CN112851789B - 一种脑靶向hiv进入抑制剂多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种脑靶向HIV进入抑制剂多肽及其应用。本发明涉及一组能够穿透血脑屏障进而靶向于脑部，且对人类免疫缺陷病毒HIV具有抑制活性，进而用于HIV脑部感染、及潜伏库进行清除的多肽。所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示及其衍生产物。本发明能为人类免疫缺陷病毒HIV脑部感染的预防、治疗、及脑部潜伏库的清除提供候选多肽类药物。

Description

一种脑靶向HIV进入抑制剂多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种脑靶向HIV进入抑制剂多肽及其应用。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染所引起的一种危害极大的慢性传染病。HIV主要攻击人类的免疫系统，削弱人体对病原体感染和某些癌症的防御能力。随着病毒对免疫细胞的破坏，感染者免疫系统逐渐出现功能缺陷，并造成机体越来越易受到机会性病原体的感染、癌症和某些疾病的侵袭。根据基因差异和表面抗原的差异，可将HIV分为两个亚型：HIV-1和HIV-2，其中HIV-1是在全世界广泛流行的HIV亚型。

世界卫生组织报道，到2018年底，约有3790万艾滋病毒感染者，低收入和中等收入国家中分别有62％和54％的HIV感染成人和儿童在终生接受抗逆转录病毒药物治疗。由于在HIV服务方面存有差距，2018年全球有77万人死于HIV相关原因，170万人成为新感染者。2018年，在全球HIV新感染者中，重点人群及其性伴侣首次占到半数以上(估计为54％)。在东欧、中亚、中东和北非地区，这些群体占HIV新发感染的95％左右。

尽管高效联合抗逆转录病毒治疗(highly active anti-retroviral therapy，HAART)可以降低HIV感染者发生AIDS的发病率和死亡率，但在临床上针对HIV-1逆转录酶和蛋白酶的药物都存在着用药周期持久，毒副作用强，易产生抗药性病毒株等缺点。因此，针对于保守的HIV-1包膜蛋白gp41为代表的新靶点低毒性的HIV进入抑制剂逐渐发展起来，成为了目前艾滋病药物研究的热点之一。

HIV-1对靶细胞的侵入是病毒感染的第一步，也是至关重要的一步。侵入过程可以分为以下步骤：首先，HIV包膜蛋白gp120/gp41复合物通过gp120与靶细胞表面的受体CD4相互作用；随后，构象变化的gp120暴露出的辅受体结合位点并与靶细胞膜上的CCR5或CXCR4结合，这一结合进一步诱导了膜蛋白构象的变化；最后，gp41的融膜肽(FP)弹出插入到靶细胞膜中，紧接着gp41的C端重复区(CHR)和N端重复区(NHR)反向折叠形成六螺旋结构束(6-HB)，从而将靶细胞膜和病毒包膜拉到足够近的距离，使病毒进入并发生细胞融合。该过程目前已经成为抗HIV药物研发的重要靶点，对该融合过程中任何一步的有效抑制，都能达到阻止HIV-1入侵靶细胞的目的。因此，只要阻断病毒与细胞融合过程中的任何一步，就能起到抑制HIV感染和治疗艾滋病的目的。

“柏林病人”的成功的“治愈”鼓舞了研究人员对实现艾滋病功能性治愈的信心。近年来美国政府启动的“艾滋病病毒治愈计划”，以及中国政府“艾滋病功能性治愈的创新性研究”重大传染病专项研究，都将艾滋病的药物研究进一步推向新的高潮。研究发现，患者感染四个月内HIV-1就可以突破血脑屏障，并在大脑中稳定存在。之后，进入脑组织的HIV-1逐渐发生变异，并最终造成脑萎缩等神经系统及精神健康方面的危害。此外，由于正常脑组织中血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的存在，导致了98％的小分子药物和100％的大分子药物无法从血液进入脑部，继而阻止了药物发挥治疗作用，同样，绝大多数HAART药物也无法通过BBB。因此，HIV-1能逃避药物的作用隐藏于中枢神经系统以及宿主的CD4⁺T细胞、神经胶质细胞等细胞中，形成病毒潜伏库(latent viral reservoir)。其中，脑是重要的HIV-1储存库之一，也是HIV-1清除过程重要障碍。因此，HAART疗法虽能最大限度抑制HIV-1的复制，却无法有效阻止HIV对中枢神经系统的感染。一旦停药，病毒就会重新复制和扩增，导致病毒载量的迅速反弹。目前，国际上正集中优势力量研发HIV治疗的“shock andkill”策略，即先用HIV激活剂来激活潜伏的病毒，再用抗HIV-1灭活剂将其杀灭的策略来作为治愈艾滋病的方案。但是，由于血脑屏障的存在，脑潜伏库的激活和脑部HIV-1的感染的药物阻断成为该策略的难点，因此，急需一种方法携带药物顺利通过血脑屏障以阻断HIV病毒对中枢神经系统的感染。

Angiopep-2是近年来报道的一种高效的脑靶向头基。Angiopep-2是一段由19个氨基酸(TFFYGGSRGKRNNFKTEEY)残基组成的短肽，能与BBB上高表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein,LRP)结合并介导入脑。其入脑效率高于转铁蛋白(transferrin，Tf)、乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)、以及抗生物素蛋白(Avidin)等经典脑靶头。并且，Angiopep-2已经成功递送多种基因及药物用于帕金森病、神经胶质瘤等脑内疾病的治疗。

目前，国际上正集中优势力量研发HIV治疗的“shock and kill”策略，即先用HIV激活剂来激活潜伏的病毒，再用抗HIV-1灭活剂将其杀灭的策略来作为治愈艾滋病的方案。但是，由于血脑屏障的存在，脑潜伏库的激活和脑部HIV-1感染的药物阻断成为该策略的难点，因此，急需一种能够顺利通过血脑屏障以阻断HIV对中枢神经系统的感染药物。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种脑靶向HIV进入抑制剂多肽及其应用，该多肽具有脑靶向穿透能力、且具有HIV抑制能力。

本发明的目的是提供一种脑靶向HIV进入抑制剂多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

优选的，上述脑靶向HIV进入抑制剂多肽，所述多肽由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中的任一氨基酸序列经过取代、缺失或添加一或多个氨基酸后组成。

本发明还提供了一种所述的多肽的在制备具有脑部靶向穿透血脑屏障的HIV脑感染抑制剂的应用。

优选的，上述应用，将所述多肽制成含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的重组蛋白。

本发明还提供了一种编码所述的脑靶向HIV进入抑制剂多肽的核苷酸序列，SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示多肽的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所述。

优选的，上述核苷酸序列，将所述SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.5或SEQID NO.6、的任一核苷酸序列的经密码子优化后获得能够表达SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的优化核苷酸序列。

本发明还提供了一种包含所述的核苷酸序列的表达载体。

本发明还提供了一种包含所述的表达载体的重组细胞。

本发明还提供了一种HIV抑制药物，所述药物包含上述任一多肽、重组蛋白、任一核苷酸序列、表达载体、重组细胞中的一种或者几种的组合。

本发明还提供了一种上述药物在制备脑靶向HIV进入抑制剂的用途。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明基于Angiopep-2能够穿透血内屏障的假设，选用凝集素肽(Angiopep-2)，通过低密度脂蛋白受体相关蛋白携带蛋白多肽类药物入脑，借助靶头Angiopep-2，使抗HIV-1多肽药物T1144能以LRP介导的主动转运的方式突破BBB，并进入脑组织中，而后，T1144部位发挥抗HIV-1作用，最终阻断HIV-1对神经胶质细胞的感染，获得一种针对突破血脑屏障的融合抑制剂。为进一步研发HIV-1的预防和治疗药物提供重要的理论及应用基础。

2、HIV难以治愈的主要原因是机体中潜伏存在的HIV储存库。目前，国际上清除HIV储存库主要的策略是“shock and kill”，即先用药物激活潜伏HIV储存库细胞，然后利用机体免疫系统等杀死这些被激活的感染细胞。但是，其前提要阻断激活后产生的病毒造成新的靶细胞的感染。HIV潜伏库激活药物作用过程中，本发明提供的多肽药物是脑靶向HIV进入抑制剂，其能阻断新产生的HIV对脑内靶细胞的感染，进而彻底清除HIV脑潜伏库。

3、本发明将具有多肽类药物的共有优点，即特异性强，毒性低的优势。进而，将更有利于在脑部HIV感染的治疗方面进行推广。

附图说明

图1为本发明脑靶向HIV进入机制示意图；

图2为本发明脑靶向HIV结构示意图；

图3为本发明实施例1复性产物与纯化产物的SDS-PAGE；

A：SDS-PAGE分析重组蛋白Ang-L6-T1144原核诱导表达纯化后的结果，B：SDS-PAGE分析重组蛋白T1144-L6-Ang原核诱导纯化后的结果。M：蛋白maker；1、2泳道分别代表加诱导剂后的上清和沉淀，3、4泳道分别代表蛋白变性和复性后的结果，5泳道代表蛋白超滤后的结果；

图4为本发明实施例1的Ang-L6-T1144(泳道1)和T1144-L6-Ang(泳道2)Westernblotting结果；

图5为本发明实施例2的HIV的SC42目的片段的扩增结果；

图6为本发明实施例2的4h(A)和48h(B)的荧光显微图；

图7为融合蛋白对细胞-细胞融合模型的抑制作用结果；

A：TL₆A，B：AL₆T，C：TL₁₀A，D：AL₁₀T；

图8为本发明实施例4的电泳结果；

A：TL₆A和AL₆T对HIV六螺旋形成的移植作用，B：TL₁₀A和AL₁₀T对六螺旋形成的抑制作用；

图9为本发明实施例5穿透血脑屏障的情况；

A：带有FITC的候选药物FITC-TL₆A组脑部的荧光图像；B：FITC-Ang组穿透血脑屏障后的荧光图像；C：FITC-C34组在脑部的荧光图像；D：脑组织空白对照组荧光图像。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

在本发明的描述中，如未特殊说明，则所述试剂或者方法均为本领域常规试剂或方法。下述实施例中，所用PBS的浓度为0.1M、pH为7.4。

本发明实施例提供的脑靶向HIV进入抑制剂多肽序列参见表1。表1中下划线部分为柔性连接子(linker)。Linker在重组融合蛋白中发挥多种功能，包括改善蛋白的折叠和稳定性、促进蛋白表达、提高内在的生物活性、能够靶向体内特定位点以及改变融合蛋白的药物动力学曲线等。本发明中使用的柔性linker将在连接抗HIV活性部位T1144和脑靶向部位Angiopep-2的同时，最大限度保护两个活性部位的功能。图1为本发明脑靶向HIV进入机制示意图，图2为本发明脑靶向HIV结构示意图。

表1脑靶向HIV进入抑制剂多肽序列

实施例1AL₆T、TL₆A的表达及纯化

1.重组质粒的构建

构建蛋白表达质粒pET-28a-Ang-L6-T1144和pET-28a-T1144-L6-Ang，Ang-L6-T1144及T1144-L6-Ang核苷酸序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成并通过BamHⅠ和EcoRⅠ插入pET-28a表达载体。

其中，Ang-L6-T1144核苷酸序列如下：

CGGATCCATGACCTTTTTTTATGGCGGCTGCCGCGGCAAACGCAACAACTTTAAAACCGAAGAATATAGCGGCGGCCGCGGCGGCACGACCTGGGAAGCATGGGACAGAGCTATTGCTGAATACGCAGCTAGGATAGAAGCTTTACTCAGAGCTTTACAAGAACAGCAAGAAAAGAATGAAGCAGCCTTAAGGGAATTACACCACCACCACCACCACTAA GAATTC；其中下划线部分包含酶切位点和6*his纯化标签，非下划线部分为SEQ ID NO.3的密码子序列，非下划线部分参见SEQ ID NO.5，其中的斜体部分为启动子。

T1144-L6-Ang的核苷酸序列如下：

CGGATCCATGACGACCTGGGAAGCATGGGACAGAGCTATTGCTGAATACGCAGCTAGGATAGAAGCTTTACTCAGAGCTTTACAAGAACAGCAAGAAAAGAATGAAGCAGCCTTAAGGGAATTAAGCGGCGGCCGCGGCGGCACCTTTTTTTATGGCGGCTGCCGCGGCAAACGCAACAACTTTAAAACCGAAGAATATCACCACCACCACCACCACTAA GAATTC；其中下划线部分包含酶切位点和6*his纯化标签，非下划线部分为SEQ ID NO.4的密码子序列，非下划线部分参见SEQ ID NO.6，其中的斜体部分为启动子。

Ang-L10-T1144的核苷酸序列如下：

CGGATCCATGACCTTTTTTTATGGCGGCAGCCGCGGCAAACGCAACAACTTTAAAACCGAAGAATATGGAGGAGGAGGAAGTGGCGGCGGCGGCTCGACGACCTGGGAAGCATGGGACAGAGCTATTGCTGAATACGCAGCTAGGATAGAAGCTTTACTCAGAGCTTTACAAGAACAGCAAGAAAAGAATGAAGCAGCCTTAAGGGAATTACACCACCAC CACCACCACTAAGAATTC；其中下划线部分包含酶切位点和6*his纯化标签，非下划线部分为SEQ ID NO.1的密码子序列，非下划线部分参见SEQ ID NO.7，其中的斜体部分为启动子。

T1144-L10-Ang核苷酸序列如下：

CGGATCCATGACGACCTGGGAAGCATGGGACAGAGCTATTGCTGAATACGCAGCTAGGATAGAAGCTTTACTCAGAGCTTTACAAGAACAGCAAGAAAAGAATGAAGCAGCCTTAAGGGAATTAGGAGGAGGAGGAAGTGGCGGCGGCGGCTCGACCTTTTTTTATGGCGGCAGCCGCGGCAAACGCAACAACTTTAAAACCGAAGAATATCACCACCAC CACCACCACTAAGAATTC；其中下划线部分包含酶切位点和6*his纯化标签，非下划线部分为SEQ ID NO.2的密码子序列，非下划线部分参见SEQ ID NO.8，其中的斜体部分为启动子。

2.蛋白的表达与纯化

将重组质粒pET-28a-Ang-L6-T1144和pET-28a-T1144-L6-Ang分别转化进入大肠杆菌Rosetta(DE3)，所用的抗生素为卡那霉素(KAN)和氯霉素(CHL)。具体步骤如下：

将5ml菌液加入500ml含有卡那霉素和氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养3.5h，使菌液OD₆₀₀值达到0.6左右，用已经确定的表达条件(诱导剂IPTG＝0.2mmol/L或0.8mmol/L，16℃条件诱导20h)下，诱导表达重组蛋白，12000rmp离心10min收菌。用0.1MPBS重悬洗涤两遍后，12000rmp离心10min离心留沉淀，用50ml 0.1M PBS重悬后，低温超声破碎细菌(工作5s，间隔3s)，超声破碎细菌30min后，12000rmp离心20min，收集上清和沉淀，取少量分别进行凝胶电泳检测，所有实验过程均在冰上操作。

3.包涵体蛋白洗涤与溶解

用10倍体积的PBS重悬超声破碎后的沉淀，4℃，12000rmp离心10min，收集包涵体，重复洗涤一次；使用LE Buffer溶解包涵体(约7.5ml/mg包涵体)，室温孵育1h，4℃，12000rmp离心30min，收集离心后的上清，待过Ni-NTA亲和层析介质。

4.复性及纯化

(1)将上一步的待过Ni-NTA的样品加入事先平衡好的Ni-NTA树脂中，让样品缓慢流出，使用恒流泵循环上样，控制流速在0.5-1ml/min，收集流出液，待后续使用SDS-PAGE检测纯化效率。(2)使用LE Buffer洗涤填料，直到紫外检测仪A280值稳定为止。(3)使用不同浓度尿素的复性液缓慢循环过柱，最后使用PBS缓慢冲洗柱材。(4)用2倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤填料。(5)使用洗脱缓冲液洗脱蛋白。(6)选择合适的超滤管，通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，本实施例目的蛋白分子量为11kDa左右，选择3kDa截留分子量的超滤管浓缩蛋白。

两组蛋白复性产物经SDS-PAGE，图3是复性产物与纯化产物的SDS-PAGE。A：SDS-PAGE分析重组蛋白Ang-L6-T1144原核诱导纯化后的结果，B：SDS-PAGE分析重组蛋白T1144-L6-Ang原核诱导纯化后的结果。M：蛋白maker；1、2泳道分别代表加诱导剂后的上清和沉淀(上述步骤2的上清和沉淀)，3、4泳道分别代表蛋白变性(上述步骤3的产物)和复性(上述步骤4(5)的产物)后的结果，5泳道代表蛋白超滤后(上述步骤4(6)的产物)的结果。图3可见，SDS电泳结果显示重组蛋白pET-28a-Ang-L6-T1144和pET-28a-T1144-L6-Ang经大量诱导表达，经过纯化后，与未诱导的结果比较，在分子量约为11kDa的位置出现目的条带，浓缩后的结果与复性后的结果一致，且复性之后结果显示，目的条带比较单一。

5.Western blotting检测纯化后的蛋白样品

两组蛋白复性产物经SDS-PAGE后，通过Western blot转印凝胶中的蛋白条带，结果参见图4，结果显示pET-28a-Ang-L6-T1144(泳道1)和pET-28a-T1144-L6-Ang(泳道2)的包涵体纯化产物分子量约为11kDa的条带与单抗His结合，证明本实施例已经成功诱导表达蛋白。

实施例2HIV细胞-细胞融合检测模型的构建

研究显示，通过细胞-细胞融合模型和假病毒模型检测HIV融合抑制剂的方法切实可行(参考文献1：李建彬，陈斌，米志强，等.人免疫缺陷病毒假病毒药物筛选模型的构建及其应用[J].生物技术通讯.2012,23(04):481-484。参考文献2：王萍，陈欢，罗荣华，等.VSVG/HIV-1_(NL4-3)Luc假病毒筛选抗HIV-1药物的条件优化及应用[J].中国药理学通报.2016,32(03):433-438)，相对于其他的检测模型，这两种模型构建速度快，对实验室的级别要求低，一般实验室均可进行相关实验的操作，并且可以评价药物对病毒进入细胞的抑制效果。

基于此，我们构建了用于检测HIV的细胞-细胞融合模型和假病毒模型，用于后期评价我们设计的融合抑制剂。

1.pAAV-GFP-SC42质粒的构建

插入包含HIV的env核苷酸序列(NCBI登录号：AY835441.1，HIV-1 isolate SC42clone 8 from Trinidad and Tobago)的表达质粒pcDNA3.1-SC42质粒由本实验室保存，但通过测序检测发现SC42的核苷酸序列中间存在BamH I酶切位点，故需要利用点突变的方法进行重叠PCR，破坏该酶切位点，根据序列和原核表达载体的酶切位点设计引物扩增不同目的片段，设计多条引物如下：

表2 HIV-SC42 env目的片段引物

注：F表示上游引物，R表示下游引物，表中斜体下划线为酶切位点；SC42F₁和SC42R₁扩增前半段，SC42F₂和SC42R₂扩增后半段，SC42F₁和SC42R₂扩增全长。

利用上述表2中的引物进行重叠PCR，所得产物经电泳回收得到插入片段SC42，根据载体pAAV-IRES-GFP与插入片段SC42连接点与酶切位点的关系，分别双酶切质粒pAAV-IRES-GFP与目的片段，胶回收后的产物。选择的限制性内切酶为BamHⅠ和Xho I，由T4连接酶连接后获得重组质粒pAAV-EGFP-SC42，反应条件：37℃过夜，重组质粒转化进大肠杆菌，挑取单克隆菌落进行菌落PCR鉴定和小提质粒进行双酶切鉴定。

结果参见图5，HIV的SC42目的片段的扩增，A泳道1：重叠PCR扩增SC42的前半段，泳道2：重叠PCR扩增SC42的后半段，M：AL5000 DNA Maker；B泳道1：重叠PCR扩增连接SC42的前半段加后半段，M：Maker IV 7000。

2.靶细胞TZM-b1的铺板及融合

(1)细胞融合实验前12h，对靶细胞进行铺板，弃去培养基，用PBS轻轻冲洗2遍，以去除残留血清。

(2)加入适量的胰酶消化细胞，待消化完成，加入培养基终止消化，将细胞液吹打成单细胞，1200rmp离心5min，弃去培养基。

(3)提前在96孔板每孔加入100μL的DMEM培养基，在离心后的离心管中加入10ml的新鲜培养基，轻轻吹打混匀制成单细胞悬液。

(4)96孔每孔加入100μL的单细胞悬液，吹打混匀，37℃，CO₂箱培养备用。

3.293T-GFP-SC42与TZM-b1细胞的融合

参考文献3(Lu H,Zhao Q,Xu Z,et al.Automatic quantitation of HIV-1mediated cell-to-cell fusion with a digital image analysis system(DIAS):application for rapid screening of HIV-1 fusion inhibitors[J].J VirolMethods.2003,107(2):155-161)记载到，靶细胞TZM-b1与经转染后的293T细胞共培养时，效应细胞可以识别靶细胞的CD4、CCR5和/或CXCR4受体，从而两种细胞发生融合。本实施例选择TZM-b1细胞作为靶细胞，将pAAV-EGFP-HIV-SC42以及pAAV-IRES-EGFP分别转染至293T细胞，然后将两个细胞共同孵育，该效应细胞特异性识别TZM-b1细胞上的受体，两者发生融合，同时由于转染细胞同时表达EGFP，因此，该模型中，细胞的早期融合具有可视化的优点。

(1)pAAV-EGFP-SC42转染293T细胞，37℃培养48h，该细胞被命名为293T/SC42/EGFP细胞，阴性对照为pAAV-IRES-EGFP质粒转染的293T细胞，阴性对照命名为293T/EGFP细胞。

(2)弃去上述两种293T细胞的上清，用PBS清洗两遍。

(3)加入400μL的胰酶消化细胞，直至细胞收缩。

(4)加入培养基终止反应，吹打成单细胞悬液，1200rmp离心5min，弃去培养基。

(5)加入新鲜的完全培养基重悬细胞，吹打成单细胞悬液。

(6)取50μL转染后的293T细胞加入已经铺好的96孔板的TZM-b1细胞上，5％CO₂培养箱37℃培养，不同时间点使用荧光显微镜的绿色荧光通道观察并记录细胞的融合情况。

图6是HIV-SC42 env基因产物gp160介导的细胞细胞融合，结果显示，将293T/SC42/EGFP效应细胞与TZM-b1靶细胞在37℃共同培养4小时后，效应细胞与靶细胞发生融合，融合细胞与未融合细胞相比，面积增大，荧光强度变弱(A图圆圈圈出了部分融合细胞)。这是因为细胞发生融合的同时，EGFP从293T/SC42/EGFP效应细胞扩散到靶细胞TZM-b1中，导致绿色荧光在细胞中重新分布。对照组293T/EGFP并没有发生融合，表明这是由HIV-SC42蛋白介导的细胞融合。两种细胞共培养48h后，效应细胞与靶细胞之间形成大的合胞体，在光学视野和荧光视野下都能看到(B图圆圈指示)。与实验组相比，阴性对照组在培养过程中既没有发生融合，也没有形成大的合胞体。

实施例3多肽具有抗HIV细胞-细胞融合活性

参考文献进行抑制细胞融合实验(参考文献4：Alam M M,Kuwata T,Tanaka K,etal.Synergistic inhibition of cell-to-cell HIV-1infection by combinations ofsingle chain variable fragments and fusion inhibitors[J].BiochemBiophysRep.2019,20:100687)。步骤如下：

(1)第一天晚上，将提前铺好的293T细胞制成细胞悬液铺于6孔板中。

(2)第二天，待细胞培养过夜，密度到达70-80％左右进行转染，将pAAV-IRES-EGFP质粒转染至293T细胞作为阴性对照，另外将pAAV-EGFP-SC42质粒转染至另一孔用于融合实验。

(3)转染12-18h后，更换新鲜的培养基。

(4)第四天，将转染48h后的细胞在倒置荧光显微镜下观察转染效率，可进行后续的细胞融合抑制实验。

(5)融合前一天，消化TZM-b1细胞，将细胞悬液铺于96孔板中，37℃培养过夜。

(6)消化转染成功的细胞，分别将阴性对照组和实验组重悬制成单细胞悬液。

(7)分别倍比稀释融合蛋白AL₆T、TL₆A、AL₁₀T、TL₁₀A，将其作为抑制药物，将转染后的293T/SC42/EGFP细胞加入配置好的药物孔，阳性对照则不加药物，阴性对照孔加入293T/EGFP，为了使药物与细胞充分作用，将加了药物的培养皿置于37℃、CO₂培养箱孵育30min。

(8)弃掉TZM-b1细胞中的培养液，将配置好的细胞与药物的混合液加入到TZM-b1细胞中。

(9)根据构建细胞-细胞融合模型的情况，在融合效果最好的时间段去观察抑制融合的情况。

本实施例利用该融合模型，检测AL₆T、TL₆A、AL₁₀T、TL₁₀A四个融合蛋白的抗病毒活性，其中以HIV融合抑制剂C34作为抗HIV多肽阳性药物对照(参考文献5：徐巍.长效HIV融合抑制剂的设计、评价及其作用机制研究[D].复旦大学,2014)。结果如图7结果显示，四条多肽均能抑制293T/SC42/EGFP细胞与靶细胞TZM-b1的融合，其中AL₆T、AL₁₀T，抑制活性较差。其中，AL₆T浓度达到30μM时，抑制细胞与细胞之间的融合超过90％；AL₁₀T活性较AL₆T高，其IC50约2.7μM，达到6.8μM时，细胞-细胞融合抑制活性达到90％，而TL₆A的抑制效果较强，与对照多肽C34的抑制活性相当，其IC50约为400nM，当浓度约为5μM时，已经可以抑制细胞融合的90％以上。同样，TL₁₀A的抑制效果优于AL₁₀T，起抑制活性优于C34，其IC50约为270nM，当浓度约为700nM时，细胞-细胞融合抑制活性达到90％。表明上述四条融合蛋白均能有效抑制HIV-1与靶细胞的融合。但是整体上讲，T1144位于N端，其抑制效果优于位于C端；两个功能区Linker的延长，活性有所提升。

但是值得关注的是，在该细胞融合模型中阳性药物C34 IC50约为430nm，远高于文献报道的低nM水平。虽然本实施例构建的检测方法具有安全、可视的优点，但是其敏感度低于传统病毒检测模型，在传统病毒检测模型中，候选多肽将具有更加突出的病毒抑制活性。

实施例4多肽具有抑制六螺旋形成的活性

分别制备终浓度为40μM的N36、C34、AL₆T、TL₆A、AL₁₀T、TL₁₀A，同时制备等摩尔的N36/C34(二者终浓度分别为40μM)混合物，同时分别配制含有AL₆T/N36/C34混合物、TL₆A/N36/C34混合物、AL₁₀T/N36/C34混合物、TL₁₀A/N36/C34混合物的组合物(组合物中各物质终浓度均为40μM)。25℃条件下孵育30min。上样前用PBS进行稀释，使样品终浓度为40μM。孵育完成后，取出适当体积的混合物，加入5×高pH电泳缓冲液准备上样。

将玻璃板、胶垫、梳子用双蒸水洗干净，防止残留的SDS等对蛋白样品的损伤，自然风干后待用。安装制胶架，按照表3配制分离胶(18％)。摇晃混匀后抽真空10～15min以去除溶液中的O₂，防止O₂抑制丙烯酰胺的聚合反应。最后加入新鲜配制的10g/100mL过硫酸铵和TEMED。混匀后用1mL加样器加入两块玻璃板之间。待液面上升至离玻璃板上沿1.5～2cm的时候停止灌胶。并在胶顶部缓缓加入约0.5cm高的体积分数75％酒精，使分离胶压平并赶出气泡。待分离胶完全聚合(约需1h)，倾倒上层的体积分数75％酒精，并使用滤纸吸去残留液体。按表4配制5％浓缩胶。并将浓缩胶加入玻璃板夹层至玻璃板上沿，插上10孔梳子。静止过夜，以使浓缩胶彻底聚合。上样前拔去梳子，用注射器清洗点样孔。

表3分离胶(18％)：10mL

表4浓缩胶(5％)：5mL

将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽加入足够的1×电泳液。连接电极，300V预电泳直到电流不再降低(约需要30min)以去除残留的过硫酸铵。更换电泳液准备蛋白电泳。在液体蛋白质样品中加入5×高pH值上样缓冲液后上样。125V电泳2h，至溴酚蓝到达凝胶底部。剥离凝胶后，将凝胶浸泡在染色液中煮沸2～3次，并在水平摇床上染色1h，清水洗涤后使用脱色液脱色后，凝胶成像系统进行拍照。

本实施例通过采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-PAGE)技术。其中，N36为碱性蛋白质，所含碱性氨基酸较多，等电点偏于碱性，在高pH电泳缓冲液中带正电荷，接通电源，N36、TL₆A、AL₆T、TL₁₀A、AL₁₀T泳动的方向为凝胶上方，凝胶结果上不显示这其条带。C34含酸性氨基酸较多，其等电点偏于酸性，所带电荷为负电荷，泳动方向为凝胶下方负极，故C34在凝胶上可显示一条条带，而N36和C34的混合物可形成六螺旋结构束(6HB)，作为本实验的六螺旋形成的阳性对照。图8结果显示重组蛋白AL₆T和TL₆A(图A)、TL₁₀A和AL₁₀T(图B)可以有效阻止gp41的NHR和CHR形成六螺旋束(6HB)核心结构的形成。提示多肽的抑制活性的原理同已经报道的其他HIV进入抑制剂活性原理一致。

实施例5多肽可有效通过血脑屏障

由于TL₆A具有较高溶解度、易于合成、且抗HIV活性高，因此，本实施例通过固相多肽合成法(委托浙江浙江昂拓莱司生物技术有限公司合成)合成了在N端标记有异硫氰酸荧光素FITC的候选多肽FITC-TL₆A(氨基酸序列:FITC-TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQEQQEKNEAALRELSGGRGGTFFYGGSRGKRNNFKTEEY)作为候选药物测试其在组织中的分布情况，同时选取FITC-Ang(氨基酸序列：FITC-TFFYGGSRGKRNNFKTEEY)作为能够穿越BBB的阳性药物对照，FITC-C34(FITC-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL)作为阴性药物对照，测定候选药物通过血脑屏障的能力。

本实施例中，以雌性Bal b/C小鼠为研究对象，称重后尾静脉给药(剂量为0.5μmol/kg)(所述药物为FITC-Ang、FITC-TL₆A、FITC-C34，每只小鼠注射一种药物)。各药物抽取相应摩尔数后，溶解于100μL ddH₂O中，立即使用胰岛素注射器注入小鼠尾静脉中。30min后处死小鼠，取出脑组织，常规进行冷冻切片(每张8-10μm厚)，荧光显微镜下观察并记录图像。

图9显示的结果可见，脑组织空白对照组在荧光显微镜下可发出较弱的自发荧光。FITC-C34组与空白脑组织荧光强度相当。而药物FITC-TL₆A组、FITC-Ang阳性对照较FITC-C34组及脑组织空白对照组的荧光强度明显增强。说明FITC-TL₆A具有较强的穿透血脑屏障的能力，提示经过与angiopep-2的重组表达后，候选药物具有明显的脑靶向趋势。本实施例初步证明了候选药物TL₆A可以通过angiopep-2机制透过BBB到达中枢神经系统发挥药效。

需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 大理大学

<120> 一种脑靶向HIV进入抑制剂多肽及其应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr

1 5 10 15

Glu Glu Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Trp

20 25 30

Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala

35 40 45

Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu

50 55 60

Arg Glu Leu

65

<210> 2

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1 5 10 15

Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu

20 25 30

Ala Ala Leu Arg Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40 45

Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr

50 55 60

Glu Glu Tyr

65

<210> 3

<211> 63

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr

1 5 10 15

Glu Glu Tyr Ser Gly Gly Arg Gly Gly Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp

20 25 30

Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala

35 40 45

Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu

50 55 60

<210> 4

<211> 63

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg

1 5 10 15

Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu

20 25 30

Ala Ala Leu Arg Glu Leu Ser Gly Gly Arg Gly Gly Thr Phe Phe Tyr

35 40 45

Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr Glu Glu Tyr

50 55 60

<210> 5

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgacctttt tttatggcgg ctgccgcggc aaacgcaaca actttaaaac cgaagaatat 60

agcggcggcc gcggcggcac gacctgggaa gcatgggaca gagctattgc tgaatacgca 120

gctaggatag aagctttact cagagcttta caagaacagc aagaaaagaa tgaagcagcc 180

ttaagggaat ta 192

<210> 6

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgacgacct gggaagcatg ggacagagct attgctgaat acgcagctag gatagaagct 60

ttactcagag ctttacaaga acagcaagaa aagaatgaag cagccttaag ggaattaagc 120

ggcggccgcg gcggcacctt tttttatggc ggctgccgcg gcaaacgcaa caactttaaa 180

accgaagaat at 192

<210> 7

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgacctttt tttatggcgg cagccgcggc aaacgcaaca actttaaaac cgaagaatat 60

ggaggaggag gaagtggcgg cggcggctcg acgacctggg aagcatggga cagagctatt 120

gctgaatacg cagctaggat agaagcttta ctcagagctt tacaagaaca gcaagaaaag 180

aatgaagcag ccttaaggga atta 204

<210> 8

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgacgacct gggaagcatg ggacagagct attgctgaat acgcagctag gatagaagct 60

ttactcagag ctttacaaga acagcaagaa aagaatgaag cagccttaag ggaattagga 120

ggaggaggaa gtggcggcgg cggctcgacc tttttttatg gcggcagccg cggcaaacgc 180

aacaacttta aaaccgaaga atat 204

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctcggatcca gtacccttca cctag 25

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cattacaatt tctgggtccc ctcctgagga ttgattaaag a 41

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atcctcagga ggggacccag aaattgtaat gcacagtttt aattgt 46

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agactcgagc ggccgccact g 21

Claims (8)

1.一种脑靶向HIV进入抑制剂多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的多肽的在制备具有脑部靶向穿透血脑屏障的HIV脑感染抑制剂的应用。

3.一种编码权利要求1所述的脑靶向HIV进入抑制剂多肽的核酸，其特征在于，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示多肽的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8所示 。

4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，将所述SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8的苷酸序列经密码子优化后获得能够分别表达SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2的优化核苷酸序列。

5.一种包含权利要求3或4所述的核酸的表达载体。

6.一种包含权利要求5所述的表达载体的重组细胞。

7.一种HIV抑制药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1中的任一多肽、权利要求4中的任一核苷酸序列、权利要求5中的表达载体、权利要求6中的重组细胞中的一种或者几种的组合。

8.根据权利要求7所述的药物在制备脑靶向HIV进入抑制剂的用途。

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