CN103172701B - 一种新型穿膜肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型穿膜肽及其应用，所述穿膜肽细胞毒性低、免疫原性小、穿膜效率高并且对穿膜后载物活性影响较小。

Description

一种新型穿膜肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种新型穿膜肽及其应用。

背景技术

随着生物工程学，基因组学，生物和有机化学的发展，各种类型的新型药物分子，如：短肽(peptides)，单克隆抗体蛋白(monoclonal antibodies)，反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotides)，核酶(ribozymes)，催化DNA(catalytic DNA)等纷纷被开发出来。这些具有极大生物学和医学意义的分子(当然也包括传统的质粒和融合蛋白)往往由于其过大的分子量和本身的亲水性质，限制了他们的在体应用。由于生物膜系统的阻碍，这些分子很难进入到靶向器官和组织的细胞中去发挥作用。针对这些问题，不同的技术被开发出来，他们都有各自的优缺点。

也有人采用物理透膜方式如电穿孔、微管注射、穿孔蛋白法等。这些方式虽然各有优势，但是也存在一些缺点：导入率低、对细胞刺激大甚至可能导致细胞死亡、靶向性不强。因此很多研究者致力于寻求更具高效的透膜方式。

20世纪中期人们开始认识到的一类具特殊功能的多肽分子,这些肽能够穿透细胞膜进入细胞内,而且多种运载物分子(如蛋白、多肽、核苷酸)也可以与这些肽连接并易位进入细胞内。这些肽载体构成一种新的很有潜力的物质运输载体,即细胞穿膜肽(cell penetrating peptides,CPP)。它是一大类由30个以下氨基酸残基组成的短肽。这种多肽介导的生物活性分子透膜技术，在许多方面优于常用的透膜方式。另外在合成上多肽具有高产率，对细胞毒性低，而且肽骨架能够进行不同的修饰，这样的多肽在未来的给药平台具有很大潜在的利用价值。

细胞穿膜肽均为带有正电荷的长短不等的多肽片段，富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基，具有正电性或者两亲性。穿膜肽不仅可以转导多肽和蛋白质,也可以将与穿膜肽偶联的小分子有机化合物、寡核苷酸、DNA、噬菌体、脂质体、纳米级的铁珠等多种不同大小的其他物质导人细胞，并且大部分多肽和蛋白导入后依然保持其生物活性。但是穿膜肽应用依然存在一些问题：

1）细胞毒性：穿膜肽富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基，带正电荷，容易引起细胞毒性。

2）免疫原性：随着肽链的增长，免疫原性也随之增加。大部分的穿膜肽都在10-30个氨基酸残基之间，对身体造成免疫反应的可能性大。

3）穿膜效率：大部分穿膜肽具有长的肽链，主要通过内吞作用介导载物进入细胞膜，其穿膜效率受pH、离子浓度等影响。

4）穿膜后载物活性：大部分的穿膜肽通过共价键与载物连接，进入细胞膜后无法分离，影响载物进入细胞后的活性。

因此，本领域中需要细胞毒性低、免疫原性小、穿膜效率高并且对穿膜后载物活性影响较小的穿膜肽。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有6-9个氨基酸残的穿膜肽及其应用。

在第一方面，本发明提供了一种穿膜肽，其特征在于，所述穿膜肽具有如下结构特征，其序列如下：

NH₂-X-Y-COOH

其中，X由n个精氨酸残基（Arg）和/或赖氨酸(Lys)残基组成，Y由m个色氨酸（Trp）残基和/或组氨酸（His）残基组成，且4≤n≤6，2≤m≤4，6≤m+n≤9。

本发明的穿膜肽中，X可以由n个精氨酸残基组成，优选地可以由5个精氨酸残基组成。

本发明的穿膜肽中，Y可以由m个色氨酸残基组成，优选地可以由3个色氨酸残基组成。

根据本发明的穿膜肽的序列可以为SEQ ID NO：1-20：

RRRRWWW（SEQ ID NO：1）、KKKKWWW（SEQ ID NO：2）、KRRKHHW（SEQ ID NO：3）、RKKKWWW（SEQ ID NO：4）、KRRRHWW（SEQ ID NO：5）、RRRRHHH（SEQ ID NO：6）、KKKKHHH（SEQ ID NO：7）、RRRRWHW（SEQ ID NO：8）、KRKRWHH（SEQ ID NO：9）、：RRKKWHH（SEQ ID NO：10）、KRKRWWH（SEQ ID NO：11）、KRKRWHW（SEQ ID NO：12）、RRKKWHW（SEQ ID NO：13）、RKKKWHW（SEQ ID NO：14）、KRRKWHW（SEQ ID NO：15）、KRRKWWH（SEQ ID NO：16）、RKKKWWH（SEQ ID NO：17）、RRKKWHW（SEQ ID NO：18）、KRRKWHH（SEQ ID NO：19）和RKKKWHH（SEQ ID NO：20）。

根据本发明的穿膜肽可以是药学上可接受的盐形式。

本发明的穿膜肽中，所述穿膜肽可以与生物小分子非共价作用相互结合，并携带生物小分子穿过细胞膜进入细胞。

本发明的穿膜肽中，所述的穿膜肽在C端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带标记物或货物分子穿过细胞膜进入细胞，优选地所述标记物选自由荧光素、生物素、特定的亲和基团所组成的组；优选地所述货物分子选自由糖类、多肽、蛋白、药物分子前体、纳米粒子、纳米微球所组成的组。

在第二方面，本发明提供了一种药物组合物，其特征在于，包含根据第一方面所述的穿膜肽。

在第三方面，本发明提供了根据第一方面所述的穿膜肽在用于需要进入细胞内完成诊断和/或治疗的药物的制备中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

1）低毒安全：该穿膜肽分子量小，氨基酸残基个数控制在10个以内，免疫原性低；含有4-6个碱性氨基酸残基，1-3个酸性氨基酸残基，阳离子性低；其残基序列取自20种必需氨基酸，安全无毒。

2）经济：该穿膜肽由固相合成而得，成本较低且便于质量管控。

3）高效：该穿膜肽区别于以往的穿膜肽的最大特点在于，其能够携带糖类等小分子生物物质高效的进入细胞。

附图说明

图1为本发明穿膜肽MEF细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）毒性试验结果显示图；

图2为本发明中的穿膜肽FITC荧光标记后，孵育MEF细胞，荧光显微实验成像图。

具体实施方式

实施例1：穿膜肽合成

1)活化树脂：称取1000mg Fmoc-Trp wang Resin或Fmoc-His wang Resin，加入10-15ml(浸没全部树脂)DMF浸泡30min，使其充分溶胀。

2)脱保护：浸泡树脂的DMF压滤除去，加入10ml含有20％哌啶的DMF溶液，氮气吹沸反应15min，然后压滤除去，脱除氨基的FMOC基团，用10ml异丙醇洗涤树脂三次，再用10ml DMF洗涤三次，而后用茚三酮法检测树脂应成黑色或紫色。

3)缩合反应：连接下一个氨基酸，称取FMOC-氨基酸的用量是1.4mmol/g树脂，910mg TBTU，加入10ml DMF和0.45g HOBt混和均匀后，加入0.52mlDIEA配成反应液，室温下氮气吹沸反应2h。反应完毕后，用异丙醇洗涤树脂三次，然后用DMF洗涤树脂三次。检测氨基。

4)重复步骤2)-3)过程：按多肽的顺序自C端向N端延伸多肽。重复脱保护．洗涤．缩合的过程至剩余的氨基酸连接完毕，完成多肽的连接。

5)多肽切割：用氮气将多肽-树脂复合物吹干，按TFA/phenol/H20/thioanisole/EDT/TIS（80/5/5/5/3/2）的比例配成混和切割试剂。将肽树脂置于圆底烧瓶中，加入切割液磁力搅拌3小时，用200目砂芯过滤器除去树脂，滤液直接抽入冷冻乙醚中，3000r/min离心使粗肽沉淀，冻干至恒重即得粗肽，干燥称重。

6)粗肽用HPLC纯化至95%以上，质谱鉴定。

根据上文方法共合成SEQ ID NO：1-10的共10种穿膜肽。

实施例2：细胞毒性实验

1）接种细胞：取96孔板，每孔加入含有7×10³个细胞培养液，37℃，5%二氧化碳培养箱24小时，使细胞贴壁。

2）培养细胞：配置不同浓度的穿膜肽SEQ ID NO：1，同时设三个阴性对照孔，37℃，5%二氧化碳培养1-5h。

3）显色：贴壁细胞每孔加入20μl MTT，继续孵育4-6h之后弃掉培养液，每孔加入150μl DMSO（二甲基亚砜），震荡10min。

4）比色：选择490nm或570nm波长，在酶标仪免疫检测仪上测定光吸收值，处理数据得到细胞存活率。结果见图1。

实施例3：细胞穿膜实验

1）加入含有一定浓度FITC荧光标记的穿膜肽的培养基孵育细胞，以含有FITC的培养基作为空白对照，孵育30min-4h后小心吸去培养基，并PBS洗涤贴壁细胞三次。

2）加入固定液，10min-20min，固定细胞后PBS洗涤细胞2-3次。

3）加入DAPI染色液染色5min-10min后PBS洗涤2-3次。

4）分别在488nm和543nm的激发光下用荧光显微镜观察，结果见图2。

实施例4：MEF细胞负载海藻糖实验

1）培养基中加入一定量的海藻糖和肽（SEQ ID NO：1-10，使得培养基中海藻糖的终浓度为8mM，加入肽的终浓度为1mM。

2）细胞贴壁后，加入上述培养基，培养30min-4h。孵育后小心吸去培养基，并PBS洗涤贴壁细胞三次。

3）细胞经胰酶消化后，500-1500r/min离心5min，弃去培养液。PBS洗涤1次。

4）在收集的洗涤后细胞中加入3倍于其体积的0．5mol/L三氯乙酸或甲醇，室温放置30-60min，离心后重复提取1次，取2次上清。

5）取纯蒽酮0．2g加稀释后硫酸溶液(体积分数80%)100ml使之溶解，临用前配制。

6）取待测提取液适量，加入4倍体积的硫酸-蒽酮溶液，摇匀冷却，沸水浴精确煮沸2-10min，冷水冷却后置室温10min。

7）同样方法以水为空白，通过紫外吸收法计算海藻糖导入量。结果如表1（以未与肽连接时的导入效率为1）。

表1

肽序列	无	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
												穿膜效率	1	2.19	1.98	1.81	2.04	1.86	1.83	1.92	2.10	2.01	1.87

由表1可以看出，与本发明的穿膜肽共价连接后，海藻糖的导入量比未和本发明的穿膜肽相连时相比增加了一倍以上，大大提高了穿膜效率。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用材料和步骤的等效替换以及辅助材料和步骤的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种穿膜肽，其特征在于，所述穿膜肽序列为SEQ ID NO:12。

2.根据权利要求1所述的穿膜肽，其特征在于，所述穿膜肽是药学上可接受的盐形式。

3.根据权利要求1所述的穿膜肽，其特征在于，所述穿膜肽与糖生物小分子非共价作用相互结合，并携带生物小分子穿过细胞膜进入细胞。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的穿膜肽，其特征在于，所述的穿膜肽在C端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带标记物或货物分子穿过细胞膜进入细胞。

5.根据权利要求4所述的穿膜肽，其特征在于，所述标记物选自由荧光素、生物素、特定的亲和基团所组成的组。

6.根据权利要求4所述的穿膜肽，其特征在于，所述货物分子选自由糖类、多肽、蛋白、药物分子前体、纳米粒子、纳米微球所组成的组。

7.一种药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求1至6中任一项所述的穿膜肽。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的穿膜肽在用于需要进入细胞内完成诊断和/或治疗的药物的制备中的应用。