CN113292638A - 用于抗冠状病毒感染的多肽药物及其方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疾病治疗领域，具体而言，本发明涉及抑制新型冠状病毒感染的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，编码多肽的核酸分子，制备它们的方法，以及包含它们的药物组合物。本发明进一步涉及所述多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体在预防和/或治疗冠状病毒感染相关疾病中的用途，以及在制备预防和/或治疗冠状病毒感染相关疾病的药物中的用途。

Description

用于抗冠状病毒感染的多肽药物及其方法和应用

技术领域

本发明涉及疾病治疗领域，具体而言，本发明涉及用于抗冠状病毒感染的多肽药物及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，编码多肽的核酸分子，制备它们的方法，以及包含它们的药物组合物 (例如药物制剂)。本发明进一步涉及所述多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体在预防和/或治疗冠状病毒感染相关疾病中的用途，以及在制备预防和/或治疗冠状病毒感染相关疾病的药物中的用途。

背景技术

新型冠状病毒SARS-CoV-2属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERS- CoV有明显区别。目前研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45) 同源性达85％以上。根据中国卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案 (试行第五版)》，本次新型冠状病毒导致感染的临床表现包括：潜伏期1-14 天，一般为3-7天，以发热、乏力、干咳为主要表现，少数患者伴鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状；轻型患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现；重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等。

根据报道，新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的COVID-19病死率约 3.06％，基本传染数Ro达到3.77(Yang Yang等，BioRxiv，2020.2.11)。此次疾病爆发对人类的生存与健康带来了严重的威胁，也给社会经济的发展带来了严重的影响。截至目前，尚没有针对新型冠状病毒SARS-CoV-2感染疾病的特效药物，临床主要通过对症支持治疗为主。亟待开发相应预防及治疗药物，控制疾病进一步扩散，挽救危重病人生命。

冠状病毒为单链RNA的包膜病毒，将其分为α、β、γ和δ四个类别，β类别可分为A-D四个亚组。目前为止，已发现6种病毒分子(除SARS-CoV- 2)，分别可导致不同的疾病类型，主要临床表现在上呼吸道和胃肠道感染。 SARS和MERS病毒感染会导致患者肺炎、肾衰等严重器官损伤而发生死亡。据统计，SARS和MERS导致的患者死亡率分别为9％，36％。

冠状病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有3种糖蛋白：刺突糖蛋白(S蛋白，Spikeprotein，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点)、小包膜糖蛋白(E蛋白，Envelopeprotein，较小，与包膜结合的蛋白)、膜糖蛋白 (M蛋白，Membrane proten，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出牙释放与病毒外包膜的形成)。其中β属A群冠状病毒的包膜上还具有一个较短的刺突蛋白，即凝血素糖蛋白(HE蛋白，Heamaglutininesterase)。在病毒内部，为病毒的核衣壳蛋白(N蛋白，nulceocapsid phosphor protein)，其上附着有病毒的基因组单正链RNA。

冠状病毒的感染步骤，包括吸附入侵、基因合成、成熟病毒的包装和释放这4个过程，其中病毒吸附入侵的关键步骤是病毒受体的特异性。在冠状病毒感染宿主细胞的过程中，S蛋白特异性识别细胞表面受体并形成复合物，是决定病毒入侵的关键性因素。S蛋白可被宿主细胞酶切割为S1和S2亚单位，其中S1负责受体的识别，而S2启动病毒与宿主的膜融合。S1亚基上具有宿主受体结合区(RBD)，相关受体包括CD13(APN)、唾液酸(SA)、ACE2、CD26(DPP4)等；S2亚基上具有HR1(heptad repeat 1)和HR2 区，HR1通过形成同源三聚体暴露3个高度疏水的凹槽结构，该结构能与 HR2结合，进而形成六螺旋束的核心结构，协助病毒与细胞膜的融合，从而使病毒进入靶细胞。

初步研究发现SARS-CoV-2与SARS病毒一样，均是通过S蛋白结合人体细胞表面的ACE2蛋白进入细胞(Tianlei Ying,bioRxiv,2020；Vincent Munster，bioRxiv,2020)。McLellan等人发现(Daniel Wrapp等，BioRxiv， 2020.2.15)，SARS-CoV-2与人ACE2的亲和力是SARS病毒的10-20倍，进一步解释了SARS-CoV-2较SARS病毒具有更强的传染能力的原因。

因此，针对SARS-CoV-2等冠状病毒感染人体细胞的路径研发特异性预防或治疗药物也是目前药物研发的重要方向。

发明内容

在本发明中，发明人开发了能够用于抗冠状病毒(如SARS-CoV-2)感染动物细胞(尤其是阻断冠状病毒感染)的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体。该多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体通过竞争性阻断SARS-CoV-2等冠状病毒融合进入细胞的过程，以降低或阻止病毒感染风险，减少发病率，防止病毒进一步传播。

SARS-CoV-2病毒融合进入细胞的过程包括病毒表面S蛋白的S1亚基与人体特异性受体ACE2结合，再通过S2亚基启动病毒与宿主细胞膜的融合。在冠状病毒融合过程中，S蛋白的S2区域的中有两个关键区域HR1和HR2， HR1会先形成三聚体，然后结合三个HR2形成稳定复合物，为病毒融合进入细胞的必须结构。本发明针对该融合过程中的不同靶点设计特异性结合分子，阻断病毒与人体细胞的融合过程。

本发明一个方面提供一类多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，所述多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体以SARS-CoV-2病毒的S2亚基中HR1区域作为靶标。该类多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体能够阻断病毒S2亚基中的HR1与HR2结合形成六聚体，进而阻断病毒与人体细胞融合，抑制病毒感染人体。

在某些实施方案中，该类多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，包含：

(1)如SEQ ID NO:1、3或4任一氨基酸序列所示的多肽；

(2)与(1)所示多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如 1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)的多肽；或者

(3)与(1)所示多肽具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽。

在某些实施方案中，本发明的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，具有如下的氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO:1、3或4任一所示的氨基酸序列；

(2)与(1)所示序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如 1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或者

(3)与(1)所示序列具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。

在某些优选的实施方案中，所述一个或几个氨基酸的置换为保守置换。

在某些优选的实施方案中，本发明的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体包含如SEQ ID NO:1、3或4任一氨基酸序列所示的多肽。

在某些优选的实施方案中，本发明的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体具有如SEQ ID NO:1、3或4任一所示的氨基酸序列。

在某些优选的实施方案中，本发明的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体氨基酸序列如SEQ ID NO:1、3或4任一所示。

在某些优选的实施方案中，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽。

在某些优选的实施方案中，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽的功能等价变体，所述变体与SEQ ID NO:1所示多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个， 8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)，或与SEQ IDNO:1所示多肽具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；优选的，所述功能等价变体与SEQ ID NO:1所示的多肽具有基本相同或更高的抗病毒感染活性。

在某些优选的实施方案中，本发明提供的多肽的氨基酸序列以SEQ ID No：1为基础，在其第14，17，18，20，21，25和28位中至少含有一个突变，所述突变后的氨基酸残基选自：K(Lys)，R(Arg)，E(Glu),D(Asp)。

在某些优选的实施方案中，本发明提供的多肽的氨基酸序列以SEQ ID No：1为基础，在其第14，17，18，20，21，25和28位中至少含有两个突变，所述突变后的氨基酸残基选自：K(Lys)，R(Arg)，E(Glu),D(Asp)。

在某些优选的实施方案中，本发明提供的多肽的氨基酸序列以SEQ ID No：1为基础，在其第14，17，18，20，21，25和28位中至少含有三个突变，所述突变后的氨基酸残基选自：K(Lys)，R(Arg)，E(Glu),D(Asp)。

在某些优选的实施方案中，本发明提供的多肽的氨基酸序列以SEQ ID No：1为基础，在其第14，17，18，20，21，25和28位中至少含有四个突变，所述突变后的氨基酸残基选自：K(Lys)，R(Arg)，E(Glu),D(Asp)。

在某些优选的实施方案中，本发明提供的多肽的氨基酸序列以SEQ ID No：1为基础，在其第14，17，18，20，21，25和28位中至少含有五个突变，所述突变后的氨基酸残基选自：K(Lys)，R(Arg)，E(Glu),D(Asp)。

在某些优选的实施方案中，本发明提供的多肽的氨基酸序列以SEQ ID No：1为基础，在其第14，17，18，20，21，25和28位中至少含有六个突变，所述突变后的氨基酸残基选自：K(Lys)，R(Arg)，E(Glu),D(Asp)。

在某些优选的实施方案中，本发明提供的多肽的氨基酸序列以SEQ ID No：1为基础，在其第14，17，18，20，21，25和28位中至少含有七个突变，所述突变后的氨基酸残基选自：K(Lys)，R(Arg)，E(Glu),D(Asp)。

在某些优选的实施方案中，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽。

在某些优选的实施方案中，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽的功能等价变体，所述变体与SEQ ID NO:3所示多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个， 8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)，或与SEQ IDNO:3所示多肽具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；优选的，所述功能等价变体与SEQ ID NO:3所示的多肽具有基本相同或更高的抗病毒感染活性。

在某些优选的实施方案中，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的多肽。

在某些优选的实施方案中，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的多肽的功能等价变体，所述变体与SEQ ID NO:4所示多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个， 8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)，或与SEQ IDNO:4所示多肽具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；优选的，所述功能等价变体与SEQ ID NO:4所示的多肽具有基本相同或更高的抗病毒感染活性。

本发明另一个方面提供一类多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，所述多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体以SARS-CoV-2病毒的S蛋白保守区部分多肽为靶标。本发明针对SARS-CoV-2病毒S蛋白相关保守区域设计了多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，所述多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体能够发挥阻断病毒感染的作用。

在某些实施方案中，该类多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，包含：

(1)如SEQ ID NO:5-6任一氨基酸序列所示的多肽；

(2)与(1)所示多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如 1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)的多肽；或者

(3)与(1)所示多肽具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽。

在某些实施方案中，本发明的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，具有如下的氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO:5-6任一所示的氨基酸序列；

(2)与(1)所示序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如 1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或者

(3)与(1)所示序列具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少 97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。

在某些优选的实施方案中，所述一个或几个氨基酸的置换为保守置换。

在某些优选的实施方案中，本发明的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体包含如SEQ ID NO:5-6任一氨基酸序列所示的多肽。

在某些优选的实施方案中，本发明的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体具有如SEQ ID NO:5-6任一所示的氨基酸序列。

在某些优选的实施方案中，本发明的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5- 6任一所示。

在某些优选的实施方案中，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的多肽。

在某些优选的实施方案中，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的多肽的功能等价变体，所述变体与SEQ ID NO:5所示多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个， 8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)，或与SEQ IDNO:5所示多肽具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；优选的，所述功能等价变体与SEQ ID NO:5所示的多肽具有基本相同或更高的抗病毒感染活性。

在某些优选的实施方案中，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的多肽。

在某些优选的实施方案中，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的多肽的功能等价变体，所述变体与SEQ ID NO:6所示多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个， 8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)，或与SEQ IDNO:6所示多肽具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；优选的，所述功能等价变体与SEQ ID NO:6所示的多肽具有基本相同或更高的抗病毒感染活性。

本发明另一方面提供一种分离的核酸分子，其包含编码本发明所述的多肽及其功能等价变体的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含与异源启动子可操作性连接的编码本发明的多肽及其功能等价变体的核苷酸序列。

在某些优选的实施方案中，本发明分离的核酸分子编码如SEQ ID NO:1、 3-6任一所示的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。在某些优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。在某些优选的实施方案中，所述载体能够在适合的宿主细胞中表达本发明的多肽及其功能等价变体。

在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子或本发明的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO(例如CHO-K1、CHO-S、 CHODG44)。

在另一个方面，本发明提供制备本发明所述的多肽的方法。如根据本领域已知的各种方式来制备。

在一些实施方案中，通过基因工程的手段体外表达获得的本发明的多肽。将编码多肽的DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞(如E.coli细胞、酵母细胞、COS细胞、CHO细胞等)，在允许所述多肽表达的条件下，培养宿主细胞，从培养的宿主细胞培养物中回收所述多肽。所述载体包含表达 DNA分子所必需的调节元件，例如包括启动子序列、转录起始序列和任选存在的增强子序列等。进一步的，所述回收还可以包括通过免疫亲和纯化等方式来纯化多肽。

在一些实施方案中，本发明的宿主细胞可以是合适的原核或真核表达系统。例如原核表达系统的大肠杆菌细胞，真核表达系统例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。

在一些实施方案中，本发明的多肽也可以化学合成。例如，可使用固相方法来合成肽(Stewart,J.M和Young,J.D.,"Solid Phase Peptide Synthesis,第2 版",(1984),Pierce Chemical Company,Rockford,Ill(1984)inois；Bodanzsky M.y Bodanzsky A.,"The practice of Peptide Synthesis",(1994),Springer Verlag,Berlin；LloydWilliams P.et al.,"Chemical Approaches tothe Synthesis of Peptides andProteins",(1997),CRC,Boca Raton,FL,USA)，溶液中的合成、酶促合成(Kullmann W."Proteases as catalysts for enzymic syntheses ofopioid peptides",(1980),J.Biol.Chem.,255(17),8234-8238)或其任意组合。

例如，多肽合成的方法可包括向生长的肽链中相继添加一个或多个氨基酸或经过适当保护的氨基酸。第一个氨基酸的氨基或羧基通常由合适的保护基保护。经过保护或衍生的氨基酸随后连接至惰性的固体支撑物或通过在具有经过适当保护的互补基团(氨基或羧基)的序列中加入下一个氨基酸并且在适合形成酰胺键的条件下在溶液中使用。随后从这个新加入的氨基酸残基中去除保护基并加入下一个氨基酸(经过适当保护)，等等。在按适当顺序连接所有需要的氨基酸之后，相继或同时去除任何剩下的保护基(和任何固体支撑物)以获得最终的粗肽，经进一步后处理得最终的多肽。

在某些优选的实施方案中，本发明的多肽的合成在固相合成仪上完成或通过手动固相法合成。

在某些优选的实施方案中，本发明多肽的合成包括如下步骤：

(1)将树脂固相载体和Fmoc保护的碳端第一个氨基酸(如Fmoc- AA-OH)偶联，得到Fmoc-AA-树脂后，脱除Fmoc保护基；得到H-AA- 树脂；

(2)通过固相合成法，在偶联剂系统的存在下，按多肽氨基酸序列由碳端向氮端依次将保护氨基酸偶联到H-AA-树脂上，制备得到线性多肽的肽树脂；

(3)线性多肽的肽树脂经裂解，制得多肽。

在某些优选的实施方案中，步骤(1)中所述脱除Fmoc保护基的试剂由体积比为1:1～10的哌啶和DMF组成；优选地，所述脱除Fmoc保护基的试剂由体积比为1:4的哌啶和DMF组成。

在某些优选的实施方案中，步骤(1)固相合成在Wang树脂或2-氯三苯甲基树脂上进行；优选地，所述Wang树脂取代度为0.4～1.0mmol/g；所述2-氯三苯甲基树脂取代度为0.4-1.1mmol/g。

在某些优选的实施方案中，步骤(2)中所述的偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自HBTU/DIEA、HATU/DIEA、 HBTU/HOBt/DIEA、HCTU/NMM、HATU/HOAt/DIEA、TBTU/DIEA、 HOBt/DIC、HOAt/DIC、Cl-HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、 PyAOP/HOBt/DIEA和Oxyma/DIC中的一种或多种，所述反应溶剂选自 DMF、DCM、NMP和DMSO中的一种或多种；优选地，所述缩合剂为 HOBt/DIC，反应溶剂为DMF。

在某些优选的实施方案中，步骤(3)所述的裂解采用的裂解试剂是由TFA、TIS、H₂O、EDT、苯甲硫醚、苯酚和对甲苯酚中的2种或2种以上组成的混合溶液；优选地，所述的裂解试剂由体积比为90～95:1～5:1～5:1～5 的TFA、TIS、H₂O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为74～96:1～7:1～7:1～7:1～5:1～5的TFA、TIS、H₂O、EDT、苯酚和苯甲硫醚组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为85～95:1～5:2～8:2～8 的TFA、TIS、H₂O和对甲苯酚组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为85～95:1～5:2～8:2～8的TFA、TIS、H₂O和苯甲硫醚组成的混合溶液；更优选地，所述的裂解试剂由体积比为92:4:2:2的TFA、TIS、H₂O和EDT 组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为82.5：5：5：5：2.5的 TFA、苯酚、苯甲硫醚、H₂O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为88:2:5:5或90:2:5:3的TFA、TIS、H₂O和对甲苯酚组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为88:2:5:5的TFA、TIS、H₂O和苯甲硫醚组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为95:5的TFA和 H₂O组成的混合溶液。

本发明另一方面提供包含本发明多肽的药物组合物，其包含本发明的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。在某些优选的实施方案中，所述药物组合物包含另外的药学活性剂，该另外的药学活性剂可选自抗病毒药物、免疫治疗药物和/或抗生素。

在某些优选的实施方案中，在所述药物组合物中，本发明所述的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体与所述另外的药学活性剂作为分离的组分提供，或作为同一组合物或产品的不同组分提供。因此，本发明所述的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。

在某些优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂选自ACE抑制剂， ARB，利巴韦林，克力芝(Aluvia)，瑞德西韦(Remdesivir),阿昔洛韦，恩夫韦地(enfuvirtide)，齐多夫定，利托那韦，阿比朵尔(Arbido)，洛匹那韦， Methylprednisolone或其任意组合。

在某些优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂为抗病毒药物，可选自克力芝(Aluvia洛匹那韦利托那韦片)、瑞德西韦(Remdesivir)、奥司他韦 (oseltamivir)、扎那米韦(zanamivir)和/或帕拉米韦(peramivir)。在某些实施方案中，抗病毒药物为阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺(a ma n tad ine)、安普那韦(a m prena vi r)、安普利近(ampligen)、阿比朵尔 (arbidol)、阿扎那韦、立普妥(atripla)、波西普韦(boceprevir)、西多福韦、可比韦(combivir)、康普莱(complera)、地瑞那韦、地拉韦啶、地达诺新、二十二烷醇、度鲁特韦、依度尿苷、依法韦仑、恩曲他滨、恩夫韦地 (enfuvirtide)、恩替卡韦(entecavir)、泛昔洛韦、福米韦生(fomivirsen)、膦沙那韦(fosamprenavir)、膦甲酸、膦乙醇、更昔洛韦、伊巴他滨(ibacitabine)、伊姆诺韦(imunovir)、碘苷、咪喹莫特(imiquimod)、茚地那韦(indinavir)、肌苷、III型干扰素、II型干扰素、I型干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺(loviride)、马拉韦罗(maraviroc)、吗啉胍(moroxydine)、美替沙腙、奈非那韦(nelfinavir)、奈韦拉平、奈沙韦(nexavir)、聚乙二醇干扰素α聚乙二、喷昔洛韦、帕拉米韦、普可那利(pleconaril)、足叶草毒素(podophyllotoxin)、雷特格韦、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、培拉米定(pyramidine)、沙奎那韦、司他夫定、stribild、替诺福韦、替诺福韦酯、富马酸替诺福韦艾拉酚胺、替拉那韦(tipranavir)、曲氟尿苷、trizivir、曲金刚胺(tromantadine)、特鲁瓦达(truvada)、伐昔洛韦(valaciclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)、维立韦罗(vicriviroc)、氟达拉滨、韦拉米定(viramidine)、扎西他滨、扎那米韦、齐多夫定及其组合。

在某些优选的实施方案中，所述药物组合物包含本发明所述的SEQ ID No.1、3-6中任一种或多种多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体。

在某些优选的实施方案中，所述药物组合物包含本发明所述的SEQ ID No.1、3-6中至少两种多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体。

在某些优选的实施方案中，所述药物组合物包含本发明所述的SEQ ID No.1、3-6中至少三种多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体。

在某些优选的实施方案中，所述药物组合物包含本发明所述的SEQ ID No.1、3-6中至少四种多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体。

在某些优选的实施方案中，所述药物组合物包含本发明所述的SEQ ID No.1、3-6中五种多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体。

本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂 (包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、气雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和预防/治疗用途。例如，可通过下述方法来制备液体制剂：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的多肽，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。或者可通过下述方法来制备冻干制剂：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌，冷冻干燥或直接冰冻。

在某些优选的实施方案中，本发明的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体、药物组合物通过吸入的方式给药，如通过吸入器或喷雾器施用。在一个优选的实施方案中，本发明的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体、药物组合物以包括但不限于干粉吸入剂、气雾剂、供雾化器用的液体制剂或其他可通过吸入给药的制剂形式吸入给予。

在某些优选的实施方案中，本发明的制剂为液体制剂(例如作为供雾化器用的液体制剂，或供其他方式施用的液体制剂)，其含有多肽活性成分，渗透压调节剂，pH调节剂和注射用水。在某些更优选的实施方案中，所述液体制剂含有0.05-5mg/mL的多肽活性成分，1-9mg/mL的渗透压调节剂，pH 调节剂和注射用水。在某些特别优选的实施方案中，所述液体制剂含有 1mg/mL的多肽活性成分，9mg/mL的渗透压调节剂，pH调节剂和注射用水。在某些优选的实施方案中，所述多肽活性成分为ACV01或ACV03多肽，渗透压调节剂为氯化钠，pH调节剂为盐酸、醋酸或氢氧化钠，和/或pH为7.0- 9.0，优选为7.5-8.5，更优选8.0-8.5。

作为示例，本发明提供一种优化的液体制剂，优选为吸入制剂，该制剂含有：1mg/mL的ACV01多肽，9mg/mL的氯化钠，用盐酸或氢氧化钠调 pH至8.0-8.5，加注射用水至规定容量。

作为示例，本发明提供一种优化的液体制剂，优选为吸入制剂，该制剂含有：1mg/mL的ACV03多肽，9mg/mL的氯化钠，用醋酸或氢氧化钠调 pH至8.0-8.5，加注射用水至规定容量。

在某些优选的实施方案中，本发明的制剂为液体制剂(例如作为供雾化器用的液体制剂，或供其他方式施用的液体制剂)，其含有多肽活性成分，渗透压调节剂，助溶剂，pH调节剂和注射用水。在某些更优选的实施方案中，所述液体制剂含有0.05-5mg/ml的多肽活性成分，1-9mg/ml的渗透压调节剂， 0.05-100mg/ml的助溶剂，pH值调节剂和注射用水。在某些优选的实施方案中，所述多肽活性成分为ACV01或ACV03多肽，渗透压调节剂为氯化钠，pH调节剂为盐酸、醋酸或氢氧化钠，助溶剂为精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、聚山梨酯20或聚山梨酯80，和/或pH为7.0-9.0，优选为7.5-8.5，更优选8.0-8.5。

作为示例，本发明提供一种优化的液体制剂，优选为吸入制剂，该制剂含有：1mg/mL的ACV01多肽或ACV03多肽，9mg/mL的氯化钠， 1mg/mL的精氨酸，用氢氧化钠或醋酸或盐酸溶液调节pH至8.0-8.5，加注射用水至规定容量。

作为示例，本发明提供一种优化的液体制剂，优选为吸入制剂，该制剂含有：1mg/mL的ACV01多肽或ACV03多肽，9mg/mL的氯化钠， 5mg/mL的精氨酸，用氢氧化钠或醋酸或盐酸溶液调节pH至8.0-8.5，加注射用水至规定容量。

作为示例，本发明提供一种优化的液体制剂，优选为吸入制剂，该制剂含有：1mg/mL的ACV01多肽或ACV03多肽，9mg/mL的氯化钠，3mg/mL 的聚山梨酯20或聚山梨酯80，用氢氧化钠或醋酸或盐酸溶液调节pH至 8.0-8.5，加注射用水至规定容量。

作为示例，本发明提供一种优化的液体制剂，优选为吸入制剂，该制剂含有：1mg/mL的ACV01多肽或ACV03多肽，9mg/mL的氯化钠， 0.05mg/mL的聚山梨酯20或聚山梨酯80，用氢氧化钠或醋酸或盐酸溶液调节pH至8.0-8.5，加注射用水至规定容量。

在某些优选的实施方案中，本发明的制剂可为冻干粉剂，其是在前述液体制剂的基础上，加入1-50mg/mL的甘露醇、山梨醇、蔗糖或乳糖等保护剂制备成冻干粉剂，在使用时按照规定容量配置成溶液。

在本发明提供的药物组合物和制剂中，所述多肽活性成分或多肽(如 ACV01多肽或ACV03多肽)包括多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体。

此外，本发明所述的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。

本发明所述的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体的预防或治疗有效量可根据如下因素发生变化：待预防或治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等。

在本发明中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。

本发明另一个方面提供一种方法或用途，所述方法或用途包括将本发明的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体、药物组合物用于预防和/或抑制冠状病毒与细胞的融合。本发明另一方面提供一种预防和/或抑制冠状病毒与细胞的融合的方法，所述方法包括向需要的对象或细胞施用有效量的本发明的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体、药物组合物。在优选的实施方案中，所述方法或用途是用于预防冠状病毒与细胞的融合。在优选的实施方案中，所述方法或用途是用于抑制冠状病毒与细胞的融合。在优选的实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV，MERS-CoV或SARS-CoV-2。在更优选的实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。

本发明另一个方面提供一种预防和/或治疗方法或用途，所述预防和/或治疗方法或用途包括将本发明所述的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体、药物组合物用于在对象(例如人)中预防和/ 或治疗冠状病毒感染相关的疾病。本发明另一个方面提供一种用于在对象中预防和/或治疗冠状病毒感染相关的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的本发明所述的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体、药物组合物。在优选的实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV，MERS-CoV或SARS-CoV-2；在更优选的实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。在某些优选的实施方案中，所述冠状病毒感染相关的疾病为COVID-19或中东呼吸综合征(MERS)或重症急性呼吸综合征(SARS)；在更优选的实施方案中，所述冠状病毒感染相关的疾病是 COVID-19。

本发明另一个方面提供将本发明的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体、药物组合物制备药物的用途，所述药物用于抑制冠状病毒与细胞的融合，或用于在对象(例如人)中预防和/或治疗冠状病毒感染相关的疾病。在优选的实施方案中，所述药物用于抑制冠状病毒 SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2与细胞的融合，或用于在对象(例如人)中预防冠状病毒SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2感染相关的疾病；在更优选的实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。在某些优选的实施方案中，所述冠状病毒感染相关的疾病为COVID-19或中东呼吸综合征(MERS)或重症急性呼吸综合征(SARS)；在更优选的实施方案中，所述冠状病毒感染相关的疾病是COVID-19。

在某些优选的实施方案中，当本发明所述的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体、所述药物组合物、制剂用于制备药物时，所述药物用于在对象(例如人)中预防和/或治疗与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症恶化、复发。在优选的实施方案中，所述疾病为COVID-19。

在另一个方面，本发明提供了一种在对象中预防和/或治疗与冠状病毒感染相关的疾病或病症的方法。在另一个方面，本发明提供了一种在对象中延迟与冠状病毒感染相关的疾病或病症的方法。在另一个方面，本发明提供了一种在对象中降低或抑制与冠状病毒感染相关的疾病或病症复发的方法。以上所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的本发明所述的多肽，或其修饰物，或其立体异构体、其衍生物、其药学上可接受的盐和/或其功能等价的变体，药物组合物，制剂。在某些优选的实施方案中，所述冠状病毒感染相关的疾病或病症为COVID-19或中东呼吸综合征(MERS)或重症急性呼吸综合征(SARS)；在更优选的实施方案中，所述冠状病毒感染相关的疾病或病症是COVID-19。

在优选的实施方案中，所述对象是哺乳动物。在某些更优选的实施方案中，所述对象是人。

本发明另一方面提供一种容器(例如塑料或玻璃小瓶，例如具有盖中空孔针或注射器圆筒)，其包含任一本发明的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体、组合物、制剂。本发明还提供注射装置或气雾吸入装置，其包含任一本发明的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体、组合物、制剂。

缩写及术语定义

在本文中使用以下缩写：

多肽、名称和序列对应表

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学实验室等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文所定义的，术语“多肽”，“蛋白质”，“肽”和“氨基酸序列”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸残基的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且可以被非氨基酸的化学部分打断。该术语还包括已被天然或人工修饰(例如二硫键形成，糖基化，脂化，乙酰化，磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记或生物活性组分缀合)的氨基酸聚合物。术语“肽”包括通过共价键(例如酰胺键)连接的两个或更多个天然存在的或合成的氨基酸。

如本文中所使用的，术语“衍生物”是指把所述多肽氨基酸序列中的氨基酸的一个或者几个基团用另外的基团取代后与所述多肽具有同样生物活性的多肽。例如母体多肽的一个或多个氨基酸残基被引入选自酰胺、糖类、烷基、酰基、酯、聚乙二醇化等一种或多种取代基。

如本文中所使用的，术语“立体异构体”表示由于具有一个或多个立体异构中心形成的异构体，且各个异构中心可以以R或S构型或其组合的形式存在。类似地，本文所述多肽可具有一个或多个双键，且各双键可以以 E(反式)或Z(顺式)构型或其组合的形式存在。一个特定的立体异构体、结构异构体(regioisomer)、非对映异构体、对映异构体或差向异构体应被理解为包括所有可能的立体异构体、结构异构体、非对映异构体、对映异构体或差向异构体及其混合物。因此，本文所述多肽包括所有构型上不同的立体异构体、结构异构体、非对映异构体、对映异构体或差向异构体形式以及其相应的混合物。本发明多肽的优选结构纯异构体，也即对映体或非对映体。用于转化特定立体异构体或使特定立体异构体保持原状的技术，以及拆分立体异构体混合物的技术是本领域熟知的，本领域技术人员能够就具体情况选择适合的方法。

如本文中所使用的，术语"药学上可接受的盐"意指其在动物中和更特别地在人类中的用途得到承认的盐，并且包括用以形成碱加成盐的盐，无论它们是无机盐还是有机盐，无机盐比如且不限于锂、钠、钾、钙、镁、锰、铜、锌或铝等，或有机盐比如且不限于乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸或哌嗪等；或者酸加成盐，无论它们是有机盐还是无机盐，有机盐比如且不限于乙酸盐，柠檬酸盐，乳酸盐，丙二酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，富马酸盐，苯甲酸，天冬氨酸盐，谷氨酸盐，琥珀酸盐，油酸酯，三氟乙酸盐，草酸盐，双羟萘酸盐或葡糖酸盐等，或无机盐比如且不限于氯化物，硫酸盐，硼酸盐或碳酸盐等。盐的性质不是关键，条件是它是药学上可接受的。本发明肽的药学上可接受的盐能够通过现有技术中熟知的常规方法获得。

如本文中所使用的，术语"功能等价的变体"是指通过氨基酸的置换、缺失或添加修改的衍生自本发明多肽序列的多肽，或与本发明多肽具有一定序列同一性的衍生多肽，条件是所提及的衍生多肽维持基于相应的非修饰多肽的功能的至少20％，至少50％，至少80％的功能，至少100％的功能。该功能等价的变体也包括与非修饰多肽相比，功能活性提高的多肽。在本文中，当特别指出“具有基本相同或更高的…活性”时，其中基本相同的活性是指所述功能等价的变体的活性是原多肽活性的至少50％。本发明多肽的功能和其功能等价的变体可通过定量其抑制病毒感染细胞的能力来确定。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒 (如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒 (如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞， CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序 (DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443- 453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers 和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120 权重残基表(weightresidue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5 或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人 Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds., Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

如本文中所使用的，术语“药物组合物”是指通过混合或组合不止一种活性成分而获得的药物治疗，其包括活性成分的固定组合和不固定组合。术语“固定组合”是指以单个实体或单个剂型的形式向患者同时施用至少一种本文所述的化合物和至少一种另外的药物活性剂。术语“不固定组合”是指以单独实体的形式向患者同时施用、合用或以可变的间隔时间顺次施用至少一种本文所述的化合物和至少一种另外的药物活性剂，其中此类施用在患者体内提供有效水平的两种或多种化合物。这些也应用到鸡尾酒疗法中，例如施用三种或更多种活性成分。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与对象和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。

如本文中所使用的，术语“预防”是指，用于阻断、减少、抑制、防止和/ 或延迟疾病或病症或症状(例如，呼吸系统疾病和症状、感染或自身免疫性疾病)在对象体内的发生而实施的方法，降低所述对象中感染性疾病患病发生率的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，所述对象患病后减轻症状、缩小疾病范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展，改善或减轻疾病的状态、和缓解症状 (无论部分或全部)，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。

如本文中使用的，术语“对象”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述对象(例如人)患有呼吸系统疾病和症状、感染或自身免疫性疾病，或者，具有患有上述疾病的风险。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如，呼吸系统疾病和症状、感染或自身免疫性疾病)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如，呼吸系统疾病和症状、感染或自身免疫性疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。适当剂量的测定通过临床医师，例如使用本领域中已知或怀疑影响治疗的参数或因素进行。通常，剂量以略小于最佳剂量的量开始，且其随后以较小增量增加，直至相对于任何负面的副作用实现所要或最佳作用。重要的诊断量度包括例如炎症的症状或所产生炎性细胞因子的水平的量度。

本发明所述的多肽的治疗或预防有效量的典型非极限范围是0.01～ 1000mg/kg，例如0.1～500mg/kg，1～250mg/kg，或1～50mg/kg。此外，本领域技术人员理解，对于任一特定患者，特定的给药方案应根据患者需要和医生的专业评价而随时间调整；此处给出的剂量范围只用于举例说明目的，而不限定本发明药物组合物或免疫原性组合物的使用或范围。

本发明的药物组合物中的多肽，其修饰物，或其立体异构体、其混合物、其药学上可接受的盐和/或其功能等价的变体在对象中产生至少一项以下生物学活性：结合至ACE2，抑制S1与ACE2的结合；结合至S2，抑制6-HB的形成；结合至HR1，抑制6-HB的形成；结合S蛋白相关保守区域，抑制 SARS-CoV-2与细胞的融合。

本发明的药物组合物中的多肽，其衍生物，或其立体异构体、其混合物、其药学上可接受的盐和/或其功能等价的变体能够有效抑制SARS-CoV-2与细胞的融合，对于预防和治疗SARS-CoV-2感染相关的疾病具有重大的临床价值。

附图说明

图1：HEK293T-ACE-2细胞流式检测，流式荧光检测显示，荧光表达明显，阳性率100％，成功构建了表达ACE2的HEK293T细胞。

图2：ACV02阻断病毒侵染ACE2高表达细胞活性测试。

图3：ACV03阻断病毒侵染ACE2高表达细胞活性测试。

图4：ACV06阻断病毒侵染ACE2高表达细胞活性测试。

图5：多肽ACV01和ACV03阻断病毒侵染ACE2高表达细胞活性测试。

具体实施方式

为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，以下结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。并且，下列实施例中未提及的具体实验方法，均按照常规实验方法进行。

实施例1 ACV01的制备

(1)肽树脂的制备

称取取代度为0.38mmol/g的Wang树脂3.947g，加入多肽反应器中，加入40ml DCM洗涤，并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Leu-OH(2.25mmol， 0.80g)，DMAP(0.15mmol，0.018g)，加24ml溶剂(DCM:DMF＝2:1) 溶解，加入DIC(3mmol，0.5ml)活化后将溶解后的反应液加入至树脂中，25℃反应4小时。反应完成后，排干溶液，分别使用40ml DMF洗涤树脂2 次后，再分别用40ml DCM溶液洗涤树脂2次。洗涤完成后，往树脂中加入40ml封闭液(DCM:Ac₂O:吡啶＝90:5:5(V：V：V))封闭反应1小时，排干溶液，分别使用40ml DMF溶液洗涤树脂4次，得到Fmoc-Leu-Wang 树脂。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为0.28mmol/g。

取Fmoc-Leu-Wang树脂，使用40ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF 溶液＝1:4(V：V))处理树脂5min后，排干溶液，再用40ml脱除Fmoc 的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))溶液处理树脂15min，脱除 Fmoc保护基，然后分别使用40ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法(Kaiser Test)检测判断反应终点，得到H- Leu-Wang树脂。

称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH.H₂0(4.42mmol，1.96g)，HOBt (4.42mmol，0.597g)溶解于24ml DMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(10.17mmol，1.7ml)搅拌反应10min后，将反应溶液加入至制备的H-Leu-Wang树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用茚三酮法(Kaiser Test)检测缩合完成情况，1小时反应完全，抽干树脂，分别使用40ml DMF洗涤树脂3次，以茚三酮法(Kaiser Test)检测判断反应终点。

重复上述脱除Fmoc保护和氨基酸偶联的步骤，按照主链肽序从C端到N端依次偶联后续氨基酸，直至全部偶联完成。每种氨基酸、HOBt每次分别投料4.42mmol，DIC每次投料4.86mmol。偶联完毕，分别用40ml DMF、40ml DCM、40ml MeOH交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到肽树脂(12.7g)。

(2)肽树脂的裂解

称取步骤(1)得到的肽树脂12.7g加入至多肽裂解反应器中，加入 190ml预先降温至0℃左右的由体积比为92：4：2：2的TFA、TIS、水、 EDT组成的裂解试剂，室温(10-30℃)条件下搅拌反应2小时。反应完成后，将反应液过滤至1.9L预先降温至-10℃左右的甲基叔丁基醚，有白色固体产生，-10℃下搅拌该白色淤浆物30min，随后将白色淤浆物离心后，弃掉上清液，收集白色淤浆物，加入新鲜的甲基叔丁基醚，重复上述离心过程2-4 次，收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得粗品(4.33g，纯度为 77.7％)。

(3)肽树脂的纯化、换盐，冻干

称取步骤(2)得到的粗品1.0克经0.1％TFA纯化，NH4 OAc换盐得到的肽溶液，经冷冻干燥得到成品(重量0.101g，纯度97.5％)。LCMS (m/z)：1003.6，质谱响应形式(M+4H)/4。

实施例2：ACV03的制备

(1)肽树脂的制备

称取260g取代度为0.66mmol/g的Wang树脂加入多肽反应器中，同时加入3L DCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Leu-OH(198mmol， 70g)，DMAP(16mmol，194mg)，加1.4L DCM溶解，加入DIC (100mmol，15.5ml)活化后将溶解后的反应液加入至树脂中，25℃反应1 小时。反应完成后，排干溶液，分别使用3L DMF洗涤树脂2次后，再分别用17L DCM溶液洗涤树脂2次。洗涤完成后，往树脂中加入3L封闭液 (DCM:Ac2O:吡啶＝90:5:5(V：V：V))封闭反应0.5小时，排干溶液，分别使用3L DMF溶液洗涤树脂4次，得到Fmoc-Leu-Wang树脂。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为0.24mmol/g。

取Fmoc-Leu-Wang树脂，使用3L脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂5min后，排干溶液，再用3L脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))溶液处理树脂15min，脱除Fmoc保护基，然后分别使用3L DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法(Kaiser Test)检测判断反应终点，得到H-Leu-Wang树脂。

称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH.H2O(390mmol，161.92g)，Cl-HOBt (507mmol，79.49g)溶解于750ml DMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(897mmol，138.6ml)搅拌反应5min。将反应溶液加入至制备的H-Leu-Wang树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用茚三酮法(Kaiser Test)检测缩合完成情况，1小时反应完全，抽干树脂，分别使用3L DMF洗涤树脂3次，以茚三酮法(Kaiser Test)检测判断反应终点。

重复上述脱除Fmoc保护和氨基酸偶联的步骤，按照主链肽序从C端到N端依次偶联后续氨基酸，直至全部偶联完成。每种氨基酸每次投料 390mmol、Cl-HOBt每次投料507mmol，DIC每次投料507mmol。偶联完毕，分别用3L的DMF、3L的DCM、3L的MeOH交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到肽树脂(1050g)。

(2)肽树脂的裂解

称取步骤(1)得到的肽树脂分两次进行裂解，每次裂解肽树脂重量为 470g、475g。每次裂解方法如下：将肽树脂加入至多肽裂解反应器中，加入4L预先降温至0℃左右的由体积比为95：5的TFA和水组成的裂解试剂，在室温条件下搅拌反应2小时。反应完成后，将反应液过滤至40L预先降温至-10℃左右的甲基叔丁基醚，有白色固体产生，-10℃下搅拌该白色淤浆物30min离心后，弃掉上清液，收集白色淤浆物，加入新鲜的甲基叔丁基醚，重复上述离心过程，收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得粗品(221g，纯度为60.8％)。

(3)肽树脂的纯化、换盐及冻干

称取步骤(2)得到的粗品经0.1％TFA纯化，NH4OAc换盐得到肽溶液，经冷冻干燥得到成品(重量42g，纯度99.8％)。LCMS(m/z)：1007.6，质谱响应形式(M+4H)/4。

实施例3：ACV05的制备

(1)肽树脂的制备

称取4.76g取代度为0.66mmol/g的Wang树脂加入多肽反应器中，同时加入50mlDCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Gln(Trt)-OH (4.71mmol，2.88g)，DMAP(0.31mmol，0.037g)，加15ml DCM溶解，加入DIC(6.28mmol，1ml)活化后将溶解后的反应液加入至树脂中，25℃反应2小时。反应完成后，排干溶液，分别使用50ml DMF洗涤树脂2次后，再分别用50ml DCM溶液洗涤树脂2次。洗涤完成后，往树脂中加入 50ml封闭液(DCM:Ac2O:吡啶＝90:5:5(V：V：V))封闭反应1小时，排干溶液，分别使用50ml DMF溶液洗涤树脂4次，得到Fmoc-Leu-Wang树脂。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc 量，树脂的取代度为0.42mmol/g。

取Fmoc-Gln(Trt)-Wang树脂，使用50ml脱除Fmoc的试剂(哌啶： DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂5min后，排干溶液，再用50ml脱除 Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))溶液处理树脂15min，脱除Fmoc保护基，然后分别使用50ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法(Kaiser Test)检测判断反应终点，得到H- Gln(Trt)-Wang树脂。

称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH.H2O(10mmol，4.47g)，Cl-HOBt (13mmol，2.33g)溶解于15ml DMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(23mmol，3.6ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至制备的H-Gln(Trt)-Wang树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用Kaiser Test检测缩合完成情况，1小时反应完全，抽干树脂，分别使用50ml DMF洗涤树脂3次，以茚三酮法(Kaiser Test)判断反应终点。

重复上述脱除Fmoc保护和氨基酸偶联的步骤，按照主链肽序从C端到N端依次偶联后续氨基酸，直至全部偶联完成。每种氨基酸每次投料 10mmol、Cl-HOBt每次投料13mmol，DIC每次投料13mmol。偶联完毕，分别用50ml DMF、50ml DCM、50ml MeOH依次洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到肽树脂7.34g。

(2)肽树脂的裂解

称取步骤(1)得到的肽树脂7.34g加入至多肽裂解反应器中，加入 74ml预先降温至0℃左右的由体积比为82.5：5：5：5：2.5的TFA、苯酚、苯甲硫醚、水、EDT组成的裂解试剂室温条件下搅拌反应2小时。反应完成后，将反应液过滤至0.75L预先降温至-10℃左右的甲基叔丁基醚，有白色固体产生，-10℃下搅拌该白色淤浆物30min后，弃掉上清液，收集白色淤浆物，加入新鲜的甲基叔丁基醚搅拌洗涤，重复上述离心过程2次，收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得粗品(4.31g，纯度为34.5％)。

(3)肽树脂的纯化、换盐及冻干

称取步骤(2)得到的粗品别经0.1％TFA和KH2PO4纯化，NH4OAc 换盐得到精肽溶液，精肽经冷冻干燥得到成品(重量240.5mg，纯度 88.1％)。LCMS(m/z)：1100.7，质谱响应形式(M+2H)/2。

实施例4：ACV06的制备

(1)肽树脂的制备

称取4.83g取代度为1.1mmol/g的CTC树脂加入多肽反应器中，同时加入50ml DCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Pro-OH(3.2mmol， 1.14g)加20ml溶剂DCM溶解，再加入DIEA(16mmol，2.6ml)，搅拌均匀后加入树脂中25℃反应2小时。然后往树脂中加入4ml甲醇封闭树脂1 小时，排干溶液，50ml DMF溶液洗涤树脂4次，得到Fmoc-Pro-CTC树脂。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc 量，树脂的取代度为0.414mmol/g。

取Fmoc-Pro-CTC树脂，使用50ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF 溶液＝1:4(V：V))处理树脂5min后，排干溶液，再用50ml脱除Fmoc 的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))溶液处理树脂15min，脱除 Fmoc保护基，然后分别使用50ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法(Kaiser Test)检测判断反应终点，得到H- Pro-CTC树脂。

称取Fmoc-Thr(tBu)-OH(10mmol，3.91g)，HBTU(10mmol， 3.77g)，Cl-HOBt(5mmol，0.87g)溶解于15ml DMF溶液中，将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIEA(20mmol，3.5ml)搅拌反应10min后，将反应溶液加入至制备的H-Pro-CTC树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用Kaiser Test检测缩合完成情况，1小时反应完全，抽除反应液，50ml DMF洗涤树脂3次，以茚三酮法(Kaiser Test)判断反应终点。

重复上述脱除Fmoc保护和氨基酸偶联的步骤，按照主链肽序从C端到N端依次偶联后续氨基酸，直至全部偶联完成。每种氨基酸和HBTU每次分别投料10mmol、Cl-HOBt每次投料5mmol，DIEA每次投料20mmol。偶联完毕，用50ml DMF、50ml DCM、50ml MeOH依次洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到肽树脂(7.77g)。

(2)肽树脂的裂解

称取步骤(1)得到的肽树脂7.77g加入至多肽裂解反应器中，加入 80ml预先降温至0℃左右的由体积比为的TFA：水＝95：5组成的裂解试剂，在室温条件下搅拌反应2小时。反应完成后，将反应液过滤至0.8L预先降温至-10℃左右的甲基叔丁基醚，有白色固体产生，-10℃下搅拌该白色淤浆物30min，随后将白色淤浆物离心后，弃掉上清液，收集白色淤浆物，加入新鲜的甲基叔丁基醚，重复上述离心过程，收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得粗品(3.11g，纯度为80.4％)。

(3)肽树脂的纯化、换盐及冻干

称取步骤(2)得到的粗品经0.1％TFA纯化，NH4OAc换盐得到精肽溶液，经冷冻干燥得到成品(重量174.4mg，纯度87.9％)。LCMS(m/z)： 1108.1，质谱响应形式(M+2H)/2。

实施例5-6：其他多肽的制备

参照实施例1-4类似的方法，采用固相合成方法合成ACV02(氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示,可参考S.Xia,L.Yan,W.Xu,A.S.Agrawal,A. Algaissi,C.-T.K.Tseng,Q.Wang,L.Du,W.Tan,I.A.Wilson,S.Jiang,B. Yang,L.Lu,A pan-coronavirus fusion inhibitortargeting the HR1 domainof human coronavirus spike.Sci.Adv.5,eaav4580(2019)中的EK1多肽)、 ACV04(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)。

实验例1：多肽阻断假病毒颗粒侵染过表达ACE2细胞活性的检测

当S-Virus假病毒颗粒与过表达ACE2的细胞共孵育时，S蛋白结合受体ACE2后，进行一系列变构并与细胞膜融合，将报告基因转导至靶细胞，并在靶细胞中表达荧光素酶。本发明多肽通过阻断S蛋白变构/膜融合，抑制病毒侵染靶细胞，因此可以利用本实验来检测多肽是否抑制病毒侵染靶细胞，从而推测是否阻断病毒S蛋白变构及蛋白ACE2和S蛋白结合介导的膜融合。

首先，利用本领域常规的基因工程手段构建表达人ACE2的质粒(含有APC荧光标记基因)，转染HEK293T细胞，经过加压筛选，获得表达 ACE2且带有APC荧光信号的HEK293T-ACE2。通过流式检测验证，如图 1所示，荧光表达明显，阳性率100％，证明表达ACE2的HEK293T-ACE2 细胞构建成功。

其次，利用本领域常规的基因工程手段构建表达SARS-Cov-2的S蛋白的质粒(含有GFP基因)，将该质粒与慢病毒骨架质粒和包装质粒共转染 HEK293T细胞，包装形成慢病毒颗粒，收获病毒上清，获得在病毒包膜上嵌合SARS-Cov-2的S蛋白的S假病毒颗粒S-Virus。

在96孔板中按照50ul/孔加入培养基DMEM(购自源培)和10％FBS(购自BI)，然后加入2.6*10⁵个/mL HEK293T-ACE2。用检测培养基溶解多肽 (ACV02，ACV03，ACV06)，0.22uM滤膜除菌，按3倍稀释的梯度调整多肽浓度从120uM到0.49uM，加入2倍体积的S-Virus混匀，随后取150uL/ 孔加入至96孔板中，与细胞混匀。在37℃5％CO₂培养箱培养12-16小时。去除培养基，加入新的检测培养基150uL/孔，在37℃5％CO₂培养箱培养 24小时。加入50ul One–Glo检测试剂，酶标仪读取信号值，根据数据作图。

ACV02，ACV03，ACV06的实验结果如图2、图3和图4所示， ACV02，ACV03和ACV06均能够有效阻断假病毒颗粒侵染过表达ACE2 细胞，且随着浓度的增加，抑制率均逐渐增加，其中ACV02的最高抑制率为50％，ACV03和ACV06最高抑制率达80％，ACV03阻断活性IC50达0.37μM。

实验例2：多肽阻断表达ACE2的细胞与表达S蛋白的细胞融合活性的检测

在含有80ng/mL胰酶的DMEM培养基中，加入表达ACE2的 HEK293T-ACE2(含有APC荧光标记基因，实验例1构建)与S假病毒颗粒S-Virus(每个细胞2*E4个，150ul/孔，实验例1构建)混匀；37℃ 5％CO2培养箱中培养4小时，流式细胞仪检测APC及GFP荧光以及细胞融合情况，酶标仪读取信号值，根据数据作图。

实验结果如图5所示，ACV01和ACV03多肽均能显著抑制S假病毒颗粒S-Virus与表达ACE2蛋白细胞融合，且随着浓度的增加，抑制率逐渐增加，ACV01和ACV03多肽的IC50分别为0.0456μM和0.9353μM，最高抑制率接近100％.

实验例3：动物体内毒性试验

实验选用年龄3～5岁食蟹猴4只(购自海南金港生物技术股份有限公司)，雌雄各半，单次静脉给予0.25mg/kg的本发明的多肽化合物(ACV01 和ACV03)，给药浓度为0.1mg/ml，给药体积为2.5ml/kg，给药时间为 2min/只。

在给药第1天进行TK采血，采血时间点为给药前及给药后5min、 30min、1h、2h、4h、8h、24h，试验期间观察动物的死亡和濒死情况，临床症状，摄食量情况，在第2、3天采集血液样本进行血液学、血清生化学指标检测。

结果显示，4只食蟹猴静脉给药后体循环达到了良好的系统暴露量，且 ACV01和ACV03在食蟹猴体内有合理的药代动力学行为，给药后半衰期 (t1/2)约为0.9h，给药后24h内药物从体内全部清除。安全性方面，临床观察均未见明显异常，与自身给药前相比，血液学和血生化指标变化符合要求。因此，本发明的多肽化合物ACV01和ACV03经单次静脉给予食蟹猴，安全性良好，无毒性反应剂量(NOAEL)为0.25mg/kg，不存在雌雄差异。

制剂例1：ACV01吸入制剂1

制剂配方

制备方法：

(1)取总量40～80％的注射用水，水温控制在10～30℃并搅拌，缓慢加入称量的活性成分ACV01盐酸盐，搅拌溶解5min，调节pH至7-8。加入所述量的氯化钠，搅拌溶解5-10min，使溶液均一，之后调节溶液pH至 8.0-8.5。

(2)加注射用水至总体积(按密度称量)定容，必要时用盐酸或氢氧化钠将制剂pH调节至所述要求；

(3)将药液经0.45μm滤膜进行粗滤，后经0.22μm滤膜除菌过滤至暂存罐；后分装到2ml/瓶吸入容器中。随后可以选择性地包装并储存。

通过上述方法制备的吸入剂可采用药用雾化器雾化，使用者吸入雾化后的活性成分来接受给药。

制剂例2：ACV01制剂2

参考制剂例1的制备方法，制备如下组成的制剂：其中1mg/ml的 ACV01多肽盐酸盐，9mg/ml的氯化钠，1mg/ml的精氨酸，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至8.0～8.5，加注射用水至规定容量。

制剂例3：ACV01制剂3

参考制剂例1的制备方法，制备如下组成的制剂：1mg/ml的ACV01多肽盐酸盐，9mg/ml的氯化钠，5mg/ml的精氨酸。用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至8.0～8.5，加注射用水至规定容量。

制剂例4：ACV01制剂4

参考制剂例1的制备方法，制备如下组成的制剂：其中1mg/ml的 ACV01多肽盐酸盐，9mg/ml的氯化钠，0.05mg/ml的聚山梨酯80或20；用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至8.0～8.5，加注射用水至规定容量。

制剂例5：ACV01制剂5

参考制剂例1的制备方法，制备如下组成的制剂：其中1mg/ml的 ACV01多肽，9mg/ml的氯化钠，3mg/ml的聚山梨酯80或20。用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至8.0～8.5，加注射用水至规定容量。

制剂例6：ACV03吸入制剂1

制剂配方

制备方法：

(1)取总量40～80％注射用水，水温控制在10～30℃并搅拌，缓慢加入称量的ACV03醋酸盐，搅拌溶解5min，调节pH至7-8，加入氯化钠，搅拌溶解5-10min，使溶液均一，之后调节pH至8.0-8.5；

(2)加注射用水至总体积(按密度称量)，必要时使用醋酸或氢氧化钠将制剂pH调节至要求pH；

(3)药液经0.45μm滤膜进行粗滤，后经0.22μm滤膜除菌过滤至暂存；后分装到2ml/瓶吸入容器中。

通过上述方法制备的吸入剂可采用药用雾化器雾化，使用者吸入雾化后的活性成分来接受给药。

制剂例7：ACV03制剂2

参考制剂例6的制备方法，制备如下组成的制剂：其中1mg/mL的 ACV03多肽醋酸盐，9mg/mL的氯化钠，1mg/mL的精氨酸，用氢氧化钠或醋酸溶液调节pH至8.0～8.5，加注射用水至规定容量。

制剂例8：ACV03制剂3

参考制剂例6的制备方法，制备如下组成的制剂：其中1mg/mL的 ACV03多肽醋酸盐，9mg/mL的氯化钠，5mg/mL的精氨酸，用氢氧化钠或醋酸溶液调节pH至8.0～8.5，加注射用水至规定容量。

制剂例9：ACV03制剂4

参考制剂例6的制备方法，制备如下组成的制剂：1mg/mL的ACV03 多肽醋酸盐，9mg/mL的氯化钠，0.05mg/mL的聚山梨酯20或聚山梨酯80，用氢氧化钠或醋酸溶液调节pH至8.0～8.5，加注射用水至规定容量。

制剂例10：ACV03制剂5

参考制剂例6的制备方法，制备如下组成的制剂：1mg/mL的ACV03 多肽醋酸盐，9mg/mL的氯化钠，3mg/mL的聚山梨酯20或聚山梨酯80，用氢氧化钠或醋酸溶液调节pH至8.0～8.5，加注射用水至规定容量。

制剂实验例1：pH条件对ACV01制剂稳定性的影响

用注射用水配制ACV01的浓度为1mg/ml的溶液，并加入氯化钠，将溶液分为4组，用氢氧化钠溶液、稀盐酸溶液(如有必要)分别调节至表1 所示的pH，随后分别过滤，获得配方1～4的吸入制剂。

表1：配方1～4的pH

	配方1	配方2	配方3	配方4
					pH	pH 6.0	pH 7.5	pH8.0	pH 8.5

在2-8℃条件下放置1～3天，观察制剂性状变化，结果参见表2：

表2：配方1～4的溶液性状变化

由上表可见，配方2～4的吸入溶液均可在2～8℃条件下放置3天保持无色澄明，而配方1储存1天即出现析晶，表明pH大于6的所述ACV01制剂具有较好的稳定性。

制剂实验例2：氯化钠浓度对制剂稳定性的影响

用注射用水配制ACV01多肽溶液，并分别加入氯化钠，ACV01及氯化钠的浓度分别如表3所示，用氢氧化钠溶液、稀盐酸溶液(如有必要)调节 pH至7，并分别过滤，获得配方5～6的制剂。

表3：ACV01多肽盐及氯化钠的浓度

将上述配方制剂在2-8℃条件下放置1天，测定性状、活性成分含量及有关物质指标。

表4：制剂的稳定性及渗透压结果

由上表可见，2-8℃下放置1天后，两组溶液性状均保持无色澄明，配方 5的有关物质微量增加(约0.2％)，配方6的有关物质含量基本未增加，说明这两组都具有较好的稳定性。

制剂实验例3：pH条件对ACV03制剂稳定性的影响

用注射用水配制ACV03多肽盐的浓度为1mg/ml的溶液，并加入氯化钠得到溶液。将溶液分为2组，用氢氧化钠溶液、醋酸溶液(如有必要)分别将两组的pH调节到6.0和8.0，并分别过滤，获得吸入制剂7和8。

在冷藏条件下将配方7和8的制剂存放4天，测定活性成分ACV03的含量，并与0天时的所述活性成分含量对比，计算活性成分含量峰面积变化率。

表5：pH对稳定性的影响

由上表可见，对于ACV03制剂而言，pH为8.0下的所述制剂的稳定性明显优于pH为6.0的配方制剂。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川科伦博泰生物医药股份有限公司

<120> 用于抗冠状病毒感染的多肽药物及其方法和应用

<130> IDC200052

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ACV01

<400> 1

Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile

1 5 10 15

Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp

20 25 30

Leu Gln Glu Leu

35

<210> 2

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ACV02

<400> 2

Ser Leu Asp Gln Ile Asn Val Thr Phe Leu Asp Leu Glu Tyr Glu Met

1 5 10 15

Lys Lys Leu Glu Glu Ala Ile Lys Lys Leu Glu Glu Ser Tyr Ile Asp

20 25 30

Leu Lys Glu Leu

35

<210> 3

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ACV03

<400> 3

Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Glu Glu Ile

1 5 10 15

Asp Arg Leu Glu Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp

20 25 30

Leu Gln Glu Leu

35

<210> 4

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ACV04

<400> 4

Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Glu Glu Ile

1 5 10 15

Lys Arg Leu Glu Glu Val Ala Lys Glu Leu Asn Lys Ser Leu Ile Asp

20 25 30

Leu Gln Glu Leu

35

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ACV05

<400> 5

Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile

1 5 10 15

Ala Val Glu Gln

20

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ACV06

<400> 6

Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp

1 5 10 15

Gln Leu Thr Pro

20

Claims (21)

1.能够抑制冠状病毒感染的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，包含：

(1)如SEQ ID NO:1，3-6任一氨基酸序列所示的多肽；

(2)与(1)所示多肽具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)的多肽；或者

(3)与(1)所示多肽具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽。

2.根据权利要求1所述的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，所述多肽具有如下的氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO:1，3-6任一所示的氨基酸序列；

(2)与(1)所示序列具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或9个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或者

(3)与(1)所示序列具有至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的序列。

3.根据权利要求1或2所述的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，其包含如SEQ ID NO:1，3-6任一氨基酸序列所示的多肽。

4.根据权利要求1-3任一所述的多肽及其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，其多肽具有如SEQ ID NO:1，3-6任一所示的氨基酸序列；

优选的，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，3-6任一所示。

优选的，所述多肽的氨基酸序列以SEQ ID No：1为基础，在其第14，17，18，20，21，25和28位中至少含有一个，两个，三个，四个，五个，六个或七个突变，所述突变后的氨基酸选自：K(Lys)，R(Arg)，E(Glu),D(Asp)。

5.分离的核酸分子，其编码权利要求1-4任一项所述的任一多肽；

可选的，所述分离的核酸分子包含与异源启动子可操作性连接的编码权利要求1-4任一项所述的任一多肽的核苷酸序列。

6.载体，其包含权利要求5所述的分离的核酸分子；

优选的，所述载体为克隆载体或表达载体；更有选的，所述载体是质粒，粘粒，噬菌体。

7.宿主细胞，其包含权利要求5所述的分离的核酸分子或权利要求6所述的载体；

优选的，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；更有选的，所述原核细胞是大肠杆菌细胞，所述真核细胞是酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞、小鼠细胞、人细胞等)。

8.制备权利要求1-4任一所述多肽的方法，所述方法包括基因工程表达的方式或化学合成的方式制备。

9.根据权利要求8所述的方法，所述基因工程表达的方式包括将编码多肽的的DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，在允许所述多肽表达的条件下，培养宿主细胞，从培养的宿主细胞培养物中回收所述多肽；

优选的，所述回收还可以包括通过免疫亲和纯化等方式来纯化多肽的步骤。

10.根据权利要求8所述的方法，所述化学合成的方式包括固相方法合成多肽，溶液中合成多肽或酶促合成多肽，或其任意组合。

11.根据权利要求8所述的方法，所述化学合成的方式包括如下步骤：

(1)将树脂固相载体和Fmoc保护的碳端第一个氨基酸(如Fmoc-AA-OH)偶联，得到Fmoc-AA-树脂后，脱除Fmoc保护基，得到H-AA-树脂；

(2)通过固相合成法，在偶联剂系统的存在下，按多肽氨基酸序列由碳端向氮端依次将保护氨基酸偶联到H-AA-树脂上，制备得到线性多肽的肽树脂；

(3)线性多肽的肽树脂经裂解，制得多肽；

优选的，步骤(1)中所述脱除Fmoc保护基的试剂由体积比为1:1～10的哌啶和DMF组成；更优选地，所述脱除Fmoc保护基的试剂由体积比为1:4的哌啶和DMF组成；

优选的，步骤(1)固相合成在Wang树脂或2-氯三苯甲基树脂上进行；更优选地，所述Wang树脂取代度为0.4～1.0mmol/g；所述2-氯三苯甲基树脂取代度为0.4-1.1mmol/g；

优选的，步骤(2)中所述的偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自HBTU/DIEA、HATU/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、HCTU/NMM、HATU/HOAt/DIEA、TBTU/DIEA、HOBt/DIC、HOAt/DIC、Cl-HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、PyAOP/HOBt/DIEA和Oxyma/DIC中的一种或多种，所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP和DMSO中的一种或多种；更优选地，所述缩合剂为HOBt/DIC，反应溶剂为DMF；

优选的，步骤(3)所述的裂解采用的裂解试剂是由TFA、TIS、H₂O、EDT、苯甲硫醚、苯酚和对甲苯酚中的2种或2种以上组成的混合溶液；更优选地，所述的裂解试剂由体积比为90～95:1～5:1～5:1～5的TFA、TIS、H₂O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为74～96:1～7:1～7:1～7：1～5的TFA、TIS、H₂O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为85～95:1～5:2～8:2～8的TFA、TIS、H₂O和对甲苯酚组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为85～95:1～5:2～8:2～8的TFA、TIS、H₂O和苯甲硫醚组成的混合溶液；更优选地，所述的裂解试剂由体积比为92:4:2:2的TFA、TIS、H₂O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为82.5：5：5：5：2.5的TFA、苯酚、苯甲硫醚、H₂O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为88:2:5:5或90:2:5:3的TFA、TIS、H₂O和对甲苯酚组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为88:2:5:5的TFA、TIS、H₂O和苯甲硫醚组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为95:5的TFA和H₂O组成的混合溶液。

12.药物组合物，其包含权利要求1-4任一所述的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体；可选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂；

优选的，所述药物组合物包含SEQ ID No.1，3-6中任一种或多种多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体；

优选地，所述药物组合物包含SEQ ID No.1，3-6中至少两种、至少三种、至少四种或至少五种多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体。

13.根据权利要求12的药物组合物，该组合物还包含另外药学活性剂；

优选的，所述另外的药物活性剂包含抗病毒药物、免疫治疗药物和/或抗生素；

更优选的，所述药学活性剂选自ACE抑制剂，ARB，利巴韦林，克力芝(Aluvia)，瑞德西韦(Remdesivir),阿昔洛韦，恩夫韦地(enfuvirtide)，齐多夫定，利托那韦，阿比朵尔(Arbido)，洛匹那韦，Methylprednisolone或其任意组合。

14.根据权利要求12或13的药物组合物，该组合物的剂型选自片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂；

优选的，所述组合物的剂型为吸入剂或喷雾剂。

15.一种药物制剂，其为液体制剂(例如作为供雾化器用的液体制剂)，包含权利要求1-4任一所述的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，渗透压调节剂，pH调节剂和注射用水；

优选的，所述液体制剂含有0.05-5mg/mL的多肽活性成分(更优选1mg/mL的多肽活性成分)，1-9mg/mL的渗透压调节剂，pH调节剂和注射用水；

更优选的，所述液体制剂中多肽活性成分为ACV01或ACV03多肽，渗透压调节剂为氯化钠，pH调节剂为盐酸、醋酸或氢氧化钠，和/或，pH为7.0-9.0(优选为7.5-8.5，更优选为8.0-8.5)；

更优选的，所述液体制剂含有：1mg/mL的ACV01多肽，9mg/mL的氯化钠，用盐酸或氢氧化钠调pH至8.0-8.5，加注射用水至规定容量；

更优选的，所述液体制剂含有：1mg/mL的ACV03多肽，9mg/mL的氯化钠，用醋酸或氢氧化钠调pH至8.0-8.5，加注射用水至规定容量。

16.根据权利要求15的药物制剂，其中所述药物制剂还包括助溶剂；

优选的所述助溶剂为精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺或聚山梨酯类(如聚山梨酯20或80)；

优选的，所述药物制剂含有0.05-5mg/mL的多肽活性成分，1-9mg/mL的渗透压调节剂，0.05-100mg/mL的助溶剂，pH值调节剂和注射用水；

更优选的，所述多肽活性成分为ACV01或ACV03多肽，渗透压调节剂为氯化钠，pH调节剂为盐酸、醋酸或氢氧化钠，助溶剂为精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺或聚山梨酯类(如聚山梨酯20或80)，和/或pH为7.0-9.0(优选为7.5-8.5，更优选为8.0-8.5)；

更优选的，所述药物制剂含有：1mg/mL的ACV01多肽或ACV03多肽，9mg/mL的氯化钠，1mg/mL或5mg/mL的精氨酸，用氢氧化钠或醋酸溶液调节pH至8.0-8.5，加注射用水至规定容量；

更优选的，所述药物制剂含有：1mg/mL的ACV01多肽或ACV03多肽，9mg/mL的氯化钠，0.05mg/mL或3mg/mL的聚山梨酯80或聚山梨酯20，用氢氧化钠或醋酸溶液调节pH至8.0-8.5，加注射用水至规定容量。

17.根据权利要求15或16的药物制剂，所述制剂进一步含有1-50mg/mL的甘露醇、山梨醇、蔗糖或乳糖，经冻干形成粉剂。

18.一种抑制冠状病毒与细胞的融合的方法，所述方法包括向需要的对象(如人)或细胞(如人体细胞)施用有效量的权利要求权利要求1-4任一项所述的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，或权利要求12-14任一项所述的药物组合物，或权利要求15-17任一项的药物制剂；

优选的，所述冠状病毒是SARS-CoV，MERS-CoV或SARS-CoV-2；

更优选的，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。

19.一种用于在对象(如人)中预防和/或治疗冠状病毒感染相关的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的权利要求1-4任一项所述的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，或权利要求12-14任一项所述的药物组合物，或权利要求15-17任一项的药物制剂；

优选的，所述冠状病毒是SARS-CoV，MERS-CoV或SARS-CoV-2；

优选的，所述冠状病毒感染相关的疾病为COVID-19或中东呼吸综合征(MERS)或重症急性呼吸综合征(SARS)；

更优选的，所述冠状病毒是SARS-CoV-2；

更优选的，所述冠状病毒感染相关的疾病是COVID-19。

20.权利要求1-4任一项所述的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，或权利要求12-14任一项所述的药物组合物，或权利要求15-17任一项的药物制剂用于制备药物的用途，所述药物用于抑制冠状病毒与细胞的融合，或用于在对象(如人)中预防和/或治疗冠状病毒感染相关的疾病；

优选的，所述冠状病毒是SARS-CoV，MERS-CoV或SARS-CoV-2；

优选的，所述冠状病毒感染相关的疾病为COVID-19或中东呼吸综合征(MERS)或重症急性呼吸综合征(SARS)；

更优选的，所述冠状病毒是SARS-CoV-2；

更优选的，所述冠状病毒感染相关的疾病是COVID-19。

21.包含权利要求1-4任一项所述的多肽或其衍生物、立体异构体、药学上可接受的盐或功能等价的变体，或权利要求12-14任一项所述的药物组合物，权利要求15-17任一项的药物制剂的施药容器；

优选的所述施药容器为注射装置或气雾吸入装置或喷雾装置。

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