CN113549128B - 含氟烷基链连接的多肽及其在多肽胞内递送中的应用 - Google Patents

含氟烷基链连接的多肽及其在多肽胞内递送中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113549128B
CN113549128B CN202010330603.3A CN202010330603A CN113549128B CN 113549128 B CN113549128 B CN 113549128B CN 202010330603 A CN202010330603 A CN 202010330603A CN 113549128 B CN113549128 B CN 113549128B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
fluoroalkyl chain
fluoroalkyl
chain
linked
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010330603.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113549128A (zh
Inventor
程义云
荣广玉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
East China Normal University
Original Assignee
East China Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by East China Normal University filed Critical East China Normal University
Priority to CN202010330603.3A priority Critical patent/CN113549128B/zh
Publication of CN113549128A publication Critical patent/CN113549128A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113549128B publication Critical patent/CN113549128B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种含氟烷基链连接的多肽及其在多肽胞内递送中的应用，所述含氟烷基链连接的多肽由含氟烷基链和多肽组成，所述含氟烷基链共价连接在多肽的任意位点上，所述多肽为序列长度小于等于50个氨基酸的多肽；所述含氟烷基链为含不同数量氟原子的烷基直链；所述含氟烷基链连接的多肽可以直接内吞进入细胞发挥多肽功能，无需载体辅助。本发明提供的含氟烷基链连接多肽可以高效率的递送多肽入胞，对不同分子量、亲疏水性、等电点和氨基酸长度的多肽均有效，并且可以保持药物多肽的生物活性，同时对细胞产生的毒性小，具有良好的生物相容性。

Description

含氟烷基链连接的多肽及其在多肽胞内递送中的应用
技术领域
本发明属于生物技术、高分子化学、细胞生物学等领域，具体涉及含氟烷基链连接的多肽及其在多肽胞内递送中的应用。
背景技术
多肽胞内递送是指将外源多肽分子递送到细胞质中，从而实现细胞生物学功能的调控、疾病的治疗等作用。多肽是天然蛋白的功能性片段，通常是在研究者们通过分子生物学技术分析天然蛋白时发现的。这些功能性片段虽然体积小，结构简单，但是在某些情况下具有能够与蛋白质相媲美的生物活性。近年来，越来越多的多肽被用来治疗细菌和病毒感染、癌症和血管疾病。与主导制药业的传统化学药品相比，多肽具有高选择性和良好的生物相容性。然而，由各种氨基酸通过酰胺键组成的多肽，在体内极易被酶降解，致其体内半衰期短，难以达到治疗效果，阻碍了多肽药物的临床转化。此外，由于大多数药物多肽不能穿透细胞膜，目前的药物多肽仅局限于细胞外靶点，如细胞表面受体、离子通道和分泌蛋白等。将细胞穿膜肽，如TAT或R8，与功能多肽结合是最广泛采用的促进多肽胞内递送的策略。然而，细胞穿膜肽修饰的多肽通常通过内吞途径被细胞内化，并可能在细胞内运输过程中被降解或包裹在内含体中不能释放。这些经过细胞穿膜肽修饰的多肽仍然容易被酶降解，不得不通过环化等化学修饰来提高其蛋白水解的稳定性和细胞膜的通透性。载体可以将蛋白靶点为胞内的多肽递送到胞质中，目前多肽胞内递送的载体主要包括聚合物、脂质体、高分子载体和无机纳米颗粒等。此外，多肽本身也可以通过超分子组装或基因工程制备成纳米结构，以提高蛋白水解稳定性和细胞内化。尽管以上方法具备一定的优点，但开发一种简便、可靠、可以克服胞内和胞外多种障碍的多肽胞内递送策略仍是一项具有挑战性的任务。
大量研究表明，将疏水组分如烷基链、胆固醇、疏水氨基酸等结合到多肽的骨架上可以促进其膜的通透性。这些疏水组分的引入构建了可以自组装成各种纳米结构的两亲性肽，这不仅改善了多肽的内吞作用和内含体逃逸，而且改善了它们的蛋白水解稳定性。但是由于多肽种类多样，分子量、空间结构、带电状态、亲疏水性差异巨大，单单依靠烷基链很难做到普适、高效的递送多种多肽。
发明内容
为了解决现有技术中多肽酶稳定性和普适高效的胞内递送问题，基于含氟烷基链修饰的高分子已被证实具备高效的基因或蛋白质胞内递送效率和血清稳定性的特性，本发明设想将含氟烷基链与多肽共价连接后，组装成纳米粒并提高多肽的蛋白水解稳定性和胞内递送效率。针对以上设想，含氟烷基链连接的多肽可以解决多肽酶稳定性和普适高效的胞内递送问题。一方面含氟烷基链既疏水又疏油，在水相、磷脂相以及蛋白质溶液中均维持良好的稳定性，易于穿透细胞膜，提高多肽内吞效率；另一方面多肽可借助含氟烷基链亲氟效应和疏水性驱动自组装，提高其酶稳定性。本发明利用这一原理，设计合成了一类含氟烷基链连接的多肽，这些多肽可以自组装成均一的纳米粒子并且具备良好的酶稳定性和高效的胞内递送效率。
本发明创新地提供了一类含氟烷基链连接的多肽。这类含氟烷基链连接的多肽胞内递送效率高，递送到细胞内的多肽仍具有生物活性，并且具有较好的酶稳定性。同时对细胞产生的毒性小，具有良好的生物相容性。
本发明提供了一类含氟烷基链连接的多肽，所述含氟烷基链连接的多肽包括含氟烷基链和多肽，所述含氟烷基链通过共价键连接在多肽的任意位置上。
所述含氟烷基链连接的多肽的结构如式(1)所示：
CF3(CF2)n-(CH2)m-X-R
式(1)
式(1)中，
R为多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-6中的任意一种或多种；
X为连接键，所述连接键包括但不限于-S-S-、-MAL-S-、-S-、-CO-NH-、-NH-CO-、-C(OH)-CH2-NH-、-NH-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝S)-NH-等；优选地，为-S-S-；
所述连接键中的-MAL-S-的结构式如式(2)所示：
Figure BDA0002464820170000031
n为0-10之间的整数；优选地，为0-9之间的整数；进一步优选地，为n＝5；
m为0-5之间的整数；优选地，为0-2之间的整数；进一步优选地，为m＝2。
进一步地，本发明所述含氟烷基链连接的多肽的结构如式(3)所示：
CF3(CF2)n-(CH2)m-X-R1
式(3)
式(3)中，
R1为多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
X为连接键，所述连接键为-S-S-；
n＝3或7；
m＝2。
本发明还提供了所述含氟烷基链连接的多肽在多肽胞内递送中的应用。所述含氟烷基链如式(1)所示，所述多肽胞内递送是将多肽由细胞外递送到细胞内。
本发明还提供了所述含氟烷基链连接的多肽在制备多肽胞内递送产品中的应用。
本发明还提供了所述含氟烷基链连接的多肽的制备方法。所述含氟烷基链与多肽在有机溶剂中进行反应，得到所述含氟烷基链连接的多肽。
其中，所述有机溶剂选自甲醇、二氯甲烷、二甲亚砜、二甲基甲酰胺等中的一种或多种；优选地，为甲醇和二氯甲烷。
其中，所述含氟烷基链与多肽的摩尔比为(3-5)：1；优选地，为3：1。
其中，所述反应的时间为4-12小时；优选地，为4小时。
其中，所述反应的温度为4-25℃；优选地，为4℃。
本发明优选在惰性气体保护下进行。
本发明所述制备得到的含氟烷基链连接的多肽后，还包括纯化步骤，将所述制备得到的含氟烷基链连接的多肽经高效液相色谱或薄层色谱进行纯化。
本发明还提供一种多肽胞内递送方法，所述多肽胞内递送是将式(1)所述的含氟烷基链连接的多肽由细胞外递送到细胞内。
所述多肽胞内递送是将式(1)所述的含氟烷基链连接的多肽递送至肾上皮细胞、胚胎成纤维细胞、单核巨噬细胞、乳腺癌细胞。
所述肾上皮细胞包括293T、HEK293。
所述胚胎成纤维细胞包括NIH3T3。
所述单核巨噬细胞包括RAW264.7。
所述乳腺癌细胞包括乳腺癌MDA-MB-231细胞、乳腺癌MCF7细胞。
本发明将制备的含氟烷基链连接的多肽组装成纳米粒，直接加入到无血清培养基中，然后转入细胞中即可完成胞内递送。
其原理为：含氟烷基链连接的多肽组装成纳米粒通过内吞进入细胞，其中，内吞的通路包括网格蛋白介导的内吞、脂阀介导的内吞、巨胞饮以及细胞表面二硫键交换介导的内吞。
本发明还提供了一种治疗个体的肿瘤的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述的含氟烷基链连接的多肽。
所述肿瘤为乳腺癌、宫颈癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌等。
所述乳腺癌为乳腺癌MDA-MB-231细胞。
所述宫颈癌为宫颈癌HeLa细胞。
本发明还提供一种新的含氟烷基链连接的多肽的纳米组装体，将式(1)所述的含氟烷基链连接的多肽在水溶液或缓冲液中组装成纳米组装体。
本发明还提供一种多肽纳米组装体的制备方法，将式(1)所述的含氟烷基链连接的多肽溶于二甲亚砜中，然后加入水溶液或缓冲液进行组装，得到含氟烷基链连接的多肽的纳米组装体。
其中，所述“水溶液”指超纯水。
其中，所述“缓冲液”指PBS缓冲液。
本发明进行自组装的原理为：含氟烷基链的表面活性能低，亲氟效应使得含氟烷基链连接的多肽趋向自组装。
在一个具体实施方式中，本发明多肽纳米组装体的制备方法，具体包括以下步骤：将式(1)所述的含氟烷基链连接的多肽溶于二甲亚砜中，缓慢滴入水溶液或缓冲液中后超滤离心或透析去除二甲亚砜，得到含氟烷基链连接的多肽的纳米组装体。
本发明还提供了所述含氟烷基链连接的多肽纳米组装体在多肽胞内递送以及多肽治疗中的应用。
本发明还提供了所述含氟烷基链连接的多肽纳米组装体在制备多肽胞内递送产品和/或抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤为乳腺癌、宫颈癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌等。
所述乳腺癌为乳腺癌MDA-MB-231细胞、乳腺癌MCF7细胞。
所述宫颈癌为宫颈癌HeLa细胞。
利用本发明分别在HeLa，MDA-MB-231等细胞系中递送上述多肽。实验结果表明本发明具有以下优点：本发明提出的含氟烷基链连接的多肽具有较高的胞内递送效率，效率远高于碳氢烷基链连接的多肽和细胞穿膜肽(TAT)连接的多肽；不同分子量、亲疏水性、等电点和氨基酸长度的多肽通过本发明提出的方法连接含氟烷基链后均可以自组装成均一的纳米粒，并且具备较好的蛋白酶水解稳定性；不同长度的含氟烷基链连接的多肽和含氟烷基链通过不同连接键连接的多肽都可以有效递送多肽入胞；通过细胞毒性实验发现本发明提供的含氟烷基链连接的多肽(非生物活性多肽)具有低细胞毒性，在多肽递送的实验条件下细胞的存活率高于90％，具有良好的生物相容性；通过生物活性肽的递送，发现本发明将生物活性多肽递送到癌细胞MDA-MB-231，具有明显的细胞毒性，达到杀伤癌细胞的治疗效果；通过生物活性肽的体内肿瘤抑制实验，发现本发明具有一定的体内治疗效果；本发明提出的含氟烷基链连接的多肽在细胞内递送过程中可以达到高递送效率，制备简单，材料细胞毒性小，能够有效且安全地将多肽分子递送到细胞质中，可应用于药物多肽的体内治疗。
附图说明
图1为本发明实施例3中含氟烷基链连接的多肽的纳米组装体动态光散射和透射电子显微镜表征。
图2为本发明实施例4中碳氢烷基链连接的多肽的纳米组装体动态光散射和透射电子显微镜表征。
图3为本发明实施例3中含氟烷基链连接的多肽在HeLa细胞内递送效率，及其与未连接含氟烷基链的多肽的比较。
图4为本发明实施例3中含氟烷基链连接的多肽在HeLa细胞内递送效果图，及其与碳氢烷基链的多肽和细胞穿膜肽(TAT)连接的多肽的比较。
图5为本发明实施例5中不同长度的含氟烷基链连接的多肽的胞内递送效果图。
图6为本发明实施例3中含氟烷基链连接的生物活性多肽F-P6对MDA-MB-231细胞的细胞毒性图。
图7为本发明实施例3中含氟烷基链连接的生物活性肽F-P6的体内治疗效果。
图8为本发明实施例6制备的含氟烷基链通过不可断裂化学键连接的多肽和未修饰的多肽在HeLa细胞上的荧光显微镜观察的荧光照片。
图9为本发明实施例6中含氟烷基链通过不可断裂化学键连接生物活性多肽后处理MDA-MB-231细胞后的细胞毒性图。
图10为本发明实施例3中含氟烷基链连接的多肽在HeLa细胞中的毒性检测。
图11为本发明实施例3中含氟烷基链连接的多肽F-P1的蛋白酶水解稳定性，及其与未连接含氟烷基链的多肽和TAT连接的多肽的比较。
图12为本发明实施例3中含氟烷基链连接的多肽F-P1在不同细胞内递送效果图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：氨基酸序列SEQ ID NO.1-6的多肽合成。
采用经典的固相合成方法合成了氨基酸序列如SEQ ID NO.1-6所示的多肽，分别命名为P1-P6，每个序列的N末端或C末端都添加一个半胱氨酸残基。氨基酸序列SEQ IDNO.1-5的每个序列的N末端都添加绿色荧光素(FITC)用于观察和检测递送到细胞内的多肽。经反向高效液相色谱(HPLC)纯化上述多肽，并通过电喷雾电离质谱表征多肽的分子量。所有多肽的纯度均大于95％，呈冻干粉状。多肽的序列、分子量、疏水性和带电量如下表1所示。细胞穿膜肽(TAT)连接上述SEQ ID NO.1-6的多肽作为阳性对照多肽，合成方法同上。
表1多肽的序列、分子量、疏水性和净电荷
Figure BDA0002464820170000071
实施例2：含氟烷基链连接的多肽和碳氢烷基链连接的多肽的合成。
在一个具体的实施例中，含氟烷基链连接的多肽的制备方法为：将溶于甲醇的多肽滴加到溶于二氯甲烷的含氟烷基链中，两者的摩尔比为1:3。惰性气体保护下，4℃反应4小时，乙醚沉淀3次得到粗产物，通过制备反向高效液相色谱或制备薄层色谱分离提纯即可得到产物。含氟烷基链连接本发明实施例1制备的多肽后，分别命名为F-P1、F-P2、F-P3、F-P4、F-P5、F-P6。通过电喷雾电离质谱表征多肽的分子量。所述含氟烷基链的结构为CF3(CF2)n-(CH2)m-，n＝5；m＝2。含氟烷基链与多肽连接的化学键为-S-S-。碳氢烷基链连接的多肽的制备方法同上。碳氢烷基链连接本发明实施例1制备的多肽后，分别命名为C1-P1、C1-P2、C1-P3、C1-P4、C1-P5、C1-P6、C2-P1、C2-P2、C2-P3、C2-P4、C2-P5、C2-P6。所述碳氢烷基链C1的结构为CH3(CH2)n-，n＝7；C2的结构为CH3(CH2)n-，n＝11。碳氢烷基链与多肽连接的化学键为-S-S-。
实施例3：含氟烷基链连接的多肽的纳米组装体的合成，并利用动态光散射(DLS)及透射电子显微镜(TEM)表征纳米组装体的粒径及表面电势。
具体操作方法如下：将本发明实施例2中制备的含氟烷基链连接的多肽F-P1、F-P2、F-P3、F-P4、F-P5和F-P6溶于二甲亚砜(DMSO)中，缓慢滴加到水或磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中，室温静置5分钟，使用3000Da分子量的超滤管离心去除DMSO或者使用3000Da分子量的透析袋透析去除DMSO，使用纳米粒度分析仪检测溶液中纳米颗粒的尺寸分布和表面电势，使用透射电子显微镜观察纳米颗粒。
实验结果：图1a表示本发明实施例3制备的含氟烷基链连接的多肽的纳米组装体DLS表征的尺寸分布、表面电势。图1b表示本发明实施例3制备的含氟烷基链连接的多肽的纳米组装体TEM表征的尺寸和形状。结果表明，不同分子量、亲疏水性、等电点和氨基酸长度的多肽连接含氟烷基链后均可以组装成纳米组装体，并且颗粒紧实，尺寸均一。由于含氟烷基链的亲氟效应，含氟烷基链连接多肽后，趋向自组装。
实施例4：碳氢烷基链连接的多肽的纳米组装体的合成，并利用动态光散射(DLS)及透射电子显微镜(TEM)表征纳米组装体的粒径及表面电势。
具体操作方法如下：将本发明实施例2中制备的碳氢烷基链连接的多肽C1-P1、C1-P2、C1-P3、C1-P4、C1-P5、C1-P6、C2-P1、C2-P2、C2-P3、C2-P4、C2-P5和C2-P6溶于二甲亚砜(DMSO)中，缓慢滴加到水或磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中，室温静置5分钟，使用3000Da分子量的超滤管离心去除DMSO或者使用3000Da分子量的透析袋透析去除DMSO，使用纳米粒度分析仪检测溶液中纳米颗粒的尺寸分布和表面电势，颗粒分散系数(PDI)小于0.3的样品使用透射电子显微镜观察纳米颗粒。
实验结果：图2a表示本发明实施例4制备的碳氢烷基链连接的多肽的纳米组装体DLS表征的尺寸分布、表面电势。图2b表示本发明实施例4制备的碳氢烷基链连接的多肽的纳米组装体TEM表征的尺寸和形状。结果表明，少数多肽连接碳氢烷基链后可以组装成纳米组装体，不具备普适性，易形成大尺寸聚集体。
实施例5：不同长度的含氟烷基链连接的多肽的合成。
在一个具体的实施例中，将本发明实施例1制备的多肽P1与不同长度的含氟烷基链连接的制备方法为：将溶于甲醇的多肽滴加到溶于二氯甲烷的含氟烷基链中，两者的摩尔比为1:3。惰性气体保护下，4℃反应4小时，乙醚沉淀3次得到粗产物，通过制备反向高效液相色谱或制备薄层色谱分离提纯即可得到产物9F-P1和17F-P1。按照实施例3中的方法制备多肽纳米组装体。所述含氟烷基链连接的多肽结构如式(3)所示：
CF3(CF2)n-(CH2)m-X-R1
式(3)
式(3)中，
R1为本发明实施例1中制备的多肽P1，
X为连接键，所述连接键为-S-S-；
n＝3或7；
m＝2。
实施例6：含氟烷基链通过不可断裂化学键连接多肽。
在一个具体的实施例中，将本发明实施例1制备的P1和P6与含氟烷基链通过不可断裂化学键连接的制备方法为：将末端分子为马来酰亚胺的含氟烷基链(式(4))溶于二氯甲烷中后与溶解在甲醇中的本发明实施例1制备的P1或P6按摩尔比3:1混合，4℃反应4小时后，乙醚沉淀3次得到粗产物，通过制备反向高效液相色谱或制备薄层色谱分离提纯即可得到产物F-MP1和F-MP6。含氟烷基链与多肽连接的化学键为-MAL-S-。按照实施例3中的方法制备多肽纳米组装体。
Figure BDA0002464820170000101
实施例7：含氟烷基链连接的多肽的胞内递送效率。
不同分子量、亲疏水性、等电点和氨基酸长度的多肽N末端均标记FITC，通过检测细胞内的荧光，在HeLa细胞上评估含氟烷基链连接的多肽的递送效率。
具体方法如下：将HeLa细胞接种到24孔板中培养过夜，待HeLa细胞密度达到90％以上时，开始多肽递送实验。将本发明实施例3制备的F-P1、F-P2、F-P3、F-P4和F-P5以及未修饰的多肽分别加入到200μL无血清培养基中，震荡混匀。移除细胞培养基，使用PBS清洗一次后，加入含有多肽的培养基溶液，37℃培养箱孵育6小时。使用激光共聚焦显微镜观察细胞内的荧光强度和分布。之后使用流式细胞仪定量分析HeLa细胞的平均荧光强度。具体方法为：待含有多肽的培养基溶液处理细胞后，移除培养基，使用PBS清洗细胞两次，使用台盼蓝清洗细胞一次，胰酶消化收集细胞，离心后使用PBS重悬，使用流式细胞仪检测细胞内的绿色荧光强度。每孔多肽的摩尔浓度为10μM。
实验结果：图3为本发明实施例3制备的含氟烷基链连接的多肽和未修饰的多肽在HeLa细胞上递送结果。图3a为递送未修饰的多肽在HeLa细胞上的激光共聚焦显微镜观察的荧光照片；图3b为递送含氟烷基链连接的多肽在HeLa细胞上的激光共聚焦显微镜观察的荧光照片；图3c为流式细胞仪定量统计分析细胞的平均荧光强度。结果表明本发明制备的含氟烷基链连接的多肽具备较高的胞内递送效率，且胞内绿色荧光均匀弥散。
实施例8：含氟烷基链连接的多肽、碳氢烷基链连接的多肽及细胞穿膜肽(TAT)连接的多肽的胞内递送效率比较。
不同分子量、亲疏水性、等电点和氨基酸长度的多肽N末端均标记FITC，通过检测细胞内的荧光，在HeLa细胞上比较含氟烷基链连接的多肽、碳氢烷基链连接的多肽和细胞穿膜肽(TAT)连接的多肽的递送效率。
具体方法如下：将HeLa细胞接种到24孔板中过夜，待HeLa细胞密度达到90％以上时，开始多肽递送实验。将本发明实施例3制备的含氟烷基链连接的多肽(F-P1、F-P2、F-P3、F-P4和F-P5)加入到200μL无血清培养基中，震荡混匀。移除细胞培养基，使用PBS清洗一次后，加入含有多肽的培养基溶液，37℃培养箱孵育6小时。使用激光共聚焦显微镜观察细胞内的荧光强度和分布。每孔多肽的摩尔浓度为10μM。对照肽：碳氢烷基链连接的多肽和TAT连接的多肽均按上述剂量和方法观察荧光强度和分布。
实验结果：图4为本发明实施例3制备的含氟烷基链连接的多肽与碳氢烷基链连接的多肽、TAT连接的多肽在HeLa细胞上递送结果。图4a为递送含氟烷基链连接的多肽在HeLa细胞上的激光共聚焦显微镜观察的荧光照片；图4b为递送碳氢烷基链(C1)的多肽在HeLa细胞上的激光共聚焦显微镜观察的荧光照片；图4c为递送碳氢烷基链(C2)的多肽在HeLa细胞上的激光共聚焦显微镜观察的荧光照片；图4d为递送TAT连接的多肽在HeLa细胞上的激光共聚焦显微镜观察的荧光照片。结果表明，本发明制备的含氟烷基链连接的多肽的胞内递送效果明显高于碳氢烷基链连接的多肽和TAT连接的多肽的递送效果，并且在细胞质内绿色荧光均匀分布。
实施例9：不同长度的含氟烷基链连接的多肽的胞内递送效率。
具体方法如下：将HeLa细胞接种到24孔板中培养过夜，待HeLa细胞密度达到90％以上时，开始多肽递送实验。将本发明实施例5制备的不同长度的含氟烷基链连接的多肽9F-P1和17F-P1以及未修饰的多肽分别加入到200μL无血清培养基中，震荡混匀。移除细胞培养基，使用PBS清洗一次后，加入含有多肽的培养基溶液，37℃培养箱孵育6小时。使用荧光显微镜观察细胞内的荧光强度和分布。每孔多肽的摩尔浓度为10μM。
实验结果：图5为本发明实施例5制备的不同长度的含氟烷基链连接的多肽和未修饰的多肽在HeLa细胞上的荧光显微镜观察的荧光照片。结果表明本发明制备的不同长度的含氟烷基链连接的多肽同样具备较高的胞内递送效率，且胞内绿色荧光均匀弥散。
实施例10：含氟烷基链连接的生物活性肽在MDA-MB-231细胞上的活性。
本发明实施例1制备的P6为已知的生物活性肽，可以促进肿瘤细胞凋亡。利用MTT法检测本发明实施例3制备的含氟烷基链连接的多肽F-P6处理MDA-MB-231细胞后的细胞存活率，评估对癌细胞的杀伤水平，评估促凋亡多肽的细胞内递送效率。
具体操作方法如下：将MDA-MB-231细胞预先接种到96孔板中，过夜培养。移除培养基，加入100μL含有不同浓度(2-10μM)的本发明实施例3制备的F-P6的无血清培养基溶液，孵育细胞6小时。之后移除培养基，更换为含有10％血清的培养基，继续培养18小时。按照MTT法的标准步骤检测MDA-MB-231细胞的存活率。每组实验分别检测五个重复样品。对照肽：碳氢烷基链连接的多肽和TAT连接的多肽均按上述剂量和方法检测细胞的存活率。
实验结果：图6所示的在MDA-MB-231细胞上递送不同浓度F-P6的细胞存活率。随着F-P6浓度的提高，本发明实施例3制备的含氟烷基链连接的生物活性多肽F-P6的细胞存活率出现明显的下降，在10μM的浓度时，细胞存活率低于60％。而相同实验条件下，未修饰的多肽和碳氢烷基链连接的多肽则检测不到明显的细胞毒性，细胞存活率接近100％。结果表明本发明制备的含氟烷基链连接的多肽可以高效的递送生物活性多肽进入细胞，并对癌细胞产生明显的细胞毒性。
实施例11：含氟烷基链连接的生物活性肽的体内治疗效果。
本发明实施例1制备的P6为已知的生物活性肽，可以促进肿瘤细胞凋亡。通过荷瘤小鼠肿瘤抑制试验评估F-P6的体内治疗效果。
具体操作方法如下：将150μmol本发明实施例3制备的含氟烷基链连接的生物活性肽F-P6尾静脉注射到MDA-MB-231细胞荷瘤的小鼠体内，分别在第一天、第三天和第五天注射，最后一次注射五天后将小鼠安乐死并取出肿瘤组织，拍照称重。每组做5只重复。小鼠每天称重，测量肿瘤体积。对照肽：碳氢烷基链连接的多肽和TAT连接的多肽均按上述剂量和方法评估其体内治疗效果。
实验结果：图7所示的本发明实施例3制备的含氟烷基链连接的生物活性肽F-P6的体内治疗效果。图7a为小鼠治疗后的肿瘤体积。图7b为小鼠治疗后的肿瘤组织图片。图7c为小鼠治疗后的肿瘤重量。图7d为小鼠治疗后的体重。结果表明本发明制备的含氟烷基链连接的生物活性肽体内抑制肿瘤效率明显高于未修饰的多肽，具有较好的体内治疗效果，并且生物相容性好。
实施例12：含氟烷基链通过不可断裂化学键连接的多肽的胞内递送效率。
具体方法如下：将HeLa细胞接种到24孔板中培养过夜，待HeLa细胞密度达到90％以上时，开始多肽递送实验。将本发明实施例6制备的含氟烷基链通过不可断裂化学键连接的多肽F-MP1以及未修饰的多肽分别加入到200μL无血清培养基中，震荡混匀。移除细胞培养基，使用PBS清洗一次后，加入含有多肽的培养基溶液，37℃培养箱孵育6小时。使用荧光显微镜观察细胞内的荧光强度和分布。每孔多肽的摩尔浓度为10μM。
实验结果：图8为本发明实施例6制备的含氟烷基链通过不可断裂化学键连接的多肽和未修饰的多肽在HeLa细胞上的荧光显微镜观察的荧光照片。结果表明本发明制备的含氟烷基链通过不可断裂化学键连接的多肽同样具备较高的胞内递送效率，且胞内绿色荧光均匀弥散。
实施例13：含氟烷基链通过不可断裂化学键连接生物活性多肽在MDA-MB-231细胞上的活性。
本发明实施例1制备的P6为已知的生物活性肽，利用MTT法检测本发明实施例6制备的含氟烷基链通过不可断裂化学键连接的多肽F-MP6处理MDA-MB-231细胞后的细胞存活率，评估对癌细胞的杀伤水平，评估促凋亡多肽的细胞内递送效率。
具体操作方法如下：将MDA-MB-231细胞预先接种到96孔板中，过夜培养。移除培养基，加入100μL不同浓度的实施例6制备的含氟烷基链通过不可断裂化学键连接的多肽F-MP6的无血清培养基溶液，孵育细胞6小时。之后移除培养基，更换为10％血清的培养基，继续培养18小时。按照MTT法的标准步骤检测细胞的存活率。每组实验分别检测五个重复样品。
实验结果：图9所示的在MDA-MB-231细胞上递送不同浓度F-MP6的细胞存活率。随着F-MP6浓度的提高，本发明实施例6制备的含氟烷基链通过不可断裂化学键连接的多肽F-MP6的细胞存活率出现明显的下降，在10μM的浓度时，细胞存活率低于60％。而相同实验条件下，未修饰的P6则检测不到明细的细胞毒性，细胞存活率接近100％。结果表明本发明制备的含氟烷基链通过不可断裂化学键连接的多肽同样可以高效的递送多肽进入细胞，对癌细胞产生明显的细胞毒性。
实施例14：含氟烷基链连接的多肽的细胞毒性评价。
利用MTT法检测不同浓度条件下的含氟烷基链连接的多肽对HeLa细胞产生的毒性。
具体操作方法如下：将HeLa细胞预先接种到96孔板中，过夜培养。移除培养基，加入100μL不同浓度(2μM、5μM、10μM、20μM、30μM)的本发明实施例3中的含氟烷基链连接的多肽的无血清培养基溶液，孵育细胞6小时。之后移除培养基，更换为10％血清的培养基，继续培养18小时。按照MTT法的标准步骤检测细胞的存活率。每组实验分别检测五个重复样品。
实验结果：图10所示的在不同浓度条件下，MTT检测含氟烷基链连接的多肽处理的HeLa细胞的细胞存活率都高于90％。结果表明，本发明实施例3制备的含氟烷基链连接的多肽对细胞的毒性较低，并且在多肽递送过程中也没有对细胞产生明显的毒性，本发明制备的含氟烷基链连接的多肽具有较好的生物相容性。
实施例15：含氟烷基链连接的多肽的蛋白酶水解稳定性。
糜蛋白酶是一种蛋白水解酶，用于肽链的酶解，专门水解肽键。可以通过在多肽中加入糜蛋白酶来检测多肽的蛋白酶水解稳定性。
具体方法如下：以本发明实施例3制备的F-P1、F-P2、F-P3和F-P4为例，将多肽加入到糜蛋白酶溶液中，37℃孵育0、0.5、1、4、12小时后，HPLC检测溶液中残留的多肽。多肽浓度为1mg/mL，糜蛋白酶浓度为1mg/mL。每个时间点做3个重复。对照肽：未修饰的多肽和TAT连接的多肽均按上述剂量和方法检测多肽的蛋白酶水解稳定性。
实验结果：图11为本发明实施例3中所得含氟烷基链连接的多肽，以及未修饰的多肽和TAT连接的多肽在糜蛋白酶溶液中的降解率。结果表明，本发明制备的含氟烷基链连接的多肽经酶处理12小时后的多肽残留含量均大于50％，其蛋白酶水解稳定性明显高于未修饰的多肽和TAT连接的多肽。
实施例16：含氟烷基链连接的多肽的在不同细胞系中的递送。
具体方法如下：293T，NIH3T3，MCF7和RAW264.7细胞分别接种到共聚焦小皿中过夜，待细胞密度达到90％以上时，开始多肽递送实验。将本发明实施例3制备的含氟烷基链连接的多肽F-P1加入到1mL无血清培养基中，震荡混匀。移除细胞培养基，使用PBS清洗一次后，加入含有多肽的培养基溶液，37℃培养箱孵育6小时。使用激光共聚焦显微镜观察细胞内的荧光强度和分布。多肽的摩尔浓度为10μM。
实验结果：图12为分别在293T，NIH3T3，MCF7和RAW264.7细胞上递送本发明实施例3制备的含氟烷基链连接的多肽F-P1的激光共聚焦显微镜观察的细胞荧光图片。结果表明，本发明制备的含氟烷基链连接的多肽可以高效的递送到不同的细胞系中，并且多肽在细胞质内均匀分布。
以上实施例只是为了说明本发明技术构思及特点，让本领域普通技术人员能够了解本发明内容并据以实施，并不能以此限制本发明保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作的等效变化和修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 含氟烷基链连接的多肽及其在多肽胞内递送中的应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Glu Leu Leu Val Asp Leu Leu Gly Cys
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Trp Gly Gly Phe Leu Arg Lys Arg Cys
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe Cys
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Val Ile Val Pro Arg Tyr Leu Lys Cys
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Cys
1 5 10
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Cys Gly Gly Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala
1 5 10 15
Lys

Claims (11)

1.一类含氟烷基链连接的多肽，其特征在于，包括含氟烷基链和多肽，所述含氟烷基链通过共价键连接在多肽的任意位置上；所述含氟烷基链连接的多肽的结构如式（1）所示：
CF3(CF2)n-(CH2)m-X-R
式（1）；
式（1）中，
R为多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-6中的任意一种或多种；
X为连接键，所述连接键包括-S-S-、-MAL-S-、-S-、-CO-NH-、-NH-CO-、-NH-C(=O)-NH-、-NH-C(=S)-NH-中的一种或多种；
n为3、5或7；
m为2；
所述连接键中的-MAL-S-的结构式如式（2）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式（2）。
2.如权利要求1所述的含氟烷基链连接的多肽，其特征在于，所述含氟烷基链连接的多肽的结构如式（1）所示，其中，n为3、5或7，m为2，R为多肽，所述连接键X为-S-S-。
3.如权利要求2所述的含氟烷基链连接的多肽，其特征在于，所述n为5，m为2，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-6中的任意一种，所述连接键X为-S-S-。
4.如权利要求1所述的含氟烷基链连接的多肽，其特征在于，所述含氟烷基链连接的多肽的结构如式（3）所示：
CF3(CF2)n-(CH2)m-X-R1
式（3）；
式（3）中，
R1为多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述连接键X为-S-S-；
n=3或7；
m=2。
5.如权利要求1-4之任一项所述的含氟烷基链连接的多肽的制备方法，其特征在于，所述含氟烷基链与多肽在有机溶剂中进行反应后，得到所述含氟烷基链连接的多肽。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲醇、二氯甲烷、二甲亚砜、二甲基甲酰胺中的一种或多种；所述含氟烷基链与多肽的摩尔比为（3-5）：1；所述反应的温度为4-25℃；所述反应的时间为4-12小时。
7.一种多肽纳米组装体，其特征在于，将如权利要求1-4之任一项所述的含氟烷基链连接的多肽在水溶液或缓冲液中组装成所述多肽纳米组装体。
8.一种多肽纳米组装体的制备方法，其特征在于，将如权利要求1-4之任一项所述的含氟烷基链连接的多肽溶于二甲亚砜中，然后加入水溶液或缓冲液，得到含氟烷基链连接的多肽纳米组装体。
9.如权利要求1-4之任一项所述的含氟烷基链连接的多肽或如权利要求7所述的多肽纳米组装体在制备多肽胞内递送产品和/或抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌、宫颈癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌。
11.一种不以疾病治疗为目的的多肽胞内递送方法，其特征在于，所述多肽胞内递送是将如权利要求1-4之任一项所述的含氟烷基链连接的多肽由细胞外递送到细胞内。
CN202010330603.3A 2020-04-24 2020-04-24 含氟烷基链连接的多肽及其在多肽胞内递送中的应用 Active CN113549128B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010330603.3A CN113549128B (zh) 2020-04-24 2020-04-24 含氟烷基链连接的多肽及其在多肽胞内递送中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010330603.3A CN113549128B (zh) 2020-04-24 2020-04-24 含氟烷基链连接的多肽及其在多肽胞内递送中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113549128A CN113549128A (zh) 2021-10-26
CN113549128B true CN113549128B (zh) 2023-03-31

Family

ID=78129559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010330603.3A Active CN113549128B (zh) 2020-04-24 2020-04-24 含氟烷基链连接的多肽及其在多肽胞内递送中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113549128B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5446023A (en) * 1992-08-06 1995-08-29 Alliance Pharmaceutical Corporation Amphiphilic compounds derived from amino acids or peptides, their methods of synthesis and their application as drug delivery systems
EP1046394A2 (en) * 1999-04-19 2000-10-25 ImaRx Pharmaceutical Corp. Novel compositions useful for delivering compounds into a cell
CN108611375A (zh) * 2018-03-20 2018-10-02 华东师范大学 含氟高分子在蛋白质和小肽胞内递送中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5446023A (en) * 1992-08-06 1995-08-29 Alliance Pharmaceutical Corporation Amphiphilic compounds derived from amino acids or peptides, their methods of synthesis and their application as drug delivery systems
EP1046394A2 (en) * 1999-04-19 2000-10-25 ImaRx Pharmaceutical Corp. Novel compositions useful for delivering compounds into a cell
CN108611375A (zh) * 2018-03-20 2018-10-02 华东师范大学 含氟高分子在蛋白质和小肽胞内递送中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
氟固相萃取辅助的生物分子质谱分析新方法;张程等;《分析化学评述与进展》;20171231;第45卷(第12期);第1857-1864页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113549128A (zh) 2021-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106822036B (zh) 特异靶向多肽自组装纳米载体、载药纳米颗粒及制备方法
Wadhwani et al. Antibiotic gold: tethering of antimicrobial peptides to gold nanoparticles maintains conformational flexibility of peptides and improves trypsin susceptibility
Pichon et al. Histidine-rich peptides and polymers for nucleic acids delivery
Tang et al. A stabilized retro-inverso peptide ligand of transferrin receptor for enhanced liposome-based hepatocellular carcinoma-targeted drug delivery
US20020041898A1 (en) Novel targeted delivery systems for bioactive agents
JP2002514892A (ja) 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用
CN106632695B (zh) 一种pH敏感性多肽及其应用
Gao et al. A progressively targeted gene delivery system with a pH triggered surface charge-switching ability to drive angiogenesis in vivo
JP2013513601A (ja) Ｂｐｂベースのカーゴ運搬システム
CN113599504B (zh) 一种无载体蛋白质胞内递送前药及其制备方法与应用
Ding et al. Substance P containing peptide gene delivery vectors for specifically transfecting glioma cells mediated by a neurokinin-1 receptor
EP3384934B1 (en) Targeted shell for use in drug delivery system utilizing carbosilane dendrimer
CN113549128B (zh) 含氟烷基链连接的多肽及其在多肽胞内递送中的应用
JP2003503569A (ja) 核酸を細胞に輸送するためのコポリマー
CN115151278A (zh) 用于核酸疗法的靶向肿瘤的多肽纳米颗粒递送系统
CN106957370B (zh) 一种可在肿瘤细胞内引发毒性的多肽
KR102274876B1 (ko) 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도
CN109310729A (zh) 用于改善转染效率的合成化合物
WO1998050078A1 (en) Lipophilic and/or lytic peptides for specific delivery of nucleic acids to cells
US11723985B2 (en) Protein delivery to membranes
KR20220057542A (ko) 펩타이드 내포 페리틴
CN109134659B (zh) 一种核酸载体及其用途
CN113214353B (zh) 两亲性寡肽结构物质
CN113350517B (zh) 一种调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子及其制备方法和应用
US11578106B2 (en) Surfactant adhesive composition

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant