DE60035412T2

DE60035412T2 - Beta-amyloid-peptidaggregation regulierende peptide mit d-aminosäuren

Info

Publication number: DE60035412T2
Application number: DE60035412T
Authority: DE
Inventors: Mark A. Belmont FINDEIS; Kathryn Boston PHILLIPS; Gary L. Moutainside OLSON; Christopher West Caldwell SELF
Original assignee: Praecis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Praecis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-03-04
Filing date: 2000-03-03
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2020-03-04
Also published as: KR20020007316A; AU3719600A; EP1161449B1; RU2260599C2; NZ514414A; CN1362967A; ES2290023T3; CY1106899T1; JP2011121952A; CA2362834A1; US20050137128A1; KR100771712B1; EP1161449A1; PT1161449E; WO2000052048A1; US7803774B2; ZA200107913B; DK1161449T3; ATE366259T1; JP2002543043A

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Alzheimerkrankheit (AD), die zuerst von dem bayerischen Psychiater Alois Alzheimer 1907 beschrieben wurde, ist eine progressive neurologische Funktionsstörung, die mit dem Verlust des Kurzzeitgedächtnisses beginnt und über Desorientierung, eingeschränktem Urteilungsvermögen und logischem Denken und letztlich Demenz führt. Der Verlauf dieser Krankheit führt normalerweise zum Tod in einem schwer geschwächten, unbeweglichen Stadium, zwischen vier und zwölf Jahren nach dem Ausbruch. AD setzt geschätzter Weise fünf bis elf Prozent der Bevölkerung über 65 Jahren und bis zu 47 Prozent der Bevölkerung über 85 Jahren zu. Die gesellschaftlichen Kosten für die Bewältigung von AD liegen bei über 80 Milliarden Dollar jährlich, hauptsächlich auf Grund der intensiven Pflegebehandlung, die für AD Patienten nötig ist. Darüber hinaus wird das Steuern und die Behandlung von AD ein noch größeres bedeutendes Problem für das Gesundheitswesen, wenn die Erwachsenen, die während des Bevölkerungsbooms der 1940er und '50er Jahre geboren wurden, das Alter erreichen, in dem AD gängiger wird. Im Moment existiert keine Behandlung, die das Fortschreiten der Erkrankung bedeutend bremst. Für Reviews über Alzheimer siehe Selkoe, D.J. Sci. Amer., November 1991, pp. 68-78; und Yanker, B.A. et al. (1991) N. Eng: J. Med. 325: 1849-1857.
Vor kurzem wurde berichtet (Games et al. (1995) Nature 373: 523-527), dass eine Alzheimer-artige Neuropathologie in transgenen Mäusen erzeugt wurde. Die transgenen Mäuse exprimierten hohe Niveaus von human-mutantem Amyloid Vorläuferprotein und entwickelten stufenweise viele pathologische Zustände, die mit AD in Verbindung gebracht werden.
Pathologisch gesehen ist Alzheimer durch die Anwesenheit von ausgeprägten Läsionen in dem Gehirn des Opfers gekennzeichnet. Diese Gehirnläsionen beinhalten abnormale intrazelluläre Filamente, genannt neurofibrilläres Wirrwarr (neurofibrillary tangles, NTFs) und extrazelluläre Ablagerungen von amyloidogenischen Proteinen in senilen oder amyloiden Plaques. Amyloide Ablagerungen kommen auch in den Wänden der cerebralen Blutgefäße von AD Patienten vor. Als Hauptproteinbestandteil von amyloiden Plaques wurde ein 4 kDa Peptid identifiziert, das β-Amyloid-Peptid (β-AP) genannt wird (Glenner, G.G. and Wong, C.W. (1984) Biochem. Res. Commun. 120: 885-890; Masters, C. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4245-4249). Diffuse Ablagerungen von β-AP werden häufig in normalen Gehirnen Erwachsener beobachtet, wohingegen AD Gehirngewebe durch kompaktere, kerndichte β-Amyloid-Plaques gekennzeichnet ist. (siehe Davies, L. et al. (1988) Neurology 38: 1688-1693) Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die β-AP Ablagerung der Zerstörung von Neuronen, die bei AD auftritt, vorausgeht und dazu beiträgt. Zur weiteren Unterstützung einer direkten pathogenen Rolle für β-AP wurde gezeigt, dass β-Amyloid toxisch auf ausgewachsene Neuronen wirkt, sowohl in Kultur, als auch in vivo. Yanker, B.A. et al. (1989) Science 245: 417-420; Yanker, B.A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9020-9023; Roher, A.E. et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 174: 572-579; Kowall, N.W. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7247-7251. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Patienten mit erblicher Hämorrhagie mit Amyloidose holländischer Art (Dutch-type) (HCHWA-D), die durch diffuse β-Amyloid Ablagerungen innerhalb des cerebral-Cortex und des cerebralen Gefäßsystems gekennzeichnet ist, eine Punktmutation aufweisen, die zu einem Austausch einer Aminosäure innerhalb des β-AP führt. Levy, E. et al. (1990) Science 248: 1124-1126. Diese Beobachtung zeigt, dass eine spezifische Veränderung der β-AP Sequenz zur Ablagerung von β-Amyloid fuhren kann.
Natürliches β-AP wird aus der Proteolyse eines viel größeren Proteins abgeleitet, das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) genannt wird. Kang, J. et al. (1987) Nature 325: 733; Goldgaber, D. et al. (1987) Science 235: 877; Robakis, N.K. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4190; Tanzi, R.E. et al. (1987) Science 235: 880. Das APP Gen wird auf Chromosom 21 kartiert, was zu einer Erklärung für die β-Amyloid Ablagerungen führt, die in einem frühen Alter bei Individuen mit Down-Syndrom, welches durch die Chromosom 21 Trisomie hervorgerufen wird, gefunden wurde. Mann, D.M. et al. (1989) Neuropathol. Appl. Neurobiol. 15: 317; Rumble, B. et al. (1989) N. Eng. J. Med. 320: 1446. App enthält eine einzelne membranumspannende Domäne mit einer langen Amino-terminalen Region (ungefähr zwei Drittel des Proteins), die sich in die extrazelluläre Umgebung erstreckt und eine kürzere Carboxy-terminale Region, die in das Cytoplasma hineinreicht. Differenziertes Spleißen der App messenger RNA führt zu mindestens fünf App Formen, zusammengesetzt aus entweder 563 Aminosäuren (APP-563), 695 Aminosäuren (APP-695), 714 Aminosäuren (APP-714), 751 Aminosäuren (APP-751) oder 770 Aminosäuren (APP-770).
Innerhalb von APP beginnt das natürlich vorkommende β-Amyloid Peptid an einem Asparaginsäurerest an Aminosäureposition 672 von APP-770. Natürlich vorkommendes β-AP, das aus der Proteolyse von APP abgeleitet ist, ist 39 bis 43 Aminosäurereste lang, abhängig vom Carboxy-terminalen Endpunkt, der Heterogenität aufzeigt. Die vorwiegend im Blut zirkulierende Form von β-AP und in der cerebrospinalen Flüssigkeit von sowohl AD Patienten, als auch von normalen Erwachsenen, ist β1-40 ("kurzes β"). Seubert, P. et al. (1992) Nature 359: 325; Shoji, M. et al. (1992) Science 258: 126. Allerdings sind auch β1-42 und β1-43 ("langes β") Formen in β-Amyloid Plaques. Masters, C. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4245; Miller, D. et al. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 301: 41; Mori, H. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 17082. Obwohl der exakte molekulare Mechanismus, der zur β-APP Aggregation und Ablagerung führt, unbekannt ist, wurde der Prozess mit dem der Keimbildungs-abhängigen Polymerisation, wie beispielsweise der Proteinkristallisierung, der Bildung von Mikrotubuli und der Aktinpolymerisation, verglichen. Siehe z.B. Jarrett, J.T. and Lansbury, P.T. (1993) Cell 73: 1055-1058. In solchen Prozessen kommt es solange nicht zur Polymerisation von monomeren Bestandteilen, bis der Nukleus gebildet ist. Daher sind diese Prozesse durch eine Verzögerungszeit (lag time) gekennzeichnet, die vor der Aggregation auftritt, gefolgt von einer schnellen Polymerisation nach der Nukleation. Die Nukleation kann durch den Zusatz eines "Keims" oder eines vorgeformten Nukleus beschleunigt werden, was zu schneller Polymerisation führt. Es wurde gezeigt, dass die lange β-Form des β-AP als Keim wirkt und dabei die Polymerisation von sowohl langen, als auch von kurzen β-AP-Formen beschleunigt. Jarrett, J.T. et al. (1993) Biochemistry 32: 4693.
In einer Studie, in der β-AP Aminosäuren ausgetauscht wurden, wurde berichtet, dass zwei β-Peptid-Mutanten die Polymerisation von nicht-mutierten β-AP beeinflussen, wenn die mutierten und nicht-mutierten Formen der Peptide gemischt werden. Hilbich, C. et al. (1992) J. Mol. Biol. 228: 460-473. Es wurden equimolare Mengen der mutierten und der nicht-mutierten (d.h. natürlichen) β-Amyloid-Peptide genommen, um diesen Effekt zu beobachten, und es wurde berichtet, dass die Peptidmutanten für die in vivo Anwendung nicht geeignet sind. Hilbich, C. et al. (1992), supra.
WO 96/28471 offenbart Peptide unterschiedlicher Längen, die die Aggregation von amyloidogenen Proteinen modulieren. Die Peptide bestehen aus natürlich auftretenden Aminosäuren, d.h. L-Isomere, die modifiziert werden können.
WO 97/21728 offenbart Modulatoren der β-Amyloid Aggregation, basierend auf zwei allgemeinen Formeln, die aus einer Kernstruktur aus vier Aminosäuren bestehen, die entweder D- oder L-Isomere sein können. Die Position 2 ist als ein Leucinrest vorbestimmt und die C- und N-terminalen Aminosäuren können modifiziert werden.
Es wurde gezeigt, dass die Eigenschaft des Peptids Lys-Leu-Val-Phe-Phe die amyloide Fibrillenbildung zu unterbrechen, auf der stereotypischen Bindung des Peptids an die homologe Sequenz von βA basiert (Tjernberg et al. (1995) Journal of Biological Chemistry 272: 12601-12605). Aufgrund dieser Entdeckung wurde ein generelles Motiv von fünf D-Aminosäuren identifiziert, die Phenylalanin in der zweiten Position und Leucin in der dritten Position enthält, dass die Bildung von Amyloid-Fibrillen verhindert.
WO 98/08868 offenbart Zusammensetzungen, die eine Peptidstruktur, vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe von 22 Strukturen und modifizierenden Gruppen, die die β-Amyloid Aggregation modulieren, aufweisen. Modifizierende Gruppen können zyklische, heterozyklische oder verzweigte Alkylgruppen sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen davon, die an natürliche β-Amyloid-Peptide (β-AP) binden können, die die Aggregation von natürlichem β-AP modulieren können und/oder die Neurotoxizität von natürlichen β-APs inhibieren können. Die Zusammensetzungen sind in einer Art und Weise modifiziert, die ihnen eine erhöhte Biostabilität verleiht und verlängerte erhöhte Konzentrationen im Plasma. Die β-Amyloid Modulatorzusammensetzung der Erfindung umfasst eine Peptidstruktur, vorzugsweise basierend auf einem β-Amyloid-Peptid, das komplett aus D-Aminosäuren zusammengesetzt ist. In verschiedenen Ausführungsformen umfasst die Peptidstruktur der Modulatorzusammensetzung eine D-Aminosäuresequenz, die einer L-Aminosäuresequenz entspricht, die innerhalb von natürlichem β-AP gefunden wurde, eine D-Aminosäuresequenz, die ein inverses Isomer von einer L-Aminosäuresequenz ist, die innerhalb von natürlichem β-AP gefunden wurde, eine D-Aminosäuresequenz, die ein retro inverses Isomer von einer L-Aminosäuresequenz ist, die innerhalb von natürlichem β-AP gefunden wurde oder eine D-Aminosäuresequenz, die eine gedrängte (scrambled) oder ausgetauschte Version von einer L-Aminosäuresequenz ist, die innerhalb von natürlichem β-AP gefunden wurde. Bevorzugter Weise basiert die Gestaltung der D-Aminosäure-Peptidstruktur des Modulators auf einer Unterregion aus natürlichem β-AP an den Positionen 17-21 (entweder Aβ_17-20 oder Aβ_17-21), die die Aminosäuresequenz Leu-Val-Phe-Phe-Ala (Seq. ID Nr.: 4) aufweist. In bevorzugten Ausführungsformen ist ein Phenylalanin in den Zusammensetzungen der Erfindung gegen ein Phenylalanin Analog ausgetauscht, das stabiler und weniger anfällig für beispielsweise oxidativen Metabolismus ist, oder erhöhte Konzentrationen der Zusammensetzung im Gehirn ermöglicht.
In noch einer weiteren Ausführungsform beinhaltet eine Modulatorenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ein β-Amyloid-Peptid, das D-Aminosäuren, ein inverses Isomer eines β-Amyloid-Peptids, oder ein retro-inverses Isomer eines β-Amyloid-Peptids enthält, das an einem Hydrazinrest angebracht ist, wobei die Zusammensetzung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet oder die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden inhibiert, wenn sie in Kontakt mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden kommt.
Eine Modulatorenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst bevorzugter Weise 3-20 D-Aminosäuren, mehr bevorzugt 3-10 Aminosäuren und am meisten bevorzugt 3-5 Aminosäuren. Das Amino-Ende und das Carboxy-Ende der D-Aminosäuren-Peptidstruktur des Modulators können beide modifiziert werden. Zum Beispiel kann eine N-terminale modifizierende Gruppe genutzt werden, die die Fähigkeit der Zusammensetzung erhöht, die Aβ-Aggregation zu inhibieren. Außerdem können die Amino-Enden und/oder Carboxy-Enden des Peptids modifiziert werden, um eine pharmakokinetische Eigenschaft der Zusammensetzung zu verändern (wie beispielsweise Stabilität, Bioverfügbarkeit, z.B. verbesserter Transport der Zusammensetzung über die Blut-Hirn-Schranke und Eintritt ins Gehirn und ähnliches). Bevorzugte modifizierende Gruppen des Amino-Endes beinhalten Alkylgruppen, z.B. Methyl-, Ethyl- oder Isopropylgruppen. Bevorzugte modifizierende Gruppen des Carboxy-Endes beinhalten Amidgruppen, Alkyl- oder Aryl-Amidgruppen (z.B. Phenethylamid), Hydroxygruppen (d.h. Reduktionsprodukte von Peptidsäuren, die Peptidalkohole ergeben), Acyl-Amidgruppen und Acetylgruppen. Noch weiter kann eine Modulatorzusammensetzung dahingehend modifiziert werden, dass die Zusammensetzung mit einer erfassbaren Substanz (z.B. einer radioaktiven Markierung) markiert wird.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen. Gewöhnlicher Weise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung eine therapeutisch effektive Menge einer Modulatorzusammensetzung der Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Eine noch weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft Verfahren zur Inhibition der Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden. Diese Verfahren umfassen das in Kontaktbringen des natürlichen β-Amyloid-Peptids mit einer Modulatorzusammensetzung der Erfindung, so dass die Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide inhibiert wird.
Eine noch weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft Verfahren zur Erfassung der Gegenwart oder Abwesenheit von natürlichen β-Amyloid-Peptiden in einer biologischen Probe. Dieses Verfahren umfasst das in Kontaktbringen einer biologischen Probe mit einer Zusammensetzung der Erfindung, wobei die Zusammensetzung mit einer erfassbaren Substanz markiert ist, und das Erfassen der an natürlichen β-Amyloid-Peptiden gebundenen Zusammensetzung, um dabei die Gegenwart oder Abwesenheit von natürlichen β-Amyloid-Peptiden in der biologischen Probe in vivo zu erfassen.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die Verwendung der Modulatoren der vorliegenden Erfindung für die Therapie oder für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Störung, die mit β-Amyloidose assoziiert ist. Die Anwendung umfasst das Verabreichen einer therapeutisch effektiven Menge einer Modulatorzusammensetzung der Erfindung an ein Individuum, so dass das Individuum gegen eine Störung, die mit β-Amyloidose assoziiert ist, behandelt wird. Bevorzugter Weise ist diese Störung Alzheimer.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Tabelle, die die Ergebnisse eines Hirn-Aufnahme-Assays zeigt.
2 ist ein Graph, der die Ergebnisse eines Fibrillen-Bindungs-Assays beschrieben in Beispiel 2 zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und pharmazeutische Zusammensetzungen davon, die natürliche β-Amyloid-Peptide binden können, die Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden (β-AP) modulieren können und/oder die Neurotoxizität von natürlichen β-APs inhibieren können. Die Zusammensetzungen sind in einer Art und Weise moduliert, die ihnen eine erhöhte Biostabilität und erhöhte Konzentrationen im Plasma ermöglicht. Eine Zusammensetzung der Erfindung, die die Aggregation von natürlichem β-AP moduliert, hier austauschbar bezogen auf eine β-Amyloid Modulatorzusammensetzung, einen β-Amyloid-Modulator oder einfach einen Modulator, ändert die Aggregation natürlicher β-APs, wenn der Modulator mit natürlichem β-AP in Kontakt kommt. Daher agiert eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verändernd auf den natürlichen Aggregationsprozess oder die Aggregationsrate von β-AP, wobei sie diesen Prozess unterbricht. Bevorzugter Weise inhibiert die Zusammensetzung die β-AP Aggregation. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Peptidstruktur umfassen, die gänzlich aus D-Aminosäureresten zusammengesetzt ist. Diese Peptidstruktur basiert vorzugsweise auf einem β-Amyloid-Peptid und kann beispielsweise eine D-Aminosäuresequenz umfassen, die einer L-Aminosäuresequenz entspricht, die innerhalb von natürlichem β-AP gefunden wurde, eine D-Aminosäuresequenz, die ein inverses Isomer von einer L-Aminosäuresequenz ist, die innerhalb von natürlichem β-AP gefunden wurde, eine D-Aminosäuresequenz, die ein retro-inverses Isomer von einer L-Aminosäuresequenz ist, die innerhalb von natürlichem β-AP gefunden wurde, oder eine D-Aminosäuresequenz, die eine gedrängte oder ausgetauschte Version von einer L-Aminosäuresequenz ist, die innerhalb von natürlichem β-AP gefunden wurde. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Phenylalanine der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gegen Phenylalanin Analoge ausgetauscht, die stabiler und weniger anfällig für beispielsweise oxidativen Metabolismus sind.
Die vorliegenden Erfindung umfasst Modulatorzusammensetzungen, die eine D-Aminosäure-Peptidstruktur umfassen, in denen das Amino-Ende und das Carboxy-Ende der Peptidstruktur modifiziert sind.
Die β-Amyloid-Modulatorzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können basierend auf ihrer Fähigkeit an natürliche β-Amyloid-Peptide zu binden, die Aggregation von natürlichem β-AP in vitro zu modulieren und/oder die Neurotoxizität von natürlichen β-AP Fibrillen auf kultivierte Zellen zu inhibieren (Anwendung hier beschriebener Assays, beispielsweise des Neurotoxizitäts-Assays, des Keimbildungs-Assays oder des Fibrillen-Bindungs-Assays) gewählt werden. Bevorzugte Modulatorzusammensetzungen inhibieren die Aggregation von natürlichem β-AP und/oder inhibieren die Neurotoxizität von natürlichem β-AP. Jedoch können Modulatorzusammensetzungen, die basierend auf einer oder beider dieser Eigenschaften ausgewählt wurden, zusätzliche in vivo Eigenschaften aufweisen, die in der Behandlung von Amyloidose förderlich sind (J.S. Pachter et al. (1998) "Aβ1-40 induced neurocytopathic activation of human monocytes is blocked by Aβ peptide aggregation inhibitors." Neurobiology of Aging (Abstracts: The 6^th International Conference an Alzheimer's Disease and Related Disorders, Amsterdam, 18-23 July 1998) 19, S128 (Abstract 540); R. Weltzein, A. et al. (1998) "Phagocytosis of Beta-Amyloid: A Possible Requisite for Neurotoxicity." J. Neuroimmunology (Special Issue: Abstracts of the International Society of Neuroimmunology Fifth International Congress, Montreal, Canada, 23-27 August 1998) 1998, 90, 32 (Abstract 162)). Beispielsweise kann die Modulatorzusammensetzung die Verarbeitung von natürlichem β-AP (entweder durch direkte oder indirekte Proteaseinhibition) oder durch die Modulation von Prozessen, die in vivo toxisches β-AP oder andere APP Fragmente produzieren, beeinträchtigen. Alternativ können Modulatorzusammensetzungen basierend auf diesen letzteren Eigenschaften ausgewählt werden, anstatt aufgrund der Inhibition der Aβ-Aggregation in vitro. Außerdem können Modulatorzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die basierend auf ihrer Wechselwirkung mit natürlichen β-AP ausgewählt sind, auch mit APP oder anderen APP Fragmenten Wechselwirken. Weiterhin kann eine Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung durch ihre Fähigkeit, β-Amyloid-Fibrillen (die beispielsweise durch radioaktive Markierung der Zusammensetzung, durch in Kontaktbringen der Zusammensetzung mit β-Amyloid-Plaques und durch Zählen oder Erfassen, z.B. durch Bildaufnahmen, der Zusammensetzung gebunden an pathologische Formen von β-AP, beispielsweise dem Plaque, bestimmt werden) zu binden, gekennzeichnet sein, während sie die Aggregation der β-Amyloid-Fibrillen nicht wesentlich verändert. Eine solche Zusammensetzung, die effizient an β-Amyloid-Fibrillen bindet, während sie die Aggregation der β-Amyloid-Fibrillen nicht wesentlich verändert, kann beispielsweise zur Erfassung von β-Amyloid-Fibrillen (z.B. für Diagnosezwecke, was später beschrieben wird) angewendet werden. Es sollte jedoch anerkannt werden, dass die Fähigkeit einer bestimmten Zusammensetzung β-Amyloid-Fibrillen zu binden und/oder ihre Aggregation zu modulieren, abhängig von der Konzentration der Zusammensetzung variieren kann. Dementsprechend kann eine Zusammensetzung, die bei einer niedrigen Konzentration β-Amyloid-Fibrillen bindet, ohne ihre Aggregation zu verändern, trotzdem bei höheren Konzentrationen die Aggregation der Fibrillen inhibieren. Alle diese Zusammensetzungen, die die Eigenschaft des Bindens an β-Amyloid-Fibrillen und/oder des Modulierens der Aggregation der Fibrillen aufweisen, sind dazu vorgesehen, von der Erfindung umfasst zu sein.
Wie hier verwendet, soll sich ein "Modulator" der β-Amyloid Aggregation auf ein Mittel beziehen, das, wenn es mit natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt kommt, die Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden verändert. Der Term "Aggregation von β-Amyloid-Peptiden" bezieht sich auf einen Prozess, bei dem die Peptide miteinander assoziieren, um einen multimerischen, größtenteils unlöslichen Komplex zu bilden. Der Term "Aggregation" ist dazu vorgesehen, weiterhin die β-Amyloid-Fibrillen Bildung und auch die β-Amyloid-Plaques zu umfassen.
Die Terme "natürliche β-Amyloid-Peptide", "natürliche β-AP" und "natürliche Aβ-Peptide" werden hier gegeneinander austauschbar genutzt und sind dazu vorgesehen, natürlich auftretende proteolytische Spaltungsprodukte des β-Amyloid Vorläuferproteins (APP) zu umfassen, die in der β-AP Aggregation und bei der β-Amyloidose involviert sind. Diese natürlichen Peptide beinhalten β-Amyloid-Peptide, die 39-43 Aminosäuren aufweisen (d.h. Aβ_1-39, Aβ_1-40, Aβ_1-41, Aβ_1-42 und Aβ_1-43). Der Amino-terminale Aminosäurerest von natürlichem β-AP entspricht dem Asparaginsäurerest an Position 672 der 770 Aminosäurereste-Form des Amyloid Vorläuferproteins ("APP-770"). Die 43 Aminosäurenlange Form von natürlichem β-AP weist die Aminosäuresequenz DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT auf (auch in Seq. ID Nr.: 1 gezeigt), wobei bei den kürzeren Formen 1-4 Aminosäuren von ihrem Carboxyterminalen Ende entfernt worden sind. Die Aminosäuresequenz von APP-770 von Position 672 (d.h. das Amino-Ende von natürlichem β-AP) bis zu seinem C-terminalen Ende (103 Aminosäuren) ist in Seq. ID Nr.: 2 gezeigt. Die bevorzugte Form des natürlichen β-APs für die Anwendung in dem Aggregations-Assay, der hier beschrieben ist, ist Aβ_1-40 oder Aβ_1-42.
In Gegenwart eines Modulators der vorliegenden Erfindung wird die Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden "verändert" oder "moduliert". Die verschiedenen Formen des Terms "Veränderung" oder "Modulation" sind dazu vorgesehen, sowohl die Inhibition der β-AP Aggregation und die Förderung der β-AP Aggregation zu umfassen. Die Aggregation des natürlichen β-APs wird in Gegenwart des Modulators "inhibiert", wenn es eine Abnahme in der Menge und/oder der Rate der β-AP Aggregation verglichen mit der Menge und/oder der Rate der β-AP Aggregation in Abwesenheit des Modulators gibt. Die verschiedenen Formen des Terms "Inhibition" sind dazu vorgesehen, beide, sowohl die ganzheitliche, wie auch die teilweise Inhibition der β-AP Aggregation zu enthalten. Die Inhibition der Aggregation kann als mehrfache Verlängerung der Verzögerungszeit für die Aggregation oder als Senkung des gesamten Plateaulevels der Aggregation (d.h. der gesamten Menge der Aggregation) quantifiziert werden, indem ein Aggregations-Assay angewandt wird, der in den Beispielen beschrieben ist. In verschiedenen Ausführungsformen erhöht ein Modulator der Erfindung die Verzögerungszeit um mindestens das 1,2-fache, 1,5-fache, 1,8-fache, 2-fache, 2,5-fache, 3-fache, 4-fache oder 5-fache, beispielsweise wenn die Zusammensetzung in einem 1 molaren Äquivalent zu dem β-AP vorliegt. In verschiedenen anderen Ausführungsformen inhibiert ein Modulator der Erfindung das Plateaulevel der Aggregation um mindestens 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 75 % oder 100 %.
Ein Modulator, der die β-AP Aggregation inhibiert (eine "inhibitorische Modulatorzusammensetzung") kann zur Verhinderung oder Verzögerung des Fortschreitens der β-Amyloid-Ablagerung verwendet werden. Vorzugsweise inhibieren Modulatorzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung die Bildung und/oder die Aktivität von neurotoxischen Aggregationen aus natürlichem Aβ-Peptid (d.h. die inhibitorischen Zusammensetzungen können zur Inhibition der Neurotoxizität von natürlichem β-AP angewandt werden). Zusätzlich können die inhibitorischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung die Neurotoxizität der vorgeformten β-AP Aggregationen reduzieren, was darauf hinweist, dass die inhibitorischen Modulatoren entweder vorgeformte Aβ-Fibrillen oder lösliche Aggregationen binden und ihre dazugehörige Neurotoxizität modulieren können, oder dass die Modulatoren das Gleichgewicht zwischen den monomerischen und den zusammen gelagerten Formen des β-AP zu Gunsten der nicht-neurotoxischen Form stören können.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Modulatoren der vorliegenden Erfindung in der Lage, die β-AP Aggregation zu verändern, wenn sie mit einem molaren Mengenüberschuss von natürlichem β-AP in Kontakt gebracht werden. Ein "molarer Mengenüberschuss von natürlichem β-AP" bezieht sich auf eine Konzentration von natürlichem β-AP, in Mol, die größer ist, als die Konzentration des Modulators in Mol. Beispielsweise liegen der Modulator und das β-AP in "equimolaren" Mengen vor, wenn beide eine Konzentration von 1 μM ufweisen, wohingegen das β-AP in einer 5-fach molaren Mengenüberschuss verglichen mit dem Modulator vorliegt, wenn der Modulator in einer Konzentration von 1 μM vorliegt und das β-AP in einer Konzentration von 5 μM. In bevorzugten Ausführungsformen ist ein Modulator der vorliegenden Erfindung effektiv im Verändern der natürlichen β-AP Aggregation, wenn das natürliche β-AP in einem mindestens 2-fachen, 3-fachen oder 5-fachen molaren Überschuss vorliegt, verglichen mit der Konzentration des Modulators. In einer weiteren Ausführungsform ist der Modulator effektiv im Verändern der natürlichen β-AP Aggregation, wenn das natürliche β-AP in einem mindestens 10-fachen, 20-fachen, 33-fachen, 50-fachen, 100-fachen oder 1000-fachen molaren Überschuss vorliegt, verglichen mit der Konzentration des Modulators.
Der hier genutzte Term "β-Amyloid-Peptid umfasst gänzlich D-Aminosäuren", wie in einem Modulator der vorliegenden Erfindung verwendet, ist dazu vorgesehen, Peptide zu umfassen, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die identisch zu der natürlichen Sequenz in APP ist, und auch Peptide, die akzeptable Auswechselungen von Aminosäuresequenzen von der natürlichen Sequenz aufweisen, aber die eher aus D-Aminosäuren zusammengesetzt sind, als aus den natürlichen L-Aminosäuren, die in natürlichem β-AP vorkommen. Akzeptable Auswechselungen von Aminosäuresequenzen sind solche, die die Fähigkeit der D-Aminosäure enthaltenden Peptide, die Aggregation des natürlichen β-APs zu verändern nicht beeinflussen und/oder verbessern können. Weiterhin können bestimmte Auswechselungen von Aminosäuren weiter zu der Fähigkeit des Peptids beitragen, die Aggregation des natürlichen β-APs zu verändern und/oder dem Peptid zusätzliche fördernde Eigenschaften (z.B. erhöhte Löslichkeit, reduzierte Assoziierung mit anderen amyloiden Proteinen, etc.) zu gewähren. Ein Peptid wird auch als "inverse" Zusammensetzung bezeichnet, wenn es eine identische Aminosäuresequenz zu der aufweist, die innerhalb von elterlichen Peptiden gefunden werden kann, in der allerdings alle L-Aminosäuren gegen D- Aminosäuren ausgetauscht wurden. Wenn beispielsweise ein elterliches Peptid Thr-Ala-Tyr ist, dann ist die inverse Form D-Thr-D-Ala-D-Tyr.
Der hier genutzte Term "retro-inverses Isomer eines β-Amyloid-Peptids", wie in einem Modulator der vorliegenden Erfindung verwendet, ist dazu vorgesehen, Peptide zu umfassen, in denen die Sequenz der Aminosäuren umgekehrt ist, verglichen mit der Sequenz von natürlichem β-AP und in der alle L-Aminosäuren gegen D-Aminosäuren ausgetauscht sind. Wenn beispielsweise ein elterliches Peptid Thr-Ala-Tyr ist, dann ist die retro-inverse Form D-Tyr-D-Ala-D-Thr. Verglichen mit dem elterlichen Peptid weist ein retro-inverses Peptid ein umgekehrtes Rückgrat auf, während es die ursprüngliche räumliche Konformation der Seitenketten im Wesentlichen beibehält, was zu einem retro-inversen Isomer mit einer Topologie führt, die der des elterlichen Peptids sehr ähnelt. Siehe Goodman et al. "Perspectives in Peptide Chemistry" pp. 283-294 (1981). Siehe auch U.S. Patent No. 4,522,752 von Sisto für weitere Beschreibungen von "retro-inversen" Peptiden.
Verschiedene zusätzliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und deren Verwendung sind in den folgenden Unterabschnitten detaillierter beschrieben.
I. Modulatorzusammensetzungen
In einer Ausführungsform umfasst eine Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ein β-Amyloid-Peptid, wobei das β-Amyloid-Peptid gänzlich aus D-Aminosäuren zusammengesetzt ist, wobei die Zusammensetzung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet oder die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden inhibiert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. Vorzugsweise umfasst das β-Amyloid-Peptid des Modulators 3-20 D-Aminosäuren, mehr bevorzugt 3-10 D-Aminosäuren und am meisten bevorzugt 3-5 D-Aminosäuren. In bevorzugten Ausführungsformen ist ein Phenylalanin in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gegen ein Phenylalanin Analog ausgetauscht, das stabiler und weniger anfällig für beispielsweise oxidativen Metabolismus ist.
In einer Ausführungsform ist das β-Amyloid-Peptid des Modulators der vorliegenden Erfindung Amino-terminal modifiziert, beispielsweise mit einer modifizierenden Gruppe, die eine Alkylgruppe umfasst, wie beispielsweise eine C1-C6 niedere Alkylgruppe, z.B. eine Methyl-, Ethyl- oder Propylgruppe, oder eine zyklische, heterozyklische, polyzyklische oder verzweigte Alkylgruppe. Beispiele von geeigneten N-terminal-modifizierenden Gruppen werden weiter in Unterabschnitt II beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform ist das β-Amyloid-Peptid des Modulators Carboxy-terminal modifiziert, beispielsweise kann der Modulator ein Peptid-Amid, ein Peptid-Alkyl oder Aryl-Amid (z.B. ein Peptid Phenethylamid) oder ein Peptid-Alkohol umfassen. Beispiele von geeigneten C-terminalmodifizierenden Gruppen werden weiter in den Unterabschnitten II und III beschrieben. Das β-Amyloid-Peptid des Modulators kann zur Verbesserung der Fähigkeit des Modulators, die β-AP Aggregation oder die Neurotoxizität zu verändern, modifiziert werden. Zusätzlich oder alternativ kann das β-Amyloid-Peptid des Modulators zur Veränderung einer pharmakokinetischen Eigenschaft des Modulators und/oder zur Markierung des Modulators mit einer erfassbaren Substanz modifiziert werden (weiter beschrieben in Unterabschnitt III).
In einer weiteren Ausführungsform umfasst eine Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ein retro-inverses Isomer eines β-Amyloid-Peptids, wobei die Zusammensetzung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet oder die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität der natürlichen β-Amyloid-Peptide inhibiert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt kommt. Vorzugsweise weist das retro-inverse Isomer des β-Amyloid-Peptids 3-20 D-Aminosäuren auf, mehr bevorzugt 3-10 D-Aminosäuren, am meisten bevorzugt 3-5 D-Aminosäuren. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Phenylalanine der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ausgetauscht gegen Phenylalanin Analoge, die stabiler und weniger anfällig für beispielsweise oxidativen Metabolismus sind.
In einer Ausführungsform ist das retro-inverse Isomer Amino-terminal modifiziert, beispielsweise mit einer modifizierenden Gruppe, die eine Alkylgruppe umfasst, wie beispielsweise eine C1-C6 niedere Alkylgruppe, z.B. eine Methyl-, Ethyl- oder Propylgruppe, oder eine zyklische, heterozyklische, polyzyklische oder verzweigte Alkylgruppe. Beispiele von geeigneten N-terminal-modifizierenden Gruppen werden weiter in Unterabschnitt II beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform ist das retro-inverse Isomer Carboxy-terminal modifiziert, beispielsweise mit einer Amidgruppe, einer Alkyl- oder Aryl-Amidgruppe (z.B. Phenethylamid) oder einer Hydroxygruppe (d.h. das Reduktionsprodukt einer Peptidsäure, das ein Peptidalkohol ergibt). Beispiele von geeigneten C-terminal-modifizierenden Gruppen sind weiter in Unterabschnitt II und III beschrieben.
Das retro-inverse Isomer kann zur Verbesserung der Fähigkeit des Modulators, die β-AP Aggregation oder die Neurotoxizität zu verändern, modifiziert werden. Zusätzlich oder alternativ kann das retro-inverse Isomer zur Veränderung einer pharmakokinetischen Eigenschaft des Modulators und/oder zur Markierung des Modulators mit einer erfassbaren Substanz modifiziert werden (weiter beschrieben in Unterabschnitt III).
In noch einer weiteren Ausführungsform beinhaltet eine Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ein β-Amyloid-Peptid, das ganzheitlich oder teilweise D-Aminosäuren umfasst, ein inverses Isomer eines β-Amyloid-Peptids oder ein retro-inverses Isomer eines β-Amyloid-Peptids, das an einem Hydrazinrest angebracht ist, wobei die Zusammensetzung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet oder die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden inhibiert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt kommt. Vorzugsweise umfasst die Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung 1-20 D-Aminosäuren, mehr bevorzugt 1-10 D-Aminosäuren und am meisten bevorzugt 1-5 D-Aminosäuren, die an einen Hydrazinrest angebracht sind.
In einer Ausführungsform sind die Modulatorzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die einen Hydrazinrest enthalten, Amino-terminal modifiziert, beispielsweise mit einer modifizierenden Gruppe, umfassend eine Alkylgruppe, z.B. eine Methyl-, Ethyl- oder Isopropylgruppe. Beispiele von geeigneten N-terminal-modifizierenden Gruppen sind weiter in Unterabschnitt II beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform sind Modulatorzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die einen Hydrazinrest enthalten, Carboxyterminal modifiziert, beispielsweise mit einem Acetyl. Beispiele von geeigneten C-terminalmodifizierenden Gruppen sind weiter in den Unterabschnitten II und III beschrieben. Die Modulatorzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die einen Hydrazinrest enthalten, können zur Erhöhung der Fähigkeit des Modulators die β-AP Aggregation oder die Neurotoxizität zu verändern, modifiziert werden. Zusätzlich oder alternativ können die Modulatorzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die einen Hydrazinrest enthalten, zur Veränderung einer pharmakokinetischen Eigenschaft des Modulators und/oder zur Markierung des Modulators mit einer erfassbaren Substanz, modifiziert werden (weiter beschrieben in Unterabschnitt III).
Die Modulatoren der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise auf der Aminosäuresequenz einer Unterregion des natürlichen β-APs basierend gestaltet. Der Term "Unterregion des natürlichen β-Amyloid-Peptids" ist dazu vorgesehen, die Amino-terminalen und/oder Carboxy-terminalen Deletionen des natürlichen β-APs zu enthalten. Der Term "Unterregion des natürlichen β-Amyloid-Peptids" ist nicht dazu vorgesehen, das voll-längen natürliche β-AP zu enthalten (d.h. "Unterregion" beinhaltet nicht Aβ_1-39, Aβ_1-40, Aβ_1-41, Aβ_1-42 und Aβ_1-43). Eine bevorzugte Unterregion des natürlichen β-Amyloid-Peptids ist eine "Aβ-Aggregations-Kerndomäne" (ACD). Wie hier verwendet, bezieht sich der Term "Aβ-Aggregations-Kerndomäne" auf eine Unterregion des natürlichen β-Amyloid-Peptids, die geeignet ist, die Aggregation von natürlichen β-APs zu modulieren, wenn diese Unterregion in ihrer L-Aminosäure-Form entsprechend modifiziert ist (d.h. am Amino-Ende modifiziert), wie in U.S. patent application Serial No. 08/548,998 und in U.S. patent application Serial No. 08/616,081 detailliert beschrieben ist, deren gesamter Inhalt hier ausdrücklich durch Referenzen einbezogen wird. Vorzugsweise ist das ACD nach einer Unterregion des natürlichen β-APs geformt, die eine Länge von weniger als 15 Aminosäuren aufweist und mehr bevorzugt eine Länge zwischen 3-10 Aminosäuren aufweist. In verschiedenen Ausführungsformen ist das ACD nach einer Unterregion des natürlichen β-APs geformt, die eine Länge von 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 oder 3 Aminosäuren aufweist. In einer Ausführungsform ist die Unterregion, nach der das ACD geformt ist, eine interne oder Carboxy-terminale Region des β-APs (d.h. von dem Amino-Ende an Aminosäureposition 1 stromabwärts). In einer weiteren Ausführungsform ist das ACD nach einer hydrophoben Unterregion des natürlichen β-APs geformt. Bevorzugte Aβ-Aggregations-Kerndomänen umfassen die Aminosäurereste 17-20 oder 17-21 von natürlichem β-AP (Aβ_17-20 bzw. Aβ_17-21) und Analoge davon, wie hier beschrieben ist. Die Aminosäuresequenzen von Aβ_17-20 und Aβ_17-21 sind Leu-Val-Phe-Phe (Seq. ID Nr.: 3) bzw. Leu-Val-Phe-Phe-Ala (Seq. ID Nr.: 4).
Wie in den Beispielen gezeigt, sind D-Aminosäuren-enthaltende Modulatoren, die auf den Aminosäuresequenzen Aβ_17-20 und Aβ_17-21 basierend gestaltet sind, besonders effektive Inhibitoren der Aβ-Aggregation und sie zeigen eine erhöhte Biostabilität und verlängerte erhöhte Konzentrationen im Plasma. Diese Modulatoren können eine D-Aminosäuresequenz umfassen, die der L-Aminosäuresequenz von Aβ_17-20 oder Aβ_17-21, einer D-Aminosäuresequenz die ein inverses Isomer der L-Aminosäuresequenz von Aβ_17-20 oder Aβ_17-21 ist, einer D-Aminosäuresequenz, die ein retro-inverses Isomer der L-Aminosäuresequenz von Aβ_17-20 oder Aβ_17-21 ist oder eine D-Aminosäuresequenz, die eine gedrängte oder ausgetauschte Version von einer L-Aminosäuresequenz von Aβ_17-20 oder Aβ_17-21 ist, entspricht. In bevorzugten Ausführungsformen ist ein Phenylalanin in den Modulatoren, die auf der Aminosäuresequenz von Aβ_17-20 und Aβ_17-21 basierend gestaltet sind, gegen ein Phenylalanin Analog ausgetauscht, das stabiler und weniger anfällig für beispielsweise oxidativen Metabolismus ist. In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Modulatoren, die auf der Aminosäuresequenz von Aβ_17-20 und Aβ_17-21 basierend gestaltet sind, ferner einen Hydrazinrest.
Die auf der D-Aminosäuresequenz basierenden Modulatoren können ein modifiziertes Amino-Ende und Carboxy-Ende aufweisen (weiter unten beschrieben). Die Peptidstrukturen der effektiven Modulatoren sind generell hydrophob und sind durch die Anwesenheit von D-Aminosäurestrukturen, ausgewählt aus der Gruppe, die eine D-Leucin Struktur, eine D-Phenylalanin Struktur und eine D-Valin Struktur umfasst, gekennzeichnet. Wie hier verwendet, ist der Term "D-Aminosäurestruktur" (wie bei einer "D-Leucin Struktur", einer "D-Phenylalanin Struktur" und bei einer "D-Valin Struktur") dazu vorgesehen, sowohl die D-Aminosäure, als auch Analoge, Derivate und Mimetika der D-Aminosäure zu beinhalten, die die funktionelle Aktivität der Zusammensetzung erhalten (weiter unten ausgeführt). Beispielsweise ist dazu der Term "D-Phenylalanin Struktur" vorgesehen, der sowohl D-Phenylalanin, als auch D-Cyclohexylalanin [D-cha], D-4-Fluorophenylalanin (para-Fluorphenylalanin) {[p-F]f oder D-[p-F]Phe}, D-Pentafluorophenylalanin {[F₅]f oder D-[F₅]Phe}, Chlorophenylalanin, Bromophenylalanin, Nitrophenylalanin, D-Pyridylalanin, D-Homophenylalanin, Methyltyrosin und Benzylserin, als auch den Austausch mit einer D-Lysin Struktur, einer D-Valin Struktur oder einer D-Leucin Struktur enthält. Der Term "D-Leucin Struktur" ist dazu vorgesehen, sowohl D-Leucin, als auch den Austausch mit D-Valin, D-Isoleucin oder anderen natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäuren, die eine aliphatische Seitenkette wie beispielsweise D-Norleucin oder D-Norvalin aufweisen, zu enthalten. Der Term "D-Valin Struktur" ist dazu vorgesehen, sowohl D-Valin, als auch den Austausch mit D-Leucin oder anderen natürlichen oder nicht-natürlichen Aminosäuren, die eine aliphatische Seitenkette aufweisen, zu enthalten.
Die vorliegende Erfindung stellt eine β-Amyloid Modulatorzusammensetzung bereit, die die Formel (I) umfasst: (Y-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Z-A_n) _(I),wobei Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃ und Xaa₄ je eine D-Aminosäure Struktur sind und mindestens zwei von Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃ und Xaa₄ unabhängig aus der Gruppe bestehend aus einer D-Leucin Struktur, einer D-Phenylalanin Struktur, beispielsweise D-Cyclohexylalanin, D-4-Fluorphenylalanin (para-Fluorphenylalanin), D-Pentafluorphenylalanin, Chlorphenylalanin, Bromphenylalanin, Nitrophenylalanin, D-Homophenylalanin und einer D-Valin Struktur ausgewählt sind, wobei
Y, das an- oder abwesend sein kann, eine Struktur ist, die die Formel (Xaa)_a aufweist, wobei Xaa jegliche D-Aminosäurestruktur sein kann und a eine ganze Zahl zwischen 1 und 15 ist,
Z, das an- oder abwesend sein kann, eine Struktur ist, die die Formel (Xaa)_b aufweist, wobei Xaa jegliche D-Aminosäurestruktur sein kann und b eine ganze Zahl zwischen 1 und 15 ist,
A, das an- oder abwesend sein kann, eine modifizierende Gruppe ist, die direkt oder indirekt an die Zusammensetzung angebracht ist; und
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 15 ist,
wobei Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄, Y, Z, A und n so ausgewählt sind, dass die Zusammensetzung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet oder die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität der natürlichen β-Amyloid-Peptide inhibiert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt kommt, und weniger anfällig für Metabolismen, beispielsweise oxidativen Metabolismus ist.
In einer Ausführungsform dieser Formel ist ein fünfter Aminosäurerest, Xaa₅, C-terminal zu Xaa₄ und Z festgelegt, der an- oder abwesend sein kann, der eine Struktur ist, die die Formel (Xaa)_b aufweist, wobei Xaa jegliche D-Aminosäurestruktur sein kann und b eine ganze Zahl zwischen 1 und 14 ist. Danach stellt die Erfindung eine β-Amyloid Modulatorzusammensetzung bereit, die die Formel (II) umfasst: (Y-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Xaa₅-Z-A_n) _(II), wobei b eine ganze Zahl zwischen 1 und 14 ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₄ und Xaa₅ aus Formel (II) ausgewählt, basierend auf der Sequenz von Aβ_17-21 oder auf akzeptablen Substitutionen davon. Danach ist Xaa₁ eine D-Leucin Struktur, Xaa₂ eine D-Valin Struktur, Xaa₃ eine D-Phenylalanin Struktur, beispielsweise D-Cyclohexylalanin, D-4-Fluorphenylalanin (para-Fluorphenylalanin), D-Pentafluorphenylalanin, Chlorphenylalanin, Bromphenylalanin, Nitrophenylalanin und D-Homophenylalanin, eine D-Tyrosin Struktur, eine D-Iodtyrosin Struktur oder eine D-Lysin Struktur, Xaa₄ ist eine D-Phenylalanin Struktur, beispielsweise D-Cyclohexylalanin, D-4-Fluorphenylalanin (para-Fluorphenylalanin), D-Pentafluorphenylalanin, Chlorphenylalanin, Bromphenylalanin, Nitrophenylalanin, D-Pyridylalanin und D-Homophenylalanin, eine D-Tyrosin Struktur, eine D-Iodtyrosin Struktur oder eine D-Lysin Struktur und Xaa₅ ist eine D-Leucin Struktur.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine β-Amyloid Modulatorzusammensetzung bereit, die die Formel (III) umfasst: (Y-Xaa₁-Xaa₂-NH-[(Z-Xaa₁'-Xaa₂'-Xaa₃'-)NH-A_n) _(III),wobei Xaa₁ und Xaa₂ je D-Aminosäurestrukturen sind und mindestens eine von Xaa₁ und Xaa₂ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die eine D-Leucin Struktur, eine D-Phenylalanin Struktur, beispielsweise D-Cyclohexylalanin, D-4-Fluorphenylalanin (para-Fluorphenylalanin), D-Pentafluorphenylalanin, Chlorphenylalanin, Bromphenylalanin, Nitrophenylalanin und D-Homophenylalanin, eine D-Iodtyrosin Struktur eine D-Lysin Struktur oder eine D-Valin Struktur umfasst, wobei
NH-NH eine Hydrazinstruktur ist,
Y, das an- oder abwesend sein kann, eine Struktur ist, die die Formel (Xaa)_a aufweist, wobei Xaa jegliche D-Aminosäurestruktur sein kann und a eine ganze Zahl zwischen 1 und 15 ist,
Xaa₁', Xaa₂' und Xaa₃' je D-Aminosäurestrukturen sind und Xaa₁', Xaa₂' und Xaa₃' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die eine D-Leucin Struktur, eine D-Phenylalanin Struktur, beispielsweise D-Cyclohexylalanin, D-4-Fluorphenylalanin (para-Fluorphenylalanin), D-Pentafluorphenylalanin, Chlorphenylalanin, Bromphenylalanin, Nitrophenylalanin und D-Homophenylalanin oder eine D-Valin Struktur umfasst,
Z, das an- oder abwesend sein kann, eine Struktur ist, die die Formel (Xaa)_b aufweist, wobei Xaa jegliche D-Aminosäurestruktur sein kann und b eine ganze Zahl zwischen 1 und 15 ist,
A, das an- oder abwesend sein kann, eine modifizierende Gruppe ist, die direkt oder indirekt an die Zusammensetzung angebracht ist; und
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 15 ist,
wobei Xaa₁, Xaa₂, Xaa₃, Xaa₁', Xaa₂', Xaa₃', Y, Z, A und n so gewählt sind, dass die Zusammensetzung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet oder die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität der natürlichen β-Amyloid-Peptide inhibiert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt kommt, und weniger anfällig für Metabolismen, beispielsweise oxidativen Metabolismus ist.
In den Modulatoren der Erfindung, die die Formel (II) oder (III) aufweisen, wie vorstehend gezeigt, ist eine optionale modifizierende Gruppe ("A") direkt oder indirekt an der Peptidstruktur des Modulators angebracht. (Wie hier verwendet, sind die Terme "modulierende Gruppe" und "modifizierende Gruppe" untereinander austauschbar, um eine chemische Gruppe zu bezeichnen, die direkt oder indirekt an der Peptidstruktur des Modulators angebracht ist). Beispielsweise kann eine modifizierende Gruppe/können modifizierende Gruppen durch kovalentes Binden an die Peptidstruktur angebracht werden oder eine/mehrere modifizierende Gruppe/n können indirekt durch eine stabile nicht-kovalente Assoziierung angebracht werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine modifizierende Gruppe an dem Amino-Ende und an dem Carboxy-Ende des Modulators angebracht. In einer weiteren Ausführungsform ist eine modulierende Gruppe/sind modulierende Gruppen an der Seitenkette von mindestens einem Aminosäurerest der Peptidstruktur des Modulators angebracht (z.B. durch die Epsilon-Amino-Gruppe eines Lysylrests/von Lysylresten oder andere geeignete reaktive Gruppen auf einer Aminosäuren-Seitenkette).
In Anwesenheit einer modifizierenden Gruppe/von modifizierenden Gruppen wird die modifizierende Gruppe so gewählt, dass die Zusammensetzung die Aggregation von β-Amyloid-Peptiden inhibiert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt kommt.
Eine noch mehr bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält PPI:1019: N-methyl-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH₂. (Wie zuvor beschrieben steht D-Cha für D-Cyclohexylalanin, [p-F]f oder D-[p-F]Phe steht für D-4-Fluorphenylalanin (auch para-Fluorphenylalanin), [F₅]f oder D-[F₅]Phe steht für D-Pentafluorophenylalanin und D-Nle steht für D-Norleucin).
Die D-Aminosäure-Peptidstruktur der Modulatoren der vorliegenden Erfindung sind dazu vorgesehen ferner andere Peptidmodifikationen zu enthalten, einschließlich Analoge, Derivate und Mimetika, die die Fähigkeit des Modulators bewahren, die natürliche β-AP Aggregation zu verändern, wie hier beschrieben wurde. Beispielsweise kann eine D-Aminosäure-Peptidstruktur eines Modulators der vorliegenden Erfindung weiter modifiziert werden, um seine Stabilität, Bioverfügbarkeit und Löslichkeit zu erhöhen. Die Terme "Analog", "Derivat", und "Mimetikum", die hier verwendet wurden, sind dazu vorgesehen Moleküle zu enthalten, die die chemische Struktur einer D-Peptidstruktur nachahmen und die funktionalen Eigenschaften der D-Peptidstruktur erhalten. Herangehensweisen an eine Gestaltung von Peptidanalogen, Derivaten und Mimetika sind bekannt. Siehe zum Beispiel Farmer, P.S. in Drug Design (E.J. Ariens, ed.) Academic Press, New York, 1980, Vol. 10, Seiten 119-143; Ball, J.B. und Alewood, P.F. (1990) J. Mol. Recognition 3: 55; Morgan, B.A. und Gainor, J.A. (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243; und Freidinger, R.M. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10: 270. Siehe auch Sawyer, T.K. (1995) "Peptidomimetic Design and Chemical Approaches to Peptide Metabolism" in Taylor, M.D. und Amidon, G.L. (eds.) Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Kapitel 17; Smith A.B. III et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117: 11113-11123; Smith, A.B. III et al. (1994) J. Am. CHem. Soc. 116: 9947-9962; und Hirschman, R. et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 12550-12568.
Wie hier verwendet, bezieht sich ein "Derivat" einer Zusammensetzung X (z.B. ein Peptid oder eine Aminosäure) auf eine Form von X, in der eine oder mehrere Reaktionsgruppen auf der Zusammensetzung mit einer substituierenden Gruppe derivatisiert worden sind. Beispiele von Peptidderivaten enthalten Peptide, in denen eine Aminosäure-Seitenkette, das Peptid-Rückgrat oder das Amino- oder Carboxy-Ende derivatisiert wurden (z.B. Peptidzusammensetzungen mit methylierten Amid-Verbindungen). Wie hier verwendet, bezieht sich ein "Analog" einer Zusammensetzung X auf eine Zusammensetzung, die die chemischen Strukturen von X, die für die funktionale Aktivität von X nötig sind, erhält, jedoch auch bestimmte chemische Strukturen enthält, die sich von X unterscheiden. Ein Beispiel eines Analogs eines natürlich vorkommenden Peptids ist ein Peptid, das eine oder mehrere nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren enthält. Wie hier verwendet bezieht sich ein "Mimetikum" einer Zusammensetzung X auf eine Zusammensetzung, in der chemische Strukturen von X, die für die funktionelle Aktivität von X nötig sind, gegen andere chemische Strukturen ausgetauscht worden sind, die die Konformation von X nachahmen. Beispiele für Peptid-Mimetika enthalten Peptidzusammensetzungen, in denen das Peptid-Rückgrat gegen ein oder mehrere Benzodiazepin Molekül(e) ausgetauscht ist (siehe beispielsweise James, G.L. et al. (1993) Science 260: 1937-1942).
Analoge der Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung sind dazu vorgesehen, Zusammensetzungen zu enthalten, in denen eine oder mehrere D-Aminosäuren der Peptidstruktur gegen eine homologe Aminosäure ausgetauscht sind, so dass die Eigenschaften des ursprünglichen Modulators erhalten bleiben. Ein "konservierter Aminosäure-Austausch" ist einer, bei dem der Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest ausgetauscht wird, der eine ähnliche Seitenkette aufweist. Familien von Aminosäureresten, die ähnliche Seitenketten aufweisen, wurden im Stand der Technik definiert, einschließlich basische Seitenketten (beispielsweise Lysin, Arginin, Histidin), saure Seitenketten (beispielsweise Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladene polare Seitenketten (beispielsweise Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolare Seitenketten (beispielsweise Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), β-verzweigte Seitenketten (beispielsweise Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatische Seitenketten (beispielsweise Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Nicht begrenzende Beispiele von homologen Ersetzungen, die in der Peptidstruktur der Modulatoren der vorliegenden Erfindung gemacht werden können, enthalten den Austausch von D-Phenylalanin gegen D-Tyrosin, D-Pyridylalanin oder D-Homophenylalanin, den Austausch von D-Leucin gegen D-Valin oder eine andere natürliche oder nicht-natürliche Aminosäure, die eine aliphatische Seitenkette aufweist und/oder den Austausch von D-Valin gegen D-Leucin oder eine andere natürliche oder nicht-natürliche Aminosäure, die eine aliphatische Seitenkette aufweist.
Der Term mimetisch und insbesondere peptidomimetisch, ist dazu vorgesehen, Isostere zu enthalten. Der Term "Isoster", wie er hier verwendet wird, ist dazu vorgesehen, eine chemische Struktur zu enthalten, die gegen eine zweite chemische Struktur ausgetauscht werden kann, da die sterische Konformation der ersten Struktur an eine Bindungsstelle passt, die spezifisch für die zweite Struktur ist. Der Term enthält insbesondere Peptid-Rückgrat Modifikationen (d.h. Amidbindungsmimetika), die dem Fachmann bekannt sind. Solche Modifikationen beinhalten Modifikationen des Amid-Stickstoffs, des α-Kohlenstoffs, des Amidcarbonyls, den vollständigen Austausch der Amidbindung, Verlängerungen, Deletionen oder Rückgratverbindungen. Mehrere Peptid-Rückgrat Modifikationen sind bekannt, einschließlich Ψ[CH₂S], ψ[CH₂NH], ψ[CSNH₂], Ψ[NHCO], ψ[COCH₂] und ψ[
oder (Z) CH=CH]. In der vorstehend verwendeten Nomenklatur zeigt ψ die Abwesenheit einer Amidbindung an. Die Amidgruppe-ersetzende Struktur ist in den Klammern angegeben.
Andere mögliche Modifikationen beinhalten einen N-Alkyl (oder Aryl) Austausch (ψ[CONR]) oder die Vernetzung des Rückgrats, um Lactame oder andere zyklische Strukturen zu erzeugen. Andere Derivate der Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten C-terminale Hydroxymethyl Derivate, O-modifizierte Derivate (beispielsweise ein C-terminales Hydroxymethyl-Benzylether), N-terminal modifizierte Derivate, einschließlich substituierte Amide, wie beispielsweise Alkylamide und Hydrazide und Zusammensetzungen, in denen ein C-terminaler Phenylalaninrest gegen ein Phenethylamid Analog ausgetauscht ist (beispielsweise Val-Phe-Phenethylamid als ein Analog des Tripeptids Val-Phe-Phe).
Die Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in pharmazeutische Zusammensetzungen eingegliedert werden (weiter beschrieben in Unterabschnitt V) und kann in Erfassungs- und Behandlungsverfahren genutzt werden, was in Unterabschnitt VI weiter beschrieben ist.
II: Modifizierende Gruppen
Die Modulatorzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind direkt oder indirekt an mindestens zwei modifizierende Gruppen (abgekürzt als MG) gekoppelt. Der Term "modifizierende Gruppe" ist dazu vorgesehen, Strukturen zu enthalten, die sowohl direkt an die D-Aminosäure-Peptidstruktur angebracht sind (beispielsweise durch kovalentes Koppeln), als auch solche, die indirekt an der Peptidstruktur angebracht sind (beispielsweise durch eine stabile nicht-kovalente Assoziierung oder durch kovalentes Koppeln an zusätzliche Aminosäurereste oder Mimetika, Analoge oder Derivate davon, die die von Aβ herrührende D-Aminosäure-Peptidstruktur flankieren). Beispielsweise kann die modifizierende Gruppe an das Amino-Ende und das Carboxy-Ende einer von Aβ herrührenden D-Aminosäure-Peptidstruktur gekoppelt sein oder an eine Peptid- oder peptidomimetische Region, die die Kerndomäne flankiert. Alternativ kann die modifizierende Gruppe an eine Seitenkette von mindestens einem D-Aminosäurerest einer von Aβ herrührenden Aminosäure-Peptidstruktur gekoppelt sein, oder an eine Peptid- oder Peptid-mimetische Region, die die Kerndomäne flankiert (beispielsweise durch die Epsilon-Amino-Gruppe eines Lysylrests/von Lysylresten, durch die Carboxylgruppe von Asparaginsäureresten/eines Asparaginsäurerestes oder eines Glutaminsäurerestes/von Glutaminsäureresten, durch eine Hydroxygruppe eines Tyrosylrestes/von Tyrosylresten, eines Serinrestes/von Serinresten oder eines Threoninrestes/von Threoninresten oder anderen geeigneten reaktive Gruppen auf einer Aminosäuren-Seitenkette). Modifizierende Gruppen, die kovalent an die Aminosäure-Peptidstruktur gekoppelt sind, können durch Mittel und Verfahren angebracht werden, die im Stand der Technik bekannt sind, um chemische Strukturen zu verbinden, einschließlich beispielsweise Amide, Alkylamino-, Carbamat-, Harnstoff- und Esterbindungen.
Der Term "modifizierende Gruppe" ist dazu vorgesehen, Gruppen zu enthalten, die nicht natürlich an natürliche β-Amyloid-Peptide in ihrer nativen Form gekoppelt sind. Danach ist der Term "modifizierende Gruppe" nicht dazu vorgesehen, Wasserstoff zu enthalten. Die modifizierende(n) Gruppe(n) wird so gewählt, dass die Modulatorzusammensetzung die Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden verändert und vorzugsweise inhibiert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt kommt, oder sie inhibiert die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt kommt. Obwohl sie nicht dazu vorgesehen sind durch den Mechanismus beschränkt zu werden, sind die modifizierende(n) Gruppe(n) in Modulatoren, die (eine) modifizierende Gruppe(n) umfassen, dazu gedacht, als Schlüsselpharmakophor zu funktionieren, das die Fähigkeit des Modulators verbessert, die Aβ-Polymerisation zu unterbrechen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die modifizierende(n) Gruppe(n) eine Alkylgruppe. Der Term "Alkyl", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine gerade oder verzweigte Kettenkohlenwasserstoffgruppe, die ungefähr ein bis ungefähr zehn Kohlenstoffatome aufweist. Exemplarische Alkylgruppen enthalten Methyl, Ethyl, Dimethyl, Diethyl, N-Propyl, Isopropyl, N-Butyl, Isobutyl, Sec-Butyl, Tert-Butyl, N-Pentyl und N-Hexyl. Eine Alkylgruppe kann unsubstituiert sein oder kann an einer oder mehreren Positionen beispielsweise gegen Halogene, Alkyle, Cycloalkyle, Alkenyle, Alkynyle, Aryle, Heterocyclen, Hydroxyle, Aminos, Nitrone, Thiole, Amine, Imine, Amide, Phosphonate, Phosphine, Carbonyle, Carboxyle, Silyle, Ether, Thioether, Sulfonyle, Selenoether, Ketone, Aldehyde, Ester, -CF₃, -CN oder ähnliche substituiert sein.
In einer weiteren Ausführungsform ist die modifizierende Gruppe, beispielsweise eine Alkylgruppe, an eine weitere modifizierende Gruppe gekoppelt. In noch einer weiteren Ausführungsform ist eine D-Aminosäure in einer Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung mit zwei modifizierenden Gruppen modifiziert. Danach enthalten bevorzugte modifizierende Gruppen eine 1-Piperidin Acetylgruppe.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die modifizierende(n) Gruppe(n) eine zyklische, heterozyklische, polyzyklische oder verzweigte Alkylgruppe. Der Term "zyklische Gruppe", wie er hier verwendet wird, ist dazu vorgesehen, zyklische gesättigte und ungesättigte (d.h. aromatische) Gruppen zu enthalten, die ungefähr 3 bis 10, vorzugsweise 4 bis 8 und mehr bevorzugt 5 bis 7 Kohlenstoffatome aufweisen. Exemplarische zyklische Gruppen enthalten Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cyclooctyl. Zyklische Gruppen können unsubstituiert oder an einer oder mehreren Ringpositionen substituiert sein. Folglich kann eine zyklische Gruppe mit beispielsweise Halogenen, Alkylen, Cycloalkylen, Alkenylen, Alkynylen, Arylen, Heterocyclen, Hydroxylen, Aminos, Nitrone, Thiolaminen, Iminen, Amiden, Phosphonaten, Phosphinen, Carbonylen, Carboxylen, Silylen, Ethern, Thioethern, Sulfonylen, Sulfonaten, Selenoethern, Ketonen, Aldehyden, Estern, -CF₃, -CN oder ähnlichen substituiert sein.
Der Term "heterozyklische Gruppe" ist dazu vorgesehen, zyklische gesättigte und ungesättigte (d.h. aromatische) Gruppen zu enthalten, die ungefähr 3 bis 10, vorzugsweise 4 bis 8 und mehr bevorzugt 5 bis 7 Kohlenstoffatome aufweisen, wobei die Ringstruktur ungefähr ein bis vier Heteroatome enthält. Heterozyklische Gruppen enthalten Pyrrolidine, Oxolane, Thiolane, Imidazole, Oxazole, Piperidine, Piperazine, Morpholine und Pyridine.
Der heterozyklische Ring kann an einer oder mehreren Positionen mit Substituenten wie beispielsweise Halogenen, Alkylen, Cycloalkylen, Alkenylen, Alkynylen, Arylen, anderen Heterocyclen, Hydroxyl, Amino, Nitro, Thiol, Iminen, Amiden, Phosphonaten, Phosphinen, Carbonylen, Carboxylen, Silylen, Ethern, Thioethern, Sulfonylen, Selenoethern, Ketonen, Aldehyden, Estern, -CF₃, -CN oder ähnlichen substituiert sein. Heterozyklen können, wie unten beschrieben, auch mit anderen zyklischen Gruppen verbunden oder fusioniert sein.
Der Term "polyzyklische Gruppe", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf zwei oder mehrere gesättigte oder ungesättigte (d.h. aromatische) zyklische Ringe, in denen zwei oder mehrere Kohlenstoffe gewöhnlich für zwei angrenzende Ringe sind, beispielsweise sind die Ringe "fusionierte Ringe". Ringe, die durch nicht-angrenzende Atome vereinigt sind, werden "überbrückte" (bridged) Ringe genannt. Jeder der Ringe der polyzyklischen Gruppe kann mit solchen Substituenten, die vorstehend beschrieben sind, substituiert werden, wie beispielsweise durch Halogene, Alkyle, Cycloalkyle, Alkenyle, Alkynyle, Hydroxyle, Amino, Nitrone, Thiole, Amine, Imine, Amide, Phosphonate, Phosphine, Carbonyle, Carboxyle, Silyle, Ether, Thioether, Sulfonyle, Selenoether, Ketone, Aldehyde, Ester, -CF₃, -CN oder ähnlichen.
Eine bevorzugte polyzyklische Gruppe ist eine Gruppe, die eine cis-Dekalin-Struktur enthält. Obwohl sie nicht dazu vorgesehen ist, durch den Mechanismus beschränkt zu werden, ist die "gekrümmte" (bent) Konformation, die auf eine modifizierende Gruppe durch die Anwesenheit einer cis-Dekalin-Struktur übertragen ist, dazu gedacht, zu der Wirksamkeit der modifizierende Gruppe beizutragen, die die Aβ-Polymerisation unterbricht. Danach können auch andere Strukturen, die die "gekrümmte" Struktur der cis-Dekalin-Struktur nachahmen, als modifizierende Gruppe genutzt werden. Ein Beispiel einer cis-Dekalin enthaltenden Struktur, die als modifizierende Gruppe genutzt werden kann, ist eine Cholanoyl Struktur, wie beispielsweise eine Cholylgruppe. Zum Beispiel kann ein Modulator an seinem Amino-Ende mit einer Cholylgruppe durch das Erzeugen einer Reaktion der Aggregations-Kerndomäne mit Cholsäure, einer Gallensäure, modifiziert werden. Außerdem kann ein Modulator an seinem Carboxy-Ende mit einer Cholylgruppe nach Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, modifiziert werden (siehe beispielsweise Wess, G. et al. (1993) Tetrahedron Letters, 34: 817-822; Wess, G. et al. (1992) Tetrahedron Letters 33: 195-198; und Kramer, W. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 18598-18604). Cholyl-Derivate und -Analoge können auch als modifizierende Gruppe genutzt werden. Zum Beispiel ist Aic (3-(O-Aminoethyl-iso)-Cholyl) ein bevorzugtes Cholyl-Derivat, das eine freie Aminogruppe aufweist, die für die weitere Modifizierung der Modulatorzusammensetzung genutzt werden kann (beispielsweise kann eine Chelatbildungsgruppe für ^99mTc durch die freie Aminogruppe von Aic eingeführt werden). Der Term "Cholanoyl Struktur", wie er hier verwendet wird, ist dazu gedacht, die Cholylgruppe und Derivate und Analoge davon zu enthalten, insbesondere solche, die eine Vier-Ring cis-Dekalin-Konfiguration bewahren. Beispiele von Cholanoyl Strukturen beinhalten Gruppen, die von Gallensäuren herrühren, wie beispielsweise Desoxycholsäure, Lithocholsäure, Ursodesoxycholsäure, Chenodesoxycholsäure und Hyodesoxycholsäure, sowie andere verwandte Strukturen wie beispielsweise Cholansäure, Bufalin und Resibufogenin (obwohl die letzten beiden Zusammensetzungen für die Verwendung als modifizierende Gruppe nicht bevorzugt werden). Ein weiteres Beispiel einer cis-Dekalin enthaltenen Zusammensetzung ist 5β-Cholestan-3α-ol (das cis-Dekalin-Isomer von (+)-Dihydrocholesterol). Für eine weitere Beschreibung der Gallensäure und der Steroidstruktur und Nomenklatur siehe Nes, W.R. und McKean, M.L. Biochemistry of Steroids and Other Isopentanoids, University Park Press, Baltimore, MD, Kapitel 2.
Zusätzlich zu den cis-Dekalin enthaltenen Gruppen können andere Gruppen als modifizierende Gruppen genutzt werden. Beispielsweise sind modifizierende Gruppen, die aus Steroiden oder β-Lactamen herrühren, geeignete modifizierende Gruppen. In einer Ausführungsform ist die modifizierende Gruppe eine "Biotinyl-Struktur", die Biotinylgruppen und Analoge und Derivate davon enthält (wie beispielsweise eine 2-Iminobiotinylgruppe). In einer weiteren Ausführungsform kann die modifizierende Gruppe eine "Fluorescein-enthaltene Gruppe" umfassen, solch eine Gruppe rührt von der Reaktion einer Aβ-herrührenden Peptidstruktur mit 5-(und 6-)-Carboxyfluorescein, Succinimidylester oder Fluorescein-Isothiocyanat her. In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann die modifizierende(n) Gruppe(n) eine N-Acetylneuraminylgruppe, eine trans-4-Cotinincarboxylgruppe, eine 2-Imino-1-Imidazolidinacetylgruppe, eine (S)-(–)-Indolin-2-Carboxylgruppe, eine (–)-Menthoxyacetylgruppe, eine 2-Norbornanacetylgruppe, ein γ-Oxo-5-Acenaphthenbutyryl, eine (–)-2-Oxo-4-Thiazolidincarboxylgruppe, eine Tetrahydro-3-Furoylgruppe, eine 2-Iminobiotinylgruppe, eine Diethylentriaminpentaacetylgruppe, eine 4-Morpholincarbonylgruppe, eine 2-Thiophenacetylgruppe oder eine 2-Thiophensulfonylgruppe umfassen.
Zusätzlich zu den zyklischen, heterozyklischen und polyzyklischen Gruppen, die vorstehend beschrieben wurden, können andere Arten von modifizierenden Gruppen in einem Modulator der vorliegenden Erfindung genutzt werden. Beispielsweise können hydrophobe Gruppen und verzweigte Alkylgruppen geeignete modifizierende Gruppen sein.
Beispiele beinhalten Actylgruppen, Phenylacetylgruppen, Diphenylacetylgruppen, Triphenylacetylgruppen, Isobutanylgruppen, 4-Methylvalerylgruppen, trans-Cinnamylgruppen, Butanylgruppen und 1-Adamantancarbonylgruppen.
Noch eine weitere modifizierende Gruppe ist eine Zusammensetzung, die eine nicht-natürliche Aminosäure enthält, die als β-Drehungs-Mimetikum agiert, wie beispielsweise eine Aminosäure, die auf Dibenzofuran basiert, beschrieben in Tsang, K.Y. et al. (1994) J.
Am. Chem. Soc. 116: 3988-4005; Diaz, H. und Kelly, J.W. (1991) Tetrahedron Letters 41: 5725-5728; und Diaz, H. et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 8316-8318. Ein Beispiel einer solchen modifizierenden Gruppe ist eine peptid-Aminoethyldibenzofuranyl-Proprionsäure (Adp) Gruppe (z.B. DDIIL-Adp) (Seq. ID Nr.: 31). Diese Art einer modifizierenden Gruppe kann ferner eine oder mehrere N-Methyl-Peptid Bindungen umfassen, um der Aggregation des natürlichen β-APs zusätzliche sterische Hindernisse zu geben, wenn Zusammensetzungen dieser Art mit natürlichen β-APs Wechselwirken.
Noch eine weitere modifizierende Gruppe ist eine NH-OR Gruppe, worin das R eine der hier beschriebenen modifizierten oder unmodifizierten Alkyl- oder Cycloalkylgruppen sein kann.

Nicht einschränkende Beispiele geeigneter modifizierender Gruppen mit ihren entsprechenden modifizierenden Reagenzien sind im Folgenden aufgeführt:

Modifizierende Gruppe	Modifizierendes Reagenz
Methyl-	Methylamin, Fmoc-D-[Me]-Leu-OH, Metrhylamin und ein Bromacetylpeptid
Ethyl-	Ethylamin, Acetaldehyd und Natrium-Cyanoborhydrid, Ethylamin und ein Bromacetylpeptid
Propyl-	Propylamin, Proprionaldehyd und Natrium-Cyanoborhydrid, Propylamin und ein Bromacetylpeptid

Isopropyl-	Isopropylamin, Isopropylamin und ein Bromacetylpeptid
Piperidin-	Piperidin und ein Bromacetylpeptid
Acetyl-	Essigsäureanhydrid, Essigsäure
Dimethyl-	Methylamin, Formaldehyd und Natrium-Cyanoborhydrid
Diethyl-	Acetaldehyd und Natrium-Cyanoborhydrid
Cholyl-	Cholsäure
Lithocholyl-	Lithocholsäure
Hyodesoxycholyl	Hyodesoxycholylsäure
Chenodesoxycholyl-	Chenodesoxycholylsäure
Ursodesoxycholyl-	Ursodesoxycholylsäure
3-Hydroxycinnamyl-	3-Hydroxycinnamylsäure
4-Hydroxycinnamyl-	4-Hydroxycinnamylsäure
2-Hydroxycinnamyl-	2-Hydroxycinnamylsäure
3-Hydroxy-4-Methoxycinnamyl-	3-Hydroxy-4-Methoxycinnamylsäure
4-Hydroxy-3-Methoxycinnamyl	4-Hydroxy-3-Methoxycinnamylsäure
2-Carboxycinnamyl-	2-Carboxycinnamylsäure
3-Formylbenzoyl	3-Carboxybenzaldehyd
4-Formylbenzoyl	4-Carboxybenzaldehyd
3,4,-Dihydroxyhydrocinnamyl-	3,4,-Dihydroxyhydrocinnamylsäure
3,7-Dihydroxy-2-Naphtoyl-	3,7-Dihydroxy-2-Naphtensäure
4-Formylcinnamyl-	4-Formylcinnamylsäure
2-Formylphenoxyacetyl-	2-Formylphenoxyacetylsäure
8-Formyl-1-Naphtoyl	1,8-Naphtaldehydsäure
4-(Hydroxymethyl)Benzoyl-	4-(Hydroxymethyl)Benzoylsäure
4-Hydroxyphenylacetyl-	4-Hydroxyphenylacetylsäure
3-Hydroxybenzoyl-	3-Hydroxybenzoylsäure
4-Hydroxybenzoyl-	4-Hydroxybenzoylsäure
5-Hydanoinacetyl-	5-Hydanoinacetylsäure
L-Hydroorotyl-	L-Hydroorotylsäure
4-Methylvaleryl-	4-Methylvalerylsäure

2,4-Dihydroxybenzoyl-	2,4-Dihydroxybenzoylsäure
3,4-Dihydroxycinnamyl-	3,4-Dihydroxycinnamylsäure
3,5-Dihydroxy-2-Naphtoyl-	3,5-Dihydroxy-2-Naphtoylsäure
3-Benzoylpropanoyl-	3-Benzoylpropanoylsäure
trans-Cinnamyl-	trans-Cinnamylsäure
Phenylacetyl-	Phenylacetylsäure
Diphenylacetyl-	Diphenylacetylsäure
Triphenylacetyl-	Triphenylacetylsäure
2-Hydroxyphenylacetyl-	2-Hydroxyphenylessigsäure
3-Hydroxyphenylacetyl-	3-Hydroxyphenylessigsäure
4-Hydroxyphenylacetyl-	4-Hydroxyphenylessigsäure
(±)-Mandelyl-	(±)-Mandelsäure
(±)-2.4-Dihydroxy-3,3-Di- methylbutanoyl	(±)-Pantolacton
Butanoyl-	Buttersäureanhydrid
Isobutanoyl-	Isobutansäureanhydrid
Hexanoyl-	Hexansäureanhydrid
Proprionyl-	Proprionsäureanhydrid
3-Hydroxybutyroyl	β-Butyrolacton
4-Hydroxybutyroyl	γ-Butyrolacton
3-Hydroxyproprionoyl	β-Propriolacton
2,4-Dihydroxybutyroyl	α-Hydroxy-β-Butyrolacton
1-Adamantancarbonyl-	1-Adamantancarbonsäure
Glykolyl-	Glykolsäure
DL-3-(4-Hydroxyphenyl)Laktyl-	DL-3-(4-Hydroxyphenyl)-Milchsäure
3-(2-Hydroxyphenyl)Proprionyl-	3-(2-Hydroxyphenyl)Propriosäure
4-(2-Hydroxyphenyl)Proprionyl-	4-(2-Hydroxyphenyl)Propriosäure
D-3-Phenyllaktyl-	D-3-Phenylmilchsäure
Hydrocinnamyl-	Hydrocinnamylsäure
3-(4-Hydroxyphenyl)Proprionyl-	3-(4-Hydroxyphenyl)Proprionsäure

L-3-Phenyllaktyl-	L-3-Phenylmilchsäure
4-Methylvaleryl	4-Methylvaleriansäure
3-Pyridylacetyl	3-Pyridylacetylsäure
4-Pyridylacetyl Isonicotinyl	4-Pyridylacetylsäure
4-Chinolincarboxyl	4-Chinolincarboxylsäure
1-Isochinolincarboxyl	1-Isochinolincarboxylsäure
3-Isochinolincarboxyl	3-Isochinolincarboxylsäure

Bevorzugte modifizierende Gruppen enthalten Methyl-Enthaltende Gruppen, Ethyl-Enthaltende Gruppen, Propyl-Enthaltende Gruppen und Piperidin-Enthaltende Gruppen, beispielsweise eine Piperidinacetyl-Gruppe.
III. Zusätzliche chemische Modifikationen von Aβ-Modulatoren
Eine β-Amyloid Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann weiter modifiziert werden, um die spezifischen Eigenschaften der Zusammensetzung zu verändern, während die Fähigkeit der Zusammensetzung erhalten bleibt, die Aβ-Aggregation zu verändern und die Aβ-Neurotoxizität zu inhibieren. Beispielsweise ist eine Ausführungsform der Zusammensetzung weiter modifiziert, um eine pharmakokinetische Eigenschaft der Zusammensetzung zu verändern, wie beispielsweise die in vivo Stabilität oder die Halbwertzeit. In einer weiteren Ausführungsform ist die Zusammensetzung weiter modifiziert, um die Zusammensetzung mit einer erfassbaren Substanz zu markieren. In noch einer weiteren Ausführungsform ist die Zusammensetzung weiter modifiziert, um die Zusammensetzung an einen zusätzlichen therapeutischen Rest zu koppeln. Schematisch kann ein Modulator der vorliegenden Erfindung, der eine D-Aminosäure-Aβ-Aggregationsdomäne umfasst, die direkt oder indirekt an mindestens eine modifizierende Gruppe gekoppelt ist, als MG-ACD dargestellt werden, wohingegen diese Zusammensetzung, die weiter modifiziert wurde, um die Eigenschaften des Modulators zu verändern, als MG-ACD-CM dargestellt werden kann, bei der CM eine zusätzliche chemische Modifikation repräsentiert.
Um die Zusammensetzung weiter chemisch zu modifizieren, beispielsweise um die pharmakokinetischen Eigenschaften der Zusammensetzung zu verändern, können reaktive Gruppen derivatisiert werden. Wenn die modifizierende Gruppe beispielsweise an das Amino-terminale Ende der Aggregations-Kerndomäne angefügt ist, kann das Carboxyterminale Ende weiter modifiziert werden. Bevorzugte C-terminale Modifikationen beinhalten solche, die die Fähigkeit der Zusammensetzung reduzieren als Substrat für Carboxypeptidasen zu agieren. Beispiele für bevorzugte C-terminale Modifizierer enthalten eine Amidgruppe (d.h. ein Peptidamid). Alternativ kann das Amino-terminale Ende weiter modifiziert werden, wenn die modifizierende Gruppe an das C-terminale Ende angefügt ist, beispielsweise um die Fähigkeit der Zusammensetzung zu reduzieren, als Substrat für Aminopeptidasen zu agieren.
Eine Modulatorzusammensetzung kann weiter modifiziert werden, um die Zusammensetzung durch das Reagieren der Zusammensetzung mit einer erfassbaren Substanz zu markieren. Geeignete erfassbare Substanzen beinhalten verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszente Materialien, lumineszente Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele von geeigneten Enzymen beinhalten die Meerrettich-Peroxidase, Alkaline-Phosphatase, β-Galaktosidase oder Acetylcholinesterase. Beispiele von geeigneten prosthetischen Gruppen-Komplexen beinhalten Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin. Beispiele von geeigneten fluoreszenten Materialien beinhalten Umbelliferon, Fluorescein, Fluorescein Isothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylamin Fluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin. Beispiele von geeigneten radioaktiven Materialien beinhalten ¹⁴C, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ^99mTc, ³⁵S oder ³H. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Modulatorzusammensetzung radioaktiv mit ¹⁴C markiert, entweder durch die Aufnahme von ¹⁴C in die modifizierende Gruppe oder in eine oder mehrere Aminosäurestrukturen in der Modulatorzusammensetzung. Markierte Modulatorzusammensetzungen können zur Bemessung der in vivo Pharmakokinetiken der Zusammensetzung dienen, sowie zum Erfassen von Aβ-Aggregationen, beispielsweise für diagnostische Zwecke. Aβ-Aggregationen können durch die Verwendung einer markierten Modulatorzusammensetzung entweder in vivo oder in einer in vitro Probe eines Individuums erfasst werden.
Vorzugsweise ist eine Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung für die Anwendung als ein in vivo Diagnostikmittel mit radioaktivem Technetium oder Iod markiert. Dementsprechend stellt die Erfindung in einer Ausführungsform eine Modulatorzusammensetzung bereit, die mit Technetium markiert ist, vorzugsweise mit ^99mTc. Verfahren zur Markierung von Peptidzusammensetzungen mit Technetium sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise U.S. Patent Nummern: 5,443,815 , 5,225,180 und 5,405,597 , alle von Dean et al.; Stepniak-Biniakiewicz, D., et al. (1992) J. Med. Chem. 35: 274-279; Fritzberg, A.R., et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4025-4029; Baidoo, K.E., et al. (1990) Cancer Res. Supl. 50: 799s-803s; und Regan, L. und Smith, C.K. (1995) Science 270: 980-982). Es kann eine modifizierende Gruppe gewählt werden, die eine Stelle bereitstellt, an der eine Chelatgruppe für ^99mTc eingefügt werden kann, so wie das Aic Derivat von Cholsäure, das eine freie Aminogruppe aufweist. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine Modulatorzusammensetzung bereit, die mit radioaktivem Iod markiert ist. Beispielsweise kann ein Phenylalaninrest in der Aβ-Sequenz (wie beispielsweise Phe₁₉ oder Phe₂₀) mit radioaktivem Iodtyrosyl substituiert werden. Jedes der verschiedenen Isotope von radioaktivem Iod kann eingefügt werden, um ein diagnostisches Mittel zu erstellen. Vorzugsweise wird ¹²³I (Halbwertzeit = 13,2 Stunden) für die Ganzkörper-Zintigrafie verwendet, ¹²⁴I (Halbwertzeit = 4 Tage) für die Positronen-Emissions-Tomografie (PET), ¹²⁵I (Halbwertzeit = 60 Tage) für metabolische Umsatzstudien und ¹³¹I (Halbwertzeit = 8 Tage) für die Ganzkörper-Zählung und für verzögerte Studien mit niedriger Bildauflösung (delayed low resolution imaging studies).
Weiterhin kann eine zusätzliche Modifikation einer Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung dazu dienen, eine zusätzliche therapeutische Eigenschaft auf die Zusammensetzung zu übertragen. Das bedeutet, dass die zusätzliche chemische Modifikation einen zusätzlichen funktionalen Rest umfasst. Zum Beispiel kann ein funktionaler Rest, der dazu dient, Amyloid-Plaques zu zerbrechen oder zu lösen, an die Modulatorzusammensetzung gekoppelt werden. In dieser Form dient der MG-ACD Teil des Modulators dazu, die Zusammensetzung an die Aβ-Peptide zu bringen und die Polymerisation der Aβ-Peptide zu unterbrechen, wohingegen der zusätzliche funktionale Rest dem Zerstören oder Lösen der Amyloid-Plaques dient, nachdem die Zusammensetzung an diese Stelle gebracht wurde.
In einer alternativen chemischen Modifikation ist eine β-Amyloid Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung als ein "Pro-Pharmakon" (prodrug) hergestellt, worin die Zusammensetzung nicht selbst die Aβ-Aggregation moduliert, sondern eher in der Lage ist, bei der Verstoffwechselung in vivo in eine β-Amyloid Modulatorzusammensetzung umgewandelt zu werden, wie sie hier beschrieben wird. Beispielsweise kann in dieser Art der Zusammensetzung die modulierende Gruppe in einer Pro-Pharmakon-Form vorliegen, die in der Lage ist, bei der Verstoffwechselung in die Form einer aktiven modulierenden Gruppe umgewandelt zu werden. Solch eine Pro-Pharmakon-Form einer modifizierenden Gruppe wird hier als "zweite modifizierende Gruppe" bezeichnet. Verschiedene Strategien zur Herstellung von Peptid-Pro-Pharmakonen, die den Stoffwechsel begrenzen um eine Zuführung der aktiven Form des Peptid-Basierenden Medikaments zu verbessern, sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise Moss, J. (1995) in Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Taylor, M.D. und Amidon, G.L. (eds.), Kapitel 18. Zusätzliche Strategien wurden spezifisch so zugeschnitten, dass eine ZNS-Zuführung, die auf einem "sequenziellen Stoffwechsel" basiert, erreicht wird (siehe beispielsweise Bodor, N., et al. (1992) Science 275: 1698-1700; Prokai, L., et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 2643-2644; Bodor, N. und Prokai, L. (1995) in Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Taylor, M.D. und Amidon, G.L. (eds.), Kapitel 14. In einer Ausführungsform eines Pro-Pharmakons eines Modulators der vorliegenden Erfindung umfasst die modifizierende Gruppe einen Alkylester, um die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen.
Modulatorzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch Standardtechniken hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Die Peptid-Zusammensetzung eines Modulators kann durch die Verwendung von Standardtechniken synthetisiert werden, wie beispielsweise solche, die in Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) und in Grant, G.A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman and Company, New York (1992) beschrieben sind. Automatisierte Peptid-Synthese-Geräte sind kommerziell erhältlich (beispielsweise Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). Zusätzlich kann eine oder mehrere Gruppen an die von Aβ-herrührende Peptid-Zusammensetzung durch Standardverfahren angebracht werden, beispielsweise durch die Verwendung von Verfahren für eine Reaktion durch eine Aminogruppe (beispielsweise die α-Aminogruppe an dem Amino-Ende eines Peptids), eine Carboxylgruppe (beispielsweise an dem Carboxy-Ende eines Peptids), eine Hydroxylgruppe (beispielsweise auf einem Tyrosin-, Serin- oder Threoninrest) oder eine andere geeignete Gruppe auf einer Aminosäure-Seitenkette (siehe beispielsweise Greene, T.W. und Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Inc., New York (1991). Exemplarische Synthesen von D-Aminosäuren-β-Amyloid-Modulatoren sind weiter in Beispiel 1 beschrieben.
IV. Selektions-Assays
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Auswahl eines Modulators der β-Amyloid-Aggregation bereitzustellen. In dem Verfahren wird eine Testzusammensetzung mit natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht, die Aggregation des natürlichen β-APs wird ermittelt und ein Modulator wird aufgrund der Fähigkeit der Testzusammensetzung die Aggregation des natürlichen β-APs zu verändern (beispielsweise die Aggregation zu verhindern oder zu fördern) ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Testzusammensetzung mit einem molaren Überschuss des natürlichen β-APs in Kontakt gebracht. Die Menge und/oder die Rate der natürlichen β-AP-Aggregation in Gegenwart der Testzusammensetzung kann durch einen geeigneten Assay, wie hier beschrieben (siehe beispielsweise Beispiel 2), bestimmt werden.
In einem bevorzugten Assay ist das natürliche β-AP in Gegenwart einer Testzusammensetzung in einer Lösung gelöst und die Aggregation des natürlichen β-APs wird in einem Keimbildungs-Assay (siehe Beispiel 2) ermittelt, indem die Trübung der Lösung über die Zeit ermittelt wird, was durch die apparente Absorption der Lösung bei 405 nm gemessen wird (weiter beschrieben in Beispiel 2, siehe auch Jarrett et al. (1993) Biochemistry 32: 4693-4697). Während der Verzögerungszeit, in der das β-AP in Lösung bleibt, bleibt die Absorption A_405nm der Lösung in Abwesenheit eines β-Amyloid-Modulators gewöhnlich relativ konstant, aber sobald das β-AP aggregiert und ausfallt, erhöht sich die A_405nm der Lösung schnell, bis sie letztendlich ein Plateaulevel erreicht (d.h. die A_405nm der Lösung zeigt eine sigmoidal verlaufende Kinetik über der Zeit). Im Gegensatz dazu wird die A_405nm der Lösung in Gegenwart einer Testzusammensetzung, die die β-AP-Aggregation verhindert, reduziert, verglichen mit dem Fall, in dem der Modulator abwesend ist. Daher kann die Lösung in Gegenwart eines inhibitorischen Modulators eine erhöhte Verzögerungszeit, einen erniedrigten Anstieg der Aggregation und/oder ein niedrigeres Plateaulevel aufweisen, verglichen mit dem Fall, in dem der Modulator fehlt. Dieses Verfahren zur Selektion eines Modulators der β-Amyloid-Polymerisation kann genauso zur Auswahl von Modulatoren dienen, die die β-Amyloid-Polymerisation fördern. Folglich ist die A_405nm der Lösung in Gegenwart eines Modulators, der die β-Amyloid-Aggregation fördert, erhöht, verglichen mit dem Fall, in dem der Modulator fehlt (beispielsweise weist die Lösung eine kürzere Verzögerungszeit, einen erhöhten Anstieg der Aggregation und/oder ein höheres Plateaulevel auf, verglichen mit dem Fall, in dem der Modulator abwesend ist).
Ein weiterer Assay, der für die Anwendung im Selektionsverfahren der Erfindung geeignet ist, ist ein gekeimter bzw. platzierter Extensionsassay, der weiter in Beispiel 2 beschrieben wird. In diesem Assay sind ein β-AP-Monomer und ein aggregierter β-AP-"Keim" miteinander in Gegenwart und Abwesenheit einer Testzusammensetzung kombiniert, und die Menge der β-Fibrillenbildung wird basierend auf der verbesserten Emission des Farbstoffs Thioflavin T untersucht, wenn er mit den β-Fibrillen in Kontakt kommt. Außerdem kann die β-AP-Aggregation durch Elektronenmikroskopie (EM) der β-AP-Präparate in Gegenwart oder Abwesenheit des Modulators festgestellt werden. Beispielsweise ist die β-Amyloid-Fibrillenbildung, die durch EM erfassbar ist, in Gegenwart eines Modulators, der die β-AP-Aggregation inhibiert, reduziert (d.h. es gibt eine geringere Menge oder Anzahl an β-Fibrillen in Gegenwart des Modulators), wohingegen die β-Fibrillenbildung in Gegenwart eines Modulators, der die β-AP-Aggregation fördert, erhöht ist (d.h. es gibt eine größere Menge oder Anzahl an β-Fibrillen in Gegenwart des Modulators).
Ein weiterer bevorzugter Assay für die Anwendung im Selektionsverfahren der Erfindung geeignete Modulatoren zu finden, ist der Neurotoxizitäts-Assay, der in Beispiel 3 beschrieben wird. Hier werden Zusammensetzungen, die die Bildung von neurotoxischen Aβ-Aggregaten inhibieren und/oder die Neurotoxizität inhibieren, die von Aβ-Fibrillen ausgeht, ausgewählt. Dieser Neurotoxizitäts-Assay soll die Neurotoxizität in vivo voraussagen. Demnach lässt sich aus der inhibitorischen Aktivität einer Modulatorzusammensetzung in dem in vitro Neurotoxizitäts-Assay auf eine ähnliche inhibitorische Aktivität der Zusammensetzung auf die Neurotoxizität in vivo schließen.
V. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, pharmazeutische Zusammensetzungen der β-Amyloid-Modulatorzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. In einer Ausführungsform enthält die Zusammensetzung eine β-Amyloid-Modulatorzusammensetzung in einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge, die ausreicht, um die Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide zu verändern und vorzugsweise zu inhibieren, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. In einer weiteren Ausführungsform enthält die Zusammensetzung eine β-Amyloid-Modulatorzusammensetzung in einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge, die ausreicht, um die Neurotoxizität der natürlichen β-Amyloid-Peptide zu inhibieren, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Eine "therapeutisch wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge, die wirksam genug ist, bei nötigen Dosierungen und Zeitabschnitten das gewünschte therapeutische Ergebnis zu erreichen, wie beispielsweise Reduktion oder Umkehr der β-Amyloid-Ablagerungen und/oder Reduktion oder Umkehr der Aβ-Neurotoxizität. Eine therapeutisch wirksame Menge eines Modulators kann abhängig von Faktoren wie beispielsweise dem Stadium der Erkrankung, Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums und die Fähigkeit des Modulators, eine erwünschte Reaktion in dem Individuum hervorzurufen, variieren. Dosierungsreglementierungen können angepasst werden, um die optimale therapeutische Wirkung bereitzustellen. Eine therapeutisch wirksame Menge ist auch eine, bei der der therapeutische Nutzen jeglichen giftigen oder schädlichen Effekten des Modulators überwiegt. Die potenzielle Neurotoxizität des Modulators der vorliegenden Erfindung kann durch Verwenden des Zell-basierten Assays aus Beispiel 6 untersucht werden und es kann ein therapeutisch wirksamer Modulator gewählt werden, der keine bedeutende Neurotoxizität aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine therapeutisch wirksame Menge des Modulators ausreichend, um die Aggregation eines molaren Überschusses von β-Amyloid-Peptiden zu verändern und vorzugsweise zu inhibieren. Eine "prophylaktisch wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge, die wirksam genug ist, bei nötigen Dosierungen und Zeitabschnitten das gewünschte prophylaktische Ergebnis zu erreichen, wie beispielsweise Verhindern oder Inhibition der Rate der β-Amyloid-Ablagerungen und/oder der Aβ-Neurotoxizität in einem Individuum, das empfänglich für die β-Amyloid-Ablagerung ist. Eine prophylaktisch wirksame Menge kann wie die therapeutisch wirksame Menge bestimmt werden. Gewöhnlich ist die prophylaktisch wirksame Menge geringer als die therapeutisch wirksame Menge, da die prophylaktische Dosis bei Individuen angewandt wird, bei denen die Erkrankung noch nicht ausgebrochen ist oder sich in einem frühen Stadium befindet.
Ein Faktor der beachtet werden muss, wenn eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines β-Amyloid-Modulators bestimmt werden soll, ist die Konzentration der natürlichen β-APs in einem biologischen Teilbereich (compartment) des Individuums, wie beispielsweise in der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) des Individuums. Die Konzentration des natürlichen β-APs in der CSF wurde auf 3 nM geschätzt (Schwartzman, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8368-8372). Ein nicht einschränkender Bereich für eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines β-Amyloid-Modulators ist 0,01 nM-10 nM. Es soll darauf hingewiesen werden, dass die Dosierungswerte sich mit der Schwere des Zustands der gelindert werden soll, verändern. Es soll weiter darauf hingewiesen werden, dass für jedes bestimmte Individuum die Dosierungsreglementierungen über die Zeit angepasst werden sollen, entsprechend den individuellen Bedürfnissen und der professionellen Einschätzung der Person, die die Zusammensetzung verabreicht oder die Verabreichung beaufsichtigt, und dass die hier angegebenen Dosierungsreichweiten nur exemplarisch sind und nicht dazu gedacht sind, den Bereich oder die Anwendung der beanspruchten Zusammensetzung einzuschränken.
Die Menge der aktiven Bestandteile in der Zusammensetzung kann abhängig von Faktoren wie beispielsweise Erkrankungsstadium, Alter, Geschlecht und Gewicht eines Individuums variieren, von denen jeder die Menge von natürlichem β-AP in dem Individuum beeinflussen kann. Dosierungsreglementierungen können angepasst werden, um die optimale therapeutische Wirkung bereitzustellen. Beispielsweise kann ein einzelner Bolus verabreicht werden, verschiedene unterteilte Dosen können über einen Zeitverlauf verabreicht werden oder die Dosis kann proportional entsprechend den Erfordernissen der therapeutischen Situation reduziert oder erhöht werden. Es ist zwecks erleichterter Aufnahme und Einheitlichkeit der Dosierung besonders vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in Dosierungseinheitsformen zu formulieren. Wie hier verwendet bezieht sich Dosierungseinheitsform auf physikalisch getrennte Einheiten, die als einzelne Dosierungen für die Behandlung eines Säugetierindividuums geeignet sind. Jede Einheit enthält eine vorbestimmte Menge einer aktiven Zusammensetzung, die berechnet wurde, um den erwünschten therapeutischen Effekt in Verbindung mit dem pharmazeutischen Träger zu ergeben. Die Spezifizierungen für die Dosierungseinheitsform der vorliegenden Erfindung hängen ab von und werden festgelegt durch (a) die universelle Charakteristik der aktiven Zusammensetzung und den besonderen therapeutischen Effekt, der erzielt werden soll und (b) die Begrenzungen, die für die Art und Weise der Zusammensetzung einer solchen aktiven Zusammensetzung zur Behandlung der Empfänglichkeit in Individuen inhärent sind.
Wie hier verwendet beinhaltet "pharmazeutisch akzeptabler Träger" jegliche und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und fungizide Mittel, isotonische und Absorptions-Verzögernde Mittel und ähnliche, die physiologisch kompatibel sind. In einer Ausführungsform ist der Träger für die parenterale Verabreichung geeignet. Vorzugsweise ist der Träger für die Verabreichung in das Zentrale Nervensystem geeignet (beispielsweise intraspinal oder intracerebral). Alternativ kann der Träger für die intravenöse, intraperitoneale oder intramuskuläre Verabreichung geeignet. In einer weiteren Ausführungsform ist der Träger für die orale Verabreichung geeignet. Pharmazeutisch akzeptable Träger enthalten sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die improvisierte Vorbereitung einer sterilen injizierbaren Lösung oder Dispersion. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik bekannt. Außer jedem herkömmliche Medium oder Mittel, dass mit der aktiven Zusammensetzung inkompatibel ist und dessen Anwendung in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung erwägt wird. Ergänzende aktive Zusammensetzungen können in die Zusammensetzungen auch eingebracht werden.
Therapeutische Zusammensetzungen müssen typischerweise steril und stabil unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen sein. Die Zusammensetzung kann als Lösung, Mikroemulsion, Liposom oder andere geordnete Struktur, die geeignet für eine hohe Medikamentenkonzentration ist, formuliert sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, einschließlich beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und ähnliche) und geeignete Gemische davon. Die passende Fluidität kann durch beispielsweise die Verwendung einer Beschichtung wie beispielsweise Lezithin erhalten werden, durch die Aufrechterhaltung der benötigten Partikelgröße im Falle einer Dispersion und durch die Verwendung von Netzmitteln. In vielen Fällen wäre es wünschenswert in die Zusammensetzung isotonische Mittel einzufügen, beispielsweise Zucker, Polyalkohole wie beispielsweise Manitol, Sorbitol oder Natriumchlorid. Eine anhaltende Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch das Einfügen eines Mittels zu der Zusammensetzung, das die Absorption verlangsamt, erreicht werden, beispielsweise Monostearatsalze und Gelatine.
Außerdem können die Modulatoren in einer Zeitverzögerungs-Formel verabreicht werden, beispielsweise in einer Zusammensetzung, die ein Polymer mit langsamer Abgabe enthält. Die aktive Zusammensetzung kann mit Trägern hergestellt werden, die die Zusammensetzung vor einer schnellen Abgabe schützen, wie beispielsweise eine kontrollierte Abgabeformel, einschließlich Implantaten und mikroeingekapselten Bereitstellungssystemen. Biologisch abbaubare, biokompatible Polymere, wie beispielsweise Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Kollagen, Polyorthoester, Polymilchsäuren und polylaktische, polyglykolische Copolymere (PLG), können verwendet werden. Viele Verfahren zur Herstellung solcher Formeln sind patentiert oder dem Fachmann bekannt.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Einbringen der aktiven Zusammensetzung (beispielsweise β-Amyloid-Modulator) in ein geeignetes Lösungsmittel mit einem oder einer Zusammensetzung aus den vorstehend aufgezählten Inhaltsstoffen, nach Bedarf hergestellt werden, gefolgt von filtrierter Sterilisation. Allgemein werden Dispersionen durch das Einbringen der aktiven Zusammensetzung in ein steriles Vehikel, das ein basisches Dispersionsmedium und die anderen benötigten Inhaltsstoffe von den vorstehend aufgezählten enthält, hergestellt. Im Fall von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Verfahren der Herstellung Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung, die ein Pulver aus dem aktiven Inhaltsstoff und jeglichem zusätzlich gewünschten Inhaltsstoff aus einer davon vorher steril-filtrierten Lösung ergeben.
Eine Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann mit einer oder mehreren zusätzlichen Zusammensetzungen formuliert werden, die die Löslichkeit der Modulatorzusammensetzung verbessern. Bevorzugte Zusammensetzungen, die den Formeln zur Verbesserung der Löslichkeit zugefügt werden, sind Cyclodextrin Derivate, vorzugsweise Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrin. Medikamenten-Zuführenden Vehikel, die Cyclodextrin Derivate für die Zuführung von Peptiden zum Zentralen Nervensystem enthalten, sind in Bodor, N., et al. (1992) Science 257: 1698-1700 beschrieben. Die Einbeziehung der hier beschriebenen β-Amyloid-Modulatoren in die Formel von Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrin bei einer Konzentration von 50-200 mM erhöht die Wasserlöslichkeit der Zusammensetzungen. Zusätzlich zur erhöhten Löslichkeit kann die Einbeziehung von Cyclodextrin Derivaten in die Formel andere vorteilhafte Effekte haben, da berichtet wurde, dass β-Cyclodextrin selbst mit dem Aβ-Peptid wechselwirkt und die Fibrillenbildung in vitro inhibiert (Camilleri, P. et al. (1994) FERS Letters 341: 256-258. Entsprechend kann die Verwendung einer Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit einem Cyclodextrin Derivat zu einer erhöhten Inhibition der Aβ-Aggregation führen, als die Verwendung des Modulators allein. Chemische Modifizierungen von Cyclodextrinen sind im Stand der Technik bekannt (Hanessian, S. et al. (1995) J. Org. Chem. 60: 4786-4797). Zusätzlich zur Verwendung als Zusatz in einer pharmazeutischen Zusammensetzung die einen Modulator der vorliegenden Erfindung enthält, können Cyclodextrin Derivate auch als modifizierende Gruppen nützlich sein und können auch entsprechend an eine Aβ-Peptid Zusammensetzung gekoppelt sein, um eine Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung zu bilden.
Eine weitere bevorzugte Formel für die Modulatorzusammensetzung, um die Aufnahme durch das Gehirn zu verbessern, umfasst das Detergenz Tween-80, Polyethylenglykol (PEG) und Ethanol in einer Salzlösung. Ein nicht einschränkendes Beispiel einer solchen bevorzugten Formel besteht aus 0,16 % tween-80, 1,3 % PEG-3000 und 2 % Ethanol in Salzlösung.
In einer weiteren Ausführungsform ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Modulator der vorliegenden Erfindung umfasst, so formuliert, dass der Modulator durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS) transportiert wird. Verschiedene Strategien, die im Stand der Technik bekannt sind und die den Transport durch die BHS erhöhen, können auf die Modulatoren der vorliegenden Erfindung angewandt werden, um dabei den Transport durch die BHS zu erhöhen (für Reviews solcher Strategien siehe beispielsweise Pardridge, W.M. (1994) Trends in Biotechnol. 12: 239-245; Van Bree, J.B. et al. (1993) Pharm. World Sci. 15: 2-9; und Pardridge, W.M. et al. (1992) Pharmacol. Toxicol. 71: 3-10). Bei einer Vorgehensweise ist der Modulator chemisch modifiziert, um ein Pro-Pharmakon zu bilden, das einen erhöhten Transmembran-Transport aufweist. Geeignete chemische Modifikationen beinhalten kovalentes Binden einer Fettsäure an den Modulator durch eine Amid- oder Esterbindung (siehe beispielsweise U.S. Patent 4,933,324 und PCT Veröffentlichung WO 89/07938 , beide von Shashoua; U.S. Patent 5,284,876 von Hesse et al.; Toth, I. et al. (1994) J. Drug Target. 2: 217-239; und Shashoua, V.E. et al. (1984) J. Med. Chem. 27: 659-664) und Glykosylieren (glycating) des Modulators (siehe beispielsweise U.S. Patent 5,260,308 von Poduslo et al.). Es können auch N-Acylamino Derivate in einem Modulator verwendet werden, um ein "lipidisches" Pro-Pharmakon zu bilden (siehe beispielsweise 5,112,863 von Hashimoto et al.).
Bei einer weiteren Vorgehensweise für die Erhöhung des Transports durch die BHS wird ein Peptidmodulator oder ein peptidmimetischer Modulator an ein zweites Peptid oder Protein gepaart bzw. konjugiert, wobei ein chimerisches Protein gebildet wird, worin das zweite Peptid oder Protein eine Absorptions-Vermittelte oder Rezeptor-Vermittelte Transcytose (transcytosis) durch die BHS durchläuft. Dementsprechend wird durch das Koppeln des Modulators an das zweite Peptid oder Protein das chimere Protein durch die BHS transportiert. Das zweite Peptid oder Protein kann ein Ligand für einen Zellrezeptor im Gefäßendothel des Gehirns sein. Beispielsweise ist ein bevorzugter Ligand ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch an den Transferrinrezeptor der Gefäßendothelzellen im Gehirn bindet (siehe beispielsweise U.S. Patente 5,182,107 und 5,154,924 und PCT Veröffentlichungen WO 93/10819 und WO 95/02421 , alle von Friden et al.). Andere geeignete Peptide oder Proteine, die den Transport durch die BHS vermitteln, enthalten Histone (siehe beispielsweise U.S. Patent 4,902,505 von Pardridge und Schimmel) und Liganden wie beispielsweise Biotin, Folat, Niazin, Pantothensäure, Riboflavin, Thiamin, Pryridoxalsäure und Ascorbinsäure (siehe beispielsweise U.S. Patente 5,416,016 und 5,108,921 , beide von Heinstein). Zusätzlich wurde beschrieben, dass der Glukosetransporter GLUT-1 Glykopeptide (L-Serinyl-β-D-glukosidisches Analog von [Met5]Enkephalin) durch die BHS transportiert (Polt, R. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7114-1778). Entsprechend kann eine Modulatorzusammensetzung an solch ein Glykopeptid gekoppelt werden, um den Modulator an den GLUT-1 Glukosetransporter zu bringen. Beispielsweise kann ein Modulator, der an seinem Amino-Ende mit der modifizierenden Gruppe Aic (3-(O-Aminoethyl-iso-Cholyl, einem Derivat aus Cholsäure, das eine freie Aminogruppe aufweist) modifiziert ist, durch die Aminogruppe des Aic und durch Standardverfahren an ein Glykopeptid gekoppelt werden. Chimere Proteine können durch rekombinante DNA Verfahren (beispielsweise durch die Bildung eines chimeren Gens, das ein Fusionsprotein codiert) oder durch chemisches Verbinden des Modulators mit dem zweiten Peptid oder Protein gebildet werden. Eine Vielzahl chemischer Verbindungsmittel ist im Stand der Technik bekannt (beispielsweise kommerziell erhältlich von Pierce, Rockford, IL, USA). Es kann ein Verbindungsmittel gewählt werden, das eine hohe Bindungsrate des Modulators an das zweite Peptid oder Protein gewährt und ein anschließendes Spalten der Verbindung erlaubt, um den bioaktiven Modulator freizusetzen. Beispielsweise kann ein Bindungssystem basierend auf Biotin-Avidin verwendet werden.
Bei noch einer weiteren Vorgehensweise für die Erhöhung des Transports durch die BHS ist der Modulator in einen Trägervektor eingekapselt, der den Transport durch die BHS vermittelt. Beispielsweise kann der Modulator in einem Liposom eingekapselt sein, wie beispielsweise ein positiv geladenes, einzellamelläres Liposom (siehe beispielsweise PCT Veröffentlichungen WO 88/07851 und WO 88/07852 , beide von Faden) oder in polymerische Mikrokugeln (siehe beispielsweise U.S. Patent 5,413,797 von Khan et al., U.S. Patent 5,271,961 von Mathiowitz et al. und 5,019,400 von Gombotz et al.). Außerdem kann der Trägervektor modifiziert werden, um ihn zur Zielgruppe für den Transport durch die BHS zu machen. Beispielsweise kann der Trägervektor (beispielsweise Liposom) mit einem Molekül, das aktiv durch die BHS transportiert wird, beispielsweise ein monoklonaler Antikörper der spezifisch an Transferrinrezeptoren bindet, kovalent modifiziert werden (siehe beispielsweise PCT Veröffentlichungen WO 91/04014 von Collins et al. und WO 94/02178 von Greig et al.).
Bei noch einer weiteren Vorgehensweise für die Erhöhung des Transports durch die BHS wird der Modulator zusammen mit einem anderen Mittel verabreicht, das die BHS permeabilisiert. Beispiele solcher BHS-"Permeabilisatoren" enthalten Bradykinin und Bradykinin Agonisten (siehe beispielsweise U.S. Patent 5,112,596 von Malfroy-Camine) und Peptidzusammensetzungen, die in U.S. Patent 5,268,164 von Kozarich et al. offenbart sind.
Assays, die die in vitro Stabilität der Modulatorzusammensetzungen in cerebrospinaler Flüssigkeit (CSF) und den Grad der Gehirnaufnahme der Modulatorzusammensetzung in Tiermodellen messen, können als Indikatoren bzw. Vorherseher der in vivo Wirksamkeit der Zusammensetzungen verwendet werden. Geeignete Assays für die Messung der CSF Stabilität und der Gehirnaufnahme sind in Beispiel 7 bzw. 8 beschrieben.
Eine Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert werden, in der der Modulator der einzige aktive Bestandteil ist, oder die pharmazeutische Zusammensetzung kann alternativ zusätzliche aktive Bestandteile enthalten. Beispielsweise können zwei oder mehrere Modulatorzusammensetzungen in Verbindung verwendet werden. Außerdem kann eine Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung mit einem oder mehreren anderen Mitteln kombiniert werden, die anti-amyloidogenische Eigenschaften aufweisen. Beispielsweise kann eine Modulatorzusammensetzung mit dem nicht-spezifischen Cholinesterasehemmer Tacrin (COGNEX^®, Parke-Davis) kombiniert werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung als abgepackte Formel bereitgestellt. Die abgepackte Formel kann eine pharmazeutische Verbindung der vorliegenden Erfindung in einem Behälter und gedruckte Anweisungen für die Verabreichung der Zusammensetzung enthalten, um ein Individuum mit einer Störung zu behandeln, die mit β-Amyloidose, beispielsweise Alzheimer, zu tun hat.
VI. Verfahren der Anwendung von Aβ-Modulatoren
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur Veränderung der Aggregation oder der Inhibition der Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden bereitzustellen. In den Verfahren der vorliegenden Erfindung werden natürliche β-Amyloid-Peptide mit einem β-Amyloid-Modulator in Kontakt gebracht, so dass die Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide verändert wird oder die Neurotoxizität der natürlichen β-Amyloid-Peptide inhibiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform inhibiert der Modulator die Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide. In einer weiteren Ausführungsform fördert der Modulator die Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide. Vorzugsweise wird die Aggregation einer β-AP Menge im molaren Überschuss, verglichen mit der Menge des Modulators, auf den Kontakt mit dem Modulator hin verändert.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können natürliche β-Amyloid-Peptide entweder in vitro oder in vivo mit dem Modulator in Kontakt kommen. Der Term "in Kontakt kommen mit" ist dazu vorgesehen, sowohl die Inkubation eines Modulators mit natürlichen β-AP Präparaten in vitro, als auch die Bereitstellung des Modulators an einer Stelle in vivo, am der natürliches β-AP anwesend ist, zu enthalten. Da die Modulatorzusammensetzung mit natürlichem β-AP wechselwirkt, können die Modulatorzusammensetzungen zur Erfassung von β-AP entweder in vitro oder in vivo verwendet werden. Entsprechend ist ein Anwendungsbereich der Modulatorzusammensetzungen der eines diagnostischen Mittels, um die Gegenwart von natürlichem β-AP in entweder einer biologischen Probe oder in vivo in einem Individuum zu erfassen. Ferner kann die Erfassung natürlichen β-APs unter Verwendung einer Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung genutzt werden, um Amyloidose in einem Individuum zu diagnostizieren. Zusätzlich, da die Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung die β-AP-Aggregation unterbricht und die β-AP Neurotoxizität inhibiert, sind die Modulatorzusammensetzung auch in der Behandlung von Störungen, die mit Amyloidose in Verbindung stehen, anwendbar, entweder prophylaktisch oder therapeutisch. Entsprechend ist eine weitere Verwendung der Modulatorzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung die eines therapeutischen Mittels, um die Aggregation und/oder die Neurotoxizität von natürlichem β-AP zu verändern.
In einer Ausführungsform wird eine Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung in vitro verwendet, beispielsweise um natürliches β-AP in einer Probe (beispielsweise eine Probe aus biologischer Flüssigkeit) zu erfassen und zu quantifizieren. Die Modulatorzusammensetzung kann mit einer erfassbaren Substanz markiert werden, um das Erfassen zu erleichtern. Die Quelle des natürlichen β-APs, das in dem Verfahren genutzt wird, kann beispielsweise eine Probe auf cerebrospinaler Flüssigkeit sein (beispielsweise von einem AD Patienten, einem Erwachsenen, der aufgrund der Familiengeschichte empfänglich für AD ist oder von einem normalen Erwachsenen). Die Probe mit natürlichem β-AP wird mit einem Modulator der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht und die Aggregation des β-APs wird gemessen, so wie in dem Assay in Beispiel 2 beschrieben. Der Grad der Aggregation der β-AP-Probe kann dann mit dem einer oder mehrerer Kontrollproben mit einer bekannten Konzentration von β-AP verglichen werden, die ähnlich mit dem Modulator in Kontakt gebracht wurden, und die Ergebnisse können als Indikator verwendet werden, ob ein Individuum empfänglich für β-Amyloidose ist oder ob es eine Störung aufweist, die mit β-Amyloidose zu tun hat. Außerdem kann β-AP erfasst werden, indem eine modulierende Gruppe, die in den Modulator eingefügt wurde, erfasst wird. Beispielsweise können Modulatoren, in die eine Biotinzusammensetzung eingefügt wurde, was hier beschrieben wurde (beispielsweise ein Amino-terminal biotinyliertes β-AP-Peptid), durch die Verwendung einer Streptavidin- oder Avidinsonde erfasst werden, die mit einer erfassbaren Substanz (beispielsweise einem Enzym wie Peroxidase) markiert ist.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung in vivo verwendet, um natürliche β-AP-Ablagerungen in einem Individuum zu erfassen und, wenn gewünscht, zu quantifizieren, beispielsweise um die Diagnose von β-Amyloidose in dem Individuum zu unterstützen. Um die Erfassung zu unterstützen, kann die Modulatorzusammensetzung mit einer erfassbaren Substanz, vorzugsweise mit ^99mTc oder radioaktivem Iod (vorstehend beschrieben) markiert werden, die in einem Individuum in vivo erfasst werden kann. Die markierte β-Amyloid-Modulatorzusammensetzung wird dem Individuum verabreicht und wird durch standardisierte Abbildungstechniken nach einer ausreichenden Zeit, in der es dem Modulator ermöglicht wird, sich an den Stellen der Amyloid-Ablagerungen zu akkumulieren, erfasst. Das durch die markierte Zusammensetzung erzeugte radioaktive Signal kann direkt erfasst werden (beispielsweise durch eine Ganzkörper-Zählung) oder alternativ kann das radioaktive Signal in ein Bild auf einem Autoradiografen oder auf einem Computerbildschirm konvertiert werden, was eine bildlich Darstellung der Amyloid-Ablagerungen in einem Individuum ermöglicht. Verfahren zur bildlichen Darstellung von Amyloidose unter Verwendung von radiomarkierten Proteinen sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise Hawkins, P.N. und Pepys, M.B. (1995) Eur. J. Nucl. Med. 22: 595-599). Von den verschiedenen Isoformen des radioaktiven Iods wird vorzugsweise ¹²³I (Halbwertzeit = 13,2 Stunden) für die Ganzkörper-Zintigrafie verwendet, ¹²⁴I (Halbwertzeit = 4 Tage) für die Positronen-Emissions-Tomografie (PET), ¹²⁵I (Halbwertzeit = 60 Tage) für metabolische Umsatzstudien und ¹³¹I (Halbwertzeit = 8 Tage) für die Ganzkörper-Zählung und für verzögerte Studien mit niedriger Bildauflösung. Analog zu den Studien, in denen radiomarkiertes SAP genutzt wird, kann eine markierte Modulatorzusammensetzung der vorliegenden Erfindung einem Individuum über einen angebrachten Weg (beispielsweise intravenös, intraspinal, intracerebral) in einem einzelnen Bolus verabreicht werden, der beispielsweise 100 μg markierte Zusammensetzung enthält, die schätzungsweise 180 MBq Radioaktivität trägt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erfassung der Gegenwart oder Abwesenheit von natürlichen β-Amyloid-Peptiden in einer biologischen Probe bereit, die das in Kontaktbringen einer biologischen Probe mit einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung und das Erfassen der Zusammensetzung, die an natürliche β-Amyloid-Peptide gebunden ist, um so die Gegenwart oder Abwesenheit von natürlichen β-Amyloid-Peptiden in der biologischen Probe zu erfassen, umfasst. In einer Ausführungsform kommen die β- Amyloid-Modulatorzusammensetzung und die biologische Probe in vitro in Kontakt. In einer weiteren Ausführungsform kommt die β-Amyloid-Modulatorzusammensetzung mit der biologischen Probe durch die Verabreichung der β-Amyloid-Modulatorzusammensetzung an ein Individuum in Kontakt. Für die in vivo Verabreichung ist die Zusammensetzung vorzugsweise mit radioaktivem Technetium oder radioaktivem Iod markiert.
Die vorliegenden Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Erfassung von natürlichen β-Amyloid-Peptiden bereit, um die Diagnose einer β-amyloidischen Erkrankung zu erleichtern, das das in Kontaktbringen einer biologischen Probe mit der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung und das Erfassen der Zusammensetzung, die an natürliche β-Amyloid-Peptide gebunden ist, um so die Diagnose einer β-amyloidischen Erkrankung zu erleichtern, umfasst. In einer Ausführungsform kommen die β-Amyloid-Modulatorzusammensetzung und die biologische Probe in vitro in Kontakt. In einer weiteren Ausführungsform kommen die β-Amyloid-Modulatorzusammensetzung und die biologische Probe durch Verabreichung der β-Amyloid-Modulatorzusammensetzung an ein Individuum in Kontakt. Für die in vivo Verabreichung ist die Zusammensetzung vorzugsweise mit radioaktivem Technetium oder radioaktivem Iod markiert. Vorzugsweise hilft die Anwendung des Verfahrens bei der Diagnose der Alzheimerschen Krankheit.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Veränderung der natürlichen β-Amyloid-Aggregartion oder zur Inhibition der β-AP-Neurotoxizität bereit, welches prophylaktisch oder therapeutisch in der Behandlung oder der Prävention von Störungen verwendet werden kann, die mit β-Amyloidose, beispielsweise Alzheimer, in Verbindung stehen. Modulatorzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können die Toxizität der natürlichen β-AP-Aggregate auf kultivierte neuronale Zellen reduzieren. Außerdem weisen die Modulatoren auch die Fähigkeit auf, die Neurotoxizität zu reduzieren, die von Aβ-Fibrillen ausgeht. Entsprechend können Modulatorzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Inhibition oder zur Prävention der Bildung von neurotoxischen Aβ-Fibrillen in Individuen verwendet werden (beispielsweise prophylaktisch in einem Individuum, das für β-Amyloid-Ablagerungen prädisponiert ist) und sie können zur therapeutischen Umkehr der β-Amyloidose in Individuen angewendet werden, die bereits eine β-Amyloid-Ablagerung aufweisen.
Ein erfindungsgemäßer Modulator wird mit natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht, die in einem Individuum (beispielsweise in der cerebrospinalen Flüssigkeit oder dem Cerebrum des Individuums) vorhanden ist, um dadurch die Aggregation des natürlichen β-APs zu ändern und/oder die Neurotoxizität des natürlichen β-APs zu inhibieren. Dem Individuum kann eine Modulatorzusammensetzung alleine verabreicht werden, oder alternativ kann die Modulatorzusammensetzung in Kombination mit anderen therapeutisch aktiven Mitteln (beispielsweise wie vorstehend in Unterabschnitt IV dargelegt) verabreicht werden. Wird eine Kombinationstherapie angewendet, dann können die therapeutischen Mittel in einer einzigen pharmazeutischen Zusammensetzung co-verabreicht werden, in getrennten pharmazeutischen Zusammensetzungen co-verabreicht oder sequenziell verabreicht werden.
Der Modulator kann einem Individuum auf einem beliebigen Weg verabreicht werden, der für ein Inhibieren der Aggregation von natürlichem β-AP in dem Individuum wirksam ist, obwohl in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Modulator parenteral, am meisten bevorzugt dem Zentralnervensystem des Individuums verabreicht wird. Mögliche Wege einer ZNS-Verabreichung schließen eine intraspinale Verabreichung und intracerebrale Verabreichung (beispielsweise intracerebrovaskuläre Verabreichung) ein. Alternativ kann die Verbindung beispielsweise oral, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Für Nicht-ZNS-Verabreichungswege kann die Verbindung in einer Formulierung verabreicht werden, die über die BHS transportiert werden kann. Bestimmte Modulatoren können ohne irgendeine zusätzliche weitere Modifikation über die BHS transportiert werden, wohingegen, wie vorstehend in Unterabschnitt IV beschrieben, andere eine weitere Modifikation erfordern können.
Geeignete Modi und Einrichtungen zur Auslieferung bzw. Zuführung therapeutischer Verbindungen an das ZNS eines Individuums sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich cerebrovaskulärer Reservoirs (beispielsweise Ommaya- oder Rikker-Reservoirs, siehe beispielsweise Raney, J.P. et al., (1988) J. Neurosci. Nurs. 20: 23-29; Sundaresan, N et al., (1989) Oncology 3: 15-22), Kathetern zur intrathekalen Zuführung (beispielsweise Port-a-Cath, Y-Katheter und dergleichen, siehe beispielsweise Plummer, J.L. (1991) Pain 44: 215-220; Yaksh, T.L. et al., (1986) Pahrmacol. Biochem. Behau. 25: 483-485(, injizierbare intrathekale Reservoirs (beispielsweise Spinalgesie, siehe beispielsweise Brazenor, G.A. (1987), Neurosurgery 21: 484-491), implantierbare Infusionspumpensysteme (beispielsweise Infusaid, siehe beispielsweise Zierski, J. et al., (1988) Acta Neurochem. Suppl. 43: 94-99; Kanoff, R.B. (1994) J. Am. Osteopath. Assoc. 94: 487-493) und osmotische Pumpen (verkauft durch Alza Corporation). Ein besonders bevorzugter Modus einer Verabreichung besteht über eine implantierbare, von außen programmierbare Infusionspumpe. Geeignete Infusionspumpensysteme und Reservoirsysteme werden ebenfalls in US Patent 5,368,562 , von Blumquist und US Patent 4,731,058 durch Doan beschrieben, welche durch Pharmacia Deltec Inc. entwickelt wurde.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Ändern der β-AP-Aggregation in vivo und insbesondere zum Inhibieren einer Aggregation von β-AP, kann bei Erkrankungen therapeutisch verwendet werden, die mit einer anormalen β-Amyloid-Aggregation und Ablagerung assoziiert sind, um dadurch die Rate einer β-Amyloid-Ablagerung zu verlangsamen und/oder den Grad einer β-Amyloid-Ablagerung zu vermindern, wodurch der Verlauf der Erkrankung gebessert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren dazu verwendet, die Alzheimer-Krankheit (beispielsweise sporadische oder familiäre AD, einschließlich sowohl Individuen, die Symptome von AD zeigen und Individuen, die gegenüber familiärer AD empfänglich sind) zu behandeln. Das Verfahren kann ebenfalls prophylaktisch bzw. vorbeugend oder therapeutisch verwendet werden, um andere klinische Ausprägungen einer β-Amyloid-Ablagerung zu behandeln, wie beispielsweise bei Individuen mit Down-Syndrom und bei Patienten mit vererblicher cerebraler Hämorrhagie mit Amyloidose holländischer Art (HCHWA-D). Während eine Hemmung einer β-AP-Aggregation ein bevorzugtes nützliches therapeutisches Verfahren darstellt, können Modulatoren ebenfalls therapeutisch nützlich sein, die eine β-AP-Aggregation fördern, indem die Sequestrierung von β-AP an Stellen ermöglicht wird, die nicht zu einer neurologischen Beeinträchtigung führen.
Außerdem wurde eine anormale Anreicherung von β-Amyloid-Vorläuferprotein in Muskelfasern mit der Pathologie sporadischer Einschlusskörper-Myositis (IBM) in Zusammenhang gebracht (Askana, V. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1314-1319; Askana V. et al., (1995) Current Opnion in Rheumatology 7: -486-496). Dementsprechend können die Modulatoren der Erfindung prophylaktisch oder therapeutisch bei der Behandlung von Krankheiten, wie beispielsweise bei Behandlung von IBM durch Zuführung der Modulatoren zu den Muskelfasern verwendet werden, bei denen β-AP an nicht neurologischen Stellen anormal abgelagert wird.
Diese Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele erläutert, die nicht als beschränkend angesehen werden sollten. Die Fähigkeit eines Modulators die Aggregation von natürlichem β-Amyloid-Peptid zu verändern und/oder die Neurotoxizität von natürlichem β-Amyloid-Peptid in den nachfolgend beschriebenen Assays zu inhibieren, sind für die Fähigkeit, das der Modulator die gleiche Funktion in vivo ausführt, vorhersagend/prädikativ.
Diese Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, die nicht als beschränken angesehen werden sollten. Der Inhalt der Referenzen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen, die durch diese Anmeldung zitiert werden, als auch der Figuren werden hier durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispiel 1 Präparation von Modulatorzusammensetzungen von β-Amyloid, die D-Aminosäuren umfassen
Modulatoren von β-Amyloid, die D-Aminosäuren umfassen, können durch Fest-Phasen-Peptidsynthese, beispielsweise unter Verwendung einer N^α-9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC)-basierenden Schutzstrategie präpariert werden. Ausgehend von 2,5 mMolen FMOC-D-Val-Wang-Harz werden unter Verwendung eines vierfachen Überschusses geschützter Aminosäuren sequenzielle Additionen von jeder Aminosäure, 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und Diisopropylcarbodiimid (DIC), ausgeführt. Wiederankopplungen werden ausgeführt, falls sie, wie durch ein Ninhydrintesten des Harzes nach der Kopplung bestimmt, erforderlich sind. Jeder Synthesezyklus wird minimal beschrieben durch ein dreiminütiges Entschützen (25 % Piperidin/N-Methylpyrrolidon (NMP)), ein 15-minütiges Entschützen, fünf einminütige Waschungen mit NMP, einen 60-minütigen Kopplungszyklus, fünf Waschungen mit NMP und einem Ninhydrin-Test. Für eine N-terminale Modifikation wird ein N-terminal modifizierendes Reagenz für eine FMOC-D-Aminosäure substituiert und durch das vorstehende Protokoll an einen 700 mg umfassenden Anteil des vollständig angeordneten Peptidharzes gekoppelt. Das Peptid wird durch Behandlung für zwei Stunden mit Trifluoressigsäure (TFA) (82,5 %), Wasser (5 %), Thioanisol (5 %), Phenol (5 %), Ethanedithiol (2,5 %) gefolgt durch Präzipitation des Peptids in kalten Ether von dem Harz entfernt bzw. gelöst. Der Feststoff wird durch Zentrifugation (2400 Upm × 10 Min.) pelletiert und der Ether wird dekantiert. Der Feststoff wird in Ether resuspendiert, pelletiert und ein zweites Mal dekantiert. Der Feststoff wird in 10 % Essigsäure gelöst und bis zur Trockenheit gefriergetrocknet. Für eine präparative Reinigung und anschließende analytische Charakterisierung werden 60 mg des Feststoffs in 25 % Acetonitril (ACN)/0,1 % TFA gelöst und auf eine C18 Umkehrphasen-Säule einer Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) aufgetragen.
Alternativkönnen β-Amyloid-Modulatoren, die D-Aminosäuren umfassen unter Verwendung eines automatischen Protokolls an einem Rainin PS3 Peptidsynthesizer präpariert werden, das durch den Hersteller für eine 0,25 mMol Maßstabssynthese eingeführt wurde. Die Kopplungen werden unter Verwendung von 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl-uronium-hexafluorphosphat (HBTU)/FMOC-D-Aminosäure in vierfachem Überschuss in 0,4 M N-Methylmorpholin (NMM)/Dimethylforamid (DMF) für 60 Minuten ausgeführt. Zwischen den Kopplungen wird die FMOC-Gruppe durch eine Reaktion mit 20 % Piperidin/DMF für 20 Minuten entfernt. Das Peptid wird von dem Harz durch Behandlung mit 95 %TFA/Wasser für eine Stunde entfernt und mit Ether präzipitiert. Das Pellet wird in 40 % Acetonitril/Wasser resuspendiert und gefriergetrocknet. Falls erforderlich wurde das Material durch eine präparative HPLC unter Verwendung von 15 %-50 % Acetonitril über 60 Minuten an einer Vydac C18-Säule (21 × 250 mm) gereinigt.
Es können verschiedene modifizierte β-Amyloid-Modulatorzusammensetzungen unter Verwendung eines Standardverfahrens synthetisiert werden. Es werden vollständig geschützte, an Harz gebundene Peptide hergestellt, wie vorstehend beschrieben an ein geeignetes Harz, um Carboxylsäuren terminaler Peptide hervorzubringen. Kleine Anteile von jedem Peptid remore beispielsweise 13-20 μMole) werden in getrennte Reaktionsgefäße aliquotiert. Die N-terminale FMOC-Schutzgruppe von jeder Probe wird auf die Standardweise mit 20 % Piperidin in NMM, gefolgt durch umfassendes Waschen mit DMF, entfernt. Die entschützte N-terminale α-Aminogruppe von jeder Peptid-Harz-Probe kann unter Verwendung von einem der folgenden Verfahren modifiziert werden: Verfahren A, Kopplung von modifizierenden Reagenzien, die freie Carboxylsäuregruppen beinhalten: Das modifizierende Reagenz (fünf Äquivalente) wird in NMP, DMSO oder einem Gemisch von diesen zwei Lösungsmitteln vorgelöst HOBt und DIC (fünf Äquivalente von jedem Reagenz) werden zu dem gelösten Modifikator gegeben und die erhaltene Lösung wird zu einem Äquivalent des freien Amino-Peptid-Harzes gegeben. Die Kopplung kann über Nacht ablaufen, die von Waschen gefolgt wird. Zeigt ein Ninhydrin-Test an einer kleinen Probe eines Peptidharzes dass das Koppeln nicht vollständig ist, wird das Koppeln unter Verwendung von 1-Hydroxy-7-Azabenzotriazol (HOAt) anstelle von HOBt wiederholt.
Verfahren B, Kopplung von modifizierenden Reagenzien, die in voraktivierten Formen erhalten werden: Das Modifizierende Reagenz (fünf Äquivalente) wird in NMP, DMSO oder einem Gemisch von diesen zwei Lösungsmitteln vorgelöst und zu einem Äquivalent eines Peptidharzes gegeben. Diisopropylethylamin (DIEA, sechs Äquivalente) wird zu der Suspension von aktiviertem Modifikator und Peptidharz gegeben. Koppeln kann über Nacht ablaufen, das von Waschen gefolgt wird. Falls ein Ninhydrin-Test an einer kleinen Probe von Peptidharz zeigt, dass das Koppeln nicht vollständig war, dann wird das Koppeln wiederholt.
Nach dem zweiten Koppeln (falls erforderlich) werden die N-terminal modifizierten Peptidharze bei vermindertem Druck getrocknet, und wobei sie, wie vorstehend beschrieben, von dem Harz mit Entfernung der Seitenketten-Schutzgruppen entfernt werden. Eine analytische Umkehrphasen-HPLC wird verwendet, um zu bestätigen, dass ein Hauptprodukt in den erhaltenen rohen Peptiden vorhanden sind, die unter Verwendung von Millpore-Sep-Pak-Patronen oder einer präparativen Umkehrphasen-HPLC gereinigt werden. Massenspektrometrie oder Hochfeld Kern-Magnet-Resonanz-Spektrometrie wird verwendet, um das Vorhandensein der erwünschten Verbindung in dem Produkt zu bestätigen.
Verfahren C, Herstellung von N-terminalen mit Alkyl substituierten Peptiden unter Verwendung von Bromacetyl-Peptid-Zwischenprodukten: Ein an ein Harz gebundenes Peptid kann mit 1,3-Diisopropylcarbodiimid (DIC) (13 Äquivalente) in DMF an eine Bromessigsäure (12 Äquivalente) gekoppelt werden. Das mit Bromacetyl substituierte Peptid kann auf Reaktion mit primären oder sekundären Aminen einschließlich Methylamin, Ethylamin, Propylamin, Isopropylamin und Piperidin modifiziert werden. Die Reaktion wird in 60 % DMSO/DMF ausgeführt und ist gewöhnlich nach 24 Stunden abgelaufen bzw. beendet.
Verfahren D, Herstellung von N-terminalen mit Alkyl substituierten Peptiden über eine reduktive Alkylierung: Nachdem das Peptid in Wasser gelöst (oder teilweise gelöst) ist, das 0-10 % Methanol beinhaltet, wird es mit einem Aldehyd (5-8 Äquivalente) und Natriumcyanborhydrid (10-16 Äquivalente) zur Reaktion gebracht. Die Anzahl von Äquivalenten kann für den Typ eines Aldehyds und den Grad einer erwünschten Substitution angepasst werden. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wird mit 1 M HCl auf 2 eingestellt und für eine Stunde bei 2 beibehalten. Die Reaktion wird durch HPLC überwacht und ist gewöhnlich nach zwei Stunden beendet. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur konzentriert und durch HPLC gereinigt.
Verfahren E, C-terminale Modifikation: Das Peptid wurde an einem 2-Chlortrityl-Harz unter Verwendung einer Standard-FMOC-Chemie synthetisiert, wobei jedoch die letzte gekoppelte D-Aminosäuregruppe BOC geschützt wird. Das Peptid wurde von dem Harz mit 8/1/1 Dichlormethan (DCM)/Essigsäure/Trifluorethanol entfernt, wobei das Gemisch konzentriert wurde. Der Peptidrest wurde in 20 % Acetonitril gelöst, gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Die rohe mit BOC geschützte Peptidsäure wurde unter basischen Bedingungen (pH-Wert = 11, eingestellt mit DIEA) mit einem Äquivalent von jeweils 1-Hydroxy-7-azobenzotriazol (HOAt) und DIC an ein Amin gekoppelt. Die Reaktion war nach einem Rühren über Nacht beendet und das Peptid wurde mit Wasser präzipitiert. Die BOC-Gruppe wurde auf eine Reaktion mit 25 % TFA in DCM für eine Stunde gespalten und das Peptid über HPLC gereinigt.
Beispiel 2: β-Amyloid Aggregations-Assays
Die Fähigkeit von β-Amyloid Modulatorzusammensetzungen die Aggregation von natürlichem β-AP zu modulieren (beispielsweise inhibieren oder fördern), wenn es mit dem natürlichen β-AP kombiniert wird, kann in einem oder beiden der nachfolgend beschriebenen Aggregations-Assays untersucht werden. Natürliches β-AP (β-AP_1-40), das in den Aggregations-Assays verwendet werden kann, ist im Handel von Bachem (Torrance, CA) erhältlich.
A. Keimbildungs-Assay
Der Keimbildungs-Assay wird angewendet, um die Fähigkeit einer Testzusammensetzung zu bestimmen, um die frühen Ereignisse bei der Bildung von β-AP-Fasern aus monomerem β-AP zu ändern. Charakteristisch für einen keimbildenden (nucleated) Polymerisationsmechanismus ist vor der Keimbildung eine beobachtete Verzögerungszeit, nach der das Peptid schnell Fasern ausbildet, was sich in einem linearen Anstieg in der Trübheit widerspiegelt. Die Zeitverzögerung vor der Polymerisation von β-AP-Monomer als auch das Ausmaß der Bildung unlöslicher Fasern kann durch Lichtstreuung (Trübheit) quantifiziert werden. Die Polymerisation erreicht ein Gleichgewicht, wenn die maximale Trübheit ein Plateau erreicht. Die Trübheit einer Lösung von natürlichem β-AP wird in der Abwesenheit oder Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von einer β-Amyloid-Modulatorzusammensetzung durch Erfassen des scheinbaren bzw. offenbaren Absorptionsvermögens bzw. Extinktion der Lösung bei 405 nm (A_405nm) über die Zeit bestimmt. Der Schwellenwert einer Empfindlichkeit zur Erfassung einer Trübheit liegt in dem Bereich von 15-20 μM β-AP. Eine Abnahme in der Trübheit über die Zeit in Gegenwart des Modulators verglichen zu der Trübheit in der Abwesenheit des Modulators zeigt an, dass der Modulator eine Bildung von β-AP-Fasern aus monomerem β-AP hemmt. Dieser Assay kann unter Verwendung eines Rührens oder Schüttelns ausgeführt werden, um eine Polymerisation zu beschleunigen, wodurch die Geschwindigkeit des Assays erhöht wird. Außerdem kann der Assay auf das Format einer 96-Lochplatte angepasst werden, um mehrere Verbindungen zu durchmustern.
Um den Keimbildungs-Assay auszuführen, wird Aβ_1-40-Peptid zuerst in HFIP (1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol, Aldrich 10,522-8) mit einer Konzentration von 2 mg Peptid/ml gelöst und bei Raumtemperatur für 30 Min. inkubiert. HFIP solubilisiertes Peptidwird in einem Ultraschall-Wasserbad für 5 Min. bei der höchsten Einstellung mit Ultraschall behandelt und anschließend unter einem Strom von Argon bis zur Trockenheit verdampft. Der Peptidfilm wird in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) mit einer Konzentration von 6,9 mg/ml (25x Konzentration) resuspendiert, wie zuvor für 5 Min. mit Ultraschall behandelt und anschließend durch einen 0,2 Mikron Nylon-Spritzenfilter (VWR Kat. 28196-050) filtriert. Die Testzusammensetzungen werden in DMSO mit einer 100x Konzentration gelöst. Vier Volumen von 25x Aβ_1-40-Peptid in DMSO werden mit einem Volumen einer Testzusammensetzung in DMSO in einer Glasampulle kombiniert und vermischt, um ein 1:1 Molverhältnis von Aβ-Peptid zu Testzusammensetzung zu erzeugen.
Testzusammensetzungen werden für unterschiedliche Molverhältnisse vor der Zugabe zu Aβ_1-40 mit DMSO verdünnt, um die End-DMSO- und Aβ_1-40-Konzentrationen konstant zu halten. Kontrollproben beinhalten keine Testzusammensetzung. Zehn Mikroliter des Gemisches werden dann auf den Boden eines Loches einer ultra niedrig bindenden 96-Lochplatte von Corning Costar (Corning Costar, Cambridge MA, Kat. 2500) gegeben. Neunzig Mikroliter Wasser werden dem Loch zugegeben, die Platte wird auf einem Drehschüttler bei einer konstanten Geschwindigkeit bei Raumtemperatur für 30 Sekunden geschüttelt, es werden zusätzliche 100 μl eines 2x PTL-Puffers (20 mM NaPO₄, 300 mM NaCl, pH-Wert 7,4) dem Loch zugegeben, die Platte wird erneut für 30 Sekunden geschüttelt und es wird eine Grundlinien-(t = 0) Trübheits-Auslesung durch Erfassen der offenbaren Extinktion bei 405 nm unter Verwendung eines Model-450 Mikroplatten-Lesegerätes von Bio-Rad vorgenommen. Die Platte wird dann wieder dem Schüttler übergeben und fortlaufend für 5 Stunden geschüttelt.
Eine β-Amyloid-Aggregation in der Abwesenheit von beliebigen Modulatoren führt zu einer erhöhten Trübheit der natürlichen β-AP-Lösung (d.h. ein Anstieg in der offenbaren Trübheit bei 405 nm über die Zeit). Dementsprechend zeigt eine Lösung einschließlich einer wirksamen inhibierenden Modulatorzusammensetzung, verglichen mit der Kontrolleprobe ohne die Modulatorzusammensetzung (d.h. eine geringere offenbare Extinktion bei 405 nm über die zeit verglichen zu der Kontrollprobe), eine verringerte Trübheit.
Um alternativ die Trübheit zur Quantifizierung einer β-Amyloid-Aggregation zu verwenden, kann die Fluoreszenz von Thioflavin T (Th-T) ebenfalls verwendet werden, um eine β-Amyloid-Aggregation beim Keimbildungs-Assay (die Verwendung der Thioflavin-Fluoreszenz zum Quantifizieren einer β-Amyloid-Aggregation wird weiterhin weiter unter für den gekeimten Extensions-Assay beschrieben) zu quantifizieren.
B. Fibrillen-Eindungs-Assay
Die folgenden Materialien werden für den Fibrillen-Eindungs-Assay benötigt. Mehrfach-Filter-Gerät von Millipore, 12 × 75 Glassröhrchen, GF/F 25 mm Glasfilter, PBS/0,1 % Tween 20 bei 4 °C (PEST), Aβ-Fibrillen, radioaktive Verbindung, nicht-radioaktive Zusammensetzung, Wiederholungspipettiergerät von Eppendorf mit Spitzen, Etiketten, Zangen und Vakuum.
In diesem Assay wird jede Probe dreifach bzw. in Triplikaten ausgeführt. Die "gealterte bzw. aged" Aβ-Fibrille wird zuerst ungefähr 8 Tage vorher hergestellt, indem 1 ml-Aliquots einer 200 μM Aβ_1-40-Peptid-Lösung in 4 % DMSO/PBS für 8 Tage bei 37°C mit Schaukeln gealtert werden. Derartiges "gealtertes" Aβ-Peptitd kann unmittelbar auf Zellen oder gefroren bei –80°C getestet werden.
Die 200 μM Aβ-Fibrille wird in PEST verdünnt, um ein 4 μM Lösung (320 Ml in 16 ml PEST) zu erhalten. Aliquots von 100 μl dieser Lösung werden mit dem Wiederholungspipettiergerät pro Röhrchen zugegeben.
Die β-Amyloid-Modulatorzusammensetzungen der Erfindung werden wie folgt, mit Verdünnungen von 2 μM-200 fM hergestellt:

Verdünnen einer 5 mM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 1,6667 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 1,667 mM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 0,5556 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 1,667 mM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 0,5556 Stammlösung (200 μ1 in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 555,556 μM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 185,19 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 185,185 μM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 61,728 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 61,728 μM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 20,576 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 20,576 μM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 6,8587 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 6,8587 μM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 2,2862 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 2,2862 μM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 0,7621 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 0,7621 nM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 254,03 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 254,03 nM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 84,675 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 84,675 nM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 28,225 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 28,225 nM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 9,4084 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 9,4084 nM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 3,1361 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 3,1361 nM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 1,0454 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 1,045 nM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 0,3485 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 348,459 pM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 116,15 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 116,15 pM Stammlösung 1:3 in DMSO, um eine 38,718 Stammlösung (200 μl in 400 μl DMSO) zu erhalten.
Verdünnen einer 185,185 μM Stammlösung 1:25 in PEST, um eine 7,4074 Stammlösung (50 μl in 1,2 ml PEST) zu erhalten.
20 Verdünnen einer 61,728 μM Stammlösung 1:25 in PEST, um eine 2,4691 Stammlösung (50 μl in 1,2 ml PEST) zu erhalten.
Verdünnen einer 20,576 μM Stammlösung 1:25 in PEST, um eine 0,823 Stammlösung (50 μl in 1,2 ml PEST) zu erhalten.
Verdünnen einer 6,859 μM Stammlösung 1:25 in PEST, um eine 0,2743 Stammlösung (50 μl in 1,2 ml PEST) zu erhalten.
Verdünnen einer 2,286 μM Stammlösung 1:25 in PEST, um eine 0,0914 Stammlösung (50 μl in 1,2 ml PEST) zu erhalten.
Verdünnen einer 762,079 nM Stammlösung 1:25 in PEST, um eine 30,483 Stammlösung (50 μl in 1,2 ml PEST) zu erhalten.
25 Verdünnen einer 254,026 nM Stammlösung 1:25 in PEST, um eine 10,161 Stammlösung (50 μl in 1,2 ml PEST) zu erhalten.
Verdünnen einer 84,675 nM Stammlösung 1:25 in PEST, um eine 3,387 Stammlösung (50 μl in 1,2 ml PEST) zu erhalten.
Verdünnen einer 28,225 nM Stammlösung 1:25 in PEST, um eine 1,129 Stammlösung (50 μl in 1,2 ml PEST) zu erhalten.
Verdünnen einer 9,408 nM Stammlösung 1:25 in PEST, um eine 0,3763 Stammlösung (50 μl in 1,2 ml PEST) zu erhalten.
Verdünnen einer 3,136 nM Stammlösung 1:25 in PEST, um eine 0,1254 Stammlösung (50 μl in 1,2 ml PBST) zu erhalten.
30 Verdünnen einer 1,045 nM Stammlösung 1:25 in PBST, um eine 0,0418 Stammlösung (50 μl in 1,2 ml PBST) zu erhalten.
Verdünnen einer 348,459 pM Stammlösung 1:25 in PBST, um eine 13,938 Stammlösung (50 μl in 1,2 ml PBST) zu erhalten.
Verdünnen einer 116,153 pM Stammlösung 1:25 in PBST, um eine 4,6461 Stammlösung (50 μl in 1,2 ml PBST) zu erhalten.

Die β-Amyloid-Modulatorzusammensetzung (200 μl) wird dann dem geeigneten Röhrchen zugegeben, das die Aβ-Fibrille beinhaltet.
Die radioaktiv markierte β-Amyloid-Modulatorzusammensetzung wird unter Verwendung standardisierter Sicherheitsprotokolle für Radioaktivität hergestellt, indem eine Verdünnung in einer PBS/0,1 % Tween-20-Lösung ausgeführt wird, so dass eine Endkonzentration von 20,000 dpm pro 100 μl erhalten werden. Es werden Aliquots von 100 μl der radioaktiv markierten β-Amyloid-Modulatorzusammensetzung pro Röhrchen unter Verwendung des Wiederholungspipettiergerätes zugegeben. Die Proben werden mit Parafilm abgedeckt, und bei 37°C innerhalb von Radioaktivtaschen aus Kunststoff über Nacht inkubiert.
Um die Proben zu filtrieren werden die Filter mit einem kleinen Volumen PBST vorgenässt. In zwei Mehrfachfiltrationsgeräten von Millipore werden in jeden Filtrationsschlitz den Angaben des Herstellers folgend GF/F-Filter eingesetzt. Die Proben werden aus dem 37°C-Inkubator entnommen und jede Probe wird unter Verwendung eines kleinen Volumens (~ 5 ml) kalten PEST-Puffers filtriert. Die Probe wird anschließend mit zwei zusätzlichen 5 ml Volumen von kaltem PEST-Puffer gewaschen. Nach Zugabe der letzten Probe kann das Vakuum für ungeführ 2 Minuten zu einem halbtrocknen Filter ziehen und der Filter wird zum Iodierungszählen zu einem markierten Röhrchen überführt. Es werden Zählungen bzw. Zählereignisse von einer Minute aufgezeichnet, die Daten werden grafisch dargestellt und das Prism-Programm (GraphPAD) wird verwendet, um die Diagramme entsprechend den Angaben des Herstellers zu analysieren.
C. Gekeimter Extensions-Assay
Der gekeimte Extensions-Assay kann angewendet werden, um die Rate einer Aβ-Faser zu erfassen, die folgend auf eine Zugabe von polymerer Aβ-Faser "Keim" in einer Lösung von Aβ-Monomer gebildet wurde. Die Fähigkeit von Testzusammensetzungen eine weitere Ablagerung von monomerem Aß an vorher abgelagertem Amyloid zu verhindern, wird unter Verwendung eines direkten Indikators einer β-Faltblatt-Bildung unter Verwendung von Fluoreszenz bestimmt. Im Gegensatz zum Keimbildungs-Assay stellt die Zugabe eines Keims eine unmittelbare Keimbildung und fortgesetztes Wachstum vorgeformter Fibrillen bereit ohne beständiges Vermischen zu erfordern, und was folglich zu der Abwesenheit einer Verzögerungszeit vor einem Polymerisationsstart führt. Da dieser Assay statische Polymerisationsbedingungen verwendet, kann die Aktivität von positiven Verbindungen in dem Keimbildungs-Assay in diesem zweiten Assay unter unterschiedlichen Bedingungen und mit einer zusätzlichen Sonde einer Amyloid-Struktur bestätigt werden.
In dem gekeimten Extensions-Assay wird monomeres Aβ_1-40 in Gegenwart eines "Keim"-Kerns (ungefähr zehn Molprozent von Aß, das vorher unter kontrollierten statischen Bedingungen polymerisieren konnte) inkubiert. Die Proben der Lösung werden dann in Thioflavin T (Th-T) verdünnt. Die Polymer-spezifische Assoziation von Th-T mit Aß erzeugt einen Fluoreszenzkomplex, über den das Ausmaß einer Fibrillenbildung (Levine, H. (1993) Protein Science 2: 404-410) erfasst werden kann. Insbesondere führt die Assoziation von Th-T mit aggregiertem β-AP, jedoch nicht mit monomerem oder schwach assoziiertem β-AP, zu einem neuen Anregungs-(ex)-maximum bei 450 nm und einer erhöhten Emission (em) bei 482 nm, verglichen zu den 385 nm (ex) und 445 nm (em) für den freien Farbstoff. Kleine Aliquots des Polymerisations-Gemisches beinhalten ausreichend mit Th-T zu vermischende Fibrillen, so dass das Reaktionsgemisch durch wiederholte Probennahme bzw. Durchmusterung überwacht werden kann. Es wird eine lineare Wachstumskurve in der Gegenwart von überschüssigem Monomer beobachtet. Die Bildung von auf Thioflavin T reagierenden β-Faltblatt-Fibrillen entspricht einem Anstieg der Trübheit, die unter Verwendung des Keimbildungs-Assays beobachtet wird.
Eine Lösung von Aβ-Monomer, die in dem gekeimten Extensions-Assay verwendet wird, wird durch Lösen einer geeigneten Menge von Aβ_1-40-Peptid in 1/25 Volumen von Dimethylsulfoxid (DMSO), gefolgt durch Wasser zu ½ Volumen und ½ Volumen 2x PBS (10x PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na₂HPO₄·7H₂O, 4,3 mM, KH₂PO₄ 1,4 mM, pH-Wert 7,2) auf eine Endkonzentration von 200 μM. Um den Stammlösungs-Keim herzustellen wird 1 ml der Aβ-Monomer-Präparation für ungefähr 8 Tage bei 37°C inkubiert und sequenziell durch eine 18, 23, 26 und 30 Kalibernadel 25-, 25-, 50-beziehungsweise 100-mal geschert. Es werden 2 μl der gescherten Probenmaterials für die Fluoreszenzerfassungen nach jeden 50 Durchführungen bzw. Passagen durch die 30 Kalibernadel bis die Fluoreszenzeinheiten (FU) ein Plateau (ungefähr 100-150x) bilden. Die Testzusammensetzungen werden durch Lösen einer geeigneten Menge von Testzusammensetzung in 1x PBS zu einer Endkonzentration von 1 mM (10x Stammlösung) hergestellt. Falls die Zusammensetzung unlöslich ist, wird sie in 1/10 Volumen DMSO verdünnt und in 1x PBS zu 1 mM verdünnt. Eine weitere 1/10 Verdünnung wird ebenfalls hergestellt, um jeden Kandidaten mit beidem 100 μM und 10 μM zu testen.
Um den gekeimten Extensions-Assay auszuführen, wird jede Probe mit 50 μl eines 200 μM Monomers, 125 FU gescherten Keims (eine variable Menge, die von der Keim-Charge abhängig ist, routinemäßig 3-6 μl) und 10 μl einer 10x Modulator-Lösung angeordnet. Das Probenvolumen wird dann auf ein Endvolumen von 100 μl mit 1x PBS eingestellt. Es werden gewöhnlich zwei Konzentrationen von jedem Modulator getestet: 100 μM und 10 μM, die einen 1:1 und einem 1:10 Molverhältnis von Monomer zu Modulator entsprechen. Die Kontrollen umfassen eine nicht-gekeimte Reaktion, um zu bestätigen, dass das frische Monomer keinen Keim beinhaltet und eine gekeimte Reaktion in der Abwesenheit von beliebigen Modulatoren als eine Referenz zum Vergleich mit den Test- bzw. Kandidaten modulatoren. Der Assay wird bei 37°C für 6 Std. inkubiert, wobei stündlich 2 μl für Fluoreszenzerfassungen entnommen werden. Um die Fluoreszenz zu erfassen, wird eine 2 μl Probe zu 400 μl einer Thioflavin T-Lösung (50 mM Kaliumphosphat, 10 mM Thioflavin-T, pH-Wert 7,5) gegeben. Die Proben werden gevortext und die Fluoreszenz wird in einer 0,5 ml Mikro-Quartz-Küvette bei EX 450 nm und EM 482 nm (Hitachi 4500 Fluorimeter) ausgelesen.
Die β-Amyloid-Aggregation führt zu einer erhöhten Emission von Thioflavin-T. Proben, die dementsprechend eine wirksam inhibierende Modulatorzusammensetzung umfassen, zeigen, verglichen zu Kontrollproben ohne die Modulatorzusammensetzung, eine verringerte Emission.
Beispiel 3: Analyse von β-Amyloid-Modulatorzusammensetzungen

In diesem Beispiel wurden hier beschriebene β-Amyloid-Modulatorzusammensetzungen hergestellt und auf deren Fähigkeit die Aggregation von natürlichem β-Amyloid-Peptid unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Aggregations-Assays getestet. Die Ergebnisse einer ersten Serie von Experimenten sind nachfolgend in Tabellen I, II und III zusammengefasst. Tabelle I

PPI#	Keimbildungs-Assay Δ lag			Fibrillenbindung Kd's
	5 μM	2,5 μM	1,25 μM	Cpmd	Ref. cpmd	Ref. Kd
803	<1	<1	<1
913	1	1	1
968	>5	>5	2
969	>5	>5	3	1,13 × 10^–9	PPI-558	3,7 × 10^–9
970	>5	>5	1
992	3	1	1	2,43 × 10^–9	PPI-558	3,70 × 10–9
993	1	1	1
1005	3	3	1
1006	1	1	1
*1007	4	4	3	8,64 × 10^–10	PPI-558	1,69 × 10^–9
#1007	1,5	1,5	1,5	6,27 × 10^–10	PPI-558	2,75 × 10^–9

1008				1,7 × 10^–9	PPI-558	1,00 × 10^–9
#1013	2	>3	2	2,47 × 10^–10	PPI-558	1,69 × 10^–9
1017				3,89 × 10^–10	PPI-558	2,42 × 10^–9
1018				7,01 × 10^–10	PPI-558	2,42 × 10^–9
1020				6,01 × 10^–10	PPI-558	2,42 × 10^–9
1022				1,50 × 10^–10	PPI-558	1,00 × 10^–9
1025				4,30 × 10^–10	PPI-558	1,00 × 10^–9
1028				4,90 × 10^–10	PPI-558	1,00 × 10^–9
1038				6,52 × 10–10	PPI-558	3,76 × 10^–9
1039				2,44 × 10^–9	PPI-558	3,76 × 10^–9
1040				4,08 × 10^–10	PPI-558	2,4 × 10^–9
1041				1,61 × 10^–9	PPI-558	2,4 × 10^–9
1042				2,34 × 10^–10	PPI-558	2,4 × 10^–9
1088				3,40 × 10^–9	PPI-558	1,93 × 10^–9
1089				5,7 × 10^–10	PPI-558	3,3 × 10^–9
1093				1,02 × 10^–9	PPI-558	1,93 × 10^–9
1094				3,7 × 10^–9	PPI-558	3,5 × 10^–9
1179				6,04 × 10^–10	PPI-558	1,93 × 10^–9
1180				3,3 × 10^–10	PPI-558	3,5 × 10^–9
1261				1,12 × 10^–8	PPI-558	3,34 × 10^–9

Anmerkungen:

* Bedeutet, dass die Keimbildungs-Assaydaten bei 3, 1 und 0,3 μM der Verbindung erfasst wurden;
# bedeutet, dass die Keimbildungsdaten bei 2,5, 1,25 und 0,6 μM der Verbindung erfasst wurden.

PPI#	Keimbildungsassaydaten			Fibrillenbindung Kd's
	3 μM	1 μM	0,3 μM	Cpmd	Ref. cpmd	Ref. Kd
*1019	>2,5	>2,5	2,0	4,11 × 10^–10	PPI-558	1,69 × 10^–9
1019				5,34 × 10^–10	PPI-558	1,93 × 10^–9
1301				1,1 × 10^–9	PPI-558	1,4 × 10^–9
1302				2,2 × 10^–10	PPI-558	1,4 × 10^–9
1303				1,1 × 10^–9	PPI-558	1,4 × 10^–9
1318	>5	2	1	7,7 × 10^–11	PPI-558	2,3 × 10^–9
1318				1,4 × 10^–9
1318				6,2 × 10^–11
1319	>5	>5	1
1320	>5	3	1	1,4 × 10^–9	PPI-1318	6,2 × 10^–11
1321	>1	1	1
1322				1,2 × 10^–9	PPI-1318	6,2 × 10^–11
1323

1324
1325				1,4 × 10^–9	PPI-1318	1,4 × 10^–9
1326				5,6 × 10^–10	PPI-1318	6,2 × 10^–11
1327				8,2 × 10^–10	PPI-1318	1,4 × 10^–9
1328				2,4 × 10^–9	PPI-1318	6,2 × 10^–11
1329
*1125	>2,5	>2,5	2,0	1,27 × 10^–9	PPI-558	2,08 × 10^–9
1125				1,34 × 10^–9	PPI-558	2,08 × 10^–9
1133				3,18 × 10^–7	PPI-558	2,08 × 10^–9
1155				1,24 × 10^–7	PPI-558	2,08 × 10^–9

Anmerkungen:

*Bedeutet, dass die Keimbildungs-Assaydaten bei 2,5, 1,25 und 0,6 μM der Verbindung erfasst wurden.

Die Modulatorzusammensetzungen wurden in Keimbildungs-Assays beurteilt, bei denen 5 μM Aβ_1-40 und entweder 5 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 3 μM, 1 μM oder 0,3 μM Testzusammensetzung verwendet wurden. Die Änderung in der Verzögerungszeit (ΔLag) wird als das Verhältnis der in der Anwesenheit der Testzusammensetzung (bei entweder 5 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 3 μM, 1 μM oder 0,3 μM) to der Verzögerungszeit der Kontrolle beobachteten Verzögerungszeit dargestellt. Tabelle III

PPI#	STRUCTURE	Fibril binding Kd's cmpd
PPI-504	TFA·H-(l[3-l]y-fa)-NH₂
PPI-1181	TFA·H-(lvffl)-NH-Et
PPI-1465	TFA·H-lvffl-NH-CH₂-NH₂	3.6 × 10^–9
PPI-1603	TFA·H-(GGGlvffl)-NH₂
PPI-1604	TFA·H-(GGGlvfyl)-NH₂
PPI-1605	TFA·H-(GGGlvf-[3-l]y-l)-NH₂
PPI-1619	2TFA·H-LVF-NH-NH-FVL-H	3.5 × 10^–8 ein Analog von 1125

PPI-1621	2TFA·H-LVF-NH-NH-fvl-H	8.7 × 10^–9 (ein Analog von 1125)
PPI-1635	TFA·H-lff-(nvl)-l-NH₂	1.4 × 10^–9
PPI-1636	TFA·H-lf[pF]f-(nvl)-l-NH₂	1.5 × 10^–9
PPI-1637	TFA·H-I-[pF]f-[pF]f-(nvl)-l-NH₂	1.8 × 10^–9
PPI-1782	TFA·Me-lvyfl-NH₂
PPI-1783	TFA·H-(lvyfl)-NH
PPI-1784	TFA·Me-(lv-[p-F]f-fl)NH₂	2.5 × 10^–9
PPI-1785	TFA·H-(lv-[p-F]f-fl)-NH₂	2.8 × 10^–9
PPI-1786	TFA·H-(lvf-[p-F]f-l)-NH₂
PP1-1787	TFA·Me-lvff-[nvl])-NH₂	5.8 × 10^–9
PPI-1788	TFA·Me-(lvff-[nle])-NH₂	(~4 × 10^–9) 3-Punkt-Assay
PPI-1799	TFA·Me-lvffl)-OH
PPI-1800	TFA·Me-(lvffl)-NH-OH	(~4 × 10^–9) 3-Punkt-Assay
PPI-1805	TFA·H-(lv-[p-F]f-f-(nvl))-NH₂
PPI-1806	TFA·Me-(l-v-[p-F]f-f-(nvl))-NH₂
PPI-1807	TFA·H-((nvl)-v-[p-F]f-f-nvl)-NH₂
PPI-1818	TFA·H-(l-(nvl)-[p-F]f-f-(nvl)-NH₂
PPI 1819	TFA·H-((nvl)-(nvl)-[p-F]f-f-(nvl))- NH₂
PPI 1820	TFA·Me-(l-(nvl)-[p-F]f-f-(nvl))-NH₂
PPI 1827	TFA·H-(lvff-(nvl))
PPI 1828	Ac-(lvffl)-NH₂
PPI 1829	Ac-(lvffl)-OH
PPI 1830	TFA·H-(lv-[3-l]y-fl)-NH₂

(nvl) = D-Norvalin
(nle) = D-Norleucin
[3-l]y = 3-Iod-D-Tyrosin
[p-F]f = para-Fluor-D-Phenylalanin

PPI-1801 ist das Acetylamid-Analog von H-LPFFD-OH über das in der Literatur berichtet wurde. Diese Verbindung wurde hergestellt und zu Vergleichszwecken auf Aktivität getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Verbindung in dem hier verwendeten Assay schwach an Fibrillen bindet.
Im Gegensatz dazu zeigen die in Tabelle I, II, und III und 2 gezeigten Ergebnisse, dass die β-Amyloid-Modulatoren der Erfindung wirksame Hemmstoffe einer Aβ-Aggregation sind.
Beispiel 6: Neurotoxizitäts-Assay
Die Neurotoxizität von natürlichem β-Amyloid-Peptid-Aggregaten kann entweder in Gegenwart oder Abwesenheit eines β-Amyloid-Modulators in einem auf Zellen basierenden Assay unter Verwendung einer von Neuronen abgeleiteten Zelllinie (PC-12-Zellen oder NT-2-Zellen) von Ratten oder des Menschen und dem Lebensfähigkeits-Indikator 3,(4,4-Dimethylthiszol-2-yl)2,5-diphenyl-tetrazolium-bromid (MTT) getestet werden. (Siehe beispielsweise Shearman, M.S. et al., (1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91: 1470-1474, Hansen, M.B. et al., (1989), J. Immun. Methods 119: 203-210 für eine Beschreibung ähnlicher auf Zellen basierender Lebensfähigkeits-Assays.) PC-12 ist eine Pheochromocytom-Zelllinie und ist im Handel von der American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC CRL, 1721) erhältlich. MTT (im Handel von Sigma Chemicals Co., erhältlich) ist ein chromogenes Substrat, das in lebenden Zellen von Gelb zu Blau umgesetzt wird, was spektrophotometrisch erfasst werden kann.
Um die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden zu testen, werden zuerst Stammlösungen von frischen Aβ-Monomeren und gealterten Aβ-Aggregaten hergestellt. Aβ_1-40 wird aus gefriergetrocknetem Pulver in 100 % DMSO hergestellt und unmittelbar in einem halben des Endvolumens in H₂O und anschließend einem halben des Endvolumens in 2x PBS so verdünnt, dass eine Endkonzentration von 200 μM Peptid, 4 % DMSO erreicht wird. Das auf diese Weise präparierte und unmittelbar an Zellen getestete Peptid wird als "frisches" Aβ-Monomer bezeichnet. um "gealterte" Aβ-Aggregate herzustellen, wird die Peptidlösung in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen angeordnet und bei 37°C für acht Tage inkubiert, so dass Fibrillen gebildet werden können. Die Neurotoxizität von frischen Monomeren und gealterten Aggregaten wird unter Verwendung von PC-12- und NT2-Zellen getestet. PC-12-Zellen werden routinemäßig in Dubecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) kultiviert, das 10 % Pferdeserum, 5 % fötales Kälberserum, 4 mM Glutamin und 1 % Gentamycin beinhaltet. NT2-Zellen werden routinemäßig in OPTI-MEM-Medium (Gibco-Brl Kat. #31985) kultiviert, das mit 10 % fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 1 % Gentamycin ergänzt wird. Die Zellen werden mit 10-15.000 Zellen pro Loch in 90 μl des frischen Mediums in einer 96-Loch-Gewebekulturplatte 3-4 Stunden vor der Behandlung ausplattiert. Die frischen oder gealterten Aβ-Peptid-Lösungen (10 μl) werden anschließend 1:10 in Gewebekulturmedium so verdünnt, dass die Endkonzentration in dem Bereich von 1-10 μM Peptid liegt. Die Zellen werden in der Anwesenheit von Peptid ohne einen Mediumswechsel für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Für die letzten drei Stunden einer Exposition der Zellen mit der β-AP-Präparation wird den Medien MTT zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben und die Inkubation wird bei 37°C fortgeführt. Nach den zwei Stunden mit MTT wird das Medium entfernt und die Zellen werden in 100 μl einer Isopropanol/0,4 N HCl-Lösung unter Bewegung lysiert. Ein gleiches Volumen PBS wird jedem Loch zugegeben und die Platten werden für zusätzliche 10 Minuten bewegt. Die Extinktion eines jeden Lochs wird bei 570 nm unter Verwendung eines Mikrotiterplattenlesegerätes erfasst, um lebende Zellen zu quantifizieren.
Unter Verwendung dieses Assays wurde die Neurotoxizität von gealterten (5 Tage oder 8 Tage) Aβ_1-40-Aggregaten alleine, jedoch nicht frischen Aβ_1-40-Monomeren alleine bestätigt. Die Experimente zeigten, dass das Inkubieren der neuronalen Zellen mit ansteigenden Mengen von frischen Aβ_1-40-Monomeren für die Zellen nicht signifikant toxisch war, wohingegen die Inkubation der Zellen mit ansteigenden Mengen von Tag 5 oder Tag 8 Aβ_1-40-Aggregaten zu einer steigenden Neurotoxizität führte. Der EC₅₀ für die Toxizität von gealterten Aβ_1-40-Aggregaten betrug 1-2 μM für sowohl die PC-12 Zellen als auch die NT2-Zellen.
Um die Wirkung einer β-Amyloid-Modulatorzusammensetzung auf die Neurotoxizität von Aβ_1-40-Aggregaten zu bestimmen, wird eine Modulatorzusammensetzung mit Aβ_1-40-Monomeren unter standardisierten Bedingungen eines Keimbildungs-Assays, wie in Beispiel 2 beschrieben vorinkubiert und zu bestimmten Zeitintervallen nach der Inkubation werden Aliquots der β-AP/Modulator-Lösung entfernt und wobei 1) die Trübheit der Lösung als eine Erfassung einer Aggregation beurteilt wird und wobei 2) die Lösung auf kultivierte neuronalen Zellen für 48 Stunden aufgebracht wird, zu welchem Zeitpunkt die Zelllebensfähigkeit bzw. -viabilität unter Verwendung von MTT bewertet wird, um die Neurotoxizität der Lösung zu bestimmen. Außerdem kann die Fähigkeit von β-Amyloid-Modulatorzusammensetzungen die Neurotoxizität von vorgeformten Aβ_1-40-Aggregaten zu verringern, getestet werden. In diesen Experimenten werden Aβ_1-40-Aggregate durch Inkubation der Monomere in der Abwesenheit von beliebigen Modulatoren ausgebildet. Die Modulatorzusammensetzung wird dann mit den vorgeformten Aβ_1-40-Aggregaten für 24 Stunden bei 37°C inkubiert, nach welcher Zeit die Aβ-Modulator-Lösung gesammelt und deren Neurotoxizität wie vorstehend beschrieben beurteilt wird.
Beispiel 7: Assay zur Stabilität einer Modulatorzusammensetzung in der Cerebrospinalflüssigkeit
Die Stabilität einer Modulatorzusammensetzung in der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) kann in einem in vitro Assay wie folgt getestet werden. Es wird eine CSF-Lösung hergestellt, die 75 % CSF vom Rhesusaffen (im Handel von Northern Research erhältlich) 23 % sterile Phosphat gepufferte Salzlösung und 2 % Dimethylsulfoxid (v/v) (Aldrich Chemicals Co., Katalog-Nr. 27,685-5) beinhaltet. Test-Modulatorzusammensetzungen werden zu der CSF-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 40 μM oder 15 μM zugegeben. Die gesamte Probenhandhabung wird unter einer Haube/Arbeitsbank mit laminarer Luftströmung ausgeführt und die Test-Lösungen werden während des Assays bei 37°C gehalten. Nach 24 Stunden wird die enzymatische Aktivität in den Lösungen durch Zugabe von Acetonitril gelöscht bzw. gestoppt, um eine Endkonzentration von 25 % (v/v) zu erzeugen. Die Proben (für den 0 Zeitpunkt und den 24 Stunden Zeitpunkt) werden bei Raumtemperatur unter Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC analysiert. Eine Kapillar-Säule wird für eine maximale Empfindlichkeit verwendet. Die Parameter für eine analytische HPLC sind wie folgt:
Lösungsmittelsystem

A: 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser (v/v)
B. 0,085 % TFA/Acetonitril, 1 % H₂O (v/v)

Injektion und Gradient

Injektion: 100-250 μl Test-Probe
Lauf: 10 % für B für 5 Min., dann 10-70 % B über 60 Min.

Die chromatographische Analyse wird unter Verwendung eines Hewlett Packard 1090 Reihe II HPLC ausgeführt. Die für die Trennung verwendete Säule ist eine C4, 5 μm, 1 × 250 mm (Vydac #214TP51). Die Flussrate beträgt 50 μl/Min. und das Elutionsprofil der Testzusammensetzungen wird bei 214, 230, 260 und 280 nm überwacht.
Beispiel 8: Assay für Aufnahme in Gehirn
Gehirnniveaus von den von Aß abgeleiteten Peptiden wurden in den Ratten nach intravenöser Verabreichung bestimmt. Unter einer Ketamin/Xylazin-Anästhesie erhielten männliche Sprague-Dawley-Ratten (219-302 g) eine intravenöse Injektion über einen Katheter, der in die linke Jugularvene (Dosisvolumen von 4 ml/kg verabreicht über 1 Minute) eingefügt war. Die tatsächlich verabreichte Dosis von jeder getesteten Verbindung ist in 1 gezeigt.
60 Minuten nach der Verabreichung wurde die linke gemeinsame Carotisarterie kanuliert bzw. mit einer Kanüle versehen, um eine Perfusion des linken Vorderhirns zu ermöglichen, um cerebrales Blut zu entfernen. Das von Blut entleerte linke Vorderhirn wurde einer Kapillardepletion unterzogen, beschriebenen durch (Triguero et al., (1990) J. Neurochem. 54: 1882-1888). Diese eingeführte Technik trennt die Hirngefäßverteilung von dem Parenchym und folglich kann die Konzentration einer untersuchten Verbindung genau bestimmt werden, die die Blut-Hirn-Schranke überquerte. Die Menge einer Eltern-Verbindung, die in dem Gehirn vorhanden war, wurde durch LC/MS/MS bestimmt.

Der vorstehend beschriebene Assay wurde verwendet, um die Gehirnaufnahme der folgenden Modulatoren zu erfassen:

Verbindungen PPI	Struktur	MW	Konz. (mg/ml)	Dosis mg/kg
1324	TFA·H-(l-[F₅]f-fvl)-NH2	841	1.20	4.9
1318	TFA·H-(lf-D-Cha-vl)-NH2	757	0.29	1.0
1319	TFA·H-(lf-[p-F]f-vl)-NH2	769	1.70	6.6
1327	TFA·H-(l-[p-F]f-[p-F]f-vl)-NH2	787	0.98	4.0
1301	TFA·H-(lvf-D-Cha-l)-NH2	757	0.70	2.9
1302	TFA·H-(lvf-[p-F]f-p)-NH2	769	0.19	0.7
1328	TFA·H-(l-[F₅]f-[F₅]f-vl)-NH2	931	0.29	1.2
1322	TFA·H-(l-D-Cha-fvl)-NH2	757	0.03	0.1
1303	TFA·H-(lvf-[F₅]f-l)-NH2	841	0.27	1.0
1326	TFA·H-(l-D-Cha-D-Cha-vl)-NH2	763	0.05	0.2
1320	TFA·H-(lf-[F₅]f-vl)-NH2	841	0.70	3.0

* Die Kleinbuchstabenschreibung bezieht sich auf eine D-Konfiguration.

Diese Ergebnisse sind in der 1 zusammengefasst.

Die hier beschriebenen β-Amyloid-Modulatorzusammensetzungen sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. Tabelle IV

PPI#	Beschreibung	SEQ ID NO
803	TFA·N,N-dimethyl-(Gaffvl)-NH₂
913	TFA·N,N-dimethyl-(affvl)-NH₂
918	TFA·H-(l-[Me]v-ffa)-NH₂
968	TFA·N-methyl-(Gaffvl)-NH₂
969	TFA·N-ethyl-(Gaffvl)-NH₂
970	TFA·N-isopropyl-(Gaffvl)-NH₂
992	TFA·H-(lvffa)-isopropylamide
993	TFA·H-(lvffa)-dimethylamide
E 1005	TFA·N,N-diethyl-(Gaffvl)-NH₂
1006	TFA·N,N-diethyl-(affvl)-NH₂
1007	TFA·N,N-dimethyl-(lvffl)-NH₂
1008	TFA·N,N-dimethytl(lffvl)-NH₂
1013	TFA·H-(Glvffl)-NH₂
1017	TFA·N-ethyl-(Glvffl)-NH₂
1018	TFA·N-ethyl-(Glffvl)-NH₂
1020	TFA·N-methyl-(lffvl)-NH₂
1022	TFA·N-ethyl-(lvffl)-NH₂
1025	TFA·N-propyl-(lvffl)-NH₂
1028	TFA·N,N-diethyl-(Glvffl)-NH₂
1038	TFA·H-(ivffi)-NH₂
1039	TFA·H-(ivffa)-NH₂
1040	TFA·H-(iiffi)-NH₂
1041	TFA·H-(D-Nle-vffa)-NH₂
1042	TFA·H-(D-Nle-vff-D-Nle)-NH₂
1088	TFA·l-piperidine-acetyl-(lvffl)-NH₂
108	TFA·l-piperidine-acetyl-(lffv)-NH₂
1093	TFA·H-lvffl-isopropylamide

1094	TFA·H-lffvl-isopropylamide
1179	TFA·H-(lvfll)-methylamide
1180	TFA·H-(lffvl)-methylamide
1261	TFA·H-(lvffl)-OH
1019	TFA·N-methyl-(lvffl)-NH₂
1301	TFA·H-(lvf-D-Cha-l)-NH₂
1302	TFA·H-(lvf-[p-F]f-l)-NH₂
1303	TFA·H(lvf-[F₅]f-l)-NH₂
1306	N-methyl-(lvf-D-Cha-l)-NH₂
1307	N-methyl-(lvf-[p-F]f-l)-NH₂
1308	N-methyl-(lvf-[F₅]f-l)-NH₂
1318	TFA·H-(lf-D-Cha-vl)-NH₂
1319	TFA·H-(lf-[p-F]f-vl)-NH₂
1320	TFA·H-(lf-[F₅]f-vl)-NH₂
1321	TFA·H-(lfkvl)-NH₂
1322	TFA·H-(l-D-Cha-fvl)-NH₂
1323	TFA·H-(l-[p-F]f-fvl)-NH₂
1324	TFA·H-(l-[F₅]f-fvl)-NH₂
1325	TFA·H-(lkfvl)-NH₂
1326	TFA·H-(l-D-Cha-D-Cha-vl)-NH₂
1327	TFA·H-(l-[p-F]f-[p-F]f-vl)-NH₂
1328	TFA·H-(l-[F₅]f-[F₅]f-vl)-NH₂
1329	TFA·H-(lkkvl)-NH₂
1125	TFA·H-lvf-NH-NH-fvl-H
1133	TFA·H-lvf-NH-NH-Acetyl
1155	TFA·H-lvf-NH-NH₂

Äquivalente
Der Fachmann wird zahlreiche Äquivalente zu den hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen der Erfindung erkennen oder unter Verwendung von nicht mehr als einem Routineexperimentieren fähig sein sie zu ermitteln. Derartige Äquivalente sind vorgesehen durch die folgenden Ansprüche umfasst zu sein.
SEQUENZLISTE

Claims

Verbindung der Struktur N-Methyl-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH₂.
Verbindung, umfassend die Struktur: N-Methyl-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH₂.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung eine Formulierung mit Langzeitfreisetzung ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung geeignet ist, die Verbindung über die Blut-Hirn-Schranke zu transportieren.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments für die Inhibition der Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden in einem Subjekt.
Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart oder der Abwesenheit von natürlichen β-Amyloid-Peptiden in einer biologischen Probe in vitro, umfassend: In Kontakt Bringen einer biologischen Probe mit der Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindung mit einer nachweisbaren Substanz markiert ist, und Nachweisen der an natürliche β-Amyloid-Peptide gebundenen Verbindung, um dadurch die Gegenwart oder die Abwesenheit von natürlichen β-Amyloid-Peptiden in der biologischen Probe nachzuweisen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Verbindung mit radioaktivem Technetium oder radioaktivem Iod markiert ist.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Diagnose einer Störung, welche mit β-Amyloidose assoziiert ist, in einem Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Störung Alzheimer-Krankheit ist.