DE69621607T2

DE69621607T2 - VERBINDUNGEN MIT AGGREGATIONS-MODULIERENDEN WIRKUNG AUF DAS AMYLOiD PROTEIN

Info

Publication number: DE69621607T2
Application number: DE69621607T
Authority: DE
Inventors: Howard Benjamin; Joseph Chin; A. Findeis; B. Garnick; L. Gefter; Arvind Hundal; Laura Kasman; Michael Kelley; William Kubasek; Jung-Ja Lee; Susan Molineaux; Gary Musso; J. Reed; R. Signer; James Wakefield
Original assignee: Praecis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Praecis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-03-14
Filing date: 1996-03-14
Publication date: 2003-01-02
Anticipated expiration: 2016-03-15
Also published as: ATE218583T1; EP0815134B1; US5854204A; ES2175083T3; CA2214247A1; DE69621607D1; US20040005307A1; US20110009343A1; US7658917B2; US20020098173A1; WO1996028471A1; JPH11514333A; CA2214247C; EP0815134A1; US6319498B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die zuerst von dem bayrischen Psychiater Alois Alzheimer im Jahre 1907 beschriebene Alzheimer Krankheit (AD) ist eine progressive neurologische Erkrankung, die mit Verlust des Kurzzeitgedächtnisses beginnt und zur Desorientierung, Beeinträchtigung von Beurteilungsvermögen und Denkfähigkeit und schließlich bis zur Demenz fortschreitet. Der Krankheitsverlauf führt normalerweise vier bis zwölf Jahre nach Ausbruch in einem schwer entkräfteten, immobilen Zustand zum Tode. Schätzungsweise sind 5 bis 11 Prozent der Bevölkerung im Alter von über 65 Jahren und so viel wie 47 Prozent der Bevölkerung im Alter von über 85 Jahren von AD betroffen. Die gesellschaftlichen Kosten für den Umgang mit AD betragen, hauptsächlich aufgrund des für AD Patienten erforderlichen beträchtlichen Betreuungsaufwandes, jährlich mindestens 80 Milliarden Dollar. Da die während der geburtenstarken Jahrgänge der 1940er und 1950er geborenen Erwachsenen das Alter erreichen, in dem AD häufig ist, wird die Kontrolle und Behandlung von AD außerdem ein noch deutlicheres Problem des Gesundheitswesens darstellen. Gegenwärtig gibt es keine Behandlung, die das Fortschreiten der Erkrankung deutlich verlangsamt. Zur Übersicht über AD siehe Selkoe, D. J. Sci. Amer., November 1991, pp. 68-78; und Yankner, B. A. et al. (1991) N. Eng. J. Med. 325: 1849-1857.
Vor kurzem wurde berichtet (Garnes et al. (1995) Nature 373: 523-527), dass eine Alzheimer-artige Neuropathologie in transgenen Mäusen erzeugt wurde. Die transgenen Mäuse exprimieren einen hohen Gehalt an humanem mutierten Amyloid-Präkursor-Protein und entwickeln fortschreitend viele der mit AD assoziierten pathologischen Zustände.
Pathologisch ist AD durch das Vorhandensein von ausgeprägten Läsionen im Gehirn des Betroffenen gekennzeichnet. Diese Gehirnläsionen schließen anormale intrazelluläre Filamente, die neurofibrilläre Bündel (NTFs) genannt werden und extrazelluläre Ablagerungen des amyloidogenen Proteins in senilen oder amyloiden Plaques ein. WO-A-94/28412 offenbart Amyloid-bindende Zusammensetzungen für bildgebende Verfahren in vivo von Amyloid-Ablagerungen, während WO-A-9304194 ein markiertes β- Amyloid-Peptid für eine Verwendung zur Detektion von Alzheimer Krankheit in humanem Gewebe bereitstellt. Amyloide Ablagerungen sind ebenfalls in den Wänden cerebraler Blutgefäße von AD Patienten vorhanden. Als Hauptproteinbestandteil amyloider Plaques ist ein 4 Kilodalton Peptid, das β- Amyloid-Peptid (β-AP) genannt wird, identifiziert worden (Glenner, G. G. und Wong, C. W. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 885-890; Masters, C. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4245-4249). Diffuse β-AP Ablagerungen werden häufig in normalen Gehirnen von Erwachsenen beobachtet, während AD Gehirngewebe durch kompaktere, dichtkernige β- Amyloid-Plaques gekennzeichnet ist. (Siehe z. B. Davies, L. et al. (1988) Neurology 38: 1688-1693). Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die β-AP Ablagerung voranschreitet und zur bei AD vorkommenden Zerstörung von Neuronen beiträgt. Zur Unterstützung einer direkten pathogenen Rolle für β-AP ist gezeigt worden, dass β-Amyloid für reife Neuronen sowohl in Kultur als auch in vivo toxisch ist. Yankner, B. A. et al. (1989) Science 245: 417-420; Yankner, B. A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9020-9023; Roher, A. E. et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 174: 572-579; Kowall, N. W. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7247-7254. Außerdem wurde gezeigt, dass Patienten mit hereditärer Enzephalorrhagie mit Holländischer-Typ Amyloidose (HCHWA-D), welche durch diffuse β-Amyloid- Ablagerungen innerhalb dem Cortex cerebralis und Cerebrovaskulatur gekennzeichnet ist, eine Punktmutation haben, die zu einer Aminosäure- Substitution innerhalb β-AP führt. Levy E. et al. (1990) Science 248: 1124- 1126. Diese Beobachtung zeigt, dass eine spezifische Veränderung der β-AP Sequenz β-Amyloid-Ablagerung bewirken kann.
Natürliches β-AP wird durch Proteolyse eines viel größeren Proteins, das Amyloid-Präkursor-Protein (APP) genannt wird, hergeleitet. Kang, J. et al. (1987) Nature 325: 733: Goldgaber, D. et al. (1987) Science 235: 877; Robakis, N. K. et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84: 4190; Tanzi, R. E. et al. (1987) Science 235: 880. Das APP Gen wurde auf Chromosom 21 lokalisiert, wobei eine Erklärung für β-Amyloid-Ablagerung bereit gestellt wird, die in einem frühen Alter bei Individuen mit Down-Syndrom, das durch Trisomie von Chromosom 21 verursacht ist, beobachtet wurde. Mann, D. M. et al. (1989) Neuropathol. Appl. Neurobiol. 15: 317; Rumble, B. et al. (1989) N. Eng. J Med. 320: 1446. APP enthält eine einzige membrandurchdringende Domäne mit einer langen aminoterminalen Region (etwa zweidrittel des Proteins), die bis in die extrazellulären Bereich reicht und mit einer kürzeren carboxyterminalen Region, die in das Cytoplasma hineinragt. Differentielles Spleißen der APP messenger RNS ergibt mindestens fünf APP Formen mit entweder 563 Aminosäuren (APP-563), 695 Aminosäuren (APP-695), 714 Aminosäuren (APP-714), 751 Aminosäuren (APP-751) oder 770 Aminosäuren (APP-770).
Innerhalb APP beginnt natürlicherweise vorkommendes β-Amyloid- Peptid bei einem Asparaginsäure-Rest bei Aminosäure-Position 672 von APP-770. Natürlichweise vorkommendes, von APP Proteolyse abstammendes β-AP ist in Abhängigkeit von dem Heterogenität aufweisenden carboxyterminalen Endpunkt 39 bis 43 Aminosäure-Reste lang. Die prädominante zirkulierende Form von β-AP im Blut und in der Cerebrospinalflüssigkeit von sowohl AD Patienten als auch normalen Erwachsenen ist β1-40 ("kurzes β"). Seubert, P. et al. (1992) Nature 359: 325; Shoji, M. et al. (1992) Science 258: 126. Dennoch sind β1-42 und β1-43 ("langes β") ebenfalls Formen in β- Amyloid-Plaques. Masters. C. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4245; Miller. D. et al. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 301: 41; Mori, H. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 17082. Obwohl die genauen molekularen Mechanismen, die zur β-APP Aggregation und Ablagerung führen, nicht bekannt sind, wurde der Vorgang mit Nukleierungs-abhängigen Polymerisationen verglichen, wie zum Beispiel Proteinkristallisation, Mikrotubuli- Bildung und Aktin-Polymerisation. Siehe z. B. Jarrett, J. T. und Lansbury, P. T. (1993) Cell 73: 1055-1058. In solchen Vorgängen findet eine Polymerisation der Monomer-Komponenten nicht vor Kernbildung statt. Somit sind diese Vorgänge durch eine lange Anlaufzeit, bevor eine Aggregation stattfindet, gefolgt von einer schnellen Polymerisation nach Nukleierung gekennzeichnet. Nukleierung kann durch die Zugabe eines "Keims" oder eines vorgeformten Kerns beschleunigt werden, wodurch eine schnelle Polymerisation folgt. Es wurde gezeigt, dass die langen β-Formen von β-AP als Keime wirken, wobei eine Polymerisation von sowohl langen als auch kurzen β-AP Formen beschleunigt wird. Jarrett, J. T. et al. (1993) Biochemistry 32: 4693.
In einer Studie, in der Aminosäure-Substitutionen in β-AP vorgenommen wurden, wurde von zwei mutierten β-Peptiden berichtet, die eine Polymerisation von nichtmutiertem β-AP störten, wenn die mutierten und nichtmutierten Formen des Peptides vermischt wurden. Hilbich, C. et al. (1992) J. Mol. Biol. 228: 460-473. Dennoch wurden äquimolare Mengen des mutierten und nichtmutierten (d. h. natürlichen) β-Amyloid-Peptides verwendet, um diese Wirkung zu beobachten und es wurde berichtet, dass die mutierten Peptide für eine Verwendung in vivo ungeeignet sind. Hilbich, C. et al. (1992), supra.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Verbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen davon, die die Aggregation von amyloidogenen Proteinen und Peptiden modulieren können, insbesondere Verbindungen, die die Aggregation von natürlichen β Amyloid-Peptiden (β-AP) modulieren können und die Neurotoxizität von natürlichen β-APs hemmen. In einem Anwendungsfall stellt die Erfindung eine Amyloid-Modulator-Verbindung bereit, die ein amyloidogenes Protein oder Peptidfragment davon umfasst, das direkt oder indirekt an mindestens eine modifizierende Gruppe gekoppelt ist, so dass die Verbindung die Aggregation von natürlichen Amyloid-Proteinen oder Peptiden moduliert, wenn sie mit den natürlichen amyloidogenen Proteinen oder Peptiden in Kontakt gebracht wird, worin das amyloidogene Protein oder ein Peptidfragment davon mindestens ein D-Aminosäure umfasst und worin die mindestens eine modifizierende Gruppe eine cyclische, heterocyclische oder polycyclische Gruppe oder anderen Teil mit ähnlicher sterischer Ausdehnung umfasst. Vorzugsweise hemmt die Verbindung eine Aggregation von natürlichen amyloidogenen Proteinen oder Peptiden, wenn sie mit den natürlichen amyloidogenen Proteinen oder Peptiden in Kontakt gebracht wird. Das amyloidogene Protein oder Peptidfragment davon, kann zum Beispiel aus der Gruppe ausgewählt sein bestehend aus Transthyretin (TTR), Prion-Protein (PrP), Insel-Amyloid-Polypeptid (IAPP), atrial natriuretischer Faktor (ANF), kappa leichte Kette, lambda leichte Kette, Amyloid A, Procalcitonin, Cystatin C, β2 Mikroglobulin, ApoA-I, Gelsolin, Procalcitonin, Calcitonin, Fibrinogen und Lysozym.
In dem bevorzugtesten Anwendungsfall der Erfindung moduliert die Verbindung die Aggregation von natürlichem β-AP. Die Erfindung stellt eine β-Amyloid-Peptidverbindung bereit, die eine Formel umfasst:
worin Xaa ein β-Amyloid-Peptid ist mit einem aminoterminalen Aminosäure-Rest, der Position 668 vom β-Amyloid-Präkursor-Protein-770 (APP-770) oder einem Rest carboxyterminal zu Position 668 von APP-770 entspricht, und A eine modifizierende Gruppe ist, die an dem Aminoterminus des β-Amyloid-Proteins gebunden ist, so dass die Verbindung eine Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β- Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird, worin A einen cyclischen oder heterocyclischen Teil umfasst.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung bereit, die aus einer 4 bis 7 Aminosäuren langen Aβ Aggregation-Kern- Domäne (ACD) besteht und den Aminosäure-Positionen 17 bis 20 vom natürlichen β-Amyloid-Peptid nachgebildet ist, die direkt oder indirekt an mindestens eine modifizierende Gruppe (MG) gekoppelt ist, die natürlicherweise nicht an natürliche β-Amyloid-Peptide in ihrer nativen Form gekoppelt ist, so dass die Verbindung die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β- Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung bereit, die eine Formel umfasst:
worin Xaa&sub1;, Xaa&sub2; und Xaa&sub3; jeweils Aminosäure-Strukturen sind und mindestens zwei aus Xaa&sub1;, Xaa&sub2; und Xaa&sub3; unabhängig sind, und aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus einer Leucin-Struktur, einer Phenylalanin-Struktur und einer Valin-Struktur und mindestens ein Xaa&sub1;, Xaa&sub2; und Xaa&sub3; eine D-Aminosäure ist;
Y, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, eine Peptid-Struktur mit der Formel (Xaa)a ist, worin Xaa eine beliebige Aminosäure-Struktur ist und a eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist;
Z, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, eine Peptid-Struktur mit der Formel (Xaa)b ist, worin Xaa eine beliebige Aminosäure-Struktur ist und b eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist; und
A eine modifizierende Gruppe ist, die direkt oder indirekt an die Verbindung gebunden ist und n eine ganze Zahl ist;
wobei Xaa&sub1;, Xaa&sub2;, Xaa&sub3;, Y, Z, A und n so ausgewählt sind, dass die Verbindung die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. In einem bevorzugten Anwendungsfall sind Xaa&sub1; und Xaa&sub2; jeweils Phenylalanin-Strukturen. In einem anderen bevorzugten Anwendungsfall sind Xaa&sub2; und Xaa&sub3; jeweils Phenylalanin-Strukturen.
Die Erfindung stellt außerdem eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung bereit, die eine Formel umfasst:
worin Xaa&sub1; und Xaa&sub3; Aminosäure-Strukturen sind;
Xaa&sub2; eine Valin-Struktur ist;
Xaa&sub4; eine Phenylalanin-Struktur ist,
wobei mindestens eines aus Xaa&sub1;, Xaa&sub2;, Xaa&sub3; und Xaa&sub4; eine D- Aminosäure ist;
Y, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, eine Peptid- Struktur mit der Formel (Xaa)a ist, worin Xaa eine beliebige Aminosäure- Struktur ist und a eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist;
Z, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, eine Peptid- Struktur mit der Formel (Xaa)b ist, worin Xaa eine beliebige Aminosäure- Struktur ist und b eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist; und
A eine modifizierende Gruppe ist, die direkt oder indirekt an die Verbindung gebunden ist und n eine ganze Zahl ist;
wobei Xaa&sub1;, Xaa&sub3;, Y, Z, A und n so ausgewählt sind, dass die Verbindung die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. In einem bevorzugten Anwendungsfall ist Xaa&sub1; eine Leucin-Struktur und Xaa&sub3; ist eine Phenylalanin-Struktur.
Die Erfindung stellt ferner noch eine Verbindung bereit, die die Formel umfasst:
A-Xaa&sub1;-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-Xaa&sub4;-Xaa&sub5;-Xaa&sub6;-Xaa&sub7;-Xaa&sub8;-B
worin Xaa&sub1; eine Histidin-Struktur ist;
Xaa&sub2; eine Glutamin-Struktur ist;
Xaa&sub3; eine Lysin-Struktur ist;
Xaa&sub4; eine Leucin-Struktur ist;
Xaa&sub5; eine Valin-Struktur ist;
Xaa&sub6; eine Phenylalanin-Struktur ist;
Xaa&sub7; eine Phenylalanin-Struktur ist;
Xaa&sub8; eine Alanin-Struktur ist;
A und B modifizierende Gruppen sind, die direkt oder indirekt an den Aminoterminus und beziehungsweise an den Carboxyterminus der Verbindung gebunden sind, wobei besagte modifizierende Gruppen Gruppen sind, die nicht natürlicherweise an die β- Amyloid-Peptide in ihrer nativen Form gekoppelt sind;
und worin Xaa&sub1;-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;, Xaa&sub1;-Xaa&sub2; oder Xaa&sub1; vorhanden oder nicht vorhanden sein können;
Xaa&sub8; vorhanden oder nicht vorhanden sein kann; und
mindestens A oder B vorhanden ist.
Die Erfindung stellt außerdem noch eine β-Amyloid-Modulator- Verbindung bereit, die eine direkt oder indirekt an eine Peptid-Struktur gebundene modifizierende Gruppe umfasst, worin die Peptid-Struktur Aminosäure-Strukturen mit einer Aminosäure-Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 5), His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe (SEQ ID Nr. 6), Gln-Lys-Leu- Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 7), Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe (SEQ ID Nr. 8), Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 9), Lys-Leu-Val-Phe-Phe (SEQ ID Nr. 10), Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 11), Leu-Val-Phe-Phe (SEQ ID Nr. 12), Leu-Ala-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 13), Val-Phe-Phe (SEQ ID Nr. 19), Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 20), Phe-Phe-Val-Leu-Ala (SEQ ID Nr 21), Leu- Val-Phe-Phe-Lys (SEQ ID Nr. 22), Leu-Val-Iodtyrosin-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 23), Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 24), Ala-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 25), Leu-Val-Phe-Iodtyrosin-Ala (SEQ ID Nr. 26), Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu (SEQ ID Nr. 27), Phe-Phe-Val-Leu (SEQ ID Nr. 28), Phe-Lys-Phe-Val-Leu (SEQ ID Nr. 29), Lys-Leu-Val-Ala-Phe (SEQ ID Nr. 30), Lys-Leu-Val-Phe-Phe-βAla (SEQ ID Nr. 31) und Leu-Val-Phe-Phe-DAla (SEQ ID Nr. 32).
In den Verbindungen der Erdindung, die eine modifizierene Gruppe umfassen, umfasst die modifizierende Gruppe vorzugsweise eine cyclische, heterocyclische oder polycyclische Gruppe. Bevorzugte modifizierende Gruppen enthalten eine cis-Decalin Gruppe, wie zum Beispiel eine Chalonyl- Struktur. Bevorzugte modifizierende Gruppen schiessen eine Cholyl-Gruppe, eine Biotin-haltige Gruppe, eine Diethylentriaminpentaacetyl-Gruppe, eine (-)- Menthoxyacetyl-Gruppe, eine Fluorescein-haltige Gruppe oder eine N- Acetylneuraminyl-Gruppe ein.
Die Verbindungen der Erfindung können weiter modifiziert werden, zum Beispiel um eine pharmakokinetische Eigenschaft der Verbindung zu verändern oder um die Verbindung mit einer detektierbaren Substanz zu markieren. Bevorzugte radioaktive Markierungen sind radioaktives Iod oder Technetium.
Die Erfindung stellt ebenfalls einen β-Amyloid-Modulator bereit, der eine Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmt, wenn er mit einer molaren Überschussmenge von natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird.
In einem anderen Anwendungsfall kennzeichnet die vorliegende Erfindung eine β-Amyloid-Peptidverbindung, die eine Formel umfasst:
worin ein Xaa ein β-Amyloid-Peptid ist und A eine modulierende Gruppe ist, die an den Carboxyterminus des β-Amyloid-Peptids gebunden ist, so dass die Verbindung eine Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird, worin A einen cyclischen oder heterocylischen Teil oder anderen Teil mit ähnlicher räumlicher Ausdehnung umfasst.
In noch einem anderen Anwendungsfall kennzeichnet die Erfindung eine Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus βAP&sub0;&submin;&sub2;&sub0;(SEQ ID Nr. 4), βAP&sub1;&sub0;&submin;&sub3;&sub0;(SEQ ID Nr. 14), βAP&sub1;&submin;&sub2;&sub0;,&sub2;&sub6;&submin;&sub4;&sub0;(SEQ ID Nr. 15) und EEVVHHHHQQ-βAP&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub0;(SEQ ID Nr. 16).
In einem anderen Anwendungsfall kennzeichnet die Erfindung eine β- Amyloid-Modulator-Verbindung umfassend ein β-Amyloid-Peptid, das mindestens eine D-Aminosäure umfasst, worin die Verbindung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet oder die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird.
In einem weiteren Anwendungsfall kennzeichnet die Erfindung eine β- Amyloid-Modulator-Verbindung umfassend ein β-Amyloid-Peptid, wobei das β-Amyloid-Peptid vollständig aus D-Aminosäuren besteht, worin die Verbindung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet oder die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität von natürlichem β-Amyloid-Peptid hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird.
In einem anderen Anwendungsfall kennzeichnet die Erfindung eine β- Amyloid-Modulator-Verbindung umfassend ein retro-inverso Isomer eines β- Amyloid-Peptids, worin die Verbindung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet oder die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität natürlicher β- Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird.
Die Verbindungen der Erfindung können ebenfalls in pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert sein, die die Verbindung und einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfassen. Die Verbindungen können ebenfalls bei der Herstellung von einem Medikament zur Diagnose oder Behandlung einer amyloidogenen Krankheit verwendet werden.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft diagnostische Verfahren und Behandlungsverfahren unter Verwendung von Verbindungen der Erfindung. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Aggregationshemmung natürlicher β- Amyloid-Peptide bereit, das in-Kontakt-Bringen der natürlichen β-Amyloid- Peptide mit einer Verbindung der Erfindung umfasst, so dass eine Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide gehemmt ist. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Hemmung von Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden bereit, das in-Kontakt-Bringen der natürlichen β- Amyloid-Peptide mit einer Verbindung der Erfindung umfasst, so dass Neurotoxizität der natürlichen β-Amyloid-Peptide gehemmt ist.
In einem anderen Anwendungsfall stellt die Erfindung ein Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins natürlicher β- Amyloid-Peptide in einer biologischen Probe bereit, umfassend In-Kontakt- Bringen einer biologischen Probe mit einer Verbindung der Erfindung und Detektion der an natürliche β-Amyloid-Peptide gebundenen Verbindung, um dadurch das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein natürlicher β-Amyloid- Peptide in der biologischen Proben zu detektieren. In einem Anwendungsfall werden die β-Amyloid-Modulator-Verbindung und die biologische Probe in vitro in Kontakt gebracht. In einem anderen Anwendungsfall wird die β- Amyloid-Modulator-Verbindung mit der biologischen Probe durch Verabreichen der β-Amyloid-Modulator-Verbindung an einen Patienten in Kontakt gebracht. Für eine in vivo Verabreichung ist die Verbindung vorzugsweise mit radioaktivem Technetium oder radioaktivem 10d markiert.
In einem anderen Anwendungsfall stellt die Erfindung ein Verfahren zur Detektion natürlicher β-Amyloid-Peptide bereit, um eine Diagnose einer β- amyloidogenen Erkrankung zu erleichtern, umfassend In-Kontakt-Bringen einer biologischen Probe mit einer Verbindung der Erfindung und Detektion der an natürliche β-Amyloid-Peptide gebundenen Verbindung, um eine Diagnose einer β-amyloidogenen Erkrankung zu erleichtern. In einem Anwendungsfall werden die β-Amyloid-Verbindung und die biologische Probe in vitro in Kontakt gebracht. In einem anderen Anwendungsfall werden die β- Amyloid-Modulator-Verbindung mit der biologischen Probe durch Verabreichen der β-Amyloid-Modulator-Verbindung an einen Patienten in Kontakt gebracht. Für eine in vivo Verabreichung ist die Verbindung vorzugsweise mit radioaktivem Technetium oder radioaktivem Iod markiert. Vorzugsweise erleichtert das Verfahren eine Diagnose der Alzheimer Krankheit.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten gegen eine Erkrankung bereit, die mit Amyloidose assoziiert ist, umfassend Verabreichung einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge einer Verbindung der Erfindung an den Patienten, so dass der Patient gegen eine Erkrankung behandelt wird, die mit Amyloidose assoziiert ist. Das Verfahren kann verwendet werden, um Erkrankungen zu behandeln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus familiärer polyneuropathischer Amyloidose (Portugiesischer, Japanischer und Schwedischer Typ), familiärer cardiomyopathischer Amyloidose (Dänischer Typ), isolierter cardiopathischer Amyloidose, systemischer Altersamyloidose, Scrapie, boviner spangioformer Enzephalopathie, Creutzfeld-Jakob Krankheit, Gerstmann-Straussler- Scheinker Syndrom, nicht insulinabhängiger Diabetes mellitus, Insulinom, isolierter Atrial-Amyloidose, idiopathischer (primärer) Amyloidose, Myelom- oder Makroglobulinämie-assoziierte Amyloidose, primär lokalisierte Hautamyloidose assoziiert mit Sjögrens Syndrom, reaktiver (sekundärer) Amyloidose, familiärem Mittelmeerfieber und familiärer nephropathischer Amyloidose mit Urticaria und Taubheit (Muckle-Wells Syndrom), hereditärer Enzephalorrhagie mit Island-Typ Amyloidose, Amyloidose assoziiert mit Langzeit-Hämodialyse, hereditärer nicht neuropathischer systemischer Amyloidose (familiäre Amyloid-Polyneuropathie III), familiärer Amyloidose Finnischer Typ, Amyloidose assoziiert mit medullärem Karzinom der Schilddrüse, Fibrinogen assoziierte hereditäre Nieren-Amyloidose und Lysozym assoziierte hereditäre systemische Amyloidose.
In einem bevorzugten Anwendungsfall stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zur Behandlung eines Patienten gegen eine Erkrankung, die mit β- Amyloidose assoziiert ist, umfassend Verabreichung einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge einer Verbindung der Erfindung an den Patienten, so dass der Patient gegen eine Erkrankung behandelt wird, die mit β-Amyloidose assoziiert ist. Vorzugsweise ist die Erkrankung Alzheimer Krankheit.
In noch einem anderen Anwendungsfall stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zur Behandlung eines Patienten gegen eine Erkrankung, die mit β-Amyloidose assoziiert ist, umfassend Verabreichung an den Patienten eines rekombinanten Expressionsvektors, der eine Peptidverbindung der Erfindung codiert, so dass die Verbindung in dem Patienten synthetisiert wird und der Patient gegen eine Erkrankung behandelt wird, die mit β-Amyloidose assoziiert ist. Vorzugsweise ist die Erkrankung Alzheimer Krankheit.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Trübung einer β-AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Lösung, erhalten durch Messung der optischen Dichte bei 400 nm, entweder bei Nichtvorhandensein eines β-Amyloid-Modulators oder bei Vorhandensein des β-Amyloid-Modulators N-Biotinyl-βAP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; (1% oder 5%).
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung der Verbindungen, die zum Modifizieren eines β-AP oder einer Aβ Aggregation-Kern-Domäne zum Bilden eines β-Amyloid-Modulators der Erfindung verwendet werden können.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der Toxizität von A&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Aggregaten, aber nicht von Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Monomeren, bei kultivierten neuronalen Zellen.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Aggregation von Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; bei Vorhandensein einer äquimolaren Menge Cholyl-Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (Tafel A), eines -2- fachen molaren Überschusses Cholyl-Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (Tafel B) oder eines ~6-fachen molaren Überschusses Cholyl-Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (Tafel C) und der entsprechenden Toxizität der Aggregate der Tafeln A, B und C bei kultivierten neuronalen Zellen (Tafeln D, E und beziehungsweise F).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen davon, die die Aggregation amyloidogener Proteine und Peptide modulieren können, insbesondere Verbindungen, die die Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden (β-AP) modulieren und die Neurotoxizität von natürlichen β-APs hemmen können. Eine Verbindung der Erfindung, die eine Aggregation von natürlichem β-AP moduliert, welche hierin austauschbar als eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung, als ein β-Amyloid-Modulator oder einfach als ein Modulator bezeichnet wird, verändert die Aggregation von natürlichem β-AP, wenn der Modulator mit natürlichem β-AP in Kontakt gebracht wird. Somit wirkt eine Verbindung der Erfindung, um den natürlichen Aggregationsvorgang oder die Aggregationsrate für β-AP zu verändern, wobei dieser Vorgang unterbrochen wird. Vorzugsweise hemmen die Verbindungen eine β-AP Aggregation. Außerdem stellt die Erfindung Subregionen des β-Amyloid-Peptides bereit, die bei geeigneter Modifikation, wie hierin beschrieben, ausreichen, um Aggregation von natürlichen β-Amyloid- Peptiden zu verändern (und vorzugsweise zu hemmen), wenn sie mit natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht werden. Insbesondere bestehen bevorzugte Modulator-Verbindungen der Erfindung aus einer modifizierten Form einer Aβ Aggregation-Kern-Domäne, die der zuvor genannten Aβ-Subregion nachgebildet ist (wie weiter unter beschrieben), welche ausreicht, den natürlichen Aggregationsvorgang oder -rate für β-AP zu verändern (und vorzugsweise zu hemmen). Diese Aβ Aggregation-Kern- Domäne kann so wenig wie drei Aminosäure-Reste (oder Derivate, Analoga oder Nachahmungen davon) umfassen. Außerdem ist es nicht wesentlich, dass, während die Aminosäure-Sequenz der Aβ Aggregation-Kern-Domäne direkt einer in natürlichem β-AP gefundenen Aminosäure-Sequenz entsprechen kann, die Aminosäure-Sequenz direkt einer β-AP Sequenz entspricht. Bevorzugt ist, dass die von einer bevorzugten β-AP Subregion (eine hydrophobe Region, die um die Positionen 17-20 zentriert ist) abstammenden Aminosäure-Reste in ihrer Reihenfolge umgeordnet und/oder mit homologen Resten innerhalb einer Modulator-Verbindung der Erfindung substituiert werden können und noch ihre inhibitorische Aktivität beibehalten (weiter unten beschrieben).
Die β-Amyloid-Modulator-Verbindungen der Erfindung können basierend auf ihrer Fähigkeit die Aggregation von natürlichem β-AP in vitro zu hemmen und/oder die Neurotoxizität von natürlichen β-AP Fibrillen bei kultivierten Zellen zu hemmen (unter Verwendung der hierin beschriebenen Tests) ausgewählt werden. Dementsprechend hemmen die bevorzugten Modulator- Verbindungen die Aggregation von natürlichem β-AP und/oder hemmen die Neurotoxizität von natürlichem β-AP. Dennoch können basierend auf einer dieser oder auf beide dieser Eigenschaften ausgewählte Modulator- Verbindungen zusätzliche Eigenschaften in vivo haben, die zum Nutzen in der Behandlung von Amyloidose sein können. Zum Beispiel kann die Modulator-Verbindung das Prozessieren von natürlichem β-AP (entweder durch direkte oder indirekte Protease-Hemmung) oder durch Modulieren des Vorganges, der toxisches β-AP oder andere APP-Fragmente in vivo herstellt, stören. Modulator-Verbindungen können wahlweise eher aufgrund dieser letztgenannten Eigenschaften ausgewählt werden, als aufgrund einer Aβ- Aggregationshemmung in vitro. Außerdem können Modulator-Verbindungen der Erfindung, die aufgrund ihrer Interaktion mit natürlichem β-AP ausgewählt werden, ebenfalls mit APP oder mit anderen APP-Fragmenten interagieren.
Wie hierin verwendet, beabsichtigt ein "Modulator" der β-Amyloid- Aggregation ein Mittel zu bezeichnen, das, wenn es mit natürlichen β- Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird, die Aggregation der natürlichen β- Amyloid-Peptide verändert. Der Ausdruck "Aggregation von β-Amyloid- Peptiden" bezeichnet einen Vorgang, wobei die Peptide zum Bilden eines multimeren, größtenteils nichtlöslichen Komplexes miteinander assoziieren. Der Ausdruck "Aggregation" bezeichnet ferner β-Amyloid-Fibrillenbildung zu umfassen und umfasst ebenfalls β Amyloid-Plaques.
Die Ausdrücke "natürliches β-Amyloid-Peptid", "natürliches β-AP" und "natürliches Aβ-Peptid", die austauschbar hierin verwendet werden, beabsichtigen natürlich vorkommende proteolytische Spaltungsprodukte des β- Amyloid-Präkursor-Proteins (APP) zu umfassen, die an der β-AP Aggregation und β-Amyloidose beteiligt sind. Diese natürlichen Peptide schließen β- Amyloid-Peptide mit 39-43 Aminosäuren ein (d. h. Aβ&sub1;&submin;&sub3;&sub9;, Ab&sub1;&submin;&sub4;&sub0;, Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub1;, Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub2; und Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub3;). Der aminoterminale Aminosäure-Rest von natürlichem β-AP entspricht dem Asparaginsäure-Rest bei Position 672 der 770 Aminosäure- Reste Form des Amyloid-Präkursor-Proteins ("APP-770"). Die 43 Aminosäuren lange Form des natürlichen β-AP hat die Aminosäure-Sequenz
(ebenfalls in SEQ ID NR. 1 dargestellt), wohingegen bei den kürzeren Formen 1-4 Aminosäure-Reste von dem carboxyterminalen Ende deletiert sind. Die Aminosäure-Sequenz von APP-770 von Position 672 (d. h. der Aminoterminus von natürlichem β-AP) bis zu seinem C-terminalen Ende (103 Aminosäuren) ist in SEQ ID NR. 2 dargestellt. Die bevorzugte Form von natürlichem β-AP zur Verwendung in den hierin beschriebenen Aggregationstests ist Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0;.
Bei Vorhandensein eines Modulators der Erfindung wird eine Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide "verändert" oder "moduliert". Die verschiedenen Formen des Ausdruckes "Veränderung" oder "Modulation" beabsichtigen sowohl Hemmung einer β-AP Aggregation als auch eine Förderung einer β-AP Aggregation zu umfassen. Aggregation von natürlichem β-AP wird bei Vorhandensein des Modulators gehemmt, wenn es eine Abnahme der Menge und/oder der Rate der β-AP Aggregation verglichen mit der Menge oder Rate der β-AP Aggregation bei Nichtvorhandensein des Modulators gibt.
Die verschiedenen Formen des Ausdruckes "Hemmung" beabsichtigen sowohl vollständige als auch partielle Hemmung von β-AP Aggregation einzuschließen. Aggregationshemmung kann als -fache Steigerung in der Aggregationsanlaufzeit oder als die Abnahme des Gesamtplateaugehaltes (d. h. der Aggregationsgesamtmenge) unter Verwendung eines Aggregationstests, wie in den Beispielen beschrieben, quantifiziert werden. In verschiedenen Anwendungsfällen steigert ein Modulator der Erfindung die Aggregationsanlaufzeit mindestens 1,2-fach, 1,5-fach, 1,8-fach, 2-fach, 2,5-fach, 3- fach, 4-fach oder 5-fach. In verschiedenen anderen Anwendungsfällen hemmt ein Modulator der Erfindung den Aggregationsplateaugehalt mindestens um 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75% oder 100%.
Ein Modulator, der β-AP Aggregation hemmt (eine "inhibitorische Modulator-Verbindung") kann verwendet werden, um den Beginn einer β- Amyloid Ablagerung vorzubeugen oder zu verzögern. Außerdem hemmen, wie in Beispiel 10 gezeigt, inhibitorische Modulator-Verbindungen der Erfindung die Bildung und/oder Aktivität neurotoxischer Aggregate aus natürlichem Aβ-Peptid (d. h. die inhibitorischen Verbindungen können verwendet werden, um die Neurotoxizität von β-AP zu hemmen). Des Weiteren, wie ebenfalls in Beispiel 10 gezeigt, können die inhibitorischen Verbindungen der Erfindung verwendet werden, um die Neurotoxizität vorgeformter β-AP Aggregate zu verringern, wobei angezeigt wird, dass die inhibitorischen Modulatoren entweder an vorgeformte Aβ-Fibrillen oder lösliche Aggregate binden und ihre eigene Neurotoxizität modulieren oder dass die Modulatoren das Gleichgewicht zwischen monomeren und aggregierten β-AP Formen zugunsten der nichtneurotoxischen Form stören.
Alternativ fördert eine Modulator-Verbindung der Erfindung in einem anderen Anwendungsfall die Aggregation natürlicher Aβ-Peptide. Die verschiedenen Formen des Ausdruckes "Förderung" bezeichnen eine Steigerung der Menge und/oder der Rate der β-AP Aggregation bei Vorhandensein des Modulators, verglichen mit der Menge und/oder Rate der β-AP Aggregation bei Nichtvorhandensein des Modulators. Solch eine Verbindung, die eine Aβ-Aggregation fördert, wird als eine stimulatorische Modulator- Verbindung bezeichnet. Stimulatorische Modulator-Verbindungen können zum Absondern von β Amyloid-Peptiden, zum Beispiel in ein biologisches Kompartiment, in dem eine β-AP Aggregation nicht schädlich ist, nützlich sein, um dabei β-AP aus einem biologischen Kompartiment zu depletieren, in dem β-AP Aggregation schädlich ist. Außerdem können stimulatorische Modulator-Verbindungen verwendet werden, um eine Aβ-Aggregation in in vitro Aggregationstests zu fördern (z. B. solche Tests, die in den Beispielen beschrieben werden), zum Beispiel in Suchtests für Testverbindungen, die dann diese Aβ-Aggregation hemmen oder umkehren können (d. h. eine stimulatorische Modulator-Verbindung kann als ein "Keim" wirken, um die Bildung von Aβ-Aggregaten zu fördern).
In einem bevorzugten Anwendungsfall haben die Modulatoren der Erfindung die Fähigkeit eine β-AP Aggregation zu verändern, wenn sie mit einer molaren Überschussmenge von natürlichem β-AP in Kontakt gebracht werden. Eine "molare Überschussmenge von natürlichem β-AP" bezeichnet eine Konzentration von natürlichem β-AP, in Molen, die größer als die Konzentration in Molen des Modulators ist. Wenn zum Beispiel sowohl der Modulator als auch β-AP bei einer Konzentration von 1 uM vorhanden sind, sind diese "äquimolar", während wenn der Modulator bei einer Konzentration von 1 uM und β-AP bei einer Konzentration von 5 uM vorhanden ist, ist das β-AP in einer 5-fachen molaren Überschussmenge verglichen mit dem Modulator vorhanden. In bevorzugten Anwendungsfällen verändert ein Modulator der Erfindung eine natürliche β-AP Aggregation wirksam, wenn das natürliche β- AP mindestens in einem 2-fachen, 3-fachen oder 5-fachen molaren Überschuss verglichen mit den Konzentrationen des Modulators vorhanden ist. In anderen Anwendungsfällen verändert der Modulator eine β-AP Aggregation wirksam, wenn das natürliche AP mindestens in einem 10-fachen, 20-fachen, 33-fachen, 50-fachen, 100-fachen, 500-fachen der 1000-fachen molaren Überschuss verglichen mit der Konzentration des Modulators vorhanden ist.
Verschiedene zusätzliche Aspekte der Modulatoren der Erfindung und Verwendungen davon werden detaillierter in den folgenden Unterabschnitten beschrieben.

I. Modulator-Verbindunpen

In einem Anwendungsfall umfasst ein Modulator der Erfindung eine β- Amyloid-Peptidverbindung, die die Formel umfasst:
worin Xaa ein β-Amyloid-Peptid ist. A ist eine modulierende Gruppe, die direkt oder indirekt an das β-Amyloid-Peptid der Verbindung gebunden ist, so dass die Verbindung eine Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird, und n ist eine ganze Zahl, so ausgewählt, dass die Verbindung eine Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β- Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird.
Vorzugsweise hat das β-Amyloid-Peptid der Verbindung einen aminoterminalen Aminosäure-Rest, der Position 668 des β-Amyloid-Präkursor- Protein-770 (APP-770) oder einem Rest carboxyterminal zu Position 668 von APP-770 entspricht. Die Aminosäure-Sequenz von APP-770 von Position 668 bis Position 770 (d. h. der Carboxyterminus) ist unten und in SEQ ID Nr. 2 dargestellt:
Bevorzugter entspricht der aminoterminale Aminosäure-Rest des β- Amyloid-Peptides der Position 672 von APP-770 (Position 5 der Aminosäure- Sequenz von SEQ ID NR: 2) oder einem Rest carboxyterminal zu Position 672 von APP-770. Obwohl das β-Amyloid-Peptid der Verbindung die 103 Aminosäure-Reste, die den Positionen 668-770 von APP-770 entsprechen, umfasst, ist das Peptid vorzugsweise zwischen 6 und 60 Aminosäuren lang, bevorzugter zwischen 10 und 43 Aminosäuren lang und noch bevorzugter zwischen 10 und 25 Aminosäure-Reste lang.
Wie hierin verwendet, beabsichtigt der Ausdruck "β-Amyloid-Peptid", wie bei einem Modulator der Erfindung verwendet, Peptide mit einer zu der natürlichen Sequenz in APP identischen Aminosäure-Sequenz, als auch Peptide mit geeigneten Aminosäure-Substitutionen der natürlichen Sequenz zu umfassen. Geeignete Aminosäure-Substitutionen sind solche, die nicht die Fähigkeit des Peptides, die natürlichen β-AP Aggregation zu verändern, beeinflussen. Außerdem können besondere Aminosäuren-Substitutionen zur Fähigkeit des Peptides, natürliche β-AP Aggregation zu verändern weiter beitragen, und/oder sie können dem Peptid zusätzliche nützliche Eigenschaften verleihen (z. B. gesteigerte Löslichkeit, verringerte Assoziation mit anderen Amyloid-Proteinen, etc.). Zum Beispiel kann eine Substitution durch hydrophobe Aminosäure-Reste der zwei Phenylalanin-Reste bei Position 19 und 20 von natürlichem β-AP (Positionen 19 und 20 der in SEQ ID NR. 1 gezeigten Aminosäure-Sequenz) zur Fähigkeit des Peptides eine β-AP Aggregation zu verändern weiter beitragen (siehe Hilbich, C. (1992) J. Mol. Biol. 228: 460-473). Somit besteht in einem Anwendungsfall das β-AP der Verbindung aus der unten und in SEQ ID NR. 3 dargestellten Aminosäure- Sequenz:
(oder eine aminoterminale oder carboxyterminale Deletion davon), worin Xaa eine hydrophobe Aminosäure ist. Beispiele hydrophober Aminosäuren sind Isoleucin, Leucin, Threonin, Serin, Alanin, Valin oder Glycin. Vorzugsweise wird F&sub1;&sub9;F&sub2;&sub0; durch T&sub1;&sub9;T&sub2;&sub0; oder G&sub1;&sub9;I&sub2;&sub0; substituiert.
Andere geeignete Aminosäuren-Substitutionen schließen Ersetzungen von Aminosäuren in dem humanen Peptid mit den entsprechenden Aminosäuren des rodenten β-AP Peptides ein. Die drei Aminosäure-Reste, die zwischen humanem und Ratten β-AP unterschiedlich sind, sind an Position 5, 10 und 13 der in den SEQ ID Nr. 1 und 3 gezeigten Aminosäure-Sequenz. Es wurde gezeigt, dass ein humanes β-AP mit den Substitutionen von human zu rodent Arg&sub5; zu Gly, Tyr&sub1;&sub0; zu Phe und His&sub1;&sub3; zu Arg die Eigenschaften des humanen Peptids beibehält (siehe Fraser, P. E. et al. (1992) Biochemistry 31: 10716-10723; und Hilbich, C. et al. (1991) Eur. J. Biochem. 201: 61-69). Dementsprechend ist ein humanes β-AP mit rodenten β-AP Aminosäure- Substitutionen für eine Verwendung in einem Modulator der Erfindung geeignet.
Andere mögliche β-AP Aminosäure-Substitutionen sind von Hilbich, C. et al. (1991) J. Mol. Biol. 218: 149-163; und Hilbich, C. (1992) J. Mol. Biol. 228: 460-473 beschrieben worden. Außerdem können Aminosäure-Substitutionen, die die Fähigkeit von β-AP mit anderen Proteinen zu assoziieren, beeinflussen, eingeführt werden. Zum Beispiel können eine oder mehrere Aminosäure- Substitutionen, die die Fähigkeit von β-AP mit dem Serpin-Enzym-Komplex (SEC) Rezeptor, α1-Antichymotrypsin (ACT) und/oder Apolipoprotein E (ApoE) zu assoziieren, verringern, eingeführt werden. Eine bevorzugte Substitution für die Verringerung des Bindens an den SEC Rezeptor ist L&sub3;&sub4;M&sub3;&sub5; Zu A&sub3;&sub4;A&sub3;&sub5; (bei Position 34 und 35 der in SEQ ID NR. 1 und 3 gezeigten Aminosäure-Sequenzen). Eine bevorzugte Substitution zum Verringern eines Bindens an ACT ist S&sub8; zu A&sub8; (an Position 8 der in SEQ ID NR. 1 und 3 gezeigten Aminosäure-Sequenzen).
Als Alternative zu den hierin beschriebenen oder im Fachgebiet bekannten β-AP Aminosäure-Substitutionen kann ein Modulator, der zumindest teilweise aus einem Aminosäure-substituierten β-Amyloid-Peptid besteht mit Hilfe von Standardverfahren hergestellt werden und hinsichtlich der Fähigkeit β-AP Aggregation zu verändern unter Verwendung eines hierin beschriebenen Aggregationstests getestet werden. Um die Eigenschaften des ursprünglichen Modulators zu erhalten, werden vorzugsweise konservative Aminosäure-Substitutionen an einem oder mehreren Aminosäure-Resten vorgenommen. Eine "konservative Aminosäure-Substitution" ist eine Substitution, bei der der Aminosäure-Rest durch einen Aminosäure-Rest mit einer ähnlichen Seitenkette ersetzt wird. Familien von Aminosäure-Resten mit ähnlichen Seitenketten sind im Fachgebiet definiert worden, einschließlich basischer Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), saurer Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladener polarer Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolarer Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), β-verzweigter Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischer Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Dementsprechend ist ein Modulator, der aus einem β- Amyloid-Peptid mit einer Aminosäure-Sequenz, die aus der Wildtyp-Sequenz in APP-770 mutiert wurde, besteht, der noch die Fähigkeit beibehält, die natürliche β-AP Aggregation zu verändern, im Rahmen der Erfindung.
Wie hierin verwendet, beabsichtigt der Ausdruck "β-Amyloid Peptid" ferner Peptid-Analoga oder Peptid-Derivate oder Peptid-Nachahmungen, die die Fähigkeit beibehalten, eine natürliche β-AP Aggregation, wie hierin beschrieben, zu verändern, einzuschließen. Zum Beispiel kann ein β- Amyloid-Peptid eines Modulators der Erfindung modifiziert werden, um dessen Stabilität, Bioverfügbarkeit, Löslichkeit, etc. zu erhöhen. Die Ausdrücke "Peptid-Analogon", "Peptid-Derivat" und "Peptid-Nachahmung" wie hierin verwendet, beabsichtigen Moleküle einzuschließen, die die chemische Struktur eines Peptides nachahmen und die funktionellen Eigenschaften des Peptides beibehalten. Versuchsannäherungen zum Entwurf von Peptid- Analoga sind im Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel siehe Farmer, P. S. in Drua Desicin (E. J. Ariens, ed.) Academic Press, New York, 1980, Vol. 10, pp. 119-143, Ball, J. B. und Alewood, PF. (1990) J MoL Recognition 3: 55; Morgan, B. A. und Gainor, J. A. (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243; und Freidinger, R. M. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10: 270. Beispiele von Peptid- Analoga, -Derivaten und Peptid-Nachahmungen schließen mit einem oder mehreren Benzodiazepin-Molekülen substituierte Peptide (siehe z. B. James, G. L. et al. (1993) Science 260: 1937-1942), Peptide mit methylierten Amid- Verknüpfungen und "retro-inverso"-Peptide (siehe U.S. Patentnr. 4,522,752 von Sisto) ein. Peptid-Analoga, Peptid-Derivate und Peptid-Nachahmungen werden unten detaillierter hinsichtlich Verbindungen, die eine Aβ Aggregation- Kern-Domäne umfassen, beschrieben.
In einem Modulator der Erfindung mit der oben gezeigten Formel, ist eine modulierende Gruppe ("A") direkt oder indirekt an das β-Amyloid-Peptid des Modulators gebunden. (Die Ausdrücke "modulierende Gruppe" und "modifizierende Gruppe" werden, wie hierin verwendet, austauschbar verwendet, um eine direkt oder indirekt an eine von Aβ abstammende Peptid- Struktur gebundene chemische Gruppe zu beschreiben). Zum Beispiel kann die modulierende Gruppe direkt durch kovalente Kopplung an das β-Amyloid- Peptid gekoppelt sein, oder die modulierende Gruppe kann indirekt durch eine stabile nichtkovalente Assoziation gebunden sein. In einem Anwendungsfall der Erfindung wird die modulierende Gruppe an den Aminoterminus des β-Amyloid-Peptides des Modulators gebunden. Dementsprechend kann der Modulator eine Verbindung umfassen mit einer Formel:
Wahlweise ist in einem anderen Anwendungsfall der Erfindung die modulierende Gruppe an den Carboxyterminus des β-Amyloid-Peptides des Modulators gebunden. Dementsprechend kann der Modulator eine Verbindung umfassen mit einer Formel:
In noch einem anderen Anwendungsfall ist die modulierende Gruppe an die Seitenkette von mindestens einem Aminosäure-Rest des β-Amyloid- Peptides der Verbindung gebunden (z. B. durch die Epsilon-Aminogruppe von (einem) Lysyl-Rest(en), durch die Carboxylgruppe von (einem) Asparaginsäure-Rest(en) oder von (einem) Glutaminsäure-Rest(en), durch eine Hydroxygruppe von (einem) Tyrosyl-Rest(en), von (einem) Serin-Rest(en) oder von (einem) Threonin-Rest(en) oder einer anderen reaktiven Gruppe an einer Aminosäure-Seitenkette).
Die modulierende Gruppe ist so ausgewählt, dass die Verbindung eine Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. Da das β-AP Peptid der Verbindung in seinem natürlichen Zustand modifiziert wird, beabsichtigt dementsprechend die modulierende Gruppe "A", wie hierin verwendet, nicht Wasserstoff einzuschließen. In einem bevorzugten Anwendungsfall ist die modulierende Gruppe eine Biotin-Verbindung der Formel:
worin X&sub1;-X&sub3; jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus S, O und NR&sub2;, worin R&sub2; Wasserstoff oder ein Aryl-, niederer Alkyl-, Alkenyl- oder Alkynyl-Teil ist; W ist =O oder NR&sub2;; R&sub1; ist ein niederer Alkenyl-Teil und Y ist eine direkte Bindung oder ein Trennmolekül, ausgewählt aufgrund seiner Fähigkeit mit einer Zielgruppe auf einem β-AP zu reagieren. Mindestens eines von X&sub1;-X&sub3; oder W ist eine NR&sub2;-Gruppe.
Der Ausdruck "Aryl" beabsichtigt aromatische Teile, die (einen) substituierte(n) oder nichtsubstituierte(n) Ring(e) enthalten, einzuschließen, z. B. Benzyl, Naphtyl, etc.. Andere komplexere kondensierte Ring-Teile sind beabsichtigenderweise ebenfalls eingeschlossen.
Der Ausdruck "niederer Alkyl- oder Alkylenyl-Teil" bezeichnet eine gesättigte, gerade oder verzweigte (oder Kombination davon) Kohlenwasserstoffkette, die 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome, bevorzugter 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält. Die Ausdrücke "niederer Alkenyl-Teil" und niederer "Alkynyl- Teil" bezeichnen ungesättigte Kohlenwasserstoffe, die 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome, bevorzugter 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthalten. Vorzugsweise enthält R&sub2; 1 bis 3 Kohlenstoffatome. Vorzugsweise enthält R&sub1; 4 Kohlenstoffatome.
Das Trennmolekül (Y) kann zum Beispiel eine niedere Alkyl-Gruppe oder ein Verknüpfungspeptid sein und ist vorzugsweise aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt mit einer freien Aminogruppe zu verknüpfen (z. B. die α- Aminogruppe an dem Aminoterminus eines β-AP). Somit modifiziert in einem bevorzugten Anwendungsfall die Biotin-Verbindung den Aminoterminus eines β-Amyloid-Peptides.
Zusätzliche geeignete modulierende Gruppen können andere cyclische und heterocyclische Verbindungen und andere Verbindungen mit ähnlicher sterischer "Ausdehnung" einschließen. Nichteinschränkende Beispiele von Verbindungen, die zum Modifizieren eines β-AP verwendet werden können, sind in Fig. 2 schematisch dargestellt und schließen N-Acetylneuraminsäure, Cholsäure, trans-4-Kotinincarbonsäure, 2-Imino-1-imidazolidinessigsäure, (S)-(-)-Indolin-2-Carbonsäure, (-)-Menthoxyessigsäure, 2-Norbonanessigsäure, γ-oxo-5-Acenaphthenbuttersäure, (-)-2-oxo-4-Thiazolidincarbonsäure, Tetrahydro-3-furancarbonsäure, 2-Iminobiotin-N-hydroxysuccinimidester, Diethylentriaminpentaessigsäuredianhydrid, 4-Morpholincarbonylchlorid, 2-Thiophenacetylchlorid, 2-Thiophensulfonylchlorid, 5-(und 6-)- Carboxyfluorescein(succinimidylester), Fluoresceinisothiocyanat und Essigsäure (oder Derivate davon) ein.
Geeignete modulierende Gruppen sind weiter in Unterabschnitt II unten beschrieben.
In einem Modulator der Erfindung kann eine einzige modulierende Gruppe an ein β-Amyloid-Peptid gebunden werden (z. B. n = 1 in der oben gezeigten Formel) oder mehrere modulierende Gruppen können an das Peptid gebunden werden. Die Anzahl an modulierenden Gruppen ist so ausgewählt, dass die Verbindung eine Aggregation natürlicher β-Amyloid- Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. Dennoch ist n vorzugsweise eine ganze Zahl zwischen 1 und 60, bevorzugter zwischen 1 und 30 und noch bevorzugter zwischen 1 und 10 oder 1 und 5.
In einem anderen Anwendungsfall umfasst eine β-Amyloid-Modulator- Verbindung der Erfindung eine Aβ Aggregation-Kern-Domäne (abgekürzt als ACD), die direkt oder indirekt an eine modifizierende Gruppe gekoppelt ist, so dass die Verbindung die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid- Peptiden in Kontakt gebracht wird. Wie hierin verwendet, ist beabsichtigt, dass eine "Aβ Aggregation-Kern-Domäne" eine Struktur bezeichnet, die einer Subregion eines natürlichen β-Amyloid-Peptides nachgebildet ist, welche ausreicht, um Aggregation von natürlichen β-APs zu modulieren, wenn diese Subregion des natürlichen β-AP wie hierin beschrieben geeignet modifiziert wird (z. B. am Aminoterminus modifiziert). Der Ausdruck "Subregion eines natürlichen β-Amyloid-Peptides" beabsichtigt, aminoterminale und/oder carboxyterminale Deletionen des natürlichen β-AP einzuschließen. Der Ausdruck "Subregion eines natürlichen β-AP" beabsichtigt nicht natürliches β- AP vollständiger Länge einzuschließen (d. h. "Subregion" schließt nicht Aβ&sub1;&submin;&sub3;&sub9;, Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0;, Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub1;, Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub2; und Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub3; ein).
Obwohl es nicht beabsichtigt ist, die Mechanismen einzuschränken, wird angenommen, dass die ACD der Modulatoren der Erfindung der Verbindung eine spezifische Zielfunktion verleihen, die der Verbindung ermöglicht natürliches β-AP zu erkennen und spezifisch damit zu interagieren. Vorzugsweise wird die ACD einer Subregion von natürlichem β-AP nachgebildet, die weniger als 15 Aminosäuren lang ist und bevorzugter zwischen 3-10 Aminosäuren lang ist. In verschiedenen Anwendungsfällen ist die ACD nach einer Subregion von β-AP modelliert, die 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 oder 3 Aminosäuren fang ist. In einem Anwendungsfall ist die Subregion von β-AP, der die ACD nachgebildet wird, eine interne oder carboxyterminale Region von β-AP (d. h. stromabwärts zum Aminoterminus an Aminosäure-Position 1). In einem anderen Anwendungsfall wird die ACD einer Subregion von β-AP nachgebildet, die hydrophob ist. In bestimmten spezifischen Anwendungsfällen schließt der Ausdruck Aβ Aggregation-Kern-Domäne spezifische β-AP Subregionen aus, die den Aminosäure-Positionen 1-15 (Aβ&sub1;&submin;&sub1;&sub5;), 6-20 (Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0;) und 16-40 (Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub0;) entsprechen.
Eine Aβ Aggregation-Kern-Domäne kann aus Aminosäure-Resten bestehen, die durch Peptidbindungen verknüpft sind. Das bedeutet, die ACD kann ein Peptid sein, das einer Subregion von β-AP entspricht. Wahlweise kann eine Aβ Aggregation-Kern-Domäne der natürlichen Aβ-Peptid-Region nachgebildet werden, kann aber aus einem Peptid-Analogon, Peptid-Derivat oder einer peptidnachahmenden Verbindung oder anderen ähnlichen Verbindungen, die die Struktur und Funktion des natürlichen Peptides nachahmen, bestehen. Dementsprechend ist beabsichtigt, dass, wie hierin verwendet, eine "Aβ Aggregation-Kern-Domäne" Peptide, Peptid-Analoga, Peptid- Derivate und peptidnachahmende Verbindungen einschließt, die bei geeigneter Modifizierung, die Aggregation-modulierende Aktivität der modifizierten natürlichen Aβ-Peptid-Subregion beibehalten. Solche Strukturen werden aufgrund der Aminosäure-Sequenz entworfen und werden hierin als "von Aβ abstammende Peptid-Strukturen" bezeichnet. Versuchsannäherungen zum Entwurf von Peptid-Analoga, -Derivaten und -Nachahmungen sind im Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel siehe Farmer, P. S. in Druc Desian (E. J. Ariens, ed.) Academic Press, New York, 1980 Vol. 10, pp. 119-143; Ball, J. B. und Alewood, P. F. (1990) J. Mol. Recognition 3: 55; Morgan, B. A. und Gainor, J. A. (1989) Ann. Rep. Med. Chem. 24: 243; und Freidinger, R. M. (1989) Trends Pharmacot Sci. 10: 270. Siehe ebenfalls Sawyer, T. K. (1995) "Peptidomimetic Design and Chemical Approaches to Peptide Metabolism" in Taylor, M. D. und Amidon, G. L. (eds.) Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism. Kapitel 17: Smith. A. B. 3% et al. (1995) JJ Am. Chem. Soc. 117: 11113-11123; Smith. A. B. 3rd et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 9947- 9962; und Hirschman, R., et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 12550-12568.
Wie hierin verwendet bezeichnet ein "Derivat" einer Verbindung X (z. B. ein Peptid oder Aminosäure) eine Form von X, in der eine oder mehrere Reaktionsgruppen an der Verbindung mit einer Substituenten-Gruppe derivatisiert worden sind. Beispiele von Peptid-Derivaten schließen Peptide ein, in denen eine Aminosäure-Seitenkette, das Peptidrückgrat oder der Amino- oder Carboxyterminus derivatisiert worden sind (z. B. Peptidverbindungen mit methylierten Amid-Verknüpfungen). Wie hierin verwendet bezeichnet ein "Analog" einer Verbindung X eine Verbindung, die die chemischen Strukturen von X beibehält, die für eine funktionale Aktivität von X notwendig sind, und ebenfalls noch bestimmte chemische Strukturen enthält, die sich von X unterscheiden. Ein Beispiel eines Analogons eines natürlich vorkommenden Peptides ist ein Peptid, das eine oder mehrere nichtnatürlich vorkommende Aminosäuren einschließt. Wie hierin verwendet bezeichnet eine "Nachahmung" einer Verbindung X eine Verbindung, in der chemische Strukturen von X, die für funktionelle Aktivität von X notwendig sind, durch andere chemische Strukturen ersetzt worden sind, die die Konformation von X nachahmen. Beispiele von Peptid-Nachahmungen schließen Peptidverbindungen, in denen das Peptidrückgrat mit einem oder mehreren Benzodiazeplin-Molekülen substituiert worden ist (siehe z. B. James, G. L. et al. (1993) Science 260: 1937- 1942), Peptide, in denen alle L-Aminosäuren durch die entsprechenden D- Aminosäuren substituiert worden sind, und "retro-inverso" Peptide (siehe U.S. Patentnr. 4,522,752 von Sisto), die weiter unten beschrieben sind, ein.
Der Ausdruck Nachahmung und insbesondere Peptid-Nachahmung beabsichtigt Isostere einzuschließen. Der Ausdruck "Isoster", wie hierin verwendet, beabsichtigt eine chemische Struktur einzuschließen, die durch eine zweite chemische Struktur substituiert werden kann, da die sterische Konformation der ersten Struktur in eine für die zweite Struktur spezifische Bindungsstelle passt. Der Ausdruck schließt spezifisch Peptidrückgrat- Modifikationen ein (d. h. Amidbindung-Nachahmungen), die einem Fachmann wohl bekannt sind. Solche Modifikationen schließen Modifikationen des Amid- Stickstoffes, des α-Kohlenstoffes, des Amidcarbonyl, vollständige Ersetzungen der Amidbindung, Verlängerungen, Deletionen oder Rückgratvernetzungen ein. Mehrere Pepitidrückgrat-Modifikationen sind bekannt, einschließlich ψ[CH&sub2;-S], ψ[CH&sub2;NH], ψ[CSNH&sub2;], ψ[NHCO], ψ[COCH&sub2;] und ψ[(E) oder (Z) CH=CH]. In der oben verwendeten Nomenklatur zeigt ψ das Nichtvorhandensein einer Amidbindung an. Die Struktur, die die Amidgruppe ersetzt, ist innerhalb der Klammern spezifiziert. Andere Beispiele von Isosteren schließen Peptide ein, die mit einem oder mehreren Benzodiazepin- Molekülen substituiert sind (siehe z. B. James, G. L. et al. (1993) Science 260: 1937-1942).
Andere mögliche Modifikationen schließen eine N-Alkyl (oder N-Aryl)- Substitution (ψ[CONR]) Rückgrat-Vernetzung, um Lactame und andere cyclische Strukturen, zu konstruieren, Substitution aller L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren innerhalb der Verbindung ("inverso" Verbindungen") oder Retro-inverso Aminosäure-Inkorporation (ψ[NHCO]) ein. Bei "inverso" ist ein Ersetzen von L-Aminosäuren einer Sequenz mit D-Aminosäuren gemeint und "retro-inverso" oder "enantio-retro" bedeutet Reversion der Sequenz der Aminosäuren ("retro") und Ersetzen der L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren. Zum Beispiel ist das Ausgangspeptid Thr-Ala-Tyr, so ist die retro modifizierte Form Tyr-Ala-Thr, die inverso Form ist thr, ala, tyr und die retro- inverso Form ist tyr-ala-thr (kleingeschriebene Buchstaben bezeichnen D- Aminosäuren). Verglichen mit dem Ausgangspeptid hat ein retro-inverso Peptid ein revertiertes Rückgrat, während im wesentlichen die ursprüngliche räumliche Konformation der Seitenketten beibehalten wird, wodurch ein retro- inverso Isomer mit einer Topologie resultiert, die dem Ausgangspeptid sehr ähnelt. Siehe Goodmann et al. "Perspectives in Peptid Chemistry" pp.283- 294 (1981). Siehe ebenfalls U.S. Patentnr. 4,522,752 von Sisto zur weiteren Beschreibung von "retro-inverso" Peptiden.
Andere Derivate von Modulator-Verbindungen der Erfindung schließen C-terminale Hydroxymethyl-Derivate, O-modifizierte Derivate (z. B. C- terminaler Hydroxymethylbenzylether), N-terminal modifizierte Derivate einschließlich substituierter Amide wie zum Beispiel Alkylamide und Hydrazide und Verbindungen, in denen ein C-terminaler Phenylalanin-Rest durch ein Phenethylamid-Analogon ersetzt worden ist (z. B. Val-Phe-Phenethylamid als ein Analogon des Tripeptides Val-Phe-Phe).
In einem bevorzugten Anwendungsfall wird die ACD des Modulators der Subregion von β-AP nachgebildet, die die Aminosäure-Positionen 17-20 (d. h. Leu-Val-Phe-Phe; SEQ ID NR.12) umfasst. Wie weiter in den Beispielen 7, 8 und 9 beschrieben, wurden Peptid-Subregionen von Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; präpariert, aminoterminal modifiziert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit Aggregation natürlicher β- Amyloid-Peptide zu modulieren, bewertet. Eine Subregion, die eine Aggregation wirksam hemmte, war Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (d. h. Aminosäure-Reste 6-20 des natürlichen Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Peptides, die Aminosäure-Sequenz davon ist in SEQ ID NR. 4 gezeigt). Aminosäure-Reste wurden nacheinanderfolgend von dem Aminoterminus oder Carboxyterminus dieser Subregion deletiert, um eine minimale Subregion näher zu beschreiben, die für eine aggregationshemmende Aktivität ausreichte. Dieser Vorgang definierte Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub0; (d. h. die Aminosäure-Reste 17-20 des natürlichen Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Peptides) als eine minimale Subregion, die bei geeigneter Modifizierung für aggregationshemmende Aktivität ausreicht. Dementsprechend kann eine "Aβ Aggregation-Kern-Domäne" innerhalb einer Modulator-Verbindung der Erfindung Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub0; nachgebildet werden. In einem Anwendungsfall umfasst die Aβ Aggregation-Kern-Domäne Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub0; selbst (d. h. ein Peptid, das die Aminosäure-Sequenz Leucin-Valin-Phenylalanin- Phenylalanin umfasst; SEQ ID NR. 12). In anderen Anwendungsfällen wird die Struktur von Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub0; als ein Model für den Entwurf einer Aβ Aggregation- Kern-Domäne mit ähnlicher Struktur und Funktion wie Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub0; verwendet. Zum Beispiel können Peptid-Nachahmungen, Derivate oder Analoga von Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub0; (wie oben beschrieben) als eine Aβ Aggregation-Kern-Domäne verwendet werden. Zusätzlich zu Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub0; ist es wahrscheinlich, dass das natürliche Aβ- Peptid andere minimale Subregionen enthält, die für eine aggregationshemmende Aktivität ausreichen. Solche zusätzlichen minimalen Subregionen können durch die in den Beispielen 7, 8 und 9 beschriebenen Vorgänge identifiziert werden, worin eine 15mer Subregion von Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; nacheinanderfolgend von dem Aminoterminus oder Carboxyterminus deletiert wird, die deletierten Peptide werden geeignet modifiziert und dann hinsichtlich ihrer aggregationshemmenden Aktivität bewertet.
Eine Form einer β-Amyloid-Modulator-Verbindung, die eine Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub0;, nachgebildete Aβ Aggregation-Kern-Domäne umfasst, die direkt oder indirekt an mindestens eine modifizierende Gruppe gekoppelt ist, hat die Formel:
worin Xaa&sub1; und Xaa&sub3; Aminosäure-Strukturen sind;
Xaa&sub2; eine Valin-Struktur ist;
Xaa&sub4; eine Phenylalanin-Struktur ist;
Y, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, eine Peptid-Struktur mit der Formel (Xaa)a ist, worin Xaa eine beliebige Aminosäure-Struktur ist und a eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist;
Z, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, eine Peptid-Struktur mit der Formel (Xaa)b ist, worin Xaa eine beliebige Aminosäure-Struktur ist und b eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist; und
A eine modifizierende Gruppe ist, die direkt oder indirekt an die Verbindung gebunden ist und n eine ganze Zahl ist;
wobei Xaa&sub1;, Xaa&sub3;, Y, Z, A und n so ausgewählt sind, dass die Verbindung die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird;
Vorzugsweise hemmt eine Modulator-Verbindung der obigen Formel eine Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird und/oder sie hemmt Aβ-Neurotoxizität. Wahlweise kann die Modulator-Verbindung eine Aggregation natürlicher β Amyloid-Peptide fördern, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid- Peptiden in Kontakt gebracht wird. Die Art und Anzahl modifizierender Gruppen ("A") gekoppelt an den Modulator ist so ausgewählt, dass die Verbindung eine Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide verändert (und vorzugsweise hemmt), wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. Eine einzige modifizierende Gruppe kann an den Modulator gekoppelt sein (d. h. n = 1 in der obigen Formel) oder wahlweise können mehrere modifizierende Gruppen an den Modulator gekoppelt sein, in verschiedenen Anwendungsfällen ist n eine ganze Zahl zwischen 1 und 60, zwischen 1 und 30, zwischen 1 und 10, zwischen 1 und 5 oder zwischen 1 und 3. Geeignete Arten modifizierender Gruppen sind weiter unten in Unterabschnitt II beschrieben.
Wie in Beispiel 9 gezeigt, sind die Aminosäure-Positionen 18 (Val&sub1;&sub8;) und 20 (Phe&sub2;&sub0;) von Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub0; (die Xaa&sub2; und Xaa&sub4; entsprechen) innerhalb der Kerndomäne für eine inhibitorische Aktivität der Modulator-Verbindung besonders wichtig. Dementsprechend sind diese Positionen innerhalb der Kerndomäne in der oben dargestellten Formei konserviert. Die Ausdrücke "Valin-Struktur" und "Phenylalanin-Struktur" wie in der obigen Formel verwendet, beabsichtigen die natürlichen Aminosäuren, als auch nichtnatürlich vorkommende Analoga, Derivate und Nachahmungen von Valin und beziehungsweise Phenylalanin, (einschließlich D-Aminosäuren), einzuschließen, die die funktionelle Aktivität der Verbindung beibehalten. Außerdem, obwohl Val&sub1;&sub8; und Phe&sub2;&sub0; eine wichtige funktionelle Rolle haben, ist es möglich, dass Xaa&sub2; und/ oder Xaa&sub4; durch andere natürlich vorkommende Aminosäuren substituiert werden können, die mit Valin oder beziehungsweise Phenylalanin strukturell verwandt sind, während immer noch die Aktivität der Verbindung beibehalten wird. Somit beabsichtigen die Ausdrücke "Valin-Struktur" konservative Aminosäure-Substitutionen einzuschließen, die die Aktivität von Valin bei Xaa&sub2; beibehalten und der Ausdruck "Phenylalanin-Struktur" beabsichtigt, konservative Aminosäure-Substitutionen einzuschließen, die die Aktivität von Phenylalanin bei Xaa&sub4; beibehalten. Dennoch beabsichtigt der Ausdruck "Valin-Struktur" nicht, Threonin einzuschließen.
Im Gegensatz zu Positionen 18 und 20 von Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub0; zerstörte eine Phe zu Ala Substitution an Position 19 (entspricht Xaa&sub3;) die Aktivität des Modulators nicht, was darauf hinweist, dass Position 19 eher für Aminosäure-Substitution geeignet ist. In verschiedenen Anwendungsfällen der obigen Formel, sind die Positionen Xaa&sub1; und Xaa&sub3; eine beliebige Aminosäure-Struktur. Der Ausdruck "Aminosäure-Struktur" beabsichtigt sowohl natürliche und nichtnatürliche Aminosäuren als auch Analoga, Derivate und Nachahmungen davon einzuschließen, einschließlich D-Aminosäuren. In einem bevorzugten Anwendungsfall der obigen Formel ist Xaa&sub1; eine Leucin-Struktur und Xaa&sub3; ist eine Phenylalanin-Struktur (d. h. Leu&sub1;&sub7; und beziehungsweise Phe&sub1;&sub9; in der natürlichen Aβ-Peptid-Sequenz nachgebildet). Der Ausdruck "Leucin-Struktur" wird hierin auf die gleiche Weise wie Valin-Struktur und Phenylalanin-Struktur, wie oben beschrieben, verwendet. Wahlweise ist Xaa&sub3; in einem anderen Anwendungsfall eine Alanin-Struktur.
Die Vier-Aminosäuren-Struktur von ACD des Modulators der obigen Formel kann an der aminoterminalen Seite, carboxyterminalen Seite oder an beiden, mit Peptid-Strukturen flankiert sein, die entweder von der natürlichen Aβ-Peptid-Sequenz oder von nicht-Aβ-Sequenzen abstammen. Der Ausdruck "Peptid-Struktur" beabsichtigt Peptid-Analoga, Derivate und Nachahmungen davon, wie oben beschrieben, einzuschließen. Die Peptid-Struktur besteht aus einer oder mehreren verknüpften Aminosäure-Strukturen, von denen die Art und Anzahl in der obigen Formel variabel ist. Zum Beispiel flankieren in einem Anwendungsfall keine zusätzlichen Aminosäure-Strukturen die Xaa&sub1;- Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-Xaa&sub4; Kernsequenz (d. h. Y und Z sind in der obigen Formel nicht vorhanden). In einem anderen Anwendungsfall flankieren eine oder mehrere zusätzliche Aminosäure-Strukturen nur den Aminoterminus der Kernsequenzen (d. h. Y ist vorhanden, aber Z ist in der obigen Formel nicht vorhanden). In noch einem anderen Anwendungsfall flankieren eine oder mehrere zusätzliche Aminosäure-Strukturen nur den Carboxyterminus der Kernsequenzen (d. h. Z ist vorhanden, aber Y ist in der obigen Formel nicht vorhanden). Die Länge der flankierenden Z oder Y Sequenzen ist ebenfalls variabel. Zum Beispiel sind in einem Anwendungsfall a und b ganze Zahlen von 1 bis 15. Bevorzugter sind a und b ganze Zahlen zwischen 1 und 10. Noch bevorzugter sind a und b ganze Zahlen zwischen 1 und 5. Am bvorzugsten sind a und b ganze Zahlen zwischen 1 und 3.
Eine Form einer β-Amyloid-Modulator-Verbindung, die eine Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub0; nachgebildete Aβ Aggregation-Kern-Domäne umfasst, die direkt oder indirekt an mindestens eine modifizierende Gruppe gekoppelt ist, hat die Formel:
A-(Y)-Xaa&sub1;-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-Xaa&sub4;-(Z)-B
worin Xaa&sub1; und Xaa&sub3; Aminosäuren oder Aminosäure- Nachahmungen sind;
Xaa&sub2; Valin oder eine Valin-Nachahmung ist;
Xaa&sub4; Phenylalanin oder eine Phenylalanin-Nachahmung ist;
Y, das vorhanden oder nicht vorhanden sein Kann, ein Peptid oder eine Peptid-Nachahmung mit der Formel (Xaa)a ist, worin Xaa eine beliebige Aminosäure oder Aminosäure-Nachahmung ist und a eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist;
Z, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, ein Peptid oder Peptid-Nachahmung mit der Formel (Xaa)b ist, worin Xaa eine beliebige Aminosäure oder Aminosäure-Nachahmung ist und b eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist; und
A eine B, von denen mindestens eines vorhanden ist, modifizierende Gruppen sind, die direkt oder indirekt an den Aminoterminus und beziehungsweise Carboxyterminus der Verbindung gebunden sind;
wobei Xaa&sub1;, Xaa&sub3;, Y, Z, A und B so ausgewählt sind, dass die Verbindung die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität natürlicher β- Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird.
In diesem Anwendungsfall ist die Modulator-Verbindung an entweder ihrem Aminoterminus, ihrem Carboxyterminus oder beiden spezifisch modifiziert. Die in dieser Formei verwendete Terminologie ist die gleiche wie oben beschrieben. Geeignete modifizierende Gruppen sind im Unterabschnitt II unten beschrieben. In einem Anwendungsfall wird die Verbindung nur an ihrem Aminoterminus modifiziert (d. h. B ist nicht vorhanden und die Verbindung umfasst die Formel: A-(Y)-Xaa&sub1;-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-Xaa&sub4;-(Z)). In einem anderen Anwendungsfall ist die Verbindung nur an ihrem Carboxyterminus modifiziert (d. h. A ist nicht vorhanden und die Verbindung umfasst die Formel: (Y)-Xaa&sub1;- Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-Xaa&sub4;-(Z)-B). In noch einem anderen Anwendungsfall ist die Verbindung an sowohl ihrem Amino- als auch ihrem Carboxyterminus modifiziert (d. h. die Verbindung umfasst die Formel A-(Y)-Xaa, -Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-Xaa&sub4;-(Z)-B und sowohl A und B sind vorhanden). Wie oben beschrieben, ist die Art und Anzahl der Aminosäure-Strukturen, die die Xaa&sub1; -Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-Xaa&sub4; Kernsequenzen in der obigen Formel flankieren, variabel. Zum Beispiel sind in einem Anwendungsfall a und b ganze Zahlen von 1 bis 15. Bevorzugter sind a und b ganze Zahlen zwischen 1 und 10. Noch Bevorzugter sind a und b ganze Zahlen zwischen 1 und 5. Am bevorzugtesten sind a und b ganze Zahlen zwischen 1 und 3.
Wie in den Beispielen 7, 8 und 9 gezeigt, umfassen bevorzugte Aβ- Modulator-Verbindungen der Erfindung modifizierte Formen von Aβ&sub1;&sub4;&submin;&sub2;&sub1; (His- Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala; SEQ ID NR. 5), oder aminoterminale oder carboxyterminale Deletionen davon mit einer bevorzugten "minimalen Kernregion", die Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub0; umfasst. Dementsprechend stellt die Erfindung in spezifischen Anwendungsfällen Verbindungen bereit, die die Formel umfassen:
A-Xaa&sub1;-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-Xaa&sub4;-Xaa&sub5;-Xaa&sub5;-Xaa&sub7;-Xaa&sub8;-B
worin Xaa&sub1; eine Histidin-Struktur ist;
Xaa&sub2; eine Glutamin-Struktur ist;
Xaa&sub3; eine Lysin-Struktur ist;
Xaa&sub4; eine Leucin-Struktur ist;
Xaa&sub5; eine Valin-Struktur ist;
Xaa&sub5; eine Phenylalanin-Struktur ist;
Xaa&sub7; eine Phenylalanin-Struktur ist;
Xaa&sub8; eine Alanin-Struktur ist;
A und B modifizierende Gruppen sind, die direkt oder indirekt an den Aminoterminus oder beziehungsweise Carboxyterminus der Verbindung gebunden sind;
und worin Xaa&sub1;-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;, Xaa&sub1;-Xaa&sub2; oder Xaa&sub1; vorhanden oder nicht vorhanden sind;
Xaa&sub8; vorhanden oder nicht vorhanden ist; und
mindestens A oder B vorhanden ist.
In einem spezifischen Anwendungsfall umfasst die Verbindung die Formel: A-Xaa&sub4;-Xaa&sub5;-Xaa&sub6;-Xaa&sub7;-B (z. B. eine modifizierte Form von Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub0;, die eine Aminosäure-Sequenz Leu-Val-Phe-Phe; SEQ ID NR. 12 umfasst).
In einem anderen spezifischen Anwendungsfall umfasst die Verbindung die Formel: A-Xaa&sub4;-Xaa&sub5;-Xaa&sub5;-Xaa&sub7;-Xaa&sub8;-B (z. B. eine modifizierte Form von Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub1;, die eine Aminosäure-Sequenz Leu-Val-Phe-Phe-Ala; SEQ ID NR. 11 umfasst).
In einem anderen spezifischen Anwendungsfall umfasst die Verbindung die Formel: A-Xaa&sub3;-Xaa&sub4;-Xaa&sub5;-Xaa&sub5;-Xaa&sub7;-B (z. B. eine modifizierte Form von Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0;, die eine Aminosäure-Sequenz Lys-Leu-Val-Phe-Phe; SEQ ID NR. 10 umfasst).
In einem anderen spezifischen Anwendungsfall umfasst die Verbindung die Formel: A-Xaa&sub3;-Xaa&sub4;-Xaa&sub5;-Xaa&sub5;-Xaa&sub7;-Xaa&sub8;-B (z. B. eine modifizierte Form von Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub1;, die eine Aminosäure-Sequenz Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala; SEQ ID NR. 9 umfasst).
In einem anderen spezifischen Anwendungsfall umfasst die Verbindung die Formel: A-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-Xaa&sub4;-Xaa&sub5;-Xaa&sub5;-Xaa&sub7;-B (z. B. eine modifizierte Form von Aβ&sub1;&sub5;&submin;&sub2;&sub0;, die eine Aminosäure-Sequenz Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe; SEQ ID NR. 8 umfasst).
In einem anderen spezifischen Anwendungsfall umfasst die Verbindung die Formel: A-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-Xaa&sub4;-Xaa&sub5;-Xaa&sub6;-Xaa&sub7;-Xaa&sub8;-B (z. B. eine modifizierte Form von Aβ&sub1;&sub5;&submin;&sub2;&sub1;, die eine Aminosäure-Sequenz Gln-Lys-Leu- Val-Phe-Phe-Ala; SEQ ID NR. 7 umfasst).
In einem anderen spezifischen Anwendungsfall umfasst die Verbindung die Formel: A-Xaa&sub1;-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-Xaa&sub4;-Xaa&sub5;-Xaa&sub5;-Xaa&sub7;-B (z. B. eine modifizierte Form von Aβ&sub1;&sub4;&submin;&sub2;&sub0;, die eine Aminosäure-Sequenz His-Gln-Lys- Leu-Val-Phe-Phe; SEQ ID NR. 6 umfasst).
In einem anderen spezifischen Anwendungsfall umfasst die Verbindung die Formel: A-Xaa&sub1;-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-Xaa&sub4;-Xaa&sub5;-Xaa&sub6;-Xaa&sub7;-Xaa&sub8;-B (z. B. eine modifizierte Form von Aβ&sub1;&sub4;&submin;&sub2;&sub1;, die eine Aminosäure-Sequenz His-Gln-Lys- Leu-Val-Phe-Phe-Ala; SEQ ID NR. 5 umfasst).
In bevorzugten Anwendungsfällen der vorhergenannten spezifischen Anwendungsfälle ist A oder B eine Cholanoyl-Struktur oder eine Biotin-haltige Struktur (unten in Unterabschnitt II weiter beschrieben).
In weiteren Experimenten zum Beschreiben der Subregionen von Aβ, denen eine Aβ Aggregation-Kern-Domäne nachgebildet werden kann, (die Ergebnisse davon sind in Beispiel 11 beschrieben), wurde gezeigt, dass eine Modulator-Verbindung mit inhibitorischer Aktivität so wenig wie nur drei Aβ- Aminosäure-Reste umfassen kann (z. B. Val-Phe-Phe, welche Aβ&sub1;&sub8;&submin;&sub2;&sub0; entsprechen oder Phe-Phe-Ala, welche Aβ&sub1;&sub9;&submin;&sub2;&sub1; entsprechen). Die Ergebnisse zeigten ebenfalls, dass eine Modulator-Verbindung mit einer modulierenden Gruppe an ihrem Carboxyterminus eine Aβ-Aggregation wirksam hemmt. Die Ergebnisse zeigten ferner noch, dass die Cholyl-Gruppe als eine modulierende Gruppe unter Beibehaltung der inhibitorischen Aktivität der Verbindungen manipuliert werden kann und dass ein Phenylalanin durch Iodtyrosyl unter Beibehaltung der Fähigkeit der Verbindung eine Aβ-Aggregation zu hemmen, substituiert werden kann (z. B. bei Position 19 oder 20 der Aβ- Sequenz).
Die Ergebnisse zeigen außerdem noch, dass Verbindungen mit einer inhibitorischen Aktivität unter Verwendung von Aminosäure-Resten geschaffen werden können, die von der Aβ-Sequenz in der Region von etwa den Positionen 17-21 abstammen, worin aber die Aminosäure-Sequenz umgeordnet ist oder eine Substitution durch eine nicht von Aβ abstammende Aminosäure hat. Beispiele solcher Verbindungen schließen PPI-426, in dem die Sequenz von Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub1; (LVFFA) umgeordnet wurde (FFVLA), PPI-372, in dem 1 die Sequenz von Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (KLVFF) umgeordnet wurde (FKFVL) und PPI-338, - 389 und -390, in denen die Sequenz von Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub1; (LVFFA) an den Positionen 17, 18, oder beziehungsweise 19 durch einen Alanin-Rest substituiert wurde (AVFFA für PPI-388, LAFFA für PPI-389 und LVAFA für Position für PPI-390) ein. Die inhibitorische Aktivität dieser Verbindungen ist ein Hinweis, dass das Vorhandensein einer Aminosäure-Sequenz in der Verbindung, die direkt einem Teil von Aβ entspricht, nicht für die inhibitorische Aktivität wesentlich ist, lässt aber eher vermuten, dass eine Beibehaltung der hydrophoben Eigenschaft dieser Kernregion durch Einschließen von Aminosäure-Resten, wie zum Beispiel Phenylalanin, Valin, Leucin, ungeachtet ihrer präzisen Reihenfolge für eine Hemmung einer Aβ-Aggregation ausreichend sein kann. Dementsprechend kann eine auf der direkten Aβ-Aminosäure-Sequenz oder einer umgeordneten Aβ-Sequenz, die die Hydrophobizität der Aβ-Subregion beibehält, basierende Aβ Aggregation-Kern-Domäne entworfen werden, z. B. die Region um die Positionen 17-20. Diese Region von Aβ enthält die Aminosäure-Reste Leu, Val und Phe. Dementsprechend bestehen bevorzugte Aβ Aggregation-Kern-Domänen aus mindestens drei Aminosäure- Strukturen (da dieser Ausdruck vorstehend definiert wurde, einschließlich Aminosäure-Derivate, -Analoga und -Nachahmungen), worin mindestens zwei der Aminosäure-Strukturen unabhängig entweder eine Leucin-Struktur, eine Valin-Struktur oder eine Phenylalanin-Struktur (da diese Ausdrücke vorstehend definiert wurden, einschließlich Derivate, Analoga und Nachahmungen) sind.
Somit stellt in einem anderen Anwendungsfall die Erfindung eine β- Amyloid-Modulator-Verbindung bereit, die eine Formel umfasst:
worin Xaa&sub1;, Xaa&sub2; und Xaa&sub3; jeweils Aminosäure-Strukturen sind und mindestens zwei aus Xaa&sub1;, Xaa&sub2; und Xaa&sub3; unabhängig sind und aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus einer Leucin-Struktur, einer Phenylalanin-Struktur und einer Valin-Struktur;
Y, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, ist eine Peptidstruktur mit der Formel (Xaa)a, worin Xaa eine beliebige Aminosäure- Struktur ist und a eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist;
Z, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann" ist eine Peptidstruktur mit der Formel (Xaa)b, worin Xaa eine beliebige Aminosäure- Struktur ist und b eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist; und
A eine modifizierende Gruppe ist, die direkt oder indirekt an die Verbindung gebunden ist und n eine ganze Zahl ist;
wobei Xaa&sub1;, Xaa&sub2;, Xaa&sub3;, Y, Z, A und n so ausgewählt sind, dass die Verbindung die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird.
Vorzugsweise hemmt die Verbindung eine Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. In bevorzugten Anwendungsfällen sind Xaa&sub1; und Xaa&sub2; jeweils Phenylalanin-Strukturen oder Xaa&sub2; und Xaa&sub3; sind jeweils Phenylalanin-Strukturen. "n" kann zum Beispiel eine ganze Zahl zwischen 1 und 5 sein, während "a" und "b" zum Beispiel ganze Zahlen zwischen 1 und 5 sind. Die modifizierende Gruppe "A" umfasst vorzugsweise eine cyclische, heterocyclische oder polycyclische Gruppe. Noch bevorzugter enthält A eine cis-Decalin-Gruppe, wie zum Beispiel eine Cholanyl-Struktur oder eine Cholyl-Gruppe. In anderen Anwendungsfällen kann A eine Biotin-haltige Gruppe, eine Diethylentriaminpentaacetyl-Gruppe, eine (-)-Menthoxyacetyl- Gruppe, eine Fluorescein-haltige Gruppe oder eine N-Acetylneuraminyl- Gruppe umfassen. In noch anderen Anwendungsfällen kann die Verbindung eine Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden fördern, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird, und kann weiter modifiziert werden, um die pharmakokinetische Eigenschaft der Verbindung zu verändern oder kann weiter modifiziert werden, um die Verbindung mit einer detektierbaren Substanz zu markieren.
In einem anderen Anwendungsfall stellt die Erfindung eine β-Amyloid- Modulator-Verbindung bereit, die eine Formel umfasst:
A-(Y)-Xaa&sub1;-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-(Z)-B
worin Xaa&sub1;, Xaa&sub2; und Xaa&sub3; jeweils Aminosäure-Strukturen sind und mindestens zwei aus Xaa&sub1;, Xaa&sub2; und Xaa&sub3; unabhängig sind und aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus einer Leucin-Struktur, einer Phenylalanin-Struktur und einer Valin-Struktur;
Y, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, ist eine Peptid-Struktur mit der Formel (Xaa)a, worin Xaa eine beliebige Aminosäure- Struktur ist und a eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist;
Z, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, ist eine Peptid-Struktur mit der Formel (Xaa)b, worin Xaa eine beliebige Aminosäure- Struktur ist und b eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist; und
A und B, von denen mindestens eines vorhanden ist, modifizierende Gruppen sind, die direkt oder indirekt an den Aminoterminus und beziehungsweise Carboxyterminus der Verbindung gebunden sind;
wobei Xaa&sub1;, Xaa&sub2;, Xaa&sub3;, Y, Z, A und B so ausgewählt sind, dass die Verbindung die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden hemmt, wenn sie mit den natürlichen β- Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird.
Vorzugsweise hemmt die Verbindung eine Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Pepitden in Kontakt gebracht wird. In bevorzugten Anwendungsfällen sind Xaa, und Xaa&sub2; jeweils Phenylalanin-Strukturen oder Xaa&sub2; und Xaa&sub3; sind jeweils Phenylalanin-Strukturen. In einem untergeordneten Anwendungsfall umfasst die Verbindung die Formel:
A-(Y)-Xaa&sub1;-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-(Z)
In einem anderen untergeordneten Anwendungsfall umfasst die Verbindung die Formel:
(Y)-Xaa&sub1;-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-(Z)-B
"n" kann, zum Beispiel eine ganze Zahl zwischen 1 und 5 sein, während "a" und "b" zum Beispiel ganze Zahlen zwischen 1 und 5 sind. Die modifizierende Gruppe "A" umfasst vorzugsweise eine cyclische, heterocyclische oder polycyclische Gruppe. Bevorzugter enthält A eine cis-Decalin-Gruppe, wie zum Beispiel eine Cholanyl-Struktur oder eine Cholyl-Gruppe. In anderen Anwendungsfällen kann A eine Biotin-haltige Gruppe, eine Diethylentriaminpentaacetyl-Gruppe, eine (-)-Menthoxyacetyl-Gruppe, eine Fluoresceinhaltige Gruppe oder eine N-Acetylneuraminyl-Gruppe umfassen. In noch anderen Anwendungsfällen kann die Verbindung eine Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden fördern, wenn sie mit den natürlichen β- Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird, und kann weiter modifiziert werden, um eine pharmakokinetische Eigenschaft der Verbindung zu verändern oder kann weiter modifiziert werden, um die Verbindung mit einer detektierbaren Substanz zu markieren.
In bevorzugten spezifischen Anwendungsfällen stellt die Erfindung eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung bereit, die eine direkt oder indirekt an eine Peptid-Struktur gebundene modifizierende Gruppe umfasst, worin die Peptid- Struktur Aminosäure-Strukturen mit einer Aminosäure-Sequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 5), His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe (SEQ ID Nr. 6), Gln-Lys-Leu- Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 7), Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe (SEQ ID Nr. 8), Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 9), Lys-Lau-Val-Phe-Phe (SEQ ID Nr. 10), Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 11), Leu-Val-Phe-Phe (SEQ ID Nr. 12), Leu-Ala-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 13), Val-Phe-Phe (SEQ ID Nr. 19), Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 20), Phe-Phe-Val-Leu-Ala (SEQ ID Nr. 21), Leu- Val-Phe-Phe-Lys (SEQ ID Nr. 22), Leu-Val-Iodtyrosin-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 23), Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 24), Ala-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 25), Leu-Val-Phe-Iodtyrosin-Ala (SEQ ID Nr. 26), Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu (SEQ ID Nr. 27), Phe-Phe-Val-Leu (SEQ ID Nr. 28), Phe-Lys-Phe-Val-Leu (SEQ ID Nr. 29), Lys-Leu-Val-Ala-Phe (SEQ ID Nr. 30), Lys-Leu-Val-Phe-Phe-βAla (SEQ ID Nr. 31) und Leu-Val-Phe-Phe-DAla (SEQ ID Nr. 32).
Diese spezifischen Verbindungen können weiter modifiziert werden, um eine pharmakokinetische Eigenschaft der Verbindung zu verändern und/oder weiter modifiziert werden, um die Verbindung mit einer detektierbaren Substanz zu markieren.
Diese Modulator-Verbindungen der Erfindung können in pharmazeutischen Zusammensetzungen inkorporiert sein (weiter im Unterabschnitt V unten beschrieben) und können in Detektions- und Behandlungsverfahren, wie im Unterabschnitt VI unten weiter beschrieben, verwendet werden.

II. Modifizierende Gruppen

Innerhalb einer Modulator-Verbindung der Erfindung ist eine Peptid- Struktur (wie zum Beispiel ein von Aβ abstammendes Peptid oder eine Aβ Aggregation-Kern-Domäne oder eine Aminosäure-Sequenz, die einer umgeordneten Aβ Aggregation-Kern-Domäne entspricht) an mindestens eine modifizierende Gruppe (abgekürzt mit MG) direkt oder indirekt gekoppelt. In einem Anwendungsfall, in dem Modulator-Verbindungen der Erfindung eine an eine Aggregation-Kern-Domäne gekoppelte modifizierende Gruppe umfassen, kann die Verbindung schematisch als MG-ACD veranschaulicht werden. Der Ausdruck "modifizierende Gruppe" beabsichtigt Strukturen, die direkt an die Peptid-Struktur gebunden sind (z. B. durch kovalente Kopplung), als auch solche, die indirekt an die Peptid-Struktur gebunden sind (z. B. durch eine stabile nichtkovalente Assoziation oder durch kovalente Kopplung an zusätzliche Aminosäure-Reste, oder -Nachahmungen, -Analoga oder - Derivate davon, die die von Aβ abstammende Peptid-Struktur flankieren können), einzuschließen. Zum Beispiel kann die modifizierende Gruppe an den Aminoterminus oder Carboxyterminus einer von Aβ abstammenden Peptid-Struktur oder an eine die Kerndomäne flankierende Peptid- oder peptidnachahmende Region gekoppelt sein. Wahlweise kann die modifizierende Gruppe an eine Seitenkette von mindestens einem Aminosäure-Rest einer von Aβ abstammenden Peptid-Struktur oder an eine die Kerndomäne flankierende Peptid- oder peptidnachahmende Region gekoppelt sein (z. B. durch die Epsilon-Aminogruppe von (einem) Lysyl-Rest(en), durch die Carboxyl-Gruppe von (einem) Asparaginsäure-Rest(en) oder von (einem) Glutaminsäure-Rest(en), durch eine Hydroxygruppe von (einem) Tyrosyl- Rest(en), von (einem) Serin-Rest(en) oder von (einem) Threonin-Rest(en) oder einer anderen geeigneten reaktiven Gruppe an der Aminosäure Seitenkette). An die Peptid-Struktur gekoppelte modifizierende Gruppen können mit Hilfe und unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren zur Verknüpfung chemischer Strukturen gebunden werden, einschließlich, zum Beispiel Amid-, Alkylamino-, Carbamat- oder Harnstoff- Bindungen.
Der Ausdruck "modifizierende Gruppe" beabsichtigt Gruppen einzuschließen, die nicht natürlich an natürliche Aβ-Peptide in ihrer nativen Form gekoppelt sind. Dementsprechend beabsichtigt der Ausdruck "modifizierende Gruppe" nicht Wasserstoff einzuschließen. Die modifizierende(n) Gruppe(n) ist(sind) so ausgewählt, dass die Modulator-Verbindung eine Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden verändert, und vorzugsweise hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird oder sie die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. Obwohl nicht beabsichtigt ist, die Mechanismen einzuschränken, wird angenommen, dass die modifizierende(n) Gruppe(n) der Modulator-Verbindungen der Erfindung als ein Schlüssel-Pharmakophor wirken, das wichtig ist, um dem Modulator die Fähigkeit zu verleihen, eine Aβ-Polymerisation zu unterbrechen.
In einem bevorzugten Anwendungsfall umfasst(umfassen) die modifizierende(n) Gruppe(n) eine cyclische, heterocyclische oder polycyclische Gruppe. Der Ausdruck "cyclische Gruppe", wie hierin verwendet, beabsichtigt eine cyclische gesättigte oder ungesättigte (d. h. aromatische) Gruppe mit etwa 3 bis 10, vorzugsweise etwa 4 bis 8 und bevorzugter 5 bis 7 Kohlenstoff- Atomen einzuschließen. Exemplarische cyclische Gruppen schließen Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cyclooctyl ein. Cyclische Gruppen können an einer oder an mehreren Ringpositionen unsubstituiert oder substituiert sein. Somit kann eine cyclische Gruppe substituiert sein mit z. B. Halogenen, Alkylen, Cycloalkylen, Aklenylen, Alkynylen, Arylen, Heterocyclen, Hydroxylen, Amino, Nitro, Thiolaminen, Iminen, Amiden, Phosphonaten, Phosphinen, Carbonylen, Carboxylen, Silylen, Ethern, Thioethern, Sulfonylen, Sulfonaten, Selenoethern, Ketonen, Aldehyden, Estern, -CF&sub3;, -CN oder Ähnlichen.
Der Ausdruck "heterocyclische Gruppe" beabsichtigt ein cyclische gesättigte oder ungesättigte (d. h. aromatische) Gruppe mit etwa 3 bis 10, vorzugsweise etwa 4 bis 8 und bevorzugter 5 bis 7 Kohlenstoff-Atomen einzuschließen, worin die Ringstruktur etwa ein bis vier Heteroatome einschließt. Heterocyclische Gruppen schließen Pyrrolidin, Oxolan, Thiolan, Imidazol, Oxazol, Piperidin, Piperazin, Morpholin ein. Der heterocyclische Ring kann an einer oder an mehreren Positionen substituiert sein mit solchen Substituenten wie, zum Beispiel Halogenen, Alkylen, Cycloalkylen, Alkenylen, Alkynylen, Arylen, anderen Heterocyclen, Hydroxyl, Amino, Nitro, Thiol, Aminen, Iminen, Amiden, Phosphonaten, Phosphinen, Carbonylen, Carboxylen, Silylen, Ethern, Thioethern, Sulfonylen, Selenoethern, Ketonen, Aldehyden, Estern, -CF&sub3;, -CN oder Ähnlichen. Heterocyclen können ebenfalls an andere cyclische Gruppen überbrückt oder kondensiert werden, wie unten beschrieben.
Der Ausdruck "polycyclische Gruppe", wie hierin verwendet, beabsichtigt zwei oder mehrere gesättigte oder ungesättigte (d. h. aromatische) cyclische Ringe zu bezeichnen, in denen zwei oder mehrere Kohlenstoffatome zwei benachbarten Ringen gemeinsam sind, z. B. sind die Ringe "kondensierte Ringe". Ringe, die über nichtbenachbarte Atome vereint sind, werden "Brücken-Ringe" genannt. Jeder dieser Ringe der polycyclischen Gruppe kann mit solchen Substituenten, wie oben beschrieben, substituiert sein, wie zum Beispiel Halogene, Alkyle, Cycloalkyle, Aklenyle, Alkynyle, Hydroxyl, Amino, Nitro, Thiol, Amine, Imine, Amide, Phosphonate, Phosphine, Carbonyle, Carboxyle, Silyle, Ether, Thioether, Sulfonyle, Selenoether, Ketone, Aldehyde, Ester, -CF&sub3;, -CN oder Ähnliche.
Eine bevorzugte polycyclische Gruppe ist eine cis-Decalin-Struktur- haltige Gruppe. Obwohl es nicht beabsichtigt ist, den Mechanismus einzuschränken, wird angenommen, dass die "gekrümmte" Konformation, die einer modifizierenden Gruppe durch das Vorhandensein einer cis-Decalin-Struktur verliehen wird, an der Wirksamkeit der modifizierenden Gruppe Aβ-Polymerisation zu stören, beteiligt ist. Dementsprechend können andere Strukturen, die die "gekrümmte" Konformation der cis-Decalin-Struktur nachahmen, ebenfalls als modifizierende Gruppen verwendet werden. Ein Beispiel einer cis-Decalin-haltigen Struktur, die als eine modifizierende Gruppe verwendet werden kann, ist eine Cholanoyl-Struktur, wie zum Beispiel eine Cholyl- Gruppe. Zum Beispiel kann eine Modulator-Verbindung an ihrem Aminoterminus mit einer Cholyl-Gruppe durch Reagieren der Aggregation-Kern- Domäne mit Cholsäure, einer Gallensäure, wie in Beispiel 4 beschrieben, modifiziert sein (die Struktur der Cholsäure ist in Fig. 2 veranschaulicht). Außerdem kann eine Modulator-Verbindung an ihrem Carboxyterminus mit einer Cholyl-Gruppe gemäss im Fachgebiet bekannten Verfahren modifiziert sein (siehe z. B. Wess, G. et al. (1993) Tetrahedron Letters, 34: 817-822; Wess, G. et al. (1992) Tetrahedron Letters 33: 195-198; und Kramer, W. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 18598-18604). Cholyl-Derivate und -Analoga können ebenfalls als modifizierende Gruppen verwendet werden. Zum Beispiel ist ein bevorzugtes Cholyl-Derivat Aic (3-(O-Aminoethyl-iso)-cholyl), das eine freie Amino-Gruppe hat, die zur weiteren Modifizierung der Modulator-Verbindung verwendet werden kann (z. B. kann eine Chelation- Gruppe für 99mTc durch die freie Amino-Gruppe von Aic eingeführt werden). Wie hierin verwendet beabsichtigt der Ausdruck "Cholanoyl-Struktur" die Cholyl-Gruppe und Derivate und Analoga davon einzuschließen, insbesondere solche, die eine vier-Ring cis-Decalin-Konfiguration beinhalten. Beispiele von Cholanoyl-Strukturen schließen Gruppen ein, die von anderen Gallensäuren abstammen, wie zum Beispiel Deoxycholsäure, Lithocholsäure, Ursodeoxycholsäure, Chenodeoxycholsäure und Hyodeoxycholsäure, als auch andere verwandte Strukturen, wie zum Beispiel Cholansäure, Bufalin und Resibufogenin (obwohl die zwei letztgenannten Verbindungen für eine Verwendung als eine modifizierende Gruppe nicht bevorzugt sind). Ein anderes Beispiel einer cis-Decalin-haltigen Verbindung ist 5β-Cholestan-3α-ol (das cis-Decalin-Isomer von (+)-Dihydrocholesterol). Zur weiteren Beschreibung von Gallensäure und Steroidstruktur und Nomenklatur siehe Nes, W. R. und McKean, M. L. Biochemistry of Steroids and Other Isopentanoids, University Park Press, Baltimore, MD, Kapitel 2.
Zusätzlich zu cis-Decalin-haltigen Gruppen können andere polycyclische Gruppen als modifizierende Gruppen verwendet werden. Zum Beispiel können von Steroiden oder β-Lactamen abstammende modifizierende Gruppen geeignete modifizierende Gruppen sein. Außerdem sind nichteinschränkende Beispiele mancher zusätzlicher cyclischer, heterocyclischer oder polycyclischer Verbindungen, die zum Modifizieren einer von Aβ abstammenden Peptid-Struktur verwendet werden können, in Fig. 2 schematisch dargestellt. In einem Anwendungsfall ist die modifizierende Gruppe eine "Biotinyl-Struktur", die Biotinyl-Gruppen und Analoga und Derivate davon einschließt (wie zum Beispiel eine 2-Iminobiotinyl-Gruppe). In einem anderen Anwendungsfall kann die modifizierende Gruppe eine "Fluorescein-haltige Gruppe" umfassen, wie zum Beispiel eine Gruppe, die durch Reagieren einer von Aβ abstammenden Peptid-Struktur mit 5- (und 6-)-Carboxyfluorescein, Succinimidylester oder Fluoresceinisothiocyanat hergeleitet wird. In verschiedenen anderen Anwendungsfällen kann(können) die modifizierende(n) Gruppe(n) eine N-Acetylneuraminyl-Gruppe, eine trans-4-Kotinincarboxyl- Gruppe, eine 2-Imino-1-Imidazolidinacetyl-Gruppe, eine (S)-(-)-Indolin-2- carboxyl-Gruppe, eine (-)-Menthoxyacetyl-Gruppe, eine 2-Norbornanacetyl- Gruppe, ein γ-oxo-5-Acenaphtenbutyryl, eine (-)-2-oxo-4-Thiazolidincarboxyl- Gruppe, eine Tetrahydro-3-furoyl-Gruppe, eine 2-Iminobiotinyl-Gruppe, eine Diethylentriaminpentaacetyl-Gruppe, eine 4-Morpholincarbonyl-Gruppe, eine 2-Thiophenacetyl-Gruppe oder eine 2-Thiophensulfonyl-Gruppe umfassen.
Bevorzugte modifizierende Gruppen schließen Gruppen ein, die Cholyl- Strukturen, Biotinyl-Strukturen, Fluorescein-haltige Gruppen, eine Diethylentriaminpentaacetyl-Gruppe, eine (-)-Menthoxyacetyl-Gruppe und eine N- Acetylneuraminyl-Gruppe umfassen. Bevorzugtere modifizierende Gruppen sind solche, die eine Cholyl-Struktur oder eine Iminobiotinyl-Gruppe umfassen.
Zusätzlich zu den oben diskutierten cyclischen, heterocyclischen und polycyclischen Gruppen können in einem Modulator der Erfindung andere Arten modifizierender Gruppen verwendet werden. Zum Beispiel können kleine hydrophobe Gruppen geeignete modifizierende Gruppen sein. Ein Beispiel einer geeigneten nichtcyclischen modifizierenden Gruppe ist eine Acetyl-Gruppe.
Eine andere Art einer modifizierenden Gruppe ist noch eine Verbindung, die eine nichtnatürliche Aminosäure enthält, die als Nachahmung einer beta- Schleife wirkt, wie zum Beispiel eine auf Dibenzofuran-basierende Aminosäure, beschrieben in Tsang, K. Y. et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 3988- 4005; Diaz, H. und Kelly, J. W. (1991) Tetrahedron Letters 41: 5725-5728; und Diaz, H. et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 8316-8318. Ein Beispiel solch einer modifizierenden Gruppe ist eine Peptid-Aminoethyldibenzofuranylpropionsäure (Adp)-Gruppe (z. B. DDIIL-Adp). Diese Art einer modifizierenden Gruppe kann weiter eine oder mehrere N-Methyl-Peptidbindungen umfassen, um zusätzliche sterische Hindernisse für die Aggregation von natürlichem β- AP einzuführen, wenn Verbindungen dieser Art mit natürlichem β-AP interagieren.

III. Zusätzliche Chemische Modifikationen von Aβ-Modulatoren

Eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung der Erfindung kann weiter modifiziert werden, um die spezifischen Eigenschaften der Verbindung zu verändern, während die Fähigkeit der Verbindung eine Aβ-Aggregation zu verändern und Aβ-Neurotoxizität zu hemmen, beibehalten wird. Zum Beispiel wird in einem Anwendungsfall die Verbindung weiter modifiziert, um eine pharmakokinetische Eigenschaft der Verbindung, wie zum Beispiel in vivo Stabilität oder Halbwertszeit zu verändern. In einem anderen Anwendungsfall wird die Verbindung weiter modifiziert, um die Verbindung mit einer detektierbaren Substanz zu markieren. In noch einem anderen Anwendungsfall wird die Verbindung weiter modifiziert, um die Verbindung an einen zusätzlichen therapeutischen Teil zu koppeln. Schematisch kann ein Modulator der Erfindung, der eine direkt oder indirekt an mindestens eine modifizierende Gruppe gekoppelte Aβ Aggregation-Kern-Domäne umfasst, als MG-ACD veranschaulicht werden, während diese Verbindung, die weiter modifiziert worden ist, um die Eigenschaften des Modulators zu verändern als MG-ACD-cm veranschaulicht werden kann, worin cm eine zusätzliche chemische Modifikation anzeigt.
Um die Verbindung chemisch weiter zu modifizieren, wie zum Beispiel zum Verändern der pharmakokinetischen Eigenschaften der Verbindung, können reaktive Gruppen derivatisiert werden. Zum Beispiel kann, wenn die modifizierende Gruppe an das aminoterminale Ende der Aggregation-Kern- Domäne gebunden ist, das carboxyterminale Ende der Verbindung weiter modifiziert werden. Bevorzugte C-terminale Modifikationen schließen solche ein, die die Fähigkeit der Verbindung als ein Substrat für Carboxypeptidasen zu wirken, verringern. Beispiele bevorzugter C-terminaler Modifikatoren schließen eine Amid-Gruppe, eine Ethylamid-Gruppe und verschiedene nichtnatürliche Aminosäuren, wie zum Beispiel D-Aminosäuren und β-Alanin ein. Wahlweise kann, wenn die modifizierende Gruppe an das carboxyterminale Ende der Aggregation-Kern-Domäne gebunden ist, das aminoterminale Ende der Verbindung weiter modifiziert werden, um zum Beispiel die Fähigkeit der Verbindung als ein Substrat für Aminopeptidasen zu wirken, zu verringern.
Eine Modulator-Verbindung kann weiter modifiziert werden, um die Verbindung durch Reagieren der Verbindung mit einer detektierbaren Substanz zu markieren. Geeignete detektierbare Substanzen schließen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Materialien, lumineszente Materialien und radioaktive Materialien ein. Beispiele geeigneter Enzyme schließen Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, β- Galaktosidase oder Acetylcholinesterase ein; Beispiele geeigneter prosthetischer Gruppen-Komplexe schließen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin ein; Beispiele geeigneter fluoreszierender Materialien schließen Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin ein; ein Beispiel eines lumineszenten Materials schließt Luminol ein; und Beispiele eines geeigneten radioaktiven Materials schließen ¹&sup4;C, ¹²³I, ¹²&sup4;I, ¹²&sup5;I, ¹³¹I 99mTc, ³&sup5;S oder ³H ein. In einem bevorzugten Anwendungsfall ist eine Modulator-Verbindung mit ¹&sup4;C entweder durch Inkorporation von ¹&sup4;C in die modifizierende Gruppe oder in eine oder mehrere Aminosäure-Strukturen in der Modulator-Verbindung radioaktiv markiert. Markierte Modulator-Verbindungen können verwendet werden, um die in vivo Pharmakokinetiken der Verbindungen zu bewerten, als auch um Aβ-Aggregation zu detektieren, zum Beispiel für diagnostische Zwecke. Aβ- Aggregation kann unter Verwendung einer markierten Modulator-Verbindung entweder in vivo oder in einer von einem Patienten abstammenden in vitro Probe detektiert werden.
Vorzugsweise ist eine Modulator-Verbindung der Erfindung für eine Verwendung als ein in vivo diagnostisches Mittel mit radioaktivem Technetium oder Iod markiert. Dementsprechend stellt die Erfindung in einem Anwendungsfall eine mit Technetium, vorzugsweise 99mTc markierte Modulator- Verbindung bereit. Verfahren zur Markierung von Peptidverbindungen mit Technetium sind im Fachgebiet bekannt (siehe z. B. U.S. Patentnr. 5,443,815, 5,225,180 und 5,405,297 alle von Dean et al.; Stepniak-Biniakiewicz, D. et al. (1992) J. Med. Chem. 35: 274-279; Fritzberg, A. R. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4025-4029; Baidoo, K. E. et al. (1990) Cancer Res. Suppl. 50: 799 s-803s; und Regan, L. und Smith, C. K. (1995) Science 270: 980-982). Es kann eine modifizierende Gruppe ausgewählt werden, die eine Stelle bereitstellt, an der eine Chelation-Gruppe für 99mTc eingeführt werden kann, wie zum Beispiel das Aic-Derivat der Cholsäure, das eine freie Amino-Gruppe hat (siehe Beispiel 11). In einem anderen Anwendungsfall stellt die Erfindung eine mit radioaktivem Iod markierte Modulator-Verbindung bereit. Zum Beispiel kann ein Phenylalanin-Rest innerhalb der Aβ-Sequenz (wie zum Beispiel Phe&sub1;&sub9; oder Phe&sub2;&sub0;) mit radioaktivem Iodtyrosyl substituiert werden (siehe Beispiel 11). Jedes der verschiedenen Isotope des radioaktiven bods kann zum Erschaffen eines diagnostischen Mittels inkorporiert werden. Vorzugsweise wird ¹²³I (Halbwertszeit = 13,2 Stunden) für Ganzkörperszintigraphie verwendet, ¹²&sup4;I (Halbwertszeit = 4 Tage) wird für Positronen-Emissions- Tomographie (PET) verwendet, ¹²&sup5;I (Halbwertszeit = 60 Tage) wird für Stoffwechselumsatz-Untersuchungen verwendet und ¹³¹I (Halbwertszeit = 8 Tage) wird für Ganzkörperzählung und verzögerte geringauflösende bildgebende Untersuchungen verwendet.
Des Weiteren kann eine zusätzliche Modifikation einer Modulator- Verbindung der Erfindung dazu dienen, der Verbindung eine zusätzliche therapeutische Eigenschaft zu verleihen. Das bedeutet, dass die zusätzliche chemische Modifikation einen zusätzlichen funktionellen Teil umfassen kann. Zum Beispiel kann ein funktioneller Teil, der dazu dient, Amyloid-Plaques abzubauen oder zu lösen, an die Modulator-Verbindung gebunden werden. In dieser Form dient der MG-ACD-Anteil des Modulators dazu, die Verbindung auf Aβ-Peptide zu zielen und die Polymerisation der Aβ-Peptide zu unterbrechen, während der zusätzliche funktionelle Teil dazu dient, Amyloid- Plaques abzubauen oder zu lösen, nachdem die Verbindung auf diese Stellen gezielt worden ist.
In einer alternativen chemischen Modifikation wird eine β-Amyloid- Verbindung der Erfindung in Form eines "Prowirkstoffes" präpariert, worin die Verbindung selbst nicht eine Aβ-Aggregation moduliert, aber die Fähigkeit hat, im Zuge des Stoffwechsels in vivo in eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung, wie hierin beschrieben, transformiert zu werden. Zum Beispiel kann in dieser Art an Verbindung die modulierende Gruppe in Form eines Prowirkstoffes vorhanden sein, der die Fähigkeit hat, im Zuge des Stoffwechsels in die Form einer aktiven modulierenden Gruppe umgewandelt zu werden. Solch eine Form eines Prowirkstoffes einer modifizierenden Gruppe wird hierin als eine "sekundäre modifizierende Gruppe" bezeichnet. Eine Vielzahl an Strategien zur Präparation von Peptid-Prowirkstoffen, die den Stoffwechsel zum Optimieren der Lieferung der aktiven Form des auf Peptid-basierenden Stoffes verwenden, sind im Fachgebiet bekannt (siehe z. B. Moss, J. (1995) in Peptid-Based Drug Design: Controlling Transport and Metabolism, Taylor, M. D. und Amidon, G. L. (eds). Kapitel 18). Zusätzliche Strategien sind spezifisch auf ein Erzielen einer auf einen "aufeinanderfolgenden Stoffwechsel" basierenden ZNS-Zuführung zugeschnitten (siehe z. B. Bodor, N., et al. (1992) Science 257: 1698-1700; Prokai, L., et al. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 2643-2644; Bodor, N. und Prokai, L. (1995) in Peptide- Based Drua Design: Controlling Transport and Metabolism. Taylor, M. D. und Amidon, G. L. (eds). Kapitel 14). In einem Anwendungsfall einer Form eines Prowirkstoffes eines Modulators der Erfindung umfasst die modifizierende Gruppe einen Alkylester zum Erleichtern der Blut-Hirn-Schranken- Durchlässigkeit.
Modulator-Verbindungen der Erfindung können durch im Fachgebiet bekannte Standardverfahren präpariert werden. Die Peptid-Komponente eines Modulators, der zumindest teilweise aus einem Peptid besteht, kann unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert werden, wie solche, die beschrieben sind in Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) und Grant, G. A. (ed.) Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992). Automatisierte Peptidsynthetisierer sind kommerziell erhältlich (z. B. Advanced ChemTech Model 396: Milligen/Biosearch 9600). Zusätzlich können eine oder mehrere modulierende Gruppen an die von Aβ abstammende Peptid-Komponente (z. B. eine Aβ Aggregation-Kern-Domäne) durch Standardverfahren gebunden werden, zum Beispiel unter Verwendung von Verfahren für Reaktion durch eine Amino-Gruppe (z. B. die alpha Amino-Gruppe am Aminoterminus eines Peptides), eine Carboxyl-Gruppe (z. B. am Carboxyterminus eines Peptides), eine Hydroxyl-Gruppe (z. B. an einem Tyrosin-, Serin- oder Threonin-Rest) oder eine andere geeignete reaktive Gruppe an einer Aminosäure-Seitenkette (siehe z. B. Greene, T. W. und Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis. John Wiley und Sons, Inc., New York (1991). Exemplarische Synthesen bevorzugter β-Amyloid-Modulatoren sind weiter in den Beispielen 1, 4 und 11 beschrieben.

IV. Suchtests

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Selektion eines Modulators von β-Amyloid-Aggregation. In dem Verfahren wird eine Testverbindung mit natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht, die Aggregation des natürlichen β-AP wird gemessen und ein Modulator wird aufgrund der Fähigkeit der Testverbindung die Aggregation des natürlichen β- AP zu verändern (z. B. hemmen oder fördern von Aggregation), ausgewählt. In einem bevorzugten Anwendungsfall wird die Testverbindung mit einer molaren Überschussmenge des natürlichen β-AP in Kontakt gebracht. Die Menge und/oder Rate der natürlichen β-AP Aggregation bei Vorhandensein der Testverbindung kann durch einen geeigneten Test, der, wie hierin beschrieben, auf β-AP Aggregation hinweist, bestimmt werden (siehe z. B. Beispiele 2, 5 und 6).
In einem bevorzugten Test wird das natürlichen β-AP in Lösung bei Vorhandensein der Testverbindung gelöst und eine Aggregation des natürlichen β-AP wird in einem Nukleierungstest (siehe Beispiel 6) durch Bewertung der Trübung der Lösung über einen Zeitraum durch Messen der ersichtlichen Absorption der Lösung bei 405 nm bewertet (weiter in Beispiel 6 beschrieben; siehe ebenfalls Jarrett et al. (1993) Biochemistry 32: 4693-4691). Bei Nichtvorhandensein eines β-Amyloid-Modulators bleibt die A405nm der Lösung während einer Anlaufzeit, in der das β-AP in Lösung bleibt, typischerweise relativ konstant, dann steigt aber die A405nm der Lösung schnell an, da das β-AP aggregiert und aus der Lösung tritt, und schließlich ein Plateaulevel erreicht (d. h. A405nm der Lösung zeigt sigmoidale Kinetiken über einen Zeitraum). Im Gegensatz dazu ist bei Vorhandensein einer Testverbindung, die eine β-AP Aggregation hemmt, die A405nm der Lösung verglichen damit, wenn der Modulator nicht vorhanden ist, verringert. Somit kann bei Vorhandensein des inhibitorischen Modulators die Lösung eine gesteigerte Anlaufzeit, eine verringerte Aggregationssteigung und/oder ein verringertes Plateaulevel verglichen damit, wenn der Modulator nicht vorhanden ist, aufzeigen. Dieses Verfahren zur Selektion eines Modulators der β-Amyloid-Polylmerisation kann auf ähnliche Weise zur Selektion von Modulatoren verwendet werden, die eine β-AP-Aggregation fördern. Somit ist die A405nm der Lösung bei Vorhandensein eines Modulators, der eine β-AP Aggregation fördert, verglichen damit, wenn der Modulator nicht vorhanden ist, gesteigert (z. B. kann die Lösung eine verringerte Anlaufzeit, eine gesteigerte Aggregationssteigung und/oder ein höheres Plateaulevel verglichen damit, wenn der Modulator nicht vorhanden ist, aufweisen).
Ein anderer für eine Verwendung in dem Suchverfahren der Erfindung geeigneter Test, ein Keimextensionstest, ist ebenfalls weiter in Beispiel 6 beschrieben. In diesem Test werden ein β-AP Monomer und ein aggregierter β-AP "Keim" bei Vorhandensein und Nichtvorhandensein einer Testverbindung vereint und die Menge an β-Fibrillenbildung wird basierend auf einer verstärkten Emission des Farbstoffes Thioflavin T, wenn dieser mit β-AP Fibrillen in Kontakt gebracht wird, bewertet. Außerdem kann eine β-AP Aggregation durch Elektronenmikroskopie (EM) der β-AP Präparation bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein des Modulators bewertet werden. Zum Beispiel ist eine β-Amyloid-Fibrillenbildung, die mittels EM detektierbar ist, bei Vorhandensein eines Modulators der β-AP Aggregation hemmt, verringert (d. h. es gibt eine verringerte Menge oder Anzahl an β-Fibrillen bei Vorhandensein des Modulators), während eine β-Fibrillenbildung bei Vorhandensein eines Modulators, der eine β-AP Aggregation fördert, erhöht ist (d. h. es gibt eine erhöhte Menge oder Anzahl an β-Fibrillen bei Vorhandensein eines Modulators).
Ein noch bevorzugter Test zur Verwendung in dem Suchverfahren der Erfindung zur Selektion geeigneter Modulatoren ist der in den Beispielen 3 und 10 beschriebene Neurotoxizitätstest. Es werden Verbindungen ausgewählt, die die Bildung neurotoxischer Aβ-Aggregate hemmen und/oder die die Neurotoxizität vorgeformter Aβ-Fibrillen hemmen. Es wird in Betracht gezogen, dass dieser Neurotoxizitätstest Neurotoxizität in vivo vorhersagt. Dementsprechend weist eine inhibitorische Aktivität einer Modulator-Verbindung in dem in vitro Neurotoxizitätstest auf eine ähnliche inhibitorische Aktivität der Verbindung hinsichtlich Neurotoxizität in vivo hin.

V. Pharmazeutische Zusammensetzungen

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen der β-Amyloid-Modulator-Verbindungen der Erfindung. In einem Anwendungsfall schließt die Zusammensetzung eine β-Amyloid-Modulator- Verbindung in einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge, welche ausreicht, eine Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden zu verändern und vorzugsweise zu Memmen und einen pharmazeutisch geeigneten Träger ein. In einem anderen Anwendungsfall schließt die Zusammensetzung eine β-Amyloid-Modulator-Verbindung in einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge, welche ausreicht, die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden zu hemmen und einen pharmazeutisch geeigneten Träger ein. Eine "therapeutisch wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge, die bei Dosierung und für erforderliche Zeitspannen wirksam das erwünschte therapeutische Ergebnis, wie zum Beispiel Verringerung oder Umkehrung von β-Amyloid-Ablagerung und/oder Verringerung oder Umkehrung von Aβ-Neurotoxizität erzielt. Eine therapeutisch wirksame Menge eines Modulators kann gemäss den Faktoren, wie zum Beispiel Krankheitsstadium, Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums und der Fähigkeit des Modulators eine erwünschte Antwort in dem Individuum hervorzurufen, variieren. Dosierungsvorschriften können zum Bereitstellen der optimalen therapeutischen Antwort angeglichen werden. Eine therapeutisch wirksame Menge ist ebenfalls eine, bei der beliebige toxische oder schädliche Wirkungen des Modulators durch die therapeutischen nützlichen Wirkungen aufgewogen werden. Die potentielle Neurotoxizität der Modulatoren der Erfindung kann unter Verwendung der in den Beispielen 3 und 10 beschriebenen auf teilen basierenden Tests untersucht werden, und ein therapeutisch wirksamer Modulator kann ausgewählt werden, der keine signifikante Neurotoxizität aufzeigt. In einem bevorzugten Anwendungsfall ist eine therapeutisch wirksame Menge eines Modulators ausreichend, um eine Aggregation einer molaren Überschussmenge von natürlichen β-Amyloid-Peptiden zu verändern und vorzugsweise zu hemmen. Eine "prophylaktisch wirksame Menge" bezeichnet eine Menge, die bei Dosierung und für erforderliche Zeitspannen das erwünschte prophylaktische Resultat, wie zum Beispiel Vorbeugen oder Hemmung der β-Amyloid-Ablagerungsrate und/oder Aβ-Neurotoxizität in einem für β-Amyloid-Ablagerung prädisponierten Patienten wirksam erzielt. Eine prophylaktisch wirksame Menge kann, wie oben für die therapeutisch wirksame Menge beschrieben, bestimmt werden. Typischerweise wird, da eine prophylaktisch Dosis in Patienten vor oder an einem früheren Erkrankungsstadium verwendet wird, die prophylaktisch wirksame Menge weniger als die therapeutisch wirksame Menge sein.
Ein Faktor, der bei der Bestimmung einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge eines β-Amyloid-Modulators beachtet werden sollte, ist die Konzentration von natürlichem β-AP in einem biologischen Kompartiment eines Patienten, wie zum Beispiel in der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) des Patienten. Die Konzentration von natürlichem β-AP in der CSF ist auf 3 nM geschätzt worden (Schwartzman, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8368-8372). Ein nichteinschränkender Bereich für eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines β-Amyloid-Modulators ist 0,01 nM - 10 uM. Es muss angemerkt werden, dass die Dosierungswerte in Abhängigkeit von der Schwere des zu mildernden Zustandes variieren. Es muss außerdem verständlich sein, dass für jeden einzelnen Patienten, eine spezifische Dosierungsvorschrift über eine Zeitspanne an die Bedürfnisse des Individuums und an die professionelle Bewertung der verabreichenden oder die Verabreichung der Zusammensetzungen überwachenden Person angepasst werden soll, und dass die hierin bekannt gegebenen Dosierungsbereiche nur beispielhaft sind und nicht beabsichtigen, den Rahmen oder Praktizierung der beanspruchten Zusammensetzung einzuschränken.
Die Menge der aktiven Verbindung in der Zusammensetzung kann gemäss den Faktoren, wie zum Beispiel Krankheitsstadium, Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums variieren, wobei jeder die Menge von natürlichem β-AP in dem Individuum beeinflussen kann. Dosierungsvorschriften können zum Bereitstellen der optimalen therapeutische Antwort angepasst werden. Zum Beispiel kann ein einziger Bolus verabreicht werden, mehrere unterteilte Dosierungen können über einen Zeitraum verabreicht werden, oder die Dosis kann proportional verringert oder gesteigert werden, welches durch die Dringlichkeit der therapeutischen Situation angezeigt ist. Es ist insbesondere vorteilhaft parenterale Zusammensetzungen in Form einer Dosierungseinheit zur Erleichterung der Verabreichung und gleichmäßigen Dosierung zu formulieren. Dosierungseinheit, wie hierin verwendet, bezeichnet physikalisch abgegrenzte Einheiten, die als gleichmäßige Dosierungen für die zu behandelnden Säugerpatienten geeignet sind; wobei jede Einheit eine vorherbestimmte Menge einer aktiven Verbindung enthält, die so berechnet wurde, um die gewünschte therapeutische Wirkung in Assoziation mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger herzustellen. Die Spezifikation für die Dosierungseinheiten der Erfindung werden diktiert von und sind direkt abhängig von (a) den einzigartigen Merkmalen der aktiven Verbindung und der zu erzielenden besonderen therapeutischen Wirkung und (b) den Einschränkungen, die der Kunst des Zusammensetzens solch einer aktiven Verbindung für die Sensitivitätsbehandlung in Individuen innewohnen.
Wie hierin verwendet, schließt ein "pharmazeutisch geeigneter Träger" beliebige und alle Lösemittel, Dispersionmittel, Beschichtungen, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische und Absorption-verzögernde Mittel und Ähnliche, die physiologisch kompatibel sind, ein. In einem Anwendungsfall ist der Träger für eine parenterale Verabreichung geeignet. Vorzugsweise ist der Träger für eine Verabreichung in das Zentralnervensystem (z. B. intraspinal oder intracerebral) geeignet. Wahlweise kann der Träger für intravenöse, intraperitoneale oder intramuskuläre Verabreichung geeignet sein. In einem anderen Anwendungsfall ist der Träger für orale Verabreichung geeignet. Pharmazeutisch geeignete Träger schließen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Puder für die extemporierte Präparation steril injizierbarer Lösungen oder Dispersion ein. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Fachgebiet bekannt. Ist ein beliebiges herkömmliches Medium oder Mittel mit der aktiven Verbindung inkompatibel, wird eine Verwendung davon in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung erwägt. Ergänzende aktive Verbindungen können ebenfalls in den Zusammensetzungen inkorporiert sein.
Therapeutische Zusammensetzungen müssen typischerweise bei den Herstellungs- und Lagerbedingungen steril und stabil sein. Die Zusammensetzung kann als eine Lösung, Mikroemulsion, Liposom oder andere für eine hohe Stoffkonzentration geeignete geordnete Struktur formuliert werden. Der Träger kann ein Lösemittel oder Dispersionsmedium sein, das, zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und Ähnliche) enthält und geeignete Mischungen davon. Die richtige Fluidität kann zum Beispiel durch die Verwendung einer Beschichtung, wie zum Beispiel Lecithin, durch die Beibehaltung der erforderlichen Partikelgröße in dem Fall einer Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Substanzen erhalten werden. In vielen Fällen wird bevorzugt, isotonische Mittel, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole, wie zum Beispiel Manitol, Sorbitol oder Natriumchlorid in der Zusammensetzung einzuschließen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch Einschließen eines Mittels, das Absorption verzögert, zum Beispiel Monostearat-Salze und Gelatin in die Zusammensetzung bewerkstelligt werden. Außerdem können die Modulatoren in einer Depotwirkstoff-Formulierung, zum Beispiel in einer Zusammensetzung, die ein langsam freisetzendes Polymer einschließt, verabreicht werden. Die aktiven Verbindungen können mit Trägern präpariert werden, die die Verbindung gegen schnelle Freisetzung schützen werden, wie zum Beispiel eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung, einschließlich Implantate und mikroverkapselter Liefersysteme. Es Können biologisch abbaubare, blokompatible Polymere verwendet werden, wie zum Beispiel Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Kollagen, Polyorthoester, Polymilchsäuren und Poly(milchsäure)-Poly(Glycolsäure) Kopolymere (PLG). Viele Verfahren für die Präparation solcher Formulierungen sind patentiert oder einem Fachmann im Allgemeinen bekannt.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Inkorporieren der aktiven Verbindung (z. B. β-Amyloid-Verbindung) in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Lösemittel mit einem oder einer Kombination der oben aufgezählten Ingredienzien, wenn erforderlich, gefolgt von filtrierter Sterilisation, präpariert werden. Im allgemeinen werden Dispersionen durch Inkorporieren der aktiven Verbindung in ein steriles Vehikel, das ein basisches Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen, von den oben aufgezählten Ingredienzien enthält, präpariert. Im Fall von sterilen Pudern für die Präparation steril injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Präparationsverfahren Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung, die ein Puder des aktiven Ingredienz plus eines zusätzlichen gewünschten Ingredienz aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung davon, hervorbringen.
Eine Modulator-Verbindung der Erfindung kann mit einer oder mehreren zusätzlichen Verbindungen formuliert werden, die die Löslichkeit der Modulator-Verbindung verstärken. Bevorzugte Verbindungen, die an Formulierungen hinzugefügt werden, um die Löslichkeit der Modulatoren zu verstärken, sind Cyclodextrin-Derivate, vorzugsweise Hydroxypropyl-γ-cyclodextrin. Wirkstoff-Liefervehikel, die Cyclodextrin-Derivate zum Liefern von Peptiden an das Zentralnervensystem enthalten, sind beschrieben in Bodor, N., et al. (1992) Science 257: 1698-1700. Für die hierin beschriebenen β-Amyloid- Modulatoren steigert ein Einschluß von Hydroxypropyl-γ-cyclodextrin bei einer Konzentration von 50-200 mM in die Formulierung die Wasserlöslichkeit der Verbindungen. Zusätzlich zur gesteigerten Löslichkeit kann ein Einschluß eines Cyclodextrin-Derivates in die Formulierung andere nützliche Wirkungen haben, da berichtet worden ist, dass β-Cyclodextrin selbst mit dem Aβ-Peptid interagiert und eine Fibrillenbildung in vitro hemmt (Camilleri, P., et al. (1994) FEBS Letters 341: 256-258). Dementsprechend kann eine Verwendung einer Modulator-Verbindung der Erfindung in Kombination mit einem Cyclodextrin- Derivat eine größere Hemmung von Aβ-Aggregation als eine Verwendung des Modulators alleine zur Folge haben. Chemische Modifikationen von Cyclodextrinen sind im Fachgebiet bekannt (Hanessian, S., et al. (1995) J. Org. Chem. 60: 4786-4797). Zusätzlich zur Verwendung als ein Additiv in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen Modulator der Erfindung enthält, können Cyclodextrin-Derivate ebenfalls als modifizierende Gruppen nützlich sein und können dementsprechend an eine Aβ-Peptidverbindung zum Bilden einer Modulator-Verbindung der Erfindung kovalent gekoppelt sein.
In einem anderen Anwendungsfall wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Modulator der Erfindung umfasst, so formuliert, dass der Modulator durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB) transportiert wird. Verschiedene im Fachgebiet bekannte Strategien zur Steigerung des Transportes durch die BBB können zum Verstärken eines Transportes der Modulatoren durch die BBB an die Modulatoren der Erfindung angepasst werden (zur Übersicht solcher Strategien siehe z. B. Pardridge, W. M. (1994) Trends in Biotechnol. 12: 239-245; Van Bree, J. B. et al. (1993) Pharm. World Sci. 15: 2-9 und Pardridge, W. M. et al. (1992) Pharmacol. Toxicol. 71: 3-10). In einer Versuchsannäherung wird der Modulator chemisch modifiziert, um einen Prowirkstoff mit verstärktem transmembranen Transport zu bilden. Geeignete chemische Modifikationen schließen kovalentes Verknüpfen einer Fettsäure an den Modulator über eine Amid- oder Esterverknüpfung (siehe z. B. Patent 4, 933,324 und PCT Veröffentlichung WO 89/07938, beide von Shashoua; U.S. Patent 5,284,876 von Hesse et al.; Toth, I. et al (1994) J. Drug Target. 2: 217-239; und Shashoua, V. E. et al. (1984) J. Med. Chem. 27: 659-664) und Glykation des Modulators (siehe z. B. U.S. Patent 5,260,308 von Poduslo et al.) ein. Ebenso können N-Acylaminosäure-Derivate in einem Modulator zum Bilden eines "lipidartigen" Prowirkstoffes verwendet werden (siehe z. B. 5,122,863 von Hashimoto et al.).
In einer anderen Versuchsannäherung zur Steigerung des Transportes durch die BBB wird ein Peptidmodulator oder peptidnachahmender Modulator an ein zweites Peptid oder Protein konjugiert, wobei ein chimäres Protein gebildet wird, worin das zweite Peptid oder Protein Absorption-vermittelte oder Rezeptor-vermittelte Transcytose durch die BBB erfährt. Dementsprechend wird durch Kopplung des Modulators an dieses zweite Peptid oder Protein, das chimäre Protein durch die BBB transportiert. Das zweite Peptid oder Protein kann ein Ligand für einen Gehirnkapillar-Endothelzellen-Rezeptorliganden sein. Zum Beispiel ist ein bevorzugter Ligand ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch an den Transferrin-Rezeptor auf Gehirnkappillar-Endothelzellen bindet (siehe z. B. U.S. Patente 5,182,107 und 5,154,924 und PCT Veröffentlichungen WO 93/10819 und WO 95/02421 alle von Friden et al.). Andere geeignete Peptide oder Proteine, die einen Transport über die BBB vermitteln können, schließen Histone (siehe z. B. U.S. Patent 4,902,505 von Pardridge und Schimmel) und Liganden, wie zum Beispiel Biotin, Folat, Niacin, Pantothensäure, Riboflavin, Thiamin, Pryridoxal und Ascorbinsäure ein (siehe z. B. U.S. Patente 5,416,016 und 5,108,921 beide von Heinstein). Zusätzlich wurde berichtet, dass der Glucose-Transporter GLUT-1 Glycopeptide (L-Serinyl-β-D-Glucosid-Analoga von [Met5]enkephalin) durch die Blut-Hirn-Schranke transportiert (Polt, R. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7114-1778). Dementsprechend kann eine Modulator-Verbindung an solch ein Glycopeptid gekoppelt werden, um den Modulator auf den GLUT-1 Glucose-Transporter zu zielen. Zum Beispiel kann eine Modulator- Verbindung, die an ihrem Aminoterminus mit der modifizierenden Gruppe Aic (3-(O-Aminoethyl-iso)-cholyl, einem Derivat der Cholsäure mit einer freien Aminiogruppe) modifiziert ist, an ein Glycopeptid über die Amino-Gruppe von AIC mittels Standardverfahren gekoppelt werden. Chimäre Proteine können durch rekombinante DNS-Verfahren (z. B. durch Bildung eines chimären Gens, das ein Fusionsprotein codiert) oder durch chemisches Vernetzen des Modulators an das zweite Peptid oder Protein zum Bilden eines chimären Proteins gebildet werden. Im Fachgebiet sind zahlreiche chemische Vernetzungsmittel bekannt (z. B. kommerziell erhältlich von Pierce, Rockford IL). Es kann ein Vernetzungsmittel ausgewählt werden, das eine hohe Kopplungsausbeute des Modulators an das zweite Peptid oder Protein und nachfolgende Spaltung des Linkers zur Freisetzung eines biologisch aktiven Modulators ermöglicht. Zum Beispiel kann ein auf Biotin-Avidin basierendes Verknüpfungssystem verwendet werden.
In noch einer anderen Versuchsannäherung zum Verstärken des Transportes durch die BBB, wird der Modulator in einen Trägervektor eingekapselt, der einen Transport durch die BBB vermittelt. Zum Beispiel kann der Modulator in ein Liposom eingekapselt werden, wie zum Beispiel ein positiv geladenes unilamellares Liposom (siehe z. B. PCT Veröffentlichungen WO 88/07851 und WO88/07852, beide von Faden) oder in polymeren Mikrosphären (siehe z. B. U.S. Patent 5,413,797 von Kahn et al., U.S. Patent 5,271,961 von Mathiowitz et al. und 5,019,400 von Gombotz et al.). Des Weiteren kann der Trägervektor modifiziert werden, um ihn auf einen Transport durch die BBB zu zielen. Zum Beispiel kann der Trägervektor (z. B. Liposom) mit einem Molekül, das aktiv durch die BBB transportiert wird oder mit einem Liganden für Gehirn-Endothelzellen-Rezeptoren, wie zum Beispiel ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch an Transferrin-Rezeptoren bindet (siehe z. B. PCT Veröffentlichungen WO 91/04014 von Collins et al. und WO 94/02178 von Greig et al.) kovalent modifiziert werden.
In noch einer anderen Versuchsannäherung zum Verstärken des Transports des Modulators durch die BBB wird der Modulator mit einem anderen Mittel mit der Funktion, die BBB durchlässig zu machen, mitverabreicht. Beispiele solcher BBB "Durchlässigkeitsförderer" schließen Bradykinin und Bradykinin-Agonisten (siehe z. B. U.S. Patent 5,112,596 von Malfroy-Canine) und in U.S. Patent 5,268,164 von Kozarich et al. offenbarte Peptidverbindungen ein.
Eine Modulator-Verbindung der Erfindung kann in eine pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden, worin der Modulator die einzig aktive Verbindung ist oder wahlweise kann die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzliche aktive Verbindungen enthalten. Zum Beispiel können zwei oder mehr Modulator-Verbindungen in Kombination verwendet werden. Außerdem kann eine Modulator-Verbindung der Erfindung mit einem oder mehreren anderen Mitteln kombiniert werden, die anti-amyloidogene Eigenschaften haben. Zum Beispiel kann eine Modulator-Verbindung mit dem nichtspezifischen Cholinesterase-Inhibitor Tacrin (Cognex®, Parke-Davis) kombiniert werden.
In einem anderen Anwendungsfall wird eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung als eine Verpackungsformulierung bereitgestellt. Die Verpackungsformulierung kann eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung in einem Behälter und gedruckte Anleitungen zur Verabreichung der Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten mit einer mit β-Amyloidose assoziierten Erkrankung, z. B. Alzheimer Krankheit, einschließen.

VI. Verfahren zur Verwendung von Aβ-Modulatoren

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Veränderung der Aggregation oder Hemmung der Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid- Peptiden. In den Verfahren der Erfindung werden natürliche β-Amyloid- Peptide so mit einem β-Amyloid-Modulator in Kontakt gebracht, dass die Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide verändert wird oder die Neurotoxizität der natürlichen β-Amyloid-Peptide gehemmt wird. In einem bevorzugten Anwendungsfall hemmt der Modulator eine Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide. In einem anderen Anwendungsfall fördert der Modulator eine Aggregation der natülichen β-Amyloid-Peptide. Vorzugsweise wird eine Aggregation einer molaren Überschussmenge von β-AP im Verhältnis zu der Menge des Modulators verändert, wenn sie mit dem Modulator in Kontakt gebracht wird.
In dem Verfahren der Erfindung können natürliche β-Amyloid-Peptide mit einem Modulator entweder in vitro oder in vivo in Kontakt gebracht werden. Somit beabsichtigt der Ausdruck "in Kontakt bringen" sowohl eine Inkubation eines Modulators mit einer natürlichen β-AP Präparation in vitro als auch ein Liefern des Modulators an eine Stelle in vivo, an der natürliches β-AP vorhanden ist, zu umfassen. Da die Modulator-Verbindung mit natürlichem β-AP interagiert, können die Modulator-Verbindungen verwendet werden, um natürliches β-AP entweder in vitro als auch in vivo zu detektieren. Dementsprechend ist eine Verwendung der Modulator-Verbindungen der Erfindung eine Verwendung als diagnostisches Mittel, um das Vorhandensein von natürlichem β-AP entweder in einer biologischen Probe oder in vivo in einem Patienten zu detektieren. Außerdem kann eine Detektion von natürlichem β- AP unter Verwendung einer Modulator-Verbindung der Erfindung ferner verwendet werden, um Amyloidose in einem Patienten zu diagnostizieren. Zusätzlich sind die Modulator-Verbindungen, da die Modulator-Verbindungen der Erfindung eine β-AP Aggregation unterbrechen und β-AP Neurotoxizität hemmen, ebenfalls in der Behandlung von mit β-Amyloidose assoziierten Erkrankungen, entweder prophylaktisch oder therapeutisch, nützlich. Dementsprechend ist eine andere Verwendung der Modulator-Verbindungen der Erfindung eine Verwendung als therapeutisches Mittel, um eine Aggregation und/oder Neurotoxizität von natürlichem β-AP zu verändern.
In einem Anwendungsfall wird eine Modulator-Verbindung der Erfindung in vitro verwendet, zum Beispiel um in einer Probe (z. B. eine Probe einer biologischen Flüssigkeit) natürliches β-AP zu detektieren und zu quantifizieren. Zur Hilfe bei Detektion kann die Modulator-Verbindung mit einer detektierbaren Substanz modifiziert werden. Die Quelle von natürlichem β- AP, das in dem Verfahren verwendet wird, kann zum Beispiel eine Probe Cerebrospinalflüssigkeit (z. B. aus einem AD Patienten, einem Erwachsenen, der aufgrund der Familienhistorie für AD anfällig ist oder aus einem normalen Erwachsenen) sein. Die natürliche β-AP Probe wird mit einem Modulator der Erfindung in Kontakt gebracht, und eine Aggregation des β-AP wird, so wie bei einem in den Beispielen 2, 5 und 6 beschriebenen Test, gemessen. Vorzugsweise wird der in Beispiel 6 beschrieben Nukleierungstest und/oder Keimextensionstest verwendet. Der Aggregationsgrad der β-AP Probe kann dann mit dem (von) einer Kontrollprobe(n) mit einer bekannten β-AP Konzentration verglichen werden, die auf ähnliche Weise mit dem Modulator in Kontakt gebracht wird und die Ergebnisse können als ein Hinweis, ob ein Patient anfällig ist oder eine mit β-Amyloidose assoziierte Erkrankung hat, verwendet werden. Außerdem kann β-AP durch Detektion einer in den Modulator inkorporierten modulierenden Gruppe detektiert werden. Zum Beispiel können Modulatoren, die eine Biotin-Verbindung wie hierin beschrieben (z. B. ein aminoterminal biotinyliertes β-AP Peptid) beinhalten, unter Verwendung einer Streptavidin oder Avidin-Sonde, die mit einer detektierbaren Substanz markiert ist (z. B. ein Enzym, wie zum Beispiel Peroxidase) detektiert werden. Eine Detektion von natürlichen β-AP Aggregaten, vermischt mit einem Modulator der Erfindung unter Verwendung einer Sonde, die an die modulierende (z. B. Biotin/Streptavidin) Gruppe bindet, ist in Beispiel 2 weiter beschrieben.
In einem anderen Anwendungsfall wird eine Modulator-Verbindung der Erfindung verwendet, um in vivo eine natürliche β-AP Ablagerung in einem Patienten zu detektieren und, wenn erwünscht zu quantifizieren, zum Beispiel zur Unterstützung bei der Diagnose einer β-Amyloidose in dem Patienten. Zur Unterstützung bei Detektion kann die Modulator-Verbindung mit einer detektierbaren Substanz, vorzugsweise 99mTc oder radioaktivem Iod (weiter oben beschrieben) modifiziert werden, das in vivo in einem Patienten detektiert werden kann. Die markierte β-Amyloid-Modulator-Verbindung wird dem Patienten verabreicht und nach ausreichender Zeit, um eine Anreicherung des Modulators an Stellen mit Amyloid-Ablagerung zu erlauben, wird der markierte Modulator durch bildgebende Standardverfahren detektiert. Das durch die markierte Verbindung erzeugte radioaktive Signal kann direkt detektiert werden (z. B. durch Ganzkörperzählung), oder wahlweise kann das radioaktive Signal in ein Bild auf einem Autoradiogramm oder auf einem Computerschirm umgewandelt werden, um eine Bildgebung von Amyloid- Ablagerungen in dem Patienten zu ermöglichen. Verfahren zur Bildgebung von Amyloidose unter Verwendung von radioaktiv markierten Proteinen sind im Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel ist die mit entweder ¹²³I oder 99mTC radioaktivmarkierte Serum Amyloid P Komponente (SAP) zur Bildgebung von systemischer Amyloidose verwendet worden (siehe z. B. Hawkins, P. N. und Pepys, M. B. (1995) Eur. J. Nucl. Med. 22: 595-599). Von den verschiedenen Isotypen von radioaktiven Iod wird vorzugsweise ¹²³I (Halbwertszeit = 13,2 Stunden) für Ganzkörperszintigraphie verwendet, ¹²&sup4;I (Halbwertszeit = 4 Tage) wird für Positronen-Emissions-Tomographie (PET) verwendet, ¹²&sup5;I (Halbwertszeit = 60 Tage) wird für Stoffwechselumsatz-Untersuchungen und ¹³¹I (Halbwertszeit = 8 Tage) wird für Ganzkörperzählung und verzögerte niedrigauflösende bildgebende Untersuchungen verwendet. Analog zu den Studien unter Verwendung von radioaktiv markiertem SAP kann eine markierte Modulator-Verbindung der Erfindung an einen Patienten durch einen geeigneten Weg (z. B. intravenös, intraspinal, intracerebral) in einem einzigen Bolus, der zum Beispiel 100 ug markierte etwa 180 Mbq Radioaktivität tragende Verbindung enthält, geliefert werden.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins von natürlichen β-Amyloid-Peptiden in einer biologischen Probe bereit, das In-Kontakt-Bringen einer biologischen Probe mit einer Verbindung der Erfindung und Detektieren der an natürliche β-Amyloid- Peptide gebundenen Verbindung umfasst, um dabei das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von natürlichen β-Amyloid-Peptiden in der biologischen Probe zu detektieren. In einem Anwenaungsfall wird die β-Amyloid- Modulator-Verbindung mit der biologischen Probe in vitro in Kontakt gebracht. In einem anderen Anwendungsfall wird die β-Amyloid-Modulator-Verbindung mit der biologischen Probe durch Verabreichen der β-Amylo d-Modulator- Verbindung an einen Patienten in Kontakt gebracht. Für eine in vivo Verabreichung ist die Verbindung vorzugsweise mit radioaktivem Technetium oder radioaktivem Iod markiert.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Detektion natürlicher β- Amyloid-Peptide bereit, um eine Diagnose einer β-amyloidodenen Erkrankung zu vereinfachen, das In-Kontakt-Bringen einer biologischen Probe mit der Verbindung der Erfindung und Detektieren der an natürliche β-Amyloid- Peptide gebundenen Verbindung umfasst, um eine Diagnose einer βamyloidogenen Erkrankung zu vereinfachen. In einem Anwendungsfall wird die β-Amyloid-Modulator-Verbindung mit der biologischen Probe in vitro in Kontakt gebracht. In einem anderen Anwendungsfall wird die β-Amyloid- Modulator-Verbindung mit der biologischen Probe durch Verabreichen der β- Amyloid-Modulator-Verbindung an einen Patienten in Kontakt gebracht. Für eine in vivo Verabreichung ist die Verbindung vorzugsweise mit radioaktivem Technetium oder radioaktivem Iod markiert. Vorzugsweise vereinfacht eine Verwendung des Verfahren eine Diagnose von Alzheimer Krankheit.
In einem anderen Anwendungsfall stellt die Erfindung ein Verfahren zur Veränderung einer natürlichen β-AP Aggregation oder Hemmung von β-AP Neurotoxizität bereit, das prophylaktisch oder therapeutisch in der Behandlung oder Vorbeugung von mit β-Amyloidose assoziierten Erkrankungen, z. B. Alzheimer Krankheit, verwendet werden kann. Wie in Beispiel 10 gezeigt, verringern Modulator-Verbindungen der Erfindung die Toxizität natürlicher β- AP Aggregate von kultivierten neuronalen Zellen. Außerdem verringern die Modulatoren nicht nur die Bildung neurotoxischer Aggregate, sie haben sondern auch die Fähigkeit die Neurotoxizität vorgeformter Aβ-Fibrillen zu verringern. Dementsprechend können die Modulator-Verbindungen der Erfindung verwendet werden, um die Bildung von neurotoxischen Aβ-Fibrillen in Patienten (z. B. prophylaktisch in einem für β-Amyloid-Ablagerung prädisponierten Patienten) zu hemmen oder vorzubeugen oder sie können verwendet werden, um β-Amyloidose in bereits β-Amylod-Ablagerung aufweisenden Patienten therapeutisch umzukehren.
Ein Modulator der Erfindung wird mit in einem Patienten vorhandenen natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht (z. B. in der Cerebrospinalflüssigkeit oder Cerebrum des Patienten, um dabei die Aggregation des natürlichen β-AP zu verändern und/oder die Neurotoxizität der natürlichen β-APs zu hemmen. Eine Modulator-Verbindung kann allein an den Patienten verabreicht werden, oder wahlweise kann die Modulator- Verbindung in Kombination mit anderen therapeutisch aktiven Mitteln (z. B. wie oben in Unterabschnitt IV diskutiert) verabreicht werden. Wird eine Kombinationstherapie angewandt, können die therapeutischen Mittel in einer einzigen pharmazeutischen Zusammensetzung mitverabreicht, in getrennten pharmazeutischen Zusammensetzungen mitverabreicht oder hintereinander verabreicht werden.
Der Modulator kann an einen Patienten durch jeglichen Weg, der eine natürliche β-AP Aggregation in einem Patienten wirksam hemmt, verabreicht werden, obwohl in einem bevorzugten Anwendungsfall der Modulator parenteral, am bevorzugtesten an das Zentralnervensystem des Patienten verabreicht wird. Mögliche Wege einer ZNS Verabreichung schließen intraspinale Verabreichung und intracerebrale Verabreichung (z. B. intracerebrovaskulare Verabreichung) ein. Wahlweise kann die Verbindung zum Beispiel oral, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Bei nicht- ZNS Verabreichungswegen kann die Verbindung in einer Formulierung verabreicht werden, die einen Transport durch die BBB ermöglicht. Bestimmte Modulatoren können durch die BBB ohne weitere zusätzliche Modifikation transportiert werden, während andere eine weitere Modifikation, wie oben in Unterabschnitt IV beschrieben, bedürfen.
Geeignete Arten und Vorrichtungen zum Liefern von therapeutischen Verbindungen an das ZNS eines Patienten sind im Fachgebiet bekannt, einschließlich cerebrovaskularer Reservoire (z. B. Ommaya oder Rikker Reservoire, siehe z. B. Raney, J. P. et al. (1988) J. Neurosci. Nurs. 20: 23-29; Sundaresan, N. et al. (1989) Oncology 3: 15-22), Katheter für intrathekale Lieferung (z. B. Port-a-Cath, Y-Katheter und Ähnliche; siehe z. B. Plummer, J. L. (1991) Pain 44: 215-220; Yaksh, T. L. et al. (1986) Pharmacol. Biochem. Behav. 25: 483-485), injizierbare intrathekale Reservoire (z. B. Spinalgesic; siehe z. B. Brazenor, G. A. (1987) Neurosurgery 21: 484-491), implantierbare Infusionspumpensysteme (z. B. Infusaid; siehe z. B. Zierski, J. et al. (1988) Acta Neurochem. Suppl. 43: 94-99; Kanoff, R. B. (1994) J. Am. Osteopath. Assoc. 94: 487-493) und osmotische Pumpen (verkauft von Alza Corporation). Eine besonders bevorzugte Verabreichungsart ist über eine implantierbare, extern programmierbare Infusionspumpe. Geeignete Infusionspumpensysteme und Reservoirsysteme sind ebenfalls beschrieben in U.S. Patentnr. 5,368,562 von Blomquist und U.S. Patentnr. 4,731,058 von Doan, entwickelt von Pharmacia Deltec Inc.
Das Verfahren der Erfindung zur Veränderung einer β-AP Aggregation in vivo und insbesondere zur Hemmung einer β-AP Aggregaion kann in mit abnormaler β-Amyloid-Aggregation und -Ablagerung assoziierten Erkrankungen zum Verlangsamen der β-Amyloid-Ablagerungsrate und/oder zum Verringern des β-Amyloid-Ablagerungsgrades therapeutisch verwendet werden, um somit den Krankheitsverlauf zu verbessern. In einem bevorzugten Anwendungsfall wird das Verfahren verwendet, um Alzheimer Krankheit zu behandeln (z. B. sporadische oder familiäre AD, einschließlich sowohl Individuen, die AD-Symptome aufzeigen als auch für familiäre AD anfällige Induviduen). Das Verfahren kann ebenfalls zur Behandlung von anderem klinischen Vorkommen einer β-Amyloid-Ablagerung prophylaktisch oder therapeutisch verwendet werden, wie zum Beispiel in Individuen mit Down Syndrom und in Patienten mit hereditärer Enzephalorragie mit Holländischer-Typ Amyloidose (HCHWA-D). Während eine Hemmung von β-AP Aggregation ein bevorzugtes therapeutisches Verfahren ist, können Moulatoren, die eine β-AP Aggregation fördern, durch Ermöglichen der Absonderung von β-AP an Stellen, die zu keiner neurologischen Beeinträchtigung führen, ebenfalls therapeutisch nützlich sein.
Zusätzlich ist eine abnormale Anreicherung eines β-Amyloid-Präkursor- Proteins in Muskelfasern an der Pathologie von sporadischer Einschlußkörper Myositis (IBM) beteiligt (Askana, V. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1314-1319; Askanas, V. et al (1995) Current Opinion in Rheumatology 7: 486-496). Dementsprechend können die Modulatoren der Erfindung prophylaktisch oder therapeutisch in der Behandlung von Erkrankungen, in denen β-AP oder APP abnormal an nichtneurologischen Orten abgelagert wird, verwendet werden, wie zum Beispiel bei einer Behandlung von IBM durch Lieferung der Modulatoren an Muskelfasern.

VII. Nichtmodifizierte Aβ-Peptide, die eine Aggregation von natürlichem 13-AP hemmen

Zusätzlich zu den vorhergehend beschriebenen β-Amyloid-Modulatoren, in denen ein Aβ-Peptid an eine modifizierende Gruppe gekoppelt wird, stellt die Erfindung ebenfalls β-Amyloid-Modulatoren bereit, die aus einem nichtmodifizierten Aβ-Peptid bestehen. Es wurde nun entdeckt, dass bestimmte Anteile von natürlichem β-AP eine Aggregation von natürlichem β-APs verändern können, wenn sie mit den natürlichen β-APs in Kontakt gebracht werden (siehe Beispiel 12). Dementsprechend umfassen diese nichtmodifizierten Aβ- Peptide einen Anteil der natürlichen β-AP Sequenz (d. h. ein Anteil von βAP&sub1;- &sub3;&sub9;, βAP&sub1;&submin;&sub4;&sub0;, βAP&sub1;&submin;&sub4;&sub2; und βAP&sub1;&submin;&sub4;&sub3;). Insbesondere haben diese nichtmodifizierten Aβ-Peptide mindestens eine Aminosäure-Deletion verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9;, das kürzeste natürliche β-AP, so dass die Verbindung eine Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden verändert, wenn sie mit den natürlichen β- Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. In verschiedenen Anwendungsfällen können diese nichtmodifizierten Peptidverbindungen eine Aggragation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden fördern, oder vorzugsweise, können sie eine Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmen, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht werden. Noch bevorzugter hemmt die nichtmodifizierte Peptidverbindung eine Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden, wenn sie mit einer molaren Überschussmenge natürlicher β-Amyloid-Peptide in Kontakt gebracht wird (z. B. eine 10-fache, 33-fache oder 100-fache molare Überschussmenge von natürlichem β-AP).
Wie oben diskutiert, umfassen die nichtmodifizierten Peptidverbindungen der Erfindung eine Aminosäure-Sequenz mit mindestens einer Aminosäure- Deletion verglichen mit der Aminosäure-Sequenz von βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9;. Wahlweise kann die nichtmodifizierte Peptidverbindung mindestens fünf, zehn, fünfzehn, zwanzig, fünfundzwanzig, dreißig oder fünfunddreißig deletierte Aminosäuren verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; haben. Außerdem kann die nichtmodifizierte Peptidverbindung 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30 oder 1-35 deletierte Aminosäuren verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; haben. Die Aminosäure-Deletion(en) kann/können an dem Aminoterminus, dem Carboxyterminus, einer internen Stelle der β-AP Sequenz oder an einer Kombination davon stattfinden. Dementsprechend umfasst in einem Anwendungsfall eine nichtmodifizierte Peptidverbindung der Erfindung eine Aminosäure-Sequenz, die mindestens eine deletierte interne Aminosäure verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; hat. Wahlweise kann die nichtmodifizierte Peptidverbindung mindestens fünf, zehn, fünfzehn, zwanzig, fünfundzwanzig, dreißig oder fünfunddreißig deletierte interne Aminosäuren verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; haben. Außerdem kann die nichtmodifizierte Peptidverbindung 1-5, 1- 10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30 oder 1-35 deletierte interne Aminosäuren verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; haben. Bei Peptiden mit internen Deletionen hat das Peptid vorzugsweise einen Aminoterminus, der dem Aminosäure-Rest 1 von natürlichem βAP entspricht und einen Carboxyterminus, der dem Rest 40 von natürlichem βAP entspricht und hat einen oder mehrere deletierte interne β- AP Aminosäure-Reste (d. h. ein nichtdurchgängiges Aβ-Peptid).
In einem anderen Anwendungsfall umfasst die nichtmodifizierte Peptidverbindung eine Aminosäure-Sequenz, die mindestens eine deletierte N- terminale Aminosäure verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; hat. Wahlweise kann die nicht- modifizierte Peptidverbindung mindestens fünf, zehn, fünfzehn, zwanzig, fünfundzwanzig, dreißig oder fünfunddreißig deletierte N-terminale Aminosäuren verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; haben. Außerdem kann die nichtmodifizierte Peptidverbindung 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30 oder 1-35 deletierte N- terminale Aminosäuren verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; haben.
In noch einem anderen Anwendungsfall umfasst die nichtmodifizierte Peptidverbindung eine Aminosäure-Sequenz, die mindestens eine deletierte C-terminale Aminosäure verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; hat. Wahlweise kann die nichtmodifizierte Peptidverbindung mindestens fünf, zehn, fünfzehn, zwanzig, fünfundzwanzig, dreißig oder fünfunddreißig deletierte C-terminale Aminosäuren verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; haben. Außerdem kann die nichtmodifizierte Peptidverbindung 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30 oder 1-35 deletierte C- terminale Aminosäuren verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; haben.
Zusätzlich zur Deletion von Aminosäuren verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; kann die Peptidverbindung zusätzlich angefügte nicht-β-AP Aminosäure-Reste zum Beispiel an dem Amirioterminus, dem Carboxyterminus oder einer internen Stelle haben. In einem Anwendungsfall hat die Peptidverbindung mindestens eine von nicht-β-Amyloid-Peptid abstammende Aminosäure an ihrem N- Terminus. Wahlweise kann die Verbindung zum Beispiel 1-3, 1-5, 1-7, 1-10, 1-15 oder 1-20 von nicht-β-Amyloid-Peptid abstammende Aminosäuren an ihrem N-Terminus haben. In einem anderen Anwendungsfall hat die Peptidverbindung mindestens eine von nicht-β-Amyloid-Peptid abstammende Aminosäure an ihrem C-Terminus. Wahlweise kann die Verbindung zum Beispiel 1-3, 1-5, 1-7, 1-10, 1-15 oder 1-20 von nicht-β-Amyloid-Peptid abstammende Aminosäuren an ihrem C-Terminus haben.
In spezifischen bevorzugten Anwendungsfällen umfasst eine nicht- modifizierte Peptidverbindung der Erfindung Aβ&sub6;-20 (die Aminosäure-Sequenz davon ist in SEQ ID NR. 4 gezeigt), Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub0; (die Aminosäure-Sequenz davon ist in SEQ ID NR. 14 gezeigt), Aβ&sub1;&submin;&sub2;&sub0;, &sub2;&sub6;&submin;&sub4;&sub0; (die Aminosäure-Sequenz davon ist in SEQ ID NR. 15 gezeigt) oder EEVVHHHHQQ-βAP&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub0; (die Aminosäure- Sequenz davon ist in SEQ ID NR. 16 gezeigt). In der hierin verwendeten Nomenklatur stellt βAP&sub1;&submin;&sub2;&sub0;, &sub2;&sub6;&submin;&sub4;&sub0; βAP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; dar, in dem die internen Aminosäure- Reste 21-25 deletiert worden sind.
Eine nichtmodifizierte Peptidverbindung der Erfindung kann unter Verwendung von Standardtechniken chemisch synthetisiert werden, wie solche beschrieben in Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) und Grant, G. A. (ed.) Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H Freeman und Company, New York (1992). Automatisierte Peptidsynthetisierer sind kommerziell erhältlich (z. B. Advanced ChemTech Model 396: Milligen/Biosearch 9600). Wahlweise können nichtmodifizierte Peptidverbindungen gemäss den rekombinante DNS Standardtechniken unter Verwendung eines Nucleinsäure-Moleküls, das das Peptid codiert, präpariert werden. Eine das Peptid codierende Nucleotid-Sequenz kann unter Verwendung des genetischen Codes bestimmt werden und ein Oligonucleotid-Molekül mit dieser Nucleotid-Sequenz kann durch DNS Synthese- Standardverfahren synthetisiert werden (z. B. unter Verwendung eines automatisierten DNS-Synthetisierers). Wahlweise kann ein DNS-Molekül, das eine nichtmodifizierte Peptidverbindung codiert, von dem natürlichen β- Amyloid-Präkursor-Protein-Gen oder cDNS (z. B. unter Verwendung der Polymerasen-Kettenreaktion und/oder Restriktionsenzym-Verdau) gemäss den molekularbiologischen Standardtechniken abgeleitet werden.
Dementsprechend stellt die Erfindung ferner ein isoliertes Nucleinsäure- Molekül bereit, das eine Nucleotid-Sequenz umfasst, die eine β-Amyloid- Peptidverbindung codiert, wobei die β-Amyloid-Peptidverbindung eine Aminosäure-Sequenz mit mindestens einer Aminosäure-Deletion verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; umfasst, so dass die β-Amyloid-Peptidverbindung eine Aggregation von natürlichen β-Amyloid-Peptiden verändert, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird. Wie hierin verwendet beabsichtigt der Ausdruck "Nucleinsäure-Molekül" DNS Moleküle und RNS Moleküle einzuschließen und kann einzelsträngige oder doppelsträngige, aber vorzugsweise doppelsträngige DNS sein. Die isolierte Nucleinsäure codiert ein Peptid, worin eine oder mehrere Aminosäuren von dem N-Terminus, C-Terminus und/oder einer internen Stelle von βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; wie oben beschrieben deletiert sind. In noch anderen Anwendungsfällen codiert die isolierte Nucleinsäure eine Peptidverbindung mit einer oder mehreren deletierten Aminosäuren verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; und weiter mit mindestens einem von nicht-β-AP abstammenden Aminosäure-Rest, zum Beispiel an dem Aminoterminus, dem Carboxyterminus oder einer internen Stelle daran angefügt. In spezifischen bevorzugten Anwendungsfällen codiert ein isoliertes Nucleinsäure-Molekül der Erfindung βAP&sub6;&submin;&sub2;&sub0;, βAP&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;, βAP&sub1;&submin;&sub2;&sub0;, &sub2;&sub6;&submin;&sub4;&sub0; oder EEVVHHHHQQ-βAP&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub0;.
Zum Vereinfachen einer Expression einer Peptidverbindung in einer Wirtszelle durch rekombinante DNS-Standardtechniken wird die isolierte Nucleinsäure, die das Peptid codiert, in einen rekombinanten Expressionsvektor inkorporiert. Dementsprechend stellt die Erfindung ebenfalls rekombinante Expressionsvektoren bereit, die die Nucleinsäure-Moleküle der Erfindung umfassen. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "Vektor" ein Nucleinsäure-Molekül, das die Fähigkeit hat, eine andere Nucleinsäure zu transportieren, an die es gekoppelt worden ist. Eine Art eines Vektors ist ein "Plasmid", welches einen zirkulären doppelsträngigen DNS Ring bezeichnet, in den zusätzliche DNS-Abschnitte ligiert werden können. Eine andere Art eines Vektors ist ein viraler Vektor, worin zusätzliche DNS Abschnitte in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren haben die Fähigkeit der autonomen Replikation in einer Wirtszelle, in die sie eingeführt werden (z. B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säuger-Vektoren). Andere Vektoren (z. B. nichtepisomale Säuger- Vektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle durch Einführen in die Wirtszelle integriert und werden dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Außerdem haben bestimmte Vektoren die Fähigkeit die Expression von Genen, an die sie operativ verknüpft sind, zu steuern. Solche Vektoren werden hierin als "rekombinante Expressionsvektoren" oder einfach "Expressionsvektoren" bezeichnet. Im allgemeinen sind in rekombinanten DNS- Techniken nützliche Expressionsvektoren oftmals in der Form von Plasmiden. In der vorliegenden Spezifikation kann "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors ist. Dennoch beabsichtigt die Erfindung solche andere Formen von Expressionsvektoren, wie zum Beispiel virale Vektoren, die äquivalenten Funktionen dienen, einzuschließen.
In den rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung ist die Nucleinsäure-Sequenz, die die Peptidverbindung codiert, an eine oder mehrere regulatorische Sequenzen operativ gekoppelt, die aufgrund der für eine Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählt werden. Der Ausdruck "operativ gekoppelt" beabsichtigt zu bedeuten, dass die Sequenzen, die die Peptidverbindung codieren, an die regulatorische Sequenz(en) auf eine Weise gekoppelt werden, die eine Expression der Peptidverbindung ermöglicht. Der Ausdruck "regulatorische Sequenz" beabsichtigt Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z. B. Polyadenylierungssignal) einzuschließen. Solche regulatorischen Sequenzen sind zum Beispiel beschrieben in Goeddel; Gene Expression Technology Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatorische Sequenzen schließen solche ein, die eine konstitutive Expression einer Nucleotid-Sequenz in vielen Arten von Wirtszellen steuern, solche die eine direkte Expression der Nucleotid-Sequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern (z. B. Gewebe-spezifische regulatorische Sequenzen) und solche, die eine Expression auf eine regulierbare Weise steuern (z. B. nur bei Vorhandensein eines induzierenden Mittels). Es ist einem Fachmann bewußt, dass der Entwurf des Expressionsvektors von solchen Faktoren, wie die Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Expressionsgehalt einer gewünschten Peptidverbindung, etc. abhängt. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingeführt werden, um dabei Peptidverbindungen herzustellen, die wie hierein beschrieben, von Nucleinsäuren codiert werden.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können für eine Expression von Peptidverbindungen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen entworfen werden. Zum Beispiel können Peptidverbindungen in bakteriellen Zellen, wie zum Beispile E. coli, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugerzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden weiter diskutiert in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Wahlweise kann der rekombinante Expressionsvektor, zum Beispiel unter Verwendung von T7 Promotor regulatorischen Sequenzen und T7 Polymerase in vitro transkribiert und translatiert werden. Beispiele von Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerivisiae schließen pYepSec1 (Baldari et al., (1987) EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, (1982) Cell. 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) ein. Für eine Expression von Proteinen oder Peptiden in kultivierten Insektenzellen (z. B. Sf9Zellen) erhältliche Baculovirus-Vektoren schließen die pAc Serien (Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) und die pVL Serien (Lucklow, V. A., und Summers, M. D., (1989) Virology 170: 31-39) ein. Beispiele von Säuger- Expressionsvektoren schließen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195) ein. Bei Verwendung in Säugerzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oftmals durch virale regulatorische Elemente bereit gestellt. Zum Beispiel stammen gemein verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simian Virus 40 ab.
Zusätzlich zu den oben diskutierten regulatorischen Kontrollsequenzen kann der rekombinante Expressionsvektor zusätzliche Nucleotid-Sequenzen enthalten. Zum Beispiel kann der rekombinante Expressionsvektor ein selektierbares Markergen zum Identifizieren von Wirtszellen, die den Vektor inkorporiert enthalten, codieren. Solch selektierbare Markergene sind im Fachgebiet wohl bekannt. Außerdem codiert der rekombinante Expressionsvektor zum Vereinfachen einer Sezernierung der Peptidverbindung aus einer Wirtszelle, insbesondere Säugerwirtszellen, vorzugsweise eine Signalsequenz, die an den Aminoterminus der Peptidverbindung codierenden Sequenzen operativ gekoppelt ist, so dass bei Expression die Peptidverbindung mit der an ihr Aminoterminus fusionierten Signalsequenz synthetisiert wird. Die Signalsequenz steuert die Peptidverbindung in den sezernierenden Pfad der Zelle und wird dann gespalten, um eine Freisetzung der reifen Peptidverbindung (d. h. die Peptidverbindung ohne die Signalsequenz) aus der Wirtszelle zu ermöglichen. Eine Verwendung einer Signalsequenz zur Vereinfachung einer Sezernierung von Proteinen oder Peptiden aus Säugerwirtszellen ist im Fachgebiet wohl bekannt.
Ein rekombinanter Expressionsvektor, der eine Nucleinsäure umfasst, die eine Peptidverbindung codiert, die eine Aggregation von natürlichem β-AP verändert, kann in eine Wirtszelle eingeführt werden, um damit die Peptidverbindung in der Wirtszelle herzustellen. Dementsprechend stellt die Erfindung ebenfalls Wirtszellen bereit, die die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung enthalten. Die Ausdrücke "Wirtszelle" und "rekombinate Wirtszelle" werden hierin austauschbar verwendet. Es ist zu verstehen, dass solche Ausdrücke nicht nur die besondere Patientenzelle, sondern auch die Nachkommenschaft oder potentielle Nachkommenschaft solch einer Zelle bezeichnet. Da bestimmte Modifikationen in nachfolgenden Generationen aufgrund von entweder Mutation oder Umwelteinflüssen stattfinden können, kann eine solche Nachkommenschaft tatsächlich zur Ausgangszelle nicht identisch sein, ist aber immer noch im Rahmen des Ausdruckes, wie hierin verwendet, eingeschlossen. Eine Wirtszelle kann jegliche prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Zum Beispiel kann eine Peptidverbindung in bakteriellen Zellen, wie zum Beispiel E. coli, Insektenzellen, Hefe oder Säugerzellen exprimiert werden. Vorzugsweise wird die Peptidverbindung in Säugerzellen exprimiert. In einem bevorzugten Anwendungsfall wird die Peptidverbindung in Säugerzellen in vivo in einem Säuger-Patienten zum Behandeln von Amyloidose in dem Patienten durch Gentherapie exprimiert (weiter unten diskutiert). Vorzugsweise wird die durch den rekombinanten Expressionsvektor codierte β-Amyloid-Peptidverbindung aus der Wirtszelle bei Expression in der Wirtszelle sezerniert.
Vektor-DNS kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen via herkömmlicher Transformations- oder Transfektionsverfahren eingeführt werden. Wie hierin verwendet, beabsichtigen die Ausdrücke "Transformation" und "Transfektion" eine Vielzahl an im Fachgebiet bekannten Techniken zur Einführung fremder Nucleinsäure (z. B. DNS) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, Lipofektion, Elektroporation, Mikroinjektion und viral- vermittelte Transfektion zu bezeichnen. Geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen können in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) und anderen Laborhandbüchern vorgefunden werden. Verfahren zur Einführung von DNS in Säugerzellen in vivo sind ebenfalls im Fachgebiet bekannt und können zum Liefern der Vektor-DNS an einen Patienten für Gentherapie verwendet werden (wird weiter unten diskutiert).
Für eine stabile Transfektion von Säugerzellen ist es bekannt, dass in Abhängigkeit von dem verwendeten Expressionsvektor und Transfektionstechnik nur ein kleiner Anteil der Zellen die fremde DNS in ihr Genom integriert. Zur Identifizierung und Selektion dieser Integranten wird im Allgemeinen ein Gen in die Wirtszellen zusammen mit dem Gen von Interesse eingeführt, das einen selektierbaren Marker codiert (z. B. Antibiotikaresistenz). Bevorzugte selektierbare Marker schließen solche ein, die Resistenz gegen Stoffe, wie zum Beispiel G418, Hygromycin und Methotrexat übertragen. Eine einen selektierbaren Marker codierende Nucleinsäure kann in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor, der die Peptidverbindung codiert, eingeführt werden oder kann auf einem getrennten Vektor eingeführt werden. Mit der eingeführten Nucleinsäure stabil transfizierte Zellen können durch Stoff-Selektion identifiziert werden (z. B. Zellen, die ein selektierbares Markergen inkorporiert enthalten, werden überleben, während die anderen Zellen sterben).
Eine Nucleinsäure der Erfindung kann in vivo Zellen unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren geliefert werden, wie zum Beispiel direkte Injektion von DNS, Rezeptor-vermittelte DNS Aufnahme oder viral- vermittelte Transfektion. Direkte Injektion wurde verwendet, um nackte DNS in Zellen in vivo einzuführen (siehe z. B. Acsadi et al. (1991) Nature 332: 815- 818; Wolfet al. (1990) Science 247: 1465-1468). Ein Lieferapparat (z. B. eine "Genpistole") kann zum Injizieren von DNS in Zellen in vivo verwendet werden. Solch ein Apparat ist kommerziell erhältlich (z. B. von BioRad). Nackte DNS kann auch durch Komplexieren der DNS an ein Kation, wie zum Beispiel Polylysin, das an einen Liganden für einen Zelloberflächen-Rezeptor gekoppelt ist, in Zellen eingeführt werden (siehe zum Beispiel Wu, G. und Wu, C. H. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14621; Wilson, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 963-967; und U.S. Patentnr. 5,166,320). Ein Binden des DNS- Ligand-Kompexes an den Rezeptor vereinfacht eine Aufnahme der DNS durch Rezeptor-vermittelte Endozytose. Zusätzlich kann ein DNS-Ligand Komplex, der an Adenovirus-Kapside verknüpft ist, die natürlicherweise Endosomen unterbrechen, wobei in das Cytoplasma Material freigesetzt wird, zum Vermeiden eines Abbau des Komplexes durch intrazelluläre Lysosomen verwendet werden (siehe zum Beispiel Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8850; Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2122- 2126).
Defekte Retroviren sind für eine Verwendung bei Gentransfer bei Durchführung von Gentherapie gut charakterisiert worden (zur Übersicht siehe Miller, A. D. (1990) Blood 76: 271). Protokolle zur Herstellung rekombinanter Retroviren und zum Infizieren von Zellen in vitro oder in vivo mit solchen Viren können in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Abschnitte 9.10-9.14 und in anderen Standardlaborhandbüchern gefunden werden. Beispiele geeigneter Retroviren schließen pLJ, pZIP, pWE und pEM ein, die einem Fachmann wohl bekannt sind. Beispiele geeigneter Verpackungsviruslinien schließen ψCrip, ψCre, ψ2 und ψAm ein. Retroviren sind zur Einführung einer Vielzahl an Genen in viele verschiedene Zelltypen, einschließlich Epithelzellen, Endothelzellen, Lymphozyten, Myoblasten, Hepatozyten, Knochenmarkszellen in vitro und/oder in vivo verwendet worden (siehe zum Beispiel Eglitis, et al. (1985) Science 230: 1395-1398; Danos und Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. 86 USA 87: 6141- 6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. 56 USA 88: 8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. 56 USA 88: 8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254: 1802-1805; von Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3: 641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150: 4104-4115; U.S. Patentnr. 4,868,116; U.S. Patentnr 4,980,286; PCT Anmeldung WO 89/07136; PCT Anmeldung WO 89/02468; PCT Anmeldung WO 89/05345; und PCT Anmeldung WO 92/07573).
Wahlweise kann das Genom eines Adenovirus so manipuliert werden, dass es eine Peptidverbindung codiert und exprimiert, aber hinsichtlich seiner Fähigkeit, innerhalb eines normalen lytischen viralen Lebenszyklus zu replizieren, inaktiviert ist. Siehe zum Beispiel Berkner et al. (1988) BioTechniques 6: 616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252: 431-434; und Rosenfeld et al. (1992) Cell. 68: 143-155. Geeignete adenovirale Vektoren, die von dem Adenovirus Stamm Ad Typ 5 dl324 oder anderen Adenovirus-Stämmen (z. B. Ad2, Ad3, Ad7 etc.) abstammen, sind einem Fachmann wohl bekannt. Rekombinante Adenoviren sind insofern vorteilhaft, da sie nicht sich teilende Zellen benötigen, um wirksame Gen-Liefervehikel zu sein und können verwendet werden, um eine weitreichende Vielzahl an Zelltypen, einschließlich Luftröhrenepithelium (Rosenfeld et al. (1992) zitiert supra), Endothelzellen (Lemarchand et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 6482-6486), Hepatozyten (Herz und Gerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2812- 2816) und Muskelzellen (Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2581-2584) zu infizieren. Zusätzlich ist eingeführte adenovirale DNS (und darin enthaltene fremde DNS) in das Genom einer Wirtszelle nicht integriert und verbleibt episomal, wobei dadurch potentielle Probleme vermieden werden, die als eine Folge von Insertionsmutagenese in Situationen stattfinden können, in denen eingeführte DNS in das Wirtsgenom integriert wird (z. B. retrovirale DNS).
Adeno-Assoziiertes Virus (AAV) kann ebenfalls zum Liefern von DNS für Gentherapie verwendet werden. AAV ist ein natürlich vorkommendes defektes Virus, das ein anderes Virus, wie zum Beispiel ein Adenovirus oder ein Herpesvirus, als ein Helfervirus für eine effiziente Replikation und einen produktiven Lebenszyklus benötigt (Zur Übersicht siehe Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro, and Immunol. (1992) 158: 97-129). Es ist ebenfalls eines von wenigen Viren, das seine DNS in nichtteilende Zellen integrieren kann, und weist eine hohe Häufigkeit an stabiler Integration auf (siehe zum Beispiel Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63: 3822-3828; und McLaughlin et al. (1989) J. Virot 62: 1963- 1973). Vektoren, die so wenig wie nur 300 Basenpaare AAV enthalten, können verpackt werden und können integrieren. Ein AAV-Vektor, wie zum Beispiel der beschrieben in Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3251- 3260 kann zum Einführen von DNS in Zellen verwendet werden. Eine Vielzahl an Nucleinsäuren sind in verschiedene Zelltypen unter Verwendung von AAV Vektoren eingeführt worden (siehe zum Beispiel Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081: Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2: 32-39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51: 611-619; und Flotte et al. (1993) J. Biot Chem. 268: 3781-3790).
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten gegen eine mit β-Amyloidose assoziierte Erkrankung bereit, welches Verabreichen eines rekombinanten Expressionsvektors, der eine β-Amyloid-Peptidverbindung codiert, umfasst, wobei die Verbindung eine Aminosäure-Sequenz mit mindestens einer Aminosäure-Deletion verglichen mit βAP&sub1;&submin;&sub3;&sub9; umfasst, so dass die β-Amyloid-Peptidverbindung in dem Patienten synthetisiert wird und der Patient gegen eine mit β-Amyloidose assoziierte Erkrankung behandelt wird. Vorzugsweise ist die Erkrankung Alzheimer Krankheit. In einem Anwendungsfall steuert der rekombinante Expressionsvektor eine Expression der Peptidverbindung in neuronalen Zellen. In einem anderen Anwendungsfall steuert der rekombinante Expressionsvektor eine Expression der Peptidverbindung in Gliazellen. In noch einem anderen Anwendungsfall steuert der rekombinante Expressionsvektor eine Expression der Peptidverbindung in Fibroblastenzellen.
Allgemeine Verfahren zur Gentherapie sind im Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel U.S. Patentnr. 5,399,346 von Anderson et al. Eine biokompatible Kapsel zum Liefern von genetischem Material ist in PCT Veröffentlichung WO 95/05452 von Baetge et al. beschrieben. Verfahren zum Transplantieren genetisch modifizierter Zellen zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralnervensystems sind beschrieben in U.S. Patentnr. 5,082,670 und in PCT Veröffentlichungen WO 90/06757 und WO 93/10234 alle von Gage et al. Eine Isolation und/oder genetische Modifikation multipotenter neuraler Stammzellen oder neurostämmiger fötaler Zellen sind beschrieben in PCT Veröffentlichungen WO 94/02593 von Anderson et al., WO 94/16718 von Weiss et al., und WO 94/23754 von Major et al. Andenovirus-Vektoren zum Transferieren von genetischem Material in Zellen des Zentralnervensystems sind beschrieben in PCT Veröffentlichung WO 94108026 von Kahn et al. Herpes simplex Virus Vektoren, die für eine Behandlung von neuralen Erkrankungen geeignet sind, sind beschrieben in PCT Veröffentlichungen WO 94/04695 von Kaplitt und WO 90/09441 von Geiler et al.. Promotor-Elemente des glialen fibrillären sauren Proteins, die eine Astrozyten spezifische Expression eines gekoppelten Gens oder Genfragentes verleihen können und die somit für eine Expression von Aβ-Peptiden spezifisch in Astrozyten verwendet werden können, sind in PCT Veröffentlichung WO 93/07280 von Brenner et al. beschrieben. Außerdem kann alternativ zur Expression eines Aβ-Peptides zum Modulieren von Amyloidose, ein Antisense-Oligonucleotid, das zu einer Region der β-Amyloid-Präkursor- Protein-mRNS komplementär ist, die den hierin beschriebenen Peptiden entspricht, in einem Patienten zum Modulieren von Amyloidose exprimiert werden. Allgemeine Verfahren zur Expression von Antisense-Oligonucleotiden zum Modulieren von Erkrankungen des Nervensystems, sind in PCT Veröffentlichung WO 95/09236 beschrieben.
Alternativ zur Lieferung durch Gentherapie kann eine Peptidverbindung der Erfindung, die eine Aminosäure-Sequenz mit mindestens einer Aminosäure-Deletion verglichen mit βAP1&submin;&sub3;&sub9; an einen Patienten durch direkte Verabreichung der Peptidverbindung an den Patienten, wie weiter hierin für die modifizierten Peptidverbindungen der Erfindung beschrieben, geliefert werden. Die Peptidverbindung kann in eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert werden, die eine therapeutisch wirksame Menge der β-Amyloid-Peptidverbindung und einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfasst. Die Peptidverbindung kann mit natürlichen β- Amyloid-Peptiden mit einer β-Amyloid-Peptidverbindung so in Kontakt gebracht werden, dass eine Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide gehemmt wird. Außerdem kann die Peptidverbindung an den Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge so verabreicht werden, dass der Patient gegen eine mit β-Amyloidose assoziierte Erkrankung, wie zum Beispiel Alzheimer Krankheit behandelt wird.

VIII. Andere Anwendungsfälle

Obwohl die Erfindung hinsichtlich Aβ-Peptidverbindungen vorhergehend veranschaulicht worden ist, sind die beschriebenen Prinzipien, die ein Binden (von) einer modifizierenden Gruppe(n) an eine Peptidverbindung einbeziehen, auf jegliches amyloidogene Protein oder Peptid als ein Mittel zum Erschaffen einer Modulator-Verbindung, die eine Amyloid-Aggregation moduliert, und vorzugsweise hemmt, anwendbar. Dementsprechend stellt die Erfindung Modulator-Verbindungen bereit, die zum Behandeln von Amyloidose in einer Vielzahl von Formen und klinischen Situationen verwendet werden können.
Amyloidose ist ein allgemein verwendeter Ausdruck zum Beschreiben von pathologischen Zuständen, die durch das Vorhandensein von Amyloid gekennzeichnet sind. Amyloid ist ein allgemeiner Ausdruck, der eine Gruppe diverse aber spezifische extrazelluläre Protein-Ablagerungen bezeichnet, die in einer Anzahl verschiedener Erkrankungen ersichtlich sind. Obwohl sie in ihrer Erscheinung divergieren, haben alle Amyloid-Ablagerungen gemeinsame morphologische Eigenschaften, sind mit spezifischen Farbstoffen (z. B. Kongorot) anfärbbar und haben eine charakteristische rot-grüne doppelbrechende Erscheinung in polarisiertem Licht nach Färbung. Sie teilen ebenfalls gemeinsame ultrastrukturelle Merkmale und gemeinsame Röntgenbeugung und Infrarotspektren. Amyloidose kann als primär, sekundär, familiär und/oder isoliert klinisch klassifiziert werden. Primäre Amyloidose erscheint de novo ohne eine vorhergehende Erkrankung. Sekundäres Amyloid ist die Form, die als eine Komplikation einer zuvor existierenden Erkrankung erscheint. Familiäres Amyloid ist eine genetisch vererbte Form, die insbesondere in geographischen Populationen gefunden wird. Isolierte Formen von Amyloid sind solche, die dazu tendieren, ein Einzelorgansystem einzubeziehen.
Verschiedene Amyloide werden durch die in der Ablagerung vorhandenen Art an Protein(en) oder Peptid(en) gekennzeichnet. Zum Beispiel umfassen, wie vorhergehend hierin beschrieben, mit Alzheimer Krankheit assoziierte Amyloid-Ablagerungen das β-Amyloid-Peptid und somit wird eine Modulator-Verbindung der Erfindung zur Detektion und/oder Behandlung von Alzheimer Krankheit basierend auf Modifikation des β-Amyloid-Peptides entworfen. Die Identitäten der in mit einer Reihe anderer amyloidogenen Erkrankungen assoziierten Amyloid-Ablagerungen vorhandenen Protein(e) oder Peptid(e), sind aufgeklärt worden. Dementsprechend können Modulator- Verbindungen für eine Verwendung zur Detektion und/oder Behandlung dieser anderen amyloidogenen Erkrankungen auf eine ähnliche Weise zu der hierin für von β-AP-abstammenden Modulatoren beschriebenen, präpariert werden. In vitro Testsysteme können unter Verwendung eines amyloidogenen Proteins oder Peptides, das in vitro Fibrillen bildet, analog zu den hierin beschriebenen Aβ-Tests, etabliert werden. Modulatoren können unter Verwendung solcher Testsysteme basierend auf der Fähigkeit des Modulators die β-Faltblatt-Struktur der Fibrillen zu stören, identifiziert werden. Anfänglich kann ein gesamtes amyloidogenes Protein modifiziert werden oder bevorzugter, kann ein Peptidfragment davon, das bekanntermaßen in vitro Fibrillen bildet, modifiziert werden (z. B. analog zu Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0;, wie hierin beschrieben). Aminosäure-Deletions- und Substitutionsanalysen können dann an dem modifizierten Protein oder Peptid (analog zu den in den Beispielen beschriebenen Studien) durchgeführt werden, um eine Aggregation-Kern-Domäne zu beschreiben, die ausreicht, um nach Modifikation eine Fibrillenbildung zu unterbrechen.
Nichteinschränkende Beispiele amyloidogener Proteine und Peptide und ihre assoziierten amyloidogenen Erkrankungen, schließen ein:
Transthyretin (TTR) - Amyloide, die Transthyretin enthalten, kommen in familiärer polyneuropathischer Amyloidose (Portugiesischer, Japanischer und Schwedischer Typ), familiärer cardiomyopathischer Amyloidose (Dänischer Typ), isolierter cardiopathischer Amyloidose und systemischer Altersamyloidose vor. Es wurde gezeigt, dass Peptidfragmente von Transthyretin Amyloid-Fibrillen in vitro bilden. Zum Beispiel bilden TTR 10-20 und TTR 105- 115 amyloidartige Fibrillen in 20-30% Acetonitril 1 Wasser bei Raumtemperatur (Jarvis, J. A., et al. (1994) Int. J. Pept Protein Res. 44: 388-398). Außerdem ist familiäre cardiomyopathische Amyloidose (Dänischer Typ) mit Mutation von Leu an Position 111 zu Met assoziiert und ein Analog von TTR 105-115, in dem das Wildtyp Leu an Position 111 durch Met substituiert worden ist (TTR 105-115 Met 111), bildet ebenfalls amyloidartige Fibrillen in vitro (siehe z. B. Hermansen. L. F. et al. (1995) Eur. J. Biochem. 227: 772-779; Jarvis et al. supra). Peptidfragmente von TTR, die Amyloid-Fibrillen in vitro bilden, werden ebenfalls beschrieben in Jarvis, J. A. et af. (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 192: 991-998 und Gustavsson, A., etal. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 175: 1159-1164. Ein Peptidfragment des Wildtyp oder mutierten Transthyretin, das Amyloid-Fibrillen bildet, kann wie hierin beschrieben modifiziert werden, um einen Modulator von Amyloidose zu erschaffen, der zur Detektion oder Behandlung von familiärer polyneuropathischer Amyloidose (Portugiesischer, Japanischer und Schwedischer Typ), familiärer cardiomyopathischer Amyloidose (Dänischer Typ), isolierter cardiopathischer Amyloidose und systemischer Altersamyloidose verwendet werden kann.
Prion Protein (PrP) - Amyloide in einer Reihe spongioformer Enzephalopathien einschließlich Scrapie in Schafen, boviner spongioformer Enzephalopahtie in Kühen und Creutzfeld-Jakob Krankheit (CJ) und Gerstmann- Straussler-Scheinker Syndrom (GSS) in Menschen, enthalten PrP. Eingeschränkte Proteolyse von PrPSc (das mit Scrapie assoziierte Prion-Protein) führt zu einem 27-30 kDa Fragment (PrP27-30), das zu stäbchenförmigen Amyloiden polymerisiert (siehe z. B. Pan, K. M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10962-10966; Gasset, M., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1-5). Es wurde gezeigt, dass Peptidfragmente von PrP aus Menschen und anderen Säugern Amyloid-Fibrillen in vitro bilden. Zum Beispiel bilden Polypeptide, die Sequenzen entsprechen, die von normalen und mutierten Allelen des PRNP Gens (das den in CJ beteiligten Präkursor des Prion-Proteins codiert) in den Regionen von Codon 178 und Codon 200 codiert werden, in vitro spontan Amyloid-Fibrillen (siehe z. B. Goldfarb, L. G., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4451-4454). Es wurde berichtet, dass ein die Reste 106-126 von humanem PrP umfassendes Peptid gerade Fibrillen bildet, die denen ähneln, die aus GGS Gehirnen extrahiert wurden, während berichtet wurde, dass ein die Reste 127-147 von humanem PrP umfassendes Peptid verdrehte Fibrillen bildet, die den Scrapie-assoziierten Fibrillen ähneln (Tagliavini, F., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9678-9682). Es wurde berichtet, dass die Reste 109-122, 113-127, 113- 120, 178-191 oder 202-218 umfassende Peptide aus Syrischen Hamster PrP Amyloid-Fibrillen bilden, wobei das häufigste amyloidogene Peptid Ala-Gly- Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala (SEQ ID NR. 17) ist, welches den Resten 113-120 des Syrischen Hamster PrP entspricht, das aber auch in PrP aus anderen Arten konserviert ist (Gasset, M. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. 86 USA 89: 10940-10944). Ein Peptidfragment von PrP, das Amyloid-Fibrillen bildet, kann wie hierin beschrieben modifiziert werden, um einen Modulator von Amyloidose zu erschaffen, der zur Detektion oder Behandlung von Scrapie, boviner spongioformer Enzephalopahtie, Creutzfeld-Jakob Krankheit oder Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrom verwendet werden kann.
Insel-Amyloid-Polypeptid (IAPP, ebenfalls als Amylin bekannt)- Amyloide, die IAPP enthalten, kommen in nicht insulinabhängiger Diabetes mellitus und Insulinom vor. IAPP ist ein 37 Aminosäuren langes Polypeptid- Fragment, das aus einem 89 Aminosäuren langen Präkursor-Protein gebildet wird (siehe z.B Betsholtz C., et al. (1989) Exp. Cell. Res. 183: 484-493; Westermark, P., et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3881-3885). Es wurde berichtet, dass ein den IAPP Resten 20-29 entsprechendes Peptid amyloidartige Fibrillen in vitro bildet, wobei die Reste 25-29 mit der Sequenz Ala-Ile-Leu-Ser-Ser (SED ID NR. 18) stark amyloidogen sind (Westermark, P., et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5036-5040; Glenner, G. G., et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 155: 608-614). Ein Peptidfragment von IAPP, das Amyloid-Fibrillen bildet, kann wie hierin beschrieben modifiziert werden, um einen Modulator von Amyloidose zu erschaffen, der zum Nachweis oder Behandlung von nicht insulinabhängiger Diabetes mellitus und Insulinom verwendet werden kann.
Atrial Natriuretischer Faktor (ANF) - Amyloide, die ANF enthalten, sind mit isolierter Atrial-Amyloidose assoziiert (siehe z. B. Johansson, B., et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 148: 1087-1092). AFN entspricht den Aminosäure-Resten 99-126 (proANF99-126) des ANF Prohormons (proANP1-126) (Pucci, A., et al. (1991) J. Pathol. 165: 235-241). AFN oder ein Fragment davon, das Amyloid-Fibrillen bildet, kann wie hierin beschrieben modifiziert werden, um einen Modulator von Amyloidose zu erschaffen, der zur Detektion oder Behandlung von isolierter Atrial-Amyloidose verwendet werden kann.
Kappa oder Lambda Leichte Kette - Amyloide, die Kappa oder Lambda Leichte Ketten enthalten, sind mit idiopathischer (primärer) Amyloidose, Myelom- oder Makroglobulinämieassozierter Amyloidose und primär lokalisierter Hautamyloidose assoziiert mit Sjögrens Syndrom assoziiert. Die Struktur von amyloidogenen Kappa und Lambda leichten Ketten, einschließlich Aminosäure-Sequenz-Analyse, wurde charakterisiert (siehe z. B. Buxbaum, J. N., et al. (1990) Ann. Intern. Med. 112: 455-464; Schormann, N., et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9490-9494; Hurle, M. R., et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5446-5450; Liepnieks, J. J., et al. (1990) Mol. Immunol. 27: 481-485; Gertz, M. A., et al. (1985) Scand. J. Immunol. 22: 245-250; Inazumi, T., et al. (1994) Dermatology 189: 125-128). Kappa oder Lambda leichte Ketten, oder ein Peptidfragment davon, das Amyloid-Fibrillen bildet, kann wie hierin beschrieben modifiziert werden, um einen Modulator von Amyloidose zu erschaffen, der zur Detektion oder Behandlung von idiopathischer (primärer) Amyloidose, Myelom- oder Makroglobulinämieassozierter Amyloidose und primär lokalisierter Hautamyloidose assoziiert mit Sjögrens Syndrom verwendet werden kann.
Amyloid A - Amyloide, die Amyolid A Protein (AA Protein), das von Serum Amyloid A abstammt, enthalten, sind mit reaktiver (sekundärer) Amyloidose (siehe z. B. Liepnieks, J. J., et al. (1995) Biochem. Biophys. Acta 1270: 81-86), familiärem Mittelmeerfieber und familiärer nephropathischer Amyloidose mit Urticaria und Taubheit (Muckle-Wells Syndrom) (siehe z. B. Linke. R. P., et al. (1983) Lab. Invest. 48: 698-704) assoziiert. Rekombinantes humanes Serum Amyloid A bildet amyloidartige Fibrillen in vitro (Yamada, T., et al. (1994) Biochem. Biophys. Acta 1226: 323-329) und Zirkulardichroismus- Untersuchungen offenbarten eine prädominante β Faltblatt/Schleifen- Struktur (McCubbin, W. D., et al. (1988) Biochem. J. 256: 775-783). Serum Amyloid A, Amyloid A Protein oder ein Fragment davon, das Amyloid-Fibrillen bildet, kann wie hierin beschrieben modifiziert werden, um einen Modulator von Amyloidose zu erschaffen, der zur Detektion oder Behandlung von reaktiver (sekundärer) Amyloidose, familiärem Mittelmeerfieber und familiärer nephropathischer Amyloidose mit Urticaria und Taubheit (Muckle-Wells Syndrom) verwendet werden kann.
Cystatin C - Amyloide, die eine Variante von Cystatin C enthalten, sind mit hereditärer Enzephalorrhagie mit Island-Typ Amyloidose assoziiert. Die Erkrankung ist mit einer Leucin zu Glycin Mutation an Position 68 assoziiert und diese Mutation enthaltendes Cystatin C aggregiert in vitro (Abrahamson, M. und Grubb, A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1416-1420). Cystatin C oder ein Peptidfragment davon, das Amyloid-Fibrillen bildet, kann wie hierin beschrieben modifiziert werden, um einen Modulator von Amyloidose zu erschaffen, der zur Detektion oder Behandlung von hereditärer Enzephalorrhagie mit Island-Typ Amyloidose verwendet werden kann.
β2 Mikroglobulin - Amyloide, die β2 Mikroglobulin (β2M) enthalten, sind eine Hauptkomplikation bei Langzeit-Hämodialyse (siehe z. B. Stein, G., et al. (1994) Nephrol. Dial. Transplant. 9: 48-50; Floege, J., et al. (1992) Kidney Int. Suppl. 38: 578-S85; Maury, C. P. (1990) Rheumatol. Int. 10: 1-8). Es wurde gezeigt, dass das native β2M Protein Amyloid-Fibrillen in vitro bildet (Connors, L. H., et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 131: 1063- 1068; Ona, K., et al. (1994) Nephron 66: 404-407). β2M oder ein Peptidfragment davon, das Amyloid-Fibrillen bildet, kann wie hierin beschrieben modifiziert werden, um einen Modulator von Amyloidose zu erschaffen, der zur Detektion oder Behandlung von Amyloidose assoziiert mit Langzeit- Hämodialyse verwendet werden kann.
Apolipoprotein A-I (ApoA-I) - Amyloide, die eine Formvariante von ApoA- I enthalten wurden in hereditärer nicht neuropathischer systemischer Amyloidose (familiäre Amyloid-Polyneuropathie III) gefunden. Zum Beispiel sind N-terminale Fragmente (Reste 1-86, 1-92 und 1-93) einer ApoA-I Variante mit einer Trp zu Arg Mutation an Position 50 in Amyloiden detektiert worden (Booth, D. R., et al. (1995) OJM 88: 695-702). In einer anderen Familie wurde eine Leucin zu Arginin Mutation an Position 60 gefunden (Soutar, A. K., et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7389-7393). ApoA-I oder ein Peptidfragment davon, das Amyloid-Fibrillen bildet, kann wie hierin beschrieben modifiziert werden, um einen Modulator von Amyloidose zu erschaffen, der zur Detektion oder Behandlung von hereditärer nicht neuropathischer systemischer Amyloidose verwendet werden kann.
Gelsolin - Amyloide, die Gelsolin-Varianten enthalten, sind mit familiärer Amyloidose Finnischer Typ assoziiert. Es wird von synthetischen Gelsolin- Peptiden, die eine Sequenzhomologie zu Wildtyp- oder mutierten Gelsolinen haben und die Amyloid-Fibrillen in vitro bilden, in Maury, C. P. et al. (1994) Lab. Invest. 70: 558-564 berichtet. Ein neun Reste langer Abschnitt, der den Rest 187 umgibt (der in familiärer Gelsolin Amyloidose mutiert ist) wurde als eine amyloidogene Region definiert (Maury, et al., supra; siehe ebenfalls Maury, C. P., et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 183: 227-231; Maury, C. P. (1991) J. Clin. Invest. 87: 1195-1199). Gelsolin oder ein Peptidfragment davon, das Amyloid-Fibrillen bildet, kann wie hierin beschrieben modifiziert werden, um einen Modulator von Amyloidose zu erschaffen, der zur Detektion oder Behandlung von familiärer Amyloidose Finnischer Typ verwendet werden kann.
Procalcitonin oder Calcitonin - Amyloide, die Procalcitonin, Calcitonin oder calcitoninartige Immunreaktivität enthalten, sind in Amyloid-Fibrillen detektiert worden, die mit medullärem Karzinom der Schilddrüse assoziiert sind (siehe z. B. Butler, M. und Khan, S. (1986) Arch. Pathol. Lab. Med. 110: 647-649; Sletten, K., et al. (1976) J. Exp. Med. 143: 993-998). Es wurde gezeigt, dass Calcitonin eine nichtverzweigte fibrilläre Struktur in vitro bildet (Kedar, I., et al. (1976) Isr. J. Med. Sci. 12: 1137-1140). Procalcitonin, Calcitonin oder ein Fragment davon, das Amyloid-Fibrillen bildet, kann wie hierin beschrieben modifiziert werden, um einen Modulator von Amyloidose zu erschaffen, der zur Detektion oder Behandlung von Amyloidose assoziiert mit medullärem Karzinom der Schilddrüse verwendet werden kann.
Fibrinogen - Amyloide, die eine variante Form der Fibrinogen alpha- Kette enthalten, wurden in hereditärer Nieren-Amyloidose gefunden. Es wurde von einer Arginin zu Leucin-Mutation an Position 554 in Amyloid- Fibrillen-Protein aus einer postmortem isolierten Niere eines betroffenen Individuums berichtet (Benson. M. D., et al. (1993) Nature Genetics 3: 252- 255). Fibrinogen alpha-Kette oder ein Peptidfragment davon, das Amyloid- Fibrillen bildet, kann wie hierin beschrieben modifiziert werden, um einen Modulator von Amyloidose zu erschaffen, der zur Detektion oder Behandlung von Fibrinogen assoziierter hereditärer Nieren-Amyloidose verwendet werden kann.
Lysozym - Amyloide, die eine variante Form von Lysozym enthalten, wurden in hereditärer systemischer Amyloidose gefunden. In einer Familie war die Erkrankung mit einer Threonin zu Isoleucin Mutation an Position 56 assoziiert, während in einer anderen Familie die Erkrankung mit einer Histidin zu Asparaginsäure Mutation an Position 67 assoziiert war (Pepys, M. B., et al. (1993) Nature 362: 553-557). Lysozym oder ein Peptidfragment davon, das Amyloid-Fibrillen bildet, kann wie hierin beschrieben modifiziert werden, um einen Modulator von Amyloidose zu erschaffen, der zur Detektion oder Behandlung von Lysozym assoziierter hereditärer systemischer Amyloidose verwendet werden kann.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, die als nicht abschließend angesehen werden sollen. Die Fähigkeit eines Modulators die Aggregation von β-Amyloid-Peptid in den unten beschriebenen Tests zu verändern sagen die Fähigkeit eines Modulators, die gleiche Funktion in vivo aufzuweisen, voraus. Die Inhalte aller hierin in dieser Anmeldung zitierten Referenzen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen sind hierdurch in der Referenz angeführt.

Beispiel 1: Konstruktion von β-Amyloid-Modulatoren

Ein β-Amyloid-Modulator, der ein aminoterminal biotinyliertes β-Amyloid- Peptid umfasst mit der Aminosäure-Sequenz:
(Position 1 bis 40 von SEQ ID NR. 1) wurde durch Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung einer auf Nα-9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC)- basierenden Schutzgruppen-Strategie wie folgt präpariert: Ausgehend von 2,5 mmol FMOC-Val-Wang Harz wurden nacheinanderfolgend Additionen jeder Aminosäure unter Verwendung eines vierfachen Überschusses geschützte Aminosäure, 1-Hydoxybenzotriazol (HOBt) und Diisopropylcarbodiimid (DIC) durchgeführt. Es wurden, wenn erforderlich, Kopplungswiederholungen durchgeführt, welches durch Ninhydrin-Analyse des Harzes nach Kopplung festgestellt wurde. Jeder Synthesezyklus wird in Kürze beschrieben durch drei Minuten Schutzgruppen-Entfernung (25% Piperidin/N-Methylpyrrolidon (NMP)), 15 Minuten Schutzgruppen-Entfernung, fünf mal eine Minute NMP-Waschen, 60 Minuten Kopplungszyklus, fünf mal Waschen mit NMP und ein Ninhydrin-Test. Zu einem 700 mg-Anteil des vollständig zusammengesetzten Peptidharzes wurde eine durch das obige Protokoll gekoppelte FMOC-Aminosäure mit Biotin (von Molecular Probes, Inc. kommerziell erhalten) substituiert. Das Peptid wurde durch Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA) (82,5%), Wasser (5%), Thianisol (5%), Phenol (5%), Ethandithiol (2,5%) für zwei Stunden von dem Harz entfernt, gefolgt von Fällung des Peptides in kaltem Ether. Der Feststoff wurde durch Zentrifugation (2400 rpm · 10 min) pelletiert und der Ether dekantiert. Der Feststoff wurde ein zweites Mal in Ether resuspendiert, pelletiert und dekantiert. Der Feststoff wurde in 10% Essigsäure gelöst und zur Trocknung lyophilisiert, um 230 mg biotinyliertes Rohpeptid zu erhalten. 60 mg des Feststoffes wurde in 25% Acetonitril (ACN)/0,1% TFA gelöst und auf eine C18 Reversphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) Säule aufgetragen. Biotinyl-βAP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten 30-45% Acetonitril/0,1% TFA 40 Minuten eluiert. Eine primäre Fraktion (4 mg) und mehrere Nebenfraktionen wurden isoliert. Die Hauptfraktion ergab ein Massenspektrum von 4556 (matrixgestützte Laserdesorptionsflugzeitmassenspektrometrie), welches mit dem theoretischen Wert (4555) für dieses Peptid übereinstimmt.
Ein β-Amyloid-Modulator, der ein aminoterminal biotinyliertes β-Amyloid- Peptid umfasst mit der Aminosäure-Sequenz:
(Positionen 1 bis 15 von SEQ ID NR. 1) wurde auf einem Advanced ChemTech Model 396 multiplen Peptidsynthetisierer unter Verwendung eines von dem Hersteller etablierten automatisierten Protokols für eine Synthese im Größenbereich von 0,025 mmol präpariert. Doppelte Kopplungen wurde bei allen Zyklen unter Verwendung von 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU)/N,N,-Diisopropylethylamin (DIEA)/HOBt/FMOC-AA in vierfachem Überschuss 30 Minuten gefolgt von 45 Minuten DIC/HOBt/FMOC-AA in vierfachem Überschuss durchgeführt. Vom Peptid wurde die Schutzgruppe entfernt und das Peptid wurde von dem Harz durch Behandlung mit TFA/Wasser (95%/5%) für 3 Stunden entfernt und mit Ether wie oben beschrieben gefällt. Das Pellet wurde in 10% Essigsäure resuspendiert und lyophilisiert. Das Material wurde durch eine präparative HPLC unter Verwendung von 15% - 40% Acetonitril 80 Minuten auf einer Vydac C18 Säule (21 · 250 mm) gereinigt. Das Hauptisolat eluierte als ein einziger symmetrischer Peak bei Analyse durch analytische HPLC und ergab das erwartete Molekulargewicht bei Analyse durch Elektrospray- Massenspektrometrie. Ergebnis = 2052,6 (2052 theoretischer Wert).
β-Amyloid-Modulator-Verbindungen, die andere Region der β-AP Aminosäure-Sequenz enthalten (z. B. eine Aβ Aggregation-Kern-Domäne) wurden auf ähnliche Weise unter Verwendung der oben beschriebenen Syntheseverfahren präpariert. Außerdem können Modulatoren, die andere amyloidogene Peptide umfassen, auf ähnliche Weise präpariert werden.

Beispiel 2: Hemmung der β-Amyloid-Aggregation durch Modulatoren

Die Fähigkeit von β-Amyloid-Modulatoren die Aggregation von natürlichem β-AP zu hemmen, wenn sie mit dem natürlichen β-AP vereint werden, wurde in einer Reihe von Aggregationstests untersucht. Natürliches β-AP (β- AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0;) wurde von Bachem kommerziell erhalten (Torrance, CA). Aminoterminal biotinylierte β-AP Modulatoren wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, präpariert.

A. Test der optischen Dichte

In einem Test wurde β-AP Aggregation durch Bestimmung der Steigerung der Trübung einer Lösung von natürlichem β-AP über eine Zeitspanne bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein verschiedener Konzentrationen des Modulators gemessen. Die Trübung der Lösung wurde durch Bestimmung der optischen Dichte bei 400 nm (A400 nm) der Lösung über einen Zeitraum quantifiziert.
Die Aggregation von natürlichem β-AP bei Nichtvorhandensein des Modulators wurde wie folgt bestimmt. β-AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; wurde in Hexafluorisopropanol (HFIP; Aldrich Chemical Co., Inc) mit 2 mg/ml gelöst. Aliquots der HFIP- Lösung (87 ul) wurden in einzelne 10 mm · 75 mm Reagenzgläser überführt. Ein Argongasstrahl wurde zum Verdampfen von HFIP durch jedes Röhrchen gerichtet. Zu der resultierenden dünnen Peptidschicht wurde zum Lösen des Peptides Dimethylsulfoxid (DMSO; Aldrich Chemical Co., Inc.) (25 ul) hinzugefügt. Ein 2 mm · 7 mm teflonbeschichteter Magnetrührstab wurde in jedes Röhrchen hinzugefügt. Puffer (475 uL 100 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4) wurde zu der DMSO Lösung unter Rühren hinzugefügt. Die resultierende Mischung wurde kontinuierlich gerührt und die optische Dichte wurde zum Beobachten der Bildung von unlöslichen Peptid-Aggregaten bei 400 nm überwacht.
Wahlweise wurde β-AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; in DMSO wie oben beschrieben bei 1,6 mM (6,9 mg/ml) gelöst und Aliquots (25 ul) wurden zum gerührten Puffer (475 ul) hinzugefügt, gefolgt von Überwachung der Absorption bei 400 nm.
Für Hemmungsstudien, in denen ein β-Amyloid-Modulator in Lösung zusammen mit dem natürlichen β-AP gelöst wurde, wurden die Modulatoren in DMSO entweder mit oder ohne vorheriges Lösen in HFIP gelöst. Diese Verbindungen wurden dann unter Rühren zum Puffer hinzugefügt, gefolgt von Zugabe von β-AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; in DMSO. Wahlweise wurden HFIP-Lösungen von Modulatoren mit β-AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; in HFIP vereint, gefolgt von Verdampfen und Wiederlösen der Mischung in DMSO. Dann wurde zum Initiieren des Tests Puffer zu der DMSO Lösung hinzugefügt. Die aminoterminal biotinylierten β-Amyloid- Peptid-Modulatoren N-Biotinyl-βAP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; und N-Biotinyl-βAP&sub1;&submin;&sub1;&sub5; wurden bei Konzentrationen von 1% und 5% in der natürlichen β-AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Lösung getestet.
Ein repräsentatives Beispiel der Ergebnisse ist in Fig. 1 graphisch dargestellt, die die Aggregationshemmung von natürlichem β-AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; durch N- Biotinyl-βAP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; veranschaulicht. Bei Nichtvorhandensein des Modulators zeigte die optische Dichte der natürlichen β-AP Lösung eine charakteristische sigmoidale Kurve mit einer Anlaufzeit vor Aggregation (etwa 3 Stunden in Fig. 1), in der die A400 nm gering war, gefolgt von einem schnellen Anstieg der A400 nm, die schnell ein Plateaulevel erreichte, welches eine Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide repräsentierte. Im Gegensatz dazu wurde bei Vorhandensein von so wenig wie 1% des N-Biotinyl-βAP&sub1;&submin;&sub4;&sub0;-Modulators eine Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide merklich gehemmt, welches durch eine Anlaufzeitsteigerung, einer Abnahme der Aggregationssteigung und einer Abnahme des erreichten Plateaulevels bei Trübung der Lösung angezeigt wurde (siehe Fig. 1). N-Biotinyl-βAP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; hemmte bei einer Konzentration von 5% auf ähnliche Weise eine Aggregation der natürlichen β- Amyloid-Peptide. Des Weiteren wurden ähnliche Ergebnisse beobachtet, wenn N-Biotinyl-βAP&sub1;&submin;&sub1;&sub5; als der Modulator verwendet wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein N-terminal biotinylierter β-AP-Modulator die Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide wirksam hemmen kann, sogar wenn die natürlichen β-Amyloid-Peptide in einer 100-fachen molaren Überschusskonzentration vorhanden sind.

B. Fluoreszenztest

In einem zweiten Test wurde β-AP Aggregation unter Verwendung eines fluorometrischen Tests gemessen, der im wesentlichen in Levine, H. (1993) Protein Science 2: 404-410 beschrieben ist. In diesem Test wird der Farbstoff Thioflavin T (ThT) mit der β-AP Lösung in Kontakt gebracht. Eine Assoziation von ThT mit aggregiertem β-AP, aber nicht mit monomerem oder lose assoziiertem β-AP, ergibt ein neues Anregungsmaximum (ex) bei 450 nm und eine verstärkte Emission (em) bei 482 nm verglichen mit 385 nm (ex) und 445 nm (em) für den freien Farbstoff. Eine β-AP Aggregation wurde durch dieses Verfahren wie folgt untersucht. Aliquots (2,9 ul) dieser Lösungen wurden in den Aggregationstests wie oben in Abschnitt A beschrieben aus den Proben entnommen und mit 200ul Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0), der Thioflavin T enthielt (10 uM; von Aldrich Chemical Co., Inc. kommerziell erhalten) verdünnt. Die Anregung wurde auf 450 nm eingestellt und die Emission wurde bei 482 nm gemessen. Ähnlich zu den mit dem oben in Abschnitt A beschriebenen Test der optischen Dichte beobachteten Ergebnissen, hemmte so wenig wie 1% von den N-biotinylierten β-AP Modulatoren eine Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide unter Verwendung dieses fluorometrischen Tests wirksam.

C. Statischer Aggregationstest

In einem dritten Test wurde β-AP Aggregation durch Sichtbarmachen der Peptid-Aggregate unter Verwendung von SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gemessen. In diesem Test wurde β-AP Lösungen erlaubt über einen Zeitraum zu aggregieren und dann wurden Aliquots der Reaktion auf einem Standard SDS-PAGE Gel aufgetragen. Typische Lösungsbedingungen waren 200 uM β-AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; in PBS bei 37ºC für 8 Tage oder 200 uM β-AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; in 0,1 M Natriumacetat bei 37ºC für 3 Tage. Die Peptid- Aggregate wurden durch Coomassie-Blau Färbung des Gels oder, bei β-AP Lösungen, die einen biotinylierten β-AP Modulator enthielten, durch Western- Blot eines von dem Gel präparierten Filters mit einer Streptavidin-Peroxidase- Sonde, gefolgt von einem Standard Peroxidasetest sichtbar gemacht. Die β- AP Aggregate sind als Banden mit hohem Molekulargewicht und geringer Mobilität auf dem Gel identifizierbar, die sich von den Banden mit geringem Molekulargewicht und hoher Mobilität von β-AP Monomeren oder Dimeren deutlich unterscheiden.
Wurde eine natürliche β-AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Aggregation mit diesem Verfahren bei Nichtvorhandensein von β-Amyloid-Modulatoren untersucht, waren Aggregate mit hohem Molekulargewicht ohne weiteres auf dem Gel detektierbar. Im Gegensatz dazu, wurden bei Untersuchung einer Selbstaggregation von N- Biotinyl-β-AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Modulator (d. h. Aggregation des N-Biotinyl-Peptids alleine, bei Nichtvorhandensein eines beliebigen natürlichen β-AP), wenn überhaupt, wenige Aggregate mit hohem Molekulargewicht beobachtet, was darauf hinweist, dass die Fähigkeit des Modulators mit sich selbst zu aggregieren verglichen mit natürlichem β-AP signifikant verringert ist. Schließlich wurde, wenn eine Aggregation einer Mischung von natürlichem β-AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; und N- biotinyliertem β-AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0; durch dieses Verfahren untersucht wurde, verringerte Mengen der in Aggregaten mit hohem Molekulargewicht assoziierten Peptidmischung beobachtet, wobei somit gezeigt wurde, dass der β-Amyloid-Modulator die Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide wirksam hemmt.

Beispiel 3: Neurotoxizitätsanalyse von β-Amyloid-Modulatoren

Die Neurotoxizität der β-Amyloid-Modulatoren wird in einem auf Zellen basierenden Test unter Verwendung der neuronalen Präkursor-Zelllinie PC- 12 oder primären neuronalen Zellen und dem Viabilitätsindikator 3,(4,4- Dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) getestet. (Siehe Shearman, M. S. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1470-1474; Hansen, M. B. et al. (1989) J. Immun. Methods 119: 203-210). PC12 ist eine adrenale Pheochromocytom-Zelllinie aus Ratten und ist aus der American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC CRL 1721) erhältlich. MTT (von Sigma Chemical Co. kommerziell erhältlich) ist ein chromogenes Substrat, das von gelb nach blau in lebenden Zellen umschlägt, was spektrophotometrisch detektiert werden kann.
Zum Testen der Neurotoxizität eines β-Amyloid-Modulators (entweder alleine oder zusammen mit natürlichem β-AP) werden Zellen zunächst in Platten mit 96 Vertiefungen mit 7000-10 000 Zellen/Vertiefung ausplattiert und erlaubt durch Übernachtkultur bei 37ºC zu wachsen. Verdünnungsreihen frisch gelöster oder "gealterter" Modulatoren (entweder alleine oder zusammen mit natürlichem β-AP) in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) werden in Dreifachbestimmungen zu den Vertiefungen hinzugefügt und eine Inkubation wird für zwei oder mehr Tage fortgeführt. Gealterte Modulatoren werden durch ungestörtes Inkubieren einer wässrigen Lösung des Modulators bei 37ºC für einen längeren Zeitraum (z. B. fünf oder mehr Tage) präpariert. Während der letzten zwei Stunden, in denen die Zellen der Modulator-Präparation ausgesetzt sind, wird MTT zu den Medien bei einer Endkonzentration von 1 mg/ml hinzugefügt und eine Inkubation wird bei 37ºC fortgeführt. Im Anschluss an die zweistündige Inkubation mit MTT werden die Medien entfernt und die Zellen werden in Isopropanol/0,4 N HCL unter Rühren lysiert. Eine gleiche Menge an PBS wird in jede Vertiefung hinzugegeben und die Absorption einer jeden Vertiefung wird zum Quantifizieren lebender Zeilen bei 570 nm gemessen. Wahlweise wird MTT durch Zugabe von 50% N,N- Dimethylformamid/20% Natriumdodecylsulfat, das direkt zu den Medien in den Vertiefungen hinzugefügt wird, gelöst, und die lebenden Zellen werden auf ähnliche Weise durch Messung der Absorption bei 570 nm quantifiziert. Die relative Neurotoxizität eines β-Amyloid-Modulators (entweder alleine oder in Kombination mit natürlichem β-AP) wird durch Vergleich mit natürlichem β- AP alleine (z. B. β&sub1;&submin;&sub4;&sub0;, β&sub1;&submin;&sub4;&sub2;) bestimmt, welches Neurotoxi~ität in diesem Test aufweist und somit als eine Positivkontrolle dienen kann.

Beispiel 4: Synthesen von zusätzlichen modifizierten β-Amyloid- Peptidverbindungen

In diesem Beispiel wurde eine Reihe modifizierter β-APs mit einer Vielzahl an N-terminalen oder zufälligen Seitenketten-Modifikationen synthetisiert.
Eine Reihe N-terminal modifizierter β-Amyloid-Pept de wurde unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert. Vollständ g geschützte Harzgebundene Peptide, die Aβ(1-15) und Aβ(1-40) entsprachen, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben an Wang-Harz präpariert, um schließlich carboxyterminale Peptid-Säuren bereitzustellen. Kleine Anteile eines jeden Peptidharzes (13 und beziehungsweise 20 umol) wurden in die Vertiefungen des Reaktionsblockes eines Advanced ChemTech Model 396 Multiple Peptide Synthesizer aliquotiert. Die N-terminale FMOC Schutzgrippe einer jeden Probe wurde standardmäßig mit 25% Piperidin in NMP, gefolgt von ausgiebigem Waschen mit NMP entfernt. Die ungeschützte N-terminale α-Amino- Gruppe einer jeden Peptidharz-Probe wurde unter Verwindung von einem der folgenden Verfahren modifiziert:
Verfahren A, Kopplung modifizierender Reagenzier, die freie Carbonsäure-Gruppen enthalten: Das modifizierende Reagenz (fünf Äquivalente) wurde in NMP, DMSO oder einer Mischung dieser zwei Lösemittel vorgelöst. HOBT und DIC (fünf Äquivalente eines jeden Reagenz) wurden zu dem gelösten Modifizierer hinzugegeben und die resultierende Lösung wurde zu einem Äuqivalent des freien Amino-Peptidharzes hinzugefügt. Die Kopplung wurde über Nacht fortgesetzt, gefolgt von Waschen. Zeigte ein Ninhydin-Test einer kleinen Probe des Peptidharzes, dass eine Kopplung nicht vollendet war, wurde die Kopplung unter Verwendung von 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol (HoAt) anstelle von HOBt wiederholt.
Verfahren B, Kopplung modifizierender Reagenzien, die in präaktivierten Formen erhalten werden: Das modifizierende Reagenz (fünf Äquivalente) wurde in NMP, DMSO oder einer Mischung dieser zwei Lösemittel vorgelöst und zu einem Äuqivalent des Peptidharz hinzugefügt. Diisopropylethylamin (DIEA; sechs Äquivalente) wurde zu der Suspension von aktivierten Modifizierer und Peptidharz hinzugegeben. Die Kopplung wurde über Nacht fortgesetzt, gefolgt von Waschen. Zeigte ein Ninhydin-Test einer kleinen Probe des Peptidharzes, dass eine Kopplung nicht vollendet war, wurde die Kopplung wiederholt.
Nach der zweiten Kopplung (wenn notwendig) wurden die N-terminal modifizierten Harze bei erniedrigtem Druck getrocknet und von dem Harz unter Entfernung von Seitenketten-Schutzgruppen wie in Beispiel 1 beschrieben gespalten. Analytische Reverse-Phasen HPLC wurde zur Bestätigung verwendet, dass ein Hauptprodukt in den resultierenden Rohpeptiden vorhanden war, welches unter Verwendung von Millipore-Sep-Pak Kartuschen oder präparativer Reverse-Phasen HPLC gereinigt wurde. Massenspektrometrie wurde zum Bestätigen des Vorhandenseins der gewünschten Verbindung in dem Produkt verwendet.
Verfahren A wurde verwendet, um N-Acetylneuraminsäure, Cholsäure, trans-4- Kotinincarbonsäure, 2-Imino-1-imidazolidinessigsäure, (S)-(-)Indolin- 2-carbonsäure, (-)-Menthoxyessigsäure, 2-Norbornanessigsäure, γ-oxo-5- Acenaphthenbuttersäure, (-)-2-oxo-4-Thiazolidincarbonsäure und Tetrahydrofurancarbonsäure zu koppeln. Verfahren B wurde zur Kopplung von 2-Iminobiotin-N-hydroxysuccinimidester, Diethylentriaminpentaessigsäuredianhydrid, 4-Morpholincarbonylchlorid, 2-Thiophenacetylchlorid und 2-Thiophensulfonylchlorid verwendet.
Auf eine ähnliche Weise zu der oben beschriebenen Konstruktion von N- teminal modifizierten Aβ(1-15) und Aβ(1-40) Peptiden wurden N-Fluoresceinyl Aβ(1-15) und Aβ(1-40) auf zwei verschiedene Weisen unter Verwendung der präaktivierten Reagenzien 5-(und 6)-Carboxyfluoresceinsuccinimidylester und Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC Isomer I) präpariert. Beide Reagenzien wurden von Molecular Probes Inc. erhalten. Die Kopplungen wurden unter Verwendung von vier Äquivalenten eines Reagenzes pro Äquivalent Peptidharz durchgeführt und DIEA hinzugefügt, um die Reaktionslösung auf nassem pH-Papier basisch zu machen. Die Kopplungen eines jeden Reagenzes an Aβ(1-15) -Harz schienen nach einer einzigen Kopplung über Nacht vollendet zu sein. Kopplung an Aβ(1-40)-Harz war langsamer, was durch einen positiven Ninhydrin-Test angedeutet wurde, und beide Reagenzien wurde an dieses Peptidharz über Nacht in Tetrahydrofuran-NMP (1 : 2 v/v) erneut gekoppelt. Die resultierenden N-terminal modifizierten Peptidharze wurden wie in Beispiel A beschrieben gespalten, die Schutzgruppen entfernt und gereinigt.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen N-Fluoresceinyl Aβ-Peptiden wurde ein β-Amyloid-Modulator, der aus zufälliger Modifikation von Aβ(1-40) mit Fluorescein besteht, präpariert. Von Bachem erworbenes Aβ(1-40) wurde in DMSO bei etwa 2 mg/ml gelöst. Von Molecular Probes erworbenes 5-(und 6)- Carboxyfluorescein wurde in einem 1,5 molaren Überschuss hinzugefügt und DIEA wurde hinzugegeben, um die Lösung auf nassem pH Papier basisch zu machen. Die Reaktion wurde eine Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt und wurde dann mit Triethanolamin beendet. Das Produkt wurde zu den Tests als diese Rohmischung hinzugegeben.
β-Amyloid-Modulator-Verbindungen, die andere Regionen der β-AP Aminosäure-Sequenz (z. B. eine Aβ Aggregation-Kern-Domäne) umfassen, wurden auf ähnliche Weise unter Verwendung der oben beschriebenen Syntheseverfahren präpariert. Außerdem können Modulatoren, die andere amyloidogene Peptide umfassen, auf ähnliche Weise präpariert werden.

Beispiel 5: Identifizierung zusätzlicher β-Amyloid-Modulatoren

In diesem Beispiel wurden zwei Aβ-Aggregationstest verwendet, um β- Amyloid-Modulatoren zu identifizieren, die diesen Vorgang hemmen können.
Der erste Test wird als ein statischer Test mit Keimbildner (SSA) bezeichnet und wurde wie folgt durchgeführt:
Zur Präparation einer Aβ-Monomer-Lösung wurde die geeignete Menge Aβ(1-40) Peptid (Bachem) auf einer Mikrowaage ausgewogen (die Menge wurde bezüglich der Menge an Wasser in der Präparation, welche in Abhängigkeit von der Chargennummer 20-30% w/w betrug), korrigiert. Das Peptid wurde in 1/25 Volumen Dimethylsulfoxid (DMSO), gefolgt von Wasser auf ¹/&sub2; Volumen und ¹/&sub2; Volumen 2xPBS (10x PBS, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na&sub2;HPO&sub4;·7H&sub2;O 4,3 mM, KH&sub2;PO&sub4; 1,4 mM pH 7,2) auf eine Endkonzentration von 200 uM gelöst.
Zur Präparation eines Ausgangskeims wurde 1 ml der obigen Aβ- Monomer Präparation 8 Tage bei 37ºC inkubiert und nachfolgend durch eine 18, 23, 26 und 30 gauge Nadel 25, 25, 50 und beziehungsweise 100 mal geschert. 2 ul Proben des gescherten Materials wurden für Fluoreszenzmessungen nach 50 Durchgängen durch die 30 gauge Nadel genommen, bis die Fluoreszenzeinheiten (FU) eine Ebene erreichten (etwa 100-150x).
Zur Präparation eines Prüfhemmstoffes wurde die erforderliche Menge eines Prüfhemmstoffes ausgewogen und die Stammsubstanz wurde in 1x PBS auf eine Endkonzentration von 1 mM gelöst (10x Stammsubstanz). Wenn löslich, wurde sie in 1/10 Volumen DMSO gelöst und mit 1x PBS auf 1mM verdünnt. Eine weitere 1/10 Verdünnung wurde ebenfalls präpariert, um jeden Prüfstoff bei sowohl 100 uM als auch 10 uM zu testen.
Für den Aggregationstest wurde jede Probe in einer Dreifachbestimmung angesetzt [50 ul 200 uM Monomer, 125 FU gescherter Keim (variable Menge in Abhängigkeit von der Keimcharge, üblicherweise 3-6 ul), 10 ul 10x Hemmstofflösung, mit 1x PBS auf Endvolumen von 100 ul auffüllen]. Zwei Konzentrationen eines jeden Hemmstoffes wurden getestet, 100 uM und 10 uM, welche äquivalent zu einem 1 : 1 und einem 1 : 10 molaren Verhältnis von Monomer zu Hemmstoff ist. Die Kontrollen schlossen eine Reaktion ohne Keimbildner zur Bestätigung, dass das frische Monomer keinen Keim enthielt, und eine Reaktion mit Keimbildner bei Nichtvorhandensein eines Hemmstoffes als eine Referenz zum Vergleich gegen putative Hemmstoffe ein. Der Test wurde 6 h bei 37ºC inkubiert, wobei stündlich 2 ul Probe für die Fluoreszenzmessungen entnommen wurden. Zur Fluoreszenzmessung wurde eine 2 ul Probe von Aβ zu 400 ul Thioflavin-T-Lösung (50 mM Kaliumphosphat 10 mM Thioflavin-T pH 7,5) hinzugefügt. Die Proben wurden gevortext und die Fluoreszenz wurde in einer 0,5 ml Mikroquartzküvette bei EX 450 nm und EM 482 nm (Hitachi 4500 Fluorimeter) abgelesen. β-Aggregation hat eine verstärkte Emission von Thioflavin-T zur Folge. Dementsprechend zeigen Proben, die eine wirksame Hemmstoff-Verbindung einschließen, eine verringerte Emission verglichen mit Kontrollproben ohne die Hemmstoff- Verbindung.
Der zweite Test wird als auf geschüttelten Platten basierender Aggregationstest bezeichnet und wurde wie folgt durchgeführt:
Aβ(1-40)Peptid von Bachem (Torrance, CA) wurde in HFIP (1,1,1,3,3,3- Hexafluor-2-propanol; Aldrich 10,522-8) mit einer Konzentration von 2 mg Peptid/ml gelöst und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das HFIP gelöste Peptid wurde in einem Ultraschallbad 5 min in höchster Einstellung beschallt und dann zur Trocknung unter einem Argonstrahl verdampft. Die Peptidschicht wurde in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) bei einer Konzentration von 6,9 mg/ml resuspendiert und wie zuvor 5 min beschallt, dann durch einen 0,2 Mikron Nylon-Spritzenfilter filtriert (VWR Kat. Nr. 28196- 050). Prüfhemmstoffe wurden direkt in DMSO, im Allgemeinen bei einer 4 fach molaren Konzentration im Vergleich zu Aβ(1-40) Peptid, gelöst.
Die Prüfstoffe wurden in Dreifachbestimmungen getestet. Für jeden zu testenden Prüfstoff wurden 4 Teile Aβ(&sub1;&submin;&sub4;&sub0;) Peptid in DMSO mit 1 Teil Prüfhemmstoff in DMSO in einem Glasprobenfläschchen vereint und zur Herstellung eines 1 : 1 molaren Verhältnisses von Aβ-Peptid zu Prüfstoff vermischt. Für verschiedene molare Verhältnisse wurden die Prüfstoffe mit DMSO vor Zugabe von Aβ(1-40) verdünnt, um die DMSO und Aβ(1-40) Endkonzentrationen konstant zu halten. In eine Platte mit 96 Vertiefungen mit ultrageringer Bindung (Corning Costar Kat. Nr. 2500, Cambridge MA) wurde 100 ul PTL Puffer (150 mM NaCl, 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;; pH 7,4) pro Vertiefung aliquotiert. Für jeden Prüfstoff wurde 10 ul Peptid-Mischung in DMSO in jeweils drei Puffer enthaltende Vertiefungen aliquotiert. Die abgedeckte Platte wurde kräftig auf einem Plattenschüttler bei hoher Geschwindigkeit 30 Sekunden gevortext. Zusätzliche 100 ul PTL Puffer wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt und die Platte wurde wieder 30 Sekunden kräftig gevortext. Die Absorption bei 405 wurde unmittelbar in einem Plattenlesegerät für eine Grundlinienablesung abgelesen. Die Platte wurde auf dem Plattenschüttler zurückgestellt und bei moderater Geschwindigkeit 5 Stunden bei Raumtemperatur gevortext, wobei Absorptionslesungen in 15-20 minütigen Intervallen vorgenommen wurden. Eine gesteigerte Absorption war ein Hinweis auf Aggregation. Dementsprechend verursachen wirksame Hemmstoff- Verbindungen eine Absorptionsabnahme in einer Testprobe verglichen mit einer Kontrollprobe ohne die Hemmstoff-Verbindung.
Repräsentative Ergebnisse des statischen Tests mit Keimbildner und des auf geschüttelten Platten basierenden Tests mit bevorzugten β-Amyloid- Modulatoren sind unten in Tabelle I dargestellt. TABELLE I
* ++ = Eine starker Aggregationshemmstoff. Die Aggregationsrate bei Vorhandensein des Hemmstoffes war verglichen mit der Kontrolle mindestens um 30-50% verringert.
Diese Ergebnisse sind ein Hinweis, dass durch eine weitreichende Vielzahl an N-terminal modifizierenden Gruppen modifizierte β-APs eine β- Amyloid-Aggregation wirksam modulieren.

Beispiel 6: Zusätzliche β-Amyloid-Aggregationstests

Am bevorzugtesten wird die Fähigkeit von β-Amyloid-Modulator-Verbindungen die Aggregation von natürlichem β-AP zu modulieren (z. B. hemmen oder fördern), wenn sie mit dem natürlichen β-AP vereint werden, in einem oder beiden der unten beschriebenen Aggregationstests untersucht. Natürliches β-AP (β-AP&sub1;&submin;&sub4;&sub0;) zur Verwendung in den Aggregationstests ist von Bachem (Torrance, CA) kommerziell erhältlich.

A. Nukleierungstest

Der Nukleierungstest wird zur Bestimmung der Fähigkeit von Testverbindungen die frühen Ereignisse in der Bildung von β-AP Fasern aus monomerem β-AP zu verändern (z. B. hemmen) angewandt. Charakteristischerweise wird bei einem nukleierten Polymerisationsmechanismus eine Anlaufzeit vor Nukleierung beobachtet, nach der das Peptid rasch Fasern bildet, welches in einem linearen Trübungsanstieg deutlich wird. Die Zeitverzögerung vor Polymerisation von β-AP Monomeren, als auch das Ausmass der Bildung von unlöslichen Fasern kann durch Lichtstreuung (Trübung) quantifiziert werden. Die Trübung einer Lösung natürlichen β-AP bei Nichtvorhandensein oder Vorhandensein verschiedener Konzentrationen einer β-Amyloid- Modulator-Verbindung wird durch Messung der ersichtlichen Absorption der Lösung bei 405 nm (A405 nm) über einen Zeitraum bestimmt. Die Empfindlichkeitsgrenze der Trübung liegt in dem Bereich von 15-20 uM β-AP. Eine Trübungsabnahme über eine Zeitspanne bei Vorhandensein des Modulators verglichen mit der Trübung bei Nichtvorhandensein des Modulators ist ein Hinweis, dass der Modulator eine Bildung von β-AP Fasern aus monomerem β-AP hemmt. Dieser Test kann unter Rühren oder Schütteln zur Beschleunigung der Polymerisation durchgeführt werden, wobei die Geschwindigkeit des Tests erhöht wird. Außerdem kann der Test an ein Format mit Platten mit 96 Vertiefungen angepasst werden, um mehrere Verbindungen zu durchsuchen.
Zur Durchführung des Nukleierungstests wird zunächst Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Peptid in HFIP (1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol; Aldrich 10.522-8) bei einer Konzentration von 2 mg Peptid/ml gelöst und bei Raumtemperatur 30 min inkubiert. In HFIP gelöstes Peptid wird in einem Ultraschallbad für 5 min in höchster Einstellung beschallt, und dann zur Trocknung unter einem Argonstrahl verdampft. Die Peptidschicht wird in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) bei einer Konzentration von 6,9 mg/ml (25x Konzentration) resuspendiert, wie zuvor 5 min beschallt, dann durch einen 0,2 Mikron Nylon-Spritzenfilter (VWR Kat. Nr. 28196-050) filtriert. Testverbindungen werden in DMSO bei einer 100x Konzentration gelöst. Vier Volumen 25x Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Peptid in DMSO werden mit einem Volumen der Testverbindung in DMSO in einem Glasprobenfläschchen vereint und zur Herstellung eines 1 : 1 molaren Verhältnisses von Aβ- Peptid zu Testverbindung vermischt. Für verschiedene molare Verhältnisse werden Testverbindungen mit DMSO vor Zugabe von Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; verdünnt, um die DMSO und Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Endkonzentrationen konstant zu halten. Kontrollproben enthalten die Testverbindung nicht. Zehn Mikroliter der Mischung werden kann auf den Boden einer Vertiefung einer Corning Costar Platte mit 96 Vertiefungen mit ultrageringer Bindung (Corning Costar, Cambridge MA; Kat. Nr. 2500) gegeben. Neunzig Mikroliter Wasser werden in die Vertiefung hinzugefügt, die Platte wird auf einem Rotationsschüttler bei einer konstanten Geschwindigkeit bei Raumtemperatur 30 Sekunden geschüttelt, zusätzlich werden 100 ul 2x PTL Puffer (20 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 300 mM NaCl, pH 7,4) in die Vertiefung hinzugegeben, die Platte wird wiederum 30 Sekunden geschüttelt und eine Grundlinie (t = 0) der Trübungsmessung wird durch Messung der ersichtlichen Absorption bei 405 nm unter Verwendung eines Bio-Rad Model 450 Mikroplattenlesegerätes vorgenommen. Die Platte wird dann in den Schüttler zurückgeführt und 5 Stunden kontinuierlich geschüttelt. Trübungsablesungen werden in 15 minütigen Intervallen vorgenommen.
β-Amyloid-Aggregaion bei Nichtvorhandensein eines Modulators hat eine verstärkte Trübung der natürlichen β-AP Lösung (d. h. eine Steigerung der ersichtlichen Absorption bei 405 nm über eine Zeitspanne) zur Folge. Dementsprechend weist eine Lösung, die eine wirksame inhibitorische Modulator-Verbindung einschließt, eine verringerte Trübung verglichen mit der Kontrollprobe ohne die Modulator-Verbindung auf (d. h. eine geringere ersichtliche Absorption bei 405 nm über eine Zeitspanne verglichen mit der Kontrollprobe) auf.

B. Keimextensionstest

Der Keimextensionstest kann zur Messung der Rate gebildeter Aβ- Fasern in einer Aβ-Monomer-Lösung im Anschluss an Zugabe eines polymeren Aβ-Faser-"Keims" durchgeführt werden. Die Fähigkeit der Testverbindungen weitere Ablagerung von monomerem Aβ zu bereits abgelagertem Amyloid zu verhindern, wird unter Verwendung eines direkten Indikators der β-Faltblatt-Bildung unter Verwendung von Fluoreszenz bestimmt. Im Gegensatz zu dem Nukleierungstest stellt die Zugabe eines "Keims" unmittelbare Nukleierung und fortsetzendes Wachstum vorgeformter Fibrillen ohne die Notwendigkeit kontinuierlichen Mischens bereit und hat somit das Nichtvorhandensein einer Anlaufzeit vor Polymerisationsbeginn zur Folge. Da dieser Test statische Polymerisationsbedingungen verwendet, kann die Aktivität positiver Verbindungen in dem Nukleierungstest in diesem zweiten Test unter Verwendung von unterschiedlichen Bedingungen und mit einer zusätzlichen Sonde der Amyloid-Struktur bestätigt werden.
In dem Keimexiensionstest wird monomeres Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; bei Vorhandensein eines "Keims" (etwa zehn Molprozent von Aβ, dem kurz zuvor erlaubt wurde unter kontrollierten statischen Bedingungen zu polymerisieren) inkubiert. Proben dieser Lösung werden dann in Thioflavin T (Th-T) verdünnt. Die Polymer- spezifische Assoziation von Th-T mit Aβ stellt einen fluoreszierenden Komplex her, der die Messung des Ausmasses der Fibrillenbildung ermöglicht (Levine, H. (1993) Protein Science 2: 404-410). Insbesondere ergibt eine Assoziation mit Th-T mit aggregiertem β-AP, aber nicht mit monomerem oder lose assoziiertem β-AP ein neues Anregungsmaximum (ex) bei 405 und eine verstärkte Emission (em) bei 482 nm, verglichen mit 385 nm (ex) ung 445 nm (em) für den freien Farbstoff. Kleine Aliquots der Polymerisationsmischung enthalten ausreichend Fibrillen, um mit Th-T vermischt zu werden, so dass die Überwachung der Reaktionsmischung durch wiederholte Probennahme möglich ist. Eine lineare Wachstumskurve wird bei Vorhandensein von überschüssigem Monomer beobachtet. Die Bildung von Thioflavin T als Antwort auf β-Faltblatt-Fibrillen verläuft parallel zur Trübungszunahme, die unter Verwendung des Nukleierungstests beobachtet wird.
Eine Aβ-Monomer-Lösung zur Verwendung in dem Keimextensionstest wird durch Lösen einer geeigneten Menge an Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Peptid in 1/25 Volumen Dimethylsulfoxid (DMSO), gefolgt von Wasser auf ¹/&sub2; Volumen und ¹/&sub2; Volumen 2xPBS (10x PBS, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na&sub2;HPO&sub4;·7H&sub2;O 4,3 mM. KH&sub2;PO&sub4; 1,4 mM pH 7,2) auf eine Endkonzentration von 200 uM präpariert. Zur Präparation des Ausgangskeims wurde 1 ml der obigen Aβ-Monomer Präparation etwa 8 Tage bei 37ºC inkubiert und nachfolgend durch eine 18, 23, 26 und 30 Gauge Nadel 25, 25, 50 und beziehungsweise 100 mal geschert. 2 ul Proben des gescherten Materials werden für Fluoreszenzmessungen nach jeweils 50 Durchgängen durch die 30 gauge Nadel genommen, bis die Fluoreszenzeinheiten (FU) eine Ebene erreichten (etwa 100-150x). Testverbindungen werden durch Lösen einer geeigneten Menge der Testverbindung in 1x PBS auf eine Endkonzentration von 1 mM (10x Stammsubstanz) präpariert. Wenn löslich, wird die Verbindung in 1/10 Volumen DMSO gelöst und in 1x PBS auf 1mM verdünnt. Eine weitere 1/10 Verdünnung wird ebenfalls präpariert, um jeden Prüfstoff bei sowohl 100 uM und 10 uM zu testen.
Zur Durchführung des Keimextensionstest wird jede Probe mit 50 ul 200 uM Monomer, 125 FU gescherten Keim (variable Menge in Abhängigkeit von der Keimcharge, üblicherweise 3-6 ul) und 10 ul 10x Modulator-Lösung angesetzt. Das Probenvolumen wurde dann mit 1x PBS auf ein Endvolumen von 100 ul eingestellt. Zwei Konzentrationen eines jeden Modulators wurden typischerweise getestet; 100 uM und 10 uM, äquivalent zu einem 1 : 1 und einem 1 : 10 molaren Verhältnis von Monomer zu Modulator. Die Kontrollen schließen eine Reaktion ohne Keimbildner zur Bestätigung, dass das frische Monomer keinen Keim enthält, und eine Reaktion mit Keimbildner bei Nichtvorhandensein eines Modulators als eine Referenz zum Vergleich gegen Modulator-Prüfstoffe ein. Der Test wurde 6 h bei 37ºC inkubiert, wobei stündlich 2 ul Probe für die Fluoreszenzmessungen entnommen wurden. Zur Fluoreszenzmessung wurde eine 2 ul Probe von Aβ zu 400 ul Thioflavin-T- Lösung (50 mM Kaliumphosphat 10 mM Thioflavin-T pH 7,5) hinzugefügt. Die Proben wurden gevortext und die Fluoreszenz wurde in einer 0,5 ml Mikroquartzküvette bei EX 450 nm und EM 482 nm (Hitachi 4500 Fluorimeter) abgelesen.
β-Amyloid-Aggregation hat eine verstärkte Emission von Thioflavin-T zur Folge. Dementsprechend zeigen Proben, die eine wirksame inhibitorische Modulator-Verbindung einschließen, eine verringerte Emission verglichen mit Kontrollproben ohne die Modulator-Verbindung auf.

Beispiel 7: Wirkung verschiedener Aminosäure-Subregionen von Aβ-Peptid auf die inhibitorische Aktivität von β-Amyloid- Modulator-Verbindungen

Zur Bestimmung der Wirkung verschiedener Subregionen von Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; auf die inhibitorische Aktivität eines β-Amyloid-Modulators wurden überlappende 15 mere des Aβ-Peptides konstruiert. Für jedes 15mer wurden vier verschiedene aminoterminale Modifikatoren getestet: eine Cholyl-Gruppe, eine Iminobiotinyl-Gruppe, eine N-Acetylneuraminyl-Gruppe (NANA) und eine 5- (und 6-)-Carboxyfluoresceinyl-Gruppe (FICO). Die Modulatoren wurden in dem Nukleierungstest und Keimextensionstest, die in Beispiel 6 beschrieben wurden, bewertet.
Die Ergebnisse des Nukleierungstests sind unten in Tabelle II zusammengefasst. Die Konzentration des in den Tests verwendeten Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; war 50 uM. Der in Tabelle II aufgelistete "Mol %"-Wert bezeichnet die %- Konzentration der Testverbindung im Verhältnis zu Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0;. Dementsprechend zeigt 100% an, dass Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; und die Testverbindung äquimolar waren. Mol %-Werte unter 100% zeigen an, dass Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; in einem molaren Überschuss im Verhältnis zur Testverbindung vorlag (z. B. 10% zeigt an, dass Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; in einem 10- fachen molaren Überschuss im Vergleich zur Testverbindung vorlag). Die Ergebnisse der Nukleierungstests für jede Testverbindung sind in Tabelle II auf zwei Weisen dargestellt. Die "-fache Steigerung der Anlaufzeit", die eine Messung der Fähigkeit der Verbindung den Aggregationsbeginn zu verzögern ist, bezeichnet das Verhältnis der beobachteten Anlaufzeit bei Vorhandensein der Testverbindung zur beobachteten Anlaufzeit in der Kontrolle ohne die Testverbindung. Dementsprechend ist eine -fache Steigerung der Anlaufzeit von 1,0 ein Hinweis auf keine Veränderung der Anlaufzeit, während Zahlen > 1,0 ein Hinweis auf eine Steigerung der Anlaufzeit sind. Die "% Hemmung des Plateaus", die eine Messung der Fähigkeit der Verbindung ist, die Aggregationsgesamtmenge zu verringern, bezeichnet die Endtrübungsverringerung bei Vorhandensein der Testverbindung, ausgedrückt als Prozent der Kontrolle ohne die Testverbindung. Dementsprechend wird ein Hemmstoff, der eine Aggregation während dem Testverlauf aufhebt, eine % Hemmung von 100 haben. N-terminal modifizierte Aβ-Subregionen, die eine inhibitorische Aktivität aufwiesen, sind in fetter Schrift in Tabelle II hervorgehoben. Tabelle II
Diese Ergebnisse sind ein Hinweis, dass bestimmte Subregionen von Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0;, wenn sie mit einer geeigneten modifizierenden Gruppe modifiziert sind, die Aggregation von Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; wirksam hemmen. Eine Cholyl-Gruppe war bei mehreren Subregionen eine wirksame modifizierende Gruppe. Cholsäure alleine wurde hinsichtlich ihrer inhibitorischen Aktivität untersucht, wies jedoch keine Wirkung auf eine Aβ-Aggregation auf Die Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0;-Subregion zeigte hohe Gehalte an inhibitorischer Aktivität auf, wenn sie mit mehreren verschiedenen modifizierenden Gruppen modifiziert war (Cholyl, NANA, Iminobiotinyl), wobei Cholyl-Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (PPI-264) die aktivste Form ist. Dementsprechend wurde diese Modulator-Verbindung zur weiteren Analyse ausgewählt, die in Beispiel 8 beschrieben ist.

Beispiel 8: Identifizierung einer fünf Aminosäuren-Subregion eines Aβ-Peptides, ausreichend für eine inhibitorische Aktivität einer β-Amyloid-Modulator-Verbindung

Zur weiteren Beschreibung einer minimalen Subregion von Cholyl-Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0;, die für inhibitorische Aktivität ausreicht, wurde eine Reihe aminoterminaler und carboxyterminaler Aminosäure-Deletionen von Cholyl-Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0; konstruiert. Die Modulatoren hatten alle die gleiche aminoterminale Cholyl-Modifikation. Zusätzlich war bei den Peptidreihen mit carboxyterminalen Deletionen der Carboxyterminus weiter als ein Amid modifiziert. Die Modulatoren wurden wie in Beispiel 7 beschrieben bewertet, und die Ergebnisse sind unten in Tabelle III zusammengefasst, worin die Daten wie in Beispiel 7 beschrieben, präsentiert werden. Tabelle III
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Aktivität des Modulators beibehalten wird (d. h. Cholyl-Aβ&sub7;&submin;&sub2;&sub0; behielt Aktivität), wenn Aminosäure-Rest 6 von dem aminoterminalen Ende des Modulators entfernt wird, die Aktivität aber verloren geht, wenn das Peptid weiter am aminoterminalen Ende durch Entfernen der Aminosäure-Position 7 bis zur Aminosäure-Position 12 deletiert wird (d. h. Cholyl-Aβ&sub8;&submin;&sub2;&sub0; bis Cholyl-Aβ&sub1;&sub3;&submin;&sub2;&sub0; hemmte das Plateaulevel der Aβ- Aggregation). Dennoch hatte eine weitere Deletion von Aminosäure-Position 13 eine Verbindung (d. h. Cholyl-Aβ&sub1;&sub4;&submin;&sub2;&sub0;) zur Folge, in der eine inhibitorische Aktivität wiederhergestellt wurde. Außerdem behielt eine zusätzliche Deletion der Aminosäure-Position 14 (d. h. Cholyl-Aβ&sub1;&sub5;&submin;&sub2;&sub0;) oder der Positionen 14 und 15 (d. h. Cholyl-Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0;) immernoch eine inhibitorische Aktivität bei. Somit identifizierten aminoterminale Deletionen von Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0; Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0; als eine minimale Subregion, die bei geeigneter Modifizierung für eine inhibitorische Aktivität ausreicht. Im Gegensatz dazu hatte eine carboxyterminale Deletion der Aminosäure-Position 20 einen Aktivitätsverlust zur Folge, der nicht vollständig wiederhergestellt wurde, wenn das Peptid weiter am carboxyterminalen Ende deletiert wurde. Somit kann ein Beibehalten der Position 20 innerhalb des Modulators für eine inhibitorische Aktivität wichtig sein.

Beisplel 9: Identifizierung einer vier Aminosäuren-Subregion eines Aβ-Peptides, ausreichend für eine inhibitorische Aktivität einer β-Amyloid-Modulator- Verbindung

In diesem Beispiel wurde der in den in Beispiel 8 beschriebenen Studien identifizierte kleinste wirksame Modulator, Cholyl-Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (PPI-350) weiter untersucht. Zusätzliche amino- und carboxyterminale Deletionen wurden bei Cholyl-Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0; vorgenommen, als auch eine Aminosäure-Substitution (Val&sub1;&sub8;- > Thr), um die kleinste Region zu identifizieren, die für die inhibitorische Aktivität des Modulators ausreicht. Ein fünf Alanin-Reste (Ala)&sub5; umfassendes Peptid, das an seinem Aminoterminus mit Cholsäure modifiziert ist, wurde als eine Spezifitätskontrolle verwendet. Die Modulatoren wurden wie in Beispiel 7 beschrieben, bewertet, und die Ergebnisse sind unten in Tabelle IV zusammengefasst, worin die Daten wie in Beispiel 7 beschrieben präsentiert sind. Tabelle IV
Wie in Tabelle IV dargestellt, zeigten sowohl Cholyl-Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (PPI-350) als auch Cholyl-Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub1; (PPI-368) inhibitorische Aktivität, was darauf hinweist, dass die vier Aminosäuren umfassende minimale Subregion der Positionen 17-20 für eine inhibitorische Aktivität ausreicht. Ein Verlust der Position 20 (z. B. in PPI-366 und PPI-321) hatte einen Verlust an inhibitorischer Aktivität zur Folge, wodurch die Wichtigkeit der Position 20 aufgezeigt wurde. Dennoch hatte eine Mutation von Valin bei Position 18 zu Threonin (in PPI- 369) ebenfalls einen Aktivitätsverlust zur Folge, wodurch die Wichtigkeit von Position 18 aufgezeigt wurde. Im Gegensatz dazu hatte eine Mutation von Phenylalanin bei Position 19 zu Alanin (Cholyl-Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0; Phe&sub1;&sub9;-> Ala; PPI-370) eine Verbindung zur Folge, die immer noch eine detektierbare inhibitorische Aktivität beibehielt. Dementsprechend ist das Phenylalanin an Position 19 für Substitution, vorzugsweise mit einem anderen hydrophoben Aminosäure- Rest eher zugänglich. Cholyl-Penta-Alanin (PPI-365) zeigte keine inhibitorische Aktivität, wodurch die Spezifität des Aβ-Peptid-Anteils des Modulators aufgezeigt ist. Außerdem war nichtmodifiziertes Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (PPI-377) nicht inhibitorisch, wodurch die funktionelle Wichtigkeit der aminoterminal modifizierenden Gruppe aufgezeigt wird. Die spezifische funktionelle Gruppe beeinflusste die Aktivität des Modulators. Zum Beispiel zeigte Iminobiotinyl-Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (PPI- 374) eine zu Cholyl-Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0; ähnliche inhibitorische Aktivität, während ein mit N-Acetylneuraminsäure (NANA) modifiziertes Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0; kein wirksamer inhibitorischer Modulator war (in Tabelle IV nicht aufgelistet). Ein C-terminales Amid- Derivat von Cholyl-Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (PPI-319) behielt eine hohe Aktivität bei der Verzögerung der Aggregationsanlaufzeit bei, wodurch darauf hingewiesen wird, dass der Carboxyterminus des Modulators ohne Verlust von inhibitorischer Aktivität derivatisiert werden kann. Obwohl diese Amid-derivatisierte Verbindung nicht das allgemeine Plateaulevel der Aggregation über einen Zeitraum hemmte, wurde die Verbindung nicht bei Konzentrationen über 33% Mol getestet. Höhere Konzentrationen der Amid-derivatisierten Verbindung hemmen vermutlich das allgemeine Plateaulevel der Aggregation, ähnlich wie Cholyl-Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (PPI-350).

Beispiel 10: Wirkung von β-Amytoid-Modulatoren auf die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptid- Aggregaten

Dis Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptid Aggregaten entweder bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines β-Amyloid-Modulators wird in einem auf Zellen basierenden Test unter Verwendung von entweder einer Ratten-Zelllinie oder einer humanen neuronal-stämmigen Zelllinie (PC- 12 Zellen oder beziehungsweise NT-2 Zellen) und unter Verwendung des Viabilitätsindikators 3,(4,4-Dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) untersucht. (Siehe z. B. Shearman, M. S. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1470-1474; Hansen, M. B. et al. (1989) J. Immun. Methods 119: 203-210 für eine Beschreibung ähnlicher auf Zellen basierender Viabilitätstests). PC-12 ist eine adrenale Ratten-Pheochromocytom-Zelllinie und ist aus der American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC CRL 1721) erhältlich. MTT (kommerziell von Sigma Chemical Co. erhältlich) ist ein chromogenes Substrat, das von gelb nach blau In lebenden Zellen umschlägt, das spektrophomotrisch detektiert werden kann.
Zum Testen der Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden wurden Stammlösungen frischer Aβ-Monomere und gealterter Aβ-Aggregate zuerst präpariert. Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; in 100% DMSO wurde aus lyophilisiertem Puder präpariert und unmittelbar in der einen Hälfte des Endvolumens in H&sub2;O und dann in der Hälfte des Endvolumens in 2x PBS verdünnt, so dass eine Endkonzentration von 200 uM Peptid, 4% DMSO erzielt wurde. Auf diese Weise präpariertes und unmittelbar an Zellen getestetes Peptid wird als "frisches" Aβ-Monomer bezeichnet. Um "gealterte" Aβ-Aggregate zu präparieren, wurde eine Peptid-Lösung in einem 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäss plaziert und zum Ermöglichen einer Fibrillenbildung bei 37ºC acht Tage inkubiert. Solch "gealtertes" Aβ-Peptid kann direkt an Zellen getestet werden oder bei -80ºC gefroren werden. Die Neurotoxizität von frischen Monomeren und gealterten Aggregaten wurde unter Verwendung von PC12 und NT2 Zellen getestet. PC12 Zellen wurden üblicherweise in Dulbecos's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), das 10% Pferdeserum, 5% fötales Kalbserum, 4 mM Glutamin und 1% Gentamycin enthält, kultiviert. NT2 Zellen wurden üblicherweise in OPTI-MEM Medium (GIBCO BRL KAT. #31985), ergänzt mit 10% fötalem Kalbserum, 2 mM Glutamin und 1% Gentamycin kultiviert. Die Zellen wurden mit 10-15 000 Zellen pro Vertiefung in 90 ul frischem Medium in einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen 3-4 Stunden vor Behandlung ausplattiert. Die frischen oder gealterten Aβ-Peptid-Lösungen (10 ul) wurden dann 1 : 10 direkt in das Gewebekultur-Medium verdünnt, so dass die Endkonzentration in dem Bereich von 1-10 uM Peptid lag. Die Zellen wurden bei Vorhandensein von Peptid ohne einen Austausch der Medien 48 Stunden bei 37ºC inkubiert. In den letzten drei Stunden, in denen die Zellen der β-AP Präparation ausgesetzt waren, wurde MTT zu den Medien in einer Endkonzentration von 1 mg/ml hinzugefügt, und die Inkubation wurde bei 37ºC fortgesetzt. Im Anschluss an die zwei stündige Inkubation mit MTT wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden in 100 uL Isopropanol/0,4 N HCL unter Rühren lysiert. Ein gleiches Volumen PBS wurde in jede Vertiefung hinzugefügt, und die Platten wurden zusätzlich 10 Minuten gerührt. Die Absorption einer jeden Vertiefung wurde unter Verwendung eines Mikrotiterplattenlesegerätes zum Quantifizieren lebender Zellen gemessen.
Die Neurotoxizität gealterter (Tag 5 oder Tag 8) Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Aggregate allein, aber nicht frischer Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Monomere allein, wurde in einem Experiment bestätigt, dessen Ergebnisse in Fig. 3 dargestellt sind, welche zeigen, dass eine Inkubation neuronaler Zellen mit steigenden Mengen frischer Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Monomere für die Zellen nicht signifikant toxisch war, während ein Inkubieren der Zellen mit steigenden Mengen von Tag 5 oder Tag 8 Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Aggregaten zu erhöhter Neurotoxizität führte. Der EC50 der Toxizität gealterter Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Aggregate war 1-2 uM für sowohl die PC12 Zellen als auch die NT2 Zellen.
Zur Bestimmung der Wirkung einer β-Amyloid-Modulator-Verbindung auf die Neurotoxizität von Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Aggregaten wurde eine Modulator-Verbindung, Cholyl-Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (PPI-264) unter den Standardbedingungen eines Nukleierungstests, wie in Beispiel 6 beschreiben, mit Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Monomeren präinkubiert, und an bestimmten Zeitintervallen nach Inkubation wurden Aliquots der β-AP/ Modulator-Lösung entnommen und 1) wurde die Trübung der Losung als eine Aggregationsmessung bewertet und 2) wurde die Lösung zu kultivierten neuronalen Zellen für 48 Stunden zugefügt, wobei an diesem Zeitpunkt die Viabilität unter Verwendung von MTT bewertet wurde, um die Neurotoxizität der Lösung zu bestimmen. Die Ergebnisse der Trübungsanalyse sind in Fig. 4, Tafeln A, B und C dargestellt. In Tafel A waren sowohl Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; als auch Cholyl-Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0; bei 64 uM vorhanden. In Tafel B war Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; bei 30 uM und Cholyl-Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0; war bei 64 uM vorhanden. In Tafel C war Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; bei 10 uM und Cholyl-Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0; war bei 64 uM vorhanden. Diese Daten zeigen, dass eine äquimolare Menge von Cholyl-Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0; eine Aggregation von Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; wirksam hemmt (siehe Fig. 4, Tafel A) und dass bei verringerter Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0;-Konzentration die Menge an detektierbarer Aggregation des Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Monomers entsprechend verringert ist (vergleiche Fig. 4, Tafeln B und C mit Tafel A). Die entsprechenden Ergebnisse der Neurotoxizitätsanalyse sind in Fig. 4, Tafeln D, E und F dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die β-Amyloid-Modulator- Verbindung nicht nur eine Aggregation von Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Monomeren hemmt, sondern auch die Neurotoxizität der Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Lösung hemmt, was durch die verringerten Prozent Toxizität der Zellen, wenn sie mit der Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0;/Modulator- Lösung inkubiert werden, verglichen mit Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; alleine, veranschaulicht wird (siehe z. B. Fig. 4, Tafel D). Außerdem hemmte, sogar wenn Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Aggregation, wie durch Lichtstreuung gemessen, nicht detektierbar war, die Modulator-Verbindung die Neurotoxizität der Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Lösung (siehe Fig. 4, Tafeln E und F). Somit kommt die Bildung von neurotoxischen Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Aggregaten der Bildung von nichtlöslichen Aggregaten, die durch Lichtstreuung detektierbar sind, zuvor und die Modulator-Verbindung hemmt wirksam die Bildung und/oder Aktivität dieser neurotoxischen Aggregate. Ähnliche Ergebnisse wurden bei anderen Modulator-Verbindungen beobachtet, wie zum Beispiel Iminobiotinyl-Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (PPI-267), Cholyl-Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (PPI-350) und Cholyl Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0;-amid (PPI-319).
Zusätzlich ist gezeigt worden, dass die β-Amyloid-Modulator-Verbindungen die Neurotoxizität von vorgeformten Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Aggregaten verringert. In diesen Experimenten wurden Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Aggregate durch Inkubation der Monomere bei Nichtvorhandensein von jeglichen Modulatoren vorgeformt. Die Modulator-Verbindung wurde dann mit den vorgeformten Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Aggregaten 24 Stunden bei 37ºC inkubiert, nach dieser Zeit wurde die β-AP/Modulator- Lösung aufgefangen und ihre Neurotoxizität wie oben beschrieben bewertet. Inkubation von vorgeformten Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0;-Aggregaten mit der Modulator-Verbindung vor Anwendung der Lösung an neuronalen Zellen hatte eine Abnahme der Neurotoxizität der Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; Lösung zur Folge. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der Modulator entweder an Aβ-Fibrillen oder lösliche Aggregate bindet und ihre eigene Neurotoxiztät modulieren kann oder dass der Modulator das Gleichgewicht zwischen monomeren und aggregierten Formen von Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; zugunsten der nichtneurotoxischen Form stören kann.

Beispiel 11: Charakterisierung zusätzlicher β-Amyloid-Modulator- Verbindungen

In diesem Beispiel wurden zusätzliche Modulator-Verbindungen präpariert, die den Aminosäuren 17-20 von Aβ, LVFF (identifiziert in Beispiel 9) zugrunde liegen und zur weiteren Beschreibung der strukturellen Merkmale, die für eine Hemmung von β-Amyloid-Aggregation notwendig sind, analysiert. Analysierte Verbindungsarten schließen solche mit nur drei Aminosäure- Resten einer Aβ Aggregation-Kern-Domäne, Verbindungen, in denen die Aminosäure-Reste einer Aβ Aggregation-Kern-Domäne umgeordnet wurden oder in denen Aminosäure-Substitutionen vorgenommen wurden, mit einer carboxyterminal modifizierenden Gruppe modifizierte Verbindungen und Verbindungen, in denen die modifizierende Gruppe derivatisiert worden war, ein. In diesem Beispiel verwendete Abkürzungen sind: H- (freier Aminoterminus), -OH(freier Carbonsäure-Terminus), NH&sub2; (Amidterminus), CA (Cholyl, der Acylanteil von Cholsäure), NANA (N-Acetylneuraminyl), IB (Iminobiotinyl), βA (β-Alanyl), DA (D-Alanyl), Adp (Aminoethyldibenzofuranpropansäure), Aic (3-(O-Aminoethyl-iso)-cholyl, ein Cholsäure-Derivat), IY (Iodtyrosyl), o-Methyl (carboxyterminaler Methylester), N-me (N-Methyl-Peptidbindung), DeoxyCA (Deoxycholyl) und LithoCA (Lithocholyl).
Modulator-Verbindungen mit einer Aic-modifizierenden Gruppe entweder an dem Amino- oder Carboxyterminus (z. B. PPI-408 und PPI-418) wurden unter Verwendung bekannter Verfahren synthetisiert (siehe z. B. Wess, G. et al. (1993) Tetrahedron Letters, 34: 817-822; Wess, G. et al. (1992) Tetrahedron Letters 33: 195-198). Kurz zusammengefasst wurde 3-iso-O-(2- Aminoethyl)-cholsäure, (3β-(2-aminoethoxy)-7α2α-dihydroxy-5β- cholansäure) in das FMOC-geschützte Derivat unter Verwendung von FMCO- OSu (der Hydroxysuccinimidester der FMOC-Gruppe, welches kommerziell erhältlich ist) konvertiert, um ein Reagenz zu erhalten, das zum Einführen des Cholsäure-Derivates in die Verbindung verwendet wurde. Für eine N-terminale Einführung des Cholsäure-Teils wurde das FMOC-geschützte Reagenz an die N-terminale Aminosäure eines Festphasen-Peptides auf standardisierte Weise gekoppelt, gefolgt von Standardbdingungen einer FMOC- Schutzgruppenentfernung und nachfolgende Spaltung von dem Harz, gefolgt von HPLC-Reinigung. Für eine C-terminale Einführung des Cholsäure-Teils wurde das FMOC-geschützte Reagenz an 2-Chlortritylchlorid-Harz auf die übliche Weise gebunden. Dieses Aminoacyl-derivatisierte Harz wurde dann auf standardmäßige Weise zum Synthetisieren des vollständigen modifizierten Peptides verwendet.
Die Modulatoren wurden in den Nukleierungstests und Keimextensionstests wie in Beispiel 6 beschrieben bewertet, und die Ergebnisse sind unten in Tabelle V zusammengefasst. Die Veränderung der Anlaufzeit (ΔLag) ist als das Verhältnis der bei Vorhandensein der Testverbindung beobachteten Anlaufzeit zur Anlaufzeit der Kontrolle dargestellt. Daten werden von Tests bei Vorhandensein von 100 Mol% Hemmstoff im Verhältnis zur Konzentration von Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0; dargestellt, mit der Ausnahme von PPI-315, PPI-348, PPI-380, PPI-407 und PPI-418, für die die Daten bei Vorhandensein von 33 Mol % Hemmstoff dargestellt werden. Hemmung (%I nucl'n) ist als Prozent Verringerung in der maximal beobachteten Trübung in der Kontrolle am Ende der Testzeitdauer aufgeführt. Hemmung in dem Extensionstest (% Iext'n) ist als Prozent Verringerung von Thioflavin-T Fluoreszenz der β-Struktur bei Vorhandensein von 25 Mol % Hemmstoff aufgeführt. Verbindungen mit einer %I nucl'n von mindestens 30% sind durch fette Schrift hervorgehoben. Tabelle V
*ND = nicht durchgeführt
** = 33 Mol%
*** = h-DDIII(N-Me-Val)DLL(Adp)
**** = h-DDII(N-Me-Leu)VEH(Adp)
Bestimmte in Tabelle V gezeigte Verbindungen (PPI-319, PPI-349, PPI- 350, PPI-368 und PPI-426) wurden ebenfalls, wie die in Beispiel 10 beschriebenen, in Neurotoxizitätstests getestet. Für jede Verbindung traf die Verzögerung des Vorkommens von Neurotoxizität im Verhältnis zur Kontrolle mit der Zeitverzögerung, in der Polymerisation von Aβ in den Nukleierungstests begann, zusammen. Diese Korrelation zwischen der Vorbeugung der Bildung neurotoxischer Aβ-Arten und der Vorbeugung von Aβ-Polymerisation konnte bei allen getesteten Verbindungen gleichbleibend beobachtet werden.
Die in Tabelle V gezeigten Ergebnisse zeigen, dass eine wirksame Modulator-Verbindung so wenig wie drei Aβ-Aminosäure-Reste umfassen kann (siehe PPI-394, umfassend die Aminosäure-Sequenz VFF, die Aβ&sub1;&sub8;&submin;&sub2;&sub0; entspricht, und PPI-395, umfassend die Aminosäure-Sequenz FFA, die Aβ&sub1;&sub9;&submin; &sub2;&sub1; entspricht). Die Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass eine Modulator- Verbindung mit einer modulierenden Gruppe an ihrem Carboxyterminus eine Aβ-Aggregation wirksam hemmt (siehe PPI-408, modifiziert an seinem C- Terminus mit Aic). Ferner zeigen die Ergebnisse weiterhin, dass die Cholyl- Gruppe als eine modulierende Gruppe manipuliert werden kann, während die inhibitorische Aktivität der Verbindungen beibehalten wird (siehe PPI-408 und PPI-418, die beide das Cholyl-Derivat Aic umfassen). Die freie Aminogruppe des Aic-Derivates von Cholsäure stellt eine Position dar, an der eine Chelation-Gruppe für 99mTc eingeführt werden kann, z. B. zum Erzeugen eines diagnostisches Mittels. Zusätzlich ist die Fähigkeit Iodtyrosyl durch Phenylalanin bei Position 19 oder 20 der Aβ-Sequenz zu substituieren (siehe PPI- 396 und PPI-397), während die Fähigkeit der Verbindung Aβ-Aggregation zu hemmen erhalten bleibt, ein Hinweis, dass die Verbindung mit radioaktivem Iod markiert werden könnte, z. B. zum Erzeugen eines diagnostisches Mittels, ohne Verlust der inhibitorischen Aktivität der Verbindung.
Schließlich wurden Verbindungen mit inhibitorischer Aktivität unter Verwendung von von Aβ abstammenden Aminosäuren erzeugt, worin aber die Aminosäure-Sequenz umgeordnet wurde oder eine Substitution durch eine nicht von Aβ abstammende Aminosäure hatten. Beispiele solcher Verbindungen schließen PPI-426 ein, in dem die Sequenz von Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub1; (LVFFA) umgeordnet wurde (FFVLA), PPI-372, in dem die Sequenz von Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (KLVFF) umgeordnet wurde (FKFVL) und PPI-338, -389 und -390, in dem die Sequenz von Aβ&sub1;&sub7;&submin;&sub2;&sub1; (LVFFA) an Position 17, 18 oder beziehungsweise 19 durch einen Alanin-Rest subsituiert wurde (AVFFA für PPI-388, LAFFA für PPl-389 und LVAFA für PPI-390). Die inhibitorische Aktivität dieser Verbindungen sind ein Hinweis, dass das Vorhandensein einer Aminosäure- Sequenz in der Verbindung, die direkt einem Anteil von Aβ entspricht, nicht für eine inhibitorische Aktivität wesentlich ist, lässt aber eher vermuten, dass ein Beibehalten der hydrophoben Natur dieser Kernregion durch Einschließen von Aminosäure-Resten wie zum Beispiel Phenylalanin, Valin, Leucin, ungeachtet ihrer präzisen Reihenfolge, für eine Hemmung von Aβ-Aggregation ausreicht.

Beispiel 12: Charakterisierung von β-Amyloid-Modulator- Verbindungen, die ein nichtmodifiziertes β-Amyloid- Peptid umfassen

Zur Untersuchung der Fähigkeit von nichtmodifizierten Aβ-Peptiden Aggregation von natürlichem β-AP zu modulieren, wurde eine Reihe von Aβ- Peptiden mit amino- und/oder carboxyterminalen Deletionen verglichen mit Aβ&sub1;&submin;&sub4;&sub0;, oder mit deletierten internen Aminosäuren (d. h. nichtdurchgängige Peptide) präpariert. Ein Peptid (PPI-220) hatte zusätzliche nicht von Aβ abstammende Aminosäure-Reste an seinem Aminoterminus. Diese Peptide hatten alle eine freie Aminogruppe an dem Aminoterminus und eine freie Carbonsäure an dem Carboxyterminus. Diese nichtmodifizierten Peptide wurden in Tests, wie in Beispiel 7 beschriebenen, bewertet. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle VI zusammengefasst, worin die Daten wie in Beispiel 7 beschrieben aufgeführt sind. Verbindungen, die mindestens eine 1,5 fache Steigerung der Anlaufzeit aufweisen, sind durch fette Schrift hervorgehoben.
Die in Tabelle VI dargestellten Ergebnisse zeigen, dass eingeschränkte Anteile der Aβ-Sequenz eine signifikant inhibitorische Wirkung auf natürliche β-AP Aggregation haben können, sogar wenn das Peptid nicht mit einer modifizierenden Gruppe modifiziert ist. Bevorzugte nichtmodifizierte Peptide sind Aβ&sub6;&submin;&sub2;&sub0; (PPI-226), Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub0; (PPI-228), Aβ&sub1;&submin;&sub2;&sub0;, &sub2;&sub6;&submin;&sub4;&sub0;(PPI-249) und EEVVHHHHQQ -Aβ&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub0; (PPI-220), von denen die Aminosäure-Sequenzen in SEQ ID NR: 4, 14, 15 und beziehungsweise 16 gezeigt werden.
Bildender Teil dieser Offenbarung ist die anhängige Sequenzliste, die Inhalte davon sind unten in der Tabelle zusammengefasst.

Entsprechungen

Der Fachmann erkennt viele Entsprechungen oder kann diese mit Hilfe üblicher Experimente zu den spezifischen Anwendungen der hier beschriebenen Erfindung feststellen. Solche Entsprechungen liegen beabsichtigenderweise im Rahmen der folgenden Ansprüche.

SEQUENZ-LISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION
(i) ANMELDER:
(A) NAME: PHARMACEUTICAL PEPTIDES INCORPORATED
(B) STRASSE: 1 HAMPSHIRE STREET
(C) STADT: CAMBRIDGE
(D) BUNDESSTAAT: MASSACHUSETTS
(E) STAAT: U.S.A.
(F) PLZ: 02139-1572
(G) TELEPHON: (617) 494-8400
(H) TELEFAX: (617) 494-8414
(ii) TITEL DER ERFINFUNG: Verbindungen mit aggregations- modulierender Wirkung auf das Amyloid Protein
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 32
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) ADRESSAT: LAHIVE & COCKFIELD
(B) STRASSE: 60 State Street, Suite 510
(C) STADT: Boston
(D) BUNDESSTAAT: Massachusetts
(E) STAAT: U.S.A.
(F) PLZ: 02109-1875
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MIDIUMTYP: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1,25
(vi) AKTUELLE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: 000000
(B) EINREICHUNG: Hiermit
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) FRÜHERE ANMELDEDATEN
(A) ANMELDUNGSNUMMER: USSN 08/404,831
(B) EINREICHUNG: 14 März 1995
(vii) FRÜHERE ANMELDEDATEN
(A) ANMELDUNGSNUMMER: USSN 08/475, 579
(B) EINREICHUNG: 07 Juni 1995
(vii) FRÜHERE ANMELDEDATEN
(A) ANMELDUNGSNUMMER: USSN 08/548, 998
(B) EINREICHUNG: 27 Oktober 1995
(viii) PATENTANWALT:
(A) NAME: DeConti, Giulio A.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 33, 503
(C) REFERENZ/LISTENNUMMER: PPI-002C2PC
(ix) TELEKOMUNIKATION:
(A) TELEFON: (617) 227-7400
(B) TELEFAX: (617) 227-5941
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 1:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 43 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(v) FRAGMENTTYP: intern (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 1:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 2:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 103 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(v) FRAGMENTTYP: intern (xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 3:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 43 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(V) FRAGMENTTYP: intern
(ix) KENNZEICHEN:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 19
(C) ANDERE INFORMATION: /bemerke= Xaa ist eine hydrophobe Aminosäure
(ix) KENNZEICHEN:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 20
(C) ANDERE INFORMATION: /bemerke= Xaa ist eine hydrophobe Aminosäure (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 4:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 4:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 5:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 6:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 6:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 7:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 7:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 8:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 8:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 9:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 9:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 10:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 10:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 11:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 11:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 12:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 12:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 13:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(v) FRAGMENTTYP: intern (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 13:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 14:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(V) FRAGMENTTYP: intern (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 14:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 15:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LANGE: 35 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(v) FRAGMENTTYP: intern (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 15:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 16:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 35 Aminosäuren
(B) TYP; Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(v) FRAGMENTTYP: intern (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 16:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 17:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(v) FRAGMENTTYP: intern (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 17:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 18:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(8) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(v) FRAGMENTTYP: intern (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 18:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 19:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 3 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 19:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 20:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 3 Aminosäuren
(B) TYP; Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 20:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 21:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 21:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 22:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 22:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 23:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LANGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) KENNZEICHEN:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 3
(C) ANDERE INFORMATION: /bemerke= Xaa ist Iodtyrosyl (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 23:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 24:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 24:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 25:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 25:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 26:
(1) SEQUENZMERKMALE:
(A) LANGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) KENNZEICHEN:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 4
(C) ANDERE INFORMATION: /bemerke= Xaa ist Iodtyrosyl (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 26:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 27:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 27:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 28:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 28:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 29:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 29:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 30:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIHUNG: SEQ ID NR. 30:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 31:
(1) SEQUENZMERKMKLE:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) KENNZEICHEN:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 6
(C) ANDERE INFORMATION: /bemerke= Xaa ist ein beta- Alanyl (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 31:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NR. 32:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) KENNZEICHEN:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 5
(C) ANDERE INFORMATION: /bemerke= Xaa ist D-Alanyl (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 32:

Claims

1. Eine Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus:

a) einer Amyloid-Modulator-Verbindung, die ein amyloidogenes Protein oder Peptid-Fragment davon umfasst, das direkt oder indirekt an mindestens eine moidifizierende Gruppe gekoppelt ist, worin das amyloidogene Protein oder ein Peptid-Fragment davon mindestens ein D- Aminosäure umfasst und worin die mindestens eine modifizierende Gruppe eine cyclische, heterocyclische oder polycyclische Gruppe oder anderen Teil mit ähnlicher sterischer Ausdehnung umfasst, so dass die Verbindung die Aggregation einer molaren Überschussmenge von natürlichen Amyloid- Proteinen oder Peptiden moduliert, wenn sie mit den natürlichen amyloidogenen Proteinen oder Peptiden in Kontakt gebracht wird;

b) einer β-Amyloid-Peptid-Verbindung, die eine Formel umfasst:

worin Xaa ein β-Amyloid-Peptid ist mit einem Amino-terminalen Aminosäure-Rest, der Position 668 vom β-Amyloid-Präkursor-Protein-770 (APP-770) oder einem Rest Carboxy-terminal zu Position 668 von APP-770 entspricht, und A eine modulierende Gruppe ist, die an dem Amino-Terminus des β-Amyloid-Proteins gebunden ist, so dass die Verbindung eine Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird, worin A einen cyclischen oder heterocyclischen Teil umfasst;

c) einer β-Amyloid-Modulator-Verbindung, die aus einer 4 bis 7 Aminosäuren langen Aβ Aggregation-Kern-Domäne (ACD) besteht und den Aminosäure-Positionen 17 bis 20 vom natürlichen β-Amyloid-Peptid nachgebildet ist, direkt oder indirekt an mindestens eine modifizierende Gruppe (MG) gekoppelt ist, die natürlicherweise nicht an natürliche β- Amyloid-Peptide in ihrer nativen Form gekoppelt ist, so dass die Verbindung die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität natürlicher β-Amyloid- Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird;

d) einer β-Amyloid-Modulator-Verbindung mit einer Formel:

worin Xaa&sub1;, Xaa&sub2; und Xaa&sub3; jeweils Aminosäure-Strukturen sind und mindestens zwei aus Xaa&sub1;, Xaa&sub2; und Xaa&sub3; unabhängig sind und aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus einer Leucin-Struktur, einer Phenylalanin-Struktur und einer Valin-Struktur und mindestens ein Xaa&sub1;, Xaa&sub2; und Xaa&sub3; eine D-Aminosäure ist:

Y, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, eine Peptid-Struktur mit der Formel (Xaa)a ist, worin Xaa eine beliebige Aminosäure-Struktur ist und a eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist;

Z, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, eine Peptid-Struktur mit der Formel (Xaa)b ist, worin Xaa eine beliebige Aminosäure-Struktur ist und b eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist; und

A eine modifizierende Gruppe ist, die direkt oder indirekt an die Verbindung gebunden ist und n eine ganze Zahl ist;

wobei Xaa&sub1;, Xaa&sub2;, Xaa&sub3;, Y, Z, A und n so ausgewählt sind, dass die Verbindung die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden hemmt, wenn sie mit den β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird;

e) einer β-Amyloid-Modulator-Verbindung, die eine Formel umfasst:

worin Xaa&sub1; und Xaa&sub3; Aminosäure-Strukturen sind;

Xaa&sub2; eine Valin-Struktur ist;

Xaa&sub4; eine Phenylalanin-Struktur ist;

wobei mindestens eines aus Xaa&sub1;, Xaa&sub2; Xaa&sub3;, und Xaa&sub4; eine D- Aminosäure ist;

Y, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, eine Peptid- Struktur mit der Formel (Xaa)a ist, worin Xaa eine beliebige Aminosäure- Struktur ist und a eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist;

Z, das vorhanden oder nicht vorhanden sein kann, eine Peptid- Struktur mit der Formel (Xaa)b ist, worin Xaa eine beliebige Aminosäure- Struktur ist und b eine ganze Zahl von 1 bis 15 ist; und

wobei Xaa&sub1;, Xaa&sub3;, Y, Z, A und n so ausgewählt sind, dass die Verbindung die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird;

f) einer Verbindung, die die Formel umfasst:

A-Xaa&sub1;-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;-Xaa&sub4;-Xaa&sub5;-Xag&sub6;-Xaa&sub7;-Xaa&sub8;-β

worin Xaa&sub1; eine Histidin-Struktur ist;

Xaa&sub2; eine Glutamin-Struktur ist;

Xaa&sub3; eine Lysin-Struktur ist;

Xaa&sub4; eine Leucin-Struktur ist;

Xaa&sub5; eine Valin-Struktur ist;

Xaa&sub6; eine Phenylalanin-Struktur ist;

Xaa&sub7; eine Phenylalanin-Struktur ist;

Xaa&sub8; eine Alanin-Struktur ist;

A und B modifizierende Gruppen sind, die direkt oder indirekt an den Amino-Terminus und beziehungsweise an den Carboxy- Terminus der Verbindung gebunden sind, wobei besagte modifizierende Gruppen Gruppen sind, die nicht natürlicherweise an die β-Amyloid-Peptide in ihrer nativen Form gekoppelt sind;

und worin Xaa&sub1;-Xaa&sub2;-Xaa&sub3;, Xaa&sub1;-Xaa&sub2; oder Xaa&sub1; vorhanden oder nicht vorhanden sein können;

Xaa&sub8; vorhanden oder nicht vorhanden sein kann; und

mindestens A oder B vorhanden ist;

g) einer β-Amyloid-Modulator Verbindung, die eine direkt oder indirekt an eine Peptid-Struktur gebundene modifizierende Gruppe umfasst, worin die Peptid-Struktur eine Aminosäure-Struktur mit einer Aminosäure-Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus His-Gln-Lys-Leu- Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 5), His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe (SEQ ID Nr. 6), Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 7), Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe (SEQ ID Nr. 8), Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 9), Lys-Leu-Val-Phe- Phe (SEQ ID Nr. 10), Leu-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 11), Leu-Val-Phe- Phe (SEQ ID Nr. 12), Leu-Ala-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 13), Val-Phe-Phe (SEQ ID Nr. 19), Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 20), Phe-Phe-Val-Leu-Ala (SEQ ID Nr. 21), Leu-Val-Phe-Phe-Lys (SEQ ID Nr. 22), Leu-Val-Iodtyrosin-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 23), Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 24), Ala-Val-Phe-Phe-Ala (SEQ ID Nr. 25), Leu-Val-Phe-Iodtyrosin-Ala (SEQ ID Nr. 26), Leu-Val-Phe- Phe-Ala-Glu (SEQ ID Nr. 27), Phe-Phe-Val-Leu (SEQ ID Nr. 28), Phe-Lys- Phe-Val-Leu (SEQ ID Nr. 29), Lys-Leu-Val-Ala-Phe (SEQ ID Nr. 30), Lys-Leu- Val-Phe-Phe-βAla (SEQ ID Nr. 31) und Leu-Val-Phe-Phe-DAla (SEQ ID Nr. 32);

h) einer β-Amyloid-Modulator-Verbindung, die eine Formel umfasst:

worin ein Xaa ein β-Amyloid-Peptid ist und A eine modulierende Gruppe ist, die an den Carboxy-Terminus des β-Amyloid-Peptids gebunden ist, so dass die Verbindung eine Aggregation natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie in Kontakt mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden gebracht wird, worin A einen cyclischen oder heterocylischen Teil oder anderen Teil mit ähnlicher räumlicher Ausdehnung umfasst.

i) einer Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus βAP&sub6;&submin;&sub2;&sub0;(SEQ ID Nr. 4), βAP&sub1;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;(SEQ ID Nr. 14), βAP&sub1;&submin;&sub2;&sub0;, &sub2;&sub6;&submin;&sub4;&sub0;(SEQ ID Nr. 15) und EEVVHHHHQQ-βAP&sub1;&sub6;&submin;&sub4;&sub0;(SEQ ID Nr. 16);

j) einer β-Amyloid-Modulator-Verbindung umfassend ein β-Amyloid- Peptid, das mindestens eine D-Aminosäure umfasst, worin die Verbindung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet oder die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird;

k) einer β-Amyloid-Modulator-Verbindung umfassend ein β-Amyloid- Peptid, wobei das β-Amyloid-Peptid vollständig aus D-Aminosäuren besteht, worin die Verbindung an natürliche β-Amyloid-Peptide bindet oder die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird; oder

l) einer β-Amyloid-Modulator-Verbindung umfassend ein retro-inverso Isomer eines β-Amyloid-Peptids, worin die Verbindung an natürliche β- Amyloid-Peptide bindet oder die Aggregation moduliert oder die Neurotoxizität natürlicher β-Amyloid-Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen β-Amyloid-Peptiden in Kontakt gebracht wird;

2. Die Verbindung nach Anspruch 1, worin die Verbindung außerdem definiert ist durch:

a) sie die Verbindung nach Anspruch 1(a) ist, die eine Aggregation natürlicher amyloidogener Proteine oder Peptide hemmt, wenn sie mit den natürlichen amyloidogenen Proteinen oder Peptiden in Kontakt gebracht wird;

b) sie die Verbindung nach Anspruch 1(a) ist, worin das amyloidogene Protein oder Peptid-Fragment davon aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Transthyretin (TTR), Prion-Protein (PrP), Insel-Amyloid- Polypeptid (IAPP), atrial natriuretischer Faktor (ANF), kappa leichte Kette, lambda leichte Kette, Amyloid A, Procalcitonin, Cystatin C, β2 Mikroglobulin, ApoA-I, Gelsolin, Procalcitonin, Calcitonin, Fibrinogen und Lysozym;

c) sie die Verbindung nach Anspruch 1(d) ist, worin Xaa&sub1; und Xaa&sub2; jeweils Phenylalanin-Strukturen sind;

d) sie die Verbindung nach Anspruch 1(d) ist, worin Xaa&sub2; und Xaa&sub3; jeweils Phenylalanin-Strukturen sind;

e) sie die Verbindung nach Anspruch 1(e) ist, worin Xaa&sub1; eine Leucin- Struktur ist und Xaa&sub3; eine Phenylalanin-Struktur ist;

f) sie die Verbindung nach Anspruch 1(j), (k) oder (l) ist, worin das β- Amyloid-Peptid Amino-terminal modifiziert ist und gegebenenfalls

worin das β-Amyloid-Peptid Amino-terminal mit einer modifizierenden Gruppe, die eine cyclische, heterocyclische oder polycyclische Gruppe umfasst, modifiziert ist; und außerdem gegebenenfalls;

worin die modifizierende Gruppe aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus cis-Decalin-haltigen Gruppen, einer Cholyl-Gruppe, Biotin- haltigen Gruppen, einer Diethylentriaminpentaacetyl-Gruppe, einer (-)- Menthoxyacetyl-Gruppe, Fluorescein-haltigen Gruppen und einer N- Acetylneuraminyl-Gruppe;

g) sie die Verbindung nach Anspruch 1(j), (k) oder (l) ist, worin das β- Amyloid-Peptid Carboxy-terminal modifiziert ist und gegebenenfalls

worin das β-Amyloid-Peptid Carboxy-terminal mit einer Amid-Gruppe oder Ethylamid-Gruppe modifiziert ist;

h) sie die Verbindung nach Anspruch 1(j), (k) oder (l) ist, worin das β- Amyloid-Peptid Amino-terminal modifiziert ist und Carboxy-terminal modifiziert ist;

i) sie die Verbindung nach Anspruch 1(j), (k) oder (l) ist, die modifiziert ist, um die pharmakokinetische Eigenschaft der Verbindung zu verändern;

j) sie die Verbindung nach Anspruch 1(j), (k) oder (l) ist, die modifiziert ist, um die Verbindung mit einer detektierbaren Substanz zu markieren.

3. Die Verbindung nach Anspruch 1, worin

a) die modifizierende Gruppe eine cyclische, heterocyclische oder polycyclische Gruppe umfasst;

b) die modifizierende Gruppe eine cis-Decalin-Gruppe enthält;

c) die modifizierende Gruppe eine Cholanolyl-Struktur enthält;

d) die modifizierende Gruppe eine Cholyl-Gruppe ist;

e) die modifizierende Gruppe eine Biotin-haltige Gruppe, eine Diethylentriaminpentaacetyl-Gruppe, eine (-)-Menthoxyacetyl-Gruppe, eine Fluorescein-haltige Gruppe oder eine N-Acetylneuraminyl-Gruppe umfasst;

f) die Verbindung außerdem modifiziert ist, um eine pharmakokinetische Eigenschaft der Verbindung zu verändern;

g) die Verbindung außerdem modifiziert ist, um die Verbindung - mit einer detektierbaren Substanz - zu markieren;

h) eine Aminosäure einer Peptid-Komponente der Verbindung eine D- Aminosäure ist; oder

i) eine Peptid-Komponente der Verbindung vollständig aus D- Aminosäuren besteht.

4. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die Verbindung nach Ansprüchen 1 bis 3 und einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfasst.

5. Verwendung der Verbindung nach Ansprüchen 1 bis 3 bei Herstellung entweder von: (a) einem Mittel zur Diagnose einer amyloidogenen Krankheit; oder (b) einem Medikament zur Behandlung einer amyloidogenen Krankheit.

6. Die Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung in Therapie oder Diagnose.

7. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 4 zur Verwendung in einem Verfahren, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist, die Verwendung gemäß Anspruch 5(b), wo die Behandlung ein Verfahren umfasst, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist, oder die Verbindung gemäß Anspruch 6, wo die Therapie aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist, worin die Gruppe besteht aus:

a) einem Verfahren zur Hemmung der Aggregation von natürlichen β- Amyloid-Peptiden, das in-Kontakt-Bringen der natürlichen β-Amyloid-Peptide mit der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst, so dass die Aggregation der natürlichen β-Amyloid-Peptide gehemmt ist;

b) einem Verfahren zur Hemmung der Neurotoxizität von natürlichen β-Amyloid-Peptiden, das in-Kontakt-Bringen der natürlichen β-Amyloid- Peptide mit der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst, so dass die Neurotoxizität der natürlichen β-Amyloid-Peptide gehemmt ist;

c) einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten gegen eine Erkrankung, die mit einer Amyloidose assoziiert ist, umfassend:

Verabreichung einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 an den Patienten, so dass der Patient gegen eine Erkrankung behandelt wird, die mit einer Amyloidose assoziiert ist;

d) einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten gegen eine Erkrankung, die mit β-Amyloidose assoziiert ist, umfassend:

Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbingung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 an den Patienten, so dass der Patient gegen eine Erkrankung behandelt wird, die mit β-Amyloidose assoziiert ist; oder

e) einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten gegen eine Erkrankung, die mit β-Amyloidose assoziiert ist, umfassend:

Verabreichung eines rekombinanten Expressionsvektors, der die Verbindung nach Anspruch 1(i) codiert an den Patienten, so dass die Verbindung in dem Patienten synthetisiert wird und der Patient gegen eine Erkrankung behandelt wird, die mit β-Amyloidose assoziiert ist.

8. Die pharmazeutische Zusammensetzung, Verwendung oder Verbindung nach Anspruch 7, worin entweder:

a) im Falle 7(c)

die Erkrankung aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus familiärer polyneuropathischer Amyloidose (Portugisischer, Japanischer und Schwedischer Typ), familiärer cardiomyopathischer Amyloidose (Dänischer Typ), isolierter cardiopathischer Amyloidose, systemischer Altersamyloidose, Scrapie, boviner spangioformer Enzephalopathie, Creutzfeld-Jakob Krankheit, Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrom, nicht insulinabhängiger Diabetes mellitus, Insulinom, isolierter Atrial-Amyloidose, idiopathischer (primärer) Amyloidose, Myelom- oder Makroglobulinämie-assoziierte Amyloidose, primär lokalisierte Hautamyloidose assoziiert mit Sjögrens Syndrom, reaktiver (sekundärer) Amyloidose, familiärem Mittelmeerfieber und familiärer nephropathischer Amyloidose mit Urticaria und Taubheit (Muckle- Wells Syndrom), hereditärer Enzephalorrhagie mit Island-Typ Amyloidose, Amyloidose assoziiert mit Langzeit-Hämodialyse, hereditärer nicht neuropathischer systemischer Amyloidose (familiäre Amyloid- Polyneuropathie III), familiärer Amyloidose Finnischer Typ, Amyloidose assoziiert mit medullärem Karzinom der Schilddrüse, Fibrinogen assoziierte hereditäre Nieren-Amyloidose und Lysozym assoziierte hereditäre systemische Amyloidose; oder

b) im Falle 7(d) oder 7(e) die Erkrankung die Alzheimer Krankheit ist.

9. Ein in vitro Verfahren entweder für: (a) zur Detektion der Anwesenheit oder Abwesenheit natürlicher β-Amyloid-Peptide in einer biologischen Probe, umfassend:

In-Kontakt-Bringen einer biologischen Probe mit der Verbindung nach Ansprüchen 1 bis 3; und

Detektion der an natürlichen β-Amyloid-Peptiden gebundenen Verbindung, um dadurch die Anwesenheit oder Abwesenheit natürlicher β- Amyloid-Peptide in der biologischen Proben zu detektieren; oder (b) Detektion natürlicher β-Amyloid-Peptide, um eine Diagnose einer β- amyloidogenen Erkrankung zu erleichtern, umfassend:

Detektion der an natürlichen β-Amyloid-Peptiden gebundenen Verbindung, um eine Diagnose einer β-amyloidogenen Erkrankung zu erleichtern.

10. Das Verfahren gemäß Anspruch 9, worin

a) die β-Amyloid-Modulator-Verbindung und die biologische Probe in vitro in Kontakt gebracht werden; und/oder

b) die Verbindung mit radioaktivem Technetium oder radioaktivem Iod markiert ist; und/oder

c) das Verfahren eine Diagnose der Alzheimer Krankheit erleichtert.