KR100771712B1 - Ｄ-아미노산을 포함하는 베타-아밀로이드 펩티드 응집 조절인자 화합물, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 천연 β 아밀로이드 펩티드 응집을 조절하는 화합물을 제공한다. 본 발명의 조절인자는 바람직하게 β 아밀로이드 펩티드를 기초로 한 펩티드를 포함하고 전체가 D-아미노산으로 이루어져 있다. 바람직하게, 펩티드는 3 - 5 개의 D-아미노산 잔기를 포함하며 D-로이신, D-페닐알라닌 및 D-발린 중에서 독립적으로 선택한 적어도 2 개의 D-아미노산 잔기를 포함한다. 특별하게 바람직한 실시형태에서, 펩티드는 β 아밀로이드 펩티드의 역-반전 이성질체이고, 바람직하게는 Aβ17-21 의 역-반전 이성질체이다. 특정한 실시형태에서, 펩티드는 아미노-말단, 카르복시-말단 또는 둘 다에서 변형된다. 바람직한 아미노-말단의 변형기는 알킬기이다. 바람직한 카르복시-말단의 변형기는 아미드기, 아세테이트기, 알킬 아미드기, 아릴 아미드기 또는 히드록시기를 포함한다. 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물과 본 발명의 화합물을 이용하여 아밀로이드원성 질환의 진단 및 치료 방법에 관해서도 기재되어 있다.
β-아밀로이드 펩티드, 알쯔하이머병, 아밀로이드증, 응집, 변형, 신경독성 억제

Description

Ｄ-아미노산을 포함하는 베타-아밀로이드 펩티드 응집 조절인자 화합물, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 방법{MODULATOR COMPOUNDS OF BETA-AMYLOID PEPTIDE AGGREGATION COMPRISING D-AMINO ACIDS, A PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND A METHOD COMPRISING THESE COMPOUNDS}
1907 년에 바바리아의 정신과의사인 알로이스 알쯔하이머에 의해 처음으로 발견된 알쯔하이머병(AD)은 진행성 신경계 질환으로서 단기간 기억 상실로 시작하여 방향상실, 판단 및 이성 장애 및 종국에는 치매로 진행된다. 이 질환은 발병 후 4 년 내지 12 년 사이에 급격히 쇠약해지고, 거동하기 힘든 상태가 되며 결국에는 사망하게 된다. 65 세 이상의 인구 중 5 % 내지 11 % 및 85 세 이상의 인구 중 47 % 도 마찬가지로 AD 를 앓고 있는 것으로 추정된다. AD 를 관리하기 위해 매년 800 억 달러 이상이 사회 비용으로 쓰이며, 이는 일차적으로 AD 환자에게 필요한 광범위한 치료에서 기인한 것이다. 더욱이, 1940 년대 와 1950 년대의 인구 증가 기간에 태어난 성인이 AD 가 좀 더 발병할 수 있는 나이에 이르게 되면, AD 의 조절 및 치료는 훨씬 더 중요한 건강 관리 문제로 대두될 것이다. 현재는 이 질환의 진행을 현저하게 저해하는 치료가 없다. AD 에 관한 리뷰로서, Selkoe, D.J. Sci. Amer., November 1991, pp. 68 - 78 ; 및 Yankner, B.A. 등의 (1991) N. Eng. J. Med. 325 : 1849 - 1857 을 참조하라.
알쯔하이머-타입 신경병리학으로 형질전환 마우스를 만들어 냈다고 최근[Games 등의 (1995) Nature 373 : 523 - 527]에 보고되었다. 형질전환 마우스는 인체 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질을 높은 수준으로 발현하며 AD 와 관련된 많은 병리학적 증상을 진행적으로 나타낸다.
병리학적으로, AD 는 손상된 뇌에서 뚜렷한 병변이 존재함을 특징으로 한다. 이러한 뇌 병변은 신경원섬유 엉킴(NTFs)이라 불리는 비정상적 세포내 필라멘트 및 노인반 또는 아밀로이드반에서의 아밀로이드원성 단백질의 세포외 침착을 포함한다. 아밀로이드 침착은 또한 AD 환자의 뇌혈관 벽에서 나타난다. 아밀로이드반의 주요 단백질 구성은 β-아밀로이드 펩티드 (β-AP)로 불리는 4 킬로달톤의 펩티드로 밝혀졌다[Glenner, G.G. 및 Wong, C.W. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120 : 885 - 890 ; Masters, C. 등의 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82. 4245 - 4249]. 일반적으로 정상 성인의 뇌에서 β-AP 의 침착은 산재되어 있는 반면에, AD 뇌조직은 좀 더 조밀하고 밀집한-코어β-아밀로이드반을 특징으로 한다[예를들어, Davies, L. 등의 (1988) Neurology 38 : 1688 - 1693 참조하라]. 이러한 사실은 β-AP 침착이 AD 에서 발생하는 신경세포 파괴에 관여함을 시사하고 있다. β-AP 에 관한 직접적인 병원성 역할을 좀 더 뒷받침해주는 것으로, β-아밀로이드가 배양액 및 생체내에서 성숙한 신경세포에 독성을 나타낸다. Yankner, B.A. 등의 (1989) Science 245 : 417 - 420 ; Yankner, B.A. 등의 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 9020 - 9023 ; Roher, A.E. 등의 (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 174 : 572 - 579 ; Kowall, N.W. 등의 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 7247 - 7251. 더욱이, 더치 타입-아밀로이드증(amyloidosis-Dutch-type)을 수반하는 유전성 뇌출혈(HCHWA-D)을 앓고 있는 환자는 대뇌 피질 및 대뇌 혈관내에서 β-아밀로이드 침착이 산재되어 나타나며 β-AP 내에서 하나의 아미노산 치환을 야기하는 점돌연변이를 나타내었다. Levy, E. 등의 (1990) Science 248 : 1124 - 1126. 이러한 사실은 β-AP 서열의 특이적 변형으로 인해 β-아밀로이드가 침착됨을 서술하고 있다.
천연 β-AP 는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)이라 불리는 다량의 단백질로부터 단백질 가수분해에 의해 유도된 것이다. Kang, J. 등의 (1987) Nature 325 : 733 ; Goldgaber, D. 등의 (1987) Science 235 : 877 ; Robakis, N.K. 등의 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 4190 ; Tanzi, R.E. 등의 (1987) Science 235 : 880. APP 유전자가 염색체 21 에 존재함으로써 염색체 21 의 삼염색체성에 의해 야기되는 다운 증후군을 나타내는 개체의 초년기에 나타나는 β-아밀로이드 침착을 설명할 수 있다. Mann, D.M. 등의 (1989) Neuropathol. Appl. Neurobiol. 15 : 317 ; Rumble, B. 등의 (1989) N. Eng. J. Med. 320 : 1446. APP 는 세포외 환경까지 연장된 긴 아미노 말단 영역(단백질의 약 2/3)으로 이루어진 단일 막 스패닝 도메인과 세포질까지 돌출된 짧은 카르복시-말단 영역을 포함한다. APP 메신저 RNA 의 특별한 스플라이싱으로 적어도 5 개의 APP 형태를 야기하며 이들은 563 개의 아미노산 (APP-563), 695 개의 아미노산 (APP-695), 714 개의 아미노산 (APP-714), 751 개의 아미노산 (APP-751) 또는 770 개의 아미노산 (APP-770)으로 이루어져 있다.
APP 내에서, 자연 발생적인 β-아밀로이드 펩티드는 APP-770 의 아미노산 위치 672 인 아스파르트산에서 시작한다. APP 의 단백질 가수분해로부터 유도된 자연 발생적인 β-AP 는 카르복시 말단의 끝 지점에 따라 결정되는 39 내지 43 개의 길이로 된 아미노산 잔기이며 이질성을 나타낸다. 혈액 및 AD 환자와 정상 성인의 뇌척수액 내에서 β-AP 의 일반적 순환 형태는 β1 - 40 ("짧은 β")이다. Seubert, P. 등의 (1992) Nature 359 : 325 ; Shoji, M. 등의 (1992) Science 258 : 126. 그러나, β-아밀로이드반에서는 β1 - 42 및 β1 - 43 ("긴β") 형태이다. Masters, C. 등의 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 4245 ; Miller, D. 등의 (1993) Arch. Biochem. Biophys. 301 : 41 ; Mori, H. 등의 (1992) J. Biol. Chem. 267 : 17082. β-APP 응집 및 침착을 야기하는 정확한 분자 메카니즘이 밝혀지지는 않았으나, 그 과정은 단백질 결정화, 미소관 형성 및 액틴 중합반응과 같은 핵생성-의존 중합반응의 과정과 유사하다. 예를들어, Jarrett, J.T. 및 Lansbury, P.T. (1993) Cell 73 : 1055 - 1058 참조하라. 상기 과정에서, 단량체 성분의 중합반응은 핵이 형성될때 까지 일어나지 않는다. 따라서, 이러한 과정은 응집 전에 약간의 시간이 지체되고 핵생성 이후에 급속한 중합반응이 일어나는 것을 특징으로 한다. 핵생성은 "시드(Seed)" 또는 이미 형성된 핵 첨가로 가속화될 수 있으며 이로 인해 급속한 중합반응이 일어난다. β-AP 의 긴 β 형태는 시드로 작용함으로써 길고 짧은 β-AP 형태의 중합반응을 가속화시키는 것으로 나타났다. Jarrett, J.T. 등의 (1993) Biochemistry 32 : 4693.
한 연구에서는 β-AP 에서 일어나는 아미노산 치환에 있어서, 펩티드의 돌연변이 형태와 비-돌연변이 형태가 혼합된 경우에 두 개의 돌연변이 β 펩티드가 비-돌연변이 β-AP 의 중합반응을 방해하는 것으로 보고되었다. Hilbich. C. 등의 (1992) J. Mol. Biol. 228 : 460 - 473. 돌연변이 β 아밀로이드 펩티드와 비-돌연변이(즉, 천연) β 아밀로이드 펩티드의 등몰량은 이러한 효과를 관찰하는데 사용되며 돌연변이 펩티드는 생체내 사용에 부적합한 것으로 보고되었다. Hilbich, C. 등의 (1992), 상기문헌 참조하라.
발명의 요약
본 발명은 천연 β 아밀로이드 펩티드(β-AP)에 결합하고 천연 β-AP 의 응집을 조절하고/하거나 천연 β-APs 의 신경독성을 저해할 수 있는 화합물 및 그의 약학적 조성물에 관한 것이다. 이 화합물은 생물학적 안정성을 증가시키고 상승된 혈장 수준을 연장시키도록 하는 방법으로 수정된다. 본 발명의 β-아밀로이드 조절인자 화합물은 바람직하게 β-아밀로이드 펩티드를 기초로 한 펩티드 구조를 포함하며, 전체적으로 D-아미노산으로 구성되어 있다. 다양한 실시형태에 있어서, 조절인자 화합물의 펩티드 구조는 천연 β-AP 내에서 발견된 L-아미노산 서열과 상응하는 D-아미노산 서열을 포함한다. 여기에서, D-아미노산 서열은 천연 β-AP 내에서 발견된 L-아미노산 서열의 반전-이성질체이고 D-아미노산 서열은 천연 β-AP 내에서 발견된 L-아미노산 서열의 역-반전 이성질체이며, 또는 D-아미노산 서열은 천연 β-AP 내에서 발견된 L-아미노산 서열의 불규칙한 또는 치환된 변형이다. 바람직하게, 조절인자의 D-아미노산 펩티드 구조는 17 - 21 위치(각각 Aβ17-20 및 Aβ17-21)에서 천연 β-AP 의 서브영역을 기초로 하여 제조하였으며, 아미노산 서열 Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID NO : 4)을 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 화합물내의 페닐알라닌은 좀 더 안정하여 예를들어, 산화적 대사가 덜 일어나는 페닐알라닌 유사체로 치환되며 화합물의 뇌 수준을 증가시킨다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 조절인자 화합물은 D-아미노산, L-아미노산 또는 둘 다, 히드라진 성분에 부착되는 β-아밀로이드 펩티드의 반전-이성질체 또는 β-아밀로이드 펩티드의 역-반전 이성질체로 구성된 β-아밀로이드 펩티드를 포함한다. 여기에서, 화합물은 천연 β-아밀로이드에 결합하거나 응집을 조절하며 천연 β-아밀로이드 펩티드와 접촉할 경우에 천연 β-아밀로이드 펩티드의 신경독성을 저해한다.
본 발명의 조절인자 화합물은 3 - 20 개의 D-아미노산, 더 바람직하게 3 - 10 개의 D-아미노산 및 좀 더 바람직하게 3 - 5 개의 D-아미노산을 포함한다. 조절인자의 D-아미노산 펩티드 구조는 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 카르복시 아미드 말단을 가지고 있지 않다. 선택적으로, 아미노-말단, 카르복시-말단 또는 둘 다 변형될 수 있다. 예를들어, N-말단 변형기는 Aβ 응집을 저해하는 화합물의 능력을 강화시키는데 사용될 수 있다. 더욱이, 펩티드의 아미노-말단 및/또는 카르복시 말단은 화합물의 약동력학적 특성(안정성, 생체내이용효율, 예를들어, 혈액뇌장벽을 가로질러 뇌에 들어가는 화합물의 증가된 수송등)을 수정하기 위해 변형될 수 있다. 바람직한 아미노-말단의 변형기는 알킬기(예를들어, 메틸, 에틸 또는 이소프로필기)를 포함한다. 바람 직한 카르복시-말단의 변형기는 아미드기, 알킬 또는 아릴 아미드기(예를들어, 펜에틸아미드), 히드록시기(즉, 펩티드 산의 환원으로 생성된 펩티드 알콜), 아실 아미드기 및 아세틸기를 포함한다. 조절인자 화합물은 또한 검출가능한 물질(예를들어, 방사성 표지)로 화합물을 표지하기 위해 변형될 수 있다.
특정의 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 다음의 구조를 갖는 화합물을 제공한다 :
N,N-디메틸-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N,N-디메틸-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N-메틸-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N-에틸-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N-이소프로필-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-이소프로필아미드 ; H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-디메틸아미드 ; N,N-디에틸-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N,N-디에틸-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N,N-디메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; N,N-디메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; N,N-디메틸-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; N-에틸-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; N-에틸-(Gly-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N-메틸-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N-에틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; N-프로필-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; N,N-디에틸-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2 ; H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-NH2 ; H-(D-Ile-D-Ile-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2 ; H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-NH2 ; H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Nle)-NH2 ; 1-피페리딘-아세틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; 1-피페리딘-아세틸-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu-이소프로필아미드 ; H-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu-이소프로필아미드 ; H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-메틸아미드 ; H-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-메틸아미드 ; H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-OH ; N-메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Phe-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Cha-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N-메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2 ; N-메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2 ; N-메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2 ; H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-(H-D-Leu-D-Val-D-Phe)-NH ; H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH-COCH3 ; 및 H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH2.
특별하게 본 발명의 바람직한 화합물은 실시예에 설명되어 있다.
본 발명의 다른 양상은 약학적 조성물에 관한 것이다. 전형적으로, 약학적 조성물은 본 발명의 조절인자 화합물의 치료학적 유효량 및 약학적으로 용인가능한 담체를 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 천연 β-아밀로이드 펩티드의 응집을 저해하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 본 발명의 조절인자 화합물과 천연 β-아밀로이드 펩티드가 접촉하여 천연 β-아밀로이드 펩티드 응집의 저해를 포함한다.
본 발명의 또다른 양상은 생물학적 시료내에서 천연 β-아밀로이드 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 생물학적 시료와 본 발명의 화합물과의 접촉을 포함한다. 검출가능한 물질로 화합물을 표지하는데 있어서, 검출되는 화합물은 천연 β-아밀로이드 펩티드와 결합함으로써 생물학적 시료내에서 천연 β-아밀로이드 펩티드의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 β-아밀로이드증 관련 질환에 걸린 피실험자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 피실험자에게 본 발명의 조절인자 화합물의 치료학적 유효량을 투여함으로써 β-아밀로이드증 관련 질환에 걸린 피실험자를 치료하는 것을 포함한다. 바람직하게, 상기 질환은 알쯔하이머병이다. β-아밀로이드증 관련 질환을 치료하기 위해서나 치료하기 위한 약제를 제조하기 위해 본 발명의 조절인자를 사용하는 것도 본 발명의 범주내에 포함된다.
도 1 은 뇌 흡수 검정으로 부터 얻은 결과를 표로 나타낸 것이다.
도 2 는 실시예 2 에 기술된 원섬유 결합 검정의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명은 천연 β-아밀로이드 펩티드에 결합할 수 있고 천연 β 아밀로이드 펩티드(β-AP)의 응집을 조절하고/하거나 천연 β-APs 의 신경독성을 저해하는 화합물 및 그의 약학적 조성물에 관한 것이다. 이 화합물은 생물학적 안정성을 증가시키고 상승된 혈장 수준을 지속시키는 방법으로 변형된다. 천연 β-AP 의 응집을 조절하는 본 발명의 화합물을 본원에서는 β 아밀로이드 조절인자 화합물, β 아밀로이드 조절인자 또는 간단하게 조절인자라고도 부르며, 이 화합물은 조절인자가 천연 β-AP 와 접촉할 경우에 천연 β-AP 의 응집을 변형시킨다. 따라서, 본 발명의 화합물은 이러한 과정을 방해함으로써 천연 β-AP 의 응집 과정 또는 속도를 변형시키는 작용을 한다. 바람직하게, 화합물은 β-AP 응집을 저해한다. 본 발명의 화합물은 전체가 D-아미노산 잔기로 구성된 펩티드 구조를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이러한 펩티드 구조는 바람직하게 β-아밀로이드 펩티드를 기초로 하며 예를들어, 천연 β-AP 내에서 발견된 L-아미노산 서열과 상응하는 D-아미노산 서열을 포함할 수 있고, D-아미노산 서열은 천연 β-AP 내에서 발견된 L-아미노산 서열의 반전 이성질체이고, D-아미노산 서열은 천연 β-AP 내에서 발견된 L-아미노산 서열의 역-반전 이성질체이며 또는 D-아미노산 서열은 천연 β-AP 내에서 발견된 L-아미노산 서열의 불규칙한 또는 치환된 변형이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 화합물내의 페닐알라 닌은 좀 더 안정하며 예를들어, 산화적 대사가 덜 일어나는 페닐알라닌 유사체로 치환된다.
펩티드 구조의 아미노-말단, 카르복시-말단 및/또는 곁사슬이 변형된 조절인자 화합물 뿐만 아니라 아미노-말단, 카르복시-말단 또는 카르복시 아미드-말단이 없는 D-아미노산 펩티드 구조를 포함하는 조절인자 화합물도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 β-아밀로이드 조절인자 화합물은 천연 β-아밀로이드 펩티드와의 결합, 시험관내에서 천연 β-AP 의 응집 조절 및/또는 배양된 세포의 경우 천연 β-AP 원섬유의 신경독성을 저해하는 능력을 기초로 선택할 수 있다(예를들어, 신경독성 검정, 핵생성 검정 또는 원섬유 결합 검정과 같이 본원에 서술된 검정을 사용함). 바람직한 조절인자 화합물은 천연 β-AP 의 응집을 저해하고/하거나 천연 β-AP 의 신경독성을 저해한다. 이러한 특성 중 하나 또는 둘 다를 기초로 선택한 조절인자 화합물은 아밀로이드증 치료에 유익할 수 있는 생체내 다른 특성을 나타낼 것이다[J.S. Pachter 등의 (1998) "Aβ1-40 induced neurocytopathic activation of human monocytes is blocked by Aβ peptide aggregation inhibitors". Neurobiology of Aging (Abstracts: The 6th International Conference on Alzheimer's Disease 및 Related Disorders, Amsterdam, 18 - 23 July 1998) 19, S128 (Abstract 540); R. Weltzein, A. 등의 (1998) "Phagocytosis of Beta-Amyloid: A Possible Requisite for Neurotoxicity". J. Neuroimmunology (Special Issue: Abstracts of the International Society of Neuroimmunology Fifth International Congress, Montreal, Canada, 23 - 27 August 1998) 1998, 90, 32 (Abstract 162)]. 예를들어, 조절인자 화합물은 생체내에서 독성의 β-AP 또는 다른 APP 단편을 생산하는 과정을 조절함으로써 천연 β-AP 의 프로세싱을 저해할 것이다(직접 또는 간접 단백분해효소 저해에 의해). 선택적으로, 조절인자 화합물은 시험관내에서 Aβ 응집을 저해하기 보다는 이러한 후자의 특성을 기본으로 선택될 것이다. 더욱이, 천연 β-AP 와 상호작용하는 것을 근거로 선택한 본 발명의 조절인자 화합물은 또한 APP 또는 다른 APP 단편과 상호작용할 것이다. 본 발명의 조절인자 화합물은 β-아밀로이드 원섬유에 결합하는 그것의 능력에 의해 특정화 되지만(예를들어, 방사성표지 화합물, 화합물과 β-아밀로이드반의 접촉 및 예를들어, 영상에 의한 계수 및 검출, 반과 같은 β-AP 의 병리학적 형태에 결합한 화합물에 의해 측정할 수 있다), β-아밀로이드 원섬유의 응집을 현저하게 변형시키지 못한다. β-아밀로이드 원섬유에 효과적으로 결합하지만 β-아밀로이드 원섬유의 응집을 현저하게 변형시키지 않는 상기 화합물은 예를들어, β-아밀로이드 원섬유를 검출하는데(예를들어, 본원에서 서술한 진단 목적으로) 사용될 수 있다. β-아밀로이드 원섬유에 결합하고/하거나 화합물의 농도에 따라 변형될 수 있는 그들의 응집을 조절하는 특정 화합물의 능력을 생각해야 한다. 따라서, 낮은 농도에서의 화합물은 응집의 변형없이 β-아밀로이드 원섬유에 결합하지만, 고농도에서는 원섬유의 응집을 저해한다. β-아밀로이드 원섬유에 결합하고/하거나 원섬유의 응집을 조절하는 특성을 갖는 상기 모든 화합물은 본 발명의 범주에 포함된다.
본원에서 사용한 바와 같이, β-아밀로이드 응집의 "조절인자" 란 천연 β-아밀로이드 펩티드와 접촉할 경우에, 천연 β-아밀로이드 펩티드의 응집을 변형시키는 제제를 의미한다. "β-아밀로이드 펩티드의 응집" 이란 용어는 대부분 불용성 복합체인 다량체를 형성하도록 펩티드 각각을 결합시킨 작용을 의미한다. "응집" 이란 용어는 β 아밀로이드 원섬유 형성을 포함하며 β-아밀로이드반 또한 포함한다.
본원에서 상호교환적으로 사용하는 "천연 β-아밀로이드 펩티드", "천연 β-AP" 및 "천연 Aβ 펩티드" 란 용어는 β-AP 응집 및 β-아밀로이드증에 관여하는 β아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 자연 발생적인 단백질 가수분해의 분할 산물을 의미한다. 이러한 자연적 펩티드는 39 - 43 개의 아미노산을 갖는 β-아밀로이드 펩티드(즉, Aβ1-39, Aβ1-40, Aβ 1-41, Aβ1-42 및 Aβ1-43)를 포함한다. 천연 β-AP 의 아미노-말단의 아미노산 잔기는 아밀로이드 전구체 단백질의 770 개의 아미노산 잔기("APP-770") 중 672 위치의 아스파르트산 잔기와 일치한다. 천연 β-AP 의 43 개의 아미노산의 긴 형태는 아미노산 서열 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT(SEQ ID NO : 1 에 나타나 있음) 을 포함하는 반면에, 짧은 형태는 카르복시-말단 끝에서 부터 1 - 4 개의 아미노산 잔기가 결실된 것이다. 672 위치(즉 천연 β-AP 의 아미노 말단)에서 부터 C-말단(103 개의 아미노산) 까지의 APP-770 의 아미노산 서열은 SEQ ID NO : 2 에 나타나 있다. 본원에서 서술한 응집 검정에 사용하는 천연 β-AP 의 바람직한 형태는 Aβ1-40 또는 Aβ1-42 이다.
본 발명의 조절인자 존재시에, 천연 β 아밀로이드 펩티드의 응집은 "변형" 되거나 "조절" 된다. "변형" 또는 "조절" 이라는 용어의 여러가지 형태는 β-AP 응집의 저해와 β-AP 응집의 증진 둘 다를 포함한다. 조절인자 부재시의 β-AP 응집의 양 및/또는 속도와 비교하여 β-AP 응집의 양 및/또는 속도가 감소된 경우에 조절인자 존재시에 천연 β-AP 의 응집은 "저해된다". "저해" 라는 용어의 여러가지 형태는 β-AP 응집의 완전한 저해와 부분적 저해를 포함한다. 응집의 저해는 실시예에 서술된 응집 검정을 이용하여, 응집 하기 위한 지체 시간(lag time)의 증가 배수 또는 응집의 전체 불변기(Plateau level)의 감소(즉, 응집의 총 양)로 정량할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 예를들어, 화합물이 β-AP 에 대해 1 몰당량인 경우에, 본 발명의 조절인자는 응집의 지체 시간을 적어도 1.2 배, 1.5 배, 1.8 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 4 배 또는 5 배 증가시킨다. 다른 다양한 실시형태에서, 본 발명의 조절인자는 응집의 불변기를 적어도 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 75 % 또는 100 % 저해한다.
β-AP 응집을 저해하는 조절인자("저해성 조절인자 화합물")는 β-아밀로이드 축적의 시작을 예방하거나 지연시키는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 저해성 조절인자 화합물은 천연 Aβ 펩티드의 신경독성 응집체의 형성 및/또는 활성을 저해한다(즉, 저해 화합물은 β-AP 의 신경독성을 저해하는데 사용될 수 있다). 부가적으로, 본 발명의 저해성 화합물은 이미 형성된 β-AP 응집체의 신경독성을 감소시킬 수 있고 저해성 조절인자는 이미 형성된 Aβ 원섬유 또는 가용성 응집체에 결합하여 그들 고유의 신경독성을 조절하거나 그 조절인자는 비-신경독성 형태를 위해 β-AP 의 단량체와 응집된 형태 사이의 평형상태를 교란시킬 수 있다.
선택적으로, 다른 실시형태에서, 본 발명의 조절인자 화합물은 천연 Aβ 펩티드의 응집을 증진시킨다. "증진" 이란 용어의 여러가지 형태는 조절인자 부재시의 β-AP 응집의 양 및/또는 속도와 비교하여, 조절인자 존재시에 β-AP 응집의 양 및/또는 속도의 증가를 의미한다. Aβ 응집을 증진시키는 상기 화합물을 자극성 조절인자 화합물이라 한다. 자극성 조절인자 화합물은 β-AP 의 응집이 유독한 생물학적 구획으로 부터 β-AP 를 감소시킴으로써 β-AP 의 응집이 유독하지 않은 생물학적 구획에서 β-아밀로이드 펩티드를 분리하는데 유용할 것이다. 더욱이, 자극성 조절인자 화합물은 예를들어, Aβ 응집을 저해하거나 역전시킬 수 있는 실험 화합물에 대한 스크리닝 검정과 같은 시험관내 응집 검정(실시예 2 에 서술된 것들과 같은 검정)에서 Aβ 응집을 증진시키는데 사용될 수 있다(즉, 자극성 조절인자 화합물은 Aβ 응집체의 형성을 증진시키는데 "시드" 로 작용할 수 있다).
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조절인자가 천연 β-AP 의 몰 초과량과 접촉한 경우에 β-AP 응집을 변형시킬 수 있다. "천연 β-AP 의 몰 초과량" 이란 조절인자의 몰 농도보다 높은 천연 β-AP 의 몰 농도를 의미한다. 예를들어, 조절인자와 β-AP 가 1 μM 농도에서 둘 다 존재한다면, 이를 "등몰" 이라고 하는 반면에, 조절인자는 1 μM 농도에 존재하고 β-AP 는 5 μM 농도에 존재한다면, β-AP 는 조절인 자와 비교하여 5 배의 몰 초과량으로 존재하게 된다. 바람직한 실시형태에서, 조절인자의 농도와 비교하여 천연 β-AP 가 적어도 2 배, 3 배 또는 5 배의 몰 초과로 존재하게 되면 본 발명의 조절인자는 천연 β-AP 응집을 변형시키는데 효과적이다. 다른 실시형태에서, 조절인자의 농도와 비교하여 천연 β-AP 가 적어도 10 배, 20 배, 33 배, 50 배, 100 배, 500 배 또는 1000 배의 몰 초과로 존재하게 되면 본 발명의 조절인자는 β-AP 응집을 변형시키는데 효과적이다.
본원에서 사용한 바와같이, 본 발명의 조절인자에서 사용한 "D-아미노산 전체로 구성된 β 아밀로이드 펩티드" 란 용어는 천연 서열로 부터 이용가능한 아미노산 치환이 일어난 펩티드 뿐만 아니라 APP 에서 천연 서열로 이루어진 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하며, 천연 β-AP 에 존재하는 천연 L-아미노산 보다 오히려 D-아미노산으로 이루어져 있다. 이용가능한 아미노산 치환은 천연 β-AP 응집을 변형시키기 위해 D-아미노산-함유 펩티드의 능력에 영향을 미치지 않고/않거나 증진 시킬 것이다. 더욱이, 특정 아미노산 치환은 천연 β-AP 응집을 변형시키기 위해 펩티드 능력에 좀 더 기여할 수 있고/있거나 펩티드 상에 다른 유익한 특성을 부여할 수 있다(예를들어, 증가된 용해도, 그 밖의 다른 아밀로이드 단백질과의 감소된 결합). L-아미노산 모두가 D-아미노산 모두로 치환된 선조 펩티드 내에서 발견된 아미노 산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 "반전" 화합물이라 한다. 예를들어, 선조 펩티드가 Thr-Ala-Tyr 이라면, 그것의 반전 형태는 D-Thr-D-Ala-D-Tyr 이다.
본원에서 사용한 바와 같이, 본 발명의 조절인자에서 사용된 "β-아밀로이드 펩티드의 역-반전 이성질체" 는 천연 β-AP 에서의 서열과 비교하여 아미노산 서열이 역전된 펩티드를 포함하며 모든 L-아미노산은 D-아미노산으로 치환되었다. 예를들어, 선조 펩티드가 Thr-Ala-Tyr 이라면 그것의 역-반전 형태는 D-Tyr-D-Ala-D-Thr 이다. 선조 펩티드와 비교하여, 역-반전 펩티드는 실질적으로 곁사슬의 처음의 공간 입체구조를 유지하는 역전된 구조를 가지며, 위상수학을 나타낸 역-반전 이성질체는 선조 펩티드와 매우 유사하다. Goodman 등의 "Perspectives in Peptide Chemistry" PP. 283 - 294 (1981) 참조하라. 미국 특허 번호 제 4,522,752 호의 Sisto for further description of "retro-inverso" peptides 참조하라. 본 발명의 조절인자의 여러가지 다른 양상 및 그것의 용도는 하기의 부분에 상세히 서술되어 있다.
Ⅰ. 조절인자 화합물
첫 번째 실시형태에서, 본 발명의 조절인자 화합물은 전체가 D-아미노산으로 이루어진 β-아밀로이드 펩티드를 포함하며, 여기에서 화합물은 천연 β-아밀로이드 펩티드에 결합하고 천연 β-아밀로이드 펩티드와 접촉한 경우에 천연 β-아밀로이드 펩티드의 신경독성을 저해하고 응집을 조절한다. 바람직하게, 조절인자의 β-아밀로이드 펩티드는 3 - 20 개의 D-아미노산으로 이루어졌으며, 더 바람직하게는 3 - 10 개의 D-아미노산 및 좀 더 바람직하게는 3 - 5 개의 D-아미노산으로 이루어졌다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 화합물내의 페닐알라닌은 좀 더 안정하며 산화적 대사가 덜 일어나는 페닐알라닌 유사체로 치환된다.
실시형태에서, 조절인자의 β-아밀로이드 펩티드는 예를들어, C1-C6 저급 알킬기(예를들어, 메틸, 에틸 또는 프로필기) 와 같은 알킬기 또는 고리 알킬기, 헤테로고리 알킬기, 여러 고리 알킬기 또는 분지된 알킬기를 포함하는 변형기로 아미노 말단을 변형시켰다. 적절한 N-말단의 변형기의 예는 하기 Ⅱ 항에 보다 상세히 서술되어 있다. 다른 실시형태에서, 조절인자의 β-아밀로이드 펩티드는 카르복시 말단이 변형된 것이며 예를들어, 조절인자는 펩티드 아미드, 펩티드 알킬 또는 아릴 펩티드(예를들어, 펩티드 펜에틸아미드) 또는 펩티드 알콜을 포함할 수 있다. 적절한 C-말단의 변형기의 예는 하기 Ⅱ 및 Ⅲ 항에 상세히 서술되어 있다. 조절인자의 β-아밀로이드 펩티드는 β-AP 응집 또는 신경독성을 변형시키는 조절인자의 능력을 증강시키기 위해 변형될 것이다. 부가적 또는 선택적으로, 조절인자의 β-아밀로이드 펩티드는 조절인자의 약동력학적 특성을 변형시키고/시키거나 검출가능한 물질로 조절인자를 표지하도록 변형될 것이다(하기의 Ⅲ 항에 상세히 서술되어 있음).
다른 실시형태에서, 본 발명의 조절인자 화합물은 β-아밀로이드 펩티드의 역-반전 이성질체를 포함하며, 화합물은 천연 β-아밀로이드 펩티드에 결합하거나 응집을 조절하며 천연 β-아밀로이드 펩티드와 접촉한 경우에 천연 β-아밀로이드 펩티드의 신경독성을 저해한다. 바람직하게, β-아밀로이드 펩티드의 역-반전 이성질체는 3 - 20 개의 D-아미노산, 더 바람직하게 3 - 10 개의 D-아미노산 및 좀 더 바람직하게 3 - 5 개의 D-아미노산으로 이루어져 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 화합물내의 페닐알라닌은 좀 더 안정하며 예를들어, 산화적 대사가 덜 일어나는 페닐알라닌 유사체로 치환하였다.
실시형태에서, 역-반전 이성질체는 예를들어, C1-C6 저급 알킬기(예를들어, 메틸, 에틸 또는 프로필기)와 같은 알킬기 또는 고리 알킬기, 헤테로고리 알킬기, 여러 고리 알킬기 또는 분지된 알킬기를 포함하는 변형기로 아미노-말단이 변형된 것이다. 적절한 N-말단의 변형기는 하기의 Ⅱ 항에 상세히 서술되어 있다. 다른 실시형태에서, 역-반전 이성질체는 예를들어, 아미드기, 알킬 또는 아릴 아미드기(예를들어, 펜에틸아미드), 또는 히드록시기(즉, 펩티드 산의 환원으로 생성된 펩티드 알콜)를 포함하는 카르복시-말단이 변형된 것이다. 적절한 C-말단의 변형기는 하기의 Ⅱ 및 Ⅲ 항에 상세히 서술되어 있다. 역-반전 이성질체는 β-AP 응집 또는 신경독성을 변형시키는 조절인자의 능력을 증강시키도록 변형될 것이다. 부가적 또는 선택적으로, 조절인자의 β-아밀로이드 펩티드는 조절인자의 약동력학적 특성을 변형시키고/시키거나 검출가능한 물질로 조절인자를 표지하도록 변형될 것이다(하기의 Ⅲ 항에 상세히 서술되어 있음).
또다른 실시형태에서, 본 발명의 조절인자 화합물은 전체 또는 부분적으로 D-아미노산으로 구성된 β-아밀로이드 펩티드, β-아밀로이드 펩티드의 반전 이성질체 또는 히드라진 성분이 결합된 β-아밀로이드 펩티드의 역-반전 이성질체를 포함하며, 여기에서 화합물은 천연 β-아밀로이드 펩티드에 결합하거나 응집을 조절하고 또는 천연 β-아밀로이드 펩티드와 접촉한 경우에 천연 β-아밀로이드 펩티드의 신경독성을 저해한다. 바람직하게, 본 발명의 조절인자 화합물은 1 - 20 개의 D-아미노산, 더 바람직하게 1 - 10 개의 D-아미노산, 좀 더 바람직하게 1 - 5 개의 D-아미노산 및 가장 바람직하게 히드라진 성분이 결합된 2 - 4 개의 D-아미노산으로 이루어져 있다.
하나의 실시형태에서, 히드라진 성분을 포함한 본 발명의 조절인자 화합물은 예를들어, 알킬기(메틸, 에틸 또는 이소프로필기)를 포함하는 변 형기에 의해 아미노 말단이 변형된 것이다. 적절한 N-말단의 변형기의 예는 하기 Ⅱ 항에 상세히 서술되어 있다. 다른 실시형태에서, 히드라진 성분을 포함하는 본 발명의 조절인자 화합물은 예를들어, 아세틸에 의해 카르복시-말단이 변형된 것이다. 적절한 C-말단의 변형기의 예는 하기의 Ⅱ 및 Ⅲ 항에 상세히 서술되어 있다. 히드라진 성분을 포함한 본 발명의 조절인자 화합물은 β-AP 응집 또는 신경독성을 변형시키기 위해 조절인자의 능력을 증강시키도록 변형될 것이다. 부가적 또는 선택적으로, 히드라진 성분을 포함한 본 발명의 조절인자 화합물은 조절인자의 약동력학적 특성을 변형하고/하거나 검출가능한 물질로 조절인자를 표지하도록 변형될 것이다(하기 Ⅲ 항에 서술되어 있음).
바람직하게, 본 발명의 조절인자는 천연 β-AP 의 서브영역(subregion)의 아미노산 서열을 기초로 제조하였다. "천연 β-아밀로이드 펩티드의 서브영역" 이란 용어는 천연 β-AP 의 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단의 결실을 포함하고자 한다. "천연 β-AP 의 서브영역" 이란 용어는 전장의 천연 β-AP 를 포함하지 않는다(즉, "서브영역" 은 Aβ1-39, Aβ1-40, Aβ1-41, Aβ1-42 및 Aβ1-43 을 포함하지 않는다). 천연 β-아밀로이드 펩티드의 바람직한 서브영역은 "Aβ 응집 코어 도메인" (ACD)이다. 본원에서 사용한 바와 같이, "Aβ 응집 코어 도메인" 은, 미국 특허 출원 일련 번호 제 08/548,998 호 및 제 08/616,081 호에 상세히 서술되어 있으며, 본원에서 참고문헌으로 인용한 각각의 모든 내용에 상세히 서술된 바와 같이, L-아미노산 형태에서 이러한 서브영역이 적절하게 변형되었을 때(예를들어, 아미노-말단에서 변형되었음) 천연 β-APs 의 응집을 조절하기에 충분한 천연 β-아밀로이드 펩티드의 서브영역을 나타낸다. 바람직하게, ACD 는 15 개의 아미노산 길이보다 짧게, 더 바람직하게 3 - 10 개의 아미노산 길이를 나타내는 천연 β-AP 서브영역 뒤에서 형성된다. 다양한 실시형태에서, ACD 는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3 개의 아미노산 길이를 나타내는 β-AP 의 서브영역 뒤에서 만들어진다. 하나의 실시형태에서, ACD 가 형성된 경우에 β-AP 의 서브영역은 β-AP 의 내부 또는 카르복시-말단 영역을 나타낸다(즉, 1 아미노산 위치에서 아미노-말단의 하류). 다른 실시형태에서, β-AP 의 서브영역 뒤에 생성된 ACD 는 소수성을 나타낸다. 바람직한 Aβ 응집 코어 도메인은 본원에 서술된 바와 같이, 천연 β-AP 의 아미노산 잔기 17 - 20 또는 17 - 21 (각각 Aβ17-20 및 Aβ17-21) 및 그의 유사체를 포함한다. Aβ17-20 및 Aβ17-21 의 아미노산 서열은 각각 Leu-Val-Phe-Phe (SEQ ID NO : 3) 및 Leu-Val-Phe-Phe-Val (SEQ ID NO : 4)이다.
실시예에 기술된 바와 같이, Aβ17-20 및 Aβ17-21 의 아미노산 서열을 기초로 만들어진 D-아미노산-함유 조절인자는 특히 Aβ 응집의 효과적인 저해제이고 증강된 생물학적 안정성을 나타내며 상승된 혈장 수준을 지속시킨다. 이러한 조절인자는 Aβ17-20 또는 Aβ17-21 의 L-아미노산 서열과 상응하는 D-아미노산 서열을 포함할 수 있다. D-아미노산 서열은 Aβ17-20 또는 Aβ17-21 의 L-아미노산 서열의 반전 이성질체이고 Aβ17-20 또는 Aβ17-21 의 L-아미노산 서열의 역-반전 이성질체이거나 Aβ 17-20 또는 Aβ17-21 의 L-아미노산 서열의 무질서하거나 치환된 변형이다. 바람직한 실시형태에서, Aβ17-20 및 Aβ17-21 의 아미노산 서열을 기초로 만들어진 조절인자내의 페닐알라닌은 좀 더 안정하며 예를들어, 산화적 대사가 덜 일어나는 페닐알라닌 유사체로 치환된다. 다른 바람직한 실시형태에서, Aβ17-20 및 Aβ17-21 의 아미노산 서열을 기초로 만들어진 조절인자는 히드라진 성분을 더 포함한다.
D-아미노산-기저 조절인자는 변형되지 않은 아미노- 및/또는 카르복시-말단 및/또는 카르복시 아미드 말단이거나 선택적으로, 변형된 아미노-말단, 카르복시-말단 또는 둘 다 변형될 것이다(하기에 상세히 기재되어 있음). 효과적인 조절인자의 펩티드 구조는 일반적으로 소수성을 나타 내며 D-로이신 구조, D-페닐알라닌 구조 및 D-발린 구조 중에서 독립적으로 선택한 적어도 두 개의 D-아미노산 구조가 존재함을 특징으로 한다. 본원에서 사용한것 같이, "D-아미노산 구조" (예를들어, "D-로이신 구조", "D-페닐알라닌 구조 또는 "D-발린 구조")란 화합물의 기능적 활성을 유지하는 D-아미노산의 유사체, 유도체 및 모의체 뿐만 아니라 D-아미노산을 포함한다(하기에 논의되었음). 예를들어, "D-페닐알라닌 구조" 란 D-페닐알라닌 뿐만 아니라 D-시클로헥실알라닌[D-Cha], D-4-플루오로페닐알라닌(파라-플루오로페닐알라닌){[p-F]f 또는 D-[p-F]Phe}, D-펜타플루오로페닐알라닌 {[F5]f 또는 D-[F5]Phe}, 클로로페닐알라닌, 브로모페닐알라닌, 니트로페닐알라닌, D-피리딜알라닌, D-호모페닐알라닌, 메틸티로신 및 벤질세린과 D-리신 구조, D-발린 구조 또는 D-로이신 구조로의 치환 또한 포함한다. "D-로이신 구조" 란 D-로이신 뿐만 아니라 D-노르로이신 또는 D-노르발린과 같은 지방족화합물의 곁사슬을 포함하는 다른 천연 또는 비-천연 아미노산 또는 D-발린, D-이소로이신과의 치환을 포함한다. "D-발린 구조" 란 D-발린 뿐만아니라 D-로이신 또는 지방족화합물의 곁사슬을 포함하는 다른 천연 또는 비-천연 아미노산과의 치환을 포함한다.
다른 실시형태에서, 조절인자의 펩티드 구조는 D-로이신 구조, D-페닐알라닌 구조, D-발린 구조, D-알라닌 구조, D-티로신 구조, D-요오드티 로신 구조 및 D-리신 구조 중에서 독립적으로 선택한 적어도 2 개의 D-아미노산 구조를 포함한다. 또다른 실시형태에서, 펩티드 구조는 D-로이신 구조, D-페닐알라닌 구조 및 D-발린 구조 중에서 독립적으로 선택한 적어도 3 개의 D-아미노산 구조로 이루어져 있다. 또다른 실시형태에서, 펩티드 구조는 D-로이신 구조, D-페닐알라닌 구조, D-발린 구조, D-알라닌 구조, D-티로신 구조, D-요오드티로신 구조 및 D-리신 구조 중에서 독립적으로 선택한 적어도 3 개의 D-아미노산 구조로 이루어져 있다. 또다른 실시형태에서, 펩티드 구조는 D-로이신 구조, D-페닐알라닌 구조 및 D-발린 구조 중에서 독립적으로 선택한 적어도 4 개의 D-아미노산 구조를 포함한다. 또다른 실시형태에서, 펩티드 구조는 D-로이신 구조, D-페닐알라닌 구조 및 D-발린 구조 중에서 독립적으로 선택한 적어도 4 개의 D-아미노산 구조로 이루어져 있다. 바람직한 실시형태에서, 펩티드 구조는 페닐알라닌 보다 더 안정하며 예를들어, 산화적 대사가 덜 일어나는 적어도 하나의 페닐알라닌 유사체를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 다음의 화학식(I)을 포함하는 β-아밀로이드 조절인자 화합물을 제공한다 :
Figure 112001022012147-pct00001
여기에서, Xaa1, Xaa2, Xaa3 및 Xaa4 는 D-아미노산 구조이며 Xaa1, Xaa2, Xaa3 및 Xaa4 중 적어도 2 개는 D-로이신 구조, D-페닐알라닌 구조 [예를들어, D-시클로헥실알라닌, D-4-플루오로페닐알라닌(파라-플루오로페닐알라닌), D-펜타플루오로페닐알라닌, 클로로페닐알라닌, 브로모페닐알라닌, 니트로페닐알라닌 및 D-호모페닐알라닌] 및 D-발린 구조 중에서 독립적으로 선택한 것이고 ;
Y 는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 상기 Y 가 존재할 경우에, Y 는 화학식(Xaa)a 를 갖는 구조이며, 여기에서 Xaa 는 모든 D-아미노산 구조이고 a 는 정수 1 내지 15 이고 ;
Z 는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 상기 Z 가 존재할 경우에, Z 는 화학식(Xaa)b 를 갖는 구조이며, 여기에서 Xaa 는 모든 D-아미노산 구조이고 b 는 정수 1 내지 15 이며 ;
A 는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 상기 A 가 존재할 경우에, A 는 화합물에 직접 또는 간접적으로 결합된 변형기이며 ;
n 은 정수 1 내지 15 이다 ;
여기에서, Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Y, Z, A 및 n 은 화합물이 천연 β-아밀로이드 펩티드에 결합하거나 응집을 조절하며 천연 β-아밀로이 드 펩티드와 접촉한 경우에 천연 β-아밀로이드 펩티드의 신경독성을 저해하며 대사, 예를들어 산화적 대사가 비교적 덜 일어나도록 선택된다.
이러한 화학식의 하기 실시형태에서, 5 번째 아미노산 잔기인 Xaa5 는 Xaa4 및 Z 에 대해 특이적인 C-말단이고 Xaa5 가 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 상기 Xaa5 가 존재할 경우에, Xaa5 는 화학식 (Xaa)b 를 갖는 구조이며, 여기에서 Xaa 는 모든 D-아미노산 구조이고 b 는 정수 1 내지 14 이다. 따라서, 본 발명은 다음의 화학식(Ⅱ)를 포함하는 β-아밀로이드 조절인자 화합물을 제공한다 :
Figure 112005011326811-pct00002
여기에서 b 는 정수 1 내지 14 이다.
바람직한 실시형태에서, 화학식(Ⅰ)의 Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4 는 Aβ17-20 의 서열 또는 그것의 이용가능한 치환을 근거로 선택하였다. 따라서 바람직한 실시형태에서, Xaa1 은 D-알라닌 구조 또는 D-로이신 구조이고 Xaa2 는 D-발린 구조 또는 D-페닐알라닌 구조이며 Xaa3 은 D-페닐알라닌 구조[예를들어, D-시클로헥실알라닌, D-4-플루오로페닐알라닌(파라-플루오로 페닐알라닌), D-펜타플루오로페닐알라닌, 클로로페닐알라닌, 브로모페닐알라닌, 니트로페닐알라닌 및 D-호모페닐알라닌], D-티로신 구조, D-요오드티로신 구조 또는 D-리신 구조이고 Xaa4 는 D-페닐알라닌 구조[예를들어, D-시클로헥실알라닌, D-4-플루오로페닐알라닌(파라-플루오로페닐알라닌), D-펜타플루오로페닐알라닌, 클로로페닐알라닌, 브로모페닐알라닌, 니트로페닐알라닌 및 D-호모페닐알라닌], D-티로신 구조, D-요오드티로신 구조 또는 D-리신 구조이다.
바람직한 다른 실시형태에서, 화학식(Ⅱ)의 Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4 및 Xaa5 는 Aβ17-21 의 서열 또는 그것의 이용가능한 치환을 근거로 선택하였다. 따라서 바람직한 실시형태에서, Xaa1 은 D-알라닌 구조 또는 D-로이신 구조이고 Xaa2 는 D-발린 구조이며 Xaa3 은 D-페닐알라닌 구조[예를들어, D-시클로헥실알라닌, D-4-플루오로페닐알라닌(파라-플루오로페닐알라닌), D-펜타플루오로페닐알라닌, 클로로페닐알라닌, 브로모페닐알라닌, 니트로페닐알라닌 및 D-호모페닐알라닌], D-티로신 구조, D-요오드티로신 구조 또는 D-리신 구조이고 Xaa4 는 D-페닐알라닌 구조[예를들어, D-시클로헥실알라닌, D-4-플루오로페닐알라닌(파라-플루오로페닐알라닌), D-펜타플루오로페닐알라닌, 클로로페닐알라닌, 브로모페닐알라닌, 니트로페닐알라닌, D-피리딜알라닌 및 D-호모페닐알라닌], D-티로신 구조, D-요오드티로신 구조 또는 D-리신 구조이며 Xaa5 는 D-알라닌 구조 또는 D-로이신 구조이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 화학식(I)의 Xaa1, Xaa2, Xaa3 및 Xaa4 는 Aβ17-20 의 역-반전 이성질체 또는 그것의 이용가능한 치환을 근거로 선택하였다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, Xaa1 은 D-알라닌 구조, D-로이신 구조 또는 D-페닐알라닌 구조[예를들어, D-시클로헥실알라닌, D-4-플루오로페닐알라닌(파라-플루오로페닐알라닌), D-펜타플루오로페닐알라닌, 클로로페닐알라닌, 브로모페닐알라닌, 니트로페닐알라닌, 및 D-호모페닐알라닌], D-티로신 구조, D-요오드티로신 구조, D-로이신 구조, D-발린 구조 또는 D-리신 구조이고 ; Xaa2 는 D-페닐알라닌 구조[예를들어, D-시클로헥실알라닌, D-4-플루오로페닐알라닌(파라-플루오로페닐알라닌), D-펜타플루오로페닐알라닌, 클로로페닐알라닌, 브로모페닐알라닌, 니트로페닐알라닌, D-피리딜알라닌 및 D-호모페닐알라닌], D-티로신 구조, D-요오드티로신 구조 또는 D-리신 구조이며 ; Xaa3 은 D-페닐알라닌 구조[예를들어, D-시클로헥실알라닌, D-4-플루오로페닐알라닌(파라-플루오로페닐알라닌), D-펜타플루오로페닐알라닌, 클로로페닐알라닌, 브로모페닐알라닌, 니트로페닐알라닌, D-피리딜알라닌 및 D-호모페닐알라닌], D-티로신 구조, D-요오드티로신 구조 또는 D-리신 구조이고 ; Xaa4 는 D-발린 구조 또는 D-로이신 구조이다.
또다른 바람직한 실시형태에서, 화학식(Ⅱ)의 Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa 4 및 Xaa5 는 Aβ17-21 의 역반전 이성질체 또는 그것의 이용가능한 치환을 근거로 선택하였다. 따라서, 바람직한 실시형태에서 Xaa1 은 D-알라닌 구조, D-로이신 구조 또는 D-페닐알라닌 구조[예를들어, D-시클로헥실알라닌, D-4-플루오로페닐알라닌(파라-플루오로페닐알라닌), D-펜타플루오로페닐알라닌, 클로로페닐알라닌, 브로모페닐알라닌, 니트로페닐알라닌, D-피리딜알라닌 및 D-호모페닐알라닌], D-티로신 구조, D-요오드티로신 구조 또는 D-리신 구조이고 ; Xaa2 는 D-페닐알라닌 구조[예를들어, D-시클로헥실알라닌, D-4-플루오로페닐알라닌(파라-플루오로페닐알라닌), D-펜타플루오로페닐알라닌, 클로로페닐알라닌, 브로모페닐알라닌, 니트로페닐알라닌, D-피리딜알라닌 및 D-호모페닐알라닌], D-티로신 구조, D-요오드티로신 구조 또는 D-리신 구조이며 ; Xaa3 은 D-페닐알라닌 구조[예를들어, D-시클로헥실알라닌, D-4-플루오로페닐알라닌 (파라-플루오로페닐알라닌), D-펜타플루오로페닐알라닌, 클로로페닐알라닌, 브로모페닐알라닌, 니트로페닐알라닌, D-피리딜알라닌 및 D-호모페닐알라닌], D-티로신 구조, D-요오드티로신 구조 또는 D-리신 구조이고 ; Xaa4 는 D-발린 구조 또는 D-로이신 구조이며 Xaa5 는 D-로이신 구조이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 화학식(Ⅲ)을 포함하는 β-아밀로이드 조절인자 화합물을 제공한다 :
Figure 112001022012147-pct00003
여기에서 Xaa1 및 Xaa2 는 각각 D-아미노산 구조이고 Xaa1 및 Xaa2 중 적어도 2개는 D-로이신 구조, D-페닐알라닌 구조[예를들어, D-시클로헥실알라닌, D-4-플루오로페닐알라닌(파라-플루오로페닐알라닌), D-펜타플루오로페닐알라닌, 클로로페닐알라닌, 브로모페닐알라닌, 니트로페닐알라닌 및 D-호모페닐알라닌], D-티로신 구조, D-요오드티로신 구조, D-리신 구조 또는 D-발린 구조이며 ;
NH-NH 는 히드라진 구조이고 ;
Y 는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 상기 Y 가 존재할 경우에, Y 는 화학식(Xaa)a 를 갖는 구조이며, 여기에서 Xaa 는 모든 D-아미노산 구조이고 a 는 정수 1 내지 15 이다 ;
Xaa1', Xaa2', 및 Xaa3' 은 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 상기 Xaa1', Xaa2', 및 Xaa3' 가 존재할 경우에, Xaa1', Xaa2' 및 Xaa3' 는 각각은 D-아미노산 또는 L-아미노산 구조이며 Xaa1', Xaa2', 및 Xaa3' 중 적어도 2개는 D-또는 L-로이신 구조, D-또는 L-페닐알라닌 구조[예를들어, D-시클로헥실알라닌, D-4-플루오로페닐알라닌(파라-플루오로페닐알라닌), D-펜타플루오로페닐알라닌, 클로로페닐알라닌, 브로모페닐알라닌, 니트로페닐알라닌 및 D-호모페닐알라닌], D-또는 L-티로신 구조, D-또는 L-요오드티로신 구조, D-또는 L-리신 구조 또는 D-또는 L-발린 구조 중에서 독립적으로 선택한 것이고 ;
Z 는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 상기 Z 가 존재할 경우에, Z 는 화학식(Xaa)b 를 갖는 구조이며, 여기에서 Xaa 는 모든 D-아미노산 구조이고 b 는 정수 1 내지 15 이며 ;
A 는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 상기 A 가 존재할 경우에, A 는 화합물에 직접 또는 간접적으로 결합된 변형기이며 ;
n 은 정수 1 내지 15 이다 ;
여기에서 Xaa1, Xaa2, Xaa1', Xaa2', Xaa3', Y, Z, A 및 n 은 화합물이 천연 β-아밀로이드 펩티드에 결합하고 응집을 조절하며 천연 β-아밀로이드 펩티드와 접촉한 경우에 천연 β-아밀로이드 펩티드의 신경독성을 저해하고 대사, 예를들어 산화적 대사가 덜 일어나도록 선택된다.
상기에 제시한 화학식 (I), (Ⅱ) 또는 (Ⅲ)을 갖는 본 발명의 조절인자에서, 임의의 변형기 ("A")는 조절인자의 펩티드 구조에 직접 또는 간접적으로 결합된다(본원에서 사용한 "조절기"와 "변형기"란 용어는 펩티드 구조에 직접 또는 간접적으로 결합된 화학기를 나타내도록 상호 교환하여 사용하였다). 예를들어, 변형기(들)는 공유결합에 의해 펩티드 구조에 직접 결합되거나 안정한 비-공유 회합에 의해 간접적으로 결합될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 변형기는 조절인자의 아미노-말단에 결합한다. 선택적으로, 본 발명의 다른 실시형태에서, 변형기는 조절인자의 카르복시-말단에 결합한다. 다른 실시형태에서, 변형기는 조절인자의 아미노 및 카르복시-말단에 결합한다. 또다른 실시형태에서, 조절기(들)는 조절인자의 펩티드 구조 중 적어도 하나의 아미노산 잔기의 곁사슬에 결합한다(예를들어, 리신 잔기의 엡실런 아미노기, 아스파르트산 잔기 또는 글루탐산 잔기의 카르복시기, 티로신 잔기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기의 히드록시기 또는 아미노산 곁사슬 상의 다른 적절한 반응기를 통해서).
만일 변형기가 존재한다면, 변형기는 화합물이 천연 β-아밀로이드 펩티드와 접촉한 경우에 천연 β-아밀로이드 펩티드의 응집을 저해하도록 선택한다. 따라서, 화합물의 β-AP 펩티드가 그것의 천연 상태로부터 변형된 것이므로, 본원에서 사용한 변형기 "A" 는 수소를 포함하지 않 는다. 본 발명의 조절인자에서, 단일 변형기는 펩티드 구조에 결합할 것이며 또는 다수의 변형기도 펩티드 구조에 결합할 것이다. 화합물이 천연 β-아밀로이드 펩티드와 접촉한 경우에 천연 β-아밀로이드 펩티드의 응집을 저해하도록 변형기의 수를 선택하였다. 그러나, n 은 바람직하게 정수 1 내지 60 이고 더욱 바람직하게 1 내지 30 이며 더욱 더 바람직하게 1 내지 10 또는 1 내지 5 이다. 바람직한 실시형태에서, A 는 고리 알킬기, 헤테로고리 알킬기, 여러 고리 알킬기, 선형 또는 분지된 알킬기를 포함하는 아미노-말단 변형기이며 n=1 이다. 그 밖의 다른 바람직한 실시형태에서, A 는 아미드기, 알킬 아미드기, 아릴 아미드기 또는 히드록시기를 포함하는 카르복시-말단 변형기이며 n=1 이다. 적절한 변형기는 하기의 Ⅱ 및 Ⅲ 항에 상세히 기재되어 있다.
바람직한 특정 실시형태에 있어서, 본 발명은 다음 중에서 선택한 펩티드 구조를 포함하는 β-아밀로이드 조절인자 화합물을 제공한다 : (D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)(SEQ ID NO : 5) ; (D-Leu-D-Val-D-Cha-D-Phe-D-Leu)(SEQ ID NO : 6) ; (D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)(SEQ ID NO : 7) ; (D-Leu-D-Val-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Leu)(SEQ ID NO : 8) ; (D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)(SEQ ID NO : 9) ; (D-Leu-D-Val-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Leu)(SEQ ID NO : 10) ; (D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO : 11) ; (D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO : 12) ; D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO : 13) ; (D-Leu-D-Phe-D-Lys-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO : 14) ; (D-Leu-D-Cha-D-Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO : 15) ; (D-Leu-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO : 16) ; (D-Leu-D-[F5]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO : 17) ; (D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO : 18) ; (D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO : 19) ; (D-Leu-D-Val-D-Cha-D-Cha-D-Leu)(SEQ ID NO : 20) ; (D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO : 21) ; (D-Leu-D-Val-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)(SEQ ID NO : 22) ; (D-Leu-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)(SEQ ID NO : 23) ; (D-Leu-D-Val-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)(SEQ ID NO : 24) ; (D-Leu-D-Val-D-Phe)(SEQ ID NO : 25).
전술한 특정 펩티드 구조들 모두는 아미노-말단 변이되거나/되고 카르복시-말단 변이될 수 있으며, 하기 Ⅱ 항 및/또는 Ⅲ 항에 보다 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 특히 바람직한 조절인자는 다음을 포함한다 : N,N-디메틸-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N,N-디메틸-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val- D-Leu)-NH2 ; N-메틸-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N-에틸-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N-이소프로필-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-이소프로필아미드 ; H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-디메틸아미드 ; N,N-디에틸-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N,N-디에틸-(D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N,N-디메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; N,N-디메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; N,N-디메틸-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; N-에틸-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; N-에틸-(Gly-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N-메틸-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N-에틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; N-프로필-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; N,N-디에틸-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2 ; H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-NH2 ; H-(D-Ile-D-Ile-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2 ; H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-NH2 ; H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Nle)-NH2 ; 1-피페리딘-아세틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; 1-피페리딘-아세틸-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu-이소프로필아미드 ; H-D-Leu-D-Phe-D- Phe-D-Val-D-Leu-이소프로필아미드 ; H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-메틸아미드 ; H-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-메틸아미드 ; H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-OH ; N-메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Phe-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Cha-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-[F5 ]Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ; H-(D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Val-D-Leu)-NH2 ; N-메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2 ; N-메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2 ; N-메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2 ; H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-(H-D-Leu-D-Val-D-Phe-)NH ; H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH-COCH3 ; 및 H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH2.
더욱 바람직한 본 발명의 화합물은 PPI-1319 : H-(D-Leu-D-Phe-[p-F]D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 및 PPI : 1019 : N-메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 이다. 상기한 바와 같이, D-Cha 는 D-시클로헥실알라닌을 나타내고 ; [p-F]f 또는 D-[p-F]Phe 는 D-4-플루오로페닐알라닌(파라-플루오로페닐알라닌이라고도 함)을 나타내며 ; [F5]f 또는 D-[F5]Phe 는 D-펜타플루오로페닐알라닌을 나타내고 ; D-Nle 는 D-노르로이신을 나타낸다.
본 발명의 조절인자의 D-아미노산 펩티드 구조는 본원에 기술된 천연 β-AP 응집을 변형시키는 조절인자의 능력을 보유하는 유사체, 유도체 및 모의체를 포함한 다른 펩티드 변이체가 더 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 조절인자의 D-아미노산 펩티드 구조는 그것의 안정성, 생체내이용효율 및 가용성이 증가되도록 더 변형시킬 수 있다. 본원에 사용된 용어 "유사체", "유도체" 및 "모의체" 는 D-펩티드 구조의 화학 구조와 유사하며 D-펩티드 구조의 기능상 특성을 보유하는 분자를 포함하고자 한다. 이러한 펩티드 유사체, 유도체 및 모의체를 제조하는 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Farmer, P.S. in Drug Design(E.J. Ariens, ed.) Academic Press, New York, 1980, vol. 10, pp. 119 - 143 ; Ball. J.B. 및 Alewood, P.F. (1990) J. Mol. Recognition 3 : 55 ; Morgan, B.A. 및 Gainor, J.A. (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24 : 243 ; Freidinger, R.M. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10 : 270 문헌을 참조하라. 또한 Sawyer, T.K. (1995) "Peptidomimetic Design and Chemical Approaches to Peptide Metabolism" in Taylor, M.D. 및 Amidon, G.L. (eds.) Peptide-Based Drug Design : Controlling Transport and Metabolism, Chapter 17 ; Smith, A.B. 3rd 등의 (1995) J. Am. Chem. Soc. 117 : 11113 - 11123 ; Smith, A.B. 3rd 등의 (1994) J. Am. Chem. Soc. 116 : 9947 - 9962 ; 및 Hirschman, R. 등의 (1993) J. Am. Chem. Soc. 115 : 12550 - 12568 문헌을 참조하라.
본원에 사용된 화합물 X (예를 들어, 펩티드 또는 아미노산)의 "유도체" 는 화합물 상의 반응기 중 하나 또는 그 이상을 치환기로 유도한 X 의 형태를 말한다. 펩티드 유도체의 예에는 아미노산 곁기, 펩티드 골격 또는 아미노- 또는 카르복시-말단을 유도화한 펩티드(예를 들어, 메틸화된 아미드 결합을 갖는 펩티드 화합물)가 포함된다. 본원에 사용된 화합물 X 의 "유사체" 는 X 의 기능상 활성에 필요한 X 의 화학적 구조를 보유하면서도 X 와는 다른 특정 화학 구조를 함유하는 화합물을 이른다. 자연발생적인 펩티드 유사체의 예로는 비-자연발생적인 아미노산 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 펩티드가 있다. 본원에 사용된 화합물 X 의 "모의체" 는 X 의 기능상 활성에 필수적인 X 의 화학 구조를 X 의 입체형태를 모방한 다른 화학 구조로 치환한 화합물을 말한다. 펩티드 모의체의 예에는 펩티드 골격을 벤조디아제핀 분자 중 하나 또는 그 이상으로 치환한 펩티드 화합물이 포함된다[예를 들어, James, G.L. 등의 (1993) Science 260 : 1937 - 1942 문헌을 참조하라].
본 발명의 조절인자 화합물의 유사체는, 원래의 조절인자의 특성을 보유할 수 있도록 동종 아미노산으로 펩티드 구조의 D-아미노산 중 하나 또는 그 이상을 치환시킨 화합물을 포함하고자 한다. 하나 또는 그 이상의 잔기에서 보존적인 아미노산 치환을 하는 것이 바람직하다. "보존적인 아미노산 치환" 은 아미노산 잔기를 유사한 곁사슬을 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 말한다. 유사한 곁사슬을 갖는 아미노산 잔기 군은 본 분야에 다음과 같이 규정되어 있다 : 염기성 곁사슬(예, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 곁사슬(예, 아스파르트산, 글루타민산), 비하전 극성 곁사슬(예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 곁사슬(예, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β-가지난 곁사슬(예, 트레오닌, 발린, 이소로이신) 및 방향성 곁사슬(예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘). 본 발명의 조절인자의 펩티드 구조에서 일어날 수 있는 동종 치환의 예로는 D-티로신, D-피리딜알라닌 또는 D-호모페닐알라닌으로 D-페닐알라닌 치환, D-발린 또는 그외의 지방족 곁사슬을 갖는 천연 또는 비천연 아미노산으로 D-로이신 치환 및/또는 D-로이신 또는 그외의 지방족 곁사슬을 갖는 천연 또는 비천연 아미노산으로 D-발린 치환을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
용어 "모의체", 특히 "펩티드 모의체" 는 등 배전자체를 포함하고자 한다. 본원에 사용된 용어 "등 배전자체" 는 1 차 구조의 입체형태가 2 차 구조에 특이한 결합 부위에 알맞기 때문에 2 차 화학 구조를 치환할 수 있는 화학 구조를 포함하고자 한다. 이 용어는 특히 본 분야의 숙련자들에게 잘 알려진 펩티드 골격 변형(즉, 아미드 결합 모의체)을 포함한다. 이러한 변형은 아미드 질소, α-탄소, 아미드 카르보닐의 변형, 아미드 결합의 완전 치환, 확대, 결실 또는 골격 가교 등을 포함한다. ψ[CH2S], ψ[CH2NH], ψ[CSNH2], ψ[NHCO], ψ[COCH2] 및 ψ[(E) 또는 (Z) CH=CH] 를 포함한 수 개의 펩티드 골격 변형은 잘 알려져 있다. 상기에 사용한 명명법에서, ψ 는 아미드 결합의 부재를 나타낸다. 아미드기를 치환하는 구조는 괄호 안에 특정한다.
다른 가능한 변형은 락탐 및 그외의 고리형 구조를 구성하기 위한 골격 가교 또는 N-알킬(또는 아릴) 치환(ψ[CONR])을 포함한다. 본 발명의 조절인자 화합물의 다른 유도체는 C-말단 히드록시메틸 유도체, 0-변형 유도체(예를 들어, C-말단 히드록시메틸 벤질 에테르), 알킬아미드 및 히드라지드와 같은 치환 아미드를 포함한 N-말단 변형 유도체 및 펜에틸아미드 유사체(예, 트리펩티드 Val-Phe-Phe 의 유사체로서 Val-Phe-펜에 틸아미드)로 C-말단 페닐알라닌 잔기를 치환한 화합물을 포함한다.
본 발명의 조절인자 화합물은 약학적 조성물 내로 혼입될 수 있으며(하기 Ⅴ 항에 보다 상세히 기술되어 있음), 하기 Ⅵ 항에 기술되어 있는 바와 같이 검출 및 치료방법에 이용할 수 있다.
Ⅱ. 변형기
특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 조절인자 화합물은 적어도 하나의 변형기(MG 라 약칭함)와 직·간접적으로 결합한다. 용어 "변형기" 는 D-아미노산 펩티드 구조에 직접 결합하는 구조(예를 들어, 공유 결합에 의해) 뿐만 아니라 펩티드 구조에 간접적으로 결합하는 구조(예를 들어, 부가적인 아미노산 잔기 또는 그것의 모의체, 유사체나 유도체에 공유 결합이나 안정한 비-공유 결합에 의해 결합함으로써 Aβ-유도 D-아미노산 펩티드 구조의 측면에 위치함)를 포함하고자 한다. 예를 들어, 변형기는 Aβ-유도 D-아미노산 펩티드 구조의 아미노-말단이나 카르복시-말단에 결합하거나, 코어 도메인의 측면에 위치한 펩티드나 펩티드 모의체에 결합할 수 있다. 택일적으로, 변형기는 Aβ-유도 D-아미노산 펩티드 구조의 D-아미노산 잔기 중 적어도 하나의 곁사슬에 결합하거나, 코어 도메인의 측면에 위치한 펩티드 또는 펩티드 모의체 영역에 결합할 수 있다(예를 들어, 리신 잔기의 엡실런 아미노기에 의해서, 아스파 르트산 잔기나 글루타민산 잔기의 카르복시기에 의해서, 티로신 잔기, 세린 잔기나 트레오닌 잔기 또는 아미노산 곁사슬 상의 다른 적당한 반응기의 히드록시기에 의해서). 예를 들어, 아미드, 알킬아미노, 카바메이트, 요소 또는 에스테르 결합 등을 포함한 결합 화학 구조에 관하여 본 분야에 널리 공지된 방법에 의하여 D-아미노산 펩티드 구조와 공유결합하는 변형기를 부착시킬 수 있다.
용어 "변형기" 는 그것의 천연 형태로는 천연 Aβ 펩티드에 자연적으로 결합하지 않는 기를 포함하고자 한다. 따라서, 용어 "변형기" 는 수소를 포함하지 않는다. 변형기는, 조절인자 화합물이 천연 β-아밀로이드 펩티드와 접촉하였을 때 천연 β-아밀로이드 펩티드의 응집을 변형시킬 수 있도록, 바람직하게는 억제할 수 있도록 선택하거나, 또는 천연 β-아밀로이드 펩티드와 접촉하였을 때 천연 β-아밀로이드 펩티드의 신경독성을 조절인자 화합물이 억제할 수 있도록 변형기를 선택한다. 조절인자가 변형기(들)를 포함할 경우의 특정형태에 있어서 메카니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 변형기는 조절인자가 Aβ 중합반응을 방해하는 능력을 증진시키는 핵심적인 약물특이 분자단으로 작용할 것으로 여겨진다.
바람직한 실시형태에 있어서, 변형기는 알킬기를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "알킬" 은 약 1 내지 약 10 개의 탄소 원자를 갖는 곧거나 가지난 사슬 탄화수소기를 말한다. 전형적인 알킬기는 메틸, 에틸, 디메틸, 디에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2 차-부틸, 3 차-부틸, n-펜틸 및 n-헥실이 포함된다. 알킬기는 치환되지 않거나, 예를 들어 할로겐류, 알킬류, 시클로알킬류, 알켄일류, 알킨일류, 아릴류, 헤테로고리류, 히드록실류, 아미노류, 니트로류, 티올류, 아민류, 이민류, 아미드류, 포스폰산류, 포스핀류, 카르보닐류, 카르복실류, 실릴류, 에테르류, 티오에테르류, 술폰일류, 셀레노에테르류, 케톤류, 알데히드류, 에스테르류, -CF3, -CN 등으로 하나 또는 그 이상의 위치에서 치환될 수 있다. 바람직한 알킬류는 메틸, 에틸, 디메틸, 디에틸, n-프로필, 이소프로필이다.
다른 실시형태에 있어서, 알킬기와 같은 변형기는 다른 변형기와 결합한다. 또다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 조절인자 화합물의 D-아미노산은 두 변형기로 변형시킨다. 따라서, 바람직한 변형기는 1-피페리딘 아세틸기를 포함한다.
바람직한 실시형태에 있어서, 변형기는 고리 알킬기, 헤테로고리 알킬기, 여러 고리 알킬기 또는 가지난 알킬기를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "고리기" 는 약 3 - 10 개, 바람직하게는 약 4 - 8 개, 더욱 바람직하게는 약 5 - 7 개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화된(즉, 방향성) 고리기를 포함하고자 한다. 전형적인 고리기는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 및 시클로옥틸을 포함한다. 고리기는 하나 또는 그 이상의 고리 위치에서 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 따라서, 고리기는 예를 들어 할로겐류, 알킬류, 시클로알킬류, 알켄일류, 알킨일류, 아릴류, 헤테로고리류, 히드록실류, 아미노류, 니트로류, 티올류, 아민류, 이민류, 아미드류, 포스폰산류, 포스핀류, 카르보닐류, 카르복실류, 실릴류, 에테르류, 티오에테르류, 술폰일류, 술폰산류, 셀레노에테르류, 케톤류, 알데히드류, 에스테르류, -CF3, -CN 등으로 치환할 수 있다.
용어 "헤테로고리기" 는 약 3 - 10 개, 바람직하게는 약 4 - 8 개, 더욱 바람직하게는 약 5 - 7 개의 탄소 원자를 갖는 포화되거나 불포화된(즉, 방향성) 고리기를 포함하며, 여기에서 고리 구조는 약 1 - 4 개의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로고리기는 피롤리딘, 옥솔레인, 티올레인, 이미다졸, 옥사졸, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린 및 피리딘을 포함한 다. 헤테로고리형 고리는 예를 들어 할로겐류, 알킬류, 시클로알킬류, 알켄일류, 알킨일류, 아릴류, 다른 헤테로고리류, 히드록실, 아미노, 니트로, 티올, 아민류, 이민류, 아미드류, 포스폰산류, 포스핀류, 카르보닐류, 카르복실류, 실릴류, 에테르류, 티오에테르류, 술폰일류, 셀레노에테르류, 케톤류, 알데히드류, 에스테르류, -CF3, -CN 등의 치환기로 하나 또는 그 이상의 위치에서 치환될 수 있다. 헤테로고리는 하기한 바와 같이 다른 고리기와 융합되거나 다리를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "여러 고리기" 는 둘 또는 그 이상의 탄소가 인접한 두 고리, 예를 들어 "융합된 고리" 에 공통적인 둘 또는 그 이상의 포화되거나 불포화된(즉, 방향성의) 고리형 고리를 말한다. 비-인접 원자를 통해 연결되는 고리는 "다리 걸친" 고리라 한다. 여러 고리기의 각 고리는 상기한 바와 같이 예를 들어 할로겐류, 알킬류, 시클로알킬류, 알켄일류, 알킨일류, 히드록실, 아미노, 니트로, 티올, 아민류, 이민류, 아미드류, 포스폰산류, 포스핀류, 카르보닐류, 카르복실류, 실릴류, 에테르류, 티오에테르류, 술폰일류, 셀레노에테르류, 케톤류, 알데히드류, 에스테르류, -CF3, -CN 등의 치환기로 치환될 수 있다.
바람직한 여러 고리기는 시스-데칼린 구조를 포함하는 기이다. 특정 메카니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 시스-데칼린 구조가 존재함으로써 변형기에 부여되는 "굽은" 입체형태로 인해 변형기가 Aβ 중합반응을 방해할 수 있게 된다고 생각된다. 따라서, 시스-데칼린 구조의 "굽은" 입체형태를 모방한 다른 구조들 또한 변형기로 사용할 수 있다. 변형기로 사용할 수 있는 구조를 내포하는 시스-데칼린의 예는 콜릴기와 같은 콜라노일 구조이다. 예를 들어, 조절인자 화합물은 담즙산인 콜산과 응집 코어 도메인을 반응시킴으로써 콜릴기로 그것의 아미노 말단을 변형시킬 수 있다. 더욱이, 조절인자 화합물은 본 분야에 공지된 방법에 의해 콜릴기로 그것의 카르복시 말단을 변형시킬 수 있다[예를 들어, Wess, G 등의 (1993) Tetrahedron Letters, 34 : 817 - 822 ; Wess, G. 등의 (1992) Tetrahedron Letters 33 : 195 - 198 ; 및 Kramer, W. 등의 (1992) J. Biol. Chem. 267 : 18598 - 18604 문헌 참조]. 콜릴 유도체와 유사체도 변형기로 사용할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 콜릴 유도체는 Aic(3-(O-아미노에틸-이소)-콜릴)으로서, 조절인자 화합물을 더 변형시키는 데 사용할 수 있는 유리 아미노기를 갖는다(예를 들어, 99mTc 에 대한 킬레이트화기는 Aic 의 유리 아미노기를 통해 결합된다). 본원에 사용된 용어 "콜라노일 구조" 는 콜릴기 및 그것의 유도체와 유사체, 특히 4 개의 고리 시스-데칼린 입체형태를 갖는 것들을 포함하고자 한다. 콜라노일 구조의 예는 데옥시콜산, 리토콜산, 우르소데옥시콜산, 케노데옥시콜산 및 히오데옥시콜산 등과 같은 다른 담즙산으로부터 유도한 기 뿐만 아니라 콜란산, 부팔린 및 레시부포게닌과 같은 다른 관련 구조(맨 뒤의 두 화합물은 변형기로 이용하기에는 바람직하지 않음)를 포함한다. 시스-데칼린 함유 화합물의 다른 예는 5β-콜레스탄-3α-올 [(+)-디히드로콜레스테롤의 시스-데칼린 이성질체]이다. 담즙산과 스테로이드 구조 및 명명법에 관한 보다 상세한 설명은 Nes, W.R. 및 McKean, M.L. Biochemistry of Steroids and Other Isopentanoids, University Park Press, Baltimore, MD, Chapter 2 를 참조하라.
시스-데칼린 함유 기 이외에도, 다른 여러 고리기를 변형기로 사용할 수 있다. 예를 들어, 스테로이드 또는 β-락탐으로부터 유도한 변형기는 안정한 변형기일 것이다. 한 실시형태에 있어서, 변형기는 "바이오틴일 구조" 로서, 바이오틴일기 및 그것의 유사체와 유도체(2-아미노바이오틴일기 등)를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 변형기는 Aβ-유도 펩티드 구조가 5-(및 6-)-카르복시플루오레세인, 숙시니미딜 에스테르 또는 플루오레세인 이소티오시아네이트와 반응함으로써 유도된 기 등의 "플루오레세인-함유 기" 를 포함한다. 그외의 다양한 실시형태에 있어서, 변형기는 N-아세틸뉴라미닐기, 트랜스-4-코티나인카르복시기, 2-이미노-1-이미다졸리딘아세틸기, (S)-(-)-인돌린-2-카르복시기, (-)-멘톡시아세 틸기, 2-노르보난아세틸기, γ-옥소-5-아세나프테넨부티릴, (-)-2-옥소-4-티아졸리딘카르복시기, 테트라히드로-3-푸로일기, 2-이미노비오틴일기, 디에틸렌트리아민펜타아세틸기, 4-모르폴린카르보닐기, 2-티오펜아세틸기 또는 2-티오펜술폰일기를 포함할 수 있다.
상기한 고리기, 헤테로고리기 및 여러 고리기 이외에, 다른 형태의 변형기를 본 발명의 조절인자로 사용할 수 있다. 예를 들어, 소수성 기와 가지난 알킬기가 변형기로 적합할 것이다. 예로는 아세틸기, 페닐아세틸기, 디페닐아세틸기, 트리페닐아세틸기, 이소부탄오일기, 4-메틸발레릴기, 트랜스-신남오일기, 부탄오일기 및 1-아다만탄카르보닐기 등이 포함된다.
또다른 형태의 변형기는 Tsang, K.Y. 등의 (1994) J. Am. Chem. Soc. 116 : 3988 - 4005 ; Diaz, H 및 Kelly, J.W. (1991) Tetrahedron Letters 41 : 5725-5728 ; 및 Diaz. H 등의 (1992) J. Am. Chem. Soc. 114 : 8316 - 8318 에 기술되어 있는 디벤조푸란-기저 아미노산과 같은 베타-턴 모의체로서 작용하는 비-천연 아미노산을 함유하는 화합물이다. 이러한 변형기의 예로는 펩티드-아미노에틸디벤조푸라닐-프로프리온산(Adp)기(예, DDIIL-Adp) (SEQ ID NO : 31)가 있다. 변형기의 또다른 형태는 이 형태의 화합물이 천연 β-AP 와 상호작용할 때 천연 β-AP 의 응집에 대한 부가적인 입체장애가 생기도록 하는 N-메틸 펩티드 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
변형기의 또다른 형태는 NH-OR 기로서, R 은 본원에 기술한 변형되거나 변형되지 않은 알킬기 또는 시클로알킬기일 수 있다.
적당한 변형기와 그에 상응하는 변형제의 예를 하기하였으며, 이에 한정되지는 않는다 :
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바람직한 변형기는 메틸-함유 기, 에틸-함유 기, 프로필-함유 기 및 피페리딘-함유 기, 예를들어 1-피페리딘-아세틸기를 포함한다.
Ⅲ. Aβ 조절인자의 부가적인 화학 변형
본 발명의 Aβ-아밀로이드 조절인자 화합물은 Aβ 응집을 변형시키고 Aβ 신경독성을 저해하는 화합물의 능력은 보유하되, 화합물의 특정 성질은 변화시키도록 더 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 한 실시형태에 있어서 생체내 안정성 또는 반감기와 같은 화합물의 약물동력학적 특성을 변화시키도록 더 변형시킨다. 다른 실시형태에 있어서, 검출가능한 물질로 화합물을 표지하여 변형시킨다. 또다른 실시형태에 있어서, 부가적인 치료제를 화합물에 결합시켜 더 변형시킨다. 개략적으로, 적어도 하나의 변형기에 직접적으로 또는 간접적으로 결합하는 D-아미노산 Aβ 응집체의 코어 도메인을 함유하는 본 발명의 조절인자는 MG-ACD 로 나타내는 반면, 조절인자의 성질을 변화시키도록 더 변형시킨 이 화합물은 MG-ACD-CM(CM 은 부가적인 화학 변형을 나타냄) 으로 나타낸다.
화합물의 약물동력학적 성질을 변형시키는 등 화합물을 화학적으로 더 변형시키기 위하여, 반응기를 유도할 수 있다. 예를 들어, 응집체의 코어 도메인의 아미노-말단에 변형기가 부착될 경우에 화합물의 카르복시 말단을 더 변형시킬 수 있다. 바람직한 C-말단 변형은 카르복시펩티다제에 대한 기질로 작용하는 화합물의 능력을 감소시키는 것을 포함한다. C-말단 변형체로서 바람직한 예는 아미드기(즉, 펩티드 아미드), 알킬 또는 아릴 아미드기(예를 들어, 에틸아미드기 또는 펜에틸아미드기), 히드록시기(즉, 펩티드 알콜) 및 D-아미노산과 β-알라닌 등의 여러 비-천연 아미노산을 포함한다. 택일적으로, 응집체의 코어 도메인의 카르복시-말단에 변형기가 부착될 경우에 화합물의 아미노 말단은 예를 들어 아미노펩티다제에 대한 기질로서의 화합물의 능력이 감소하도록 더 변형시킬 수 있다.
검출가능한 물질로 화합물을 반응시켜 표지함으로써 조절인자 화합물을 더 변형시킬 수 있다. 검출가능한 물질로는 여러 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질이 적당하다. 적당한 효소의 예는 호스래디쉬 과산화효소, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 있으며 ; 보결 분자단 복합체로 적당한 것은 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이고 ; 형광 물질로 적당한 것은 움벨리페론, 플루오레세인, 이소티오시안산 플루오레세인, 로다민, 디클로로트리아진일아민 플루오레세인, 단실클로라이드 또는 피코에리트린이며 ; 발광 물질의 예로는 루미놀이 포함되며 ; 적당한 방사성 물질로는 14C, 123I, 124I, 125I, 131I, 99mTc, 35S 또는 3H 가 포함된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 조절인자 화합물내 하나 또는 그 이상의 아미노산 구조 또는 변형기 내로 14C 를 결합시킴으로써 조절인자 화합물을 14C 로 방사성표지한다. 표지된 조절인자 화합물은 화합물의 생체내 약물동력학을 측정하는 데 사용할 뿐만 아니라, 예를 들어 진단 목적으로 Aβ 응집을 검출하는 데에도 사용할 수 있다. Aβ 응집은 피검자로부터 수득한 생체내 또는 시험관내 시료에서 표지된 조절인자 화합물을 이용하여 검출할 수 있다.
생체내 진단제로 사용하기 위해서는, 본 발명의 조절인자 화합물을 테크네튬이나 요오드로 표지하는 것이 바람직하다. 따라서, 한 실시형태에 있어서 본 발명은 테크네튬, 바람직하게는 99mTc 로 표지된 조절인자 화합물을 제공한다. 테크네튬으로 펩티드 화합물을 표지하는 방법은 본 분야에 공지되어 있다[예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,443,815 호, 제 5,225,180 호 및 제 5,405,597 호(모두 Dean 등에 의함) ; Stepniak -Biniakiewicz, D. 등의 (1992) J. Med. Chem. 35 : 274 - 279 ; Fritzberg, A.R. 등의 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 4025 - 4029 ; Baidoo, K.E. 등의 (1990) Cancer Res. Suppl. 50 : 799s - 803s ; 및 Regan, L. 및 Smith, C.K. (1995) Science 270 : 980 - 982 문헌 참조]. 변형기는 유리 아미노기를 갖는 콜산의 Aic 유도체처럼 99mTc 에 대한 킬레이트화기를 도입할 수 있는 부위를 제공하도록 선택할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 방사성 요오드로 표지한 조절인자 화합물을 제공한다. 예를 들어, Aβ 서열 내의 페닐알라닌 잔기(Phe19 또는 Phe20)를 방사성 요오드티로실로 치환할 수 있다. 요오드의 모든 방사성 동위원소를 진단제 내로 결합시킬 수 있다. 바람직하게, 123I (반감기 = 13.2 시간)은 전신 신티그래피에 사용하고, 124I (반감기 = 4 일)는 양전자 방출 단층 촬영법(PET)에 사용하며, 125I (반감기 = 60 일)는 대사 회전 연구에 사용하고, 131I (반감기 = 8 일)은 전신 방사성 계측 및 지연 저분해능 영상 연구에 사용한다.
또한, 본 발명의 조절인자 화합물의 부가적인 변형은 화합물 상에 부가적인 치료 성질을 부여하는 것이다. 즉, 부가적인 화학 변형은 부가적인 기능성 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아밀로이드 반을 파쇄하거나 용해시키는 기능성 부분을 조절인자 화합물에 결합시킬 수 있다. 이런 형태에 있어서, 조절인자의 MG-ACD 는 Aβ 펩티드를 표적으로 삼아 Aβ 펩티드의 중합을 방해하는 반면에 부가적인 기능성 부분은 화합물이 아밀로이드 반을 표적으로 삼은 후에 이 부위를 파쇄하거나 용해시키는 작용을 한다.
대안적인 화학 변형에 있어서, 본 발명의 β-아밀로이드 화합물은 "약물전구체" 형태로 제조되는데, 여기에서 화합물 자체가 Aβ 응집을 조절하지는 않지만 생체내 대사시에 본원에 규정한 β-아밀로이드 조절인자 화합물 내로 형질전환될 수 있다. 예를 들어, 이러한 화합물의 형태에서 변형기는 대사시에 화학 변화에 의해 활성 변형기 형태로 될 수 있는 약물전구체 형태로 존재할 수 있다. 변형기의 이러한 약물전구체 형태를 본원에서는 "2 차 변형기" 라 한다. 펩티드-기저 약물의 활성형의 수송을 최적화하기 위하여 대사를 제한하는 펩티드 약물전구체를 제조하는 다양한 방법은 본 분야에 공지되어 있다[예를들어, Moss, J. (1995) in Peptide-Based Drug Design : Controlling Transport and Metabolism, Taylor, M.D. 및 Amidon, G.L. (eds), Chapter 18 참조]. "순차적 대사" 에 기초한 CNS 수송에 대해 특이적으로 고안된 다른 방법도 있다[예를 들어, Bodor, N. 등의 (1992) Science 257 : 1698 - 1700 ; Prokai, L. 등의 (1994) J. Am. Chem. Soc. 116 : 2643 - 2644 ; Bodor, N. 및 Prokai, L. (1995) in Peptide-Based Drug Design : Controlling Transport and Metabolism, Taylor, M.D. 및 Amidon, G.L. (eds), Chapter 14 참조]. 본 발명의 조절인자의 약물전구체 형태에 관한 실시형태에 있어서, 변형기는 혈액뇌장벽 투과성을 높이는 알킬 에스테르를 포함한다.
본 발명의 조절인자 화합물은 본 분야에 공지된 표준 기술로 제조할 수 있다. Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) 및 Grant, G.A (ed.). Synthetic Peptides : A User's Guide, W.H. Freeman and Company, New York (1992) 문헌에 기술되어 있는 표준 기술을 이용하여 조절인자의 펩티드 성분을 합성할 수 있다. 펩티드 자동 합성기는 통상적으로 입수가능하다(예를 들어, 어드밴스트 켐테크 모델 396 ; 밀리젠/바이오서치 9600). 또한, 표준 방법을 이용하여 하나 또는 그 이상의 변형기를 Aβ-유도 펩티드 성분(예를 들어, Aβ 응집체의 코어 도메인)에 결합시킬 수 있으며, 상기 표준 방법은 예를 들어 아미노기(예, 펩티드의 아미노-말단에 있는 알파-아미노기), 카르복시기(예, 펩티드의 카르복시 말단의), 히드록시기(예, 티로신, 세린 또는 트레오닌 잔기 상의) 또는 아미노산 곁사슬 상의 다른 적당한 반응기에 의한 반응 방법이다[예를 들어, Greene, T.W 및 Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Inc., New York (1991) 문헌 참조]. D-아미노산 β 아밀로이드 조절인자의 합성예는 실시예 1 에 상세히 기술되어 있다.
Ⅳ. 스크리닝 검정
본 발명의 다른 양상은 β-아밀로이드 응집에 대한 조절인자를 선택하는 방법에 관한 것이다. 방법은, 실험 화합물을 천연 β 아밀로이드 펩티드와 접촉시킨 다음 천연 β-AP 의 응집을 측정하고, 천연 β-AP 의 응집을 변형시키는(예를 들어, 응집을 저해하거나 촉진시키는) 실험 화합물의 능력에 기초하여 조절인자를 선택하는 것이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 실험 화합물은 천연 β-AP 의 과다 몰양과 접촉시 킨다. 본원의 실시예 2 등에 기술한 바와 같이 β-AP 응집을 나타내는 적당한 검정법을 이용하여 실험 화합물의 존재하에 천연 β-AP 의 응집량 및/또는 응집율을 측정할 수 있다.
바람직한 검정에 있어서, 실험 화합물의 존재하에 용액에 천연 β-AP 를 용해시키고, 405 nm 에서 용액의 겉보기 흡광도를 측정하여 시간에 따른 용액의 혼탁도를 측정함으로써 핵생성 검정(실시예 2 참조)으로 천연 β-AP 의 응집을 측정하였다[실시예 2 에 보다 상세히 기술되어 있으며, Jarrett 등의 (1993) Biochemistry 32 : 4693 - 4697 문헌도 참조하라]. β-아밀로이드 조절인자의 부재시에, β-AP 가 용액 내에 남아 있는 지체 시간 중에는 일반적으로 용액의 A405nm 가 비교적 일정하지만 β-AP 가 응집되어 용액에서 나타나면서 용액의 A405nm 가 급격히 증가하다가 결국에는 불변기에 도달하게 된다(즉, 용액의 A405nm 는 시간에 따라 S 자형을 나타낸다). 이와는 반대로, β-AP 의 응집을 저해하는 실험 화합물의 존재시에는 조절인자의 부재시보다 용액의 A405nm 가 감소된다. 따라서, 저해성 조절인자의 존재시에 용액은 조절인자의 부재시에 비해 지체 시간이 길고, 응집 기울기가 감소하며 불변기가 낮다. β-아밀로이드 중합반응의 조절인자를 선택하는 방법은 β-AP 응집을 촉진시키는 조절인자를 선택하는 데에도 이용할 수 있다. 따라서, β-AP 응집을 촉진시키는 조절인자의 존재시에 용액의 A405nm 는 조절인자의 부재시에 비해 증가한다(예를 들어, 조절인자의 부재시에 비해 지체 시간은 감소하고 응집 기울기는 증가하며 불변기는 더 높다).
본 발명의 스크리닝 방법에 사용하기에 적당한 또다른 검정인 시드 확대 검정(seeded extension assay)은 실시예 2 에 기술되어 있다. 이 검정에서, β-AP 단량체와 응집된 β-AP "시드" 를 실험 화합물의 존재시 및 부재시에 혼합한 다음 β-AP 원섬유와 접촉하여 방출되는 염료 티오플라빈 T 의 증가를 근거로 β-원섬유 형성량을 측정한다. 또한, 조절인자의 존재 또는 부재시에 β-AP 제제를 전자 현미경(EM)으로 β-AP 응집을 측정할 수 있다. 예를 들어, EM 에 의해 검출가능한 β 아밀로이드 원섬유 형성은 β-AP 응집을 저해하는 조절인자의 존재시에는 감소하는 반면(즉, 조절인자의 존재시에 β-원섬유의 수나 양이 감소함), β-AP 응집을 촉진시키는 조절인자의 존재시에는 β 원섬유 형성이 증가한다(즉, 조절인자의 존재시에 β-원섬유의 수나 양이 증가함).
적당한 조절인자를 선택하기 위한 본 발명의 스크리닝 방법에 사용하기에 적합한 또다른 검정인 신경독성 검정은 실시예 3 에 기술되어 있다. 신경독성 Aβ 응집체 형성을 저해하고/하거나 이미 형성된 Aβ 원섬유의 신경독성을 저해하는 화합물을 선택한다. 이러한 신경독성 검정으로 생체내 신경독성을 예측할 수 있을 것이다. 따라서, 시험관내 신경독성 검정에서 조절인자 화합물의 저해 활성은 생체내 신경독성에 대한 화합물의 저해 활성과 유사할 것이라 생각된다.
Ⅴ. 약학적 조성물
본 발명의 또다른 양상은 본 발명의 β-아밀로이드 조절인자 화합물의 약학적 조성물을 포함한다. 한 실시형태에 있어서, 조성물은 천연 β-아밀로이드 펩티드의 응집을 변형시키기에, 바람직하게는 저해하기에 충분한 치료학적·예방학적 유효량의 β 아밀로이드 조절인자 화합물 및 약학적으로 용인가능한 담체를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 조성물은 천연 β-아밀로이드 펩티드의 신경독성을 억제하기에 충분한 치료학적·예방학적 유효량의 β 아밀로이드 조절인자 화합물 및 약학적으로 용인가능한 담체를 포함한다. "치료학적 유효량" 은 필요한 시간과 투여량에서 β-아밀로이드 침착의 감소 또는 그 반대 및/또는 Aβ 신경독성의 감소 또는 그 반대와 같은 원하는 치료학적 결과를 달성하기 위한 양을 말한다. 조절인자의 치료학적 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 체중 등의 변수와 개체에 대해 원하는 반응을 도출해 내는 조절인자의 능력에 따라 달라진다. 투여량 섭생법은 최적의 치료학적 반응을 제공할 수 있도록 조절한다. 치료학적 유효량은 또한 조절인자의 독성 효과나 유해 효과 보다는 치료학적으로 이로운 효과가 더 크게 나타나는 양을 말한다. 본 발명의 조절인자의 신경독성은 실시예 6 에 기술되어 있는 세포-기저 검정을 이용하여 분석할 수 있으며, 치료학적으로 유효한 조절인자는 높은 신경독성을 나타내지 않도록 선택할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 조절인자의 치료학적 유효량은 과다 몰량의 천연 β-아밀로이드 펩티드의 응집을 변형시키기에, 바람직하게는 저해하기에 충분하다. "예방학적 유효량" 은 필요한 시간과 투여량에서 β-아밀로이드 침착 및/또는 β-아밀로이드가 침착되기 쉬운 피검자의 Aβ 신경독성을 방해하거나 저해하는 등의 원하는 예방 효과를 얻을 수 있는 양을 말한다. 예방학적 유효량은 치료학적 유효량에 대하여 상기한 바와 같이 결정할 수 있다. 일반적으로, 예방 투여는 질병이 발병하기 전이나 질병 초기에 피검자에게 사용하므로 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 더 적은 양일 것이다.
β 아밀로이드 조절인자의 치료학적·예방학적 유효량을 측정할 때 고려해야 할 변수 중 하나는 피검자의 뇌척수액(CSF) 등의 피검자의 생물학적 구획에서의 천연 β-AP 의 농도이다. CSF 에서의 천연 β-AP 의 농도를 3 nM 로 추정하였다[Schwartzman, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 8368 - 8372 문헌 참조]. β 아밀로이드 조절인자의 치료학적·예방학적 유효량은 0.01 nM - 10 μM 이나, 이에 한정되지는 않는다. 투여량은 치료할 증상의 정도에 따라 달라질 것으로 생각된다. 특정 피검자의 경우, 개체의 요구 및 조성물을 투여하거나 그것을 관리하는 자의 전문 지식을 바탕으로 한 판단에 따라 특정 투여량을 시간에 따라 조절해야 하며, 본원에 기술된 투여량 범위는 특정 예를 나타낸 것일 뿐으로, 이것으로 청구한 조성물의 범주나 실시를 제한하려는 것은 아니다.
조성물내 활성 화합물의 양은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 체중 등의 변수에 따라 달라지며, 이들 변수 각각은 개체의 천연 β-AP 의 양에 영향을 미친다. 투여량 섭생법은 최적의 치료학적 반응을 제공할 수 있도록 조절한다. 예를 들어, 단일괴로 투여하거나 시간에 따라 수 차례 나눠서 투여하거나 또는 치료 상황의 긴박성에 따라 상대적으로 투여량을 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 위해 단일 투여형의 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 바람직하다. 본원에 사용한 단일 투여형은 치료되는 포유동물 피검자의 단일 투여량에 맞게 따로따로 나눠 놓은 것을 말한다 ; 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유하는 각 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 원하는 치료학적 효과를 얻을 수 있도록 계산하였다. 본 발명의 단일 투여형은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성과 이루어야 할 특정 치료 효과 및 (b) 개체의 민감성 치료를 위한 활성 화합물을 혼합하는 것에 관한 본 분야 고유의 제한에 따라 직접적으로 언급된다.
본원에 사용된 용어 "약학적으로 용인가능한 담체" 는 생리학적으로 양립되는 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항박테리아제, 항진균제, 등장제, 흡수지연제 등을 포함한다. 한 실시형태에 있어서, 담체는 비경구 투여에 적합하다. 바람직하게, 담체는 중추신경계내(예를 들어, 척수내 또는 대뇌내)로 투여하기에 적합하다. 택일적으로, 담체는 정맥내, 복강내 또는 근육내 투여하기에 적합할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 담체는 경구 투여에 적합하다. 약학적으로 용인가능한 담체는 멸균 수용액이나 분산액 및 주사가능한 멸균액 또는 분산액의 임기 조제를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 매질과 약물을 사용하는 것은 본 분야에 잘 알려져 있다. 통상적인 매질이나 약물이 활성 화합물과 양립하지 않는 것을 제외하고는, 본 발명의 제약학적 조성물에서 그것을 이용할 수 있다. 보조적인 활성 화합물을 조성물 내로 혼합시킬 수 있다.
치료학적 조성물은 일반적으로 제조 상태 및 보관시에 안정하고 무균이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로 에멀젼, 리포솜 또는 고농도의 약물에 적합한 그외의 규칙 조직으로 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 그것의 적당한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적당한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제를 사용하거나 분산의 경우에는 요구되는 입자 크기를 유지함으로써 얻을 수 있으며, 계면활성제를 사용할 수도 있다. 여러 경우에 있어서, 예를들어 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨 등의 폴리알콜, 설탕과 같은 등장제를 조성물 내에 함유하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물이 지속적으로 흡수될 수 있도록 하기 위해서는 모노스테아르산염과 겔라틴 등 흡수를 지연시킬 수 있는 약물을 조성물 내에 포함시킬 수 있다. 더욱이, 조절인자는 서방성 중합체를 함유하는 조성물 같은 서방성 제형 형태로 투여할 수 있다. 활성 화합물은 이식제와 미세피포성 수송계를 함유하는 조절 방출 제형처럼 화합물이 신속히 방출되는 것을 막는 담체와 함께 조제할 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 및 폴리락틱, 폴리글리콜 공중합체(PLG) 등의 생분해가능한 생적합성 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 제형의 여러 제조방법은 본 분야의 숙련자들에게 널리 알려져 있거나 특허출원되었다.
주사가능한 멸균 용액은 적당한 용매 내에 필요량 만큼의 활성 화합물(예를들어, β-아밀로이드 조절인자)과 상기한 다수의 성분이나 그 배합물을 혼합한 후에 필요에 따라 여과 면역법을 실시함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산매와 상기한 다수의 성분 중 필요한 성분을 함유하는 멸균 부형제 내로 활성 화합물을 혼합시킴으 로써 제조한다. 주사가능한 멸균 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 진공건조법 및 동결건조법으로서, 활성 성분의 분말과 그것의 멸균-여과 용액의 부가적인 성분을 수득할 수 있다.
본 발명의 조절인자 화합물은 조절인자 화합물의 안정성을 증진시킬 수 있는 부가적인 화합물 중 하나 또는 그 이상과 함께 제형화할 수 있다. 조절인자의 안정성을 증진시키는 제형 내에 부가되기에 바람직한 화합물은 시클로덱스트린 유도체, 바람직하게는 히드록시프로필-γ-시클로덱스트린이다. 중추신경계에 대한 펩티드 수송을 위한 시클로덱스트린 유도체를 함유하는 약물 수송 부형제는 Bodor, N 등의 (1992) Science 257 : 1698 - 1700 문헌에 기술되어 있다. 본원에 기술한 β-아밀로이드 조절인자의 경우, 50 - 200 mM 농도의 히드록시프로필-γ-시클로덱스트린 제형내 봉입체는 화합물의 수성 안정성을 증진시킨다. 안정성 증진 이외에, 제형내 시클로덱스트린 유도체의 봉입체는 β-시클로덱스트린 자체가 Aβ 펩티드와 상호작용하며 시험관내에서 원섬유 형성을 저해한다고 보고되었으므로 그외의 다른 이점을 가질 것이다[Camilleri, P. 등의 (1994) FEBS Letters 341 : 256 - 258 문헌 참조]. 따라서, 시클로덱스트린 유도체와 연합하여 본 발명의 조절인자 화합물을 이용함으로써 조절인자를 단독으로 이용하는 것보다 더 큰 Aβ 응집 억제 효과를 얻을 수 있다. 시클로덱스트린의 화학 변형은 본 분야에 공지되어 있다[Hanessian, S. 등의 (1995) J. Org. Chem. 60 : 4786 - 4797 참조]. 본 발명의 조절인자를 함유하는 약학적 조성물의 첨가제로 사용하는 것 이외에, 변형기로 시클로덱스트린 유도체가 유용하며 따라서 본 발명의 조절인자 화합물을 형성하기 위해 Aβ 펩티드 화합물에 공유결합할 수 있다.
뇌 흡수를 높이기 위한 조절인자 화합물에 바람직한 다른 제형은 식염수 내에 계면활성제 트윈-80, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 에탄올을 포함한다. 이러한 제형의 예로 바람직한 것은 식염수내 0.16 % 트윈-80, 1.3 % PEG-3000 및 2 % 에탄올이며, 이에 한정되지는 않는다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 조절인자를 함유하는 약학적 조성물은 조절인자가 혈액뇌장벽(blood brain barrier, BBB)을 가로질러 수송할 수 있도록 제형화된다. BBB 를 가로지르는 수송을 증가시킬 수 있는 것으로 본 분야에 공지된 여러 방법을 본 발명의 조절인자에 맞게 변형시켜 BBB 를 가로질러 조절인자의 수송을 증가시킬 수 있다[이러한 방법에 대한 리뷰는 예를 들어, Pardridge, W.M. (1994) Trends in Biotechnol. 12 : 239 - 245 ; Van Bree, J.B. 등의 (1993) Pharm. World Sci. 15 : 2 - 9 ; 및 Pardridge, W.M. 등의 (1992) Pharmacol. Toxicol. 71 : 3 - 10 을 참조하라]. 조절인자를 화학 변형하여 트랜스멤브레인 수송을 증가시킨 약물전구체를 형성하는 방법도 있다. 적당한 화학 변형은 아미드 결합이나 에스테르 결합을 통해 조절인자에 지방산을 공유결합시키거나[예를 들어, Shashoua 의 미국 특허 번호 제 4,933,324 호 및 PCT 공개 번호 제 WO 89/07938 호 ; Hesse 등의 미국 특허 번호 제 5,284,876 호 ; Toth, I. 등의 (1994) J. Drug Target. 2 : 217 - 239 ; 및 Shashoua, V.E. 등의 (1984) J. Med. Chem. 27 : 659 - 664 참조], 조절인자를 글리케이트화하는 것이다[예를 들어, Poduslo 등의 미국 특허 번호 제 5,260,308 호 참조]. 또한 N-아실아미노산 유도체를 조절인자에 사용하여 "지질" 약물전구체를 형성할 수 있다[예를 들어, Hashimoto 등의 제 5,112,863 호 참조].
BBB 를 가로지르는 수송을 증가시키는 다른 방법은 펩티드 조절인자 또는 펩티드 모의체 조절인자를 다른 펩티드나 단백질에 결합시켜 키메라 단백질을 제조하는 것으로, 다른 펩티드나 단백질은 BBB 를 통한 흡수-매개 또는 수용체-매개 트랜스사이토시스(transcytosis)를 겪게 된다. 따라서, 이러한 다른 펩티드나 단백질을 조절인자에 결합시킴으로써 키메라 단백질이 BBB 를 가로질러 수송된다. 다른 펩티드나 단백질은 뇌모세관 내피 세포 수용체 리간드의 리간드일 수 있다. 예를 들어, 바람직한 리간드는 뇌모세관 내피 세포 상의 트랜스페린 수용체와 특이하게 결합하는 모노클로날 항체이다[예를 들어, Friden 등의 미국 특허 제 5,182,107 호, 제 5,154,924 호 및 PCT 공개 번호 제 WO 93/10819 호, 제 WO 95/02421 호 참조]. BBB 관통을 매개하는 다른 적당한 펩티드 또는 단백질은 히스톤[예를 들어, Pardridge 및 Schimmel 의 미국 특허 제 4,092,505 호 참조], 및 비오틴, 엽산, 나이아신, 판토텐산, 리보플라빈, 티아민, 피리독살 및 아스코르브산과 같은 리간드(예를 들어, Heinstein 의 미국 특허 제 5,416,016 호 및 제 5,108,921 호 참조)를 포함한다. 부가적으로, 글루코스 수송기 GLUT-1 은 BBB 를 가로지르는 수송 글리코펩티드([Met5]엔케팔린의 L-세린일-β-D-글루코시드 유사체)로 보고되었다[Polt, R. 등의 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 7114 - 1778 참조]. 따라서, 조절인자 화합물은 이러한 글리코펩티드에 결합되어 GLUT-1 글루코스 수송기를 표적으로 삼을 수 있다. 예를 들어, 변형기 Aic 로 그것의 아미노 말단을 변형시킨 조절인자 화합물[유리 아미노기를 갖는 콜산의 유도체인 3-(0-아미노에틸-이소)-콜릴]은 표준 방법에 의해 Aic 의 아미노기를 통해 글리코펩티드에 결합할 수 있다. 키메라 단백질은 DNA 재조합 방법(예를 들어, 융합 단백질을 코드하는 키메라 유전자의 형성)에 의해 형성되거나, 키메라 단백질을 형성하는 다른 펩티드나 단백질에 조절인자를 화학적으로 교차결합시킴으로써 형성할 수 있다. 다수의 화학 교차결합제가 본 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 일리노이 록포드 소재 피어스에서 통상적으로 입수가능함). 교차결합제는 다른 펩티드나 단백질에 조절인자를 효율적으로 결합시키고 생물학적으로 활성인 조절인자를 방출시키기 위해 링커를 바로 절단시킬 수 있도록 선택한다. 예를 들어, 비오틴-아비딘 기저 링커계를 사용할 수 있다.
BBB 를 가로지르는 수송을 높이는 또다른 방법은, BBB 를 가로지르는 수송을 매개하는 운반 벡터로 조절인자를 캡슐화하는 것이다. 예를 들어, 조절인자는 양하전된 단층 리포솜(예를 들어 Faden 의 PCT 공개 번호 제 WO 88/07851 호 및 제 WO 88/07852 호 참조) 등과 같은 리포솜이나 중합체성 중심체(예를 들어, Khan 등의 미국 특허 제 5,413,797 호, Mathiowitz 등의 미국 특허 제 5,271,961 호 및 Gombotz 등의 미국 특허 제 5,019,400 호 참조)로 캡슐화 할 수 있다. 더욱이, 운반 벡터(예를 들어, 리포솜)는 BBB 를 가로질러 능동적으로 수송하는 분자 또는 트랜스페린 수용체와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 등과 같은 뇌 내피세포 수용체로 공유적으로 변형시킬 수 있다[예를 들어, Collins 등의 PCT 공개 번호 제 WO 91/04014 호 및 Greig 등의 제 WO 94/02178 호 참조].
BBB 를 가로지르는 조절인자의 수송을 증가시키는 또다른 방법은, 조절인자를 BBB 를 투과할 수 있는 작용을 하는 다른 약물과 함께 공동투여하는 것이다. 이러한 BBB "투과기" 의 예로는 브라디키닌과 브라디키닌 길항물질(예를 들어, Malfroy-Camine 의 미국 특허 제 5,112,596 호 참조) 및 Kozarish 등의 미국 특허 제 5,268,164 호에 기술된 펩티드 화합물을 포함한다.
뇌척수액(CSF)에서의 조절인자 화합물의 시험관내 안정성 및 동물 모델에서의 조절인자 화합물의 뇌흡수 정도를 측정하는 검정은 화합물의 생체내 효율의 전조요인으로 사용할 수 있다. CSF 안정성과 뇌흡수를 측정하는 적당한 검정은 각각 실시예 7 및 8 에 기술되어 있다.
본 발명의 조절인자 화합물은 약학적 조성물로 제형화될 수 있으며, 이때 조절인자는 활성 화합물일 뿐이며, 택일적으로, 약학적 조성물은 부가적인 활성 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 둘 또는 그 이상의 조절인자 화합물을 연합하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조절인자 화합물은 항-아밀로이드원성 특성을 갖는 하나 또는 그 이상의 다른 약물과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 조절인자 화합물은 비-특이 콜린에스테라제 저해제인 타크린(COGNEX(R), 파르케-데이비스)과 배합할 수 있다.
한 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 패키지 제형으로 제공된다. 패키지 제형은 용기내 본 발명의 약학적 조성물 및 알쯔하이머병 등의 β-아밀로이드증 관련 질병을 앓고있는 피검자 치료용 조성물 투여 지시 인쇄물을 포함한다.
Ⅵ. Aβ 조절인자의 이용방법
본 발명의 다른 양상은 천연 β-아밀로이드 펩티드의 신경독성을 억제하거나 응집을 변형시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 있어서, 천연 β 아밀로이드 펩티드는 천연 β 아밀로이드 펩티드의 응집이 변형되거나 천연 β 아밀로이드 펩티드의 신경독성이 억제되도록 β 아밀로이드 조절인자와 접촉시킨다. 바람직한 실시형태에 있어서, 조절인자는 천연 β 아밀로이드 펩티드의 응집을 저해한다. 다른 실시형태에 있어서, 조절인자는 천연 β 아밀로이드 펩티드의 응집을 촉진시킨다. 바람직하게는, 조절인자의 양과 관련하여 β-AP 의 과다 몰량의 응집은 조절인자와의 접촉에 의해 변한다.
본 발명의 방법에 있어서, 천연 β 아밀로이드 펩티드는 시험관내 또는 생체내에서 조절인자와 접촉할 수 있다. 따라서, 용어 "∼와 접촉하다" 는 시험관내에서 천연 β-AP 제제와 조절인자를 항온시키는 것과 생체내에서 천연 β-AP 가 존재하는 부위로 수송하는 것 둘다를 포함한다. 조절인자 화합물이 천연 β-AP 와 상호작용하므로, 조절인자 화합물은 시험관내 또는 생체내에서 천연 β-AP 를 검출하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조절인자 화합물은 생물학적 시료 또는 피검자의 생체내에서 천연 β-AP 가 존재하는 지를 검출하는 진단약으로 사용한다. 또한, 본 발명의 조절인자 화합물을 사용한 천연 β-AP 의 검출은 피검자의 아밀로이드증을 진단하는 데 사용할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 조절인자 화합물이 β-AP 응집을 방해하고 β-AP 신경독성을 저해하기 때문에 조절인자 화합물은 β-아밀로이드증 관련 질병을 예방학적·치료학적으로 치료하는 데 유용하다. 따라서, 본 발명의 조절인자 화합물의 또다른 용도는 천연 β-AP 의 응집 및/또는 신경독성을 변형시키는 치료제로 사용하는 것이다.
한 실시형태에 있어서, 본 발명의 조절인자 화합물은 예를들어, 시험관내 시료(예, 생체액 시료)에서 천연 β-AP 를 검출하여 정량하는 데 사용한다. 검출을 돕기 위해, 조절인자 화합물을 검출가능한 물질로 변형시킬 수 있다. 본 방법에 사용한 천연 β-AP 의 원은 예를들어 뇌척수액 시료(예를 들어, AD 환자, 가계 병력으로 인해 AD 에 민감할 것으로 추정되는 성인 또는 정상 성인으로부터 수득)일 수 있다. 천연 β-AP 시료를 본 발명의 조절인자와 접촉시킨 후, 실시예 2 에 기술한 검정 등에 의해 β-AP 응집을 측정한다. 그런 다음 β-AP 시료의 응집 정도를 β-AP 의 농도가 알려져 있는 조절인자와 유사한 조건으로 접촉시킨 대조 시료의 응집 정도와 비교한 후, 환자가 β-아밀로이드증 관련 질병을 갖는 지 또는 그 질병에 민감한 지 여부의 지수로 결과를 나타낸다. 특히, β-AP 는 조절인자와 결합된 조절기를 검출함으로써 검출할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 조절인자가 결합된 화합물(예, 아미노 말단에 비오틴일화된 β-AP 펩티드)은 검출가능한 물질(예, 과산화효소 등의 효소)로 표지된 스트렙타비딘 또는 아비딘 프로브를 사용하여 검출할 수 있다.
또다른 실시형태에 있어서, 발명의 조절인자 화합물은 예를들어 피검자내 β-아밀로이드증을 진단하는데 도움이 되는 피검자내 천연 β-AP 침착의 생체내 검출, 및 원한다면, 그것을 정량하는데 사용된다. 검출을 용이하게 하기 위하여, 조절인자 화합물을 검출가능한 물질로 변형시킬 수 있는데, 바람직하게는 피검자 생체내에서 검출될 수 있는 99mTc 또는 방사선 요오드(상기에 자세히 기술됨)로 변형시킬 수 있다. 표지된 β-아밀로이드 조절인자 화합물을 피검자에게 투여하고, 아밀로이드 침착 부위에 조절인자가 축적되도록 충분한 시간이 지난 후, 표준 영상 기술로 표지된 조절인자 화합물을 검출한다. 표지된 화합물에 의해 생성된 방사선 신호를 직접적으로 검출할 수 있으며 (예, 전신방사능계측), 또는 대안적으로, 피검자내 아밀로이드 침착을 영상화 하기 위하여 방사선 신호를 방사선사진 또는 컴퓨터 스크린 상의 영상으로 전환시킬 수 있다. 방사선 표지된 단백질을 사용하는 아밀로이드증 영상 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 예를들어, 123I 또는 99mTc 로 방사선 표지된 혈청 아밀로이드 P 성분(SAP)은 전신성 아밀로이드증을 영상화하는데 사용되어 왔다 [예를들어, Hawkins, P.N. 및 Pepys, M.B. (1995) Eur. J. Nucl. Med. 22 : 595 - 599 를 참조하라]. 방사선 요오드의 다양한 이소타입 중 123I (반감기 = 13.2 시간)가 전신섬광촬영술에 사용하는데 바람직하고, 124I (반감기 = 4 일)는 양전자단층촬영(PET)에 사용하고, 125I (반감기 = 60 일)는 물질대사전환 연구에 사용하고, 131I (반감기 = 8 일)는 전신방사능계측 및 지연된 저해상도 영상 연구에 사용한다. 방사선 표지된 SAP 를 사용하는 연구와 유사한, 본 발명의 표지된 조절인자 화합물은 적절한 경로(예, 정맥내, 척수내, 대뇌내)에 의해 예를들어, 약 180 MBq 의 방사능을 지니는 표지된 화합물 100 ㎍ 을 함유하는 단일 농축괴로 피검자에게 투여될 수 있다.
본 발명은 생물학적 시료내 천연 β-아밀로이드 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공하는데, 발명의 화합물과 생물학적 시료를 접촉시키고 천연 β-아밀로이드 펩티드에 결합된 화합물을 검출함으로써 생물학적 시료내 천연 β-아밀로이드 펩티드의 존재 또는 부재를 검출할 수 있음을 포함한다. 한 실시형태에 있어서, β-아밀로이드 조절인자 화합물과 생물학적 시료는 시험관내에서 접촉한다. 다른 실시형태에 있어서, β-아밀로이드 조절인자 화합물을 피검자에게 투여함으로써 β-아밀로이드가 생물학적 시료와 접촉한다. 생체내 투여의 경우, 화합물 을 방사선 테크네튬 또는 방사선 요오드로 표지하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 β-아밀로이드원성 질병의 진단을 용이하게 하기 위한 천연 β-아밀로이드 펩티드를 검출하는 방법도 제공하는데, 발명의 화합물과 생물학적 시료를 접촉시키고 β-아밀로이드원성 질병의 진단을 용이하게 하기 위하여 천연 β-아밀로이드 펩티드에 결합된 화합물을 검출하는 것을 포함한다. 한 실시형태에 있어서, β-아밀로이드 조절인자 화합물과 생물학적 시료는 시험관내에서 접촉한다. 다른 실시형태에 있어서, β-아밀로이드 조절인자 화합물을 피검자에게 투여함으로써 β-아밀로이드가 생물학적 시료와 접촉한다. 생체내 투여의 경우, 화합물을 방사선 테크네튬 또는 방사선 요오드로 표지하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 이러한 방법을 사용하여 알쯔하이머병의 진단을 용이하게 한다.
또다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 천연 β-AP 응집을 변경하고 β-AP 신경독성을 억제하는 방법을 제공하는데, 이는 β-아밀로이드증 관련 질환, 예를들어, 알쯔하이머병을 치료 또는 예방하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 조절인자 화합물은 배양된 신경 세포에 대한 천연 β-AP 응집의 독성을 경감시킬 수 있다. 또한, 조절인자는 미리 형성된 Aβ 원섬유의 신경독성을 경감시키는 능력을 갖는다. 따라서, 본 발명의 조절인자 화합물은 피검자내 신경독성 Aβ 원섬유의 형성을 저해 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있고(예, β-아밀로이드 침착이 되기 쉬운 피검자에서 예방적으로), 이미 β-아밀로이드 침착을 나타내는 피검자내에서 치료학적으로 β-아밀로이드증을 역전시키기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조절인자를 피검자내 존재하는(예, 피검자의 뇌척수액 또는 대뇌내) 천연 β-아밀로이드 펩티드와 접촉시킴으로써 천연 β-AP 의 응집을 변경하고 및/또는 천연 β-AP 의 신경독성을 억제한다. 조절인자 화합물만 단독으로 피검자에게 투여할 수 있고, 대안적으로, 조절인자 화합물을 다른 치료학적 활성제(예, 상기 Ⅳ 부분에 기술된 것과 같은)와 연합하여 투여할 수 있다. 연합 치료를 사용할 경우, 치료 제제는 단일 제약학적 조성물로 공동 투여되거나, 각각의 제약학적 조성물로 따로따로 공동 투여되거나, 연속적으로 투여될 수 있다.
특히 바람직한 실시형태에 있어서, 조절인자가 비경구적으로 투여되는 것이 바람직하고, 피검자의 중추 신경계로 투여되는 것이 가장 바람직하긴 하지만, 조절인자는 피검자내 천연 β-AP 응집을 억제하는데 효과적인 임의의 적절한 경로에 의해 피검자에게 투여될 수 있다. 가능한 CNS 투여 경로는 척수내 투여 및 대뇌내 투여(예, 대뇌혈관내 투여)를 포함한다. 대안적으로는, 화합물을 예를들어, 경구, 복막내, 정맥내 또는 근육내로 투여할 수 있다. 비-CNS 투여 경로의 경우, 화합물은 BBB 를 가로질러 통과할 수 있는 제형으로 투여할 수 있다. 일부 조절인자는 부가적인 변형 없이도 BBB 를 가로질러 통과할 수 있지만, 반면에 그 외의 것들은 상기 Ⅳ 부분에 기술된 것과 같은 변형을 더 필요로 한다.
피검자의 CNS 로 치료 화합물을 수송하는 적절한 방식 및 기구는 본 분야에 공지되어 있는데, 다음을 포함한다 : 대뇌혈관 저장소 [예, 오미야(Ommaya) 또는 리커(Rikker) 저장소 ; 예를들어, Raney, J.P. 등의 (1988) J. Neurosci. Nurs. 20 : 23 - 29 ; Sundaresan, N. 등의 (1989) Oncology 3 : 15 - 22 참조], 초내 수송용 카테터 [예, Port-a-Cath, Y-카테터 등 ; 예를들어 Plummer, J.L. (1991) Pain 44 : 215 - 220 ; Yaksh, T.L. 등의 (1986) Pharmacol. Biochem. Behav. 25 : 483 - 485 참조], 주사가능한 초내 저장소 [예, 스피날제식(Spinalgesic) ; 예를들어, Brazenor, G.A. (1987) Neurosurgery 21 : 484 - 491 참조], 이식가능한 주입 펌프 시스템 [예, 인퓨사이드 (Infusaid) ; 예를들어, Zierski,J. 등의 (1988) Acta Neurochem. Suppl. 43 : 94 - 99 ; Kanoff, R.B. (1994) J. Am. Osteopath. Assoc. 94 : 487 - 493 참조] 및 삼투 펌프(알자 코포레이션에서 시판). 특히 바람직한 투여 방식은 이식가능하고 외부 프로그램 가능한 주입 펌프를 통하는 것이다. 적절한 주입 펌프 시스템과 저장소 시스템은 또한 Blomquist 의 미국 특허 번호 제 5,368,562 호 및 파마시아 델테크 인코포레이티드, Doan 의 미국 특허 번호 제 4,731,058 호에 기술되어 있다.
생체내 β-AP 응집을 변경시키는 발명의 방법, 특히 β-AP 응집을 억제하는 방법은 비정상적인 β-아밀로이드 응집 및 침착과 관련된 질환에 치료학적으로 사용하여 β-아밀로이드 침착 속도를 늦추고 및/또는 β-아밀로이드 침착의 정도를 줄임으로써 질병의 진행을 개선하는데 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 이러한 방법은 알쯔하이머병을 치료하기 위해 사용된다(예를들어, AD 증상을 나타내는 개인 및 가족성 AD 에 걸리기 쉬운 개인 둘 다를 포함하는 산발성 또는 가족성 AD). 또한 본 방법은 다운 증후군 및 더치 타입 아밀로이드증을 수반하는 유전성 뇌출혈(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis-Dutch-type ; HCHWA-D) 환자내 β-아밀로이드 침착과 같은 다른 임상적 발생을 예방적 또는 치료학적으로 치료하기 위하여 사용될 수도 있다. β-AP 응집을 억제하는 것이 바람직한 치료 방법이긴 하지만, β-AP 응집을 조정하는 조절인자도 신경학적 장애를 일으키지 않는 장소에 β-AP 부골형성을 함으로써 치료학적으로 유용할 것이다.
또한, 근섬유내 β-아밀로이드 전구체 단백질의 비정상적인 축적은 산발성 봉입체근염(IBM)의 병리학에 관련되어 있다[Askana, V. 등의 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 1314 - 1319 ; Askanas, V. 등의 (1995) Current Opinion in Rheumatology 7 : 486 - 496]. 따라서, 본 발명의 조절인자는, 근섬유로 조절인자를 방출하여 IBM 을 치료하는 것과 같이 비-신경학적 위치에 비정상적으로 침착된 β-AP 또는 APP 질병을 예방적 또는 치료학적으로 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 제한하려는 의도가 아닌 하기 실시예들에 의해 더 자세히 설명된다. 천연 β-아밀로이드 펩티드 응집을 변경하고 및/또는 천연 β-아밀로이드 펩티드의 신경독성을 억제하는 하기 기술된 검정에서의 조절인자의 능력으로 생체내에서 동일한 기능을 수행하는 조절인자의 능력을 예측한다.
본 발명은 제한하려는 의도가 아닌 하기 실시예들에 의해 더 자세히 설명된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용 뿐만 아니라 도면들은 본원에서 참고적으로 사용되었다.
실시예 1 : D-아미노산을 포함하는 β-아밀로이드 조절인자 화합물의 제조
D-아미노산을 포함하는 β-아밀로이드 조절인자는 예를들어, 다음과 같은 Nα-9-플루오렌일메틸옥시카르보닐(FMOC)-기제 보호 전략을 사용하는 고체-상 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 2.5 mmol 의 FMOC-D-Val-왕수지로 시작하여, 4-배 초과 보호된 아미노산, 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt) 및 디이소프로필카르보디이미드(DIC)를 사용하여 각 아미노산을 차례로 첨가한다. 필요하다면 재커플링을 실시하면서 커플링 후 수지의 닌히드린 테스트에 의해 측정한다. 각각의 합성 주기는 최소한 다음과 같다 : 3 분간 탈보호 [25 ％ 피페리딘/N-메틸-피롤리돈(NMP)], 15 분간 탈보호, 1 분간 NMP 세척 5 회, 60 분간 커플링 주기, NMP 세척 5 회 및 닌히드린 테스트. N-말단 변형을 위하여, FMOC-D-아미노산 대신 N-말단 변형 시약을 사용하고 상기 프로토콜에 의해 완전히 결합된 펩티드-수지 700 ㎎ 과 커플링한다. 트리플루오로아세트산(TFA)(82.5 ％), 물(5 ％), 티오아니솔(5 ％), 페놀(5 ％), 에탄에디티올(2.5 ％)로 2 시간 동안 처리하여 수지로부터 펩티드를 제거한 후 차가운 에테르에서 펩티드를 침전시킨다. 원심분리하여 (2400 rpm x 10 분) 고체를 펠릿화하고 에테르를 분리한다. 고체를 에테르에 재현탁하고 펠릿화하여 상 층액을 분리한다. 고체를 10 ％ 아세트산에 용해시키고 건조시키기 위해 냉동건조한다. 예비 정제 및 차후의 분석적 특성화를 위하여, 60 ㎎ 의 고체를 25 ％ 아세토니트릴(ACN)/0.1 ％ TFA 에 용해시키고 C18 역상 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 컬럼에 적용시킨다.
대안적으로, D-아미노산을 포함하는 β-아밀로이드 조절인자는 0.25 mmol 규모 합성을 위하여 제조업자에 의해 만들어진 자동 프로토콜을 사용하는 라이닌 PS3 펩티드 합성기(Rainin PS3 peptide synthesizer) 상에서 제조할 수 있다. 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-우로늄-헥사플루오로-포스페이트(HBTu)/FMOC-D-아미노산 4-배 초과 0.4 M N-메틸모르폴린(NMM)/디메틸포름아미드(DMF)를 사용하여 60 분간 커플링을 실시한다. 커플링 사이에, 20 ％ 피페리딘/DMF 와 20 분간 반응시켜 FMOC 군을 제거한다. 95 ％ TFA/물로 1 시간 동안 처리하여 수지로부터 펩티드를 제거하고 에테르에 침전시킨다. 펠릿을 40 ％ 아세토니트릴/물에 재현탁하고 냉동건조한다. 필요하다면, 바이닥 C18 컬럼(Vydac C18 column ; 21 x 250 ㎜) 상에서 15 ％ - 50 ％ 아세토니트릴을 사용하는 예비 HPLC 하여 60 분에 걸쳐 정제한다.
N-말단이 변형된 다양한 β-아밀로이드 조절인자 화합물은 표준 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 완전히 보호된 수지와 결합된 펩티 드를 적절한 수지 상에서 상기 기술한 바와 같이 제조하여 카르복시 말단 아미노산을 수득한다. 각 펩티드 수지의 적은 부분 (예, 13 - 20 μ㏖)을 분리된 반응 용기로 등분한다. 각 시료의 N-말단 FMOC 보호기를 NMM 내 20 ％ 피페리딘을 사용하여 표준 방법으로 제거하고 DMF 로 광범위하게 세척한다. 펩티드-수지 시료 각각의 탈보호된 N-말단 α-아미노기는 하기 방법들 중 하나를 사용하여 변형될 수 있다 :
방법 A, 자유 카르복시산기를 함유하는 변형 시약의 커플링 : 변형 시약(5 당량)을 NMP, DMSO 또는 이들 두 용매의 혼합물에 미리 용해한다. HOBT 및 DIC (각 시약의 5 당량)를 용해된 변형기에 첨가하고 결과적인 용액을 1 당량의 자유-아미노 펩티드-수지에 첨가한다. 밤새 커플링을 실시한 다음 세척한다. 펩티드-수지의 적은 시료 상에서의 닌히드린 테스트가 커플링이 완전하지 않음을 보여준다면, HOBt 대신에 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)을 사용하여 커플링을 반복한다.
방법 B, 미리 활성화된 형태로 수득된 변형 시약의 커플링 : 변형 시약 (5 당량)을 NMP, DMSO 또는 이들 두 용매의 혼합물에 미리 용해하고 1 당량의 펩티드-수지에 첨가한다. 디이소프로필에틸아민(DIEA ; 6 당량)을 활성화된 변형기 및 펩티드-수지의 현탁액에 첨가한다. 밤새 커플링을 실시한 다음 세척한다. 펩티드-수지의 적은 시료 상에서 의 닌히드린 테스트가 커플링이 완전하지 않음을 보여준다면, 커플링을 반복한다.
두번째 커플링(필요하다면) 후, N-말단이 변형된 펩티드-수지를 감압하여 건조시키고 상기 기술한 바와 같이 곁사슬 보호기를 제거하여 수지로부터 분리한다. 밀리포어 세프-팩 카트리지(Millipore Sep-Pak cartridges) 또는 예비 역상 HPLC 를 사용하여 정제한 결과적인 조펩티드 (crude peptide)에 주 생성물이 존재함을 확인하기 위하여 분석적 역상 HPLC 를 사용한다. 생성물내에 원하는 화합물이 존재하는지를 확인하기 위하여 질량분석법 또는 고-필드 핵자기공명분광법을 사용한다.
방법 C, 브로모아세틸 펩티드 중간체를 사용하는 N-말단-알킬 치환된 펩티드의 제조 : 수지-결합 펩티드는 DMF 내 1,3-디이소프로필카르보디이미드 (DIC) (13 당량)와 함께 브로모아세트산 (12 당량)에 커플링할 수 있다. 결과적인 브로모아세틸 치환된 펩티드는 메틸아민, 에틸아민, 프로필아민, 이소프로필아민 및 피페리딘을 포함하는 1 차 또는 2 차 아민과의 반응하에 변형될 수 있다. 반응은 60 ％ DMSO/DMF 에서 수행되고 일반적으로 24 시간 후에 완전히 이뤄진다.

방법 D, 환원성 알킬화를 통한 N-말단-알킬 치환된 펩티드의 제조 : 펩티드를 0 - 10 ％ 메탄올을 함유하는 물에 용해시킨 후(또는 부분적으로 용해시킴), 알데히드(5 - 8 당량) 및 소듐시아노보로하이드라이드(10 - 16 당량)와 반응시킨다. 당량수는 알데히드의 타입 및 원하는 치환 정도에 맞출 수 있다. 결과적인 용액의 pH 는 1 M HCl 로 2 에 맞추고 1 시간 동안 pH 2 를 유지한다. HPLC 로 반응을 모니터하는데, 반응은 보통 2 시간이면 완전히 이뤄진다. 반응 혼합물을 실온에서 농축하고 HPLC 정제한다.
방법 E, C-말단 변형 : 표준 Fmoc 화학을 사용하여 2-클로로트리틸 수지 상에서 펩티드를 합성하는데, 결합된 최종 D-아미노산기는 Boc 보호된다. 8/1/1 의 디클로로메탄(DCM)/아세트산/트리플루오로에탄올을 사용하여 펩티드를 수지에서 제거하고 혼합물을 농축한다. 펩티드 잔기를 20 ％ 아세토니트릴에 용해한 후, 냉동하여 밤새 냉동건조한다. 염기성 조건하에서(pH = 11, DIEA 로 조정) BOC 보호된 조펩티드 산을 1-히드록시-7-아조벤조트리아졸(HOAt) 및 DIC 각각 1 당량과 함께 아민에 커플링한다. 밤새 교반한 후 반응이 완전히 이뤄진 후, 펩티드를 물로 침전한다. BOC 기는 DCM 내 25 ％ TFA 와 1 시간 동안 반응시켜 제거하고 펩티드는 HPLC 정제한다.
실시예 2 : β-아밀로이드 응집 검정
β-아밀로이드 조절인자 화합물이 천연 β-AP 와 결합할 때 천연 β-AP 의 응집을 조절하는 (예, 억제 또는 증진) 능력을 하기 기술된 응집 검정 중 하나 또는 둘 다에서 조사될 수 있다. 응집 검정에 사용하는 천연 β-AP (β-AP1-40)는 바켐(미국 캘리포니아 토랜스 소재)에서 통상적으로 입수가능하다.
A. 핵생성 검정
단량체 β-AP 로부터의 β-AP 섬유 형성에 있어 초기 결과를 변경(예, 억제)하는 실험 화합물의 능력을 측정하기 위하여 핵생성 검정을 실시한다. 핵생성된 중합반응 메카니즘의 특징인 지체 시간(lag time)이 핵생성 전에 관찰되고, 그 후에 펩티드는 혼탁도 상에서의 선형 상승을 반영하여 섬유를 빠르게 형성한다. β-AP 단량체의 중합반응 전 지체 시간은 빛 산란법(혼탁도)에 의해 용해되지 않은 섬유의 형성 정도를 측정할 수 있다. 최대 혼탁도가 불변기에 도달할 때 중합반응은 평형에 도달한다. 다양한 농도의 β-아밀로이드 조절인자 화합물의 존재 또는 비존재하의 천연 β-AP 용액의 혼탁도는 일정 시간에 걸쳐 405 ㎚ 에서 용액의 명백한 흡광도를 측정하여 결정된다. 혼탁도 측정에 대한 감도 한계치는 15 - 20 μM β-AP 범위이다. 조절인자가 없는 경우의 혼탁도와 비교하여, 조절인자 존재하에 일정 시간에 걸쳐 혼탁도가 감소하는 것은 조절인자가 β-AP 로부터 β-AP 섬유의 형성을 억제한다는 것을 시사한다. 이러한 검정은 중합반응을 가속화하기 위하여 교반 또는 진탕하며 실시하고, 그로인해 검정의 속도가 빨라진다. 또한 다중의 화합물을 스크린하기 위해 96-웰 플레이트 포맷으로 검정을 실시할 수도 있다.
핵생성 검정을 실시하기 위해, 먼저 Aβ1-40 펩티드를 2 ㎎ 펩티드/㎖ 의 농도로 HFIP(1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 ; 알드리치 10, 522 - 8)에 용해시키고 실온에서 30 분간 항온한다. HFIP-용해된 펩티드를 5 분간 수조 초음파발생장치에서 최고강도 세팅으로 초음파처리한 다음, 아르곤 하에서 건조를 위해 증발시킨다. 펩티드 필름을 6.9 ㎎/㎖ (25x 농도)의 농도로 무수 디메틸술폭시드(DMSO)에 재현탁하고, 먼저와 같이 5 분간 초음파처리한 다음, 0.2 미크론 나일론 시린지 필터(VWR cat. No. 28196 - 050)를 통해 여과한다. 실험 화합물을 DMSO 에 100x 농도로 용해한다. DMSO 에 용해된 4 부피의 25x Aβ1-40 펩티드와 DMSO 에 용해된 1 부피의 실험 화합물을 유리병 안에서 결합시키고, 실험 화합물에 대한 Aβ 펩티드의 몰 비율을 1 : 1 로 생성하도록 혼합한 다. 다른 몰 비율의 경우에 있어서, 최종 DMSO 및 Aβ1-40 농도 계수를 유지하기 위하여 Aβ1-40 에 첨가하기 전에 실험 화합물을 DMSO 로 희석한다. 대조 시료는 실험 화합물을 함유하지 않는다. 10 ㎕ 의 혼합물을 코닝 코스타 울트라 로우 바인딩 96-웰 플레이트(미국 메사추세츠 캠브리지 소재의 코닝 코스타에서 입수 ; cat. No. 2500)의 웰 바닥에 첨가한다. 90 ㎕ 의 물을 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30 초간 회전식 진탕기에서 일정 속도로 진탕하고, 100 ㎕ 의 2x PTL 완충액 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 7.4)을 추가로 웰에 첨가하고, 플레이트를 30 초간 재진탕하고, 바이오-래드 모델 450 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405 ㎚ 에서 흡광도를 측정함으로써 기준(t = 0) 혼탁도 값을 얻는다. 그런다음 플레이트를 진탕기에 다시 넣어 5 시간 동안 계속해서 진탕시킨다. 15 분 간격으로 혼탁도 값을 측정한다.
어떠한 조절인자도 없는 경우의 β-아밀로이드 응집은 천연 β-AP 용액의 혼탁도를 증가시키는 결과를 낳는다(즉, 일정 시간 동안 405 ㎚ 에서의 흡광도가 증가함). 따라서, 효과적인 억제 조절인자 화합물을 포함하는 용액은 조절인자 화합물이 없는 대조 시료에 비하여 감소된 혼탁도를 보여준다(즉, 대조 시료와 비교하여 일정 시간 동안 405 ㎚ 에서의 흡광도가 더 낮음).
β-아밀로이드 응집을 정량하기 위해 혼탁도를 사용하는 것 이외에, 핵생성 검정에 있어서 β-아밀로이드 응집을 정량하기 위해 티오플라빈 T(Th-T)의 형광도 사용할 수 있다(β-아밀로이드 응집의 정량을 위한 Th-T 형광의 사용은 시드 확대 검정에 대해 기술된 하기에 더 자세히 기술되어 있다).
B. 원섬유 결합 검정
원섬유 결합 검정을 위하여 다음 물질들이 필요하다 : 밀리포어 멀티필터 기구 ; 12 x 75 유리 튜브 ; GF/F 25 ㎜ 유리 필터 ; 4 ℃ 의 PBS/0.1 ％ 트윈 20 (PBST) ; Aβ 원섬유 ; 방사선 화합물 ; 비방사선 화합물 ; 팁이 있는 에펜도르프 리피트 피펫터 ; 라벨 ; 집게 ; 및 진공.
본 검정에 있어서, 각 시료는 3 벌로 실험한다. 4 ％ DMSO/PBS 에 용해된 200 μM Aβ1-40 펩티드 용액 1 ㎖ 분취량을 37 ℃ 에서 흔들며 8 일간 미리 숙성시켜서 약 8 일 "숙성된(aged)" Aβ 원섬유를 먼저 제조한다. 이렇게 "숙성된" Aβ 펩티드는 세포에 바로 실험하거나 -80 ℃ 로 냉동시킬 수 있다.
200 μM Aβ 원섬유를 PBST 에 희석하여 4 μM 용액(16 ml PBST 내 320 ㎕)을 수득한다. 이 용액의 100 μL 분취량을 리피트 피펫터로 각 튜브에 첨가한다.
본 발명의 β-아밀로이드 조절인자 화합물을 다음과 같이 2 μM - 200 fM 희석하여 제조한다 :
5 mM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 1.6667 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
1.6667 mM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 0.5556 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
555.556 μM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 185.19 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
185.185 μM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 61.728 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
61.728 μM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 20.576 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
20.576 μM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 6.8587 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
6.859 μM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 2.2862 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
2.286 μM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 0.7621 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
762.079 nM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 254.03 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
254.026 nM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 84.675 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
84.675 nM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 28.225 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
28.225 nM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 9.4084 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
9.408 nM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 3.1361 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
3.136 nM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 1.0454 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
1.045 nM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 0.3485 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
348.459 pM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 116.15 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
116.153 pM 저장액을 DMSO 에 1 : 3 으로 희석하여 38.718 저장액을 수득함 (400 ㎕ DMSO 내 200 ㎕).
185.185 μM 저장액을 PBST 에 1 : 25 로 희석하여 7.4074 를 수득함(1.2 mL PBST 내 50 μL).
61.728 μM 저장액을 PBST 에 1 : 25 로 희석하여 2.4691 을 수득함(1.2 mL PBST 내 50 μL).
20.576 μM 저장액을 PBST 에 1 : 25 로 희석하여 0.823 을 수득함(1.2 mL PBST 내 50 μL).
6.859 μM 저장액을 PBST 에 1 : 25 로 희석하여 0.2743 을 수득함(1.2 mL PBST 내 50 μL).
2.286 μM 저장액을 PBST 에 1 : 25 로 희석하여 0.0914 를 수득함(1.2 mL PBST 내 50 μL).
762.079 nM 저장액을 PBST 에 1 : 25 로 희석하여 30.483 을 수득함(1.2 mL PBST 내 50 μL).
254.026 nM 저장액을 PBST 에 1 : 25 로 희석하여 10.161 을 수득함(1.2 mL PBST 내 50 μL).
84.675 nM 저장액을 PBST 에 1 : 25 로 희석하여 3.387 을 수득함(1.2 mL PBST 내 50 μL).
28.225 nM 저장액을 PBST 에 1 : 25 로 희석하여 1.129 를 수득함(1.2 mL PBST 내 50 μL).
9.408 nM 저장액을 PBST 에 1 : 25 로 희석하여 0.3763 을 수득함(1.2 mL PBST 내 50 μL).
3.136 nM 저장액을 PBST 에 1 : 25 로 희석하여 0.1254 를 수득함(1.2 mL PBST 내 50 μL).
1.045 nM 저장액을 PBST 에 1 : 25 로 희석하여 0.0418 을 수득함(1.2 mL PBST 내 50 μL).
348.459 pM 저장액을 PBST 에 1 : 25 로 희석하여 13.938 을 수득함(1.2 mL PBST 내 50 μL).
116.153 pM 저장액을 PBST 에 1 : 25 로 희석하여 4.6461 을 수득함(1.2 mL PBST 내 50 μL).
그런다음 β-아밀로이드 조절인자 화합물(200 μL)을 Aβ 원섬유를 함유하는 적당한 튜브에 첨가한다.
방사선적으로 표지된 β-아밀로이드 조절인자 화합물은 표준 방사선 안전 프로토콜을 사용하여 PBS/0.1 ％ 트윈-20 용액으로 희석하여 최종 농도가 20,000 dpm/100 μL 가 되게 제조한다. 방사선적으로 표지된 β-아밀로이드 조절인자 화합물의 100 ㎕ 분취량을 리피트 피펫터를 사용하여 각 튜브에 첨가한다. 시료를 파라필름으로 감싸고 플라스틱 방사선 백 안에 37 ℃ 로 밤새 항온한다.

시료를 여과하기 위하여, 필터를 적은 부피의 PBST 에 미리 적셔둔다. 2 밀리포어 다중여과 기구는 제조자의 지시에 따라 각 여과 슬롯에 GF/F 필터를 넣어 셋팅한다. 37 ℃ 항온기에서 시료를 꺼내서 각 시료를 적은 부피의(∼5 ml) 차가운 PBST 완충액을 사용하여 여과한다. 그런다음 시료 튜브를 부가적인 5 mL 의 차가운 PBST 완충액으로 2 번 세척한다. 마지막 시료를 첨가한 후 반 건조 필터가 되도록 진공상태에 약 2 분간 두고, 필터를 요오드화 계수를 위해 표지된 튜브로 옮긴다. 1 분 계수를 기록하여 데이터를 도표화하고, 그래프를 분석하기 위해 제조자의 지시를 따라 프리즘 프로그램(GraphPAD)을 사용한다.
C. 시드 확대 검정
시드 확대 검정은 중합체성 Aβ 섬유 "시드(seed)" 의 첨가 후 Aβ 단량체 용액내 형성된 Aβ 섬유의 속도를 측정하는데 사용될 수 있다. 이미 침착된 아밀로이드 이외에 단량체성 Aβ 이 더 침착되는 것을 예방하는 실험 화합물의 능력은 형광을 사용하는 β-시트 형태의 직접 표시기를 사용하여 측정한다. 핵생성 검정과는 반대로, 시드를 첨가하면 핵생성이 즉시 일어나고 지속적으로 혼합하지 않아도 미리 형성된 원섬유의 성장을 지속시키므로, 중합반응 시작 전의 지체 시간이 없어지는 결과를 낳는다. 이러한 검정은 정적인 중합반응 조건을 사용하므로, 핵생성 검정에서 양성 활성을 보이는 화합물을 다른 조건하에서 부가적인 아밀로이드 구조의 프로브로 이러한 2 차 검정을 실시하여 확인할 수 있다.
시드 확대 검정에 있어서, 단량체성 Aβ1-40 은 "시드" 핵의 존재하에 항온한다(조절된 정적 조건하에서 미리 중합반응 되도록 허용된 Aβ 의 약 10 몰 ％). 그런다음 용액의 시료를 티오플라빈 T(Th-T)에 희석한다. Th-T 와 Aβ 와의 중합체-특이 결합은 원섬유 형성의 정도를 측정하는 형광 복합체를 생산한다[Levine, H. (1993) Protein Science 2 : 404 - 410]. 중합체성 β-AP 또는 느슨하게 결합된 β-AP 이외의, 응집된 β-AP 와 Th-T 의 결합은 자유 염료에 대한 385 nm(여기 ; ex) 및 445 nm(방출 ; em)와 비교하여 최대 450 nm 에서 새로운 여기(ex) 및 482 nm 에서 증가된 방출(em)을 일으킨다. 중합반응 혼합물의 적은 분취량은 반복되는 샘플링에 의해 반응 혼합물을 모니터할 수 있도록 하는 Th-T 와 혼합된 원섬유를 충분히 함유한다. 단량체가 초과 존재하는 경우, 선형 생장 곡선이 관찰된다. β-시트 원섬유에 반응하는 티오플라빈 T 의 형성은 핵생성 검정을 사용하여 관찰된 혼탁도의 증가와 유사하다.
시드 확대 검정에 사용하는 Aβ 단량체 용액은 1/25 부피의 디메틸술폭시드(DMSO)에 적절한 양의 Aβ1-40 펩티드를 용해시킨 다음, 1/2 부피의 물 및 1/2 부피의 2x PBS (10x PBS : NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4·7H2 O 4.3 mM, KH2PO4 1.4 mM, pH 7.2)에 용해시켜 200 μM 의 최종 농도로 제조한다. 저장 시드를 제조하기 위하여, 1 ㎖ 의 Aβ 단량체 제제를 약 8 일간 37 ℃ 에서 항온하고 차례로 18, 23, 26 및 30 게이지 바늘을 통해 각각 25, 25, 50 및 100 회 시어링한다. 형광 유닛(FU) 불변기(약 100 - 150x)까지 30 게이지 바늘을 매 50 회 통과한 후 형광 측정을 위해 시어링된 물질의 2 ㎕ 시료를 수집한다. 실험 화합물은 1x PBS 에 적절한 양의 펩티드를 용해시켜 1 mM (10x 저장액)의 최종 농도로 제조한다. 만일 용해되지 않는다면, 화합물을 1/10 부피의 DMSO 에 용해시키고 1x PBS 로 1 mM 로 희석한다. 또한 100 μM 및 10 μM 둘 다에서 각각의 후보자를 실험하기 위해 1/10 희석액을 더 제조한다.
시드 확대 검정을 실시하기 위하여, 각 시료에 50 ㎕ 의 200 μM 단량체, 125 FU 시어드 시드(시드의 뱃치에 따라 다양한 양, 일반적으로 3 - 6 ㎕) 및 10 ㎕ 의 10x 조절인자 용액을 첨가한다. 그런다음 1x PBS 로 시료의 부피를 100 ㎕ 의 최종 부피로 맞춘다. 2 가지 농도의 각 조절인자가 전형적으로 실험된다 : 100 μM 및 10 μM, 조절인자에 대한 단량체의 몰 비율은 1 : 1 및 1 : 10 에 상당한다. 이 검정은 6 시간 동안 37 ℃ 로 항온하는데, 형광 측정을 위해 매 시간마다 2 ㎕ 의 시료를 수집한다. 형광을 측정하기 위하여, 2 ㎕ 의 Aβ 시료를 400 ㎕ 의 티오플라빈-T 용액(50 mM 인산칼륨, 10 mM 티오플라빈-T, pH 7.5)에 첨가한다. 시료를 볼텍싱하고, EX 450 nm 및 EM 482 nm 에서 5 ml 의 마이크로 수정 큐벳에 넣어 판독한다(히타치 4500 플루오리메터).
β-아밀로이드 응집은 티오플라빈-T 의 증가된 방출 결과로 나타난다. 따라서, 효과적인 억제 조절인자 화합물을 포함하는 시료는 조절인자 화합물이 없는 대조 시료와 비교하여 감소된 방출을 나타낸다.
실시예 3 : β-아밀로이드 조절인자 화합물의 분석
본 실시예에서는, 본원에 기술된 β-아밀로이드 조절인자 화합물을 제조하고, 실시예 2 에 기술된 바와 같이 응집 검정을 사용하여 천연 β-아밀로이드 펩티드의 응집을 억제하는 그것의 능력을 실험한다. 실험의 첫번째 시리즈 결과는 하기 표 1, 2 및 3 에 요약되어 있다.
Figure 112001022012147-pct00009
Figure 112001022012147-pct00010
Figure 112001022012147-pct00011
조절인자 화합물은 5μM 의 Aβ1-40 및 5μM, 2.5μM, 1.25μM, 3μM, 1μM 또는 0.3μM 의 실험 화합물을 사용하는 핵생성 검정으로 평가하였다. 지체 시간의 변화(△ Lag)는 실험 화합물(5μM, 2.5μM, 1.25μM, 3μM, 1μM 또는 0.3μM 에서)의 존재시 관찰된 지체 시간을 대조 화합물의 지체 시간에 대한 비율로 나타내었다.
Figure 112001022012147-pct00012
Figure 112001022012147-pct00013
PPI-1801 은 문헌에 보고되어 있는 H-LPFFD-OH 의 아세틸 아미드 유사체이다. 이 화합물은 비교를 목적으로 제조되고 활성도에 대해 실험되었다. 본원에 사용된 검정에서 이 화합물은 원섬유와 불충분하게 결합하는 결과를 나타낸다.
반대로, 표 1, 2 및 3, 및 도 2 에 나타난 결과는 발명의 β-아밀로이드 조절인자가 Aβ 응집의 효과적인 억제제임을 증명한다.
실시예 6 : 신경독성 검정
β-아밀로이드 조절인자의 존재 또는 부재시에 천연 β-아밀로이드 펩티드 응집체의 신경독성은 랫 또는 인체 신경-유래 세포주(각각 PC-12 세포 또는 NT-2 세포) 및 생존도 지시제 3-(4,4-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드(MTT)를 사용하여 세포-기저 검정을 시험할 수 있다[예를들어, Shearman, M.S. 등의 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 1470 - 1474 ; 유사한 세포-기저 생존도 검정을 기술한 Hansen, M.B. 등의 (1989) J. Immun. Methods 119 : 203 - 210 참조]. PC-12 는 랫 부신 크롬친화성세포종 세포주이고 미국 매릴랜드 로크빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에서 입수가능하다(ATCC 제 CRL 1721 호). MTT (시그마 케미컬 코포레이션에서 상업적으로 입수가능함)는 생존하는 세포에서 노란색에서 푸른색으로 바뀌는 색소 기질로서, 분광광도측정법으로 검출할 수 있다.
천연 β-아밀로이드 펩티드의 신경독성을 실험하기 위하여, 갓 제조한 Aβ 단량체의 저장 용액 및 숙성된 Aβ 응집체를 먼저 제조한다. 냉동건조된 분말로부터 100 ％ DMSO 내 Aβ1-40 을 제조하고, 곧바로 최종 부피의 1/2 인 H2O 로 희석한 다음 최종 부피의 1/2 인 2x PBS 로 희석하여 최종 농도 200 μM 펩티드, 4 ％ DMSO 를 얻는다. 이런식으로 제조되고 세포에 즉시 실험된 펩티드를 "갓 제조한(fresh)" Aβ 단량체로 명명한다. "숙성된" Aβ 응집체를 제조하기 위하여, 펩티드 용액을 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 넣어서 원섬유가 형성되도록 8 일간 37 ℃ 로 항온한다. 이러한 "숙성된" Aβ 펩티드는 세포에 곧바로 실험할 수 있거나 또는 -80 ℃ 에 냉동할 수 있다. PC12 및 NT2 세포를 사용하여 갓 제조한 단량체 및 숙성된 응집체의 신경독성을 실험한다. PC12 세포는 10 ％ 말 혈청, 5 ％ 우태아 혈청, 4 mM 글루타민 및 1 ％ 젠타마이신을 함유하는 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM)에서 일반적으로 배양한다. NT2 세포는 10 ％ 우태아 혈청, 2 mM 글루타민 및 1 ％ 젠타마이신으로 보충된 OPTI-MEM 배지(깁코 비알엘 CAT. # 31985)에서 일반적으로 배양한다. 처리 3 - 4 시간 전에 96-웰 조직 배양 플레이트내 90 ㎕ 의 갓 제조한 배지에 10 - 15,000 세포/웰로 세포를 평판한다. 그런다음 갓 제조한 Aβ 펩티드 또는 숙성된 Aβ 펩티드 용액(10μL)을 조직 배양 배지에 직접 1 : 10 으로 희석하여 최종 농도가 1 - 10 μM 펩티드 범위가 된다. 세포를 배지의 교환없이 48 시간 동안 37 ℃ 에서 펩티드의 존재하에 배양한다. 마지막 3 시간 동안 세포를 β-AP 제제로 노출하기 위하여, 1 ㎎/㎖ 의 최종 농도로 배지에 MTT 를 첨가하고 37 ℃ 에서 계속 항온한다. MTT 첨가하고 2 시간 후, 배지를 제거하고 세포를 교반하며 100 μL 의 이소프로판올/0.4 N HCl 에 용균시킨다. 동 부피의 PBS 를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 10 분간 더 교반한다. 생존 세포를 정량하기 위해 미량역가 플레이트 리더를 사용하여 570 nm 에서 각 웰의 흡광도를 측정한다.
본 검정을 사용하여, 숙성된(5 일 또는 8 일) Aβ1-40 응집체만 신경독성(갓 제조한 Aβ1-40 단량체는 아님)이 확인되었다. 이는 증가된 양의 갓 제조한 Aβ1-40 단량체와 신경 세포를 배양하면 세포에 심각한 독성을 미치지 않으나, 반면에 증가된 양의 5 일 또는 8 일 숙성된 Aβ1-40 응집체와 세포를 배양하면 신경독성의 양을 증가시킴을 증명한다. 숙성된 Aβ1-40 응집체의 독성에 대한 EC50 은 PC12 세포 및 NT2 세포 둘 다에서 1 - 2 μM 이었다.
Aβ1-40 응집체의 신경독성에 대한 β-아밀로이드 조절인자 화합물의 효과를 측정하기 위하여, 실시예 2 에 기술된 바와 같은 조건 및 항온 후 특정 시간 간격으로 표준 핵생성 검정하에 Aβ1-40 단량체와 예비항온하고, β-AP/조절인자 용액의 분취량을 옮기고 1) 응집을 측정하여 용액의 혼탁도를 평가하고 2) 용액의 신경독성을 측정하기 위해 MTT 를 사용하여 세포 생존도를 평가하는 48 시간 동안 용액을 배양된 신경 세포에 첨가한다. 또한, 미리 형성된 Aβ1-40 응집체의 신경독성을 감소시키는 β-아밀로이드 조절인자 화합물의 능력도 평가될 수 있다. 이러한 실험에 있어서, Aβ1-40 응집체는 어떠한 조절인자도 없는 조건하에서 단량체를 항온하여 미리형성한다. 그런다음 β-AP/조절인자 용액을 수집하고 상기 기술한 바와 같이 그것의 신경독성을 평가한 후, 조절인자 화합물을 37 ℃ 에서 24 시간 동안 미리형성된 Aβ1-40 응집체와 항온한다.
실시예 7 : 뇌척수액내 조절인자 화합물 안정성의 검정
뇌척수액(CSF)내 조절인자 화합물의 안정성은 다음과 같은 시험관내 실험으로 검정할 수 있다. CSF 용액은 75 ％ 붉은털 원숭이 CSF(노던 바이오메디컬 리서치에서 상업적으로 입수가능함), 23 ％ 인산염 완층 된 살균한 식염수 및 2 ％ 디메틸술폭시드(v/v)(알드리치 케미컬 코포레이션, 카탈로그 번호 27,685 - 5)를 함유하여 제조한다. 실험 조절인자 화합물을 CSF 용액에 첨가하여 40 μM 또는 15 μM 의 최종 농도가 된다. 모든 시료의 조작은 층류 후드에서 실시하고 실험 용액은 검정하는 동안 37 ℃ 로 유지한다. 24 시간 후, 최종 농도를 25 ％ (v/v)로 맞추는 아세토니트릴을 첨가하여 용액내 효소 활성을 일시적으로 중단시킨다. 역상 HPLC 를 사용하여 시료를(0 시 포인트 및 24 시 포인트) 실온에서 분석한다. 감도를 최대화하기 위해 마이크로보어 컬럼을 사용한다. 분석 HPLC 를 위한 파라미터는 다음과 같다 :
용매계
A : 물에 용해된 0.1 ％ 트리플루오로아세트산(TFA)(v/v)
B : 0.085 ％ TFA/아세토니트릴, 1 ％ H2O(v/v)
주입 및 기울기
주입 : 100 - 250 μL 의 실험 시료
런(run) : 5 분간 10 ％ B, 다음에 60 분에 걸쳐 10 - 70 ％ B
휴렛 팩커드 1090 시리즈 Ⅱ HPLC 를 사용하여 크로마토그래피 분석을 실시한다. 분리에 사용된 컬럼은 C4, 5 μm, 1 x 250 mm (바이 닥 # 214TP51) 이다. 유속은 50 μL/분이고, 실험 화합물의 용출 프로필을 214, 230, 260 및 280 nm 에서 모니터한다.
실시예 8 : 뇌 흡착 검정
Aβ-유래 펩티드의 뇌 수준을 랫에서의 하기 정맥내 투여로 측정하였다. 케타민/질라진 마취하에, 수컷 스프래그-돌레이 랫(219 - 302 g)에게 좌측 경정맥에 삽입된 카테터를 통해 정맥내 주사하였다(1 분간 4 mL/㎏ 투여). 실험된 각 화합물의 실제 투여량은 도 1 에 나타나있다.
투여 60 분 후에, 대뇌 혈액을 제거하기 위한 좌측 전뇌의 관류를 가능하게 하기 위하여 좌측 경동맥에 캐뉼라를 삽입하였다. 혈액이 빠져나간 좌측 전뇌를 Triguero 등의 (1990) J. Neurochem. 54 : 1882 - 1888 에 기술된 바와 같이 모세혈관 사혈하였다. 이러한 기술은 뇌 맥관구조를 실질로부터 분리하므로, 조사중에 혈액뇌장벽을 가로지른 화합물의 정확한 측정을 가능하게 한다. 대뇌내에 존재하는 모 화합물의 양은 LC/MS/MS 로 측정하였다.

하기 조절인자들의 뇌 흡착을 측정하기 위해 상기에 기술된 검정을 사용하였다 :
Figure 112001022012147-pct00014

결과는 도 1 에 요약되어 있다.
본원에 기술된 β-아밀로이드 조절인자 화합물은 하기 표에 요약되어 있다.
Figure 112001022012147-pct00015
Figure 112001022012147-pct00016
등가물
본 분야의 숙련자는 본원에 기술된 발명의 특정 실시형태에 상당하는 많은 등가물을 일상적인 실험만을 사용하여 인지하고 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Praecis Pharmaceuticals, Inc. <120> MODULATORS OF B-AMYLOID PEPTIDE AGGREGATION <130> PPI-068CPPC <140> PCT/US00/05574 <141> 2000-03-03 <150> USSN 60/122,736 <151> 1999-03-04 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr 35 40 <210> 2 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 1 5 10 15 His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 30 Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val 35 40 45 Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile 50 55 60 His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg 65 70 75 80 His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys 85 90 95 Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn 100 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: amyloid deposit inhibitor peptide <400> 3 Leu Val Phe Phe 1 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: amyloid deposit inhibitor peptide <400> 4 Leu Val Phe Phe Ala 1 5

Claims (17)

  1. 다음 중에서 선택한 구조를 갖는 화합물
    N-메틸-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    N-에틸-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    N-이소프로필-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-이소프로필아미드;
    N,N-디에틸-(Gly-D-Ala-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    N,N-디메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ;
    N,N-디메틸-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    H-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ;
    N-에틸-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ;
    N-에틸-(Gly-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    N-메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ;
    N-메틸-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    N-에틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ;
    N-프로필-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ;
    N,N-디에틸-(Gly-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ;
    H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2 ;
    H-(D-Ile-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-NH2 ;
    H-(D-Ile-D-Ile-D-Phe-D-Phe-D-Ile)-NH2 ;
    H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Ala)-NH2 ;
    H-(D-Nle-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Nle)-NH2 ;
    l-피페리딘-아세틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ;
    l-피페리딘-아세틸-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    H-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu-이소프로필아미드 ;
    H-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu-이소프로필아미드 ;
    H-D-Leu-D-Val-D-Phe-NH-NH-D-Phe-D-Val-D-Leu-H ;
    H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-메틸아미드 ;
    H-(D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Val-D-Leu)-메틸아미드 ;
    H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Cha-D-Leu)-NH2 ;
    H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Leu)-NH2 ;
    H-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Leu)-NH2 ;
    H-(D-Leu-D-Phe-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    H-(D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    H-(D-Leu-D-Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    H-(D-Leu-D-Cha-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    H-(D-Leu-D-Lys-D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    H-(D-Leu-D-Cha-D-Cha-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    H-(D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    H-(D-Leu-D-[F5]Phe-D-[F5]Phe-D-Val-D-Leu)-NH2 ;
    H-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu-NH-CH2CH2-NH2 ;
    H-D-Leu-D-Phe-D-Phe-D-Nvl-D-Leu-NH2 ;
    H-D-Leu-D-Phe-D-[p-F]Phe-D-Nvl-D-Leu-NH2 ;
    H-D-Leu-D-[p-F]Phe-D-[p-F]Phe-D-Nvl-D-Leu-NH2 ;
    H-(메틸-D-Leu-D-Val-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ;
    H-(D-Leu-D-Val-D-[p-F]Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2 ; 및
    H-(메틸-D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Nvl)-NH2 ;
    이 식에서,
    D-Cha 는 D-시클로헥실알라닌을 나타내고,
    D-[p-F]Phe 는 D-4-플루오로페닐알라닌을 나타내고,
    D-[F5]Phe 는 D-펜타플루오로페닐알라닌을 나타내고,
    D-Nle 는 D-노르로이신을 나타내고,
    D-Nvl 은 D-노르발린을 나타낸다.
    상기 화합물이 천연 β-아밀로이드 펩티드와 결합되거나 또는 천연
    β-아밀로이드 펩티드와 접촉되는 경우에는 이들 천연 β-아밀로이드
    펩티드의 응집이 조절되거나 신경독성이 억제되며, 대사가 적게
    일어난다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 다음 구조를 갖는 화합물
    H-(D-Leu-D-Phe-[p-F]D-Phe-D-Val-D-Leu)-NH2.
  6. 다음 구조를 갖는 화합물
    N-메틸-(D-Leu-D-Val-D-Phe-D-Phe-D-Leu)-NH2.
  7. 제 1 항, 제 5 항 및 제 6 항 중 어느 한 항의 화합물의 치료학적 유효량 및 약학적으로 용인가능한 담체를 포함하는, 알쯔하이머병, 다운증후군 및 더치 타입 아밀로이드증을 수반하는 유전성 뇌출혈(HCHWA-D) 중에서 선택한 β-아밀로이드증 관련 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물.
  8. 제 1 항, 제 5 항 및 제 6 항 중 어느 한 항의 화합물과 천연 β-아밀로이드 펩티드를 접촉시켜 천연 β-아밀로이드 펩티드의 응집을 억제시킴을 포함하는, 천연 β-아밀로이드 펩티드의 응집을 억제하는 방법.
  9. 다음 단계를 포함하는, 인체를 제외한 생물학적 시료내 천연 β-아밀로이드 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 방법
    (1) 검출가능한 물질로 표지된 제 1 항, 제 5 항 및 제 6 항 중 어느 한 항의 화합물과 생물학적 시료를 접촉시키는 단계 ;
    및
    (2) 천연 β-아밀로이드 펩티드와 결합된 화합물을 검출하여
    생물학적 시료내 천연 β-아밀로이드 펩티드의 존재 또는
    부재를 검출하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, β-아밀로이드 조절인자 화합물과 생물학적 시료를 시험관내에서 접촉시킴을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 인체를 제외한 포유동물에게 β-아밀로이드 조절인자 화합물을 투여하여 β-아밀로이드 조절인자 화합물이 생물학적 시료와 접촉되게함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 화합물이 방사선 테크네튬 또는 방사선 요오드로 표지됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항, 제 5 항 및 제 6 항 중 어느 한 항의 화합물의 치료학적 유효량을 인체를 제외한 포유동물에게 투여하여 상기 포유동물의 알쯔하이머병, 다운증후군 및 더치 타입 아밀로이드증을 수반하는 유전성 뇌출혈(HCHWA-D) 중에서 선택한 β-아밀로이드증 관련 질환을 치료하거나 진단함을 포함하는, β-아밀로이드증 관련 질환을 앓고있는 상기 포유동물을 치료하거나 진단하는 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 1 항, 제 5 항 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 검출가능한 물질로 추가로 표지됨을 특징으로 하는 화합물.
  17. 제 1 항, 제 5 항 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 혈액뇌장벽(blood brain barrier, BBB)을 가로지르는 수송을 매개하는 펩티드 또는 단백질을 추가로 포함함을 특징으로 하는 화합물.
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