CN106916207A - 细胞穿膜肽hPP‑chol、生产及其介导的质粒DNA转染的方法 - Google Patents

细胞穿膜肽hPP‑chol、生产及其介导的质粒DNA转染的方法 Download PDF

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CN106916207A CN201710051694.5A CN201710051694A CN106916207A CN 106916207 A CN106916207 A CN 106916207A CN 201710051694 A CN201710051694 A CN 201710051694A CN 106916207 A CN106916207 A CN 106916207A
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Abstract

本发明涉及生物医学领域，公开了一种新型的胆固醇修饰下的人源性细胞穿膜肽hPP‑chol的生产及其介导的质粒DNA转染的方法。细胞穿膜肽hPP‑chol的序列为：Chol‑KIPLPRFKLKCIFCKKRRKR。其在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带标记物或货物分子穿过细胞膜进入细胞。穿膜肽hPP‑chol是基于人源性细胞穿膜肽的改进与修饰，免疫原性低，安全低毒；该穿膜肽由固相合成而得，成本较低且便于质量管控；该穿膜肽的穿膜效果显著，效率高于

Description

细胞穿膜肽hPP-chol、生产及其介导的质粒DNA转染的方法
技术领域
本发明涉及一种细胞穿膜肽、生产及其介导质粒DNA转染的方法。
背景技术
细胞膜由脂质双分子层组成，其内部由疏水性的非极性分子构成。细胞膜是物质进出细胞的屏障，其仅仅允许分子量小于600Da的非脂溶性分子进入活细胞。这一屏障虽然对机体有保护作用，但也使一些有价值的亲水性大分子药物难以穿透细胞膜进入细胞内部达到有效治疗浓度，使得这类有治疗价值但无细胞穿透性且易降解的亲水性分子在细胞生物学、药学等研究领域中的应用大大受到限制。
在过去的几十年里，人们发现了一些肽和蛋白质能穿透细胞膜进入细胞内，而且多种运载分子也可以与这些肽和蛋白质连接并易位进入细胞内。这些肽和蛋白质载体构成一种新的很有潜力的药物运输载体，即细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)，它是一大类由10-30个氨基酸组成的短肽，也称为蛋白转导域(protein translocationdomain,PTD)。这些肽分子不会产生细胞膜的永久性损伤，并且毒性低。特别是人源性穿膜肽(hCPP)，其与其他生物来源地CPPs相比，hCPP引起人体的免疫反应的可能性比较小，潜在的不安全因素相对较少(如hPP10公开号：102863516A)，但对于hPP10来说，其介导质粒DNA转染的效率较低，影响其作为药物胞内运载工具的应用前景。
胆固醇是一种环戊烷多氢菲的衍生物，其广泛存在于动物体内。其溶解性与脂肪类似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶剂。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料。胆固醇是许多天然生物膜的重要成分，本身并不形成膜的结构，但是能够以1:1甚至2:1的摩尔比插入磷脂膜中。
在相关研究中，发现胆固醇可应用于阳离子脂质体中，其可作为阳离子类脂疏水尾部。在阳离子脂质体介导的基因转染的过程中，胆固醇作为疏水尾部，其优点有：①在基因转染过程中，胆固醇的存在加强了微团形成的稳定性及进一步提高了包封率；②由于胆固醇就是形成细胞膜的重要物质，在脂质体中加入胆固醇进一步提高了与细胞的结合率。有研究表明，脂质体中含有胆固醇成分对细胞摄取的促进作用显著高于无胆固醇成分的脂质体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新型的胆固醇修饰下的人源性细胞穿膜肽hPP-chol的生产及其介导质粒DNA转染的方法。
本发明所涉及的细胞穿膜肽hPP-chol，其氨基酸序列表达如下：
Chol-KIPLPRFKLKCIFCKKRRKR。
所述穿膜肽hPP-chol能够与生物小分子共价或非共价作用相互结合，并携带生物小分子穿过细胞膜进入细胞。
所述穿膜肽hPP-chol在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带标记物或货物分子穿过细胞膜进入细胞，优选地所述标记物选自由荧光素、生物素、特定的亲和基团所组成的组；优选地所述货物分子选自由糖类、多肽、蛋白、药物分子前体、纳米粒子、纳米微球所组成的组。
本发明提供上述新型的胆固醇修饰下人源性细胞穿膜肽的生产方法。该方法既可以在实验室水平也可在工业水平进行合成，生产方法优选化学合成法。
化学合成方法生产穿膜肽hPP-chol，本发明中优选树脂：Fmoc-Arg(PBF)-Wang树脂或H-Arg(PBF)-2cl树脂，采用固相Fmoc法合成，具体合成纯化步骤如下：
(1)称取一定量树脂倒入玻璃反应器中，加入合适量的二氯甲烷(DCM)浸泡直至树脂溶胀，抽干；
(2)向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时，抽干，向反应器中加入适量DMF，氮气鼓动，抽干，重复操作1-10次；
(3)称取相当于树脂1-10倍摩尔量的每步投料的氨基酸，1-10倍摩尔量的碳二亚型缩合剂(如二环己基碳二亚胺(DCC))或苯并三唑鎓盐型缩合剂溶于二甲基甲酰胺(DMF)或DCM或四氢呋喃(THF)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；
(4)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；
(5)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；
(6)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；
(7)反复上述操作直至多肽链合成完成，得到Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg-OH；
(8)脱除上述多肽链N端Fmoc-Lys(Boc)-OH上面的保护基Fmoc，使N端裸露出来。然后称取1-10倍量的胆固醇甲酰氯，1-10倍量的HBTU，加入DMF溶剂置于摇床中反应48小时后，滤去溶液，用DMF反复洗涤9次。
(9)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用TFA洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；
(10)运用HPLC/MS法对所述多肽粗品进行多肽的鉴定和纯化，纯化后得到所需细胞穿膜肽hPP-chol。
同时，本发明提供上述新型的胆固醇修饰下人源性细胞穿膜肽hPP-chol介导的质粒DNA转染方法，包括以下步骤：
(1)将质粒pEGFP或PdsRED与合成后穿膜肽分别混合于磷酸盐缓冲液(PBS)中；
(2)计算质粒与穿膜肽含量间的N/P比(NH+ 3/PO- 4),调整两者间N/P比分别为0、1、3、5、10、20、40、80，并添加对照组，即使用2000进行穿膜对照，室温或者37℃孵育半个小时或一个小时；
(3)养过夜的细胞，用没有血清的培养基洗两次，加入质粒DNA和穿膜肽复合物加入到500ul培养基中；
(4)6小时候去掉培养基加含有10％FCS的新鲜培养基；
(5)静置1-4小时后即可。
本发明所述细胞穿膜肽具有以下优点和有益效果：
1)低毒安全：本发明是基于人源性细胞穿膜肽的改进与修饰，免疫原性低，安全低毒；
2)经济：该穿膜肽由固相合成而得，成本较低且便于质量管控；
3)高效：该穿膜肽的穿膜效果显著，效率高于2000；
本发明穿膜肽hPP-chol可广泛应用于生产药物、保健品、美容或护肤品、转染试剂或诊断试剂的实际生产应用中。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步具体说明。
图1为本发明实施例细胞穿膜肽与质粒DNA结合后最优n/p比的实验结果图。
图2a为本发明实施例细胞穿膜肽用于BHK21细胞转染结果示意图。
图2b为本发明实施例细胞穿膜肽用于B16细胞转染结果示意图。
图3为本发明实施例细胞穿膜肽用于BHK21及B16转染得到的荧光值。
图4a为本发明实施例细胞穿膜肽用于BHK21MTT结果示意图。
图4b为本发明实施例1-6细胞穿膜肽用于B16MTT结果示意图。
具体实施方式
本发明的细胞穿膜肽hPP-chol，其氨基酸序列表达如下：
Chol-KIPLPRFKLKCIFCKKRRKR。
穿膜肽hPP-chol能够与生物小分子共价或非共价作用相互结合，并携带生物小分子穿过细胞膜进入细胞。
穿膜肽hPP-chol在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带标记物或货物分子穿过细胞膜进入细胞。标记物选自由荧光素、生物素、特定的亲和基团所组成的组；货物分子选自由糖类、多肽、蛋白、药物分子前体、纳米粒子、纳米微球所组成的组。
本发明提供上述新型的胆固醇修饰下人源性细胞穿膜肽的生产方法。该方法既可以在实验室水平也可在工业水平进行合成，生产方法优选化学合成法。
实施例1：
(1)称取一定量Fmoc-Arg(PBF)-Wang树脂或H-Arg(PBF)-2cl树脂，倒入玻璃反应器中，加入合适量的二氯甲烷(DCM)浸泡直至树脂溶胀，抽干；
(2)向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时，抽干，向反应器中加入适量DMF，氮气鼓动，抽干，重复操作1-10次；
(3)称取相当于树脂1倍摩尔量的每步投料的氨基酸，1倍摩尔量的碳二亚型缩合剂(如二环己基碳二亚胺(DCC))或苯并三唑鎓盐型缩合剂(如O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU))溶于二甲基甲酰胺(DMF)或DCM或四氢呋喃(THF)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；
(4)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；
(5)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；
(6)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；
(7)反复上述操作直至多肽链合成完成，得到Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg-OH；
(8)脱除上述多肽链N端Fmoc-Lys(Boc)-OH上面的保护基Fmoc，使N端裸露出来。然后称取1-10倍量的胆固醇甲酰氯，1-10倍量的HBTU，加入DMF溶剂置于摇床中反应48小时后，滤去溶液，用DMF反复洗涤9次。
(9)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用TFA洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；
(10)运用HPLC/MS法进行多肽的鉴定和纯化，纯化条件如下：应用高阶液相色谱waters2489检测器，waters二元泵，分析柱Boston Annlytics，在室温20℃，流速1-5ml/min条件下，A相为0.05-0.1％溶于乙腈的三氟乙酸，B相为0.05-0.1％溶于水的三氟乙酸，梯度10％-60％；应用型号为WATERS ZQ2000的质谱仪，ESI探针，Nebulizer Gas Floe为1.5-3L/min，介质为50-80％乙腈。
(11)按照上述化学合成方法得到穿膜肽hPP-chol，并将质粒pEGFP或PdsRED与上述穿膜肽分别混合于磷酸盐缓冲液(PBS)中；
(12)计算质粒与穿膜肽含量间的N/P比(NH+ 3/PO- 4),调整两者间N/P比分别为0、1、3、5、10、20、40、80；
(13)将上述调整好N/P比的混合液进行琼脂糖电泳实验，如图1所示，最优N/P比在1左右，质粒与穿膜肽已结合的较好。
实施例2：
(1)称取一定量Fmoc-Arg(PBF)-Wang树脂或H-Arg(PBF)-2cl树脂，倒入玻璃反应器中，加入合适量的二氯甲烷(DCM)浸泡直至树脂溶胀，抽干；
(2)向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时，抽干，向反应器中加入适量DMF，氮气鼓动，抽干，重复操作1-10次；
(3)称取相当于树脂10倍摩尔量的每步投料的氨基酸，10倍摩尔量的碳二亚型缩合剂(如二环己基碳二亚胺(DCC))或苯并三唑鎓盐型缩合剂(如O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU))溶于二甲基甲酰胺(DMF)或DCM或四氢呋喃(THF)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；
(4)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；
(5)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；
(6)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；
(7)反复上述操作直至多肽链合成完成，得到Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg-OH；
(8)脱除上述多肽链N端Fmoc-Lys(Boc)-OH上面的保护基Fmoc，使N端裸露出来。然后称取1-10倍量的胆固醇甲酰氯，1-10倍量的HBTU，加入DMF溶剂置于摇床中反应50小时后，滤去溶液，用DMF反复洗涤10次。
(9)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用TFA洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；
(10)运用HPLC/MS法进行多肽的鉴定和纯化，纯化条件如下：应用高阶液相色谱waters2489检测器，waters二元泵，分析柱Boston Annlytics，在室温20℃，流速1-5ml/min条件下，A相为0.05-0.1％溶于乙腈的三氟乙酸，B相为0.05-0.1％溶于水的三氟乙酸，梯度10％-60％；应用型号为WATERS ZQ2000的质谱仪，ESI探针，Nebulizer Gas Floe为1.5-3L/min，介质为50-80％乙腈。
(11)按照上述化学合成方法得到穿膜肽hPP-chol，并将质粒pEGFP或PdsRED与上述穿膜肽分别混合于磷酸盐缓冲液(PBS)中；
(12)计算质粒与穿膜肽含量间的N/P比(NH+ 3/PO- 4),调整两者间N/P比分别为0、1、3、5、10、20、40、80；
(13)将上述调整好N/P比的混合液进行琼脂糖电泳实验，如图1所示，最优N/P比在1左右，质粒与穿膜肽已结合的较好。
实施例3：
(1)称取一定量Fmoc-Arg(PBF)-Wang树脂或H-Arg(PBF)-2cl树脂，倒入玻璃反应器中，加入合适量的二氯甲烷(DCM)浸泡直至树脂溶胀，抽干；
(2)向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时，抽干，向反应器中加入适量DMF，氮气鼓动，抽干，重复操作1-10次；
(3)称取相当于树脂5倍摩尔量的每步投料的氨基酸，5倍摩尔量的碳二亚型缩合剂(如二环己基碳二亚胺(DCC))或苯并三唑鎓盐型缩合剂(如O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU))溶于二甲基甲酰胺(DMF)或DCM或四氢呋喃(THF)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；
(4)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；
(5)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；
(6)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；
(7)反复上述操作直至多肽链合成完成，得到Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg-OH；
(8)脱除上述多肽链N端Fmoc-Lys(Boc)-OH上面的保护基Fmoc，使N端裸露出来。然后称取1-10倍量的胆固醇甲酰氯，1-10倍量的HBTU，加入DMF溶剂置于摇床中反应48小时后，滤去溶液，用DMF反复洗涤9次。
(9)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用TFA洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；
(10)运用HPLC/MS法进行多肽的鉴定和纯化，纯化条件如下：应用高阶液相色谱waters2489检测器，waters二元泵，分析柱Boston Annlytics，在室温20℃，流速1-5ml/min条件下，A相为0.05-0.1％溶于乙腈的三氟乙酸，B相为0.05-0.1％溶于水的三氟乙酸，梯度10％-60％；应用型号为WATERS ZQ2000的质谱仪，ESI探针，Nebulizer Gas Floe为1.5-3L/min，介质为50-80％乙腈。
(11)按照上述化学合成方法得到穿膜肽hPP-chol，并将质粒pEGFP或PdsRED与上述穿膜肽分别混合于磷酸盐缓冲液(PBS)中；
(12)计算质粒与穿膜肽含量间的N/P比(NH+ 3/PO- 4),调整两者间N/P比分别为0、1、3、5、10、20、40、80；
(13)将上述调整好N/P比的混合液进行琼脂糖电泳实验，如图1所示，最优N/P比在1左右，质粒与穿膜肽已结合的较好。
实施例4：
(1)称取一定量Fmoc-Arg(PBF)-Wang树脂或H-Arg(PBF)-2cl树脂，倒入玻璃反应器中，加入合适量的二氯甲烷(DCM)浸泡直至树脂溶胀，抽干；
(2)向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时，抽干，向反应器中加入适量DMF，氮气鼓动，抽干，重复操作1-10次；
(3)称取相当于树脂3倍摩尔量的每步投料的氨基酸，7倍摩尔量的碳二亚型缩合剂(如二环己基碳二亚胺(DCC))或苯并三唑鎓盐型缩合剂(如O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU))溶于二甲基甲酰胺(DMF)或DCM或四氢呋喃(THF)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；
(4)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；
(5)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；
(6)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；
(7)反复上述操作直至多肽链合成完成，得到Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg-OH；
(8)脱除上述多肽链N端Fmoc-Lys(Boc)-OH上面的保护基Fmoc，使N端裸露出来。然后称取1-10倍量的胆固醇甲酰氯，1-10倍量的HBTU，加入DMF溶剂置于摇床中反应48小时后，滤去溶液，用DMF反复洗涤9次。
(9)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用TFA洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；
(10)运用HPLC/MS法进行多肽的鉴定和纯化，纯化条件如下：应用高阶液相色谱waters2489检测器，waters二元泵，分析柱Boston Annlytics，在室温20℃，流速1-5ml/min条件下，A相为0.05-0.1％溶于乙腈的三氟乙酸，B相为0.05-0.1％溶于水的三氟乙酸，梯度10％-60％；应用型号为WATERS ZQ2000的质谱仪，ESI探针，Nebulizer Gas Floe为1.5-3L/min，介质为50-80％乙腈。
(11)按照上述化学合成方法得到穿膜肽hPP-chol，并将质粒pEGFP或PdsRED与上述穿膜肽分别混合于磷酸盐缓冲液(PBS)中；
(12)计算质粒与穿膜肽含量间的N/P比(NH+ 3/PO- 4),调整两者间N/P比分别为0、1、3、5、10、20、40、80；
(13)将上述调整好N/P比的混合液进行琼脂糖电泳实验，如图1所示，最优N/P比在1左右，质粒与穿膜肽已结合的较好。
实施例5：
(1)称取一定量Fmoc-Arg(PBF)-Wang树脂或H-Arg(PBF)-2cl树脂，倒入玻璃反应器中，加入合适量的二氯甲烷(DCM)浸泡直至树脂溶胀，抽干；
(2)向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时，抽干，向反应器中加入适量DMF，氮气鼓动，抽干，重复操作1-10次；
(3)称取相当于树脂1倍摩尔量的每步投料的氨基酸，1倍摩尔量的碳二亚型缩合剂(如二环己基碳二亚胺(DCC))或苯并三唑鎓盐型缩合剂(如O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU))溶于二甲基甲酰胺(DMF)或DCM或四氢呋喃(THF)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；
(4)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；
(5)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；
(6)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；
(7)反复上述操作直至多肽链合成完成，得到Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg-OH；
(8)脱除上述多肽链N端Fmoc-Lys(Boc)-OH上面的保护基Fmoc，使N端裸露出来。然后称取1-10倍量的胆固醇甲酰氯，1-10倍量的HBTU，加入DMF溶剂置于摇床中反应48小时后，滤去溶液，用DMF反复洗涤9次。
(9)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用TFA洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；
(10)运用HPLC/MS法进行多肽的鉴定和纯化，纯化条件如下：应用高阶液相色谱waters2489检测器，waters二元泵，分析柱Boston Annlytics，在室温20℃，流速1-5ml/min条件下，A相为0.05-0.1％溶于乙腈的三氟乙酸，B相为0.05-0.1％溶于水的三氟乙酸，梯度10％-60％；应用型号为WATERS ZQ2000的质谱仪，ESI探针，Nebulizer Gas Floe为1.5-3L/min，介质为50-80％乙腈。
(11)按照上述化学合成方法得到穿膜肽hPP7K，并将质粒pEGFP或PdsRED与上述穿膜肽分别混合于磷酸盐缓冲液(PBS)中；
(12)计算质粒与穿膜肽含量间的N/P比(NH+ 3/PO- 4),调整两者间N/P比分别为0、1、3、5、10、20、40、80；
(13)将上述调整好N/P比的混合液进行琼脂糖电泳实验，如图1所示，最优N/P比在1左右，质粒与穿膜肽已结合的较好。
实施例6：
穿膜肽hPP-chol与质粒DNA结合后的穿膜效果实验：
(1)本发明所合成穿膜肽hPP-chol和pEGFP或PdsRED按0、2、3、4、5的N/P比混合，室温或者37℃孵育半个小时或一个小时，阳性对照组使用2000，按照说明书操作进行实验；
(2)实验细胞分别为BHK21和B16细胞系。培养细胞过夜，用没有血清的培养基洗两次，加入质粒DNA和穿膜肽复合物加入到500ul培养基中；
(3)6小时候去掉培养基加含有10％胎牛血清的新鲜培养基；
(4)4小时后显微镜观察，在BHK21细胞系中，结果如图2a所示，hPP-chol与质粒DNA在N/P比为2的条件下结合时，其已能将质粒DNA带入胞内，且在N/P比为4时，其穿膜效率最高，且远高于2000的穿膜效率。在B16细胞系中，结果如图2b所示，与BHK21细胞系情况类似，hPP-chol与质粒DNA在N/P比为4的条件下结合时，其转染效率较高，但穿膜效率也远高于2000的穿膜效率。
(5)BHK21或B16细胞系细胞经上述处理4h后经流式细胞仪检测，得到荧光定量结果，在BHK21及B16细胞系中，如图3所示，hPP-chol在1.2uM时，其荧光强度最强，其荧光强度均远远大于2000的荧光强度。
实施例7
细胞毒性实验：
(1)取对数生长期培养细胞BHK21和B16，以每孔1×104个细胞接种于96孔板，37℃，5％二氧化碳培养箱培养24小时，使细胞贴壁；
(2)至对数生长期，换成无血清的培养液，继续培养1小时；
(3)配置不同浓度的穿膜肽hPP-chol，同时设置三个阴性对照孔及阳性对照孔(2000)，阳性对照孔(2000)按照说明书操作进行实验。37℃，5％二氧化碳培养箱培养1-24h；
(4)孵育时间结束后，每孔加入PBS洗涤；
(5)贴壁细胞每孔加入20ul MTT(0.5％)，继续孵育4-6h之后弃掉培养液，每孔加入150ul DMSO(二甲基亚砜)，震荡10min；
(6)比色：选择490nm或570nm波长，在酶标仪免疫检测仪上测定光吸收值，处理数据得到细胞存活率，对于BHK21细胞系，结果如图4a所示，本发明细胞穿膜肽hPP-chol在0-1.6umol/L的浓度范围内，细胞存活率与阳性对照组无明显差别；对于B16细胞系，结果如图4b所示，本发明细胞穿膜肽hPP-chol在0-1.6umol/L的浓度范围内，细胞存活率也与阳性对照组无明显差别。上述实验结果证明本发明涉及的细胞穿膜肽安全低毒，其毒性与2000无差别，且各浓度的毒性变化不大，无浓度依赖性。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种细胞穿膜肽hPP-chol，其特征在于，所述细胞穿膜肽序列为：
Chol-KIPLPRFKLKCIFCKKRRKR。
2.根据权利要求1所述的细胞穿膜肽hPP-chol，其特征在于，所述细胞穿膜肽能够与生物小分子共价或非共价作用相互结合，并携带生物小分子穿过细胞膜进入细胞。
3.根据权利要求2中所述细胞穿膜肽hPP-chol，其特征在于，所述细胞穿膜肽在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带标记物或货物分子穿过细胞膜进入细胞。
4.根据权利要求3所述细胞穿膜肽hPP-chol，其特征在于，所述标记物选自：自由荧光素、生物素、亲和基团所组成的组。
5.根据权利要求3所述细胞穿膜肽hPP-chol，其特征在于，所述货物分子选自：自由糖类、多肽、蛋白、药物分子前体、纳米粒子、纳米微球所组成的组。
6.一种权利要求1所述细胞穿膜肽hPP-chol的生产方法，其特征在于，采用固相Fmoc法合成，具体包括以步骤：
(1)称取一定量树脂倒入玻璃反应器中，加入合适量的二氯甲烷(DCM)浸泡直至树脂溶胀，抽干；所述树脂为Fmoc-Arg(PBF)-Wang树脂或H-Arg(PBF)-2cl树脂；
(2)向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时，抽干，向反应器中加入适量DMF，氮气鼓动，抽干，重复操作1-10次；
(3)称取相当于树脂1～10倍摩尔量的每步投料的氨基酸，1～10倍摩尔量的碳二亚型缩合剂溶于二甲基甲酰胺(DMF)或DCM或四氢呋喃(THF)中加入反应器，反应1-4h，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；
(4)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-5次；
(5)向反应器中加入适量脱帽液，氮气鼓动1-3h，抽干，茚三酮法检测呈阳性；
(6)将反应器中的溶液抽干，加适量DMF洗涤，氮气鼓动，抽干，重复洗涤1-10次；
(7)反复上述操作直至多肽链合成完成，得到多肽链Lys-Ile-Pro-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Leu-Lys-Cys-Ile-Phe-Cys-Lys-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg-OH；
(8)脱除上述多肽链N端Fmoc-Lys(Boc)-OH上面的保护基Fmoc，使N端裸露出来；然后称取1-10倍量的胆固醇甲酰氯，1-10倍量的HBTU，加入DMF溶剂置于摇床中反应24-72小时后，滤去溶液，用DMF反复洗涤1-9次；
(9)将干燥后的树脂装入合适的离心管中，加入适量配好的切割液4-30度恒温机械搅拌1-4h，过滤后用TFA洗涤，过滤，将滤液全部收集到烧瓶中，直接加入5-60倍体积的冰无水乙醚，放置1-4h，高速离心后得到所需多肽粗品；
(10)运用HPLC/MS法对所述多肽粗品进行多肽的鉴定和纯化，纯化后得到所需细胞穿膜肽hPP-chol。
7.一种权利要求1所述的细胞穿膜肽hPP-chol介导的质粒DNA转染方法，包括以下步骤：
(1)将质粒pEGFP或PdsRED与穿膜肽hPP-chol分别混合于磷酸盐缓冲液(PBS)中；
(2)计算质粒与穿膜肽含量间的N/P比(NH+ 3/PO- 4),调整两者间N/P比分别为0、1、3、5、10、20、40、80，即2000进行穿膜对照，室温或者37℃孵育半个小时至一个小时；
(3)养过夜的细胞，用没有血清的培养基洗1-4次，加入质粒DNA与穿膜肽的复合物加入到培养基中；
(4)6小时候去掉培养基加含有10％FCS的新鲜培养基；
(5)静置1-4小时。
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Denomination of invention: Cell membrane penetrating peptide HPP CHOL, its production and its mediated plasmid DNA transfection method

Effective date of registration: 20211119

Granted publication date: 20200414

Pledgee: Bank of Hankou Limited by Share Ltd. Sales Department

Pledgor: TAIZE (WUHAN) BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

Registration number: Y2021420000127

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