JP2018528168A - 新血管生成抑制のための血管内皮成長因子受容体ターゲッティングペプチド−エラスチン融合ポリペプチド及び自己組立ナノ構造体 - Google Patents
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Abstract
Description
血管内皮成長因子(Vascular Endothelial Growth Factor:VEGF)受容体に特異的に結合するペプチド;及び前記ペプチドに連結される親水性であるエラスチン基盤ポリペプチド(親水性EBP)。
前記VEGF受容体に特異的に結合するペプチドは、VEGF受容体であるFlt1又はFlk−1/KDRに特異的に結合するペプチドであることができる。
[式1]
[配列番号1]n;又は
[式2]
[配列番号2]n、
前記式1又は式2で、
前記配列番号1は、[VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]で構成され;
前記配列番号2は、[VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]で構成され;
前記nは、1以上の整数であり、前記配列番号1又は配列番号2の繰り返し回数であり;また、
前記Xは、プロリン以外のアミノ酸であり、ペンタペプチドVPGXG又はVPAXGが繰り返されるとき、任意の天然アミノ酸又は人工アミノ酸から選択され、前記Xのうち少なくとも一つは、親水性アミノ酸である。
A(Ala)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなるか[配列番号20];
K(Lys)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなるか[配列番号22];
D(Asp)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなるか[配列番号24];又は
E(Glu)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなる[配列番号26];ものであるか、
又は
前記式2で、nは、1であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、
A(Ala)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなるか[配列番号21];
K(Lys)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなるか[配列番号23];
D(Asp)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなるか[配列番号25];又は
E(Glu)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなる[配列番号27]ものであることができる。
前記式2で、nは、3、6、12又は24であり、
前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、A(Ala)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなる、配列番号41、配列番号42、配列番号43又は配列番号44で表示されものであるか;又は
前記式2で、nは、12であり、
前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、E(Glu)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなる配列番号45で表示されるものであることができる。
前記親水性EBPに連結される疎水性エラスチン基盤ポリペプチド(疎水性EBP)をさらに含んで構成され得る。
血管内皮成長因子(Vascular Endothelial Growth Factor:VEGF)受容体に特異的に結合するペプチド;
前記ペプチドに連結される親水性であるエラスチン基盤ポリペプチド(親水性EBP);及び
前記親水性EBPに連結される疎水性エラスチン基盤ポリペプチド(疎水性EBP)。
[式1]
[配列番号1]n;又は
[式2]
[配列番号2]n、
前記式1又は式2で、
前記配列番号1は、[VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]で構成され;
前記配列番号2は、[VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]で構成され;
前記nは、1以上の整数であり、前記配列番号1又は配列番号2の繰り返し回数であり;また、
前記Xは、プロリン以外のアミノ酸であり、ペンタペプチドVPGXG又はVPAXGが繰り返されるとき、任意の天然アミノ酸又は人工アミノ酸から選択され、前記Xのうち少なくとも一つは、疎水性アミノ酸又は脂肪族アミノ酸である。
前記式1で、nは1であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、
G(Gly)、A(Ala)、F(Phe)が1:3:2の比率よりなる[配列番号28]ものであるか、又は
前記式2で、nは、1であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、
G(Gly)、A(Ala)、F(Phe)が1:3:2の比率よりなるか[配列番号29];
K(Lys)、A(Ala)、F(Phe)が1:3:2の比率よりなるか[配列番号30];
D(Asp)、A(Ala)、F(Phe)が1:3:2の比率よりなるか[配列番号31];
K(Lys)、F(Phe)が3:3の比率よりなるか[配列番号32];
D(Asp)、F(Phe)が3:3の比率よりなるか[配列番号33];
H(His)、A(Ala)、I(Ile)が3:2:1の比率よりなるか[配列番号34];
H(His)、G(Gly)が5:1の比率よりなるか[配列番号35];又は
G(Gly)、C(Cys)、F(Phe)が1:3:2の比率よりなる[配列番号36]ものであることができる。
前記式2で、nは、12であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、
G(Gly)、A(Ala)、F(Phe)が1:3:2の比率よりなるか[配列番号46]、又は
前記式2で、nは、24であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、
G(Gly)、A(Ala)、F(Phe)が1:3:2の比率よりなる[配列番号47]のであることができる。
抗−Flt1ペプチド;及び前記抗−Flt1ペプチドに連結される親水性EBP[ A1G4I1]3で構成され、[配列番号48]で表示;
抗−Flt1ペプチド;及び前記抗−Flt1ペプチドに連結される親水性EBP[ A1G4I1]6で構成され、[配列番号49]で表示;
抗−Flt1ペプチド;及び前記抗−Flt1ペプチドに連結される親水性EBP[ A1G4I1]12で構成され、[配列番号50]で表示;又は
抗−Flt1ペプチド;及び前記抗−Flt1ペプチドに連結される親水性EBP[A1G4I1]24で構成され、[配列番号51]で表示。
抗−Flt1ペプチド;親水性EBP[E1G4I1]12;及び疎水性EBP[G1A3F2]12で構成され、[配列番号52]で表示;又は
抗−Flt1ペプチド;親水性EBP[E1G4I1]12;及び疎水性EBP[G1A3F2]24で構成され、[配列番号53]で表示。
pET−21a(+)ベクター及びBL21(DE3)大腸菌細胞は、Novagen Inc.(米国、ウィスコンシン、メディソン)から得た。Top10収容細胞(competent cells)及びカルセイン−AM(Calcein−AM)は、Invitrogen(米国、カリフォルニア、カルズベド)から購買し、HUVECsは、アメリカンタイプカルチュアコレクション(American Type Culture Collection、ATCC)(米国、バージニア)から購買した。すべての注文製作されたオリゴヌクレオチドドルは、Cosmo Gene Tech(韓国、ソウル)で合成され、組み換えヒトVEGF−165(rhVEGF165)は、Sino Biological Inc.(中国、北京)から得た。子牛腸アルカリホスファターゼ(Calf intestinal alkaline phosphatase、CIP)、BamHI及びXbaIは、Fermentas(カナダ、オンタリオ)から得た。AcuI及びBseRIは、New England Biolabs(米国、マサチューセッツ、イプスイッチ)から購買した。T4DNA連結酵素(T4 DNA ligase)は、Elpis Bio−tech(韓国、帯電)から得た。DNA分離キット(DNA miniprep)、ゲル抽出(gel extraction)、及びPCR精製キットは、Geneall Biotechnology(韓国、ソウル)から得た。「Dyne Agarose High」は、DYNE BIO、Inc.(韓国、城南)から得た。Top10細胞は、MO BIO Laboratories、Inc.(米国、カリフォルニア、カルズベド)から得た「TB DRY」培養培地で生育した。BL21(DE3)細胞は、MP Biomedicals(米国、オハイオ、ソロン)から得た「Circle Grow」培養培地で生育した。「Ready Gels、Tris−HCl 2〜20% precast gels」は、Bio−Rad(米国、カリフォルニア、エルクルレス)から購入した。リン酸緩衝食塩水(Phosphate buffered saline、PBS、pH7.4)、カナマイシン、ポリエチレンアミン(polyethyleneamine、PEI)、FITC−デキストラン(FITC−dextran)、ホルマリン及び牛血清アルブミン(bovine serum albumin、BSA)は、Sigma−Aldrich(米国、ミズーリ、セントルイス)から得た。マトリゲル(matrigel)は、BD Biosciences(米国、カリフォルニア、サンディエゴ)から購買した。ベバシズマブ(Bevacizumab)とも呼ばれるアバスチン(Avastin)は、Roche Pharma Ltd.(スイス、ライナク)から購買した。ケタミン(Ketamine)は、Huons(韓国、城南)から得た。キシラジン(Xylazine)は、BAYER(ドイツ、レボクゼン)から購買した。トロピカミド(Tropicamide)は、Santen pharmaceutical co. Ltd(日本国、大阪、北区)から購買した。立体顕微鏡は、Leica(ドイツ、ベツルラオ)から得た。組み換えヒトVEGF165タンパク質及び組み換えヒトVEGF R1/Flt−1 Fcは、R&D System(米国、ミネソタ、ミネアポリス)から購買した。ウサギ抗−ヒトIgG Fc−HRPキメラタンパク質及び3、3’、5、5’−テトラメチルベンジジン(tetramethylbenzidine、TMB)は、ThermoFisher(米国、マサチューセッツ)から得た。
ペンタペプチド繰り返し単位であるVal−Pro−(Gly又はAla)−Xaa−Gly[VP(G又はA)XG]を有する互いに異なるEBPは、次のように命名する。前記Xaaは、Proを除いた任意のアミノ酸であることができる。第一に、可塑性を有するVal−Pro−Ala−Xaa−Gly(VPAXG)のペンタペプチド繰り返しは、可塑性を有するエラスチン系ポリペプチド(elastin−based polypeptide with plasticity:EBPP)と定義する。一方、Val−Pro−Gly−Xaa−Gly(VPGXG)のペンタペプチド繰り返しは、弾性を有するエラスチン系ポリペプチド(the elastin−based polypeptide with elasticity:EBPE)と称する。第二に、[XiYjZk]nで、括弧内の大文字は、ゲスト残基の単文字アミノ酸コード、すなわち、EBPペンタペプチドの4番目位置(Xaa又はX)においてのアミノ酸であり、これらの該当する下付き文字は、繰り返し単位としてEBPモノマー遺伝子のゲスト残基の比率(ratio)を示す。[XiYjZk]nの下付き文字の数nは、本発明の配列番号1[VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]又は配列番号2[VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]のEBPの繰り返し回数の総数を示す。例えば、EBPP[G1A3F2]12は、配列番号2[VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]の単位が12回繰り返されてなるEBPPブロックであり、ここで 4番目ゲスト残基位置(Xaa)においてのGly、Ala、及びPheの比は、1:3:2である。最後に、EBP−EBPジブロックポリペプチドは、EBPP[E1G4I1]12−EBPP[G1A3F2]12のように、ブロック間のハイフンとともにブラケット括弧でそれぞれのブロックの構成によって命名される。
37℃で20分間FastDigest緩衝剤で50UのXbaI、50UのBamHI、10Uの感熱(thermosensitive)アルカリリン酸フォスファターゼとともに4μgのpET−21aベクターを消化(digestion)及び脱リン酸化した。制限されたプラスミドDNAをPCR精製キットを使用して精製した後、40μLの蒸留された脱イオン水で溶離した。XbaIとBamHI互換可能な接着末端を有する二つのオリゴヌクレオチド、すなわち配列番号39(5’−ctagaaataattttgtttaactttaagaaggaggagtacatatgggctactgataatgatcttcag−3’)及び配列番号40(5’−gatcctgaagatcattatcagtagcccatatgtactcctccttcttaaagttaaacaaaattattt−3’)を設計した。2分間95℃でT4DNAリガーゼ緩衝剤で2μMオリゴヌクレオチド濃度の50μLを加熱することによって、二つのオリゴヌクレオチドをアーニリングした後、その溶液を3時間にわたって室温までゆっくり冷却した。30分間37℃で20pmolのアーニリングされたdsDNAと0.1pmolの線形化されたベクターを、1UのT4DNAリガーゼを有するT4DNAリガーゼ緩衝剤に培養することによって、pET−21aベクター内の多数の複製サイトへのDNAインサートの連結反応(ligation)を実施した。シームレス(seamless)遺伝子クローニングと発現のための変形されたpET−21a(mpET−21a)ベクターをTop10の収容細胞で形質転換し、引き続いて、これらを50μg/mlのアンピシリンが補充されたSOC(super optimal broth with catabolite repression)プレート上に塗布した。引き続いて、mpET−21aベクターのDNA配列を蛍光色素終了子DNAシーケンシング(Applied Biosystems Automatic DNA Sequencer ABI 3730)により検証した。
4番目残基が互いに異なるモル比で可変されるペンタペプチド繰り返し単位であるVal−Pro−(Gly又はAla)−Xaa−Glyを有するEBP配列をDNAレベルで設計し、生理的温度未満でTtを最適化した。17個のEBPライブラリに対して、多様なペンタペプチド繰り返し単位を有するEBPのDNAとアミノ酸配列が表1と表2にそれぞれ示されている。
VEGFR1拮抗剤として作用する抗−Flt1ペプチドを暗号化するオリゴヌクレオチドドルの一対は、Cosmo Genetech(韓国、ソウル)で化学的に合成され、AcuI及びBseRIを含む粘着末端(cohesive ends)を有するオリゴヌクレオチドカセット(cassette)に連結された。抗−Flt1ペプチドを暗号化するオリゴヌクレオチドカセットは、シームレス遺伝子クローニングのために、BseRI、XbaI、AcuI及びBamHIにより認識されるどんな部位も有しないように、合理的に設計され、これは、下記表3に示された通りである。
大腸菌株BL21(DE3)細胞は、EBPs、抗−Flt1−EBPP[A1G4I1]3n及び抗−Flt1−EBPジブロックブロックを含むそれぞれのベクターで形質転換され、その後、50μg/mLアンピシリンで補充されたCircleGrow培地50mLに接種された。前培養(preculture)は、37℃でひと晩200rpmで振とう培養器で行われた。次に、50mLのTBDRY培養培地は、50μg/mLのアンピシリンを含む500mLのCircleGrow培養培地に接種され、37℃で16時間200rpmで振とう培養器で培養された。光学濃度が600nm(OD600)で1.0に到逹したとき、EBP又はそのブロックポリペプチド遺伝子の過発現は、1mMの最終濃度でIPTGを添加することによって誘導された。前記細胞は、4℃で10分間4500rpmで遠心分離された。前記発現されたEBPs及びこれらのブロックポリペプチドは、既存に報告されたように、逆転移循環(inverse transition cycling、ITC)で精製された。細胞ペレット(pellet)は、30mLのPBS緩衝剤に再浮遊(resuspension)させた後、氷の上で超音波分解(VC−505、Sonic and materials Inc.(米国、デンベリ)機器を使用して20秒間隔で10秒間超音波を付加する条件)で細胞を溶解させた。細胞溶解物の不溶性残余物を沈澱させるために、50mL遠心分離機チューブに細胞溶解物を収容し、4℃で15分間13000rpmで遠心分離した。次に、可溶性EBPsを含む上層液は、新しい50mLの遠心分離機チューブに移され、核酸汚染物を沈澱させるために、PEIを0.5%w/vになるように入れた後、4℃で15分間13000rpmで遠心分離した。EBPsの逆位相転移は、4Mの最終濃度で塩化ナトリウムを添加することによって触発され、また、凝集された(aggregated)EBPsは、4℃で15分間13000rpmで遠心分離することによって、溶解物溶液から分離された。前記凝集されたEBPsは、冷たいPBS緩衝剤に再浮遊され、このEBP溶液は、4℃で15分間13000rpmで遠心分離され、他の凝集されたタンパク質汚染物が除去された。このような凝集(aggregation)及び再浮遊(resuspension)過程は、EBPの純度が約95%まで到逹するまで5〜10回繰り返され、ここで、純度は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−polyacrylamide gel electrophoresis、SDS−PAGE)により決定された。
EBPs、抗−Flt1−EBPP[A1G4I1]3n及び抗−Flt1−EBPジブロックブロックの純度は、SDS−PAGE、及びShodex GPC OHpak SB−804 HQ(Showa Denko Co.,日本国、東京)カラムを使用する高性能液体クロマトグラフィー(high−performance liquid chromatography、HPLC)1260シリーズ機構(Agilent Technologies、米国、カリフォルニア、ペルロエルト)とともに、ゲル透過クロマトグラフィー(gel permeating chromatography、GPC)で決定された。20℃の脱イオン水は、1ml/分の流速で溶離液として使用され、GPCカラムは、20℃で維持された。5900から200000g/molの範囲内にある低分散ポルランは、基準として使用された。EBPs、抗−Flt1−EBPP[A1G4I1]3n及び抗−Flt1−EBPジブロックブロックのシリーズは、屈折率検出器(refractive index detector、RID)及び280nmで可変型吸光度検出器(variable wavelength detector、VWD)で分析された。PBSに25μMの濃度である多様なEBPs、抗−Flt1−EBPP[A1G4I1]3n及び抗−Flt1−EBPジブロックコポリペプチドの逆位相転移に対する温度の効果は、Cary 100 Bio UV/Vis分光光度計(マルチセル熱電温度調節器(Varian instruments、米国、カリフォルニア、ワルノックリック)を備える)を利用して10から85℃の間で1℃/分の速度でOD350を測定することによって決定された。抗−Flt1−EBPP[E1G4I1]12−[G1A3F2]12及び抗−Flt1−EBPP[E1G4I1]12−[G1A3F2]24の可溶性単一体(soluble unimers)からミセルへの自己組立挙動は、温度−調節Nano ZS90(ZEN3690)動的光散乱(dynamic light scattering、DLS)機構(Malvern instruments、イギリス、ウストショ)により分析された。PBSで25μMでこれらの流体力学的半径(hydrodynamic radius、RH)は、1℃/分の加熱速度で18から50℃の温度範囲でそれぞれの温度で11連続で測定された。これらのTtは、それぞれのDLSプロット(plot)から計算された相転移に対する開始温度として定義される。
抗−Flt1−EBPジブロックブロックの濃度が増加するほど、一次−及び二次Ttが漸進的に低くなった。一般的に、抗−Flt1−EBPジブロックコポリペプチドの温度触発式相転移は、二度発生し、その理由は、低いTtを有する脂肪族−及び疎水性EBPP[A1G3F2]ブロック及び高いTtを有する極性−及び親水性EBPP[E1G4I1]ブロックのこれら二つの互いに異なる熱特性に起因する。25mMで抗−Flt1−EBPP[E1G4I1]12−[G1A3F2]12の相転移は、36.2及び81.2℃で発生し、一方、同一の濃度で抗−Flt1−EBPP[E1G4I1]12−[G1A3F2]24の相転移は、28.0及び78.0℃で発生したが、これは、二倍になった疎水性EBPP[A1G3F2]のブロック長さが大きい影響を及ぼし、一次−及び二次Ttを8.2及び3.2℃低くしたことを示す。特に、対照群(control)として抗−Flt1融合がないEBPP[E1G4I1]12−[G1A3F2]12及びEBPP[E1G4I1]12−[G1A3F2]24のジブロックポリペプチドは、図9(A)に示されたように、これ以上の位相転移なしにただ39.0及び29.1℃の一次Ttを示した。他方では、抗−Flt1−EBPジブロックコポリペプチドは、抗−Flt1がないジブロックポリペプチドの位相転移挙動と対照的に低くなった一次−及び二次Ttを明確に示したが、これは、ジブロックポリペプチドの親水性EBPP[E1G4I1]ブロックとともに、疎水性抗−Flt1ペプチド(Gly−Asn−Gln−Trp−Phe−Ile(GNQWFI))の融合は、EBPP[G1A3F2]の一次Tt及び親水性EBPP[E1G4I1]ブロックの二次Ttを大きく減少させるからであり、このような減少は、二つのブロックの隣接に起因する。さらに、抗−Flt1−EBPジブロックコポリペプチドにおいて正確に1:1及び1:2の比率で調節されたブロック長さを有するEBPP[A1G3F2]及びEBPP[E1G4I1]は、これらの一次Ttの直上に(right above)固有の準安定ミセル相(phase)を作り、これは、前記熱−触発式両親媒性抗−Flt1−EBPジブロックコポリペプチドが準安定ミセルに自己組立されたことを示し、この際、一次Ttから二次Ttに至る温度範囲で準安定ミセルは、安定したミセルに継続的に発達される。これは、既存に報告された他のEBP基盤ジブロック共重合体基盤ミセルのように、抗−Flt1と融合されないEBPP[E1G4I1]12−[G1A3F2]12及びEBPP[E1G4I1]12−[G1A3F2]24のジブロックポリペプチドの自己組立挙動とよく一致する。
抗−Flt1−EBPジブロックコポリペプチドの固有な熱転移と符合するように、抗−Flt1−EBPP[E1G4I1]12−[G1A3F2]12及び抗−Flt1−EBPP[E1G4I1]12−[G1A3F2]24が可溶性単一体からミセルに自己組立される挙動は、動的光散乱(dynamic light scattering、DLS)で特性化された。PBSで25μMで存在するこれらの流体力学的半径(hydrodynamic radius、RH)は、1℃/分の加熱速度で18から50℃の温度内の各温度で11連続で測定された。これらのTtは、相転移に対する開始温度として定義され、図10の各DLSプロットから計算され、下記表7に示した。
Flt1に対する抗−Flt1−EBPP[A1G4I1]3n(n:1、2、4、及び8)及び抗−Flt1−EBPジブロックコポリペプチドの特異的結合は、酵素免疫測定法(enzyme−linked immunosorbent assay、ELISA)により測定された。まず、0.5mg/ml濃度で二硫化−連結されたホモ二量体状態で存在する組み換えヒトVEGF165タンパク質(recombinant human VEGF165 protein、rhVEGF165)(M.W.38.4kDa)の50μLを4℃でひと晩96孔平板(96 well plate)に恒温処理し、前記平板をコーティングした。前記rhVEGF165でコーティングされた孔(wells)は、コーティングされないrhVEGF165を完全に除去するために、ツイン−20(Tween−20)を0.05%含有するPBSで洗浄され、各孔のコーティングされない表面をブロッキング(blocking)するために、BSAを3wt.%含有するPBSで常温で2時間恒温処理され、また、非結合BSAの除去のために、ツイン−20を0.05%含有するPBSで洗浄された。二番目に、抗−Flt1ペプチドとFlt1(VEGFR1)間の特異的結合力を付与するために、0.5μg/ml濃度で二硫化−連結されたホモ二量体で存在する組み換えヒトFlt1−Fcキメラタンパク質(M.W.200.0kDa)は、1wt.%BSAを含有するPBSで(1)抗−Flt1−EBPP[A1G4I1]3n(n:1、2、4、及び8)で前恒温処理(preincubation)されるか、又は(2)異なる長さの疎水性ブロックを有する抗−Flt1−EBPジブロックコポリペプチド(抗−Flt1−EBPP[E1G4I1]12−EBPP[G1A3F2]12及び抗−Flt1−EBPP[E1G4I1]12−EBPP[G1A3F2]24)で前恒温処理され(preincubated)、この際、前恒温処理は、0.5−500μM内の異なる濃度で2時間常温で実施された。その後、rhVEGF165でコーティングされた孔(wells)に前記混合溶液を添加し、常温で追加に2時間恒温処理した。前記EBPP[A1G4I1]12及び異なる長さの疎水性ブロック(同一の濃度を有する)を有するEBPジブロックコポリペプチド(EBPP[E1G4I1]12−EBPP[G1A3F2]12及び抗−Flt1−EBPP[E1G4I1]12−EBPP[G1A3F2]24)は、基準として使用された。それぞれの孔は、0.05%ツイン−20で補充されたPBSで洗浄され、前記孔の表面でrhVEGF165と結合しないFlt1−Fcタンパク質が除去された。rhVEGF165でコーティングされた孔に特異的に結合するヒトFlt1−Fcタンパク質の結合可否は、ウサギ抗−ヒトIgG Fc−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase、HRP)結合体を二次抗体として使用して、タンパク質−抗体結合時に発生する酸化された色素気質の吸光度を450nmで測定することによって確認された。抗−ヒトIgG Fc−HRPが希釈されたPBS(0.3w%BSA含有)を各孔に添加して常温で1時間恒温処理し、その後、0.05%ツイン−20を含むPBSで8回洗浄された。3、3’、5、5’−テトラメチルベンジジン(tetramethylbenzidine、TMB)が各孔に添加され、VEGFに対するFlt1−Fcタンパク質の特異的結合程度が間接的に測定され、これは、Flt1−Fcタンパク質と抗−ヒトIgG Fc−HRPタンパク質間の特異的相互作用とそれによるHRPにより触媒されるTMBの酸化程度を測定することによって決定された。酸化されたTMBの色相強度は、450nmで測定された。それぞれのELISA実験は、再現性のために3回行われた。
可溶性抗−Flt1−EBPP[A1G4I1]12を利用したHUVECsの生体外の管形成分析(in vitro tubing assay)は、内皮細胞の増殖、移動及び管形成(tube formation)に対する可溶性抗−Flt1−EBPP[A1G4I1]12コポリペプチドの効果を評価するために実施された。コーティングのために、8.7mg/mlのマトリゲル200μLを48孔(well)平板培地に37℃で1時間恒温処理し、固めた。HUVECsを蛍光で付着するために、10μMのカルセイン(calcein)−AMで37℃で15分間恒温処理した後、PBSで数回洗浄した。2×104細胞/孔(well)のカルセイン−付着されたHUVECsは、マトリゲルでコーティングされた孔(wells)で培養され、50ng/mlの組み換えヒトrhVEGF165及びそれぞれ異なる濃度の(Flt1特異的拮抗剤として)抗−Flt1−EBPP[A1G4I1]12で37℃で4時間恒温処理され、内皮細胞の増殖、移動及び管形成がどのように刺激されるか測定された。抗−Flt1−EBPP[A1G4I1]12がどれほどHUVECsの管形成を抑制できるかを明白に示すために、同一の濃度のEBPP[A1G4I1]12が基準に評価された。追加に、Flt1特異的拮抗剤として抗−Flt1−EBPP[A1G4I1]12の治療効率を基礎とする抗−血管新生の治療効率を比較するために、VEGFに対する組み換え人間単一クローン抗体(monoclonal antibody、mAb)であるアバスチン(Avastin)が他の基準として使用された。HUVECsの管形成は、Micromanipulator(Olympus、日本国、東京)でイメージを獲得した後、Image lab software(Bio−Rad Laboratories、米国、カリフォルニア、エルクルレス)を使用して孔(well)当たり三つの無作為領域で全体管長さを測定することによって定量化されたが、この際、PBSで4時間恒温処理されたときに移動したHUVECsの管形成に基づいて測定された。これらの管形成は、三回繰り返された。
6〜8週齢の雄性C57BL−6マウスにケタミン及びキシラジンそれぞれ100mg/kg及び10mg/kgを腹腔内に注射して麻酔させ、5mg/mLのトロピカミドで瞳孔を拡張させた後、生体内脈絡膜新生血管形成を誘発させるために、532nmダイオード(diode)レーザー(150〜210mW、0.1秒、50〜100μM)がそれぞれの眼底(fundus)に適用された。眼球の後極部(posterior pole)の6、9、12、及び3時位置は、スリットランプ(slit−lamp)伝達システムで複数回のバーン(burns)が行われた。レーザーを受けるときに生成される気泡は、ブルッフ膜(Bruch’s membrane)の破裂を指示し、これは、CNVモデルを得るのに重要な要素である。生体内レーザー−誘発脈絡膜新生血管形成モデルにおいて抗−新生血管形成に対する抗−Flt1−EBPP[A1G4I1]3nコポリペプチドの効果を評価するために、PBS(運搬体)、EBPP[A1G4I1]12又は多様な濃度の抗−Flt1−EBPP[A1G4I1]12を5日間一日に一回ずつCNVモデルマウスの硝子体内に(intravitreal)注入し、14日後にケタミン及びキシラジンそれぞれ100mg/kg及び10mg/kgを腹腔内に注射して麻酔させた。前記マウスに25mg/mLのFITC−デキストランを含む超純水100mLを眼窩後方(retro−orbital)方式で注入した。次に、摘出された目は、常温で10%ホルマリンで30分間固定された。角膜、虹彩、水晶体、及び硝子体は、立体顕微鏡(Leica、ドイツ、ベツルラオ)の下で慎重に除去された。解剖された網膜は、放射性で4回切開され、カバーガラス(coverslip)が使用され、平坦になった。各生体内の抗−新生血管形成実験は、3回繰り返された。
Claims (17)
- 血管内皮成長因子(Vascular Endothelial Growth Factor:VEGF)受容体に特異的に結合するペプチド;及び
前記ペプチドに連結される親水性のエラスチン基盤ポリペプチド(親水性EBP)
を含む、新血管生成抑制用融合ポリペプチド。 - 前記VEGF受容体に特異的に結合するペプチドは、VEGF受容体であるFlt1又はFlk−1/KDRに特異的に結合するペプチドである、請求項1に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。
- 前記VEGF受容体に特異的に結合するペプチドは、抗−Flt1ペプチド[配列番号38]である、請求項2に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。
- 前記親水性EBPは、
下記式1又は式2で表示されるアミノ酸配列よりなるものである、請求項1に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド:
[式1]
[配列番号1]n;又は
[式2]
[配列番号2]n、
前記式1又は式2で、
前記配列番号1は、[VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]で構成され;
前記配列番号2は、[VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]で構成され;
前記nは、1以上の整数であり、前記配列番号1又は配列番号2の繰り返し回数であり;また
前記Xは、プロリン以外のアミノ酸であり、ペンタペプチドVPGXG又はVPAXGが繰り返されるとき、任意の天然アミノ酸又は人工アミノ酸から選択され、前記Xのうち少なくとも一つは、親水性アミノ酸である。 - 前記親水性EBPは、
前記式1で、nは、1であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、
A(Ala)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなるか[配列番号20];
K(Lys)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなるか[配列番号22];
D(Asp)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなるか[配列番号24];もしくは
E(Glu)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなる[配列番号26]ものであるか、又は
前記式2で、nは、1であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、
A(Ala)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなるか[配列番号21];
K(Lys)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなるか[配列番号23];
D(Asp)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなるか[配列番号25];もしくは
E(Glu)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなる[配列番号27]ものである、請求項1に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。 - 前記親水性EBPは、
前記式2で、nは、3、6、12又は24であり、
前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、A(Ala)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなる、配列番号41、配列番号42、配列番号43もしくは配列番号44で表示されるものであるか;又は
前記式2で、nは、12であり、
前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、E(Glu)、G(Gly)、I(Ile)が1:4:1の比率よりなる配列番号45で表示されるものである、請求項1に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。 - 前記融合ポリペプチドは
前記親水性EBPに連結される疎水性のエラスチン基盤ポリペプチド(疎水性EBP)をさらに含み、
前記疎水性EBPは、下記式1又は式2で表示されるアミノ酸配列よりなるものである、請求項1に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド:
[式1]
[配列番号1]n;又は
[式2]
[配列番号2]n、
前記式1又は式2で、
前記配列番号1は、[VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]で構成され;
前記配列番号2は、[VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]で構成され;
前記nは、1以上の整数であり、前記配列番号1又は配列番号2の繰り返し回数であり;また、
前記Xは、プロリン以外のアミノ酸であり、ペンタペプチドVPGXG又はVPAXGが繰り返されるとき、任意の天然アミノ酸又は人工アミノ酸から選択され、前記Xのうち少なくとも一つは、疎水性アミノ酸又は脂肪族アミノ酸である。 - 前記疎水性EBPは、
前記式1で、nは、1であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、
G(Gly)、A(Ala)、F(Phe)が1:3:2の比率よりなるか[配列番号28]、又は
前記式2で、nは、1であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、
G(Gly)、A(Ala)、F(Phe)が1:3:2の比率よりなるか[配列番号29];
K(Lys)、A(Ala)、F(Phe)が1:3:2の比率よりなるか[配列番号30];
D(Asp)、A(Ala)、F(Phe)が1:3:2の比率よりなるか[配列番号31];
K(Lys)、F(Phe)が3:3の比率よりなるか[配列番号32];
D(Asp)、F(Phe)が3:3の比率よりなるか[配列番号33];
H(His)、A(Ala)、I(Ile)が3:2:1の比率よりなるか[配列番号34];
H(His)、G(Gly)が5:1の比率よりなるか[配列番号35];もしくは
G(Gly)、C(Cys)、F(Phe)が1:3:2の比率よりなる[配列番号36]ものである、請求項7に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。 - 前記疎水性EBPは、
前記式2で、nは、12であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、
G(Gly)、A(Ala)、F(Phe)が1:3:2の比率よりなる[配列番号46]ものであるか、又は
前記式2で、nは、24であり、前記繰り返されるペンタペプチドそれぞれのXは、
G(Gly)、A(Ala)、F(Phe)が1:3:2の比率よりなる[配列番号47]ものである、請求項7に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。 - 前記融合ポリペプチドは配列番号48、配列番号49、配列番号50又は配列番号51で表示されるものである、請求項1に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。
- 前記融合ポリペプチドは、配列番号52又は配列番号53で表示されるものである、請求項7に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。
- 前記融合ポリペプチドは、温度刺激により前記疎水性EBPがコア構造を形成し、前記親水性EBP及びVEGF受容体特異的ペプチドがシェル構造を形成することによって、コア−シェル構造の自己組立ナノ構造体を形成する、請求項7〜請求項11のいずれか一項に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。
- 前記自己組立ナノ構造体は、多価(multivalent)のVEGF受容体特異的ペプチドをシェルとして有する、請求項12に記載の新血管生成抑制用融合ポリペプチド。
- 請求項1〜請求項6のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを含み、
前記融合ポリペプチドのVEGF受容体特異的ペプチドがVEGF受容体と非共有結合をし、血管新生を抑制する、
新血管生成に起因する疾患の治療用組成物。 - 請求項1〜請求項11のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを含み、
前記融合ポリペプチドは、温度刺激により疎水性EBPがコア構造を形成し、親水性EBP及びVEGF受容体特異的ペプチドがシェル構造を形成することによって、コア−シェル構造の自己組立ナノ構造体を構成し、
前記自己組立ナノ構造体のシェルは、多価(multivalent)のVEGF受容体特異的ペプチドを有することによって、VEGF受容体との結合力が増加し、これにより、VEGFがVEGF受容体に結合しないため、血管新生を抑制する、
新血管生成に起因する疾患の治療用組成物。 - 前記新血管生成に起因する疾患は、糖尿病性網膜症(diabetic retinopathy)、早熟児の網膜症、黄斑部変性症、脈絡膜新生血管生成症、新生血管性緑内障、角膜血管新生による眼球疾患、角膜移植時の拒絶反応、角膜浮腫、角膜混濁、癌(cancer)、血管腫、血管線維腫、関節リウマチ(rheumatoid arthritis)、及び乾癬の中から選択されるいずれか一つ以上である、請求項14又は請求項15に記載の新血管生成に起因する疾患の治療用組成物。
- 請求項15又は請求項16に記載の組成物を個体に投与する工程を含む、個体の血管新生を抑制する方法。
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