ES2290023T3 - Moduladores de la agregacion del peptido beta-amiloide que comprenden d-aminoacidos. - Google Patents
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Abstract
Compuesto de la estructura: N-metil-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2.
Description
Moduladores de la agregación del péptido
\beta-amiloide que comprenden
D-aminoácidos.
La enfermedad de Alzheimer (EA), descrita por
primera vez por el psiquiatra bávaro Alois Alzheimer en 1907, es un
trastorno neurológico progresivo que comienza con pérdida de la
memoria a corto plazo y continúa con desorientación, deterioro del
juicio y razonamiento y en última instancia, demencia. El transcurso
de la enfermedad conduce normalmente a la muerte en un estado de
inmovilidad, gravemente debilitado entre cuatro y 12 años tras la
aparición. Se ha estimado que la EA afecta a del 5 al 11 por ciento
de la población con más 65 años de edad y hasta el 47 por ciento de
la población con más de 85 años de edad. El coste social del
tratamiento de la EA es superior a los 80 mil millones de dólares
anualmente, debido principalmente a los extensos cuidados
supervisados requeridos por los pacientes de EA. Además, a medida
que los adultos nacidos durante el auge de población de los años
1940 y 1950 se aproximan a la edad en la que la EA es más
prevalente, el control y tratamiento de la EA se convertirá en un
problema de atención sanitaria incluso más significativo.
Actualmente, no existe ningún tratamiento que retrase
significativamente la progresión de la enfermedad. Para revisiones
sobre la EA, véanse Selkoe, D.J. Sci. Amer., noviembre de 1991,
págs. 68-78; y Yankner, B.A. et al. (1991) N.
Eng. J. Med. 325:1849-1857.
Se ha notificado recientemente (Games et
al. (1995) Nature 373:523-527) que se ha creado
una neuropatología de tipo Alzheimer en ratones transgénicos. Los
ratones transgénicos expresan altos niveles de proteína precursora
de amiloide mutante humano y desarrollan progresivamente muchos de
los estados patológicos asociados con
la EA.
la EA.
Patológicamente, la EA se caracteriza por la
presencia de lesiones distintivas en el cerebro de la víctima.
Estas lesiones cerebrales incluyen filamentos intracelulares
anómalos denominados ovillos neurofibrilares (NTF) y depósitos
extracelulares de proteínas amiloidogénicas en placas seniles o de
amiloide. Los depósitos de amiloide también están presentes en las
paredes de los vasos sanguíneos cerebrales de los pacientes con EA.
El constituyente proteico principal de las placas de amiloide se ha
identificado como un péptido de 4 kilodalton denominado péptido
\beta-amiloide (\beta-PA)
(Glenner, G.G. y Wong, C.W. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun.
120:885-890; Masters, C. et al. (1985) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82:4245-4249). Se observan
frecuentemente depósitos difusos de \beta-PA en
cerebros de adultos sanos, mientras que el tejido cerebral con EA
se caracteriza por placas de \beta-amiloide más
compactadas, de núcleo denso. (Véase por ejemplo, Davies, L. et
al. (1988) Neurology 38:1688-1693) Estas
observaciones sugieren que la deposición de
\beta-PA precede, y contribuye a, la destrucción
de las neuronas que se produce en la EA. En un apoyo adicional de
un papel patogénico directo de \beta-PA, se ha
mostrado que el \beta-amiloide es tóxico para las
neuronas maduras, tanto en cultivo como in vivo. Yankner,
B.A. et al. (1989) Science 245:417-420;
Yankner, B.A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:9020-9023; Roher, A.E. et al. (1991)
Biochem. Biophys. Res. Commun. 174:572-579; Kowall,
N.W. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:7247-7251. Además, se ha mostrado que los
pacientes con hemorragia cerebral hereditaria con amiloidoisis de
tipo Dutch (HCHWA-D), que se caracteriza por
depósitos de \beta-amiloide difusos dentro de la
corteza cerebral y la vasculatura del cerebro, tienen una mutación
puntual que conduce a una sustitución de aminoácidos EN
\beta-PA. Levy, E. et al. (1990) Science
248:1124-1126. Esta observación demuestra que una
alteración específica de la secuencia de \beta-PA
puede producir que se deposite el
\beta-amiloide.
El \beta-PA natural deriva
mediante proteolisis de una proteína mucho más grande denominada la
proteína precursora del amiloide (PPA). Kang. J. et al.
(1987) Nature 325:733; Goldgaber, D. et al. (1987) Science
235:877; Robakis. N.K. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84:4190; Tanzi, R.E. et al. (1987) Science 235:880. El
gen de la PPA se mapea en el cromosoma 21, proporcionando de ese
modo una explicación para la deposición de
\beta-amiloide observada a una edad temprana en
individuos con síndrome de Down, que está producido por trisomía
del cromosoma 21. Mann, D.M. et al. (1989) Neuropathol. Appl.
Neurobiol. 15:317; Rumble, B. et al. (1989) N. Eng. J. Med.
320: 1446. La PPA contiene un único dominio transmembrana, con una
región amino-terminal larga (aproximadamente dos
tercios de la proteína) que se extiende dentro del entorno
extracelular y una región carboxilo-terminal más
corta que se proyecta dentro del citoplasma. El corte y empalme
diferencial del ARN mensajero de PPA conduce a al menos cinco formas
de PPA, compuestas por o bien 563 aminoácidos
(PPA-563), 695 aminoácidos
(PPA-695), 714 aminoácidos
(PPA-714), 751 aminoácidos (PPA-751)
o bien 770 aminoácidos (PPA-770).
Dentro de la PPA, el péptido
\beta-amiloide que se produce de manera natural
comienza en un residuo de ácido aspártico en la posición de
aminoácido 672 de PPA-770. El
\beta-PA que se produce de manera natural derivado
de la proteolisis de la PPA tiene de 39 a 43 residuos de
aminoácidos de longitud, dependiendo del punto del extremo
carboxilo-terminal, que muestra heterogeneidad. La
forma circulante predominante de \beta-PA en la
sangre y el líquido cefalorraquídeo tanto de pacientes de EA como de
adultos sanos es \beta1-40 ("\beta
corta"). Seubert, P. et al. (1992) Nature 359:325; Shoji,
M. et al. (1992) Science 258:126. Sin embargo,
\beta1-42 y \beta1-43
("\beta larga") también son formas en las placas de
\beta-amiloide. Masters, C. et al. (1985)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4245; Miller, D. et al. (1993)
Arch. Biochem. Biophys. 301:41; Mori, H. et al. (1992) J.
Biol. Chem. 267:17082. Aunque se desconoce el mecanismo molecular
preciso que conduce a la agregación y deposición de
\beta-PPA, se ha comparado el proceso al de las
polimerizaciones dependientes de nucleación, tales como
cristalización de proteínas, formación de microtúbulos y
polimerización de actina. Véase, por ejemplo, Jarrett, J.T. y
Lansbury, P.T. (1993) Cell 73:1055-1058. En tales
procesos, la polimerización de los componentes monoméricos no se
produce hasta la formación del núcleo. Por tanto, estos procesos se
caracterizan por un tiempo de demora antes de que se produzca la
agregación, seguido por polimerización rápida tras la nucleación.
La nucleación puede acelerarse mediante la adición de una
"simiente" o núcleo formado previamente, que da como resultado
polimerización rápida. Se ha mostrado que las formas de \beta
largas de \beta-PA actúan como simientes,
acelerando de ese modo la polimerización tanto de formas cortas como
largas de \beta-PA. Jarrett, J.T. et al.
(1993) Biochemistry 32:4693.
En un estudio, en el que se hicieron
sustituciones de aminoácidos en \beta-PA, se
notificó que dos péptidos \beta mutantes interferían con la
polimerización de \beta-PA no mutado cuando se
mezclaban las formas mutantes y no mutantes del péptido. Hilbich,
C. et al. (1992) J. Mol. Biol. 228:460-473.
Se usaron cantidades equimolares de los péptidos
\beta-amiloides mutantes y no mutantes (es decir,
naturales) para observar este efecto y se notificó que los péptidos
mutantes no eran adecuados para su uso in vivo. Hilbich, C.
et al. (1992), citado anteriormente.
El documento WO 96/28471 describe péptidos de
diversa longitud que modulan la agregación de proteínas
amiloidogénicas. Los péptidos consisten en aminoácidos que se
producen de manera natural, es decir, isómeros L, que pueden
modificarse.
El documento WO 97/21728 describe moduladores de
la agregación del \beta-amiloide basados en dos
fórmulas genéricas que consisten en una estructura central de
cuatro aminoácidos, que pueden ser o bien isómeros D o bien L. La
posición 2 está predeterminada para que sea un residuo de leucina y
pueden modificarse los aminoácidos C y
N-terminales.
Se ha mostrado que la propiedad del péptido
Lys-Leu-Val-Phe-Phe
de perturbar la formación de fibrillas de amiloide está basada en
unión de manera estereotípica del péptido a la secuencia homóloga de
A\beta (Tjernberg et al (1997) Journal of Biological
Chemistry 272: 12601-12605). Debido a este hallazgo,
se identificó que un motivo general de cinco
D-aminoácidos que comprenden fenilalanina en la
segunda posición y leucina en la tercera posición evitaba la
formación de fibrillas de amiloide.
El documento WO 98/08868 describe compuestos que
comprenden una estructura peptídica, seleccionada preferiblemente
de un grupo de 22 estructuras, y grupos modificadores, que modulan
la agregación del \beta-amiloide. Los grupos
modificadores pueden ser grupos alquilo cíclicos, heterocíclicos o
ramificados.
Esta invención se refiere a compuestos, y
composiciones farmacéuticas de los mismos, que pueden unirse a
péptidos \beta-amiloides naturales
(\beta-PA), modular la agregación de
\beta-PA natural y/o inhibir la neurotoxicidad de
los \beta-PA naturales. Los compuestos se
modifican de una manera que permite un aumento de la bioestabilidad
y niveles plasmáticos elevados prolongados. Los compuestos
moduladores del \beta-amiloide de la invención
comprenden una estructura peptídica, preferiblemente basada en el
péptido \beta-amiloide, que está compuesta
completamente por D-aminoácidos. En diversas
realizaciones, la estructura peptídica del compuesto modulador
comprende una secuencia de D-aminoácidos
correspondiente a una secuencia de L-aminoácidos que
se encuentra en el \beta-PA natural, una
secuencia de D-aminoácidos que es un isómero inverso
de una secuencia de L-aminoácidos que se encuentra
en el \beta-PA natural, una secuencia de
D-aminoácidos que es un isómero retroinverso de una
secuencia de L-aminoácidos que se encuentra en el
\beta-PA natural, o una secuencia de
D-aminoácido que es una versión desordenada o
sustituida de una secuencia de L-aminoácidos que se
encuentra en el \beta-PA natural.
Preferiblemente, la estructura peptídica de
D-aminoácidos del modulador se diseña basándose en
una subregión de \beta-PA natural en las
posiciones 17-21 (A\beta_{17-20}
y A\beta_{17-21}, respectivamente), que tiene
la secuencia de aminoácidos
Leu-Val-Phe-Phe-Ala
(SEQ ID NO:4). En realizaciones preferidas, se sustituye una
fenilalanina en los compuestos de la invención por un análogo de
fenilalanina que es más estable y menos propenso a, por ejemplo,
metabolismo oxidativo, o permite un aumento de los niveles
cerebrales del
compuesto.
compuesto.
Aún en otra realización, un compuesto modulador
de la invención incluye un péptido \beta-amiloide
compuesto por D-aminoácidos, un isómero inverso de
un péptido \beta-amiloide o un isómero
retroinverso de un péptido \beta-amiloide que
está unido a un resto de hidrazina, en el que el compuesto se une a
péptidos \beta-amiloides naturales o modula la
agregación o inhibe la neurotoxicidad de los péptidos
\beta-amiloides naturales cuando se pone en
contacto con los péptidos \beta-amiloides
naturales.
Un compuesto modulador de la invención comprende
preferiblemente 3-20 D-aminoácidos,
más preferiblemente 3-10
D-aminoácidos e incluso más preferiblemente
3-5 D-aminoácidos. Se modifican
tanto el extremo amino-terminal como el extremo
carboxilo-terminal de la estructura peptídica de
D-aminoácidos del modulador. Por ejemplo, puede
usarse un grupo modificador N-terminal que potencia
la capacidad del compuesto para inhibir la agregación de A\beta.
Además, pueden modificarse los extremos amino y/o
carboxilo-terminales del péptido para alterar una
propiedad farmacocinética del compuesto (tal como estabilidad,
biodisponibilidad, por ejemplo, administración potenciada del
compuesto a través de la barrera hematoencefálica y entrada en el
cerebro, y similares). Los grupos modificadores
amino-terminales preferidos incluyen grupos alquilo,
por ejemplo grupos metilo, etilo o isopropilo. Los grupos
modificadores carboxilo-terminales preferidos
incluyen grupos amida, grupos alquil o arilamida (por ejemplo,
fenetilamida), grupos hidroxilo (es decir, productos de reducción de
ácidos peptídicos, dando como resultado alcoholes peptídicos),
grupos acilamida y grupos acetilo. Todavía adicionalmente, puede
modificarse un compuesto modulador para marcar el compuesto con una
sustancia detectable (por ejemplo, un marcador radiactivo).
En una determinada realización preferida, la
invención proporciona un compuesto que tiene la estructura:
N-metil-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH_{2}.
Otro aspecto de la invención se refiere a
composiciones farmacéuticas. Normalmente, la composición
farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un
compuesto modulador de la invención y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Aún otro aspecto de la invención se refiere a
métodos para inhibir la agregación de péptidos
\beta-amiloides naturales. Estos métodos
comprenden poner en contacto los péptidos
\beta-amiloides naturales con un compuesto
modulador de la invención de tal manera que se inhibe la agregación
de los péptidos \beta-amiloides naturales.
Aún otro aspecto de la invención se refiere a
métodos para detectar la presencia o ausencia de péptidos
\beta-amiloides naturales en una muestra
biológica. Estos métodos comprenden poner en contacto una muestra
biológica con un compuesto de la invención, en los que el compuesto
está marcado con una sustancia detectable, y detectar el compuesto
unido a los péptidos \beta-amiloides naturales
para detectar de ese modo la presencia o ausencia de péptidos
\beta-amiloides naturales en la muestra biológica
in vitro.
Todavía otro aspecto de la invención se refiere
al uso de los moduladores de la invención para la terapia o para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno
asociado con \beta-amiloidosis y está abarcado
por la invención. El uso comprende administrar al sujeto una
cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto modulador de la
invención de tal manera que el sujeto se trata para un trastorno
asociado con \beta-amiloidosis. Preferiblemente,
el trastorno es la enfermedad de Alzheimer.
La figura 1 es una tabla que representa los
resultados de un ensayo de captación cerebral.
La figura 2 es un gráfico que representa los
resultados del ensayo de unión a fibrillas descrito en el ejemplo
2.
Esta invención se refiere a compuestos, y
composiciones farmacéuticas de los mismos, que pueden unirse a
péptidos \beta-amiloides naturales, modulan la
agregación de péptidos \beta-amiloides naturales
(\beta-PA) y/o inhiben la neurotoxicidad de los
\beta-PA naturales. Los compuestos se modifican de
una manera que permite un aumento de la bioestabilidad y niveles
plásmáticos elevados prolongados. Un compuesto de la invención que
modula la agregación de \beta-PA natural,
denominado en el presente documento de manera intercambiable un
compuesto modulador del \beta-amiloide, un
modulador del \beta-amiloide o simplemente un
modulador, altera la agregación de \beta-PA
natural cuando el modulador se pone en contacto con
\beta-PA natural. Por tanto, un compuesto de la
invención actúa para alterar el proceso o la velocidad de agregación
naturales para \beta-PA, perturbando de ese modo
este proceso. Preferiblemente, los compuestos inhiben la agregación
de \beta-PA. Los compuestos de la invención se
caracterizan porque comprenden una estructura peptídica compuesta
completamente por residuos de D-aminoácidos. Esta
estructura peptídica se basa preferiblemente en péptido
\beta-amiloide y puede comprender, por ejemplo,
una secuencia de D-aminoácidos correspondiente a una
secuencia de L-aminoácidos que se encuentra en el
\beta-PA natural, una secuencia de
D-aminoácidos que es un isómero inverso de una
secuencia de L-aminoácidos que se encuentra en el
\beta-PA natural, una secuencia de
D-aminoácidos que es un isómero retroinverso de una
secuencia de L-aminoácidos que se encuentra en el
\beta-PA natural, o una secuencia de
D-aminoácidos que es una versión desordenada o
sustituida de una secuencia de L-aminoácidos que se
encuentra en el \beta-PA natural. En realizaciones
preferidas, las fenilalaninas en los compuestos de la invención se
sustituyen por análogos de fenilalanina que son más estables y menos
propensos a, por ejemplo, metabolismo oxidativo.
La invención abarca compuestos moduladores que
comprenden una estructura peptídica de D-aminoácidos
en la que se modifican el extremo amino-terminal y
el extremo carboxilo-terminal de la estructura
peptídica.
Los compuestos moduladores del
\beta-amiloide de la invención pueden
seleccionarse basándose en su capacidad de unirse a péptidos
\beta-amiloides naturales, modular la agregación
de \beta-PA natural in vitro y/o inhibir
la neurotoxicidad de fibrillas de \beta-PA
naturales para células en cultivo (usando los ensayos descritos en
el presente documento, por ejemplo, el ensayo de neurotoxicidad, el
ensayo de nucleación o el ensayo de unión a fibrillas). Los
compuestos moduladores preferidos inhiben la agregación de
\beta-PA natural y/o inhiben la neurotoxicidad de
\beta-PA natural. Sin embargo, los compuestos
moduladores seleccionados basándose en una o ambas de estas
propiedades pueden tener propiedades adicionales in vivo que
pueden ser beneficiosas en el tratamiento de la amiloidosis (J. S.
Pachter et al. (1998) "A\beta1-40 induced
neurocytopathic activation of human monocytes is blocked by
A\beta peptide aggregation inhibitors". Neurobiology of Aging
(Abstracts: The 6th International Conference on Alzheimer's disease
and Related Disorders (Resúmenes: 6ª Conferencia internacional
sobre la enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados),
Amsterdam, 18-23 de julio de 1998) 19, S128
(resumen 540); R. Weltzein, A. et al. (1998) "Phagocytosis
of Beta-Amyloid: A Possible Requisite for
Neurotoxicity". J. Neuroimmunology (Tema especial: Resúmenes del
International Society of Neuroimmunology Fifth International
Congress (quinto Congreso internacional de la Sociedad internacional
de Neuroinmunología,), Montreal, Canadá, 23-27 de
agosto de 1998) 1998, 90, 32 (resumen 162)). Por ejemplo, el
compuesto modulador puede interferir con el procesamiento de
\beta-PA natural (mediante la inhibición de
proteasas o bien directa o bien indirecta) o mediante la modulación
de los procesos que producen \beta-PA tóxico, u
otros fragmentos de PPA, in vivo. Alternativamente, pueden
seleccionarse compuestos moduladores basándose en estas últimas
propiedades, en lugar de la inhibición de la agregación de A\beta
in vitro. Además, los compuestos moduladores de la invención
que se seleccionan basándose en su interacción con
\beta-PA natural también pueden interaccionar con
PPA o con otros fragmentos de PPA. Todavía adicionalmente, un
compuesto modulador de la invención puede caracterizarse por su
capacidad de unirse a fibrillas de \beta-amiloide
(que puede determinarse, por ejemplo, mediante radiomarcaje del
compuesto, poniendo en contacto el compuesto con una placa de
\beta-amiloide y contando o detectando, por
ejemplo, mediante formación de imágenes, el compuesto unido a
formas patológicas de \beta-PA, por ejemplo, la
placa), mientras que no altera significativamente la agregación de
las fibrillas de \beta-amiloide. Puede usarse un
compuesto de este tipo que se une eficazmente a fibrillas de
\beta-amiloide mientras que no altera
significativamente la agregación de las fibrillas de
\beta-amiloide, por ejemplo, para detectar
fibrillas de \beta-amiloide (por ejemplo, para
fines de diagnóstico, tal como se describe adicionalmente en el
presente documento). Sin embargo, debe apreciarse que la capacidad
de un compuesto particular para unirse a fibrillas de
\beta-amiloide y/o modular su agregación puede
variar dependiendo de la concentración del compuesto. Por
consiguiente, un compuesto que, a una baja concentración, se une a
fibrillas de \beta-amiloide sin alterar su
agregación puede inhibir, no obstante, la agregación de las
fibrillas a una concentración superior. Se pretende que todos los
compuestos de este tipo que tienen la propiedad de unirse a
fibrillas de \beta-amiloide y/o modular la
agregación de las fibrillas estén abarcados por la invención.
Tal como se usa en el presente documento, se
pretende que un "modulador" de la agregación del
\beta-amiloide se refiera a un agente que, cuando
se pone en contacto con péptidos \beta-amiloides
naturales, altera la agregación de los péptidos
\beta-amiloides naturales. El término
"agregación de los péptidos \beta-amiloides"
se refiere a un proceso mediante el cual los péptidos se asocian
entre sí para formar un complejo multimérico, en gran parte
insoluble. Se pretende además que el término "agregación"
abarque la formación de fibrillas de
\beta-amiloide y también abarque las placas de
\beta-amiloide.
Se pretende que los términos "péptido
\beta-amiloide natural",
"\beta-PA natural" y "péptido A\beta
natural", usados de manera intercambiable en el presente
documento, abarquen productos de escisión proteolítica que se
producen de manera natural de la proteína precursora del
\beta-amiloide (PPA) que están implicados en la
agregación de \beta-PA y la
\beta-amiloidosis. Estos péptidos naturales
incluyen péptidos \beta-amiloides que tienen
39-43 aminoácidos (es decir,
A\beta_{1-39},
A\beta_{1-40},
A\beta_{1-41}, A\beta_{1-42}
y A\beta_{1-43}). El residuo de aminoácido
amino-terminal de \beta-PA natural
corresponde al residuo de ácido aspártico en la posición 672 de la
forma de 770 residuos de aminoácidos de la proteína precursora del
amiloide ("PPA-770"). La forma de 43
aminoácidos de longitud de \beta-PA natural tiene
la secuencia de aminoácidos DAEFRHDSG
YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT (mostrada también en SEQ ID NO:1), mientras que las formas más cortas tienen 1-4 residuos de aminoácidos delecionados del extremo carboxilo-terminal. La secuencia de aminoácidos de PPA-770 desde la posición 672 (es decir, el extremo amino-terminal de \beta-PA natural) hasta tu extremo C-terminal (103 aminoácidos) se muestra en SEQ ID NO:2. La forma preferida de \beta-PA natural para su uso en los ensayos de agregación descritos en el presente documento es A\beta_{1-40} o A\beta_{1-42}.
YEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT (mostrada también en SEQ ID NO:1), mientras que las formas más cortas tienen 1-4 residuos de aminoácidos delecionados del extremo carboxilo-terminal. La secuencia de aminoácidos de PPA-770 desde la posición 672 (es decir, el extremo amino-terminal de \beta-PA natural) hasta tu extremo C-terminal (103 aminoácidos) se muestra en SEQ ID NO:2. La forma preferida de \beta-PA natural para su uso en los ensayos de agregación descritos en el presente documento es A\beta_{1-40} o A\beta_{1-42}.
En presencia de un modulador de la invención, la
agregación de los péptidos \beta-amiloides
naturales se "altera" o se "modula". Las diversas formas
del término "alteración" o "modulación" pretenden abarcar
tanto la inhibición de la agregación de \beta-PA
como la promoción de la agregación de \beta-PA. La
agregación de \beta-PA natural se "inhibe"
en presencia del modulador cuando hay una disminución en la cantidad
y/o velocidad de agregación de \beta-PA comparado
con la cantidad y/o velocidad de agregación de
\beta-PA en ausencia del modulador. Las diversas
formas del término "inhibición" pretenden incluir tanto la
inhibición completa como parcial de la agregación de
\beta-PA. La inhibición de la agregación puede
cuantificarse como el aumento en veces en el tiempo de demora para
la agregación o como la disminución en el nivel de meseta global de
la agregación (es decir, la cantidad total de agregación), usando un
ensayo de agregación tal como se describe en los ejemplos. En
diversas realizaciones, un modulador de la invención aumenta el
tiempo de demora de la agregación al menos 1,2 veces, 1,5 veces,
1,8 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces, por
ejemplo, cuando el compuesto está a un equivalente molar con
respecto al \beta-PA. En otras diversas
realizaciones, un modulador de la invención inhibe el nivel de
meseta de la agregación al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75% o
el 100%.
Puede usarse un modulador que inhibe la
agregación de \beta-PA (un "compuesto modulador
inhibidor") para evitar o retrasar la aparición de la deposición
de \beta-amiloide. Preferiblemente, los compuesto
moduladores inhibidores de la invención inhiben la formación y/o
actividad de los agregados neurotóxicos del péptido A\beta
natural (es decir, los compuestos inhibidores pueden usarse para
inhibir la neurotoxicidad de \beta-PA).
Adicionalmente, los compuestos inhibidores de la invención pueden
reducir la neurotoxicidad de agregados de
\beta-PA formados previamente, lo que indica que
los moduladores inhibidores pueden o bien unirse a fibrillas de
A\beta formadas previamente o agregados solubles y modular su
neurotoxicidad inherente o bien que los moduladores pueden
perturbar el equilibrio entre las formas agregadas y monoméricas de
\beta-PA a favor de la forma no neurotóxica.
En una realización preferida, los moduladores de
la invención pueden alterar la agregación de
\beta-PA cuando se ponen en contacto con una
cantidad en exceso molar de \beta-PA natural. Una
"cantidad en exceso molar de \beta-PA
natural" se refiere a una concentración de
\beta-PA natural, en moles, que es mayor que la
concentración, en moles, del modulador. Por ejemplo, si el modulador
y \beta-PA están ambos presentes a una
concentración de 1 \muM, se dice que son "equimolares",
mientras que si el modulador está presente a una concentración de 1
\muM y \beta-PA está presente a una
concentración de 5 \muM, se dice que \beta-PA
está presente en un exceso molar de 5 veces comparado con el
modulador. En realizaciones preferidas, un modulador de la
invención es eficaz alterando la agregación de
\beta-PA natural cuando \beta-PA
natural está presente en al menos un exceso molar de 2 veces, 3
veces o 5 veces comparado con la concentración del modulador. En
otras realizaciones, el modulador es eficaz alterando la agregación
de \beta-PA cuando el \beta-PA
natural está presente en al menos un exceso molar de 10 veces, 20
veces, 33 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces
comparado con la concentración del modulador.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "péptido \beta-amiloide compuesto
completamente por D-aminoácidos", tal como se
usa en un modulador de la invención, pretende abarcar péptidos que
tienen una secuencia de aminoácidos idéntica a la de la secuencia
natural en PPA, así como péptidos que tienen sustituciones de
aminoácidos aceptables de la secuencia natural, pero que está
compuesto por D-aminoácidos en lugar de los
L-aminoácidos naturales presentes en el
\beta-PA natural. Las sustituciones de aminoácidos
aceptables son aquellas que no afectan y/o pueden mejorar la
capacidad del péptido que contiene D-aminoácidos
para alterar la agregación de \beta-PA natural.
Además, las sustituciones de aminoácidos particulares pueden
contribuir adicionalmente a la capacidad del péptido para alterar
la agregación de \beta-PA natural y/o pueden
conferir propiedades beneficiosas adicionales al péptido (por
ejemplo, aumento de solubilidad, reducción de la asociación con
otras proteínas amiloides, etc.). Un péptido que tiene una secuencia
de aminoácidos idéntica a la que se encuentra en un péptido
original pero en la que todos los L-aminoácidos se
han sustituido por D-aminoácidos se denomina
también compuesto "inverso". Por ejemplo, si un péptido
original es Thr-Ala-Tyr, la forma
inversa es
D-Thr-D-Ala-D-Tyr.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "isómero retroinverso de un péptido
\beta-amiloide", tal como se usa en un
modulador de la invención, pretende abarcar péptidos en los que la
secuencia de los aminoácidos está invertida comparado con la
secuencia en el \beta-PA natural y todos los
L-aminoácidos están sustituidos por
D-aminoácidos. Por ejemplo, si un péptido original
es Thr-Ala-Tyr, la forma
retroinversa es
D-Tyr-D-Ala-D-Thr.
Comparado con el péptido original, un péptido retroinverso tiene una
estructura principal invertida aunque conserva sustancialmente la
conformación espacial original de las cadenas laterales, dando como
resultado un isómero retroinverso con una topología que se asemeja
estrechamente al péptido original. Véase Goodman et al.
"Perspectives in Peptide Chemistry" págs.
283-294 (1981). Véase también la patente
estadounidense número 4.522.752 concedida a Sisto para una
descripción adicional de los péptidos "retroinversos".
Se describen con más detalle diversos aspectos
adicionales de los moduladores de la invención, y los usos de los
mismos, en las siguientes subsecciones.
En una realización, un compuesto modulador de la
invención comprende un péptido \beta-amiloide,
estando compuesto el péptido \beta-amiloide
completamente por D-aminoácidos, en el que el
compuesto se une a péptidos \beta-amiloides
naturales o modula la agregación o inhibe la neurotoxicidad de
péptidos \beta-amiloides naturales cuando se pone
en contacto con los péptidos \beta-amiloides
naturales. Preferiblemente, el péptido
\beta-amiloide del modulador está compuesto por
3-20 D-aminoácidos, más
preferiblemente 3-10 D-aminoácidos,
e incluso más preferiblemente 3-5
D-aminoácidos. En realizaciones preferidas, se
sustituye una fenilalanina en los compuestos de la invención por un
análogo de fenilalanina que es más estable y menos propenso a, por
ejemplo, metabolismo oxidativo.
En una realización, el péptido
\beta-amiloide del modulador se modifica en el
extremo amino-terminal, por ejemplo, con un grupo
modificador que comprende un grupo alquilo tal como un grupo alquilo
inferior C1-C6, por ejemplo, un grupo metilo, etilo
o propilo; o un grupo alquilo cíclico, heterocíclico, policíclico o
ramificado. Los ejemplos de grupos modificadores
N-terminales adecuados se describen adicionalmente
en la subsección II más adelante. En otra realización, el péptido
\beta-amiloide del modulador se modifica en el
extremo carboxilo-terminal, por ejemplo el
modulador puede comprender una amida peptídica, un alquilo peptídico
o una arilamida (por ejemplo una fenetilamida peptídica) o un
alcohol peptídico. Se describen adicionalmente ejemplos de grupos
modificadores C-terminales adecuados en las
subsecciones II y III más adelante. El péptido
\beta-amiloide del modulador puede modificarse
para potenciar la capacidad del modulador para alterar la agregación
o neurotoxicidad de \beta-PA. Adicionalmente o
como alternativa, el péptido \beta-amiloide del
modulador puede modificarse para alterar una propiedad
farmacocinética del modulador y/o para marcar el modulador con una
sustancia detectable (descrito adicionalmente en la subsección III
más adelante).
En otra realización, un compuesto modulador de
la invención comprende un isómero retroinverso de un péptido
\beta-amiloide, en el que el compuesto se une a
los péptidos \beta-amiloides naturales o modula la
agregación o inhibe la neurotoxicidad de los péptidos
\beta-amiloides naturales cuando se pone en
contacto con los péptidos \beta-amiloides
naturales. Preferiblemente, el isómero retroinverso del péptido
\beta-amiloide está compuesto por
3-20 D-aminoácidos, más
preferiblemente 3-10 D-aminoácidos,
e incluso más preferiblemente 3-5
D-aminoácidos. En realizaciones preferidas, se
sustituyen las fenilalaninas en los compuestos de la invención por
análogos de fenilalanina que son más estables y menos propensos a,
por ejemplo, metabolismo oxidativo.
En una realización, el isómero retroinverso se
modifica en el extremo amino-terminal, por ejemplo,
con un grupo modificador que comprende un grupo alquilo tal como un
grupo alquilo inferior C1-C6, por ejemplo un grupo
metilo, etilo o propilo; o un grupo alquilo cíclico, heterocíclico,
policíclico o ramificado. Se describen adicionalmente ejemplos de
grupos modificadores N-terminales adecuados en la
subsección II más adelante. En otra realización, el isómero
retroinverso se modifica en el extremo
carboxilo-terminal, por ejemplo con un grupo amida,
un grupo alquil o arilamida (por ejemplo fenetilamida) o un grupo
hidroxilo (es decir, el producto de reducción de un ácido
peptídico, dando como resultado un alcohol peptídico. Se describen
adicionalmente ejemplos de grupos modificadores
C-terminales adecuados en las subsecciones II y III
más adelante. El isómero retroinverso puede modificarse para
potenciar la capacidad del modulador para alterar la agregación o
neurotoxididad de \beta-PA. Adicionalmente o como
alternativa, puede modificarse el isómero retroinverso para alterar
una propiedad farmacocinética del modulador y/o para marcar el
modulador con una sustancia detectable (descrito adicionalmente en
la subsección III más adelante).
Aún en otra realización, un compuesto modulador
de la invención incluye un péptido \beta-amiloide
compuesto completa o parcialmente por
D-aminoácidos, un isómero inverso de un péptido
\beta-amiloide o un isómero retroinverso de un
péptido \beta-amiloide que está unido a un resto
de hidrazina, en el que el compuesto se une a péptidos
\beta-amiloides naturales o modula la agregación o
inhibe la neurotoxicidad de los péptidos
\beta-amiloides naturales cuando se pone en
contacto con los péptidos \beta-amiloides
naturales. Preferiblemente, el compuesto modulador de la invención
está compuesto por 1-20
D-aminoácidos, más preferiblemente
1-10 D-aminoácidos, incluso más
preferiblemente 1-5 D-aminoácidos
que están unidos a un resto de hidrazina.
En una realización, los compuestos moduladores
de la invención que incluyen un resto de hidrazina se modifican en
el extremo amino-terminal, por ejemplo con un grupo
modificador que comprende un grupo alquilo, por ejemplo un grupo
metilo, etilo o isopropilo. Se describen adicionalmente ejemplos de
grupos modificadores N-terminales adecuados en la
subsección II más adelante. En otra realización, los compuestos
moduladores de la invención que incluyen un resto de hidrazina se
modifican en el extremo carboxilo-terminal, por
ejemplo con un acetilo. Se describen adicionalmente ejemplos de
grupos modificadores C-terminales adecuados en las
subsecciones II y III más adelante. Los compuestos moduladores de
la invención que incluyen un resto de hidrazina pueden modificarse
para potenciar la capacidad del modulador para alterar la agregación
o neurotoxicidad de \beta-PA. Adicionalmente o
como alternativa, los compuestos moduladores de la invención que
incluyen un resto de hidrazina pueden modificarse para alterar una
propiedad farmacocinética del modulador y/o para marcar el modulador
con una sustancia detectable (descrito adicionalmente en la
subsección III más adelante).
Los moduladores de la invención se diseñan
preferiblemente basándose en la secuencia de aminoácidos de una
subregión de \beta-PA natural. El término
"subregión de un péptido \beta-amiloide
natural" pretende incluir deleciones
amino-terminales y/o
carboxilo-terminales de \beta-PA
natural. El término "subregión de \beta-PA
natural" no pretende incluir \beta-PA natural
de longitud completa (es decir, la "subregión" no incluye
A\beta_{1-39},
A\beta_{1-40},
A\beta_{1-41}, A\beta_{1-42}
y A\beta_{1-43}). Una subregión preferida del
péptido \beta-amiloide natural es un "dominio
central de agregación de A\beta" (DCA). Tal como se usa en el
presente documento, el término "dominio central de agregación de
A\beta" se refiere a una subregión de un péptido
\beta-amiloide natural que es suficiente para
modular la agregación de \beta-PA naturales
cuando esta subregión, en su forma de L-aminoácido,
se modifica apropiadamente (por ejemplo, modificada en el extremo
amino-terminal), tal como se describe en detalle en
la solicitud de patente estadounidense con número de serie
08/548.998 y la solicitud de patente estadounidense con número de
serie 08/616.081, incorporándose el contenido completo de cada una
de ellas al presente documento como referencia. Preferiblemente, el
DCA está modelado después de una subregión de
\beta-PA natural que tiene menos de 15 aminoácidos
de longitud y más preferiblemente tiene entre 3-10
aminoácidos de longitud. En diversas realizaciones, el DCA está
modelado después de una subregión de \beta-PA que
tiene 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ó 3 aminoácidos de longitud. En una
realización, la subregión de \beta-PA tras la cual
está modelado el DCA es una región interna o
carboxilo-terminal de \beta-PA
(es decir, en sentido 3' del extremo amino-terminal
en la posición de aminoácido 1). En otra realización, el DCA está
modelado después de una subregión de \beta-PA que
es hidrófoba. Los dominios centrales de agregación de A\beta
preferidos abarcan los residuos de aminoácidos 17-20
o 17-21 de \beta-PA natural
(A\beta_{17-20} y
A\beta_{17-21}, respectivamente) y análogos de
los mismos, tal como se describe en el presente documento. Las
secuencias de aminoácidos de A\beta_{17-20} y
A\beta_{17-21} son
Leu-Val-Phe-Phe
(SEQ ID NO:3) y
Leu-Val-Phe-Phe-Ala
(SEQ ID NO:4), respectivamente.
Tal como se demuestra en los ejemplos, los
moduladores que contienen D-aminoácidos diseñados
basándose en las secuencias de aminoácidos de
A\beta_{17-20} y
A\beta_{17-21} son inhibidores particularmente
eficaces de la agregación de A\beta y muestran una bioestabilidad
mejorada y niveles plasmáticos elevados prolongados. Estos
moduladores pueden comprender una secuencia de
D-aminoácidos correspondiente a la secuencia de
L-aminoácidos de A\beta_{17-20}
o A\beta_{17-21}, una secuencia de
D-aminoácidos que es un isómero inverso de la
secuencia de L-aminoácidos de
A\beta_{17-20} o
A\beta_{17-21}, una secuencia de
D-aminoácidos que es un isómero retroinverso de la
secuencia de L-aminoácidos
A\beta_{17-20} o
A\beta_{17-21}, o una secuencia de
D-aminoácidos que es una versión desordenada o
sustituida de la secuencia de L-aminoácidos de
A\beta_{17-20} o
A\beta_{17-21}. En realizaciones preferidas, se
sustituye una fenilalanina en los moduladores diseñados basándose
en las secuencias de aminoácidos de
A\beta_{17-20} y
A\beta_{17-21} por un análogo de fenilalanina
que es más estable y menos propenso a, por ejemplo, metabolismo
oxidativo. En otras realizaciones preferidas, los moduladores
diseñados basándose en las secuencias de aminoácidos de
A\beta_{17-20} y
A\beta_{17-21} comprenden además un resto de
hidrazina.
Los moduladores basados en
D-aminoácidos pueden tener el extremo
amino-terminal y el extremo
carboxilo-terminal modificados (descrito
adicionalmente más adelante). Las estructuras peptídicas de los
moduladores eficaces son generalmente hidrófobas y se caracterizan
por la presencia de estructuras de D-aminoácidos
seleccionadas del grupo que consiste en una estructura de
D-leucina, una estructura de
D-fenilalanina y una estructura de
D-valina. Tal como se usa en el presente documento,
el término una "estructura de D-aminoácidos"
(tal como una "estructura de D-leucina", una
"estructura de D-fenilalanina" o una
"estructura de D-valina") pretende incluir el
D-aminoácido, así como análogos, derivados y
miméticos del D-aminoácido que mantienen la
actividad funcional del compuesto (tratado adicionalmente más
adelante). Por ejemplo, el término "estructura de
D-fenilalanina" pretende incluir
D-fenilalanina así como
D-ciclohexilalanina [D-cha],
D-4-fluorofenilalanina
(para-fluorofenilalanina)
{[p-F]f o D-[p-F]Phe},
D-pentafluorofenilalanina ([F5]f o
D-[F5]Phe}, clorofenilalanina, bromofenilalanina,
nitrofenilalanina, D-piridilalanina,
D-homofenilalanina, metiltirosina y bencilserina,
así como la sustitución por una estructura de
D-lisina, estructura de D-valina o
una estructura de D-leucina. El término
"estructura de D-leucina" pretende incluir
D-leucina, así como la sustitución por
D-valina, D-isoleucina u otros
aminoácidos naturales o no naturales que tienen una cadena lateral
alifática, tales como D-norleucina o
D-norvalina. El término "estructura de
D-valina" pretende incluir
D-valina, así como la sustitución por
D-leucina u otros aminoácidos naturales o no
naturales que tienen una cadena lateral alifática.
La invención proporciona un compuesto modulador
del \beta-amiloide que comprende una fórmula
(I):
en la que Xaa_{1}, Xaa_{2},
Xaa_{3} y Xaa_{4} son cada uno estructuras de
D-aminoácidos y al menos dos de Xaa_{1},
Xaa_{2}, Xaa_{3} y Xaa_{4} se seleccionan, independientemente,
del grupo que consiste en una estructura de
D-leucina, una estructura de
D-fenilalanina, por ejemplo,
D-ciclohexilalanina,
D-4-fluorofenilalanina
(para-fluorofenilalanina),
D-pentafluorofenilalanina, clorofenilalanina,
bromofenilalanina, nitrofenilalanina y
D-homofenilalanina, y una estructura de
D-valina;
D-valina;
Y, que puede estar o no presente, es una
estructura que tiene la fórmula (Xaa)_{a}, en la que Xaa es
cualquier estructura de D-aminoácidos y a es un
número entero desde 1 hasta 5;
Z, que puede estar o no presente, es una
estructura que tiene la fórmula (Xaa)_{b}, en la que Xaa es
cualquier estructura de D-aminoácidos y b es un
número entero desde 1 hasta 15;
A, que puede estar o no presente, es un grupo
modificador unido directa o indirectamente al compuesto; y n es un
número entero desde 1 hasta 15;
en la que Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3},
Xaa_{4}, Y, Z, A y n se seleccionan de tal manera que el compuesto
se une a péptidos \beta-amiloides naturales o
modula la agregación o inhibe la neurotoxicidad de los péptidos
\beta-amiloides naturales cuando se pone en
contacto con los péptidos \beta-amiloides
naturales, y es menos propenso al metabolismo, por ejemplo,
metabolismo oxidativo.
En una realización de esta fórmula, se
especifica que un quinto residuo de aminoácido, Xaa_{5},
C-terminal con respecto a Xaa_{4} y Z, que puede
estar o no presente, es una estructura que tiene la fórmula
(Xaa)_{b}, en la que Xaa es cualquier estructura de
D-aminoácidos y b es un número entero desde 1 hasta
14. Por consiguiente, la invención proporciona un compuesto
modulador del \beta-amiloide que comprende una
fórmula (II):
en la que b en un número entero
desde 1 hasta
14.
En otra realización preferida, Xaa_{1},
Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4} y Xaa_{5} de fórmula (II) se
seleccionan basándose en la secuencia de
A\beta_{17-21}, o sustituciones aceptables de la
misma. Por consiguiente, Xaa_{1} es una estructura de
D-leucina, Xaa_{2} es una estructura de
D-valina, Xaa_{3} es una estructura de
D-fenilalanina, por ejemplo,
D-ciclohexilalanina,
D-4-fluorofenilalanina
(para-fluorofenilalanina),
D-pentafluorofenilalanina, clorofenilalanina,
bromofenilalanina, nitrofenilalanina y
D-homofenilalanina, una estructura de
D-tirosina, una estructura de
D-yodotirosina o una estructura de
D-lisina, Xaa_{4} es una estructura de
D-fenilalanina, por ejemplo,
D-ciclohexilalanina,
D-4-fluorofenilalanina
(para-fluorofenilalanina),
D-pentafluorofenilalanina, clorofenilalanina,
bromofenilalanina, nitrofenilalanina,
D-piridilalanina y
D-homofenilalanina, una estructura de
D-tirosina, una estructura de
D-yodotirosina o una estructura de
D-lisina, y Xaa_{5} es una estructura de
D-leucina.
En otra realización, la invención proporciona un
compuesto modulador del \beta-amiloide que
comprende una fórmula (III):
en la que Xaa_{1} y Xaa_{2} son
cada uno estructuras de D-aminoácidos y al menos dos
de Xaa_{1} y Xaa_{2} se seleccionan, independientemente, del
grupo que consiste en una estructura de D-leucina,
una estructura de D-fenilalanina, por ejemplo,
D-ciclohexilalanina,
D-4-fluorofenilalanina
(para-fluorofenilalanina),
D-pentafluorofenilalanina, clorofenilalanina,
bromofenilalanina, nitrofenilalanina y
D-homofenilalanina, una estructura de
D-tirosina, una estructura de
D-yodotirosina, una estructura de
D-lisina o una estructura de
D-valina;
NH-NH es una estructura de
hidrazina;
Y, que puede estar o no presente, es una
estructura que tiene la fórmula (Xaa)_{a}, en la que Xaa es
cualquier estructura de D-aminoácidos y a es un
número entero desde 1 hasta 15;
Xaa1', Xaa2', y Xaa3' son cada uno estructuras
de D-aminoácidos y Xaa1', Xaa2', y Xaa3' se
seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en una
estructura de D-leucina, una estructura de
D-fenilalanina, por ejemplo,
D-ciclohexilalanina,
D-4-fluorofenilalanina
(para-fluorofenilalanina),
D-pentafluorofenilalanina, clorofenilalanina,
bromofenilalanina, nitrofenilalanina y
D-homofenilalanina, o una estructura de
D-valina;
Z, que puede estar o no presente, es una
estructura que tiene la fórmula (Xaa)_{b}, en la que Xaa es
cualquier estructura de D-aminoácidos y b es un
número entero desde 1 hasta 15;
A, que puede estar o no presente, es un grupo
modificador unido directa o indirectamente al compuesto; y
n es un número entero desde 1 hasta 15;
en la que Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{1}',
Xaa_{2}', Xaa_{3}', Y, Z, A y n se seleccionan de tal manera
que el compuesto se une a péptidos \beta-amiloides
naturales o modula la agregación o inhibe la neurotoxicidad de
péptidos \beta-amiloides naturales cuando se pone
en contacto con los péptidos \beta-amiloides
naturales, y es menos propenso a metabolismo, por ejemplo,
metabolismo oxidativo.
En los moduladores de la invención que tienen la
fórmula (II) o (III) mostradas anteriormente, se une un grupo
modificador opcional ("A") directa o indirectamente a la
estructura peptídica del modulador. (Tal como se usa en el presente
documento, el término "grupo modulador" o "grupo
modificador" se usan de manera intercambiable para describir un
grupo químico unido directa o indirectamente a una estructura
peptídica). Por ejemplo, puede(n)
unirse directamente un/unos grupo(s) modificador(es) mediante acoplamiento covalente a la estructura peptídica o puede(n) unirse indirectamente un/unos grupo(s) modificador(es) mediante una asociación no covalente estable. En una realización de la invención, se une un grupo modificador al extremo amino-terminal y al extremo carboxilo-terminal del modulador.
unirse directamente un/unos grupo(s) modificador(es) mediante acoplamiento covalente a la estructura peptídica o puede(n) unirse indirectamente un/unos grupo(s) modificador(es) mediante una asociación no covalente estable. En una realización de la invención, se une un grupo modificador al extremo amino-terminal y al extremo carboxilo-terminal del modulador.
Aún en otra realización, se une un/unos
grupo(s) modulador(es) a la cadena lateral de al menos
un residuo de aminoácido de la estructura peptídica del modulador
(por ejemplo, a través del grupo amino épsilon de un/unos
residuo(s)
de lisina, u otro grupo reactivo adecuado en una cadena lateral de aminoácido).
de lisina, u otro grupo reactivo adecuado en una cadena lateral de aminoácido).
Si está presente un/unos grupo(s)
modificador(es), se selecciona el grupo modificador de tal
manera que el compuesto inhibe la agregación de péptidos
\beta-amiloides naturales cuando se pone en
contacto con los péptidos \beta-amiloides
naturales.
Los moduladores particularmente preferidos de la
invención incluyen los siguientes:
D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH_{2};
N-metil-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH_{2};
N-metil-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH_{2};
N-metil-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F_{5}]Phe-D-Leu)-NH_{2}.
Compuestos incluso más preferidos de la
invención incluyen PPI:1019:
N-metil-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH_{2}.
(Tal como se describió anteriormente, D-Cha
representa D-ciclohexilalanina; [p-F]f
o D-[p-F]Phe representan
D-4-fluorofenilalanina (también
para-fluorofenilalanina); [F_{5}]f o
D-[F_{5}]Phe representan
D-pentafluorofenilalanina; y D-Nle
representa D-norleucina).
Se pretende además que las estructuras
peptídicas de D-aminoácidos de los moduladores de la
invención incluyan otras modificaciones peptídicas, incluyendo
análogos, derivados y miméticos, que conservan la capacidad del
modulador para alterar la agregación de \beta-PA
natural tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo,
una estructura peptídica de D-aminoácidos de un
modulador de la invención puede modificarse adicionalmente para
aumentar su estabilidad, biodisponibilidad y solubilidad. Los
términos "análogo", "derivado" y "mimético" tal como
se usan en el presente documento pretenden incluir moléculas que
imitan la estructura química de una estructura
D-peptídica y conservan las propiedades funcionales
de la estructura D-peptídica. Se conocen en la
técnica enfoques para diseñar análogos, derivados y miméticos
peptídicos. Por ejemplo, véanse Farmer, P.S. en Drug Design (E.J.
Ariens, ed.) Academic Press, Nueva York, 1980, vol. 10, págs.
119-143; Ball. J.B. y Alewood, P.F. (1990) J. Mol.
Recognition 3:55; Morgan, B.A. y Gainor, J.A. (1989) Ann. Rep. Med.
Chem. 24:243; y Freidinger, R.M. (1989) Trends Pharmacol. Sci.
10:270. Véanse también Sawyer, T.K. (1995) "Peptidomimetic Design
and Chemical Approaches to Peptide Metabolism" en Taylor, M.D. y
Amidon, G.L. (eds.) Peptide-Based Drug Design:
Controlling Transport and Metabolism, capítulo 17; Smith. A.B. 3º.
et al (1995) J. Am. Chem. Soc.
117:11113-11123; Smith, A.B. 3º, et al (1994)
J. Am Chem. Soc. 116:9947-9962; y Hirschman, R.,
et al. (1993) J. Am. Chem Soc. 115
12550-12568.
Tal como se usa en el presente documento, un
"derivado" de un compuesto X (por ejemplo, un péptido o un
aminoácido) se refiere a una forma de X en la que se han
derivatizado uno o más grupos reactivos en el compuesto con un
grupo sustituyente. Los ejemplos de derivados peptídicos incluyen
péptidos en los que se ha derivatizado una cadena lateral de
aminoácido, la estructura principal peptídica o el extremo amino o
carboxilo-terminal (por ejemplo, compuestos
peptídicos con enlaces amida metilados). Tal como se usa en el
presente documento, un análogo de un compuesto X se refiere a un
compuesto que conserva las estructuras químicas de X necesarias
para la actividad funcional de X que contiene también ciertas
estructuras químicas que difieren de X. Un ejemplo de un análogo de
un péptido que se produce de manera natural es un péptido que
incluye uno o más aminoácidos que no se producen de manera natural.
Tal como se usa en el presente documento, un "mimético" de un
compuesto X se refiere a un compuesto en el que se han sustituido
las estructuras químicas de X necesarias para la actividad
funcional de X por otras estructuras químicas que imitan la
conformación de X. Los ejemplos de peptidomiméticos incluyen
compuestos peptídicos en los que se sustituye la estructura
principal peptídica por una o más moléculas de benzodiazepina
(véase por ejemplo James, G.L. et al. (1993) Science 260:
1937-1942).
Se pretende que los compuestos moduladores de la
invención incluyan compuestos en los que se sustituyen uno o más
D-aminoácidos de la estructura peptídica por un
aminoácido homólogo de tal manera que las propiedades del modulador
original se mantienen. Preferiblemente, se realizan sustituciones de
aminoácidos conservativas en uno o más residuos de aminoácidos. Una
"sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que se
sustituye el residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que
tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica
familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales
similares, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo,
lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo,
ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales no cargadas
(por ejemplo, glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina,
tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo,
alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina,
metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en \beta
(por ejemplo treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales
aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano,
histidina). Los ejemplos no limitantes de sustituciones homólogas
que pueden realizarse en las estructuras peptídicas de los
moduladores de la invención incluyen sustitución de
D-fenilalanina por D-tirosina,
D-piridilalanina o
D-homofenilalanina, sustitución de
D-leucina por D-valina u otro
aminoácido natural o no natural que tiene una cadena lateral
alifática y/o sustitución de D-valina por
D-leucina u otro aminoácido natural o no natural
que tiene una cadena lateral alifática.
El término mimético, y en particular
peptidomimético, pretende incluir isósteros. El término
"isóstero" tal como se usa en el presente documento pretende
incluir una estructura química que puede sustituirse por una
segunda estructura química porque la conformación estérica de la
primera estructura se ajusta a un sitio de unión específico para la
segunda estructura. El término incluye específicamente
modificaciones de la estructura principal peptídica (es decir,
miméticos con enlace amida) bien conocidas por los expertos en la
técnica. Tales modificaciones incluyen modificaciones del nitrógeno
de la amida, el carbono \alpha, el carbonilo de la amida, la
sustitución completa del enlace amida, extensiones, deleciones o
reticulaciones de la estructura principal. Se conocen varias
modificaciones de la estructura principal peptídica, incluyendo
\Psi[CH_{2}S], \Psi[CH_{2}NH],
\Psi[CSNH_{2}], \Psi[NCHO],
\Psi[COCH_{2}] y \Psi[(E) o (Z) CH=CH]. En la
nomenclatura usada anteriormente, \Psi indica la ausencia de un
enlace amida. La estructura que sustituye el grupo amida se
especifica dentro de los paréntesis.
Otras posibles modificaciones incluyen una
sustitución de N-alquilo (o arilo)
(\Psi[CONR], o reticulación de la estructura principal
para construir lactamas y otras estructuras cíclicas. Otros
derivados de los compuestos moduladores de la invención incluyen
derivados de hidroximetilo C-terminales, derivados
O-modificados (por ejemplo, hidroximetil bencil éter
C-terminal), derivados modificados en el extremo
N-terminal incluyendo amidas sustituidas tales como
alquilamidas e hidrazidas y compuestos en los que se sustituye un
residuo de fenilalanina C-terminal por un análogo
de fenetilamida (por ejemplo,
Val-Phe-fenetilamida como un análogo
del tripéptido Val-Phe-
Phe).
Phe).
Los compuestos moduladores de la invención
pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas (descritas
adicionalmente en la subsección V más adelante) y pueden usarse en
métodos de tratamiento y detección tal como se describe
adicionalmente en la subsección V más adelante.
Los compuestos moduladores de la invención están
acoplados directa o indirectamente a al menos dos grupos
modificadores (abreviados como GM). El término "grupo
modificador" pretende incluir estructuras que están unidas
directamente a la estructura peptídica de
D-aminoácidos (por ejemplo, mediante acoplamiento
covalente), así como aquellas que están unidas indirectamente a la
estructura peptídica (por ejemplo, mediante asociación no covalente
estable o mediante acoplamiento covalente a residuos de aminoácidos
adicionales, o miméticos, análogos o derivados de los mismos, que
pueden flanquear la estructura peptídica de
D-aminoácidos derivada de A\beta). Por ejemplo,
el grupo modificador puede acoplarse al extremo
amino-terminal o al extremo
carboxilo-terminal de una estructura peptídica de
D-aminoácidos derivada de A\beta, o a una región
peptídica o peptidomimética que flanquea el dominio central. Como
alternativa, puede acoplarse el grupo modificador a una cadena
lateral de al menos un residuo de D-aminoácido de
una estructura peptídica de D-aminoácidos derivada
de A\beta, o a una región peptídica o peptidomimética que
flanquea el dominio central (por ejemplo, a través del grupo amino
épsilon de un/unos residuo(s) de lisina, a través del grupo
carboxilo de un/unos residuo(s) de ácido aspártico o un/unos
residuo(s) de ácido glutámico, a través de un grupo hidroxilo
de un/unos residuo(s) de tirosilo, un/unos residuo(s)
de serina o un/unos residuo(s) de treonina u otro grupo
reactivo adecuado en una cadena lateral de aminoácido). Los grupos
modificadores acoplados covalentemente a la estructura peptídica de
D-aminoácidos pueden unirse mediante y usando
métodos bien conocidos en la técnica para unir estructuras
químicas, incluyendo, por ejemplo, enlaces amida, alquilamino,
carbamato, urea o
éster.
éster.
El término "grupo modificador" pretende
incluir grupos que no están acoplados de manera natural a péptidos
A\beta naturales en su forma nativa. Por consiguiente, el término
"grupo modificador" no pretende incluir hidrógeno. El/los
grupo(s) modificador(es) se selecciona(n) de
modo que el compuesto modulador altera, y preferiblemente inhibe,
la agregación de péptidos \beta-amiloides
naturales cuando se pone en contacto con los péptidos
\beta-amiloides naturales o inhibe la
neurotoxicidad de péptidos \beta-amiloides
naturales cuando se pone en contacto con los péptidos
\beta-amiloides naturales. Aunque no se pretende
estar limitado por el mecanismo, en realizaciones en las que el
modulador comprende un/unos grupo(s) modificador(es),
se cree que el/los grupo(s) modificador(es) funcionan
como un farmacóforo clave que potencia la capacidad del modulador
para perturbar la polimerización de A\beta.
En una realización preferida, el/los
grupo(s) modificador(es) comprende(n) un grupo
alquilo. El término "alquilo", tal como se usa en el presente
documento, se refiere a un grupo hidrocarbonado de cadena lineal o
ramificada que tiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente
10 átomos de carbono. Los grupos alquilo a modo de ejemplo incluyen
metilo, etilo, dimetilo, dietilo, n-propilo,
isopropilo, n-butilo, isobutilo,
sec-butilo, terc-butilo,
n-pentilo y n-hexilo. Un grupo
alquilo puede no estar sustituido, o puede estar sustituido en una
o más posiciones, con, por ejemplo, halógenos, alquilos,
cicloalquilos, alquenilos, alquinilos, arilos, heterociclos,
hidroxilos, aminos, nitros, tioles, aminas, iminas, amidas,
fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos, éteres,
tioéteres, sulfonilos, selenoéteres, cetonas, aldehídos, ésteres,
-CF_{3}, -CN o similares. Son alquilos preferidos los metilos,
etilos, dimetilos, dietilos, n-propilos,
isopropilos.
En otra realización, un grupo modificador, por
ejemplo un grupo alquilo, está acoplado a otro grupo modificador.
Aún en otra realización, se modifica un D-aminoácido
en un compuesto modulador de la invención con dos grupos
modificadores. Por consiguiente, los grupos modificadores preferidos
incluyen un grupo 1-piridinacetilo.
En una realización preferida, el/los
grupo(s) modificador(es) comprende(n) un grupo
alquilo cíclico, heterocíclico, policíclico o ramificado. El
término "grupo cíclico", tal como se usa en el presente
documento, pretende incluir un grupo saturado o insaturado cíclico
(es decir, aromático) que tiene desde aproximadamente 3 hasta 10,
preferiblemente de aproximadamente 4 a 8 y más preferiblemente de
aproximadamente 5 a 7 átomos de carbono. Los grupos cíclicos a modo
de ejemplo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo,
ciclohexilo y ciclooctilo. Los grupos cíclicos pueden estar no
sustituidos o sustituidos en una o más posiciones de anillo. Por
tanto, un grupo cíclico puede estar sustituido con, por ejemplo,
halógenos, alquilos, cicloalquilos, alquenilos, alquinilos, arilos,
heterociclos, hidroxilos, aminos, nitros, tioles, aminas, iminas,
amidas, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos,
éteres, tioéteres, sulfonilos, sulfonatos, selenoéteres, cetonas,
aldehídos, ésteres, -CF_{3}, - CN, o similares.
El término "grupo heterocíclico" pretende
incluir un grupo saturado o insaturado cíclico (es decir, aromático)
que tiene desde aproximadamente 3 hasta 10, preferiblemente de
aproximadamente 4 a 8 y más preferiblemente de aproximadamente 5 a
7 átomos de carbono, en el que la estructura de anillo incluye de
aproximadamente uno a cuatro heteroátomos. Los grupos
heterocíclicos incluyen pirrolidina, oxolano, tiolano, imidazol,
oxazol, piperidina, piperazina, morfolina y piridina. El anillo
heterocíclico puede estar sustituido en una o más posiciones con
sustituyentes tales como por ejemplo halógenos, alquilos,
cicloalquilos, alquenilos, alquinilos, arilos, otros heterociclos,
hidroxilo, amino, nitro, tiol, aminas, iminas, amidas, fosfonatos,
fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos, éteres, tioéteres,
sulfonilos, selenoéteres, cetonas, aldehídos, ésteres, -CF_{3}, -
CN, o similares. Los heterociclos también pueden unirse por un
puente o condensarse con otros grupos cíclicos tal como se describe
más adelante.
El término "grupo policíclico" tal como se
usa en el presente documento pretende referirse a dos o mas anillos
cíclicos saturados o insaturados (es decir, aromáticos) en los que
dos o más carbonos son comunes a dos anillos contiguos, por
ejemplo, los anillos son "anillos condensados". Los anillos que
se unen a través de átomos no adyacentes se denominan anillos
"unidos por un puente". Cada uno de los anillos del grupo
policíclico puede estar sustituido con sustituyentes tales como los
descritos anteriormente, como por ejemplo halógenos, alquilos,
cicloalquilos, alquenilos, alquinilos, hidroxilo, amino, nitro,
tiol, aminas, iminas, amidas, fosfonatos, fosfinas, carbonilos,
carboxilos, sililos, éteres, tioéteres, sulfonilos, selenoéteres,
cetonas, aldehídos, ésteres, -CF_{3}, - CN, o similares.
Un grupo policíclico preferido es un grupo que
contiene una estructura de cis-decalina. Aunque no
se pretende estar limitado por el mecanismo, se cree que la
conformación "curvada" conferida en un grupo modificador por
la presencia de una estructura de cis-decalina
contribuye a la eficacia del grupo modificador para perturbar la
polimerización de A\beta. Por consiguiente, también pueden usarse
otras estructuras que imitan la configuración "curvada" de la
estructura de cis-decalina como grupos
modificadores. Un ejemplo de estructura que contiene
cis-decalina que puede usarse como grupo modificador
es una estructura de colanoílo, tal como un grupo colilo. Por
ejemplo, puede modificarse un compuesto modulador en su extremo
amino-terminal con un grupo colilo haciendo
reaccionar el dominio central de agregación con ácido cólico, un
ácido biliar. Además, puede modificarse un compuesto modulador en
su extremo carboxilo-terminal con un grupo colilo
según métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo Wess, G.
et al. (1993) Tetrahedron Letters,
34:817-822; Wess, G. et al. (1992)
Tetrahedron Letters 33:195-198; y Kramer, W. et
al. (1992) J. Biol. Chem. 267:18598-18604).
También pueden usarse derivados y análogos de colilo como grupos
modificadores. Por ejemplo, un derivado de colilo preferido es Aic
(3-(O-aminoetil-iso)-colilo), que
tiene un grupo amino libre que puede usarse para modificar
adicionalmente el compuesto modulador (por ejemplo, puede
introducirse un grupo quelante para ^{99m}Tc a través del grupo
amino libre de Aic). Tal como se usa en el presente documento, el
término "estructura de colanoílo" pretende incluir el grupo
colilo y derivados y análogos del mismo, en particular aquellos que
conservan una configuración de cis-decalina de
cuatro anillos. Los ejemplos de estructuras de colanoílo incluyen
grupos derivados de otros ácidos biliares, tales como ácido
desoxicólico, ácido litocólico, ácido ursodesoxicólico, ácido
quenodesoxicólico y ácido hiodesoxicólico, así como otras
estructuras relacionadas tales como ácido colánico, bufalina y
resibufogenina (aunque los últimos dos compuestos no se prefieren
para su uso como grupo modificador). Otro ejemplo de un compuesto
que contiene cis-decalina es
5\beta-colestan-3\alpha-ol
(el isómero de cis-decalina de
(+)-dihidrocolesterol). Para una descripción
adicional de la estructura y nomenclatura de ácidos biliares y
esteroides, véase, W.R. y McKean, M.L. Biochemistry of Steroids and
Other Isopentanoids, University Park Press, Baltimore, MD, capítulo
2.
Además de los grupos que contienen
cis-decalina, pueden usarse otros grupos
policíclicos como grupos modificadores. Por ejemplo, los grupos
modificadores derivados de esteroides o
\beta-lactamas pueden ser grupos modificadores
adecuados. En una realización, el grupo modificador es una
"estructura de biotinilo", que incluye grupos biotinilo y
análogos y derivados de los mismos (tales como un grupo
2-iminobiotinilo). En otra realización, el grupo
modificador puede comprender un "grupo que contiene
fluoresceína", tal como un grupo derivado de la reacción de una
estructura peptídica derivada de A\beta con 5-(y
6)-carboxifluoresceína, succinimidil éster o
isotiocianato de fluoresceína. En otras diversas realizaciones,
el/los grupo(s) modificador(es) puede(n)
comprender un grupo N-acetilneuraminilo, un grupo
trans-4-cotinincarboxilo, un grupo
2-imino-1-imidazolidinacetilo,
un grupo
(S)-(-)-indolin-2-carboxilo,
un grupo (-)-mentoxiacetilo, un grupo
2-norbonanoacetilo, un grupo
\gamma-oxo-5-acenaftenobutirilo,
un grupo
(-)-2-oxo-4-tiazolidincarboxilo,
un grupo tetrahidro-3-furoílo, un
grupo 2-iminobiotinilo, un grupo
dietilentriaminopentaacetilo, un grupo
4-morfolincarbonilo, un grupo
2-tiofenoacetilo o un grupo
2-tiofenosulfonilo.
Además de los grupos cíclicos, heterocíclicos y
policíclicos tratados anteriormente, pueden usarse otros grupos
modificadores en un modulador de la invención. Por ejemplo, los
grupos hidrófobos y grupos alquilo ramificados pueden ser grupos
modificadores adecuados. Los ejemplos incluyen grupos acetilo,
grupos fenilacetilo, grupos fenilacetilo, grupos difenilacetilo,
grupos trifenilacetilo, grupos isobutanoílo, grupos
4-metilvalerilo, grupos trans-cinamoílo,
grupos butanoílo y grupos 1-adamantanocarbonilo.
Aún otro tipo de grupo modificador es un
compuesto que contiene un aminoácido no natural que actúa como un
mimético de giro beta, tal como un aminoácido basado en
dibenzofurano descrito en Tsang, K.Y. et al. (1994) J. Am.
Chem. Soc. 116:3988-4005; Diaz, H y Kelly, J.W.
(1991) Tetrahedron Letters 41:5725-5728; y Diaz. H
et al. (1992) J. Am. Chem. Soc.
114:8316-8318. Un ejemplo de un grupo modificador de
este tipo es un grupo de ácido
peptídico-aminoetildibenzofuranilo-propiónico
(Adp) (por ejemplo, DDIIL-Adp) (SEQ ID NO: 31). Este
tipo de grupo modificador puede comprender además uno o más enlaces
N-metilpeptídicos para introducir un impedimento
estérico adicional a la agregación de \beta-PA
natural cuando los compuestos de este tipo interaccionan con
\beta-PA
natural.
natural.
Aún otro tipo de grupo modificador es un grupo
NH-OR, en el que el R puede ser cualquiera de los
grupos alquilo o cicloalquilo modificados o no modificados
descritos en el presente documento.
Se enumeran a continuación ejemplos no
limitantes de grupos modificadores adecuados, con sus
correspondientes reactivos modificadores:
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los grupos modificadores preferidos incluyen
grupos que contienen metilo, grupos que contienen etilo, grupos que
contienen propilo y grupos que contienen piperidina, por ejemplo un
grupo 1-piperidin-acetilo.
Un compuesto modulador del
\beta-amiloide de la invención puede modificarse
adicionalmente para alterar las propiedades específicas del
compuesto aunque se conserva la capacidad del compuesto para alterar
la agregación de A\beta e inhibir la neurotoxicidad de A\beta.
Por ejemplo, en una realización, el compuesto se modifica
adicionalmente para alterar una propiedad farmacocinética del
compuesto, tal como la semivida o la estabilidad in vivo. En
otra realización, el compuesto se modifica adicionalmente para
marcar el compuesto con una sustancia detectable. Aún en otra
realización, el compuesto se modifica adicionalmente para acoplar el
compuesto a un resto terapéutico adicional. De manera esquemática,
un modulador de la invención que comprende un dominio central de
agregación de A\beta de D-aminoácidos acoplado
directa o indirectamente a al menos un grupo modificador puede
ilustrarse como GM-DCA, mientras que este compuesto
que se ha modificado adicionalmente para alterar las propiedades
del modulador puede ilustrarse como
GM-DCA-MQ, en el que CM representa
una modificación química adicional.
Para modificar químicamente de manera adicional
el compuesto, tal como para alterar las propiedades farmacocinéticas
del compuesto, pueden derivatizarse grupos reactivos. Por ejemplo,
cuando el grupo modificador está unido al extremo
amino-terminal del dominio central de agregación, el
extremo carboxilo-terminal del compuesto puede
modificarse adicionalmente. Las modificaciones
C-terminales preferidas incluyen aquellas que
reducen la capacidad del compuesto para actuar como un sustrato
para carboxipeptidasas. Los ejemplos de modificadores
C-terminales preferidos incluyen un grupo amida (es
decir, una amida peptídica). Como alternativa, cuando el grupo
modificador está unido al extremo
carboxilo-terminal de un dominio central de
agregación, el extremo amino-terminal del compuesto
puede modificarse adicionalmente, por ejemplo, para reducir la
capacidad del compuesto para actuar como un sustrato para
aminopeptidasas.
Puede modificarse adicionalmente un compuesto
modulador para marcar el compuesto haciendo reaccionar el compuesto
con una sustancia detectable. Las sustancias detectables adecuadas
incluyen diversos enzimas, grupos prostéticos, materiales
fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos.
Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa del rábano,
fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa o
acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos
prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y
avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados
incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína,
rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína,
cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material
luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de materiales
radiactivos adecuados incluyen ^{14}C, ^{123}I, ^{124}I,
^{125}I, ^{131}I, ^{99m}Tc, ^{35}S o ^{3}H. En una
realización preferida, se marca radiactivamente un compuesto
modulador con ^{14}C, mediante la incorporación o bien de ^{14}C
dentro del grupo modificador o bien de una o más estructuras de
aminoácido en el compuesto modulador. Los compuestos moduladores
marcados pueden usarse para valorar la farmacocinética in
vivo de los compuestos, así como para detectar la agregación de
A\beta, por ejemplo para fines de diagnóstico. Puede detectarse la
agregación de A\beta usando un compuesto modulador marcado o bien
in vivo o bien en una muestra in vitro derivada de un
sujeto.
Preferiblemente, para su uso como un agente de
diagnóstico in vivo, se marca un compuesto modulador de la
invención con tecnecio o yodo radiactivos. Por consiguiente, en una
realización, la invención proporciona un compuesto modulador
marcado con tecnecio, preferiblemente ^{99m}Tc. Se conocen en la
técnica métodos para marcar compuestos peptídicos con tecnecio
(véanse por ejemplo las patentes estadounidenses números 5.443.815,
5.225.180 y 5.405.597, todas por Dean et al.;
Stepniak-Biniakiewicz, D., et al.
(1992)J. Med. Chem. 35:274-279; Fritzberg,
A.R., et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:4025-4029; Baidoo, K.E., et al. (1990)
Cancer Res. Suppl. 50:799s-803s; y Regan, L. y
Smith, C.K. (1995) Science 270:980-982). Puede
elegirse un grupo modificador que proporcione un sitio en el que
puede introducirse un grupo quelante para ^{99m}Tc, tal como el
derivado Aic del ácido cólico, que tiene un grupo amino libre. En
otra realización, la invención proporciona un compuesto modulador
marcado con yodo radiactivo. Por ejemplo, puede sustituirse un
residuo de fenilalanina dentro de la secuencia de A\beta (tal como
Phe_{19} o Phe_{20}) por yodotirosilo radiactivo. Puede
incorporarse cualquiera de los diversos isótopos del yodo radiactivo
para crear un agente de diagnóstico. Preferiblemente, se usa
^{123}I (semivida = 13,2 horas) para la gammagrafía corporal
completa, se usa ^{124}I (semivida = 4 días) para la tomografía
por emisión de positrones (PET), se usa ^{125}I (semivida = 60
días) para los estudios de renovación metabólica y se usa ^{131}I
(semivida = 8 días) para los estudios de recuento corporal completo
y formación de imágenes de baja resolución retrasadas.
Además, una modificación adicional de un
compuesto modulador de la invención puede servir para conferir una
propiedad terapéutica adicional al compuesto. Es decir, la
modificación química adicional puede comprender un resto funcional
adicional. Por ejemplo, puede acoplarse un resto funcional que sirve
para romper o disolver las placas de amiloide al compuesto
modulador. De esta forma, la parte GM-DCA del
modulador sirve para dirigir el compuesto hacia péptidos A\beta y
perturba la polimerización de los péptidos A\beta, mientras que el
resto funcional adicional sirve para romper o disolver las placas
de amiloide después de que el compuesto haya sido dirigido hacia
estos sitios.
En una modificación química alternativa, se
prepara un compuesto de \beta-amiloide de la
invención en forma de "profármaco", en el que el compuesto no
modula por sí mismo la agregación de A\beta, sino que es su lugar
puede transformarse, tras metabolismo in vivo, en un
compuesto modulador del \beta-amiloide tal como
se define en el presente documento. Por ejemplo, en este tipo de
compuesto, puede presentarse el grupo modulador en forma de
profármaco que puede transformarse tras metabolismo en la forma de
un grupo modulador activo. Tal forma de profármaco de un grupo
modificador se denomina en el presente documento "grupo
modificador secundario". Se conocen en la técnica una variedad
de estrategias para preparar profármacos peptídicos que limiten el
metabolismo con el fin de optimizar la administración de la forma
activa del fármaco basado en péptidos (véase, por ejemplo, Moss, J.
(1995) en Peptide-Based Drug Design: Controlling
Transport and Metabolism, Taylor, M.D. y Amidon. G.L. (eds).
Capítulo 18). Adicionalmente se han adaptado de manera específica
estrategias para lograr la administración al SNC basándose en
"metabolismo secuencial" (Véanse, por ejemplo, Bodor, N., et
al. (1992) Science 257:1698-1700; Prokai, L.,
et al. (1994) J. Am. Chem. Soc.
116:2643-2644: Bodor. N. y Prokai, L. (1995) en
Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport
and Metabolism, Taylor, M.D. y Amidon, G.L. (eds), capítulo 14). En
una realización de una forma de profármaco de un modulador de la
invención, el grupo modificador comprende un alquil éster para
facilitar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica.
Pueden prepararse compuestos moduladores de la
invención mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica.
Puede sintetizarse el componente peptídico de un modulador usando
técnicas convencionales tales como las descritas en Bodansky, M.
Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlín (1993) y
Grant, G.A (ed.). Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman
and Company, Nueva York (1992). Están disponibles comercialmente
sintetizadores de péptidos automatizados (por ejemplo, Advanced
ChemTech modelo 396; Milligen/Biosearch 9600). Adicionalmente,
pueden unirse uno o más grupos moduladores al componente peptídico
derivado de A\beta (por ejemplo, un dominio central de
agregación) mediante métodos convencionales, usando por ejemplo
métodos para la reacción a través de un grupo amino (por ejemplo,
el grupo alfa-amino en el extremo
amino-terminal de un péptido), un grupo carboxilo
(por ejemplo, en el extremo carboxilo-terminal de un
péptido), un grupo hidroxilo (por ejemplo sobre un residuo de
tirosina, serina o treonina) u otro grupo reactivo adecuado sobre
una cadena lateral de aminoácidos (véase, por ejemplo, Greene, T.W y
Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and
Sons, Inc., Nueva York (1991). Se describe más adelante en el
ejemplo 1 la síntesis a modo de ejemplo de modulador del
\beta-amiloide de
D-aminoácidos.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método para seleccionar un modulador de la agregación de
\beta-amiloide. En el método, se pone en contacto
un compuesto de prueba con péptidos
\beta-amiloides naturales, se mide la agregación
del \beta-PA natural y se selecciona un modulador
basándose en la capacidad del compuesto de prueba para alterar la
agregación del \beta-PA natural (por ejemplo,
inhibe o promueve la agregación). En una realización preferida, se
pone en contacto el compuesto de prueba con una cantidad en exceso
molar del \beta-PA natural. Puede determinarse la
cantidad y/o velocidad de agregación de \beta-PA
natural en presencia del compuesto de prueba mediante un ensayo
adecuado indicativo de la agregación de \beta-PA,
tal como se describe en el presente documento (véase, por ejemplo,
el
ejemplo 2).
ejemplo 2).
En un ensayo preferido, se disuelve el
\beta-PA natural en disolución en presencia del
compuesto de prueba y se valora la agregación del
\beta-PA natural en un ensayo de nucleación (véase
el ejemplo 2) valorando la turbidez de la disolución con el tiempo,
tal como se mide mediante la absorbancia aparente de la disolución
a 405 nm (descrito adicionalmente en el ejemplo 2; véase también
Jarrett et al. (1993) Biochemistry
32:4693-4697). En ausencia de un modulador del
\beta-amiloide, la A_{405 \ nm} de la
disolución permanece normalmente constante de manera relativa
durante un lapso de tiempo en el que \beta-PA se
mantiene en disolución, pero luego la A_{405 \ nm} de la
disolución aumenta rápidamente a medida que
\beta-PA se agrega y sale de la disolución,
alcanzando en última instancia un nivel de meseta (es decir, la
A_{405 \ nm} de la disolución muestra una cinética sigmoidea con
el tiempo). En cambio, en presencia de un compuesto de prueba que
inhibe la agregación de \beta-PA, se reduce la
A_{405 \ nm} de la disolución comparado a cuando el modulador
está ausente. Por tanto, en presencia del modulador inhibidor, la
disolución puede mostrar un aumento del lapso de tiempo, una
disminución de la pendiente de agregación y/o un nivel de meseta
inferior comparado a cuando el modulador está ausente. Este método
para seleccionar un modulador de la polimerización del
\beta-amiloide puede usarse de manera similar
para seleccionar moduladores que promuevan la agregación de
\beta-PA. Por tanto, en presencia de un modulador
que promueve la agregación de \beta-PA, aumenta la
A_{405 \ nm} de la disolución comparado a cuando el modulador
está ausente (por ejemplo, la disolución puede mostrar una
disminución en el lapso de tiempo, un aumento en la pendiente de
agregación y/o un nivel de meseta superior comparado a cuando el
modulador está ausente).
Otro ensayo adecuado para su uso en el método de
selección de la invención, un ensayo de extensión con simiente, se
describe también adicionalmente en el ejemplo 2. En este ensayo, se
combinan el monómero de \beta-PA y una
"simiente" de \beta-PA agregada en presencia
y ausencia de un compuesto de prueba, y se somete a ensayo la
cantidad de formación de fibrilla \beta basándose en la emisión
potenciada del colorante tioflavina T cuando se pone en contacto
con fibrillas de \beta-PA. Además, puede valorarse
la agregación de \beta-PA mediante microscopía
electrónica (ME) de la preparación de \beta-PA en
presencia o ausencia del modulador. Por ejemplo, la formación de
fibrillas de \beta-amiloide, que puede detectarse
mediante ME, se reduce en presencia de un modulador que inhibe la
agregación de \beta-PA (es decir, hay una
reducción en la cantidad o número de fibrillas \beta en presencia
del modulador), mientras que aumenta la formación de fibrillas
\beta en presencia de un modulador que promueve la agregación de
\beta-PA (es decir, hay un aumento en la cantidad
o número de fibrillas \beta en presencia del modulador).
Otro ensayo preferido para su uso en el método
de selección de la invención para seleccionar moduladores adecuados
es el ensayo de neurotoxicidad descrito en el ejemplo 3. Se
seleccionan compuestos que inhiben la formación de agregados de
A\beta neurotóxicos y/o que inhiben la neurotoxicidad de las
fibrillas de A\beta formadas previamente. Se considera que este
ensayo de neurotoxicidad es predictivo de la neurotoxicidad in
vivo. Por consiguiente, la actividad inhibidora de un compuesto
modulador en el ensayo de neurotoxicidad in vitro es
predictivo de la actividad inhibidora similar del compuesto para la
neurotoxicidad in vivo.
Otro aspecto de la invención se refiere a
composiciones farmacéuticas de los compuestos moduladores del
\beta-amiloide de la invención. En una
realización, la composición incluye un compuesto modulador del
\beta-amiloide en una cantidad terapéutica o
profilácticamente eficaz suficiente para alterar, y preferiblemente
inhibir, la agregación de los péptidos
\beta-amiloides naturales, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la composición
incluye un compuesto modulador del \beta-amiloide
en una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz suficiente
para inhibir la neurotoxicidad de los péptidos
\beta-amiloides naturales, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Una "cantidad terapéuticamente
eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y
durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado
terapéutico deseado, tal como la reducción o reversión de la
deposición de \beta-amiloide y/o reducción o
reversión de la neurotoxicidad de A\beta. Una cantidad
terapéuticamente eficaz del modulador puede variar según factores
tales como el estado patológico, edad, sexo y peso del individuo, y
la capacidad del modulador para provocar una respuesta deseada en
el individuo. Pueden ajustarse los regímenes de dosificación para
proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad
terapéuticamente eficaz es también una en la que se compensa
cualquier efecto tóxico o perjudicial del modulador por los efectos
terapéuticamente beneficiosos. Puede someterse a ensayo la
neurotoxicidad potencial de los moduladores de la invención usando
el ensayo basado en células descrito en el ejemplo 6 y puede
seleccionarse un modulador terapéuticamente eficaz que no muestre
neurotoxicidad significativa. En una realización preferida, una
cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador es suficiente para
alterar, y preferiblemente inhibir, la agregación de una cantidad
en exceso molar de los péptidos \beta-amiloides
naturales. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere
a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de
tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado,
tal como evitar o inhibir la velocidad de deposición de
\beta-amiloide y/o la neurotoxicidad de A\beta
en un sujeto predispuesto a la deposición de
\beta-amiloide. Puede determinarse una cantidad
profilácticamente eficaz tal como se describió anteriormente para
la cantidad terapéuticamente eficaz. Normalmente, dado que se usa
una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa más
temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será
inferior que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Un factor que puede considerarse cuando se
determina una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un
modulador del \beta-amiloide, es la concentración
de \beta-PA natural en un compartimiento biológico
de un sujeto, tal como en el líquido cefalorraquídeo (LCR) del
sujeto. La concentración de \beta-PA en el LCR se
ha estimado que es de 3 nM (Schwartzman, (1994) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91:8368-8372). Un intervalo no limitante
para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un
modulador del \beta-amiloide es 0,01
nM-10 \muM. Debe observarse que los valores de
dosificación pueden variar con la gravedad del estado que va a
paliarse. Debe entenderse que para cualquier sujeto particular,
deben ajustarse los regímenes de dosificación específicos con el
tiempo según las necesidades del individuo y el criterio profesional
de la persona que administra o supervisa la administración de las
composiciones, y que los intervalos de dosificación expuestos en el
presente documento son sólo a modo de ejemplo y no pretenden limitar
el alcance o la práctica de la composición reivindicada.
La cantidad de compuesto activo en la
composición puede variar según factores tales como el estado
patológico, edad, sexo y peso del individuo, cada uno de los cuales
puede afectar a la cantidad de \beta-PA natural
en el individuo. Pueden ajustarse los regímenes de dosificación para
proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, puede
administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis
divididas en el tiempo y puede reducirse o aumentarse
proporcionalmente la dosis tal como se indique por las exigencias de
la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular
composiciones parenterales en forma farmacéutica unitaria para la
facilidad de administración y uniformidad de administración. Forma
farmacéutica unitaria tal como se usa en el presente documento se
refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como
dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que van a
tratarse; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de
compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico
deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La
especificación para las formas farmacéuticas unitarias de la
invención está dictada por y depende directamente de (a) las
características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico
particular que va a lograrse, y (b) las limitaciones inherentes en
la técnica de componer tal compuesto activo para el tratamiento de
sensibilidad en individuos.
Tal como se usa en el presente documento,
"vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y
todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos,
agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de
retraso de la absorción y similares que son fisiológicamente
compatibles. En una realización, el vehículo es adecuado para la
administración parenteral. Preferiblemente, el vehículo es adecuado
para la administración en el sistema nervioso central (por ejemplo,
por vía intrarraquídea o por vía intracerebral). Como alternativa,
el vehículo puede ser adecuado para la administración intravenosa,
intraperitoneal o intramuscular. En otra realización, el vehículo
es adecuado para la administración oral. Los vehículos
farmacéuticamente aceptables incluyen disoluciones o dispersiones
acuosas estériles y polvos estériles para la preparación
extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles.
El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente
activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que
cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el
compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las
composiciones farmacéuticas de la invención. También pueden
incorporarse compuestos activos complementarios en las
composiciones.
Las composiciones terapéuticas deben ser
normalmente estériles y estables en las condiciones de fabricación
y almacenamiento. La composición puede formularse como una
disolución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada
adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede
ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo,
agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y
polietilenglicol líquido y similares), y mezclas adecuadas de los
mismos. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo,
mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el
mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una
dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será
preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares,
polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la
composición. Puede ocasionarse la absorción prolongada de las
composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente
que retrasa la absorción, por ejemplo sales de monoestearato y
gelatina. Además, pueden administrarse los moduladores en una
formulación de liberación lenta, por ejemplo en una composición que
incluye un polímero de liberación lenta. Los compuestos activos
pueden prepararse con vehículos que protegerán al compuesto frente
a la liberación rápida, tal como una formulación de liberación
controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración
microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables,
biocompatibles, tales como etileno-acetato de
vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno,
poliortoésteres, poli(ácido láctico) y copolímeros polilácticos,
poliglicólicos (PLG). Están patentados muchos métodos para la
preparación de tales formulaciones o los conocen generalmente los
expertos en la técnica.
Pueden prepararse disoluciones inyectables
estériles incorporando el compuesto activo (por ejemplo, el
modulador del \beta-amiloide) en la cantidad
requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de
componentes enumerados anteriormente, tal como se requiera, seguido
por esterilización por filtración. Generalmente, se preparan
dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril
que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes
requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos
estériles para la preparación de disoluciones inyectables
estériles, los métodos de preparación preferidos son secado a vacío
y liofilización que producen un polvo del principio activo más
cualquier componente deseado adicional a partir de una disolución
previamente filtrada para esterilidad de los mismos.
Un compuesto modulador de la invención puede
formularse con uno o más compuestos adicionales que potencian la
solubilidad del compuesto modulador. Los compuestos preferidos que
van a añadirse a las formulaciones para aumentar la solubilidad de
los moduladores son derivados de ciclodextrina, preferiblemente
hidroxipropil-\gamma-ciclodextrina.
Se describen vehículos de administración de fármacos que contienen
un derivado de ciclodextrina para la administración de péptidos al
sistema nervioso central en Bodor, N., et al. (1992) Science
257:1698-1700. Para los moduladores del
\beta-amiloide descritos en el presente documento,
la inclusión en la formulación de
hidroxipropil-\gamma-ciclodextrina
a una concentración de 50-200 mM aumenta la
solubilidad acuosa de los compuestos. Además de aumentar la
solubilidad, la inclusión de un derivado de ciclodextrina en la
formulación puede tener otros efectos beneficiosos, dado que se ha
notificado que la \beta-ciclodextrina por sí misma
interacciona con el péptido A\beta e inhibe la formación de
fibrillas in vitro (Camilleri, P., et al. (1994) FEBS
Letters 341:256-258. Por consiguiente, el uso de un
compuesto modulador de la invención en combinación con un derivado
de ciclodextrina puede dar como resultado una mayor inhibición de
la agregación de A\beta que el uso del modulador solo. Se conocen
en la técnica modificaciones químicas de las ciclodextrinas
(Hanessian, S., et al. (1995) J. Org. Chem.
60:4786-4797). Además de su uso como un aditivo en
una composición farmacéutica que contiene un modulador de la
invención, los derivados de ciclodextrina también pueden ser útiles
como grupos modificadores y, por consiguiente, también pueden
acoplarse covalentemente a un compuesto de péptido A\beta para
formar un compuesto modulador de la invención.
Otra formulación preferida de los compuestos
moduladores para aumentar la captación cerebral comprende el
detergente Tween-80, polietilenglicol (PEG) y etanol
en una solución salina. Un ejemplo no limitante de tal formulación
preferida es Tween-80 al 0,16%,
PEG-3000 al 1,3% y etanol al 2% en solución
salina.
En otra realización, se formula una composición
farmacéutica que comprende un modulador de la invención de modo que
el modulador se transporta a través de la barrera hematoencefálica
(BHE). Pueden adaptarse diversas estrategias conocidas en la
técnica para aumentar el transporte a través de la BHE en los
moduladores de la invención para aumentar de ese modo el transporte
de los moduladores a través de la BHE (para revisiones de tales
estrategias, véanse por ejemplo, Pardridge, W.M. (1994) Trends in
Biotechnol. 12:239-245; Van Bree, J.B. et
al. (1993) Pharm. World Sci. 15:2-9; y
Pardridge. W.M. et al. (1992) Pharmacol. Toxicol.
71:3-10). En un enfoque, se modifica químicamente
el modulador para formar un profármaco con aumento del transporte
transmembrana. Las modificaciones químicas adecuadas incluyen la
unión covalente de un ácido graso al modulador a través de un
enlace amida o éster (véase, por ejemplo, la patente estadounidense
4.933.324 y la publicación PCT WO 89/07938, ambas concedidas a
Shashoua; la patente estadounidense 5.284.876 concedida a Hesse
et al.; Toth, I. et al. (1994) J. Drug Target.
2:217-239; y Shashoua, V.E. et al. (1984) J.
Med. Chem. 27:659-664) y glicosilar el modulador
(véase, por ejemplo, la patente estadounidense 5.260.308 concedida a
Poduslo et al.). También, pueden usarse derivados de
N-acilaminoácido en un modulador para formar un
profármaco "lipídico" (véase también el documento 5.112.863
concedido a Hashimoto
et al.).
et al.).
En otro enfoque para potenciar el transporte a
través de la BHE, se conjuga un modulador peptídico o
peptidomimético con un segundo péptido o proteína, formando de ese
modo una proteína quimérica, en el que el segundo péptido o
proteína experimenta transcitosis mediada por receptor o mediada por
absorción a través de la BHE. Por consiguiente, acoplando el
modulador con este segundo péptido o proteína, la proteína quimérica
se transporta a través de la BHE. El segundo péptido o proteína
puede ser un ligando para un ligando de receptor de célula
endotelial capilar cerebral. Por ejemplo, un ligando preferido es
un anticuerpo monoclonal que se une específicamente al receptor de
transferrina sobre células endoteliales capilares cerebrales
(véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.182.107 y
5.154.924 y las publicaciones PCT WO 93/10819 y WO 95/02421, todas
concedidas a Friden et al.). Otros péptidos o proteínas
adecuados que pueden mediar el transporte a través de la BHE
incluyen histonas (véase, por ejemplo, la patente estadounidense
4.902.505 concedida a Pardridge y Schimmel) y ligandos tales como
biotina, folato, niacina, ácido pantoténico, riboflavina, tiamina,
piridoxal y ácido ascórbico (véanse por ejemplo las patentes
estadounidenses 5.416.016 y 5.108.921, concedidas ambas a
Heinstein). Adicionalmente, se ha notificado que el transportador
de glucosa GLUT-1 transporta glucopéptidos (análogos
de
L-serinil-\beta-D-glucósido
de (Met5]encefalina) a través de la BHE (Polt, R. et
al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:7114-1778). Por consiguiente, puede acoplarse un
compuesto modulador a tal glucopéptido para dirigir el modulador
hasta el transportador de glucosa GLUT-1. Por
ejemplo, puede acoplarse un compuesto modulador que está modificado
en su extremo amino-terminal con el grupo
modificador Aic
(3-(O-aminoetil-iso)-colilo,
un derivado del ácido cólico que tiene un grupo amino libre) con un
glucopéptido a través del grupo amino de Aic mediante métodos
convencionales. Pueden formarse proteínas quiméricas mediante
métodos de ADN recombinante (por ejemplo, mediante la formación de
un gen quimérico que codifica para una proteína de fusión) o
mediante reticulación química del modulador con el segundo péptido
o proteína para formar una proteína quimérica. Se conocen en la
técnica numerosos agentes de reticulación química (por ejemplo,
disponibles comercialmente de Pierce, Rockford IL). Puede elegirse
un agente de reticulación química que permita un acoplamiento de
alto rendimiento del modulador con el segundo péptido o proteína y
la escisión posterior del ligador para liberar el modulador
bioactivo. Por ejemplo, puede usarse un sistema de ligador basado en
biotina-avidina.
Aún en otro enfoque para potenciar el transporte
a través de la BHE, el modulador está encapsulado en un vector de
vehículo que medía el transporte a través de la BHE. Por ejemplo, el
modulador puede encapsularse en un liposoma, tal como un liposoma
unilamelar cargado positivamente (véanse por ejemplo, las
publicaciones PCT WO 88/07851 y WO 88/07852, concedidas ambas a
Faden) o en microesferas poliméricas (véase por ejemplo la patente
estadounidense 5.413.797 concedida a Khan et al., la patente
estadounidense 5.271.961 concedida a Mathiowitz et al. y
5.019.400 concedida a Gombotz et al.). Además, el vector de
vehículo puede modificarse para dirigirlo hacia el transporte a
través de la BHE. Por ejemplo, el vector de vehículo (por ejemplo,
liposoma) puede modificarse covalentemente con una molécula que se
transporta activamente a través de la BHE o con un ligando para
receptores celulares endoteliales cerebrales, tales como un
anticuerpo monoclonal que se une específicamente a receptores de
transferrina (véase, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 91/04014
concedida a Collins et al. y WO 94/02178 concedida a
Greig
et al.).
et al.).
Todavía en otro enfoque para potenciar el
transporte del modulador a través de la BHE, se administra
conjuntamente el modulador con otro agente que funciona
permeabilizando la BHE. Los ejemplos de tales
"permeabilizadores" de la BHE incluyen bradiquinina y
agonistas de la bradiquinina (véase por ejemplo, la patente
estadounidense 5.112.596 concedida a
Malfroy-Camine) y compuestos peptídicos descritos en
la patente estadounidense 5.268.164 concedida a Kozarich et
al.
Pueden usarse ensayos que miden la estabilidad
in vitro de los compuestos moduladores en el líquido
cefalorraquídeo (LCR) y puede usarse el grado de captación cerebral
de los compuestos moduladores en modelos animales como predicciones
de la eficacia in vivo de los compuestos. Se describen
ensayos adecuados para medir la estabilidad en LCR y la captación
cerebral en los ejemplos 7 y 8, respectivamente.
Un compuesto modulador de la invención puede
formularse en una composición farmacéutica en la que el modulador
es el único compuesto activo o, como alternativa, la composición
farmacéutica puede contener compuestos activos adicionales. Por
ejemplo, pueden usarse dos o más compuestos moduladores en
combinación. Además, puede combinarse un compuesto modulador de la
invención con uno o más de otros agentes que tienen propiedades
antiamiloidogénicas. Por ejemplo, puede combinarse un compuesto
modulador con el inhibidor no específico tacrina (COGNEX®,
Parke-Davis).
En otra realización, se proporciona una
composición farmacéutica de la invención como una formulación
envasada. La formulación envasada puede incluir una composición
farmacéutica de la invención en un recipiente e instrucciones
impresas para la administración de la composición para tratar a un
sujeto que tiene un trastorno asociado con la
\beta-amiloidosis, por ejemplo enfermedad de
Alzheimer.
Otro aspecto de la invención se refiere a
métodos para alterar la agregación o inhibir la neurotoxicidad de
péptidos \beta-amiloides naturales. En los métodos
de la invención, se ponen en contacto péptidos
\beta-amiloides naturales con un modulador del
\beta-amiloide de modo que se altera la agregación
de los péptidos \beta-amiloides naturales o se
inhibe la neurotoxicidad de los péptidos
\beta-amiloides naturales. En una realización
preferida, el modulador inhibe la agregación de los péptidos
\beta-amiloides naturales. En otra realización, el
modulador promueve la agregación de los péptidos
\beta-amiloides naturales. Preferiblemente, se
altera la agregación de una cantidad en exceso molar de
\beta-PA, en relación con la cantidad de
modulador, tras el contacto con el modulador.
En el método de la invención, pueden ponerse en
contacto péptidos \beta-amiloides naturales con un
modulador o bien in vitro o bien in vivo. Por tanto,
el término "poner en contacto con" pretende abarcar tanto la
incubación de un modulador con una preparación de
\beta-PA natural in vitro como la
administración del modulador a un sitio in vivo en el que
está presente \beta-PA natural. Dado que el
compuesto modulador interacciona con \beta-PA
natural, pueden usarse los compuestos moduladores para detectar
\beta-PA natural, o bien in vitro o bien
in vivo. Por consiguiente, un uso de los compuestos
moduladores de la invención es como agentes de diagnóstico para
detectar la presencia de \beta-PA natural, o bien
en una muestra biológica o bien in vivo en un sujeto.
Además, puede usarse adicionalmente la detección de
\beta-PA natural utilizando un compuesto
modulador de la invención para diagnosticar la amiloidosis en un
sujeto. Adicionalmente, dado que los compuestos moduladores de la
invención deterioran la agregación de \beta-PA e
inhiben la neurotoxicidad de \beta-PA, los
compuestos moduladores de la invención también son útiles en el
tratamiento de trastornos asociados con la
\beta-amiloidosis, o bien profiláctica o bien
terapéuticamente. Por consiguiente, otro uso de los compuestos
moduladores de la invención es como agentes terapéuticos para
alterar la agregación y/o neurotoxicidad de
\beta-PA natural.
En una realización, se usa un compuesto
modulador de la invención in vitro, por ejemplo para detectar
y cuantificar \beta-PA natural en una muestra
(por ejemplo, una muestra de fluido biológico). Para ayudar en la
detección, puede modificarse el compuesto modulador con una
sustancia detectable. La fuente de \beta-PA
natural usada en el método puede ser, por ejemplo, una muestra de
líquido cefalorraquídeo (por ejemplo, de un paciente con EA, un
adulto susceptible a la EA o un adulto sano). La muestra de
\beta-PA natural se pone en contacto con un
modulador de la invención y se mide la agregación de
\beta-PA, tal como mediante los ensayos descritos
en el ejemplo 2. Puede compararse entonces el grado de agregación de
la muestra de \beta-PA con la de una(s)
muestra(s) control de una concentración conocida de
\beta-PA, que se ha(n) puesto en contacto
de manera similar con el modulador y pueden usarse los resultados
como una indicación de si el sujeto es propenso a o tiene un
trastorno asociado con la \beta-amiloidosis.
Además, puede detectarse \beta-PA detectando un
grupo de modulación incorporado en el modulador. Por ejemplo, los
moduladores que incorporan un compuesto de biotina tal como se
describe en el presente documento (por ejemplo un péptido
\beta-PA biotinilado en el extremo
amino-terminal) pueden detectarse usando una sonda
de estreptavidina o avidina que está marcada con una sustancia
detectable (por ejemplo, una enzima tal como peroxidasa).
En otra realización, se usa in vivo un
compuesto modulador de la invención para detectar y, si se desea,
cuantificar, la deposición de \beta-PA natural en
un sujeto, por ejemplo para ayudar en el diagnóstico de la
\beta-amiloidosis en el sujeto. Para ayudar en la
detección, el compuesto modulador puede modificarse con una
sustancia detectable, preferiblemente ^{99m}Tc o yodo radiactivo
(descrito de manera adicional anteriormente), que puede detectarse
in vivo en un sujeto. El compuesto modulador del
\beta-amiloide marcado se administra al sujeto y,
después de un tiempo suficiente para permitir la acumulación del
modulador en los sitios de deposición del amiloide, se detecta el
compuesto modulador marcado mediante técnicas de formación de
imágenes convencionales. La señal radiactiva generada por el
compuesto marcado puede detectarse directamente (por ejemplo,
recuento corporal completo), o como alternativa, puede
transformarse la señal radiactiva en una imagen sobre una
autorradiografía o en una pantalla de ordenador para permitir la
formación de imágenes de los depósitos de amiloide en el sujeto. Se
conocen en la técnica métodos para la formación de imágenes de
amiloidosis usando proteínas radiomarcadas. Por ejemplo, se ha
usado el componente P de amiloide del suero (SAP), radiomarcado con
o bien ^{123}I o bien ^{99m}Tc, para la formación de imágenes
de amiloidosis sistémica (véase por ejemplo, Hawkins, P.N. y Pepys,
M.B. (1995) Eur. J. Nucl. Med. 22:595-599). De los
diversos isotipos de yodo radiactivo, se usa preferiblemente
^{123}I (semivida = 13,2 horas) para la gammagrafía corporal
completa, se usa ^{124}I (semivida = 4 días) para la tomografía
de emisión de positrones (PET), se usa ^{125}I (semivida = 60
días) para los estudios de recambio metabólico y se usa ^{131}I
(semivida = 8 días) para el recuento corporal completo y los
estudios de formación de imágenes de baja resolución retardadas. De
manera análoga a los estudios que usan SAP radiomarcado, puede
administrarse un compuesto modulador marcado de la invención a un
sujeto mediante una vía apropiada (por ejemplo, por vía
intravenosa, por vía intrarraquídea, por vía intracerebral) en un
único bolo, que contiene por ejemplo 100 \mug del compuesto
marcado que porta aproximadamente 180 MBq de radiactividad.
La invención proporciona un método para detectar
la presencia o ausencia de péptidos
\beta-amiloides naturales en una muestra
biológica, que comprende poner en contacto una muestra biológica con
un compuesto de la invención y detectar el compuesto unido a
péptidos \beta-amiloides naturales para detectar
de ese modo la presencia o ausencia de péptidos
\beta-amiloides naturales en la muestra biológica.
En una realización, el compuesto modulador del
\beta-amiloide y la muestra biológica se ponen en
contacto in vitro. En otra realización, el compuesto
modulador del \beta-amiloide se pone en contacto
con la muestra biológica administrando el compuesto modulador del
\beta-amiloide a un sujeto. Para la administración
in vivo, se marca preferiblemente el compuesto con tecnecio
radiactivo o yodo
radiactivo.
radiactivo.
La invención también proporciona un método para
detectar péptidos \beta-amiloides naturales para
facilitar el diagnóstico de una enfermedad
\beta-amiloidogénica, que comprende poner en
contacto una muestra biológica con el compuesto de la invención y
detectar el compuesto unido a péptidos
\beta-amiloides naturales para facilitar el
diagnóstico de una enfermedad
\beta-amiloidogénica. En una realización, el
compuesto modulador del \beta-amiloide y la
muestra biológica se ponen en contacto in vitro. En otra
realización, el compuesto modulador del
\beta-amiloide se pone en contacto con la muestra
biológica administrando el compuesto modulador del
\beta-amiloide a un sujeto. Para la administración
in vivo, se marca preferiblemente el compuesto con tecnecio
radiactivo o yodo radiactivo. Preferiblemente, el uso del método
facilita el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.
En otra realización, la invención proporciona un
método para alterar la agregación de \beta-PA
natural o inhibir la neurotoxicidad de \beta-PA,
que puede usarse profiláctica o terapéuticamente en el tratamiento
o prevención de trastornos asociados con la
\beta-amiloidosis, por ejemplo la enfermedad de
Alzheimer. Los compuestos moduladores de la invención pueden
reducir la toxicidad de agregados de \beta-PA
naturales en células neuronales en cultivo. Además, los moduladores
también tienen la capacidad para reducir la neurotoxicidad de las
fibrillas de A\beta formadas previamente. Por consiguiente, los
compuestos moduladores de la invención pueden usarse para inhibir o
evitar la formación de fibrillas de A\beta neurotóxicas en sujetos
(por ejemplo, profilácticamente en un sujeto predispuesto a la
deposición de \beta-amiloide) y pueden usarse para
revertir la \beta-amiloidosis terapéuticamente en
sujetos que muestran ya la deposición de
\beta-amiloide.
Se pone en contacto un modulador de la invención
con péptidos \beta-amiloides naturales presentes
en un sujeto (por ejemplo, en el líquido cefalorraquídeo o corteza
cerebral del sujeto) para alterar de ese modo la agregación del
\beta-PA natural y/o inhibir la neurotoxicidad de
los \beta-PA naturales. Puede administrarse un
compuesto modulador solo al sujeto, o como alternativa, puede
administrarse el compuesto modulador en combinación con otros
agentes terapéuticamente activos (por ejemplo, tal como se trató
anteriormente en la subsección IV). Cuando se emplea terapia de
combinación, los agentes terapéuticos pueden coadministrarse en una
única composición farmacéutica, coadministrarse en composiciones
farmacéuticas separadas o administrarse secuencialmente.
El modulador puede administrarse a un sujeto
mediante cualquier vía adecuada eficaz para inhibir la agregación
de \beta-PA natural en el sujeto, aunque en una
realización particularmente preferida, el modulador se administra
por vía parenteral, lo más preferiblemente al sistema nervioso
central del sujeto. Las posibles vías de administración al SNC
incluyen administración intrarraquídea y administración
intracerebral (por ejemplo, administración intracerebrovascular).
Como alternativa, el compuesto puede administrarse, por ejemplo, por
vía oral, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa o por vía
intramuscular. Para vías de administración que no son al SNC, el
compuesto puede administrarse en una formulación que permite el
transporte a través de la BHE. Ciertos moduladores pueden
transportarse a través de la BHE sin ninguna otra modificación
adicional mientras que otros necesitan modificación adicional tal
como se describió anteriormente en la subsección IV.
Se conocen en la técnica modos y dispositivos
adecuados para administrar los compuestos terapéuticos al SNC de un
sujeto, incluyendo depósitos cerebrovasculares (por ejemplo,
depósitos de Ommaya o Rikker; véanse por ejemplo, Raney, J.P. et
al. (1988) J. Neurosci. Nurs. 20:23-29;
Sundaresan, N. et al. (1989) Oncology
3:15-22), catéteres para la administración
intratecal (por ejemplo, catéteres
Port-a-Cath, en Y y similares;
véanse por ejemplo, Plummer, J.L. (1991) Pain
44:215-220; Yaksh, T.L. et al. (1986)
Pharmacol. Biochem. Behav. 25:483-485), depósitos
intratecales inyectables (por ejemplo, Spinalgesic; véase por
ejemplo, Brazenor, G.A. (1987) Neurosurgery
21:484-491), sistemas de bomba de infusión
implantable (por ejemplo, Infusaid; véanse, por ejemplo, Zierski,
J. et al. (1988) Acta Neurochem. Suppl.
43:94-99; Kanoff, R.B. (1994) J Am. Osteopath.
Assoc. 94:487-493) y bombas osmóticas (vendidas por
Alza Corporation). Un modo de administración particularmente
preferido es mediante una bomba de infusión implantable, programable
externamente. Se describen también sistemas de bomba de infusión y
depósitos adecuados en la patente estadounidense número 5.368.562
concedida a Blomquist y la patente estadounidense número 4.731.058
concedida a Doan, desarrollados por Pharmacia Deltec Inc.
El método de la invención para alterar la
agregación de \beta-PA in vivo, y en
particular para inhibir la agregación de
\beta-PA, puede usarse terapéuticamente en
enfermedades asociadas con agregación y deposición anómalas de
\beta-amiloide para retrasar de ese modo la
velocidad de deposición del \beta-amiloide y/o
reducir el grado de deposición de \beta-amiloide,
mejorando de ese modo el transcurso de la enfermedad. En una
realización preferida, se usa el método para tratar la enfermedad de
Alzheimer (por ejemplo, EA esporádica o familiar, incluyendo tanto
individuos que muestran síntomas de EA como individuos propensos a
EA familiar). El método también puede usarse profiláctica o
terapéuticamente para tratar otras manifestaciones clínicas de la
deposición de \beta-amiloide, tales como en
individuos con síndrome de Down y en pacientes con hemorragia
cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo Dutch
(HCHWA-D). Aunque la inhibición de la agregación de
\beta-PA es un método terapéutico preferido, los
moduladores que promueven la agregación de
\beta-PA también pueden ser útiles
terapéuticamente permitiendo el secuestro de
\beta-PA en sitios que no conducen a deterioro
neurológico.
Adicionalmente, se ha implicado a la acumulación
anómala de la proteína precursora del
\beta-amiloide en fibras musculares en la
patología de la miositis con cuerpos de inclusión esporádica (MCI)
(Askana, V. et al. (1996) Proc. Natl. Acad Sci USA
93:1314-1319; Askanas, V. et al. (1995)
Current Opinion in Rheumatology 7:486-496). Por
consiguiente, los moduladores de la invención pueden usarse
profiláctica o terapéuticamente en el tratamiento de trastornos en
los que \beta-PA, o PPA, se deposita de manera
anómala en ubicaciones no neurológicas, tal como en el tratamiento
de la MCI mediante la administración de los moduladores a fibras
musculares.
Esta invención se ilustra adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como
limitantes. Una capacidad del modulador para alterar la agregación
del péptido \beta-amiloide natural y/o inhibir la
neurotoxicidad del péptido \beta-amiloide natural
en los ensayos descritos a continuación es predictiva de la
capacidad del modulador para realizar la misma función in
vivo.
Esta invención se ilustra adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como
limitantes. El contenido de todas las referencias, patentes y
solicitudes de patentes publicadas citadas en toda esta solicitud,
así como las figuras, se incorporan al presente documento como
referencia.
Pueden prepararse moduladores del
\beta-amiloide que comprenden
D-aminoácidos mediante síntesis peptídica en fase
sólida, por ejemplo usando una estrategia de protección basada en
N^{\alpha}-9-fluorenilmetiloxicarbonilo
(FMOC) tal como sigue. Partiendo de 2,5 mmoles de resina
FMOC-D-Val-Wang, se
realizan adiciones secuenciales de cada aminoácido usando un exceso
de cuatro veces de los aminoácidos protegidos,
1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y
diisopropilcarbodiimida (DIC). Se realizan reacoplamientos cuando es
necesario, según se determina mediante pruebas con ninhidrina de la
resina tras el acoplamiento. Cada ciclo de síntesis se describe
mínimamente como una desprotección de tres minutos (piperidina al
25%/N-metil-pirrolidona (NMP)), una
desprotección de 15 minutos, cinco lavados con NMP de un minuto, un
ciclo de acoplamiento de 60 minutos, cinco lavados con NMP y una
prueba con ninhidrina. Para una modificación
N-terminal, se sustituye un reactivo modificador
N-terminal por un
FMOC-D-aminoácido y se acopla a una
parte de 700 mg del péptido-resina completamente
ensamblados mediante el protocolo anterior. Se retira el péptido de
la resina mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA)
(82,5%), agua (5%), tioanisol (5%), fenol (5%), etanoditiol (2,5%)
durante dos horas seguido por precipitación del péptido en éter
frío. Se sedimenta el sólido mediante centrifugación (2400 rpm x 10
min.), y se decanta el éter. Se resuspende el sólido en éter,
sedimenta y se decanta una segunda vez. Se disuelve el sólido en
ácido acético al 10% y se liofiliza hasta sequedad. Para la
purificación preparativa y posterior caracterización analítica, se
disuelven 60 mg del sólido en acetonitrilo (ACN) al 25%/TFA al 0,1%
y se aplican a una columna de cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) de fase inversa C18.
Como alternativa, pueden prepararse moduladores
del \beta-amiloide que comprenden
D-aminoácidos en un sintetizador de péptidos Rainin
PS3 usando un protocolo automatizado establecido por el fabricante
para la síntesis a una escala de 0,25 mmoles. Se realizaron
acoplamientos usando hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio
(HBTU) / FMOC-D-aminoácido en un
exceso de cuatro veces en N-metilmorfolina (NMM) 0,4
M /
dimetilformamida (DMF) durante 60 minutos. Entre acoplamientos, se elimina el grupo FMOC mediante reacción con piperidina al 20% / DMF durante 20 minutos. Se retira el péptido de la resina mediante tratamiento con TFA al 95%/agua durante una hora y se precipita con éter. Se resuspende el sedimento en acetonitrilo al 40%/agua y se liofiliza. Cuando fue necesario, se purificó el material mediante HPLC preparativa usando acetonitrilo al 15%-50% durante 60 minutos en una columna Vydac C18 (21 x 250 mm).
dimetilformamida (DMF) durante 60 minutos. Entre acoplamientos, se elimina el grupo FMOC mediante reacción con piperidina al 20% / DMF durante 20 minutos. Se retira el péptido de la resina mediante tratamiento con TFA al 95%/agua durante una hora y se precipita con éter. Se resuspende el sedimento en acetonitrilo al 40%/agua y se liofiliza. Cuando fue necesario, se purificó el material mediante HPLC preparativa usando acetonitrilo al 15%-50% durante 60 minutos en una columna Vydac C18 (21 x 250 mm).
Pueden sintetizarse diversos compuestos
moduladores del \beta-amiloide modificados en el
extremo N-terminal usando métodos convencionales.
Se preparan péptidos unidos a resina completamente protegidos según
se describió anteriormente en una resina apropiada para producir en
última instancia ácidos peptídicos
carboxilo-terminales. Se toman alícuotas de
pequeñas partes de cada péptido-resina (por ejemplo,
13-20 \mumoles) en recipientes de reacción
separados. Se elimina el grupo protector FMOC
N-terminal de cada muestra de la manera habitual
con piperidina al 20% en NMM seguido por lavado exhaustivo con DMF.
Puede modificarse el grupo a-amino
N-terminal no protegido de cada muestra de
péptido-resina usando uno de los siguientes
métodos:
Método A, acoplamiento de reactivos
modificadores que contienen grupos ácido carboxílico libres: se
disuelven previamente el reactivo modificador (cinco equivalentes)
en NMP, DMSO o una mezcla de estos dos disolventes. Se añaden HOBT
y DIC (cinco equivalentes de cada reactivo) al modificador disuelto
y se añade la disolución resultante a un equivalente de la
resina-péptido de extremo amino libre. Se permite
que el acoplamiento prosiga durante la noche, seguido por lavado.
Si una prueba con ninhidrina en una pequeña muestra de
péptido-resina muestra que el acoplamiento no es
completo, se repite el acoplamiento usando
1-hidroxi-7-azabenzotriazol
(HOAt) en lugar de HOBt.
Método B, acoplamiento de reactivos
modificadores obtenidos en formas preactivadas: se disuelve
previamente el agente modificador (cinco equivalentes) en NMP, DMSO
o una mezcla de estos dos disolventes y se añaden a un equivalente
de péptido-resina. Se añade diisopropiletilamina
(DIEA; seis equivalentes) a la suspensión de modificador activado y
péptido-resina. Se permite que el acoplamiento
prosiga durante la noche, seguido por lavado. Si una prueba con
ninhidrina en una pequeña muestra de péptido-resina
muestra que el acoplamiento no es completo, se repite el
acoplamiento. Tras el segundo acoplamiento (si se requiere), se
secan los péptido-resinas modificados en el extremo
N-terminal a presión reducida y se escinden de la
resina con eliminación de los grupos protectores de cadenas
laterales, según se describió anteriormente. Se usa HPLC en fase
inversa analítica para confirmar que está presente un producto
principal en los péptidos brutos resultantes, que se purifican
usando cartuchos Sep-Pak de Millipore o HPLC en fase
inversa preparativa. Se usa espectrometría de masas o
espectrometría de resonancia magnética nuclear de alto campo para
confirmar la presencia del compuesto deseado en el producto.
Método C, preparación de péptidos
alquilsustituidos N-terminales usando productos
intermedios peptídicos de bromoacetilo: puede acoplarse un péptido
unido a resina a ácido bromoacético (12 equivalentes) con
1,3-diisopropilcarbodiimida (DIC) (13 equivalentes)
en DMF. El péptido bromoacetilsustituido resultante puede
modificarse mediante la reacción con aminas primarias o secundarias
incluyendo, metilamina, etilamina, propilamina, isopropilamina y
piperidina. Se realiza la reacción en DMSO al 60%/DMF y se completa
normalmente tras 24 horas.
Método D, preparación de péptidos
alquilsustituidos N-terminales a través de
alquilación reductora: tras disolverse el péptido (o disolverse
parcialmente) en agua que contiene metanol al 0-10%,
se hace reaccionar con un aldehído (5-8
equivalentes) y cianoborohidruro de sodio (10-16
equivalentes). Puede ajustarse el número de equivalentes para el
tipo de aldehído y el grado de sustitución deseados. Se ajusta el pH
de la disolución resultante hasta 2 con HCl 1 M y se mantiene en 2
durante una hora. Se monitoriza la reacción mediante hplc y
normalmente se completa con dos horas. Se concentra la mezcla de
reacción a temperatura ambiente y se purifica mediante hplc.
Método E, modificación
C-terminal: se sintetizó el péptido sobre resina de
2-clorotritilo usando la química de Fmoc habitual,
sin embargo, el grupo del D-aminoácido final
acoplado estaba protegido con Boc. Se retiró el péptido de la
resina con diclorometano (DCM) / ácido acético / trifluoroetanol
8/1/1 y se concentró la mezcla. Se disolvió el residuo peptídico en
acetonitrilo al 20%, se congeló y se liofilizó durante la noche. Se
acopló el ácido peptídico protegido con BOC bruto en condiciones
básicas (pH = 11, ajustado con DIEA) a una amina con un equivalente
de cada uno de
1-hidroxi-7-azobenzotriazol
(HOAt) y DIC. Se completó la reacción tras agitar durante la noche
y se precipitó el péptido con agua. Se escindió el grupo BOC
mediante reacción con TFA al 25% en DCM durante una hora y se
purificó el péptido mediante HPLC.
Puede examinarse la capacidad de compuestos
moduladores del \beta-amiloide para modular (por
ejemplo, inhibir o promover) la agregación de
\beta-PA natural cuando se combinan con el
\beta-PA natural en uno o ambos de los ensayos de
agregación descritos a continuación. El \beta-PA
natural (\beta-PA_{1-40}) para
su uso en los ensayos de agregación está disponible comercialmente
de Bachem (Torrance, CA).
Se emplea el ensayo de nucleación para
determinar la capacidad de los compuestos de prueba para alterar
(por ejemplo, inhibir) los acontecimientos iniciales en la
formación de fibras de \beta-PA a partir de
\beta-PA monomérico. Se observa un tiempo de
demora antes de la nucleación, característico de un mecanismo de
polimerización nucleada, tras el cual el péptido forma rápidamente
fibras, tal como se refleja en un aumento lineal de la turbidez.
Puede cuantificarse el retardo temporal antes de la polimerización
del monómero de \beta-PA así como el grado de
formación de fibras insolubles mediante dispersión de luz
(turbidez). La polimerización alcanza el equilibrio cuando la
turbidez máxima alcanza una meseta. Se determina la turbidez de una
disolución de \beta-PA natural en ausencia o
presencia de diversas concentraciones de un compuesto modulador del
\beta-amiloide midiendo la absorbancia aparente
de la disolución a 405 nm (A_{405 \ nm}) con el tiempo. El umbral
de sensibilidad para la medición de la turbidez está en el
intervalo de \beta-PA 15-20
\muM. Una disminución en la turbidez con el tiempo en presencia
del modulador, en comparación con la turbidez en ausencia del
modulador, indica que el modulador inhibe la formación de fibras de
\beta-PA a partir de \beta-PA
monomérico. Este ensayo puede realizarse usando agitación o
removido para acelerar la polimerización, aumentando de ese modo la
velocidad del ensayo. Además, el ensayo puede adaptarse a un
formato de placa de 96 pocillos para seleccionar múltiples
compuestos.
Para realizar el ensayo de nucleación, en primer
lugar se disuelve el péptido A\beta_{1-40} en
HFIP
(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol;
Aldrich 10.522-8) a una concentración de 2 mg de
péptido/ml y se incuba a temperatura ambiente durante 30 min. Se
sonica el péptido solubilizado en HFIP en un sonicador con baño de
agua durante 5 min. en la posición superior, luego se evapora hasta
sequedad bajo una corriente de argón. Se resuspende la película de
péptido en dimetilsulfóxido (DMSO) anhidro a una concentración de
6,9 mg/ml (concentración de 25 veces), se sonica durante 5 min.
como antes, luego se filtra a través de un filtro de jeringa de
nylon de 0,2 micras (nº cat. VWR 28196-050). Se
disuelven los compuestos de prueba en DMSO a una concentración de
100 veces. Se combinan cuatro volúmenes de 25x péptido
A\beta_{1-40} en DMSO con un volumen de
compuesto de prueba en DMSO en un vial de vidrio, y se mezclan para
producir una razón molar 1:1 molar de péptido A\beta con respecto
al compuesto de prueba. Para diferentes razones molares, se diluyen
los compuestos de prueba con DMSO antes de la adición a
A\beta_{1-40}, con el fin de mantener constantes
las concentraciones finales de DMSO y
A\beta_{1-40}. Las muestras control no
contienen el compuesto de prueba. Entonces se añaden diez
microlitros de la mezcla al fondo de un pocillo de una placa de 96
pocillos de unión ultrabaja de Corning Costar (Corning Costar,
Cambridge MA; nº cat. 2500). Se añaden noventa microlitros de agua
al pocillo, se agita la placa en un agitador rotatorio a una
velocidad constante a temperatura ambiente durante 30 segundos, se
añaden 100 \mul adicionales de tampón 2x PTL (NaH_{2}PO_{4}
20 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4) al pocillo, se vuelve a agitar la placa
durante 30 segundos y se toma una lectura de turbidez de nivel
inicial (t=0) midiendo la absorbancia aparente a 405 nm usando un
lector de microplacas modelo 450 de Bio-Rad.
Entonces se devuelve la placa al agitador y se agita continuamente
durante 5 horas. Se toman lecturas de turbidez a intervalos de 15
minutos.
La agregación del
\beta-amiloide en ausencia de todos los
moduladores da como resultado un aumento de la turbidez de la
disolución del \beta-PA natural (es decir, un
aumento en la absorbancia aparente a 405 nm con el tiempo). Por
consiguiente, una disolución que incluye un compuesto modulador
inhibidor eficaz muestra una turbidez reducida en comparación con
la muestra control sin el compuesto modulador (es decir, menos
absorbancia aparente a 405 nm con el tiempo en comparación con la
muestra control).
Como alternativa al uso de la turbidez para
cuantificar la agregación del \beta-amiloide,
puede usarse también la fluorescencia de tioflavina T
(Th-T) para cuantificar la agregación del
\beta-amiloide en el ensayo de nucleación (el uso
de la fluorescencia de Th-T para cuantificar la
agregación del \beta-amiloide se describe
adicionalmente a continuación para el ensayo de extensión
sembrada).
Se necesitan los siguientes materiales para el
ensayo de unión a fibrillas: aparato de múltiples filtros de
Millipore; tubos de vidrio 12 x 75; filtros de vidrio GF/F de 25 mm;
PBS/0,1% de Tween 20 a 4ºC (PBST); fibrillas de A\beta; compuesto
radiactivo; compuesto no radiactivo; pipeta automática de repetición
Eppendorf con puntas; marcadores; pinzas; y vacío.
En este ensayo, se ejecuta cada muestra por
triplicado. En primer lugar, se prepara la fibrilla de A\beta
"envejecida" aproximadamente 8 días por adelantado envejeciendo
alícuotas de 1 ml de una disolución de péptido
A\beta_{1-40} 200 \muM en DMSO al 4%/PBS
durante 8 días a 37ºC con oscilación. Tal péptido A\beta
"envejecido" puede someterse a prueba directamente en células o
congelarse a -80ºC.
Se diluye la fibrilla de A\beta 200 \muM con
PBST para producir una disolución 4 \muM (320 \mul en 16 ml de
PBST). Se añaden alícuotas de 100 \muL de esta disolución por tubo
con la pipeta automática de repetición.
Se preparan los compuestos moduladores del
\beta-amiloide de la invención a diluciones 2
\muM - 200 fM tal como sigue:
Se diluye una disolución madre 5 mM 1:3 con DMSO
para producir una disolución madre 1,6667 (200 \mul en 400 \mul
de DMSO).
Se diluye una disolución madre 1,667 mM 1:3 con
DMSO para producir una disolución madre 0,5556 (200 \mul en 400
\mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 555,556 \muM
1:3 con DMSO para producir una disolución madre 185,19 (200 \mul
en 400 \mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 185,185 \muM
1:3 con DMSO para producir una disolución madre 61,728 (200 \mul
en 400 \mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 61,728 \muM 1:3
con DMSO para producir una disolución madre 20,576 (200 \mul en
400 \mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 20,576 \muM 1:3
con DMSO para producir una disolución madre 6,8587 (200 \mul en
400 \mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 6,859 \muM 1:3
con DMSO para producir una disolución madre 2,2862 (200 \mul en
400 \mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 2,286 \muM 1:3
con DMSO para producir una disolución madre 0,7621 (200 \mul en
400 \mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 762,079 nM 1:3
con DMSO para producir una disolución madre 254,03 (200 \mul en
400 \mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 254,026 nM 1:3
con DMSO para producir una disolución madre 84,675 (200 \mul en
400 \mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 84,675 nM 1:3 con
DMSO para producir una disolución madre 28,225 (200 \mul en 400
\mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 28,225 nM 1:3 con
DMSO para producir una disolución madre 9,4084 (200 \mul en 400
\mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 9,408 nM 1:3 con
DMSO para producir una disolución madre 3,1361 (200 \mul en 400
\mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 3,136 nM 1:3 con
DMSO para producir una disolución madre 1,0454 (200 \mul en 400
\mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 1,045 nM 1:3 con
DMSO para producir una disolución madre 0,3485 (200 \mul en 400
\mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 348,459 pM 1:3
con DMSO para producir una disolución madre 116,15 (200 \mul en
400 \mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 116,153 pM 1:3
con DMSO para producir una disolución madre 38,718 (200 \mul en
400 \mul de DMSO).
Se diluye una disolución madre 185,185 \muM
1:25 con PBST para producir una 7,4074 (50 \mul en 1,2 ml de
PBST).
Se diluye una disolución madre 61,728 \muM
1:25 con PBST para producir una 2,4691 (50 \mul en 1,2 ml de
PBST).
Se diluye una disolución madre 20,576 \muM
1:25 con PBST para producir una 0,823 (50 \mul en 1,2 ml de
PBST).
Se diluye una disolución madre 6,859 \muM 1:25
con PBST para producir una 0,2743 (50 \mul en 1,2 ml de
PBST).
Se diluye una disolución madre 2,286 \muM 1:25
con PBST para producir una 0,0914 (50 \mul en 1,2 ml de
PBST).
Se diluye una disolución madre 762,079 nM 1:25
con PBST para producir una 30,483 (50 \mul en 1,2 ml de PBST).
Se diluye una disolución madre 254,026 nM 1:25
con PBST para producir una 10,161 (50 \mul en 1,2 ml de
PBST).
Se diluye una disolución madre 84,675 nM 1:25
con PBST para producir una 3,387 (50 \mu en 1,2 ml de PBST).
Se diluye una disolución madre 28,225 nM 1:25
con PBST para producir una 1,129 (50 \mul en 1,2 ml de PBST).
Se diluye una disolución madre 9,408 nM 1:25 con
PBST para producir una 0,3763 (50 \mul en 1,2 ml de PBST).
Se diluye una disolución madre 3,136 nM 1:25 con
PBST para producir una 0,1254 (50 \mul en 1,2 ml de PBST).
Se diluye una disolución madre 1,045 nM 1:25 con
PBST para producir una 0,0418 (50 \mul en 1,2 ml de PBST).
Se diluye una disolución madre 348,459 pM 1:25
con PBST para producir una 13,938 (50 \mul en 1,2 ml de PBST).
Se diluye una disolución madre 116,153 pM 1:25
con PBST para producir una 4,6461 (50 \mul en 1,2 ml de PBST)
Entonces se añade el compuesto modulador del
\beta-amiloide (200 \mul) al tubo apropiado que
contiene la fibrilla de A\beta.
Se prepara el compuesto modulador del
\beta-amiloide marcado radiactivamente usando
protocolos de seguridad radiactiva habituales haciendo una dilución
con una disolución de PBS/0,1% de Tween-20 de tal
manera que haya una concentración final de 20.000 dpm por 100
\mul. Se añaden alícuotas de 100 \mul del compuesto modulador
del \beta-amiloide marcado radiactivamente por
tubo usando la pipeta automática de repetición. Se cubren las
muestras con película y se incuban a 37ºC dentro de bolsas de
plástico para radiactividad durante la noche.
Para filtrar las muestras, se humedecen
previamente los filtros con un pequeño volumen de PBST. Se fijan dos
aparatos de multifiltración de Millipore con filtros GF/F en cada
ranura de filtración siguiendo las instrucciones del fabricante. Se
retiran las muestras de la incubadora a 37ºC y se filtra cada
muestra usando un pequeño volumen (\sim5 ml) de tampón PBST frío.
Entonces se lava el tubo de muestra con dos volúmenes de 5 ml
adicionales de tampón PBST frío. Se permite que se cree vacío en un
filtro semiseco durante aproximadamente 2 minutos después de añadir
la última muestra y se transfiere el filtro a un tubo marcado para
el recuento por yodación. Se registran cuentas de un minuto, se
representan gráficamente los datos, y se usa el programa Prism
(GraphPAD) para analizar el gráfico, según las instrucciones del
fabricante.
Puede emplearse el ensayo de extensión sembrada
para medir la tasa de fibras de A\beta formadas en una disolución
de monómero de A\beta tras la adición de "simiente" de fibra
de A\beta polimérica. Se determina la capacidad de los compuestos
de prueba para evitar la deposición adicional de A\beta monomérico
en amiloide depositado previamente usando un indicador directo de
la formación de láminas \beta usando fluorescencia. A diferencia
del ensayo de nucleación, la adición de simiente proporciona la
nucleación inmediata y el crecimiento continuado de fibrillas
formadas previamente sin la necesidad de mezclado continuo, y así da
como resultado la ausencia de un tiempo de demora antes de que se
inicie la polimerización. Dado que este ensayo usa condiciones
estáticas de polimerización, puede confirmarse la actividad de los
compuestos positivos en el ensayo de nucleación en este segundo
ensayo en condiciones diferentes y con un sondeo adicional de la
estructura amiloide.
En el ensayo de extensión sembrada, se incuba
A\beta_{1-40} monomérico en presencia de un
núcleo "simiente" (aproximadamente el diez por ciento en moles
de A\beta que se ha permitido previamente que polimerice en
condiciones estáticas controladas). Entonces se diluyen muestras de
la disolución con tioflavina T (Th-T). La
asociación específica de polímero de Th-T con
A\beta produce un complejo fluorescente que permite la medición
del grado de formación de fibrillas (Levine, H. (1993) Protein
Science 2:404-410). En particular, la asociación de
Th-T con \beta-PA agregado, pero
no \beta-PA monomérico o asociado débilmente, da
lugar a un nuevo máximo de excitación (ex) a 450 nm y un aumento de
la emisión (em) a 482 nm, comparado con los 385 nm (ex) y 445 nm
(em) para el colorante libre. Pequeñas alícuotas de la mezcla de
polimerización contienen suficientes fibrillas que van a mezclarse
con Th-T para permitir la monitorización de la
mezcla de reacción mediante toma de muestras repetida. Se observa
una curva de crecimiento lineal en presencia de monómero en exceso.
La formación de fibrillas con lámina \beta que responden a
tioflavina T es paralela al aumento de la turbidez observado usando
el ensayo de nucleación.
Se prepara una disolución de monómeros de
A\beta para su uso en el ensayo de extensión sembrada disolviendo
una cantidad apropiada de péptido A\beta péptido en un volumen de
1/25 de dimetilsulfóxido (DMSO), seguido por agua hasta un volumen
de 1/2 y un volumen de 1/2 de 2xPBS (10x PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7
mM, Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O 4,3 mM, KH_{2}PO_{4} 1,4
mM pH 7,2) hasta una concentración final de 200 \muM para preparar
la disolución madre de simiente. Se incuba 1 ml de la preparación
de monómero de A\beta, durante aproximadamente 8 días a 37ºC y se
somete a cizalladura de manera secuencial a través de una aguja de
calibre 18, 23, 26 y 30, respectivamente 25, 25, 50 y 100 veces. Se
toman muestras de 2 \mul del material sometido a cizalladura para
mediciones de fluorescencia tras cada 50 pases a través de la aguja
de calibre 30 hasta una meseta de las unidades de fluorescencia
(UF) (aprox. 100-150 veces). Se preparan los
compuestos de prueba disolviendo una cantidad apropiada de
compuesto de prueba en 1 x PBS hasta una concentración final de 1 mM
(10x disolución madre). Si es insoluble, se disuelve el compuesto
en un volumen de 1/10 de DMSO y se diluye con 1x PBS hasta 1 mM. Se
prepara también una dilución 1/10 adicional para someter a prueba
cada candidato tanto a 100 \muM como a 10 \muM.
Para realizar el ensayo de extensión sembrada,
se ajusta cada muestra con 50 \mul de monómero 200 \muM, 125 UF
de simiente sometida a cizalladura (una cantidad variable
dependiendo del lote de simiente, de forma rutinaria
3-6 \mul) y 10 \mul de 10x disolución de
modulador. Entonces se ajusta el volumen de muestra hasta un
volumen final de 100 \mul con 1x PBS. Normalmente se someten a
prueba dos concentraciones de cada modulador: 100 \muM y 10
\muM, equivalentes a una razón molar de monómero con respecto a
modulador de 1:1 y 1:10. Los controles incluyen una reacción sin
siembra para confirmar que el monómero nuevo no contiene simiente,
y una reacción con siembra en ausencia de cualquier modulador, como
referencia para comparar frente a los moduladores candidatos. Se
incuba el ensayo a 37ºC durante 6 h, tomándose muestras de 2 \mul
cada hora para mediciones de fluorescencia. Para medir la
fluorescencia, se añade una muestra de 2 \mul de A\beta a 400
\mul de disolución de tioflavina T (fosfato de potasio 50 mM
tioflavina T 10 mM pH 7,5). Se agitan en vórtex las muestras y se
lee la fluorescencia en una microcubeta de cuarzo de 0,5 ml a 450 nm
de EX y 482 nm de EM (fluorímetro Hitachi 4500).
La agregación del
\beta-amiloide da como resultado un aumento de la
emisión de tioflavina T. Por consiguiente, las muestras que
incluyen un compuesto modulador inhibidor eficaz presentan una
emisión reducida en comparación con las muestras control sin el
compuesto modulador.
En este ejemplo, se prepararon los compuestos
moduladores del \beta-amiloide descritos en el
presente documento y se sometieron a prueba para determinar su
capacidad para inhibir la agregación del péptido
\beta-amiloide natural usando ensayos de
agregaciones tal como se describe en el ejemplo 2. A continuación en
las tablas I, II y III, se resumen los resultados de una primera
serie de experimentos.
Notas:
* significa que los datos del ensayo de
nucleación se midieron a 3, 1 y 0,3 \muM de compuesto
# significa que los datos del ensayo de
nucleación se midieron a 2,5, 1,25 y 0,6 \muM de compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Notas:
* significa que los datos del ensayo de
nucleación se midieron a 2,5, 1,25 y 0,6 \muM de compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron los compuestos moduladores en
ensayos de nucleación utilizando A\beta_{1-40} 5
\muM y compuesto de prueba o bien 5 \muM, 2,5 \muM, 1,25
\muM, 3 \muM, 1 \muM, o bien 0,3 \muM. Se presenta el
cambio en el tiempo de demora (\Deltadem) como la razón del tiempo
de demora observado en presencia del compuesto de prueba (a o bien
5 \muM, 2,5 \muM, 1,25 \muM, 3 \muM, 1 \muM, o bien 0,3
\muM) con respecto al tiempo de demora del control.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PPI-1801 es el análogo de
acetilamida de H-LPFFD-OH que se ha
notificado en la bibliografía. Este compuesto se preparó y sometió
a prueba para determinar su actividad con fines de comparación. Los
resultados indican que este compuesto se une escasamente a las
fibrillas en el ensayo usado en el presente documento.
Por el contrario, los resultados mostrados en
las tablas I, II, y III, y la figura 2 demuestran que los
moduladores del \beta-amiloide de la invención
son inhibidores eficaces de la agregación de A\beta.
Puede someterse a prueba la neurotoxicidad de
los agregados del péptido \beta-amiloide natural,
o bien en presencia o bien en ausencia de un modulador del
\beta-amiloide, en un ensayo basado en células que
usa una línea celular derivada de neuronas o bien de rata o bien
humana (células PC-12 o células
NT-2, respectivamente) y el indicador de viabilidad
bromuro de
3,(4,4-dimetiltiazol-2-il)2,5-difenil-tetrazolio
(MTT). (Véanse, por ejemplo, Shearman, M.S. et al. (1994)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1470-1474; Hansen,
M.B. et al. (1989) J. Immun. Methods
119:203-210 para una descripción de ensayos de
viabilidad basados en células similares). PC-12 es
una línea celular de feocromocitoma suprarrenal de rata y está
disponible de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville,
MD (ATCC CRL 1721). MTT (disponible comercialmente de Sigma Chemical
Co.) es un sustrato cromogénico que se convierte de amarillo a azul
en células viables, que puede detectarse
espectrofotométricamente.
Para someter a prueba la neurotoxicidad de
péptidos \beta-amiloides naturales, en primer
lugar se prepararon disoluciones madres de monómeros de A\beta
nuevos y agregados de A\beta envejecidos. Se prepara
A\beta_{1-40} en DMSO al 100% a partir de polvo
liofilizado y se diluye inmediatamente a la mitad del volumen final
con H_{2}O y luego a la mitad del volumen final con 2X PBS de
modo que se logra una concentración final de péptido de 200 \muM,
DMSO al 4%. El péptido preparado de esta manera y sometido a prueba
inmediatamente en células se denomina monómero de A\beta
"nuevo". Para preparar agregados de A\beta
"envejecidos", se pone la disolución de péptido en un tubo
Eppendorf de 1,5 ml y se incuba a 37ºC durante ocho días para
permitir que se formen las fibrillas. Tal péptido de A\beta
"envejecido" puede someterse a prueba directamente en células o
congelarse a -80ºC. Se somete a prueba la neurotoxicidad de los
monómeros nuevos y agregados envejecidos usando células PC12 y NT2.
Las células PC12 se cultivan de forma rutinaria en medio de Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene un 10% de suero de
caballo, un 5% de suero de ternero fetal, glutamina 4 mM, y un 1% de
gentamicina. Las células NT2 se cultivan de forma rutinaria en
medio OPTI-MEM (nº CAT. GIBCO BRL 31985
complementado con un 10% de suero de ternero fetal, glutamina 2 mM
y un 1% de gentamicina). Se siembran en placas las células a
10-15.000 células por pocillo en 90 \mul de medio
nuevo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos
3-4 horas antes del tratamiento. Se diluyen entonces
las disoluciones de péptido A\beta nuevas o envejecidas (10
\mul) 1:10 directamente con medio de cultivo tisular de modo que
la concentración final esté en el intervalo de péptido
1-10 \muM. Se incuban las células en presencia de
péptido sin un cambio de medios durante 48 horas a 37ºC. Para las
tres horas finales de exposición de las células a la preparación de
\beta-PA, se añade MTT a los medios hasta una
concentración final de 1 mg/ml y se continúa la incubación a 37ºC.
Tras la incubación de dos horas con MTT, se eliminan los medios y
se lisan las células con 100 \mul de isopropanol / HCl 0,4 N con
agitación. Se añade un volumen igual de PBS a cada pocillo y se
agitan las placas durante 10 minutos adicionales. Se mide la
absorbancia de cada pocillo a 570 nm un lector de placas de
microtitulación para cuantificar las células
viables.
viables.
\newpage
Usando este ensayo, se confirmó la
neurotoxicidad de agregados de A\beta_{1-40}
envejecidos (5 días u 8 días) solos, pero no de los monómeros de
A\beta_{1-40} nuevos solos. Los experimentos
demostraron que la incubación de células neuronales con cantidades
crecientes de monómeros de A\beta_{1-40} nuevos
no fue significativamente tóxica para las células mientras que la
incubación de las células con cantidades crecientes de agregados de
A\beta_{1-40} de 5 días o de 8 días condujo a
una cantidad creciente de neurotoxicidad. La CE_{50} para la
toxicidad de los agregados de A\beta_{1-40}
envejecidos fue de 1-2 \muM tanto para las
células PC12 como para las células NT2.
Para determinar el efecto de un compuesto
modulador del \beta-amiloide sobre la
neurotoxicidad de los agregados de
A\beta_{1-40}, se preincubó un compuesto
modulador con monómeros de A\beta_{1-40} en
condiciones habituales para un ensayo de nucleación tal como se
describen en el ejemplo 2 y en intervalos de tiempo particulares
tras la incubación, se retiraron alícuotas de la disolución de
\beta-PA/modulador solución y 1) se valora la
turbidez de la disolución como una medida de agregación y 2) se
aplica la disolución a células neuronales en cultivo durante 48
horas, tiempo en el que se valora la viabilidad celular usando MTT
para determinar la neurotoxicidad de la disolución. Adicionalmente,
puede someterse a ensayo la capacidad de los compuestos moduladores
del \beta-amiloide para reducir la neurotoxicidad
de los agregados de A\beta_{1-40} formados
previamente. En estos experimentos, se forman previamente los
agregados de A\beta_{1-40} mediante la
incubación de los monómeros en ausencia de cualquier modulador.
Entonces se incuba el compuesto modulador con los agregados de
A\beta_{1-40} formados previamente durante 24
horas a 37ºC, tiempo tras el cual se recoge la disolución de
\beta-PA/modulador y se evalúa su neurotoxicidad
tal como se describió anteriormente.
Puede someterse a ensayo la estabilidad de un
compuesto modulador en líquido cefalorraquídeo (LCR) en un ensayo
in vitro tal como sigue. Se prepara una disolución de LCR que
contiene un 75% de LCR de mono Rhesus (disponible comercialmente de
Northern Biomedical Research), un 23% de solución salina tamponada
con fosfato estéril y un 2% de dimetilsulfóxido (v/v) (Aldrich
Chemical Co., nº de catálogo 27.685-5). Se añaden
compuestos moduladores de prueba a la disolución de LCR hasta una
concentración final de 40 \muM o 15 \muM. Todo el manejo de
muestras se lleva a cabo bajo una campana extractora de flujo
laminar y se mantienen las disoluciones de prueba a 37ºC durante el
ensayo. Tras 24 horas, se extingue la actividad enzimática en las
disoluciones añadiendo acetonitrilo para producir una concentración
final del 25% (v/v). Se analizan las muestras (en el punto de
tiempo 0 y el punto de tiempo de 24 horas) a temperatura ambiente
usando HPLC en fase inversa. Se usa una columna Microbore para
maximizar la sensibilidad. Los parámetros para la HPLC analítica son
los siguientes:
- \quad
- A: ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% en agua (v/v)
- \quad
- B: TFA al 0,085%/acetonitrilo, 1% de H_{2}O (v/v)
- \quad
- Inyección: 100-250 \mul de la muestra de prueba
- \quad
- Ejecución: 10% para B durante 5 min., entonces 10-70% de B durante 60 min.
Se realiza el análisis cromatográfico usando
HPLC Hewlett Packard 1090 serie II. La columna usada para la
separación es una C4, de 5 \mum, 1 x 250 mm (Vydac nº 214TP51). La
velocidad de flujo es de 50 \muL/min y se monitoriza el perfil de
elución de los compuestos de prueba a 214, 230, 260 y 280 nm.
Se determinaron los niveles en cerebro de los
péptidos derivados de A\beta en la rata tras la administración
intravenosa. Con anestesia de ketamina/xilazina, ratas
Sprague-Dawley macho (219-302 g)
recibieron una inyección intravenosa a través de un catéter
insertado en la vena yugular izquierda (volumen de dosis de 4 ml/kg
administrado durante 1 minuto). En la figura 1, se muestra la dosis
real administrada de cada compuesto sometido a prueba.
Sesenta minutos tras la administración, se
canuló la arteria carótida primitiva izquierda para permitir la
perfusión de la parte izquierda del prosencéfalo para eliminar la
sangre cerebral. Se sometió la parte izquierda del prosencéfalo,
carente de sangre, a depleción capilar tal como se describe por
(Triguero et al. (1990) J. Neurochem.
54:1882-1888). Esta técnica establecida separa la
vasculatura del cerebro del parénquima y permite así la
determinación precisa de la concentración de compuesto en
investigación que ha atravesado la barrera hematoencefálica. Se
determinó la cantidad de compuesto original que estaba presente en
el cerebro mediante CL/EM/EM.
\newpage
Se usó el ensayo descrito anteriormente para
medir la captación cerebral de los siguientes moduladores:
Los resultados se resumen en la figura 1.
En la siguiente tabla, se resumen los compuestos
moduladores del \beta-amiloide descritos en el
presente documento.
\vskip1.000000\baselineskip
Los expertos en la técnica reconocerán o podrán
determinar usando tan sólo la experimentación de rutina, muchos
equivalentes de las realizaciones específicas de la invención
descritas en el presente documento. Tales equivalentes pretenden
estar abarcados por las siguientes reivindicaciones.
<110> Praecis Pharmaceuticals, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MODULADORES DE LA AGREGACIÓN DEL
PÉPTIDO B-AMILOIDE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PPI-068CPPC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Documento PCT/US00/05574
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
03-03-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento USSN 60/122.736
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
04-03-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido inhibidor de los depósitos de amiloide
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Val Phe Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido inhibidor de los depósitos de amiloide
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Val Phe Phe Ala}
Claims (10)
1. Compuesto de la estructura:
- \quad
- N-metil-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH_{2}.
2. Compuesto que comprende la estructura:
- \quad
- N-metil-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH_{2}.
3. Composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto según las
reivindicaciones 1 ó 2 y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
4. Composición farmacéutica según la
reivindicación 3, en la que dicha composición farmacéutica es una
formulación de liberación lenta.
5. Composición farmacéutica según la
reivindicación 3, en la que dicha composición farmacéutica es
adecuada para transportar dicho compuesto a través de la barrera
hematoencefálica.
6. Uso de un compuesto según las
reivindicaciones 1 ó 2, para la fabricación de un medicamento para
inhibir la agregación de los péptidos
\beta-amiloides naturales en un sujeto.
7. Método para detectar la presencia o ausencia
de péptidos \beta-amiloides naturales en una
muestra biológica in vitro, que comprende:
- \quad
- poner en contacto una muestra biológica con el compuesto según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el compuesto está marcado con una sustancia detectable; y
- \quad
- detectar el compuesto unido a los péptidos \beta-amiloides naturales para detectar de ese modo la presencia o ausencia de péptidos \beta-amiloides naturales en la muestra biológica.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
el compuesto está marcado con tecnecio radiactivo o yodo
radiactivo.
9. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz
del compuesto según las reivindicaciones 1 ó 2, para la fabricación
de un medicamento para tratar o diagnosticar un trastorno asociado
con \beta-amiloidosis en un sujeto.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que el
trastorno es la enfermedad de Alzheimer.
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| US6610658B1 (en) * | 1999-03-04 | 2003-08-26 | Praecis Pharmaceuticals Inc. | Modulators of μ-amyloid peptide aggregation |
| US7060670B1 (en) | 1999-05-05 | 2006-06-13 | Neurochem (International) Limited | Stereoselective antifibrillogenic peptides and peptidomimetics thereof |
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| US20020094335A1 (en) * | 1999-11-29 | 2002-07-18 | Robert Chalifour | Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases |
| US20070135337A2 (en) * | 1999-11-29 | 2007-06-14 | Neurochem (International) Limited | Vaccine for the Prevention and Treatment of Alzheimer's and Amyloid Related Diseases |
| WO2001058470A2 (en) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Praecis Pharmaceuticals Incorporated | Methods for enhancing the bioavailability of a drug |
| AUPR215700A0 (en) * | 2000-12-19 | 2001-01-25 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Carboxylic acid compound having cyclopropane ring |
| DE10117281A1 (de) * | 2001-04-06 | 2002-10-24 | Inst Molekulare Biotechnologie | Peptid zur Diagnose und Therapie der Alzheimer-Demenz |
| EP1499729B9 (en) | 2002-04-18 | 2012-03-14 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Derivatives of the nf-kappab inducing enzyme, their preparation and use |
| WO2004058239A1 (en) * | 2002-12-24 | 2004-07-15 | Neurochem (International) Limited | Therapeutic formulations for the treatment of beta-amyloid related diseases |
| CN100340599C (zh) * | 2003-06-09 | 2007-10-03 | 湖南大学 | 多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒与制备方法及作为基因载体的应用 |
| GB0503434D0 (en) * | 2005-02-18 | 2005-03-30 | Senexis Ltd | Amyloid-binding peptides, analogues and uses thereof |
| JO2824B1 (en) * | 2005-12-12 | 2014-09-15 | اف . هوفمان لاروش ايه جي | Antibody glycosylate in the changing region |
| WO2008099210A2 (en) | 2007-02-12 | 2008-08-21 | Merck & Co., Inc. | Piperazine derivatives for treatment of ad and related conditions |
| DE102008037564A1 (de) * | 2008-11-19 | 2010-05-20 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Zusammensetzung zur Herstellung von anti-Amyloid beta-Peptid-Antikörpern mit D-Peptiden |
| BR112012013662B1 (pt) * | 2009-12-07 | 2022-08-02 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Muteínas de lipocalina associada à gelatinase de neutrófilo humano (lcn2, hngal), seu uso e seus métodos de geração e produção, molécula de ácido nucleico, célula hospedeira, composição farmacêutica e kit de diagnóstico ou analítico |
| US10653631B2 (en) | 2011-09-07 | 2020-05-19 | Roland SAUR-BROSCH | Optimal colon targeting technology |
| AU2012305915B2 (en) | 2011-09-07 | 2017-09-07 | Roland Saur-Brosch | Formulation for the controlled release of one or several substances in the digestive tract of a mammal |
| KR101437354B1 (ko) * | 2012-07-27 | 2014-09-05 | 한국과학기술연구원 | 고수율 및 고순도의 아밀로이드-베타 펩타이드의 제조방법 |
| KR20230128606A (ko) * | 2022-02-28 | 2023-09-05 | 경상국립대학교산학협력단 | 티로신을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머병의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR82516E (fr) * | 1962-10-11 | 1964-02-28 | Ciba Geigy | Procédé de préparation de dérivés peptidiques, notamment d'hydrazides peptidiques |
| US4119493A (en) | 1975-10-23 | 1978-10-10 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center | Process for producing a peptide |
| US5284664A (en) | 1988-08-04 | 1994-02-08 | Kremers-Urban Company | Method of treating the symptoms of Alzheimer's disease |
| US5652214A (en) | 1989-06-05 | 1997-07-29 | Cephalon, Inc. | Treating disorders by application of insulin-like growth factors and analogs |
| US5338663A (en) | 1990-08-24 | 1994-08-16 | President And Fellows Of Harvard College | Method of identifying inhibitors of β-protein esterase activity |
| US5434050A (en) | 1991-08-13 | 1995-07-18 | Regents Of The University Of Minnesota | Labelled β-amyloid peptide and methods of screening for Alzheimer's disease |
| US5338837A (en) | 1991-12-13 | 1994-08-16 | The Trustees Of Princeton University | Glycosylated steroid derivatives for transport across biological membranes and process for making same |
| US5766846A (en) | 1992-07-10 | 1998-06-16 | Athena Neurosciences | Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production |
| US6120768A (en) | 1993-05-17 | 2000-09-19 | Immunomedics, Inc. | Dota-biotin derivatives |
| WO1994028412A1 (en) | 1993-05-28 | 1994-12-08 | The Miriam Hospital | Composition and method for in vivo imaging of amyloid deposits |
| US5541290A (en) | 1993-06-24 | 1996-07-30 | Harbeson; Scott L. | Optically pure calpain inhibitor compounds |
| CA2125467C (en) | 1993-07-06 | 2001-02-06 | Heinz Dobeli | Process for producing hydrophobic polypeptides, proteins or peptides |
| AU7556994A (en) | 1993-08-13 | 1995-03-14 | Molecular Geriatrics Corporation | Methods for the diagnosis of alzheimer's disease |
| GB9317120D0 (en) | 1993-08-17 | 1993-09-29 | Royal Postgrad Med School | Human serum amyloid p component |
| US5652334A (en) | 1993-09-08 | 1997-07-29 | City Of Hope | Method for design of substances that enhance memory and improve the quality of life |
| US5470951A (en) | 1993-09-29 | 1995-11-28 | City Of Hope | Peptides for antagonizing the effects of amyloid βprotein |
| US5744368A (en) | 1993-11-04 | 1998-04-28 | Research Foundation Of State University Of New York | Methods for the detection of soluble amyloid β-protein (βAP) or soluble transthyretin (TTR) |
| JPH07149668A (ja) | 1993-11-30 | 1995-06-13 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | アミロイド沈着検出用物質 |
| CA2182731A1 (en) | 1994-02-03 | 1995-08-10 | Michael P. Vitek | Compositions and methods for advanced glycosylation endproduct-mediated modulation of amyloidosis |
| US6303567B1 (en) * | 1995-03-14 | 2001-10-16 | Praecis Pharmaceuticals, Inc . | Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids |
| EP0815134B1 (en) | 1995-03-14 | 2002-06-05 | Praecis Pharmaceuticals Incorporated | Modulators of amyloid aggregation |
| US5767233A (en) | 1995-05-12 | 1998-06-16 | Schering Corporation | Soluble cleavable substrates of the hepatitis C virus protease |
| US5985242A (en) | 1995-10-27 | 1999-11-16 | Praecis Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids |
| US6277826B1 (en) * | 1996-08-27 | 2001-08-21 | Praecis Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids |
| WO1997021728A1 (en) * | 1995-12-12 | 1997-06-19 | Karolinska Innovations Ab | PEPTIDE BINDING THE KLVFF-SEQUENCE OF AMYLOID $g(b) |
| EP1586584A1 (en) * | 1996-08-27 | 2005-10-19 | Praecis Pharmaceuticals Incorporated | Modulators of beta-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids |
| US6610658B1 (en) * | 1999-03-04 | 2003-08-26 | Praecis Pharmaceuticals Inc. | Modulators of μ-amyloid peptide aggregation |
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