KR20100080812A

KR20100080812A - 치료용 항-ｈｉｖ 펩티드의 합성 방법

Info

Publication number: KR20100080812A
Application number: KR1020107008986A
Authority: KR
Inventors: 브라이언 엘. 브레이; 바바라 이. 존스턴; 스티븐 이. 슈네이더; 니콜라이 아. 트베르뫼스; 후이 장; 폴 이. 프리드릭
Original assignee: 트라이머리스, 인코퍼레이티드
Priority date: 2007-09-25
Filing date: 2008-09-25
Publication date: 2010-07-12
Also published as: CA2700354A1; EP2201028A2; US20100261876A1; WO2009042194A2; MX2010003179A; WO2009042194A3; JP2010540528A; CN101874038A; BRPI0817697A2

Abstract

펩티드의 합성 방법이 본원에서 제공된다. 특히, 치료용 항바이러스 펩티드의 합성 방법이 본원에서 제공된다.

Description

치료용 항-ＨＩＶ 펩티드의 합성 방법 {METHODS OF SYNTHESIS FOR THERAPEUTHIC ANTI-HIV PEPTIDES}

관련 출원에 관한 교차 참조

본 출원은 미국 가출원 번호 60/995,318 (2007년 9월 25일 출원)을 우선권으로 청구하고, 이는 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.

기술 분야

펩티드, 펩티드를 포함하는 조성물, 및 펩티드의 합성 방법이 본원에서 제공된다. 치료제의 투여 방법이 또한 제공된다. 특히, 서열 9 (TRI-1144) 및 유사 펩티드의 합성 방법이 본원에서 제공된다. 이같은 방법들은 고체 및 액체 상 합성 절차를 사용하여, 관심 펩티드가 산출되도록 특정 펩티드 단편의 군을 합성하고 조합한다. 관심 펩티드, 예를 들어, 서열 9의 합성에서 중간체로서 예를 들어 작용하는 개별적인 펩티드들이 본원에서 또한 제공된다. 전장 서열 9 및 유사 펩티드가 생산되도록 함께 사용될 수 있는 펩티드들의 군이 본원에서 추가로 제시된다.

배경기술

펩티드 전달 시스템

펩티드 제품에는 질환의 예방 및 치료를 위한 치료제 및/또는 예방제로서의 광범위한 용도가 있다. 이같은 펩티드 제품은, 예를 들어, 호르몬, 효소 및 면역조정제 (예를 들어, 항체, 혈청 단백질 및 사이토카인)과 같은 다양한 카테고리에 속한다.

펩티드가 환자에서 이의 적합한 생물학적 및 치료적 영향을 나타내기 위해서는, 생체 내의 이의 작용 부위에서 적합한 농도로 존재하여야 한다. 더욱 구체적으로, 임의의 특정 화합물 (임의의 특정 펩티드 포함)의 약동학은 생체 내에서의 이러한 화합물의 생체이용률, 분포 및 소거율에 좌우된다. 그러나, 펩티드의 화학적 성질 및 특성, 예컨대 크기, 복합도, 형상 필요조건 및 용해도 프로파일은 펩티드의 약동학적 프로파일이 다른 화합물의 약동학적 프로파일에 비해 차선이도록 하는 경향이 있다.

따라서, 치료제의 생체이용률 및 반감기 양쪽 모두가 증가되도록 치료제 예컨대 펩티드를 투여하는 방식을 개발해 보기 위해 당업계에서 상당한 노력이 있었다. 이와 관련하여 진전이 이루어졌으나, 원하는 약동학적 프로파일이 있는 펩티드 치료제를 전달하는데 유용한 추가적인 조성물이 당업계에서 여전히 요구된다. 본원에서 제공되는 조성물 및 방법이 이러한 요구를 다룬다.

발명의 개요

환자에게 생체활성 분자를 투여하는데 예를 들어 사용될 수 있는 조성물, 및 이러한 조성물의 합성 방법이 본원에서 제공된다. 구체적으로, 용매, 젤화 물질 및 생체활성 분자, 예컨대 항바이러스 펩티드를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 항바이러스 펩티드가 포함되는 조성물을 생산하기 위한 선형 합성, 2-단편 및 3-단편 접근법을 포함하는 합성 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 이론에 제한되지 않으면서, 본원에서 제공되는 실시양태들은, 적어도 부분적으로, 대상에게의 투여 시 바람직한 약동학적 프로파일을 나타내면서 증가된 중량 백분율의 생체활성 분자가 조성물 내에 혼입될 수 있다는 뜻밖의 발견을 기초로 한다. 본원에서 제공되는 실시양태들은, 적어도 부분적으로, 합성 방법으로부터의 뜻밖의 결과, 예를 들어, 치수 예컨대 확장성 및 순도에 대한 결과를 기초로 한다.

한 실시양태에서, 환자에게의 투여 시, 본원에서 제공되는 조성물은 C_max에 신속하게 (예를 들어, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 28시간, 32시간, 36시간 또는 48시간 이내에) 도달하는 생체분자의 혈장 농도를 산출한 후, 5일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일 또는 28일 동안 또는 이보다 길게 생체분자의 비교적 일정한 혈장 농도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물에 대한 바람직한 약동학적 성질은 더 낮은 C_max, 더 긴 t_max 및 더 긴 t₀ _.01 또는 t₀ _.1이다.

본원에서 제공되는 조성물은, 예를 들어, T20 (서열 2), T1249 (서열 57), T897 (서열 58), T2635 (서열 5), T999 (서열 59) 및 T1144 (서열 9)로 지칭되는 특정 항바이러스 펩티드, 또는 이러한 펩티드들 중 2개 이상의 조합물, 뿐만 아니라 T20 (서열 2), T1249 (서열 57), T897 (서열 58), T2635 (서열 5), T999 (서열 59) 및 T1144 (서열 9) 펩티드의 유도체를 포함하는 조성물을 투여하는데 유용하다.

한 실시양태에서, 조성물은 용매, 용매-피하액(subcutaneous fluid) 교환 시 매트릭스를 형성하는 젤화 물질, 및 하나 이상의 생체활성 분자, 예를 들어, 항바이러스 펩티드 예컨대 T20 (서열 2), T1249 (서열 57), T897 (서열 58), T2635 (서열 5), T999 (서열 59) 및 T1144 (서열 9) 또는 이들의 유도체를 포함한다.

또다른 실시양태에서, 이같은 조성물은 하나 이상의 추가 성분 예컨대 제약상 허용가능한 담체, 거대분자, 또는 이들의 조합물을 더 포함한다. 또다른 실시양태에서, 이같은 조성물은 상기 열거된 항바이러스 펩티드에 더하여 항바이러스제를 더 포함할 수 있다.

본원에서 제공되는 조성물을 사용하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 한 실시양태에서, 조성물은 치료 요법, 예를 들어, 항바이러스 치료 요법의 일환으로서 사용된다. 특정 실시양태에서, 이같은 치료 요법은, 예를 들어, HIV 감염, 예를 들어, HIV-1 감염의 치료법에 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 표적 세포가 HIV에 의한 세포의 감염을 억제하는데 효과적인 양의 활성 작용제, 예를 들어, 항바이러스 펩티드 및/또는 또다른 항바이러스제와 접촉되도록 상당량의 본원에서 제공되는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 표적 세포에 대한 HIV의 전파를 억제하기 위해 본원에서 제공되는 조성물을 사용하는 방법이 본원에서 제공된다.

HIV 감염을 치료하는데 효과적인 양으로 본원에서 제공되는 조성물을 HIV-감염 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, HIV 감염 (한 실시양태에서, HIV-1 감염)의 치료 방법이 본원에서 또한 제공된다.

유효량의 생체활성 분자, 예컨대 항바이러스 펩티드를 함유하는 조성물을 HIV 감염의 치료법에서 사용하기 위한 의약 (예를 들어, HIV의 전파를 억제하는 방법, HIV 융합을 억제하는 방법, 및/또는 HIV 감염을 치료 또는 억제하는 방법에서 사용됨)의 제작에서 사용하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다.

본원에서 제공되는 조성물 및 방법의 상기 및 기타 목적, 특색, 및 장점이 첨부된 도면와 함께 독해될 때 하기의 상세한 설명에서 명백할 것이다.

도면의 간단한 설명
도 1은 헵타드(heptad) 반복 1 영역 (HR1), 및 주지된 류신 지퍼-유사 모티프 INNYTSLI를 포함하는 헵타드 반복 2 영역 (HR2)를 gp41의 또다른 기능성 영역과 함께 나타내는 HIV-1 gp41의 개략도이다. HR1 및 HR2에 상응하는 예시적인 천연 아미노산 서열, 및 아미노산 위치 번호매김이 설명의 목적으로, 그리고 gp160, 균주 HIV_IIIB와 관련되어 제시된다.
도 2는 설명의 목적을 위한 것이고 제한적이지 않은, HIV-1 gp41의 HR2 영역 내에 함유된 천연 아미노산 서열들의 비교를 나타내고, 이는 다양한 실험 균주 및 임상 단리물로부터 결정되였으며, 이때 단일 문자 아미노산 코드에 의해 지시되는 바와 같이 아미노산 서열에서의 약간의 변동 (예를 들어, 다형성)이 도해된다. 예시의 목적으로, 가장 위쪽의 단리물 서열 내의 아미노산 서열 INNYTSLI와 정렬되는 단리물 서열이 HR2 류신 지퍼-유사 모티프에 상응한다.
도 3은 2개의 펩티드 단편의 어셈블리(assembly)를 수반하는 단편 축합 접근법을 사용하는, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 펩티드의 합성을 나타내는 개략도이다.
도 4는 링크(rink)-로딩(loaded) CTC 2-단편 축합 어셈블리 전략을 사용하는, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 펩티드의 합성을 나타내는 개략도이다.
도 5는 지베르(Sieber) 수지의 사용을 2-단편 축합 접근법에 적용하는, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드의 합성을 나타내는 개략도이다.
도 6은 2개의 펩티드 단편의 어셈블리를 수반하는 접근법에서 Glu-측쇄 로딩 수지를 사용하는, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드의 합성을 나타내는 개략도이다.
도 7은 3개의 펩티드 단편의 어셈블리를 수반하는 단편 축합 접근법을 사용하는, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드-서열 9의 합성을 나타내는 개략도이다.
도 8은 2개의 펩티드 단편의 어셈블리를 수반하는 단편 축합 접근법을 사용하는, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드-서열 9의 합성을 나타내는 개략도이다.
도 9는 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 432시간의 기간에 걸친 사이노몰구스 원숭이에서의 T1144 혈장 농도의 플롯(plot)을 나타낸다: 74:11:15 SAIB:PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (89％ 펩티드)의 100 ㎎/g 현탁액 1000 ㎕ (--◆--) 및 40:60 PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (60％ 펩티드)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--).
도 10은 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: 74:11:15 SAIB:PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (89％ 펩티드)의 100 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--) 및 40:60 PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (60％ 펩티드)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--).
도 11은 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 80:0:20 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (89％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 75:5:20 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (89％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--), 및 65:15:20 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (89％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--▲--).
도 12는 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 85:0:15 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 및 74:11:15 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--).
도 13은 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 70:10:20 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 및 75:5:20 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--).
도 14는 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 70:10:20 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 및 74:11:15 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--).
도 15는 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 75:5:20 SAIB:PLA3M:트리아세틴 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 75:5:20 SAIB:PLA3M:벤질 벤조에이트 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--), 및 75:5:20 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--▲--).
도 16은 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 75:5:20 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 75:5:20 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 75 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--), 및 75:5:20 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 100 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--▲--).
도 17은 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 77:15:8 SAIB:NMP:에탄올 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (88％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 77:15:8 SAIB:NMP:에탄올 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (88％ 펩티드, 2％ 아연)의 100 ㎎/g 현탁액 200 ㎕ (--■--), 74:11:15 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 100 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◇--), 및 74:11:15 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 100 ㎎/g 현탁액 200 ㎕ (--□--).
도 18은 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 75:5:20 SAIB:PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (89％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 및 75:5:20 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (89％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--).
도 19는 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 75:5:20 SAIB:PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 75:5:20 SAIB:PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (89％)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--), 75:5:20 SAIB:PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전 (73％)되고 ZnSO₄ 용액 내에 슬러리화 (70％)된 T1144의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--▲--), 75:5:20 SAIB:PLA3L:NMP 내의 분무 건조 (89％)되고 ZnSO₄ 용액 내에 슬러리화 (66％)된 T1144의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--○--), 75:5:20 SAIB:PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전 (88％)되고 ZnSO₄ 용액 내에 슬러리화 (71％)된 T1144의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--*--), 및 75:5:20 SAIB:PLA3L:NMP 내의 분무 건조 (89％)되고 ZnSO₄ 용액 내에 슬러리화 (65％)된 T1144의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--×--).
도 20은 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 432시간의 기간에 걸친 사이노몰구스 원숭이에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3.5 ㎎/㎖ 용액 800 ㎕ (―), 75:5:20 SAIB:PLA3M:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (89％)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 74:11:15 SAIB:PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (89％)의 100 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--), 및 74:11:15 SAIB:PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (89％)의 100 ㎎/g 현탁액 1000 ㎕ (--▲--).
도 21은 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 40:60 PLGA1A:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (89％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 60:40 PLGA1A:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (89％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--), 및 40:60 PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (88％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--▲--).
도 22는 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 50:50 PLGA1A:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 40:60 PLGA1A:트리아세틴 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--), 40:60 PLGA3A:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--▲--) 및 40:60 PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--○--).
도 23은 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 50:50 PLGA1A:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 50:50 PLGA1A:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (73％ 펩티드, 2％ 아연)의 100 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--), 40:60 PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (91％ 펩티드, 2％ 아연)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◇--), 40:60 PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (91％ 펩티드, 2％ 아연)의 100 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--□--), 및 40:60 PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (90％ 펩티드, 2％ 아연)의 200 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--△--).
도 24는 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 40:60 PLA3L:NMP 내의 분무 건조에 의해 제조된 T1144의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--) 및 40:60 PLA3L:NMP 내의 MeOH에서 pH 침전된 T1144 (88％ 펩티드)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (-■--).
도 25는 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 40:60 PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (60％)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 40:60 PLA3L:NMP 내의 세정된 T1144 (94％)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--), 40:60 PLA3L:NMP 내의 ZnSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (88％)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--▲--) 및 40:60 PLA3L:NMP 내의 MeOH/H₂O로부터 침전된 T1144 (91％)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--○--).
도 26은 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 래트에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 40:60 PLA3L:NMP 내의 CaCl₂ 용액에 의해 침전된 T1144 (29％)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 40:60 PLA3L:NMP 내의 CaCl₂ 용액에 의해 침전된 T1144 (53％)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--), 40:60 PLA3L:NMP 내의 FeSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (88％)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--▲--), 및 40:60 PLA3L:NMP 내의 FeSO₄ 용액에 의해 침전된 T1144 (91％)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--○--).
도 27은 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 432시간의 기간에 걸친 사이노몰구스 원숭이에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3.5 ㎎/㎖ 용액 800 ㎕ (―), 40:60 PLGA1A:NMP 내의 아연 용액에 의해 침전된 T1144 (89％)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--◆--), 및 40:60 PLA3L:NMP 내의 아연 용액에 의해 침전된 T1144 (60％ 펩티드)의 50 ㎎/g 현탁액 400 ㎕ (--■--).
도 28은 하기의 조성물로 투여된 T1144에 대한 투약 후 168시간의 기간에 걸친 사이노몰구스 원숭이에서의 T1144 혈장 농도의 플롯을 나타낸다: T1144의 3 ㎎/㎖ 용액 1200 ㎕ (―), 40:60 PLA3L:NMP 내의 침전물 H의 현탁액 400 ㎕ (--□--), 40:60 PLA3L:NMP 내의 침전물 J의 현탁액 400 ㎕ (--◇--), 40:60 PLA3L:NMP 내의 침전물 M의 현탁액 400 ㎕ (--◆--) 및 40:60 PLA3L:NMP 내의 침전물 N의 현탁액 400 ㎕ (-■-).
도 29는 SAIB:PLA:NMP 최적화 래트 제약 ("PK") 연구 #526에서의 원위치 형성(forming) 젤의 결과를 나타낸다. 래트 혈장 내의 TRI-1144 농도. 803-003-A: SAIB:PLA3L:NMP (74:11:15) 내에 현탁된 황산아연에 의해 침전된 TRI-1144 100 ㎎/g; 803-003-B: SAIB:PLA3L:NMP (65:15:20) 내에 현탁된 황산아연에 의해 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 803-003-C: SAIB:PLA3L:NMP (70:15:15) 내에 현탁된 황산아연에 의해 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 803-003-D: SAIB:PLA3L:NMP (75:5:20) 내에 현탁된 황산아연에 의해 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g.
도 30은 SAIB:PLA:NMP 및 PLGA:NMP 비교 래트 PK 연구 #526에서의 원위치 형성 젤의 결과를 나타낸다. 래트 혈장 내의 TRI-1144 농도. 803-010-A: SAIB:PLA3L:NMP (75:5:20) 내에 현탁된 과량의 황산아연으로 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 803-010-E: SAIB:PLA3L:NMP (75:5:20) 내에 현탁된 황산아연으로 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 803-010-F: PLA3L:NMP (40:60) 내에 현탁된 과량의 황산아연으로 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g.
도 31은 PLGA 최적화 원숭이 PK 연구 #527에서의 원위치 형성 젤의 결과를 나타낸다. 원숭이 혈장 내의 TRI-1144 농도. 0782-096: (50:50)PLA3L:NMP (40:60) 내에 현탁된 과량의 황산아연의 첨가에 의해 물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 803-020: SAIB:PLA3L:NMP (75:11:15) 내에 현탁된 과량의 황산아연의 첨가에 의해 물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g.
도 32는 PLGA 최적화 래트 PK 연구 #530 및 531에서의 원위치 형성 젤의 결과를 나타낸다 . 래트 혈장 내의 TRI-1144 농도. 0782-099: PLA3L:NMP (40:60) 내에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 0782-102: PLA3L:NMP (40:60) 내에 현탁된 과량의 황산아연의 첨가에 의해 물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g.
도 33은 PLGA 최적화 래트 PK 연구 #552에서의 원위치 형성 젤의 결과를 나타낸다. 래트 혈장 내의 TRI-1144 농도. 803-050-1: ((50:50)PLGA 2A):NMP (40:60)에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 803-050-3: ((50:50)PLGA2.5A):NMP (40:60)에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 803-050-4: ((50:50)PLGA 3A):NMP (40:60)에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g.
도 34는 PLA-PEG 1500 및 PLGA-PEG 1500 공중합체:NMP 래트 PK 연구 #553에서의 원위치 형성 젤의 결과를 나타낸다. 래트 혈장 내의 TRI-1144 농도. 803-051-2: ((65:35)PLGA-PEG1500):NMP (40:60) 내에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 803-051-3: PLA3L-PEG1500:NMP (40:60) 내에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 803-0514: PLA3L:NMP (40:60) 내에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g.
도 35는 용매 비율 및 PLA/NMP 최적화 PK 연구 #560을 나타낸다. 래트 혈장 내의 TRI-1144 농도. 803-072-8: PLA3L:NMP (40:60) 내에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 803-072-9: PLA3L:NMP (30:70) 내에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 803-072-10: (50:50PLGA3A):NMP (40:60) 내에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g.
도 36은 용매 최적화 PK 연구 #561을 나타낸다. 래트 혈장 내의 TRI-1144 농도. 803-073-3: (PLA3L:((NMP:PEG400 (50:50))) (30:70) 내에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 803-073-4: (PLA3L:((NMP:PEG400(50:50))) (40:60) 내에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 803-073-5: (PLA3L:((NMP:프로필렌 글리콜 (70:30))) (40:60) 내에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g.
도 37은 PLGA 부위 소거율 PK 연구 #585의 결과를 나타낸다. 래트 혈장 내의 TRI-1144 농도. 782-165-1: (50:50 PLGA2.5A:(((NMP:PEG400 (50:50))) (40:60) 내에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 782-165-2: (50:50 PLGA2A:((NMP:PEG400 (50:50))) (40:60) 내에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g; 782-165-3: (50:50 PLGA1A:((NMP:PEG400(50:50))) (40:60) 내에 현탁된 황산아연의 첨가에 의해 50:50 메탄올:물로부터 침전된 TRI-1144 50 ㎎/g.

상세한 설명

정의

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "환자"는 포유동물, 예컨대 인간을 의미한다. 특정 실시양태에서, "환자"는 본원에 개시된 질환 또는 장애, 예컨대 HIV 또는 AIDS의 치료를 필요로 하는 포유동물, 예컨대 인간이다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "표적 세포"는 HIV에 감염될 수 있는 세포를 의미한다. 한 실시양태에서, 세포는 인간 세포(들)이고; 또다른 실시양태에서, 세포는 막 융합이 포함되는 프로세스를 통해 HIV에 감염될 수 있는 인간 세포(들)이다. 또다른 실시양태에서, 세포는 환자, 예컨대 인간 환자 내에 존재한다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "조성물"은 용매, 젤화 물질 및 생체활성 분자, 예컨대 항바이러스 펩티드를 포함하는 제형을 의미한다. 예시적인 조성물들이 본원에서 기술된다. 본원에서 제공되는 조성물은, 예를 들어, 의약으로 사용될 수 있거나 의약을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "용매"는 수-혼화성 액체를 의미한다. 한 실시양태에서, 용매는 수-혼화성 액체이고, 공용매(co-solvent), 예를 들어, NMP와 조합되어 사용된다. 용매는, 예를 들어, 젤화 물질을 환자 내로의 주사를 허용하도록 충분히 희석하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 용매들이 본원에서 기술되고, 당업자에게 공지되어 있다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "젤화 물질"은 용매 및 젤화 물질을 포함하는 조성물 내에 존재하는 경우에 용매-피하액 교환, 즉 용매-환자의 피하액 교환 시 매트릭스를 형성하는 용매-혼화성 물질을 의미한다. 예시적인 젤화 물질들이 본원에서 기술되고, 당업자에게 공지되어 있다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "매트릭스"는 용매-피하액 교환 후에 젤화 물질이 취하는 생체분해성 또는 생체부식성 형태를 의미한다. 한 실시양태에서, 매트릭스는 점성인 (즉, 전단에 대해 저항성인) 매트릭스이다. 또다른 실시양태에서, 매트릭스는 젤이다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "비히클(vehicle)"은 생체활성 분자 (예를 들어, 펩티드, 예컨대 항바이러스 펩티드)를 환자에게 전달하도록 사용될 수 있는 용매 및 젤화 물질을 포함하는 액체 물질을 의미한다. 비히클은 수성 상태로 보관될 수 있다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "제약상 허용가능한 담체"는 자신이 첨가되는 활성 성분 (예를 들어, HIV 융합 억제제 펩티드)의 생물학적 활성을 유의하게 변경시키지 않는 담체 매질을 의미한다. 제약상 허용가능한 담체에는 물, 완충수, 염수, 0.3％ 글리신, 수성 알코올, 등장성 수용액 중 하나 이상이 포함되지만, 이에 한정되지 않고; 글리세롤, 오일, 염, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 암모늄, 포스포네이트, 카르보네이트 에스테르, 지방산, 당류 (예를 들어, 만니톨), 다당류, 중합체, 부형제, 및 방부제 및/또는 안정화제와 같은 하나 이상의 물질이 더 포함될 수 있다 (저장 기간을 증가시키기 위해, 또는 조성물의 제작 및 유통에 필요하고 적합한 경우). 한 실시양태에서, 제약상 허용가능한 담체는 근육내, 피하 또는 비경구 투여에 적절하다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해, 그리고 HIV 융합 억제제 펩티드와 관련되어, 용어 "이소류신 또는 류신을 포함하는 아미노산"이 의미하는 것은, 달리 명확하게 지적되지 않는 한, 각각 이소류신 또는 류신, 또는 이들 각각의 천연 발생 아미노산 (예를 들어, L-아미노산), 비-천연 발생 아미노산 (예를 들어, D-아미노산), 이성체 형태 (예를 들어, 노르류신, 알로(allo)-이소류신 등) 또는 유도체 형태 (예를 들어, tert-류신)을 지칭하는 것이다. 하나의 형태의 아미노산 이소류신 또는 류신이 다른 형태의 아미노산을 배제하고 사용될 수 있다. 본원에 기술된 HIV 융합 억제제 펩티드는, 이들의 아미노산 서열 내에, 이소류신 또는 류신을 포함하는 아미노산이 포함되도록 본원에 교시된 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에서를 제외하고, 각각이 유래되는 HIV gp41의 HR2 영역의 서열에서 발견되는 하나 이상의 다형성을 또한 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 2 참조).

용어 "HIV"는 인간 면역결핍 바이러스를 지칭하고, 한 실시양태에서는 HIV-1를 지칭한다.

생체활성 분자, 예를 들어, 항바이러스 펩티드 예컨대 HIV 융합 억제제 펩티드, 또는 펩티드 단편과 관련하여 사용되는 경우의 용어 "단리된"은 생체활성 분자 자체의 일체형 구조의 일부가 아닌 성분이 실질적으로 없음, 예를 들어, 생물학적, 생화학적 또는 화학적 프로세스를 사용하여 화학적으로 합성, 생산 또는 변형된 경우 화학적 전구물질 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없음을 의미한다. 특정 실시양태에서, 단리된 생체활성 분자는 약 75 중량％, 80 중량％, 85 중량％, 90 중량％, 95 중량％, 97 중량％, 99 중량％ 또는 99.9 중량％를 초과하여 순수하다.

HIV 융합 억제제 펩티드와 관련하여 사용되는 경우의 용어 "1개 내지 3개 사이의 아미노산 치환"은 (a) 1개를 초과하는 류신 지퍼-유사 모티프 및 류신 지퍼-유사 모티프를 형성하는데 필요한 류신 이외의 (즉, 류신 지퍼-유사 모티프의 위치 1 또는 8 이외의) 1개 이상의 추가적인 류신, 또는 (b) 3개 내지 5개 사이의 류신 지퍼-유사 모티프가 여전히 있고; HIV에 대한 항바이러스 활성 (HIV-매개 융합을 억제하는 것에서의 활성)이 있으면서, HIV 융합 억제제 펩티드가 서열 9-15 중 어느 하나와 비교하여 1개 이상, 3개 이하의 아미노산 차이가 있는 것을 제외하고는 서열 9-15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 또한 지닐 수 있다는 것을 의미한다. 이와 관련하여, (서열 9-15와 비교했을 때) 치환이 있는 HIV 융합 억제제 펩티드의 아미노산 차이는 본 발명에 따른 HIV 융합 억제제 펩티드에 대해 표시된 류신 및/또는 이소류신 잔기 이외의 아미노산 서열의 위치에 존재한다 (예를 들어, 본원의 도식 (I) 및 (II) 참조). 1개 이상, 3개 이하의 아미노산 차이는 보존성 아미노산 치환 (교체되는 아미노산과 실질적으로 동일한 전하, 크기, 소수성 및/또는 방향성을 지니는 아미노산의 치환을 포함하는 것으로 당업계에 공지됨; 예로는 글리신-알라닌-발린, 트립토판-타이로신, 아스파르트산-글루탐산, 아르기닌-라이신, 아스파라긴-글루타민, 및 세린-트레오닌이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다) 및/또는 다형성 (예를 들어, 도 2에 도해되거나, 또는 HIV-1의 실험실, 다양한 클레이드(clade) 및/또는 임상 단리물에서 발견됨)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 서열 11, 12, 또는 13과 관련하여, HIV 융합 억제제 펩티드에는 서열 11, 12, 또는 13 중 어느 하나의 아미노산 잔기 10, 17, 24, 31, 및 38 이외의 위치에 있는 1개 내지 3개 사이의 아미노산 차이가 있다. 예를 들어, 서열 9 및 서열 14와 관련하여, HIV 융합 억제제 펩티드에는 서열 9 또는 서열 14의 아미노산 잔기 10, 17, 21, 24, 및 38 이외의 위치에 있는 1개 내지 3개 사이의 아미노산 차이가 있다. 예를 들어, 서열 10 또는 서열 15와 관련하여, HIV 융합 억제제 펩티드에는 서열 10 또는 서열 15의 아미노산 잔기 10, 17, 21, 31, 및 38 이외의 위치에 있는 1개 내지 3개 사이의 아미노산 차이가 있다. 이러한 실시양태의 예시적인 예로는 1개 내지 3개 사이의 아미노산 치환의 아미노산 차이 부위일 수 있는 위치가 Xaa (임의의 천연 발생 또는 비-천연 발생 아미노산을 나타냄; 즉, 1개를 초과하는 가능한 아미노산이 이러한 아미노산 위치에서 사용될 수 있다)로 표시된 서열 16의 아미노산 서열이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있고, 예컨대 라이신이 아르기닌 또는 히스티딘으로, 아르기닌이 라이신 또는 히스티딘으로, 글루탐산이 아스파르트산으로, 또는 아스파르트산이 글루탐산으로 치환될 수 있다. 아미노산 위치 10, 17, 21, 24, 31, 및 38에 예시적인 목적으로 밑줄이 그어진다. 또한 서열 9-15를 지칭할 때, 서열 16에서, 류신 또는 이소류신일 수 있는 아미노산을 표시하기 위해 "Zaa"가 사용되고, 바람직하게는 류신, 이소류신이지만, Xaa일 수 있는 아미노산을 표시하기 위해 Baa가 사용되며, 단 하나 이상의 Baa는 류신 또는 이소류신이라는 것을 유념한다.

서열 16:

XaaXaaXaaEAXaaDRAZaaAEXaaAARZaaEAZaaZaaRABaaXaaEXaaXaaEKBaaEAAZaaREZaa

본원에 기술된 HIV 융합 억제제 펩티드는, HIV 융합 억제제 펩티드가 서열 16의 아미노산 요건을 충족시키는 한, HIV-1의 실험실, 클레이드 또는 임상 단리물, 예를 들어, 도 2에 열거된 실험실 균주 및 임상 단리물에 존재하는 서열 5에 (서열 정렬에 의해) 상응하는 HIV gp41의 HR2 영역으로부터 유래된 펩티드를 예를 들어 또한 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 이같은 HIV 융합 억제제 펩티드는 서열 9-15 중 임의의 것에 비해 1개 내지 3개 사이의 아미노산 치환을 나타낸다. 한 실시양태에서, HIV 융합 억제제 펩티드는 N-말단 차단기 또는 C-말단 차단기, 또는 양쪽 모두를 더 포함하고, 이러한 말단 기들에는 N-말단의 아미노 기 또는 아세틸 기 및 C-말단의 카르복실 기 또는 아미도 기가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

본원에 기술된 HIV 융합 억제제 펩티드는, HIV 융합 억제제 펩티드가 서열 16의 아미노산 요건을 충족시키는 한, US 2006/0247416 (이의 전체 내용은 거명에 의해 전체적으로 본원에 포함됨)에 개시된 펩티드들 중 임의의 것의 변이체 아미노산 서열을 나타내는 펩티드를 또한 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 이같은 HIV 융합 억제제 펩티드는 서열 9-15 중 어느 하나에 비해 1개 내지 3개 사이의 아미노산 치환을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, HIV 융합 억제제 펩티드의 길이는 아미노산 잔기 14개 내지 60개 사이이다. 한 실시양태에서, HIV 융합 억제제 펩티드는 N-말단 차단기 또는 C-말단 차단기, 또는 양쪽 모두를 더 포함하고, 이러한 말단 기들에는 N-말단의 아미노 기 또는 아세틸 기 및 C-말단의 카르복실 기 또는 아미도 기가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "반응성 관능기"는 또다른 화학 기 또는 화학 모이어티(moiety)와 결합을 형성할 수 있는 화학 기 또는 화학 모이어티를 의미한다. 화학 기와 관련하여, 반응성 관능기는 말레이미드, 티올, 카르복실산, 수소, 포스포릴, 아실, 하이드록실, 아세틸, 소수성, 아민, 아미도, 단실, 술포, 숙신이미드, 티올-반응성, 아민-반응성, 카르복실-반응성 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는 기를 포함하는 것으로 당업자에게 공지되어 있다. 하나의 반응성 관능기가 또다른 반응성 관능기를 배제하고 사용될 수 있다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "링커"는 2개의 상이한 분자를 작동가능하게 연결하는 분자 다리로서 작용하는 화합물 또는 모이어티를 의미한다 (예를 들어, 링커의 제1 반응성 관능기는 거대분자 담체의 반응성 관능기에 공유결합으로 커플링되고, 링커의 제2 반응성 관능기는 HIV 융합 억제제 펩티드의 반응성 관능기에 공유결합으로 커플링된다). 링커는 HIV 융합 억제제 펩티드의 하나 이상의 복사본을 함유하는 재조합 융합 단백질의 생산에서와 같이 아미노산일 수 있다. 별법적으로, 2개의 상이한 분자가 단계적인 방식으로 링커에 연결될 수 있다 (예를 들어, 화학적 커플링을 통해). 일반적으로, 링커가 분자 다리로서의 이의 목적을 이행할 수 있는 한, 링커의 크기 또는 함량은 특별히 제한되지 않는다. 링커는 화학적 사슬, 화학적 화합물 (예를 들어, 시약), 아미노산 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는 것으로 당업자에게 공지되어 있다. 링커에는 동종이관능성 링커, 이종이관능성 링커, 생체안정성 링커, 가수분해성 링커, 및 생체분해성 링커, 뿐만 아니라 당업계에 공지된 기타 링커가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 당업자에게 주지된 이종이관능성 링커는 제1 분자를 특이적으로 연결하는 제1 반응성 관능기가 있는 한쪽 끝부분, 및 제2 분자에 특이적으로 연결되는 제2 반응성 관능기가 있는 반대쪽 끝부분을 함유한다. 다양한 일관능성, 이관능성 및 다중관능성 시약 (예컨대 Pierce Chemical Co. (Rockford, Ill.)의 카탈로그에 기술된 것들)이 링커로서 사용될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 연결될 분자, 연결이 수행되는 조건, 및 투여 시의 의도되는 약동학적 성질과 같은 인자들에 따라, 생물학적 활성 및 기능의 보존, 안정성, 특정 화학적 및/또는 온도 파라메터에 대한 저항성, 생체내 절단에 대한 감수성, 및 충분한 입체선택성 또는 크기와 같은 성질들을 최적화하기 위해 링커의 길이 및 구성이 변할 수 있다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "거대분자 담체"는 하나 이상의 본 발명에 따른 펩티드에 연결, 결합 또는 융합됨으로써 (예를 들어, 화학적으로, 또는 유전자 발현을 사용하는 재조합 수단을 통해), 분자가 하나 이상의 펩티드에 대한 안정성, 하나 이상의 펩티드의 생물학적 활성에서의 증가, 또는 하나 이상의 펩티드의 혈장 반감기에서의 증가 (예를 들어, 신체 내에서의 하나 이상의 펩티드의 존속을 연장시킴) 중 하나 이상의 성질을 분자의 부재 시의 하나 이상의 펩티드와 관련된 성질들에 비해 부여할 수 있는 분자를 의미한다. 이같은 거대분자 담체는 혈청 단백질, 중합체, 탄수화물, 및 지질-지방산 접합체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 것으로 당업계에 주지되어 있다. 거대분자 담체로 전형적으로 사용되는 혈청 단백질에는 트랜스페린, 알부민 (바람직하게는 인간 알부민), 면역글로불린 (바람직하게는 인간 IgG 또는 이의 하나 이상의 사슬), 또는 호르몬이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 거대분자 담체로 전형적으로 사용되는 중합체에는 폴리라이신 또는 폴리(D-L-알라닌)-폴리(L-라이신), 또는 폴리올이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 폴리올은 수용성 폴리(알킬렌 옥시드) 중합체를 포함할 수 있고, 선형 사슬 또는 분지형 사슬(들)이 있을 수 있다. 중합체는 분지형 사슬 폴리올 (예컨대 HIV 융합 억제제 펩티드에 직접적으로 또는 링커를 통해 각각 커플링될 수 있는 다중 (예를 들어, 3개 이상) 사슬이 있는 PEG)일 수 있고, 한 실시양태에서, 생체내 조건 하에 생체분해성이고/이거나 경시적으로 절단되는 분지형 사슬 폴리올일 수 있다. 적절한 폴리올에는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 및 PEG-PPG 공중합체가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 폴리올은 약 1,000 달톤 내지 약 20,000 달톤 범위에서 선택되는 평균 분자 크기의 PEG를 포함한다. 분자량이 일반적으로 20,000 달톤을 초과하는, 사용될 수 있는 또다른 유형의 거대분자 담체들이 당업계에 공지되어 있다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "화학적 보호기", 또는 "CPG"는 아민 기를 포함하는 반응성 관능기를 또다른 반응성 관능기와의 화학적 반응으로부터 차단하는데 사용되는 화학적 모이어티를 의미한다. 화학적 보호기는 Dmcp (디메틸시클로프로필메틸), Bsmoc (벤조[b]티오펜술폰-2-메톡시카르보닐), tBu (t-부틸), trt (트리페닐메틸(트리틸)), OtBu (tert-부톡시), Boc 또는 t-Boc (tert-부틸옥시카르보닐), Fmoc (9-플루오레닐메톡시카르보닐), Aoc (t-아밀옥시-카르보닐), TEOC (β-트리메틸에틸옥시카르보닐), CLIMOC (2-클로로-1-인다닐 메톡실 카르보닐), BIMOC (벤즈-[f]-인덴-3-메톡실카르보닐), PBF (2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란-5-술포닐), 2-Cl-Z (클로로벤질-옥시카르보닐), Alloc (알릴옥시카르보닐), Cbz (벤질옥시카르보닐), Adoc (아다만틸옥시-카르보닐), Mcb (1-메틸사이클로부틸옥시카르보닐), Bpoc (2-(p-비페닐릴) 프로필-2-옥시카르보닐), Azoc (2-(p-페닐아조페닐) 프로필-2-옥시카르보닐), Ddz (2,2 디메틸-3,5-디메틸옥시벤질-옥시카르보닐), MTf (4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐), PMC (2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐), Tos (토실), Hmb (2-하이드록실-4-메톡시벤질), Poc (2-페닐프로필-2-옥시카르보닐), Dde (1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸), ivDde (1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소-사이클로헥스-1-일리덴)-3-메틸부틸), 벤질, 단실, 파라-니트로벤질 에스테르 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 것으로 펩티드 합성 분야의 당업자에게 주지되어 있다. 하나의 화학적 보호기가 또다른 화학적 보호기를 배제하고 사용될 수 있다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "탈보호"는 하나 이상의 화학적 보호기(들)이 하나 이상의 화학적 보호기를 함유하는 분자로부터 제거되는 공정을 의미하는 것으로 당업계에 공지되어 있고, 이때 상기 분자는 아미노산, 펩티드 단편, 또는 HIV 융합 억제제 펩티드를 포함한다. 일반적으로, 탈보호 공정은 하나 이상의 화학적 보호기에 의해 보호된 분자를 화학적 보호기를 제거하는 화학 작용제와 반응시키는 것을 수반한다. 예를 들어, 화학적 보호기에 의해 보호된 N-말단 알파 아미노 기가 염기와 반응하여, 염기에 불안정한 화학적 보호기 (예를 들어, Fmoc 등)가 제거될 수 있다. 화학적 보호기 (예를 들어, Boc, TEOC, Aoc, Adoc, Bopc, Ddz, Cbz 등)가 산에 의해 제거된다. 기타 화학적 보호기, 특히 카르복실산으로부터 유래된 보호기는 산 또는 염기에 의해 제거될 수 있다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "유도체(들)"은 하나 이상의 원자가 또다른 원자 또는 기로 교체되는 것에 의해 어버이 화합물로부터 발생되는 화합물을 의미하고, 항바이러스 화합물의 경우, 바람직하게는 이는 어버이 화합물의 항바이러스 활성을 모두 또는 실질적으로 모두 유지한다.

용어 "제1", "제2", "제3" 등은 (a) 순서를 가리키도록, 또는 (b) 분자들 또는 분자의 반응성 관능기들을 구별하도록, 또는 (c) (a)와 (b)의 조합으로 본원에서 사용될 수 있다. 그러나, 용어 "제1", "제2", "제3" 등은 다른 방식으로 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

용어 "펩티드 단편" 및 "중간체"는, 본 발명에 따른 HIV 융합 억제제 펩티드와 관련하여, 그리고 명세서 및 청구항의 목적을 위해, 길이가 아미노산 약 5개 이상, 아미노산 잔기 약 30개 이하인 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 의미하도록 동의적으로 사용되고, 이러한 HIV 융합 억제제 펩티드의 아미노산 서열의 적어도 일부분 (연속 아미노산으로서의 일부분)을 포함한다. 서열 9 및 10을 제조하는데 유용한 펩티드 단편의 예시적인 예를 위해, 본원의 실시예 4-7, 및 표 4, 5, 7 & 8 참조. 추가로, 바람직한 실시양태에서, 아미노산 잔기들 간에 펩티드 결합이 형성되도록 펩티드 단편이 합성되지만 (단독으로 또는 HIV 융합 억제제 펩티드를 형성하도록 일군으로 조합되는 경우), 당업자에게 공지된 반응을 사용하여 비-펩티드 결합이 형성될 수 있다는 것이 당업자에게 이의 없이 명백하다 (예를 들어, 이미노, 에스테르, 하이드라지드, 아조, 세미카르바지드 등).

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "약동학적 성질"은 시간 경과에 따른 전신적으로 이용가능한 조성물 내의 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)의 총량을 의미한다. 약동학적 성질은 생체 내에서 투여된 후 시간 경과에 따른 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)의 총 전신 농도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 예로서, 약동학적 성질은 곡선하 면적 (AUC (Area Under the Curve)), 생물학적 반감기, 및/또는 소거율의 측면에서 표현될 수 있다. AUC는 질량-시간/부피 단위의 시간 경과에 따른 전신 생체활성 분자 농도의 통합 척도이다. 1회 용량의 생체활성 분자의 투여 후, 투약 시점부터 활성 성분이 신체 내에 잔존하지 않는 시점까지의 AUC는 생체활성 분자 (및/또는 생체활성 분자의 대사산물)에 대한 개체의 노출의 척도이다. 본원에 기술된 것들 이외의 제형에 함유된 생체활성 분자(들)에 비교하여, 조성물이 함유하는 생체활성 분자(들)에 하기의 (a) 내지 (g) 중 하나 이상이 있을 때 조성물은 "개선된" 또는 "증가된" 약동학적 성질을 지닌다: (a) 더 긴 ("증가된") 생물학적 (최종 제거) 반감기 ("t½), (b) 생물학적 (전신) 소거율 (Cl)에서의 감소, (c) 더 긴 지속 방출 프로파일, (d) 조성물 내로의 증가된 중량 백분율 (예를 들어, 약 10％ 이상) 혼입, (e) 감소된 또는 더 낮은 C_max, (f) 더 긴 t_max, 및 (g) 더 긴 t₀ _.01 또는 t₀ _.1. 한 실시양태에서, 개선된 약동학은 비교되는 제형의 소거율에 비해 감소된 생체활성 분자의 소거율을 의미하고, 예컨대 전형적으로 약 2배 감소 내지 약 10배 감소이다. 또다른 실시양태에서, 개선된 약동학은 비교되는 제형의 반감기에 비해 약 10％ 증가 내지 약 60％ 증가의 생물학적 반감기에서의 증가를 의미한다. 개선된 약동학은 소거율에서의 감소 및 생물학적 반감기에서의 증가 양쪽 모두를 또한 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 바람직한 약동학적 성질에는 C_max에 신속하게 (예를 들어, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간, 24시간, 28시간, 32시간, 36시간 또는 48시간 이내에) 도달한 후, 5일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일 또는 28일 동안 또는 이보다 길게 혈장 농도가 비교적 일정한 것이 또한 포함된다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물의 바람직한 약동학적 성질은 더 낮은 C_max, 더 긴 t_max 및 더 긴 t₀ _.01 또는 t₀ _.1이다. 혈장 농도 대 시간 곡선하 면적 (AUC), 전신 소거율 (Cl), 및 최종 제거 반감기 (t½)를 계산하는데 사용되는 식이 본원에서 실시예 1에서 기재된다.

하나 이상의 고체가 내부에 용해된 수성 유체를 지칭하는 것에서 당업계에서 관례적인 용어 "용액 내"는 본원에 더욱 상세하게 기술되고 주사용 약물 제형에 대한 업계에서 관례적인 바와 같은 농도 및 온도의 실제 사용 조건 하에 용액 내에 용해된 생체활성 분자 예컨대 HIV 융합 억제제 펩티드를 함유하는 수성 용액을 의미하도록 명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용된다. 현탁액의 형성과 대조적인 것으로 용액의 형성을 구별하기 위한 다양한 방식, 예컨대 시각적 투명도 (용액의 투명함 대 현탁액의 혼탁함), 광 투과 등의 점검이 당업계에 공지되어 있다. 용액으로부터의 침전 또는 생체활성 분자를 함유하는 수성 유체의 젤화의 관찰된 증거를 나타내지 않으면서 수성 유체 내의 용액 내에 존재하는 생체활성 분자 예컨대 HIV 융합 억제제 펩티드의 양 (예를 들어, 중량 백분율)에 의해 "용해도"가 결정된다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "지속 방출"은 투여 시 생체활성 분자가 특정한 시간 간격에 걸쳐 연속적으로 방출된다는 것을 의미한다.

명세서 및 청구항의 목적을 위해 본원에서 사용될 때, 용어 "유효량"은 특정 방법의 원하는 결과를 달성할 생체활성 분자의 양을 의미한다. 한 실시양태에서, 생체분자의 유효량은 (단독으로 및/또는 투약 요법과 함께) 환자 내의 HIV 바이러스 로드를 (예를 들어, 생체활성 분자의 부재 시의 로드와 비교하여) 감소시키는데 충분한 양일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 생체분자의 유효량은 HIV에 의한 세포의 감염을 (예를 들어, 생체활성 분자의 부재 시의 감염과 비교하여) 억제하거나 또는 표적 세포의 바이러스 진입을 억제하는데 충분한 양일 수 있다. 당업계에 공지된 분석법을 사용하여 이같은 억제를 측정할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 생체분자의 유효량은 HIV 감염과 관련된 증상을 완화시키는데 충분한 양일 수 있다. 당업자에게 주지된 관례적인 시험관내 및 생체내 연구로부터의 데이터를 사용하여 당업자에 의해 생체분자의 유효량이 결정될 수 있다.

용어 "치료" 또는 "치료법", 또는 이의 문법적인 등가물은 HIV 감염과 관련하여 상호교환가능하게 사용되고, 명세서 및 청구항의 목적을 위해, 생체활성 분자 예컨대 HIV 융합 억제제 펩티드를 포함하는 조성물이 HIV 감염과 관련된 하나 이상의 프로세스, 또는 이같은 치료 또는 치료법의 치료적 효과 (예를 들어, "치료적 용도")를 결정하기 위한 지표물로서 사용되는 하나 이상의 파라메터 또는 종점에 영향을 미치는데 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 생체활성 분자가 하기의 프로세스들 중 하나 이상을 억제하는데 사용될 수 있다: 표적 세포로의 HIV의 전파; HIV와 표적 세포 간의 융합 ("HIV 융합"); 바이러스 진입 (감염 프로세스 동안 HIV 또는 이의 유전자 물질이 표적 세포 내로 진입하는 프로세스); 및 합포체(syncytia) 형성 (예를 들어, HIV-감염 세포와 표적 세포 간의 융합). HIV 감염의 치료 또는 치료법에서 약물의 효능을 평가하기 위해, 바이러스 억제 (체액 또는 조직 내의 HIV의 바이러스 로드를 측정하기 위한 당업계에 공지되어 있는 방법에 의해 결정됨)는 통상적으로 사용되는 1차 종점이고, 혈류 내에서 순환하는 CD4⁺ 세포 개수의 증가는 통상적으로 사용되는 2차 종점이며, 각각은 표적 세포로의 HIV의 전파를 억제하는 것의 측정가능한 효과이다. 따라서, 생체활성 분자 예컨대 HIV 융합 억제제 펩티드를 포함하는 조성물은 바이러스 억제 및/또는 순환 CD4⁺ 세포의 상대적인 개수의 증가를 포함하는 치료적 용도에 영향을 미치는데 사용될 수 있다.

조성물

생체활성 분자(들)를 환자에게 투여하는데 유용한 조성물들이 본원에서 제공된다. 구체적으로, 용매, 젤화 물질 및 생체활성 분자, 예컨대 항바이러스 펩티드를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 이론에 제한되지 않으면서, 본원에서 제공되는 실시양태들은, 적어도 부분적으로, 환자에게의 투여 시 바람직한 지속 방출 프로파일을 나타내면서 증가된 중량 백분율의 생체활성 분자가 조성물 내에 혼입될 수 있다는 뜻밖의 발견을 기초로 한다. 본원에 기술된 조성물들은 환자에게 투여되고 용매-피하액 교환이 발생할 때 조성물이 매트릭스를 포함하게 된다는 점에서 원위치 형성 젤 조성물을 구성할 수 있다.

한 실시양태에서, 조성물은 용매, 용매-피하액 교환 시 매트릭스를 형성하는 젤화 물질, 및 하나 이상의 생체활성 분자, 예를 들어, 항바이러스 펩티드 예컨대 T20 (서열 2), T1249 (서열 57), T897 (서열 58), T2635 (서열 5), T999 (서열 59) 및 T1144 (서열 9) 또는 이들의 유도체를 포함한다. 조성물은, 예를 들어, 투여 전에 용액 또는 현탁액으로서 존재할 수 있다. 용액 또는 현탁액은 수성일 수 있거나, 또는 유기 용매를 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 실온에서 18개월까지 실온에서 보관될 수 있다. 투여 및 환자의 피하 공간 내의 유체에의 노출 시, 젤화 물질은 생체분해성 또는 적어도 생체부식성인 매트릭스를 형성할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 조성물은 이를 필요로 하는 환자에게 액체 형태로, 예를 들어, 피하 주사에 의해, 투여될 수 있다. 생성된 매트릭스는, 예를 들어, 생체활성 분자(들)에 대한 지속 방출 매트릭스로 작용할 수 있다.

본원에서 제공되는 조성물은 하나 이상의 젤화 물질을 환자에게의 투여 시 매트릭스를 형성하도록 충분한 양 (예를 들어, 약 50-1000 ㎎/g, 100-900 ㎎/g, 150-900 ㎎/g, 200-900 ㎎/g, 250-900 ㎎/g, 500-900 ㎎/g, 750-900 ㎎/g 또는 750-1000 ㎎/g)으로 일반적으로 포함한다. 한 실시양태에서, 젤화 물질의 적합한 양 (㎎/g 단위)은 비히클 비율로부터의 비히클 젤화 물질 조성물을 더하고 10을 곱함으로써 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 젤화 물질은 락티드 또는 글리콜리드 중합체이다. 특정 실시양태에서, 젤화 물질은 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 (SAIB), 폴리락티드 (PLA, 예를 들어, PLA3L, PLA3M, 또는 PLA-PEG) 또는 폴리락티드-코-글리콜리드 (PLG, PLGA, 예를 들어, PLGA1, PLGA-글루코스, 또는 PLGA-PEG)이다. 본원에서 제공되는 조성물은 생체활성 분자, 예컨대 항바이러스 펩티드를 또한 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 유효 용량의 생체활성 분자가 환자에게의 투여 시 매트릭스로부터 방출되도록, 예를 들어, 지속 방출 방식으로 방출되도록 충분한 농도의 생체활성 분자를 포함한다.

본원에서 제공되는 조성물은 일반적으로 5％ 이상의 생체활성 분자를 포함할 수 있고, 이러한 농도로 투여될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 조성물의 중량의 약 5％, 6％, 7％, 8％, 9％, 10％, 11％, 12％, 13％, 14％, 15％, 20％ 이상인 양의 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)를 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 약 80-90 ㎎/㎖, 90-100 ㎎/㎖, 100-105 ㎎/㎖, 105-110 ㎎/㎖, 110-125 ㎎/㎖, 125-130 ㎎/㎖, 130-140 ㎎/㎖, 140-150 ㎎/㎖, 150-200 ㎎/㎖, 200-250 ㎎/㎖, 250-300 ㎎/㎖의 생체활성 분자를 포함한다.

특정 실시양태에서, 환자에게의 투여 시, 본원에서 제공되는 조성물은 매트릭스를 형성하고, 이는 생체활성 분자의 초기 급방출(burst)을 제공한 후, 생체활성 분자를 조성물의 투여 후 적어도 5일, 7일, 10일 또는 14일 동안 지속적으로 방출한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물을 투여함으로써 제공되는 생체활성 분자의 초기 급방출은 조성물의 투여 후 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간 또는 24시간 이내의 적어도 약 1 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 3 ㎍/㎖, 4 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 6 ㎍/㎖, 7 ㎍/㎖, 8 ㎍/㎖, 9 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 11 ㎍/㎖, 12 ㎍/㎖, 13 ㎍/㎖, 14 ㎍/㎖ 또는 15 ㎍/㎖ 또는 이를 초과하는 C_max이다. 특정 실시양태에서, 환자에게 본원에서 제공되는 조성물을 투여함으로써 제공되는 생체활성 분자의 지속 방출은 조성물의 투여 후 적어도 5일, 7일, 10일, 14일, 21일, 25일 또는 28일 동안 또는 이보다 길게 0.1 ㎍/㎖, 0.5 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 1.25 ㎍/㎖, 1.5 ㎍/㎖ 또는 2.0 ㎍/㎖ 이상이거나 이를 초과한다.

또다른 실시양태에서, 환자에게의 투여 시, 매트릭스를 형성하고 (예를 들어, 원위치에서), 투여 12시간 이내에 적어도 10 ㎍/㎖의 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)의 C_max를 제공한 후, 적어도 7일 동안 적어도 1 ㎍/㎖의 혈장 수준을 초래하는 지속 방출이 이어지는 조성물이 본원에서 제공된다.

한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항바이러스 펩티드를 포함하는 조성물은 하나 이상의 추가 성분 예컨대 제약상 허용가능한 담체, 거대분자, 또는 이들의 조합물을 더 포함한다.

또다른 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 추가적인 생체활성 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 T20, T1249, T897, T2635, T999 또는 T1144 펩티드 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 이같은 조성물은 하나 이상의 다른 항바이러스제를 포함할 수 있거나 또는 더 포함할 수 있다. 단독으로 또는 조합 치료 요법의 일환으로서 조성물에서 사용될 수 있는 다른 항바이러스제에는 DP107 (T21) 또는 임의의 기타 항바이러스 폴리펩티드, 예컨대 미국 특허 번호 6,541,020 B1 (거명에 의해 전체적으로 본원에 포함됨)에 기술된 것들이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 치료제의 또다른 예시적이고 비-제한적인 예로는 항바이러스제 예컨대 사이토카인, 예를 들어, rIFNα, rIFNβ, rIFNγ; 아바카비르, AZT (지도부딘), ddC (잘시타빈), 네비라핀, ddI (디다노신), FTC (엠트리시타빈), (+) 및 (-) FTC, 리버세트, 3TC (라미부딘), GS 840, GW-1592, GW-8248, GW-5634, HBY097, 델라비르딘, 에파비렌즈, d4T (스타부딘), FLT, TMC125, 아데포비르, 테노포비르 및 알로부딘을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 역전사 효소 억제제; 암프레니비르, CGP-73547, CGP-61755, DMP-450, 인디나비르, 넬피나비르, PNU-140690, 리토나비르, 사퀴나비르, 텔리나비르, 티프라노비르, 아타자나비르, 로피나비르, ABT378, ABT538 및 MK639를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 프로티에이스 억제제; 바이러스 mRNA 캡핑(capping) 억제제, 예컨대 리바비린; 항-HIV 활성이 있는 지질-결합 분자로서의 암포테리신 B; 당단백질 프로세싱 억제제로서의 카스타노스퍼민; 바이러스 진입 억제제 예컨대 융합 억제제 (엔푸비르티드, T1249, 기타 융합 억제제 펩티드, 및 소형 분자), SCH-D (Schering-Plough), UK-427857 (Pfizer), TNX-355 (Tanox Inc.), AMD-070 (AnorMED), Pro 140, Pro 542 (Progenics), FP-21399 (EMD Lexigen), BMS806, BMS-488043 (Bristol-Myers Squibb), 마라비록 (UK-427857), ONO-4128, GW-873140, AMD-887, CMPD-167, 및 GSK-873,140 (GlaxoSmithKline); CXCR4 길항제, 예컨대 AMD-070); 지질 및/또는 콜레스테롤 상호작용 조정인자, 예컨대 프로카인 하이드로클로라이드 (SP-01 및 SP-01A); L-870 및 810을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 인테그레이스 억제제; RNAseH 억제제; rev 또는 REV 억제제; vif 억제제 (예를 들어, vif에서 유래된 프롤린이 풍부한 펩티드, HIV-1 프로티에이스 N-말단-유래 펩티드); 베툴린, 및 디하이드로베툴린 유도체 (예를 들어, PA-457)를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 바이러스 프로세싱 억제제; 및 AS-101, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, IL-2, 발프로산, 및 싸이모펜틴을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 면역조정제가 포함된다.

한 실시양태에서, 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 용해된 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 현탁된 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 현탁된 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 분무-건조 형태인 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 현탁된 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 염 (예를 들어, 금속 염)을 포함하는 분무-건조 형태인 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 현탁된 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 아연을 포함하는 분무-건조 형태인 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 현탁된 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 칼슘을 포함하는 분무-건조 형태인 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 현탁된 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 철을 포함하는 분무-건조 형태인 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 현탁된 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 침전 형태인 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 현탁된 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 염 (예를 들어, 금속 염)을 포함하는 침전 형태인 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 현탁된 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 아연을 포함하는 침전 형태인 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 현탁된 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 칼슘을 포함하는 침전 형태인 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 현탁된 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 철을 포함하는 침전 형태인 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 현탁된 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 마그네슘을 포함하는 침전 형태인 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 현탁된 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 구리를 포함하는 침전 형태인 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 현탁된 생체활성 분자 (예를 들어, 항바이러스 펩티드)가 알루미늄을 포함하는 침전 형태인 조성물이 본원에서 제공된다.

또다른 실시양태에서, 약 1-15％, 1-14％, 1-13％, 1-12％, 1-11％, 1-10％, 1-9％, 1-8％, 1-7％, 1-6％, 1-5％, 1-4％, 1-3％, 1-2％, 5-15％, 7-15％, 5-10％, 7-10％ 또는 10-15％의 염, 예컨대 금속 염을 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 추가적인 실시양태에서, 생체분자, 예컨대 항바이러스 펩티드에 대해 1:1 몰비로 존재하는 염, 예컨대 금속 염을 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 본원에서 제공되는 조성물에서 유용한 금속 염의 특정 예로는 아연, 칼슘 및 철이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

본원에서 제공되는 조성물 내의 젤화 물질의 비율을 변경하는 것은 본원에서 제공되는 조성물을 환자에게 투여했을 때 형성되는 매트릭스로부터의 생체분자의 전달 속도를 조정, 예를 들어, 개선 또는 최적화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물 내의 SAIB:PLA 비율을 감소시키는 것은 환자 내의 임의의 특정 시점의 생체분자의 혈장 농도 증가를 초래할 수 있고, 환자에서 생체분자의 특정 혈장 수준이 유지되는 기간을 증가시킬 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물에서 트리아세틴 또는 벤질벤조에이트 대신 용매로서 NMP를 사용하는 것은 환자 내의 임의의 특정 시점의 생체분자의 혈장 농도 증가를 초래할 수 있고, 환자에서 생체분자의 특정 혈장 수준이 유지되는 기간을 증가시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 트리아세틴 대신 용매로서 NMP를 사용하는 것은 C_max 증가를 초래할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물의 투여되는 주사 부피를 증가시키는 것 (예를 들어, 배가)은 환자 내의 임의의 특정 시점의 생체분자의 혈장 농도 증가를 초래할 수 있고, 환자에서 생체분자의 특정 혈장 수준이 유지되는 기간을 증가시킬 수 있다.

또다른 실시양태에서, 사용되는 젤화 물질 (예를 들어, PLA)의 유형이 본원에서 제공되는 조성물의 약동학적 파라메터에 영향을 미칠 수 있다. 특정 실시양태에서, PLA 유형을 3L에서 3M으로 변화시키는 것은 C_max 감소, t_max 증가 및 t₀ _.01 증가를 초래할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물 내의 젤화 물질 대 용매의 비율을 변경시키는 것이 생체분자의 전달 속도에 영향을 줄 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물 내의 젤화 물질 대 용매의 비율 (예를 들어, PLGA1A 대 NMP)을 증가시키는 것은 C_max 감소, t_max 증가 및 t₀ _.01 증가를 초래할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 중합체 유형 및 분자량을 변경시키는 것이 생체분자의 전달 속도에 영향을 줄 수 있다. 특정 실시양태에서, 중합체 분자량을 증가시키는 것 및/또는 L:G (락티드:글리콜리드) 비율을 증가시키는 것은 C_max 감소, t_max 증가 및 t₀ _.01 증가를 초래할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물 내의 펩티드 농도를 증가시키는 것 (예를 들어, 배가)는 C_max 감소, t_max 증가 및 t₀ _.01 감소를 초래할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 비히클 내의 젤화 물질 (예를 들어, PLGA)의 양을 증가시키는 것은 C_max 감소, t_max 증가 및 t₀ _.01 감소를 초래할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 비히클 (예를 들어, SAIB 함유 비히클) 내의 젤화 물질 (예를 들어, PLA)의 양을 증가시키는 것은 본원에서 제공되는 조성물로부터의 생체분자의 방출을 느리게 한다 (예를 들어, C_max를 감소시키고/시키거나, t_max를 증가시키고/시키거나 t₀ _.01을 증가시킨다). 특정 실시양태에서, 비히클 내의 PLA의 양을 1％에서 5％로 증가시키는 것은 본원에서 제공되는 조성물로부터의 생체분자의 방출을 추가로 느리게 한다. 또다른 실시양태에서, 비히클 내의 PLA의 양을 5％에서 10％로 증가시키는 것은 본원에서 제공되는 조성물로부터의 생체분자의 방출을 추가로 느리게 한다.

용매

본원에서 제공되는 조성물 및 방법에서 유용한 용매에는 환자 내로의 조성물의 주사를 허용하도록 충분히 젤화 물질을 희석할 수 있는 임의의 수-혼화성 액체가 포함된다. 한 실시양태에서, 용매는 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP)이다. 기타 적절한 용매로는 물, 알코올 (예를 들어, 메틸, 에틸, 이소프로필 및 벤질 알코올), 글리콜 (예를 들어, 폴리에틸렌, 프로필렌 및 테트라 글리콜), 벤조에이트 (예를 들어, 에틸벤조에이트 및 벤질벤조에이트), 글리세리드 (예를 들어, 모노-, 디- 및 트리-글리세리드), 트리아세틴 및 제약상 허용가능한 에스테르 (예를 들어, 에틸-락테이트 및 프로필-카르보네이트)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

젤화 물질

본원에서 제공되는 조성물 및 방법에서 유용한 젤화 물질에는 용매-피하액 교환 시 매트릭스를 형성하는 임의의 용매-혼화성 물질이 포함된다. 한 실시양태에서, 젤화 물질은 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 (SAIB) 또는 이의 유도체, 예를 들어, 수크로스 아세테이트 또는 수크로스 아세테이트 이소부티레이트-특수 등급 (SAIB-SG)이다. 또다른 실시양태에서, 젤화 물질은 폴리락티드 (PLA), 예를 들어, PLA3L 또는 PLA3M이다. 또다른 실시양태에서, 젤화 물질은 폴리락티드-코-글리콜리드 (PLG, PLGA, PLGA-글루코스 또는 이의 유도체, 예를 들어, PLGA-PEG1500 또는 PLA-PEG1500)이다. 또다른 실시양태에서, 젤화 물질은 폴리-카프로락톤 또는 이의 유도체 또는 락티드/글리콜리드 공중합체이다. PLA 및 PLGA는 락티드:글리콜리드 비율, 분자량 및 이들의 말단기가 상이하다. 명칭 내의 숫자에 의해 분자량이 등급화된다. 분자량의 추정치는 10000×숫자이다. 말단 기는 카르복실산 (A), 메틸 에스테르 (M) 또는 라우릴 에스테르 (L)이다.

한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 동일한 또는 상이한 중량 백분율로 존재하는 2개 이상의 상이한 젤화제를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 젤화 물질은 PLA, PLG, PLGA 또는 PLGA-글루코스로부터 선택된 2개 이상의 물질의 혼합물이다.

특정 실시양태에서, 젤화 물질은 약 5-95 중량％, 약 5-90 중량％, 약 10-90 중량％, 약 10-85 중량％, 약 15-85 중량％, 약 20-85 중량％, 약 30-85 중량％, 약 30-80 중량％, 약 30-70 중량％, 약 30-65 중량％, 약 30-60 중량％, 약 40-85 중량％, 약 45-85 중량％, 약 50-85 중량％, 약 55-85 중량％, 약 60-85 중량％, 약 65-85 중량％, 약 70-85 중량％, 약 75-85 중량％, 약 80-85 중량％, 약 1-15 중량％, 약 5-15 중량％ 또는 약 10-15 중량％ 사이의 양으로 존재한다.

또다른 실시양태에서, 젤화 물질은 약 25-900 ㎎/g, 100-900 ㎎/g, 200-900 ㎎/g, 300-900 ㎎/g, 400-900 ㎎/g, 500-900 ㎎/g, 100-800 ㎎/g, 100-700 ㎎/g, 100-600 ㎎/g, 100-500 ㎎/g, 200-800 ㎎/g, 300-600 ㎎/g, 25-250 ㎎/g, 25-200 ㎎/g, 25-150 ㎎/g, 50-150 ㎎/g, 50-100 ㎎/g, 50 ㎎/g, 75 ㎎/g 또는 100 ㎎/g의 양으로 존재한다.

펩티드

항바이러스 펩티드인 생체활성 분자와 관련하여, 당업계에 공지된 임의의 항바이러스 펩티드가 본원에서 제공되는 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 항바이러스 펩티드는 T20, T1249, T897, T2635, T999 또는 T1144 펩티드 또는 이의 유도체이다.

본원에서 제공되는 조성물 및 방법에서 유용한 특정 항바이러스 펩티드에는 서열 5의 아미노산 서열을 지니는 기본 아미노산 서열 ("기본 서열")로부터 유래되지만, 이때 아미노산 서열 내에 1개를 초과하는 류신 지퍼-유사 모티프가 있고, 류신 지퍼-유사 모티프를 형성하는데 필요한 것 이외의 하나 이상의 추가적인 류신 (즉, 류신 지퍼-유사 모티프의 아미노산 위치 1 또는 8 이외에서의 서열 내의 아미노산; 서열 5의 아미노산 위치 21에서 이소류신을 류신으로 치환함으로써 예시됨)이 아미노산 서열 내에 있다는 것에 의해 각각의 HIV 융합 억제제 펩티드가 기본 서열과 상이한 HIV 융합 억제제 펩티드들이 포함된다.

본원에서 제공되는 조성물 및 방법에서 유용한 추가적인 항바이러스 펩티드에는 서열 5의 아미노산 서열을 지니는 기본 아미노산 서열 ("기본 서열")로부터 유래되지만, 이때 아미노산 서열 내에 2개를 초과하는 류신 지퍼-유사 모티프가 있다는 점에서 각각의 HIV 융합 억제제 펩티드가 기본 서열과 상이한 HIV 융합 억제제 펩티드들이 포함된다.

본원에서 제공되는 조성물 및 방법에서 유용한 추가적인 항바이러스 펩티드에는 각각의 HIV 융합 억제제 펩티드가 (a) HIV gp41의 HR2 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 함유하고; (b) 2개 이상, 5개 이하의 류신 지퍼-유사 모티프가 있는 아미노산 서열을 지니며; (c) 류신 지퍼-유사 모티프의 아미노산 위치 1 또는 8 이외에서 아미노산 서열 내에 하나 이상의 추가적인 류신이 있고 (예를 들어, 서열 5-7 중 임의의 하나 이상의 기본 서열과 비교하여); 임의적으로, (d) 하나 이상의 생물학적 성질에서의 예상 밖의 개선을 나타내는 일련의 HIV 융합 억제제 펩티드들이 포함된다. 한 실시양태에서, HIV 융합 억제제 펩티드는 HIV gp41의 HR2 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 함유하고, 이때 상기 아미노산 서열은 HR2 류신 지퍼-유사 모티프, 예를 들어, 도 1 또는 도 2에 도해된 HR2 류신 지퍼-유사 모티프를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, HIV 융합 억제제 펩티드의 길이는 아미노산 잔기 14개 내지 60개 사이이다. 한 실시양태에서, HIV 융합 억제제 펩티드는 N-말단 차단기 또는 C-말단 차단기, 또는 양쪽 모두를 더 포함하고, 이러한 말단 차단기들에는 N-말단의 아미노 기 또는 아세틸 기 및 C-말단의 카르복실 기 또는 아미도 기가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

본원에서 제공되는 조성물 및 방법에서 유용한 추가적인 항바이러스 펩티드에는 각각의 HIV 융합 억제제 펩티드가 (a) HIV gp41의 HR2 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 함유하고; (b) 2개 초과, 5개 이하의 류신 지퍼-유사 모티프가 있는 아미노산 서열을 지니며; (c) 류신 지퍼-유사 모티프의 아미노산 위치 1 또는 8 이외에서 아미노산 서열 내에 하나 이상의 추가적인 류신이 있고 (예를 들어, 서열 5-7 중 임의의 하나 이상의 기본 서열과 비교하여); (d) 하나 이상의 생물학적 성질에서의 예상 밖의 개선을 나타내는 HIV 융합 억제제 펩티드들이 포함된다. 한 실시양태에서, HIV 융합 억제제 펩티드는 HIV gp41의 HR2 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 함유하고, 이때 상기 아미노산 서열은 HR2 류신 지퍼-유사 모티프, 예를 들어, 도 1 또는 도 2에 도해된 HR2 류신 지퍼-유사 모티프를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, HIV 융합 억제제 펩티드의 길이는 아미노산 잔기 14개 내지 60개 사이이다. 한 실시양태에서, HIV 융합 억제제 펩티드는 N-말단 차단기 또는 C-말단 차단기, 또는 양쪽 모두를 더 포함하고, 이러한 말단 차단기들에는 N-말단의 아미노 기 또는 아세틸 기 및 C-말단의 카르복실 기 또는 아미도 기가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

본원에서 제공되는 조성물 및 방법에서 유용한 추가적인 항바이러스 펩티드에는 서열 5와 유사한 아미노산 서열을 지니고, 단 HIV 융합 억제제 펩티드 아미노산 서열에 (a) 1개를 초과하는 류신 지퍼-유사 모티프가 있고, 류신 지퍼-유사 모티프를 형성하는데 필요한 류신 이외의 (즉, 류신 지퍼-유사 모티프의 위치 1 또는 8 이외의) 1개 이상의 추가적인 류신이 있거나, 또는 (b) 2개를 초과하는 류신 지퍼-유사 모티프가 있으며, 이때 HIV 융합 억제제 펩티드가 하나 이상의 생물학적 성질에서의 예상 밖의 개선을 나타내는 HIV 융합 억제제 펩티드들이 포함된다. 한 실시양태에서, HIV 융합 억제제 펩티드의 길이는 아미노산 잔기 14개 내지 60개 사이이다. 한 실시양태에서, HIV 융합 억제제 펩티드는 HIV gp41의 HR2 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 함유하고, 이때 상기 아미노산 서열은 HR2 류신 지퍼-유사 모티프, 예를 들어, 도 1 또는 도 2에 도해된 HR2 류신 지퍼-유사 모티프를 포함한다.

본원에서 제공되는 조성물 및 방법에서 유용한 추가적인 항바이러스 펩티드에는 서열 9, 10, 14, 및 15에 의해 예시되는 펩티드, 또는 서열 9, 10, 14, 및 15 중 어느 하나와 비교하여 1개 내지 3개 사이의 아미노산 차이를 함유하는 HIV 융합 억제제 펩티드가 포함된다.

본원에서 제공되는 조성물 및 방법에서 유용한 추가적인 항바이러스 펩티드에는 서열 5의 기본 아미노산 서열과 아미노산 서열이 유사하고, 단 기본 아미노산 서열과 비교했을 때, HIV 융합 억제제 펩티드 아미노산 서열이 이의 아미노산 서열 내에 2개를 초과하는 류신 지퍼-유사 모티프를 지니며, 이때 HIV 융합 억제제 펩티드가 하나 이상의 생물학적 성질에서의 예상 밖의 개선을 나타내는 HIV 융합 억제제 펩티드가 포함된다. 본원에서 제공되는 조성물 및 방법에서 유용한 추가적인 항바이러스 펩티드에는 서열 11-13에 의해 예시되는 펩티드, 또는 서열 11-13 중 어느 하나와 비교하여 1개 내지 3개 사이의 아미노산 차이를 함유하는 HIV 융합 억제제 펩티드가 포함된다.

본원에서 기술된 HIV 융합 억제제 펩티드는 펩티드를 코딩하는 핵산의 재조합 발현이 포함되는 주지된 방법들을 통해 관례적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 재조합적으로 HIV 융합 억제제 펩티드를 발현하도록 조작된 세포를 펩티드가 발현되도록 적합한 기간 동안 적합한 조건 하에 배양할 수 있고, 이로부터 펩티드를 수득할 수 있다. 본원에 기술된 HIV 융합 억제제 펩티드가 합성 방법을 통해 또한 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 선형 합성 방법을 통해 펩티드들이 어셈블리된다. 또다른 실시양태에서, 2개 이상의 펩티드 단편으로부터의 단편 축합 접근법을 사용하여 펩티드들이 어셈블리된다. 한 실시양태에서, 단편 AA(1-26) 및 AA(27-37)이 공유결합으로 커플링되고, AA(38)과 어셈블리되어, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드가 산출되는 2-단편 축합 접근법이 사용된다. 추가적인 실시양태에서, 단편 AA(1-12), AA(13-26) 및 AA(27-37)이 공유결합으로 커플링되고, AA(38)과 어셈블리되어, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드가 산출되는 3-단편 접근법이 사용된다.

본원에 기술된 조성물에서 사용될 수 있는 특정 펩티드 단편은 하기와 같다. 각각의 펩티드 단편은 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 또는 서열 15 중 하나의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드가 산출되도록 펩티드 단편의 군 내의 하나 이상의 다른 펩티드 단편과 공유결합으로 커플링될 수 있는 중간체로서의 역할을 할 수 있다. 한 실시양태에서, 펩티드 단편의 군 내의 펩티드 단편이 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 또는 서열 15의 아미노산 서열을 지니는 바람직한 HIV 융합 억제제 펩티드가 초래되는 방식으로 용액 상 공정에서 커플링된다. 펩티드의 구성 펩티드 단편을 합성한 후, 이러한 펩티드 단편을 어셈블리하여 HIV 융합 억제제 펩티드를 형성시킴으로써 생산되고, 이때 HIV 융합 억제제 펩티드가 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 또는 서열 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드가 본원에서 제공되는 조성물에서 또한 유용하다.

한 실시양태에서, 펩티드를 분무 건조시키는 것을 포함하는 펩티드의 제조 방법이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 펩티드를 4 미만 또는 6 초과의 pH에서 (예를 들어, 물 내에) 용해시킨 후 (이때 적합한 산 또는 염기, 예컨대 1N NaOH 또는 1N HCl이 pH를 조정하는데 사용됨), 분무 노즐을 통해 펩티드 용액을 가열된 챔버 내로 분무할 수 있다. 건조된 펩티드 입자를 수동으로 수집할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 상기 기술된 분무 건조 방법은 부형제를 분무 건조 용액에 첨가함으로써 부형제 및 펩티드를 혼입시키는 단계를 더 포함한다. 예시적인 부형제의 예로는 충전제, 증량제, 희석제, 습윤화제, 용매, 유화제, 방부제, 향미료, 흡수 강화제, 지속 방출 매트릭스, 착색제, 및 거대분자성 물질 예컨대 알부민, 또는 아미노산 및 당과 같은 물질이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

또다른 실시양태에서, (분무 건조와 유사한 방식으로) 분무 노즐을 통해 펩티드 용액을 또다른 용액 (예를 들어, 금속 염 용액, 예컨대 아연 염, 철 염 또는 칼슘 염 용액) 내로 분무하는 펩티드의 제조 방법이 본원에서 제공된다. 그후, 생성된 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 따라내고, 침전물을 냉동할 수 있다. 침전물을 동결건조시키고, 200 ㎛ 스크린에 통과시킬 수 있다.

또다른 실시양태에서, 펩티드가 (예를 들어, 물 내에) 4 미만 또는 6 초과의 pH에서 용해되고, 이때 적합한 산 또는 염기, 예컨대 1N NaOH 또는 1N HCl이 약 4 내지 6사이, 또는 약 4.8 내지 5.2 사이로 pH를 조정하는데 사용되는, 염 또는 pH 침전을 포함하는 펩티드의 제조 방법이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 염 용액 또는 강산/강염기 용액을 펩티드 용액에 첨가하여 침전을 야기하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 이러한 방법은 원심분리에 의해 침전물을 수집하는 단계, 동결건조에 의해 침전물을 건조시키는 단계, 및 임의적으로 침전물을 200 ㎛ 스크린에 통과시켜 입자 크기를 제어하는 단계를 더 포함한다.

이론에 제한되지 않으면서, 본원에서 제공되는 조성물에서 사용되는 펩티드를 제조하는데 사용되는 공정 및 시약이 특정 환자 또는 질환에 유용한 바람직한 또는 개선된 약동학적 파라메터 (예를 들어, 생체활성 분자의 방출량 또는 방출 기간)를 초래할 수 있는 것으로 생각된다. 특히, 금속 (예를 들어, 아연, 철 또는 칼슘)이 펩티드 침전물 내로 혼입시키는 방식 (예를 들어, 분무 및/또는 침전)이 생성된 조성물의 약동학적 파라메터에 영향을 미칠 수 있다.

한 실시양태에서, 펩티드 침전 공정 동안 금속 함량 (예를 들어, 아연 함량)을 증가시키는 것은 C_max를 감소시킬 수 있고, t_max를 증가시킬 수 있으며, t₀ _.01을 증가시킬 수 있다. 또다른 실시양태에서, 동결건조된 염으로서 금속 염 (예를 들어, 황산아연)을 저-금속 (예를 들어, 저-아연) 침전물에 첨가하는 것은 C_max를 감소시킬 수 있고, t_max를 증가시킬 수 있으며, t₀ _.01을 증가시킬 수 있다.

또다른 실시양태에서, 펩티드가 침전되는 용액이 C_max 및 t_max에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 50:50 메탄올:물로부터의 펩티드의 침전은 물 단독으로부터의 펩티드의 침전에 비해 C_max를 감소시킬 수 있고, t_max를 증가시킬 수 있다.

또다른 실시양태에서, 펩티드가 제조되는 방식이 C_max 및 t_max에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 분무된 침전물은 분무되지 않은 침전물에 비해 C_max를 증가시킬 수 있고, t_max를 증가시킬 수 있다.

사용 방법

본원에서 제공되는 조성물의 사용 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 한 실시양태에서, 조성물은 치료 요법, 예를 들어, 항바이러스 치료 요법의 일환으로서 사용된다. 특정 실시양태에서, 이같은 치료 요법은, 예를 들어, HIV 감염의 치료법을 위해 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 표적 세포가 HIV에 의한 세포의 감염을 억제하는데 효과적인 양의 활성 작용제, 예를 들어, 항바이러스 펩티드와 접촉되도록 상당량의 본원에서 제공되는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 표적 세포에 대한 HIV의 전파를 억제하기 위해 본원에서 제공되는 조성물을 사용하는 방법이 본원에서 제공된다. 이러한 방법은, 예를 들어, HIV-감염 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 세포에 대한 HIV의 전파를 억제하는 것은 표적 세포에 대한 HIV-1의 gp41-매개 융합을 억제하는 것 및/또는 HIV-감염 세포와 표적 세포 간의 합포체 형성을 억제하는 것을 포함한다.

HIV 감염을 치료하는데 효과적인 양으로 본원에서 제공되는 조성물을 HIV-감염 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, HIV 감염 (한 실시양태에서, HIV-1 감염)의 치료 방법이 본원에서 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 조성물은 표적 세포에 대한 HIV의 전파를 억제하는데 효과적인 양의 HIV 융합 억제제 펩티드, 및/또는 표적 세포에 대한 HIV의 gp41-매개 융합을 억제하는데 효과적인 양의 HIV 융합 억제제 펩티드를 포함한다. 이러한 방법들은, 예를 들어, HIV-감염 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 용매, 젤화 물질, 및 T20, T1249, T897, T2635, T999 및 T1144 또는 이의 조합물로부터 선택된 펩티드를 포함하는 조성물을 HIV 감염 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, HIV 감염과 관련된 증상을 완화시키는 방법이 본원에서 제공된다.

HIV 감염의 치료법에서 사용하기 위한 의약 (예를 들어, HIV의 전파를 억제하는 방법, HIV 융합을 억제하는 방법, 및/또는 HIV 감염을 치료하는 방법에서 사용됨)의 제작에서 HIV 융합 억제제 펩티드를 함유하는 조성물을 사용하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 의약은 생체활성 분자, 예컨대 HIV 융합 억제제 펩티드, 용매, 젤화 물질 및 임의적인 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물의 형태일 수 있다.

한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 주사, 예컨대 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 3일, 5일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일, 28일 또는 60일마다 한번씩 (예를 들어, 피하 주사에 의해) 투여될 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 1일 이상, 1주일 이상, 1개월 이상, 또는 1년 이상 동안 하루에 1회, 2회, 3회 또는 이를 초과하여 (예를 들어, 피하 주사에 의해) 투여될 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 1주일에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 또는 이를 초과하여 (예를 들어, 피하 주사에 의해) 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 1주일에 1회 또는 2회로 (예를 들어, 피하 주사에 의해) 투여될 수 있다. 또다른 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 2주 마다 2회로 (예를 들어, 피하 주사에 의해) 투여될 수 있다. 각각의 투여는 1회, 2회, 3회 또는 이를 초과하는 주사를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 100 ㎕, 200 ㎕, 300 ㎕, 400 ㎕, 500 ㎕, 600 ㎕, 700 ㎕, 800 ㎕, 900 ㎕, 1000 ㎕ 또는 이를 초과하는 부피로 투여된다.

한 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 주사기, 예를 들어, 100 ㎕, 200 ㎕, 300 ㎕, 400 ㎕, 500 ㎕, 600 ㎕, 700 ㎕, 800 ㎕, 900 ㎕, 1000 ㎕ 또는 이를 초과하는 부피의 주사기에 의한 주사에 의해 전달된다. 한 실시양태에서, 전달을 위한 자동주입기 또는 펜(pen) 장치가 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 전달 장치가 미리 충전될 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 30 게이지의 0.5 인치 고정 바늘이 있는 300 ㎕, 500 ㎕ 또는 1000 ㎕ 부피의 AutoJect 2 (Owen Mumford)가 전달 주사기로 사용될 수 있다. 또다른 특정 실시양태에서, 30 게이지의 0.5 인치 고정 바늘이 있는 300 ㎕, 500 ㎕ 또는 1000 ㎕ 부피의 Becton Dickinson UltraFine 주사기가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 약물 전달의 주사 깊이가 제어될 수 있다.

한 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 주사용수 (pH 7.4) 내의 50 ㎎/㎖의 활성 제약 성분, 예를 들어, 서열 9 + 제약상 허용가능한 담체, 예를 들어, 만니톨의 투여량으로 매일 1회 투여된다. 또다른 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 조성물은 pH 7.4의 물 내의 125 ㎎/㎖의 활성 제약 성분, 예를 들어, 서열 9의 투여량으로 매일 1회 투여된다.

실시예

실시예 1

하기의 예들에서, 다양한 생물물리학적 파라미터 및 생물학적 파라미터가 평가되었다. 이러한 파라미터들을 결정하는 일반적인 방법론은 하기와 같다.

HIV 융합 억제제 펩티드 및 기본 서열이 포함되는 펩티드들을 표준 고상 합성 기술을 사용하여, 그리고 표준 FMOC 펩티드 화학, 또는 본원의 실시예 3에 더욱 상세하게 기술된 바와 같은 고상 합성과 용액 상 합성의 조합을 사용하여, 펩티드 합성기 상에서 합성하였다. 이러한 예에서, HIV 융합 억제제 펩티드는 반응성 관능기들을 더 포함할 수 있었고, 즉, 대부분은 아세틸 기에 의해 N-말단에서 및/또는 아미드 기에 의해 C-말단에서 차단되었다. 수지로부터의 절단 후, 펩티드들을 침전시키고, 침전물을 동결건조시켰다. 그후, 펩티드들을 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 펩티드 신원을 전기분무 질량 분광법으로 확인하였다.

생체물리학적 파라메터의 평가는 나선성(helicity) 및 열 안정성의 측정을 포함하였다. 하기와 같이 원형 광이색성 ("CD")에 의해 나선성을 평가하였다. 간략하게, 열전기 온도 조절기가 장착된 분광기를 사용하여 CD 스펙트럼을 수득하였다. 200 nm에서 260 nm까지의 0.5 나노미터 (nm) 단계, 1.5 nm의 대역폭, 및 4초/단계의 전형적인 평균 시간으로 25℃에서 스펙트럼을 수득하였다. 세포/완충제 블랭크(blank)를 차감한 후, 보존적인 윈도우 크기와 함께 3차 최소 제곱 다항식 피트(fit)를 사용하여 스펙트럼을 매끄럽게 하여, 무작위 잔차를 제공하였다. 표준 방법을 사용하여 미처리(raw) 타원율 값을 평균 잔여 타원율로 전환시키고, 파장 (200 ㎚에서 260 ㎚까지) 대 [θ]×10-3 (도 ㎠/dmol)을 플로팅(plotting)하였다. 이후, 표준 방법을 사용하여 나선성 값 백분율을 계산하였다 (일반적으로 10 μM, 25℃에서의 나선성 백분율로 표현됨). 열 안정성의 평가는 1분 평형 시간으로 온도가 2℃ 단계로 상승함에 따른 222 nm에서의 CD 신호의 변화를 모니터함으로써 수행하였다. Tm 값으로 표시되는, 각각의 샘플 (예를 들어, HIV 융합 억제제 펩티드)에 대한 안정성은 열 전이의 일차 도함수의 최대값에 상응하는 온도이다.

생물학적 성질의 평가는 HIV-1 균주에 대한 항바이러스 활성의 측정을 포함하였다. HIV 융합 억제제 펩티드의 항바이러스 활성 (예를 들어, 한 척도는 표적 세포에 대한 HIV의 전파를 억제하는 능력임)을 결정하는 것에서, HIV gp41의 HR 영역으로부터 유래된 펩티드를 사용하여 생성된 데이터에 의해, 생체내에서 관찰되는 항바이러스 활성의 예측인 것으로 나타난 시험관내 분석법이 사용되었다. 더욱 특히, 시험관내 감염성 분석법 ("Magi-CCR5 감염성 분석법"; 예를 들어, 미국 특허 번호 6,258,782 참조)을 사용하여 관찰된 항바이러스 활성은 동일한 HIV gp41 유래 펩티드에 대해 생체 내에서 관찰된 항바이러스 활성과 합리적으로 상관되는 것으로 나타났다 (예를 들어, [Kilby et al., 1998, Nature Med . 4:1302-1307] 참조). 이러한 분석법들은 지표물 세포주 MAGI 또는 CCR5 발현 유도체 cMAGI를 사용하여 감염성 바이러스 역가의 감소를 채점한다. 양쪽 세포주 모두 HIV-LTR에 의해 구동되는 β-갈락토시데이스 리포터 유전자의 발현을 트랜스-활성화시키는 HIV-1 tat의 능력을 활용한다. β-gal 리포터가 핵 내에 국소화되도록 변형되었고, 감염 수일 이내에 강한 핵 염색으로서 X-gal 기질로 검출될 수 있다. 따라서, 염색된 핵의 개수는 염색 전에 오직 1회 라운드의 감염만이 있는 경우 챌린지(challenge) 접종물 내의 감염성 비리온의 개수와 동일한 것으로 해석될 수 있다. 감염된 세포를 CCD-영상화기를 사용하여 계수하고, 1차 단리물 및 실험실-개조 단리물 양쪽 모두 바이러스 입력과 영상화기에 의해 가시화된 감염된 세포수 간에 선형 관계를 나타낸다. MAGI과 cMAGI 분석법에서, 감염성 역가에서의 50％ 감소 (Vn/Vo = 0.5)가 유의하고, 항바이러스 활성을 평가하기 위한 1차 차단값을 제공한다 ("IC50"은 감염성 바이러스 역가에서 50％ 감소를 초래하는 활성 성분의 농도로 정의된다). 항바이러스 활성에 대하여 테스트되는 펩티드를 다양한 농도로 희석하고, 48웰 미량역가 플레이트의 웰 당 약 1500-2000개의 감염된 세포를 산출하도록 조정된 HIV 접종물에 대하여 이중 또는 삼중으로 테스트하였다. (각각의 희석물 내의) 펩티드를 cMAGI 또는 MAGI 세포에 첨가한 후, 바이러스 접종물을 첨가하고, 24시간 후, 감염 및 세포-세포 융합의 억제제 (예를 들어, 서열 2 (엔푸비르티드))를 첨가하여 2차 라운드의 HIV 감염 및 세포-세포 바이러스 확산을 방지하였다. 세포들을 2일 더 배양한 후, 고정시키고, X-gal 기질로 염색하여 HIV로 감염된 세포를 검출하였다. CCD-영상화기로 각각의 대조군 및 펩티드 희석물에 대한 감염된 세포의 개수를 측정한 후, IC50을 계산하였다 (㎍/㎖로 표현됨).

기본 서열로 구성되는 펩티드의 항바이러스 활성에 대해 저항성인 바이러스를 표준 실험실 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 기본적으로, IC50 및 IC90을 계산한 후, 세포가 바이러스, 및 배양물 내의 펩티드 (예를 들어, IC90에 가까운 농도)과 혼합되었다 (세포가 분할된 경우 포함). 합포체가 존재할 때까지 배양물을 유지시키고 모니터링한다. 이러한 1차 라운드의 배양으로부터 수확된 바이러스를 사용하여, 2차 라운드의 배양물 내의 세포를 감염시키고, 이때 펩티드는 1차 라운드의 배양에서 사용된 것보다 높은 (2배 내지 4배) 농도로 존재한다. 2차 라운드의 배양을 유지시키고, 펩티드의 항바이러스 활성에 대해 저항성인 바이러스의 존재에 대해 모니터링한다. 펩티드의 항바이러스 활성에 대해 저항성인 바이러스 단리물을 최종적으로 생성시키기 위해 후속 라운드의 배양이 필요할 수 있다 (이같은 단리물에 대한 펩티드의 미리 결정된 IC50 수준에서).

약동학적 성질을 결정하기 위해, HIV 융합 억제제 펩티드 또는 HIV 융합 억제제 펩티드가 유래되는 기본 서열을 사이노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fasicularis))에게 정맥내 투약하였다 (당업계에 공지된 바와 같이, 다른 동물 모델이 약동학적 성질을 결정하는데 사용될 수 있음). 투약 후의 다양한 시점에, 혈액 샘플을 채취하고, 원심분리에 의해 혈장을 단리하였다. 전자분무 양성-이온 모드에서 LC-MS (액체 크로마토그래피/질량 분광법)에 의해 분석할 때까지 혈장 샘플을 냉동 보관하였다. HIV 융합 억제제 또는 기본 서열을 10 mM 암모늄 아세테이트의 완충제 (pH 6.8) 내의 아세토니트릴의 구배로 C18 또는 C8 HPLC 컬럼으로부터 용출시켰다. 분석 시점에, 0.5％ 포름산을 함유하는 2 또는 3 부피의 아세토니트릴로 혈장 샘플에서 단백질을 제거하였다. 샘플과 동일한 시점에 사이노몰구스 혈장 샘플에서 이중 보정 표준물을 제조하고, HIV 융합 억제제 펩티드 또는 기본 서열을 함유하는 샘플 전후에 분석하였다. 약동학적 성질을 단일-지수 또는 이중-지수 수치 모델을 사용하여 혈장 농도-시간 데이터로부터 계산하였다. 비-선형 최소 제곱 최적화에 의해 모델이 유도되었다. 농도의 1/C² 가중이 사용되었다. 하기 방정식들이 혈장 농도 대 시간 곡선하 면적 (AUC), 전신 소거율 (Cl), 및 최종 제거 반감기 (t ½)를 계산하는데 사용되었다.

AUC = A/-a + B/-b

[식중, A 및 B는 절편이고, a 및 b는 각각 분포 및 제거 단계를 기술하는 지수 방정식의 속도 상수이다]. 단일-지수 모델이 사용되는 경우, "A"와 "a" 속성이 배제되었다.

Cl = 용량/AUC (L/K/hr로 표현됨)

t ½ = -0.6903/b (hr로 표현됨)

실시예 2

본원에서 제공된 실시양태들을 설명하기 위한 목적으로, 기본 서열은 하기의 아미노산 서열 (서열 5)을 갖는다.

한 실시양태에서, HIV 융합 억제제 펩티드는, 자신이 유래된 기본 서열과 비교하여, 2개를 초과하는 류신 지퍼-유사 모티프를 포함한다. 이같은 HIV 융합 억제제 펩티드의 예로는 서열 11, 서열 12 및 서열 13; 또는 서열 11, 서열 12 또는 서열 13 중 어느 하나와 비교하여 1개 내지 3개 사이의 아미노산 차이가 있는 (예를 들어, 동일성이 92％ 이상인) 아미노산 서열이 포함되지만, 이에 한정되지 않고, 각각의 HIV 융합 억제제 펩티드는 3개 내지 5개 사이의 류신 지퍼-유사 모티프의 아미노산 서열을 갖는다. 하기 도식 (I)은 기본 서열의 아미노산 위치 아래쪽 ("｜"를 사용하여 정렬됨)의 1문자 아미노산 코드 ("L"은 류신, "I"는 이소류신)를 사용하여 나타낸 아미노산 차이 (기본 서열에 비교했을 때의 차이)가 있고, 류신 지퍼-유사 모티프에 수반되는 이소류신 및 류신 (동일한 류신 지퍼-유사 모티프의 위치 1 또는 8, 또는 하나의 류신 지퍼-유사 모티프의 위치 8 및 인접한 류신 지퍼-유사 모티프의 위치 1)에 밑줄이 그어진, HIV 융합 억제제 펩티드들의 아미노산 서열을 나타낸다. 하나의 류신 지퍼의 위치 1 또는 8은 서열 내의 또다른 류신 지퍼-유사 모티프의 반대쪽 말단 위치로, 즉 하나의 모티프의 위치 8 및 또다른 후속 모티프의 위치 1로 또한 작용할 수 있다.

(I)

또다른 실시양태에서, HIV 융합 억제제 펩티드는, 자신이 유래된 기본 서열과 비교하여, 1개를 초과하는 류신 지퍼-유사 모티프, 뿐만 아니라, 류신 지퍼-유사 모티프의 형성에 수반되지 않는 추가적인 류신을 포함한다. 이같은 HIV 융합 억제제 펩티드의 예로는 서열 9, 서열 10, 서열 14, 및 서열 15; 또는 서열 9, 서열 10, 서열 14, 또는 서열 15 중 어느 하나와 비교하여 1개 내지 3개 사이의 아미노산 차이가 있는 (예를 들어, 동일성이 92％ 이상인) 아미노산 서열이 포함되지만, 이에 한정되지 않고, 이때 각각의 HIV 융합 억제제 펩티드는 1개를 초과하는 류신 지퍼-유사 모티프, 및 류신 지퍼-유사 모티프의 형성에 수반되지 않는 (즉, 류신 지퍼-유사 모티프의 위치 1 또는 8 이외에서의) 추가적인 류신을 함유하는 것에 의해 서열 5의 기본 서열과 상이하다. 한 실시양태에서, 비-류신 지퍼-유사 모티프 류신 치환은 서열 5의 기본 서열 내의 아미노산 21 위치에서 이소류신을 교체하는데, 이러한 펩티드들에 이로운 생물학적 성질들을 촉진하는 인자를 제공하는 치환이다. 하기 도식 (II)은 기본 서열의 아미노산 위치 아래쪽 ("｜"를 사용하여 정렬됨)의 1문자 아미노산 코드 ("L"은 류신, "I"는 이소류신)를 사용하여 나타낸 아미노산 차이 (기본 서열에 비교했을 때의 차이)가 있고, 류신 지퍼-유사 모티프에 수반되는 이소류신 및 류신 (동일한 류신 지퍼-유사 모티프의 위치 1 또는 8, 또는 하나의 류신 지퍼-유사 모티프의 위치 8 및 인접한 류신 지퍼-유사 모티프의 위치 1)에 밑줄이 그어진, HIV 융합 억제제 펩티드들의 아미노산 서열을 나타낸다. 류신 지퍼-유사 모티프의 형성에 수반되지 않는 류신이 이탤릭체로 표시된다.

(II)

하기 도식 (III)은 "기본 서열"인 서열 5 대 서열 5에 비해 개선된 생물학적 성질들을 나타내는 본 개시물의 펩티드 9-15의 요약 비교를 나타낸다. 서열 5의 기본 서열에 비교하여 서열 9-15 각각에서의 아미노산 치환에 밑줄이 그어지고, 볼드체로 표시된다.

(III)

표 1을 참조로, 본 발명에 따른 HIV 융합 억제제 펩티드를 기본 서열은 동일하지만 아미노산 서열이 (서열 9-15와 비교하여) 상이하고, 항-HIV 활성이 있는 합성 펩티드와 비교하였다. 비교에는 본원의 실시예 1에 기술된 방법을 사용하여 결정된 생체물리학적 파라메터 및 생물학적 활성 파라메터가 포함된다. 항바이러스 활성에 의해 평가되는 생물학적 활성의 결정에서, HIV-매개 융합을 억제하는 것으로 공지된 일부 펩티드의 항바이러스 활성에 대하여 저항성인 바이러스 단리물이 사용된다 (저항성 바이러스 단리물은 표 1에서 "Res"로 명시됨).

서열 6 및 서열 7은 단일 류신 치환 (각각 위치 24 또는 위치 31)에 의해 기본 서열인 서열 5와 상이하고, 상기 표 1에 나타난 바와 같이, 이러한 치환은 항바이러스 활성에는 두드러지게 영향을 미치지 않지만, 이러한 치환은 반감기에서의 개선에 이른다 (하기 표 2 참조). 서열 9의 아미노산 서열에 하나의 추가적인 아미노산 차이인, 아미노산 위치 21에서의 류신이 있다는 것을 제외하고 (반면에, 서열 6에는 아미노산 위치 21에 이소류신이 있음), 서열 6은 서열 9의 본 발명에 따른 HIV 융합 억제제 펩티드와 유사하다. 표 1을 참조하면, 서열 9에서의 이소류신에 대한 류신 치환은, 서열 6의 펩티드와 비교하여 양호한 저항성 프로파일 (저항성 바이러스 단리물 "Res"에 대한 활성)을 유지하면서, 나선성을 감소시킨다 (97％에서 61％로). 유사하게, 서열 10의 아미노산 서열에 하나의 아미노산 차이인, 아미노산 위치 21에서의 류신이 있다는 것을 제외하고 (반면에, 서열 7에는 아미노산 위치 21에 이소류신이 있음), 서열 7은 서열 10의 본 발명에 따른 HIV 융합 억제제 펩티드와 유사한 아미노산 서열이다. 표 1을 참조하면, 서열 10에서의 이소류신에 대한 류신 치환은, 서열 7의 펩티드와 비교하여 양호한 저항성 프로파일 (저항성 바이러스 단리물 "Res"에 대한 활성)을 유지하면서, 나선성을 감소시킨다 (84％에서 77％로). 따라서, 표 1은 서열 6-7에 비해 서열 9 및 10에 대해 개선된 성질을 나타낸다.

이러한 실시양태에서, 기본 아미노산 서열에 비교하여 본 발명에 따른 HIV 융합 억제제 펩티드의 약동학적 성질이 설명된다. 앞서 실시예 1에 더욱 상세하게 기술된 바와 같은 약동학적 성질의 평가 방법을 사용하여, 표 2에서는 기본 서열인 서열 5의 약동학적 성질과 비교하여 본 발명에 따른 대표적인 HIV 융합 억제제 펩티드들의 약동학적 성질이 설명된다.

표 2에 나타난 바와 같이, 서열 6, 7, 9, 및 10 각각은 증가된 생물학적 반감기 ("t½")를 나타낸다. 아미노산 위치 21에서 류신을 함유하지만, 아미노산 위치 24 또는 31에서는 류신을 함유하지 않는 서열 8은 서열 6, 7, 9, 및 10의 펩티드들이 나타낸 반감기에서의 극적인 증가를 나타내지 않는다.

제약 제형의 생산에서 HIV 융합 억제제를 제약상 허용가능한 담체 내로 제형하기 위해, 수용액에서의 안정성이, 특히 제약 제형이 비경구적으로 투여되는 경우, 중요한 파라메터일 수 있다. 본 발명에 따른 HIV 융합 억제제 펩티드가 생리학적 pH에서 수용액에서의 안정성의 개선을 나타낸다는 것을 유념한다. 예를 들어, 10 ㎎/㎖ 농도로 포스페이트-완충 염수 (PBS)에 펩티드를 첨가하고, 37℃에서 약 pH 7.3 내지 약 pH 7.5 범위의 용액에 잔존하는 펩티드의 양을 1주일 (168시간)의 기간에 걸쳐 상이한 시점에 측정 (예를 들어, HPLC에 의해 측정)함으로써, 서열 2, 서열 5의 아미노산 서열을 지니는 합성 펩티드, 및 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 각각 개별적으로 용해도에 대해 테스트하였다. 서열 2를 함유하는 용액은 수시간 후 만에 불안정해졌다 (용액에서 최소의 펩티드가 검출됨). 대조적으로, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드의 90％ 이상은 1주일의 시점에 용액 내에 검출가능하게 잔존하는 반면, 서열 5의 아미노산 서열을 지니는 펩티드의 80％ 미만이 1주일 시점에 용액 내에 검출가능하게 잔존하였다.

실시예 3

본원에서 제공되는 HIV 융합 억제제 펩티드의 생물학적 성질을 서열 2 (엔푸비르티드)가 포함되는 다른 승인된 효과적인 항바이러스제와 비교하였다. 특히, 하기와 같이 상세하게 기술되는, 시험관내 저항성 비교 연구를 관심의 대상이 되는 신규한 서열 9 화합물과 서열 2의 확립된 항바이러스제 간에 수행하였다: MT2 세포를 바이러스 단리물 (IIIB, 030, 060 및 098)로 감염시키고, 서열 2 (엔푸비르티드) 또는 서열 9의 농도를 증가시키면서 배양하여, 저항성에 대해 선별하였다. 초기 펩티드 농도는 상응하는 야생형 단리물에 대한 각각의 펩티드의 IC₅₀의 약 2배였다. 1-3일마다 신선한 펩티드를 첨가함으로써 펩티드 농도를 유지시켰다. 표준 기법을 사용하여 세포병변(cytopathic) 효과 (CPE)에 대하여 배양물을 모니터링하고, 최대 CPE에 도달했을 때, 소량의 분취량의 바이러스를 후속 라운드의 감염에 사용하였다. 야생형 바이러스의 성장 속도와 비교했을 때 배양 시간의 길이에 따라 펩티드 농도가 2 내지 4배 증가되었다. 선별 과정 동안, 펩티드가 없는 바이러스 스톡(stock) 또한 수집하였다. 펩티드가 없는 바이러스 스톡이 디데옥시 서열분석 화학에 의해 gp41 유전자형 변화에 대한 특성화되었고, cMAGI 감염성 분석법을 사용하여 표현형적 감수성이 결정되었다.

서열 2 및 서열 9를 사용한 시험관내 선별들 간의 비교의 결과가 표 3에 제시된다. 이러한 데이터는 배양물에서 서열 9 선별물이 서열 2 선별물보다 평균 3배 더 길어서, IC₅₀에서의 더 낮은 배수 변화 (서열 9에 대한 24배에 비해 서열 2에 대해서는 42배)를 초래하였음을 나타낸다. 이러한 더 낮은 배수 변화를 달성하기 위해 서열 9 선별물은 서열 2 (기하 평균 1.7)보다 더 많은 돌연변이 (기하 평균 3.6)를 필요로 하였다. 더 긴 배양 일수, 더 낮은 배수 변화, 및 더 낮은 배수 변화를 달성하는데 필요한 더 많은 개수의 돌연변이는, 모두, 서열 9가 서열 2와 비교하여 시험관내에서 저항성의 발달에 대한 더 높은 장벽을 나타낸다는 것을 가리킨다. 즉, 이러한 결과는 서열 9에 대한 HIV 저항성이 서열 2에 대한 저항성보다 발생하는데 더 오래 걸린다는 것을 가리킨다. 또다른 펩티드들, 예를 들어, 서열 2 및 T1249에서 수행된 종래의 HIV 저항성 발달 연구를 기초로, 본원에서 제시된 시험관내 결과가 생체내 결과와 합리적으로 상관되어야 함이 예상될 것이다.

또다른 펩티드들, 예를 들어, 서열 2 및 T1249에서 수행된 종래의 HIV 저항성 발달 연구를 기초로, 본원에서 제시된 시험관내 결과가 생체내 결과와 합리적으로 상관되어야 함이 예상될 것이다 (예를 들어, [Melby et al., 2006, AIDS Research and Human Retroviruses 22(5):375-385]; [Greenberg & Cammack, 2004, J. Antimicrobial Chemotherapy 54:333-340]; [Sista et al., 2004, AIDS 18:1787-1794] 참조).

실시예 4

일반적으로, 본원에서 제공되는 HIV 융합 억제제 펩티드는 2개의 방법 각각에 의해 합성될 수 있다. 첫번째 방법은 표준 고상 합성 기술을 사용하고, 표준 Fmoc 펩티드 화학 또는 기타 표준 펩티드 화학 (화학적 보호기 또는 CPG를 사용함)을 사용하는 선형 합성에 의한 것이다. 본원에서 제공되는 HIV 융합 억제제 펩티드의 합성을 위한 두번째 방법은 단편 축합 접근법에 의한 것이다. 간략하게, 생산될 HIV 융합 억제제 펩티드의 완전한 아미노산 서열의 각각의 일부분을 각각의 단편이 함유하는 2개 이상의 단편이 합성된다. 단편의 합성에서, 원한다면, 아미노산의 유리 아민 (예를 들어, 측쇄 아민)이 화학적 보호기에 의해 화학적으로 보호된 아미노산이 혼입될 수 있다. 그후, (정확한 아미노산 서열을 지니는) HIV 융합 억제제 펩티드가 생산되도록 단편이 어셈블리된다 (이러한 펩티드가 생산되도록 하는 방식 및 순서로 함께 공유결합으로 커플링된다).

펩티드 합성과 관련하여, 개별적인 펩티드 단편 자체, 및 펩티드 단편의 군의 조합으로부터 생산되는 본원에서 제공되는 HIV 융합 억제제 펩티드가 펩티드 서열의 합성에 대해 당업자에게 공지되어 있는 기술을 사용하여 각각 제조될 수 있다. 예를 들어, 한 접근법에서, 펩티드 단편이 고상에서 합성된 후, 결과적인 HIV 융합 억제제 펩티드를 생산하기 위한 어셈블리 공정에서, 용액 상에서 조합될 수 있다. 또다른 접근법에서, 용액 상 합성을 사용하여 펩티드 단편을 생산한 후, 이러한 단편이 HIV 융합 억제제 펩티드를 생산하기 위한 어셈블리 공정에서 고상에서 조합될 수 있다. 또다른 접근법에서, 각각의 펩티드 단편이 고상 합성을 사용하여 합성된 후, HIV 융합 억제제 펩티드의 완전한 아미노산 서열을 생산하기 위한 어셈블리 공정에서 고상에서 조합될 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 펩티드 단편이 당업자에게 공지된 고상 합성을 사용하여 생산된다. 또다른 실시양태에서, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드가 일군의 펩티드 단편을 사용하는 고상 및 용액 상 기술이 조합된 어셈블리 공정을 사용하여 생산된다. 예를 들어, 펩티드 단편의 군은 2개 내지 4개 사이의 펩티드 단편을 포함하고, 이들이 합성된 후, 어셈블리되어, 본원에서 제공되는 HIV 융합 억제제 펩티드의 합성이 완료된다. 본원에서의 교시를 기초로, 서열 9-16 중 어느 하나의 아미노산 서열을 지니는 일부 HIV 융합 억제제 펩티드들에 대해, 이러한 단편 어셈블리 접근법이 사용될 수 있고, 사용되어 왔음이 당업자에게 명백하다.

단편 축합 접근법에 의한 본원에서 제공되는 HIV 융합 억제제 펩티드의 생산을 설명하기 위해, 펩티드 단편의 군 내의 펩티드 단편이 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드의 합성 방법에서 펩티드 단편을 어셈블리하는 것에서 공유결합으로 커플링되었다. 본원에서 제공되는 펩티드 단편에는 하기 표 4에 도시된 아미노산 서열을 지니는 것들이 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 본원에서 제공되는 특정 펩티드 단편(들)은 다른 펩티드 단편(들)을 배제하고 사용될 수 있다. 각각의 펩티드 단편의 서열 9 내의 상응하는 아미노산들이 또한 지시된다; 따라서, 각각의 펩티드 단편은 서열 9의 아미노산 서열의 다수의 연속 아미노산으로 구성된다는 것이 제시된다.

서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드의 합성 방법에서 중간체로서 작용하는 펩티드 단편의 특정 군이 본원에서 추가로 제공된다. 본원에서 제공되는 펩티드 단편의 군에는 표 5에 지정된 바와 같은 군 1-16이 포함된다 (군의 번호매김은 오직 설명을 용이하게 하기 위한 것이다). 펩티드 단편의 특정 군(들)은 펩티드 단편의 또다른 군(들)을 배제하고 사용될 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 합성하는데 사용될 수 있는 방법, 펩티드 단편, 및 펩티드 단편의 군이 본원에서 제공된다. 이같은 방법, 펩티드 단편 및 펩티드 단편의 군을 사용하여, 하나 이상의 하기의 화학 기를 함유하는, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 합성할 수 있다는 것이 본원에서의 설명으로부터 또한 명백하다:

[식중, 아미노 말단 끝부분, 카르복실 말단 끝부분, 또는 측쇄의 유리 반응성 관능기 (예를 들어, 내부 라이신의 엡실론 아민) 중 하나 이상이 반응성 관능기, 화학적 보호기 (CPG), 및 링커 중 하나 이상을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는 화학기 (B, U, Z; 식중, B, U, 및 Z는 동일한 화학기 또는 상이한 화학기일 수 있음)에 의해 변형된다]. 펩티드 단편의 N-말단에, 또는 펩티드 단편의 C-말단에, 내부 아미노산의 유리 아민에, 또는 이들의 조합에 화학기를 도입하는데 유용한 기술들이 당업계에 주지되어 있다. 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드의 생산과 관련되어, 보호된 펩티드 단편 (하나 이상의 화학기가 있는 펩티드 단편)의 예시적인 예로는 표 6에 열거된 펩티드 단편이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

Ac는 아세틸 기이고, NH₂는 아미드 기이다 (그러나, 본원의 "정의" 섹션에 더욱 상세히 기술된 바와 같은 또다른 화학기일 수 있다); CPG는 화학적 보호기이다 (예를 들어, 본원의 "정의" 섹션에 더욱 상세히 기술된 바와 같은 Fmoc 또는 기타 N-말단 화학적 보호기); U는 상기 정의된 바와 같다.

초기의 연구 분량이 생산되도록 서열 9가 선형으로 초기에 합성되었다. 먼저 2-단편 합성을 사용하여, 대량의 서열 9를 생산하였고, 2-단편 접근법에 의해 공정에 도입된 효율로 인해, 이러한 경로 (도 3)가 독성학 및 임상 물질의 최초의 GMP 합성에 사용되었다. 3-단편 접근법 (예를 들어, 도 7 참조)이 또한 실행되었다. 선도적인 합성 경로에는, 예를 들어, 아미노산 위치 1-26 및 아미노산 위치 27-37의 단편을 사용하는 2-단편 접근법, 및 아미노산 위치 1-12, 아미노산 위치 13-26, 및 아미노산 위치 27-37의 단편을 사용하는 3-단편 접근법이 포함된다. 서열 9의 원래는 선형인 합성에 대한 다양한 변형이 시험되었다 (실시예 12). 예를 들어, 지베르 아미드 수지, 링크-로딩 CTC 수지, 및 Glu37 측쇄 로딩 수지 상에서, 서열 9가 선형으로 어셈블리되었다. 서열 9를 어셈블리하는데 사용되는 선형 합성 방법의 추가적인 예로는, 예를 들어, 링크-로딩 CTC (도 4), 지베르 수지 (도 5) 및 Glu-로딩 CTC (도 6)를 사용하는 합성이 포함된다.

실시예 5

표 5 (1군 또는 2군) 및 도 7을 참조하여, 3개의 특정 펩티드 단편 (예를 들어, 서열 17-19 + Leu; 또는 서열 17, 18, 및 20)을 사용하고, 상기 3개의 펩티드 단편을 조합하는 것이 수반되는 단편 축합 접근법을 사용하여 HIV 융합 억제제 펩티드를 생산하는, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 합성하기 위한 방법이 설명된다. 각각의 이러한 펩티드 단편은 이들을 고수율 및 고순도로 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 합성하기 위한 방법에서 사용되기에 바람직한 펩티드 단편 (일부 2-단편 접근법들에 비해)이도록 하는 물리적 성질 및 용해도 특성을 나타냈고, 출발 물질로서 오직 하나의 로딩 수지만을 추가로 필요로 한다 (합성 방법의 간소화에서). 서열 17의 아미노산 서열을 지니고 서열 9의 처음 12개의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편 (도 7의 "AA(1-12)" 참조)이 표준 고상 합성에 의해 합성되었고 (초강산 감수성 수지, 예를 들어, 4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시-부티르산 수지 또는 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 (도 7의 "CTC")를 사용함), 이때 N-말단은 아세틸화 (화학기로서의 "Ac")되었고, C-말단에는 카르복실 기 (-COOH)가 있었다 (도 7의 "Ac-AA(1-12)-OH" 참조). 서열 18의 아미노산 서열을 지니고 서열 9의 아미노산 13-26을 포함하는 펩티드 단편 (도 7의 "AA(13-26)" 참조)가 표준 고상 합성에 의해 합성되었고, 이때 N-말단에는 Fmoc (화학적 보호기로서), C-말단에는 -OH가 있었다 (도 7의 "Fmoc-AA(13-26)-OH" 참조). 서열 19의 아미노산 서열을 지니고, 서열 9의 아미노산 27-37을 포함하는 펩티드 단편 (도 7의 "AA(27-37)" 참조)이 표준 고상 합성에 의해 합성되었고, 이때 N-말단에는 Fmoc (화학적 보호기로서), C-말단에는 -OH가 있었다 (도 7의 "Fmoc-AA(27-37)-OH" 참조). 절단 시약, 용매, 및 당업자에게 주지된 기술에 의해 각각의 펩티드 단편을 이의 고상 합성을 위해 사용된 수지로부터 절단하였다. 그후, 증류에 의해 상기 언급된 용매 대부분을 제거하고, 물을 알코올 함유-공용매와 함께 또는 이러한 공용매 없이 첨가하여 펩티드 단편을 침전시킴으로써, 각각의 펩티드 단편을 단리하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 단리하고, 세정하고, 물 또는 알코올/물 내에 다시 슬러리화시키고, 재여과하고, 진공 오븐에서 건조시켰다.

도 7에 나타난 바와 같이, 서열 19의 아미노산 서열을 지니는 펩티드 단편 (도 7의 "Fmoc-AA(27-37)-OH" 참조)을 아미드화된 서열 9의 아미노산 38인 Leu에 용액 상에서 화학적으로 커플링시켜, 서열 20의 아미노산 서열을 갖고 (서열 9의 아미노산 27-38 포함), C-말단의 아미드화 (화학적 보호기로서)가 있는 펩티드 단편이 초래되는 용액 상 합성에 의해 펩티드 단편이 생산되었다 (도 7의 "Fmoc-AA(27-38)-NH₂" 참조). 한 합성 방법에서, 펩티드 단편 H-AA(27-38)-NH₂가 포함되지만 이에 한정되지 않는, 본원에서 제공되는 아미드화 펩티드 단편이 아미드 수지를 사용하여 직접적으로 합성될 수 있다. 이러한 용액 상 반응을 요약하면, 단리된 펩티드 단편 Fmoc-AA(27-37)-OH의 카르복시 말단이 DIEA (디이소프로필에틸 아민) 및 류신 아미드 (예를 들어, 커플링 시약 및 라세미화 반응억제제의 조합물)의 존재 하에 HBTU (0-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 또는 TBTU (O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸테트라플루오로보레이트) 및 HOBT (1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트), 6-Cl HOBT, 또는 HOAT (1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸) 각각을 사용하여 HOBT, 6-Cl HOBT*H₂O, 또는 HOAT의 활성 에스테르로 전환된다. 반응은 0 내지 30℃에서 극성 비양자성 용매 예컨대 DMF (디메틸 포름아미드), DMAc (디메틸아세트아미드) 또는 NMP (N-메틸 피롤리디논) 내에서 실행된다. 커플링 반응 완료 시, 피페리딘, 탄산칼륨, DBU 또는 당업자에게 공지된 기타 염기가 추가적인 공용매와 함께 또는 공용매 없이 반응에 첨가되어, 말단 Fmoc 보호기가 제거된다. 반응 완료 시, 알코올 또는 수-혼화성 용매 및/또는 물이 첨가되어, 서열 20의 아미노산 서열을 지니고, C-말단의 아미드화가 있는 펩티드 단편 (H-AA(27-38)-NH₂)이 침전된다.

도 7에 개략적으로 도해된 바와 같이, 용액 상 공정에서 류신 아미드 (도 3의 "H-Leu-NH₂" 참조)와 조합된 펩티드 단편 Fmoc-AA(27-37)-OH를 사용하여 펩티드 단편 H-AA(27-38)-NH₂를 생산하기 위해, 펩티드 단편 Fmoc-AA(27-37)-OH (571 g, 205 mmol, 1 당량), H-Leu-NH₂ (32.0 g, 246 mmol, 1.2 당량), 및 6-Cl HOBT (41.7 g, 246 mmol, 1.2 당량)를 DMF (4568 ㎖, 8 부피)에 첨가하고, DIEA (53.6 ㎖, 307.5 mmol, 1.5 당량)로 처리하고, 용해될 때까지 실온에서 교반하였다 (약 20분). 용액을 냉각하고, TBTU (79.0 g, 246 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 반응물을 0℃에서, 이어서 25℃에서 교반하였다. HPLC에 의한 분석이 반응이 완료되었음을 나타냈을 때, 피페리딘 (81 ㎖, 820 mmol, 4 당량)을 첨가하여, 펩티드 단편 Fmoc-AA(27-38)-NH₂의 Fmoc 보호기를 제거하였다 (기타 염기 예컨대 탄산칼륨, DBU 등이 사용될 수 있음). HPLC에 의해 완료된 것으로 나타날 때까지 반응물을 30℃에서 교반하였다. 그후, 반응 혼합물을 5℃ 미만으로 냉각하고, 미리 냉각된 물 (8 부피, 4568 ㎖)을 천천히 첨가하여, 생성된 슬러리의 온도를 10℃ 미만으로 유지시켰다. 현탁액을 30분 동안 교반한 후, 여과하고, 25％ 에탄올/물로 2회 세정하였다 (2284 ㎖, 각각 4 부피). 에탄올/물 (약산 포함 또는 미포함) 및/또는 MTBE/헵탄 또는 기타 유사한 용매 혼합물 내에 다시 슬러리화시키는 것에 의해 잔류 피페리딘 및 피페리딘 디벤질풀벤을 제거하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 결과물은 단리된 펩티드 단편 H-AA(27-38)-NH₂의 제제였다.

도 7에 도해된 바와 같이, 펩티드 단편 H-AA(27-38)-NH₂ (서열 20)이 펩티드 단편 Fmoc-AA(13-26)-OH (서열 18)과 조합되고 탈보호되어 펩티드 단편 H-AA(13-38)-NH₂ (N-말단 및 C-말단 각각에 화학기가 있는 서열 35)가 산출되는 용액 상 반응이 이어서 수행되었다.

펩티드 단편 Fmoc-AA(13-26)-OH (460 g, 167 mmol, 1 당량), 펩티드 단편 H-AA(27-38)-NH₂ (460 g, 172 mmol, 1.03 당량), 및 6-Cl HOBT (34 g, 200 mmol, 1.2 당량)를 DMF (6900 ㎖, 15 부피)에 첨가하고, DIEA (47 ㎖, 267 mmol, 1.6 당량)로 처리하고, 교반하여 모든 고체를 용해시켰다. 생성된 용액을 5℃ 미만으로 냉각하였다. 반응물에 TBTU (64 g, 200 mmol, 1.2 당량)를 첨가하고, 반응물을 0℃에서, 이어서 25℃에서 교반하였다. HPLC에 의한 분석이 반응이 완료되었음을 나타내면, 피페리딘 (58 ㎖, 668 mmol, 4 당량)을 첨가하여 Fmoc를 제거하고, HPLC에 의해 완료된 것으로 나타날 때까지 반응물을 교반하였다. 용액을 5℃ 미만으로 냉각하고, 온도가 10℃ 초과로 상승하지 않도록 하는 속도로 천천히 물 (6900 ㎖, 15 부피)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 30분 동안 교반한 후, 여과에 의해 고체를 수집하고, 물 (2회, 각각 2300 ㎖, 5 부피)로 세정하고, 건조시켰다. 에탄올/물 (약산 포함 또는 미포함) 및/또는 MTBE/헵탄 또는 기타 유사한 용매 혼합물 내에 다시 슬러리화시키는 것에 의해 잔류 피페리딘 및 피페리딘 디벤질풀벤을 제거하였다. 여과에 의해 고체를 수집하고, 세정하고, 건조시켜, 순도에 대해 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석에 의해 결정 시, 실질적으로 순수한 백색 고체로서의 H-AA(13-38)-NH₂ (서열 35)가 공급되었다.

도 7에 도해된 바와 같이, 이어서 펩티드 단편 H-AA(13-38)-NH₂ (서열 35)가 용액 상 반응에서 펩티드 단편 Ac-(1-12)-OH (서열 17)와 어셈블리되어, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드 (예를 들어, 도 7의 Ac-(1-38)-NH₂ 참조)가 산출되었다. 펩티드 단편 Ac-AA(1-12)-OH (130 g, 58.5 mmol, 1 당량)를 미세 분말로 분쇄하고, 펩티드 단편 H-AA(13-38)-NH₂ (303 g, 58.5 mmol, 1 당량)와 혼합하였다. 이러한 혼합물을 2:1 DCM/DMF (20 부피, 2600 ㎖) 및 DIEA (25.5 ㎖, 146 mmol, 2.5 당량)의 가온 용액에 천천히 첨가하였다. HOAT (15.9 g, 117 mmol, 2.0 당량)를 첨가하고, 혼합물을 교반하여, 모든 고체를 용해시켰다. 생성된 용액을 5℃ 미만으로 냉각하고, TBTU (28.2 g, 87.8 mmol, 1.5 당량)를 첨가하였다. HPLC가 반응이 완료되었음을 나타낼 때까지, 용액을 30분 동안 0℃에서, 이어서 25℃에서 교반하였다. 용액을 30-35℃로 가온하고, 추가적인 DCM (13 부피, 1740 ㎖)에 이어서 H₂O (1820 ㎖, 14 부피)를 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 교반한 후, 층이 분리되도록 하였다. 수성 층을 제거하고, 신선한 H₂O (1820 ㎖, 14 부피)로 교체하였다. 총 5회에 걸쳐 분리를 반복하였다. 유기층을 이의 원래의 부피의 약 1/3로 증류시키고, 이소프로필 알코올 (IPA; 1820 ㎖, 14 부피)을 첨가하였다. 증류를 계속하여, 잔존하는 DCM을 제거하였다. 생성된 슬러리를 5℃ 미만으로 냉각하고, H₂O (1820 ㎖, 14 부피)를 천천히 첨가하였다. 형성된 고체를 여과에 의해 수집하고, H₂O로 2회 세정하고 (520 ㎖, 각각 4 부피), 건조시켜, 순도에 대해 HPLC 분석에 의해 결정 시, 단리된 HIV 융합 억제제 펩티드 Ac-AA(1-38)-NH₂ (서열 9)의 제제가 공급되었다.

도 7에 나타난 바와 같이, HIV 융합 억제제 펩티드 Ac-AA(1-38)-NH₂의 측쇄 화학적 보호기가 산가수분해에 의해, 또는 측쇄 화학적 보호기를 제거함으로서 펩티드를 탈보호시키는 것에 대해 당업자에게 공지된 임의의 또다른 방법에 의해 제거될 수 있다. 이러한 예에서, HIV 융합 억제제 펩티드 Ac-AA(1-38)-NH₂ (60 g, 8.1 mmol)를 TFA (트리플루오르아세트산):DTT (디티오트레이톨):물 (90:10:5; 570 ㎖)로 처리하고, 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 용액을 10℃ 미만으로 냉각하고, 미리 냉각된 MTBE (25 부피, 1500 ㎖)를 온도가 10℃ 미만으로 유지되도록 하는 속도로 천천히 첨가하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 수집하고, MTBE로 세정하고, 건조시켰다. 이어서, 생성된 분말을 아세토니트릴 (ACN; 10 부피, 600 ㎖) 내에 슬러리화시키고, DIEA 및 아세트산을 사용하여 pH를 4 내지 5 사이로 조정하여, 펩티드를 탈카르복실화시켰다. HPLC에 의해 상기 반응이 완료되었음이 확인되면, 여과에 의해 고체를 수집하고, ACN으로 세정하고, 건조시켜, 탈보호 및 탈카르복실화된 펩티드의 제제가 산출되었고, 이어서 이를 HPLC 또는 기타 적절한 크로마토그래피 기술에 의해 정제하여, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 단리된 보호된 HIV 융합 억제제 펩티드의 제제가 산출되었다.

실시예 6

표 5 (군 3 또는 군 4) 및 도 8을 참조하여, 2개의 특정 펩티드 단편 (예를 들어, 서열 29 & 30 + Leu; 또는 서열 29 & 31)을 사용하고, 2개의 펩티드 단편을 화학적으로 이들을 커플링 ("어셈블리")시킴으로써 조합하는 것이 수반되는 단편 어셈블리 접근법을 사용하여 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 생산하는, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 합성하기 위한 방법이 설명된다. 각각의 이러한 펩티드 단편은 이들을 2개의 펩티드 단편을 사용하는, 고수율 및 고순도로 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 합성하기 위한 방법에서 유용하고/하거나 바람직하게 하는 물리적 성질 및 용해도 특성을 나타냈다. 2-단편 어셈블리 접근법에서 사용될 펩티드 단편의 선별에서, 함께 어셈블리될 2개의 단편 (예를 들어, 서열 29의 아미노산 서열을 지니는 펩티드 단편의 C-말단 아미노산, 및 서열 31의 아미노산 서열을 지니는 펩티드 단편의 N-말단 아미노산) 사이의 접합점에 류신 및/또는 글루탐산 잔기가 있는 것이 고수율의 어셈블리 및 수득되는 순도의 정도에 유리하였음이 발견되었다.

서열 29의 아미노산 서열을 지니고, 서열 9의 처음 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편 ("AA(1-20)")이 표준 고상 합성에 의해 합성되었고, 이때 N-말단이 아세틸화 (화학기로서의 "Ac")되었고, C-말단에는 하이드록실 기 (-OH)가 있었다 (표 6 참조; 본원에서 "Ac-AA(1-20)-OH"로 또한 지칭됨). 서열 30의 아미노산 서열을 지니고, 서열 9의 아미노산 21-37을 포함하는 펩티드 단편 ("AA(21-37)" 참조)가 표준 고상 합성에 의해 합성되었고, 이때 N-말단에는 Fmoc (화학적 보호기로서), C-말단에는 -OH가 있었다 (표 6 참조, 본원에서 "Fmoc-AA(21-37)-OH"로 또한 지칭됨).

표 5 (군 3 또는 군 4) 및 도 8에 나타난 바와 같이, 펩티드 단편 Fmoc-AA(21-37)-OH를 아미드화된 서열 9의 아미노산 38인 Leu에 용액 상에서 화학적으로 커플링시켜, 서열 31의 아미노산 서열을 지니고 (서열 9의 아미노산 21-38 포함), C-말단의 아미드화 (화학적 보호기로서)가 있는 펩티드 단편이 초래되는 용액 상 합성에 의해 펩티드 단편이 생산되었다 ("Fmoc-AA(21-38)-NH₂"). 용액 상 공정에서 류신 ("H-Leu NH₂")과 조합된 펩티드 단편 Fmoc-AA(21-37)-OH를 사용하여 펩티드 단편 Fmoc-AA(21-38)-NH₂를 생산하기 위해, 펩티드 단편 Fmoc-AA(21-37)-OH (30 g, 7.43 mmol, 1.0 당량), H-Leu-NH₂*HCl (1.36 g, 8.16 mmol, 1.2 당량), 및 HOAT (1.52 g, 11.2 mmol, 1.5 당량)를 DMF (450 ㎖, 15 부피)에 용해시키고, DIEA (6.5 ㎖, 37.3 mmol, 5 당량)로 처리하고, 용해될 때까지 실온에서 교반하였다 (약 30분). 용액을 0±5℃로 냉각하고, TBTU (2.86 g, 8.91 mmol, 1.2 당량)를 첨가하고, 5분 동안 0±5℃에서 교반한 후, 25±5℃에서 2시간 동안 또는 HPLC에 의해 완료된 것으로 나타날 때까지 반응시켰다.

그후, 펩티드 단편 Fmoc-AA(21-38)-NH₂의 Fmoc 화학적 보호기를 제거하고 나서, 단편 H-AA(21-38)-NH₂를 단리하였다. 피페리딘 (7.3 ㎖, 73.8 mmol, 10 당량)을 첨가하고, 25±5℃에서 1시간 동안, 또는 HPLC에 의한 분석이 실질적으로 모든 Fmoc가 펩티드 단편으로부터 제거되었음을 나타날 때까지 용액을 교반하였다. 반응기를 냉각하고, 물 (1000 ㎖, 30 부피)을 첨가하고, 자유 유동성 슬러리를 30분 동안 10℃ 미만에서 교반한 후, 여과에 의해 단리하였다. 수집된 고체를 1:1 EtOH/물로 세정하고, 35±5℃ 진공 오븐에서 건조시켰다. 그후, 펩티드 단편을 3시간 동안 1:1 EtOH/물 (450 ㎖, 15 부피) 내에 다시 슬러리화시켰다. 고체를 수집하고, 건조시켰다. 그후, 펩티드 단편을 하룻밤 동안 3:1 헥산:MTBE (450 ㎖, 15 부피) 내에 슬러리화시킨 후, 여과에 의해 단리하고, 재건조시켰다. 필요하다면 MTBE를 다시 슬러리화시키는 것을 반복하여, 추가적인 피페리딘을 제거할 수 있다. 결과는 단리된 펩티드 단편 H-AA(21-38)-NH₂의 제제이다 (도 8 참조).

그후, 펩티드 단편 H-AA(21-38)-NH₂ (서열 31)가 펩티드 단편 Ac-AA(1-20)-OH (서열 29)와 조합되어 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드 (도 8의 Ac-(1-38)-NH₂ 참조)가 산출되는 용액 상 반응이 수행되었다. 펩티드 단편 H-AA(21-38)-NH₂ (3.40 g, 0.86 mmol, 1 당량), 펩티드 단편 Ac-AA(1-20)-OH (3.00 g, 0.86 mmol, 1.0 당량), 및 HOAT (0.177 g, 1.3 mmol, 1.5 당량) 및 DIEA (0.599 ㎖, 3.44 mmol, 4 당량)를 DMAc (디메틸 아세트아미드; 100 ㎖, 33 부피)에 용해시키고, 0±5℃로 냉각하였다. 반응물에 TBTU (0.331 g, 1.03 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 5분 동안 0±5℃에서, 그리고 25±5℃에서 3시간 동안 또는 HPLC에 의해 반응이 완료된 것으로 나타날 때까지 반응물을 교반하였다. 반응기를 냉각하고, 물 (200 ㎖, 66 부피)을 천천히 첨가하였다. 슬러리가 형성되었고, 이를 적어도 30분 동안 10℃ 미만에서 교반하였다. 여과에 의해 고체를 단리하고, 추가적인 물로 세정하였다. 수집된 고체를 35±5℃의 진공 오븐에서 건조시켰다. 결과는, 순도에 대해 HPLC 분석에 의해 결정 시, 완전하게 보호된, 단리된 HIV 융합 억제제 펩티드 Ac-AA(1-38)-NH₂ (서열 9)의 제제였다. 그후, 탈보호 및 탈카르복실화를 위해, 본원에서 실시예 5에 기술된 방법, 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 방법을 사용함으로써, HIV 융합 억제제 펩티드를 (측쇄 화학적 보호기를 제거하는 것에 의해) 탈보호시키고, (트립토판 잔기에서) 탈카르복실화시킨 후, 정제하였다 (예를 들어, HPLC에 의해). 결과는 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드의 제제 (탈보호 및 탈카르복실화됨)였다 (이러한 실례에서는, N-말단에서는 아세틸화, C-말단에서는 아미드화됨).

유사한 기술 및 조건을 사용하여, 2-단편 어셈블리 또는 3-단편 어셈블리가 수반되는 추가적인 단편 어셈블리 접근법들이 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 생산하는데 사용되었다 (예를 들어, 표 4 및 5 참조). 본 발명의 방법에 의해 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 생산하는데 사용된 바람직한 펩티드 단편이 바람직한 펩티드 단편 이외의 펩티드 단편을 배제하고 사용될 수 있다는 것이 본원의 설명으로부터 이해된다. 유사하게, 본 발명의 방법에 의해 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 생산하는데 사용되는 펩티드 단편의 바람직한 군이 펩티드 단편의 바람직한 군 이외의 펩티드 단편의 군들을 배제하고 사용될 수 있다.

실시예 7

본 발명의 또다른 실시양태는 서열 10의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 합성하는데 사용될 수 있는 방법, 펩티드 단편, 및 펩티드 단편의 군에 관한 것이다. 이같은 방법, 펩티드 단편 및 펩티드 단편의 군을 사용하여, 하나 이상의 하기의 화학 기를 함유하는, 서열 10의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 합성할 수 있다는 것이 본원에서의 설명으로부터 또한 명백하다:

[식중, 아미노 말단 끝부분 또는 카르복실 말단 끝부분 중 하나 또는 양쪽 모두가 반응성 관능기, 화학적 보호기 (CPG), 및 링커 중 하나 이상을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는 화학기 (B, U, Z; 식중, B, U, 및 Z는 동일한 화학기 또는 상이한 화학기일 수 있음)에 의해 변형된다]. 서열 10의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드의 생산과 관련되어, 펩티드 단편, 펩티드 단편의 군, 및 보호된 펩티드 단편 (하나 이상의 화학기가 있는 펩티드 단편)의 예시적인 예로는 각각 표 7, 8, & 9에 열거된 것들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

서열 10의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드의 합성 방법에서 중간체로서 작용하는 펩티드 단편의 특정 군이 본원에서 추가로 제공된다. 본원에서 제공되는 펩티드 단편의 군에는 표 8에 지정된 바와 같은 군 1-14가 포함된다 (군의 번호매김은 오직 설명을 용이하게 하기 위한 것이다). 펩티드 단편의 특정 군(들)은 펩티드 단편의 또다른 군(들)을 배제하고 사용될 수 있다.

표 8 (군 3 또는 군 4)를 참조하여, 2개의 특정 펩티드 단편 (예를 들어, 서열 29 & 48 + Leu; 또는 서열 29 & 49)을 사용하고, 2개의 펩티드 단편을 화학적으로 이들을 커플링 ("어셈블리")시킴으로써 조합하는 것이 수반되는 단편 어셈블리 접근법을 사용하여 서열 10의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 생산하는, 서열 10의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 합성하기 위한 방법이 설명된다. 용액 상 공정에서 류신 ("H-Leu-NH₂")과 조합된 서열 48의 아미노산 서열을 지니는 펩티드 단편 ("Fmoc-AA(21-37)-OH")을 사용하여 서열 49의 아미노산 서열을 지니는 펩티드 단편 ("Fmoc-AA(21-38)-NH₂")을 생산하기 위해, 펩티드 단편 Fmoc-AA(21-37)-OH (30.01 g, 7.98 mmol, 1.0 당량), H-Leu-NH₂*HCl (1.48 g, 8.78 mmol, 1.1 당량), 및 HOAT (1.63 g, 11.97 mmol, 1.5 당량)를 DMF (450 ㎖, 15 부피)에 용해시키고, DIEA (7.0 ㎖, 39.91, mmol, 5 당량)로 처리하고, 용해될 때까지 실온에서 교반하였다 (약 30분). 용액을 0±5℃로 냉각하고, TBTU (3.09 g, 9.58 mmol, 1.2 당량)를 첨가하고, 5분 동안 0±5℃에서 교반한 후, 25±5℃에서 2시간 동안 또는 HPLC에 의해 반응이 완료된 것으로 나타날 때까지 반응시켰다.

그후, 펩티드 단편 Fmoc-AA(21-38)-NH₂의 Fmoc 화학적 보호기를 제거하고 나서, 단편 H-AA(21-38)-NH₂를 단리하였다. 피페리딘 (8.0 ㎖, 79.8 mmol, 10 당량)을 첨가하고, 25±5℃에서 1.5시간 동안, 또는 HPLC에 의한 분석이 실질적으로 모든 Fmoc가 펩티드 단편으로부터 제거되었음을 나타낼 때까지 용액을 교반하였다. 반응기를 냉각하고, 물 (1000 ㎖, 30 부피)을 첨가하고, 자유 유동성 슬러리를 30분 동안 10℃ 미만에서 교반한 후, 여과에 의해 단리하였다. 수집된 고체를 1:3 EtOH/물로 세정하고, 35±5℃ 진공 오븐에서 건조시켰다. 그후, 펩티드 단편을 3시간 동안 1:3 EtOH/물 (400 ㎖, 13 부피) 내에 다시 슬러리화시켰다. 고체를 수집하고, 건조시킨 후, 펩티드 단편을 하룻밤 동안 3:1 헥산:MTBE (400 ㎖, 13 부피) 내에 슬러리화시킨 후, 여과에 의해 단리하고, 재건조시켰다. 필요하다면 MTBE를 다시 슬러리화시키는 것을 반복하여, 추가적인 피페리딘을 제거할 수 있다. 결과는 단리된 펩티드 단편 H-AA(21-38)-NH₂의 제제이다 (표 9의 서열 49 참조).

그후, 펩티드 단편 H-AA(21-38)-NH₂ (서열 49)가 펩티드 단편 Ac-AA(1-20)-OH (서열 29, 표 9)와 조합되어 서열 10의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드 (예를 들어, Ac-(1-38)-NH₂ 참조)가 산출되는 용액 상 반응이 수행되었다. 펩티드 단편 H-AA(21-38)-NH₂ (3.14 g, 0.86 mmol, 1 당량), 펩티드 단편 Ac-AA(1-20)-OH (3.00 g, 0.86 mmol, 1.0 당량), 및 HOAT (0.18 g, 1.3 mmol, 1.5 당량) 및 DIEA (0.599 ㎖, 3.44 mmol, 4 당량)를 DMAc (100 ㎖, 33 부피)에 용해시키고, 0±5℃로 냉각하였다. 반응물에 TBTU (0.331 g, 1.03 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 5분 동안 0±5℃에서, 그리고 25±5℃에서 3시간 동안 또는 HPLC를 사용하여 반응이 완료된 것으로 나타날 때까지 반응물을 교반하였다. 반응기를 냉각하고, 물 (250 ㎖, 83 부피)을 천천히 첨가하였다. 슬러리가 형성되었고, 이를 적어도 30분 동안 10℃ 미만에서 교반하였다. 여과에 의해 고체를 단리하고, 추가적인 물로 세정하였다. 수집된 고체를 35±5℃의 진공 오븐에서 건조시켰다. 결과는, 순도에 대해 HPLC 분석에 의해 결정 시, 완전하게 보호된, 단리된 HIV 융합 억제제 펩티드 Ac-AA(1-38)-NH₂ (서열 10)의 제제였다. 그후, 탈보호 및 탈카르복실화를 위해, 본원에서 실시예 4에 기술된 방법, 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 방법을 사용함으로써, HIV 융합 억제제 펩티드 Ac-AA(1-38)-NH₂를 (측쇄 화학적 보호기를 제거하는 것에 의해) 탈보호시키고, (트립토판 잔기에서) 탈카르복실화시켰다. 정제 후, HPLC를 사용하여 결정 시, 결과는 서열 10의 아미노산 서열을 지니는 단리된 HIV 융합 억제제 펩티드의 제제 (탈보호 및 탈카르복실화됨)였다 (N-말단에서는 아세틸화, C-말단에서는 아미드화됨).

유사한 기술 및 조건을 사용하여, 2-단편 어셈블리 또는 3-단편 어셈블리가 수반되는 추가적인 단편 어셈블리 접근법들이 서열 10의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 표 8 및 9 참조). 본원에서 제공된 방법에 의해 서열 10의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 생산하는데 사용된 펩티드 단편이 다른 펩티드 단편을 배제하고 사용될 수 있다는 것이 본원의 설명으로부터 이해된다. 유사하게, 본원에서 제공된 방법에 의해 서열 10의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드를 생산하는데 사용되는 펩티드 단편의 군이 펩티드 단편의 또다른 군들을 배제하고 사용될 수 있다.

실시예 8

서열 9 펩티드의 합성에서 Ac-AA(1-26)-OH 및 Fmoc-AA(27-38)-OH를 사용하는 2-단편 접근법이 개발되었다. 서열 9의 단편 Ac-AA(1-26)-OH 및 Fmoc-AA(27-37)-OH가 먼저 표준 고상 합성 기술에 의해 합성되었다.

Fmoc-AA (27-37)-OH의 합성을 위해, 수지 (2-CTC, 2 ㎏, 3.1 mol 활성 Cl)를 DCM (10 부피, 20 L)에서 15-30분 동안 25±5℃에서 팽창시킨 후, 배수시키면서, Fmoc-Glu(Otbu)-OH*H₂O (0.45 당량, 619 g, 1.40 mol) 및 DIEA (Glu에 대해 3 당량, 4.19 mmol, 729 ㎖)의 용액을 DCM (5 부피, 10 L) 내에서 제조하였다. 수지를 DCM (5 부피, 10 L) 내에 다시 슬러리화시키고, 아미노산 용액을 수지에 첨가하고, 슬러리를 2시간 동안 25+5℃에서 진탕시켰다. 용기를 배수시키고, 수지를 NMP (4 부피, 8 L) 내에 슬러리화시켰다. 말단-캡핑 용액인 9:1 (v/v) MeOH/DIEA (6 부피, 12 L)를 첨가하고, 슬러리를 40-50분 동안 25±5℃에서 슬러리화시켰다. 용기를 배수시키고, 수지를 DCM (2 × 6 부피, 각각 900 ㎖)으로 세정하였다. 그후, 수지를 NMP (4 부피, 600 ㎖)로 세정하고, 10℃에서 보관하였다.

수지를 NMP (10 부피, 20 L)에서 30-60분 동안 25±5℃에서 팽창시킨 후, 배수시켰다. 30±5℃에서의 2 × 20-40분 × 5 부피의 NMP 내 10％ PIP로의 탈보호를 사용하여 단편의 어셈블리가 달성되었다. 그후, 음성 클로라닐(Chloranil) 테스트가 수득될 때까지 수지를 NMP로 세정하였다. 15분 동안 0-5℃에서 1.5 당량의 보호된 아미노산, 1.5 당량의 6-Cl HOBt, 1.7 당량의 DIEA, 및 1.5 당량 TBTU를 사용하여 DMF (6 부피)에서의 예비활성화 후 커플링이 개시되었다. 커플링 용액을 첨가한 후, DMF 세정액 (2 부피)을 첨가하였고, 카이저(Kaiser) 테스트에 의해 완료될 때까지 30±5℃에서 4시간까지 반응이 진행되도록 하였다. 3시간 후에 완료되지 않으면, 재커플링을 수행하였다. 커플링이 완료되면, 수지를 NMP (3 × 6 부피, 12L)로 각각 5분 동안 세정하였다.

완료된 수지-결합 단편을 8 부피의 NMP (16 L)로 2×, 8 부피의 DCM (16 L)로 4× 세정하였다. 수지를 2 부피 (4 L)의 DCM 내에 슬러리화시키고, 5℃ 미만으로 미리 냉각된 DCM 내의 1％ TFA (5 부피, 10 L)를 첨가하였다. 슬러리를 5분 동안 교반한 후, 피리딘 (TFA에 대해 1.26 부피, 126 ㎖)을 함유하는 카보이(carboy) 내로 여과하였다. 5℃ 미만으로 미리 냉각된 DCM 내의 1％ TFA (5 부피, 10 L)의 또다른 일부분을 첨가하고, 교반하고, 전과 같이 배수시켰다 (2 부피의 예비팽창 없이). 추가적인 3회의 TFA/DCM 처리를 수행하였다 (총 5회). 수지를 DCM (5 부피, 10 L) 내에 5분 동안 슬러리화시키고, 배수시키고, 여과액을 생성물에 대해 HPLC에 의해 모니터링하였다. 세정액 내의 생성물의 양이 최소일 때까지 DCM 세정을 계속하였다. 풀링된 DCM 여과액으로부터 나머지 용액이 4 부피 수준 (8 L) 미만일 때까지 증류에 의해 DCM을 제거하였다. 이소프로판올 (8 부피, 16 L)을 첨가하고, IPA 슬러리 내의 잔류 DCM 함량이 <1％일 때까지 계속 증류하였다. 농축물을 <10℃으로 냉각하고, 미리 냉각된 물 (8 부피, 16 L)을 10℃ 미만의 온도를 유지시키는 속도로, 생성물이 침전되도록 빠르게 진탕하면서 첨가하였다. 슬러리를 10-15℃로 가온하고, 숙성시켰다. 생성물을 여과에 의해 단리하고, 물 (2 × 4 부피)로 세정하였다. 고체를 공기 건조시킨 후, 20％ IPA/물 (10 부피) 내에 다시 슬러리화시켰다. 생성물을 여과에 다시 단리하고, 물 (2 부피)로 세정하고, 30-40℃의 진공 오븐에서 일정한 중량으로 건조시켰다. 2618 g (72.6 ％)의 백색 분말이 회수되었다.

단편 Ac-AA(1-26)-OH의 합성을 위해, 수지 (2-CTC, 1.5 ㎏, 2.3 mol의 활성 Cl)를 단편 Fmoc-AA(27-37)-OH에 대한 상기와 같이 로딩시켰다. 단편 Ac-AA(1-26)-수지를 상기와 같이 어셈블리시키고, 유사한 방식으로 절단하였다. 2841 g (61.6％)의 백색 분말이 회수되었다.

단편 H-AA(27-38)-NH₂의 상응하는 합성이 용액 상 합성에 의해 초래되었고, 이때 펩티드 단편 Fmoc-AA(27-37)-OH가 용액 상에서 H-Leu-NH₂ (아미노산 38)에 화학적으로 커플링되어 Fmoc-AA(27-38)-NH₂가 산출된 후, N-말단 Fmoc 보호기가 제거되어 H-AA(27-38)-NH₂가 산출되었다. 별법적인 염기 (K₂CO₃, DBU, N-메틸 피페리딘, 및 DEA (디에틸아민)가 사용될 수 있다.

펩티드 단편 Fmoc-AA(27-38)-NH₂를 생산하기 위해, 펩티드 단편 Fmoc-AA(27-37)-OH (2618 g, 940 mmol, 1.0 당량), H-Leu-NH₂ (153 g, 1.18 mol, 1.25 당량) (H-Leu-NH₂ HCl 염이 또한 사용됨), 및 6-Cl-HOBT (183 g, 1.08 mol, 1.15 당량)을 DMF (18.3 L, 7 부피)에 용해시키고, DIEA (287 ㎖, 1.65 mol, 1.75 당량)로 처리하고, 2.5℃ 미만으로 냉각하면서 용해될 때까지 교반하였다. TBTU (347 g, 1.08 mol, 1.15 당량)를 DMF (1 부피, 2.6 L)에 슬러리화시켜 첨가하고, 용액을 15분 동안 0±5℃에서 교반한 후, HPLC에 의해 반응이 완료된 것으로 나타날 때까지 35±5℃에서 반응시켰다.

그후, 펩티드 단편 Fmoc-AA(27-38)-NH₂의 Fmoc 화학적 보호기를 제거하고 나서, 단편 H-AA(27-38)-NH₂를 단리하였다. 피페리딘 (372 ㎖, 3.76 mol, 4 당량)을 첨가하고, HPLC에 의한 분석이 실질적으로 모든 Fmoc가 펩티드 단편으로부터 제거되었음을 나타낼 때까지 35±5℃에서 용액을 교반하였다. 용액을 10℃ 미만으로 냉각하고, 미리 냉각된 물 (20.8 L, 8 부피)을 천천치 첨가하여, 생성물을 침전시켰다. 자유 유동성 슬러리를 10-15℃에서 숙성시킨 후, 여과에 의해 단리하였다. 수집된 고체를 25％ EtOH/물로 세정하고, 공기 건조시켰다. 그후, 펩티드 단편을 >2시간 동안 25％ EtOH/물 (20.8 L, 8 부피) 내에 다시 슬러리화시켰다. 고체를 수집하고, 세정하고, 공기 건조시켰다. 그후, 습윤 고체를 MTBE/헵탄 (1:1, 8 부피, 20.8 L) 내에 다시 슬러리화시키고, 여과에 의해 수집하고, MTBE/헵탄 (2 × 4 부피, 각각 10.4 L)으로 세정하고, 공기 건조시켰다. 제2의 MTBE/헵탄 재슬러리화를 수행한 후, 고체를 35±5℃의 진공 오븐에서 건조시켰다. 결과는 2475 g (98.4％)의 단리된 펩티드 단편 H-AA(27-38)-NH₂의 제제였다.

단편 Ac-AA(1-38)-NH₂의 제조를 위해, 펩티드 단편 H-AA(27-38)-NH₂가 펩티드 단편 Ac-AA(1-26)-OH와 조합되어 Ac-(1-38)-NH₂가 산출되는 용액 상 반응이 수행되었다. 펩티드 단편 Ac-AA(1-26)-OH (1.18 ㎏, 0.25 mol, 1.0 당량), 펩티드 단편 H-AA(27-38)-NH₂ (836 g, 0.31 mol, 1.25 당량), 6-Cl-HOBT (57 g, 338 mmol, 1.35 당량) 및 DIEA (78 ㎖, 0.45 mol, 1.8 당량)를 DMF (8.9 L, 7.5 부피)에 용해시키고, 2.5 ℃ 미만으로 냉각하였다. DMF (0.5 부피, 0.6 L) 내에 슬러리화된 TBTU (108 g, 338 mmol, 1.35 당량)를 반응물에 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 O±5℃에서, 그리고 HPLC에 의해 반응이 완료된 것으로 나타날 때까지 30±5℃에서 교반하였다. 반응기를 냉각하고, 미리 냉각된 물 (9.4 L, 8 부피)을 빠르게 교반하면서 첨가하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 단리하고, 추가적인 물로 세정하였다. 고체를 20％ 에탄올/물 (7.1 L, 6 부피) 내에 다시 슬러리화시키고, 여과에 의해 재수집하고, 물로 세정하였다. 수집된 고체를 35±5℃의 진공 오븐에서 건조시켰다. 결과는 2005 g (108％)의 완전하게 보호된, 단리된 HIV 융합 억제제 펩티드 Ac-AA(1-38)-NH₂의 제제였다.

미정제 서열 9 펩티드의 합성을 위한 공정의 한 양상으로서, HIV 융합 억제제 펩티드 Ac-AA(1-38)-NH₂의 측쇄 화학적 보호기가 산가수분해에 의해, 또는 측쇄 화학적 보호기를 제거함으로서 펩티드를 탈보호시키는 것에 대해 당업자에게 공지된 임의의 또다른 방법에 의해 제거될 수 있다. 한 예로서, HIV 융합 억제제 펩티드 Ac-AA(1-38)-NH₂ (678 g, 92 mmol)를 TFA (트리플루오로아세트산):DTT (디티오트레이톨):물 (90:15:5; 10 부피)로 처리하고, 20 +/- 2℃에서 5시간 동안 교반하였다. 바람직한 실시양태에서, 5 당량보다는 10-15 당량의 DTT가 결과를 최적화하도록 사용되었다. 용액을 10℃ 미만, 바람직하게는 5℃ 미만으로 냉각하고, 미리 냉각된 MTBE (25 부피, 17 L, 0℃ 미만, 바람직하게는 -15℃ 미만)를 온도가 여전히 10℃ 미만, 바람직하게는 7℃ 내지 8℃ 사이이도록 하는 속도로 천천히 첨가하였다. 슬러리를 10-15℃에서 숙성시키고, 생성된 고체를 여과에 의해 수집하고, MTBE로 세정하고, 공기 건조시켰다. 그후, 생성된 분말을 아세토니트릴 (ACN; 10 부피, 6.8 L) 내에 슬러리화시키고, DIEA 및 아세트산으로 pH를 4 내지 5 사이로, 바람직하게는 5에 가깝도록 조정하고, 슬러리를 25±5℃에서 교반하여, 펩티드를 탈카르복실화시켰다. HPLC에 의해 이러한 반응이 완료되면, 고체를 여과에 의해 수집하고, ACN으로 세정하고, 건조시켜, 탈보호 및 탈카르복실화된 펩티드의 제제 (414 g, 100％)가 산출되었다.

한 실시양태에서, 1144 펩티드 서열 9가 정제되었고, 농축되었으며, 농축 컬럼으로부터 직접적으로 침전되었다. 수성 NH₄OAc/아세토니트릴 완충제 내에서의 3회 RP-HPLC 주입에 의해 서열 9 (270 g)가 정제되었다. 허용가능한 분획들을 풀링하고, 완충제 내의 아세토니트릴의 총량이 약 28％일 때까지 물로 희석하였다. 용액을 HPLC 컬럼 상에 다시 로딩하고, 1:1 수성 NaOAc/아세토니트릴 완충제로 펩티드를 용출시켰다. 풀링된 분획의 pH를 5-6으로 조정한 후, 아세토니트릴을 용액에 첨가함으로써 아세토니트릴의 총량을 85％ 초과에 이르게 하였다. 침전된 고체를 진공 여과에 의해 수집하고, 90％ 아세토니트릴/물로 세정하고, 진공 오븐에서 건조시켜, 78 g의 순수한 서열 9 펩티드가 산출되었다.

실시예 9

2-단편 링크(Rink)-로딩 CTC 전략을 사용하는 한 접근법에서, N-말단의 H 및 C-말단의 화학적 보호기로서의 링크 링커-OH (p-[(R,S)-α-아미노-2,4-디메톡시벤질]-페녹시아세트산)가 있는 H-AA(27-38)-링크-OH (표 1의 서열 27)가 표준 고상 합성에 의해 합성되었다.

그후, 펩티드 단편 H-AA(27-38)-링크-OH (서열 18)이 펩티드 단편 Ac-AA(1-26)-OH (서열 10)과 조합되어, 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드가 산출된 용액 상 반응이 수행되었다. 펩티드 단편 Ac-AA(1-26)-OH (1.0 g, 0.21 mmol, 1.0 당량), 6-Cl-HOBT (39 ㎎, 0.23 mmol, 1.1 당량) 및 DIEA (55 ㎕, 0.32 mmol, 1.5 당량)를 DMF (10 ㎖, 10 부피)에 용해시키고, 0-5℃로 냉각하였다. 반응물에 TBTU (71 ㎎, 0.22 mmol, 1.05 당량)를 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 0-5℃에서 교반하고, DMF (2 ㎖) + DIEA (37 ㎕, 0.21 mmol, 1.0 당량)에 별도로 용해되고 0-5℃로 냉각된 펩티드 단편 H-AA(27-38)-링크-OH (628 ㎎, 0.21 mmol, 1.0 당량)을 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 0-5℃에서, 그리고 25 ±5℃에서 3시간 동안 또는 HPLC에 의해 반응이 완료된 것으로 나타날 때까지 교반하였다. 반응기를 냉각하고, 빠르게 교반하면서 물 (10 부피)을 첨가하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 단리하고, 추가적인 물로 세정하였다. 고체를 물/이소프로판올 내에 다시 슬러리화시키고, 여과에 의해 재수집하고, 물로 세정하였다. 수집된 고체를 35±5℃의 진공 오븐에서 건조시켰다. 결과는 1.55 g (95.7％)의 완전하게 보호된, 단리된 HIV 융합 억제제 펩티드 Ac-AA(1-38)-링크-OH의 제제였다. 그후, 탈보호 및 탈카르복실화를 위해, 상기 기술된 방법, 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 방법을 사용함으로써, HIV 융합 억제제 펩티드를 (측쇄 화학적 보호기 및 C-말단 링크 기를 제거하는 것에 의해) 탈보호시키고, (트립토판 잔기에서) 탈카르복실화시킨 후, 정제하였다 (예를 들어, HPLC에 의해). 결과는 서열 9의 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드의 제제 (탈보호, 탈카르복실화 및 정제됨)였다 (이러한 실례에서는, N-말단에서는 아세틸화, C-말단에서는 아미드화됨).

실시예 10

추가적인 실시양태에서, 서열 9 펩티드를 생성시키기 위해 초강산 감수성 수지와 함께 2-단편 접근법을 사용하여, N-말단의 H 및 C-말단의 -NH₂가 있는 서열 9의 아미노산 27-38을 포함하는 펩티드 단편 ("H-AA(27-38)-NH₂")이 지베르 아미드 수지 (래미지(Ramage)와 같은 기타 수지가 사용될 수 있음 상에서 표준 고상 합성에 의해 합성되었다).

그후, 펩티드 단편 H-AA(27-38)-NH₂가 펩티드 단편 Ac-AA(1-26)-OH (서열 40)과 조합되어 서열 9의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드가 산출되는 용액 상 반응이 수행되었다. 펩티드 단편 Ac-AA(1-26)-OH (1 g, 0.21 mmol, 1.0 당량), 펩티드 단편 H-AA(27-38)-NH₂ (677 ㎎, 0.25 mmol, 1.2 당량), 6-Cl-HOBT (39 ㎎, 0.23 mmol, 1.1 당량) 및 DIEA (92 ㎕, 0.053 mmol, 2.5 당량)를 DMF (10 ㎖, 10 부피)에 용해시키고, 0-5℃로 냉각하였다. 반응물에 TBTU (75 ㎎, 0.23 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 0-5℃에서 교반한 후, 25±5℃에서 3시간 동안 또는 HPLC에 의해 반응이 완료된 것으로 나타날 때까지 교반하였다. 반응기를 냉각하고, 빠르게 교반하면서 물 (10 부피)을 첨가하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 단리하고, 추가적인 물로 세정하였다. 고체를 물/이소프로판올 내에 다시 슬러리화시키고, 여과에 의해 재수집하고, 물로 세정하였다. 수집된 고체를 35±5℃의 진공 오븐에서 건조시켰다. 결과는 1.58 g (101％)의 완전하게 보호된, 단리된 HIV 융합 억제제 펩티드 Ac-AA(1-38)-NH₂의 제제였다. 그후, 탈보호 및 탈카르복실화를 위해, 상기 기술된 방법, 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 방법을 사용함으로써, HIV 융합 억제제 펩티드를 (측쇄 화학적 보호기 및 C-말단 링크 기를 제거하는 것에 의해) 탈보호시키고, (트립토판 잔기에서) 탈카르복실화시킨 후, 정제하였다 (예를 들어, HPLC에 의해). 결과는 서열 9를 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드의 제제 (탈보호, 탈카르복실화 및 정제됨)였다 (이러한 실례에서는, N-말단에서는 아세틸화, C-말단에서는 아미드화됨).

실시예 11

서열 9의 합성을 위한 추가적인 바람직한 2-단편 접근법에서, N-말단의 H 및 C-말단의 -NH₂가 있고, CTC 수지에 결합된 Glu₃₇의 측쇄가 있는 서열 9의 아미노산 27-38을 포함하는 단편 ("AA(27-38)-NH₂")이 H-Glu-(CTC 수지)-Leu-NH₂ (이의 합성이 하기에 기술됨)에서 출발하는 표준 고상 합성에 의해 합성되었다 (표 7 참조; 본원에서 "H-AA(27-38)-NH₂ 유리 Glu₃₇"로 또한 지칭됨).

그후, 펩티드 단편 H-AA(27-38)-NH₂ 유리 Glu₃₇ 측쇄 (서열 9)가 펩티드 단편 Ac-AA(1-26)-OH (서열 40)과 조합되어 291144의 아미노산 서열을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드가 산출되는 용액 상 반응이 수행되었다. 펩티드 단편 Ac-AA(1-26)-OH (1.0 g, 0.21 mmol, 1.0 당량), 6-Cl-HOBT (39 ㎎, 0.23 mmol, 1.1 당량) 및 DIEA (55 ㎕, 0.32 mmol, 1.5 당량)를 DMF (10 ㎖, 10 부피)에 용해시키고, 0±5℃로 냉각하였다. 반응물에 TBTU (71 ㎎, 0.22 mmol, 1.05 당량)를 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 O±5℃에서 교반하고, DMF (2 ㎖) + DIEA (37 ㎕, 0.21 mmol, 1.0 당량)에 별도로 용해되고 0-5℃로 냉각된 펩티드 단편 H-AA(27-38)-NH₂, 유리 Glu₃₇ (556 ㎎, 0.21 mmol, 1 당량)을 첨가하였다. 반응물을 15분 동안 0±5℃에서 교반한 후, 25±5℃에서 3시간 동안 또는 HPLC에 의해 반응이 완료된 것으로 나타날 때까지 교반하였다. 반응기를 냉각하고, 빠르게 교반하면서 물 (10 부피)을 첨가하였다. 생성된 고체를 여과에 의해 단리하고, 추가적인 물로 세정하였다. 수집된 고체를 물/이소프로판올 내에 다시 슬러리화시키고, 여과에 의해 재수집하고, 물로 세정하고, 35±5℃의 진공 오븐에서 건조시켰다. 결과는, 순도에 대해 HPLC 분석에 의해 결정 시, 1.43 g (92％)의 완전하게 보호된, 단리된 HIV 융합 억제제 펩티드 Ac-AA(1-38)-NH₂ 유리 Glu₃₇ (서열 9)의 제제였다. 그후, 탈보호 및 탈카르복실화를 위해, 본원에서 실시예 8에서 기술된 방법, 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 방법을 사용함으로써, HIV 융합 억제제 펩티드를 (측쇄 화학적 보호기 및 C-말단 링크 기를 제거하는 것에 의해) 탈보호시키고, (트립토판 잔기에서) 탈카르복실화시킨 후, 정제하였다 (예를 들어, HPLC에 의해). 결과는 서열 9의 HIV 융합 억제제 펩티드의 제제 (탈보호, 탈카르복실화 및 정제됨)였다 (이러한 실례에서는, N-말단에서는 아세틸화, C-말단에서는 아미드화됨).

실시예 12

선형 고상 합성 접근법을 사용하는 1144 아미노산 서열 (서열 9)을 지니는 HIV 융합 억제제 펩티드의 합성 방법이 여기에서 설명된다. 서열 9의 HIV 융합 억제제 펩티드가 고수율 및 고순도로 선형 방식으로 고상 지지체 상에서 합성될 수 있고, 이는 출발 물질로서 1개의 로딩 수지만을 필요로 하며, 합성 방법을 단순화하는 것의 일환으로서 단편의 용액 축합 및 용액 상에서의 상응하는 단편의 탈보호를 수반하지 않는다.

서열 9 펩티드가 표준 고상 합성 (아미드 수지, 예를 들어, 지베르 수지 또는 링크 수지 (래미지와 같은 기타 수지가 또한 이용가능함); 또는 변형된 산 수지, 예를 들어, 링크-링커-로딩 CTC 수지 또는 감마-글루타밀(Leu-아미드)-로딩 CTC 수지를 사용함)에 의해 합성되었고, 이때 N-말단은 아세틸화 (화학기로서의 "Ac")되었고, C-말단에는 아미드 기 (-NH₂)가 있었다. 펩티드를 이의 고상 합성에 사용된 수지로부터 절단하였고, HIV 융합 억제제 펩티드 Ac-AA(1-38)-NH₂의 측쇄 화학적 보호기가 산가수분해에 의해, 또는 측쇄 화학적 보호기를 제거함으로서 펩티드를 탈보호시키는 것에 대해 당업자에게 통상적으로 공지된 임의의 또다른 방법에 의해 제거될 수 있다. 그후, 탈보호 및 탈카르복실화된 펩티드를 HPLC 또는 기타 적절한 크로마토그래피 기술에 의해 정제하여, 단리된 HIV 융합 억제제 서열 9 펩티드의 제제가 산출되었다.

당업자에게 공지된 방법에 의해 Fmoc-링크 링커를 CTC 수지 상에 로딩함으로써 링크-링커-로딩 CTC 수지가 수득될 수 있다. 본 실시예에서, Fmoc-감마-글루타밀(Leu-아미드) 및 이를 CTC 수지에 로딩하는 것이 설명된다. Fmoc-Glu(OtBu)-OH (22.175 g, 50 mmol), 6-Cl-HOBt (10.176 g, 60 mmol), DIEA (21.78 ㎖, 125 mmol) 및 H-Leu-NH2 (9.764 g, 75 mmol)를 DMF (220 ㎖, 10 부피)에 용해시키고, 5℃ 미만으로 냉각한 후, TBTU (19.266 g, 60 mol)를 반응 플라스크 내로 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 5℃ 미만에서 교반하고, 실온에서 1시간 동안 또는 HPLC가 반응의 완료를 나타낼 때까지 교반하였다. Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-NH₂를 물에 의해 침전시키고, 0.2％N HCl로 세정하고, 20％ IPA 및 4％ NaHCO₃ 내에 다시 슬러리화시켰다. 95％ TFA/물로의 처리에 의해 t-Bu 보호기를 제거한 후, Fmoc-Glu-Leu-NH₂를 당업자에게 공지된 방법에 의해 CTC 수지 상에 로딩하여, 감마-글루타밀(Leu-아미드)-로딩 CTC 수지를 제공하였다.

실시예 13

서열 9 펩티드의 단리 및 정제를 위한 접근법에서, 순수한 동결건조된 Ac-AA(1-38)-NH₂ (908 ㎎)를 8:2 아세토니트릴:물 (18 ㎖, 20 부피) (10-30 부피가 허용가능함) 내에 20±5℃에서 3시간 (1-5시간이 허용가능함) 동안 슬러리화시켰다. 생성물을 여과에 의해 다시 단리하고, 8:2 아세토니트릴:물로 세정하고, 진공 하에 35±5℃에서 건조시켜, 854 ㎎ (94％)의 순수한 탈염 Ac-AA(1-38)-NH₂가 산출되었다.

서열 9의 염 함량에서의 유의한 감소 (제형에 허용가능하도록 하는 함량)가 순수한 서열 9를 세파덱스(Sephadex) 컬럼 상에 로딩하고 9:1 물/ACN으로 용출시킴으로써 또는 RP-HPLC 컬럼 상에 다시 로딩하고 5 mM NH₄OAc/ACN 1:1로 용출시킴으로써 또한 달성될 수 있다. 양쪽 모두의 경우, 동결건조에 의해 펩티드가 다시 단리된다.

동결건조된 서열 9 펩티드의 침전 1. 1144 (서열 9) 고체 (186.2 g, 동결건조에 의해 미리 단리됨)를 9312 ㎖의 물 내의 20％ ACN에 용해시키고, TFA (46 ㎖)로 pH를 약 1.6으로 저하시켰다. 그후, pH를 1N NaOH (583 ㎖)로 4.76의 최종 pH로 증가시켰다. 플라스크를 얼음 수조에서 2시간 동안 냉각한 후, 고체를 여과해 내고, 35±5℃의 진공 오븐에서 건조시켜, 179.5 g (96％)의 순수한 탈염 Ac-AA(1-38)-NH₂가 공급되었다.

동결건조된 서열 9 펩티드의 침전 2. 1144 (서열 9) 고체 (동결건조에 의해 미리 단리됨)를 pH를 8-9로 조정함으로써 50 ㎎/㎖의 농도로 50％ 아세토니트릴-물에 용해시켰다. 그후, 용액의 pH를 다시 5-6으로 조정하고 나서, 아세토니트릴의 총량이 85％를 초과하도록 더 많은 아세토니트릴을 첨가하였다. 침전된 고체를 진공 여과에 의해 수집하고, 90％ 아세토니트릴/물로 세정하고, 진공 오븐에서 건조시켰다.

또다른 실시양태에서, 1144 (서열 9) 고체 (동결건조에 의해 미리 단리됨)를 NH₄OH에 의해 pH를 6-9로 조정하면서 70 ㎎/㎖ 농도로 50％ 아세토니트릴/물 (14 부피)에 용해시켰다. 폴리시(polish) 여과 후, 용액을 아세토니트릴 (48 부피) 내로 첨가하고, 2 부피의 50％ 아세토니트릴/물을 더 사용하여, 용해 탱크 및 라인을 세정하였다. 생성된 슬러리를 10분 동안 교반한 후, 진공 여과하였다. 10 부피의 90％ 아세토니트릴/물 및 100％ 아세토니트릴 (각각 10 부피)을 사용하여 고체를 세정하였다. 수집된 펩티드를 일정한 중량일 때까지 진공 오븐에서 건조시켰다.

또다른 실시양태에서, 50％ ACN, 50％ 10 mM NaOAC 내의 순수한 1144 (서열 9) 용액을 pH 5-6으로 산성화시키고, 아세토니트릴로 희석하여, 생성물을 침전시켰다. 생성된 고체를 여과에 의해 단리하고, 90％ 아세토니트릴/물에 이어서 100％ 아세토니트릴 (각각 10 부피)로 세정하였다. 수집된 펩티드를 일정한 중량일 때까지 진공 오븐에서 건조시켰다.

실시예 14

HIV 감염 및/또는 AIDS의 처치에서, 이에 대한 치료법에서, 또는 이에 대한 치료 요법의 일환으로서, 항바이러스 펩티드, 예를 들어, HIV 융합 억제제 펩티드를 그 자체로, 또는 본원에서 제공되는 조성물 내의 활성 약물 물질로서 투여하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 바이러스 및/또는 세포를 HIV에 의한 세포의 감염을 억제하는데, 더욱 바람직하게는 바이러스와 표적 세포 간의 HIV-매개 융합을 억제하는데 효과적인 양의 HIV 융합 억제제 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포에 대한 HIV의 전파를 억제하는 방법에서 HIV 융합 억제제 펩티드의 항바이러스 활성이 사용될 수 있다. HIV-감염 환자를 처치하기 위해 (치료적으로), 또는 (예를 들어, 약물 사용 또는 위험성이 높은 성 행위를 통해) HIV에 새롭게 노출되었거나 HIV에 노출될 위험이 높은 환자를 처치하기 위해 (예방적으로), 이러한 방법이 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, HIV-1 감염 환자의 경우, HIV 융합 억제제 펩티드의 유효량은 치료되는 환자에서 (단독으로 및/또는 투약 요법과 함께) HIV 바이러스 로드를 감소시키는데 충분한 용량일 것이다. 당업자에게 공지된 바와 같이, HIV 바이러스 로드를 측정하기 위한 여러 표준 방법이 있고, 여기에는 말초혈 단핵 세포의 정량적 배양에 의한 것, 및 혈장 HIV RNA 측정에 의한 것이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 예컨대 바이러스 로드를 모니터링함으로써, 의사가 결정할 수 있는 바와 같이, HIV 융합 억제제 펩티드는 단일 투여로, 간헐적으로, 주기적으로, 또는 연속적으로 투여될 수 있다. HIV 융합 억제제 펩티드를 함유하는, 본원에서 제공되는 특정 조성물, 및 본원에서 제공되는 특정 조성물이 추가로 제약상 허용가능한 담체 및/또는 거대분자 담체를 더 포함하는지 여부와 같은 인자에 따라, HIV 융합 억제제 펩티드는 수일 내지 수주 범위로 또는 가능하게는 이보다 길게 주기적으로 투여될 수 있다. 추가로, HIV의 처치를 위해 사용되는 또다른 항바이러스 약물 또는 예방 작용제와 조합되어 또는 이와 함께 치료 요법에서 사용될 때 (예를 들어, 동시에 사용될 때, 또는 한 약물의 사이클링(cycling) 온(on) 및 또다른 약물의 사이클링 오프(off)에서), HIV 융합 억제제 펩티드가 항바이러스 요법에서 사용될 수 있다.

통상적으로 사용되는, 항바이러스제들의 조합이 수반되는 한가지 처치가 HAART (고도 활성 항-레트로바이러스 요법)로 공지되어 있다. HAART에서, HIV에 대한 항바이러스 활성이 있는 약물 3개 이상이 전형적으로 조합되고, 하나를 초과하는 클래스의 약물 ("클래스"는 작용 메커니즘, 또는 약물이 표적으로 하는 바이러스 단백질 또는 프로세스에 관련됨)이 전형적으로 수반된다. 따라서, HIV 융합 억제제 펩티드를 함유하는 본원에서 제공되는 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나 (예를 들어, 단일요법으로서), 또는 본원에 더욱 상세하게 기술된 바와 같은, HIV 감염 및/또는 AIDS의 처치를 위한 추가적인 치료제의 조합을 수반하면서, 처치 요법에서 투여될 수 있거나 공동-투여될 수 있다.

예를 들어, 한 실시양태에서, 하나 이상의 치료제가 본원에서 제공되는 조성물 내의 HIV 융합 억제제 펩티드로의 처치에서 조합될 수 있다. 이같은 조합물은 HIV 융합 억제제 펩티드에 더하여 하나 이상의 항바이러스제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이같은 조합물은 유효량의 현재 허가되었거나 추후 허가될 (HIV 감염을 치료하는데 유용한) 항바이러스제들로부터 제조될 수 있고, 이러한 항바이러스제에는 하기로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 치료제들이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다: 항바이러스제 예컨대 사이토카인, 예를 들어, rIFNα, rIFNβ, rIFNγ; 아바카비르, AZT (지도부딘), ddC (잘시타빈), 네비라핀, ddI (디다노신), FTC (엠트리시타빈), (+) 및 (-) FTC, 리버세트, 3TC (라미부딘), GS 840, GW-1592, GW-8248, GW-5634, HBY097, 델라비르딘, 에파비렌즈, d4T (스타부딘), FLT, TMC125, 아데포비르, 테노포비르 및 알로부딘을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 역전사 효소 억제제; 암프레니비르, CGP-73547, CGP-61755, DMP-450, 인디나비르, 넬피나비르, PNU-140690, 리토나비르, 사퀴나비르, 텔리나비르, 티프라노비르, 아타자나비르, 로피나비르, ABT378, ABT538 및 MK639를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 프로티에이스 억제제; 바이러스 mRNA 캡핑 억제제, 예컨대 리바비린; 항-HIV 활성이 있는 지질-결합 분자로서의 암포테리신 B; 당단백질 프로세싱 억제제로서의 카스타노스퍼민; 바이러스 진입 억제제 예컨대 융합 억제제 (엔푸비르티드, T1249, 기타 융합 억제제 펩티드, 및 소형 분자), SCH-D, UK-427857 (Pfizer), TNX-355 (Tanox Inc.), AMD-070 (AnorMED), Pro 140, Pro 542 (Progenics), FP-21399 (EMD Lexigen), BMS806, BMS-488043 (Bristol-Myers Squibb), 마라비록 (UK-427857), ONO-4128, GW-873140, AMD-887, CMPD-167, 및 GSK-873,140 (GlaxoSmithKline); CXCR4 길항제, 예컨대 AMD-070); 지질 및/또는 콜레스테롤 상호작용 조정인자, 예컨대 프로카인 하이드로클로라이드 (SP-01 및 SP-01A); L-870 및 810을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 인테그레이스 억제제; RNAseH 억제제; rev 또는 REV 억제제; vif 억제제 (예를 들어, vif에서 유래된 프롤린이 풍부한 펩티드, HIV-1 프로티에이스 N-말단-유래 펩티드); 베툴린, 및 디하이드로베툴린 유도체 (예를 들어, PA-457)를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 바이러스 프로세싱 억제제; 및 AS-101, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, IL-2, 발프로산, 및 싸이모펜틴을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 면역조정제. HIV 감염 및/또는 AIDS 치료 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 조합 약물 처치는 작용 메커니즘이 동일한 2가지 이상의 치료제를 포함할 수 있거나, 또는 작용 메커니즘이 상이한 2가지 이상의 치료제를 포함할 수 있다.

HIV 융합 억제제 펩티드 및/또는 본원에서 제공되는 조성물과 조합되어 사용될 수 있는 이러한 예시적인 추가 치료제의 유효 투여량은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 당업자에게 주지되어 있는 절차를 통해, 예를 들어, 효능, 생물학적 반감기, 생체이용률, 및 독성을 결정함으로써, 투여될 본원에서 제공되는 HIV 융합 억제제 펩티드 및/또는 조성물의 유효 투여량이 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 당업자에게 주지된 관례적인 시험관내 및 생체내 연구로부터의 데이터를 사용하여 당업자에 의해 HIV 융합 억제제 펩티드의 유효량 및 이의 투여량 범위가 결정된다. 예를 들어, 항바이러스 활성의 시험관내 감염성 분석법, 예컨대 본원에 기술된 분석법은 미리 결정된 범위의 바이러스 감염성 (예를 들어, 50％ 억제, IC₅₀; 또는 90％ 억제, IC₉₀) 또는 바이러스 복제를 억제하는데 필요한, 단독 활성 성분으로서의 화합물 또는 다른 활성 성분과 조합된 화합물의 평균 억제 농도 (IC)를 결정할 수 있게 한다. 그후, 바이러스 감염성 또는 바이러스 복제의 억제를 위한 미리 정해진 값과 동일하거나 이를 초과하는 활성 성분의 최소 혈장 농도 (C[min])가 수득되도록, 하나 이상의 표준 모델로부터의 약동학적 데이터를 사용하여 당업자가 적합한 용량을 선별할 수 있다. 투여량 범위는 투여 시의 선택된 투여 경로 및 투약 제형, 예를 들어, 피하, 비경구, 피내 또는 경구 투여를 포함하지만 이에 한정되지 않는 투여 경로에 전형적으로 좌우되지만, 활성 성분으로서의 화합물의 예시적인 투여량 범위는 체중 1 ㎏ 당 약 1 ㎎ 내지 체중 1 ㎏ 당 약 100 ㎎, 더욱 바람직하게는 체중 1 ㎏ 당 1 ㎎ 이상 내지 체중 1 ㎏ 당 10 ㎎ 이하일 수 있다. 한 실시양태에서, 투여는 주사 (예로서, 피하 주사 사용)에 의한 것이다. 한 실시양태에서, HIV 융합 억제제 펩티드.

따라서, HIV에 의한 세포의 감염을 억제하는 유효량으로 HIV 융합 억제제 펩티드를 포함하는 본원에 기술된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 세포에 대한 HIV의 전파를 억제하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 유효량의 본원에서 제공되는 HIV 융합 억제제 펩티드 또는 제약 조성물을 포함하는 치료제들의 조합물을 (동시에 또는 순차적으로, 또는 치료 요법의 일환으로서) 개체에게 투여함으로써, 환자에게 HIV 감염 및/또는 AIDS를 치료하는데 사용되는 다른 치료제와 조합하여 본원에 기술된 조성물을 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, HIV 진입의 억제를 필요로 하는 환자에게 표적 세포의 바이러스 진입을 억제하는 유효량으로 HIV 융합 억제제 펩티드를 포함하는 본원에서 제공되는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, HIV 진입을 억제하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 유효량의 HIV 감염 치료에 유용한 하나 이상의 추가적인 억제제, 예를 들어, 바이러스 진입 억제제와 조합하여 본원에 기술된 조성물을 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.

실시예 15

본원에서 제공되는 조성물의 제조 방법이 하기에 기재된다. 또한, 예시적인 조성물들이 기술된다.

물질: 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 (SAIB)는 Eastman Chemicals로부터 수득되었다. 폴리락티드 (PLA) 및 폴리락티드-코-글리콜리드 (PLGA)는 Lakeshore Biomateials로부터 수득되었다. PLA와 PLGA는 락티드:글리콜리드 비율, 분자량 및 이들의 말단기가 상이하다. 본 연구에서 사용된 모든 PLGA는 50:50 락티드:글리콜리드였다. 명칭 내의 숫자에 의해 분자량이 등급화된다. 분자량의 추정치는 10000×숫자이다. 말단 기는 카르복실산 (A), 메틸 에스테르 (M) 또는 라우릴 에스테르 (L)이다. N-메틸-2-피롤리돈 (NMP)은 Spectrum으로부터 수득되었다. 벤질벤조에이트 및 트리아세틴은 Sigma로부터 수득되었다. 구아니딘HCl은 Amresco로부터 수득되었다. 트리스-HCl은 Sigma로부터 수득되었다. 4-(2-피리딜아조)레조르시놀은 Sigma로부터 수득되었다. 메탄올은 VWR로부터 구입하였다. 황산아연 헵타하이드레이트는 Sigma로부터 수득되었다. 염화아연은 Sigma로부터 수득되었다.

T1144 펩티드 물질의 제조: 하기 프로토콜에 따라 T1144 펩티드 물질을 제조하였다.

분무 건조: T1144 펩티드를 4 미만 또는 6 초과의 pH에서, 일반적으로는 물 내에, 용해시켰다. 1N NaOH 또는 1N HCl을 사용하여 pH를 조정하였다. 분무 노즐을 통해 펩티드 용액을 가열된 챔버 내로 분무하였다. 건조된 펩티드 입자를 수동으로 수집하였다.

상기 기술된 분무 건조 방법에 의해, 그러나 부형제를 분무 건조 용액에 첨가하여 부형제와 펩티드를 혼입시킴으로써, 펩티드를 추가로 제조할 수 있다.

염 또는 pH 침전: 펩티드를 4 미만 또는 6 초과의 pH에서, 일반적으로는 물 내에, 용해시켰다. 1N NaOH 또는 1N HCl을 사용하여 pH를 조정하였다. 염 용액 또는 강산/강염기를 첨가하여 침전을 야기하였다. 원심분리에 의해 침전물을 수집하고, 동결건조에 의해 건조시키고, 200 ㎛ 스크린을 통과시켜 입자 크기를 제어하였다.

비히클 제조: 하기 프로토콜에 따라 비히클을 제조하였다.

SAIB 비히클 제조: 원하는 최종 농도에 도달하도록 하는 적합한 양의 SAIB를 가온하고, NMP에 첨가하고, 균일할 때까지 혼합하였다.

SAIB/PLA 비히클 제조: 원하는 최종 농도에 도달하도록 하는 적합한 양의 PLA를 NMP, 벤질벤조에이트 또는 트리아세틴에 용해시켰다. 원하는 최종 농도에 도달하도록 하는 적합한 양의 SAIB를 가온하고, PLA 용액에 첨가하고, 균일할 때까지 혼합하였다.

PLA, PLG 및 PLGA 비히클 제조: PLA, PLG 또는 PLGA의 원하는 최종 농도에 도달하도록 하는 적합한 양의 PLA, PLG 또는 PLGA를 NMP 내로 용해시켰다.

당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 조성물을 제조할 수 있다. 본 실시예에서는, (침전 또는 분무 건조된) 펩티드 물질을 바이알에 첨가하였다. 비히클을 바이알에 첨가하고, 내용물들을 균일할 때까지 혼합하였다. 일부 경우에는, 적절한 혼합을 확실히 하도록 약 40℃로 가온하는 것이 필요하였다. 제형을 제형 중량 당 펩티드 중량 (mg/g 단위)으로 정량하였다.

에델호크(Edelhoch) 방법과 유사한 방식으로 트립토판 및 타이로신 흡광도를 기초로 펩티드 함량을 결정하였다. 간략하게, 약 1 ㎎의 펩티드 물질을 1 ㎖ 8M 구아니딘 하이드로클로라이드에 용해시켰다. 용액을 276, 280 및 288 nm에서의 UV 흡광도에 대해 평가하였다. 공지의 샘플 중량과 함께, 이러한 흡광도 측정치를 사용하여, 샘플 부피, 펩티드 내의 트립토판 및 타이로신 잔기의 개수, 및 펩티드 분자량, 고체의 펩티드 함량 (％ w/w)을 결정하였다.

M² ⁺와 2:1 복합체를 형성하는 것으로 공지된 금속착색 지시약인 4-(2-피리딜아조)레조르시놀 (PAR)을 사용하는 UV/vis 흡광도 분석법을 이용하여 금속 양이온 함량을 결정하였다. 간략하게, 약 1 ㎎의 고체를, 6M 구아니딘HCl을 함유하는 1 ㎖의 트리스-HCl 완충제 (pH 8)에 용해시켰다. 최종 금속 양이온 농도가 1-10 μM이도록 (상기와 동일한 완충제를 사용하여) 이러한 용액을 희석하였다. 50 ㎕의 0.1M PAR을 950 ㎕의 희석된 용액에 첨가하였다. 평형 후, 500 nm에서의 UV/vis 흡광도에 대해 테스트 용액을 평가하였다. 같은 날 수득된 표준 곡선으로부터의 선형 최소 제곱 분석을 기초로 금속 양이온 농도를 계산하였고, 샘플의 금속 양이온 함량 (중량％)을 결정하였다.

혈장 내의 펩티드 농도를 LC-MS 평가에 의해 결정하였다. 혈장 샘플을 0.5％ (v/v) 포름산을 함유하는 3 부피의 아세토니트릴로 희석하고, 원심분리하고, 상등액을 직접 분석하였다. 총 6분의 러닝(running) 시간으로 구배 용출 (10 mM 아세트산암모늄 (pH 6.8) : 아세토니트릴, 0.6 ㎖/분)를 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 4×2 ㎜ Phenomenex SecurityGuard C8 가드 컬럼에 의해 보호된 Phenomenex Luna C8(2) 50×2 ㎜ 컬럼 상에서 분리를 수행하였다. 일반적으로 싱글-쿼드(single-quad) 방식으로, (Sciex) API4000 또는 API4000 Qtrap 장치 상에서 질량 분광법 (ESI+)을 수행하였고, 이때 [M+3H]³⁺ 또는 [M+4H]⁴⁺ 이온이 검출되었다. TRI-1144에 대한 검정 곡선을 30 ng/㎖부터 30 ng/㎖까지 구축하였다. 결과는 시간 경과에 따른 혈장 펩티드 농도로 제시된다. 하기의 약어를 사용하였다: C_max = 최대 혈장 펩티드 농도; t_max = C_max에서의 시간; t₀ _.1 = 혈장 펩티드 농도가 0.1 ㎍/㎖ 미만으로 떨어지는 시간; t₀ _.01 = 표준화된 혈장 농도가 0.01 ㎍/㎖ 미만으로 떨어지는 시간. 일부 경우에, 비교를 용이하게 하기 위해 혈장 농도가 동물 체중 1 ㎏ 당 3 ㎎ 펩티드로 표준화되었다.

하기와 같이 동물에게 투약하였다. 과량의 T1144-함유 조성물을 16G 바늘을 통해 1 cc 주사기 내로 흡인하였다. 이러한 바늘을 18G 또는 21G 바늘로 교체하고, 정확한 용량이 되도록 주사기를 비웠다. 견갑골 사이에 있는 피하 공간으로 동물에게 투약하였다. 군 당 3마리로, 래트 (400 g)에게 400 ㎕을 투약하였다. 군 당 3마리로, 사이노몰구스 원숭이 (2.5 ㎏)에게 400 ㎕ 또는 1000 ㎕를 투약하였다.

모든 약동학적 성질 데이터를 래트 또는 원숭이를 사용하여 수집하였다. 일부 경우에, 비교를 용이하게 하기 위해 혈장 농도가 동물 체중 1 ㎏ 당 3 ㎎ 펩티드로 표준화되었다.

하기의 펩티드-함유 조성물들을 제조하였다.

T1144/아연 침전물 A. T1144를 물에 용해시켰다. pH를 약 6.2로 조정하고, 25 ㎎/㎖의 농도로 물을 첨가하였다. 용액을 0.22 ㎛ 필터에 통과시켰다. 2 ㎖의 0.1M ZnSO₄를 80 ㎖의 T1144 용액에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 따라내고, 침전물을 냉동하였다. 침전물을 동결건조시키고, 200 ㎛ 스크린에 통과시켰다.

T1144/아연 침전물 B. T1144를 물에 용해시켰다. pH를 약 6.2로 조정하고, 25 ㎎/㎖의 농도로 물을 첨가하였다. 용액을 0.22 ㎛ 필터에 통과시켰다. 60 ㎖의 0.1M ZnSO₄를 120 ㎖의 T1144 용액에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 따라내고, 침전물을 냉동하였다. 침전물을 동결건조시키고, 200 ㎛ 스크린에 통과시켰다.

T1144/아연 침전물 C. T1144를 물에 용해시켰다. pH를 약 5.7로 조정하고, 40 ㎎/㎖의 농도로 물을 첨가하였다. 용액을 0.22㎛ 필터에 통과시켰다. 100 ㎎ 미만의 ZnCl₂를 20 ㎖의 T1144 용액에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 따라내고, 침전물을 1 ㎖ 물로 세정하였다. 침전물을 냉동하고, 동결건조시키고, 200 ㎛ 스크린에 통과시켰다.

T1144/아연 침전물 D. 침전물 B를 5 ㎖ 물로 세정하고, 원심분리하고, 상등액을 따라냈다. 이를 2회 더 반복하였다. 생성된 침전물을 냉동하고, 동결건조시키고, 200 ㎛ 스크린에 통과시켰다.

T1144/아연 침전물 E. 445 ㎎의 ZnSO₄*7H₂O를 2 ㎖ 물에 용해시켰다. 1.0 g의 침전물 D를 아연 용액 내에 슬러리화시켰다. 슬러리를 냉동하고, 동결건조시키고, 200 ㎛ 스크린에 통과시켰다.

T1144 침전물 F. T1144를 물에 용해시켰다. pH를 약 6.2로 조정하고, 25 ㎎/㎖의 농도로 물을 첨가하였다. 용액을 0.22 ㎛ 필터에 통과시켰다. 5 ㎖의 1N 아세트산을 첨가하여, pH를 약 5로 감소시켰다. 생성된 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 따라내고, 침전물을 냉동하였다. 침전물을 동결건조시키고, 200 ㎛ 스크린에 통과시켰다.

T1144/아연 침전물 G. 230 ㎎ ZnSO₄*7H₂O를 2 ㎖ 물에 용해시켰다. 500 ㎎의 침전물 F를 아연 용액 내에 슬러리화시켰다. 슬러리를 냉동하고, 동결건조시키고, 200 ㎛ 스크린에 통과시켰다.

T1144/아연 침전물 H. T1144를 물에 용해시켰다. pH를 약 8.4로 조정하고, 50 ㎎/㎖의 농도로 물을 첨가하였다. 용액을 0.22 ㎛ 필터에 통과시켰다. 25 ㎎/㎖의 농도로 메탄올을 첨가하였다 (50:50 메탄올:물). 약 1 ㎖의 0.1M ZnSO₄를 20 ㎖의 TRI-1144 용액에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 따라내고, 침전물을 냉동하였다. 침전물을 동결건조시키고, 200 ㎛ 스크린에 통과시켰다.

T1144 침전물 I. TRI-1144를 물에 용해시켰다. pH를 약 8.4로 조정하고, 50 ㎎/㎖의 농도로 물을 첨가하였다. 용액을 0.22 ㎛ 필터에 통과시켰다. 25 ㎎/㎖의 농도로 메탄올을 첨가하였다 (50:50 메탄올:물). pH를 약 5로 조정하였다. 생성된 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 따라내고, 침전물을 냉동하였다. 침전물을 동결건조시키고, 200 ㎛ 스크린에 통과시켰다.

T1144/아연 침전물 J. T1144를 물에 용해시켰다. pH를 약 6.2로 조정하고, 25 ㎎/㎖의 농도로 물을 첨가하였다. 용액을 0.22 ㎛ 필터에 통과시켰다. 60 ㎖의 0.1M ZnSO₄를 120 ㎖의 T1144 용액에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 따라내고, 침전물을 냉동하였다. 침전물을 동결건조시키고, 150 ㎛ 스크린에 통과시켰다.

T1144/아연 침전물 K. T1144를 물에 용해시켰다. pH를 약 6.2로 조정하고, 25 ㎎/㎖의 농도로 물을 첨가하였다. 용액을 0.22 ㎛ 필터에 통과시켰다. 1 ㎖의 0.1M ZnSO₄를 40 ㎖의 T1144 용액에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 따라내고, 침전물을 냉동하였다. 침전물을 동결건조시키고, 150 ㎛ 스크린에 통과시켰다.

T1144/아연 침전물 L. 1.0 g의 침전물 J를 30 ㎖의 물로 세정하고, 원심분리하고, 상등액을 따라냈다. 이를 반복하였다. 생성된 침전물을 냉동하고, 동결건조시키고, 200 ㎛ 스크린에 통과시켰다.

T1144/아연 침전물 M. T1144를 물에 용해시켰다. pH를 약 6.3으로 조정하고, 25 ㎎/㎖의 농도로 물을 첨가하였다. 용액을 0.22 ㎛ 필터에 통과시켰다. 25 ㎖의 T1144 용액을 (분무 건조와 유사한 방식으로) 분무 노즐을 통해 50 ㎖의 격렬하게 혼합된 0.3M ZnSO₄ 용액 내로 분무하였다. 생성된 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 따라내고, 침전물을 냉동하였다. 침전물을 동결건조시키고, 200 ㎛ 스크린에 통과시켰다.

T1144/아연 침전물 N. T1144를 물에 용해시켰다. pH를 약 6.3으로 조정하고, 50 ㎎/㎖의 농도로 물을 첨가하였다. 25 ㎎/㎖의 최종 T1144 용액 농도로 메탄올을 첨가하였다. 용액을 0.22 ㎛ 필터에 통과시켰다. 25 ㎖의 T1144 용액을 (분무 건조와 유사한 방식으로) 분무 노즐을 통해 50 ㎖의 격렬하게 혼합된 0.1M ZnSO₄ 용액 내로 분무하였다. 생성된 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 따라냈다. 침전물을 10 ㎖의 물로 3회에 걸쳐 세정하였다. 현탁액을 원심분리하고, 상등액을 따라내고, 침전물을 냉동하였다. 침전물을 동결건조시키고, 200 ㎛ 스크린에 통과시켰다.

상기 기술된 조성물들을 하기에 기술된 바와 같이 래트 또는 원숭이에게 투여하였다. 래트 또는 원숭이에서 수득된 결과는 인간 결과와 합리적으로 상관되는 것으로 예상된다.

침전물 D를 74:11:15 SAIB:PLA3L:NMP 내에 100 ㎎/g으로 제형하고, 사이노몰구스 원숭이에게 1000 ㎕로 투약하였다. 도 9에 나타난 바와 같이 (--◆--), 혈장 농도가 7일의 표적 시간을 초과하면서, 12일 동안 1 ㎍/㎖의 표적 값을 초과하였다. 침전물 J를 40:60의 PLA3L:NMP 내에 50 ㎎/g으로 제형하고, 사이노몰구스 원숭이에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 9에 나타난 바와 같이 (--■--), 혈장 농도가 7일 동안 1 ㎍/㎖의 표적 값을 초과하였고; 더 많은 용량, 예컨대 1000 ㎕의 100 ㎎/g 침전물 J는 잠재적으로 10-12일 동안 표적 혈장 농도를 산출하였을 수 있었다. 이는 T1144가 SAIB/PLA 또는 PLA 비히클 내에서 피하 전달될 수 있고, 1주일 초과 동안 표적 값 (즉, 1 ㎍/㎖)을 초과하는 혈장 농도를 제공할 수 있다는 것을 가리킨다.

침전물 D를 74:11:15 SAIB:PLA3L:NMP 내에 100 ㎎/g으로 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 10에 나타난 바와 같이 (--◆--), 혈장 농도가 7일의 표적 시간을 거의 충족시키면서, 6일 동안 1 ㎍/㎖의 표적 값을 초과하였다. 침전물 J를 40:60의 PLA3L:NMP 내에 50 ㎎/g으로 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 10에 나타난 바와 같이 (--■--), 혈장 농도가 7일 동안 1 ㎍/㎖의 표적 값을 초과하였다. 이는 제제들이 설치류 및 영장류 모델 양쪽 모두에서 T1144의 유사한 지속 전달을 제공하였다는 것을 가리킨다.

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 SAIB : PLA 비율의 영향. 침전물 A를 SAIB:PLA3M:NMP 비히클 내에 50 ㎎/g으로 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 11에 나타난 바와 같이, SAIB:PLA 비율을 감소시키면 (즉, 더 많은 PLA), C_max가 감소되고, t_max가 증가되고, t₀ _.01이 증가되었다. 침전물 B를 또한 50 ㎎/g으로 SAIB:PLA3M:NMP 비히클 내에 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 12 및 13에 나타난 바와 같이, 결과는 침전물 A에 대하여 제시된 것과 정성적으로 유사하였다. 그러나, SAIB:PLA 비율이 침전물 B로부터의 전달에 영향을 미치는 정도가 침전물 A로부터의 전달에 대한 이의 영향보다 더 적았다. 이는 SAIB:PLA 비율을 감소시키는 것이 TRI-1144의 지속 전달을 개선하고, 침전물 성질, 특히 침전물 내의 아연의 양이 전달 속도에 영향을 줄 수 있다는 것을 가리킨다.

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 매트릭스:용매 비율의 영향. 침전물 B를 SAIB:PLA3M:NMP 비히클 내에 50 ㎎/g으로 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 14에 나타난 바와 같이, 약 10％의 PLA 수준이 더 낮은 PLA 수준에 비하여 펩티드 전달을 느리게 할 수 있다.

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 용매 유형의 영향. 침전물 B를 75:5:20 SAIB:PLA3M:용매 (즉, 트리아세틴, 벤질벤조에이트 또는 NMP) 비히클 내에 50 ㎎/g으로 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 15에 나타난 바와 같이, 용매 유형이 변화됨에 따라, C_max가 감소되었고, t_max가 증가되었으며, t₀ _.01이 증가되었다. NMP가 트리아세틴보다 더 바람직한 약동학적 성질을 제공하였고, 트리아세틴은 벤질벤조에이트보다 더 우수하게 작동하였다. 이는 용매 유형이 펩티드 전달에 영향을 미친다는 것을 가리킨다.

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 펩티드 농도의 영향. 침전물 B를 75:5:20 SAIB:PLA3M:NMP 비히클 내에 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 16에 결과가 제시되고, 이는 이러한 비히클에서, 펩티드 전달에 악영향을 주지 않으면서 펩티드 농도가 증가될 수 있다는 것을 가리킨다.

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 주사 부피의 영향. 침전물 B를 74:11:15 SAIB:PLA3M:NMP 비히클 내에 100 ㎎/g으로 제형하고, 래트에게 투약하였다. 도 17에 나타난 바와 같이, 지속 전달 파라미터에 대한 용량 부피의 유의적인 영향이 없었다; 그러나, 400 ㎕ 용량이 200 ㎕ 용량보다 다소 양호하게 작동하였다 (모두 표준화됨). 침전물 C를 77:15:8 SAIB:NMP:에탄올 비히클 내에 제형하고, 래트에게 투약하였다. 도 17에 나타난 바와 같이, 펩티드 용량 제어 시 처음 3일에는 지속 전달 파라미터에 대한 용량 부피의 유의적인 영향이 없었다; 그러나, 3일 후에는 400 ㎕ 용량이 200 ㎕ 용량보다 다소 양호하게 작동하였다. 이는 주사 부피를 증가시키는 것이 지속 전달을 촉진할 수 있다는 것을 가리킨다.

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 SAIB 비히클 내의 PLA 유형의 영향. 침전물 A를 75:5:20 SAIB:PLA:NMP 비히클 내에 50 ㎎/g으로 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 18에 나타난 바와 같이, PLA 유형을 3L에서 3M으로 변화시키면, C_max가 감소되었고, t_max가 증가되었으며, t₀ _.01이 증가되었다. 이는 PLA 유형이 지속 전달에 영향을 줄 수 있다는 것을 가리킨다.

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 펩티드 침전물 형태의 영향. 침전물 A, B, E 및 G를 따로따로 75:5:20 SAIB:PLA3M:NMP 비히클 내에 50 ㎎/g으로 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 19에 나타난 바와 같이, 초기 침전 공정 동안 아연 함량을 증가시키면, C_max가 감소되었고, t_max가 증가되었으며, t₀ _.01이 증가되었다 (A 및 B). 동결건조된 염으로서의 황산아연을 저-아연 침전물에 첨가하면, C_max가 감소되었고, t_max가 증가되었으며, t₀ _.01이 증가되었다 (A 및 E). pH 대신 아연으로의 침전은 최종 침전물이 동결건조된 염으로서 황산아연을 함유하였을 때 지속 전달 파라미터에 영향을 미치지 않았다 (E 및 G). 아연 총 함량은 유사하였지만, 침전물 E 또는 G는 이러한 비히클에서 침전물 B만큼 작동하지 않았다. 이는 아연이 침전물 내로 혼입되는 방식 (예를 들어, 침전 또는 분무되는 방법)이 펩티드의 지속 전달에 유의하게 영향을 미친다는 것을 가리킨다.

원숭이에서의 약동학적 프로파일에 대한 중합체 유형 및 용량 부피의 영향. 침전물 D를 SAIB:PLA:NMP 비히클 내에 제형하고, 사이노몰구스 원숭이에게 투약하였다. 도 20에 나타난 바와 같이, 비히클을 75:5:20에서 74:11:15로 변화시키는 것 (용량 400 ㎕)은 지속 전달 파라미터에 유의하게 영향을 주지 않았다; 그러나, 양쪽 모두 수용액보다 양호하게 작동하였다. 용량 부피를 74:11:15 내의 1000 ㎕로 증가시키면, C_max가 감소되었고, t_max가 감소되었으며, t₀ _.01이 증가되었다. 이는 용량 부피를 바꾸는 것이 지속 전달에 영향을 미칠 수 있다는 가리킨다.

PLA 및 PLGA 젤 시스템

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 매트릭스:용매 비율의 영향. 침전물 A 및 D를 따로따로 PLGA1A:NMP 비히클 내에 50 ㎎/g으로 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 21에 나타난 바와 같이, 매트릭스:용매 비율을 증가시키면 (더 많은 PLGA), C_max가 감소되었고, t_max가 증가되었으며, t₀ _.01이 증가되었다. 이는 비히클 내의 중합체의 양이 지속 전달에 영향을 미친다는 것을 가리킨다.

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 중합체 유형의 영향. 침전물 A 및 D를 따로따로 중합체:NMP 비히클 내에 50 ㎎/g으로 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 21에 나타난 바와 같이, 중합체 MW 및 L:G 비율을 동시에 증가시키면, C_max가 감소되었고, t_max가 증가되었으며, t₀ _.01이 증가되었다. 침전물 B를 중합체:NMP 비히클 내에 50 ㎎/g으로 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 22에 나타난 바와 같이, L:G 비율을 증가시키면, C_max가 감소되었고, t_max가 증가되었으며, t₀ _.01이 증가되었다. 중합체 MW를 증가시키면, C_max가 감소되었고, t_max가 증가되었으며, t₀ _.01이 증가되었다. 이는 비히클 내의 중합체 유형이 지속 전달에 영향을 미친다는 것을 가리킨다.

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 용매 유형의 영향. 침전물 B를 PLGA1A:용매 비히클 내에 50 ㎎/g으로 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 22에 나타난 바와 같이, 용매를 NMP에서 트리아세틴으로 변화시키면, t₀ _.01만 증가되었다. 이는 비히클 내의 용매 유형이 지속 전달에 영향을 미친다는 것을 가리킨다.

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 펩티드 농도의 영향. 침전물 B를 50:50 PLGA1A:NMP 비히클 내에 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 23에 나타난 바와 같이, 용량을 증가시키면, C_max가 감소되었고, t_max가 증가되었으며, t_0.01이 감소되었다 (모두 표준화됨). 침전물 H를 40:60 PLA3L:NMP 비히클 내에 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 23에 나타난 바와 같이, 용량을 증가시키면, C_max가 감소되었고, t_max가 증가되었으며, t₀ _.01이 감소되었다 (모두 표준화됨). 이는 PLA 및 PLGA 비히클이 높은 용량의 펩티드의 지속 전달을 제공할 수 있다는 것을 가리킨다.

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 펩티드 형태 (아연 없음)의 영향. 침전물 I 및 분무 건조된 물질을 40:60 PLA3L:NMP 비히클 내에 50 ㎎/g으로 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 24에 나타난 바와 같이, 아연을 함유하지 않는 펩티드 형태로의 변화는 지속 전달 파라미터를 변화시키지 않았다. 이는 아연이 없는 펩티드의 물리적 형태가 지속 전달에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 것을 가리킨다.

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 펩티드 형태의 영향. 침전물 H, J, K 및 L을 40:60 PLA3L:NMP 비히클 내에 50 ㎎/g으로 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 25에 나타난 바와 같이, 침전물을 세정하여 아연 함량을 감소시키는 것은 지속 전달 파라미터를 변화시키지 않았다 (J 및 L). 세정된 침전물은 세정되지 않은 저-아연 침전물과 유의하게 상이한 방식으로 작동하였다 (K 및 L). 50:50 메탄올:물 용액으로부터의 침전은 감소된 C_max 및 증가된 t_max를 야기하였다. 이는 이러한 비히클에서, 펩티드와 함께 침전된 아연의 양이 지속 전달에 영향을 미치지 않지만, 펩티드가 이로부터 침전되는 용액은 전달에 유의하게 영향을 끼친다는 것을 가리킨다.

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 양이온 유형의 영향. 여러 칼슘 및 철 침전물을 40:60 PLA3L:NMP 비히클 내에 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 26에 나타난 바와 같이, 모든 제형이 약간의 지속 전달을 나타냈고, 이때 철 제형이 칼슘 제형보다 양호하게 작동하였다. 이는 아연에 더하여 또다른 양이온 침전물이 펩티드의 지속 전달을 제공할 수 있다는 것을 가리킨다.

원숭이에서의 약동학적 프로파일에 대한 중합체 유형 및 펩티드 형태의 영향. 침전물을 중합체:NMP 비히클 내에 제형하고, 사이노몰구스 원숭이에게 투약하였다. 도 27에 나타난 바와 같이, 40:60 PLGA1A:NMP 비히클 및 침전물 A에서 40:60 PLA3L:NMP 비히클 및 침전물 J로 동시에 변화시키면, C_max가 감소되었고, t_max가 감소되었으며, t₀ _.01이 증가되었다. 이는 중합체 성질 (예를 들어, 유형 및 분자량) 및 펩티드가 제조되는 방식이 지속 전달에서 중요하다는 것을 가리킨다.

래트에서의 약동학적 프로파일에 대한 침전 방법의 영향. 침전물 H, J, M 및 N을 따로따로 40:60 PLA3L:NMP 비히클 내에 제형하고, 래트에게 400 ㎕로 투약하였다. 도 28에 나타난 바와 같이, 표준 침전물 J 및 H가 분무된 침전물 M 및 N과 각각 유사하다 (즉, 펩티드 및 아연 함량이 유사하다). 각각의 경우에, 분무된 침전물은 증가된 C_max 및 t_max를 나타냈다. 분무된 침전물에 대한 일주일의 종점에서의 혈장 농도가 표준 침전물의 농도보다 더 높거나 등가였다. 이는 분무된 침전물이 표준 침전물과 비교하여 개선된 지속 전달 잠재력을 제공할 수 있다는 것을 가리킨다.

원위치 형성 젤

하기의 예들은 본 발명의 펩티드를 포함하는 원위치 형성 젤의 제조를 설명한다. 하기의 예들에서, 원위치 젤 제형은 Atrigel 기술 (Atrix Pharmaceuticals) 및 SABER™ 기술 (DURECT Pharmaceuticals)을 기초로 하였다.

한 예에서, 액체 용액을 형성하도록 용매, 예컨대 N-메틸피롤리디논 (NMP) 내에 고형의 생체분해성 선형 사슬 중합체 또는 공중합체, 예컨대 폴리-락티드-코-글리콜리드 산 (PLGA)이 용해된 열가소성 시스템 내에 약물 물질을 현탁시킨다. 중합체 용액이 충분한 물이 있는 신체 내로 놓이면, 고체 구조물로 고체화되도록 중합체를 남기면서 용매가 중합체로부터 확산된다. PLGA가 분해됨에 따라, 약물 물질이 천천히 방출된다. 시판품의 예는 Atrigel® 내에 현탁된 Eligard® 또는 류프롤리드 아세테이트이다.

또다른 예에서, SABER 기술을 사용하여, 용액의 점도를 저하시키도록 에탄올과 혼합된 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 (SAIB) 내에 약물 물질이 현탁된다. SAIB는 주위 조건 또는 생리학적 조건 하에 결정화되지 않는 비-중합체성, 비-수용성 고점도 액체 물질이다. 펩티드-SAIB 용액이 물이 충분한 신체 내에 놓이면, 고체 구조물로 고체화되도록 SAIB를 남기면서 용매가 SAIB로부터 확산된다. SAIB가 분해됨에 따라, 약물 물질이 혈류 내로 천천히 방출된다. 유용한 시판품의 예는 SAIB 내에 현탁된 Posidur™ 또는 부피바카인이다.

실시예 16

본 발명의 펩티드를 포함하는 원위치 젤 제형의 제조의 추가적인 예들이 여기에서 설명된다. 먼저, TRI-1144를 분무 건조하거나, 또는 빙초산의 첨가에 의해 침전시켰다. 그후, TRI-1144를 황산아연으로 수용액으로부터 침전시켜, Zn:TRI-1144 복합체를 형성시켰다. 아연 및 펩티드 함량에 대해 분석했을 때, Zn:TRI-1144 비율은 1.1:1이었다. 또다른 예에서, TRI-1144를 50:50 물:메탄올 용액에 용해시킨 후, 황산아연의 첨가에 의해 침전시켰다.

SAIB를 Mallinckrodt로부터 구입하였다. TRI-1144 침전물을 다양한 SAIB:PLGA:에탄올 (표 11) 용액에 현탁시킨 후, 래트/원숭이 내로 투약하였다. PLGA를 에탄올에 용해시킨 후, SAIB에 첨가하여, 원하는 (％ 중량-중량)를 달성하였다. 동물 PK 연구의 결과를 기초로, 침전물 유형 및 용매를 최적화하였다.

모든 PLA/PLGA 중합체는 Lakeshore Biomaterials (Mobile, Alabama)로부터 수득되었다. 아연 침전물을 다양한 PLA:NMP 및 PLGA:NMP 용액 (표 12)에 현탁시킨 후, 래트/원숭이 내로 투약하였다. 일반적으로, PLA/PLGA를 NMP에 용해시킨 후 필요하다면 기타 친수성 용매를 첨가함으로써 용매를 제조하였다. 동물 PK 연구의 결과를 기초로, 침전물 유형 및 용매를 최적화하였다.

결과/논의

SAIB로 형성된 TRI-1144의 원위치 형성 젤은 최초 1주일의 지속 방출을 나타냈다. 도 29는 TRI-1144 SAIB 젤의 래트에서의 TRI-1144 방출을 나타낸다. SAIB의 농도가 증가됨에 따라, 더 길게 TRI-1144가 방출되었다. 그러나, PLA/PLGA:NMP 내의 TRI-1144의 원위치 형성 젤에 비교했을 때, TRI-1144의 방출이 그만큼 길지 않았다. 도 30은 Atrigel 시스템 대 SABER에 의해 형성된 원위치 형성 젤의 비교를 나타낸다. SABER 젤은 급방출이 비교적 더 높았고, 본질적으로 모든 TRI-1144가 100시간에 걸쳐 방출되었다. 그러나, Atrigel 시스템으로 형성된 TRI-1144 젤은 1주일 후에도 TRI-1144를 여전히 방출하고 있었다. 또한, Atrigel 기술을 사용한 TRI-1144 제형은 SABER 기술을 사용한 제형보다 덜 점성이었다. 이는 도 31에 제시된 바와 같은 원숭이 PK 연구 #527의 결과에서 분명하였다. TRI-1144가 양쪽 모두의 제형에 대해 동일한 기간에 걸쳐 방출되었다. 그러나, PLGA 내에 현탁된 TRI-1144가 이의 비교적 더 낮은 점성으로 인해 더 쉽게 투약되었다.

Zn - TRI -1144 침전물 최적화

TRI-1144의 지속 방출이 TRI-1144를 황산아연으로 침전시킴으로써 추가로 증가되었다. 아연 함량에 대해 분석했을 때, 아연이 TRI-1144와 1.1:1 비율로 복합체를 형성하였다. 초기의 제형은 100배 과량까지의 아연을 함유하였다. 도 31의 원숭이 PK 연구 #에 제시된 결과 및 도 8의 래트 PK 연구 #530으로부터의 제형 782-102의 결과는 지속 방출이 Zn-TRI-1144 복합체에 의해 강화된다는 것을 가리킨다. 그러나, 도 32의 래트 PK 연구 #531로부터의 제형 782-099에 대한 결과에 나타난 바와 같이 TRI-1144와 복합체를 형성하는데 최소량의 아연이 사용되었을 때 결과들이 유사하였다. TRI-1144를 50:50 물:메탄올 용액에 용해시킨 후 황산아연으로 침전시킴으로써 Zn-TRI-1144 침전물이 추가로 최적화되었다. 물에 용해된 TRI-1144의 침전으로부터의 침전물은 백색의 미세 유동 분말인 반면, TRI-1144가 유기 용액에 용해되었을 때 형성된 Zn-TRI-1144 침전물은 투약 용액 내에 현탁되기 전에 분쇄를 필요로 하는 덩어리진 고체였다. x-선 분말 회절에 의해 분석했을 때, 수용액으로부터의 Zn-TRI-1144 침전물은 무정형이었고, 유기 용액으로부터의 침전물에는 약 10％의 결정질이 있었다.

PLA / PLGA 최적화

중합체 사슬 길이 및 유형을 또한 최적화하였다. 일반적으로, PLA가 PLGA보다 더 길게 지속 방출되었고, 사슬 길이가 더 긴 중합체가 더 길게 지속 방출되었다. 이는 투약 용액의 중합체 분해 및 용액 점도에 직접적으로 비례하였다. 도 33에서, PLGA2.5A 및 PLGA3A를 사용하는 제형에 비교했을 때 PLGA2A가 NMP에 용해된 제형은 급방출이 더 높았고, 덜 지속 방출되었다.

PLA - PEG1500 및 PLGA - PEG 1500을 사용하는 원위치 형성 젤

PLA와 PEG 1500 및 PLGA와 PEG 1500의 공중합체를 사용하여 Zn-TRI-1144의 원위치 형성 젤 제형을 또한 제조하였다. 이론적으로는, PEG 1500이 중합체를 더욱 친수성이게 할 것이다. 이는 NMP의 더 신속한 소실을 허용할 것이고, 따라서 젤의 경화를 보조할 것이다. 도 34에 제시된 래트 PK 연구 #로부터의 결과는 PLA-PEG 및 PLGA-PEG 1500 공중합체를 사용한 원위치 형성 젤로부터의 TRI-1144의 1주일에 걸친 0차 방출을 나타낸다. 이러한 제형들은 TRI-1144의 1회/주 용량 제형의 실행가능성을 최초로 실연하였다.

친수성 용매 최적화

NMP가 피하 주사를 위한 허용가능한 용매이기는 하지만, 지금까지 연구된 제형 내의 NMP의 양은 1회/일 투약, 잠재적으로는 1회/주 투약에 대한 제약상 허용가능한 한계를 초과한다. 따라서, PLA-PEG1500 및 PLGA-PEG 1500 공중합체가 원위치 형성 젤을 형성하는데 사용된 래트 PK 연구 #553으로부터의 결과를 기초로, MP와 함께 여전히 PLA/PLGA 중합체를 용해시킬 또다른 친수성 용매를 최적화하기 위해 일련의 연구들이 디자인되었다. 각각 도 35 및 36에 제시된 래트 PK 연구 #560 및 #561로부터의 결과는 PLA/PLGA 희석액에 친수성 용매를 첨가하는 것이 원위치 형성 젤이 더 빠르게 경화될 수 있게 하고, 따라서 TRI-1144의 방출을 지속시킨다는 것을 나타낸다. 연구된 용매들 중에서, PEG 400이 조사된 최적의 용매인 것으로 나타났다 (도 36, 803-073-3 및 803-073-4).

PLGA 최적화

PLA 3L 및 PLGA 3A가 지속 방출이 더 양호하기 때문에 PLA 3L 및 PLGA 3A가 용매 시스템을 최적화하기 위한 연구에서 먼저 사용되었다. 상이한 용매 시스템으로 인한 TRI-1144 방출에서의 임의의 차이는 식별하기 더 쉬울 것이다. 그러나, PLA 3L은 6개월에 걸쳐 분해되고, PLGA 3A는 1개월에 걸쳐 분해되어, 양쪽 모두 TRI-1144의 1회/주 투약에 허용가능하지 않았다. 래트 PK 연구 #560 및 #561에서 최적화된 용매 시스템은 PLA3L/PLGA3A가 NMP:PEG 400 (50:50) 내에 40:60 ％ 중량/중량 비율로 용해되어 함유된 시스템이었다. 더 빠르게 분해되는 중합체가 필요하였다. 도 37은 래트 PK 연구 #585의 결과를 나타낸다. 이러한 연구에서, 제형은 NMP:PEG 1500에 용해된 PLGA 1A, PLGA 2A 및 PLGA 2.5A를 함유하였다. PLGA 1A 및 PLGA 2A를 사용하는 원위치 형성 젤들은 결과가 유사하였고, TRI-1144의 1회/주 투약에 실행가능하지 않았다. PLGA 2.5A를 사용하는 원위치 형성 젤은 1주일에 걸쳐 유사-1차 방출을 나타냈고, TRI-1144의 1회/주 투약에 허용가능하였다.

단일- 및 이중 에멀션을 사용하는 TRI-1144의 지속 방출 제형이 TRI-1144의 1회/주 투약에 대한 실행가능성을 결정하기 위해 추가로 조사될 필요가 있었다. 펩티드의 로딩이 마이크로스피어의 적합한 형성을 방지하였다. 생체 내에서 분석되었을 때, 이러한 제형들은 TRI-1144의 급방출에 이은 TRI-1144의 느린 방출을 초래하였다. 이러한 제형들의 생체내 방출 프로파일을 TRI-1144 즉각 방출 액체 제형과 비교하였다. 50:50 NMP:PEG 400에 용해된 50:50 PLGA 2.5A 내에 현탁된 아연-TRI-1144 침전물의 원위치 형성 젤을 사용함으로써 TRI-1144의 1회/주 투약에 대한 원형 제형이 달성되었다. 50:50 PLGA 2.5A는 2주 동안 주사 부위에서 잔존할 것이다. NMP:PEG 400 용매 시스템은 NMP에 대한 제약상 허용가능한 한계 내에 속한다.

본원에서 제공되는 특정 실시양태들의 상기의 설명은 실례의 목적을 위해 상세하게 기술되었다. 설명 및 실례를 고려하여, 당업자는, 현재의 지식을 적용함으로써, 기본적인 개념을 벗어나지 않으면서 다양한 용도를 위해 실시양태들을 쉽게 변형 및/또는 개조할 수 있다; 따라서, 이같은 변형 및/또는 개조는 첨부된 청구항의 의의 및 범주 내인 것으로 의도된다.

다양한 참고문헌들이 본원에서 인용되고, 이들의 개시 내용은 전체적으로 거명에 의해 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Trimeris, Inc. <120> NOVEL METHODS OF SYNTHESIS FOR THERAPEUTIC ANTIVIRAL PEPTIDES <130> 7872-139-228 <140> <141> <150> 60/995,318 <151> 2007-09-25 <160> 80 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 1 Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn 1 5 10 15 Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu 20 25 30 Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu 35 40 45 Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe 50 55 60 <210> 2 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 2 Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln 1 5 10 15 Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu 20 25 30 Trp Asn Trp Phe 35 <210> 3 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 3 Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn 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Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 1 5 10 15 Ile <210> 69 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 69 Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 1 5 10 15 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 70 Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala 1 5 10 15 <210> 71 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 71 Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala 1 5 10 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 72 Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr 1 5 10 <210> 73 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 73 Glu Leu 1 <210> 74 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 74 Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu 1 5 10 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 75 Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu 1 5 10 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 76 Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu 1 5 10 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 77 Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu 1 5 <210> 78 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 78 Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln 1 5 10 15 Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp 20 25 30 Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe 35 <210> 79 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 79 Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln 1 5 10 15 Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu 20 25 30 Trp Asn Trp Phe Asn Ile Thr 35 <210> 80 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 80 Tyr Gln Glu Trp Glu Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr 1 5 10 15 Ala Leu Leu Glu Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu 20 25 30 Leu Gln Lys Leu 35

Claims

서열 58-77로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편의 축합을 포함하는, 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드의 합성 방법.
제1항에 있어서, 2개의 펩티드 단편의 축합을 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 펩티드 단편이 서열 72 및 58; 서열 70 및 59; 서열 64 및 60; 또는 서열 63 및 62의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 합성을 링크(rink)-로딩(loaded) CTC 수지, 지베르(Sieber) 수지, 래미지(Ramage) 수지, Glu-로딩 CTC 수지 또는 Glu37 측쇄 로딩 수지를 사용하여 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 펩티드의 N-말단에 아세틸 기를 형성시키는 탈보호 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 펩티드의 C-말단에 아미도 기를 형성시키는 탈카르복실화 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 펩티드의 N-말단에 아세틸 기를 형성시키는 탈보호 단계; 및 펩티드의 C-말단에 아미도 기를 형성시키는 탈카르복실화 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 3개의 펩티드 단편의 축합을 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 펩티드 단편이 서열 72, 74 및 20; 서열 71, 75, 및 20; 서열 70, 76 및 20; 또는 서열 68, 77 및 20의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 합성을 링크-로딩 CTC 수지, 지베르 수지, 래미지 수지, Glu-로딩 CTC 수지 또는 Glu37 측쇄 로딩 수지를 사용하여 수행하는 방법.
제8항에 있어서, 펩티드의 N-말단에 아세틸 기를 형성시키는 탈보호 단계를 더 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 펩티드의 C-말단에 아미도 기를 형성시키는 탈카르복실화 단계를 더 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 펩티드의 N-말단에 아세틸 기를 형성시키는 탈보호 단계; 및 펩티드의 C-말단에 아미도 기를 형성시키는 탈카르복실화 단계를 더 포함하는 방법.
서열 72, 74 및 19; 서열 71, 75 및 19; 서열 70, 76 및 19; 또는 서열 68, 77 및 19의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편의 축합을 포함하는, 서열 9를 포함하는 펩티드의 합성 방법.
제14항에 있어서, 펩티드 단편의 축합 전에 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편과 류신 아미노산 잔기를 공유결합으로 커플링시키는 단계를 더 포함하는 방법.
서열 40 및 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 펩티드 단편의 축합을 포함하며, 링크-로딩 CTC 수지, 지베르 수지 또는 Glu-로딩 CTC 수지를 사용하여 합성을 수행하는, 서열 9를 포함하는 펩티드의 합성 방법.
링크 수지, 변형된 산 수지, 링크-연결-로딩 CTC 수지 또는 감마-글루타밀(Leu-아미도)-로딩 CTC 수지를 사용하는 선형 고상 합성을 포함하는, 서열 9를 포함하는 펩티드의 합성 방법.
(a) Ac-AA(1-26)-OH 및 AA(27-37)-링크-OH;
(b) Ac-AA(1-26)-OH 및 AA(27-38)-링크-OH;
(c) Ac-AA(1-12)-OH, Fmoc-AA(13-26)-OH, 및 AA(27-37)-링크-OH;
(d) Ac-AA(1-12)-OH; Fmoc-AA(13-26)-OH, 및 AA(27-38)-링크-OH; 또는
(e) Ac-AA(1-26)-OH 및 H-AA(27-38)-NH2 프리(free) Glu37
로 이루어진 군으로부터 선택된 셋트를 포함하는, 서열 9의 합성을 위한 펩티드 단편의 셋트.
서열 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 또는 77의 아미노산 서열로 구성된 펩티드.