膜肽，具有自主穿膜功能，并在此基础上提供了本实施例的人源性细胞穿膜肽(简称MDFIC)，其包括如下序列：PGRKRRRRRRKG，其氨基酸序列如序列表所示；其中，所述P选自脯氨酸残基，所述G选自甘氨酸残基；所述R选自精氨酸残基，所述K选自赖氨酸残基。

进一步的，上述细胞穿膜肽的制备方法包括如下步骤：

S1、称取树脂(如Fmoc-Wang树脂)，倒入反应器中，加入第一溶剂(包括二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷及四氢呋喃中的一种或几种)浸泡，直至所述树脂在第一溶剂中浸泡至所述树脂溶胀，再向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时(优选为1.5h)，抽干，再向反应器中加入适量DMF，通氮气鼓动，抽干；重复上述加脱保护液、通氮气鼓动、抽干以及加适量DMF、通氮气鼓动、抽干的操作1-10次(优选为5次)；

S2、称取氨基酸以及缩合剂，且每种氨基酸(包括脯氨酸、甘氨酸、精氨酸及赖氨酸)的摩尔量均为所述树脂摩尔量的1倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的3倍；优选的，所述缩合剂包括苯并三唑鎓盐型缩合剂，且所述苯并三唑鎓盐型缩合剂包括O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐中的一种或几种；再将氨基酸、缩合剂溶于盛装于反应器内的第二溶剂中，形成混合物；

S3、在所述混合物加入溶胀的树脂中形成反应体系，反应时间为1-4h(优选为3h)，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；

S4、抽干去除反应后所述反应体系中的溶液，加适量DMF对残留物洗涤1-5次(优选为3次)，通氮气鼓动，抽干；

S5、在所述残留物中加入脱帽液，通氮气鼓动1-3h(优选为2h)，抽干，直至茚三酮法检测呈阳性；优选的，所述脱帽液包括：DFM溶液，以及溶解于所述二甲基甲酰胺溶液中的6％W/V的哌嗪和0.1M HOBT；

S6、抽干去除经由步骤S5后的反应体系中的溶液，加适量DMF洗涤1-10次，通氮气鼓动，抽干，由此获得含Pro-Gly-Arg-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Gly的多肽链；

S7、(8)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，在所述多肽链中加入切割液，在4-30℃(优选为18℃)下恒温机械搅拌1-4h(优选为3h)，过滤得滤液，且用TFA洗涤所述滤液；所述切割液包括：以重量百分数计，95％的TFA、2％的TIS以及3％的H₂O；

S8、过滤所述滤液，将滤液全部收集到烧瓶中；对经洗涤过的滤液进行萃取，高速离心得到细胞穿膜肽粗品；所述萃取包括：在经洗涤过的滤液中加入无水乙醚，放置1-4h(优选为3h)；且所述无水乙醚与滤液的体积比为(5:1)-(60:1)(优选为30:1)；

以及S9、运用HPLC/MS或超滤法或高效毛细管电泳法进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽。

此外，本实施例还提供一种上述细胞穿膜肽的应用方法，具体的，所述细胞穿膜肽用于在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。本实施例中，所述标记物选自荧光素、生物素以及亲和基团中的一种或几种；所述载物分子选自糖类、多肽、蛋白、药物分子前体、纳米粒子及纳米微球中的一种或几种。

其中，携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞的过程包括：所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA；本实施例中，所述质粒选自pEGFP或PdsRED。

具体的，所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA的过程包括如下步骤：

S1、将质粒DNA与所述细胞穿膜肽各自混合于磷酸盐缓冲液中；

S2、调整所述质粒DNA与所述细胞穿膜肽两者间的N/P(即NH⁺³/PO^-4)比为0-80；优选的，调整两者间N/P比分别为0、1、2、5、10、20、40、80；将上述调整好N/P比的质粒DNA与所述细胞穿膜肽混合液进行琼脂糖电泳实验，确定最优N/P比，结果如图1所示，N/P在5左右时，质粒DNA与细胞穿膜肽结合较好，因此，上述两者间N/P比可进一步优选为5；

S3、培养过夜的细胞，用无血清的培养基洗涤，将含有所述质粒DNA和细胞穿膜肽的磷酸盐缓冲液加入到培养基中；

以及S4、4-6h(优选为5h)后去掉培养基，添加含有10-15％FCS(即胎牛血清)的培养基，静置1-4h(优选为3h)。

实施例二：

本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中，每种氨基酸(包括脯氨酸、甘氨酸、精氨酸及赖氨酸)的摩尔量均为所述树脂摩尔量的5倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的10倍。

实施例三：

本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中，每种氨基酸(包括脯氨酸、甘氨酸、精氨酸及赖氨酸)的摩尔量均为所述树脂摩尔量的1倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的10倍。

实施例四：

本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中，每种氨基酸(包括脯氨酸、甘氨酸、精氨酸及赖氨酸)的摩尔量均为所述树脂摩尔量的5倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的1倍。

实施例五：

本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中，每种氨基酸(包括脯氨酸、甘氨酸、精氨酸及赖氨酸)的摩尔量均为所述树脂摩尔量的10倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的10倍。

实施例六：

本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤S2中，每种氨基酸(包括脯氨酸、甘氨酸、精氨酸及赖氨酸)的摩尔量均为所述树脂摩尔量的7倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的5倍。

如下示出了本发明的细胞穿膜肽MDFIC与质粒DNA结合后的穿膜效果实验过程，其具体包括如下步骤：

(1)实验组为本发明的细胞穿膜肽，将本发明的细胞穿膜肽MDFIC和pEGFP(或PdsRED)按0、10、20、40、80的N/P比混合，室温或者37℃孵育半个小时或一个小时；对照组为穿膜肽TAT，同样分别与pEGFP(或PdsRED)按0、10、20、40、80的N/P比混合，孵育时间以及温度条件与实验组相同，阳性对照组使用

2000，实验方法按照说明书所示；

(2)培养细胞(分别为BHK21和B16细胞系)过夜，用没有血清的培养基洗两次；实验组中，在细胞中加入质粒DNA和细胞穿膜肽MDFIC，形成实验组混合物，再取所述实验组混合物500μl加入到培养基中；

(3)6小时后去掉原培养基，添加含有10％胎牛血清的新鲜培养基；

(4)1-4小时后显微镜观察；如图2所示，在BHK21细胞系中，本发明的细胞穿膜肽MDFIC与质粒DNA在N/P比为10的条件下结合时，其已能将质粒DNA带入胞内，在N/P比为20时，其穿膜效率即可超过

2000的穿膜效率，且在N/P比为80时，其穿膜效率最高，远高

2000的穿膜效率，同样的，在N/P比为10、20、40、80时，其穿膜效率也都远高于TAT的穿膜效率。类似的，如图3所示，在B16细胞系中，本发明的细胞穿膜肽与质粒DNA在N/P比为40的条件下结合时，其已能将质粒DNA带入胞内，且在N/P比为40、80时，其穿膜效率都远高于TAT的穿膜效率。

(5)BHK21或B16细胞系细胞经上述处理4h后经酶标仪检测，得到荧光定量结果，如图4a-4b所示，在BHK21及B16细胞系中，本发明的细胞穿膜肽MDFIC在各个浓度值上，其荧光强度均强于TAT的荧光强度，且均在10μM时，荧光强度最强。

如下示出了本发明的细胞穿膜肽MDFIC细胞毒性实验过程，其具体包括如下步骤：

(1)取对数生长期培养细胞BHK21和B16，以每孔1×104个细胞接种于96孔板，37℃下于5％二氧化碳培养箱中培养24小时，使细胞贴壁；

(2)达到对数生长期时换成无血清的培养液，继续培养1小时；

(3)配置不同浓度的细胞穿膜肽MDFIC，同时设置三个阴性对照孔及阳性对照孔(

2000)，阳性对照孔(

2000)按照说明书操作进行实验；37℃下于5％二氧化碳培养箱培养1-24h；

(4)孵育时间结束后，每孔均加入PBS洗涤；

(5)贴壁细胞每孔加入20μl MTT(0.5％)，继续孵育4-6h之后弃掉培养液，每孔加入150μl DMSO(二甲基亚砜)，震荡10min；

(6)比色：选择490nm或570nm波长，在酶标仪免疫检测仪上测定光吸收值，处理数据得到细胞存活率；结果如图5所示，对于BHK21细胞系，本发明细胞穿膜肽MDFIC在0-27μmol/L的浓度范围内，细胞存活率与阳性对照组无明显差别；如图6所示，对于B16细胞系，本发明细胞穿膜肽MDFIC在0-27μmol/L的浓度范围内，细胞存活率与阳性对照组无明显差别；上述实验结果证明本发明涉及的细胞穿膜肽安全低毒，其毒性与

2000无差别，且各浓度的毒性变化不大，无浓度依赖性。

综上所述，本发明的细胞穿膜肽MDFIC具有如下优点：分子量小，氨基酸残基个数少，穿膜效果显著，效率明显高于穿膜肽TAT及

2000转染试剂；免疫原性低，安全低毒，毒性与

2000无差别；可由固相合成方法而得，所述合成方法既可以在实验室水平也可在工业水平进行，操作简单且便于质量管控。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 肽泽（武汉）生物科技有限公司

<120> 一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用

<130> 2017

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Pro Gly Arg Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Gly

1 5 10

Claims (4)

1.一种细胞穿膜肽，其特征在于：所述细胞穿膜肽为如下序列：PGRKRRRRRRKG。

2.一种如权利要求1所述的细胞穿膜肽的应用方法，其特征在于，所述细胞穿膜肽用于在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。

3.如权利要求2所述的应用方法，其特征在于，携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞的过程包括：所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA。

4.如权利要求3所述的应用方法，其特征在于，所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA的过程包括如下步骤：

S1、将质粒DNA与所述细胞穿膜肽各自混合于磷酸盐缓冲液中；

S2、调整所述质粒DNA与所述细胞穿膜肽两者间的N/P比为0-80，不包括0；

S3、培养过夜的细胞，用无血清的培养基洗涤，将含有所述质粒DNA和细胞穿膜肽的磷酸盐缓冲液加入到培养基中；

以及S4、4-6h后去掉培养基，添加含有10-15％FCS的培养基，静置1-4h。

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