KR102413729B1 - 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드, 다가성 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 가진 융합단백질 나노케이지 및 이의 테라노스틱스 용도 - Google Patents

신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드, 다가성 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 가진 융합단백질 나노케이지 및 이의 테라노스틱스 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드, 이 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 가진 융합단백질 나노케이지 및 이의 진단 및 치료(테라노스틱스) 용도를 제공한다.

Description

신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드, 다가성 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 가진 융합단백질 나노케이지 및 이의 테라노스틱스 용도{Anti-angiogenic fusion polypeptides, fusion protein cages with multivalent dual anti-angiogenic peptides, and their theranostics applications}
본 발명은 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드, 이 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 가진 융합단백질 나노케이지 및 이의 진단 및 치료(테라노스틱스) 용도에 대한 것이다.
유기체의 단백질은 생물학적 기능을 발휘하기 위해 잘 정렬된(well-ordered) 구조로 자가조립(self-assembly)되며, 자가조립된 구조와 그들의 바이오의학 응용은 활발히 연구되고 있다. 잘 정렬된 단백질 구조는 유전체 패키징(genome packaging), 구조적 지지(structural support), 저장 및 운반의 생물학적 요소 등 세포와 유기체 내의 중요한 기능을 수행한다. 자가조립체는 상향식(bottom-up)으로 단백질 서브유닛을 조립하여 제조되며, 나노섬유, 환형(ring-like), 케이지 구조와 같은 다양한 구조를 가진다. 이러한 구조들을 형성하는 단백질은 본래의 구조 또는 소재 형태로 바이오의학 응용분야에서 연구되고 발전해왔다. 잘 정렬된 단백질 중 하나는 콜라겐(collagen), 아밀로이드(amyloid), 및 튜불린(tubulin)과 같은 선형 단백질로, 나노섬유 구조를 형성한다. 콜라겐과 같은 선형 단백질은 약물 전달 시스템을 위해 필름, 시트 또는 하이드로겔로서 제조된다. 콜라겐 필름 또는 시트는 약물 방출을 조절하기 위해 화학적 콘쥬게이션 또는 물리적 포집(entrapment)에 의해 약물을 코팅하거나 운반한다. 튜불린과 같은 섬유 단백질은 표적 표면에 단백질 구조를 고정시키기 위해 비오틴(biotin)과 융합되거나 표적 단백질을 운반하기 위해 항체와 함께 작용된다. 다른 잘 정렬된 단백질은 β-clamp 또는 TRAP (trp RNA-binding attenuation protein)와 같은 환형 단백질이다. 이러한 환형 단백질의 기능은 단쇄(single stranded) DNA로 풀림(unwinding), 초나선형(supercoiled) DNA의 풀림 및 DNA 수송 또는 DNA 또는 RNA와 결합에 의한 DNA 조작(DNA manipulation)과 연관되어 있다. 다른 단백질 구조는 페리틴(ferritin) 또는 바이러스 캡시드(viral capsid)와 같은 케이지 단백질의 폐쇄된 껍질(closed shell) 구조이다. 케이지 구조는 비어있는 내부에서 소형-반응기나 약물 전달체로 사용되며, 외부 껍질에 작용하기 위해 수용체와 같은 기능적인 펩타이드와 융합된다. 이러한 단백질 구조는 형광 염료(fluoresce dye)나 약물과 같은 다른 기능적인 펩타이드나 화학물과 융합함으로써 첨단 약물 전달 시스템을 위해 개발된다.
단백질-기반 구조는 바이오의약 응용에 있어 생체적합성 및 생분해성의 장점을 가지고 있다. 이러한 단백질 구조 중 하나는 페리틴으로, 4개의 나선형 다발(helix bundle)과 상대적으로 짧은 나선(helix)들의 자가조립된 나노케이지 구조를 가리킨다. 페리틴은 유기체 내 철 저장 단백질 집단(family)이며, 가역적인 pH 반응성을 가진다. 페리틴은 강산 조건(pH 2)에서 분해되며 중성 pH 조건에서 다시 조립된다. 페리틴의 가역적인 pH 반응성은 몇몇 응용 및 새로운 키메라 단백질(chimera proteins)의 제작에 사용된다. 예를 들어, 페리틴을 각각 두 종류의 형광 염료에 화학적으로 콘쥬게이션하면, 두 종류의 다른 화학 염료-콘쥬게이션된 페리틴은 혼합되고 pH 감소에 따라 분해되었다. 그 후 pH가 본래의 케이지 구조로 회복되기 위해 자연(natural) pH로 조정되었다. 두 종류의 다른 염료로 표지된 페리틴 하이브리드 유닛은 페리틴과 분해된 분자로부터 추적 신호를 구별하기 위해 FRET(fluorescence resonance energy transfer)와 함께 프로브로 사용되었다. 페리틴은 다른 주요한 특징은 철 저장 기능이다. 유기체 내에서 본래 페리틴은 철 저장 단백질이다. 한편, 많은 이전 연구는 페리틴이 금, 납, 구리 등 금속 이온을 저장한다는 점을 확인했다. 페리틴 구조의 구멍 내 특정 아미노산은 결합 특이성을 가지며 이온에 따라 아미노산 서열이 다르다. 예를 들어, 금 이온(Au3+)은 Cys48, His49, Met96, His114 및 Cys126와 배위결합했으며, 납 이온(Pd2+)은 Glu45, Cys48, Arg52, Glu53 및 His173의 중심에 축적되었다. 축적된 금속 이온은 케이지 구조 내부 구멍(cavity)의 환원에 의해 금속 나노입자로 환원되고, 페리틴-금속 나노입자 복합체는 촉매나 MRI (magnetic resonance imaging), PET (positron emission tomography)의 이미징 프로브로 활용되었다. 페리틴의 추가적인 기능을 설명하기 위해, 다른 기능적인 펩타이드나 단백질로 페리틴 조각을 대체하거나, 페리틴 외부에 노출되는 표면에 도입하였다. 예를 들어, pH 반응성 펩타이드나 세포 표적 펩타이드는 페리틴과 유전공학적으로 융합되었다. 페리틴이 pH 반응성을 가짐에도 불구하고, 그 pH 범위가 너무 극단의 조건(pH 2)이기 때문에, pH 반응성 펩타이드로서 GALA 펩타이드가 C-말단의 짧은 나선을 대체했다. GALA 펩타이드는 중성 pH 조건에서 임의적인 코일형 모양이며, 산성 조건(pH 6)에서 나선형으로 형태학적 변화가 일어나 케이지 구조를 분해한다. 다른 기능적인 펩타이드는 페리틴의 두 개의 노출 부위에 도입되었는데, N 말단과 4번째 나선형 다발(helical bundle)과 짧은 나선의 중간이다. 지난 연구에서, interleukin-4 receptor (IL-4R)-targeting peptide coil and peptide (AP-1)는 페리틴의 4번째 나선형 다발과 짧은 나선 간에 유전공학적으로 융합되었으며, 융합 페리틴의 IL-4R-발현 세포주, A549로의 결합 및 내재화가 보고되었다. 페리틴은 또한 다른 세포-특이적 표적 펩타이드로서 종양 맥관 구조(tumor vasculature)를 양성 피드백하는 αVβ3와 결합하는 RGD-4C와 유전공학적으로 융합되었다. 한편, 흑색종(melanoma) 세포에 페리틴과 융합한 RGD-4C의 세포-특이적 표적 능력도 확인되었다.
엘라스틴은 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 단백질의 주요 구성성분이며, 탄성중합체 도메인(elastomeric domain)과 교차결합 도메인(crosslinking domain)으로 구성되어 있다. 탄성중합체 도메인은 소수성 아미노산과 VPGG, VPGVG, 및 APGVGV와 같은 반복적인 펩타이드로 이루어진다. 엘라스틴계 폴리펩타이드(elastin-based polypeptides: EBPs)는 탄성중합체 도메인(domain)으로부터 유래된 열 반응 생체고분자들이다. 엘라스틴은 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)에서 주요한 단백질 구성요소이다. EBPs는 탄성중합체 도메인을 기반으로 하여 열 감응성(thermal sensitivity)을 가지도록 변형되었고, 5개의 아미노산으로 구성되는 펩타이드인, 펜타펩타이드(pentapeptide)의 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly[VP(G 또는 A)XG]를 갖는다. EBPs는 열-감응성 폴리펩타이드들이고, 이들의 전이 온도는 쉽게 조절되어 약물 전달 나노구조체를 형성한다.
상기 Xaa는 게스트 잔기(guest residue)이고 프롤린(proline)을 제외한 모든 아미노산일 수 있다. 반복 단위의 서열(sequence)에 따라 두 종류의 EBPs로 구분할 수 있는데, 하나는 서열이 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly인 탄성을 가지는 엘라스틴-기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide with elasticity, EBPE)이고, 다른 하나는 서열이 Val-Pro-Ala-Xaa-Gly인 가소성을 가지는 엘라스틴-기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide with plasticity, EBPP)이다.
EBPs는 탄성중합체 도메인을 기반으로 자극-반응성, 생체적합성, 생분해성, 및 비면역성을 가지도록 고안되었다. EBPs는 열 반응성이 있는 바이오중합체로서, 많은 '펜타펩타이드 반복 유닛'인 Val-Pro-(Gly or Ala)-Xaa-Gly으로 구성되어 있으며, 이 때 Xaa는 반복적인 상기 유닛에서 4번째 아미노산으로 Pro를 제외한 어떤 아미노산이든 가능하다. EBPs는 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature, LCST) 거동을 가져 온도에 따라 가역적인 상전이를 보인다. 그들의 LCST 거동은 EBPs의 열적으로 유발되는 상전이를 사용하는, 단백질 정제 방법론에 기초한 역 전이 순환(inverse transition cycling, ITC)이 가능하다는 장점이 있다. EBPs의 용이한 정제와 자극-유발 상전이는 다른 기능적인 단백질 및 펩타이드의 유전적 융합을 가능하게 한다. 예를 들어, EBPs는 자가절단 단백질(self-cleaving protein)인 인테인(intein)과 유전적으로 융합하는 방법으로 친화크로마토그래피(Affinity chromatography) 또는 단백질 가수분해 태그 제거 없이 클로로페니콜 아세틸전달효소(Chloramphenicol acetyl transferase, CAT) 또는 티오레독신(Thioredoxin, Trx)과 같은 표적 단백질의 산출을 증가하기 위해 단백질 정제 태그로서 사용되었다. 가용성의 EBPs는 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol), PEG)과 같은 '비활성의 단백질-기반 바이오재료'와 첨단 약물 전달 체계, 재생의학, 및 조직공학을 위해 약물 또는 다른 기능적인 단백질과 함께 '약물 전달체(drug delivery carriers)'로서 기능한다.
최근에, 상당 수의 암 관련-질병들은 종양(tumor)에서의 비정상적인 혈관신생에 기인한다고 알려졌다. 생물체에서 생리적 혈관신생은 엄격한 조절에 의한 특이적 조건하에서만 오직 활성화된다. 신생혈관 통제 전략 중 하나는 세포막에서 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 두 종류의 VEGF 수용체(VEGF receptors, VEGFR)인 VEGFR1 (fms-like tyrosine kinase-1 또는 Flt1) 및 VEGFR2 (kinase insert domain-containing receptor 또는 Flk-1/KDR)에 결합시키고, 혈관내피세포에서 성장신호를 시작하는 것이다. 조절의 붕괴로 인한 혈관의 비정상적인 형성은 암뿐만 아니라 비종양성 질환과 같은 질병들을 야기한다. 따라서, 종양 성장, 암세포 전이, 망막 혈관신생, 맥락막 혈관신생, 당뇨병성 망막증, 천식과 같은 다양한 질병에서 혈관신생을 억제하기 위해, 항-혈관신생(anti-angiogenesis)에 관한 다양한 전략들이 적용되었다. 그 예로는 카페인산(caffeic acid, CA)의 색소상피유래인자(pigment epithelial-derived factor, PEDF)와 같은 혈관신생 억제제를 사용하여 항-혈관신생 신호를 개시하는 것과, 그리고 VEGF가 이의 수용체들(VEGFRs)과 결합하는 것을 방해함으로써 신생혈관 형성 신호를 막는 것이 있다. 각 VEGFRs의 특정 기능이 완전히 밝혀지지 않았음에도 불구하고, VEGFR1 및 VEGFR2가 상이한 효과를 통해 신혈관 생성을 유도한다는 사실이 유전자 삭제(gene deletion) 연구에 의해 확인되었다. VEGF 및 VEGFR1 유전자가 없는 쥐의 경우, 내피세포가 과성장하여(overgrowth) 혈관이 형성되지 않았다. VEGF 및 VEGFR2 유전자가 없는 쥐의 내피세포와 조혈세포는 정상적으로 발달하지 않았다. 내피세포와 조혈세포의 손상 없이 신생혈관을 억제하기 위해서는 VEGFR1에 높은 친화력을 가지는 생체거대분자(biomacromolecule) 또는 펩타이드를 이용하여 VEGF와 VEGFR1의 결합을 방해하는 전략이 개발되었다. 고속대량스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템 중에 하나인 PS-SPCL(positional scanning-synthetic peptide combinatorial library) 탐색을 통해서 확인된 Anti-Flt1 펩타이드는, Gly-Asn-Gln-Trp-Phe-Ile(GNQWFI)의 아미노산 서열을 가지는 헥사펩타이드(hexapeptide)이다. Anti-Flt1 펩타이드는 VEGFR1 특이적 길항제로서 VEGFR1에 특이적으로 결합하며, 그렇게 함으로써 VEGF 뿐만 아니라 태반성장인자(placental growth factor, PIGF) 및 VEGF/PIGF heterodimer를 포함한 모든 VEGFR1 리간드들과 VEGFR1이 상호작용하는 것을 방해한다. 생체 내(in vivo)에서 Anti-Flt1 펩타이드의 반감기를 증가시키기 위해서, Anti-Flt1 펩타이드-하이알루로네이트(hyaluronate, HA) 결합체는 제니스테인(genistein), 덱사메사손(dexamethasone) 또는 타이로신(tyrosine)-특이적 단백질 카이네이즈(kinases) 억제제가 함입된 자가조립 마이셀(micelle) 구조의 형성에서 연구되었다. 비록 HA 중합체와 Anti-Flt1 펩타이드의 콘쥬게이션은 신체 내에서 Anti-Flt1 펩타이드의 반감기를 증가시키지만, 콘쥬게이션 효율 및 마이셀 구조는 다분산 HA 중합체 분자량, 임의 분포(random　distribution), 및 HA와 Anti-Flt1 펩타이드의 접합 효율의 비일관성으로 인해 이질적(heterogeneous)인 문제점이 있다.
혈관신생 저해를 위한 다른 전략은 항-혈관신생 신호를 활성화하는 것이다. 색소상피 유래인자(PEDF)는 항-혈관신생 신호를 활성화할 뿐만 아니라 혈관신생 저해제로서 혈관신생과의 균형을 유지하는 역할을 하며, 신경영양(neurotrophic) 및 항종양(antitumorigenic) 특성이 있다. PEDF의 두 종류의 펩타이드인 PEDF 44-mer 펩타이드 (잔기 58-101) 및 PEDF 34-mer 펩타이드 (잔기 24-57)와 이들의 기능은 매커니즘과 함께 규명되었다. PEDF 44-mer 펩타이드는 혈관 누출을 막고, 신경영양적 기능을 가진다. 종양 세포에서, PEDF 44-mer 펩타이드는 신경내분비계 분화(neuroendocrine differentiation)와 신경세포 퇴화(neurite outgrowth)를 유발한다. PEDF 34-mer 펩타이드는 다양한 경로로 신혈관 생성 및 종양 세포를 억제하는 기능을 가진다. PEDF 34-mer 펩타이드는 JNK (c-jun-NH2 kinases)를 활성화하고, NFAT (nuclear factor of activated T cells)를 불활성화한다. 활성화된 JNK는 세포사멸(apoptosis)를 위해 내생의 카스페이즈 저해제(endogenous caspase inhibitor) 및 c-FLIP (cellular FLICE (FADD-like IL-1β-converting enzyme)-inhibitory protein)의 발현을 방해하고 NFAT의 불활성화 상태를 복원한다. 불활성화된 NFAT는 신혈관 생성 억제를 위해 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 혈관내피 성장인자(VEGF) 유도 전사를 방해한다. PEDF 34-mer 펩타이드는 F1-ATP 합성효소의 catalytic β-subunit과 결합 친화력이 있으며, 이는 ATP 합성효소 활성을 저해하기 위함이다. 세포 표면의 ATP 부족은 종양 성장 및 침입의 제한을 초래한다. PEDF 34-mer 펩타이드는 내피세포막의 라미닌(laminin) 수용체와 결합 친화력이 있다. 라미닌은 내피세포 아래 위치한 기초적인 막 중 하나인 바닥판(basal lamina)의 주요 구성요소이다. 라미닌 수용체를 포함한 PEDF 34-mer 펩타이드는 내피세포의 세포사멸을 야기하고 튜브 형성을 저해한다.
본 발명자들은, 자극반응성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptides, EBPs) 를 헬릭스 기반 케이지 형태의 나노구조체에 도입하는 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1296329호
Biomaterials 31 (2010) 5191-5198
본 발명의 목적은 신혈관 생성 억제용의 새로운 융합 폴리펩타이드를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 폴리펩타이드를 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드를 포함하는 신혈관 생성에 기인한 질환의 치료용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 가진 융합 단백질 나노케이지를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신혈관 생성에 기인한 질환을 위한 테라노스틱스 나노프로브(theranostic nanoprobe)를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은,
i) 항-혈관신생 펩타이드; 상기 펩타이드에 연결되는 서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드; 상기 펩타이드에 연결되는 친수성인 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(친수성 EBP); 상기 친수성 EBP에 연결되는 서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드로 구성되거나,
ii) 서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드; 상기 헬릭스 기반 펩타이드에 연결되는 친수성 EBP; 상기 제1 친수성 EBP에 연결되는 항-혈관신생 펩타이드; 상기 항-혈관신생 펩타이드에 연결되는 제2친수성 EBP; 및 상기 친수성 EBP에 연결되는 서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드로 구성되거나, 또는
iii) 항-혈관신생 펩타이드; 상기 펩타이드에 연결되는 서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드; 상기 단백질에 연결되는 친수성 EBP; 상기 친수성 EBP에 연결되는 항-혈관신생 펩타이드; 상기 항-혈관신생 펩타이드에 연결되는 친수성 EBP; 및 상기 친수성 EBP에 연결되는 서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드로 구성되는 것인, 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
상기 항-혈관신생 펩타이드는 항-Flt1 펩타이드[서열번호 3] 또는 PEDF(pigment epithelial-derived factor) 34-mer[서열번호 4]일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 PEDF 34-mer는 PEDF 중 항-혈관신생 기능성 34 개 아미노산 구역으로, 이 기술분야에 이미 알려져 있다.
상기 항-Flt1 펩타이드는 혈관내피 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor: VEGF) 수용체인 Flt1에 특이적으로 결합하여 새로운 혈관 생성을 억제한다. PEDF(pigment epithelial-derived factor)는 혈관 생성을 억제하는 펩타이드이다.
상기 친수성 EBP는, 서열번호 5 내지 14 중 하나로 표시된 것일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니며, 이 기술분야에서 사용가능한 친수성 EBP는 모두 포함할 수 있다.
상기 i)은 [서열번호 3의 항-Flt1 펩타이드]-[서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]-[친수성 EBP]-[서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]로 구성될 수 있다.
상기 ii)은 [서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]-[친수성 EBP]-[서열번호 4의 PEDF 34-mer]-[친수성 EBP]-[서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]로 구성될 수 있다.
상기 iii)은 [서열번호 3의 항-Flt1 펩타이드]-[서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]-[친수성 EBP]-[서열번호 4의 PEDF34-mer]-[친수성 EBP]-[서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]로 구성될 수 있다.
상기 i)은 서열번호 16, 상기 ii)는 서열번호 17, 그리고 상기 iii)은 서열번호 18로 표시될 수 있다.
다른 측면에서 본 발명은, 상기 언급한 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드를 포함하는 신혈관 생성에 기인한 질환의 치료용 조성물을 제공한다.
상기 신혈관 생성에 기인한 질환은, 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 황반부변성증, 맥락막 신생혈관생성증, 신생혈관성 녹내장, 각막혈관신생에 의한 안구질환, 각막 이식 시의 거부반응, 각막 부종, 각막 혼탁, 암(cancer), 혈관종, 혈관섬유종, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 및 건선 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
또 다른 측면에서 본 발명은, 상기 언급한 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드에서, 서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드와 서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드가 자가조립함으로써 제조되는 것인, 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 가진 융합 단백질 나노케이지를 제공한다.
상기 나노케이지는 다가(multivalent)의 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 항-Flt 펩타이드와 PEDF 34-mer를 동시에 가진다.
또 다른 측면에서 본 발명은,
형광 염료; 및
상기 언급한 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 가진 융합 단백질 나노케이지;를 포함하여 이루어지고, 상기 형광 염료는 상기 나노케이지 안에 들어 있는 것인, 신혈관 생성에 기인한 질환을 위한 테라노스틱스 나노프로브(theranostic nanoprobe)를 제공한다.
또 다른 측면에서 본 발명은,
라만 염료가 결합된 금속 나노입자; 및
상기 언급한 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 가진 융합 단백질 나노케이지;를
포함하여 이루어지고, 상기 라만 염료가 결합된 금속 나노입자는 상기 나노케이지 안에 들어 있는 것인, 신혈관 생성에 기인한 질환을 위한 테라노스틱스 나노프로브를 제공한다.
상기 신혈관 생성에 기인한 질환은, 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 황반부변성증, 맥락막 신생혈관생성증, 신생혈관성 녹내장, 각막혈관신생에 의한 안구질환, 각막 이식 시의 거부반응, 각막 부종, 각막 혼탁, 암(cancer), 혈관종, 혈관섬유종, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 및 건선 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항-혈관신생 펩타이드"란, 새로운 혈관 생성을 억제하는 펩타이드를 말한다. 구체적인 예로, 항-Flt1 펩타이드는 혈관내피 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor: VEGF) 수용체인 Flt1에 특이적으로 결합하여 새로운 혈관 생성을 억제한다. PEDF(pigment epithelial-derived factor) 34-mer는 혈관 생성을 억제하는 펩타이드이다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드는 새로운 혈관의 생성을 억제하는 작용을 한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연　아미노산　또는　인공　아미노산을 의미하며, 바람직하게는 천연　아미노산을 의미한다. 예컨대 상기　아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 글루타민, 아스파라진, 시스테인, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 타이로신 또는 트립토판 등을 의미한다.
상기 아미노산의 성질은 이 기술분야에 널리 공지되어 있다. 구체적으로 친수성(음전하성 또는 양전하성)을 나타내거나 소수성을 나타내고, 지방족 또는 방향족의 성질도 나타낸다.
본 명세서에서 사용하는 Gly(G), Ala(A) 등의 약어는 아미노산 약어이다. Gly는 글라이신의, Ala는 알라닌의 약어이다. 또한 글라이신은 G, 알라닌은 A라고도 표현한다. 상기 약어는 이 기술분야에서 널리 사용되는 표현이다.
본 발명에서 "친수성 아미노산"이란, 친수성 성질을 나타내는 아미노산으로, 리신, 아르기닌 등이 있다.
본 명세서에 사용된 "폴리펩타이드"란 용어는 아미노산의 임의의 중합체 체인을 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는　폴리펩타이드란　용어와 혼용할 수 있는 것으로서, 이 역시 아미노산의 중합체 체인을 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의　폴리펩타이드　유사체를 포함한다.　폴리펩타이드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
본 발명의 "엘라스틴-기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptides: EBPs)"는 "엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ealstin-like polypeptieds: ELP)"라고도 불린다. 본 발명의 기술분야에서 널리 사용되는 용어이다.
본 명세서에서, 상기 Xaa(또는 X) "게스트 잔기"라고 칭한다. 상기 Xaa를 다양하게 도입하여 본 발명에 따른 다양한 종류의 EBP를 제조할 수 있다.
상기 EBP는, 전이 온도(transition temperature: Tt)라고도 칭하는 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature: LCST)에서 가역 상 전이를 거친다. 이들은, Tt 미만에서 수용성이 크지만, 온도가 Tt를 초과하면 불용성으로 된다.
본 발명에서, EBP의 물리화학적 특성들은 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly의 조합에 의해 주로 제어된다. 구체적으로, 그 반복 단위의 3번째 아미노산은 상대적 기계적 특성을 결정한다. 예를 들어, 본 발명에서, 3번째 아미노산인 Gly 는 탄성(elasticity)을, 또는 Ala는 가소성(plasticity) 결정한다. 상기 탄성 또는 가소성은 전이 이후에 나타나는 성질이다.
한편, 4번째 아미노산인 게스트 잔기 Xaa의 소수성과 펜타펩타이드 반복 단위의 중합화(multimerization)는, 모두, Tt에 영향을 끼친다.
본 발명에 따른 EBP는 펜타펩타이드가 반복된 폴리펩타이드일 수 있고, 이 반복된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 블럭(EBP 블럭)을 형성할 수 있다. 구체적으로 친수성 EBP 블럭 또는 소수성 EBP 블럭을 형성할 수 있다. 본 발명의 EBP 블럭의 친수성 또는 소수성의 성질은 EBP의 전이온도가 깊은 관련성이 있다.
EBP의 전이온도는 또한 아미노산 서열 및 이의 분자량에 달려 있다. EBP 서열과 Tt의 상관 관계에 대해서는 Urry 등이 많은 연구를 수행하였다(Urry D.W., Luan C.-H., Parker T.M., Gowda D.C., Parasad K.U., Reid M.C., and Safavy A. 1991. Temperature of polypeptide inverse temperature transition depends on mean residue hydrophobicity. J. Am. Chem. Soc. 113: 4346-4348.). Urry 등은 Val-Pro-Gly-Val-Gly의 펜타펩타이드에서, 4번째 아미노산인 "게스트 잔기"를 Val 보다 더 친수성을 나타내는 잔기로 치환하는 경우, 원래 서열과 비교하여 Tt가 올라가고, 반대로 Val보다 소수성인 잔기로 게스트 잔기를 치환하면 원래 서열보다 Tt가 낮아진다는 것을 발견하였다. 즉, 친수성 EBP는 Tt가 높고 소수성 EBP는 상대적으로 Tt가 낮다는 것을 발견하였다. 이러한 발견을 통해, EBP 서열의 게스트 잔기로 어떤 아미노산을 사용할지 결정하고, 게스트 잔기의 조성 비율에 변화를 줌으로써 특정 Tt를 가지는 EBP를 제조할 수 있게 되었다(Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapter 18. pp. 329-343).
앞서 설명한 바와 같이, Tt가 높으면 친수성을 나타내고 Tt가 낮으면 소수성을 나타낸다. 본 발명에 따른 EBP 블럭들도 게스트 잔기를 포함하는 아미노산 서열과 분자량에 변화를 줌으로써 Tt를 올리거나 낮출 수 있다. 그리하여 친수성 EBP 블럭 또는 소수성 EBP 블럭의 제조가 가능하다.
참고로, 체온보다 낮은 Tt를 가지는 EBP는 소수성 블럭으로 사용될 수 있고, 체온 보다 높은 Tt를 가지는 EBP 는 친수성 블럭으로 사용될 수 있다. EBP가 가지는 이러한 성질로 인해, EBP의 친수성과 소수성의 성질은 생체공학적으로 응용할 때에는 상대적으로 정의할 수 있다.
본 발명의 EBP 서열을 예로 들면, Val-Pro-Ala-Xaa-Gly의 가소성 펜타펩타이드 가 반복되는 가소성 폴리펩타이드 블럭과 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly의 탄성 펜타펩타이드 반복되는 탄성 폴리펩타이드 블럭을 비교하였을 때, 3번째 아미노산인 Gly이 Ala보다 높은 친수성을 보인다. 따라서 가소성 폴리펩타이드 블럭(Elastin-based polypeptide with plasticity: EBPP)이 탄성 폴리펩타이드 블럭(Elastin-based polypeptide with elasticity: EBPE)보다 Tt가 낮게 나타난다.
본 발명에 따른 EBP들은 앞서 설명한 바와 같이, Tt를 조절하여, 친수성 또는 소수성의 성질을 나타낼 수 있는 것이다.
본 발명의 "헬릭스 기반 폴라펩타이드"란 나선형의 폴리펩타이드를 의미하며, 구체적으로는 페리틴(ferritin)에서 유래하였다.
페리틴은 단백질은 세포내 단백질의 일종으로 철을 저장하고, 방출하는 역할을 한다. 페리틴은 자가조립하여 단백질 케이지를 만든다. 케이지(cage) 단백질은 저분자량 단일체들의 정밀한 자가조립 성질에 의하여 단일체 분자량의 수십에서 수백 배의 거대분자를 형성할 수 있는 단백질이다. 페리틴은 일반적으로 생체내에서 속이 빈 구형의 케이지(cage) 형태를 하고 있으며, 나선형 다발(페리틴 A, B, C, D)과 짧은 5번째 나선(페리틴 E)으로 구성되어 있다.
본 발명의 헬릭스 기반 폴리펩타이드는 "HPC(helix-based protein cage)"로도 기재하며, 나선형 다발(페리틴 A, B, C, D)인 서열번호 1(실시예에서 'HPC4'로 표시함) 및, 짧은 5번째 나선(페리틴 E)인 서열번호 2(실시예에서 'HPC5'로 표시함)로 표시된다.
본 발명에서 "테라노스틱스 나노프로브(theranostic nanoprobe)"란 치료(therapy)와 진단(diagnostic)이 동시에 가능한 나노 크기의 프로브를 의미한다.
상기 "나노"란 이 기술분야의 통상의 기술자들이 이해하는 정도의 크기 범위를 포함한다. 구체적으로 상기 크기 범위는 0.1 에서 1000 nm의 크기일 수 있으며, 더 구체적으로는 10 에서 1000 nm, 더욱 바람직하게는 20 에서 500 nm, 더 더욱 바람직하게는 40 에서 250 nm 일 수 있다.
본 발명에서 "라만 염료"란 표면 증강　라만　산란(Surface-enhanced Raman scattering, SERS)"에 기반한 측정법에 이용되는 유기화합물을 의미한다. 상기 라만 염료가 부착된 금속 나노입자를 이용하여 SERS 기반으로 라만 신호를 측정한다. 이는 널리 이 기술분야에 널리 알려긴 기술이다.
상기 “라만　염료”는 이 기술분야에서 널리 사용되는 것이라면 어느 것이나 제한없이 사용할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 로다민6G, 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-플루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리민딘, 8-머캅토아데닌, 및 9-아미노-아크리딘 등을 들 수 있으나 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "다가성 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 가진 융합단백질 나노케이지"란, 1 개 이상의 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 포함한 융합폴리펩타이드를 포함하고 있는 나노케이지 구조체를 말한다. 구체적으로, 혈관내피 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor: VEGF) 수용체(Flt1 또는 Flk-1/KDR)에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 혈관 생성 억제인자인 색소상피유래인자(pigment epithelial-derived factor, PEDF)를 모두 포함한 융합폴리펩타이드를 포함한 나노구조체를 의미한다.
본 발명에서 "융합단백질 나노케이지"는 "융합 단백질 케이지"라고도 표현한다.
본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드는 도 1에 모식적으로 나타내었다.
본 발명은 비크로마토그래피 정제와 치료용 도메인의 노출을 위해 자극반응성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptides, EBPs)의 특정 클라스(class)를 페리틴 나노구조체에 도입한 것이다.
구체적인 예를 들어 설명하면, [서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]의 N말단에 [서열번호 3의 항-Flt1 펩타이드]가 연결되고, [서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]의 다른 말단에 [친수성 EBP]-[서열번호 4의 PEDF 34-mer]-[친수성 EBP]-[서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]가 순서대로 연결되었다.
본 발명은, 통제되지 않는 혈관신생 의존 질환들을 치료하기 위해 다가성 이중 신생혈관 억제용 펩타이드를 가진 융합 단백질 케이지를 유전공학적으로 개발한 것이다. 융합 폴리펩타이드는 자가조립을 위한 헬릭스 기반 단백질 케이지(helix base protein cage, HPC), 열 민감성 EBP, 두 종류의 항-혈관신생 펩타이드(Anti-Flt1 펩타이드 및 PEDF 34-mer 펩타이드)로 구성되었다. HPC는 4개의 나선형 다발(서열번호 1)과 상대적으로 짧은 나선으로 구성된 페리틴(서열번호 2)으로부터 유래되었다. 두 개의 상이한 항-혈관신생 펩타이드는 각각 HPC 및 EBP의 노출 부위에 놓이며, PEDF 34-mer 펩타이드의 효과적인 노출 및 비크로마토그래피 정제를 위해 도입되었다. 두 개의 EBP 단일블럭(monoblock)은 효과적으로 PEDF 34-mer 펩타이드를 노출시키기 위해 PEDF 34-mer 펩타이드 사이에 융합되었다. EBP-PEDF 34-mer-EBP 삼중블럭 공폴리펩타이드(copolypeptide)는 HPC의 4번째 나선과 5번?? 나선 사이에 위치되었다. 항-Flt1 펩타이드는 다른 노출 부위인 HPC의 N-말단에 위치했다. 융합 폴리펩타이드는 다가성 이중 신생혈관 억제 효능을 가진 나노케이지 구조로 자가조립되었다. 우리는 Anti-Flt1 펩타이드의 VEGFR 결합 친화력과 HPC의 철 저장 및 pH 반응성이라는 특성을 이용하여 융합 단백질 케이지의 응용 분야를 개발했다.
표면증강 라만산란법(surface enhanced Raman scattering, SERS) 기반 센싱을 위해 HPC에 형광(라만) 염료를 콘쥬게이션하고 금 나노입자(AuNP)를 HPC 내부에 합성함으로써 융합 단백질에 세포 이미징 및 센싱 기능을 추가했다. 형광 염료가 콘쥬게이션된 융합 단백질 케이지는 세포막에서 VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor)에 결합되고, 신생혈관 억제 효과와 세포 이미징을 동시에 보여주었다.
HPC에서 축적된 금 이온이 AuNP로 환원되고, AuNP의 표면에 라만 염료를 도입함으로써 융합 단백질 케이지가 SERS 기반 센싱 프로브로서 개발되었다. 라만 염료는 융합 단백질 케이지가 산성 조건에서 풀린 상태일 때 투과하여 AuNP 표면에 도입되고, 중성 조건에서 케이지 구조는 회복된다. 융합 단백질 케이지의 자가조립과 응집(aggregation)은 시간에 따른 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS)에 의해 확인되었다. 융합 단백질의 항-혈관신생과 세포 이미징은 모두 체외에서(in vitro) 인간 탯줄 정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) 조사에 의해 연구되었다.
본 발명의 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드를 포함하는 치료용 조성물은 약학적 조성물이다. 상기 약학적 조성물은 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하고 생체내(in vivo)에서 신생 혈관 생성 억제의 용도로 사용되는 것을 방해하지 않는 다른 물질들을 포함할 수 있다. 이러한 다른 물질들은 제한되지 않으며 희석제, 부형제, 담체 및/또는 다른 신생 혈관 생성 억제 물질들을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드는 예를 들어, 살균수와 일반적인 식염수를 포함하는, 적절한 희석액과 함께 제제화함으로써, 통상적인 인체 투여를 위해 제제화된다.
본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 또는 전달은 표적 조직이 그 경로를 통해 이용할 수 있는 한 임의의 경로를 통할 수 있다. 예를 들어, 투여는 국소 또는 피내, 피하, 근육내, 복강내, 동맥내, 관상동맥내, 경막내 또는 정맥내 주사, 또는 안구 유리체 주사 (intravitreal injection) 등과 같은 표적 조직(예를 들어, 심장 조직) 내로의 직접 주사에 의할 수 있다. 본 발명에 개시된 융합 폴리펩타이드의 안정성 및/또는 효력은 피하, 피내, 정맥내 및 근육내를 포함하는 편리한 투여 경로를 고려한다.
본 발명은 융합 폴리펩타이드를 (예를 들어, 본 발명에 기술된 조성물 또는 제제의 일부로서) 세포로 전달하는 방법, 및 대상에서 질환의 진행을 치료, 경감, 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명에 사용된 용어 "대상" 또는 "환자"는 인간 및 다른 영장류(예를 들어, 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소 및 말), 가정용 포유류(예를 들어, 개 및 고양이), 실험실 동물(예를 들어, 생쥐, 쥐 및 기니 피그와 같은 설치류) 및 새(예를 들어, 닭, 칠면조 및 가금류와 같은 가정용, 야생용 및 경기용 새, 오리, 거위 등)를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 척추동물을 의미한다. 일부 실시태양에서, 대상은 포유류이다.
다른 실시태양에서, 포유류는 인간이다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드 또는 약학적 조성물은 표적 세포(예를 들어, 포유류 세포)와 in vitro 또는 in vivo로 접촉될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 따른 치료용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신생 혈관 생성에 기인한 질환의 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
임상적 사용을 위해, 본 발명의 융합 폴리펩타이드는 원하는 치료 결과를 달성하는데 효과적인 임의의 적합한 투여 경로를 통해 단독으로 투여되거나 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 투여 "경로" 는 경장, 비경구 및 국소 투여 또는 흡입을 의미할 것이다. 본 발명의 융합 폴리펩타이드의 경장 투여 경로는 구강, 위장, 창자, 및 직장을 포함한다. 비경구 경로는 안구 주입, 정맥내, 복강내, 근육내, 척추강내, 피하, 국소 주입, 질, 국소, 비강, 점막 및 폐 투여를 포함한다. 본 발명의 융합 폴리펩타이드의 국소 투여 경로는 표피, 구강 및 귀, 눈 및 코 내로의 올리고뉴클레오타이드의 외부 적용을 나타낸다.
상기 치료용 조성물은 비경구, 경구, 경피, 지속된 방출, 제어된 방출, 지연된 방출, 좌약, 카테터 또는 설하 투여에 의해 투여될 수 있다.
상기 치료용 조성물 내 융합 폴리펩타이드는 다른 약물들과 병용 투여할 때 정맥 주사 시 (intravenous injection) 15mg/kg 이하의 양으로 투여될 수 있고, 안구유리체 주사 시 (intravitreal injection) 2.5 mg 이하의 양으로 투여될 수 있다.
본 발명은 제한적인 것으로 해석되지 않아야 하는 다음 추가예에 의해 추가로 설명된다. 통상의 기술자는, 본 발명의 관점에서, 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않고 개시된 특정 실시태양에 대한 여러 변화가 가능할 수 있고 동등한 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해해야한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 항-혈관신생 및 신생혈관 세포 이미징 기능을 가지는 자가조립된 융합 단백질 케이지는 망막, 각막, 맥락막 혈관신생, 종양 성장, 암세포 전이, 당뇨병성 망막증, 및 천식과 같은 혈관싱생 관련 질환들을 치료하기 위한 첨단 약물 전달 시스템의 새로운 길을 제시한다.
도 1(A) anti-Flt1 peptide, PEDF 34-mer, 및 EBPP[A1G4I1]1의 아미노산 서열 (B)와 (C) anti-Flt1-HPC-EBPP[A1G4I1]12-PEDF 34-mer 융합 폴리펩타이드의 블럭 디자인 및 응용의 전략. (B) (a) anti-Flt1 peptide는 N-말단에 위치하며 EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer-EBPP[A1G4I1]6 삼중블럭은 HPC의 4번째, 5번째 나선의 중간에 위치했다. (b) 융합 폴리펩타이드의 자가조립체 구조는 바이오이미징 및 바이오센싱을 위해 변형되었다. 형광 염료는 바이오이미징을 위해 케이지 내 표지되었고, 금 나노입자는 케이지 구조 내부에서 합성되고, 바이오센싱을 위해 라만 염료와 콘쥬게이션되었다. (C) 융합 단백질 케이지는 두 메커니즘에 의해 항-혈관신생 기능이 유도되었다. Anti-Flt1 펩타이드는 세포 내 혈관신생 신호를 저해했고, PEDF 34-mer는 항-혈관신생 신호를 활성화했다.
도 2는, (a) HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, (b) 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, (c) HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5, 및 (d) 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5의 (A) 아가로스 젤(1 %) 및 (B) SDS-PAGE 젤 이미지. (A) 상기 융합 단백질을 암호화하는 변형된 pET21-a(+) 플라스미드는 Xba I 및 AcuI 제한효소 처리되었다. 융합 단백질 케이지를 포함하는 유전자 조각의 길이는 유전자 조각 아래에 표지되었다. (B) 융합 단백질 케이지는 E. coli에서 발현되고, ITC에 의해 정제되었다. 젤은 구리 염색에 의해 시각화되었다. 예상되는 분자량은 밴드 아래에 제시했다.
도 3은, (a) HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, (b) 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, (c) HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer-EBPP[A1G4I1]6-HPC5, 및 (d) 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5의 열 민감도. 0.01 M PBS에서 25 μM (a) HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, (b) 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, (c) HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5, 및 (d) 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5의 (A) 혼탁도 프로파일(Turbidity profile) 및 (B) 유체역학적 반경(hydrodynamic radius). 350 nm에서의 흡광도와 유체역학적 반경은 1 ℃/min 속도로 가열되면서 측정되었다.
도 4는 (A) 형광 현미경 이미지 및, 0.01 nM - 10 uM의 (a) HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, (b) 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, (c) HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5, 및 (d) 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5가 처리된 (B) calcein-AM 표지된 HUVECs의 튜브 형성 정도(tube formation degree). 이는 (A) 이미지로부터 정량화되었다.
도 5는 (A) SDS-PAGE에서 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 콘쥬게이션된 형광 염료의 시각화. (a) 형광 염료 콘쥬게이션 전의 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5의 구리 용액에 염색된 SDS-PAGE의 젤과 (b) 형광 염료 켠쥬게이션 후, 형광 스캐너 하에서 UV 광선에 노출된 후의 겔의 모습. (B) (a) 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 및 (b) 형광 염료가 콘쥬게이션된 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 의 형광 스펙트럼. (C) 1 또는 10 nM의 염료 콘쥬게이션 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5이 15, 30, 및 60분동안 처리된 HUVEC 형광 이미지 및 명시야의 병합된 이미지. (C)에서 크기 바는 200 um이다.
도 6은 (A) 유체역학적 반경 및 (B) (a) 금 이온 처리 전, (b) 금 시드 합성 후 및 (c) 금 나노입자 성장에서 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5의 자외선 흡광 스펙트럼. (C) 융합 단백질 케이지 내부 금 나노입자의 TEM 이미지. (D) 융합 단백질 케이지에서 라만 염료와 콘쥬게이션된 금 나노입자의 라만 스펙트럼.
실시예 1: 재료
pET-21a (+) 벡터 및 BL21 (DE3) E. Coli 세포는 Novagen Inc. (Madison, WI, U.S.)사의 제품을 사용했다. Top10 competent cells 및 Calcein-AM은 Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.)사에서, HUVECs는 Lonza (Basel, Switzerland)사에서 구매했다. 모든 주문제작 올리고뉴클레오타이드는 Cosmo Gene Tech (Seoul, South Korea)사에서 합성했으며, 인간 재조합 VEGF-165 (rhVEGF165)는 R&D SYSTEMS (Minneapolis, U.S.) 사의 제품을 사용했다. CIP(Calf intestinal alkaline phosphatase), BamHI 및 XbaI는 Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, U.S.) 사의 제품을 사용했다. AcuI 및 BseRI는 New England Biolabs (Ipswich, MA, U.S.)사에서 구매했다. T4 DNA ligase는 Elpis Bio-tech (Taejeon, South Korea)사의 제품을 사용했다. DNA miniprep, gel extraction, 및 PCR purification kits는 Geneall Biotechnology (Seoul, South Korea)사의 제품을 사용했다. Dyne Agarose High는 DYNE BIO, Inc. (Seongnam, South Korea)사의 제품을 사용했다. Top10 cells은 MO BIO Laboratories, Inc. (Carlsbad. CA, U.S.)사에서 구매한 TB DRY media에서 배양했다. BL21(DE3) 세포는 MP Biomedicals (Solon, OH, U.S.)사에서 구매한 Circle Grow media에서 배양했다. HUVECs는 Lonza (Basel, Switzerland)사에서 구매한 EGM-2 Bullet Kit 및 EBM-2에서 키웠다. The Ready Gels, Tris - HCl 2 - 20 % precast gels은 Bio-Rad (Hercules, CA, U.S.)사에서 구매했다. PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4) 및 앰피실린은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, U.S.)사의 제품을 사용했다. 마트리겔(Matrigel)은 BD Biosciences (San Diego, CA, U.S.)사에서 구매했다. 인간 재조합 VEGF165 단백질 및 인간 재조합 VEGF R1/Flt-1 Fc은 R&D System (Minneapolis, MN, U.S.)사에서 구매했다. Gold(III) chloride trihydrate, sodium borohydride, ascorbic acid, 및 malachite Green isothiocyanate는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, U.S.)사에서 구매했다.
실시예 2: 서로 다른 EBP 블럭들과 이들의 블럭 폴리펩타이드에 대한 표기
펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly[VP(G 또는 A)XG]를 갖는 서로 다른 EBP들은 다음과 같이 명명한다. 상기 Xaa는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. 첫째, 가소성이 있는 Val-Pro-Ala-Xaa-Gly(VPAXG)의 펜타펩타이드 반복은 가소성이 있는 엘라스틴계 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide with plasticity: EBPP)라고 정의한다. 한편 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)의 펜타펩타이드 반복은 탄성이 있는 엘라스틴계 폴리펩타이드(the elastin-based polypeptide with elasticity: EBPE)라 칭한다. 둘째, [XiYjZk]n에서, 괄호 내의 대문자들은 게스트 잔기의 단글자 아미노산 코드, 즉, EBP 펜타펩타이드의 4번째 위치(Xaa 또는 X)에서의 아미노산이고, 이들의 해당하는 아래 첨자는 반복 단위로서 EBP 모노머 유전자의 게스트 잔기의 비율(ratio)을 나타낸다. [XiYjZk]n (i+j+k=6)의 아래 첨자 수 n은 본 발명의 EBP인 [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG] 또는 [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]의 EBP의 반복 횟수의 총 수를 나타낸다. 예를 들어, EBPP[A1G4I1]6는 [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG] 의 단위가 6번 반복되어 이루어진 EBPP 블럭이며, 여기서 4번째 게스트 잔기 위치(Xaa)에서의 Ala, Gly 및 Ile의 비는 1:4:1이다. 마지막으로, EBPP와 다른 펩타이드의 다이블럭 폴리펩타이드는 EBPP[A1G4I1]6-HPC5와 같이 블럭들 사이 하이픈과 함께 꺽쇠 괄호들에서 각각의 블럭의 구성에 따라 명명된다.
실시예 3: 이음매가 없는 (seamless) 유전자 클로닝을 위한 변형된 pET-21a 벡터의 제조
pET-21a 벡터를 FastDigest buffer에서 37℃, 20분간 XbaI, BamHI 및 CIP 처리하고 탈인산화(dephosphorylation)했다. 제한효소 처리된 플라스미드 DNA를 PCR purification kit를 이용해 정제하며, 탈이온수로 용출했다. XbaI 및 BamHI의 스티키 말단을 포함하며 양립할 수 있는 두 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같이 고안되었다.
5′-ctagaaataattttgtttaactttaagaaggaggagtacatatgggctactgataatgatcttcag-3′(서열번호 19)
5′-gatcctgaagatcattatcagtagcccatatgtactcctccttcttaaagttaaacaaaattattt-3′(서열번호 20)
T4 DNA ligase 버퍼에서 두 올리고뉴클레오타이드를 95℃, 2분간 가열함으로써 어닐링(annealing)하고, 이후 상온에서 3시간동안 천천히 냉각시켰다. 어닐링된 이중가닥 DNA(dsDNA)와 선형화된 벡터를 T4 DNA ligase buffer에서 T4 DNA ligase 처리하고 37℃에서 30분동안 배양함으로써 pET-21a 벡터의 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)에 DNA 삽입유전자(insert)를 라이게이션(ligation)했다. 완벽한 클로닝과 발현을 위해 유전자 재조합 pET-21a (mpET-21a) 벡터를 Top10 컴피턴트 세포(competent cell)에 형질전환(transformation)했고, 이후 50 μg/ml의 앰피실린이 처리된 SOC(super optimal broth with catabolite repression) 플레이트에 도말했다. mpET-21a 벡터의 DNA 염기서열은 fluorescent dye terminator DNA sequencing (Applied Biosystems Automatic DNA Sequencer ABI 3730)에 의해 입증되었다.
실시예 4: EBP 유전자 단위체 합성 및 이의 올리고머화
4번째 잔기로서 Ala, Gly, 및 Ile가 1:4:1의 비율인 '펜타펩타이드 반복 유닛'인 Val-Pro-Ala -Xaa-Gly을 포함하는 EBPP 염기서열은 생리학적 온도보다 낮은 Tt를 최적화하기 위해 고안되었다. T4 DNA ligase buffer에서 EBPP[A1G4I1]1를 암호화하기 위한 올리고뉴클레오타이드 한 쌍을 95℃, 3분간 가열함으로써 어닐링(annealing)하고, 이후 상온에서 3시간 동안 천천히 냉각시켰다. mpET-21a 클로닝 벡터를 37℃에서 30분간 BseRI 및 CIP 처리하고 탈인산화했다. 제한효소 처리된 플라스미드 DNA를 PCR purification kit를 이용해 정제하며, 탈이온수로 용출했다. 어닐링된 dsDNA와 선형화된 mpET-21a 클로닝 벡터를 T4 DNA ligase buffer에서 T4 DNA ligase 처리하고 16℃에서 30분동안 배양함으로써 라이게이션했다. 라이게이션된 플라스미드를 Top10 화학적 컴피턴트 세포에 형질전환했고, 이후 50 μg/ml의 앰피실린이 처리된 SOC 플레이트에 도말했다. DNA 염기서열은 DNA 시퀀싱(DNA sequencing)을 통해 확인되었다. 반복 횟수가 6, 즉 EBPP[A1G4I1]6이 될 때까지 유전자를 제작했다.
4번째 잔기들이 서로 다른 몰비로 가변되는 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly를 갖는 EBP 서열을 DNA 레벨에서 설계하여 생리적 온도 미만으로 Tt를 최적화하였다. 다양한 펜타펩타이드 반복 단위들을 갖는 EBP들의 아미노산 서열을 표 1에 나타내었다.
[표 1] EBP 아미노산 서열
Figure 112020039948920-pat00001
실시예 5: PCR에 의해 클로닝 벡터에서 PEDF 34-mer 암호화 유전자의 제조
PEDF cDNA 단편 34-mer (130-231)는 인간 PEDF cDNA 절편으로부터 다음과 같은 프라이머와 함께 PCR에 의해 증폭되었다.
5'-AAAGGATCCCCCTACTGGTAATGCTCTTCAGTCTAGAGAT-3' (forward)(서열번호 21)
5'-CACGACCAACGGCTACTGATAGTGATCTTCAGCTAGCGAT-3' (reverse)(서열번호 22)
정방향 프라이머는 3'말단에 XbaI 제한효소 사이트가 있고, 역방향 프라이머는 5'말단에 NheI 제한효소 사이트가 있었다. 양 프라이머는 EBPP[A1G4I1]n를 포함하는 유전자의 매끄러운 클로닝을 위해 중간에 AcuI 제한효소 및 인식 사이트를 가지고 있었다. PEDF 34-mer의 증폭된 유전자 절편에 CutSmart 버퍼에서 37℃, 2시간동안 XbaI 및 NheI을 처리하여 삽입유전자를 제작했다. 처리 후, 생성물을 아가로스 젤에 전기영동하고, 삽입 유전자를 겔 추출 키트(gel extraction kit)를 사용하여 정제했다. pET-21a 클로닝 벡터에 37℃, 1시간동안 XbaI 및 CIP를 처리하고 탈인산화했다. 제한효소 처리된 DNA를 PCR purification kit를 사용하여 정제하고 탈이온수에 용출했다. 제한효소 처리된 PEDF 34-mer 유전자 절편과 선형화된 pET-21a 클로닝 벡터를 T4 DNA ligase buffer에서 T4 DNA ligase 처리하고 16℃에서 30분동안 배양함으로써 라이게이션했다. 라이게이션된 생성물을 Top10 화학적 컴피턴트 세포에 형질전환하고, 50 μg/mL의 앰피실린이 처리된 SOC 플레이트에 도말했다. 형질전환체는 초반에 진단적인 제한효소 처리에 의해 아가로스 젤 위에서 스크리닝되었으며, 상기 언급된 DNA 시퀀싱에 의해 추가로 확인되었다.
실시예 6: 클로닝 벡터에서 HPC(helix-based protein cage )암호화 유전자 제작
나선형 다발(페리틴 A, B, C, D)과 짧은 5번째 나선(페리틴 E) 사이에서 다른 펩타이드의 유전자들과 융합하기 위해 4개의 나선형 다발을 암호화하는 유전자와 5번째 나선을 암호화하는 유전자를 mPET-21a에 클로닝했다. 양 말단에 XbaI 및 BamHI 제한효소 사이트를 가진 4개의 나선형 다발을 암호화하는 유전자를 pUCIDT 벡터에 전달했다. 4개의 나선형 다발을 포함하는 플라스미드를 CutSmart buffer에서 37℃, 2시간 동안 10 U의 XbaI 및 10 U의 BamHI 처리하여 삽입유전자를 제작했다. 처리 후, 생성물을 아가로스 젤에 전기영동하고, 삽입 유전자를 겔 추출 키트를 사용하여 정제했다. 총 4 μg의 mpET-21a 클로닝 벡터에 제한효소 처리했으며, 15 U의 XbaI, 10 U의 BamHI 및 10 U의 FastAP 열민감성 알칼린 포스파테이즈(thermosensitive alkaline phosphatase)로 37℃, 1시간 동안 탈인산화했다. 플라스미드 DNA를 PCR purification kit를 사용하여 정제했으며, 40 μL의 증류수이자 탈이온수에 용출했다. 90 pmol의 4개의 나선형 다발 유전자 조각과 30pmol의 선형화된 mpET-21a 클로닝 벡터를 T4 DNA 버퍼에서 함께 1U의 T4 DNA ligase 처리하고 16℃, 30분 동안 배양함으로써 라이게이션했다. 라이게이션된 생성물을 Top10 컴피턴트 세포에 형질전환하고, 50 μg/mL의 앰피실린이 처리된 SOC 플레이트에 도말했다. 형질전환체는 초반에 진단적인 제한효소 처리에 의해 아가로스 젤 위에서 스크리닝되었으며, 상기 언급된 DNA 시퀀싱에 의해 추가로 확인되었다 GG-5' 및 3'-CC의 스티키 말단(sticky ends)을 가지는 5번째 나선을 암호화하는 57bp 크기의 유전자를 혼성화(hybridization)를 통해 제작했다. 5번째 나선을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드 한 쌍을 95℃, 3분동안 T4 DNA ligase buffer에서 50 μL의 2 μM 올리고뉴클레오타이드 농도로 가열하고, 이후 상온에서 3시간 이상 천천히 냉각했다. 총 4 μg의 mpET-21a 클로닝 벡터를 처리했고, 37℃, 30분동안 15 U의 BseRI 및 열민감성 알칼린 포스파테이즈(thermosensitive alkaline phosphatase)로서 10 U의 FastAP로 탈인산화했다. 플라스미드 DNA를 PCR purification kit를 사용하여 정제한 후 40 μL의 증류수이자 탈이온수로 용출했다. 90 pmol의 어닐링된 이중가닥 DNA(dsDNA)와 30pmol의 선형화된 mpET-21a 클로닝 벡터를 T4 DNA buffer에서 함께 1U의 T4 DNA ligase 처리하고 16℃, 30분동안 배양함으로써 라이게이션했다. 라이게이션된 플라스미드를 Top10 화학적 컴피턴트 세포에 형질전환했고, 이후 50 μg/mL의 앰피실린이 처리된 SOC plates에 도말했다. DNA 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다.
실시예 7: 항-Flt1-HPC4-EBP-PEDF 34-mer-HPC5 융합 단백질 케이지의 유전자 제작
VEGFR1의 안타고니스트(antagonist) 역할을 하는 항-Flt1 펩타이드를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드 한 쌍을 Cosmo Genetech (Seoul, Korea)에서 화학적으로 합성했고, AcuI 및 BseRI의 결합가능한 부분이 있는 올리고뉴클레오타이드 카세트(oligonucleotide cassette)가 되도록 어닐링했다. 매끄러운(seamless) 클로닝을 위해 항-Flt1 펩타이드를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드 카세트는 BseRI, XbaI, AcuI 및 BamHI 인식 부위 없이 합리적으로 고안되었다. BseRI, XbaI, AcuI 및 BamHI 인식부위를 가지는 EBPP[A1G4I1]6, PEDF 34-mer, HPC의 4개의 나선형 다발 조각 및 HPC의 5번째 나선 조각을 포함하는 각각의 플라스미드와 올리고뉴클레오타이드 카세트는 항-Flt1- 4개의 나선형 번들(HPC4)-EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer-EBPP[A1G4I1]6-5번째 나선(HPC5)의 융합 폴리펩타이드 라이브러리를 위한 유전자를 제작하기 위해 사용되었다. 융합 폴리펩타이드 라이브러리를 암호화하기 위해, 5번?? 나선을 암호화하는 플라스미드 벡터를 CutSmart buffer에서 37℃, 1시간동안 15 U의 BseRI를 처리했다. 제한효소 처리된 플라스미드 DNA를 PCR purification kit를 이용하여 정제하고, CutSmart buffer에서 37℃, 1시간 동안 열민감성 알칼린 포스파테이즈로서 10 U의 FastAP를 처리하여 탈인산화했다. 제한효소 처리되고 탈인산화된 플라스미드 DNA를 PCR purification kit를 사용하여 정제하고, 40 μL의 증류수이자 탈이온수로 용출했다. 삽입 유전자 제작을 위해 4 mg의 EBPP[A1G4I1]6 유전자에 CutSmart buffer 하에서 37℃, 1시간동안 10 U의 BseRI 및 15 U의 AcuI를 처리했다. 처리 후, 생성물을 아가로스 젤에 전기영동하고, 삽입 유전자를 gel extraction kit를 사용하여 정제했다. 90 pmol의 정제된 삽입 유전자와 30 pmol의 선형화된 벡터를 T4 DNA ligase buffer에서 1 U의 T4 DNA ligase 처리하여 16℃, 30분동안 배양함으로써 라이게이션했다. 라이게이션한 생성물을 Top10 화학적 컴피턴트 세포에 형질전환하고 50 μg/mL의 앰피실린이 처리된 SOC 플레이트에 도말했다. 형질전환체는 초반에 진단적인 제한효소 처리에 의해 아가로스 젤 위에서 스크리닝되었으며, DNA 시퀀싱에 의해 추가로 확인되었다. 삽입 DNA를 포함하는 플라스미드 벡터가 상기 방법을 통해 제작되었다. 삽입 유전자 제작을 위해, 상술한 바와 같이 PCR과 제한효소 처리를 통해 PEDF 34-mer를 제작했고, 항-Flt1 펩타이드를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드 카세트가 삽입유전자로서 사용되었다. 4개의 나선형 다발의 삽입 유전자는 EBPP[A1G4I1]6 삽입유전자와 함께 동일한 방법으로 제작되었다. 라이게이션은 상술한바와 같이 진행되었다.
실시예 8: EBPs와 융합 단백질 케이지의 유전자 발현 및 정제
EBPs 및 융합 단백질 케이지를 포함하는 각각의 벡터를 E. coli strain BL21(DE3) cells에 형질전환했고, 이후 50 μg/mL ampicillin가 처리된 CircleGrow media 50mL에 접종했다. 사전배양(preculture)은 진탕배양기(shaking incubator)에서 37℃에서 200rpm으로 밤새 이루어졌다. 이후, TB DRY media 50ml를 50 μg/mL ampicillin가 처리된 CircleGrow media 500 mL에 접종하고, 진탕배양기에서 37℃에서 200rpm으로 16시간동안 배양했다. 600 nm에서 흡광도(optical density) (OD600)가 1.0에 도달했을 때, 최종 1 mM이 되도록 IPTG를 첨가함으로써 폴리펩타이드의 과발현(over-expression)이 유도되었다. 세포들을 4500 rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리했다. 발현된 EBPs 및 그들의 블럭 폴리펩타이들은 상술한 바와 같이 ITC를 이용하여 정제했다. EBPs를 포함하는 세포 펠렛(cell pellet)을 30 mL의 PBS buffer에 재현탁하고, EBPs를 PBS 조건에서 정제했다. 융합 단백질 케이지를 포함하는 세포 펠렛을 3 M 요소가 첨가된 30 mL의 PBS에 재현탁하고, NPC의 나선형 구조를 변성시키기 위해 3 M 요소가 첨가된 PBS에 정제했다. 세포를 10초동안 초음파분해(sonication) (VC-505, Sonic and materials Inc, Danbury, CT) 후 20초 쉬면서 얼음수조(ice bath)에서 세포를 용해시켰다. 세포용해액을 50mL 원심분리 튜브에 담아 불용성의 잔해물을 침전시키기 위해 13000 rpm으로 4℃ 15분동안 원심분리했다. 용해된 EBPs를 포함하는 상청액을 새로운 50mL 원심분리 튜브에 담고, 핵산 오염물을 침전시키기 위해 PEI 0.5 % w/v, 13000 rpm으로 4℃, 15분동안 원심분리했다. EBPs의 역상전이(inverse phase transition)는 최종 농도 3 M이 되도록 NaCl을 첨가함으로써 유발되며, 응집된 EBPs는 용해액으로부터 13000 rpm으로 4℃에서 15분동안 원심분리함으로써 분리되었다. 응집된 EBPs를 차가운 버퍼에 재현탁하고, 응집된 단백질 오염물을 제거하기 위해 13000 rpm으로 4℃에서 15분동안 원심분리했다. 이러한 응집과 재현탁 과정은 EBP의 순도가 SDS-PAGE 로 결정했을 때 약 95%에 도달할 때까지 5-10번 반복되었다.
도 1은 항-Flt1 펩타이드, PEDF 34-mer 펩타이드, 및 EBPP[A1G4I1]1의 아미노산 서열, EBPP[A1G4I1]12-PEDF 34-mer 융합 폴리펩타이드의 블럭 디자인을 위한 전략, 융합 폴리펩타이드의 자가조립, 바이오이미징 및 바이오센싱을 위한 자가조립체 구조의 변형과, 자가조립 융합 단백질 케이지의 두 메커니즘에 따른 항-혈관신생 기능을 보여준다. HPC의 아미노산 서열(서열번호 1 및 2), 항-Flt1 펩타이드(서열번호 3), PEDF 34-mer 펩타이드(서열번호 4), EBPP[A1G4I1] (서열번호 6), 는 표 2 및 도 1(A)에 개시되어 있다.
[표 2]
Figure 112020039948920-pat00002
도 1(B)는 (a) 항-Flt1-HPC- EBPP[A1G4I1]12-PEDF 34-mer 융합 폴리펩타이드의 블럭 디자인 및 (b) 자가조립체 구조, 형광염료 콘쥬게이션에 의한 구조의 변형, 및 바이오이미징 및 바이오센싱을 위한 금 나노입자(AuNP)에 콘쥬게이션된 라만 염료의 합성을 위한 전략을 보여준다. HPC는 4개의 나선형 다발(이하, 'HPC4'로 표시함)과 상대적으로 짧은 나선(알파-헬릭스, 이하, 'HPC5'로 표시함)으로 구성되고 이것이 나노케이지로 자가조립되는데, N-말단과 4 번째와 5번째 나선 사이에 각각 노출 부위가 있다. 두 항-혈관신생 펩타이드(항-Flt1 펩타이드와 PEDF 34-mer 펩타이드)는 HPC의 각 노출 부위에 융합되었다. 항-Flt1 펩타이드는 HPC의 N-말단에 위치했으며, EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer-EBPP[A1G4I1]6는 4번??, 5번째 나선의 사이에 위치했다. EBP 블럭은 PEDF 34-mer 펩타이드를 효과적으로 노출하고 비크로마토그래피 방법으로 융합 폴리펩타이드를 정제하기 위해 도입되었다. 융합 단백질 케이지는 시스테인(cysteine)에서 티올-말레이미드(thiol-maleimide) 반응에 의해 형광 염료와 콘쥬게이션되었다. 표면증강 라만산란법(SERS) 기반 응용을 위해, AuNP는 HPC 구조 내부에 금 이온 축적 및 환원에 의해 합성되었다. AuNP 포함 구조체는 AuNP 표면에 라만 염료를 도입하기 위해 부분적으로 파괴되었고, 그들의 본래 구조를 회복했다. 항-혈관신생 기능을 위해, 융합 폴리펩타이드는 항-혈관신생을 위해 상이한 메커니즘을 가진 항-Flt1 펩타이드 및 PEDF 34-mer로 구성되었다(도 1(C)). 항-Flt1 펩타이드는 VEGFR1 (Flt1)에 결합함으로써 세포 내 혈관신생 신호를 저해하고, VEGF와 VEGFR1간의 상호작용을 방해했다. PEDF의 항-혈관신생 기능적인 영역인 PEDF 34-mer은 세포 내 항-혈관신생 신호를 유발했다. 항-Flt1 펩타이드 및 PEDF 34-mer에 따른 융합 단백질 케이지의 항-혈관신생 기능을 연구하기 위해, 4종류의 융합 폴리펩타이드, 항-Flt1 펩타이드 및 PEDF 34-mer가 없는 융합 폴리펩타이드, 항-Flt1 펩타이드 또는 PEDF 34-mer를 포함하는 융합 폴리펩타이드, 및 항-Flt1 펩타이드 및 PEDF 34-mer를 포함하는 융합 폴리펩타이드가 고안되었다.
실시예 9: EBPs 및 항-Flt1-HPC4-EBP-PEDF 34-mer-HPC5 융합 단백질 케이지의 특성화
EBPs 및 융합 단백질 케이지의 순도는 SDS-PAGE에 의해 결정되었다. PBS에서 25 μM의 EBPs 및 융합 단백질 케이지의 역상전이에 대한 온도의 효과는 10 ~ 85 ℃, 1℃/min 속도로 다중-셀 열전기 조절기(multi-cell thermoelectric temperature controller, Varian Instruments, Walnut Creek, CA)와 함께 Cary 100 Bio UV/Vis 스펙트로미터를 이용하여 OD350을 측정하여 확인하였다. 융합 단백질 케이지의 케이지 구조로의 자가조립 및 케이지 구조의 열 민감성은 온도 조절 Nano ZS90 (ZEN3690) 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) 장비(Malvern instruments, Worcestershire, UK)로 확인하였다. 25 μM의 PBS에서 그들의 유체역학적 반경(hydrodynamic radius, RH)은 25 μM의 PBS에서, 20 ~ 60 ℃의 온도, 1℃/min의 가열 속도로 각 온도마다 11회 측정되었다. 그들의 Tt는 상전이의 시작 온도로 규명되었으며, 각 DLS 플롯(plot)에 의해 계산되었다.
실시예 10: 융합 단백질 케이지를 이용한 HUVECs의 In vitro 튜브 형성 조사
융합 단백질 케이지를 사용하여 HUVECs의 체외에서(in vitro) 튜브 형성 조사(tube formation assay)는 내피세포의 성장(proliferation), 이동(migration) 및 튜브 형성에 대한 그들의 효과를 평가하기 위해 수행되었다. 48 웰 플레이트에 200 μL의 마트리겔을 코팅시키기 위해 37℃에서 30분 배양시켜 마트리겔을 굳혔다. 형광 표지를 위해 HUVECs를 37℃에서 15분간 0.5 μM calcein-AM에 배양했다. 내피세포의 성장, 이동 및 튜브 형성이 어떻게 자극되는지 측정하기 위해 4 Х 104 cells/well의 calcein-표지된 HUVECs가 마트리겔-코팅된 웰에 뿌려졌고, 37℃, 4시간 동안 상이한 농도로 50 ng/ml 인간 재조합 rhVEGF165 및 융합 단백질 케이지와 함께 배양되었다. HUVECs의 튜브 형성은 마이크로매니퓰레이터(micromanipulator, ZEISS, Oberkochen, Germany)하에 촬영되었으며, Image J lab 소프트웨어의 신혈관 생성 분석기로 웰마다 세 개의 임의 구역의 전체 튜브 길이를 측정함으로써 정량화했다. 그들의 튜브 형성은 세 번의 복제로 수행되었다.
실시예 11: 융합 단백질 케이지에 콘쥬게이션된 형광 염료를 이용한 HUVEC 이미징
융합 단백질 케이지는 체외에서(in vitro) 세포 이미징을 위해 알렉사 플루오르 488 C5 말레이미드로 표지되었다. 50 uM의 융합 단백질 케이지는 500 uM의 알렉사 플루오르 C5 말레이미드와 함께 상온에서 2시간동안 3 M 요소 및 10 mM DTT를 포함하는 0.01 M의 PBS에서 배양되었다. 남아있는 말레이미드 488 C5 말레이미드는 PBS에 대해 투석함으로써 제거되었다. 표지는 형광 스펙트럼(Ex: 480 ; Em: 500-550, Ex slit 10 nm; Em slit 5 nm) 및 형광 단백질로 염색없이 SDS-PAGE에서 특성화되었다. 4 Х 104 cells/well에서 HUVECs를 48 웰 플레이트에 뿌리고 밤새 배양했다. HUVEC는 50 ng/ml 인간 재조합 rhVEGF165 및 염료 콘쥬게이션된 융합 단백질 케이지와 함께 37℃에서 15, 30, 및 60분마다 상이한 농도로 배양되었다. HUVECs는 마이크로매니퓰레이터 (ZEISS, Oberkochen, Germany)의 명시야(bright field) 및 FITC의 형광에서 촬영되었다.
실시예 12: 융합 단백질 케이지의 케이지 구조에서 금 나노입자의 합성 및 금 나노입자에 콘쥬게이션된 라만 염료
25 uM 융합 단백질 케이지를 0.2 mM HAuCl4와 함께 3시간 동안 상온, 0.01 M PBS에서 배양하고, PBS로 2번 세척하여 표면에 글리세롤이 제거된 원심분리기로 결합되지 않은 HAuCl4를 제거했다. 금 시드(gold seed)에 1 mM NaBH4를 첨가하여 금 이온을 제거했다. 이 때 용액은 엷은 노랑(pare-yellow)이었다. 3시간동안 물 담금질(water quench) 후, 0.2 mM HAuCl4를 추가적으로 처리하고 1시간 동안 배양했다. 금 시드가 금 나노입자(AuNP)로 성장하도록 1 mM ascorbic acid를 첨가했다. 이 때 최종 용액은 루비색(ruby red)이었다. 단백질 케이지 내부에 합성된 나노입자는 350-900 nm에서 흡광도 및 TEM image를 측정함으로써 특성화되었다.
단백질 케이지 구조 내에서 금 나노입자(AuNP)에 콘쥬게이션된 라만 염료에 대해서, AuNP-단백질을 포함하는 0.01 M PBS 버퍼의 pH는 HCl을 첨가함에 따라 융합 단백질의 pI인 6.029보다 낮은 pH 6.0까지 감소했다. pH 6.0의 0.01M PBS 버퍼에 10 uM MGITC를 첨가했으며, 버퍼의 pH는 1시간 배양 후 NaOH를 첨가함에 따라 pH 7.4까지 증가했다. 라만 측정은 라만 스펙트로스코프(Renishaw 2000, Renishaw, UK)를 이용하여 수행되었다.
결과
항-Flt1-펩타이드, PEDF 34-mer, EBP로 구성되는 융합 단백질 케이지는 융합 단백질 케이지를 암호화하는 유전자 클로닝 및 IPTG 유도에 의한 융합 단백질 케이지의 과발현에 의해 제작되었다. 융합 단백질 케이지를 암호화하는 유전자는 EBPP[A1G4I1]6, PEDF 34-mer, HPC의 4개의 나선, 및 항-Flt1 펩타이드를 암호화하는 유전자를 HPC의 5번째 나선을 포함하는 플라스미드에 순차적으로 삽입함으로써 제작되었다. 각 유전자의 삽입은 XbaI 및 AcuI 제한효소 처리, 아가로스 젤 전기영동, 및 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 제작된 4종류의 융합 단백질 케이지를 암호화하는 유전자, (a) HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, (b) 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, (c) HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5, 및 (d) 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5는 도 2(A)에 도시되었다. 융합 단백질 케이지를 암호화하는 유전자는 XbaI 및 AcuI 처리되었고, 이러한 DNA 조각들의 길이는 아가로스 젤상에 각 유전자마다 표지되었다. (a) HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5-HPC5, (b) 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, (c) HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5, 및 (d) 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5를 암호화하는 각 유전자의 DNA 길이는 각각 1614, 1632, 1719, 및 1737 bp였다. XbaI 제한효소 사이트가 융합 단백질 케이지의 유전자 내에 존재하기 때문에, 아가로스 젤상 각 유전자에 표지된 DNA 조각들의 길이는 본래의 유전자보다 큰 37bp였다.
융합 단백질 케이지는 E. coli에서 발현되었고, 역전이 순환(ITC)에 의해 정제되었다. 정제된 융합 단백질 케이지의 순도 및 분자량은 단백질 밴드를 시각화하기 위해 구리로 염색된 SDS-PAGE에 의해 확인되었다(도 2(B)). (a) HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, (b) 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, (c) HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5, 및 (d) 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5의 예상되는 분자량은 하기 밴드에 제시되어 있고(48.6, 49.4, 52.4, and 53.1 kDa (왼쪽부터 오른쪽)) SDS-PAGE 겔의 가장 오른쪽 레인은 표준 단백질 사이즈 마커의 이동을 보여준다. 표준 단백질 사이즈 마커 및 이론적인 분자량과 비교하여, 융합 단백질 케이지의 이동은 단백질 표준 마커의 이동과 일치하지 않았다. 4종류의 융합 단백질 케이지는 이론적인 분자량보다 많이 이동했고, 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5는 HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5보다 더 높은 곳에 위치했다. SDS-PAGE에서 EBP가 이론적인 분자량보다 약 20% 더 많이 이동했다는 점은 이전에 보고된 바 있다(McPherson, D. T.; Xu, J.; Urry, D. W. Protein Expression Purif. 1996, 7 (1), 51-7.; Meyer, D. E.; Chilkoti, A. Biomacromolecules 2002, 3 (2), 357-367.; McDaniel, J. R.; MacKay, J. A.; Quiroz, F. G.; Chilkoti, A. Biomacromolecules 2010, 11 (4), 944-952.). 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5는 EBPP[A1G4I1]6 두 블럭을 가진 HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5보다 더 긴 EBP 블럭을 가졌기 때문에, 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5는 HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5보다 더 높은 곳에 위치했다.
융합 단백질 케이지의 열적 민감도는 온도가 증가함에 따라 폴리펩타이드 용액의 흡광도를 측정함으로써 상전이를 관찰하기 위해 특성화되었다. 혼탁도 프로파일(Turbidity profiles)은 1 ℃/min 속도로 가열하면서 10 mM PBS에서 25 μM 융합 단백질 케이지의 흡광도를 350nm에서 측정함으로써 작성되었다(Figure 3(A)). 상전이 온도 (Tt)는 도 3(A)에 도시된 각 열적 플롯(thermal plot)의 변곡점(inflection point)로 규명되었고, 표 3에 요약되었다.
[표 3]
Figure 112020039948920-pat00003
Tt에서의 혼탁도는 융합 단백질 케이지의 자가조립된 케이지 구조에 의한 것으로, Tt이상 온도에서 흡광도가 증가했다. HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5, 및 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5의 Tt는 각각 55.12, 52.24, 44.17, 및 44.37℃였다. 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5는 HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5의 Tt보다 2.85℃ 감소했다. 하지만, HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 및 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5의 Tt는 별다른 차이를 보이지 않았다. PEDF 34-mer를 포함하는 융합 단백질 케이지는 PEDF 34-mer를 포함하지 않는 융합 단백질 케이지보다 더 낮은 Tt를 가졌다. HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 및 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5는 HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5 및 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5의 Tt보다 각각 10.85℃ 및 7.90℃ 낮았다. HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 및 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5는 삼중블럭의 EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer-EBPP[A1G4I1]6를 가지며 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5는 단일블럭의 EBPP[A1G4I1]12를 가졌다. 심지어 융합 단백질 케이지의 EBP 길이가 동일하다고 하더라도, 삼중블럭의 EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer-EBPP[A1G4I1]6의 EBP 블럭 수가 단일블럭의 EBPP[A1G4I1]12보다 2배 많았다. EBP 블럭이 분할되고 PEDF 34-mer이 삽입됨에 따라 융합 폴리펩타이드의 Tt는 감소했다.
융합 단백질 케이지에 기반을 둔 HPC는 Tt보다 낮은 온도에서 케이지 구조로 자가조립되었고, Tt보다 높은 온도에서 응집되었다. 그들의 자가조립과 응집은 동적 광산란(DLS)에 의해 특성화되었다. 10 mM PBS에서 25 μM 융합 단백질 케이지의 유체역학적 반경(RH)은 25 ~ 60 ℃ 온도 범위에서, 1℃/min의 가열속도로 각 온도에서 11회 측정되었다. 그들의 Tt는 도 3(B)의 각 열적 플롯의 변곡점으로서 규명되었고, 표 2에 요약되었다. Tt보다 낮은 온도에서 HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5, HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5, 및 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5의 RH는 각각 20.97, 26.27, 42.90, 및 28.93 nm였다. 이전에 보고된 자가조립된 케이지 구조의 반경은 12 nm였다. 융합 단백질 케이지의 RH는 노출 부위의 EBP 때문에 HPC 케이지 구조의 보고된 크기보다 더 큰 것으로 나타났다. 가용성의 유니머(unimer) EBP의 크기는 약 10 nm로 보고되었다. 융합 단백질 케이지 구조의 측정된 RH는 20 nm보다 더 컸으며, 이는 가용성 EBP를 가진 자가조립된 케이지 구조의 예상되는 RH(16~ nm)와 일치한다. Tt 이상의 온도에서, 그들의 RH는 순간적으로 응집값(value of aggregation)인 1000nm 넘게 증가했다. 융합 단백질 케이지는 Tt보다 낮은 온도에서 자가조립되었고, Tt보다 높은 온도에서 응집되었다는 결과는 혼탁도 프로파일 결과와 일치한다.
융합 단백질 케이지의 항-혈관신생 기능은 체외에서(in vitro) HUVECs의 세포 이동 및 튜브 형성 조사에 의해 연구되었다. HUVECs의 세포 이동 및 튜브 형성 저해 효과를 연구하기 위해, calcein-표지된 HUVECs에 50 ng/ml의 인간 재조합 VEGF-165 (rhVEGF165)가 첨가된 마트리겔에서 융합 단백질 케이지를 상이한 농도로 4시간 동안 처리했다. 각 신생혈관 억제용 펩타이드(항-Flt1 펩타이드 및 PEDF 34-mer)와 농도와의 관계를 평가하기 위해, 0.01 nM, 0.1nM, 1 nM, 10 nM, 0.1 uM, 1 uM, 및 1 uM의 HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5가 제외된 융합 단백질 케이지를 HUVECs와 함께 배양했다. 대조군으로서, 신생혈관 억제용 펩타이드가 없는 HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5가 4종류의 농도(0.01 nM, 1 nM, 0.1 uM)로 HUVECs에 처리되었다. 각 조건에서 HUVECs의 튜브 형성 저해는 도 4(A)에 도시되었고, 각 융합 단백질 케이지의 정량화된 저해 효과는 도 4(A)의 형광 이미지에서 HUVECs의 튜브 길이로부터 계산된 도 4(B)에 도시되었다. 기타 처리 없는 배지에서 배양한 HUVECs의 튜브 길이를 0 %로 설정하고, 세포 이동 및 튜브 형성을 유발하기 위해 rhVEGF165를 처리한 HUVECs의 튜브 길이를 100%로 설정하여, 각 농도에서의 튜브 길이를 정상화했다.
HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5를 처리한 HUVECs는 HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5의 농도에 상관없이, rhVEGF165와 배양한 HUVECs와 튜브 길이가 유사하다는 결과를 보였다. 이는 HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5가 HUVECs의 튜브 형성에 대해서 아무런 효과가 없다는 점을 의미한다. HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5를 제외하고, 다른 세 융합 단백질 케이지는 다양한 범위의 농도에서 저해효과를 보였다. 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5와 함께 배양한 HUVECs의 튜브 형성은 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5의 농도가 100 nM - 1 uM 범위로 증가함에 따라 감소했다. HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5는 항-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5가 HUVECs 튜브 형성에 대해 아무런 효과가 없는 0.01 nM-0.1nM 농도 범위에서 HUVECs의 튜브 형성을 저해했다. 1 nM 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5를 처리한 HUVECs는 가장 낮은 튜브 형성을 보였고, 그들의 튜브 형성은 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5의 농도가 0.01 nM - 1 nM로 증가함에 따라 감소했다. 항 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5는 본 발명에서 대부분의 넓은 범위의 농도에서 효과적으로 HUVECs 튜브 형성을 저해했다. 융합 단백질 케이지의 농도가 효과적인 농도 범위보다 더 높은 경우, PEDF 34-mer 펩타이드를 포함하는 융합 단백질 케이지를 처리한 HUVECs는 rhVEGF165와 함께 배양한 HUVECs와 비슷한 튜브 형성 정도를 보였다. 이전 보고에서는, PEDF 34-mer 펩타이드는 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 및 혈관내피 성장인자(VEGF)의 형질전환을 저해하기 위한 NFAT (nuclear factor of activated T cells)의 불활성화와 JNK (c-jun N-terminal kinase)의 활성화를 통한 내생적인 카스페이즈 저해제(endogenous caspase inhibitor) 및 c-FLIP (FLICE-like inhibitory protein)의 발현을 방해함으로써 신생혈관 억제를 유발했다. 한편, JNK는 내피세포(endothelial cell, EC)에서 혈관 신생의 양성조절자(positive regulator)로 보고되었다. JNK의 저해는 3D 모세관 스프라우트 배양(3D capillary sprout culture)에서 EC의 스프라우트 성장(sprout growth)를 희석시켰고, EC의 세포 성장 및 이동을 축소시켰으며, 세포 성장 및 이동에 관여하는 유전자 조절자인 전사인자 Egr-1의 단백질 수준을 감소시켰다. 이러한 보고는 HUVECs 튜브 형성 조사에서 PEDF 34-mer를 포함하는 융합 단백질 케이지가 보다 높은 농도에서 효과가 없는 이유에 대한 설명을 제공한다.
가장 효과적인 항-혈관신생 기능을 보인 항 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5는 이미징 프로브(imaging probe)로서 형광 염료와 콘쥬게이션되었다. 말레이미드 개질화된 형광염료는 HPC에서 티올에 콘쥬게이션되었고, 폴리펩타이드에 대한 형광 염료의 콘쥬게이션은 SDS-PAGE에 의해 질적으로 확인되었고, 도 5(A)에 도시되었다. 형광 염료가 콘쥬게이션된 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5는 SDS-PAGE에서 젤 염색 없이 UV 광선 노출에 의해 시각화되었다. 도 5(A)(b)에서 UV light 하 염료-콘쥬게이션된 폴리펩타이드의 위치를 명시야에서 마커와 비교했으며, 그 위치는 구리 염색한 SDS-PAGE 겔상에서 염료-콘쥬게이션 전인 융합 폴리펩타이드(도 5(A)(a))와 일치했다. 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5에 대한 염료 콘쥬게이션은 형광 스펙트럼에 의해 확인되었는데, 형광 염료-콘쥬게이션된 융합 단백질 케이지는 형광 스펙트럼을 보인 반면, 콘쥬게이션 전인 융합 단백질 케이지는 아무런 형광 신호를 보이지 않았다(도 5(B)). HUVEC은 45-웰 플레이트에 뿌려지고, 표면에 부착되어 밤새 배양되었다. HUVEC은 1uM 또는 10 uM 염료-콘쥬게이션된 폴리펩타이드와 함께 15, 30, 및 60분동안 배양되었다. 도 5(C)는 염료-콘쥬게이션된 폴리펩타이드가 처리된 HUVEC의 형광 이미지 및 명시야의 병합된 이미지를 보여준다. HUVECs의 모양은 염료-콘쥬게이션된 폴리펩타이드의 농도 및 배양시간이 길어질수록 둥글어지며, 둥근 세포는 형광 신호를 나타낸다. 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5의 항-Flt1펩타이드는 HUVEC 막에서 VEGFR1 (Flt1)에 결합되며, VEGF가 VEGFR1에 결합하는 것을 방해하여 세포 내 혈관신생 신호를 저해한다. VEGFR1에 의해 유발되는 세포 내 혈관신생 신호 중 하나는 PI-3K (phosphatidylinositol 3-kinase) 경로로, 라멜리도피아(lamellipodia) 돌출(protrude) 및 세포 신장을 위해 액틴-조절 단백질(actin-regulating protein)을 조정함으로써 세포 이동동안 내피세포의 운동성(motility)을 조절한다. 도 5(C)에 도시된 HUVEC의 형광 이미지에서, 고농도의 염료-콘쥬게이션된 폴리펩타이가 장시간 처리된 HUVEC는 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5의 항-Flt1와 더 많이 상호작용했고, HUVECs은 둥글어져 형광 신호를 나타냈다.
세포 이미징 프로브(cell imaging probe)로서 융합 폴리펩타이드의 응용은 형광 HUVEC 이미지를 통해 연구되었다. 융합 폴리펩타이드의 다른 응용으로는 케이지 구조 내부에서 금 나노입자(AuNP)를 합성하여 라만 센싱(Raman sensing)을 위해 라만 염료에 도입하는 것이다. 융합 단백질 케이지의 HPC는 금 이온을 포함하는 무기 이온 결합 부위를 가졌다. 가장 효과적으로 혈관신생을 저해하여 세포 이미징 프로브로서 잠재력이 있는 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5는 HPC에 배위결합되기 위해 금 이온과 배양되었다. HPC에 배위결합된 금 이온은 환원제에 의해 금 시드로 환원되었고, 금 시드는 금 이온과 환원제의 첨가에 따라 금 나노입자로 성장했다. 도 6(A)는 (a) 금 이온과 배양되기 전, (b) 금 이온 첨가 및 첫번째 환원 후, 및 (c) 두번째 환원 후 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5의 크기를 보여준다. 각 단계에서 UV-VIS 흡광도는 도 6(B)에 도시되어 있다. 배위결합된 금 이온은 환원되고, HPC 내부에 시드를 형성했으며, 시드는 빈 구멍이 채워질 때까지 성장했다. 융합 단백질 케이지의 크기는 도 6(A)에 도시된 바와 같이 AuNP 합성동안 일정했다. AuNP의 합성은 흡광 스펙트럼에 의해 입증되었으며, 두번째 환원 이후 오직 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5만이 AuNP로부터 520 nm에서 흡광도를 보였다(도 6(B)). 도 6(C)는 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 내부에서 AuNP의 TEM 이미지를 도시했다. AuNP의 크기는 약 10 nm로, 보고된 HPC의 내부 구멍의 반경과 일치했다. AuNP- 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 복합체를 라만 프로브(Raman probe)로서 평가하기 위해, 라만 염료인 MGITC (Malachite Green isothiocyanate)를 HPC의 pH 반응성을 이용하여 AuNP 표면에 도입했다. HPC는 가역적인 pH 반응성을 가져 산성 조건에서 구조가 붕괴되고, 자연 pH에서 본래 구조로 회복된다. AuNP- 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5복합체의 HPC는 AuNP 표면에 MGITC를 도입하기 위해 pH를 6으로 감소시킴에 따라 느슨해졌고, pH 7.4로 적응시킴에 따라 구조를 회복했다. 10 nM MGITC와 배양된 AuNP- 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 복합체는 도 6(D)에서 의미 있는 라만 스펙트럼을 보여줬다. 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 의 세포 이미징 및 라만 프로브로서의 잠재력은 상기 HUVEC 이미징 및 라만 스펙트럼을 통해 증명되었다.
다가성 이중 신생혈관 억제용 펩타이드를 가진 융합 단백질 케이지인 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 는 케이지 구조로 자가조립하는 것을 방해하지 않으면서 항-혈관신생 펩타이드인 항-Flt1 펩타이드 및 PEDF 34-mer를 노출시키기 위해 유전적 수준에서 정확히 통제되었다. 두 종류의 항-혈관신생 펩타이드인 항-Flt1 펩타이드 및 PEDF 34-mer는 신생혈관 억제를 위한 상이한 메커니즘을 가졌으며, 이는 세포 내 신호와 연관되어 있었다. 항-Flt1-펩타이드는 혈관신생을 위한 세포 내 신호를 저해했고, PEDF 34-mer는 항-혈관신생 신호를 유발했다. 이러한 상이한 메커니즘은 체외(in vitro) 튜브 형성 조사에서 융합 단백질 케이지의 투여량(dose)에 영향을 미쳤다. HUVECs의 체외 튜브 형성 조사에서, 융합 단백질 케이지는 폴리펩타이드의 농도가 항-혈관신생 펩타이드의 종류에 따라 증가함에 따라 점진적으로 HUVECs의 튜브 형성을 감소시켰다. 항-Flt1 펩타이드를 가진 융합 단백질 케이지는 uM 범위에서 항-혈관신생 효과를 보인 반면, PEDF 34-mer를 가진 융합 단백질 케이지는 nM 범위에서 HUVEC의 튜브 형성을 저해했다. 두 항-혈관신생 펩타이드를 포함하는 융합 단백질 케이지인 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 는 대부분의 넓은 농도 범위에서 가장 큰 저해효과를 보였다. 형광 염료-콘쥬게이션된 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 는 HUVEC 이미징에 의해 조사된 세포 신장(cell extension) 저해에 대해서 세포 이미징 프로브(cell imaging probe)로서의 능력을 보였다. AuNP- 항-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 는 AuNP 표면에 MGITC를 도입함으로써 라만 스펙트럼(Raman spectra)을 제안했다. 본 발명에 따른 두 상이한 항-혈관신생 펩타이드 및 HPC를 포함하는 융합 단백질 케이지는 항-혈관신생을 위한 치료용 펩타이드이자, 항-혈관신생 관련 질환의 과정을 추적하는 데 엄청난 잠재력이 있다.
자가조립 단백질 나노구조체(self-assembled protein nanostructures)는 테라노스틱스 및 나노메디슨에 이용하기 위해 기능적인 펩타이드와의 융합에 의해 연구되어 왔다. 본 발명에서는 혈관내피 성장인자 수용체 타겟팅 펩타이드(vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) targeting peptide), 혈관생성억제용 상피유래인자 34-mer 펩타이드(functional 34-mer peptide of pigment epithelial-derived factor, PEDF), 온도 반응성을 가지는 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide, EBP), 및 헬릭스 기반 단백질 케이지(helix-based protein cage, HPC)로 구성된 융합 폴리펩타이드를 유전공학적으로 제조한 후, E. coli에서 과발현하고, 비크로마토그래피 방법의 일환으로서 역전이 순환(inverse transition cycling, ITC)로 정제하였다. VEGFR 타겟팅 펩타이드 및 신혈관 생성 억제능(anti-angiogenic)이 있는 PEDF 34-mer 펩타이드는 자가조립된 단백질 케이지에 노출되었으며, EBPs는 비크로마토그래피 정제 태그로서 도입되었다. 다가성 이중 신생혈관 억제용 펩타이드를 가진 융합 단백질 케이지의 물리화학적 성질과 DySA (Dynamic self-assembly)가 특성화되었다. 융합 단백질 케이지는 마트리겔(matrigel)에서 세포 이동과 인간 탯줄 정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)의 튜브 형성을 저해했으며, 이는 신생혈관 억제를 위한 나노단위 바이오 의약품으로서의 가능성을 보여주었다. 융합 단백질 케이지는 신생혈관 억제 효과를 가지므로, 형광 염료를 단백질 케이지 또는 금속 나노입자(metallic nanoparticles, MNPs)에 화학적으로 콘쥬게이션(conjugation)함으로써 융합 단백질 케이지가 형광 나노프로브(fluorescent nanoprobes) 또는 무기-유기 하이브리드 표면증강 라만산란법 나노프로브(inorganic-organic hybrid SERS nanoprobes)로 제조되었다. 예를 들어 금, 은, 구리, 및 철 나노입자가 라만 염료(Raman dye)와 화학적으로 콘쥬게이션되어 테라노스틱스 및 나노메디슨 응용을 위해 표지하는데 활용될 수 있다. 본 발명은 다가성 이중 신생혈관 억제용 펩타이드를 가진 융합 단백질 케이지가, 통제되지 않는 망막, 각막, 및 맥락막 신생혈관 질환, 종양 성장, 암세포 전이, 당뇨병성 망막증, 및 천식의 치료제이자 동시에 그들의 성장에 대한 바이오이미징 및 바이오센싱으로서 테라노스틱스 및 나노메디슨 분야에 이용될수 있다는 것을 보여준다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> Anti-angiogenic fusion polypeptides, fusion protein cages with multivalent dual anti-angiogenic peptides, and their theranostics applications <130> DHP19-253P <150> KR 19/0045484 <151> 2019-04-18 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 156 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> helix-based protein cage <400> 1 Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala Val 1 5 10 15 Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser 20 25 30 Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Ser 35 40 45 His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg 50 55 60 Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp 65 70 75 80 Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met 85 90 95 Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp 100 105 110 Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp Phe 115 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Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 260 265 270 Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 275 280 285 Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly 290 295 300 Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly 305 310 315 320 Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 325 330 335 Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 340 345 350 Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 355 360 <210> 15 <211> 534 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5 <400> 15 Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala Val 1 5 10 15 Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser 20 25 30 Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Ser 35 40 45 His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg 50 55 60 Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp 65 70 75 80 Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met 85 90 95 Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp 100 105 110 Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp Phe 115 120 125 Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met 130 135 140 Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Val Pro Ala Gly 145 150 155 160 Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly 165 170 175 Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 180 185 190 Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 195 200 205 Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 210 215 220 Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile 225 230 235 240 Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly 245 250 255 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val 260 265 270 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro 275 280 285 Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala 290 295 300 Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly 305 310 315 320 Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 325 330 335 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 340 345 350 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 355 360 365 Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 370 375 380 Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly 385 390 395 400 Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly 405 410 415 Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 420 425 430 Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 435 440 445 Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 450 455 460 Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile 465 470 475 480 Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly 485 490 495 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val 500 505 510 Pro Ala Gly Gly Pro Glu Ala Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg 515 520 525 Leu Thr Leu Lys His Asp 530 <210> 16 <211> 540 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Flt1-HPC4-EBPP[A1G4I1]12-HPC5 <400> 16 Gly Asn Gln Trp Phe Ile Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr 1 5 10 15 Asp Val Glu Ala Ala Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala 20 25 30 Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val 35 40 45 Ala Leu Glu Gly Val Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys 50 55 60 Arg Glu Gly Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly 65 70 75 80 Arg Ala Leu Phe Gln Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly 85 90 95 Lys Thr Pro Asp Ala Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu 100 105 110 Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp 115 120 125 Pro His Leu Cys Asp Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val 130 135 140 Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu 145 150 155 160 Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly 165 170 175 Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 180 185 190 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 195 200 205 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 210 215 220 Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 225 230 235 240 Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly 245 250 255 Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly 260 265 270 Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 275 280 285 Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 290 295 300 Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 305 310 315 320 Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile 325 330 335 Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly 340 345 350 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val 355 360 365 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro 370 375 380 Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala 385 390 395 400 Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly 405 410 415 Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 420 425 430 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 435 440 445 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 450 455 460 Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 465 470 475 480 Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly 485 490 495 Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly 500 505 510 Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Pro Glu Ala Gly Leu Gly 515 520 525 Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp 530 535 540 <210> 17 <211> 568 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 <400> 17 Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala Val 1 5 10 15 Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser 20 25 30 Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Ser 35 40 45 His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg 50 55 60 Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln Asp 65 70 75 80 Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met 85 90 95 Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp 100 105 110 Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp Phe 115 120 125 Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met 130 135 140 Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Val Pro Ala Gly 145 150 155 160 Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly 165 170 175 Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 180 185 190 Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 195 200 205 Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 210 215 220 Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile 225 230 235 240 Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly 245 250 255 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val 260 265 270 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro 275 280 285 Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala 290 295 300 Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly 305 310 315 320 Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 325 330 335 Asp Pro Phe Phe Lys Val Pro Val Asn Lys Leu Ala Ala Ala Val Ser 340 345 350 Asn Phe Gly Tyr Asp Leu Tyr Arg Val Arg Ser Ser Thr Ser Pro Thr 355 360 365 Thr Asn Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly 370 375 380 Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 385 390 395 400 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 405 410 415 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 420 425 430 Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 435 440 445 Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly 450 455 460 Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly 465 470 475 480 Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 485 490 495 Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 500 505 510 Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 515 520 525 Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile 530 535 540 Gly Val Pro Ala Gly Gly Pro Glu Ala Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe 545 550 555 560 Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp 565 <210> 18 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-Flt1-HPC4- EBPP[A1G4I1]6-PEDF 34-mer- EBPP[A1G4I1]6-HPC5 <400> 18 Gly Asn Gln Trp Phe Ile Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr 1 5 10 15 Asp Val Glu Ala Ala Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala 20 25 30 Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val 35 40 45 Ala Leu Glu Gly Val Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys 50 55 60 Arg Glu Gly Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly 65 70 75 80 Arg Ala Leu Phe Gln Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly 85 90 95 Lys Thr Pro Asp Ala Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu 100 105 110 Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp 115 120 125 Pro His Leu Cys Asp Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val 130 135 140 Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu 145 150 155 160 Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly 165 170 175 Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 180 185 190 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 195 200 205 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 210 215 220 Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 225 230 235 240 Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly 245 250 255 Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly 260 265 270 Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 275 280 285 Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 290 295 300 Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 305 310 315 320 Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile 325 330 335 Gly Val Pro Ala Gly Gly Asp Pro Phe Phe Lys Val Pro Val Asn Lys 340 345 350 Leu Ala Ala Ala Val Ser Asn Phe Gly Tyr Asp Leu Tyr Arg Val Arg 355 360 365 Ser Ser Thr Ser Pro Thr Thr Asn Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 370 375 380 Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile 385 390 395 400 Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly 405 410 415 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val 420 425 430 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro 435 440 445 Ala Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala 450 455 460 Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly 465 470 475 480 Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 485 490 495 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 500 505 510 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro 515 520 525 Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala 530 535 540 Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly Pro Glu Ala Gly 545 550 555 560 Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp 565 570 <210> 19 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 19 ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gaggagtaca tatgggctac tgataatgat 60 cttcag 66 <210> 20 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 20 gatcctgaag atcattatca gtagcccata tgtactcctc cttcttaaag ttaaacaaaa 60 ttattt 66 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 21 aaaggatccc cctactggta atgctcttca gtctagagat 40 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 22 cacgaccaac ggctactgat agtgatcttc agctagcgat 40

Claims (14)

  1. i) 항-혈관신생 펩타이드; 상기 펩타이드에 연결되는 서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드; 상기 헬릭스 기반 펩타이드에 연결되는 친수성인 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(친수성 EBP); 상기 친수성 EBP에 연결되는 서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드로 구성되거나,
    ii) 서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드; 상기 펩타이드에 연결되는 친수성 EBP; 상기 제1 친수성 EBP에 연결되는 항-혈관신생 펩타이드; 상기 항-혈관신생 펩타이드에 연결되는 제2친수성 EBP; 및 상기 친수성 EBP에 연결되는 서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드로 구성되거나, 또는
    iii) 항-혈관신생 펩타이드; 상기 펩타이드에 연결되는 서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드; 상기 헬릭스 기반 폴리펩타이드에 연결되는 친수성 EBP; 상기 친수성 EBP에 연결되는 항-혈관신생 펩타이드; 상기 항-혈관신생 펩타이드에 연결되는 친수성 EBP; 및 상기 친수성 EBP에 연결되는 서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드로 구성되는 것인, 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드로,
    상기 항-혈관신생 펩타이드는 서열번호 3의 항-Flt1 펩타이드 또는 서열번호 4의 PEDF(pigment epithelial-derived factor) 34-mer 인, 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 친수성 EBP는,
    서열번호 5 내지 14 중 하나로 표시되는 것인, 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 i)은 [서열번호 3의 항-Flt1 펩타이드]-[서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]-[친수성 EBP]-[서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]로 구성되는 것인, 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 ii)은 [서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]-[친수성 EBP]-[서열번호 4의 PEDF 34-mer]-[친수성 EBP]-[서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]로 구성되는 것인, 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 iii)은
    [서열번호 3의 항-Flt1 펩타이드]-[서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]-[친수성 EBP]-[서열번호 4의 PEDF 34-mer]-[친수성 EBP]-[서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드]로 구성되는 것인, 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 i)은 서열번호 16, 상기 ii)는 서열번호 17, 그리고 상기 iii)은 서열번호 18로 표시되는 것인, 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드.
  8. 제1항, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드를 포함하는 신혈관 생성에 기인한 질환의 치료용 조성물로,
    상기 신혈관 생성에 기인한 질환은, 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 황반부변성증, 맥락막 신생혈관생성증, 신생혈관성 녹내장, 각막혈관신생에 의한 안구질환, 각막 이식 시의 거부반응, 각막 부종, 각막 혼탁, 암(cancer), 혈관종, 혈관섬유종, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 및 건선 중에서 선택된 어느 하나 이상인 신혈관 생성에 기인한 질환의 치료용 조성물.
  9. 삭제
  10. 제1항, 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드에서, 서열번호 1로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드와 서열번호 2로 표시되는 헬릭스 기반 폴리펩타이드가 자가조립함으로써 제조되는 것인, 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 가진 융합 단백질 나노케이지.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 나노케이지는 다가(multivalent)의 신혈관 생성 억제용 융합 폴리펩타이드를 가지는 것을 특징으로 하는, 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 가진 융합 단백질 나노케이지.
  12. 형광 염료; 및
    제10항에 따른 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 가진 융합 단백질 나노케이지;를
    포함하여 이루어지고,
    상기 형광 염료는 상기 나노케이지 안에 들어 있는 것인, 신혈관 생성에 기인한 질환을 위한 테라노스틱스 나노프로브(theranostic nanoprobe)로서,
    상기 신혈관 생성에 기인한 질환은, 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 황반부변성증, 맥락막 신생혈관생성증, 신생혈관성 녹내장, 각막혈관신생에 의한 안구질환, 각막 이식 시의 거부반응, 각막 부종, 각막 혼탁, 암(cancer), 혈관종, 혈관섬유종, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 및 건선 중에서 선택된 어느 하나 이상인 테라노스틱스 나노프로브.
  13. 라만 염료가 결합된 금속 나노입자; 및
    제10항에 따른 신혈관 생성 억제용 펩타이드를 가진 융합 단백질 나노케이지;를
    포함하여 이루어지고,
    상기 라만 염료가 결합된 금속 나노입자는 상기 나노케이지 안에 들어 있는 것인, 신혈관 생성에 기인한 질환을 위한 테라노스틱스 나노프로브로,
    상기 신혈관 생성에 기인한 질환은, 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 황반부변성증, 맥락막 신생혈관생성증, 신생혈관성 녹내장, 각막혈관신생에 의한 안구질환, 각막 이식 시의 거부반응, 각막 부종, 각막 혼탁, 암(cancer), 혈관종, 혈관섬유종, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 및 건선 중에서 선택된 어느 하나 이상인 테라노스틱스 나노프로브.
  14. 삭제
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