CN113350517B - 一种调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子及其制备方法和应用 - Google Patents

一种调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子及其制备方法和应用。所述糖肽分子包括依次通过化学键共价偶联的靶向单元、响应单元、疏水单元和功能单元，所述功能单元包括特异性结合M2型巨噬细胞的单糖分子。所述糖肽分子能够靶向性地在肿瘤部位富集，并响应肿瘤微环境发生剪切，剪切后片段趋向M2型巨噬细胞表面并发生自组装，组装体表面高密度的配体可与细胞膜受体发生多价结合，激活受体下游信号通路，从而实现M2型巨噬细胞向M1型的转化。

Description

一种调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子及其制备方法和应用，尤其涉及一种调控M2型巨噬细胞转化为M1型巨噬细胞的糖肽分子及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是以基因突变积累为特征，使细胞丧失了正常的细胞调控过程，突变产生肿瘤新生抗原或变异抗原，使得机体内出现“非己”成分，免疫系统能够分辨自身与非己，并清除非己成分，在肿瘤发生初期，免疫系统能够通过有效的免疫杀伤抑制肿瘤生长，但随着肿瘤进展，机体逐渐无力清除肿瘤抗原，事实上，肿瘤在与免疫系统的持续博弈中，进化出了免疫抑制性的微环境，诱导免疫系统对非己成分的分辨出错。
肿瘤微环境作为不断滋养肿瘤细胞的“土壤”，除了肿瘤细胞和基质细胞，还包含多种免疫细胞，其中肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是众多肿瘤中含量最丰富的浸润白细胞之一，在一些肿瘤类型如乳腺癌中占比高达50％，巨噬细胞具有极强的可塑性，根据其所处环境，可以分化为多种亚型，TAM主要分为2种亚型，其中M1型可由干扰素-γ(IFN-γ)等激活，表达高水平的CD80和CD86等，并分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6和12(IL-6，IL-12)等促炎因子；而M2型由白介素4、13(IL-4，IL-13)等激活，表达高水平的CD206和CD301等，分泌白介素10(IL-10)、前列腺素E2(PGE2)等抗炎因子。
TAM偏向M2型的极化状态是多种肿瘤的共同特征，M2型TAM可以通过多种机制促进肿瘤的发生、发展和转移，TAM可以趋向炎症部位，产生活性氧和活性氮等，联同其他免疫细胞共同营造一个致突变环境，随后通过分泌VEGF、PDGF等促进新血管形成，为恶变细胞供应营养物质并排出代谢废物，同时大量TAM被招募到肿瘤缺氧区加速恶性转变，并且TAM还通过分泌细胞分子、趋化因子和酶，并表达抑制性受体等多种途径抑制抗肿瘤免疫应答，最后，TAM通过预设转移灶、促进肿瘤细胞内渗和外渗，从而辅助肿瘤细胞向远端转移。
TAM的多重促肿瘤作用使其成为一个有前景的肿瘤免疫治疗的靶点，特别是将M2亚型转化为M1亚型的调控受到广泛研究，其抗肿瘤效果也已在临床试验中被证实。
CN111918967A公开了一种用于巨噬细胞极化的方法和组合物，所述组合物包括细胞外囊泡，所述细胞外囊泡包含核酸，所述核酸靶向基因，引起肿瘤相关巨噬细胞的巨噬细胞极化，但存在效率低及安全性问题。
综上所述，如何高效低毒地实现TAM向M1型极化仍然是本领域的一大挑战。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子及其制备方法和应用，所述糖肽分子能够靶向性地在肿瘤部位富集，并响应肿瘤微环境发生剪切，剪切后片段趋向M2型巨噬细胞表面并发生自组装，组装体表面高密度的配体可与细胞膜受体发生多价结合，激活受体下游信号通路，从而实现M2型巨噬细胞向M1型的转化。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子，所述糖肽分子包括依次通过化学键共价偶联的靶向单元、响应单元、疏水单元和功能单元，所述功能单元包括特异性结合M2型巨噬细胞的单糖分子。
本发明采用生物相容性良好的糖肽分子作为实现巨噬细胞亚型转化的分子，降低材料的毒性及免疫原性，保证安全性，糖肽分子按功能化设计，如图1所示，实现糖肽分子在循环过程中的组织靶向性、组织高渗透性以及在靶组织内的响应性剪切，剪切后糖肽片段的M2型巨噬细胞趋向性以及自组装特性，从而实现了巨噬细胞亚型转化的特异性、精准性与高效性，同时避免在非靶组织引起免疫毒副作用。
本发明中，靶向单元可根据肿瘤组织特有蛋白灵活选择，因此，本发明提供的调控巨噬细胞亚型转变的糖肽分子适用于多种肿瘤类型，通过选用不同的多肽单元可实现多种肿瘤组织的靶向。
优选地，所述靶向单元包括特异性靶向肿瘤组织的多肽序列。
优选地，所述特异性靶向肿瘤组织的多肽序列包括SEQ ID No.1～5中的任意一种，优选为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
SEQ ID No.1：RVG。
SEQ ID No.2：RGD。
SEQ ID No.3：CRGD。
SEQ ID No.4：CREKA。
SEQ ID No.5：CCRGDKGPDC。
优选地，所述响应单元包括被特异性剪切的多肽序列。
优选地，所述被特异性剪切的多肽序列包括SEQ ID No.6～11中的任意一种，优选为SEQ ID No.11所示的氨基酸序列。
SEQ ID No.6：GCRDGPQGIWGQDRCG。
SEQ ID No.7：DEVD。
SEQ ID No.8：GPA。
SEQ ID No.9：PLGYLG。
SEQ ID No.10：GPLGIAGQ。
SEQ ID No.11：PLGVR。
优选地，所述疏水单元包括含烷基的氨基酸，所述含烷基的氨基酸的分子式为CnH2nNO2，n为正整数。
优选地，所述烷基为直链烷烃或支链烷烃，优选为七碳直链烷烃。
本发明中，功能单元可根据M2巨噬细胞膜蛋白灵活选择，可根据膜受体决定所需的单糖类型，因此本发明提供的糖肽分子可针对M2型巨噬细胞的多种膜蛋白，通过分子的灵活设计选用不同的功能单元实现包括甘露糖受体(CD206)在内的多种蛋白的精准调控。
优选地，所述功能单元包括α-D-甘露糖甘露糖、β-D-甘露糖、α-D-半乳糖或β-D-半乳糖糖中的任意一种，优选为α-D-甘露糖。
优选地，所述靶向单元包括式Ⅰ所示的氨基酸序列。
Figure BDA0003103412900000041
优选地，所述响应单元包括式II所示的氨基酸序列。
Figure BDA0003103412900000051
优选地，所述疏水单元包括式Ⅲ所示的烷基链。
Figure BDA0003103412900000052
优选地，所述功能单元包括式Ⅳ所示的结构。
Figure BDA0003103412900000053
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子的制备方法，所述制备方法包括：
通过固相合成法制备并连接靶向单元、响应单元和疏水单元，得到骨架，随后将功能单元连接到所述骨架上，得到所述糖肽分子。
优选地，通过点击反应将所述功能单元连接到所述骨架上。
第三方面，本发明提供一种调控巨噬细胞亚型转化的方法，所述方法包括：
将第一方面所述的调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子与M2型巨噬细胞混合共孵育，将所述M2型巨噬细胞转化为M1型巨噬细胞。
将第一方面所述的糖肽分子与M2型巨噬细胞共孵育，一定时间后通过流式细胞仪鉴定巨噬细胞表面标志物，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)以及实时荧光定量Q-PCR技术对巨噬细胞所分泌的细胞因子进行定量鉴定，考察M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞的转化情况。
第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第五方面，本发明提供第一方面所述的调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子或第四方面所述的药物组合物在制备调控巨噬细胞亚型转化的试剂和/或药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的糖肽分子能够靶向性地在肿瘤部位富集，并响应肿瘤微环境发生剪切，剪切后片段趋向M2型巨噬细胞表面并发生自组装，组装体表面高密度的配体可与细胞膜受体发生多价结合，激活受体下游信号通路，从而实现M2型巨噬细胞向M1型的转化；
(2)本发明提供的糖肽聚集体能够在空间和时间分辨率上实现巨噬细胞亚型的转化，同时特异性识别并激活受体介导的下游信号转导的策略具有一定的普适性，通过分子的合理性设计，可以实现对不同细胞的特异性识别和结合以及多价刺激从而实现高效调控；
(3)本发明采用生物相容性良好的糖肽分子作为实现巨噬细胞亚型转化的分子，降低材料的毒性及免疫原性，此外，糖肽分子在活体其他正常脏器无法响应性组装，而仅在肿瘤微环境可被特异性酶剪切进而组装，因此在活体水平治疗肿瘤具有良好的安全性。
附图说明
图1为糖肽分子被特异性酶切并自组装形成的糖肽组装体与M2型巨噬细胞膜受体多价结合的示意图；
图2为糖肽分子的质谱结果图；
图3为糖肽分子组装成糖肽组装体的临界组装浓度图；
图4为糖肽分子组装成糖肽组装体的透射电子显微镜图；
图5为糖肽组装体刺激巨噬细胞亚型转化的示意图；
图6为糖肽组装体与巨噬细胞共孵育后刺激其转型的效果图；
图7为糖肽分子抗肿瘤效果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子，所述糖肽分子包括依次连接的靶向单元、响应单元、疏水单元和功能单元，所述糖肽分子的结构式如式V所示。
Figure BDA0003103412900000081
为了实现糖肽分子的靶向及响应性组装功能，将能够靶向到肿瘤细胞的靶向单元、响应以及疏水单元通过酰胺反应合成连接，其次通过点击化学反应将结合M2型巨噬细胞的功能单元偶联到多肽骨架上，得到糖肽分子，具体包括以下步骤：
(1)选用N端被Fmoc基团(9-芴基甲氧基羰基保护基)保护的、修饰密度为0.31mM的天冬氨酸Wang树脂，并用无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)过夜溶胀后，用含有体积比20％(v/v)六氢吡啶的DMF溶液脱保护15min，脱去Fmoc保护基团，并用DMF和二氯甲烷(DCM)交替洗涤3次，然后用茚三酮测试法检测脱保护是否成功(其中茚三酮检测液由茚三酮、VC、苯酚按体积比1:1:1配制)；
(2)确认保护基团脱去后(树脂颜色变成深蓝色)，分别称取10倍摩尔当量的N端被Fmoc基团保护的甘氨酸和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，用体积比为5％(v/v)氮甲基吗啉的DMF溶液溶解后加入到已脱保护的树脂中并在摇床上反应60min，在偶联剂氮甲基吗啉的催化下，通过天冬氨酸的羧基和甘氨酸的氨基之间的缩合反应使甘氨酸共价偶联到由天冬氨酸修饰的树脂上；
(3)反应结束后，用DMF和DCM交替洗涤树脂三次后用茚三酮检测试法检测偶联是否成功，树脂未变色，说明氨基酸偶联成功，重复以上操作，完成所有氨基酸的偶联；
(4)完成最后一个氨基酸保护基团的脱去后，加入脱乙酰基保护的甘露糖，同时加入溴化亚铜和抗坏血酸钠，在氩气保护的条件下过夜反应。次日向产物中加入裂解液(含有体积比为2.5％水、2.5％三异丙基硅烷和2.5％1,2-乙二硫醇的三氟乙酸溶液)进行裂解，同时脱除氨基酸的侧链保护，用低流速氮气将三氟乙酸吹干，再将得到的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥得到目标糖肽分子。
利用质谱对产物分子量进行表征(图2)，最终确认得到目标糖肽分子，并用反相制备液相色谱将分子进行纯化。其中，纯化过程的条件为：流动相是含有0.1％(v/v)三氟乙酸的乙腈和含有0.1％(v/v)三氟乙酸的双蒸水，参数设置为：梯度洗脱，流动相从15％乙腈/85％水转换到80％乙腈/20％水，流速为1mL/min，处理时间为30min；检测器为紫外检测器，检测波段为230nm。
实施例2
本实施例在水溶液中研究实施例1制备的糖肽分子的组装行为。
基于芘分子的荧光吸收光谱随其所处环境极性而变化的理论基础，将其作为探针利用荧光分光光度计测糖肽组装体的临界组装浓度(CAC)，具体为：
配制浓度为2μM、4μM、10μM、20μM、30μM、35μM、45μM、50μM和60μM的糖肽分子溶液，向其中加入相同量的芘，混匀后在393nm激发波长下测溶液在373nm和414nm处的荧光值并计算其比值，最终得到的荧光比值-浓度曲线如图3所示，结果显示当糖肽分子溶液浓度为20μM时，该比值突然增大，说明芘所处的微环境的非极性突然增加，表明芘增溶在糖肽分子组装形成的疏水内核中，这意味着糖肽分子临界组装浓度为20μM。
为了直观的观察糖肽分子组装形成的糖肽组装体的形貌，通过透射电镜(六硼化镧透射电子显微镜，Tecnai G220 S-TWIN(T-20)，美国FEI公司)拍摄了糖肽组装体的透射电子显微镜图片，如图4所示，在极性的组装环境下糖肽分子被酶剪切后的片段可以组装成尺寸较为均一的纳米颗粒，粒径约30nm。
实施例3
本实施例在细胞水平上验证实施例1制备的糖肽分子诱导巨噬细胞亚型转化的效果。
具体过程为：提取C57BL/6小鼠骨髓原代细胞，隔天进行半量换液，期间用粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)和靶细胞介素4(IL-4)诱导细胞分化，第7天时弃掉悬浮细胞，用胰酶消化贴壁细胞(M2型巨噬细胞)，并将其铺至6孔板中，次日加入糖肽分子单体和糖肽组装体，在细胞培养箱中孵育24h。
糖肽分子组装后形成的组装体可以与M2型巨噬细胞表面相应受体结合，该受体胞外域有多个糖识别位点，可以同时结合多个单糖，其胞内域介导内吞并进行信号转导，调控基因转录格局以及细胞因子分泌格局，最终实现亚型转变(图5)。通过细胞流式技术鉴定M1和M2型巨噬细胞表面标志物，如图6所示，与未处理组和糖肽分子单体组相比，糖肽组装体可以诱导更高的M1/M2比值，说明糖肽组装体能更加有效的实现巨噬细胞向M1型的转化。
实施例4
本实施例在小鼠肿瘤模型中考察糖肽组装体在抗肿瘤治疗中的潜在应用。
为了探究所设计的糖肽分子在抗肿瘤治疗中的应用，构建了小鼠黑色素瘤模型，通过静脉注射方式将实施例制备的糖肽分子注射到荷瘤小鼠体内，并与PD-1抗体进行联用，通过记录小鼠肿瘤体积的变化评估其治疗效率，具体过程包括：
选用5周龄雌性C57BL/6小鼠(购自北京维通利华实验动物科技有限公司)，体重约20g。将对数期生长的B16F10细胞用胰酶消化，使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，计数将细胞浓度调至5×104/mL，将细胞悬液移至无菌EP管中，植瘤前用剃毛器对小鼠进行剃毛，以便日后观察和测量肿瘤大小，在C57BL/6小鼠右前腋下用酒精棉球擦拭消毒，用注射器吸取100μL上述细胞悬液注入皮下，接种后压迫数秒，以防漏出，大约一周后，待肿瘤长至50mm3时将荷瘤小鼠进行随机分组，具体分为以下4组：PBS组，糖肽分子(R-glycopeptide)组，PD-1抗体(Anti-PD-1)组和R-glycopeptide+Anti-PD-1组，每组7只。
将材料或抗体溶于PBS中，将R-glycopeptide配置为500μM，将PD-1抗体配置为1mg/mL，PBS组中小鼠进行尾静脉和腹腔分别注射100μL PBS，R-glycopeptide组中小鼠进行尾静脉注射100μL糖肽分子和腹腔注射100μL PBS，Anti-PD-1组中小鼠进行尾静脉注射100μL PBS和腹腔注射100μL PD-1抗体，R-glycopeptide+Anti-PD-1组中小鼠进行尾静脉注射100μL糖肽分子和腹腔注射100μL PD-1抗体，观察治疗过程中小鼠的精神状况、饮食、体重和活动情况，肿瘤出现后用游标卡尺测量肿瘤长宽，计算肿瘤大小，每隔一天测量一次，按照下述公式计算肿瘤体积：V＝(L×W2)/2，其中L和W分别指肿瘤最宽和最窄处的长度，绘制肿瘤的生长曲线，同时每天测小鼠体重，当对照组小鼠肿瘤单边直径超过20mm时，处死全部小鼠。
结果表明，与PD-1抗体组相比，单用糖肽分子抑制肿瘤生长的效果较好，若与PD-1抗体联用之后效果更佳(图7)，肿瘤治疗实验表明糖肽分子有一定的抗肿瘤效应，并可以作为辅助治疗策略与其他免疫治疗剂起到协同抗肿瘤作用。
综上所述，本发明提供了一种调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子，其具有组织靶向性、响应性和自组装特性，静脉注射后在体循环中呈单体状态，代谢快，毒副作用较小，富集在靶组织后特异性响应于环境中活性分子进而被剪切，剪切后的片段可以自组装成糖肽组装体，该组装体表面富含高密度的功能分子，可以实现与M2型巨噬细胞膜蛋白的多价结合，进而激活信号转导，调控基因转录格局和细胞因子分泌格局，最终实现M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞的转变，该高效低毒调控巨噬细胞亚型转化的策略可以在活体水平发挥一定的肿瘤抑制效果，在与其他免疫制剂的联用中表现出优越的肿瘤治疗效果，具有广阔的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 国家纳米科学中心，中国科学院化学研究所
<120> 一种调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子及其制备方法和应用
<130> 20210603
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Arg Val Gly
1
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Arg Gly Asp
1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Cys Arg Gly Asp
1
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Cys Arg Glu Lys Ala
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Cys Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys
1 5 10
<210> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gly Cys Arg Asp Gly Pro Gln Gly Ile Trp Gly Gln Asp Arg Cys Gly
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Asp Glu Val Asp
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Gly Pro Ala
1
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Pro Leu Gly Tyr Leu Gly
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
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Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Pro Leu Gly Val Arg
1 5

Claims (7)

1.一种调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子，其特征在于，所述糖肽分子包括依次通过化学键共价偶联的靶向单元、响应单元、疏水单元和功能单元；
所述功能单元包括特异性结合M2型巨噬细胞的单糖分子；
所述靶向单元包括式Ⅰ所示的氨基酸序列；
Figure FDA0003769120200000011
所述响应单元包括式II所示的氨基酸序列；
Figure FDA0003769120200000012
所述疏水单元包括式Ⅲ所示的烷基链；
Figure FDA0003769120200000013
所述功能单元包括式Ⅳ所示的结构；
Figure FDA0003769120200000014
所述糖肽分子的结构式如式V所示；
Figure FDA0003769120200000021
2.一种如权利要求1所述的调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
通过固相合成法制备并连接靶向单元、响应单元和疏水单元，得到骨架，随后将功能单元连接到所述骨架上，得到所述糖肽分子。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，通过点击反应将所述功能单元连接到所述骨架上。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂。
7.权利要求1所述的调控巨噬细胞亚型转化的糖肽分子或权利要求4所述的药物组合物在制备调控巨噬细胞亚型转化的试剂和/或药物中的应用。
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