PT1161449E - Moduladores de agregação do péptido beta-amilóide compreendendo d-aminoácidos - Google Patents

Description

ΕΡ 1 161 449/ΡΤ DESCRIÇÃO "Moduladores da agregação do péptido beta-amilóide compreendendo D-aminoácidos"

Antecedentes da invenção A doença de Alzheimer (DA), descrita pela primeira vez pelo psiquiatra bávaro Alois Alzheimer em 1907, é um distúrbio neurológico progressivo que começa com perda de memória de curto prazo e progride para desorientação, dificuldade de julgamento e raciocínio e, finalmente, demência. A evolução da doença leva normalmente à morte num estado imóvel, gravemente debilitado, entre quatro e 12 anos após o seu início. Foi estimado que a DA afecta 5 a 11 porcento da população com idade superior a 65 anos e tanto quanto 47 porcento da população com idade superior a 85 anos. Os custos para a sociedade resultantes de lidar com a DA são para cima de 80 biliões de dólares anualmente, essencialmente devido à enorme necessidade de prestação de cuidados que os pacientes com DA têm. Além disso, à medida que os adultos nascidos durante o boom populacional dos anos 40 e 50 atingem a idade em que há maior prevalência de DA, o controlo e tratamento da DA vai-se tornando um problema de saúde cada mais maior. Actualmente, não há nenhum tratamento que retarde significativamente a progressão da doença. Para revisões sobre DA, veja-se Selkoe, D.J. Sei. Amer., Novembro 1991, pp. 68-78; e Yankner, B.A. et al. (1991) N. Eng. J. Med. 325:1849-1857.

Foi referido recentemente (Games et al. (1995) Nature 373:523-527) que foi criada uma neuropatologia do tipo Alzheimer em ratinhos transgénicos. Os ratinhos transgénicos expressam níveis elevados da proteína precursora amilóide mutante, humana e desenvolvem progressivamente muitas das condições patológicas associadas com a DA.

Patologicamente, a DA caracteriza-se pela presença de lesões características no cérebro da vítima. Estas lesões cerebrais incluem filamentos intracelulares anormais designados por emaranhados neurofibrilares (NTF) e depósitos extracelulares de proteínas amiloidogénicas em placas senis ou amilóides. Os depósitos amilóides também estão presentes nas 2 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ paredes de vasos sanguíneos cerebrais de pacientes com DA. O principal constituinte proteico das placas amilóides foi identificado como um péptido de 4 quilodalton designado por péptido β-amilóide (β-ΑΡ) (Glenner, G.G. e Wong, C.W. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:885-890; Masters, C. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:4245-4249). Os depósitos difusos de β-ΑΡ são frequentemente observados em cérebros de adulto normais, enquanto que o tecido cerebral na DA se caracteriza por placas β-amilóides de núcleo denso, mais compactas (veja-se e.g., Davies, L. et al. (1988) Neurology 38:1688-1693). Estas observações sugerem que a deposição de β-ΑΡ precede e contribui para a destruição de neurónios que ocorre na DA. Outro suporte para o papel patogénico directo do β-ΑΡ provém do facto de se ter verificado que o β-amilóide é tóxico para neurónios maduros, quer em cultura, quer in vivo. Yankner, B.A. et al. (1989) Science 245:417-420; Yankner, B.A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:9020-9023; Roher, A.E. et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 174:572-579; Kowall, N.w. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:7247-7251. Além disso, verificou-se que os pacientes com hemorragia cerebral hereditária com amiloidose tipo holandês (HCHWA-D) que se caracteriza por depósitos β-amilóides difusos no córtex cerebral e vasculatura cerebral, têm uma mutação pontual que leva a uma substituição de aminoácidos no β-ΑΡ. Levy, E. et al. (1990) Science 248:1124-1126. Esta observação demonstra que uma alteração específica na sequência de β-ΑΡ pode fazer com que o β-amilóide seja depositado. Ο β-ΑΡ natural é derivado por proteólise de uma proteína muito maior designada por proteína precursora amilóide (APP). Kang. J. et al. (1987) Nature 325:733; Goldgaber, D. et al. (1987) Science 235:877; Robakis, N.K. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:4190; Tanzi, R.E. et al. (1987) Science 235:880. O gene de APP está mapeado no cromossoma 21, proporcionando assim uma explicação para a deposição de β-amilóide observada numa idade precoce em indivíduos com síndrome de Down, que é causada pela trissomia do cromossoma 21. Mann, D.M. et al. (1989) Neuropathol. Appl. Neurobiol. 15:317; Rumble, B. et al. (1989) N. Eng. J. Med. 320: 1446. A APP contém um único domínio que atravessa a membrana, com uma região amino-terminal longa (cerca de dois terços da proteína) que se estende para o meio extracelular e 3 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ uma região carboxilo-terminal mais curta, que se projecta para o citoplasma. 0 corte e rearranjo diferencial do ARN mensageiro de APP origina pelo menos cinco formas de APP, compostas quer por 563 aminoácidos (APP-563), 695 aminoácidos (APP-695), 714 aminoácidos (APP-714), 751 aminoácidos (APP-751) ou 770 aminoácidos (APP-770).

Na APP, o péptido β-amilóide que ocorre naturalmente começa num resíduo de ácido aspártico na posição de aminoácido 672 de APP-770. Ο β-ΑΡ que ocorre naturalmente derivado da proteólise de APP tem 39 a 43 resíduos de aminoácido de comprimento, dependendo do ponto final do terminal carboxilo que exibe heterogeneidade. A forma predominante de β-ΑΡ circulante no sangue e fluido cerebrospinal quer de pacientes com DA, quer de adultos normais, é a βΐ—40 ("β curto") . Seubert, P. et al. (1992) Nature 359:325; Shoji, M. et al. (1992) Science 258:126. No entanto, a βΐ—4 2 e βΐ—43 ("β curto") também são formas de placas β-amilóides. Masters, c. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:4245 ; Miller, D. et al. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 301:41; Mori, H. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:17082. Embora o mecanismo molecular preciso que leva à agregação e deposição de β-ΑΡΡ não seja conhecido, o processo foi comparado com o de polimerizações dependentes de nucleação, tais como cristalização de proteínas, formação de microtúbulos e polimerização de actina. Veja-se, e.g., Jarrett, J.T. e Lansbury, P.T. (1993) Cell 73:1055-1058. Nestes processos, a polimerização de componentes monoméricos não ocorre até à formação do núcleo. Assim, estes processos são caracterizados por um tempo de retardo antes de ocorrer a agregação, seguido de uma polimerização rápida após a nucleação. A nucleação pode ser acelerada pela adição de uma "semente", ou núcleo pré-formado, que resulta numa polimerização rápida. Verificou-se que as formas β longas de β-ΑΡ actuam como sementes, acelerando desse modo a polimerização de ambas as formas de β-ΑΡ, longa e curta. Jarrett, J.T. et al. (1993) Biochemistry 32:4693.

Num estudo em que se fizeram substituições de aminoácidos em β-ΑΡ, foi descrito que dois péptidos β mutantes interferem com a polimerização de β-ΑΡ não mutada, quando se misturaram as formas mutante e não mutante do péptido. Hilbich, C. et al. 4 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ (1992) J. Μοί. Βϊοΐ. 228:460-473. Utilizaram-se quantidades equimolares dos péptidos β-amilóides mutante e não mutante (i.e. natural) para ver este efeito e os péptidos mutantes foram descritos como inadequados para utilização in vivo. Hilbich, C. et al. (1992), supra. A W096/28471 descreve péptidos de vários comprimentos que modulam a agregação de proteínas amiloidogénicas. Os péptidos consistem de aminoácidos que ocorrem naturalmente, i.e., L-isómeros que foram modificados. A W097/21728 descreve moduladores de agregação de β-amilóide com base em duas fórmulas genéricas que consistem de uma estrutura nuclear de quatro aminoácidos que podem ser D- ou L-isómeros. A posição 2 é predeterminada como um resíduo de leucina e os aminoácidos C- e N-terminais podem ser modificados.

Verificou-se que a propriedade do péptido Lys-Leu-Val-Phe-Phe para romper a formação de fibrilhas de amilóide se baseia na ligação estereotípica do péptido com a sequência homóloga de Αβ (Tjernberg et al. (1997) Journal of Biological Chemistry 272: 12601-12605). Devido a esta constatação, foi identificado um motivo geral de cinco D-aminoácidos que compreende fenilalanina na segunda posição e leucina na terceira posição, para impedir a formação de fibrilhas de amilóide. A WO98/08868 descreve compostos que compreendem uma estrutura peptídica, de preferência seleccionados de um grupo de 22 estruturas e grupos modificadores que modulam a agregação de β-amilóide. Os grupos modificadores podem ser grupos alquilo cíclicos, heterocíclicos ou ramificados.

Sumário da invenção A presente invenção refere-se a compostos e suas composições farmacêuticas que se podem ligar a péptidos β-amilóides (β-ΑΡ) naturais, modulam a agregação de β-ΑΡ natural e/ou inibem a neurotoxicidade de β-ΑΡ naturais. Os compostos são modificados de um modo que permite uma maior bioestabilidade e níveis plasmáticos elevados prolongados. Os 5 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ compostos moduladores de β-amilóide da invenção compreendem uma estrutura peptídica, de preferência baseada no péptido β-amilóide, que é composta totalmente por D-aminoácidos. Em várias concretizações, a estrutura peptidica do composto modular compreende uma sequência de D-aminoácidos correspondente a uma sequência de L-aminoácidos encontrada na β-ΑΡ natural, uma sequência de D-aminoácidos que é um isómero inverso de uma sequência de L-aminoácidos encontrada na β-ΑΡ natural, uma sequência de D-aminoácidos que é um isómero retro-inverso de uma sequência de L-aminoácidos encontrada numa β-ΑΡ natural ou uma sequência de D-aminoácidos que é uma versão baralhada ou substituída de uma sequência de L-aminoácidos encontrada na β-ΑΡ natural. De preferência, a estrutura peptídica de D-aminoácidos do modulador é concebida com base numa sub-região do β-ΑΡ natural nas posições 17-21 (Αβ17_2o e Αβi7-21, respectivamente) que tem as sequências de aminoácido Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID NO:4). Em concretizações preferidas, uma fenilalanina nos compostos da invenção é substituída por um análogo de fenilalanina que é mais estável e menos propenso a, por exemplo, metabolismo oxidativo, ou permite níveis cerebrais do composto aumentados.

Ainda noutra concretização, um composto modular da invenção inclui um péptido β-amilóide constituído por D-aminoácidos, um isómero inverso de um péptido β-amilóide, ou um isómero retro-inverso de um péptido β-amilóide que está ligado a uma porção de hidrazina, em que o composto se liga a péptidos β-amilóides naturais ou modula a agregação ou inibe a neurotoxicidade de péptidos β-amilóides naturais quando contactado com os péptidos β-amilóides naturais.

Um composto modular da invenção compreende de preferência 3-20 D-aminoácidos, mais preferencialmente 3-10 D-aminoácidos e ainda mais preferencialmente 3-5 D-aminoácidos. O terminal amino e o terminal carboxilo da estrutura peptídica de D-aminoácidos do modulador são ambos modificados. Por exemplo, pode-se utilizar um grupo modificador do terminal N que aumenta a capacidade do composto inibir a agregação de Αβ. Além disso, o terminal amino e/ou carboxilo do péptido podem ser modificados para alterar uma propriedade farmacocinética do composto (tal como instabilidade, biodisponibilidade, e.g., fornecimento aumentado do composto através da barreira 6 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ hematoencefálica e entrada no cérebro, e semelhantes). Grupos modificadores de terminal amino preferidos incluem grupos alquilo, e.g., grupos metilo, etilo ou isopropilo. Grupos modificadores de terminal carboxilo preferidos incluem grupos amida, grupos alquilo ou arilamida (e.g., fenetilamida), grupos hidroxilo (í.e. produtos de redução de ácidos de péptidos, resultando em álcoois de péptidos), grupos acilamida e grupos acetilo. Além disso, um composto modulador pode ser modificado para marcar o composto com uma substância detectável (e.g. um marcador radioactivo).

Numa determinada concretização preferida, a invenção proporciona um composto que tem a estrutura: N-metil-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2.

Outro aspecto da invenção refere-se a composições farmacêuticas. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto modulador da invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável.

Ainda outro aspecto da invenção refere-se a métodos para inibir a agregação de péptidos β-amilóides naturais. Estes métodos compreendem contactar os péptidos β-amilóides naturais com um composto modulador da invenção, de modo que a agregação dos péptidos β-amilóides naturais é inibida.

Ainda outro aspecto da invenção refere-se a métodos para detectar a presença ou ausência de péptidos β-amilóides naturais numa amostra biológica. Estes métodos compreendem contactar uma amostra biológica com um composto da invenção, em que o composto é marcado com uma substância detectável e detectar o composto ligado a péptidos β-amilóides naturais para detectar desse modo a presença ou ausência de péptidos β-amilóides naturais na amostra biológica in vitro.

Ainda outro aspecto da invenção refere-se à utilização dos moduladores da invenção para terapia, ou para o fabrico de um medicamento para o tratamento de um distúrbio associado com β-amiloidose também é contemplado pela invenção. A utilização compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto modulador da invenção, 7 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ de modo que o indivíduo é tratado para um distúrbio associado com β-amiloidose. De preferência, o distúrbio é a doença de Alzheimer.

Breve descrição das Figuras A Figura 1 é uma tabela que mostra os resultados de um ensaio de incorporação no cérebro. A Figura 2 é um gráfico que mostra os resultados do ensaio de ligação de fibrilhas descrito no Exemplo 2.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção refere-se a compostos e suas composições farmacêuticas que se podem ligar a péptidos β-amilóides naturais, modular a agregação de péptidos β-amilóides naturais (β-ΑΡ) e/ou inibir a neurotoxicidade de β-ΑΡ naturais. Os compostos são modificados de um modo que permite uma maior bioestabilidade e níveis plasmáticos elevados prolongados. Um composto da invenção que modula a agregação de β-ΑΡ natural aqui designado de forma interpermutável como composto modulador de β-amilóide, modulador de β-amilóide, ou simplesmente modulador, altera a agregação de β-ΑΡ natural quando o modulador é contactado com β-ΑΡ natural. Assim, um composto da invenção actua para alterar o processo ou taxa de agregação natural de β-ΑΡ, rompendo desse modo este processo. De preferência, os compostos inibem a agregação de β-ΑΡ. Os compostos da invenção são caracterizados por compreender uma estrutura peptídica composta totalmente por resíduos de D-aminoácidos. Esta estrutura peptídica baseia-se de preferência no péptido β-amilóide e pode compreender, por exemplo, uma sequência de D-aminoácidos correspondente a uma sequência de L-aminoácidos encontrada no β-ΑΡ natural, uma sequência de D-aminoácidos que é um isómero inverso de uma sequência de L-aminoácidos encontrada no β-ΑΡ natural, uma sequência de D-aminoácidos que é um isómero retro-inverso de uma sequência de L-aminoácidos encontrada no β-ΑΡ natural, ou uma sequência de D-aminoácidos que é uma versão baralhada ou substituída de uma sequência de L-aminoácidos encontrada no β-ΑΡ natural. Em concretizações preferidas, as fenilalaninas nos compostos da invenção são 8 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ substituídas com análogos de fenilalanina que são mais estáveis e menos propensos a, por exemplo, metabolismo oxidativo. A invenção inclui compostos moduladores compreendendo uma estrutura peptídica de D-aminoácidos em que o terminal amino e o terminal carboxilo da estrutura peptídica são modificados.

Os compostos moduladores de β-amilóide da invenção podem ser seleccionados com base na sua capacidade para se ligar a péptidos β-amilóides naturais, modular a agregação de β-ΑΡ natural in vitro e/ou inibir a neurotoxicidade de fibrilhas de β-ΑΡ natural para células em cultura (utilizando ensaios aqui descritos, por exemplo, o ensaio de neurotoxicidade, o ensaio de nucleação, ou o ensaio de ligação de fibrilhas). Compostos moduladores preferidos inibem a agregação de β-ΑΡ natural e/ou inibem a neurotoxicidade de β-ΑΡ natural. No entanto, os compostos moduladores seleccionados, baseados em uma ou ambas estas propriedades podem ter propriedades adicionais in vivo que podem ser benéficas no tratamento da amiloidose (J. S. Pachter et al. (1998) "Αβ1-40 induced neurocytopathic activation of human monocytes is blocked by Αβ peptide aggregation inhibitors." Neurobiology of Aging (resumos: The 6th International Conference on Alzheimer's Disease and Related Disorders, Amsterdão, 18-23 Julho de 1998) 19, S128 (Resumo 540); R. Weltzein, A. et al. (1998) "Phagocytosis of Beta-Amyloid: A Possible Requisite for Neurotoxicity." J. Neuroimmunology (edição especial: Abstracts of the International Society of Neuroimmunology Fifth International Congress, Montreal, Canadá, 23-27 Agosto de 1998) 1998, 90, 32 (resumo 162)). Por exemplo, o composto modulador pode interferir com o processamento do β-ΑΡ natural (quer por inibição directa ou indirecta da protease), ou por modulação de processos que produzem β-ΑΡ tóxico, ou outros fragmentos de APP in vivo. Alternativamente, os compostos moduladores podem ser seleccionados com base nestas últimas propriedades, em vez da inibição da agregação in vitro. Além disso, os compostos moduladores da invenção que são seleccionados com base na sua interacção com β-ΑΡ natural também podem interagir com APP ou com outros fragmentos de APP. Além disso, um composto modulador da invenção pode ser caracterizado pela sua capacidade de se ligar a fibrilhas de β-amilóide (o que pode 9 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ ser determinado, por exemplo, por marcação radioactiva do composto, contacto do composto com a placa β-amilóide e contagem ou detecção, e.g., por imagiologia, do composto ligado a formas patológicas de β-ΑΡ, e.g., a placa), apesar de não alterar significativamente a agregação das fibrilhas de β-amilóide. Pode-se utilizar um composto destes que se liga eficazmente às fibrilhas de β-amilóide, mas que não altera significativamente a agregação das fibrilhas de β-amilóide, por exemplo, para detectar fibrilhas de β-amilóide (e.g., para fins de diagnóstico, como aqui descrito mais à frente) . Deve ter-se em conta, no entanto, que a capacidade de um composto particular se ligar a fibrilhas de β-amilóide e/ou modular a sua agregação pode variar dependendo da concentração do composto. Deste modo, um composto que, a uma concentração baixa, se liga a fibrilhas de β-amilóide sem alterar a sua agregação pode, apesar de tudo, inibir a agregação das fibrilhas a uma concentração mais elevada. Todos estes compostos com a propriedade de se ligar a fibrilhas de β-amilóide e/ou modular a agregação das fibrilhas são abrangidos pela invenção.

Tal como aqui utilizado, um "modulador" da agregação de β-amilóide refere-se a um agente que quando contactado com péptidos β-amilóides naturais altera a agregação dos péptidos β-amilóides naturais. 0 termo "agregação de péptidos β-amilóides" refere-se a um processo em que os péptidos se associam uns com os outros para formar um complexo multimérico, bastante insolúvel. 0 termo "agregação" também pretende incluir a formação de fibrilhas de β-amilóide e também abrange placas β-amilóides.

Os termos "péptido β-amilóide natural", "β-ΑΡ natural" e "péptido β-ΑΡ natural" aqui utilizados indiferentemente, pretendem incluir produtos de clivagem proteolítica da proteína precursora β-amilóide (APP) que ocorrem naturalmente, que estão envolvidos na agregação de β-ΑΡ e β-amiloidose. Estes péptidos naturais incluem péptidos β-amilóides com 39-43 aminoácidos (í.e., Αβι_39, Αβι_40, Αβι_4ι, Αβ4_42 e Αβ4_43) . 0 resíduo de aminoácido amino-terminal do β-ΑΡ natural corresponde ao resíduo de ácido aspártico na posição 672 da forma de 770 resíduos de aminoácido da proteína precursora amilóide ("APP-770"). A forma longa de 43 aminoácidos do β-ΑΡ 10 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ natural tem a sequência de aminoácidos DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIAT (também apresentada na SEQ ID NO:l), enquanto que as formas mais curtas têm 1-4 resíduos de aminoácido eliminados da extremidade carboxilo-terminal. A sequência de aminoácidos de APP-770 da posição 672 (í.e. o terminal amino do β-ΑΡ natural) até ao seu terminal C (103 aminoácidos) é apresentada na SEQ ID NO:2. A forma preferida do β-ΑΡ natural para utilização em ensaios de agregação aqui descritos é Αβι_40 ou Αβι_42.

Na presença de um modulador da invenção, a agregação de péptidos β-amilóides naturais é "alterada" ou "modulada". As várias formas do termo "alteração" ou "modulação" pretendem incluir quer inibição da agregação de β-ΑΡ, quer promoção da agregação de β-ΑΡ. A agregação de β-ΑΡ natural é "inibida" na presença do modulador quando há um decréscimo na quantidade e/ou velocidade de agregação de β-ΑΡ em comparação com a quantidade e/ou velocidade de agregação de β-ΑΡ na ausência do modulador. As várias formas do termo "inibição" pretendem incluir quer inibição completa, quer parcial da agregação de β-ΑΡ. A inibição da agregação pode ser quantificada como a magnitude do aumento do tempo de retardo para a agregação, ou como o decréscimo no nível de patamar geral de agregação (í.e. a quantidade total de agregação) utilizando um ensaio de agregação como descrito nos Exemplos. Em várias concretizações, um modulador da invenção aumenta o tempo de retardo de agregação pelo menos 1,2-vezes, 1,5- vezes, 1,8-vezes, 2- vezes, 2,5- vezes, 3- vezes, 4- vezes ou 5- vezes, por exemplo, quando o composto está num equivalente molar em relação à β-ΑΡ. Em várias outras concretizações, um modulador da invenção inibe o nível de patamar de agregação pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75% ou 100%.

Um modulador que inibe a agregação de β-ΑΡ (um "composto modulador inibitório") pode ser utilizado para prevenir ou atrasar o início da deposição de β-amilóide. De preferência, os compostos moduladores inibitórios da invenção inibem a formação e/ou actividade de agregados neurotóxicos do péptido Αβ natural (i.e. os compostos inibitórios podem ser utilizados para inibir a neurotoxicidade de β-ΑΡ). Adicionalmente, os compostos inibitórios da invenção podem reduzir a neurotoxicidade de agregados de β-ΑΡ pré-formados, indicando 11 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ que os moduladores inibitórios podem ou ligar-se a fibrilhas de Αβ pré-formadas, ou a agregados solúveis e modular a sua neurotoxicidade inerente, ou que os moduladores podem perturbar o equilíbrio entre formas monoméricas e agregadas de β-ΑΡ em favor da forma não neurotóxica.

Numa concretização preferida, os moduladores da invenção são capazes de alterar a agregação de β-ΑΡ quando contactados com uma quantidade de excesso molar de β-ΑΡ natural. Uma "quantidade de excesso molar de β-ΑΡ natural" refere-se a uma concentração de β-ΑΡ natural, em moles, que é maior do que a concentração, em moles, do modulador. Por exemplo, se o modulador e ο β-ΑΡ estão ambos presentes a uma concentração de 1 μΜ, diz-se que são "equimolares", enquanto que se o modulador está presente a uma concentração de 1 μΜ e ο β-ΑΡ está presente a uma concentração de 5 μΜ, diz-se que ο β-ΑΡ está presente numa quantidade de um excesso molar de 5 vezes em comparação com o modulador. Em concretizações preferidas, um modulador da invenção é eficaz em alterar a agregação de β-ΑΡ natural quando ο β-ΑΡ natural está presente num excesso molar de pelo menos 2 vezes, 3 vezes ou 5 vezes em comparação com a concentração do modulador. Noutras concretizações, o modulador é eficaz em alterar a agregação de β-ΑΡ quando o β-ΑΡ natural está presente num excesso molar de pelo menos 10 vezes, 20 vezes, 33 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 500 vezes ou 1000 vezes, em comparação com a concentração do modulador.

Tal como aqui utilizado, o termo "péptido β-amilóide constituído totalmente por D-aminoácidos", tal como utilizado num modulador da invenção, inclui péptidos com uma sequência de aminoácidos idêntica à da sequência natural em APP, bem como péptidos com substituições de aminoácidos aceitáveis a partir da sequência natural, mas que são compostos por D-aminoácidos em vez dos L-aminoácidos naturais presentes no β-ΑΡ natural. As substituições de aminoácidos aceitáveis são as que não afectam e/ou podem melhorar a capacidade do péptido que contém os D-aminoácidos alterar a agregação natural de β-ΑΡ. Além disso, substituições de aminoácidos particulares podem também contribuir para a capacidade do péptido alterar a agregação de β-ΑΡ natural e/ou podem conferir propriedades benéficas adicionais ao péptido (e.g. maior solubilidade, menor associação com outras proteínas amilóides, etc.). Um 12 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ péptido com uma sequência de aminoácidos idêntica à encontrada no péptido mãe, mas em que todos os L-aminoácidos foram substituídos com todos os D-aminoácidos, também é designado por composto "inverso". Por exemplo, se um péptido mãe é Thr-Ala-Tyr, a forma inversa é D-Thr-D-Ala-D-Tyr.

Tal como aqui utilizado, o termo "isómero retro-inverso de um péptido β-amilóide", tal como utilizado num modulador da invenção, pretende incluir péptidos em que a sequência dos aminoácidos está invertida em comparação com a sequência na β-ΑΡ natural e todos os L-aminoácidos são substituídos por D-aminoácidos. Por exemplo, se um péptido mãe é Thr-Ala-Tyr, a forma retro-inversa é is D-Tyr-D-Ala-D-Thr. Em comparação com o péptido mãe, um péptido retro-inverso tem um esqueleto invertido, mantendo ao mesmo tempo substancialmente a conformação espacial original das cadeias laterais, resultando num isómero retro-inverso com uma topologia que se assemelha bastante ao péptido mãe. Veja-se Goodman et al. "Perspectives in Peptide Chemistry" pp. 283-294 (1981). Veja-se também patente U.S. N° 4522752 de Sisto, para uma melhor descrição de péptidos "retro-inversos".

Nas subsecções seguintes descrevem-se em maior detalhe vários aspectos adicionais dos moduladores da invenção e suas utilizações. I. Compostos moduladores

Numa concretização, um composto modulador da invenção compreende um péptido β-amilóide, sendo o péptido β-amilóide totalmente constituído por D-aminoácidos, em que o composto se liga a péptidos β-amilóides naturais, ou modula a agregação, ou inibe a neurotoxicidade de péptidos β-amilóides naturais quando contactado com os péptidos β-amilóides naturais. De preferência, o péptido β-amilóide do modulador é constituído por 3-20 D-aminoácidos, mais preferencialmente 3- 10 D-aminoácidos e ainda mais preferencialmente 3- 5 D-aminoácidos. Em concretizações preferidas, uma fenilalanina nos compostos da invenção é substituída com um análogo de fenilalanina que é mais estável e menos propenso a, por exemplo, metabolismo oxidativo. 13 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ

Numa concretização, ο péptido β-amilóide do modulador é modificado no terminal amino, por exemplo, com um grupo modificador que compreende um grupo alquilo, tal como um grupo alquilo inferior C1-C6, e.g., um grupo metilo, etilo ou propilo, ou um grupo alquilo cíclico, heterocíclico, policíclico ou ramificado. Exemplos de grupos modificadores de terminal N adequados estão descritos em maior detalhe na subsecção II a seguir. Noutra concretização, o péptido β-amilóide do modulador é modificado no terminal carboxilo, por exemplo, o modulador pode compreender uma amida de péptido, uma alquil- ou arilamida de péptido (e.g., uma fenetilamida de péptido), ou um álcool de péptido. Exemplos de grupos modificadores de terminal C adequados são descritos em maior detalhe nas subsecções II e III a seguir. 0 péptido β-amilóide do modulador pode ser modificado para aumentar a capacidade do modulador alterar a agregação ou neurotoxicidade de β-ΑΡ. Adicional ou alternativamente, o péptido β-amilóide do modulador pode ser modificado para alterar uma propriedade farmacocinética do modulador e/ou para marcar o modulador com uma substância detectável (descrito em mais detalhe na subsecção III a seguir).

Noutra concretização, um composto modulador da invenção compreende um isómero retro-inverso de um péptido β-amilóide, em que o composto se liga a péptidos β-amilóides naturais, ou modula a agregação, ou inibe a neurotoxicidade de péptidos β-amilóides naturais quando contactado com os péptidos β-amilóides naturais. De preferência, o isómero retro-inverso do péptido β-amilóide é constituído por 3-20 D-aminoácidos, mais preferencialmente 3-10 D-aminoácidos e ainda mais preferencialmente 3-5 D-aminoácidos. Em concretizações preferidas, as fenilalaninas nos compostos da invenção são substituídas com análogos de fenilalanina que são mais estáveis e menos propensos a, por exemplo, metabolismo oxidativo.

Numa concretização, o isómero retro-inverso é modificado no terminal amino, por exemplo com um grupo modificador que compreende um grupo alquilo, tal como um grupo alquilo inferior C1-C6, e.g., um grupo metilo, etilo ou propilo; ou um grupo alquilo cíclico, heterocíclico, policíclico ou ramificado. Exemplos de grupos modificadores de terminal N 14

ΕΡ 1 161 449/PT adequados são descritos em detalhe na subsecção II a seguir. Noutra concretização, o isómero retro-inverso é modificado no terminal carboxilo, por exemplo com um grupo amida, um grupo alquilo ou arilamida (e.g. fenetilamida) ou um grupo hidroxilo (i.e. o produto de redução de um ácido de péptido, resultando num álcool de péptido). Exemplos de grupos modificadores de terminal C adequados são descritos em maior detalhe nas subsecções II e III a seguir. 0 isómero retro-inverso pode ser modificado para aumentar a capacidade do modulador alterar a agregação ou neurotoxicidade de β-ΑΡ. Adicional ou alternativamente, o isómero retro-inverso pode ser modificado para alterar uma propriedade farmacocinética do modulador e/ou para marcar o modulador com uma substância detectável (descrita em maior pormenor na subsecção III a seguir).

Ainda noutra concretização, um composto modulador da invenção inclui um péptido β-amilóide constituído total ou parcialmente por D-aminoácidos, um isómero inverso de um péptido β-amilóide, ou um isómero retro-inverso de um péptido β-amilóide que está ligado a uma porção de hidrazina, em que o composto se liga a péptidos β-amilóides naturais, ou modula a agregação, ou inibe a neurotoxicidade de péptidos β-amilóides naturais quando contactados com os péptidos β-amilóides naturais. De preferência, o composto modulador da invenção é constituído por 1-20 D-aminoácidos, mais preferencialmente 1-10 D-aminoácidos, ainda mais preferencialmente 1-5 D-aminoácidos que estão ligados a uma porção de hidrazina.

Numa concretização, os compostos moduladores da invenção que incluem uma porção de hidrazina são modificados no terminal amino, por exemplo com um modificador que compreende um grupo alquilo, e.g., um grupo metilo, etilo ou isopropilo. Exemplos de grupos modificadores do terminal N adequados estão descritos em mais detalhe na subsecção II a seguir. Noutra concretização, os compostos moduladores da invenção que incluem uma porção de hidrazina são modificados no terminal carboxilo, por exemplo com um acetilo. Exemplos de grupos modificadores do terminal C adequados estão descritos em mais detalhe nas subsecções II e III a seguir. Os compostos moduladores da invenção que incluem uma porção de hidrazina podem ser modificados para aumentar a capacidade do modulador alterar a agregação ou neurotoxicidade de β-ΑΡ. Adicional, ou 15 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ alternativamente, os compostos moduladores da invenção que incluem uma porção de hidrazina podem ser modificados para alterar uma propriedade farmacocinética do modulador e/ou para marcar o modulador com uma substância detectável (descrita em mais detalhe na subsecção III a seguir).

Os moduladores da invenção são concebidos de preferência com base na sequência de aminoácidos de uma sub-região do β-ΑΡ natural. 0 termo "sub-região de um péptido β-amilóide natural" pretende incluir eliminações no terminal amino e/ou no terminal carboxilo de β-ΑΡ natural. 0 termo "sub-região de β-ΑΡ natural" não pretende incluir β-ΑΡ natural de comprimento total (i.e., "sub-região" não inclui Αβι_39, Αβ4_40, Αβι_41, Αβ4_42 and Αβι_43) . Uma sub-região preferida do péptido β-amilóide natural é um "domínio do núcleo de agregação Αβ" (ACD). Tal como aqui utilizado, o termo "domínio do núcleo de agregação Αβ" refere-se a uma sub-região de um péptido β-amilóide natural que é suficiente para modular a agregação de β-ΑΡ naturais quando esta sub-região, na sua forma de L-aminoácido, é modificada de forma adequada (e.g. modificada no terminal amino), como descrito em detalhe no pedido de patente U.S. com o N.° de série 08/548998 e no pedido de patente U.S. com o N.° de série 08/616081, sendo todo o seu conteúdo aqui expressamente incorporado como referência. De preferência, o ACD é modelado em relação a uma sub-região do β-ΑΡ natural que tem menos de 15 aminoácidos de comprimento e mais preferencialmente entre 3-10 aminoácidos de comprimento. Em várias concretizações, o ACD é modelado em relação a uma sub-região do β-ΑΡ que tem 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ou 3 aminoácidos de comprimento. Numa concretização, a sub-região do β-ΑΡ em relação à qual o ACD é modelado é uma região interna ou carboxilo-terminal de β-ΑΡ (i.e., a jusante do terminal amino, na posição de aminoácido 1) . Noutra concretização, o ACD é modelado em relação a uma sub-região do β-ΑΡ que é hidrófoba. Domínios de núcleo de agregação de Αβ preferidos incluem os resíduos de aminoácido 17-20 ou 17-21 do β-ΑΡ natural (Αβι7_20 e Αβΐ7_2ι, respectivamente) e seus análogos, como aqui descrito. As sequências de aminoácido de Αβι7_20 e Αβι7_24 são Leu-Val-Phe-Phe (SEQ ID NO:3) e Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID NO:4), respectivamente. 16 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ

Como demonstrado nos exemplos, os moduladores contendo D-aminoácidos concebidos com base nas sequências de aminoácido de Αβΐ7-2ο e Αβι7-2ΐ são inibidores particularmente eficazes da agregação de Αβ e exibem uma bioestabilidade aumentada e níveis plasmáticos elevados prolongados. Estes moduladores podem compreender uma sequência de D-aminoácidos que corresponde à sequência de L-aminoácidos de Αβι7_20 ou Αβι7_2ι, uma sequência de D-aminoácidos que é um isómero inverso da sequência de L-aminoácidos de Αβι7_20 ou Αβχ7_2ι, uma sequência de D-aminoácidos que é um isómero retro-inverso da sequência de L-aminoácidos de Αβι7_2ο ou Αβι7_2ι, ou uma sequência de D-aminoácidos que é uma versão baralhada ou substituída da sequência de L-aminoácidos de Αβι7_20 ou Αβι7_2ι. Em concretizações preferidas, uma fenilalanina nos moduladores concebidos com base nas sequências de aminoácidos de Αβι7_20 e Αβι7_2ι é substituída com um análogo de fenilalanina que é mais estável e menos propenso a, por exemplo, metabolismo oxidativo. Noutras concretizações preferidas, os moduladores concebidos com base nas sequências de aminoácido de Αβι7_20 ou Αβι7-2ι, compreendem também uma porção de hidrazina.

Os moduladores baseados em D-aminoácidos podem ter o terminal amino e o terminal carboxilo modificado (descrito em maior detalhe a seguir). As estruturas peptídicas de moduladores eficazes são geralmente hidrófobas e são caracterizadas pela presença de estruturas de D-aminoácidos seleccionadas do grupo constituído por uma estrutura de D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina e uma estrutura de D-valina. Tal como aqui utilizado, o termo "estrutura de D-aminoácidos" (tal como uma "estrutura de D-leucina", uma "estrutura de D-fenilalanina", ou uma "estrutura de D-valina") pretende incluir o D-aminoácido, bem como análogos, derivados e miméticos do D-aminoácido que mantêm a actividade funcional do composto (discutido em mais detalhe a seguir). Por exemplo, o termo "estrutura de D-fenilalanina" pretende incluir D-fenilalanina, bem como D-ciclo-hexilalanina [D-cha], D-4- fluorofenilalanina (para-fluorofenilalanina) { [p—F]f ou D-[p-F]Phe}, D-pentafluorofenilalanina ( [F5]f ou D-[F5]Phe}, clorofenilalanina, bromofenilalanina, nitrofenilalanina, D-piridilalanina, D-homofenilalanina, metiltirosina, e benzilserina, bem como uma substituição com a estrutura de D-lisina, estrutura de D-valina, ou uma estrutura de 17 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ D-leucina. Ο termo "estrutura de D-leucina" pretende incluir D-leucina, bem como substituição com D-valina, D-isoleucina, ou outros aminoácidos naturais ou não naturais que têm uma cadeia lateral alifática, tal como D-norleucina, ou D-norvalina. 0 termo "estrutura de D-valina" pretende incluir D-valina, bem como substituição com D-leucina, ou outro aminoácido natural ou não natural com uma cadeia lateral alifática. A invenção proporciona um composto modulador de β-amilóide compreendendo uma fórmula (I):

em que Xaa4, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 são cada um estruturas de D-aminoácidos e pelo menos dois de entre Xaa4, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 são, independentemente seleccionados do grupo constituído por uma estrutura de D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina, e.g., D-ciclo-hexilalanina, D-4-fluorofenilalanina (para-fluorofenilalanina), D-pentafluorofenilalanina, clorofenilalanina, bromofenilalanina, nitrofenilalanina, e D-homofenilalanina, e uma estrutura de D-valina; Y, que pode ou não estar presente, é uma estrutura com a fórmula (Xaa)a, em que Xaa é qualquer estrutura de D-aminoácido e a é um inteiro de 1 a 15; Z, que pode ou não estar presente, é uma estrutura com a fórmula (Xaa)b, em que Xaa é qualquer estrutura de D-aminoácido e b é um inteiro de 1 a 15; A, que pode ou não estar presente, é um grupo modificador ligado directa ou indirectamente ao composto; e n é um inteiro de 1 a 15; em que Xaa4, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Y, Z, A e n são seleccionados de modo que o composto se liga a péptidos β-amilóides naturais, ou modula a agregação ou inibe a neurotoxicidade de péptidos β-amilóides naturais quando contactado com os péptidos β-amilóides naturais, e é menos propenso a metabolismo, e.g. metabolismo oxidativo. 18 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ

Numa concretização desta fórmula, um quinto resíduo de aminoácido, Xaas, é especificado C-terminal em relação a Xaa4 e Z, que pode ou não estar presente, é uma estrutura com a fórmula (Xaa)b, em que Xaa é qualquer estrutura de D-aminoácido e b é um inteiro de 1 a 14. Deste modo, a invenção proporciona um composto modulador de β-amilóide compreendendo uma fórmula (II):

em que b é um inteiro de 1 a 14.

Noutra concretização preferida, Xaai, Xaa2, Xaa3, Xaa4 e Xaas de fórmula (II) são seleccionados com base na sequência de Αβ17-21, ou suas substituições aceitáveis. Deste modo, Xaa4 é uma estrutura de D-leucina, Xaa2 é uma estrutura de D-valina, Xaa3 é uma estrutura de D-fenilalanina, e.g., D-ciclo-hexilalanina, D-4-fluorofenilalanina (para-fluorofenilalanina), D-pentafluorofenilalanina, clorofenilalanina, bromofenilalanina, nitrofenilalanina, e D-homofenilalanina, uma estrutura de D-tirosina, uma estrutura de D-iodotirosina, ou uma estrutura de D-lisina, Xaa4 é uma estrutura de D-fenilalanina, e.g., D-ciclo-hexilalanina, D-4-fluorofenilalanina (para- fluorofenilalanina) , D-pentafluorofenilalanina, clorofenilalanina, bromofenilalanina, nitrofenilalanina, D-piridilalanina, e D-homofenilalanina, uma estrutura de D-tirosina, uma estrutura de D-iodotirosina, ou uma estrutura de D-lisina, e Xaas é uma estrutura de D-leucina.

Noutra concretização, a invenção proporciona um composto modulador de β-amilóide que compreende uma fórmula (III) :

An / (Y-XaarXaa^-KZ-Xaa^-Xaaz^Xaaj’-) NH] (ΠΙ) em que Xaa4 e Xaa2 são cada um estruturas de D-aminoácidos e pelo menos dois de entre Xaa4 e Xaa2 são, independentemente seleccionados do grupo constituído por uma estrutura de 19 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina, e.g., D-ciclo-hexilalanina, D-4-fluorofenilalanina (para-fluorofenilalanina), D-pentafluorofenilalanina, clorofenilalanina, bromofenilalanina, nitrofenilalanina e D-homofenilalanina, uma estrutura de D-tirosina, uma estrutura de D-iodotirosina, uma estrutura de D-lisina, ou uma estrutura de D-valina; NH-NH é uma estrutura de hidrazina; Y, que pode ou não estar presente, é uma estrutura com a fórmula (Xaa)a, em que Xaa é qualquer estrutura de D-aminoácido e a é um inteiro de 1 a 15;

Xaai', Xaa2', e Xaa3' são cada um estruturas de D-aminoácidos e Xaai', Xaa2' e Xaa2' são independentemente seleccionados do grupo constituído por uma estrutura de D-leucina, uma estrutura de D-fenilalanina, e.g., D-ciclo-hexilalanina, D-4-fluorofenilalanina (para-fluorofenilalanina), D-pentafluorofenilalanina, clorofenilalanina, bromofenilalanina, nitrofenilalanina, e D-homofenilalanina, ou uma estrutura de D-valina; Z, que pode ou não estar presente, é uma estrutura com a fórmula (Xaa)b, em que Xaa é qualquer estrutura de D-aminoácido e b é um inteiro de 1 a 15; A, que pode ou não estar presente, é um grupo modificador ligado directa ou indirectamente ao composto; e n é um inteiro de 1 a 15; em que Xaa2, Xaa2, Xaai', Xaa2', Xaa3', Y, Z, A e n são seleccionados de modo que o composto se liga a péptidos β-amilóides naturais, ou modula a agregação ou inibe a neurotoxicidade de péptidos β-amilóides naturais quando contactado com os péptidos β-amilóides naturais, e é menos propenso a metabolismo, e.g. metabolismo oxidativo.

Nos moduladores da presente invenção com a fórmula (II) ou (iii), um grupo modificador opcional ("A") é ligado directa ou indirectamente à estrutura peptídica do modulador. (Tal como aqui utilizado, o termo "grupo modulador" e "grupo modificador" são utilizados indiferentemente para descrever um grupo químico ligado directa ou indirectamente a uma estrutura peptídica). Por exemplo, um grupo(s) modificador pode ser ligado directamente por ligação covalente à estrutura peptídica, ou um grupo(s) modificador pode ser ligado indirectamente por uma associação não covalente, estável. Numa 20 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ concretização da invenção, um grupo modificador é ligado ao terminal amino e ao terminal carboxilo do modulador.

Ainda noutra concretização, um grupo(s) modulador é ligado à cadeia lateral de pelo menos um resíduo de aminoácido da estrutura peptídica do modulador (e.g. através do grupo epsílon-amino de um resíduo(s) de lisilo, ou outro grupo reactivo adequado numa cadeia lateral de aminoácido).

Se um grupo(s) modificador está presente, o grupo modificador é seleccionado de modo tal que o composto inibe a agregação de péptidos β-amilóides naturais quando contactado com os péptidos β-amilóides naturais.

Moduladores da invenção particularmente preferidos incluem os seguintes: D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 N-metil-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2; N-metil-(D-Leu-D-Val- D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2; N-metil-(D-Leu-D-Val-D-Phe- d- [f5] Phe-D-Leu) -nh2 .

Os compostos da invenção ainda mais preferidos incluem: PPI:1019: N-metil-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2. (Como descrito acima, D-Cha designa D-ciclo-hexilalanina; [p-F]f ou D-[p-F]Phe designa D-4-fluorofenilalanina (também para-fluorofenilalanina); [F5] f ou D-[F5]Phe designa D-pentafluorofenilalanina; e D-Nle designa D-norleucina).

As estruturas peptídicas de D-aminoácidos dos moduladores da invenção pretendem também incluir outras modificações de péptidos, incluindo análogos, derivados e miméticos que retêm a capacidade do modulador para alterar a agregação de β-ΑΡ natural, como aqui descrito. Por exemplo, uma estrutura peptídica de D-aminoácidos de um modulador da invenção pode ser também modificada para aumentar a sua estabilidade, biodisponibilidade e solubilidade. Os termos "análogo", "derivado" e "mimético" tal como aqui utilizados, pretendem incluir moléculas que mimetizam a estrutura química de uma estrutura D-peptídica e retêm as propriedades funcionais da estrutura D-peptídica. As abordagens para conceber análogos, derivados e miméticos de péptidos são conhecidas na arte. Veja-se, por exemplo, Farmer, P.S. in Drug Design (E.J. Ariens, ed.) Academic Press, Nova Iorque, 1980, vol. 10, pp. 21 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ 119-143; Bali. J.B. e Alewood, P.F. (1990) J. Mol. Recognition 3:55; Morgan, B.A. e Gainor, J.A. (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24:243; e Freidinger, R.M. (1989) Trends Pharmacol. Sei. 10:270. Veja-se também Sawyer, T.K. (1995) "Peptidomimetic Design and Chemical Approaches to Peptide Metabolism" in Taylor, M.D. e Amidon, G.L. (eds.) Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Capitulo 17; Smith. A.B. 3rd. et al. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:11113-11123; Smith, A.B. 3rd, et al. (1994) J. Am Chem. Soc. 116:9947-9962; e Hirschman, R., et al. (1993) J. Am. Chem Soc. 115 12550-12568.

Tal como aqui utilizado, um "derivado" de um composto X (e.g. um péptido ou aminoácido) refere-se a uma forma de X em que um ou mais grupos reaccionais no composto foram derivatizados com um grupo substituinte. Exemplos de derivados peptidicos incluem péptidos em que uma cadeia lateral de aminoácido, o esqueleto do péptido, ou o terminal amino ou carboxilo foram derivatizados (e.g. compostos peptidicos com ligações amida metiladas). Tal como aqui utilizado, um "análogo" de um composto X refere-se a um composto que retém estruturas químicas de X necessárias para a actividade funcional de X, mas que também contêm algumas estruturas químicas que diferem de X. Um exemplo de um análogo de um péptido que ocorre naturalmente é um péptido que inclui um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente. Tal como aqui utilizado, o termo "mimético" de um composto X refere-se a um composto em que estruturas químicas de X necessárias para a actividade funcional de X foram substituídas por outras estruturas químicas que mimetizam a conformação de X. Exemplos de peptidomiméticos incluem compostos peptidicos em que o esqueleto peptídico é substituído com uma ou mais moléculas de benzodiazepina (veja-se, e.g., James, G.L. et al. (1993)

Science 260: 1937-1942).

Os análogos dos compostos moduladores da invenção incluem compostos em que um ou mais D-aminoácidos da estrutura peptídica são substituídos com um aminoácido homólogo, de modo que as propriedades do modulador original se mantêm. Fazem-se de preferência substituições de aminoácidos conservadoras num ou mais resíduos de aminoácido. Uma "substituição de aminoácido conservadora" é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia 22 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ lateral semelhante. Foram definidas na arte famílias de resíduos de aminoácido com cadeias laterais semelhantes, incluindo cadeias laterais básicas (e.g. lisina, arginina, histidina) cadeias laterais ácidas (e.g. ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (e.g. glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (e.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais β-ramifiçadas (e.g. treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (e.g., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Exemplos não limitativos de substituições homólogas que podem ser feitas nas estruturas peptídicas dos moduladores da invenção incluem substituição de D-fenilalanina com D-tirosina, D-piridilalanina ou D-homofenilalanina, substituição de D-leucina com D-valina ou outro aminoácido natural ou não natural com uma cadeia lateral alifática e/ou substituição de D-valina com D-leucina ou outro aminoácido natural ou não natural, com uma cadeia lateral alifática. 0 termo mimético e, em particular, peptidomimético, pretende incluir isósteros. O termo "isóstero", tal como aqui utilizado, pretende incluir uma estrutura química que pode ser substituída por uma segunda estrutura química porque a conformação estereoquímica da primeira estrutura se ajusta a um sítio de ligação específico para a segunda estrutura. 0 termo inclui especificamente modificações do esqueleto peptídico (í.e. miméticos da ligação amida) bem conhecidos dos peritos na arte. Estas modificações incluem modificações do azoto da amida, o carbono-α, amida-carbonilo, substituição completa da ligação amida, extensões, eliminações ou reticulações do esqueleto. São conhecidas várias modificações do esqueleto peptídico, incluindo \|/[CH2S], ψ[ΟΗ2ΝΗ], \|/[CSNH2], ψ[ΝΗΟΟ], ψ[ΟΟΟΗ2], e ψ[(Ε) ou (Z) CH=CH] . Na nomenclatura utilizada acima, ψ indica a ausência de uma ligação amida. A estrutura que substitui o grupo amida está especificada entre parêntesis rectos.

Outras modificações possíveis incluem uma substituição N-alquilo(ou arilo) (ψ [CONR]), ou reticulação do esqueleto para construir lactamas e outras estruturas cíclicas. Outros derivados dos compostos moduladores da invenção incluem 23 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ derivados hidroximetilo de terminal C, derivados modificados com 0 (e.g. éter hidroximetilbenzilico de terminal C), derivados modificados no terminal C incluindo amidas substituídas, tais como alquilamidas e hidrazidas e compostos em que um resíduo de fenilalanina C-terminal é substituído por um análogo de fenetilamida (e.g. Val-Phe-fenetilamida como análogo do tripéptido Val-Phe-Phe).

Os compostos moduladores da invenção podem ser incorporados em composições farmacêuticas (descrito em mais detalhe na subsecção V a seguir) e podem ser utilizados em métodos de detecção e tratamento, como descrito em maior detalhe na subsecção VI a seguir. II. Grupos modificadores

Os compostos moduladores da invenção são acoplados directa ou indirectamente a pelo menos dois grupos modificadores (abreviados para MG). 0 termo "grupo modificador" pretende incluir estruturas que estão ligadas directamente à estrutura peptídica de D-aminoácidos (e.g. por ligação covalente), bem como as que estão ligadas indirectamente à estrutura peptídica (e.g. através de uma associação não covalente estável, ou por ligação covalente a resíduos de aminoácido adicionais, ou seus miméticos, análogos ou derivados, que podem flanquear a estrutura peptídica de D-aminoácidos derivados de Αβ). Por exemplo, o grupo modificador pode ser acoplado ao terminal amino e ao terminal carboxilo de uma estrutura peptídica de D-aminoácidos derivada de Αβ, ou a uma região peptídica ou peptidomimética que flanqueia o domínio nuclear. Alternativamente, o grupo modificador pode ser acoplado a uma cadeia lateral de pelo menos um resíduo de D-aminoácido de uma estrutura peptídica de D-aminoácidos derivada de Αβ, ou a uma região peptídica ou peptidomimética que flanqueia o domínio nuclear (e.g. através do grupo amino épsilon de um resíduo(s) de lisilo, através do grupo carboxilo de um resíduo(s) de ácido aspártico ou um resíduo(s) de ácido glutâmico, através de um grupo hidroxilo de um resíduo (s) de tirosilo, um resíduo(s) de serina, ou um resíduo(s) de treonina ou outro grupo reactivo adequado ou uma cadeia lateral de aminoácido). Os grupos modificadores ligados de forma covalente à estrutura peptídica de D-aminoácidos 24 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ podem ser ligados por meios e utilizando métodos bem conhecidos na arte para a ligação de estruturas químicas, incluindo, por exemplo, ligações amida, alquilamino, carbamato, ureia ou éster. 0 termo "grupo modificador" pretende incluir grupos que não estão naturalmente acoplados a péptidos Αβ naturais na sua forma nativa. Deste modo, o termo "grupo modificador" não pretende incluir hidrogénio. 0 grupo(s) modificador é seleccionado de modo que o composto modulador altera e, de preferência, inibe a agregação de péptidos β-amilóides naturais, quando contactado com os péptidos β-amilóides naturais ou inibe a neurotoxicidade de péptidos β-amilóides naturais quando em contacto com os péptidos β-amilóides naturais. Embora não pretendendo estar limitado por um mecanismo, em concretizações em que o modulador compreende um grupo(s) modificador, pensa-se que o(s) grupo modificador funciona como um farmacóforo chave que aumenta a capacidade do modulador romper a polimerização de Αβ.

Numa concretização preferida, o(s) grupo modificador compreende um grupo alquilo. 0 termo "alquilo", tal como aqui utilizado refere-se a um grupo hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada, que tem desde cerca de 1 a cerca de 10 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquilo incluem metilo, etilo, dimetilo, dietilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo e n-hexilo. Um grupo alquilo pode ser não substituído, ou pode ser substituído numa ou mais posições com, e.g., halogéneos, alquilos, cicloalquilos, alcenilos, alcinilos, arilos, heterociclos, hidroxilos, aminos, nitros, tióis, aminas, iminas, amidas, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos, éteres, tioéteres, sulfonilos, selenoéteres, cetonas, aldeídos, ésteres, -CF3, -CN, ou semelhantes. Alquilos preferidos são metilos, etilos, dimetilos, dietilos, n-propilos, isopropilos.

Noutra concretização, um grupo modificador, e.g., um grupo alquilo, é acoplado a outro grupo modificador. Ainda noutra concretização, um D-aminoácido num composto modulador da invenção é modificado com dois grupos modificadores. Deste modo, grupos modificadores preferidos incluem um grupo 1-piperidinacetilo. 25 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ

Numa concretização preferida, o(s) grupo modificador compreende um grupo alquilo ciclico, heterociclico, policiclico ou ramificado. 0 termo "grupo ciclico", tal como aqui utilizado, pretende incluir um grupo saturado ou insaturado ciclico (i.e., aromático) que tem de cerca de 3 a 10, de preferência de cerca de 4 a 8, e mais preferencialmente de cerca de 5 a 7 átomos de carbono. Exemplos de grupos ciclicos incluem ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, e ciclo-octilo. Grupos ciclicos podem ser substituídos ou não substituídos numa ou mais posições do anel. Assim, um grupo cíclico pode ser substituído com, e.g., halogéneos, alquilos, cicloalquilos, alcenilos, alcinilos, arilos, heterociclos, hidroxilos, aminos, nitros, tióis aminas, iminas, amidas, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos, éteres, tioéteres, sulfonilos, sulfonatos, selenoéteres, cetonas, aldeídos, ésteres, -CF3, -CN, ou semelhantes. O termo "grupo heterociclico" pretende incluir grupos saturados ou insaturados cíclicos (i.e., aromático) que têm desde cerca de 3 a 10, de preferência cerca de 4 a 8 e mais preferencialmente cerca de 5 a 7 átomos de carbono, em que a estrutura de anel inclui cerca de um a quatro heteroátomos. Grupos heterocíclicos incluem pirrolidina, oxolana, tiolana, imidazolo, oxazole, piperidina, piperazina, morfolina e piridina. O anel heterociclico pode ser substituído numa ou mais posições com estes substituintes, tal como, por exemplo, halogéneos, alquilos, cicloalquilos, alcenilos, alcinilos, arilos, outros heterociclos, hidroxilo, amino, nitro, tiol, aminas, iminas, amidas, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos, éteres, tioéteres, sulfonilos, selenoéteres, cetonas, aldeídos, ésteres, -CF3, -CN, ou semelhantes. Os heterociclos também podem ser ligados em ponte ou fundidos com outros grupos cíclicos, como descrito a seguir. O termo "grupo policiclico" tal como aqui utilizado, pretende referir-se a dois ou mais anéis cíclicos saturados ou insaturados {i.e., aromáticos) em que dois ou mais carbonos são comuns a dois anéis adjacentes, e.g., os anéis são "anéis fundidos". Os anéis que estão ligados através de átomos não 26 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ adjacentes são designados por anéis "ligados em ponte". Cada um dos anéis do grupo policiclico pode ser substituído com estes substituintes, como descrito acima, como por exemplo, halogéneos, alquilos, cicloalquilos, alcenilos, alcinilos, hidroxilo, amino, nitro, tiol, aminas, iminas, amidas, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos, éteres, tioéteres, sulfonilos, selenoéteres, cetonas, aldeídos, ésteres, -CF3, -CN, ou semelhantes.

Um grupo policiclico preferido é um grupo que contém uma estrutura de cis-decalina. Embora não pretendendo estar limitado por um mecanismo, pensa-se que a conformação "dobrada" conferida num grupo modificador pela presença de uma estrutura cis-decalina contribui para a eficácia do grupo modificador em romper a polimerização de Αβ. Deste modo, outras estruturas que mimetizam a configuração "dobrada" da estrutura cis-decalina também podem ser utilizadas como grupos modificadores. Um exemplo de uma estrutura contendo cis-decalina que pode ser utilizada como grupo modificador é uma estrutura colanoílo, tal como um grupo colilo. Por exemplo, um composto modulador pode ser modificado no seu terminal amino com um grupo colilo, por reacção do domínio nuclear de agregação com ácido eólico, um ácido biliar. Além disso, um composto modulador pode ser modificado no seu terminal carboxilo com um grupo colilo, de acordo com métodos conhecidos na arte (veja-se e.g., Wess, G. et al. (1993) Tetrahedron Letters, 34:817-822; Wess, G. et al. (1992) Tetrahedron Letters 33:195-198; e Kramer, W. et al. (1992) J. Biol. Chem. 26 7:18598-18604). Os derivados e análogos de colilo também podem ser utilizados como grupos modificadores. Por exemplo, um derivado de colilo preferido é Aic (3-(0-aminoetilo-íso)colilo), que tem um grupo amino livre que pode ser utilizado para modificar ainda mais o composto modulador {e.g., um grupo de quelante para 99mTc pode ser introduzido através do grupo amino livre de Aic). Tal como aqui utilizado, o termo "estrutura de colanoílo" pretende incluir o grupo colilo e seus derivados e análogos, em particular os que retêm uma configuração de cis-decalina de quatro anéis. Exemplos de estruturas de colanoílo incluem grupos derivados de outros ácidos biliares, tais como ácido desoxicólico, ácido litocólico, ácido ursodesoxicólico, ácido chenodesoxicólico e ácido hiodesoxicólico, bem como outras estruturas 27 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ relacionadas, tais como ácido colânico, bufalina e resibufogenina (embora os dois últimos compostos não sejam preferidos para utilização como grupo modificador). Outro exemplo de um composto que contém cis-decalina é 5p-colestan-3a-ol (o isómero cis-decalina de (+)-di-hidrocolesterol). Para uma descrição mais detalhada da estrutura e nomenclatura de ácidos biliares e esteróides veja-se, Nes, W.R. e McKean, M.L. Biochemistry of Steroids and Other Isopentanoids, University Park Press, Baltimore, MD, Capitulo 2.

Além dos grupos que contêm cis-decalina podem-se utilizar outros grupos policiclicos como grupos modificadores. Por exemplo, grupos modificadores derivados de esteróides ou β-lactamas podem ser grupos modificadores adequados. Numa concretização, o grupo modificador é uma "estrutura de biotinilo" que inclui grupos biotinilo e seus análogos e derivados (tal como um grupo 2 iminobiotinilo). Noutra concretização, o grupo modificador pode compreender um "grupos contendo fluoresceina", tal como um grupo derivado da reacção de uma estrutura peptidica derivada de Αβ com 5-(e 6)-carboxifluoresceina, éster de succinimidilo ou isotiocianato de fluoresceina. Em várias outras concretizações, o(s) grupo modificador pode compreender um grupo N-acetilneuraminilo, um grupo trans-4-cotininocarboxilo, um grupo 2-imino-l- imidazolidinoacetilo, um grupo (S)-(-)-indolino-2-carboxilo, um grupo (-)-mentoxiacetilo, um grupo 2-norbomanoacetilo, um grupo γ-οχο-5-acenaftenobutirilo, um grupo (-)-2-oxo-4- tiazolidinocarboxilo, um grupo tetra-hidro-3-furoilo, um grupo 2-iminobiotinilo, um grupo dietilenotriaminopenta-acetilo, um grupo 4-morfolinocarbonilo, um grupo 2-tiofenoacetilo ou um grupo 2-tiofenossulfonilo.

Além dos grupos cíclicos, heterocíclicos e policiclicos discutidos acima, podem-se utilizar outros tipos de grupos modificadores num modulador da invenção. Por exemplo, grupos hidrófobos e grupos alquilo ramificados podem ser grupos modificadores adequados. Exemplos incluem grupos acetilo, grupo fenilacetilo, grupos fenilacetilo, grupos difenilacetilo, grupos trifenilacetilo, grupos isobutanoílo, grupos 4-metilvalerilo, grupos trans-cinamoílo, grupos butanoílo e grupos 1-adamantanocarbonilo. 28 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ

Ainda outro tipo de grupo modificador é um composto que contém um aminoácido não natural que actua como mimético de ligações de folhas beta, tal como um aminoácido baseado em dibenzofurano descrito em Tsang, k.y. et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:3988-4005; Diaz, H e Kelly, J.W. (1991) Tetrahedron Letters 41:5725-5728; e Diaz. H et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:8316-8318. Um exemplo de um grupo modificador deste tipo é um grupo péptido-aminoetildibenzofuranilo-ácido propiónico (Adp) (e.g. DDIIL-Adp) (SEQ ID NO:31). Este tipo de grupo modificador pode também compreender uma ou mais ligações de péptido N-metil para introduzir impedimento estéreo adicional à agregação de β-ΑΡ natural quando os compostos deste tipo interagem com β-ΑΡ natural.

Ainda outro tipo de grupo modificador é um grupo NH-OR, em que R pode ser qualquer um dos grupos alquilo ou cicloalquilo modificados ou não modificados, aqui descritos.

Exemplos não limitativos de grupos modificadores adequados, com os seus reagentes modificadores correspondentes estão enumerados a seguir:

Grupo Modificador Metil-

Etil-

Propil- Isopropil- Piperidina- Acetil- Dimetil-

Reagente Modificador Metilamina, Fmoc-D-[Me]-Leu-OH, metilamina e um bromoacetilpéptido Etilamina, acetaldeido e cianoboro-hidreto de sódio, etilamina e um bromoacetilpéptido Propilamina, propionaldeido e cianoboro-hidreto de sódio, propilamina e um bromoacetilpéptido Isopropilamina, isopropilamina e um bromoacetilpéptido Piperidina e um bromoacetilpéptido Anidrido acético, ácido acético Metilamina, formaldeido e cianoboro-hidreto de sódio 29 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ

Grupo Modificador Dietil-

Colil-

Litocolil-

Hiodesoxicolil-

Chenodesoxicolil-

Ursodesoxicolil- 3- Hidroxicinamoil- 4- Hidroxicinamoil- 2- Hidroxicinamoil- 3- Hidroxi-4-metoxicinamoil- 4- Hidroxi-3-metoxicinamoil- 2- Carboxicinamoil- 3- Formilbenzoil- 4- Formilbenzoil- 3,4,-Di-hidroxi-hidrocinamoil- 3,7-di-hidroxi-2-naftoil-4-Formilcinamoil- 2- Formilfenoxiacetil-8-Formil-l-naftoil 4-(hidroximetil)benzoil-4-Hidroxifenilacetil- 3- Hidroxibenzoil- 4- Hidroxibenzoil- 5- Hidantoinacetil-L-Hidroorotil-4-Metilvaleril- 2.4- Di-hidroxibenzoil- 3.4- Di-hidroxicinamoil- 3.5- Di-hidroxi-2-naftoil-3-Benzoilpropanoil-traus-Cinamoil-Fenilacetil-Difenilacetil-Trifenilacetil- 2- Hidroxifenilacetil- 3- Hidroxifenilacetil- 4- Hidroxifenilacetil-

Reagente Modificador

Acetaldeído e cianoboro-hidreto de sódio Ácido eólico Ácido litocólico Ácido hiodesoxicólico Ácido chenodesoxicólico Ácido ursodesoxicólico Ácido 3-hidroxicinâmico Ácido 4-hidroxicinâmico Ácido 2-hidroxicinâmico Ácido 3-hidroxi-4- metoxicinâmico Ácido 4-hidroxi-3- metoxicinâmico Ácido 2-carboxicinâmico 3- Carboxibenzaldeído 4- Carboxibenzaldeído Ácido 3,4,-di-hidroxi-hidrocinâmico Ácido 3,7-di-hidroxi-2-naftóico Ácido 4-formilcinâmico Ácido 2-formilfenoxiacético Ácido 1,8-naftaldeídico Ácido 4-(hidroximetil)benzóico Ácido 4-hidroxifenilacético Ácido 3-hidroxibenzóico Ácido 4-hidroxibenzóico Ácido 5-hidantoinacético Ácido L-hidroorótico Ácido 4-metilvalérico Ácido 2,4-di-hidroxibenzóico Ácido 3,4-di-hidroxiciâmico Ácido 3,5-di-hidroxi-2-naftóico Ácido 3-Benzoilpropanóico Ácido traus-cinâmico Ácido fenilacético Ácido difenilacético Ácido trifenilacético Ácido 2-hidroxifenilacético Ácido 3-hidroxifenilacético Ácido 4-hidroxifenilacético 30 30 Reagente Modificador ΕΡ 1 161 449/ΡΤ Grupo Modificador (±)-Mandelil- (±)-2,4-di-hidroxi-3,3- dimetilbutanoil

Butanoil-

Isobutanoil-

Hexanoil-

Propionil- 3- Hidroxibutiroil 4- Hidroxibutiroil 3-Hidroxipropionoil 2,4-Di-hidroxibutiroil 1-Adamantanocarbonil-

Glicolil- DL-3-(4-hidroxifenil)lactil- 3- (2-Hidroxifenil)propionil- 4- (2-Hidroxifenil)propionil- D-3-Fenilactil-

Hidrocinamoil- 3- (4-Hidroxifenil)propionil- L-3-Fenilactil- 4- metilvalerilo 3- piridilacetilo 4- piridilacetilo Isonicotinoil-4-quinolinocarboxil 1-isoquinolinocarboxil 3-isoquinolinocarboxil Ácido (±)-mandélico (±)-Pantolactona

Anidrido butanóico Anidrido isobutanóico Anidrido hexanóico Anidrido propiónico β-Butirolactona γ-Butirolactona β-Propiolactona α-Hidroxi-β-butirolactona Ácido 1-adamantanocarbónico Ácido glicólico Ácido DL-3-(4-hidroxifenil)láctico Ácido 3-(2-hidroxifenil)-propiónico Ácido 4-(2-hidroxifenil)-propiónico Ácido D-3-feniláctico Ácido hidrocinâmico Ácido 3-(4-hidroxifenil)-propiónico Ácido L-3-Feniláctico Ácido 4-metilvalérico Ácido 3-piridilacético Ácido 4-piridilacético Ácido 4-quinolinacarboxílico Ácido 1-isoquinolinacarboxílico Ácido 3-isoquinolinacarboxílico

Grupos modificadores preferidos incluem grupos que contêm metilo, grupos que contêm etilo, grupos que contêm etilo, grupos que contêm propilo e grupos que contêm piperidina, e.g., um grupo 1-piperidino-acetilo. 31 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ III Modificações químicas adicionais de moduladores de Αβ

Um composto modulador de β-amilóide da invenção pode ainda ser modificado para alterar as propriedades específicas do composto, mantendo ao mesmo tempo a capacidade do composto alterar a agregação de Αβ e inibir a neurotoxicidade de Αβ. Por exemplo, numa concretização, o composto é ainda modificado para alterar uma propriedade farmacocinética do composto, tal como a estabilidade ou semivida in vivo. Noutra concretização, o composto é também modificado para marcar o composto com uma substância detectável. Ainda noutra concretização, o composto é também modificado para acoplar o composto a uma porção terapêutica adicional. Esquematicamente, um modulador da invenção que compreende um domínio nuclear de agregação de Αβ de D-aminoácidos acoplado directa ou indirectamente a pelo menos um grupo modificador pode ser ilustrado como MG-ACD, enquanto que este composto que foi ainda modificado para alterar as propriedades do modulador pode ser ilustrado como MG-ACD-CM, em que CM representa uma modificação química adicional.

Para modificar, adicionalmente, quimicamente o composto, tal como para alterar as propriedades farmacocinéticas do composto, podem-se derivatizar grupos reactivos. Por exemplo, quando o grupo modificador é ligado à extremidade amino-terminal do domínio nuclear de agregação, a extremidade carboxilo-terminal do composto pode ser também modificada. As modificações no terminal C preferidas incluem as que reduzem a capacidade do composto actuar como substrato para carboxipeptidases. Exemplos de modificadores do terminal C preferidos incluem um grupo amida (í.e. uma amida de péptido). Alternativamente, quando o grupo modificador é ligado à extremidade carboxilo-terminal do domínio nuclear de agregação, a extremidade amino-terminal do composto pode ser também modificada, por exemplo, para reduzir a capacidade do composto actuar como substrato para aminopeptidases.

Um composto modulador pode ser também modificado para marcar o composto, reagindo o composto com uma substância detectável. Substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioactivos. Exemplos de 32 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupo prostético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; Exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de material radioactivo adequado incluem 14C, 1231 , 1241 , 125I, 131I, 99mTc, 35S ou 3H. Numa concretização preferida, um composto modulador é marcado radioactivamente com C, quer por incorporação de C no grupo modificador, ou numa ou mais estruturas de aminoácidos no composto modulador. Podem-se utilizar compostos moduladores marcados para determinar as farmacocinéticas dos compostos in vivo, bem como para detectar a agregação de Αβ, por exemplo para fins de diagnóstico. A agregação de Αβ pode ser detectada utilizando um composto modulador marcado, quer in vivo, quer numa amostra in vitro derivada de um indivíduo.

De preferência, para utilização como agente de diagnóstico in vivo, um composto modulador da invenção é marcado com tecnécio ou iodo radioactivo. Deste modo, numa concretização, a invenção proporciona um composto modulador marcado com tecnécio, de preferência 99mTc. São conhecidos na arte métodos para marcar compostos peptídicos com tecnécio (veja-se, e.g. patentes U.S. N°s 5443815, 5225180 e 5405597, todas de Dean et al.; Stepniak-Biniakiewicz, D., et al. (1992) J. Med. Chem. 35:274-279; Fritzberg, A.R., et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4025-4029; Baidoo, e Regan, L. e Smith, C.K. (1995) Science 270:980-982). Pode-se escolher um grupo modificador que proporciona um sítio em que se pode introduzir um grupo quelante para 99mTc, tal como o derivado de ácido eólico Aic que tem um grupo amino livre. Noutra concretização, a invenção proporciona um composto modulador marcado com iodo radioactivo. Por exemplo, um resíduo de fenilalanina na sequência de Αβ (tal como Pheig ou Phe2o) pode ser substituído com iodotirosilo radioactivo. Qualquer dos vários isótopos de iodo radioactivo pode ser incorporado para criar um agente de diagnostico. De preferencia, utiliza-se I (semivida = 13,2 horas) para cintigrafia de todo o corpo, o I (semivida = 4 dias) e utilizado para tomografia de emissão 33 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ de positrões (ΡΕΤ), ο 125Ι (semivida = 60 dias) é utilizado para estudos de renovação metabólica e o 131I (semivida = 8 dias) é utilizado para contagem de todo o corpo e estudos de imagiologia de baixa resolução retardada.

Além disso, uma modificação adicional de um composto modulado da invenção pode servir para conferir uma propriedade terapêutica adicional no composto. Isto é, a modificação quimica adicional pode compreender uma porção funcional adicional. Por exemplo, uma porção funcional que serve para degradar ou dissolver placas amilóides pode ser acoplada ao composto modulador. Nesta forma, a porção MG-ACD do modulador serve para direccionar o composto para péptidos Αβ e romper a polimerização dos péptidos Αβ, enquanto que a porção funcional adicional serve para degradar ou dissolver placas amilóides após o composto ter sido direccionado para estes sítios.

Numa modificação quimica alternativa, prepara-se um composto β-amilóide da invenção numa forma de "prodroga", em que o próprio composto não modula a agregação de Αβ, mas em vez disso, é capaz de ser transformado, por metabolismo in vivo, num composto modulador de β-amilóide, como aqui definido. Por exemplo, neste tipo de composto, o grupo modulador pode estar presente numa forma de prodroga que é capaz de ser convertida, por metabolismo, na forma de um grupo modulador activo. Esta forma de prodroga de um grupo modificador é aqui designada por "grupo modificador secundário". São conhecidas na arte várias estratégias para preparar prodrogas de péptidos que limitam o metabolismo, de modo a optimizar o fornecimento da forma activa da droga baseada num péptido (veja-se, e.g. Moss, J. (1995) in Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Taylor, M.D. e Amidon, G.L. (eds). Capítulo 18. Estratégias adicionais foram especificamente moldadas para se obter fornecimento ao SNC com base no "metabolismo sequencial" (veja-se e.g., Bodor, N., et al. (1992) Science 257:1698-1700; Prokai, L., et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:2643-2644: Bodor. N. e Prokai, L. (1995) in Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Taylor, M.D. e Amidon, G.L. (eds), Capítulo 14. Numa concretização de uma forma de prodroga de um modulador da invenção, o grupo modificador 34 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ compreende um éster de alquilo para facilitar a permeabilidade da barreira hematoencefálica.

Os compostos moduladores da invenção podem ser preparados por técnicas convencionais conhecidas na arte. 0 componente de péptido de um modulador pode ser sintetizado utilizando técnicas convencionais, tais como as descritas em Bodansky, M. Principies of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlim (1993) e Grant, G.A (ed.). Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman and Company, New York (1992). Estão disponíveis comercialmente sintetizadores de péptidos automáticos (e.g., Advanced ChemTech Modelo 396; Milligen/ Biosearch 9600). Adicionalmente, podem-se ligar um ou mais grupos moduladores ao componente peptidico derivado de Αβ (e.g., um domínio nuclear da agregação de Αβ) por métodos convencionais, por exemplo utilizando métodos para reacção através de um grupo amino (e.g., o grupo alfa-amino no terminal amino de um péptido), um grupo carboxilo (e.g., no terminal carboxilo de um péptido), um grupo hidroxilo (e.g. num resíduo de tirosina, serina ou treonina), ou outro grupo reactivo adequado numa cadeia lateral de aminoácido (veja-se, e.g. Greene, T.W e Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque (1991)). Exemplos de sínteses de moduladores de β-amilóide de D-aminoácidos são descritos em mais detalhe no Exemplo 1. IV. Ensaios de pesquisa

Outro aspecto da invenção refere-se a um método para seleccionar um modulador da agregação de β-amilóide. No método, um composto de teste é contactado com péptidos β-amilóides naturais, a agregação do β-ΑΡ natural é medida e o modulador é seleccionado com base na capacidade do composto de teste alterar a agregação do β-ΑΡ natural (e.g. inibir ou promover a agregação). Numa concretização preferida, o composto de teste é contactado com uma quantidade de excesso molar do β-ΑΡ natural. A quantidade e/ou taxa da agregação de β-ΑΡ natural na presença do composto de teste pode ser determinada por um ensaio adequado indicativo de agregação de β-ΑΡ, como aqui descrito (veja-se, e.g. Exemplo 2). 35 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ

Num ensaio preferido, ο β-ΑΡ natural é dissolvido em solução na presença do composto de teste e a agregação do β-ΑΡ natural é determinada num ensaio de nucleação (veja-se Exemplo 2), determinando a turbidez da solução ao longo do tempo, tal como medido pela absorvância aparente da solução a 405 nm (descrito em mais detalhe no Exemplo 2; veja-se também Jarrett et al. (1993) Biochemistry 32:4693-4697). Na ausência de um modulador de β-amilóide, a A405nm da solução permanece tipicamente relativamente constante durante um tempo de retardo em que ο β-ΑΡ permanece em solução, mas em seguida a A4o5nm da solução rapidamente aumenta, à medida que ο β-ΑΡ se agrega e sai da solução, atingindo por fim um nivel de patamar (í.e. a A4o5nm da solução exibe uma cinética sigmoidal ao longo do tempo). Pelo contrário, na presença de um composto de teste que inibe a agregação de β-ΑΡ, a A405nm da solução é reduzida em comparação com a situação em que o modulador está ausente. Assim, na presença do modulador inibitório, a solução pode exibir um tempo de retardo maior, um declive de agregação menor e/ou um nivel de patamar menor, em comparação com a situação em que o modulador está ausente. Este método para seleccionar um modulador da polimerização de β-amilóide pode igualmente ser utilizado para seleccionar moduladores que promovem a agregação de β-ΑΡ. Assim, na presença de um modulador que promove a agregação de β-ΑΡ, a A45onm da solução está aumentada em comparação com a situação em que o modulador está ausente (e.g., a solução pode exibir um menor tempo de retardo, maior declive de agregação e/ou um nível de patamar mais elevado, em comparação com a situação em que o modulador está ausente).

Outro ensaio adequado para utilização no método de pesquisa da invenção, um ensaio de expansão de semente, está adicionalmente descrito no Exemplo 2. Neste ensaio, o monómero β-ΑΡ e uma "semente" de β-ΑΡ agregado são combinados na presença e ausência de um composto de teste e a quantidade de formação de β-fibrilhas é testada com base numa maior emissão do corante Tioflavina τ quando em contacto com fibrilhas de β-ΑΡ. Além disso, a agregação de β-ΑΡ pode ser determinada por microscopia electrónica (EM) da preparação de β-ΑΡ, na presença ou ausência do modulador. Por exemplo, a formação de fibrilhas de β-amilóide que é detectável por EM, é reduzida na presença de um modulador que inibe a agregação de β-ΑΡ (í.e. 36 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ há uma menor quantidade ou número de fibrilhas de β na presença do modulador), enquanto que a formação de fibrilhas de β é aumentada na presença de um modulador que promove a agregação de β-ΑΡ (i.e. há uma maior quantidade ou número de fibrilhas-β na presença do modulador).

Outro ensaio preferido para utilização no método de pesquisa da invenção para seleccionar moduladores adequados é o ensaio de neurotoxicidade descrito no Exemplo 3. Seleccionam-se compostos que inibem a formação de agregados de Αβ neurotóxicos e/ou que inibem a neurotoxicidade de fibrilhas de Αβ pré-formadas. Este ensaio de neurotoxicidade é considerado preditivo de neurotoxicidade in vivo. Deste modo, a actividade inibitória de um composto modulador no ensaio de neurotoxicidade in vitro é preditiva de uma actividade inibitória semelhante do composto para neurotoxicidade in vi vo. V. Composições farmacêuticas

Outro aspecto da invenção refere-se a composições farmacêuticas dos compostos moduladores de β-amilóide da invenção. Numa concretização, a composição inclui um composto modulador de β-amilóide numa quantidade terapêutica ou profilacticamente eficaz, suficiente para alterar e, de preferência, inibir a agregação de péptidos β-amilóides naturais e um transportador farmaceuticamente aceitável. Noutra concretização, a composição inclui um composto modulador de β-amilóide numa quantidade terapêutica ou profilacticamente eficaz, suficiente para inibir a neurotoxicidade de péptidos β-amilóides naturais e um transportador farmaceuticamente aceitável. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, a dosagens e por períodos de tempo necessários para alcançar o resultado terapêutico desejado, tal como redução ou inversão da deposição β-amilóide e/ou redução ou inversão da neurotoxicidade de Αβ. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de modulador pode variar de acordo com factores, tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do modulador desencadear uma resposta desejada no indivíduo. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para se obter a resposta terapêutica óptima. Uma quantidade 37 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ terapeuticamente eficaz é também uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do modulador são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. A neurotoxicidade potencial dos moduladores da invenção pode ser determinada utilizando o ensaio baseado em células descrito no Exemplo 6 e pode-se seleccionar um modulador terapeuticamente eficaz que não exibe uma neurotoxicidade significativa. Numa concretização preferida, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador é suficiente para alterar e, de preferência, inibir a agregação de uma quantidade em excesso molar de péptidos β-amilóides naturais. Uma "quantidade profilacticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, a dosagens e durante períodos de tempo necessários para se obter o resultado profiláctico desejado, tal como prevenir ou inibir a taxa de deposição de β-amilóide e/ou a neurotoxicidade de Αβ num indivíduo com predisposição para a deposição de β-amilóide. Uma quantidade profilacticamente eficaz pode ser determinada como descrito acima para a quantidade terapeuticamente eficaz. Tipicamente, uma vez que se utiliza uma dose profilática no indivíduo antes de, ou numa fase anterior da doença, a quantidade profilacticamente eficaz será inferior à quantidade terapeuticamente eficaz.

Um factor que pode ser considerado quando se determina uma quantidade terapêutica ou profilacticamente eficaz de um modulador de β-amilóide é a concentração de β-ΑΡ natural num compartimento biológico de um indivíduo, tal como no fluido cerebrospinal do indivíduo (CSF). A concentração de β-ΑΡ natural no CSF foi estimada em 3 nM (Schwartzman, (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:8368-8372). Uma gama não limitante para uma quantidade terapêutica ou profilacticamente eficaz de um modulador de β-amilóide é 0,01 nM - 10 μΜ. Deve ter-se em conta que os valores de dosagem podem variar com a gravidade da condição a ser aliviada. Deve ter-se também em conta que para qualquer indivíduo particular, os regimes de dosagem específicos deverão ser ajustados ao longo do tempo, de acordo com a necessidade do indivíduo e o critério profissional de quem administra ou supervisiona a administração das composições e que as gamas de dosagens aqui apresentadas são apenas a título de exemplo e não pretendem limitar o âmbito ou prática da composição reivindicada. 38 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ A quantidade de composto activo na composição pode variar de acordo com factores como estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo, podendo cada um afectar a quantidade de β-ΑΡ natural no indivíduo. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para se obter a resposta terapêutica óptima. Por exemplo, pode-se administrar um único bolus, podem-se administrar várias doses divididas ao longo do tempo, ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de unidade de dosagem, para facilidade de administração e uniformidade da dosagem. A forma de unidade de dosagem, tal como aqui utilizado, refere-se a unidades fisicamente discretas, adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos a ser tratados, em que cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto activo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico necessário. A especificação para as formas de unidade de dosagem da invenção são ditadas por, e directamente dependentes (a) das características únicas do composto activo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado e (b) das limitações inerentes à arte de formular um composto activo deste tipo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.

Tal como aqui utilizado, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis. Numa concretização, o transportador é adequado para administração parentérica. De preferência, o transportador é adequado para administração no sistema nervoso central (e.g., intra-espinal ou intracerebralmente). Alternativamente, o transportador pode ser adequado para administração intravenosa, intraperitoneal, ou intramuscular. Noutra concretização, o transportador é adequado para administração oral. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. A utilização destes meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é bem conhecida na arte. Excepto quando qualquer meio 39 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ ou agente convencional for incompatível com o composto activo, a sua utilização em composições farmacêuticas da invenção é contemplada. Também se podem incorporar nas composições compostos activos suplementares.

As composições terapêuticas deverão ser tipicamente estéreis nas condições de fabrico e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para uma concentração de droga elevada. 0 transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes) e suas misturas adequadas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, utilizando um revestimento, tal como lecitina, por manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e utilizando tensioactivos. Em muitos casos, será preferível incluir na composição agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina. Além disso, os moduladores podem ser administrados numa formulação de libertação prolongada, por exemplo, numa composição que inclui um polímero de libertação lenta. Os compostos activos podem ser preparados com transportadores que irão proteger o composto contra a libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de fornecimento microencapsulados. Podem-se utilizar polímeros biocompatíveis, biodegradáveis, tais como etileno e acetato de vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres, ácido poliláctico e copolímeros polilácticos, poliglicólicos (PLG). Muitos métodos para a preparação destas formulações estão patenteados, ou são conhecidos em geral pelos peritos na arte.

Podem-se preparar soluções injectáveis estéreis incorporando o composto activo (e.g., modulador de β-amilóide) na quantidade necessária, num solvente adequado, com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como necessário, seguido de esterilização por filtração. Em geral, preparam-se dispersões incorporando o composto activo num veículo estéril 40

ΕΡ 1 161 449/PT que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir dos acima enumerados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem por vácuo e liofilização que originam um pó do ingrediente activo, mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma sua solução previamente esterilizada por filtração.

Um composto modulador da invenção pode ser formulado com um ou mais compostos adicionais que aumentam a solubilidade do composto modulador. Compostos preferidos a ser adicionados às formulações para aumentar a solubilidade dos moduladores são derivados de ciclodextrina, de preferência hidroxipropil-γ-ciclodextrina. Veículos de fornecimento de drogas que contêm um derivado de ciclodextrina para fornecimento de péptidos ao sistema nervoso central estão descritos em Bodor, N., et al. (1992) Science 257:1698-1700. Para os moduladores de β-amilóide aqui descritos, a inclusão na formulação de hidroxipropil-y-ciclodextrina a uma concentração de 50-200 mM aumenta a solubilidade aquosa dos compostos. Além de uma maior solubilidade, a inclusão de um derivado de ciclodextrina na formulação pode ter outros efeitos benéficos, uma vez que foi referido que a própria β-ciclodextrina interage com o péptido Αβ e inibe a formação de fibrilhas in vitro (Camilleri, P. et al. (1994) FEBS Letters 341 :256-258. Deste modo, a utilização de um composto modulador da invenção em combinação com um derivado de ciclodextrina pode resultar numa maior inibição da agregação de Αβ do que a utilização do modulador isolado. São conhecidas na arte modificações químicas de ciclodextrinas (Hanessian, S., et al. (1995) J. Org. Chem. 60:4786-4797). Além da utilização como aditivo numa composição farmacêutica que contém um modulador da invenção, os derivados de ciclodextrina também podem ser úteis como grupos modificadores e, deste modo, podem também ser ligados de forma covalente a um composto de péptido Αβ para formar um composto modulador da invenção.

Outra formulação preferida para os compostos moduladores para aumentar a incorporação no cérebro compreende o detergente Tween-80, polietilenoglicol (PEG) e etanol, numa solução salina. Um exemplo não limitativo desta formulação 41 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ preferida é Tween-80 a 0,16%, PEG-3000 a 1,3% e etanol a 2%, em solução salina.

Noutra concretização, uma composição farmacêutica que compreende um modulador da invenção é formulada de modo a que o modulador seja transportado através da barreira hematoencefálica (BBB, do inglês Blood-Brain Barrier). Várias estratégias conhecidas na arte para aumentar o transporte através da BBB podem ser adaptadas aos moduladores da invenção, para aumentar desse modo o transporte dos moduladores através da BBB (para revisão destas estratégias, veja-se, e.g., Pardridge, W.M. (1994) Trends in Biotechnol. 12:239-245; Van Bree, J.B. et al. (1993) Pharm. World Sei. 15:2-9; e Pardridge. W.M. et al. (1992) Pharmacol. Toxicol. 71:3-10). Numa abordagem, o modulador é quimicamente modificado para formar uma prodroga com transporte transmembranar aumentado. Modificações químicas adequadas incluem ligar de forma covalente um ácido gordo ao modulador, através de uma ligação amida ou éster (veja-se, e.g., patente U.S. 4933324 e publicação PCT WO 89/07938, ambos de Shashoua; patente U.S. 5284876 de Hesse et al.; Toth, I. et al. (1994) J. Drug Target. 2:217-239; e Shashoua, V.E. et al. (1984) J. Med. Chem. 27:659-664) e glicosilar o modulador (veja-se e.g., patente U.S. 5260308 de Poduslo et al.). Além disso, podem-se utilizar derivados de N-acilamino num modulador para formar uma prodroga "lipídica" (veja-se, e.g. 5112863 de Hashimoto et al.) .

Noutra abordagem para aumentar o transporte através da BBB; conjuga-se um modulador peptidico ou peptidomimético com um segundo péptido ou proteína, formando desse modo uma proteína quimérica, em que o segundo péptido ou proteína sofre transcitose através da BBB, mediada por absorção ou mediada pelo receptor. Deste modo, acoplando o modulador a este segundo péptido ou proteína, a proteína quimérica é transportada através da BBB. O segundo péptido ou proteína pode ser um ligando para um receptor de célula endotelial capilar cerebral. Por exemplo, um ligando preferido é um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao receptor de transferrina em células endoteliais capilares cerebrais (veja-se, e.g., patentes U.S. 5182107 e 5154924 e publicações PCT WO 93/10819 e WO 95/02421, todas de Friden et al.). Outros 42 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ péptidos ou proteínas adequados que podem mediar o transporte através da BBB incluem histonas (veja-se e.g., patente U.S. 4902505 de Pardridge e Schimmel) e ligandos, tais como biotina, folato, niacina, ácido pantoténico, riboflavina, tiamina, piridoxal e ácido ascórbico (veja-se e.g., patentes U.S. 5416016 e 5108921, ambas de Heinstein) . Adicionalmente, foi referido que o transportador de glucose GLUT-1 transporta glicopéptidos (análogos de L-serinil-p-D-glucósido de (Met5]encefalina) através da BBB (Polt, R. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:7114-1778). Deste modo, um composto modular pode ser acoplado a este glicopéptido para direccionar o modulador para o transportador de glucose GLUT-1. Por exemplo, um composto modulador que é modificado no seu terminal amino com o grupo modificador Aic (3-(O-aminoetil-iso)colilo, um derivado de ácido eólico que tem um grupo amino livre) pode ser acoplado a um glicopéptido através do grupo amino de Aic, por métodos convencionais. Podem-se formar proteínas quiméricas por métodos de ADN recombinantes (e.g. por formação de um gene quimérico que codifica para uma proteína de fusão) ou por reticulação química do modulador com o segundo péptido ou proteína, para formar uma proteína quimérica. São conhecidos vários agentes de reticulação química (e.g. disponíveis comercialmente da Pierce, Rockford IL). Pode-se seleccionar um agente de reticulação que permite um acoplamento de rendimento elevado do modulador ao segundo péptido ou proteína e para clivagem subsequente do ligante para libertar o modulador bioactivo. Por exemplo, pode-se utilizar um sistema ligante baseado em biotina-avidina.

Ainda noutra abordagem para aumentar o transporte através da BBB, o modulador é encapsulado num vector transportador que medeia o transporte através da BBB. Por exemplo, o modulador pode ser encapsulado num lipossoma, tal como um lipossoma unilamelar carregado positivamente (veja-se, e.g., publicações PCT WO 88/07851 e WO 88/07852, ambas de Faden), ou em microesferas poliméricas (veja-se e.g., patente U.S. 5413797 de Khan et al., patente U.S. 5271961 de Mathiowitz et al. e 5019400 de Gombotz et al.). Além disso, o vector transportador pode ser modificado para o direccionar para transporte através da BBB. Por exemplo, o vector transportador (e.g. lipossoma) pode ser modificado de forma covalente com uma molécula que é transportada de forma activa através da BBB, ou com um ligando 43 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ para receptores de células endoteliais cerebrais, tal como um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a receptores de transferrina (veja-se, e.g. publicações PCT WO 91/04014 de Collins et al. e WO 94/02178 de Greig et al.).

Ainda noutra abordagem para aumentar o transporte do modulador através da BBB, o modulador é co-administrado com outro agente que actua para permeabilizar a BBB. Exemplos destes "permeabilizadores" de BBB incluem bradiquinina e agonistas de bradiquinina (veja-se, e.g., Patente U.S. 51112596 de Malfroy-Camine) e compostos peptídicos descritos na patente U.S. 5268164 de Kozarich et al.

Podem-se utilizar ensaios que medem a estabilidade in vitro dos compostos moduladores no fluido cerebrospinal (CSF) e o grau de incorporação no cérebro dos compostos moduladores em modelos animais, como previsão da eficácia dos compostos in vivo. Ensaios adequados para medir a estabilidade no CSF e a incorporação pelo cérebro estão descritos nos Exemplos 7 e 8, respectivamente.

Um composto modulador da invenção pode ser formulado numa composição farmacêutica em que o modulador é o único composto activo ou, alternativamente, a composição farmacêutica pode conter compostos activos adicionais. Por exemplo, podem-se utilizar dois ou mais compostos moduladores em combinação. Além disso, um composto modulador da invenção pode ser combinado com um ou mais outros agentes que têm propriedades anti-amiloidogénicas. Por exemplo, pode-se combinar um composto modulador com a tacrina inibidora não especifica de colinesterase (COGNEX®, Parke-Davis).

Noutra concretização, proporciona-se uma composição farmacêutica da invenção como uma formulação empacotada. A formulação empacotada pode incluir uma composição farmacêutica da invenção num recipiente e instruções impressas para administração da composição para tratar um indivíduo que tem um distúrbio associado com β-amiloidose, e.g., doença de Alzheimer. VI. Métodos para utilizar moduladores de Αβ

Outro aspecto da invenção refere-se a métodos para alterar a agregação ou inibir a neurotoxicidade de péptidos 44 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ β-amilóides naturais. Nos métodos da invenção, os péptidos β-amilóides naturais são contactados com um modulador de β-amilóide, de modo que a agregação dos péptidos β-amilóides naturais é alterada, ou a neurotoxicidade dos péptidos β-amilóides naturais é inibida. Numa concretização preferida, o modulador inibe a agregação dos péptidos β-amilóides naturais. Noutra concretização, o modulador promove a agregação dos péptidos β-amilóides naturais. De preferência, a agregação de uma quantidade de β-ΑΡ num excesso molar em relação à quantidade do modulador, é alterada por contacto com o modulador.

No método da invenção, os péptidos β-amilóides naturais podem ser contactados com um modulador quer in vitro, quer in vivo. Assim, o termo "contactado com" pretende incluir quer incubação de um modulador com uma preparação de β-ΑΡ natural in vitro e fornecimento do modulador a um sitio in vivo em que ο β-ΑΡ natural está presente. Uma vez que o composto modulador interage com ο β-ΑΡ natural, os compostos moduladores podem ser utilizados para detectar β-ΑΡ natural, quer in vitro, quer in vivo. Deste modo, uma utilização dos compostos moduladores da invenção é como agentes de diagnóstico para detectar a presença de β-ΑΡ natural, quer numa amostra biológica, quer in vivo num indivíduo. Além disso, a detecção de β-ΑΡ natural utilizando um composto modulador da invenção também pode ser utilizada para diagnosticar amiloidose num indivíduo. Adicionalmente, uma vez que os compostos moduladores da invenção rompem a agregação de β-ΑΡ e inibem a neurotoxicidade de β-ΑΡ, os compostos moduladores também são úteis no tratamento de distúrbios associados com β-amiloidose, quer profiláctica, quer terapeuticamente. Deste modo, outra utilização dos compostos moduladores da invenção é como agentes terapêuticos para alterar a agregação e/ou neurotoxicidade de β-ΑΡ natural.

Numa concretização, utiliza-se um composto modulador da invenção in vitro, por exemplo para detectar e quantificar o β-ΑΡ natural numa amostra (e.g. uma amostra de fluido corporal). Para auxiliar a detecção, o composto modulador pode ser modificado com uma substância detectável. A fonte de β-ΑΡ natural utilizada no método pode ser, por exemplo, uma amostra de fluido cerebrospinal (e.g. de um paciente com DA, um adulto 45 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ susceptível a DA devido a um historial familiar, ou um adulto normal). A amostra de β-ΑΡ natural é contactada com um modulador da invenção e a agregação do β-ΑΡ é medida, tal como pelos ensaios descritos no Exemplo 2. 0 grau de agregação da amostra de β-ΑΡ pode ser então comparado com o de uma amostra(s) de controlo com uma concentração de β-ΑΡ conhecida, contactada de forma semelhante com o modulador e os resultados podem ser utilizados como uma indicação do facto de um indivíduo ser ou não susceptível a, ou ter um distúrbio associado com β-amiloidose. Além disso, ο β-ΑΡ pode ser detectado, detectando um grupo modulador incorporado no modulador. Por exemplo, os moduladores que incorporam um composto de biotina como aqui descrito (e.g. um péptido β-ΑΡ biotinilado no terminal amino) podem ser detectados utilizando uma sonda de estreptavidina ou avidina que é marcada com uma substância detectável (e.g. uma enzima, tal como peroxidase).

Noutra concretização, um composto modulador da invenção é utilizado in vivo para detectar e, se desejado, quantificar a deposição de β-ΑΡ natural num indivíduo, por exemplo para auxiliar no diagnóstico de β-amiloidose no indivíduo. Para auxiliar na detecção, o composto modulador pode ser modificado com uma substância detectável, de preferência 99mTc ou iodo radioactivo (descrito mais acima) que pode ser detectado in vivo num indivíduo. 0 composto modulador de β-amilóide marcado é administrado ao indivíduo e, após um tempo suficiente para permitir a acumulação do modulador em sítios de deposição de amilóide, o composto modulador marcado é detectado por técnicas de imagiologia convencionais. 0 sinal radioactivo produzido pelo composto marcado pode ser detectado directamente (e.g., contagem de todo o corpo) ou, alternativamente, o sinal radioactivo pode ser convertido numa imagem, numa autorradiografia, ou num écran de computador, para permitir obter imagens de depósitos de amilóide no indivíduo. Os métodos de imagiologia de amiloidose utilizando proteínas marcadas radioactivamente são conhecidos na arte. Por exemplo, o componente P de amilóide do soro (SAP), radiomarcado com 123I ou 99mTc tem sido utilizado para obter imagens de amiloidose sistémica (veja-se, e.g. Hawkins, P.N. e Pepys, M.B. (1995) Eur. J. Nucl. Med. 22:595-599). De entre os vários isótopos de iodo radioactivo, utiliza-se de preferência o 123l (semivida = 13,2 horas) para cintigrafia de todo o 46 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ corpo, ο 124Ι (semivida = 4 dias) é utilizado para tomografia de emissão de positrões (PET), o 125I (semivida = 60 dias) é utilizado para estudos de renovação metabólica e o 131I (semivida = 8 dias) é utilizado para contagem de todo o corpo e estudos de imagiologia de baixa resolução retardada. De forma análoga aos estudos que utilizam SAP radiomarcado, pode-se fornecer a um indivíduo um composto modulador da invenção radiomarcado, por uma via adequada (e.g., intravenosa, intraspinal, intracerebralmente) num bolus único, por exemplo contendo 100 pg de composto marcado que transporta aproximadamente 180 MBq de radioactividade. A invenção proporciona um método para detectar a presença ou ausência de péptidos β-amilóides naturais numa amostra biológica, compreendendo contactar uma amostra biológica com um composto da invenção e detectar o composto ligado aos péptidos β-amilóides naturais, para detectar desse modo a presença ou ausência de péptidos β-amilóides naturais na amostra biológica. Numa concretização, o composto modulador de β-amilóide e a amostra biológica são contactados in vitro. Noutra concretização, o composto modulador de β-amilóide é contactado com a amostra biológica administrando o composto modulador de β-amilóide a um indivíduo. Para administração in vivo, de preferência o composto é marcado com tecnécio radioactivo ou iodo radioactivo. A invenção também proporciona um método para detectar péptidos β-amilóides naturais, para facilitar o diagnóstico de uma doença β-amiloidogénica que compreende contactar uma amostra biológica com o composto da invenção e detectar o composto ligado aos péptidos β-amilóides naturais, para facilitar o diagnóstico de uma doença β-amiloidogénica. Numa concretização, o composto modulador de β-amilóide e a amostra biológica são contactados in vitro. Noutra concretização, o composto modulador de β-amilóide é contactado com a amostra biológica por administração do composto modulador de β-amilóide a um indivíduo. Para administração in vivo, de preferência o composto é marcado com tecnécio radioactivo ou iodo radioactivo. De preferência, a utilização do método facilita o diagnóstico da doença de Alzheimer. 47

ΕΡ 1 161 449/PT

Noutra concretização, a invenção proporciona um método para alterar a agregação de β-ΑΡ natural, ou inibir a neurotoxicidade de β-ΑΡ que pode ser utilizado profiláctica, ou terapeuticamente no tratamento ou prevenção de distúrbios associados com β-amiloidose, e.g. doença de Alzheimer. Os compostos moduladores da invenção podem reduzir a toxicidade de agregados de β-ΑΡ naturais contra células neuronais em cultura. Além disso, os moduladores também têm a capacidade de reduzir a neurotoxicidade das fibrilhas de Αβ pré-formadas. Deste modo, os compostos moduladores da invenção podem ser utilizados para inibir ou prevenir a formação de fibrilhas de Αβ neurotóxicas em indivíduos (e.g., profilacticamente num indivíduo predisposto a deposição de β-amilóide) e podem ser utilizados para inverter a β-amiloidose terapeuticamente, em indivíduos que exibem deposição de β-amilóide.

Um modulador da invenção é contactado com péptidos β-amilóides naturais presentes num indivíduo (e.g., no fluido cerebrospinal ou cérebro do indivíduo) para desse modo alterar a agregação do β-ΑΡ natural e/ou inibir a neurotoxicidade dos β-ΑΡ naturais. Pode-se administrar ao indivíduo um composto modulador isolado ou, alternativamente, o composto modulador pode ser administrado em combinação com outros agentes terapeuticamente activos (e.g. como discutido acima na subsecção IV) . Quando se utiliza terapia de combinação, os agentes terapêuticos podem ser co-administrados numa única composição farmacêutica, co-administrados em composições farmacêuticas separadas, ou administrados sequencialmente. 0 modulador pode ser administrado a um indivíduo por qualquer via adequada, eficaz para inibir a agregação de β-ΑΡ natural no indivíduo, embora numa concretização particularmente preferida o modulador seja administrado parentericamente, muito preferencialmente ao sistema nervoso central do indivíduo. Vias possíveis de administração no SNC incluem administração intraspinal e intracerebral (e.g. administração intracerebrovascular). Alternativamente, o composto pode ser administrado, por exemplo, oral, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscularmente). Para vias de administração não do SNC, o composto pode ser administrado numa formulação que permite o transporte através da BBB. Alguns moduladores podem ser transportados através da BBB sem 48 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ qualquer modificação posterior adicional, enquanto que outros podem necessitar de nova modificação, como descrito acima na subsecção IV.

Os modos e dispositivos adequados para fornecimento de compostos terapêuticos ao SNC de um indivíduo são conhecidos na arte, incluindo reservatórios cerebrovasculares (e.g. (e.g., reservatórios de Ommaya ou Rikker; veja-se e.g., Raney, J.P. et al. (1988) J. Neurosci. Nurs. 20:23-29; Sundaresan, N. et al. (1989) Oncology 3:15-22), cateteres para fornecimento intratecal (e.g., Port-a-Cath, Y-cateteres e semelhantes; veja-se e.g., Plummer, J.L. (1991) Pain 44:215-220; Yaksh, T.L. et al.. (1986) Pharmacol. Biochem. Behav. 25:483-485), reservatórios intratecais injectáveis (e.g., Spinalgesic; veja-se e.g., Brazenor, G.A. (1987) Neurosurgery 21:484-491), sistemas de bomba de infusão implantáveis (e.g., Infusaid; veja-se e.g., Zierski, J. et al. (1988) Acta Neurochem. Supl. 43:94-99; Kanoff, R.B. (1994) J Am. Osteopath. Assoe. 94:487-493) e bombas osmóticas (comercializado pela Alza Corporation). Um modo de administração particularmente preferido é através de uma bomba de infusão programável externamente, implantável. Sistemas de bomba de infusão e sistemas de reservatório adequados estão também descritos na patente U.S. N° 5368562 de Blomquist e patente U.S. N° 4731058 de Doan, desenvolvidos pela Pharmacia Deltec Inc. O método da invenção para alterar a agregação de β-ΑΡ in vivo e, em particular, para inibir a agregação de β-ΑΡ, pode ser utilizado terapeuticamente em doenças associadas com agregação e deposição anormal de β-amilóide, para desse modo diminuir a taxa de deposição de β-amilóide e/ou diminuir o grau de deposição de β-amilóide, melhorando assim a evolução da doença. Numa concretização preferida, o método é utilizado para tratar a doença de Alzheimer (e.g. DA esporádica ou familiar, incluindo quer indivíduos que exibem sintomas de ADN, quer indivíduos susceptíveis a DA familiar). O método também pode ser utilizado para tratar profilática ou terapeuticamente outras ocorrências clínicas de deposição de β-amilóide, tal como em indivíduos com a síndrome de Down e em pacientes com hemorragia cerebral hereditária com amiloidose tipo holandês (HCHWA-D). Apesar da inibição da agregação de β-ΑΡ ser um método terapêutico preferido, os moduladores que 49 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ promovem a agregação de β-ΑΡ também podem ser úteis terapeuticamente, permitindo a sequestração de β-ΑΡ em sitios que não levam a uma deficiência neurológica.

Adicionalmente, a acumulação anormal da proteína precursora de β-amilóide em fibras musculares foi implicada na patologia de miosite de corpos de inclusão esporádica (IBM) (Askana, V. et al. (1996) Proc. Natl. Acad Sei USA 93:1314-1319; Askanas, V. et al. (1995) Current Opinion in

Rheumatology 7:486-496). Deste modo, os moduladores da invenção podem ser utilizados profiláctica ou terapeuticamente no tratamento de distúrbios em que ο β-ΑΡ ou APP é anormalmente depositada em localizações não neurológicas, tal como no tratamento da IBM, por fornecimento dos moduladores a fibras musculares. A presente invenção será mais bem ilustrada pelos exemplos seguintes que não deverão ser entendidos como limitativos. A capacidade do modulador para alterar a agregação do péptido β-amilóide natural e/ou inibir a neurotoxicidade do péptido β-amilóide natural nos ensaios descritos a seguir é preditiva da capacidade do modulador realizar a mesma função in vivo. A presente invenção será melhor ilustrada pelos exemplos seguintes que não deverão ser entendidos como limitativos. Os conteúdos de todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados ao longo deste pedido, bem como as Figuras são aqui incorporados como referência. EXEMPLO 1: Preparação de compostos moduladores de β-amilóide compreendendo D-aminoácidos

Os moduladores de β-amilóide compreendendo D-aminoácidos podem ser preparados por síntese de péptidos em fase sólida, por exemplo utilizando uma estratégia de protecção baseada em N°-9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), como se segue. Começando com 2,5 mmol de resina FMOC-D-Val-Wang, fazem-se adições sequenciais de cada aminoácido utilizando um excesso de quatro vezes de aminoácidos protegidos, 1-hidroxibenzotriazole (HOBt) e diisopropilcarbodiimida (DIC) . Fazem-se novos acoplamentos quando necessário, tal como 50 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ determinado por teste de ninidrina da resina, após acoplamento. Cada ciclo de síntese é descrito de forma resumida por uma desprotecção de três minutos (piperidina/N-metilpirrolidona (NMP) a 25%), uma desprotecção de 15 minutos, cinco lavagens com NMP de 1 minuto, um ciclo de acoplamento de 60 minutos, cinco lavagens com NMP e um teste de ninidrina. Para modificação do terminal N, um reagente modificador do terminal N é substituído por um FMOC-D-aminoácido e acoplado a uma porção de 700 mg do péptido totalmente montado-resina, pelo protocolo acima. O péptido é removido da resina por tratamento com ácido trifluoroacético (TFA) (82,5%), água (5%), tioanisole (5%), fenol (5%), etanoditiol (2,5%) durante duas horas, seguido de precipitação do péptido em éter frio. O sólido é sedimentado por centrifugação (2400 rpm x 10 min) e o éter decantado. O sólido é ressuspenso em éter, sedimentado e decantado uma segunda vez. O sólido é dissolvido em ácido acético a 10% e liofilizado até à secura. Para purificação preparativa e caracterização analítica subsequente, dissolvem-se 60 mg do sólido em acetonitrilo (ACN) a 25%/ TFA a 0,1% e aplica-se a uma coluna de cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa (HPLC), C18.

Alternativamente, os moduladores de β-amilóide que compreendem D-aminoácidos podem ser preparados num sintetizador de péptidos Rainin PS3 utilizando um protocolo automático estabelecido pelo fabricante para uma síntese à escala de 0,25 mmol. Os acoplamentos são realizados utilizando hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio (HBTU)/ FMOC-D-aminoácido num excesso de quatro vezes em N-metilmorfolina (NMM) 0,4 M/dimetilformamida (DMF) durante 60 minutos. Entre os acoplamentos, o grupo FMOC é removido por reacção com piperidina a 20%/DMF durante 20 minutos. O péptido é removido da resina por tratamento com TFA a 95%/água durante uma hora e precipitado com éter. O sedimento é ressuspenso em acetonitrilo a 40%/água e liofilizado. Quando necessário, o material foi purificado por HPLC preparativa utilizando acetonitrilo a 15%-50% durante 60 minutos numa coluna Vydac C18 (21 x 250 mm).

Podem-se sintetizar vários compostos moduladores de β-amilóide modificados no terminal N, utilizando métodos convencionais. Os péptidos ligados à resina totalmente 51 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ protegidos são preparados como descrito acima numa resina apropriada para eventualmente se obterem ácidos peptidicos de terminal carboxilo. Colocam-se aliquotas de pequenas porções de cada péptido-resina (e.g., 13-20 pmol) em vasos reaccionais separados. O grupo protector FMOC do terminal N de cada amostra é removido do modo convencional com piperidina a 20% em NMM seguido de várias lavagens extensivas com DMF. O grupo α-amino N-terminal desprotegido de cada amostra de péptido-resina pode ser modificado utilizando um dos seguintes métodos: Método A, acoplamento de reagentes modificadores que contêm grupos de ácido carboxilico livres. O reagente modificador (cinco equivalentes) é previamente dissolvido em NMP, DMSO, ou numa mistura destes dois solventes. HOBt e DIC (cinco equivalentes de cada reagente) são adicionados ao modificador dissolvido e a solução resultante é adicionada a um equivalente de péptido-resina com amino livre. Deixa-se o acoplamento prosseguir durante a noite, seguido de lavagem. Se um teste de ninidrina numa amostra pequena de péptido-resina mostra que o acoplamento não está completo, o acoplamento é repetido utilizando l-hidroxi-7-azabenzotriazole (HOAt) em vez de HOBt. Método B, acoplamento de reagentes modificadores obtido em formas pré-activadas: o reagente modificador (cinco equivalentes) é pré-dissolvido em NMP, DMSO ou numa mistura destes dois solventes e é adicionado a um equivalente de péptido-resina. Adiciona-se diisopropiletilamina (DIEA; seis equivalentes) à suspensão de modificador activado e péptido-resina. Deixa-se o acoplamento prosseguir durante a noite, seguido de lavagem. Se um teste de ninidrina numa amostra pequena de péptido-resina mostra que o acoplamento não está completo, o acoplamento é repetido.

Após o segundo acoplamento (se necessário) os péptidos modificados no terminal-N-resinas são secos sob pressão reduzida e clivados da resina com remoção de grupos protectores de cadeia laterais, como descrito acima. Utiliza-se HPLC de fase inversa analítica para confirmar que o produto principal está presente nos péptidos brutos resultantes que são purificados utilizando cartuchos Millipore 52 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ

Sep-Pak, ou HPLC de fase inversa preparativa. Utiliza-se espectrometria de massa ou espectrometria de ressonância magnética nuclear de campo elevado para confirmar a presença do composto desejado no produto. Método C, preparação de péptidos substituídos com alquilo no terminal-N, utilizando intermediários peptidicos de bromoacetilo: um péptido ligado à resina pode ser acoplado a ácido bromoacético (12 equivalentes) com 1,3-diisopropilcarbodiimida (DIC) (13 equivalentes) em DMF. 0 péptido substituído com bromoacetilo resultante pode ser modificado por reacção com aminas primárias ou secundárias, incluindo metilamina, etilamina, propilamina, isopropilamina e piperidina. A reacção é realizada em DMSO a 60%/DMF e está tipicamente completa após 24 horas. Método D preparação de péptidos substituídos com alquilo no terminal-N através de alquilação redutora. Após o péptido estar dissolvido (ou parcialmente dissolvido) em água contendo metanol a 0-10%, ele é reagido com um aldeído (5-8 equivalentes) e cianoboro-hidreto de sódio (10-16 equivalentes). O número de equivalentes pode ser ajustado para o tipo de aldeído e grau de substituição desejado. O pH da solução resultante é ajustado para 2 com HC1 1M e mantido em 2 durante uma hora. A reacção é monitorizada por HPLC e está normalmente completa em duas horas. A mistura reaccional é concentrada à temperatura ambiente e purificada por HPLC. Método E modificação do terminal C: O péptido foi sintetizado numa resina 2-clorotritilo utilizando química de Fmoc convencional, no entanto o grupo D-aminoácido final acoplado foi protegido com Boc. O péptido foi removido da resina com 8/1/1 de diclorometano(DCM)/ácido acético/ trifluoroetanol e a mistura foi concentrada. O resíduo de péptido foi dissolvido em acetonitrilo a 20%, congelado e liofilizado durante a noite. O ácido de péptido protegido com BOC bruto foi acoplado sob condições básicas (pH = 11, ajustado com DIEA) a uma amina com um equivalente cada de 1-hidroxi-7-azobenzotriazole(HOAt) e DIC. A reacção estava completa após agitação durante a noite e o péptido foi precipitado com água. O grupo BOC foi clivado por reacção com 53 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ TFA a 25% em DCM durante uma hora e o péptido foi purificado por HPLC. exemplo 2: ensaios de agregação de β-amilóide A capacidade dos compostos moduladores de β-amilóide modularem (e.g. inibirem ou promoverem) a agregação de β-ΑΡ natural quando combinados com ο β-ΑΡ natural pode ser analisada num ou em ambos os ensaios de agregação descritos a seguir. 0 β-ΑΡ natural (β-ΑΡι_40) para utilização nos ensaios de agregação está disponível comercialmente da Bachem (Torrance, CA). A. Ensaio de nucleação 0 ensaio de nucleação é utilizado para determinar a capacidade dos compostos de teste alterarem (e.g. inibirem) os fenómenos precoces na formação das fibras de β-ΑΡ a partir de β-ΑΡ monomérico. Como é caracteristico de um mecanismo de polimerização nucleado, observa-se um tempo de retardo antes da nucleação, após o que o péptido rapidamente forma fibras, tal como reflectido num aumento linear da turbidez. O atraso no tempo antes da polimerização do monómero β-ΑΡ pode ser quantificado, bem como a extensão da formação de fibras insolúveis, por dispersão de luz (turbidez). A polimerização atinge um equilíbrio quando a turbidez máxima atinge um patamar. A turbidez de uma solução de β-ΑΡ natural na ausência ou presença de várias concentrações de um composto modulador de β-amilóide é determinada medindo a absorvância aparente da solução a 405 nm (A^snm) ao longo do tempo. O limiar de sensibilidade para a medição de turbidez é na gama de 15-20 μΜ de β-ΑΡ. Um decréscimo na turbidez ao longo do tempo na presença do modulador, em comparação com a turbidez na ausência do modulador, indica que o modulador inibe a formação de fibras de β-ΑΡ a partir de β-ΑΡ monomérico. Este ensaio pode ser realizado utilizando mistura ou agitação para acelerar a polimerização, aumentando desse modo a rapidez do ensaio. Além disso, o ensaio pode ser adaptado a um formato de placa de 96 poços para pesquisar vários compostos.

Para realizar o ensaio de nucleação, primeiro dissolve-se o péptido Αβι_4ο em HFIP (1,1,1,3,3,3-Hexaf luoro-2-propanol; 54 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ

Aldrich 10,522-8) a uma concentração de 2 mg de péptido/ml e incuba-se à temperatura ambiente durante 30 min. O péptido solubilizado em HFIP é tratado com ultra-sons num aparelho de ultra-sons com banho de água durante 5 min no parâmetro mais elevado, em seguida é evaporado até à secura sob uma corrente de árgon. A película de péptido é ressuspensa em dimetilsulfóxido anidro (DMSO) numa concentração de 6,9 mg/ml (25x concentração), tratada com ultra-sons durante 5 min como anteriormente, em seguida filtrada através de um filtro de seringa de nylon de 0,2 micron (VWR N° cat. 28196-050) . Os compostos de teste são dissolvidos em DMSO a lOOx concentração. Quatro volumes de 25x péptido Αβ4_40 em DMSO são combinados com um volume de composto de teste em DMSO num frasco de vidro e misturados para produzir uma razão molar de 1:1 entre péptido Αβ e composto de teste. Para diferentes razões molares, os compostos de teste são diluidos com DMSO antes da adição a Αβ4_40, de modo a manter as concentrações finais de DMSO e Αβ4_40 constantes. As amostras de controlo não contêm o composto de teste. Dez microlitros da mistura são em seguida adicionados ao fundo de um poço de uma placa de 96 poços de ligação ultra baixa Corning Costar (Corning Costar, Cambridge MA; N° cat. 2500). Adicionam-se noventa microlitros de água ao poço, a placa é agitada num agitador rotativo a uma velocidade constante, à temperatura ambiente, durante 30 segundos e adicionam-se mais 100 μΐ de 2x tampão PTL (NaH2P04 20 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4) ao poço, a placa é novamente agitada durante 30 segundos e faz-se uma leitura da turbidez da linha de base (t=0) medindo a absorvância aparente a 405 nm utilizando um leitor de microplacas modelo 450 da Bio-Rad. A placa é em seguida recolocada no agitador e agitada continuamente durante 5 horas. As leituras de turbidez são feitas a intervalos de 15 minutos. A agregação de β-amilóide na ausência de quaisquer moduladores resulta numa maior turbidez da solução de β-ΑΡ natural (i.e. um aumento na absorvância aparente a 450 nm, ao longo do tempo). Deste modo, uma solução que inclui um composto modulador inibitório eficaz exibe uma menor turbidez em comparação com a amostra de controlo sem o composto modulador (i.e. menor absorvância aparente a 450 nm ao longo do tempo, em comparação com a amostra de controlo). 55 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ

Em alternativa à utilização de turbidez para quantificar a agregação de β-amilóide, também se pode utilizar a fluorescência de tioflavina T (Th-T) para quantificar a agregação de β-amilóide no ensaio de nucleação (a utilização de fluorescência de Th-T para quantificar a agregação de β-amilóide é descrita a seguir para o ensaio de expansão de semente). B. Ensaio de ligação de fibrilhas

Os materiais seguintes são necessários para o ensaio de ligação de fibrilhas: dispositivo multifiltros Millipore; tubos de vidro 12 x 75; filtros de vidro de 25 mm GF/F; PBS/Tween 20 a 0,1% a 4°C (PBST); fibrilhas de Αβ; composto radioactivo; composto não radioactivo; pipeta de repetição Eppendorf com pontas; marcadores; fórceps; e vácuo.

Neste ensaio, cada amostra é corrida em triplicado. A fibrilha de Αβ "envelhecida" é primeiro preparada com aproximadamente 8 dias de avanço, envelhecendo aliquotas de 1 ml de uma solução de péptido Αβ 1-40 200 μΜ em DMSO a 4%/PBS durante 8 dias a 37°C, com agitação basculante. Este péptido Αβ "envelhecido" pode ser testado directamente em células, ou armazenado a -80°C. A fibrilha Αβ 200 μΜ é diluída em PBST para se obter uma solução 4 μΜ (320 μΐ em 16 ml de PBST). Adicionam-se aliquotas de 100 μΐ desta solução por tubo, com a pipeta de repetição.

Os compostos moduladores de β-amilóide da invenção são preparados a diluições de 2μΜ - 200 fM como se segue:

Diluir uma solução-mãe 5 mM 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 1,6667 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO).

Diluir uma solução-mãe 1,667 mM 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 0,5556 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO).

Diluir uma solução-mãe 555, 556 μΜ 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 185,19 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO). 5 Diluir uma solução-mãe 185,185 μΜ 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 61,728 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO).

Diluir uma solução-mãe 61,728 μΜ 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 20,576 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO). 56 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ

Diluir uma solução-mãe 20,576 μΜ 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 6,8587 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO).

Diluir uma solução-mãe 6,859 μΜ 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 2,2862 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO).

Diluir uma solução-mãe 2,286 μΜ 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 0,7621 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO). 10 Diluir uma solução-mãe 762,079 nM 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 254,03 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO).

Diluir uma solução-mãe 254, 026 nM 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 84,675 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO).

Diluir uma solução-mãe 84,675 nM 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 28,225 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO).

Diluir uma solução-mãe 28,225 nM 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 9,4084 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO).

Diluir uma solução-mãe 9,408 nM 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 3,1361 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO). 15 Diluir uma solução-mãe 3,136 nM 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 1,0454 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO).

Diluir uma solução-mãe 1,045 nM 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 0,3485 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO).

Diluir uma solução-mãe 348, 459 pM 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 116,15 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO).

Diluir uma solução-mãe 116,153 pM 1:3 em DMSO para se obter uma solução-mãe 38,718 (200 μΐ em 400 μΐ de DMSO).

Diluir uma solução-mãe 185, 185 μΜ 1:25 em PBST para se obter 7,4074 (50 pL em 1,2 ml de PBST) 20 Diluir uma solução-mãe 61,728 μΜ 1:25 em PBST para se obter 2,4691 (50 μΐ em 1,2 ml PBST)

Diluir uma solução-mãe 20, 576 μΜ 1:25 em PBST para se obter 0,823 (50 μΐ em 1,2 ml de PBST)

Diluir uma solução-mãe 6,859 μΜ 1:25 em PBST para se obter 0,2743 (50 μΐ em 1,2 ml de PBST)

Diluir uma solução-mãe 2, 286 μΜ 1:25 em PBST para se obter 0,09 14 (50 μΐ em 1,2 ml de PBST)

Diluir uma solução-mãe 762, 079 nM 1:25 em PBST para se obter 30,483 (50 μΐ em 1,2 ml de PBST) 57 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ 25 Diluir uma solução-mãe 254, 026 nM 1:25 em PBST para se obter 10,161 (50 μΐ em 1,2 ml de PBST)

Diluir uma solução-mãe 84, 675 nM 1:25 em PBST para se obter 3,387 (50 μΐ em 1,2 ml de PBST)

Diluir uma solução-mãe 28,225 nM 1:25 em PBST para se obter 1,129 (50 μΐ em 1,2 ml de PBST)

Diluir uma solução-mãe 9, 408 nM 1:25 em PBST para se obter 0,3763 (50 μΐ em 1,2 ml de PBST)

Diluir uma solução-mãe 3,136 nM 1:25 em PBST para se obter 0,1254 (50 μΐ em 1,2 ml de PBST) 30 Diluir uma solução-mãe 1,045 nM 1:25 em PBST para se obter 0,0418 (50 μΐ em 1,2 ml de PBST)

Diluir uma solução-mãe 348, 459 pM 1:25 em PBST para se obter 13,938 (50 μΐ em 1,2 ml de PBST)

Diluir uma solução-mãe 116,153 pM 1:25 em PBST para se obter 4,6461 (50 μΐ em 1,2 ml de PBST) O composto modulador de β-amilóide (200 μΐ) é em seguida adicionado ao tubo adequado contendo a fibrilha de Αβ. O composto modulador de β-amilóide marcado radioactivamente é preparado utilizando protocolos de segurança radioactiva convencionais fazendo uma diluição em solução de PBS/Tween-20 a 0,1% de modo que há uma concentração final de 20.000 dpm por 100 μΐ. Adicionam-se aliquotas de 100 μΐ do composto modulador de β-amilóide marcado radioactivamente por tubo, utilizando a pipeta de repetição. As amostras são tapadas com parafilm e incubadas a 37°C dentro de sacos de radioactividade de plástico durante a noite.

Para filtrar as amostras, os filtros são pré-humedecidos num pequeno volume de PBST. Ajustam-se dois aparelhos de multifiltração Millipore com filtros GF/F em cada divisória de filtração, seguindo as instruções do fabricante. As amostras são removidas do incubador a 37°C e cada amostra é filtrada utilizando um volume pequeno (~5 ml) de tampão PBST frio. O tubo da amostra é em seguida lavado com dois volumes adicionais de 5 ml de tampão PBST frio. Deixa-se puxar o vácuo num filtro semi-seco durante aproximadamente 2 minutos, após a adição da última amostra e o filtro é transferido para um tubo 58 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ marcado para contagem da iodação. São registadas contagens de um minuto, os dados são representados graficamente e utiliza-se o programa Prism (GraphPAD) para analisar o gráfico, de acordo com as instruções do fabricante. C. Ensaio de expansão de semente 0 ensaio de expansão de semente pode ser realizado para medir a taxa de fibras Αβ formadas numa solução de monómero Αβ após adição da "semente" de fibra Αβ polimérica. A capacidade dos compostos de teste prevenirem nova deposição de Αβ monomérico num amilóide previamente depositado é determinada utilizando um indicador directo da formação de folhas-β, utilizando fluorescência. Em contraste com o ensaio de nucleação, a adição de semente proporciona a nucleação imediata e crescimento continuado de fibrilhas pré-formadas, sem a necessidade de mistura continua e, assim, a obtenção de resultados na ausência de um tempo de retardo antes do inicio da polimerização. Uma vez que este ensaio utiliza condições de polimerização estática, a actividade dos compostos positivos no ensaio de nucleação pode ser confirmada neste segundo ensaio sob condições diferentes e com uma sonda adicional da estrutura do amilóide.

No ensaio de expansão da semente, ο Αβι_40 monomérico é incubado na presença de um núcleo "semente" (aproximadamente dez moles porcento de Αβ que foram previamente deixadas polimerizar, sob condições estáticas controladas). Diluem-se em seguida amostras da solução em tioflavina (Th-T). A associação especifica do polímero de Th-T com Αβ produz um complexo fluorescente que permite medir a extensão da formação de fibrilhas (Levine, H. (1993) Protein Science 2:404-410). Em particular, a associação de Th-T com β-ΑΡ agregado, mas não com β-ΑΡ monomérico ou fracamente associado, origina um novo máximo de excitação (ex) a 450 nm e uma maior emissão (em) a 482 nm, em comparação com a (ex) a 385 nm e a (em) a 445 nm do corante livre. Alíquotas pequenas da mistura de polimerização contêm fibrilhas suficientes para serem misturadas com o Th-T, para permitir a monitorização da mistura reaccional por amostragem repetida. Observa-se uma curva de crescimento linear na presença de monómero em excesso. A formação de fibrilhas em folha-β responsiva a tioflavina T é equivalente 59 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ ao aumento de turbidez observado utilizando o ensaio de nucleação.

Prepara-se uma solução de monómeros de Αβ para utilização no ensaio de expansão de semente dissolvendo uma quantidade adequada de péptido Αβι_40 em 1/25 volumes de dimetilsulfóxido (DMSO), seguido de água até V2 volume e V2 volume de 2x PBS (lOx PBS: NaCl 137 mM, KC1 2,7 mM, Na2HP04*7H20 4, 3 mM, KH2P04 1,4 mM pH 7,2) até uma concentração final de 200 μΜ. Para preparar a semente mãe, incuba-se 1 ml da preparação de monómeros de Αβ durante aproximadamente 8 dias a 37°C e corta-se sequencialmente através de uma agulha de calibre 18, 23, 26 e 30, por 25, 25, 50 e 100 vezes, respectivamente. Recolhem-se amostras de 2 μΐ do material cortado para medições de fluorescência, após cada 50 passagens através da agulha de calibre 30, até as unidades de fluorescência (UF) atingirem um patamar (aprox. 100-150x). Os compostos de teste são preparados dissolvendo uma quantidade adequada do composto de teste em lx PBS, até uma concentração final de 1 mM (lOx solução-mãe). Quando insolúvel, o composto é dissolvido em 1/10 volumes de DMSO e diluido em lx PBS até 1 mM. Também se prepara uma outra diluição 1/10 para testar cada candidato, quer a 100 μΜ, quer a 10 μΜ.

Para realizar o ensaio de expansão de semente, cada amostra é preparada com 50 μΐ de monómero 200 μΜ, 125 UF de semente cortada (uma quantidade variável dependente do lote da semente, rotineiramente 3-6 μΐ) e 10 μΐ de lOx solução de modulador. O volume de amostra é então ajustado para um volume final de 100 μΐ com 1 xPBA. Testam-se tipicamente duas concentrações de cada modulador: 100 μΜ e 10 μΜ, equivalente a uma razão molar de 1:1 e 1:10 entre monómero e modulador. Os controlos incluem uma reacção não semeada para confirmar que o monómero fresco não contém semente e uma reacção semeada na ausência de quaisquer moduladores, como uma referência para comparar contra moduladores candidatos. O ensaio é incubado a 37°C durante 6 h, recolhendo-se amostras de 2 μΐ de hora a hora para medições de fluorescência. Para medir a fluorescência, adiciona-se uma amostra de 2 μΐ de Αβ a 400 μΐ de solução de tioflavina-T (fosfato de potássio 50 mM, Tioflavina-T 10 mM, pH 7,5). As amostras são agitadas num 60 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ vórtex e a fluorescência é lida numa cuvete de microquartzo de 0,5 ml a EX 450 nm e EM 482 nm (fluorimetro Hitachi 4500). A agregação de β-amilóide resulta numa maior emissão de tioflavina-T. Deste modo, as amostras que incluem um composto modulador inibitório, eficaz, exibem emissão reduzida em comparação com amostras de controlo, sem o composto modulador. EXEMPLO 3: análise de compostos moduladores de β-amilóide

Neste exemplo, os compostos moduladores de β-amilóide aqui descritos foram preparados e testados quanto à sua capacidade para inibir a agregação do péptido β-amilóide natural, utilizando ensaios de agregação como descrito no Exemplo 2. Os resultados de uma primeira série de experiências estão resumidos nas tabelas I, II e III.

TABELA I PPI# Ensaio de Nucleação Aretardo 5 μΜ 2,5 μΜ 1,25 μΜ Kd da ligação de fibrilhas Comp. Comp. Ref. Kd Ref 803 <1 <1 <1 913 1 1 1 968 >5 >5 2 96 9 >5 >5 3 1, 13 x 10“9 PPI-558 3,7 x IO-9 970 >5 >5 1 992 3 1 1 2,43 x 10“9 PPI-558 3,70 x IO-9 993 1 1 1 1005 3 3 1 1006 1 1 1 *1007 4 4 3 8,64 x 10“10 PPI-558 1,69 x IO-9 #1007 1,5 1,5 1,5 6,27 x 10“10 PPI-558 2, 75 x 10“9 1008 1,75 x 10“9 PPI-558 1,00 x 10“9 #1013 2 >3 2 2,47 x 10“10 PPI-558 1,69 x 10“9 1017 3,89 x 10“10 PPI-558 2,42 x 10“9 1018 7,01 x 10“10 PPI-558 2,42 x 10“9 1020 6,01 x 10“10 PPI-558 2,42 x 10“9 1022 1,50 x 10“10 PPI-558 1,00 x 10“9 1025 4,30 x 10“10 PPI-558 1,00 x 10“9 1028 4,90 x 10“10 PPI-558 1,00 x 10“9 1038 6,52 x 10“10 PPI-558 3,76 x 10“9 1039 2,44 x 10“9 PPI-558 3,76 x 10“9 61 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ PPI# Ensaio de Nucleação Aretardo 5 μΜ 2,5 μΜ 1,25 μΜ Kd da ligação de fibrilhas Comp. Comp. Ref. Kd Ref 1040 4,08 x IO-10 PPI-558 2,4 x IO-9 1041 1,61 x 10"9 PPI-558 2,4 x IO-9 1042 2,34 x 10"10 PPI-558 2,4 x IO-9 1088 3,40 x IO-9 PPI-558 1,93 x IO-9 1089 5,7 x 10_1° PPI-558 3,3 x IO-9 1093 1,02 x IO-9 PPI-558 1,93 x IO-9 1094 3,7 x 10'9 PPI-558 3,5 x IO-9 1179 6,04 x 10~10 PPI-558 1,93 x IO-9 1180 3,3 x 10~10 PPI-558 3,5 x IO-9 1261 1,12 x 10~8 PPI-558 3,34 x 10~9 Notas : * significa que resultados do ensaio de nucleação foram medidos a 3, 1 e 0,3 μΜ de composto # significa que resultados do ensaio de foram medidos a 2,5, 1,25 e 0,6 μΜ de composto

TABELA II PPI# Resultados do ensaio de nucleação 3 μΜ 1 μΜ 0,3 μΜ Kd da 1. Comp. Lgação de fi Comp. Ref. .brilhas Kd Ref. *1019 >2,5 >2,5 2, 0 4, 11 X 10“10 PPI-558 1,69 x IO-9 1019 5,34 X 10“10 PPI-558 1,93 x 10“9 1301 1,1 X 10“9 PPI-1318 1, 4 x 10“9 1302 2,2 X 10“10 PPI-1318 1, 4 x 10“9 1303 1,1 X 10'9 PPI-1318 1,4 x 10‘9 1318 >5 2 1 7,7 X 10“n PPI-558 2,3 x 10“9 1318 1,4 X 10~9 1318 6,2 X 10~n 1319 >5 >5 1 1320 >5 3 1 1,4 X 10~9 PPI-1318 6,2 x 10“n 1321 <1 <1 <1 1322 1,2 X 10~9 PPI-1318 6,2 x 10“n 1323 1324 1325 1,4 X IO-9 PPI-1318 1,4 x IO-9 1326 5,6 X 10'10 PPI-1318 6,2 x 10-11 1327 8,2 X 10“10 PPI-1318 1,4 x IO-9 1328 2,4 X 10“9 PPI-1318 6,2 x 10“n 62 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ PPI# Resultados do ensaio de nucleação 3 μΜ 1 μΜ 0,3 μΜ Kd da 1-Comp. Lgação de fi Comp. Ref. .brilhas Kd Ref. 1329 *1125 >2,5 >2,5 2, 0 1,27 x 10~9 PPI-558 2,08 x 10~9 1125 1,34 x 10~9 PPI-558 5,05 x 10~9 1133 3,18 x 10“7 PPI-558 2,08 x 10‘9 1155 1,24 x 10-7 PPI-558 2,08 x 10“9 Notas: * significa que os resultados do ensaio de nucleação foram medidos a 2,5, 1,25 e 0,6 μΜ de composto

Os compostos moduladores foram avaliados em ensaios de nucleação utilizando Αβι_40 5 μΜ e, quer 5 μΜ, 2,5 μΜ, 1,25 μΜ, 3 μΜ, 1 μΜ, ou 0,3 μΜ de composto de teste. A alteração no tempo de retardo (Aretardo) está presente como a razão entre o tempo de retardo observado na presença do composto de teste (quer a 5 μΜ, 2,5 μΜ, 1,25 μΜ, 3 μΜ, 1 μΜ, ou 0,3 μΜ) e ο tempo de retardo do controlo.

TABELA III PPI # ESTRUTURA Kd do comp. para ligação de fibrilhas PPI-504 TFA · Η-(lv-[3-1]y-fa)-NH2 PPI-1181 TFA · H-(lvff1)-NH-Et PPI-1465 TFA · Η-1 vf f 1 -NH-CH2CH2-NH2 3,6 x 10~9 PPI-1603 TFA · H-(GGClvff1)-NH2 PPI-1604 TFA · H-(GGClvfyl)-NH2 PPI-1605 TFA · H-(GGClvf-[3-1]y-l)-NH2 PPI-1619 2TFA · H-LVF-NH-NH-FVL-H 3,5 x 10“8 (um análogo de 1125) PPI-1621 2TFA · H-LVF-NH-NH-fvl-H 8,7 x 10“9 (um análogo de 1125) PPI-1635 TFA · H-lff-(nvl)-1-NH2 1,4 x 10~9 PPI-1636 TFA · H-lf-[pF]f-(nvl)-1-NH2 1,5 x 10~9 PPI-1637 TFA · H-l-[pF]f-[pF]f-(nvl)-l-NH2 1,8 x 10~9 PPI-1782 TFA *Me-lvyf1-NH2 PPI-1783 TFA *H-(lvyf1)-NH2 PPI-1784 TFA · Me-(lv-[p-F]f-f1)-NH2 2,5 x 10~9 PPI-1785 TFA · H- (lv- [p-F] f-f 1) -NH2 2,8 x 10~9 63 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ PPI # ESTRUTURA Kd do comp. para ligação de fibrilhas PPI-1786 TFA · H-(lvf-[p-F]f-1)-NH2 PPI-1787 TFA · Me-lvff-[nvl])-NH2 5,8 x 10~9 PPI-1788 TFA · Me-(lvff-[nle])-NH2 (~4 x 10“9) ensaio de 3 pontos PPI-1799 TFA*Me-lvff1)-OH PPI-1800 TFA · Me-(1vf f1)-NH-OH (~4 x 10~9) ensaio de 3 pontos PPI-1805 TFA · H-(lv-[p-F]f-f-(nvl))-NH2 PPI-1806 TFA · Me-(1-v-[p-F]f-f-(nvl))-NH2 PPI 1807 TFA · H-((nvl)-v-[p-F]f-f-nvl)-NH2 PPI-1818 TFA · Η-(1-(nvl)-[p-F]f-f-(nvl)-NH2 PPI 1819 TFA · H-((nvl)-(nvl)-[p-F]f-f-(nvl))-NH2 PPI 1820 TFA · Me-(1-(nvl) - [p-F] f-f-(nvl) )-NH2 PPI 1827 TFA · H-(lvff-(nvl))-NH2 PPI 1828 Ac-(lvff1)-NH2 PPI 1829 Ac-(lvff1)-OH PPI 1830 TFA · H-(lv-[3-1]y-fl)-NH2 (nvl) = D-norvalina (nle) = D-norleucina [3—1]y = 3-iodo-D-tirosina [p—F]f = para-fluoro-D-fenilalanina Ο ΡΡΙ-1801 é ο análogo de acetilamida de H-LPFFD-OH que foi referido na literatura. Este composto foi preparado e testado quanto a actividade para fins de comparação. Os resultados indicam que este composto se liga fracamente a fibrilhas no ensaio aqui utilizado.

Pelo contrário, os resultados apresentados nas tabelas I, li e III e Figura 2 demonstram que os moduladores de β-amilóide da invenção são inibidores eficazes da agregação de Αβ. EXEMPLO 6: Ensaio de neurotoxicidade A neurotoxicidade dos agregados de péptidos β-amilóides naturais, quer na presença, quer ausência de um modulador de β-amilóide, pode ser testada num ensaio baseado em células utilizando uma linha celular derivada neuronalmente, quer de rato, quer de humano (células Pc-12 ou células NT-2, 64 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ respectivamente) e ο indicador de viabilidade brometo de 3-(4,4-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difenil-tetrazólio (MTT). (Veja-se e.g., Shearman, M.S. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:1470-1474; Hansen, M.B. et al. (1989) J. Immun. Methods 119:203-210 para uma descrição de ensaios de viabilidade baseados em células semelhantes). A PC-12 é uma linha celular de feocromocitoma adrenal de rato e está disponível da American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC CRL 1721). O mtt (disponível comercialmente da Sigma Chemical Co.) é um substrato cromogénico que é convertido de amarelo em azul em células viáveis, que podem ser detectadas espectrofotometricamente.

Para testar a neurotoxicidade de péptidos β-amilóides naturais, preparam-se primeiro soluções-mãe de monómeros Αβ frescos e agregados de Αβ envelhecidos. Prepara-se Αβι-40 em DMSO a 100% a partir de pó liofilizado e dilui-se de imediato em metade do volume final em H20 e em seguida metade do volume final em 2x PBS, de modo que se obtém uma concentração final de péptido de 200 μΜ, DMSO a 4%. O péptido preparado deste modo e testado imediatamente nas células é designado por monómero Αβ "fresco". Para preparar agregados de Αβ "envelhecidos", a solução de péptido é colocada num tubo Eppendorf de 1,5 ml e incubada a 37°C durante oito dias, para permitir a formação de fibrilhas. Este péptido Αβ "envelhecido" pode ser testado directamente em células ou congelado a -80°C. A neurotoxicidade dos monómeros frescos e dos agregados envelhecidos é testada utilizando células PC12 e NT2. As células PC12 são cultivadas rotineiramente em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo soro de cavalo a 10%, soro fetal de vitela a 5%, glutamina 4 mM, e gentamicina a 1%. As células NT2 são rotineiramente cultivadas em meio OPTI-MEM (GIBCO BRL CAT. #31985 suplementado com soro fetal de vitela a 10%, glutamina 2 mM e gentamicina a 1%. As células são plaqueadas a 10-15 000 células por poço em 90 μΐ de meio fresco, numa placa de cultura de tecidos de 96 poços, 3-4 horas antes do tratamento. As soluções de péptido Αβ fresco ou envelhecido (10 μΐ são então diluídos 1:10 directamente no meio de cultura de tecidos de modo a que a concentração final esteja na gama de 1-10 μΜ de péptido. As células são incubadas na presença de péptidos sem alteração no meio durante 48 horas a 37°C. Para as três horas finais de exposição das células à 65 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ preparação de β-ΑΡ, adiciona-se ΜΤΤ ao meio numa concentração final de 1 mg/ml e a incubação é continuada a 37°C. Após a incubação de duas horas com ΜΤΤ o meio é removido e as células são lisadas em 100 μΐ de isopropanol/HCl 0,4 N com agitação. Adiciona-se um volume igual de PBS a cada poço e as placas são agitadas por mais 10 minutos. Mede-se a absorvância de cada poço a 570 nm utilizando um leitor de placas de microtitulo para quantificar as células viáveis.

Utilizando este ensaio, foi confirmada a neurotoxicidade de agregados de Αβι_40 envelhecidos (5 dias ou 8 dias) sozinhos, mas não de monómeros de Αβχ_40 frescos sozinhos. As experiências demonstraram que a incubação de células neuronais com quantidades crescentes de monómeros de Αβχ_40 frescos não era significativamente tóxica para as células, enquanto que a incubação das células com quantidades crescentes de agregados de Αβι_40 com 5 dias ou 8 dias levou a uma maior quantidade de neurotoxicidade. A EC50 para a toxicidade de agregados de Αβι_40 envelhecidos era de 1-2 μΜ para ambas, as células PC12 e as células NT2.

Para determinar o efeito de um composto modulador de β-amilóide na neurotoxicidade dos agregados Αβχ_40 um composto modulador é pré-incubado com monómeros Αβι_40, sob condições de ensaio de nucleação convencionais, como descrito no Exemplo 2 e a intervalos de tempo particulares após a incubação, removem-se aliquotas da solução β-ΑΡ/modulador e 1) determina-se a turbidez da solução como uma medida da agregação e 2) aplica-se a solução a células neuronais cultivadas durante 48 horas, altura em que a viabilidade celular é determinada utilizando MTT para determinar a neurotoxicidade da solução. Adicionalmente, pode-se determinar a capacidade dos compostos moduladores de β-amilóide reduzirem a neurotoxicidade dos agregados Αβι_4ο pré-f ormados. Nestas experiências, os agregados Αβι_40 são pré-formados por incubação dos monómeros na ausência de quaisquer moduladores. O composto modulador é em seguida incubado com os agregados de Αβι _40 pré-formados, durante 24 horas a 37°C; tempo após o qual a solução de β-ΑΡ/modulador é recolhida e a sua neurotoxicidade avaliada como descrito acima. 66 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ EXEMPLO 7: Ensaio da estabilidade do composto modulador no fluido cerebrospinal A estabilidade de um composto modulador no fluido cerebrospinal (CSF) pode ser determinada num ensaio in vitro, como se segue. Prepara-se uma solução de CSF contendo 75% de CSF de macaco Rhesus (disponível comercialmente da Northern Biomedical Research), solução salina tamponada com fosfato a 23%, estéril e dimetilsulfóxido a 2% (v/v) (Aldrich Chemical

Co., N° de catálogo 27.685-5). Adicionam-se compostos moduladores de teste à solução de CSF, a uma concentração final de 40 μΜ ou 15 μΜ. Todo o manuseamento de amostras é realizado numa câmara de fluxo laminar e as soluções de teste são mantidas a 37°C durante o ensaio. Após 24 horas, a actividade enzimática nas soluções é neutralizada adicionando acetonitrilo para produzir uma concentração final de 25% (v/v). As amostras (no ponto de tempo 0 e no ponto de tempo de 24 horas) são analisadas à temperatura ambiente utilizando HPLC de fase inversa. Utiliza-se uma coluna microbore para maximizar a sensibilidade. Os parâmetros para a HPLC analítica são como se segue:

Sistema solvente A: Ácido Trifluoroacético (TFA) a 0,1% em água (v/v) B: TFA a 0, 085%/Acetonitrilo, H20 a 1% (v/v) in-jecção e gradiente

Injecção: 100-250 μΐ de amostra de teste

Corrida: 10% para B durante 5 min, em seguida 10-70% B ao longo de 60 min. A análise cromatográfica é realizada utilizando um HPLC Hewlett Packard 1090 série II. A coluna utilizada para separação é uma C4, 5 pm, 1 x 250 mm (Vydac #214TP51). O fluxo é de 50 μΐ/min e o perfil de eluição dos compostos de teste é monitorizado a 214, 230, 260 e 280 nm. EXEMPLO 8: Ensaio de incorporação no cérebro

Os níveis cerebrais dos nossos péptidos derivados de Αβ foram determinados no rato após administração intravenosa. Sob anestesia com cetamina/xilazina os ratos Sprague-Dawley macho 67 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ (219-302 g) receberam uma injecção intravenosa através de um cateter inserido na veia jugular esquerda (volume de dose de 4 ml/kg administrado ao longo de um minuto). A dose efectiva administrada de cada composto testado é apresentada na Figura 1.

Aos 60 minutos após a administração inseriu-se uma cânula na artéria carótida comum esquerda para permitir a perfusão do prosencéfalo esquerdo, para remover o sangue cerebral. O prosencéfalo esquerdo, esvaziado de sangue, foi submetido a depleção capilar como descrito por (Triguero et al. (1990) J.

Neurochem. 54:1882-1888). Esta técnica estabelecida separa a vasculatura cerebral do parênquima e, assim, permite determinar de forma precisa a concentração do composto sob investigação que atravessou a barreira hematoencefálica. A quantidade de composto mãe que estava presente no cérebro foi determinada por LC/MS/MS. O ensaio acima descrito foi utilizado para medir a incorporação no cérebro dos seguintes moduladores:

Compostos PPI Estrutura pm Cone. (mg/mL) Dose mg/kg IV 1324 TFA. Η-(1-[F5] f-fvl)-NH2 841 1,20 4,9 1318 TFA. H-(lf-D-Cha-vl)-NH2 757 0,29 1,0 1319 TFA. H-(lf-[p-F]f-vl)-NH2 769 1, 70 6,6 1327 TFA. H-(1-[p-F]f-[p-F]f-vl)-NH2 787 0, 98 4,0 1301 TFA. H-(lvf-D-Cha-1)-NH2 757 0, 70 2,9 1302 TFA. H-(lvf-[p-F]f—1)-NH2 769 0,19 0,7 1328 TFA. H- (l-[F5]f-[F5] f-vl) -NH2 931 0,29 1,2 1322 TFA. H-(1-D-Cha-fvl)-NH2 757 0, 03 0,1 1303 TFA. H-(lvf-[F5]f-1)-NH2 841 0,27 1,0 1326 TFA. H-(1-D-Cha-D-Cha-vl)- NH2 763 0, 05 0, 2 1320 TFA. H-(lf- [F5]f-vl)-NH2 841 0, 70 3, 0 *A notação de letras minúsculas refere-se a uma configuração D.

Os resultados estão resumidos na Figura 1.

Os compostos moduladores de β-amilóide aqui descritos estão resumidos na Tabela que se segue. 68 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ

TABELA IV PPI# Descrição SEQ ID NO 803 TFA*N,N-dimetil-(Gaffvl)-NH2 913 TFA*N,N-dimetil-(affvl)-NH2 918 TFA*H-(1-[Me]v-ffa)-NH2 968 TFA*N-metil-(Gaffvl)-NH2 96 9 TFA'N-etil-(Gaffvl)-nh2 970 TFA*N-isopropil-(Gaffvl)-NH2 992 TFA·Η-(lvffa)-isopropilamida 993 TFA·Η-(lvffa)-dimetilamida 1005 TFA*N,N-dietil-(Gaffvl)-NH2 1006 TFA»N,N-dietil-(affvl)-nh2 1007 TFA*N,N-dimetil-(lvff1)-NH2 1008 TFA*N,N-dimetil-(lffvl)-NH2 1013 TFA*H-(Glvffl)-NH2 1017 TFA*N-etil-(Glvffl)-NH2 1018 TFA*N-etil-(Glffvl)-NH2 1020 TFA *N-metil-(lffvl)-NH2 1022 TFA*N-etil-(lvffl)-NH2 1025 TFA*N-propil-(lvffl)-NH2 1028 TFA·Ν,N-dietil-(Glvff1)-NH2 1038 TFA*H-(ivffi)-NH2 1039 TFA*H-(ivffa)-NH2 1040 TFA *H-(iiffi)-NH2 1041 TFA*H-(D-Nle-vffa)-NH2 1042 TFA*H-(D-Nle-vff-D-Nle)-NH2 1088 TFA*l-piperidino-acetil-(lvffl)-NH2 1089 TFA'1-piperidino-acetil-(lffvl)-NH2 1093 TFA»H-lvff1-isopropilamida 1094 TFA*H-lffvi-isopropilamida 1179 TFA*H-(lvffl)-metilamida 1180 TFA*H-(lffvl)-metilamida 1261 TFA*H-(lvffl)-OH 1019 TFA*N-metil-(lvffl)-NH2 1301 TFA*H-(lvf-D-Cha-1)-NH2 1302 TFA*H-(lvf-[p-F]f-1)-NH2 1303 TFA*H- (lvf- [F5] f-1) -NH2 69 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ PPI# Descrição SEQ ID NO 1306 N-metil-(lvf-D-Cha-1)-NH2 1307 N-metil-(lvf-[p-F]f—1)-NH2 1308 N-metil-(lvf- [F5] f-1)-NH2 1318 TFA*H-(lf-D-Cha-vl)-NH2 1319 TFA *H-(lf-[p-F]f-vl)-NH2 1320 TFA*H-(lf- [Fs] f-vl)-NH2 1321 2TFA*H-(lfkvl)-NH2 1322 TFA*H-(1-D-Cha-fvl)-NH2 1323 TFA·Η-(1-[p-F]f-fvl)-NH2 1324 TFA·Η-(1- [F5] f-fvl)-NH2 1325 2TFA-H-(lkfvl)-NH2 1326 TFA‘H-(1-D-Cha-D-Cha-vl)-nh2 1327 TFA *H-(1-[p-F]f-[p-F]f-vl)-NH2 1328 TFA*H- (1- [Fs] f- [Fs] f-vl) -NH2 1329 3 TFA *H-(lkkvl)-NH2 1125 2 TFA *H-lvf-NH-NH-fvl-11 1133 TFA•H-lvf-NH-NH-Acetilo 1155 TFA *H-lvf-NH-NH2

EQUIVALENTES

Os peritos na arte irão reconhecer ou ser capazes de determinar utilizando apenas experimentação de rotina, muitos equivalentes das concretizações especificas da invenção aqui descritas. Deve entender-se que estes equivalentes são abrangidos pelas reivindicações seguintes.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Praecis Pharmaceuticals, Inc.

<120> MODULADORES DA AGREGAÇÃO DE PÉPTIDO B-AMILÓIDE

<130> PPI-068CPPC <140> PCT/US00/05574 <141> 2000-03-03 70 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ <150> USSN 60/122, <151> 1999- -03-04 <16 0> 4 < 17 0 > Patentln Ver <210> 1 <211> 43 < 212 > PRT < 213 > Homo sapiens < 4 0 0 > 1

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly lyr Glu Vai His His Gin Lys 15 10 15

Leu Vai Phe Phe Ala Glu Asp Vai Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30

Gly Leu Met Vai Gly Gly Vai Vai Ile Ala Thr 35 40

< 210 > 2 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 2

Glu Vai Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Vai 15 10 15

His His Gin Lys Leu Vai Phe Phe Ala Glu Asp Vai Gly Ser Asn Lys 20 25 30

Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Vai Gly Gly Vai Vai Ile Ala Thr Vai 35 40 45

Ile Vai Ile Thr Leu Vai Met Leu Lys Lys Lys Gin Tyr Thr Ser Ile 50 55 60

His His Gly Vai Vai Glu Vai Asp Ala Ala Vai Thr Pro Glu Glu Arg 65 70 75 80

His Leu Ser Lys Met Gin Gin Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys 85 90 95

Phe Phe Glu Gin Met Gin Asn 100

<210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: péptido inibidor do depósito amilóide 71 ΕΡ 1 161 449/ΡΤ < 4 Ο Ο > 3

Leu Vai Phe Phe 1

<210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial < 2 2 O > <223> Descrição da Sequência Artificial: péptido inibidor do depósito amilóide < 4 0 0 > 4

Leu Vai Phe Phe Ala 1 5

Lisboa,

Claims (10)

1. ΕΡ 1 161 449/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composto com a estrutura: N-metil-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2.
2. 2. Composto que compreende a estrutura: N-metil-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2.
3. 3. Composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto de acordo com as reivindicações 1 ou 2 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
4. 4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, em que a referida composição farmacêutica é uma formulação de libertação prolongada.
5. 5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, em que a referida composição farmacêutica é adequada para transporte do referido composto através da barreira hematoencefálica.
6. 6. Utilização de um composto de acordo com as reivindicações 1 ou 2 para o fabrico de um medicamento para inibir a agregação de péptidos β-amilóides naturais num indivíduo.
7. 7. Método para detectar a presença ou ausência de péptidos β-amilóides naturais numa amostra biológica in vitro, que compreende: o colocar em contacto uma amostra biológica com o composto de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que o composto é marcado com uma substância detectável; e detectar o composto ligado aos péptidos β-amilóides naturais para desse modo detectar a presença ou ausência de péptidos β-amilóides naturais na amostra biológica. ΕΡ 1 161 449/ΡΤ 2/2
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o composto é marcado com tecnécio radioactivo ou iodo radioactivo.
9. 9. Utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto de acordo com as reivindicações 1 ou 2 para o fabrico de um medicamento para tratar ou diagnosticar um distúrbio associado com β-amiloidose num indivíduo.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o distúrbio é a doença de Alzheimer. Lisboa,