CN113599504B

CN113599504B - 一种无载体蛋白质胞内递送前药及其制备方法与应用

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Publication number: CN113599504B
Application number: CN202110792046.1A
Authority: CN
Inventors: 殷黎晨; 赵子印; 刘寻
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2021-07-13
Filing date: 2021-07-13
Publication date: 2024-05-14
Anticipated expiration: 2041-07-13
Also published as: CN113599504A; WO2023284554A1

Abstract

本发明提供了一种无载体蛋白质胞内递送前药及其制备方法与应用，为经由_L‑型氨基酸转运蛋白质1(LAT1)转运的无载体化蛋白质胞内递送体系。本发明的递送体系可将不同电荷/分子量的蛋白质直接递送进入细胞，避免内涵体/溶酶体的包裹，维持蛋白质活性，并且具有优异的肿瘤靶向性，减少毒副作用。这是第一例跨膜转运蛋白介导的无载体化蛋白质前药胞内转运，实现了在肿瘤细胞中蛋白质活性的高度敏感和高选择性调控。这种简单而高效的技术为抗肿瘤蛋白质药物的潜在临床应用提供了新的策略。

Description

一种无载体蛋白质胞内递送前药及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及蛋白质修饰转运技术，更具体涉及蛋白质/多肽的递送体系，具体为一种无载体蛋白质胞内递送前药及其制备方法与应用。

背景技术

蛋白质是一类重要的生物材料，其具有良好的生物相容性，多种蛋白质（如酶）还具有特殊的生物功能，因此有望于实现多种应用例如：癌症治疗、免疫治疗及生物成像等。绝大多数生物反应，都在胞内进行，胞内作用的蛋白质制剂具有广阔的应用前景。然而蛋白质分子量较大，不能穿过生物膜屏障，目前的蛋白质制剂多靶向胞外受体或结构域，这很大程度上限制了蛋白质制剂的应用。开发高效安全的蛋白质胞内递送系统，将功能性蛋白质递送进入功能异常细胞，实现细胞死亡或者功能恢复，同时减少正常细胞的毒副作用具有重要的意义。

目前蛋白质胞内递送方式多基于载体协助递送，这种递送方式存在着如下几个问题：1）为了实现较好的递送效果大多使用阳离子聚合物作为蛋白质载体，阳离子聚合物在血清中不稳定限制了其在体内的应用。2）载体协助递送的方式通过内吞途径进入细胞，绝大部分蛋白质被内涵体/溶酶体捕获，并在溶酶体中降解，只有极少数蛋白质进入胞质发挥功能。3）缺乏靶向功能，能够进入正常细胞中，产生毒副作用。4）载体与蛋白质的相互作用，可能破坏蛋白质的三维结构造成活性的丧失。5）载体在体内需要长时间降解，存在潜在的安全性问题。

因此亟需研发一种新型递送方式，能够克服上述障碍，将蛋白质安全、高效递送进入病灶细胞。

发明内容

本发明设计了一种无载体蛋白质递送系统，能够被肿瘤细胞识别并转运，可以直接将蛋白质递送进入胞质，避免内涵体/溶酶体包裹，使功能蛋白质活性得到保留，尤其是，可降低蛋白质递送系统在正常细胞中的毒副作用。解决了现有技术使用的蛋白质药物都是通过靶向细胞表面受体或者细胞外特定结构发挥功能的问题。

本发明首先由单体N与蛋白质赖氨酸残基的伯氨基团在碳酸氢钠溶液中发生反应，将N与蛋白质共价结合，得到N-蛋白质；然后将N-蛋白质与单体P反应将P结合到蛋白质上，得到PN-蛋白质。PN-蛋白质具有ROS响应性可在肿瘤细胞内高浓度的ROS条件下断裂，恢复原有蛋白质结构与活性。相关实验表明，这种无载体递送方式具有普适性，可递送多种电荷/分子量的蛋白质，并避免内涵体/溶酶体包裹，防止蛋白质降解。此外，本发明的蛋白质递送体系可准确识别肿瘤细胞，减少在正常细胞中的毒副作用，并在肿瘤细胞中高水平的ROS下，去除N修饰基团，促使蛋白质活性恢复，实现肿瘤细胞特异性杀伤。在4T1荷瘤小鼠模型中，使用尾静脉注射方式将毒素蛋白saporin前药（PN-saporin）注入小鼠体内，成功抑制肿瘤生长并且显著延长小鼠生存期。

本发明采用如下技术方案：

一种无载体蛋白质胞内递送前药，其结构为D-N-P，其中结构D为蛋白质，结构N为与蛋白质共价连接的单体结构，结构P为与结构N共价连接的单体结构，为LAT1底物分子。优选的，结构N在肿瘤细胞内环境下，能够从结构D上掉落。

上述无载体蛋白质胞内递送前药的制备方法为，将单体N与蛋白质发生反应，得到N-蛋白质；再将N-蛋白质与单体P反应，得到无载体蛋白质胞内递送前药；其中单体N结构位于蛋白质D与单体P结构之间。

本发明中，单体N与蛋白质的伯氨基团的摩尔比为（1～20）∶1；单体P与蛋白质的伯氨基团的摩尔比为1∶（0.5～10）；优选的，单体N与蛋白质的伯氨基团的摩尔比为（2～15）∶1，单体P与蛋白质的伯氨基团的摩尔比为1∶（1～5）。

本发明中，单体N一端为可以与蛋白质的伯氨基团发生反应的基团，比如硝基、炔基、羧基、琥珀酰胺基、醛基、环氧基团等；N-蛋白质的N端为可以与单体P反应的基团；单体N与蛋白质的反应在溶液中、室温下进行，得到N-蛋白质；N-蛋白质与单体P反应时，反应位点可以是单体N原始的端基，也可是单体N与蛋白质发生反应后，单体N原始的端基转化的基团。单体P一端为能够与N-蛋白质的N端反应的基团。优选的，N-蛋白质与单体P的反应在溶液中、室温下进行，因此单体N与单体P能够发生反应的一端没有特别限定，只要在水中、室温下能够反应即可。优选的，LAT1底物分子为L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-撷氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸等。

作为具体的例子，单体N为下式所示的结构之一：

单体P为下式所示结构之一：

本发明中，单体N与蛋白质的反应在溶液中、室温下进行，具体的，将单体N溶液与蛋白质溶液混合后反应5～20小时，优选的，反应条件为在室温下反应8～15小时；反应结束后，透析，得到N-蛋白质。蛋白质溶液中，溶剂为碱液，所述碱性溶液可以采用碱比如碳酸氢钠等无机碱配制。

本发明中，N-蛋白质与单体P的反应条件为室温反应5～60分钟，优选的，N-蛋白质与单体P的反应条件为室温反应15～30分钟；反应结束后，超滤，得到无载体蛋白质胞内递送前药，即PN-蛋白质。作为一个优点，本发明N-蛋白质与单体P的反应在水中进行，无需其他物质参与，保证了蛋白质前药的纯净。

本发明进一步公开了上述无载体蛋白质胞内递送前药在制备蛋白质药物或者抗肿瘤药物中的应用。

本发明中，蛋白质为毒性蛋白质、非毒性蛋白质或者酶，都是针对肿瘤细胞而言。

本发明的优势在于无载体蛋白质胞内递送前药无需内吞机制，直接将蛋白质递送进入胞质，免去了内涵体/溶酶体逃逸的环节，极大的保留了蛋白质的活性，与此同时由于使用简单的小分子对蛋白质进行修饰，其在血清中的稳定性远高于载体类递送方式。另外本发明可以将蛋白质准确递送进入肿瘤细胞中，并且在细胞外，小分子（结构N、结构P）可以将蛋白质的活性屏蔽，在细胞内环境下，结构N能够从结构D上掉落，比如在肿瘤细胞高水平的活性氧自由基（ROS）的条件下掉落恢复蛋白质活性，双重保险的存在使得对于正常细胞的毒副作用大幅度减少。

附图说明

图1 描述了N修饰以及H₂O₂脱保护后的蛋白质分子量的基质辅助激光解吸电离时间质谱（MALDI-TOF）；

图2 描述了LAT1介导的无载体递送系统递送不同修饰以及H₂O₂预处理的BSA-FITC在HeLa细胞摄取的平均荧光强度图；

图3 描述了LAT1媒介的无载体递送系统递送不同修饰以及H₂O₂预处理的BSA-FITC被HeLa细胞的激光共聚焦图；

图4 描述了LAT1介导的无载体递送系统递送PN-BSA-FITC经不同内吞抑制剂处理后在HeLa细胞中的摄取水平图；

图5 描述了LAT1介导的无载体递送系统递送PN-BSA-FITC在HeLa细胞中不同时间点与溶酶体共定位图；

图6 描述了LAT1介导的无载体递送系统递送PN-BSA-FITC在肿瘤细胞与正常细胞中分布激光共聚焦图；

图7描述了LAT1介导的无载体递送系统在HeLa细胞中递送β-半乳糖苷酶（β-gal）的原位染色图及定量分析图；

图8描述了LAT1介导的无载体递送系统以及商业化试剂PULSin/蛋白质复合物递送不同蛋白质在HeLa细胞中的激光共聚焦图；

图9 描述了LAT1介导的无载体递送系统在HeLa细胞内递送辣根过氧化物酶（HRP）的染色图；

图10描述了LAT介导的无载体递送系统递送核糖核酸酶A前药（PN-RNase A）在HeLa、NIH-3T3以及293T细胞内的毒性测试图；

图11描述了LAT介导的无载体递送系统递送皂草素前药（PN-RNase A）在4T1、NIH-3T3以及293T细胞内的毒性测试图；

图12描述了LAT1介导的无载体递送系统递送毒性蛋白质皂草素前药（PN-saporin）6小时后在小鼠4T1移植瘤模型的组织分布图；

图13描述了LAT1介导的无载体递送系统递送PN-saporin在小鼠4T1移植瘤模型上抑制肿瘤生长图以及生存周期图；

图14描述了LAT1介导的无载体递送系统递送PN-saporin在小鼠4T1移植瘤模型中主要器官以及肿瘤切片的H&E染色图；

图15描述了皂草素前药（PN-saporin）与红细胞共孵育后的溶血率图。

具体实施方式

作为一个具体的示例，本发明制备N和P修饰的蛋白质制剂（无载体蛋白质胞内递送前药）的方法示意如下：

Protein为蛋白质。

具体制备方法举例为：

（1）将4-（羟甲基）苯基硼酸频哪醇酯溶于无水THF中。加入三乙胺，然后加入氯甲酸4-硝基苯酯，室温搅拌反应。反应混合物用乙酸乙酯稀释，先后用HCl和饱和NaHCO₃洗涤。有机层经MgSO₄干燥、过滤并浓缩。然后在硅胶柱上纯化。用含5%乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到白色固体为单体N；

（2）将单体N溶于二甲基亚砜溶液中，得到单体N溶液；将蛋白质溶于NaHCO₃溶液中，得到蛋白质溶液；然后按一定的单体N与蛋白质氨基摩尔比混合单体N溶液与蛋白质溶液，室温搅拌后，将反应液转移至透析袋中，超纯水透析，得到N-蛋白质；

（3）将单体P溶于水中(1 mg/mL)；按一定摩尔比，将N-蛋白质与单体混合，室温搅拌后，将反应液转移至超滤管中，超纯水洗涤，得到PN-蛋白质，为无载体蛋白质胞内递送前药。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。本发明涉及的原料都是常规产品，可市购也可根据现有技术常规制备；涉及的具体操作方法比如搅拌、冻干都为常规方法，具体测试也为本领域常规方法。

合成例

（1）将4-（羟甲基）苯基硼酸频哪醇酯（0.5 g， 2.1 mmol）溶于20 mL无水THF中。加入三乙胺 (0.6 mL, 4.5 mmol), 然后加入氯甲酸4-硝基苯酯（0.47 g, 2.3 mmol），然后在室温中搅拌1小时。反应混合物用乙酸乙酯稀释，先后用1.0 M HCl和饱和NaHCO₃水溶液洗涤。有机层经MgSO₄干燥、过滤并浓缩，然后在硅胶柱上纯化，用含5%乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到白色固体为单体N：

通过¹H NMR (400 MHz, CDCl3)表征, δ = 8.25 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.85(d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 5.31(s, 2H), 1.35 (s, 12H)；

单体P为下式所示结构：

单体N、单体P用于以下实施例。

实施例一

将单体N溶解于二甲基亚砜溶液中，最终浓度为（32 mg/mL），得到单体N溶液；将牛血清蛋白质（BSA）溶解于浓度为0.1 M的NaHCO₃水溶液中（6 mg/mL），得到牛血清蛋白质溶液；然后按照单体N与牛血清蛋白质的氨基摩尔比为 2∶1的比例混合两种溶液，在室温下搅拌10小时，将反应液转移至透析袋中（MWCO = 1 kDa），超纯水透析3天，冻干，得到N修饰的蛋白质单体（N-BSA）。

将单体P、N-BSA分别溶解在水中，得到单体P溶液(1 mg/mL)、N-BSA溶液(6 mg/mL)。按单体P与蛋白质BSA的伯氨基团的摩尔比为2∶3的摩尔比例混合单体P溶液与N-BSA溶液，在常温下搅拌30分钟，然后将反应液转移至超滤管中（MWCO = 3 kDa），超纯水洗涤5次，冻干，得到PN-蛋白质（PN-BSA），为无载体蛋白质胞内递送前药。

将水和乙腈按1:1的比例混合，得到混合液，在混合液中加入芥酸（最终浓度为10mg/mL），以混合液为基质溶液。蛋白质浓度为1 mg/mL（水中，pH = 7），并与基质溶液等体积混合。使用基质辅助激光解吸电离时间质谱 (MALDI-TOFMS)对得到的蛋白质样品进行表征，具体见图1。MALDI-TOF实验结果表明，每个BSA上可以修饰约24个N分子，并可在修饰后在H₂O₂存在条件下无痕脱去修饰，恢复为BSA最初分子量。

实施例二

使用异硫氰酸荧光素（FITC）对BSA进行标记，在0.1 M NaHCO₃缓冲溶液中按照蛋白质：FITC = 1:4 (质量比)避光条件下，反应过夜，然后使用超纯水透析（MWCO = 3.5kDa）两天，除去未反应的FITC分子，得到标记FITC的蛋白质，然后使用实施例一中方法对蛋白质进行修饰得到PN-BSA-FITC。然后将人宫颈癌细胞（HeLa）按照每孔5×10⁴ 的数量接种到24孔板内，在含有10% FBS的DMEM培养基中培养24小时。待细胞完全贴壁以后按照4 μg/mL 的浓度将不同修饰以及终浓度为100 μM的H₂O₂提前处理12小时的蛋白质样品加入到孔中，在37 ℃以及5% CO₂的条件下孵育12小时。用PBS清洗两次以后，使用台盼蓝溶液孵育3分钟，继续用PBS清洗三次，最后通过流式细胞仪分析细胞的摄取情况。具体参见图2，实验结果表明经PN修饰的蛋白质，细胞摄取量最高，相比于仅N修饰的蛋白质，其荧光强度增加了35倍，但经H₂O₂处理后，脱去修饰，其失去内化能力，所以荧光强度与未修饰组类似。

进一步使用激光共聚焦实验对于不同修饰以及H₂O₂处理的蛋白质前药的内化进行了研究，首先将HeLa细胞按照每孔10×10⁵的数量接种到共聚焦专用皿中。在含有10% FBS的DMEM培养基中培养24小时使细胞完全贴壁，然后按照4 μg/mL的浓度将不同修饰以及终浓度为 100 μM的H₂O₂提前处理12小时的蛋白质样品加入孔中，在37 ℃以及5% CO₂ 的条件下孵育12小时，具体参见图3。共聚焦实验结果与流式细胞术分析结果一致，以上结果共同表明无载体蛋白质胞内递送前药能够被LAT1识别，并通过其转运作用实现有效内化。

实施例三

为了进一步探究蛋白质前药的内化机制，使用激光共聚焦方法进行了研究。首先将HeLa细胞按照每孔10×10⁵的数量接种到共聚焦专用皿中。在含有10% FBS的DMEM培养基中培养24小时使细胞完全贴壁PBS洗涤3次，换用新鲜培养基，加入内吞抑制剂：氯丙嗪（CPZ, 10 μg/mL）抑制网格蛋白质介导的内吞作用；染料木黄酮（GNT, 100 μg/mL）抑制小窝蛋白质介导的内吞作用；甲基-β-环糊精（mβCD, 50 μM）减少膜上胆固醇的量抑制脂质筏介导的内吞作用以及渥漫青霉素（WTM, 50 nM）抑制巨胞饮，37 ℃孵育1小时。PBS洗涤3次，更换新鲜培养基，然后加入含有PN-BSA-FITC的PBS溶液（终浓度为 4 μg/mL）继续孵育12小时，37 ℃孵育12小时，PBS洗涤3次，台盼蓝（0.2 mg/mL, 500 μL）孵育2分钟，PBS洗涤3次，RIPA裂解液（100 μL, 30 min）裂解细胞。通过荧光分光光度计（λ _ex = 488 nm, λ _em = 530nm）测定细胞摄取水平。将没有抑制剂作用下PN-BSA-FITC（终浓度为4 μg/mL）处理12小时（37 ℃）HeLa细胞的荧光强度作为100%。具体参见图4，如图所示，使用内吞抑制剂将潜在内吞通路进行抑制后，蛋白质前药内化量几乎没有减少，表明蛋白质前药以非小窝蛋白、脂筏蛋白、巨胞饮等通路内吞进入细胞，以非内吞方式进入细胞。

实施例四

直观显示无载体化蛋白质前药胞内递送系统以非内吞方式进入细胞，使用激光共聚焦的方法对于蛋白质前药（PN-BSA-FITC）和溶酶体/内涵体的共定位进行了观察。首先将HeLa细胞按照每孔10×10⁵的数量接种到共聚焦专用皿中。在含有10% FBS的DMEM培养基中培养24小时使细胞完全贴壁，然后按照4 μg/mL的浓度将蛋白质样品加入孔中，在37 ℃以及5% CO₂的条件下分别孵育1、2、4、6、8、12小时。用PBS清洗两次以后，使用台盼蓝溶液孵育3分钟，继续用PBS清洗三次，Hoechst 33342（5 μg/mL）染色20分钟，用Lysotracker deepred （20 nM）标记溶酶体/内涵体30分钟，用PBS清洗三次后在激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞内的共定位。具体参见图5。实验结果显示，在任何时刻，蛋白质前药（绿色荧光）与溶酶体/内涵体（红色荧光）几乎没有重合，表明蛋白质前药没有被包裹在溶酶体/内涵体中。以上实验结果表明，蛋白质前药以非内吞方式进入细胞。

实施例五

本发明无载体化蛋白质前药胞内递送体系可以靶向肿瘤细胞，在递送毒性功能蛋白质时减少对正常细胞的毒副作用。为了验证这一理论，选取了4T1、MDA-MB-231、CT-26、U87、U251五种肿瘤细胞，同时选取了NIH-3T3、HEK293T和H9C2三种正常细胞作为对照组。首先将不同种类的细胞按照每孔10×10⁵的数量接种到共聚焦专用皿中。在含有10% FBS的DMEM/1640完全培养基中培养24小时使细胞完全贴壁，然后按照4 μg/mL的浓度将异硫氰酸荧光素（FITC）标记的蛋白质样品（PN-BSA-FITC）加入孔中，在37 ℃以及5% CO₂的条件下孵育12小时。用冷的PBS清洗两次以后，使用台盼蓝溶液孵育3分钟，继续用PBS清洗三次，Hoechst 33342（5 μg/mL）染色20分钟，激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞内的荧光分布。具体参见图6。实验结果显示，在五种肿瘤细胞中均观察到了广泛的荧光分布，表明蛋白质前药大量内化进入细胞中，而在正常细胞中几乎没有荧光分布，表明蛋白质前药能够特异性的识别肿瘤细胞，避免在正常细胞中的内化。

实施例六

为了研究P、N修饰后的生物活性蛋白在细胞内活性恢复情况，制备了P、N修饰的β-半乳糖苷酶（β-gal）前药。制备方法与实施例一中类似，按照P:N:蛋白质伯氨基=1∶4∶1的摩尔比例进行制备，并通过透析方法纯化。

将HeLa细胞以每孔4×10⁴个接种到24孔板内，在含有10% FBS的DMEM培养基中培养24小时。为了探究细胞内ROS对PN-β-gal活性恢复的作用，使用维生素C（VC, 2 h, 除去细胞内原有的ROS）预先处理细胞，将不同修饰以及处理的β-gal蛋白质样品按照4 μg/mL的浓度加入孔中在37 ℃以及5% CO₂的条件下孵育12小时。用PBS洗三次，加入细胞固定液，室温固定10分钟。移除固定液，PBS洗三次，加入含有X-gal（0.1 mg/mL）的底物染色液。将细胞板放置于不含CO₂的37 ℃培养箱中过夜。之后移除染色液，PBS洗三次。用光学显微镜观察细胞的染色。进一步地使用邻硝基-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）对酶的活性定量分析。β-gal胞内递送实验处理后，PBS洗三次，加入200 μL裂解液裂解细胞，取50 μL裂解液加入50 μL含有ONPG的酶活检测液，37 ℃放置1 h，之后加入150 μL NaHCO₃（1 M）终止反应，将溶液转移至96孔板中检测420 nm的吸光度。以等浓度未处理的β-gal的酶活作为阳性对照，吸光度定义为100%。具体参见图7。实验结果表明，PN-β-gal显示出最多的蓝色沉积，表明有大量的β-gal内化，并且执行其生物学功能，VC处理后，蓝色沉积减少，表明ROS减少阻止了PN-β-gal活性的恢复。定量实验显示了相同的结果，PN-β-gal在细胞中几乎可以完全恢复活性，证明了P、N修饰的蛋白质前药可以有效实现蛋白内化，并且在肿瘤细胞中恢复其活性。

实施例七

本发明无载体递送体系可用于递送不同分子量/电荷的蛋白质。用FITC标记细胞色素C（Cyt C-FITC）,核糖核酸酶A（RNase A-FITC）,α-胰蛋白酶（α-Chyt-FITC），超氧化物歧化酶（SOD-FITC）,蛋清白蛋白（Egg W-FITC），免疫球蛋白（IgG-FITC）以及TRITC（5/6-羧基-四甲基-罗丹明琥珀酰亚胺酯）标记的胰蛋白酶（TRP-TRITC），溶菌酶（LYZ-TRITC），分别按实施例一中方法制备成P、N修饰的蛋白质前药；按照产品说明书，使用商业化试剂（PULSin）形成PLUSin/蛋白质复合物作对比。

在含有10% FBS的DMEM培养基中培养24小时使HeLa细胞完全贴壁，然后按照4 μg/mL的终浓度将不同分子量/电荷的蛋白质前药或PLUSin/蛋白质复合物样品加入孔中，在37℃以及5% CO₂的条件下孵育12小时。用冷的PBS清洗两次以后，使用台盼蓝溶液孵育3分钟，继续用PBS清洗三次，Hoechst 33342（5 μg/mL）染色20分钟，激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞内的荧光分布。具体参见图8。实验结果显示，经P、N化合物修饰后，所有蛋白质前药在细胞内均出现明显且均匀分布，此外，相比于商业化试剂PULSin，本发明蛋白质前药的内化量明显增加。以上实验结果共同表明，本发明小分子修饰蛋白制备蛋白质前药具有良好的普适性，并且其递送能力优于现有的商业化试剂。

实施例八

辣根过氧化物酶（HRP）的胞内递送。制备方法与实施例一类似，按照P:N:伯氨基 =1.5∶7∶1的摩尔比例进行制备，并通过透析方法纯化，得到PN-HRP。

将HeLa细胞以每孔4×10⁴个接种到24孔板内，在含有10% FBS的DMEM培养基中培养24小时。然后将不同修饰以及处理的HRP蛋白质样品按照4 μg/mL的浓度加入孔中在37℃以及5% CO₂的条件下孵育12小时。PBS洗6次，加入四甲基联苯胺（TMB，10 μg/mL）溶液和过氧化氢（3 mM）溶液，室温孵育10分钟，观察各孔的染色情况。具体参见图9。实验结果显示，PN-HRP中蓝色变化最为明显，未修饰组几乎没有颜色变化，表明PN-HRP能够有效内化进入细胞，并且执行其生物学功能。

实施例九

毒性蛋白质的胞内递送。选取核糖核酸酶A（RNase A）作为模型蛋白质检测胞内的递送效率及生物学功能。制备方法与实施例一中类似，按照P:N:蛋白质伯氨基 = 2∶7∶1的摩尔比例进行制备，并通过透析方法纯化，得到PN- RNase A。

将HeLa、NIH-3T3以及293T细胞以每孔6×10³个接种到96孔板内，在含有10% FBS的DMEM培养基中培养24小时。将N单体和单体P修饰的核糖核酸酶A按照每孔 20 μg/mL，10μg/mL，5 μg/mL，2 μg/mL，1 μg/mL，0.5 μg/mL的蛋白质浓度加入到孔中，继续培养48 h。用CTL测定法测定细胞的活力，以无任何处理的细胞作为参照，结果表示为对照细胞的百分比。具体参见图10。实验结果显示，PN-RNase A在肿瘤细胞HeLa中表现出明显毒性，其IC₅₀值为1.707 μg/mL，而在正常细胞NIH-3T3与293T中几乎没有显示出毒性，N-RNase A与RNaseA的效果近似；该结果表明PN-RNase A可以有效被肿瘤细胞识别并摄取，并特异性的杀伤肿瘤细胞具体参见图10。

实施例十

选取皂草素蛋白（saporin）作为模型蛋白质检测胞内的递送效率及生物学功能。制备方法与实施例一中类似，按照P:N:蛋白质伯氨基 = 1.5∶4∶1的摩尔比例进行制备，并通过透析方法纯化。并在0.1 M NaHCO₃缓冲溶液中，将Cy5-NHS分别与saporin或者PN-saporin混合，反应过夜，并使用超纯水透析（MWCO = 3.5 kDa）获得荧光标记的蛋白质前药。

常规用CTL测定法测定，PN-saporin对4T1细胞产生了明显的毒性，其IC₅₀值为0.050 μg/mL，在正常细胞（NIH-3T3, 293T）中均没有明显毒性，表明这种蛋白质前药对正常细胞没有毒副作用，具有良好的安全性，具体参见图11。

本发明无载体蛋白质递送系统在体内的组织分布。将生长良好的乳腺癌细胞（4T1）接种到BALB/c（6-8周）小鼠皮下，建立乳腺癌移植瘤模型。当肿瘤体积达到约200 mm³的时候，Balb/c小鼠尾静脉分别注射saporin-Cy5和PN-saporin-Cy5（0.5 mg saporin/kg），在6小时的时候，将小鼠处死，将其心、肝、脾、肺、肾以及瘤切下，在小动物成像仪下观察蛋白质在各个部位富集情况。同时将器官以及瘤称重研磨，使用组织裂解液进行裂解，用酶标仪对其荧光强度进行测量，进行定量分析。具体参见图12。

本发明无载体蛋白质递送系统在体内的抑制肿瘤效果。将生长良好的乳腺癌细胞（4T1）接种到BALB/c（6-8周）小鼠皮下，建立乳腺癌移植瘤模型。当肿瘤体积达到约50 mm³的时候，随机将小鼠分为三组，每组10只，分别为（1）PBS组，（2）皂草素（Saporin）组，（4）PN-皂草素（PN-sporin）组。每组小鼠尾静脉给与100 μL的PBS、皂草素或P-N-皂草素，其中皂草素蛋白剂量为0.5 mg/kg。分别在第1，3，5，7天给药。每隔一天测量小鼠肿瘤的体积和体重，同时检测小鼠的生存状况。当肿瘤体积达到1000 mm³的时候默认为死亡。如图所示，说明PN-saproin给药组小鼠，其肿瘤生长被明显抑制，并且小鼠生存周期延长到了40天，表明PN-saporin具有良好的体内抑瘤功效，具体参见图13。

以上实验表明，Saporin给药组肿瘤生长状况与PBS组类似，在12天的观察期内迅速生长。相比之下，PN-saporin组肿瘤生长被显著抑制，12天时肿瘤抑制率为80%。并且小鼠生存期明显延长，给药后30天内，PN-saporin组小鼠存活率为100%，而对照组小鼠在24天时就全部死亡。第12天，收集各组小鼠的肿瘤组织，并检测其肿瘤细胞坏死以及凋亡水平。其中，PBS和saporin处理后的肿瘤组织显示紧密堆积的肿瘤细胞和间质，而PN-saporin处理后的肿瘤组织则显示明显的细胞坏死及凋亡特征，例如核浓缩、细胞缩小和空泡化。在12天的观察期内，PN-saporin给药后小鼠体重没有明显减轻，主要器官切片的H&E染色结果没有显示异常，表明PN-saporin系统给药后并没有出现明显的副作用具体参见图14。溶血实验中PN-saporin给药组没有明显的溶血现象，表明其良好的生物安全性,具体参见图15。这些结果表明，PN-saporin是一种高效的蛋白质药物，可以用于体内肿瘤治疗，且没有明显的毒副作用。

本发明公开了一种无载体蛋白质前药胞内递送策略。蛋白质赖氨酸残基上共价修饰LAT1底物分子制备蛋白质前药，其可通过转运作用高效、高选择性地递送至肿瘤细胞中，避免正常细胞的摄取。这种胞内递送方式无需经过内吞途径和内涵体/溶酶体捕获，可大大提高蛋白质药物的利用率。在肿瘤细胞中高浓度的H2O2作用下蛋白质前药上的修饰基团可脱落，蛋白质恢复活性并发挥药理活性。该递送策略具有肿瘤细胞普适性，可用于递送不同分子量、等电点和功能的蛋白质药物，包括酶、抗体、毒素蛋白和CRISPR-Cas9核酸酶。尤其是，毒素蛋白saporin的前药PN-saporin在体内外表现出优异的抗肿瘤效果，而对正常细胞/组织无毒副作用。这是第一例跨膜转运蛋白介导的无载体化蛋白质胞内转运，它实现了在肿瘤细胞中蛋白质活性的高度敏感和高选择性调控。这种简单而高效的技术为抗肿瘤蛋白质药物的潜在临床应用提供了新的策略。

Claims

1.一种无载体蛋白质胞内递送前药，其特征在于，所述无载体蛋白质胞内递送前药的结构为D-N-P，其中结构D为蛋白质，结构N为与蛋白质共价连接的单体结构，结构P为与结构N共价连接的单体结构；结构N在肿瘤细胞内环境下，能够从结构D上掉落；结构N与蛋白质的伯氨基团的摩尔比为（1～20）∶1；结构P与蛋白质的伯氨基团的摩尔比为1∶（0.5～10）；结构N一端为可以与蛋白质的伯氨基团发生反应的基团；

结构N的化学结构式如下：

；

结构P的化学结构式如下：

。

2.根据权利要求1所述无载体蛋白质胞内递送前药，其特征在于，所述无载体蛋白质胞内递送前药的制备方法为，将结构N与蛋白质发生反应，得到N-蛋白质；再将N-蛋白质与结构P反应，得到无载体蛋白质胞内递送前药。

3.根据权利要求2所述无载体蛋白质胞内递送前药，其特征在于，结构N与蛋白质的反应在溶液中、室温下进行，得到N-蛋白质；N-蛋白质与结构P的反应在溶液中、室温下进行。

4.权利要求1所述无载体蛋白质胞内递送前药的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，将结构N溶液与蛋白质溶液混合后反应5～20小时，得到N-蛋白质；再将N-蛋白质与结构P室温反应5～60分钟，得到无载体蛋白质胞内递送前药。

5.根据权利要求4所述无载体蛋白质胞内递送前药的制备方法，其特征在于，蛋白质为毒性蛋白质、非毒性蛋白质或者酶。

6.权利要求1所述无载体蛋白质胞内递送前药在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物不含高分子材料。