KR101466875B1 - 항종양괴사인자 수용체 2를 발현하도록 설계된 미니서클 벡터를 이용한 자가면역질환 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TNFR2를 발현하는 미니서클 벡터를 포함하는 자가 면역 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

항종양괴사인자 수용체 2를 발현하도록 설계된 미니서클 벡터를 이용한 자가면역질환 치료 {The therapy for autoimmune disease using minicircle vector designed to express TNFR2}

본 발명은 TNFR2를 발현하는 미니서클 벡터를 포함하는 자가 면역 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

면역이란 체내에 존재하는 외부 항원 물질을 인식 및 제거하여 외부 물질로부터 신체를 보호하는 작용을 말한다. 자가 면역 질환(autoimmune disease)이란 면역계가 개체 자신의 신체의 일부에 민감하게 되어 자기와 비-자기를 구분하는 능력에 결함이 생기면서 스스로 신체를 파괴하는 질환으로, 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 루푸스, 건선, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 다발성 근육염, 피부근염, 크론병, 자가면역혈구감소증, 맥관염 증후군, 및 전신 홍반성 낭창 등을 들 수 있다.

특히, 자가 면역 질환의 하나인 류마티스성 관절염은 전 세계 인구의 약 1%에 해당하는 2,100만 명이라는 높은 유병율에도 불구하고 아직까지 발병원인이 알려지지 않은 염증성 자가 면역성 질환이다. 이 질환은 주변 관절의 구조적 기형을 일으키며 연골 파괴 및 골 침식을 야기하는 지속적인 염증성 활막염을 나타내며, 관절의 염증 및 고통뿐만, 관절과 그 주위의 조직, 더불어 여러 장기에까지 침투하여 골다공증, 폐, 피부, 눈으로까지 침범되는 전신장기침범과 고통을 동반하여 환자에게 엄청난 삶의 질 저하를 가져오고 정상인과 같은 생활을 불가능하게 한다.

전 세계계적으로 자가 면역 질환이 증가하고 있으나, 이러한 질환들의 발생에 대한 근본적인 원인 규명이 충분히 이루어지지 않은 상태이다. 현재 자가 면역 질환의 치료는 자가 면역 반응을 조절하고 신체의 손상된 면역기능을 회복시키는 것을 목적으로 이루어지며, 대표적으로는 면역 반응을 억제하기 위한 면역억제제를 사용한다. 현재 사용되는 면역억제제로는 코르티코스테로이드 약물인 프레드니손과 비스테로이드성 약물인 시클로포스파미드, 아자티오프린, 및 타크로리무스 등이 있다. 근래에 들어서는 각종 자가 면역 질환을 치료하기 위한 항 TNF 길항제들의 개발이 이루어지고 있다.

종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)는 다면발현 사이토카인으로, 염증성 반응 및 면역 체계에서 중요한 역할을 담당하며, 골파괴 과정에서 중요한 역할을 한다고 보고되었다. 따라서, TNF 의 작용을 억제하기 위한 자가 면역 질환 치료제로서, TNF 신호 전달을 억제 하기 위해 TNF 리간드에 대한 단클론 항체 및 재조합 단백질이 개발되어 왔다. 인플릭시맙(infliximab), 에타너셉트(etanercept), 및 아달리무맙(adalimumab)은 대표적인 자가 면역 관절염 치료제로서 근 10년간 임상에서 높은 효능을 보이며 치료제로 사용되어 왔다.

그러나, 이러한 항 TNF 치료제들은 높은 효능에도 불구하고 극복되어야 할 많은 문제들이 있다. 예를 들어, 치료의 부작용으로 TNF의 기작이 정지됨에 따라 면역체계에서 기능 이상으로 진균 혹은 세균의 감염의 위험이 높아지며, 특히 잠복중인 폐결핵의 재발의 위험을 높인다. 류마티스 학회에 따르면, 항 TNF 치료제들을 투여받은 류마티스성 관절염 환자들의 경우, 기존의 치료제들을 받은 경우에 비해서 피부암이 발병될 가능성이 높다는 보고가 있다.

이에, 본 발명에서는 기존 항 TNF 치료제가 가지고 있는 안전성과 효능성의 단점을 극복할 수 있는 자가 면역질환의 치료제로서, 새로운 개념의 유전자 치료제를 제시한다.

유전자 치료법은 질병과 관련이 있는 유전자를 환자의 체내에 주입하고 상기 유전자를 세포 내에서 발현시켜 질병을 치료하는 방법으로, 주입된 유전자가 성공적으로 목적 세포의 핵에 전달되어 이로부터 유전자가 다량으로 발현되게 하는 것이 중요하다.

이를 위한 유전자 전달 기술은 크게 바이러스를 전달체로 사용하는 방법, 합성 인지질이나 합성 양이온성 고분자 등을 사용하는 비바이러스성 방법, 및 세포막에 일시적인 전기자극을 가하여 유전자를 도입하는 전기 투과법 등의 물리적 방법으로 구분할 수 있다. 여기에서, 바이러스 전달체를 사용하는 방법은 뛰어난 전달 효율과 장기적이고 안정적인 유전자 발현 등의 장점이 있지만, 투여된 유전자가 인간 염색체 내 유전자의 구조를 영구적으로 변화시킨다든지 재조합능을 갖추어 스스로 복제를 하거나 인간의 면역 방어 체계를 활성화시키는 등의 생물학적 안전성의 문제들로 인해 실제 임상에 적용하기에는 제약이 따른다. 비바이러스성 유전자 전달 방법은 생물학적 안전성을 높일 수 있으며 전달체의 화학적 조성과 구조를 자유롭게 변경할 수 있는 잇점이 있으나, 그 전달 효율과 발현의 시간적인 측면에서 바이러스 전달체를 사용하는 경우에 비해 아주 미흡하여 실제 임상에 사용하기는 어려운 문제가 있다.

따라서, 본 발명자들은 치료 유전자를 목적 세포에 효율적으로 전달하며 치료 유전자를 지속적이고 오랫동안 발현시킬 수 있고 생물학적 안전성이 높은 유전자 치료 벡터 시스템을 개발하였으며, 이를 토대로 기존의 항 TNF 치료제가 가지고 있는 안전성과 효능성의 단점을 극복할 수 있는 새로운 개념의 자가 면역 질환 유전자 치료제를 제공하게 되어, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 TNFR2를 발현하는 벡터를 포함하는 자가 면역 질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 TNFR2를 발현하는 벡터를 포함하는 자가 면역 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

바람직한 양태로서, 본 발명의 약학 조성물은

(a) 프로모터;

TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2) 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편을 코딩하는 유전자; 및

전사 터미네이터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고,

(b) 상기 유전자 발현 카세트의 외부에 위치한 부위 특이적 재조합 영역을 포함하며, 및

(c) 복제 개시점 및 선별마커 유전자는 포함하지 않는

비바이러스성 벡터를 포함하는 자가 면역 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)는 다면발현 사이토카인으로, 특히 TNF-α는 염증성 반응 및 면역 체계에서 중요한 역할을 담당한다. TNF 에 결합하는 수용체로서 TNFR1(분자량, 55 kD; TNF-R55) 및 TNFR2(분자량, 75 kD; TNF-R75)가 알려져 있으며, 이 때 TNFR2에 대한 TNF-α의 친화도는 TNFR1에 대한 친화도보다 몇 배 더 높다고 알려져 있다 (Dri P. et al., J Immunol 162:460-466, 1999; Tartaglia LA. et al., J. Biol. Chem. 268: 18542-18548, 1993).

본 발명에서 TNFR2 단백질 또는 이의 세포외 영역 단편은 TNF-α에 대하여 높은 결합 친화도를 가지며 TNF-α의 작용을 억제함으로써 자가 면역 질환의 치료에 특히 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

바람직하게, 본 발명에서 TNFR2 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N말단으로부터 23번 내지 179번을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에서 TNFR2 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 N-말단 또는 C-말단에 면역글로불린의 Fc 영역을 추가로 포함할 수 있다. Fc 영역은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 CH2와 CH3 불변 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 TNFR2를 유전자 형태로 체내 질환 부위에 전달하고 해당 부위에 발현시킴으로써, 기존의 단백질 치료제가 가지는 생체 내 분해에 따른 반감기의 감소 및 생리활성의 감소와 같은 문제를 해결하고 지속적이고 안정적으로 치료 효과를 공급할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 유전자 치료법에 기존에 사용되던 바이러스성 벡터 시스템이 가지는 면역원성 등의 생물학적 안정성의 문제, 그리고 비바이러스성 벡터 시스템이 가지는 전달 효율의 문제를 모두 해결하기 위하여, 치료 유전자를 목적 세포에 효율적으로 전달하며 치료 유전자를 지속적이고 오랫동안 발현시킬 수 있고 생물학적 안전성이 높은 유전자 치료 벡터 시스템을 적용하였다.

구체적으로, 본 발명의 벡터 시스템은, 프로모터, 치료 유전자 및 전사 터미네이터와 같은 최소한의 필수요소만으로 구성된 유전자 발현 카세트를 포함하며, 기존의 벡터 시스템에 사용되던 복제 개시점 및 항생제 내성 유전자와 같은 선별마커 유전자는 포함하지 않음을 특징으로 한다.

복제 개시점은 주로 박테리아 유래의 서열로서 인체 내에서 불필요한 면역 반응을 일으킬 수 있으며, 항생제 내성 유전자와 같은 선별마커 유전자는 체내 존재하는 세균들에까지 전달될 수 있어 다른 질환으로 인해 동일 군의 치료 항생제를 투여하는 경우 불필요한 항생제 내성을 일으킬 수 있는 문제가 있다. 이에, 본 발명에서는 복제 개시점 및 선별마커 유전자를 포함하지 않음으로써, 불필요한 면역 반응 및 항생제 내성의 문제를 제거할 수 있다. 또한, 원핵세포에서 유래된 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 제거하여 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 아울러, 이로 인해 본 발명의 벡터는 기존의 벡터에 비해 물리적 크기가 작아 제작이 용이하고 전달 효율을 높이고 생물학적 안정성을 개선시킬 수 있다.

본 발명의 벡터는 원형의 수퍼코일 형태의 이중가닥 DNA 임을 특징으로 한다.

본 발명의 벡터에 사용되는 프로모터는 특별한 제한이 없이 당업계에 사용되는 프로모터를 사용할 수 있으며, 유도성 또는 구성적 프로모터를 포함하고, 바람직하게는 CMV(cytomegalovirus) 프로모터일 수 있다.

본 발명의 벡터에 사용되는 전사 터미네이터는 특별한 제한이 없이 당업계에 사용되는 터미네이터를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 치료 유전자로서 TNFR2를 코딩하는 유전자, 및 전사 터미네이터로 구성된 유전자 발현 카세트의 외부에, 부위 특이적 재조합 영역(site specific recombination)을 추가로 포함한다.

부위 특이적 재조합 영역은 DNA 상의 특정한 두 염기서열 간에 재조합이 일어날 수 있는 영역을 말하며, 이러한 부위 특이적 재조합 영역을 이용한 유전자 클로닝 방법은 제한 효소(restriction enzyme) 및 연결 효소(ligase)를 이용하는 기존 방법을 대체할 수 있는 유전자 조작 방법으로 유용하다. 바람직하게, 본 발명에서 부위 특이적 재조합 영역은 부위 특이적 재조합 영역은 대장균 또는 박테리오파아지 람다 유래의 att 부착 서열로서, attB 또는 attP 의 기질 서열, 또는 attR 또는 attL 의 하이브리드 서열일 수 있으며, 이 경우 재조합 효소의 존재 하에 attB + attP <--> attL + attR 반응에 의한 유전자 클로닝에 유용하다.

본 발명에서, 용어 "치료 및/또는 예방" 이란 TNFR2를 발현하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이용함으로써 자가 면역 질환과 관련된 임상적 상황을 억제하거나 완화하거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 바람직하게 본 발명의 TNFR2를 발현하는 벡터를 포함하는 조성물은 자가 면역 질환을 일으키는 TNF-α의 작용을 억제할 수 있다.

본 발명에서 자가 면역 질환은 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 루푸스, 건선, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 다발성 근육염, 피부근염, 크론병, 자가면역혈구감소증, 맥관염 증후군, 전신 홍반성 낭창 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 보다 바람직하게는, 류마티스성 관절염이다.

본 발명의 TNFR2를 발현하는 벡터를 포함하는 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하여 제제화될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 또는 정제로 제제화 할 수 있다.

또한 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용 약, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 TNFR2를 발현하는 벡터를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 자가 면역 질환 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 벡터는 공지된 다수의 방법, 예를 들어 일렉트로포레이션, DEAE 덱스트란(Dextran), 일가양이온성 리포좀 융합, 다가양이온성 리포좀 융합, 원형질 융합 및 네이키드 (naked) DNA 전달 등에 의해 세포 또는 조직에 도입될 수 있다. 네이키드 DNA를 세포 또는 조직에 전달하는 경우, 치료 유전자가 함유된 본 발명의 벡터가 환자의 혈액과 등장인 멸균 수용액과 배합될 수 있다.

본 발명의 치료방법은 TNFR2를 발현하는 벡터를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 바람직하게 상기 약학적 조성물의 투여량은 kg당 약 0.1 mg 내지 약 200 mg의 범위에서 사용될 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 TNF-α에 대해 길항 작용을 할 수 있는 TNFR2 또는 이의 세포외 영역 단편을, 유전자 형태로 목적 세포에 효율적으로 전달하며 치료 유전자를 지속적이고 오랫동안 발현시킬 수 있고 생물학적 안전성이 높은 유전자 치료 벡터 시스템에 적용함으로써, 자가 면역 질환의 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용한 미니서클 벡터의 제조과정을 나타내는 모식도이다.
도 2의 (A) 는 모플라스미드에 대하여 제한효소로 절단(enzyme cut) 후 전기영동으로 확인한 결과이고, (B) 는 증폭 및 클로닝이 가능하도록 모플라스미드를 E.coli 숙주에 도입하여 새로운 세포주를 제작한 후 제한효소로 절단하여 전기영동으로 확인한 결과이고, (C) 는 아라비노스를 이용하여 미니서클 벡터를 제조하였음을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 미니서클 벡터가 GFP 를 발현하도록 구성한 후 293T 세포주에 도입하여 GFP 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 미니서클 벡터가 GFP 를 발현하도록 구성한 후 쥐에 투여하여 in vivo 에서 GFP 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5의 (A)는 모플라스미드에 TNFR2(Fc 와 결합된 형태, TNFR-Fc 로 명명)를 발현하는 DNA 를 삽입한 후 그 발현을 확인한 것이고, (B) 는 모플라스미드에 TNFR2-Fc를 발현하는 DNA 를 삽입한 다음 아라비노스로 미니서클 벡터로 변환시킨 후 그 발현을 확인한 것이고, (C) 는 상기 미니서클 벡터가 TNFR2-Fc를 발현한다는 것을 제한효소 절단을 통하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 미니서클 벡터가 TNFR2를 발현한다는 것을 293T 세포주에서 GFP 발현을 통해 확인한 결과를 나타낸다. 각 그림에서 LD 는 저용량(low dose)의 TNFR2 단백질을, HD 는 고용량(high dose)의 TNFR2 단백질을 나타낸다.
도 7의 (A)는 미니서클 벡터가 TNFR2를 발현한다는 것을 293T 세포주에서 GFP 발현을 통해 다시 한 번 확인한 결과를 나타낸다. (B)는 상기 세포의 배양 상층액 내에 존재하는 수용성 TNFR2 의 농도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 쥐에 수용성 TNFR2을 발현하는 미니서클 벡터를 꼬리 정맥 주입했을 때, 쥐의 혈청 내에 존재하는 수용성 TNFR2 의 농도를 확인한 결과를 나타낸다. WT 는 정상 쥐의 혈청에서 수용성 TNFR2 의 농도를 확인한 결과이고, CIA (collagen-induced arthritis) 는 콜라겐 유발성 관절염 쥐의 혈청에서 수용성 TNFR2 의 농도를 확인한 결과이다.
도 9는 콜라겐 유발성 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 쥐의 꼬리 정맥에 수용성 TNFR2 를 발현하는 미니서클 벡터를 주입하는 모식도 및 주입 스케줄을 나타낸다.
도 10은 정상 쥐 (normal), 콜라겐 유발성 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 쥐, 및 상기 CIA 쥐에 수용성 TNFR2 을 발현하는 미니서클 벡터를 주입한 군에서 각각 발의 붓기 점수를 나타낸다.
도 11은 위의 각 쥐의 류마티스 관절염 발병율을 나타낸다.
도 12는 위의 각 쥐의 뒷발 관절의 조직 염색 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 미니서클 벡터의 제조

1-1. DNA 의 증폭

Competent cell(DH5a) 100㎕를 4℃에서 5분 동안 녹인 후, 증폭시킬 DNA sample(GFP 또는 TNFR2-Fc) 1㎍을 100㎕의 competent cell에 섞고, 4℃에서 20분 동안 인큐베이션 한 후, 42℃에서 45초 동안 열충격을 주어 DNA를 도입하였다. 그 후 2분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 그 후 이에 LB (lysogeny broth) 액상 배지 500㎕를 넣어주고, 37℃에서 1시간 동안 180rpm으로 교반하며 인큐베이션하였다. 5000rpm에서 30초 동안 원심분리 한 후, 상층액 500㎕을 제거하였다. 남은 세포를 카나마이신이 들어있는 LB 플레이트에 도말한 후, 37℃ 인큐베이터에서 하루 동안 인큐베이션하였다. 카나마이신이 포함된 5㎖ LB 배지에 지난 밤 도말한 LB 플레이트로부터 콜로니 하나를 picking 하여 넣고, 7~8 시간 동안 180rpm에서 교반하며 인큐베이션하였다. 카나마이신이 포함된 200㎖ LB 배지에 앞서 인큐베이션 한 5㎖ LB 배지 중 1㎖ 넣은 후, 15시간 정도 180rpm 으로 교반하며 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝난 후에 4℃ 9000rpm에서 15분 간 원심분리 하고, 상층액을 전부 버렸다. MN(Macherey-nagel)의 Nucleobond Xtra Midi kit (Cat #REF 740410.50)를 이용해서　DNA를 추출하였다.

1-2. 모플라스미드(parental plasmid)를 ZYCY10P3S2T E. coli 에 형질전환

Competent cell(ZYCY10P3S2T) 100㎕을 4℃에서 녹이고, DNA 1㎍을 competent cell과 섞은 후, 4℃에서 30분 인큐베이션하였다. 42℃ 30초 동안 열충격을 가한 후, ice에 2분 동안 저온 충격을 주었다. 저온 충격이 끝나면, S.O.C. medium을 0.5㎖ 섞은 후, 37℃에서 225rpm으로 교반하면서 인큐베이션을 1시간 동안 수행하였다. 그 후, 100㎕을 따서 카나마이신 들어있는 LB 배지 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 밤새 배양하였다.

1-3. 미니서클 벡터( minicircle DNA )의 제작

카나마이신이 들어 있는 LB 배지 5㎖에　ZYCY10P3S2T Competent cell에 DNA를　도입한 플레이트에서 콜로니를 picking하여 넣었다. 세포가 들어간 LB 배지를 37℃에서 200rpm으로 8시간 동안 인큐베이션하였다. 카나마이신을 넣은 200㎖ TB(terrific broth) 배지에 인큐베이션이 끝난 LB 배지를 100㎕ 넣은 후, TB buffer를 37℃ 200rpm에서 밤새 인큐베이션하였다 (15시간). 다음 날, O.D.600에서 흡광도를 재고, 그 값이 4와 5 사이일 때, 200㎖ LB 배지에 8㎖ 1N NaOH와 200㎕ 20% L-아라비노스를 넣어서 미니서클 유도용 혼합물(minicircle induction mix)를 만든 후 이를 인큐베이션이 끝난 TB 배지에 섞어주었다. 30℃에서 200rpm으로 5시간 동안 교반하며 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝난 후에 4℃에서 9000rpm으로 15분 간 원심분리 하고, 펠렛을 제외한 나머지 상층액을 전부 버렸다. Nucleobond Xtra Midi kit (Macherey-nagel, Cat #REF 740410.50.)를 이용해서 DNA를 추출하였다.

1-4. 제한효소를 이용한 미니서클 DNA 의 생성 확인

미니서클 DNA가 제대로 생성되었는지 확인하기 위해서 제한효소인 BamHI, XbaI(enzynomics)로 제한효소 반응을 시켰다. 제작한 미니서클 DNA와 제한효소 buffer Ⅱ, BSA, 3차 증류수를 적정량으로 섞고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝난 샘플은 제한효소 처리를 하지 않은 DNA 샘플과 함께 0.8% 아가로스 젤에 전기영동하였다.

도 2의 (A) 는 모플라스미드에 대하여 제한효소로 절단(enzyme cut) 후 전기영동으로 확인한 결과이고, (B) 는 증폭 및 클로닝이 가능하도록 모플라스미드를 E.coli 숙주에 도입하여 새로운 세포주를 제작한 후 제한효소로 절단하여 전기영동으로 확인한 결과이고, (C) 는 아라비노스를 이용하여 미니서클 벡터를 제조하였음을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸다.

실시예 2. 미니서클 벡터를 통한 GFP 단백질 발현의 확인

2-1. 세포주에서 확인 ( in vitro )

실시예 1에서 생성된 미니서클 DNA가 단백질 합성을 제대로 유도하는지 확인 하기 위해, GFP 가 삽입된 미니서클 DNA 를 293T 세포에 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 하루 전날, 96웰 플레이트에 3 X 10⁴ 의 293T 세포를 7.5% FBS 는 포함하되 항생제는 포함되지 않은 DMEM 배지 100㎕와 함께 플레이팅하였다. 미니서클 DNA 0.2㎍을 opti-MEM1 25㎕와 섞고, 리포펙타민2000(invitrogen) 0.5㎕와 opti-MEM 25㎕를 각기 섞은 후 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 미니서클 DNA와 리포펙타민 2000이 들은 액체를 함께 섞은 후, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이 후, 293T cell에 이 혼합물을 뿌려주고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고 생장 배지로 바꿔주었다. 이 후 24시간 후에 발현을 확인하였다.

도 3은 미니서클 벡터가 GFP 를 발현하도록 구성한 후 293T 세포주에 도입하여 GFP 가 발현함을 확인한 결과를 나타낸다.

2-2. 쥐에서 확인 ( in vivo )

실시예 1에서 생성된 미니서클 DNA가 체내에서도 단백질을 발현하는지 확인하기 위하여, 쥐에 미니서클 DNA 를 도입하였다. DBA1/J(오리엔트바이오)로 6~7주령의 암컷 쥐를 사용하였으며, GFP 가 삽입된 미니서클 DNA 7~14㎍를 쥐의 몸무게의 10%에 해당하는 1.5~1.8ml의 식염수에 섞고, 이를 꼬리에 정맥주사하였다.

도 4는 미니서클 벡터가 GFP 를 발현하도록 구성한 후 쥐에 투여하여 in vivo 에서 GFP 가 발현함을 확인한 결과를 나타낸다.

실시예 3. 미니서클 벡터를 통한 TNFR2 의 발현 확인

3-1. 제한효소를 이용한 미니서클 DNA 의 생성 확인

실시예 <1-1> 내지 <1-4>의 방법에 따라 TNFR2를 발현하는 DNA 가 삽입된 미니서클 벡터를 제조한 후 제한효소를 이용하여 미니서클 DNA 이 생성되었음을 확인하였다.

도 5의 (A)는 모플라스미드에 TNFR2(Fc 와 결합된 형태, TNFR-Fc 로 명명)를 발현하는 DNA 를 삽입한 후 그 발현을 확인한 것이고, (B) 는 모플라스미드에 TNFR2-Fc를 발현하는 DNA 를 삽입한 다음 아라비노스로 미니서클 벡터로 변환시킨 후 그 발현을 확인한 것이고, (C) 는 상기 미니서클 벡터가 TNFR2-Fc를 발현한다는 것을 제한효소 절단을 통하여 확인한 결과를 나타낸다.

3-2. 세포주에서 확인 ( in vitro )

실시예 1에서 생성된 미니서클 DNA가 TNFR2를 발현한다는 것을 확인하기 위하여, GFP 및 TNFR2를 발현하는 DNA 가 삽입된 미니서클 DNA 를 293T 세포에 트랜스펙션하고 실시예 <3-1> 의 방법에 따라 그 발현을 확인하였다.

도 6은 미니서클 벡터가 TNFR2를 발현한다는 것을 293T 세포주에서 GFP 발현을 통해 확인한 결과를 나타낸다. 각 그림에서 LD 는 저용량(low dose)의 TNFR2 단백질을, HD 는 고용량(high dose)의 TNFR2 단백질을 나타낸다.

3-3. ELISA 로 발현 확인

TNFR2의 발현 여부를 확인하기 위하여, 293T 세포에 각각의 미니서클 DNA를 트랜스펙션하고 그로부터 배양 상층액을 얻어, 수용성 TNFR2 (soluble TNFR2, sTNFR2) 에 대한 ELISA를 시행하였고, 이는 kit(Ready-to-use sandwich ELISA, eBioscience)의 프로토콜에 따랐다. 간단히 말하면, 이미 sTNFR2 에 대한 항체가 코팅되어 있는 플레이트에 혈청 샘플과, standard curve를 위한 샘플을 각 well에 첨가하고, 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 그 후 세척 과정을 네 번 수행 후, TMB 기질 용액을 100㎕ 처리하고 10분간 실온에서 인큐베이션하였다. 세척을 5회 수행한 후, 검출 항체인 항-hIgG-HRP를 1:10,000의 비율로 희석하여 첨가하고 실온에서 인큐베이션하였다. 세척을 7회 수행한 후, TMB 기질 용액을 첨가하고 실온에서 15분간 인큐베이션하였다. 그 후, 100㎕의 반응정지 용액을 첨가하고 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 7의 (A)는 미니서클 벡터가 TNFR2를 발현한다는 것을 293T 세포주에서 GFP 발현을 통해 다시 한 번 확인한 결과를 나타내고, (B)는 상기 세포의 배양 상층액 내에 존재하는 수용성 TNFR2 의 농도를 확인한 결과를 나타낸다.

3-4. 쥐에서 확인 ( in vivo )

미니서클 DNA가 체내에서도 TNFR2 단백질을 발현하는지 확인하기 위하여, 쥐에 미니서클 DNA 를 도입하였다. DBA1/J(오리엔트바이오)로 6~7주령의 암컷 쥐를 사용하였으며, Hydrodynamic 전달 방식으로 수용성 TNFR2 를 발현하는 미니서클 DNA 7~14㎍를 쥐의 꼬리 정맥 주사를 통해 주입하였다.

쥐의 혈청을 채취하여, 실시예 <3-3>과 같은 방식으로 그 혈청 내에 존재하는 수용성 TNFR2 단백질의 농도를 측정하였다. 도 8은 쥐의 혈청 내에 존재하는 수용성 TNFR2 의 농도를 확인한 결과를 나타낸다.

실험예 1. 류마티스 관절염 동물 모델에서 TNFR2 을 발현하는 미니서클 벡터의 치료 효과

1-1. 발의 부종 정도 확인

7주령의 DBA1/J 쥐에게 Mouse monoclonal anti-type II collagen 5 clone antibody cocktail kit(chondrex 53010)을 매뉴얼대로 사용하여, 류마티스 관절염 동물 모델을 구축하였다. 6mg의 5-clone cocktail 을 복강 내 투여하고, 이로부터 3일 후에 25-50㎍의 LPS를 복강 내 투여하여 질병 모델을 구축하였다. 위의 콜라겐 유발성 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 동물 모델에 수용성 TNFR2 를 발현하는 미니서클 벡터를 투여하여 실험을 진행하였다 (도 9).

각 동물에 대하여 발의 붓기 정도를 측정하여 도 10에 나타내었다. 쥐의 각 발관절의 붓기를 0~4점으로 점수로 환산하여 매긴 뒤 이를 합산하여 수치로 바꾸었으며, 점수가 높을수록 질병이 매우 심각함을 의미한다. 정상군 (normal)에 비해 질병군 (CIA)의 경우 류마티스 관절염이 유도되어 발의 붓기가 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 수용성 TNFR2 를 발현하는 발현하는 미니서클 벡터를 투여한 경우 37일 이후부터 매우 효과적으로 관절염의 진행을 막는 것을 것을 확인할 수 있으며, 이는 초기 관절염뿐만 아닐 chronic한 질환에서도 그 효과를 지속적으로 보이는 것을 의미한다.

1-2. 류마티스 관절염 발병율 확인

도 11은 발병율을 보여주는 그래프로, 상기 실험예 1-1의 각 실험군들 중 수용성 TNFR2 를 발현하는 미니서클 벡터를 투여한 군에서 발병율을 매우 유의적으로 막아내고 있음을 확인할 수 있다.

1-3. 조직 염색

상기 실험예 1-1의 실험이 마무리된 시점에서 쥐를 희생시켜서 뒷발의 뒷굼치 관절을 분리하여 조직 염색을 수행하였다. H&E 염색의 경우 Xylene Ⅰ과 xylene Ⅱ 에서 15분 탈파라핀(deparaffin)과정을 거쳐 100% 에탄올, 90% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올 (hydration 함수) 순으로 각각 5분씩 통과시켰다. 그리고 수돗물에서 5분간 세척하였다. Harris hematoxylin (Sigma-Aldrich HHS32)으로 10분간 염색한 후 수돗물로 충분히 세척한 뒤 1%HCl에 2-3회 Dipping하고, 0.2% ammonia water에서 2-3회 Dipping 하였다. 또한 Eosin(Sigma-Aldrich HT110132)으로 1분 30초간 염색 후 세척하였다. 70% 에탄올, 80% 에탄올, 90% 에탄올, 100% 에탄올 (dehydration 탈수) 순으로 통과시킨 후 Xylene에 담가 봉입(mounting)하였다. Safranin O 염색의 경우는 동일 과정을 수행하고 염색약만 다른 것을 이용하였다. 이 때에는 Weigert’s iron hematoxylin(Sigma-Aldrich HT1079-1SET)와 Fast green(FCF, Sigma-Aldrich F7252-5G)로 5분간 염색하였다. 1% 아세트산에 2-3회 Dipping하고 Safranin o(Sigma-Aldrich S2255-25G) 5분간 염색한 후 수돗물에서 세척하였다. 그 후 동일한 봉입과정을 수행하였다.

그 결과를 도 12에 나타내었다. 이를 살펴보면, 질병군(CIA)의 경우 땅콩모양의 tasal bone이 망가져 있으나, 수용성 TNFR2 를 발현하는 미니서클 벡터 투여시 회복되는 것을 확인 할 수 있다. 또한, 질병군(CIA)의 경우 관절에 존재하는 연골이 파괴되어서 염색되지 않았으나 수용성 TNFR2 를 발현하는 미니서클 벡터 투여시 다시 염색되어서 연골 파괴를 막은 것을 사프라닌과 톨루이딘 블루 염색에서 확인할 수 있다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> The therapy for autoimmune disease using minicircle vector designed to express TNFR2 <130> DPP20131630KR <150> KR10-2012-0050443 <151> 2012-05-11 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 230 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(230) <223> TNFR2 <400> 1 Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 1 5 10 15 Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys 20 25 30 Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr 35 40 45 Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 50 55 60 Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser 65 70 75 80 Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys 85 90 95 Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys 100 105 110 Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 115 120 125 Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro 130 135 140 Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His 145 150 155 160 Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala 165 170 175 Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val 180 185 190 His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr 195 200 205 Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly 210 215 220 Pro Ser Pro Pro Ala Glu 225 230 <210> 2 <211> 534 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(534) <223> TNFR2 fragment <400> 2 cccgcccagg tggcatttac accctacgcc ccggagcccg ggagcacatg ccggctcaga 60 gaatactatg accagacagc tcagatgtgc tgcagcaagt gctcgccggg ccaacatgca 120 aaagtcttct gtaccaagac ctcggacacc gtgtgtgact cctgtgagga cagcacatac 180 acccagctct ggaactgggt tcccgagtgc ttgagctgtg gctcccgctg tagctctgac 240 caggtggaaa ctcaagcctg cactcgggaa cagaaccgca tctgcacctg caggcccggc 300 tggtactgcg cgctgagcaa gcaggagggg tgccggctgt gcgcgccgct gcgcaagtgc 360 cgcccgggct tcggcgtggc cagaccagga actgaaacat cagacgtggt gtgcaagccc 420 tgtgccccgg ggacgttctc caacacgact tcatccacgg atatttgcag gccccaccag 480 atctgtaacg tggtggccat ccctgggaat gcaagcatgg atgcagtctg cacg 534

Claims (10)

1. (a) 프로모터;
   TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2) 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편을 코딩하는 유전자; 및
   전사 터미네이터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고,
   (b) 상기 유전자 발현 카세트의 외부에 위치한 부위 특이적 재조합 영역을 포함하며, 및
   (c) 복제 개시점 및 선별마커 유전자는 포함하지 않는 비바이러스성 벡터로서,
   상기 TNFR2 단백질 또는 TNFR2 의 세포외 영역을 포함하는 단편은, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 23번 내지 179번을 포함하는 폴리펩타이드이고,
   상기 부위 특이적 재조합 영역은 대장균 또는 박테리오파아지 람다 유래의 attB, attP, attR 또는 attL인,
   비바이러스성 벡터를 포함하는 류마티스성 관절염의 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 TNFR2 의 세포외 영역을 포함하는 단편을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 TNFR2 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 N-말단 또는 C-말단에 면역글로불린의 Fc 영역을 추가로 포함하는 것인 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 CMV(cytomegalovirus) 프로모터인 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 터미네이터는 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 것인 조성물.
   
8. 삭제
9. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 원형의 수퍼코일 형태의 이중가닥 DNA 인 조성물.
   
10. 삭제

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