BR112012013662B1 - Muteínas de lipocalina associada à gelatinase de neutrófilo humano (lcn2, hngal), seu uso e seus métodos de geração e produção, molécula de ácido nucleico, célula hospedeira, composição farmacêutica e kit de diagnóstico ou analítico - Google Patents

Abstract

MUTEÍNAS DE LIPOCALINA 2 HUMANA (Lcn2, hNGAL), SEU USO E MÉTODOS DE PRODUÇÃO E GERAÇÃO, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO E KIT. A presente invenção refere-se a uma nova biblioteca para a geração de muteínas e às novas muteínas derivadas e lipocalina 2 humana (Lcn2, hNGAL) e proteínas relacionadas que ligam a um alvo dado com afinidade detectável. A invenção também diz respeito às moléculas de ácido nucleico correspondentes codificando uma tal muteína e a um método para sua geração. A invenção ainda diz respeito a um método para produzir uma tal muteína. Por exemplo, tais muteínas podem servir para ligar e realizar a depleção as formas patológicas de biomoléculas naturais tais como o peptídeo beta amiloide na doença de Alzheimer ou podem visar o domínio extra de fibronectina B que está associado com a neovasculatura do tumor.

Description

SUMÁRIO

[001] A presente invenção diz respeito a uma biblioteca nova para a geração de muteínas e às novas muteínas derivadas de lipocalina 2 humana (Lcn2, hNGAL) e proteínas relacionadas que ligam a um alvo dado com afinidade detectável. A invenção também diz respeito às moléculas de ácido nucleico correspondentes codificando uma tal muteína e a um método para sua geração. A invenção ainda diz respeito a um método para produzir uma tal muteína. Além disso, a invenção é direcionada a uma composição farmacêutica compreendendo uma tal muteína de lipocalina como também aos vários usos da muteína.

[002] Muteínas de Lcn2 de acordo com esta invenção apresentam potencial como reagentes terapêuticos e/ou de diagnóstico em várias áreas de doença. Por exemplo, elas podem servir para ligar e realizar a depleção das formas patológicas de biomoléculas naturais tais como o peptídeo beta amiloide na doença de Alzheimer. Elas podem ser empregadas para o direcionamento específico de várias marcações ou toxinas para marcadores de superfície celular relacionados à doença tais como o domínio extra de fibronectina B que é em outro exemplo associado com a neovasculatura do tumor. Devido aos benefícios particulares das muteínas de Lcn2 de acordo com as que podem ser geradas esta invenção várias outras aplicações ou exemplos são possíveis.

ANTECEDENTES

[003] Doença de Alzheimer (AD) é a forma mais comum de demência na população anciã. Associado com AD é o processamento defeituoso da proteína de precursor amiloide que dá origem a 40-42 resíduos potencialmente neurotóxicos que abrangem o peptídeo beta amiloide (Aβ). Agregação subsequente de Aβ aos oligômeros e fibrilas longas representa um papel pivotante no curso da doença, culminando na formação de placas senis (Haass e Selkoe (2007) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112). Apesar da significação crescente de AD ainda há uma necessidade não satisfeita por terapias efetivas para impedir, curar ou desacelerar esta demência.

[004] As abordagens antiamiloides atuais visam a (i) a prevenção da formação de Aβ, (ii) bloqueio de sua agregação, (iii) redução dos níveis de Aβ solúveis no cérebro, e (iv) separação das placas amiloides existentes. Até agora, as imunoterapias, compreendendo imunização ativa e passiva dos pacientes de AD, têm sido muito promissoras neste campo (Dodel et al. (2003) Lancet Neurology 2, 215-220; Lichtlen e Mohajeri (2007) J. Neurochem. 104, 859-874; Brody e Holtzmann (2008) Annu. Rev. Neurosci. 31, 175-193). Porém, experimentações clínicas recentes com imunização ativa de pacientes de AD foram cessadas devido à incidência de meningoencefalite em 6% dos pacientes. Devido a estes efeitos colaterais adversos potenciais das funções imunológicas mediadas por Fc, reagentes não ligantes de Ig, tais como Anticalinas, fornecem uma alternativa. A identificação de uma molécula de Affibody com especificidade para beta amiloide é um exemplo para ilustrar o potencial das proteínas não ligantes de Ig engenheiradas (Gronwall et al (2007) J. Biotechnol. 128, 162-183; Hoyer et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 5099-5104).

[005] Porém, a origem bacteriana de Affibodies pode causar problemas com a imunogenicidade em pacientes humanos.

[006] Fibronectina (FN) representa um papel essencial na adesão, migração, proliferação, e diferenciação das células. FN é uma glicoproteína grande, modular, dimérica que compreende múltiplos domínios do tipo I, II e III. Variantes de splice alternativas de FN, tais como seu domínio B extra (ED-B) que é incorporado entre os domínios FNIII7 e FNIII8, são expressas de uma maneira dependentes do estágio de desenvolvimento, específicas ao tecido (Zardi et al. (1987) EMBO J 6, 2337-2342).

[007] O ED-B é ausente de tecido adulto normal exceto durante a cura da ferida e vascularização neoplástica. Por conseguinte, ED-B contendo fibronectina é expresso abundantemente em muitos tipos de tumor diferentes que atraem a neovascularização e sofrem angiogênese aberrante. Embora a função biológica atual do ED-B em angiogênese permaneça evasiva, sua incorporação na FN serve como excelente marcador para tumorigênese. Em geral, a discriminação entre os tecidos malignos e os órgãos saudáveis é uma estratégia terapêutica vantajosa visto que o direcionamento seletivo dos fármacos diretamente para o tecido tumoral leva a uma concentração aumentada de fármaco local.

[008] A fim de especificamente detectar e visar o ED-B, fragmentos de anticorpos recombinantes foram suscitados usando tecnologia de anticorpo de exibição de fago. Um dos fragmentos de anticorpos isolados é o Fv de cadeia simples de L19 (Carnemolla et al. (1996) Int. J. Cancer 68, 397-405; Ebbinghaus et al. (2004) Curr. Pharm. Des. 10, 1537-1549). Alcançando-se o ED-B por L19 em combinação com um agente citotóxico efetivo correntemente mostra perspectivas para terapia e diagnósticos de câncer (Schliemann e Neri (2007) Biochim. Biophys. Acta 1776, 175-192; Kaspar et al. (2006) Int. J. Cancer 118, 1331-1339).

[009] Porém, o fragmento de scFv de L19 é propenso à oligomerização.

[010] Devido aos problemas existentes acima no tratamento de doença de Alzheimer e na diagnose ou terapia de tumores, é um objetivo da presente invenção fornecer métodos e compostos alternativos que possam ser usados no tratamento da doença de Alzheimer e na diagnose ou terapia de tumores.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[011] Os inventores observaram que muteínas específicas das proteínas derivadas de Lipocalina 2 são compostos atrativos devido à sua maior estabilidade e tamanho ainda menor. Os inventores identificaram um grupo específico de muteínas de Lipocalina 2 com mutações nas posições específicas que mostram afinidade alta e especificidade, por exemplo, para ED-B. Tais muteínas de Lcn2 especificamente reconhecem ED-B contendo fibronectina em células humanas com sensibilidade alta e, desse modo, mostram perspectivas como reagentes terapêuticos para a diagnose e tratamento de doenças tumorais.

[012] Os inventores foram também capazes de identificar muteínas de Lcn2 específicas com afinidade alta e especificidade para o peptídeo Aβ. Tais muteínas de Lcn2 podem até mesmo inibir a agregação de Aβ e, desse modo, mostram perspectivas, possivelmente após ainda melhoria e modificação, como reagentes terapêuticos para tratar AD.

[013] Além disso, a presente invenção também descreve bibliotecas aleatórias novas com base no andaime de Lcn2 humana que permite a geração eficiente de muteínas, tais como as muteínas da presente invenção, com afinidade alta e especificidade para um alvo dado em geral. Exemplos para tais bibliotecas ou suas seções são mostrados nas Figuras 1 e 2.

[014] Em um aspecto pelo menos em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 tripleto(s) de nucleotídeo codificando para qualquer uma das posições de sequência 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, e 134 da sequência de polipeptídeo linear de hLcn2, uma mutagênese aleatória foi realizado permitindo substituição nestas posições por um subconjunto de tripleto de nucleotídeo. Um subconjunto de triplos de nucleotídeo pode se referir, mas não é limitado a (a) menos que os 64 tripletos possíveis codificados pelos nucleotídeos NNN (se N = A, T, G, C que quer dizer 4x4x4=64 possíveis tripletos), (b) menos que os 32 possíveis tripletos codificados pelos nucleotídeos NNK ou NNS, (c) menos que os tripletos necessários para codificar todos os 20 aminoácidos proteinogênicos naturais. Em outra modalidade, tripletos de nucleotídeo codificando para cisteína não são usados para substituição durante a mutagênese. Isso significa que a mutagênese não leva a muteínas carregando novas cisteínas que já não estivessem inclusas na sequência original não submetida à mutagênese. Desse modo, neste aspecto é especificado como os tripletos de nucleotídeo se parecem que são para ser introduzidos nas posições que são ser submetidas à mutagênese como especificado neste parágrafo (vide também Exemplo 1 e Figura 2).

[015] Desse modo, em um primeiro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método de gerar uma muteína derivada de Lipocalina 2 humana (Lcn2; também conhecida como lipocalina associada com gelatinase de neutrófilos humanos, hNGAL, ou como siderocalina). As muteínas obtidas com este método podem ligar-se a um alvo não-natural com afinidade detectável. O método compreende submeter uma molécula de ácido nucleico codificando para Lipocalina 2 humana (Lcn2, hNGAL) à mutagênese em um tripleto de nucleotídeo codificando para pelo menos uma de qualquer uma das posições de sequência correspondendo às posições de sequência 96, 100, e 106, da sequência de polipeptídeo linear de Lipocalina 2 humana, resultando em uma ou mais molécula(s) de ácido nucleico de muteína.

[016] De acordo com o acima, o termo "Lipocalina 2 humana" ou "lipocalina associada com gelatinase de neutrófilos humanos (hNGAL)" inclui homólogos estruturais, já identificados ou ainda a serem isolados, de outras espécies que têm uma homologia de sequência de aminoácido ou identidade de sequência de mais que cerca de 60%. Pse refere que estas lipocalinas humanas descritas acima compreendam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ou 17 resíduos de aminoácido mutados em qualquer uma das posições de sequência correspondendo às posições de sequência 33, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 59, 65, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 86, 87, 98, 96, 99, 100, 103, 106, 107, 110, 111, 125, 127, 132, 134, 136 e 138 da sequência de polipeptídeo linear de hNGAL. O termo "homologia", como aqui usado, em seu significado usual inclui aminoácidos idênticos como também aminoácidos que são considerados ser substituições conservativas (por exemplo, permuta de um resíduo de glutamato por um resíduo de aspartato) nas posições equivalentes na sequência de aminoácido linear de duas proteínas que são comparadas entre si. Os termos "identidade de sequência" ou "identidade", como usados na presente invenção, significam a porcentagem de resíduos idênticos em pares - seguindo alinhamento de homologia de uma sequência de um polipeptídeo da presente invenção com uma sequência em questão - com respeito ao número de resíduos na mais longa destas duas sequências.

[017] A porcentagem de homologia de sequência ou identidade de sequência é aqui determinada usando o programa BLASTP, versão blastp 2.2.5 (16 de novembro de 2002; cf. Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402). A porcentagem de homologia é com base no alinhamento das sequências de polipeptídeo inteiras (matriz: BLOSUM 62; custos de intervalo: 11,1; valor de corte ajustado em 10-3) incluindo as sequências de pró-peptídeo, usando a Lipocalina 2 humana como referência em uma comparação em pares. Ela é calculada como a porcentagem de números de "positivos" (aminoácidos homólogos) indicados como resultado na saída do programa BLASTP dividido pelo número total de aminoácidos selecionados pelo programa para o alinhamento. É observado, neste respeito, que este número total de aminoácidos selecionados pode diferir do comprimento da Lipocalina 2 humana.

[018] No caso de uma proteína diferente de Lipocalina 2 humana ser usada na presente invenção, a definição das posições de sequência mutadas dadas para a Lipocalina 2 humana pode ser atribuída à outra lipocalina com ajuda de alinhamentos de sequência publicados ou métodos de alinhamentos que estejam disponíveis ao artesão versado. Um alinhamento de sequência pode ser, por exemplo, realizado como explicado em WO 99/16873 (cf. Fig. 3 nesta), usando um alinhamento publicado tal como o na Fig. 1 de Redl, B. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 241-248. Se a estrutura tridimensional das lipocalinas estiver disponível, sobreposições estruturais podem também ser usadas para a determinação daquelas posições de sequência que serão submetidas à mutagênese na presente invenção. Outros métodos de análise estrutural tais como espectroscopia de ressonância magnética nuclear multidimensional podem também ser empregados para este propósito.

[019] O homólogo da Lipocalina 2 humana pode também ser uma proteína de muteína da própria Lipocalina 2 humana em que substituições de aminoácido são introduzidas em posições diferentes das posições selecionadas na presente invenção. Por exemplo, uma tal muteína pode ser uma proteína em que as posições na superfície exposta ao solvente da β-barril são mutadas comparadas à sequência do tipo selvagem da Lipocalina 2 humana para aumentar a solubilidade ou a estabilidade da proteína.

[020] Em geral, o termo "Lipocalina 2 humana" inclui todas as proteínas que têm uma homologia de sequência ou identidade de sequência de mais que 60%, 70% 80%, 85%, 90%, ou 95% em relação à Lipocalina 2 humana. Pse refere que estas lipocalinas humanas descritas acima compreendam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ou 17 resíduos de aminoácido mutados em qualquer uma das posições de sequência correspondendo às posições de sequência 33, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 59, 65, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 86, 87, 98, 96, 99, 100, 103, 106, 107, 110, 111, 125, 127, 132, 134, 136 e 138 da sequência de polipeptídeo linear de hNGAL.

[021] Desse modo, em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma muteína derivada de Lipocalina 2 humana (isto é, muteína de lipocalina humana ou uma lipocalina humana mutada, preferivelmente uma hNGAL madura mutada, em que a dita hNGAL madura tem o Número de Acesso do Banco de Dados SWISS-PROT P80188, mais preferivelmente a dita hNGAL madura tem a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 44). Esta muteína inclui pelo menos um ou dois resíduos de aminoácido mutados em qualquer uma das posições de sequência correspondendo às posições de sequência 96, 100 e 106 da sequência de polipeptídeo linear de Lcn2 humana, e em que a muteína liga um alvo não-natural dado com afinidade detectável.

[022] Como aqui usado, uma "muteína", uma entidade "mutada" (quer proteína quer ácido nucleico) ou "mutante" se refere à permuta, deleção, ou inserção de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, respectivamente, comparados ao andaime de "referência" de ácido nucleico ou de proteína de ocorrência natural (do tipo selvagem). Preferivelmente, o número de nucleotídeos ou aminoácidos, respectivamente, que são trocados, deletados ou são inseridos é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais tais como 25, 30, 35, 40, 45 ou 50.

[023] Os termos "lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos humanos" ou "hNGAL" ou "lipocalina 2" ou "Lcn2", como aqui usados, referem-se à hNGAL madura com o Número de Acesso do Banco de Dados SWISS-PROT P80188 (exemplificado aqui como SEQ ID NO: 44).

[024] Neste contexto, observa-se que a invenção é com base na observação surpreendente que submetendo Lipocalina 2 humana, proteína relacionada à α2-microglobulina de rato (A2m) e 24p3/uterocalina de camundongo (24p3) à mutagênese em uma ou mais destas 3 posições de sequência supracitadas fornece muteínas tendo uma ligação suficientemente afinada ao alvo pré-definido que pode incluir, mas não é limitado a um peptídeo, uma proteína, um fragmento ou um domínio de uma proteína, e uma molécula orgânica pequena.

[025] O alvo dado pode ser qualquer alvo/ligante não-natural desejado. Em uma modalidade, o termo "ligante não-natural" se refere a um composto, que não liga à hNGAL madura nativa sob condições fisiológicas.

[026] Os termos "molécula orgânica" ou "molécula orgânica pequena", como aqui usados, para o alvo não-natural denota uma molécula orgânica que compreende pelo menos dois átomos de carbono, mas preferivelmente não mais de 7 ou 12 ligações de carbono giráveis, tendo um peso molecular na faixa entre 100 e 2000 Daltons, preferivelmente entre 100 e 1000 Daltons, e opcionalmente incluindo um ou dois átomos de metal.

[027] O termo "peptídeo", como aqui usado, para o alvo não- natural se refere a um dipeptídeo ou um oligopeptídeo com 2 a 45 aminoácidos. Em uma modalidade, o peptídeo tem 2-40, 2-35, 2-30, 225, 2-20, 2-15 ou 2-10 resíduos de aminoácido. O peptídeo pode ser um peptídeo de ocorrência natural ou sintético e pode compreender - além dos 20 L-aminoácidos de ocorrência natural - D-aminoácidos, aminoácidos e análogos de aminoácidos de ocorrência não-natural. Em uma modalidade, o peptídeo é um peptídeo beta amiloide (Abeta ou Aβ). Em outra modalidade, o peptídeo beta amiloide é um peptídeo Aβ40 ou um peptídeo Aβ42.

[028] Em uma modalidade, a molécula orgânica pequena é um composto apresentando as características de um hapteno imunológico.

[029] Em uma modalidade, o alvo não-natural que é uma proteína é fibronectina ou um domínio da mesma, tal como o EB-domínio ou um fragmento do EB-domínio.

[030] Uma muteína de lipocalina 2 humana da invenção pode compreender a sequência de aminoácido do tipo selvagem (natural) fora das posições de sequência de aminoácido mutadas. Por outro lado, as muteínas de lipocalina reveladas aqui podem também conter mutações de aminoácido fora das posições de sequência submetidas à mutagênese contanto que aquelas mutações não interfiram com a atividade de ligação e o dobramento da muteína. Tais mutações podem ser realizadas muito facilmente no nível de DNA usando os métodos padrões estabelecidos (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Possíveis alterações da sequência de aminoácido são inserções ou deleções como também substituições de aminoácidos. Tais substituições podem ser conservativas, isto é, um resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido quimicamente similar. Exemplos de substituições conservativas são as substituições entre os membros dos grupos a seguir: 1) alanina, serina e treonina; 2) ácido aspártico e ácido glutâmico; 3) asparagina e glutamina; 4) arginina e lisina; 5) isoleucina, leucina, metionina e valina; e 6) fenilalanina, tirosina, e triptofano. Por outro lado, é também possível introduzir alterações não-conservativas na sequência de aminoácido. Além disso, em vez de substituir os resíduos de aminoácido simples, é também possível inserir ou deletar um ou mais aminoácidos contínuos da estrutura primária de Lipocalina 2 humana contanto que estas deleções ou inserções resultem em uma muteína dobrada/funcional estável.

[031] Como uma visão geral, tais modificações da sequência de aminoácido incluem mutagênese dirigida das posições de aminoácido simples para simplificar a subclonagem do gene de lipocalina mutada ou suas partes incorporando os sítios de clivagem às certas enzimas de restrição. Além disso, estas mutações podem também ser incorporadas para ainda melhorar a afinidade de uma muteína de lipocalina por um alvo dado. Além disso, mutações podem ser introduzidas para modular certas características da muteína tais como melhorar a estabilidade de dobramento, estabilidade em soro, resistência da proteína ou solubilidade em água ou reduzir a tendência de agregação, se necessário. Por exemplo, os resíduos de cisteína de ocorrência natural podem ser mutados em outros aminoácidos para impedir formação de ligação de dissulfeto. Porém, é também possível deliberadamente mutar outra posição de sequência de aminoácido com a cisteína para introduzir novos grupos reativos, por exemplo para a conjugação com outros compostos, tais como polietileno glicol (PEG), hidroxietil amido (HES), biotina, peptídeos ou proteínas, ou para a formação de ligações de dissulfeto de ocorrência não-natural. Possibilidades exemplares de uma tal mutação para introduzir um resíduo de cisteína na sequência de aminoácido de uma muteína de lipocalina 2 humana incluem a introdução de um resíduo de cisteína (Cys) pelo menos em uma das posições de sequência correspondendo às posições de sequência 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 ou 158 da sequência do tipo selvagem de hNGAL. A metade de tiol gerada no lado de qualquer uma das posições de aminoácido 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 e/ou 158 pode ser usada para PEGilar ou HESilar a muteína, por exemplo, para aumentar a meia-vida em soro de uma respectiva muteína de Lipocalina 2 humana.

[032] Em uma modalidade, a muteína da presente invenção inclui resíduos de aminoácido mutados pelo menos em qualquer das 2 ou todas 3 das posições de sequência correspondendo às posições de sequência 96, 100 e 106 da sequência de polipeptídeo linear de Lipocalina 2 humana.

[033] Em uma outra modalidade da invenção, a muteína inclui pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ou 17 resíduos de aminoácido mutados em qualquer uma das posições de sequência correspondendo às posições de sequência 33, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 59, 65, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 86, 87, 98, 96, 99, 100, 103, 106, 107, 110, 111, 125, 127, 132, 134, 136 e 138 da sequência de polipeptídeo linear de hNGAL. Em uma outra modalidade, a muteína inclui pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 resíduos de aminoácido mutados em qualquer uma das posições de sequência 33, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 59, 65, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 86, 87, 98, 96, 99, 100, 103, 106, 107, 110, 111, 125, 127, 132, 134, 136 e 138 da sequência de polipeptídeo linear de hNGAL. Em ainda uma outra modalidade, a muteína inclui 18, 19 ou 20 resíduos de aminoácido mutados em qualquer uma das posições de sequência 33, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 59, 65, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 86, 87, 98, 96, 99, 100, 103, 106, 107, 110, 111, 125, 127, 132, 134, 136 e 138 da sequência de polipeptídeo linear de Lipocalina 2 humana.

[034] Em uma modalidade da presente invenção, a muteína inclui resíduos de aminoácido mutados em pelo menos qualquer uma das 10, 14, 15, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35 ou todas as 45 posições de sequência acima listadas.

[035] Uma muteína da invenção que liga a um peptídeo beta amiloide, tal como peptídeo Aβ40 ou um peptídeo Aβ42, pode compreender com respeito à sequência de aminoácido do tipo selvagem de Lipocalina 2 humana madura ilustrada na Figura 17 (Lcn2), pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 substituições de aminoácido que incluem, mas não são limitadas a, Leu36 ^ Val ou Cys; Ala40 ^ Tyr ou Lys ou Val; Ile41 ^ Thr ou Ser ou Leu; Gln49 ^ Leu ou Trp; Leu70 ^ Gly; Arg72 ^ Gly ou Asp; Lys73 ^ Leu ou Thr ou Asp; Asp77 ^ Asn ou His ou Leu; Trp79 ^ Lys; Asn96 ^ Ile ou Arg; TyrlOO ^ Gln ou Arg ou Glu; Leu103 ^ Met ou Arg ou Gly; Tyr106 ^ Tyr ou Ala ou Trp; Lys125 ^ Thr ou Val ou Glu; Ser127 ^ Gly ou Gln ou Ala; Tyr132 ^ Met ou Ser ou Thr; e Lys134 ^ Asn. Foi observado que tais muteínas podem diminuir a agregação de Aβ in vitro ou in vivo. Pse refere que a muteína descrita aqui ligue e iniba a agregação de Aβ, preferivelmente Aβ40, mais preferivelmente sob condições de ensaio como especificado no Exemplo 11 (preferivelmente incluindo a razão 1:10 muteina:Aβ40). A presente invenção também diz respeito às muteínas como descritas acima tendo uma função biológica comparável quando comparada com a muteína US7. "Função biológica comparável" significa que estas muteínas podem ligar e inibir Aβ, preferivelmente Aβ40, com um desvio da atividade de inibição de agregação a respeito de US7 de não mais que cerca de 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 2% ou 1%, por exemplo, sob condições que comparam ou são idênticas com aquelas expostas no Exemplo 11 (preferivelmente incluindo a razão 1:10 muteina:Aβ40). A presente invenção também diz respeito às muteínas descritas aqui para o uso no tratamento ou prevenção de doenças neurodegenerativas tais como doença de Alzheimer.

[036] Em uma modalidade, uma muteína da invenção que liga a um peptídeo beta amiloide, tal como peptídeo Aβ40 ou um peptídeo A β 42 compreende as substituições de aminoácido a seguir Leu36 ^ Val; Ala40 ^ Tyr; Ile41 ^ Thr; Gln49 ^ Leu; Leu70 ^ Gly; Lys73 ^ Leu; Asp77 ^ Asn; Trp79 ^ Lys; Asn96 ^ Ile; Tyr100 ^ Gln; Leu103 ^ Met; Lys125 ^ Thr; Ser127 ^ Gly; Tyr132 ^ Met; e Lys134 ^ Asn. Um exemplo de uma muteína incluindo tais substituições de aminoácido é S1-A4 ilustrada na Figura 17 (SEQ ID NO: 39).

[037] Em uma outra modalidade, uma muteína da invenção que liga a um peptídeo beta amiloide, tal como peptídeo Aβ40 ou um peptídeo Aβ42 compreende as substituições de aminoácido a seguir Leu36 ^ Val; Ala40 ^ Lys; Ile41 ^ Ser; Gln49 ^ Trp; Leu70 ^ Gly; Arg72 ^ Gly; Lys73 ^ Thr; Asp77 ^ His; Trp79 ^ Lys; Asn96 ^ Arg; Tyr100 ^ Arg; Leu103 ^ Arg; Tyr106 ^ Ala; Lys125 ^ Val; Ser127 ^ Gln; Tyr132 ^ Ser; e Lys134 ^ Asn. Um exemplo de uma muteína incluindo tais substituições de aminoácido é US-7 ilustrada na Figura 17 (SEQ ID NO: 41).

[038] A invenção também visa uma lipocalina de hNGAL madura mutada (como depositada no Banco de Dados SWISS-PROT sob o Número de Acesso P80188, preferivelmente tendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 40) compreendendo em uma posição, correspondendo a uma posição 36, 40, 41, 49, 70, 72, 73, 77, 79, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, 134 da sequência de polipeptídeo linear de hNGAL do tipo selvagem, um ou mais aminoácidos mutados como descritos aqui.

[039] Em outra modalidade, uma muteína da invenção que liga a um peptídeo beta amiloide, tal como peptídeo Aβ40 ou um peptídeo A β 42 compreende as substituições de aminoácido a seguir Leu36 ^ Cys; Ala40 ^ Val; Ile41 ^ Leu; Gln49 ^ Leu; Leu70 ^ Gly; Arg72 ^ Asp; Lys73 ^ Asp; Asp77 ^ Leu; Trp79 ^ Lys; Asn96 ^ Arg; Tyr100 ^ Glu; Leu103 ^ Gly; Tyr106 ^ Trp; Lys125 ^ Glu; Ser127 ^ Ala; Tyr132 ^ Thr; e Lys134 ^ Asn. Um exemplo de uma muteína incluindo tais substituições de aminoácido é H1-G1 ilustrada na Figura 17 (SEQ ID NO: 43).

[040] Em outra modalidade, uma muteína da invenção que liga a um peptídeo beta amiloide, tal como peptídeo Aβ40 ou um peptídeo A β 42 compreende as substituições de aminoácido a seguir Leu36 ^ Ala; Ala40 ^ Val; Ile41 ^ Leu; Gln49 ^ Leu; Leu70 ^ Gly; Arg72 ^ Asp; Lys73 ^ Asp; Asp77 ^ Leu; Trp79 ^ Lys; Asn96 ^ Arg; TyrlOO ^ Glu; Leu1O3 ^ Gly; Tyr1O6 ^ Trp; Lys125 ^ Glu; Ser127 ^ Ala; Tyr132 ^ Thr; e Lys134 ^ Asn. Um exemplo de uma muteína incluindo tais substituições de aminoácido é H1GA ilustrada na SEQ ID NO: 50.

[041] Pse refere que a muteína descrita aqui acima ligue e iniba agregação de Aβ, preferivelmente Aβ4O, mais preferivelmente sob as condições de ensaio como especificadas no Exemplo 23 (preferivelmente em uma razão de 1O:2 Aβ4O:H1GA). A presente invenção também diz respeito às muteínas como descritas acima tendo uma função biológica comparável quando comparadas com a muteína H1GA. "Função biológica comparável" significa que estas muteínas podem ligar e inibir Aβ, preferivelmente Aβ4O com um desvio da atividade de inibição de agregação a respeito de H1GA de não mais que cerca de 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 2% ou 1%, por exemplo sob condições que comparam ou são idênticas com aquelas expostas no Exemplo 23 (preferivelmente em uma razão de 1O:2 Aβ4O:H1GA). A presente invenção também diz respeito às muteínas descritas aqui para o uso no tratamento ou prevenção de doenças neurodegenerativas tais como doença de Alzheimer.

[042] Em outra modalidade, uma muteína da invenção que liga a um peptídeo beta amiloide, tal como peptídeo Aβ40 ou um peptídeo A β 42 compreende as substituições de aminoácido a seguir Leu36 ^ Val; Ala4O ^ Val; Ile41 ^ Leu; Gln49 ^ Leu; Leu7O ^ Gly; Arg72 ^ Asp; Lys73 ^ Asp; Asp77 ^ Leu; Trp79 ^ Lys; Asn96 ^ Arg; Tyr1OO ^ Glu; Leu1O3 ^ Gly; Tyr1O6 ^ Trp; Lys125 ^ Glu; Ser127 ^ Ala; Tyr132 ^ Thr; e Lys134 ^ Asn. Um exemplo de uma muteína incluindo tais substituições de aminoácido é H1GV ilustrada na SEQ ID NO: 52.

[043] Pse refere que a muteína descrita aqui acima ligue a Aβ40 sob condições de ensaio como especificadas no Exemplo 21. A presente invenção também diz respeito às muteínas como descritas acima tendo uma função biológica comparável quando comparada com a muteína H1GV. "Função biológica comparável" significa que estas muteínas podem ligar a Aβ, preferivelmente Aβ40 com um desvio da atividade de inibição de agregação a respeito de H1GV de não mais que cerca de 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 2% ou 1%, por exemplo sob condições que comparam ou são idênticas com aquelas expostas no Exemplo 21. A presente invenção também diz respeito às muteínas descritas aqui para o uso no tratamento ou prevenção de doenças neurodegenerativas tais como doença de Alzheimer.

[044] Em uma outra modalidade, uma muteína da invenção que liga ao domínio B extra ou um fragmento do mesmo compreende as substituições de aminoácido a seguir Leu36 ^ Lys; Ala40 ^ His; Ile41 ^ Asp; Gln49 ^ Arg; Tyr52 ^ Gln; Ser68 ^ Asn; Leu70 ^ Arg; Arg72 ^ Val; Lys73 ^ His; Asp77 ^ Asn; Trp79 ^ Arg; Arg81 ^ Trp; Tyr100 ^ Trp; Tyr106 ^ Trp; Lys125 ^ Arg; Ser127 ^ Tyr; Tyr132 ^ Leu; Lys134 ^ Glu e Ser146 ^ Asn. Um exemplo de uma muteína incluindo tais substituições de aminoácido é N7A ilustrada na Figura 17 (SEQ ID NO: 20).

[045] Em outra modalidade, uma muteína da invenção que liga ao domínio B extra ou um fragmento do mesmo compreende as substituições de aminoácido a seguir Leu36 ^ Arg; Ala40 ^ Met; Ile41 ^ Arg; Gln49 ^ Ala; Tyr52 ^ Val; Ser68 ^ Lys; Leu70 ^ Met; Arg72 ^ Gln; Lys73 ^ Arg; Asp77 ^ Lys; Trp79 ^ Met; Arg81 ^ Asn; Asn96 ^ Ala; Tyr100 ^ Pro; Leu103 ^ Pro; Tyr106 ^ Thr; Lys125 ^ His; Ser127 ^ Phe; e Lys134 ^ His. Um exemplo de uma muteína incluindo tais substituições de aminoácido é N9B ilustrada na Figura 17 (SEQ ID NO: 24).

[046] Em outra modalidade, uma muteína da invenção que liga ao domínio B extra ou um fragmento do mesmo compreende as substituições de aminoácido a seguir Leu36 ^ Ala; Ala40 ^ Thr; Ile41 ^ Trp; Gln49 ^ Tyr; Tyr52 ^ Gln; Ser68 ^ Asn; Arg72 ^ Met; Lys73 ^ Ser; Asp77 ^ Arg; Trp79 ^ Met; Arg81 ^ His; Asn96 ^ Ser; TyrlOO ^ Trp; Tyr106 ^ Trp; Lys125 ^ Arg; Ser127 ^ Tyr; Tyr132 ^ Phe; e Lys134 ^ Gly. Um exemplo de uma muteína incluindo tais substituições de aminoácido é N10D ilustrada na Figura 17 (SEQ ID NO: 26).

[047] Em uma outra modalidade, uma muteína da invenção que liga ao domínio B extra ou um fragmento do mesmo compreende as substituições de aminoácido a seguir Leu36 ^ Glu; Ala40 ^ Ser; Ile41 ^ Leu; Gln49 ^ Arg; Leu70 ^ Arg; Lys73 ^ Ser; Asp77 ^ His; Trp79 ^ Leu; Asn96 ^ Leu; Tyr100 ^ Lys; Leu103 ^ His; Tyr106 ^ Phe; Lys125 ^ Thr; Ser127 ^ Ala; e Lys134 ^ Phe. Um exemplo de uma muteína incluindo tais substituições de aminoácido é N7E ilustrada na Figura 17 (SEQ ID NO: 22).

[048] As muteínas descritas acima com referência à Figura 17 podem incluir outras substituições de aminoácido. As muteínas podem ainda compreender substituições de aminoácido que podem incluir, mas não são limitadas a Gln28 ^ His ou Cys87 ^ Ser. Outras possíveis substituições de aminoácido incluem, mas não são limitadas a, Tyr52 ^ Gln ou Val; Ser68 ^ Lys ou Asn; ou Arg81 ^ Trp ou Asn ou His.

[049] As muteínas de lipocalina da invenção podem ligar-se ao alvo não-natural desejado com afinidade detectável, isto é, com uma constante de dissociação (KD) de pelo menos 200 nM. Em outra modalidade, a muteína se liga ao alvo não-natural dado com uma KD de 1 μM ou menos, ou 100 μM ou menos, ou 1 μM ou menos, ou 500 nM, ou 200 nM ou menos, ou 100 nM ou menos, ou 50 nM ou menos, ou 10 nM ou menos, ou 1 nM ou menos. Em outra modalidade, as muteínas de lipocalina se ligam ao alvo desejado com uma constante de dissociação para um alvo dado de pelo menos 100, 20, 1 nM ou até mesmo menos. A afinidade de ligação de uma muteína para o alvo desejado pode ser medida por uma multidão de métodos tais como titulação de fluorescência, ELISA de competição ou ressonância plasmônica de superfície (Biacore).

[050] É facilmente evidente à pessoa versada que a formação de complexo com o alvo é dependente de muitos fatores tais como concentração dos pares de ligação, a presença de competidores, resistência iônica do sistema de tampão etc. Seleção e enriquecimento são em geral executados sob condições que permitem o isolamento das muteínas de lipocalina tendo, em complexo com o alvo desejado, uma constante de dissociação como indicado acima. Porém, as etapas de lavagem e de eluição podem ser realizadas sob severidade variada. Uma seleção com respeito às características cinéticas é possível também. Por exemplo, a seleção pode ser executada sob condições que favoreçam a formação do complexo do alvo com as muteínas que mostram uma dissociação lenta do alvo ou, em outras palavras, uma taxa de koff baixa. Alternativamente, a seleção pode ser executada sob condições que favoreçam a formação rápida do complexo entre a muteína e o alvo ou, em outras palavras, uma taxa de kon alta.

[051] Uma muteína da invenção tipicamente existe como proteína monomérica. Porém, é também possível que uma muteína de lipocalina inventiva seja capaz de espontaneamente dimerizar-se ou oligomerizar- se. Embora o uso das muteínas de lipocalina que formam monômeros estáveis possa ser preferido para algumas aplicações, por exemplo por causa de difusão mais rápida e penetração de tecido melhor, o uso das muteínas de lipocalina que formam homodímeros ou multímeros estáveis pode ser vantajoso em outras circunstâncias, uma vez que tais multímeros podem fornecer uma afinidade e/ou avidez (ainda) aumentada a um alvo dado. Além disso, as formas oligoméricas da muteína de lipocalina podem ter taxas de dissociação mais lentas ou meia-vida em soro prolongada.

[052] É também observado que a formação do complexo entre a respectiva muteína e seu ligante é influenciada por muitos fatores diferentes tais como as concentrações dos respectivos pares de ligação, a presença dos competidores, pH e a resistência iônica do sistema de tampão usado, e o método experimental usado para determinação da constante de dissociação KD (por exemplo titulação de fluorescência, ELISA de competição ou ressonância plasmônica de superfície, só para citar alguns) ou até mesmo o algoritmo matemático que é usado para a avaliação dos dados experimentais.

[053] Portanto, está também claro à pessoa versada que os valores de KD (constante de dissociação do complexo formado entre a respectiva muteína e seu alvo/ligante) podem variar dentro de uma certa faixa experimental, dependendo do método e organização experimental que são usados para determinar a afinidade de uma muteína de lipocalina particular por um ligante dado. Isto significa, pode haver um desvio leve no valor de KD medido ou uma faixa de tolerância dependendo, por exemplo, se o valor de KD foi determinado por ressonância plasmônica de superfície (Biacore) ou através de ELISA de competição.

[054] Em uma modalidade, as muteínas reveladas aqui podem ser ligadas, ou N ou C terminal, a um marcador de afinidade tal como marcador de penta-histidina, um marcador de hexa-histidina ou um Strep-tag®. Desse modo, o presente pedido de patente abrange também todas as muteínas explicitamente descritas e genéricas equipadas com tais marcadores.

[055] O termo "fragmento", como usado na presente invenção, com relação ao fragmento de muteína de lipocalina característico diz respeito às proteínas ou peptídeos derivados de Lcn2 madura completa que são N-terminal e/ou C-terminalmente encontradas, isto é, desprovidas de pelo menos um dos aminoácidos N-terminais e/ou C- terminais. Tais fragmentos preferivelmente compreendem pelo menos 10, mais preferivelmente 20, o mais preferivelmente 30 ou mais aminoácidos sucessivos da sequência primária de Lcn2 madura e são usualmente detectáveis em um imunoensaio de Lcn2 madura.

[056] Também inclusas no escopo da presente invenção são as muteínas acima que foram alteradas com respeito à sua imunogenicidade.

[057] As células T citotóxicas reconhecem os antígenos de peptídeo na superfície celular de uma célula de apresentação de antígeno em associação com uma molécula do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) da classe I. A habilidade dos peptídeos para ligar às moléculas de MHC é específica ao alelo e correlata com sua imunogenicidade. Para reduzir a imunogenicidade de uma proteína dada, a habilidade para prognosticar quais peptídeos em uma proteína têm o potencial para ligar a uma molécula de MHC dada é de grande valor. Abordagens foram descritas que empregam uma abordagem de encadeamento computacional para identificar epítopos de células T potenciais foram previamente descritas para prognosticar a ligação de uma sequência de peptídeo dada às moléculas da classe I de MHC (Altuvia et al. (1995) J. Mol. Biol. 249: 244-250).

[058] Uma tal abordagem pode ser também utilizada para identificar epítopos de células T potenciais nas muteínas da invenção e, dependendo de seu uso intencionado, tornar preditiva uma seleção de uma muteína específica com base em sua imunogenicidade. Pode ser além disso possível submeter as regiões de peptídeo que foram prognosticadas conter epítopos de células T à mutagênese adicional para reduzir ou eliminar estes epítopos de células T e, desse modo, minimizar a imunogenicidade. A remoção dos epítopos anfipáticos de anticorpos geneticamente engenheirados foi descrita (Mateo et al. (2000) Hybridoma 19(6):463-471) e pode ser adaptada às muteínas da presente invenção.

[059] As muteínas desse modo obtidas pode possuir uma imunogenicidade minimizada que é desejável para seu uso em aplicações terapêuticas e de diagnóstico, tais como aquelas descritas abaixo.

[060] Para algumas aplicações, é também útil empregar as muteínas da invenção em uma forma conjugada. Consequentemente, a invenção é também direcionada às muteínas de lipocalina que são conjugadas com um composto que pode incluir, mas não é limitado a, moléculas orgânicas, uma marcação de enzima, uma marcação colorida, um agente citostático, uma toxina, uma marcação que possa ser fotoativada e que seja adequada para o uso em terapia fotodinâmica, uma marcação fluorescente, uma marcação radioativa, uma marcação cromogênica, uma marcação luminescente, complexos de metal, metal, tal como ouro coloidal, haptenos, digoxigenina, biotina, um metal quimioterapêutico, ou um metal quimioterapêutico, para citar apenas alguns exemplos evocativos. A muteína pode ser também conjugada com uma molécula de fármaco orgânica. A conjugação pode ser realizada usando qualquer método de acoplamento convencional conhecido na técnica.

[061] Em geral, é possível marcar uma muteína de Lcn2 descrita aqui com qualquer substância química ou enzima apropriada que direta ou indiretamente gere um composto ou sinal detectável em uma reação química, física, ótica ou enzimática. Um exemplo para uma reação física e ao mesmo tempo reação/marcador óptico é a emissão de fluorescência sob irradiação. Fosfatase alcalina, peroxidase de raiz-forte ou β- galactosidase são exemplos de marcações enzimáticas (e ao mesmo tempo marcações ópticas) que catalisam a formação de produtos de reação cromogênica. Em geral, todas as marcações comumente usadas para anticorpos (exceto aquelas exclusivamente usadas com a metade de açúcar na parte de Fc das imunoglobulinas) podem ser também usadas para conjugar as muteínas da presente invenção. As muteínas da invenção podem ser também conjugadas com qualquer agente terapeuticamente ativo adequado, por exemplo, para a liberação visada de tais agentes para uma certa célula, tecido ou órgão ou para o direcionamento seletivo de células, por exemplo, de células tumorais sem afetar as células normais circunvizinhas. Exemplos de tais agentes terapeuticamente ativos incluem radionuclídeos, toxinas, moléculas orgânicas pequenas, e peptídeos terapêuticos (tais como peptídeos que atuam como agonistas/antagonistas de um receptor de superfície celular ou peptídeos que competem para um sítio de ligação de proteína em um alvo celular dado). Exemplos de toxinas adequadas incluem, mas não são limitadas a toxina da coqueluche, toxina da difteria, ricina, saporina, exotoxina dos pseudomonas, caliqueamicina ou um derivado da mesma, um taxoide, um maytansinoide, uma tubulisina ou um análogo de dolastatina. O análogo de dolastatina pode ser auristatina E, monometilauristatina E, auristatina PYE e auristatina PHE. Exemplos de agente citoestático incluem, mas não são limitadas a, Cisplatina, Carboplatina, Oxaliplatina, 5-Fluorouracila, Taxotero (Docetaxel), Paclitaxel, Antraciclina (Doxorrubicina), Metotrexato, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina, Dacarbazina, Ciclofosfamida, Etoposide, Adriamicina, Camptotecina, compostos relacionados à Combretatastina A-4, sulfonamidas, oxadiazolinas, piranos espirocetais de benzo[b]tiofenossintéticos, compostos de monotetraidrofurano, curacina e derivados de curacina, derivados de metoxiestradiol e Leucovorina. As muteínas de lipocalina da invenção podem ser também conjugadas com ácidos nucleicos terapeuticamente ativos tais como moléculas de ácido nucleico antissenso, RNAs interferentes pequenos, micro RNA ou ribozimas. Tais conjugados podem ser produzidos por métodos bem conhecidos na técnica.

[062] Em uma modalidade, as muteínas da invenção podem ser também acopladas a uma metade de direcionamento que visa uma região específica do corpo para liberar as muteínas inventivas a uma região ou área desejada dentro do corpo. Um exemplo em que tal modificação pode ser desejável é o cruzamento da barreira hematoencefálica. Para cruzar a barreira hematoencefálica, as muteínas da invenção podem ser acopladas às metades que facilitam o transporte ativo ao longo desta barreira (vide Gaillard PJ, et al. (2005) International Congress Series. 1277,185-198 ou Gaillard PJ, et al. (2005) Expert Opin Drug Deliv. 2(2), 299-309). Tais compostos estão, por exemplo, disponíveis sob o nome comercial 2B-Trans™ (to-β Technologies BV, Leiden, NL). Outras moléculas de direcionamento exemplares às quais as muteínas da presente invenção podem ser acopladas incluem anticorpos, fragmentos de anticorpo ou muteínas de lipocalina com afinidade por uma molécula alvo desejada. A molécula alvo das metades de direcionamento pode ser, por exemplo, um antígeno de superfície celular. Antígenos de superfície celular podem ser específicos para um tipo de célula ou tecido, tal como, por exemplo, células cancerosas. Exemplos ilustrativos de tais proteínas de superfície celular são HER-2 ou proteoglicanos tais como NEU-2.

[063] Como indicado acima, uma muteína da invenção pode, em algumas modalidades, ser conjugada com um composto que estende a meia-vida em soro da muteína (nesta consideração, vide também publicação do PCT WO 2006/56464 onde tais estratégias de conjugação são descritas com referências às muteínas de lipocalina associada com gelatinase de neutrófilos humanos com afinidade de ligação por CTLA-4). O composto que estende a meia-vida em soro pode ser uma molécula de polialquileno glicol, tal como polietileno (PEG) ou um derivado ativado do mesmo; hidroxietil amido, moléculas de ácido graxo, tais como ácido palmítico (Vajo & Duckworth (2000) Pharmacol. Rev. 52, 1-9), uma parte de Fc de uma imunoglobulina, um domínio de CH3 de uma imunoglobulina, um domínio de CH4 de uma imunoglobulina, albumina ou um fragmento da mesma, um peptídeo ligante de albumina, ou uma proteína ligante de albumina, transferrina para citar apenas alguns. A proteína ligante de albumina pode ser uma proteína ligante de albumina bacteriana, um anticorpo, um fragmento de anticorpo incluindo anticorpos de domínio (vide patente US 6.696.245, por exemplo), ou uma muteína de lipocalina com atividade de ligação para albumina. Consequentemente, os compostos de conjugação adequados para estender a meia-vida de uma muteína de lipocalina da invenção incluem albumina (Osborn et al. (2002) J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548), ou uma proteína ligante de albumina, por exemplo, um domínio de ligação da albumina bacteriana, tal como um da proteína estreptocócica G (Konig, T. e Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83). Outros exemplos de peptídeos ligantees de albumina que podem ser usados como par de conjugação são, por exemplo, aqueles tendo uma sequência de consenso Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys, em que Xaa1 é Asp, Asn, Ser, Thr ou Trp; Xaa2 é Asn, Gln, His, Ile, Leu, ou Lys; Xaa3 é Ala, Asp, Phe, Trp, ou Tyr; e Xaa4 é Asp, Gly, Leu, Phe, Ser, ou Thr como descrito no pedido de patente US 2003/0069395 ou Dennis et al. (O Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043).

[064] Em outras modalidades, albumina em si ou um fragmento ativo biológico de albumina pode ser usada como composto de uma muteína de lipocalina da invenção que estende a meia-vida em soro da muteína. O termo "albumina" compreende todas as albuminas mamíferas tais como albumina sérica humana ou albumina sérica bovina ou albumina de rato. A albumina ou seu fragmento pode ser recombinantemente produzida como descrito na patente US 5.728.553 ou pedidos de patente europeus EP 0 330 451 e EP 0 361 991. Albumina humana recombinante (Recombumin®) para o uso como um estabilizante de proteína está disponível, por exemplo, de Novozymes Delt Ltd. (Nottingham, RU).

[065] Se a proteína ligante de albumina for um fragmento de anticorpo ela pode ser um anticorpo de domínio. Anticorpos de domínio (dAbs) são engenheirados para permitir controle preciso sobre as propriedades biofísicas e meia-vida in vivo para criar o perfil ótimo do produto de segurança e eficácia. Anticorpos de domínio estão, por exemplo, comercialmente disponíveis de Domantis Ltd. (Cambridge, RU e MA, EUA).

[066] Usando transferrina como uma metade para estender a meia-vida em soro das muteínas da invenção, as muteínas podem ser geneticamente fundidas no término N ou C, ou ambos, da transferrina não-glicosilada. Transferrina não-glicosilada tem uma meia-vida de 1417 dias, e uma proteína de fusão de transferrina similarmente terá uma meia-vida estendida. O veículo de transferrina também fornece biodisponibilidade alta, biodistribuição e estabilidade de circulação. Esta tecnologia está comercialmente disponível de BioRexis (BioRexis Pharmaceutical Corporation, PA, EUA). Transferrina humana recombinante (DeltaFerrin™) para o uso como um estabilizante de proteína está também comercialmente disponível de Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, RU).

[067] Se uma parte de Fc de uma imunoglobulina for usada para o propósito de prolongar a meia-vida em soro das muteínas da invenção, a tecnologia de SynFusion™, comercialmente disponível de Syntonix Pharmaceuticals, Inc (MA, EUA), pode ser usada. O uso desta tecnologia de fusão de Fc permite a criação de biofarmacêuticos de ação duradoura e pode consistir, por exemplo, em duas cópias da muteína ligadas à região de Fc de um anticorpo para melhorar a farmacocinética, solubilidade, e eficiência de produção.

[068] Ainda outra alternativa para prolongar a meia-vida de uma muteína da invenção é fundir o término N ou C de uma muteína da invenção com sequências ricas em glicina flexíveis, não estruturadas, longas (por exemplo, poliglicina com cerca de 20 a 80 resíduos de glicina sucessivos). Esta abordagem revelada em WO2007/038619, por exemplo, também foi denominada "rPEG" (PEG recombinante).

[069] Se polialquileno glicol for usado como o composto que estende a meia-vida da muteína, o polialquileno glicol pode ser substituído ou insubstituído. Pode ser também um derivado de polialquileno ativado. Exemplos de compostos adequados são moléculas de polietileno glicol (PEG) como descritas em WO 99/64016, na patente US 6.177.074 ou na patente US 6.403.564 em relação à interferon, ou como descritas para outras proteínas tais como asparaginase modificadas com PEG-, PEG-adenosina desaminase (PEG-ADA) ou PEG-superóxido dismutase (vide por exemplo, Fuertges et al. (1990) The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins J. Control. Release 11, 139-148). O peso molecular de um tal polímero, preferivelmente polietileno glicol, pode variar de cerca de 300 a cerca de 70.000 Daltons, incluindo, por exemplo, polietileno glicol com um peso molecular de cerca de 10.000, de cerca de 20.000, de cerca de 30.000 ou de cerca de 40.000 Daltons. Além disso, como descrito, por exemplo, na patente US 6.500.930 ou 6.620.413, oligo e polímeros de carboidrato tais como amido ou hidroxietil amido (HES) podem ser conjugados com uma muteína da invenção para o propósito de extensão da meia-vida em soro.

[070] Em outra modalidade, para fornecer cadeias laterais de aminoácido adequadas para conjugar com um dos compostos acima para as muteínas da invenção, aminoácidos artificiais podem ser introduzidos através de mutagênese. Em geral, tais aminoácidos artificiais são projetados para ser mais reativos e desse modo facilitar a conjugação com a metade desejada. Um exemplo de um tal aminoácido artificial que pode ser introduzido por meio de um tRNA artificial é para- acetil-fenilalanina.

[071] Para várias aplicações das muteínas reveladas aqui pode ser vantajoso as usar na forma de proteínas de fusão. Em algumas modalidades, a muteína inventiva é fundida em seu término N e/ou término C a uma proteína, um domínio de proteína ou um peptídeo tal como uma sequência sinal e/ou um marcador de afinidade.

[072] Para aplicações farmacêuticas, uma muteína da invenção pode ser fundida com um par de fusão que estende a meia-vida em soro in vivo da muteína (vide novamente publicação do PCT WO 2006/56464 onde o par de fusão adequado é descrito com referências às muteínas da lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos humanos com afinidade de ligação por CTLA-4). Similar aos compostos conjugados descritos acima, o par de fusão pode ser uma parte de Fc de uma imunoglobulina, um domínio de CH3 de uma imunoglobulina, um domínio de CH4 de uma imunoglobulina, albumina, um peptídeo ligante de albumina ou uma proteína ligante de albumina, para citar apenas alguns. Novamente, a proteína ligante de albumina pode ser uma proteína ligante de albumina bacteriana ou uma muteína de lipocalina com atividade de ligação para albumina. Consequentemente, os pares de fusão adequados para estender a meia-vida de uma muteína de lipocalina da invenção incluem albumina (Osborn, B. L. et al. (2002) supra J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548), ou uma proteína ligante de albumina, por exemplo, um domínio de ligação de albumina bacteriana, tal como o da proteína estreptocócica G (Konig, T. e Skerra, A., (1998) supra J. Immunol. Methods 218, 73-83). Os peptídeos ligantees de albumina descritos em Dennis et al, supra (2002) ou pedido de patente US 2003/0069395 tendo uma sequência de consensos Cys- Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys, em que Xaa1 é Asp, Asn, Ser, Thr ou Trp; Xaa2 é Asn, Gln, His, Ile, Leu ou Lys; Xaa3 é Ala, Asp, Phe, Trp, ou Tyr; e Xaa4 é Asp, Gly, Leu, Phe, Ser ou Thr podem ser também usados como par de fusão. É também possível usar albumina em si ou um fragmento ativo biológico de albumina como par de fusão de uma muteína de lipocalina da invenção. O termo "albumina" compreende todas as albuminas mamíferas tais como albumina sérica humana ou albumina sérica bovina ou albumina sérica de rato. A produção recombinante de albumina ou seus fragmentos é bem conhecida na técnica e por exemplo descrita na patente US 5.728.553, pedido de patente europeu EP 0 330 451 ou EP 0 361 991.

[073] O par de fusão pode conferir características novas à muteína de lipocalina inventiva tais como atividade enzimática ou afinidade de ligação para outras moléculas. Exemplos de proteínas de fusão adequadas são fosfatase alcalina, peroxidase de raiz-forte, glutationa- S-transferase, o domínio de ligação de albumina da proteína G, proteína A, fragmentos de anticorpo, domínios de oligomerização, muteínas de lipocalina de mesma especificidade de ligação ou diferente (que resulta na formação de "duocalinas", cf. Schlehuber, S., e Skerra, A., (2001), Duocalins, engineered ligand-binding proteins with dual specificity derived from the lipocalin fold (Biol. Chem. 382, 1335-1342), ou toxinas.

[074] Em particular, pode ser possível fundir uma muteína de lipocalina da invenção com um sítio ativo de enzima separada de modo que ambos "componentes" da proteína de fusão resultante juntos atuem em um alvo terapêutico dado. O domínio de ligação da muteína de lipocalina prende ao alvo causativo da doença, permitindo o domínio da enzima abolir a função biológica do alvo.

[075] Marcadores de afinidade tais como o Strep-tag® ou Strep- tag® II (Schmidt, T.G.M. et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 753-766), o marcador myc, o marcador Flag, o marcador His6 ou o marcador HA ou proteínas tais como glutationa-S-transferase também permitem fácil detecção e/ou purificação das proteínas recombinantes são outros exemplos de pares de fusão preferidos. Por fim, proteínas com propriedades cromogênicas ou fluorescentes tais como a proteína fluorescente verde (GFP) ou a proteína fluorescente amarela (YFP) são pares de fusão adequados para uma muteína de lipocalina da invenção também.

[076] O termo "proteína de fusão", como aqui usado, também compreende muteínas de lipocalina de acordo com a invenção que contém uma sequência sinal. Sequências sinais no término N de um polipeptídeo direcionam este polipeptídeo para um compartimento celular específico, por exemplo para o periplasma de E. coli ou o retículo endoplasmático das células eucarióticas. Um número grande de sequências sinais é conhecido na técnica. Uma sequência sinal preferida para secreção de um polipeptídeo no periplasma de E. coli é a sequência sinal OmpA.

[077] A presente invenção também diz respeito às moléculas de ácido nucleico (DNA e RNA) compreendendo sequências de nucleotídeo codificando para muteínas como descritas aqui. Considerando que a degeneração do código genético permite substituições de certos códons por outros códons que especificam o mesmo aminoácido, a invenção não é limitada a uma molécula de ácido nucleico específica codificando uma muteína da invenção mas inclui todas as moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências de nucleotídeo codificando uma muteína funcional.

[078] Portanto, a presente invenção também inclui uma sequência de ácido nucleico codificando uma muteína de acordo com a invenção incluindo uma mutação pelo menos em um códon de qualquer da sequência das posições de aminoácido 96, 100 e 106 da sequência de polipeptídeo linear de Lcn2.

[079] A invenção, como revelada aqui, também inclui moléculas de ácido nucleico codificando muteínas de Lcn2 compreendendo mutações adicionais fora das posições de sequência indicadas da mutagênese experimental. Tais mutações são frequentemente toleradas ou provadas ser vantajosas até mesmo, por exemplo, se elas contribuírem para uma eficiência melhorada de dobramento, estabilidade em soro, estabilidade térmica ou afinidade de ligação de ligante da muteína.

[080] Uma molécula de ácido nucleico revelada neste pedido de patente pode ser "operavelmente ligada" a uma sequência reguladora (ou sequências reguladoras) para permitir expressão desta molécula de ácido nucleico.

[081] Uma molécula de ácido nucleico, tal como DNA, é referida como "capaz de expressar uma molécula de ácido nucleico" ou capaz "permitir expressão de uma sequência de nucleotídeo" se compreender elementos de sequência contendo informação com relação à regulação transcricional e/ou translacional, e tais sequências são "operavelmente ligadas" à sequência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo. Uma ligação operável é uma ligação em que os elementos da sequência reguladora e da sequência a ser expressa estão de certo modo conectados permitindo expressão gênica. A natureza precisa das regiões reguladoras necessária para expressão gênica pode variar entre as espécies, mas em geral estas regiões compreendem um promotor que, em procariotos, contém tanto o promotor per se, isto é, os elementos de DNA que direcionam a iniciação da transcrição, como também elementos de DNA que, quando transcritos no RNA, sinalizará a iniciação da tradução. Tais regiões de promotor normalmente incluem sequências de não-codificação de 5' envolvidas na iniciação de transcrição e tradução, tais como as caixas -35/-10 e o elemento Shine- Dalgarno em procariotos ou a caixa TATA, as sequências CAAT, e os elementos capsidiais de 5' em eucariotos. Estas regiões podem também incluir elementos intensificadores ou repressores como também sequências sinais e líderes traduzidas para visar o polipeptídeo nativo em um compartimento específico de uma célula hospedeira.

[082] Além disso, as sequências de não-codificação de 3' podem conter elementos reguladores envolvidos na terminação transcricional, poliadenilação ou outros. Porém, se estas sequências de terminação não são satisfatoriamente funcionais em uma célula hospedeira particular, então elas podem ser substituídas com sinais funcionais naquela célula.

[083] Portanto, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode incluir uma sequência reguladora, preferivelmente uma sequência de promotor. Em outra modalidade preferida, uma molécula de ácido nucleico da invenção compreende uma sequência de promotor e uma sequência de terminação transcricional. Promotores procarióticos adequados são, por exemplo, o promotor tet, o promotor lacUV5 ou o promotor T7. Exemplos de promotores úteis para a expressão em células eucarióticas são o promotor de SV40 ou o promotor de CMV.

[084] As moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser também parte de um vetor ou qualquer outro tipo de veículo de clonagem, tal como um plasmídeo, um fagemídeo, um fago, um baculovírus, um cosmídeo ou um cromossomo artificial.

[085] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico é compreendida em um fasmídeo. Um vetor de fasmídeo denota um vetor codificando a região intergênica de um fago temperado, tal como M13 ou f1, ou uma parte funcional do mesmo fundida com o cDNA de interesse. Após superinfecção das células hospedeira bacterianas com um tal vetor de fagemídeo e um fago auxiliar apropriado (por exemplo M13K07, VCS- M13 ou R408), partículas de fago intactas são produzidas, assim permitindo acoplamento físico do cDNA heterólogo codificado ao seu polipeptídeo correspondente exibido na superfície de fago (revisado, por exemplo, em Kay, B. K. et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual, 1a Ed., Academic Press, Nova Iorque, NI; Lowman, H. B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-424, ou Rodi, D. J., e Makowski, L., (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-93).

[086] Tais veículos de clonagem podem incluir, além das sequências reguladoras descritas acima e uma sequência de ácido nucleico codificando uma muteína de lipocalina da invenção, sequências de replicação e de controle derivadas de uma espécie compatível com a célula hospedeira que é usada para expressão como também marcadores de seleção que conferem um fenótipo selecionável nas células transformadas ou transfectadas. Números grandes de vetores de clonagem adequados são conhecidos na técnica, e estão comercialmente disponíveis.

[087] A molécula de DNA codificando as muteínas de lipocalina da invenção, e em particular um vetor de clonagem que contém a sequência de codificação de uma tal muteína de lipocalina pode ser transformada em uma célula hospedeira capaz de expressar o gene. Transformação pode ser executada usando técnicas padrões (Sambrook, J. et al. (1989), supra).

[088] Desse modo, a invenção é também direcionada a uma célula hospedeira contendo uma molécula de ácido nucleico como revelada aqui.

[089] As células hospedeiras transformadas são cultivadas sob condições adequadas para expressão da sequência de nucleotídeo codificando uma proteína de fusão da invenção. Células hospedeiras adequadas podem ser procarióticas, tais como Escherichia coli (E. coli) ou Bacillus subtilis, ou eucarióticas, tais como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, células inseto de SF9 ou High5, linhagens celulares mamíferas imortalizadas (por exemplo células HeLa ou células CHO) ou células mamíferas primárias.

[090] A invenção também diz respeito a um método para a produção de uma muteína da invenção, em que a muteína, um fragmento da muteína ou uma proteína de fusão da muteína e outro polipeptídeo é produzido a partir do ácido nucleico codificando para a muteína por meio de métodos de engenharia genética. O método pode ser realizado in vivo, a muteína pode ser, por exemplo, produzida em um organismo hospedeiro bacteriano ou eucariótico e depois isolada deste organismo hospedeiro ou sua cultura. É também possível produzir uma proteína in vitro, por exemplo através do uso de um sistema de tradução in vitro.

[091] Quando produzir a muteína in vivo, um ácido nucleico codificando uma muteína da invenção é introduzido em um organismo hospedeiro bacteriano ou eucariótico adequado por meio de tecnologia de DNA recombinante (como já esboçado acima). Para este propósito, a célula hospedeira é transformada primeiro com um vetor de clonagem compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando uma muteína da invenção usando os métodos padrões estabelecidos (Sambrook, J. et al. (1989), supra). A célula hospedeira é depois cultivada sob condições que permitam a expressão do DNA heterólogo e desse modo a síntese do polipeptídeo correspondente. Subsequentemente, o polipeptídeo é recuperado da célula ou do meio de cultivo.

[092] Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para a geração de uma muteína da invenção, compreendendo: (a) submeter uma molécula de ácido nucleico codificando uma lipocalina 2 humana à mutagênese em um tripleto de nucleotídeo codificando para pelo menos uma de quaisquer das posições de sequência correspondendo às posições de sequência 96, 100, e 106 da sequência de polipeptídeo linear de Lcn2, resultando em uma ou mais molécula(s) de ácido nucleico de muteína. O método pode ainda compreender: (b) expressar a uma ou mais molécula(s) de ácido nucleico de muteína obtida(s) em (a) em um sistema de expressão adequado, e (c) enriquecer a uma ou mais muteína(s) tendo uma afinidade de ligação detectável para um alvo dado por meio de seleção e/ou isolamento.

[093] O termo "mutagênese", como aqui usado, significa que as condições experimentais são escolhidas de modo que o aminoácido de ocorrência natural em uma posição de sequência dada de Lcn2 (hNGAL; entrada do Banco de Dados de SWISS-PROT P80188) pode ser substituído por pelo menos um aminoácido que não está presente nesta posição específica na respectiva sequência de polipeptídeo natural. O termo "mutagênese" também inclui a modificação (adicional) do comprimento dos segmentos de sequência por deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos. Desse modo, está dentro do escopo da invenção que, por exemplo, um aminoácido em uma posição de sequência escolhida é substituído por uma extensão de três mutações aleatórias, conduzindo a uma inserção de dois resíduos de aminoácido comparados ao comprimento do respectivo segmento da proteína do tipo selvagem. Uma tal inserção de deleção pode ser introduzida independentemente uma da outra em quaisquer dos segmentos de peptídeo que possam ser submetidas à mutagênese na invenção. Em uma modalidade exemplar da invenção, uma inserção de várias mutações pode ser introduzida na alça AB do andaime de lipocalina escolhido (cf. Pedido de Patente Internacional WO 2005/019256 que é aqui incorporado por referência em sua totalidade). O termo "mutagênese aleatória" significa que nenhum aminoácido simples predeterminado (mutação) está presente em uma certa posição da sequência, mas que pelo menos dois aminoácidos podem ser incorporados com uma certa probabilidade em uma posição de sequência predefinida durante a mutagênese.

[094] A sequência de codificação de Lipocalina 2 humana é usada como um ponto de partida para a mutagênese dos segmentos de peptídeo selecionados na presente invenção. Para a mutagênese das posições de aminoácido citadas, a pessoa versada na técnica tem à sua disposição vários métodos padrões estabelecidos para mutagênese dirigida (Sambrook, J. et al. (1989), supra). Uma técnica comumente usada é a introdução de mutações por meio de PCR (reação em cadeia de polimerase) usando misturas de oligonucleotídeos sintéticos que carregam uma composição de base degenerada nas posições de sequência desejadas. Por exemplo, uso do códon NNK ou NNS (em que N = adenina, guanina ou citosina ou timina; K = guanina ou timina; S = adenina ou citosina) permite a incorporação de todos os 20 aminoácidos mais o códon de terminação ambarino durante a mutagênese, enquanto que o códon VVS limita o número de aminoácidos possivelmente incorporados em 12, uma vez que exclui os aminoácidos Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val de serem incorporados na posição selecionada da sequência de polipeptídeo; uso do códon NMS (em que M = adenina ou citosina), por exemplo, restringe o número de possíveis aminoácidos em 11 em uma posição selecionada da sequência uma vez que exclui os aminoácidos Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val de serem incorporados em uma posição selecionada da sequência. Neste respeito é observado que os códons para os outros aminoácidos (que os 20 aminoácidos de ocorrência natural regulares) tais como selenocisteína ou pirrolisina podem ser também incorporados em um ácido nucleico de uma muteína. É também possível, como descrito por Wang, L. et al. (2001) Science 292, 498-500, ou Wang, L. e Schultz, P. G. (2002) Chem. Comm. 1, 1-11, usar códons "artificiais" tais como UAG que são usualmente reconhecidos como códons de terminação para inserir outros aminoácidos incomuns, por exemplo o-metil-L-tirosina ou p-aminofenilalanina.

[095] O uso de blocos de construção de nucleotídeo com especificidade reduzida de pares de base, como por exemplo inosina, 8-oxo-2'deoxiguanosina ou 6(2-deoxi-β-D-ribofuranosil)-3,4-diidro-8H- pirimindo-1,2-oxazin-7-ona (Zaccolo et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589603), é outra opção para a introdução de mutações em um segmento escolhido da sequência.

[096] Uma outra possibilidade é a assim chamada mutagênese de tripleto. Este método usa misturas de tripleto de nucleotídeo diferentes, cada um destes codificam para um aminoácido, para incorporação na sequência de codificação (Virnekas B, Ge L, Pluckthun A, Schneider KC, Wellnhofer G, Moroney SE. 1994 Trinucleotide fosforamidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res 22, 5600-5607).

[097] Uma possível estratégia para introduzir mutações nas regiões selecionadas dos respectivos polipeptídeos é com base no uso de quatro oligonucleotídeos, cada um destes é parcialmente derivado de um dos segmentos de sequência correspondentes a serem mutados. Ao sintetizar estes oligonucleotídeos, uma pessoa versada na técnica pode empregar misturas de blocos de construção de ácido nucleico para a síntese daqueles tripletos de nucleotídeo correspondendo às posições de aminoácido a serem mutadas de modo que os códons codificando todos os aminoácidos naturais fortuitamente surgem, por fim resulta na geração de uma biblioteca de peptídeos da lipocalina. Por exemplo, o primeiro oligonucleotídeo corresponde em sua sequência - além das posições mutadas - ao filamento de codificação para o segmento de peptídeo a ser mutado na posição mais N-terminal do polipeptídeo de lipocalina. Consequentemente, o segundo oligonucleotídeo corresponde ao filamento de não-codificação para o segundo segmento de sequência seguindo na sequência de polipeptídeo. O terceiro oligonucleotídeo por sua vez corresponde ao filamento de codificação para o terceiro segmento de sequência correspondente. Por fim, o quarto oligonucleotídeo corresponde ao filamento de não-codificação para o quarto segmento de sequência. Uma reação em cadeia de polimerase pode ser executada com os respectivos primeiro e segundo oligonucleotídeos e separadamente, se necessário, com os respectivos terceiro e quarto oligonucleotídeos.

[098] Os produtos de amplificação de ambas destas reações podem ser combinados por meio de vários métodos conhecidos em um ácido nucleico simples compreendendo a sequência do primeiro ao quarto segmentos de sequência, em que as mutações foram introduzidas nas posições selecionadas. Para este fim, ambos os produtos podem ser, por exemplo, submetidos a uma reação em cadeia de polimerase nova usando oligonucleotídeos de flanqueamento como também uma ou mais moléculas de ácido nucleico mediadoras que contribuem para a sequência entre o segundo e o terceiro segmento de sequência. Na escolha do número e arranjo dentro da sequência dos oligonucleotídeos usados para a mutagênese, a pessoa versada na técnica tem numerosas alternativas a seu dispor.

[099] As moléculas de ácido nucleico definidas acima podem ser conectadas através de ligação com as sequências de 5' e 3' perdidas de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo de lipocalina e/ou o vetor, e pode ser clonada em um organismo hospedeiro conhecido. Uma multidão de procedimentos estabelecidos está disponível para ligação e clonagem (Sambrook, J. et al. (1989), supra). Por exemplo, as sequências de reconhecimento para endonucleases de restrição também presentes na sequência do vetor de clonagem podem ser engenheiradas na sequência dos oligonucleotídeos sintéticos. Desse modo, após amplificação do respectivo produto de PCR e clivagem enzimática, o fragmento resultante pode ser facilmente clonado usando as sequências de reconhecimento correspondentes.

[0100] Segmentos de sequência mais longos dentro do gene codificando para a proteína selecionada para mutagênese podem ser também submetidos à mutagênese aleatória por meio de métodos conhecidos, por exemplo, pelo uso da reação em cadeia de polimerase sob condições de taxa de erro aumentada, através de mutagênese química ou usando cepas mutantes bacterianas. Tais métodos podem também ser usados para otimização adicional da afinidade ou especificidade alvo de uma muteína de lipocalina. Mutações que ocorrem possivelmente fora dos segmentos da mutagênese experimental são frequentemente toleradas ou podem ser até mesmo provadas ser vantajosas, por exemplo, se elas contribuírem para uma eficiência de dobramento ou estabilidade de dobramento melhoradas da muteína de lipocalina.

[0101] De acordo com uma modalidade da presente invenção, o método acima inclui submeter a molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de lipocalina 2 humana à mutagênese pelo menos em 2 ou 3 tripletos de nucleotídeo codificando para qualquer uma das posições de sequência indicadas acima de Lipocalina 2 humana.

[0102] Em uma outra modalidade, o método também inclui submeter a molécula de ácido nucleico à mutagênese em pelo menos um tripleto de nucleotídeo codificando para qualquer uma das posições de sequência correspondendo às posições de sequência 33, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 59, 65, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 86, 87, 98, 96, 99, 100, 103, 106, 107, 110, 111, 125, 127, 132, 134, 136 e 138 da sequência de polipeptídeo linear de hNGAL.

[0103] Em ainda uma outra modalidade, o método inclui submeter a molécula de ácido nucleico à mutagênese em tripletos de nucleotídeo codificando para pelo menos quaisquer 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 das posições de sequência correspondendo às posições de sequência 33, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 59, 65, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 86, 87, 98, 96, 99, 100, 103, 106, 107, 110, 111, 125, 127, 132, 134, 136 e 138 da sequência de polipeptídeo linear de Lipocalina 2 humana.

[0104] De acordo com o método da invenção, uma muteína é obtida a partir de um ácido nucleico codificando hNGAL. Um tal ácido nucleico é submetido à mutagênese e introduzido em um organismo hospedeiro bacteriano ou eucariótico adequado por meio de tecnologia de DNA recombinante. Obtenção de uma biblioteca de ácido nucleico de Lipocalina 2 humana pode ser realizada usando qualquer técnica adequada que seja conhecido na técnica para gerar muteínas de lipocalina com propriedades semelhantes ao anticorpo, isto é, muteínas que têm afinidade para um alvo dado. Exemplos de tais métodos combinatórios são descritos em detalhes por exemplo nos pedidos de patente internacionais WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256, ou WO 2006/56464. O conteúdo de cada um destes pedidos de patente é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Após expressão das sequências de ácido nucleico que foram submetidas à mutagênese em um hospedeiro apropriado, os clones que carregam a informação genética para a pluralidade das respectivas muteínas de lipocalina, que ligam a um alvo dado, podem ser selecionados da biblioteca obtida. Técnicas bem conhecidas podem ser empregadas para a seleção destes clones, tais como exibição de fago (revisada em Kay, B. K. et al. (1996) supra; Lowman, H. B. (1997) supra ou Rodi, D. J., e Makowski, L., (1999) supra), triagem de colônias (revisada em Pini, A. et al. (2002) Comb. Chem. High Throughput Screen. 5, 503-510), exibição de ribossoma (revisada em Amstutz, P. et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12, 400-405) ou exibição de mRNA como relatado em Wilson, D. S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755 ou os métodos especificamente descritos em WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256, ou WO 2006/56464.

[0105] De acordo com esta revelação, a etapa (c) ainda compreende em outra modalidade dos métodos acima: (i) fornecer como um alvo/ligante dado um composto selecionado do grupo que consiste em um composto químico em forma livre ou conjugado que exiba características de um hapteno imunológico, um peptídeo, uma proteína ou outra macromolécula tal como um polissacarídeo, uma molécula de ácido nucleico (DNA ou RNA, por exemplo) ou uma partícula de vírus inteira ou viroide, por exemplo, (ii) contatar a pluralidade de muteínas com o dito alvo/ligante para permitir a formação de complexos entre o dito ligante e as muteínas tendo afinidade de ligação pelo dito alvo/ligante, e (iii) remover as muteínas não tendo nenhuma ou substancialmente nenhuma afinidade de ligação.

[0106] Em modalidades específicas da invenção, o alvo/ligante é um alvo não-natural que inclui, mas não é limitado a um peptídeo, uma proteína, um fragmento ou um domínio de uma proteína, ou uma molécula orgânica pequena. Em uma modalidade, a molécula orgânica pequena é um composto mostrando as características de um hapteno imunológico. Em uma outra modalidade, o peptídeo é um peptídeo beta amiloide, tal como peptídeo Aβ40 ou um peptídeo Aβ42. Em ainda outra modalidade, o alvo não-natural é fibronectina ou um domínio do mesmo, tal como o EB-domínio ou um fragmento do EB-domínio.

[0107] Em uma modalidade dos métodos da invenção, a seleção na etapa (c) é realizada sob condições competitivas. Condições competitivas, como aqui usadas, significam que a seleção das muteínas abrange pelo menos uma etapa em que as muteínas e o ligante não- natural dado de Lipocalina 2 humana (alvo) é colocado em contato na presença de um ligante adicional que compete com a ligação das muteínas ao alvo. Este ligante adicional pode ser um ligante fisiológico do alvo, um excesso do alvo em si ou qualquer outro ligante não- fisiológico do alvo que ligue pelo menos um epítopo de sobreposição ao epítopo reconhecido pelas muteínas da invenção e, desse modo, interfira com a ligação alvo das muteínas. Alternativamente, o ligante adicional compete com a ligação das muteínas complexando um epítopo distinto do sítio de ligação das muteínas ao alvo através de efeitos alostéricos.

[0108] Uma modalidade da técnica de exibição de fago (revisada em Kay, B. K. et al. (1996), supra; Lowman, H. B. (1997) supra ou Rodi, D. J., e Makowski, L., (1999), supra) usando fago M13 temperado é dada como um exemplo de um método de seleção que pode ser empregado na presente invenção. Outra modalidade da tecnologia de exibição de fago que pode ser usada para a seleção das muteínas da invenção é a tecnologia de fago de hiperfago como descrita por Broders et al. (Broders et al. (2003) "Hyperphage. Improving antibody presentation in phage display". Methods Mol. Biol. 205:295-302). Outro fago temperado, tal como f1, ou fago lítico, tal como T7, pode ser empregado também. Para o método de seleção exemplar, os fagemídeos de M13 são produzidos, que permite a expressão da sequência de ácido nucleico de lipocalina mutada como uma proteína de fusão com uma sequência sinal no término N, preferivelmente a sequência sinal de OmpA, e com a proteína de capsídeo pIII do fago M13, ou seus fragmentos, capaz de ser incorporada no capsídeo de fago no término C. O fragmento C-terminal ΔpIII da proteína de capsídeo de fago compreendendo os aminoácidos 217 a 406 da sequência do tipo selvagem é preferivelmente usado para produzir as proteínas de fusão. Especialmente preferido em uma modalidade é um fragmento C- terminal de pIII, em que o resíduo de cisteína na posição 201 é perdido ou é substituído por outro aminoácido.

[0109] Consequentemente, uma outra modalidade dos métodos da invenção envolve operavelmente fundir um ácido nucleico codificando para a pluralidade de muteínas de Lipocalina 2 humana e resultante da mutagênese na extremidade 3' com um gene codificando para a proteína do capsídeo pIII de um bacteriófago filamentoso da família de M13 ou para um fragmento desta proteína do capsídeo para selecionar pelo menos uma muteína para a ligação de um ligante dado.

[0110] A proteína de fusão pode compreender componentes adicionais tais como um marcador de afinidade que permita a imobilização, detecção e/ou purificação da proteína de fusão ou suas partes. Além disso, um códon de terminação pode estar localizado entre as regiões de sequência codificando a Lipocalina ou suas muteínas e o gene de capsídeo de fago ou seus fragmentos, em que o códon de terminação, preferivelmente um códon de terminação ambarino, é pelo menos parcialmente traduzido em um aminoácido durante a tradução em uma cepa supressor adequada.

[0111] Por exemplo, o vetor de fasmídeo pTLPC27, agora também chamado pTlc27, que é descrito aqui, pode ser usado para a preparação de uma biblioteca de fagemídeo codificando muteínas de lipocalina 2 humana. As moléculas de ácido nucleico inventivas codificando para as muteínas de hNGAL são inseridas no vetor usando os dois sítios de restrição BstXI. Após ligação a uma cepa hospedeira adequada tal como E. coli, XL1-Blue é transformada com a mistura de ácido nucleico resultante para render um número grande de clones independentes. Um respectivo vetor pode ser gerado para a preparação de uma biblioteca de hiperfagemídeos, se desejado.

[0112] A biblioteca resultante é subsequentemente superinfectada em cultura líquida com um fago auxiliar ou hiperfago de M13 apropriado para produzir fagemídeos funcionais. O fagemídeo recombinante exibe a muteína de lipocalina em sua superfície como uma fusão com a proteína do capsídeo pIII ou um fragmento da mesma, enquanto a sequência sinal N-terminal da proteína de fusão é normalmente clivada. Por outro lado, ela também carrega uma ou mais cópias da proteína de capsídeo nativa pIII fornecida pelo fago auxiliar e, desse modo, é capaz de infetar um recipiente, em geral uma cepa bacteriana que carrega um plasmídeo F ou F'. No caso da exibição do hiperfago, os hiperfagomídeos exibem as muteínas de lipocalina em sua superfície como uma fusão com a proteína do capsídeo pIII infecciosa mas nenhuma proteína de capsídeo nativa. Durante ou após a infecção com o fago ou hiperfago auxiliar, a expressão gênica da proteína de fusão entre a muteína de lipocalina e a proteína de capsídeo pIII pode ser induzidas, por exemplo por adição de anidrotetraciclina. As condições de indução são escolhidas de modo que uma fração substancial dos fagemídeos obtidos apresente pelo menos uma muteína de lipocalina em sua superfície. No caso de apresentação de hiperfago, as condições de indução resultam em uma população de hiperfagomídeos carregando entre três e cinco proteínas de fusão que consistem na muteína de lipocalina e na proteína de capsídeo pIII. Vários métodos são conhecidos para isolar os fagemídeos, tais como precipitação com polietileno glicol. Isolamento tipicamente ocorre após um período de incubação de 6-8 horas.

[0113] Os fasmídeos isolados podem ser depois submetidos à seleção através de incubação com o alvo desejado, em que o alvo é apresentado em uma forma que permite pelo menos imobilização temporária daqueles fagemídeos carregando muteínas com a atividade de ligação desejada como proteínas de fusão em seu capeamento. Entre as várias modalidades conhecidas à pessoa versada na técnica, o alvo pode, por exemplo, ser conjugado com uma proteína de veículo tal como albumina sérica e ser ligado por meio desta proteína de veículo a uma superfície de ligação de proteína, por exemplo poliestireno. Placas de microtitulação adequadas para as técnicas de ELISA ou assim chamadas "Immuno-stick" podem preferivelmente ser usadas para uma tal imobilização do alvo. Alternativamente, conjugados do alvo podem ser usados com outros grupos de ligação, tais como biotina. O alvo pode ser depois imobilizado em uma superfície que seletivamente liga este grupo, por exemplo placas de microtitulação ou partículas paramagnéticas revestidas com estreptavidina, neutravidina ou avidina. Se o alvo for fundido em uma porção de Fc de uma imunoglobulina, a imobilização pode ser também alcançada com superfícies, por exemplo placas de microtitulação ou partículas paramagnéticas, que são revestidas com proteína A ou proteína G.

[0114] Sítios de ligação de fagemídeos não-específicos presentes nas superfícies podem ser saturados com soluções de bloqueio visto que são conhecidas pelos métodos de ELISA. Os fagemídeos são depois tipicamente colocados em contato com o alvo imobilizado na superfície na presença de um tampão fisiológico. Fagemídeos não- ligados são removidos através de múltiplas lavagens. As partículas de fagemídeo que permanecem na superfície são depois eluídas. Para eluição, vários métodos são possíveis. Por exemplo, os fagemídeos podem ser eluídos por adição de proteases ou na presença de ácidos, bases, detergentes ou sais caotrópicos ou sob condições moderadamente desnaturantes. Um método preferido é a eluição usando tampões de pH 2,2, em que o eluato é subsequentemente neutralizado. Alternativamente, uma solução do alvo livre pode ser adicionada para competir com o alvo imobilizado para ligar aos fagemídeos ou os fagemídeos alvo-específicos podem ser eluídos por competição com as imunoglobulinas ou as proteínas ligantes naturais que especificamente ligam ao alvo de interesse.

[0115] Depois, as células de E. coli são infetadas com os fagemídeos eluídos. Alternativamente, os ácidos nucleicos podem ser dos fagemídeos eluídos e usados para análise de sequência, amplificação ou transformação celular de outra maneira. A partir dos clones de E. coli desse modo obtidos, os fagemídeos frescos ou hiperfagomídeos são produzidos novamente através de superinfecção com fagos auxiliares ou hiperfago de M13 de acordo com o método descrito acima e os fagemídeos amplificados são, desse modo, submetidos uma vez mais a uma seleção no alvo imobilizado. Múltiplos ciclos de seleção são frequentemente necessários para obter os fagemídeos com as muteínas da invenção em forma suficientemente enriquecida. O número de ciclos de seleção é preferivelmente escolhido de modo que na análise funcional subsequente pelo menos 0,1% dos clones estudados produz muteínas com afinidade detectável pelo alvo dado. Dependendo do tamanho, isto é, da complexidade da biblioteca empregada, 2 a 8 ciclos são tipicamente requeridos para esta extremidade.

[0116] Para a análise funcional das muteínas selecionadas, uma cepa de E. coli é infetada com os fagemídeos obtidos dos ciclos de seleção e o DNA do fasmídeo de fita dupla correspondente é isolado. A partir deste DNA do fasmídeo, o DNA, ou também do DNA de fita simples extraído dos fagemídeos, as sequências de ácido nucleico das muteínas selecionadas da invenção podem ser determinadas pelos métodos conhecidos na técnica e a sequência de aminoácido pode ser dela deduzida. A região mutada ou a sequência da muteína de hNGAL inteira pode ser subclonada em outro vetor de expressão e expressadas em um organismo hospedeiro adequado. Por exemplo, o vetor pTLPC26, agora também chamado de pTlc26, pode ser usado para a expressão nas cepas de E. coli tais como TG1 de E. coli. As muteínas de Lipocalina 2 humana desse modo produzidas podem ser purificadas por vários métodos bioquímicos. As muteínas de hNGAL produzidas, por exemplo com pTlc26, carregam o peptídeo de afinidade Strep-tag II (Schmidt et al., supra) em seus C-terminais e, portanto, podem ser preferivelmente purificadas por meio de cromatografia de afinidade de estreptavidina.

[0117] A seleção pode ser também realizada por meio de outros métodos. Muitas modalidades correspondentes são conhecidas à pessoa versada na técnica ou são descritas na literatura. Além disso, uma combinação de métodos pode ser aplicada. Por exemplo, clones selecionados ou pelo menos enriquecidos por "exibição de fago" podem ser adicionalmente submetidos à "triagem de colônia". Este procedimento tem a vantagem que os clones individuais podem ser diretamente isolados com respeito à produção de uma muteína de lipocalina 2 humana com afinidade de ligação detectável para um alvo.

[0118] Além do uso de E. coli como organismo hospedeiro na técnica de "exibição de fago" ou no método de "triagem de colônias", outras cepas bacterianas, levedura ou também células de inseto ou células mamíferas podem ser usadas para este propósito. Ainda para a seleção de uma muteína de lipocalina 2 humana a partir de uma biblioteca aleatória como descrita acima, métodos evolutivos incluindo mutagênese limitada podem ser também aplicados para otimizar uma muteína que já possui alguma atividade de ligação para o alvo com respeito à afinidade ou especificidade para o alvo.

[0119] Uma vez uma muteína com afinidade para um alvo dado foi selecionada, é adicionalmente possível submeter uma tal muteína à outra mutagênese a fim de subsequentemente selecionar variantes de afinidade até mais altas ou variantes com propriedades melhoradas tais como termoestabilidade mais alta, estabilidade em soro melhorada, estabilidade termodinâmica, solubilidade melhorada, comportamento monomérico melhorado, resistência melhorada contra desnaturação térmica, desnaturação química, proteólise, ou detergentes etc. Esta outra mutagênese, que no caso de visar a afinidade mais alta pode ser considerada como "maturação de afinidade" in vitro, pode ser alcançada através de mutação sítio-específica com base no projeto racional ou uma mutação aleatória. Outra possível abordagem para obter uma afinidade mais alta ou propriedades melhoradas é o uso de PCR propensa a erros que resulta em mutações de ponto em uma faixa selecionada de posições de sequência da muteína de lipocalina. A PCR propensa a erros pode ser realizada de acordo com qualquer protocolo conhecido tal como o descrito por Zaccolo et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603. Outros métodos de mutagênese aleatória que são adequados para tais propósitos incluem mutagênese de inserção/deleção aleatória (RID) como descrita por Murakami et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20, 7681 ou recombinação aleatória não-homóloga (NRR) como descrita por Bittker et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20,1024-1029. Se desejado, a maturação de afinidade pode ser também realizada de acordo com o procedimento descrito em WO 00/75308 ou Schlehuber et al. (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120, onde as muteínas da proteína de ligação de bilina tendo afinidade alta para digoxigenina foram obtidas. Uma outra abordagem para melhorar a afinidade é realizar mutagênese de saturação posicional. Nesta abordagem, bibliotecas de ácido nucleico "pequenas" podem ser criadas em que as permutas/mutações de aminoácido são apenas introduzidas nas posições simples dentro de qualquer um dos quatro segmentos de alça. Estas bibliotecas são depois diretamente submetidas a uma etapa de seleção (triagem por afinidade) sem outros ciclos de batelamento (panning - técnica de aderência celular à superfície sólida). Esta abordagem permite a identificação de resíduos que contribuem para a ligação melhorada do alvo desejado e permitem identificação de "pontos quente" (hot spots) que são importantes para a ligação.

[0120] Em uma modalidade, o método acima para modificar uma muteína também inclui introduzir um resíduo de Cys em pelo menos uma de quaisquer das posições de sequência correspondendo às posições de sequência 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 ou 158 da sequência do tipo selvagem de Lipocalina 2 humana e acoplar uma metade que seja capaz de modificar a meia-vida no soro da dita muteína por meio do grupo tiol de um resíduo de Cys introduzido em pelo menos uma de quaisquer das posições de sequência correspondendo às posições de sequência 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 ou 158 da sequência do tipo selvagem de hNGAL. A metade que é capaz de modificar a meia-vida no soro da dita muteína pode ser selecionada do grupo que consiste em uma molécula de polialquileno glicol e hidroxietilsamido.

[0121] Em um outro aspecto, a presente invenção é direcionada a uma muteína de Lipocalina 2 humana tendo afinidade de ligação detectável para um ligante não-natural dado de Lipocalina 2 humana que é obtenível ou obtido pelos métodos acima detalhados da invenção.

[0122] Em alguma muteína de lipocalina 2 humana da invenção, a ligação de dissulfeto de ocorrência natural entre Cys 76 e Cys 175 é removida. Consequentemente, tais muteínas (ou qualquer outro muteína de lipocalina 2 humana não compreendendo uma ligação de dissulfeto intramolecular) podem ser produzidas em um compartimento celular tendo um ambiente de redox reduzindo, por exemplo, no citoplasma das bactérias Gram-negativas.

[0123] No caso de uma muteína de lipocalina da invenção compreender ligações de dissulfeto intramoleculares, pode ser preferido direcionar o polipeptídeo nascente para um compartimento celular tendo um ambiente de redox oxidante usando uma sequência sinal apropriada. Um tal ambiente oxidante pode ser fornecido pelo periplasma das bactérias Gram-negativas tais como E. coli, no ambiente extracelular de bactérias Gram-positivas ou no lúmen do retículo endoplasmático das células eucarióticas e usualmente favorece a formação de ligações de dissulfeto estruturais.

[0124] Porém, é também possível produzir uma muteína da invenção no citosol de uma célula hospedeira, preferivelmente E. coli. Neste caso, o polipeptídeo ou pode ser obtido diretamente em um estado solúvel e dobrado ou recuperado em forma de corpos de inclusão, seguido por renaturação in vitro. Uma outra opção é o uso de cepas hospedeiras específicas tendo um ambiente intracelular oxidante que pode permitir, desse modo, a formação de ligações de dissulfeto no citosol (Venturi et al. (2002) J. Mol. Biol. 315, 1-8.).

[0125] Porém, uma muteína da invenção não necessariamente pode ser gerada ou produzida apenas por uso de engenharia genética. Do contrário, uma muteína de lipocalina pode ser também obtida através de síntese química tal como síntese de polipeptídeo de fase sólida de Merrifield ou por transcrição e tradução in vitro. Por exemplo, é possível que as mutações promissoras sejam identificadas usando modelagem molecular e depois sintetizar o polipeptídeo desejado (projetado) in vitro e investigar a atividade de ligação para um alvo dado. Métodos para a síntese de fase sólida e/ou de fase de solução das proteínas são bem conhecidos na técnica (revisados, por exemplo, em Lloyd-Williams et al. (1997) Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins. CRC Press, Boca Raton, Fields, GB, e Colowick (1997) Solid-Phase Peptide Synthesis. Academic Press, San Diego, ou Bruckdorfer et al. (2004) Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29-43).

[0126] Em outra modalidade, as muteínas da invenção podem ser produzidas por transcrição/tradução in vitro empregando métodos bem estabelecidos conhecidos àqueles versados na técnica.

[0127] A invenção também diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma muteína inventiva referida nas reivindicações ou uma proteína de fusão ou seus conjugados e, opcionalmente, um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0128] As muteínas de lipocalina de acordo com a invenção podem ser administradas por meio de rota parenteral ou não-parenteral (enteral) que seja terapeuticamente efetiva para fármacos proteináceos. Métodos de aplicação parenterais compreendem, por exemplo, injeção intracutânea, subcutânea, intramuscular ou intravenosa e técnicas de infusão, por exemplo na forma de soluções de injeção, soluções de infusão ou tinturas, como também instalação e inalação de aerossol, por exemplo na forma de misturas, pulverizações ou pós de aerossol. Por exemplo, os modos de liberação não-parenteral são oralmente, por exemplo na forma de pílulas, tabletes, cápsulas, soluções ou suspensões, ou retalmente, por exemplo na forma de supositórios. As muteínas da invenção podem ser administradas sistêmica ou topicamente em formulações contendo excipientes ou carreadores, aditivos e veículos convencionais, farmaceuticamente aceitáveis não- tóxicos como desejado.

[0129] Em uma modalidade da presente invenção o farmacêutico é administrado parenteralmente a um mamífero, e em particular a seres humanos. Métodos de administração correspondentes incluem, mas não são limitados a, por exemplo, injeção intracutânea, subcutânea, intramuscular ou intravenosa e técnicas de infusão, por exemplo na forma de soluções de injeção, soluções de infusão ou tinturas como também instalação e inalação de aerossol, por exemplo na forma de misturas, pulverizações ou pós de aerossol. Uma combinação de infusão e/ou injeção intravenosa e subcutânea poderia ser muito conveniente no caso de compostos com uma meia-vida em soro relativamente curta. A composição farmacêutica pode ser uma solução aquosa, uma emulsão de óleo-em-água ou uma emulsão de água-em-óleo.

[0130] Nesta consideração, observa-se que tecnologias de liberação transdérmicas, por exemplo iontoforese, sonoforese ou liberação intensificada com microagulha, como descritas em Meidan e Michniak (2004) Am. J. Ther. 11(4), 312-316, podem ser também usadas para liberação transdérmica das muteínas descritas aqui. Por exemplo, modos de liberação não-parenterais são orais, por exemplo na forma de pílulas, tabletes, cápsulas, soluções ou suspensões, ou administração retal, por exemplo na forma de supositórios. As muteínas da invenção podem ser administradas sistêmica ou topicamente em formulações contendo uma variedade de excipientes ou carreadores, aditivos, e veículos farmaceuticamente aceitáveis não-tóxicos convencionais.

[0131] A dosagem da muteína aplicada pode variar dentro de amplos limites para alcançar o efeito preventivo ou resposta terapêutica desejada. Por exemplo, ela dependerá da afinidade do composto por um ligante escolhido como também da meia-vida do complexo entre a muteína e o ligante in vivo. Ainda, a ótima dosagem dependerá da biodistribuição da muteína ou sua proteína de fusão ou seu conjugado, o modo de administração, a severidade da doença/distúrbio sendo tratado como também da condição médica do paciente. Por exemplo, quando usado em um unguento para aplicações tópicas, uma concentração alta da muteína de Lipocalina 2 humana pode ser usada. Porém, se desejado, a muteína pode ser também dada em uma formulação de liberação contínua, por exemplo dispersões lipossomais ou microesferas poliméricas com base em hidrogel, como PolyActive™ ou OctoDEX™ (cf. Bos et al., Business Briefing: Pharmatech 2003: 1-6).

[0132] Consequentemente, as muteínas da presente invenção podem ser formuladas em composições usando ingredientes farmaceuticamente aceitáveis como também métodos estabelecidos de preparação (Gennaro e Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Filadélfia, PA). Para preparar as composições farmacêuticas, podem ser usados excipientes inorgânicos ou orgânicos farmaceuticamente inertes. Para preparar por exemplo pílulas, pós, cápsulas de gelatina ou supositórios, por exemplo, lactose, talco, ácido esteárico e seus sais, gorduras, ceras, polióis sólidos ou líquidos, óleos naturais e endurecidos podem ser usados. Excipientes adequados para a produção de soluções, suspensões, emulsões, misturas ou pós de aerossol para reconstituição em soluções ou misturas de aerossol antes do uso incluem água, alcoóis, glicerol, polióis, e misturas adequadas dos mesmos como também óleos vegetais.

[0133] A composição farmacêutica pode também conter aditivos, tais como, por exemplo, enchedores, aglutinantes, agentes umectantes, deslizantes, estabilizantes, conservantes, emulsificantes, e, além disso, solventes ou solubilizantes ou agentes para alcançar um efeito de depósito. O último é que as proteínas de fusão podem ser incorporadas em sistemas de liberação lenta ou contínua ou de liberação visada, tais como lipossomas e microcápsulas.

[0134] As formulações podem ser esterilizadas através de numerosos meios, incluindo filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou incorporando agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou podem ser dispersadas em água estéril ou outro meio estéril apenas antes do uso.

[0135] Uma muteína da presente invenção ou uma proteína de fusão ou um conjugado da mesma pode ser empregada em muitas aplicações. Em geral, uma tal muteína pode ser usada em todas as aplicações anticorpos são usados, exceto aqueles que especificamente contam com a glicosilação da parte Fc.

[0136] Portanto, em outro aspecto da invenção, as muteínas inventadas de Lipocalina 2 humana são usadas para a ligação e/ou detecção de um ligante não-natural dado de Lipocalina 2 humana. Tal uso pode compreender as etapas de contatar a muteína com uma amostra suspeitada de conter o ligante dado sob condições adequadas, assim permitindo a formação de um complexo entre a muteína e o ligante dado, e detectar a muteína complexada por um sinal adequado.

[0137] O sinal detectável pode ser causado por uma marcação, como explicado acima, ou por uma alteração das propriedades físicas devido à ligação, isto é, a formação de complexo, em si. Um exemplo é ressonância plasmônica de superfície, o valor desta é alterado durante a ligação dos pares de ligação dos quais são imobilizados em uma superfície tal como uma chapa de ouro.

[0138] As muteínas de Lipocalina 2 humana reveladas aqui podem ser também usadas para a separação de um ligante não-natural dado de Lipocalina 2 humana. Tal uso pode compreender as etapas de contatar a muteína com uma amostra suposta conter o dito ligante sob condições adequadas, assim permitindo a formação de um complexo entre a muteína e o ligante dado, e separar o complexo de muteína/ligante da amostra.

[0139] Em ambos o uso da muteína para a detecção de um ligante não-natural dado como também a separação de um ligante dado, a muteína e/ou o alvo podem ser imobilizados em uma fase sólida adequada.

[0140] A muteína de Lipocalina 2 humana da invenção pode ser também usada para visar um composto em um sítio pré-selecionado. Em uma tal modalidade, uma muteína de Lipocalina 2 humana é usada para o direcionamento de um composto farmaceuticamente ativo para um sítio pré-selecionado em um organismo ou tecido, compreendendo: a) conjugar a muteína com o dito composto, e b) liberar o complexo de muteína/composto ao sítio pré- selecionado.

[0141] Para um tal propósito, a muteína é contatada com o composto de interesse para permitir a formação do complexo. Depois o complexo compreendendo a muteína e o composto de interesse é liberado ao sítio pré-selecionado. Isso pode ser alcançado, por exemplo, acoplando a muteína a uma metade de direcionamento, tal como um anticorpo, fragmento de anticorpo ou muteína de lipocalina ou fragmento da muteína de lipocalina com afinidade de ligação pelo alvo selecionado.

[0142] Este uso é, em particular, adequado, mas não restrito, para liberar um fármaco (seletivamente) a um sítio pré-selecionado em um organismo, tal como uma parte do corpo, tecido ou órgão infetado que é suposto ser tratado com o fármaco. Além da formação de um complexo entre a muteína e composto de interesse, a muteína pode ser também reagida com o composto dado para render um conjugado de muteína e composto. Similar ao complexo acima, um tal conjugado pode ser adequado para liberar o composto ao sítio alvo pré-selecionado. Um tal conjugado de muteína e composto pode também incluir um ligante que covalentemente liga a muteína e o composto um ao outro. Opcionalmente, um tal ligante é estável na circulação sanguínea mas é clivável em um ambiente celular.

[0143] As muteínas reveladas aqui e seus derivados podem ser, desse modo, usados em muitos campos similares para anticorpos ou seus fragmentos. Além de seu uso para ligar a um suporte, permitindo o alvo de uma muteína dada ou um conjugado ou uma proteína de fusão deste alvo ser imobilizado ou separado, as muteínas podem ser usadas para marcação com uma enzima, um anticorpo, uma substância radioativa ou qualquer outro grupo tendo atividade bioquímica ou características de ligação definidas. Assim fazendo, seus respectivos alvos ou conjugados ou proteínas de fusão dos mesmos podem ser detectados ou colocados em contato com eles. Por exemplo, as muteínas da invenção podem servir para detectar estruturas químicas por meio de métodos analíticos estabelecidos (por exemplo, ELISA ou Western blot) ou por microscopia ou imunossensóricos. Aqui, o sinal de detecção pode ser gerado diretamente pelo uso de um conjugado de muteína adequado ou proteína de fusão ou indiretamente por detecção imunoquímica da muteína ligada por meio de um anticorpo.

[0144] Numerosas possíveis aplicações para as muteínas inventivas também existem na medicina. Além de seu uso em diagnósticos e liberação de fármaco, um polipeptídeo mutante da invenção que liga por exemplo, moléculas de superfície celulares específicas ao tecido ou ao tumor podem ser geradas. Uma tal muteína pode ser, por exemplo, empregada na forma conjugada ou como uma proteína de fusão para "imageamento do tumor" ou diretamente para terapia de câncer.

[0145] Desse modo, a presente invenção também envolve o uso da muteína de Lipocalina 2 humana da invenção para a formação de complexo com um dado ligante ou alvo não-natural.

[0146] Em um outro aspecto, a presente invenção também abrange o uso de uma muteína de acordo com a invenção para a fabricação de uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica desse modo obtida pode ser adequada para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos, tais como doença de Alzheimer. A composição farmacêutica pode ser também usada para o tratamento de câncer, tratamento de fibrose ou tratamento de uma inflamação. A composição farmacêutica pode ser usada como monoterapia ou como terapia de combinação.

[0147] Em ainda outro aspecto, a presente invenção caracteriza um kit diagnóstico ou analítico que compreende uma muteína de acordo com a presente invenção.

[0148] Outro aspecto da presente invenção diz respeito a um método de tratar um sujeito sofrendo de uma doença neurodege- nerativa, ou câncer, ou fibrose, ou uma inflamação, incluindo administrar uma respectiva muteína da invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo uma muteína da invenção a um sujeito em necessidade do mesmo.

[0149] O sujeito em necessidade de um tal tratamento pode ser um mamífero, tal como um ser humano, um cachorro, um camundongo, um rato, um porco, um macaco tal como macacos cinomolgos para citar apenas alguns exemplos ilustrativos.

[0150] Em ainda outro aspecto, a presente invenção caracterizada um método para imageamento in vivo em um sujeito, incluindo administrar ao dito sujeito uma muteína da invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo uma muteína da invenção. O sujeito pode ser definido como acima.

[0151] A invenção é ainda ilustrada pelos Exemplos não-limitativos seguintes e pelos desenhos anexados, em que:

[0152] FIGURA 1 ilustra a estratégia de montagem da PCR para a mutagênese aleatória simultânea das 20 posições de aminoácido 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, e 134 (sublinhadas e numeradas) na sequência de aminoácido do Lcn2 madura. Estas 20 posições foram divididas em quatro subconjuntos de sequência. Para randomização dos aminoácidos em cada subconjunto foi sintetizado um oligodeoxinucleotídeo (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4) em que as misturas de NNK dos nucleotídeos foram empregadas nos códons mutados. N quer dizer uma mistura de todas as quatro bases A, C, G, e T enquanto K quer dizer uma mistura de apenas as duas bases G e T; consequentemente um tal tripleto codifica todos os 20 aminoácidos naturais como também o códon de terminação ambarino TAG, que é traduzido como glutamina nas cepas supE de XL1-Blue de E. coli (Bullock et al., Biotechniques 5 (1987), 376-378) ou TG1 (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Press) que foi usado para a produção de fagemídeo e expressão gênica. Quatro oligodeoxinucleotídeos adicionais (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8) com as sequências de nucleotídeo fixas correspondendo ao filamento de não-codificação (escrito abaixo da sequência de DNA de fita dupla na direção 3'-5') e preenchendo os intervalos entre os oligodeoxinucleotídeos acima mencionados foram também usados na reação de montagem. Dois oligodeoxinucleotídeos de flanqueamento mais curtos (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10), que foram adicionados em excesso e carregaram grupos biotina, serviram como iniciadores para a amplificação de PCR do fragmento de gene completamente sintético, montado. Os dois iniciadores de flanquea- mento cada abrangiam um sítio de restrição BstXI (CCANNNNNNTGG), dando origem a extensões mutuamente não-compatíveis no digesto enzimático. Este arranjo especial dos sítios de restrição permitiu uma ligação particularmente eficiente e clonagem do gene sintético. Substituição do aminoácido Gln28 por His com respeito à sequência de Lcn2 original foi necessária para introduzir o primeiro sítio de BstXI, enquanto o segundo ocorre naturalmente no cDNA de Lcn2. Além disso, o resíduo não pareado Cys87 foi substituído por Ser durante a montagem do gene. Após uma PCR de pote, o fragmento de gene resultante foi inserido em um vetor fornecendo as partes perdidas do gene estrutural de Lcn2. Esta ilustração também descreve dois iniciadores curtos (SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 46) a montante e a jusante, respectivamente, do cassete flanqueado pelos dois sítios de restrição BstXI que serviram para sequenciamento de DNA de fita dupla.

[0153] FIGURA 2 ilustra a sequência de nucleotídeo de uma biblioteca de genes de Lcn2 sintéticos (apenas o cassete central flanqueado pelos dois sítios de restrição BstXI, como na Figura 1, é mostrado). Este fragmento de gene foi preparado através de Sloning BioTechnology GmbH. Comparado com a biblioteca de DNA descrita na Figura 1 há duas diferenças. Primeira, sempre que possível, códons otimizados para a expressão de E. coli foram usados do início ao fim para as posições de aminoácido não-mutadas. Segunda, uma mistura de 19 tripletos diferentes (GAC, TTC, CTG, CAC, AAT, AGC, ACC, GCA, ATG, CCT, GTT, TGG, GAG, CAA, ATC, GGA, CGT, GCA, TAC), cada codificando um aminoácido diferente exceto Cys, foi empregada nas 20 posições randomizadas que são idênticas às descritas na Figura 1. Numeração dos aminoácidos corresponde aqui a um esquema interno empregado por Sloning BioTechnology GmbH, por meio do qual Gly n. 1 é o primeiro códon de aminoácido seguindo diretamente o sítio de restrição de BstX1 a montante.

[0154] FIGURA 3 mostra os perfis de eluição de SEC das proteínas de fusão de Aβ recombinante Trx-Aβ28 (A) e MBP-Aβ40 (B) após expressão em E. coli. A pureza de ambas as proteínas de fusão Aβ40 sintética e Aβ recombinante foi avaliada por análise de SDS-PAGE (C). Ambas as proteínas de fusão foram expressadas no citoplasma de JM83 de E. coli. Após rompimento das células com uma Célula de Pressão Francesa, as proteínas foram purificadas por meio de cromatografia de afinidade com marcador His6 e depois ainda aplicadas a uma coluna Superdex 75 H 10/30 no caso de Trx-Aβ28 ou a uma coluna Superdex 200 H 10/30 no caso de MBP-Aβ40. Ambas as proteínas eluíram principalmente como monômero na cromatografia de exclusão de tamanho e foram essencialmente homogêneas após purificação. Aβ40 foi obtida da Keck Foundation, tratada com HFIP, evaporada em um SpeedVac e por fim dissolvida em H2O destilado. O gel a 15% mostra amostras de Aβ40 após o tratamento de HFIP e Trx- Aβ28 e MBP-Aβ40 após purificação de IMAC e SEC. M descreve o marcador de peso molecular com os tamanhos de banda correspondentes em kDa exibidos na esquerda do gel.

[0155] FIGURA 4 representa uma sobreposição dos perfis de eluição de SEC das muteínas de Lcn2 H1-G1, S1-A4 e US7 (A) e a análise das proteínas purificadas por meio de 15% de SDS-PAGE (B). As três muteínas de Lcn2 H1-G1, S1-A4, e US7 foram expressadas no periplasma de JM83 de E. coli ou TG1-F- (como mostrado aqui) e purificadas por meio de cromatografia de afinidade Strep-tag II. Todas as três muteínas eluíram predominantemente como proteínas monoméricas da coluna Superdex 75 H 10/30 com um volume de retenção de 10 a 11 mL. As intensidades de pico diferiram dependendo do rendimento da expressão da muteína particular. (B) mostra uma análise de 15% de SDS-PAGE de Lcn2 do tipo selvagem recombinante (rotas 1, 5) e as muteínas US7 (rotas 2, 6), H1-G1 (rotas 3, 7), e S1-A4 (rotas 4, 8) após purificação por afinidade de Strep-tag II e SEC. Rotas 1-4 mostram as muteínas de Lcn2 reduzidas com 2-mercaptoetanol, rotas 5-8 mostram as proteínas sob condições não-redutoras. M representa o marcador de peso molecular com os tamanhos de banda correspondentes em kDa exibidos na esquerda do gel.

[0156] FIGURA 5 descreve a atividade de ligação das muteínas de Lcn2 H1-G1, S1-A4, e US7 em ELISAs de captura com diferentes alvos de Aβ biotinilada. StrepMAB-Immo a 10 μg/mL foi imobilizado em placas de microtitulação e empregado para captura de 1 μM de muteínas de Lcn2 por meio do Strep-tag II. Nas figuras A a C, a ligação das muteínas de Lcn2 S1-A4 e US7 a (A) Aβ40 biotinilada, (B) Trx-Aβ28 biotinilada, e (C) MBP-Aβ40 biotinilada é mostrada. Ligação foi detectada através de incubação com ExtrAvidin/AP e uma reação cromogênica subsequente com pNPP. Ovalbumina (Óva), tiorredoxina (Trx), e proteína ligante de maltose (MBP) foram usadas como controles negativos. Adicionalmente, ligação da lipocalina do tipo selvagem (wt) foi testada. Os dados foram ajustados a um modelo de ligação monovalente. Figura D mostra a mesma organização de ELISA executada com H1-G1 de Lcn2 e Aβ40 biotinilada e Trx-Aβ28 como alvos. Valores de KD determinados para Aβ40 foram 2,7 nM para S1-A4, 6,8 nM para US7, e 16,2 nM para H1- G1, valores correspondentes para Trx-Aβ28 foram 1,9 nM, 2,4 nM, e 24,3 nM. Ligação a MBP-Aβ40 mostrou um valor de KD de 4,7 nM para S1-A4 e 11,4 nM para US7. Consequentemente, os valores de KD para Aβ16-27 foram 2,6 nM e 2,1 nM.

[0157] FIGURA 6 mostra a atividade de ligação das muteínas de Lcn2 S1-A4 e US7 em um ELISA direto. O Aβ visa Trx-Aβ28 e MBP- Aβ40 como também a proteína de controle proteína ligante de maltose (MBP) foram imobilizada em 2 μM em PBS durante a noite. As muteínas de Lcn2 ligadas foram detectadas por meio de seu Strep-tag II usando Estreptavidina/AP seguida por uma reação cromogênica com pNPP. Como um controle, a ligação de lipocalina do tipo selvagem (wt) foi testada. Os dados foram ajustados em um modelo de ligação monovalente. Valores de KD determinados para Trx-Aβ28 foram 16,2 nM para S1-A4 e 9,6 nM para US7, os valores correspondentes para MBP-Aβ40 foram 149 nM e 49,7 nM.

[0158] FIGURA 7 mostra a atividade de ligação das muteínas de Lcn2 S1-A4 (A) e US7 (B) em um ELISA competitivo. StrepMAB-Immo foi imobilizado em 10 μg/mL em placas de microtitulação e empregado para captura de 1 μM de muteína de Lcn2 por meio do Strep-tag II. Para competição, uma concentração constante de Trx-Aβ28 biotinilada como investigador foi misturada com concentrações variadas de Trx-Aβ28 não-marcada. Trx-Aβ28 biotinilada ligada foi subsequentemente detectada por meio de incubação com ExtrAvidin/AP seguida por uma reação cromogênica com pNPP. Os dados foram ajustados usando uma equação sigmoidal. Os valores de KD foram 21,7 nM para S1-A4 e 76,9 nM para US7.

[0159] FIGURA 8 descreve a análise cinética de tempo real das muteínas de Lcn2 S1-A4 (A) e US7 (B) medida em um instrumento de Biacore a uma taxa de fluxo de 10 μL/min. A proteína de fusão MBP- Aβ40 foi acoplada por meio de química de amina em um chip de CMD 200I (ΔRU = 1455) e cada uma das muteínas de Lcn2 purificadas foram aplicadas em uma série em concentrações diferentes. O sinal medido é mostrado como uma linha cinza enquanto que o ajuste de curva é descrito como uma linha preta em cada caso. As taxas kon e koff de ambas as muteínas diferiram significativamente (kon(S1-A4) = 0,48.105 M-1s-1, kon(US7) = 2,02.105 M-1s-1, koff(S1-A4) = 8,36.10-5 s-1, koff(US7) = 25,2(10-5 s-1). Porém, os valores de KD gerais foram bastante similares com 1,74 nM para S1-A4 e 1,25 nM para US7.

[0160] FIGURA 9 mostra a atividade funcional das muteínas de Lcn2 S1-A4 e US7 testada em um ensaio de agregação de tioflavina T. 100 μM de Aβ40 foram incubados com 10 μM de US7, S1-A4, lipocalina do tipo selvagem (wt) ou com PBS a 37°C sem agitação. Nos pontos de tempo indicados 20 μL de cada amostra foram misturados com 180 μL de 5 μM de tioflavina T e fluorescência foi medida com um comprimento de onda de excitação de 450 nm e um comprimento de onda de emissão de 482 nm. A muteína de Lcn2 US7 mostrou inibição potente de agregação a uma razão de 1:10 (US7:Aβ40). S1-A4 não pôde significativamente inibir a agregação nesta razão mas exerceu inibição clara a uma razão de 1:2 (S1-A4:Aβ40) (não mostrada). A Lcn2 do tipo selvagem não revelou um efeito inibidor na agregação de Aβ.

[0161] FIGURA 10 mostra análise de SDS-PAGE, após tingimento com Coomassie brilliant blue, de ED-B recombinante (rota 1), FN7B8 (rota 2), e FN789 (rota 3) após cromatografia de permuta de íons. Todas as amostras foram reduzidas com 2-mercaptoetanol. M: marcador de peso molecular (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha).

[0162] FIGURA 11 mostra análise de SDS-PAGE, após tingimento com Coomassie brilliant blue, de muteínas de Lcn2 N7A (rota 1), N7E (rota 2), N9B (rota 3), e N10D (rota 4) após purificação por afinidade de Strep-tag II. Todas as amostras foram reduzidas com 2-mercaptoetanol. M: marcador de peso molecular (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha).

[0163] FIGURA 12 descreve a atividade de ligação no ELISA. Uma placa de microtitulação foi revestida com as proteínas purificadas FN7B8 e FN789 e incubadas com uma série de diluição das muteínas de Lcn2 selecionadas, seguido por detecção com conjugado de Estreptavidina-fosfatase alcalina e substrato de pNPP. Muteínas de Lcn2 recombinantes N7A, N9B, e N10D revelaram sinais desprezíveis neste ensaio para FN789, que eram desprovidas de ED-B e serviram como um controle negativo.

[0164] FIGURA 13 descreve a análise cinética de tempo real da muteína de Lcn2 N9B medida em um instrumento de Biacore. FN7B8 foi acoplado por meio de química de amina a um chip de sensor CMD 200 m (ΔRU = 500) e a muteína de Lcn2 purificada foi aplicada em concentrações variadas. O sinal medido é mostrado como uma linha cinza enquanto que o ajuste de curva é descrito como uma linha preta em cada caso. As constantes cinéticas determinadas deste conjunto de curvas estão listadas na Tabela 2 (Exemplo 17).

[0165] FIGURA 14 descreve a análise cinética de tempo real da muteína de Lcn2 N7E medida em um instrumento de Biacore. FN7B8 foi acoplado por meio de química de amina a um chip de sensor CMD 200 m (ΔRU = 500) e a muteína de Lcn2 purificada foi aplicada em concentrações variadas. O sinal medido é mostrado como uma linha cinza enquanto que o ajuste de curva é descrito como uma linha preta em cada caso. As constantes cinéticas determinadas deste conjunto de curvas estão listadas na Tabela 2 (Exemplo 17).

[0166] FIGURA 15 descreve a análise cinética de tempo real da muteína de Lcn2 N7A medida em um instrumento de Biacore. FN7B8 foi acoplado por meio de química de amina a um chip de sensor CMD 200 m (ΔRU = 500) e a muteína de Lcn2 purificada foi aplicada em concentrações variadas. O sinal medido é mostrado como uma linha cinza enquanto que o ajuste de curva é descrito como uma linha preta em cada caso. As constantes cinéticas determinadas deste conjunto de curvas estão listadas na Tabela 2 (Exemplo 17).

[0167] FIGURA 16 descreve a análise cinética de tempo real da muteína de Lcn2 N10D medida em um instrumento de Biacore. FN7B8 foi acoplado por meio de química de amina a um chip de sensor CMD 200 m (ΔRU = 500) e a muteína de Lcn2 purificada foi aplicada em concentrações variadas. O sinal medido é mostrado como uma linha cinza enquanto que o ajuste de curva é descrito como uma linha preta em cada caso. As constantes cinéticas determinadas deste conjunto de curvas estão listadas na Tabela 2 (Exemplo 17).

[0168] FIGURA 17 ilustra um alinhamento de sequência das muteínas de Lcn2 humana designadas S1-A4 (SEQ ID NO: 39), US-7 (SEQ ID NO: 41), H1-G1 (SEQ ID NO: 43), N7A (SEQ ID NO: 20), N7E (SEQ ID NO: 22), N9B (SEQ ID NO: 24) e N10D (SEQ ID NO: 26) com Lcn2. A última linha abaixo das sequências indica as características estruturais secundárias da Lipocalina (Schonfeld et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 8198-8203).

[0169] FIGURA 18 representa uma sobreposição dos perfis de eluição de SEC das muteínas de Lcn2 H1GA e H1GV (A), e a análise das proteínas purificadas por meio de 15% de SDS-PAGE (B). As duas muteínas de Lcn2 H1GA e H1GV foram expressadas no periplasma de JM83 de E. coli e purificadas por meio de cromatografia de afinidade Strep-tag II. Ambas as muteínas eluíram predominantemente como proteínas monoméricas da coluna Superdex 75 H 10/30 com um volume de retenção de 10 a 11 mL. As intensidades de pico diferiram dependendo dos rendimentos de expressão das muteínas. (B) mostra uma análise de 15% de SDS-PAGE das muteínas de Lcn2 recombinantes H1-G1, H1GA, e H1GV após purificação por afinidade de Strep-tag II e SEC. Todas as três muteínas de Lcn2 são mostradas sob condições reduzidas usando 2-mercaptoetanol. M representa o marcador de peso molecular.

[0170] FIGURA 19 descreve a atividade de ligação das muteínas de Lcn2 H1GA, H1GV, e H1-G1 em ELISAs de captura com os alvos de Aβ biotinilada Aβ40 (A) e Trx-Aβ28 (B). StrepMAB-Immo foi imobilizado a 10 μg/mL em placas de microtitulação e empregado para captura de 1 μM de muteínas de Lcn2 por meio do Strep-tag II. Ligação dos alvos biotinilados, aplicada em uma série de diluição, foi depois detectada através de incubação com ExtrAvidin/AP e uma reação cromogênica subsequente com pNPP. Ovalbumina biotinilada (Ova) e tiorredoxina (Trx) serviram como controles de negativo e não exibiram nenhuma ligação às muteínas de Lcn2 (não mostrado). Os dados foram ajustados a um modelo de ligação monovalente. Valores de KD determinados para Aβ40 foram 4,2 nM para H1GA, 4,9 nM para H1GV, e 21,5 nM para H1- G1; valores correspondentes para Trx-Aβ28 foram 3,8 nM, 4,2 nM, e 24,4 nM, respectivamente.

[0171] FIGURA 20 descreve a análise cinética de tempo real das muteínas de Lcn2 H1GA (A) e H1GV (B) medida em um instrumento Biacore X a uma taxa de fluxo de 20 μL/min. A proteína de fusão MBP- Aβ40 foi acoplada por meio de química de amina a um chip CMD 200I (ΔRU = 1316) e cada uma das muteínas de Lcn2 purificadas foram aplicadas em uma série em concentrações variadas. O sinal medido é mostrado como uma linha cinza enquanto o ajuste de curva é descrito como uma linha preta em cada caso. As kon e koff de ambas as muteínas foram calculadas como segue: kon(H1GA) = 5,77.104 M-1s-1, kon(H1GV) = 6,84.104 M-1s-1, koff(H1GA) = 2,75.10-5 s-1, koff(H1GV) = 7,26.10-5 s-1. Os valores de KD gerais foram 0,476 nM para H1GA e 1,06 nM para H1GV.

[0172] FIGURA 21 descreve a análise cinética de tempo real da muteína de Lcn2 H1GA medida em um instrumento Biacore T100 com Aβ40 imobilizado usando um tempo estendido de dissociação para um traço medido em concentração alta. O peptídeo alvo Aβ40 foi acoplado por meio de química de amina em um chip Biacore CM5 (ΔRU = 325), e a muteína de Lcn2 purificada H1GA foi aplicada a uma taxa de fluxo de 30 μL/min. Para determinação exata da taxa de koff baixa, dissociação foi executada por 7200 s na concentração mais alta testada. As taxas de kon foram determinadas usando a série de diluição da muteína de Lcn2 H1GA com tempos de associação e de dissociação de 300 s. Os valores cinéticos para H1GA foram determinados como segue: kon = 1,25.105 M-1s-1, koff = 1,18.10-5 s-1, e KD = 0,095 nM.

[0173] FIGURA 22 (A) mostra a atividade funcional da muteína de Lcn2 H1GA testada em um ensaio de agregação de tioflavina T. 500 μL de 1 mg/mL de Aβ monomérico foram incubados na ausência ou presença de razões molares diferentes da muteína de Lcn2 H1GA em 0,5 x PBS a 37°C com agitação. Reações de agregação foram preparadas em triplicata. Para medição da fluorescência, 20 μL de uma amostra tirada em intervalos periódicos foram cada misturados com 180 μL de ThT a uma concentração final de 50 μM em 0,5 x PBS e analisada em um comprimento de onda de excitação de 450 nm e um comprimento de onda de emissão de 482 nm. A muteína de Lcn2 H1GA mostrou inibição potente de agregação a uma razão equimolar. A uma razão subequimolar de 10:2 (Aβ40:H1GA), agregação ainda foi reduzida significativamente. (B) Em contraste, quantidades equimolares nem BSA nem Lcn2 como controles negativos tiveram um efeito inibidor na agregação de Aβ40.

[0174] FIGURA 23 resume os valores de KD determinados nas diferentes configurações de ELISA como também em medições de ressonância plasmônica de superfície para as muteínas de Lcn2 H1GA e H1GV.

[0175] FIGURA 24 ilustra um alinhamento de sequência das muteínas de Lcn2 S1-A4 (SEQ ID NO: 39), US7 (SEQ ID NO: 41), H1- G1 (SEQ ID NO: 43), H1GA (SEQ ID NO: 50), H1GV (SEQ ID NO: 52), N7A (SEQ ID NO: 20), N7E (SEQ ID NO: 22), N9B (SEQ ID NO: 24), e N10D (SEQ ID NO: 26) com Lcn2 (SEQ ID NO: 44).

[0176] FIGURA 25 ilustra um alinhamento de sequência mútuo das muteínas H1GA (SEQ ID NO: 50) e H1GV (SEQ ID NO: 52) com seu precursor H1-G1 (SEQ ID NO: 43) e Lcn2 wt (SEQ ID NO: 44).

[0177] FIGURA 26 ilustra a atividade de ligação específica do N7E Variante de Lcn2 para FN7B8 em um ELISA. Uma placa de microtitulação foi revestida com FN7B8, FN789, BSA ou ovalbumina e incubada com uma série de diluição de N7E, seguida por detecção com conjugado de estreptavidina-fosfatase alcalina e substrato de pNPP. O N7E variante de Lcn2 revelou sinais desprezíveis neste ensaio para FN789, BSA e ovalbumina.

[0178] FIGURA 27 descreve a análise cinética de tempo real de variantes de Lcn2 N7A (A), N7E (B), N9B (C) e N10D (D) medidas em um instrumento de Biacore X. O domínio de fibronectina simples ED-B foi acoplado por meio de química de amina a um chip de sensor CMD 200 m (ΔRU =180) e as variantes de Lcn2 purificadas foram aplicadas em concentrações variadas. Os sinais medidos são mostrados como traços juntos com os ajustes de curva. As constantes cinéticas determinadas destes sensorgramas estão listadas na Tabela 3 (Exemplo 24).

[0179] FIGURA 28 descreve a cromatografia de exclusão de tamanho analítica de variantes de Lcn2 N7A (A), N10D (B), N9B (C) e N7E (D). Proteína purificada por afinidade foi aplicada a uma coluna Superdex S75 10/30 equilibrada com TBS. As setas indicam o volume de exclusão da coluna (6,7 mL). Filtração analítica em gel resultou em um pico proeminente para cada uma das quatro variantes de Lcn2. O peso molecular evidente das proteínas foi 21,0 kDa para N7A, 21,3 kDa para N10D, 21,7 kDa para N9B e 21,7 kDa para N7E, indicando a presença de espécies monoméricas apenas. EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE EXIBIÇÃO DE FAGO DE LCN2 MUTANTE

[0180] Uma biblioteca combinatória de variantes de Lcn2 foi gerada em base do cDNA clonado (Breustedt et al. (2006) Biochim. Biophys. Acta 1764, 161-173), que carregou as substituições de aminoácido Cys87Ser para remover a cadeia lateral de tiol não pareada simples (Goetz et al. (2000) Biochemistry 39, 1935-1941), como também Gln28His para introduzir um segundo sítio de restrição de BstXI. Mutagênese e montagem de reação em cadeia de polimerase (PCR) desta região foram essencialmente executadas de acordo com uma estratégia publicada (Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1898-1903; Skerra (2001) J. Biotechnol. 74, 257-275), desta vez usando uma reação de amplificação de pote com oligodeoxinucleotídeos (SEQ ID NO: 1-10) como ilustrado na FIGURA 1. Os oligodeoxinucleotídeos foram projetados de modo que os iniciadores com SEQ ID NO: 1-4 corresponderam ao filamento de codificação e carregavam códons degenerados nas posições de aminoácido 36, 40, 41, 49, 52, ou 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, ou 96, 100, 103, 106, ou 125, 127, 132, 134 respectivamente, enquanto os iniciadores com SEQ ID NO: 5-8 corresponderam ao filamento de não-codificação e não carregavam códons degenerados ou anticódons. Os dois iniciadores de flanqueamento com a SEQ ID NO: 9 e a SEQ ID NO: 10 foram usados em excesso e serviram para a amplificação do fragmento de gene randomizado montado. Todas as etapas de PCR foram executadas usando Go-Taq Hot Start DNA polimerase (Promega, Mannheim, Alemanha) como descrito (Schlehuber et al. (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120).

[0181] Os oligodeoxinucleotídeos que não carregavam códons degenerados foram comprados em grau de HPLC de Metabion (Munique, Alemanha). Oligodeoxinucleotídeos contendo NNK foram comprados dessalgados do mesmo vendedor e ainda purificados através de ureia PAGE. A biblioteca de DNA resultante foi cortada com BstXI (Promega, Mannheim, Alemanha) e clonada no vetor de fagemídeo phNGAL102 (SEQ ID NO: 11) que é com base no vetor de expressão genérico pASK111 (Vogt e Skerra (2001) J. Mol. Recognit. 14 (1), 79-86) e codifica para uma proteína de fusão composta do peptídeo sinal de OmpA, da Lcn2 madura modificada, seguido por um códon ambarino, e do fragmento C-terminal da proteína do capsídeo do gene III do bacteriófago filamentoso M13, isto é, similar como previamente descrito para a proteína de ligação de biblina (Beste et al., supra; Skerra, supra). Após eletroporação de XL1-Blue de E. coli (Bullock et al. (1987) Biotechniques 5, 376-378) com a mistura de ligação de 8,4 μg de produto de PCR digerido e 94 μg de DNA de digerido, 1 x 1010 transformantes foram obtidos.

[0182] Alternativamente, uma biblioteca aleatória de Lcn2 sintética clonada que é descrita na FIGURA 2 foi obtida de Sloning BioTechnology GmbH (Puchheim, Alemanha). O cassete de gene central flanqueado pelos dois sítios de restrição BstXI foi amplificado por meio de PCR em 20 ciclos usando os iniciadores apropriados (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10) e subclonados em phNGAL108 (SEQ ID NO: 12) rendendo uma biblioteca com uma complexidade correspondendo a 1,7 x 1010 transformantes independentes. phNGAL108 que é com base no vetor de expressão genérico pASK75 (Skerra (1994) Gene 151, 131135), codifica para uma proteína de fusão composta do peptídeo sinal de OmpA, da Lcn2 madura modificada, do Strep-tag seguido por um códon ambarino, e a proteína do capsídeo do gene de comprimento total III do bacteriófago filamentoso M13 (Vogt e Skerra (2004) ChemBioChem 5, 191-199).

[0183] As etapas seguintes na geração de biblioteca foram executadas identicamente a ambas as bibliotecas de Lcn2. 100 mL da cultura, contendo as células que foram transformadas com os vetores de fasmídeo com base em phNGAL102 ou phNGAL108, respectivamente, codificando para a biblioteca das muteínas de lipocalina como proteínas de fusão de fago pIII, foram transferidos para um frasco de Erlenmeyer estéril e incubados por uma hora a 37°C, 160 rpm em meio 2YT sem pressão de seleção antibiótica. Antes da infecção com fago auxiliar de VCS-M13, a cultura foi diluída em meio 2YT a uma OD550 de 0,1 com o antibiótico correspondente adicionado e também crescida sob condições idênticas até uma OD550 de 0,6 ter sido alcançada. Após infecção com fago auxiliar de VCS-M13 (Agilent Technologies, La Jolla, EUA) a cultura foi agitada para adicional de 30 min a 37°C, 100 rpm, a uma multiplicidade de infecção de cerca de 10. Depois a temperatura da incubadora foi diminuída para 26°C e a velocidade do agitador foi aumentada novamente para 160 rpm, após 10 min canamicina (70 μg/mL) foi adicionada, seguida por indução de expressão gênica por meio de adição de anidrotetraciclina (ACROS Organics, Geel, Bélgica) a 25 μg/l (125 μL de uma solução de matéria- prima a 200 μg/mL em dimetilformamida, DMF por litro de cultura). Incubação continuou para outras 12-15 h a 26°C, 160 rpm.

[0184] Células da cultura completa foram sedimentadas através de centrifugação (30 min, 18000 g, 4°C). O sobrenadante contendo as partículas de fagemídeo foi filtrado estéril (0,45 μm), misturado com 1/4 volume de 20% p/v de PEGM 8000, 15% p/v de NaCl, e incubado em gelo por pelo menos 2 h. Após centrifugação (30 min, 18000 g, 4°C) as partículas de fagemídeo precipitadas de 1 litro de cultura foram dissolvidas em 30 mL de BBS/E frio (200 mM de Borato de Na, 160 mM de NaCl, 1 mM de EDTA pH 8,0) contendo 50 mM de benzamidina (Sigma) e Pefabloc 1 μg/mL (Roth, Karlsruhe, Alemanha). A solução foi incubada em gelo por 1 h. Após centrifugação dos componentes não- dissolvidos (10 min, 43000 g, 4°C) cada sobrenadante foi transferido para um vaso de reação novo.

[0185] Adição de 1/4 volume de 20% p/v de PEGM 8000, 15% p/v de NaCl e incubação por 60 min em gelo serviu para reprecipitar as partículas de fagemídeo até que os fagemídeos fossem aliquotados e congelados a -80°C para armazenamento. Para o primeiro ciclo de seleção, os fagemídeos foram descongelados e centrifugados (30 min, 34000 g, 4°C), o sobrenadante foi removido, e as partículas de fagemídeo precipitadas foram dissolvidas e combinadas em um total de 400 μL de PBS contendo 50 mM de benzamidina. Após incubação por 30 min em gelo, a solução foi centrifugada (5 min, 18500 g, 4°C) para remover os agregados residuais e o sobrenadante foi diretamente usado para a seleção de exibição de fago. EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE ALVOS de Aβ EM FORMATOS DIFERENTES

[0186] Peptídeo Aβ40 (SEQ ID NO: 29), correspondendo aos aminoácidos 1 a 40 da sequência beta-amiloide madura (Dodel et al. (2003) Lancet Neurology 2, 215-220), foram comprados como peptídeo sintético, liofilizado ou com um grupo biotina C-terminal preso por meio de um espaçador de lisina (Peptide Speciality Laboratory, Heidelberg, Alemanha) ou em uma forma não-marcada (W. M. Keck Laboratory, New Haven, EUA). Homogeneamente, Aβ40 monomérico foi obtido dissolvendo até 5 mg do peptídeo em 0,5 mL de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro- 2-propanol (HFIP; Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) em temperatura ambiente por pelo menos 0,5 h. Subsequentemente, HFIP foi evaporado em um concentrador de SpeedVac, e Aβ40 foi dissolvido em um volume adequado de H2O destilado seguido por sonicação (Bandelin, Sonorex, RK100, Alemanha) em água fria por 15 min. Após filtração com um filtro de 0,22 μm (Spin-X Centrifuge Tube Filter; Corning, EUA), a concentração de proteína foi determinada através de medição da absorção a 280 nm usando o coeficiente de extinção calculado de 1490 M-1cm-1 (Gasteiger et al. (2003) ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31, 3784-3788, http://www.expasy.ch/tools/protparam.html).

[0187] Versões mais curtas do peptídeo beta-amiloide, tais como o peptídeo N-terminal Aβ1-11 (SEQ ID NO: 30) e o peptídeo central Aβ16- 27 (SEQ ID NO: 31), foram também compradas do Peptide Speciality Laboratory. Estas versões mais curtas foram dissolvidas direto no tampão de escolha sem tratamento de HFIP anterior.

[0188] Além dos peptídeos sintéticos, dois vetores codificando as proteínas de fusão de Aβ recombinantes diferentes foram construídas para o propósito de expressão bacteriana: Primeiro, uma proteína de fusão com a proteína ligante de maltose (MBP, pMBP-His, SEQ ID NO: 32) foi construída de acordo com Hortschansky et al. ((2005) Protein Sci. 14, 1753-1759) resultando em pASK75-MBP-Abeta40 (SEQ ID NO: 33). Segundo, pASK75-TrxAbeta28H6 (SEQ ID NO: 34) em que os aminoácidos 1 a 28 do peptídeo amiloide maduro foram inseridos na alça de sítio ativa da tiorredoxina (Trx, pASK75-TrxH6, SEQ ID NO: 35), foi construído de acordo com Moretto et al. ((2007) J. Biol. Chem. 282, 11436-11445).

[0189] Clonagem sequencial de Aβ40 humano carregando um término N estendido na estrutura com o gene da proteína ligante de maltose rendeu o plasmídeo novo pASK75-MBP-Aβ40 de um derivado do pASK75 de vetor (Skerra (1994) Gene 151, 131-135). Este vetor codifica uma proteína de fusão da proteína ligante de maltose seguida por um marcador His6 para purificação de proteína fácil, um sítio de reconhecimento do vírus etch do fumo (TEV) para clivagem da proteína de fusão como também a sequência de Aβ40 humano. O vetor está sob controle rígido do sistema de promotor/operador da tetraciclina e permite expressão em rendimentos altos das proteínas de fusão no citoplasma de E. coli.

[0190] A sequência codificando para o aminoácido 1 a 28 do peptídeo amiloide maduro (Aβ28) foi inserida na alça de tiorredoxina por meio de um único sítio de CpoI na alça do sítio ativo de tiorredoxina (posição de nucleotídeo 99-105, correspondendo aos resíduos de aminoácido 34 e 35) rendendo o vetor pASK75-Trx-Abeta28H6.

[0191] Ambas as proteínas de fusão de Aβ, Trx-Aβ28 e MBP-Aβ40, como também as proteínas de controle não fundidas Trx e MBP foram expressadas em JM83 de E. coli (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33, 103-119) a 37°C. Expressão da proteína foi induzida a uma densidade óptica OD550 de 0,5 adicionando 200 μg/l de anidrotetraciclina (aTc; Acros, Geel, Bélgica) dissolvida em dimetilformamida livre de água (DMF; Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) e continuando a incubação com agitação por 3 h. As células foram colhidas através de centrifugação a 4200 g a 4°C por 20 min. As pelotas celulares de uma cultura de 2 L foram ressuspensas em 20 mL de tampão de lise (100 mM de Tris/HCl pH 8,0, 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA) e a suspensão resultante foi homogeneizada por três passagens através de uma Célula de Pressão Francesa. Material insolúvel foi removido através de centrifugação (34500 g, 4°C, 20 min), o sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,45 μm (Filtropur S 0,45; Sarstedt, Nuembrecht, Alemanha) e usado para purificação de afinidade por meio do marcador His6 de cada proteína. Após cromatografia de afinidade de metal imobilizada (IMAC) as proteínas de fusão foram ainda purificadas por meio de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).

[0192] As concentrações de proteína foram determinadas através da medição de absorção a 280 nm usando coeficientes de extinção calculados de 66350 M-1cm-1 para MBP (SEQ ID NO: 32), 69330 M-1cm- 1 para MBP-Aβ40 (SEQ ID NO: 33), 15470 M-1cm-1 para Trx-Aβ28 (SEQ ID NO: 34), e 13980 M-1cm-1 para Trx (SEQ ID NO: 35) (Gasteiger et al., supra).

[0193] Para os experimentos seguintes, ambas as proteínas de fusão de Aβ, Trx-Aβ28 e MBP-Aβ40, como também ovalbumina (Ova; Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha), Trx, e MBP que serviram como proteínas de controle, foram marcadas com biotina ou digoxigenina (DIG) a uma razão molar de 2:1 (reagente de marcação:proteína alvo).

[0194] Para este fim, ácido D-biotinoil-£-aminocaproico-éster de N- hidroxissuccinimida (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) ou ácido digoxigenin-3-O-metilcarbonil-£-aiTiinocaproico-éster de N- hidroxissuccinimida (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) dissolvido em dimetilformamida livre de água (DMF; Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) ou dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) foi adicionado em uma razão molar de 2 vezes à proteína em PBS (4 mM de KH2PO4, 16 mM de Na2HPO4, 115 mM de NaCl, pH 7,4). A mistura foi girada por 1 h em temperatura ambiente. Depois, 1 M de Tris/HCl pH 8,0 foi adicionado a uma concentração final de 10 mM e incubado por 10 min para saturar os grupos ativos de éster de NHS restantes, e as proteínas marcadas foram purificadas por meio de SEC em uma coluna Superdex 75 H 10/30 (Amersham-Pharmacia, Friburgo, Alemanha). Para ser usado como alvo em seleção de exibição de fago, Trx-Aβ28 foi primeiro marcado com digoxigenina por 1 h, depois - para bloquear quaisquer resíduos de Cys não pareados - um excesso molar de 50 vezes de iodoacetamida (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) foi adicionado, seguido por incubação por 1h. Subsequentemente, a proteína modificada foi tratada com 1 M de Tris/HCl pH 8,0 e purificada como acima. EXEMPLO 3: SELEÇÃO DE MUTEÍNAS DE LCN2 COM AFINIDADE PARA O PEPTÍDEO DE A β 40 ATRAVÉS DE EXIBIÇÃO DE FAGO

[0195] Durante cada ciclo de batelamento cerca de 1012 fagemídeos recombinantes em PBS (4 mM de KH2PO4, 16 mM de Na2HPO4, 115 mM de NaCl, pH 7,4) foram bloqueados com 2% (p/v) de BSA em PBS/T (PBS contendo 0,1% (v/v) de Tween 20 [monolaurato de sorbitan de polioxietileno; AppliChem, Darmstadt, Alemanha]) por 1 h. Porções de 50 e de 25 μL de suspensão de conta magnética revestida com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin; Dynal Biotech, Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha e Streptavidin Magnetic Particles; Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) foram lavadas separadamente com PBS/T e bloqueadas com 2% (p/v) de BSA em PBS/T por 1 h. Os 25 μL de contas bloqueadas foram usados para pré-adsorção dos fagemídeos bloqueados para remover os fagemídeos específicos para as contas, os 50 μL foram depois usados durante o ciclo de seleção.

[0196] Os fagemídeos bloqueados foram incubados por 30 min com os 25 μL de contas magnéticas revestidas com Estreptavidina lavadas e bloqueadas. As contas foram depois puxadas para baixo com um suporte magnético de tubo simples (Promega, Mannheim, Alemanha) por 2 min, e o sobrenadante contendo os fagemídeos não- ligados às contas foi incubado por 1-2 h com 100 nM de Aβ40 biotinilada do Exemplo 2 em um volume total de 400 μL. A mistura de fagemídeos e alvo de peptídeo foi depois incubada por 0,5 h com os 50 μL de contas bloqueadas e subsequentemente puxados para baixo com um suporte magnético de tubo simples por 2 min. O sobrenadante contendo os fagemídeos não-ligados foi descartado. Os complexos de alvo/fagemídeos ligados às contas magnéticas foram lavados 10 vezes com 400 μL de PBS/T, e depois os fagemídeos ligados foram eluídos sob rotação por 10 min com 350 μL de 0,1 M de glicina/HCl, pH 2,2, seguido por neutralização imediata com 55 μL de 0,5 M de base de Tris. Alternativamente, a eluição foi executada sob condições desnaturantes com 400 μL de 4 m de ureia em PBS por 30 min, seguido por diluição com 1 mL de PBS. Eluição sob condições desnaturantes com ácido ou ureia foi aplicada durante os ciclos de seleção 1 e 2 enquanto que durante os ciclos 3 e 4 eluição foi executada sob condições de concorrência adicionando 400 μL de 100 μM de Aβ40 não-biotinilado às contas com os fagemídeos ligados e rotação por 1 h. No total, 4 ciclos de seleção foram executados.

[0197] Para amplificação dos fagemídeos eluídos, uma cultura exponencialmente crescente de XL-1 Blue de E. coli foi infetada por 30 min a 37°C. Fagemídeos ligados à conta restantes foram eluídos por adição de XL-1 Blue de E. coli na fase de crescimento exponencial diretamente às contas. Após centrifugação a 4°C, a pelota bacteriana foi ressuspensa em um volume adequado de 2x meio de YT (16 g/l de Bacto Triptona, 10 g/l de Extrato de Bacto Levedura, 5 g/L de NaCl, pH 7,5), banhada sobre placas de LB-Cam (10 g/l de Bacto Triptona, 5 g/l de Extrato de Bacto Levedura, 5 g/l de NaCl, 15 g/l de Bacto Ágar, 35 mg/L de cloranfenicol, pH 7,5), e incubados por 14-16 h a 32°C. As células foram depois raspadas das placas e empregadas para salvamento e reamplificação dos fagemídeos recombinantes.

[0198] Triagem dos fundos gerais ricos em fagemídeo foi executada por uma triagem ELISA (Exemplo 5) após a quarta etapa de batelamento. EXEMPLO 4: SELEÇÃO DAS MUTEÍNAS DE LCN2 COM AFINIDADE PARA A PROTEÍNA DE FUSÃO TRX-Aβ28 POR MEIO DE EXIBIÇÃO DE FAGO

[0199] Durante cada ciclo de batelamento cerca de 1012 fagemídeos recombinantes em PBS (4 mM de KH2PO4, 16 mM de Na2HPO4, 115 mM de NaCl, pH 7,4) foram bloqueados primeiro por 1 h com 2% (p/v) de BSA em PBS/T (PBS contendo 0,1% (v/v) Tween 20) durante os ciclos 1 e 2. Do ciclo de seleção 3 em diante, 2% (p/v) de leite desnatado (Sucofin, TSI, Zeven, Alemanha) em PBS/T foram usados como reagente de bloqueio. 50 e 25 μL de suspensão de conta magnética revestidas com anti-DIG-IgG (Europa Bioproducts Ltd, Cambridge, RU) foram lavados com PBS/T, e separadamente bloqueados por 1 h com 2% (p/v) de BSA em PBS/T ou leite desnatado.

[0200] Os fagemídeos bloqueados foram incubados durante 30 min com os 25 μL de contas magnéticas revestidas com anti-DIG-IgG lavadas e bloqueadas. As contas foram depois puxadas para baixo com um suporte magnético de tubo simples (Promega, Mannheim, Alemanha) durante 2 min, e o sobrenadante contendo os fagemídeos não-ligados à contas foi incubado durante 30 min com 15 μM de Trx não-marcado do Exemplo 2 para remover os fagemídeos específicos para Trx. Trx-Aβ28 digoxigenado e carboximetilado do Exemplo 2 foi depois adicionado a uma concentração final de 100 nM, e a mistura foi incubada durante 1-2 h em um volume total de 400 μL. A mistura de fagemídeos, Trx, e Trx-Aβ28 foi depois incubada com as contas bloqueadas escoadas da porção de 50 μL por 0,5 h. As contas foram depois puxadas para baixo com um suporte magnético de tubo simples por 2 min. O sobrenadante contendo os fagemídeos não-ligados foi descartado. As contas magnéticas com os fagemídeos ligados foram lavadas 10 vezes com 500 μL de PBS/T. Subsequentemente, os fagemídeos ligados foram eluídos sob rotação por 30 min em 400 μL de 4 m de ureia em PBS, seguido por diluição com 1 mL de PBS. No total, 6 ciclos de seleção foram executados.

[0201] Para amplificação dos fagemídeos eluídos uma cultura exponencialmente crescente de XL-1 Blue de E. coli foi infetada por 30 min a 37°C. Fagemídeos ligados à conta restantes foram eluídos diretamente por adição de XL-1 Blue de E. coli na fase de crescimento exponencial à contas. Após centrifugação a 4°C, a pelota bacteriana foi ressuspensa em um volume adequado de 2x meio de YT (16 g/l de Bacto Triptona, 10 g/l de Extrato de Bacto Levedura, 5 g/l de NaCl, pH 7,5), banhada sobre placas de LB-Cam (10 g/l de Bacto Triptona, 5 g/l Extrato de Bacto Levedura, 5 g/l de NaCl, 15 g/l de Bacto Ágar, 35 mg/L de cloranfenicol, pH 7,5), e incubada por 14-16 h a 32°C. As células foram depois raspadas das placas e empregadas para salvamento e reamplificação dos fagemídeos recombinantes.

[0202] Triagem dos fundos gerais ricos em fagemídeo foi executada por um ensaio de triagem de colônias com filtros em sanduíche (Exemplo 6) após a sexta etapa de batelamento. EXEMPLO 5: IDENTIFICAÇÃO DAS MUTEÍNAS DE LCN2

ESPECÍFICAS PARA Aβ VIA ELISA DE TRIAGEM

[0203] Após quatro ciclos de seleção de fagemídeo com Aβ40 como descrito no Exemplo 3, o fundo geral enriquecido de muteínas de Lcn2 foi subclonado em phNGAL98 (SEQ ID NO: 27), usado para a transformação da cepa supE de E. coli TG1-F- (um derivado de K12 TG1 de E. coli (Kim et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131, 3565-3576), e submetida à ELISA de triagem.

[0204] Para este propósito, colônias simples do fundo geral enriquecidas foram crescidas em placas de 96 poços (Placa de Múltiplos Poços 96 de fundo de círculo com tampa; Sarstedt, Nuembrecht, Alemanha) em 100 μL de meio de TB-Amp (12 g/l de Bacto Triptona, 24 g/l de Extrato de Bacto Levedura, 55 mM de glicerol, 17 mM de KH2PO4, 72 mM de K2HPO4, 100 mg/L de ampicilina) a 37°C durante a noite. Uma placa nova com 100 μL de meio de TB-Amp foi inoculada com as culturas durante a noite, e crescidas em fase exponencial a 22°C ou 37°C. Expressão periplasmáticas das muteínas de Lcn2 foi induzida com 20 μL 0,2 μg/mL de anidrotetraciclina (aTc; Acros, Geel, Bélgica) dissolvida em dimetilformamida livre de água (DMF; Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) durante 13-17 h a 20°C. Proteínas periplasmáticas foram liberadas com 40 μL de BBS (800 mM de borato de Na, 640 mM de NaCl, 8 mM de EDTA, pH 8,0) incluindo 1 mg/mL de lisozima por incubação durante 1 h a 4°C e agitação a 750 rpm (Thermomixer Confort, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). Após bloquear com 40 μL de 10% (p/v) BSA em PBS/T (4 mM de KH2PO4, 16 mM de Na2HPO4, 115 mM de NaCl, pH 7,4 com 0,05% (v/v) de Tween 20) durante 1 h a 4°C e 750 rpm, as placas foram centrifugadas por 10 min a 4°C e 3000 g. O sobrenadante foi usado para ELISA.

[0205] Para captura seletiva das muteínas de Lcn2 que carregam o Strep-tag C-terminal II (Schmidt e Skerra (2007) Nat. Protoc. 2, 15281535), uma placa de microtitulação de poliestireno de 96 poços MaxiSorp (Nunc, Langenselbold, Alemanha) foi revestida com 10 μg/mL de Strep MAB-Immo (IBA, Gottingen, Alemanha) em PBS durante a noite a 4°C e bloqueada com 3% (p/v) de BSA em PBS/T (PBS com 0,1% (v/v) de Tween 20) em temperatura ambiente por 1 h. Após 3 etapas de lavagem com PBS/T, 120 μL do extrato de célula do acima foram aplicados por poço e incubados durante 1,5 h a 300 rpm. Após lavar, Aβ40 biotinilado do Exemplo 2 foi adicionado a uma concentração de 0,5 μM e incubado durante 1 h. Como um controle, Ova biotinilado em vez de Aβ40 foi usado. Os poços foram lavados novamente, e peptídeo ou proteína biotinilada ligada foram detectadas com 50 μL de conjugado de ExtrAvidin/AP (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) diluído 1:5000 em PBS/T durante 1 h, seguido por desenvolvimento de sinal na presença de 100 μL 0,5 mg/mL de fosfato de p-nitrofenila (AppliChem, Darmstadt, Alemanha) em 100 mM Tris/HCl, pH 8,8, 100 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2 por até 1 h. Absorção a 405 nm foi medida em uma leitora SpectraMax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, EUA).

[0206] Alternativamente, 0,5 μM de Aβ40 nao-biotinilado do Exemplo 2 foi imobilizado diretamente sobre uma placa de microtitulação de poliestireno de 96 poços MaxiSorp (Nunc, Langenselbold, Alemanha), seguido por bloqueio. Após incubação com o extrato celular do acima e lavagem, muteínas de Lcn2 ligadas foram detectadas por meio do Strep-tag II usando uma diluição 1:1500 de conjugado de Streptactin/AP (IBA, Gottingen, Alemanha). Como um controle, 0,5 μM de Ova foi imobilizado sobre a placa de ELISA.

EXEMPLO 6: IDENTIFICAÇÃO DAS MUTEÍNAS DE LCN2 ESPECÍFICASW PARA TRX-Aβ28 POR MEIO DE ENSAIO DE TRIAGEM DE COLONICA COM FILTROS EM SANDUÍCHE

[0207] Após seis ciclos de seleção de fagemídeo com Trx-Aβ28 como descrito no Exemplo 4, o cassete do gene de Lcn2 mutageneizado foi subclonado por meio de BstXI (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha) no plasmídeo phNGAL124 (SEQ ID NO: 42) codificando uma fusão do Peptídeo sinal de OmpA na região de codificação de Lcn2 com Strep- tag C-terminal II (Schmidt e Skerra (2007) Nat. Protoc. 2, 1528-1535) seguido por um códon de terminação ambarino como também um gene para o domínio de ligação de albumina (ABD) da proteína estreptocócica G (Schlehuber et al. (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120).

[0208] Depois, um ensaio de triagem de colônia com filtros em sanduíche foi executado, por meio do qual as proteínas de fusão Lcn2- ABD foram liberadas das colônias banhadas em uma membrana de filtro hidrófilo (tipo de PVDF GVWP, 0,22 μm; Millipore, Schwalbach, Alemanha) e funcionalmente capturadas em uma segunda membrana subjacente (membrana de Immobilon-P, 0,45 μm; Millipore, Schwalbach, Alemanha) revestida com albumina sérica humana (HSA, Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) seguindo um procedimento descrito em detalhes por Schlehuber et al. ((2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120). Esta membrana foi sondada com 100 nM de Trx-Aβ28 marcada com DIG do Exemplo 2 em PBS/T por 1 h. O conjugado alvo ligado foi detectado com um conjugado de Fab de anti-DIG/fosfatase alcalina (AP) (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) seguido por uma reação cromogênica com fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila, sal de 4-toluidina (BCIP; AppliChem, Darmstadt, Alemanha) e nitro tetrazólio azul (NBT; AppliChem, Darmstadt, Alemanha). Tendo identificado as manchas com intensos sinais de cor nesta membrana, as colônias correspondentes foram escolhidas do primeiro filtro e propagadas para comparação lado a lado em uma triagem de colônia secundária.

[0209] Para este propósito, bactérias isoladas como também bactérias que expressam muteínas de Lcn2 de controle, tais como Lipocalina do tipo selvagem, foram salpicadas sobre uma membrana hidrófila fresca e crescidas até que colônias pequenas tornassem visíveis. Ligação foi testada tanto para Trx-Aβ28 marcado com DIG como também para as proteínas de controle marcadas com DIG Trx e Ova. Muteínas de Lcn2 que deram origem aos sinais específicos para o alvo Trx-Aβ28 nesta triagem secundária foram ainda propagadas para isolamento dos plasmídeos e análise de sequência subsequente. EXEMPLO 7: PRODUÇÃO SOLÚVEL E PURIFICAÇÃO DAS MUTEÍNAS DE LCN2 ESPECÍFICAS PARA Aβ E ED-B

[0210] A Lcn2 recombinante e suas muteínas foram produzidas através de secreção periplasmática em BL21 de E. coli (Studier e Moffat (1986) J. Mol. Biol. 189, 113-130), W3110 de E. coli (Bachmann (1990) Microbiol. Rev. 54, 130-197), JM83 de E. coli (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33, 103-119) ou a cepa de supE de E. coli TG1-F- (um derivado de K12 TG1 de E. coli [Kim et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131, 3565-3576] que foi curada de seu epissoma usando laranja de acridina). Para expressão de proteína solúvel, o plasmídeo phNGAL98 (SEQ ID NO: 27) foi usado, codificando uma fusão do peptídeo sinal OmpA com a proteína de Lcn2 madura (SEQ ID NO: 28) e o Strep-tag C-terminal II, por meio do qual o plasmídeo carrega os dois sítios de restrição BstXI não-compatíveis para subclonagem unidirecional do cassete de gene mutado.

[0211] A proteína solúvel foi purificada por afinidade por meio do Strep-tag II (Schmidt e Skerra (2007) Nat. Protoc. 2, 1528-1535), seguido por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) em uma coluna Superdex 75 H 10/30 (Amersham-Pharmacia, Friburgo, Alemanha) usando tampão de PBS. Pureza da proteína foi verificada através de SDS-PAGE (Fling e Gregerson (1986) Anal. Biochem. 155, 83-88). Concentrações da proteína foram determinadas através de medição de absorção a 280 nm usando coeficientes de extinção calculados de 31400 M-1cm-1 para Lcn2 wt (SEQ ID NO: 44) e de 26930 M-1cm-1 para as muteínas específicas para Aβ H1-G1 (SEQ ID NO: 43), 24410 M-1cm-1 para S1-A4 (SEQ ID NO: 38), e 26930 M-1cm-1 para US7 (SEQ ID NO: 41). Os coeficientes de extinção calculados das muteínas de Lcn2 específicas para ED-B foram 37930 M-1cm-1 para muteína N7A (SEQ ID NO: 20), 22920 M-1cm-1 para N7E (SEQ ID NO: 22), 21430 M- 1cm-1 para N9B (SEQ ID NO: 24), e 39420 M-1cm-1 para N10D (SEQ ID NO: 26) (Gasteiger et al., supra). EXEMPLO 8: MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO PARA ALVOS DE Aβ DIFERENTES EM EXPERIMENTOS DE ELISA

[0212] Para captura seletiva das muteínas de Lcn2 que carregam o Strep-tag C-terminal II (Schmidt e Skerra (2007) Nat. Protoc. 2, 15281535), uma placa de microtitulação de poliestireno de 96 poços MaxiSorp (Nunc, Langenselbold, Alemanha) foi revestida com 10 μg/mL de Strep MAB-Immo (IBA, Gottingen, Alemanha) em PBS durante a noite a 4°C e bloqueada com 3% (p/v) de BSA em PBS/T em temperatura ambiente por 1 h. Após 3 etapas de lavagem com PBS/T, 50 μL de uma solução a 1 μM das muteínas de Lcn2 purificadas do Exemplo 7 foram aplicados a todos os poços por 1 h. Após lavar, 50 μL de uma série de diluição dos alvos biotinilados Aβ40, MBP-Aβ40 ou Trx-Aβ28 do Exemplo 2 foram adicionados e incubados por 1 h por meio do qual a forma biotinilada de Ova, MBP e Trx do Exemplo 2 serviu como proteínas de controle de negativo. Os poços foram lavados novamente e o conjugado ligado foi detectado com 50 μL de conjugado de ExtrAvidin/AP (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) diluído 1:5000 em PBS/T por 1 h, seguido por desenvolvimento de sinal na presença de 100 μL 0,5 mg/mL de fosfato de p-nitrofenila (AppliChem, Darmstadt, Alemanha) em 100 mM de Tris/HCl, pH 8,8, 100 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2. O curso de tempo de absorção ΔA/Δt a 405 nm foi medido em uma leitora SpectraMax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, EUA) e os dados foram ajustados com software de KaleidaGraph (software de Sinergia, Reading, PA) para a equação: ΔA = ΔAmax x [L]tot / (KD + [L]tot) por meio do qual [L]tot representa a concentração do conjugado de ligante aplicado e KD é a constante de dissociação (Voss e Skerra (1997) Protein Eng. 10, 975-982).

[0213] Alternativamente, para um ELISA "direto", 2 μM de alvo Aβ40 não-marcado do Exemplo 2 foram adsorvidos sobre uma placa de microtitulação de poliestireno de 96 poços MaxiSorp (Nunc, Langenselbold, Alemanha) e incubados com a muteína de Lcn2 purificada que foi detectada por meio do Strep-tag II usando uma diluição 1:1500 de conjugado de Estreptavidina/AP (GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, RU). Como um controle, 2 μM de MBP do Exemplo 2 foram adsorvidos sobre a placa de ELISA. Absorção a 405 nm foi medida em uma leitora SpectraMax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, EUA).

[0214] Alternativamente, um ELISA "competitivo" foi executado de uma maneira similar que o ELISA de "captura" descrito acima. Novamente, após imobilizar StrepMAB-Immo e lavar, 50 μL de uma solução a 1 μM da muteína de Lcn2 purificada do Exemplo 7 foram aplicados a todos os poços por 1 h. Após lavar, o alvo biotinilado Trx- Aβ28 do Exemplo 2 foi aplicado a uma concentração fixa de 5 nM (para S1-A4) ou 40 nM (para US7) na presença de concentrações variadas do alvo não-marcado livre Trx-Aβ28 como competidor. Iniciando com um excesso de 100 vezes, a concentração do competidor foi diminuída pelo fator 3 em cada etapa. Neste caso, os dados foram ajustados à equação sigmoidal: ΔA = (ΔAmax-ΔAmin)/(1+ ([L]totfree/KD)p) + ΔAmin com declive de curva p (coeficiente de Hill) como um outro parâmetro.

[0215] A tabela 1 seguinte resume os valores de KD determinados nas configurações diferentes de ELISA como também em ressonância plasmônica de superfície (vide Exemplo 9).

EXEMPLO 9: MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO PARA Aβ POR MEIO DE RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE (SPR)

[0216] Análise de tempo real das muteínas de Lcn2 foi executada em um sistema Biacore X (Biacore, Uppsala, Suécia) usando PBS/T (PBS contendo 0,005% (v/v) de Tween 20) como tampão corrente. 50 μg/mL de solução de MBP-Aβ40 do Exemplo 2 em 10 mM de acetato de Na, pH 4,5, foram imobilizados sobre um chip CMD 200I (Xantec, Dusseldorf, Alemanha) usando acoplamento químico de amina padrão, resultando em uma densidade de ligante de 1455 unidades de ressonância (RU). As muteínas de Lcn2 purificadas S1-A4 e US7 do Exemplo 7 foram aplicadas em concentrações variando de 2 nM a 125 nM a uma taxa de fluxo de 10 μL/min. Os sensorgramas foram corrigidos por subtração dos sinais correspondentes medidos para o canal de controle que tinha sido ativado e bloqueado com etanolamina. Avaliação dos dados cinética foi executada ajustando com software de BIAevaluation V 3.0 (Karlsson et al. (1991) J. Immunol. Methods 145, 229-240). Durante esta etapa, as taxas kon e koff foram globalmente ajustadas, enquanto a diferença de resposta máxima Rmax foi localmente ajustada para cada curva. EXEMPLO 10: DETERMINAÇÃO DO EPÍTOPO DE Aβ POR MEIO DE MAPEAMENTO DE EPÍTOPO EM UMA MEMBRANA SPOT

[0217] A membrana SPOT (folha de Amino-PEG500-UC540, 100 x 150 mm, Intavis, Koln, Alemanha) para mapear o epítopo de Aβ das muteínas de Lcn2 S1-A4 e US7 foi preparada em um procedimento automatizado como descrito por Frank ((2002) J. Immunol. Methods 262, 13-26) usando um instrumento MultiPep RS (Intavis, Koln, Alemanha) e aminoácidos ativados do mesmo vendedor. A sequência de aminoácido de Aβ40 (SEQ ID NO: 29) foi sintetizada na membrana em hexâmeros sucessivos, decâmeros, e pentadecâmeros, cada com uma deslocação de 1 aminoácido, desse modo abrangendo a sequência inteira. Os C-terminais destes peptídeos se tornaram covalentemente ligados à membrana enquanto que seus N-terminais foram acetilados. Strep-tag imobilizado II serviu como um controle positivo para o método de detecção.

[0218] Desproteção da cadeia lateral foi executada com 95% de ácido trifluoroacético (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha), 3% de triisopropilsilano (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha), e 2% de H2O destilada por 2 h. Após lavar a membrana 4 vezes com diclorometano (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha), duas vezes com dimetilfor- mamida (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha), e duas vezes com etanol, a membrana foi secada ao ar.

[0219] Antes de uso, a membrana foi lavada uma vez com etanol, 3 vezes com PBS (4 mM de KH2PO4, 16 mM de Na2HPO4, 115 mM de NaCl, pH 7,4), e bloqueada com 3% (p/v) de BSA em PBS/T (PBS contendo 0,1% (v/v) de Tween 20) por 1 h. Após lavar 3 vezes com PBS/T, a membrana foi incubada com a muteína de Lcn2 S1-A4 (50 nM), US7 (100 nM) ou Lcn2 do tipo selvagem (100 nM) em PBS/T por 1 h e lavada 3 vezes com PBS/T. Depois, a membrana foi incubada com uma diluição 1:1500 de conjugado de Estreptavidina/AP (GE Healthcare, Buckinghamshire, RU) em PBS/T por 1 h para a detecção de proteína por meio do Strep-tag II. Subsequentemente, a membrana foi lavada 3 vezes com PBS/T e uma vez em tampão de AP (100 mM de Tris/HCl, pH 8,8, 100 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2), seguido por uma reação cromogênica com fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila, sal de 4- toluidina (BCIP; AppliChem, Darmstadt, Alemanha) e nitro tetrazólio azul (NBT; AppliChem, Darmstadt, Alemanha) em tampão de AP como descrito por Schlehuber et al. ((2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120).

[0220] Comparação das membranas incubadas com S1-A4 e Lcn2 do tipo selvagem, respectivamente, manchas proeminentes dadas que apenas ocorreram sob incubação da membrana com S1-A4 e não com Lcn2 do tipo selvagem. Com os fragmentos pentadecaméricos de Aβ40, o motivo LVFFAED pareceu ser essencial para ligação de S1-A4. Com as sequências peptídicas hexaméricas e decaméricas mais curtas, ligação de S1-A4 aos motivos mínimos VFFAED e FFAEDV foi detectada. A muteína de Lcn2 US7 mostrou um perfil de epítopo bem parecido neste ensaio.

EXEMPLO 11: ANÁLISE FUNCIONAL DAS MUTEÍNAS DE LCN2 COM AFINIDADE PARA Aβ EM UM ENSAIO AGREGAÇÃO DE ThT

[0221] Aβ40 não-biotinilado, solubilizado e homogeneamente monomérico do Exemplo 2 foi submetido a um ensaio de agregação de tioflavina T na presença ou ausência de várias muteínas de Lcn2. Tioflavina T (ThT; Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) especificamente se liga às fibrilas amiloides ricas em folhas β e precursores oligoméricos mas não ao peptídeo Aβ monomérico, que é acompanhado por um aumento na fluorescência de ThT (Khurana et al. (2005) J. Struct. Biol. 151, 229-238).

[0222] Para este fim, ThT foi dissolvida em H2O destilado a uma concentração de 1 mm. A solução de trabalho foi preparada diluindo 1 mM de solução de matéria-prima a uma concentração final de 5 μM com 5 mM de glicina/NaOH, pH 8,5, 500 μL de uma mistura 1:1 de 200 μM de Aβ40 em H2O destilada (dissolvida de acordo com o Exemplo 2) e 20 μM da muteína de Lcn2 do Exemplo 7 em PBS foram incubadas a 37°C sem agitação. Antes de cada medição de fluorescência em pontos de tempo diferentes, amostras foram brevemente submetidas a vórtice 10 vezes e 20 μL da respectiva amostra foram misturados com 180 μL da solução de trabalho de ThT. Intensidade de fluorescência foi medida com um comprimento de onda de excitação de 450 nm e um comprimento de onda de emissão de 482 nm em um espectrômetro de luminescência (LS 50 B, Perkin Elmer, Waltham, EUA).

[0223] Como ilustrado na Figura 9, a muteína de Lcn2 US7 mostrou inibição potente da agregação de Aβ40 a uma razão de 1:10.

EXEMPLO 12: PREPARAÇÃO DE FRAGMENTOS DE FIBRONECTINA RECOMBINANTE CONTENDO O DOMÍNIO EXTRA B (ED-B)

[0224] Três fragmentos recombinantes diferentes de fibronectina humana foram usados como alvos para seleção: o domínio-B extra sozinho (denominado ED-B; Zardi et al. (1987) EMBO Journal, 6, 2337-2342), o mesmo domínio no contexto de seus domínios adjacentes 7 e 8 (referido como FN7B8), e FN789 compreendendo os domínios 7, 8 e 9 convencionais, desse modo desprovendo de ED-B (Carnemolla et al. (1996), Int. J. Cancer, 68, 397-405; Leahy et al. (1994) Proteins 19, 48-54).

[0225] Sequências de codificação de FN7B8, FN789, e ED-B foram clonadas no vetor pASK75 (Skerra (1994) Gene 151, 131-135) ou seu derivado pASG-IBA—33 (IBA, Gottingen, Alemanha), rendendo pASK75- FN7B8 (SEQ ID NO: 13), pASK75-FN789 (SEQ ID NO: 17), e pASG- IBA-33-EDB (SEQ ID NO: 15), respectivamente. Todas as construções proveem um marcador His6 no terminal carbóxi para a purificação por meio de cromatografia de afinidade de metal imobilizada (IMAC) e foram produzidas como proteínas solúveis no citoplasma de TG1/F- de E. coli [um derivado de K12 TG1 de E. coli (Gibson (1984) Studies on the Epstein-Barr virus genome, Cambridge University, Inglaterra)] ou BL21 (Studier e Moffatt (1986), 189, 113-130). Portanto, uma cultura de E. coli de 2 L abrigando o plasmídeo de expressão foi crescida para fase meio- logarítimica a 37°C em meio de LB contendo 100 μg/mL de ampicilina. Após adição de 200 μg/L de anidrotetraciclina (Acros, Geel, Bélgica) crescimento foi continuado por 5 a 7 h a 37°C. As células foram concentradas através de centrifugação, ressuspensas em 35 mL de tampão de cromatografia esfriado em gelo (40 mM de Hepes/NaOH, 1 M de NaCl, pH 7,5) e lisadas através de sonificação (S250D, Branson, Danbury CT, EUA).

[0226] O protocolo de purificação dado abaixo foi o mesmo para todos os três fragmentos de fibronectina recombinantes. O lisado clareado foi aplicado a uma coluna de Zn2+/IDA-Sefarose (GE Healthcare, Munique, Alemanha) carregada com 10 mM de ZnSO4 e equilibrada com 40 mM de Hepes/NaOH, 1 M de NaCl, pH 7,5. A proteína ligada foi eluída com um gradiente ralo entre 0 a 300 mM de imidazol (pH ajustado com HCl) em tampão de cromatografia. As frações contendo proteína recombinante foram identificadas através de SDS-PAGE, misturadas com EDTA para uma concentração final de 1 mM, e dialisadas contra 20 mM de Hepes/NaOH, pH 7,4 durante a noite. Subsequentemente, a proteína foi carregada em uma coluna de cromatografia de permuta iônica (Recurso Q, GE Healthcare, Munique, Alemanha) equilibrada com 20 ou 40 mM de Hepes/NaOH, pH 7,4. Para eluir os fragmentos, fibronectina ligada a um gradiente em 0 e 300 mM de NaCl foi usada.

[0227] Por fim, a pureza das proteínas foi confirmada por análise de SDS-PAGE e cromatografia de exclusão de tamanho. Para determinar a concentração de proteínas através de medição de absorção a 280 nm, os seguintes coeficientes de extinção calculados (Gasteiger et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31, 3784-3788) foram usados: 31,400 M-1cm-1 para FN7B8, 28420 M-1cm-1 para FN789, e 11460 M-1cm-1 para ED-B. Tipicamente, cerca de 10 a 20 mg de proteína purificada foram obtidos por cultura em frasco agitador de 2 L. As proteínas purificadas foram armazenadas a 4°C e usadas para todos os experimentos.

[0228] Fragmentos de fibronectina purificada foram marcados com digoxigenina com um excesso (4:1 razão molar) de ácido digoxigenin-3- O-metilcarbonil-£-aminocaproico-éster de N-hidroxissuccinimida (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) por 1 h em temperatura ambiente de acordo com o manual do fornecedor. Para remover a digoxigenina livre, a solução de proteína foi aplicada a uma coluna de dessalgação de PD-10 (GE Healthcare, Munique, Alemanha) equilibrada com 40 mM de Tris/HCl, 115 mM de NaCl e 1 mM de EDTA, pH 7,5. Digoxigenação bem-sucedida e integridade da proteína foram verificadas por SDS- PAGE, ESI-espectrometria massa ou tingimento de ponto utilizando fragmento de Fab anti-digoxigenina-AP, (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha).

EXEMPLO 13: SELEÇÃO DE VARIANTES DE LCN2 COM AFINIDADE PARA ED-B ATRAVÉS DE EXIBIÇÃO DE FAGO

[0229] Juntos quatro ciclos de seleção de exibição de fagemídeo foram realizados usando a biblioteca de fagemídeo aleatória de Lcn2 com base na coletânea de gene sintético originalmente sintetizado por Sloning BioTechnology GmbH como descrito no Exemplo 1. Durante o primeiro ciclo da seleção cerca de 5x1012 fagemídeos recombinantes dissolvidos em 300 μL de TBS/E (40 mM de Tris/HCl, 115 mM de NaCl e 1 mM de EDTA, pH 7,4) suplementado com 50 mM de benzamidina foram bloqueados por 30 min adicionando 100 μL de 8% (p/v) de BSA (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha) em TBS contendo 0,4% (v/v) de Tween 20 [monolaurato de polioxietileno sorbitan; AppliChem, Darmstadt, Alemanha]). Depois, esta solução foi incubada durante 1 h com Contas Magnéticas de IgG Anti-Digoxigenina (Europa Bioproducts, Cambridge, RU) que tinham sido bloqueadas por 1 h com 2% (p/v) de BSA em TBS/T (TBS contendo 0,1% (v/v) de Tween 20) e carregada com 400 μL de 0,1 μM de FN7B8 recombinante marcado com digoxigenina (vide Exemplo 12).

[0230] Após coletar as contas por meio de um magneto e descartar o sobrenadante, 10 etapas de lavagem foram executadas com TBS/T e os fagemídeos ligados restantes foram eluídos primeiro com 400 μL de 0,1 M de trietilamina (pH não ajustado) por 6 min, seguido por uma segunda eluição com 350 μL de 0,1 M de glicina/HCl, pH 2,2 por 8 min. Os eluatos foram colhidos e imediatamente neutralizados com uma quantidade apropriada de 2 m de ácido acético ou 50 μL de 0,5 M de base Tris, respectivamente, combinados, e usados para infetar XL1- Blue de E. coli exponencialmente crescente. Os fagemídeos foram titulados e reamplificados antes da próxima etapa de bateamento seguindo os protocolos publicados (Beste et al. (1999) PNAS 96, 1898903; Schlehuber et al. (2000) J Mol Biol 297 1109-20).

[0231] Para o segundo círculo de seleção cerca de 2x1012 fagemídeos amplificados foram usados e a eluição de fagemídeos ligados foi executada através de competição com 400 μL de 231 nmol/mL ED-B recombinante livre por 75 min.

[0232] Nos terceiro e quarto ciclos de seleção cerca de 2x1012 dos fagemídeos amplificados foram primeiro incubados por 1 h com 100 nM de FN7B8 marcado com digoxigenina. Depois, os complexos de fagemídeo-antígeno foram capturados em Contas Magnéticas de IgG de Anti-Digoxigenina por 20 min. Após lavar as contas dez vezes com TBS/T, os fagemídeos ligados foram eluídos através de competição com 400 μL de 140 a 231 nmol/mL de ED-B recombinante livre por 75 min em temperatura ambiente.

EXEMPLO 14: SELEÇÃO DAS VARIANTES DE LCN2 COM AFINIDADE PARA ELISA DE TRIAGEM DE ED-B

[0233] Enriquecimento das muteínas de Lcn2 resultantes da seleção de exibição de fago descrita no Exemplo 13 que especificamente liga ao ED-B de proteína alvo foi monitorado por ELISA de triagem. Usando a preparação de fasmídeo agrupado da última etapa de bateamento, o cassete do gene mutagenizado foi subclonado por meio de BstXI no plasmídeo de expressão phNGAL98, que codifica uma fusão do peptídeo sinal de OmpA para a produção periplasmática em E. coli e na região de codificação de Lcn2 com o Strep-tag C-terminal II (Schmidt e Skerra (2007) Nat. Protoc. 2, 1528-1535). Expressão solúvel das muteínas de Lcn2 individuais em placas de 96 poços foi executada como segue: 100 μL de meio de TB (Tartof e Hobbs (1987) Bethesda Research Laboratory Focus 9, 12) contendo 100 μg/mL de ampicilina foram inoculados com uma colônia simples, fortuitamente escolhida e incubadas por 5 h a 37°C com agitação (500 a 800 rpm; Thermomixer confort; Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). Para cada clone 100 μL de meio fresco foram inoculados com 10 μL desta cultura e incubados por 1 a 2 h a 37°C com agitação seguido diminuindo a temperatura para 22°C. Após outra incubação por 2-4 h, a expressão das muteínas de Lcn2 foi induzida em células exponencialmente crescentes por 12-14 h com 0,2 μg/mL e anidrotetraciclina (Acros, Geel, Bélgica). Liberação periplasmática das proteínas foi realizada pela adição de 40 μL de 2xBBS (0,2 M de borato/NaOH, 160 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0) contendo 1 mg/mL de lisozima (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) por 1 h a temperatura ambiente com agitação. Os lisados foram bloqueados com 40 μL de 10% p/v de BSA (Applichem, Darmstadt, Alemanha) em TBS e 0,5% de Tween-20 por 1 h e os restos celulares foram removidos do extrato bruto através de centrifugação por 10 min.

[0234] Para adsorver FN7B8 ou FN789 na superfície de uma placa de 96 poços Nunc Maxisorp (Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Alemanha) 50 μL de uma solução a 100 μg/mL de proteína em TBS foram adicionados por poço e incubados durante a noite a 4°C. Após três etapas de lavagem com TBS/T, os poços foram bloqueados com 2% (p/v) de BSA em TBS/T por 3 h em temperatura ambiente e lavados repetidamente antes da exposição ao extrato bruto de E. coli. Para ELISA, 50 μL do lisado clareado foram aplicados por poço, incubados por 1 h, seguido lavando três vezes com TBS/T. As muteínas de Lcn2 ligadas foram detectadas com conjugado de estreptavidina-fosfatase alcalina (1:1500 em TBS/T; GE Healthcare, Munique, Alemanha) usando o substrato de fosfato de 4-nitrofenila (pNpp, 0,5 mg/mL; AppliChem GmbH, Darmstadt, Alemanha) em 0,1 M de Tris/HCl, 0,1 M de NaCl, 5 mM de MgCl2, pH 8,8 (vide Exemplo 16).

[0235] Quatro clones foram identificados neste ELISA de triagem. Em experimentos subsequentes (vide Exemplos 16-18) estas quatro muteínas de Lcn2 foram observadas também mostrar atividade de ligação específica para FN7B8 em ELISA, análise de SPR, e em microscopia de imunofluorescência de células de câncer de cólon humano ED-B-positivas. Estas muteínas de Lcn2 foram designadas como N7A (SEQ ID NO: 20), N7E (SEQ ID NO: 22), N9B (SEQ ID NO: 24), e N10D (SEQ ID NO: 26).

EXEMPLO 15: PRODUÇÃO DE PROTEÍNA SOLÚVEL E PURIFICAÇÃO DE LCN2 E SUAS VARIANTES

[0236] Vide Exemplo 7 para detalhes.

EXEMPLO 16: MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO PARA ED-B EM UM ELISA

[0237] Para adsorver FN7B8 ou FN789 sobre a superfície de uma placa de 96 poços Nunc Maxisorp (Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Alemanha) 50 μL de uma solução a 100 μg/mL de proteína em TBS/E foram adicionados por poço e incubados em temperatura ambiente por 2 h. Adicionalmente, para incluir as proteínas de controle, os poços em branco foram expostos a 120 μL de 2% (p/v) de BSA (AppliChem, Darmstadt, Alemanha) em TBS/ET. Após três etapas de lavagem, os poços foram bloqueados com 120 μL de 2% (p/v) de BSA (AppliChem, Darmstadt, Alemanha) em TBS/ET por 2 h em temperatura ambiente e lavados repetidamente antes de 50 μL de uma série de diluição da muteína de Lcn2 purificada ser adicionado e incubados por 1 h. Os poços foram lavados novamente e muteínas de Lcn2 ligadas foram detectadas com 50 μL de conjugado de estreptavidina-fosfatase alcalina (GE Healthcare, Munique, Alemanha) diluído 1:1500 em TBS/T por 1 h, seguido por desenvolvimento de sinal na presença de 50 μL de 0,5 mg/mL de fosfato de p-nitrofenila em 100 mM de Tris/HCl, 100 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, pH 8,8. O curso de tempo de absorção ΔA/Δt a 405 nm foi medido em uma leitora SpectraMax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) e os dados foram ajustados com software de KaleidaGraph (Synergy software, Reading, PA) para a equação: ΔA = ΔAmax x [L]tot/(KD + [L]tot) por meio do qual [L]tot representa a concentração do conjugado de ligante aplicado e KD é a constante de dissociação (Voss e Skerra (1997) Protein Eng. 10, 975-982). As variantes de Lcn2 N7A, N9B, e N10D, respectivamente, foram observadas especificamente ligar a FN7B8 com valores de KD de 14,8 nM (N7A), 40,1 nM (N9B), 30,0 nM (N7E), e 51,2 (N10D) mas não a FN789 ou BSA.

EXEMPLO 17: MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO PARA FIBRONECTINA RECOMBINANTE FN7B8 POR MEIO DE RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE (SPR)

[0238] Análise de tempo real das muteínas de Lcn2 foi executada em um sistema BIAcore X (BIAcore, Uppsala, Suécia) usando HBS/ET (20 mM de Hepes, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA contendo 0,005% (v/v) de Tween 20) como tampão corrente. 200 μg/mL de solução de FN7B8 recombinante em 10 mM de acetato de Na, pH 4,0, foram imobilizados em um CMD 200 m Sensorchip (XanTec bioanalytics, Duesseldorf, Alemanha) usando química de acoplamento de amina padrão (Biacore, Uppsala, Suécia), resultando em uma densidade de ligante de cerca de 500 unidades de ressonância (RU). A muteína de Lcn2 purificada foi aplicada a uma taxa de fluxo de 25 μL/min em concentrações de 2,5 até 160 nM. Os sensorgramas foram corrigidos por subtração dos sinais correspondentes medidos para o canal de controle que tinha sido ativado e bloqueado com etanolamina. Avaliação dos dados cinéticos foi executada por ajuste global com software BIAevaluation V 4.1 (Karlsson et al. (1991) J. Immunol. Methods 145, 229-240). TABELA 2, Dados de ligação cinética das muteínas de Lcn2 selecionadas para FN7B8 determinadas por ressonância plasmônica de superfície.

EXEMPLO 18: IMUNOTINGIMENTO DAS CÉLULAS DE CaCo2 ED-B-

POSITIVAS

[0239] Células do cólon de câncer humano (células CaCo2 gentilmente fornecidas por H. Daniel, Technische Universitat Munchen, Alemanha; Pujuguet et al., Am. J. Pathol. 148, 579-592) foram cultivadas no sistema Nunc Lab-Tek™ II Chamber Slide™ (4 câmaras por lâmina; Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Alemanha) em MEM com Sais de Earle e L-glutamina, suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal, 1x MEM aminoácidos não-essenciais, e 50 μg/mL de gentamicina (PAA Laboratories, Pasching, Áustria) a 37°C em uma atmosfera umedecida até que confluência celular fosse cerca de 50 a 70%. As monocamadas celulares presas à lâmina de cobertura foram lavadas com PBS (Dulbecco sem Ca2+ e Mg2+; PAA Laboratories, Pasching, Áustria), seguido por água destilada, e depois fixadas e contracoradas com metanol esfriado em gelo contendo 5 μg/mL de DAPI (4',6-diamidino-2- fenilindol; Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha) por 5 min.

[0240] Todas as incubações subsequentes foram realizadas na escuridão. As células fixas foram lavadas e incubadas com 500 μL de 1 μM de Lcn2 do tipo selvagem, muteína de Lcn2, PBS ou scFv-L19 de ED-B de anticorpo específico (Pini et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 21769-21776) por 1 h. Todos estes reagentes foram purificados como proteínas de fusão de Strep-tag II (Schmidt e Skerra, supra). As células foram lavadas com PBS e incubadas com Antibody StrepMABimmo não-marcado (5 μg/mL em PBS; IBA, Gottingen, Alemanha) por 1 h, seguido por 2 etapas de lavagem. Por fim, a ligação específica às células de CaCo2 foi detectada usando um conjugado de Dylight-488 de fragmento F(ab')2 de IgG de anticamundongo marcado com fluorescência (H+L) (Cell Signaling Technology, Danvers, EUA), diluído 1:200 em PBS, como um anticorpo secundário.

[0241] Todas as variantes de Lcn2 e também o scFv-L19 de anticorpo mostraram tingimento célula-específico quando observado sob um microscópio de Axiovert 40 CFL (Carl Zeiss, Gottingen, Alemanha) enquanto que a Lcn2 do tipo selvagem recombinante e PBS revelaram sinais desprezíveis neste ensaio.

EXEMPLO 19: GERAÇÃO DAS MUTEÍNAS DE LCN2 Aβ- ESPECÍFICAS H1GA E H1GV POR MEIO DE PERMUTA DE UM RESÍDUO DE CISTEÍNA LIVRE EM H1-G1 NA POSIÇÃO 36

[0242] Cys36 foi substituído com Ala ou Val através de mutagênese dirigida. Para este fim, uma PCR foi conduzida com o oligodeoxinu- cleotídeo degenerado DH-4 (SEQ ID NO: 45) e o segundo oligodeoxinu- cleotídeo em J08rev (SEQ ID NO: 48) como também o DNA do plasmídeo codificando a muteína de Lcn2 H1-G1 como modelo (SEQ ID NO: 37). Os fragmentos amplificados foram subclonados por meio de BstXI no plasmídeo phNGAL98 da expressão e sequenciados para identificar as variantes de substituição individuais. Dependendo da permuta de aminoácido introduzida, as variantes de Lcn2 resultantes foram nomeadas H1GA (SEQ ID NO: 49, 50) e H1GV (SEQ ID NO: 51, 52).

EXEMPLO 20: PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO SOLÚVEL DAS NOVAS MUTEÍNAS DE LCN2 Ae—ESPECÍFICAS H1GA E H1GV USANDO CULTURAS DE E. COLI COM UMA DENSIDADE ÓPTICA ALTA

[0243] A Lcn2 recombinante e suas muteínas foram produzidas através de secreção periplasmática em JM83 de E. coli. Para expressão da proteína solúvel, o plasmídeo phNGAL98 com a inserção de BstXI correspondente codificando H1GA (SEQ ID NO: 49) ou H1GV (SEQ ID NO: 51) foi usado.

[0244] Culturas foram crescidas sob agitação a 22°C em 2 L de meio de LB contendo 100 mg/L de ampicilina (Amp). Expressão gênica foi induzida a uma densidade de célula de OD550 = 2,5 adicionando anidrotetraciclina (aTc) para uma concentração final de 0,2 mg/L. Após incubação por 5 h, as células foram colhidas através de centrifugação, ressuspensas em 40 ml de tampão de fracionamento periplasmático esfriado em gelo (0,5 m de sacarose, 1 mM de EDTA, 100 mM de Tris- HCl, pH 8,0) contendo 0,1 mg/mL de lisozima e incubadas em gelo por 30 min. Os esferoplastos resultantes foram sedimentados através de centrifugação repetida, e o sobrenadante contendo a proteína recombinante solúvel foi recuperado.

[0245] A proteína solúvel foi purificada por afinidade por meio do Strep- tag II, seguido por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) em uma coluna Superdex 75 H 10/30 usando tampão de PBS (4 mM de KH2PO4, 16 mM de Na2HPO4, 115 mM de NaCl, pH 7,4). Pureza da proteína foi verificada através de SDS-PAGE. Concentrações das proteínas foram determinadas através de medição de absorção a 280 nm usando um coeficiente de extinção calculado de 27055 M-1cm-1 para as muteínas Aβ- específicas H1GA (SEQ ID NO: 50) e H1GV (SEQ ID NO: 52).

EXEMPLO 21: MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO PARA MBP- Aβ40 POR MEIO DE RESSONÂNCIA DE PLASMON SUPERFÍCIE EM UM INSTRUMENTO BIACOREX

[0246] Análise de tempo real da interação entre as muteínas de Lcn2 H1GA ou H1GV e MBP-Aβ40 (SEQ ID NO: 33) foi executada em um sistema Biacore X usando PBS/T (4 mM de KH2PO4, 16 mM de Na2HPO4, 115 mM de NaCl, pH 7,4 contendo 0,005% (v/v) de Tween 20) como tampão corrente. Uma solução de 15 μg/mL de MBP-Aβ40 do Exemplo 2 em 10 mM de acetato de Na, pH 4,5, foram imobilizados sobre um chip CMD 200I (Xantec, Dusseldorf, Alemanha) usando química de acoplamento de amina padrão, resultando em uma densidade de ligante de 1316 unidades de ressonância (RU). As muteínas de Lcn2 purificadas H1GA e H1GV do Exemplo 20 foram aplicadas em concentrações que variam de 4 nM a 128 nM a uma taxa de fluxo de 20 μL/min. Os dados foram duplamente referenciados por subtração dos sinais correspondentes medidos para o canal de controle que tinha sido ativado e bloqueado com etanolamina, como também subtração dos sinais medidos para uma média de injeções de tampão. Dados cinéticos foram globalmente ajustados usando o software de BIAevaluation V 3.0 (Karlsson et al. (1991) J. Immunol. Methods 145, 229-240).

EXEMPLO 22: MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO PARA Aβ40 POR MEIO DE RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE EM UM INSTRUMENTO BIACORE T100

[0247] Análise de tempo real da interação entre a muteína de Lcn2 H1GA e Aβ40 (SEQ ID NO: 29) foi executada em um sistema Biacore T100 (Biacore, Uppsala, Suécia) usando PBS/P (4 mM de KH2PO4, 16 mM de Na2HPO4, 115 mM de NaCl, pH 7,4 contendo 0,005% (v/v) de Tensoativo P20) como tampão corrente. Uma solução de 10 μg/mL de Aβ40 do Exemplo 2 em 10 mM de acetato de sódio pH 4,5 foi imobilizada sobre um chip de CM5 (Biacore, Uppsala, Suécia) usando química de acoplamento de amina padrão, resultando em uma densidade de ligante de 325 RU. A muteína de Lcn2 purificada H1GA do Exemplo 20 foi aplicada em concentrações que variam de 1 nM a 32 nM a uma taxa de fluxo de 30 μL/min. A série de diluição de H1GA foi injetada com tempos de associação e dissociação de 300 s para obter a informação de kon. Para determinação exata da taxa de koff baixa a concentração mais alta foi analisada usando um tempo de dissociação de 7200 s. Os dados foram duplamente referidos como no Exemplo 21. kon e koff para a reação de ligação foram determinadas do conjunto de dados inteiro usando Biacore T100 Evaluation Software V2.0.3 para processamento de dados e ajuste cinético. Os dados foram globalmente ajustados usando um modelo de ligação 1:1.

EXEMPLO 23: ANÁLISE FUNCIONAL DA MUTEÍNA DE LCN2 H1GA EM UM ENSAIO DE AGREGAÇÃO DE THT

[0248] Para o ensaio de agregação de Tioflavina T (ThT), o peptídeo Aβ sintético (SEQ ID NO: 29) foi dissolvido em 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2- propanol (HFIP; Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) por 12 h. HFIP foi evaporado sob vácuo, e Aβ foi dissolvido em um volume adequado de H2O dd, sonicado por 15 min a 4°C, e filtrado (membrana de acetato de celulose de filtro de tubo de centrífuga Co-star Spin-X, 0,45 μm; Corning Inc., Corning, NY). O Aβ monomérico solubilizado foi depois imediatamente usado para os ensaios de agregação.

[0249] 500 μL de 1 mg/mL de Aβ foram incubados na ausência ou presença de várias muteínas de Lcn2 em razões molares diferentes ou BSA em 0,5 x PBS a 37°C com agitação. Reações de agregação foram preparadas em triplicata. Para medição da fluorescência, 20 μL de amostras periodicamente removidas foram misturados com 180 μL de ThT a uma concentração final de 50 μM em 0,5 x PBS e analisadas a um comprimento de onda de excitação de 450 nm e um comprimento de onda de emissão de 482 nm usando um espectrofluorímetro de FluoroMax-3 (HORIBA Jobin Yvon, Grasbrunn, Alemanha).

EXEMPLO 24: MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO PARA O ED-B DE DOMÍNIO SIMPLES DE FIBRONECTINA RECOMBINANTE POR MEIO DE RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE (SPR)

[0250] Análise de interação de tempo real das muteínas de Lcn2 foi executada em um instrumento BIAcore X usando HBS/ET (20 mM de Hepes, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA contendo 0,005% (v/v) de Tween 20) como tampão corrente. 100 μg/mL de solução de ED-B recombinante em 10 mM de acetato de Na, pH 4,0 foram imobilizados em um CMD 200 m Sensorchip usando química de acoplamento de amina padrão, resultando em uma densidade de ligante de cerca de 180 unidades de ressonância (RU). A muteína de Lcn2 purificada foi aplicada a uma taxa de fluxo de 25 μL/min em concentrações de 2,5 até 160 nM. Os sensorgramas foram corrigidos por subtração dos sinais correspondentes medidos para o canal de controle que tinha sido ativado e bloqueado com etanolamina. Avaliação de dados cinéticos foi executada mediante ajuste global com software de BIAevaluation V 4.1 (Karlsson et al. (1991) J. Immunol. Methods 145, 229-240). No caso de N10D, o modelo de reação de competição de analito heterogêneo foi usado para ajuste dos dados, resultando em dois conjuntos das constantes cinéticas. TABELA 3. Dados de ligação cinética das muteínas de Lcn2 para ED-B determinados por ressonância plasmônica de superfície.

Claims (13)

1. Método para geração de uma muteína derivada de lipocalina associada à gelatinase de neutrófilo humano (Lcn2, hNGAL), sendo que a dita muteína se liga a um alvo não natural dado com afinidade detectável, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) submeter uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína madura hNGAL à mutagênese em 1, 2 ou 3 tripletos de nucleotídeo que codificam os resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo nas posições de sequência de aminoácidos 96, 100, e 106 da sequência de polipeptídeo linear de hNGAL madura (SEQ ID NO: 44) e submeter a molécula de ácido nucleico a mutagênese em 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 tripletos de nucleotídeos que codificam para resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste nas posições de sequência de aminoácidos 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 103, 125, 127, 132 e 134 da sequência polipeptídica linear de hNGAL madura.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: (b) expressar mais uma molécula(s) de ácido nucleico de muteína obtida(s) em (a) em um sistema de expressão adequado, e (c) enriquecer a uma ou mais muteína(s) tendo uma afinidade de ligação detectável para um alvo dado por meio de seleção e/ou isolamento.

3. Muteína derivada de uma lipocalina associada à gelatinase de neutrófilo humano (Lcn2, hNGAL), caracterizada pelo fato de que compreende um resíduo de aminoácido mutado em 1, 2 ou 3 posições da sequência de aminoácido selecionadas do grupo que consiste nas posições da sequência de aminoácidos 96, 100 e 106, da sequência de polipeptídeo linear de hNGAL madura (SEQ ID NO: 44) e também em 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 posições da sequência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste nas posições da sequência de aminoácidos 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 103, 125, 127, 132 e 134 da sequência de polipeptídeo linear de hNGAL maduro (SEQ ID NO: 44), e em que a muteína liga-se a um alvo não natural dado com afinidade detectável, e em que a muteína tem uma identidade de sequência de mais de 70% com a sequência polipeptídica linear de hNGAL madura (SEQ ID NO: 44).

4. Muteína, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o dito alvo não natural é selecionado do grupo que consiste em um peptídeo, uma proteína, um fragmento ou um domínio de uma proteína, e uma molécula orgânica pequena, em que o dito peptídeo preferencialmente inclui um peptídeo beta amiloide, e/ou em que a dita proteína preferencialmente inclui fibronectina ou um domínio desta.

5. Muteína, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 dos seguintes resíduos de aminoácido mutados em comparação com a sequência de polipeptídeo linear da hNGAL madura (SEQ ID NO: 44): a) Leu36 ^ Val ou Cys; Ala40 ^ Tyr, Lys, ou Val; Ile41 ^ Thr, Ser, ou Leu; Gln49 ^ Leu ou Trp; Leu70 ^ Gly; Arg72 ^ Gly ou Asp; Lys73 ^ Leu, Thr, ou Asp; Asp77 ^ Asn, His, ou Leu; Trp79 ^ Lys; Asn96 ^ Ile ou Arg; TyrlOO ^ Gln, Arg, ou Glu; Leu103 ^ Met, Arg, ou Gly; Tyr106 ^ Tyr, Ala, ou Trp; Lys125 ^ Thr, Val, ou Glu; Ser127 ^ Gly, Gln, ou Ala; Tyr132 ^ Met, Ser, ou Thr; e Lys134 ^ Asn; ou b) Leu36 ^ Lys, Glu, Arg, ou Ala; Ala40 ^ His, Met, Thr, ou Ser; Ile41 ^ Asp, Arg, Trp, ou Leu; Gln49 ^ Arg, Ala, ou Tyr; Leu70 ^ Leu, Arg, ou Met; Arg72 ^ Val, Arg, Gln, ou Met; Lys73 ^ His, Arg, ou Ser; Asp77 ^ Asn, His, Lys, ou Arg; Trp79 ^ Arg, Met, ou Leu; Asn96 ^ Lys, Ala, ou Ser; TyrlOO ^ Trp, Pro, ou Lys; Leu103 ^ His ou Pro; Tyr106 ^ Phe, Trp, ou Thr; Lys125 ^ Arg, His, ou Thr; Ser127 ^ Tyr, Phe, ou Ala; Tyr132 ^ Leu ou Phe; Lys134 ^ Glu, His, Gly, ou Phe; e Ser146 ^ Asn.

6. Muteína, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que apresenta a sequência de SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 26.

7. Muteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizada pelo fato de que a é: (i) conjugada com um composto selecionado do grupo que consiste em uma molécula orgânica, uma marcação enzimática, uma marcação radioativa, uma marcação colorida, uma marcação fluorescente, uma marcação cromogênica, uma marcação luminescente, um hapteno, digoxigenina, biotina, um agente citostático, uma toxina, um complexo de metal, um metal, e ouro coloidal; (ii) fusionada em seu N-terminal e/ou seu C-terminal a um par de fusão que é uma proteína, um domínio de proteína ou um peptídeo; ou (iii) conjugada com um composto que estende a meia-vida no soro da muteína.

8. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma muteína, como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 7, sendo que a sequência de nucleotídeos compreende um ou mais ácidos nucleicos mutados em 1, 2 ou 3 tripletos de nucleotídeos selecionados do grupo que consiste nos tripletos de nucleotídeos nas posições da sequência de nucleotídeos 286-288, 298-300 e 316-318 da sequência de nucleotídeos linear que codifica hNGAL madura (SEQ ID NO: 36) e também em 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 tripletos de nucleotídeos selecionados do grupo que consiste nos tripletos de nucleotídeos nas posições da sequência de nucleotídeos 106-108, 118-120, 121- 123, 145-147, 154-156, 202-204, 208-210, 214-216, 217-219, 229-231, 235237, 241-243, 307-309, 373-375, 379-381, 394-396 e 400-402 da sequência de nucleotídeos linear que codifica hNGAL madura (SEQ ID NO: 36), ou uma sequência degenerada da mesma.

9. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que contém uma molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 8, sendo que a célula hospedeira é procariota, tal como Escherichia coli (E. coli) ou Bacillus subtilis, ou é selecionada a partir do grupo consistindo em Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris.

10. Método para produção de uma muteína, como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 7, ou uma proteína de fusão da muteína e outro polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que a muteína ou uma proteína de fusão é produzida a partir do ácido nucleico que codifica a muteína ou proteína de fusão por meio de métodos de engenharia genética.

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma muteína, como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 7 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

12. Uso de uma muteína, como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado pelo fato de que é para: (i) a ligação/detecção de um alvo dado, compreendendo: (a) contatar a muteína com uma amostra de teste que supostamente contem o dito alvo e (b) detectar o complexo de muteína/alvo por um sinal adequado; ou (ii) o direcionamento de um composto para um sítio pré- selecionado compreendendo: (a) contatar a muteína com o dito composto e (b) liberar o complexo de muteína/composto ao sítio pré- selecionado; ou (iii) a fabricação de uma composição farmacêutica para tratar uma doença neurodegenerativa, um de câncer, fibroses, uma doença envolvendo neovascularizações ou uma inflamação.

13. Kit de diagnóstico ou analítico, caracterizado pelo fato de que compreende uma muteína, como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 7.

Images