ES2396555T3 - Anticuerpos que reconocen péptido beta amiloide - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une a Aβ, o un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo, en el que dichoanticuerpo o fragmento comprende: a) una región variable de cadena ligera que comprende una primera, una segunda y una tercera regióndeterminante de complementariedad (CDR), en la que la primera CDR comprende los aminoácidos 24-39 de SEC ID Nº: 2; la segunda CDR comprende los aminoácidos 55-61 de SEC ID Nº: 2; y la tercera CDR comprende los aminoácidos 94-101 de SEC ID Nº: 2; y b) una región variable de cadena pesada que comprende una primera, una segunda y una tercera CDR, en laquela primera CDR comprende los aminoácidos 26-35 de SEC ID Nº: 4 la segunda CDR comprende los aminoácidos 50-66 de SEC ID Nº: 4 y la tercera CDR comprende los aminoácidos 99-101 de SEC ID Nº: 4.

Description

Anticuerpos que reconocen péptido beta amiloide

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad progresiva que da como resultado demencia senil. Véase en 5 general, Selkoe, TINS 16: 403 (1993); Hardy y col., documento WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol.

53:438 (1994); Duff y col., Nature 373: 476 (1995); Games y col., Nature 373: 523 (1995). A grandes rasgos, la enfermedad se clasifica en dos categorías: aparición tardía, que se produce en edad avanzada (+65 años) y aparición temprana, que se desarrolla mucho antes del periodo senil, es decir, entre los 35 y los 60 años. En ambos tipos de enfermedad, la patología es la misma pero las anomalías tienden a ser más graves y generalizadas en 10 casos que comienzan a una edad más temprana. La enfermedad se caracteriza por al menos dos tipos de lesiones en el cerebro, ovillos neurofibrilares y placas seniles. Los ovillos neurofibrilares son depósitos intracelulares de proteína tau asociada a microtúbulos que consiste en dos filamentos enrollados entre sí en pares. Las placas seniles (es decir, placas amiloides) son áreas de neurópilos desorganizados de hasta 150 !m transversalmente con depósitos amiloides extracelulares en el centro que son visibles por análisis microscópico de secciones de tejido

15 cerebral. La acumulación de placas amiloides dentro del cerebro también se asocia con el síndrome de Down y otros trastornos cognitivos.

El principal constituyente de las placas es un péptido denominado péptido A∀ o ∀-amiloide. El péptido A∀ es un fragmento interno de 4 kDa de 39-43 restos de aminoácidos de una glicoproteína transmembrana mayor denominada Proteína Precursora de Amiloide (APP). Como resultado del procesamiento proteolítico de APP por 20 diferentes enzimas secretasa, A∀ se encuentra principalmente tanto en una forma corta, de 40 aminoácidos de longitud, como en una forma larga, que varía de 42-43 aminoácidos de longitud. Parte del dominio transmembrana hidrófobo de APP se encuentra en el extremo carboxilo de A∀, y puede explicar la capacidad de A∀ para agregarse en placas, particularmente en el caso de la forma larga. La acumulación de placas amiloides en el cerebro conduce con el tiempo a muerte de células neuronales. Los síntomas físicos asociados con este tipo de deterioro neural

25 caracterizan la enfermedad de Alzheimer.

Se han correlacionado varias mutaciones dentro de la proteína APP con la presencia de enfermedad de Alzheimer. Véase, por ejemplo, Goate y col., Nature 349: 704) (1991) (valina717 a isoleucina); Chartier Harlan y col. Nature 353: 844 (1991)) (valina717 a glicina); Murrell y col., Science 254: 97 (1991) (valina717 a fenilalanina); Mullan y col., Nature Genet. 1: 345 (1992) (una doble mutación que cambia lisina595-metionina596 a asparagina595-leucina596). Se cree que

30 tales mutaciones provocan la enfermedad de Alzheimer por procesamiento aumentado o alterado de APP a A∀, particularmente procesamiento de APP a cantidades aumentadas de la forma larga de A∀ (es decir, A∀1-42 y A∀143). Se cree que mutaciones en otros genes, tales como los genes de presenilina, PS1 y PS2, afectan indirectamente al procesamiento de APP para generar cantidades aumentadas de la forma larga A∀ (véase, Hardy, TINS 20: 154 (1997)).

35 Se han usado modelos de ratones de forma exitosa para determinar la importancia de las placas amiloides en la enfermedad de Alzheimer (Games y col., mencionado anteriormente, Johnson-Wood y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1550 (1997)). En particular, cuando se inyecta a ratones transgénicos PDAPP (que expresan un forma mutante de APP humana y desarrollan enfermedad de Alzheimer a una edad temprana), la forma larga de A∀, estos presentan tanto una reducción de la progresión de Alzheimer como un aumento de los títulos de anticuerpos para el

40 péptido A∀ (Schenk y col., Nature 400, 173 (1999)). Las observaciones analizadas anteriormente indican que A∀, particularmente en su forma larga, es un elemento causante en enfermedad de Alzheimer.

El péptido A∀ puede existir en solución y puede detectarse en el SNC (por ejemplo, LCR) y plasma. En ciertas condiciones, A∀ soluble se transforma en formas de lámina-∀ fibrilares tóxicas halladas en placas neuríticas y vasos sanguíneos cerebrales de pacientes con AD. Se han investigado tratamientos que implican inmunización con 45 anticuerpos monoclonales contra A∀. Se ha ensayado inmunización tanto activa como pasiva en modelos de ratón de AD. La inmunización activa dio como resultado cierta reducción de la carga de placas en el cerebro, pero solamente cuando se administró por vía nasal. También se ha investigado la inmunización pasiva de ratones transgénicos PDAPP (Bard, y col. (2000) Nat. Med. 6: 916-19). Se descubrió que los anticuerpos que reconocen los dominios amino-terminal y central de A∀ estimulan la fagocitosis de depósitos de A∀, mientras que los anticuerpos

50 contra dominios cerca del dominio carboxilo-terminal no.

El documento WO-A-03/016467 describe un procedimiento para tratar a un sujeto que tenga una afección o enfermedad relacionada con el péptido A∀ que comprende administrar al sujeto un anticuerpo que reconoce A∀, en el que el anticuerpo tiene una afinidad por A∀ soluble mayor de 10-9M. Más particularmente, el documento WO-A03/016467 describe un procedimiento para tratar los síntomas cognitivos de una afección o enfermedad asociada

55 con A∀ en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-A∀ que tenga mayor afinidad por A∀ soluble que la que tiene el anticuerpo 266.

Se está investigando de forma continuada el mecanismo de eliminación de A∀ después de inmunización pasiva o activa. Se han propuesto dos mecanismos para la eliminación eficaz, es decir, degradación central y degradación periférica. El mecanismo de degradación central se basa en anticuerpos que son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica, unirse a placas e inducir la eliminación de placas pre-existentes. Se ha mostrado que la eliminación se promueve a través de una fagocitosis mediada por receptor de Fc (Bard, y col. (2000) Nat. Med. 6: 916-19). El mecanismo de degradación periférica de eliminación de A∀ se basa en una alteración del equilibrio dinámico de A∀ entre el cerebro, LCR y el plasma tras la administración de anticuerpo, que conduce al transporte de A∀ de un compartimento a otro. El A∀ derivado central se transporta al LCR y el plasma, en el que se degrada. Recientes estudios han sugerido que A∀ soluble y no unido están implicados en el deterioro de la memoria asociado con AD, incluso sin reducción de la deposición de amiloides en el cerebro. Se requieren estudios adicionales para determinar la acción y/o interacción de estas rutas para la eliminación de A∀ (Dodel, y col. (2003) The Lancet Vol. 2: 215).

En consecuencia, existe la necesidad de nuevas terapias y reactivos para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer, en particular, terapias y reactivos capaces de efectuar un beneficio terapéutico a dosis fisiológicas (por ejemplo, no tóxicas). Los enfoques exitosos para la prevención y/o tratamiento de AD incluyen intervenciones dirigidas a evitar la acumulación de A∀ y/o acelerar la eliminación de A∀, por ejemplo de placas de A∀.

Sumario de la invención

La presente invención presenta nuevos reactivos inmunológicos, en particular, reactivos de anticuerpos terapéuticos para prevención y tratamiento de enfermedad amiloidogénica (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) así como déficits conductuales relevantes asociados con dicha enfermedad. La invención se basa en la identificación y caracterización de un anticuerpo monoclonal 15C11, que se une específicamente a A∀. Los anticuerpos que se unen a oligómeros de A∀ mejoran la cognición en mamíferos con trastornos amiloidogénicos. La invención concierne a anticuerpos que son capaces de mejorar rápidamente la cognición en un paciente como se demostró en modelos animales predictivos de eficacia en seres humanos.

El análisis estructural y funcional del anticuerpo 15C11 conduce al diseño de diversos anticuerpos humanizados para uso profiláctico y/o terapéutico. En particular, la invención presenta humanización de las regiones variables de este anticuerpo y, en consecuencia, proporciona cadenas de anticuerpos o inmunoglobulinas humanizadas, inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados intactos y fragmentos de anticuerpo o inmunoglobulinas funcionales, en particular, CDR o fragmentos de unión a antígeno del anticuerpo presentado.

También se desvelan polipéptidos que comprenden las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal presentado, así como polinucleótidos que codifican el anticuerpo o polipéptidos derivados de los mismos y vectores y células huésped que comprenden dichos polipéptidos.

Se desvelan procedimientos para tratar enfermedades o trastornos amiloidogénicos (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) y/o síntomas asociados con tales enfermedades o trastornos, así como composiciones farmacéuticas y kits para su uso en tales aplicaciones.

También se desvelan procedimientos para identificar restos dentro de los anticuerpos monoclonales presentados que son importantes para la función inmunológica apropiada y para identificar restos que sean susceptibles de sustitución en el diseño de anticuerpos humanizados que tengan afinidades de unión mejoradas y/o inmunogenicidad reducida, cuando se usan como reactivos terapéuticos.

También se desvelan anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos humanizados) que tienen funciones efectoras alteradas, y usos terapéuticos de los mismos.

En consecuencia, en un aspecto, la invención concierne a un anticuerpo que se une a A∀, o un fragmento de unión antígeno de dicho anticuerpo, que comprende (i) una primera, una segunda y una tercera región determinante de complementariedad (CDR) de región variable de la secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina 15C11 como se expone en SEC ID Nº: 2, y (ii) una primera, una segunda y una tercera región determinante de complementariedad (CDR) de región variable de la secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina 15C11 expuesta como SEC ID Nº: 4, opcionalmente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región marco variable de una cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina aceptora humana, opcionalmente que tenga al menos un resto marco sustituido con el resto de aminoácido correspondiente de la secuencia de región variable de cadena ligera o pesada de 15C11 de ratón, en la que el resto marco se selecciona del grupo que consiste en: (a) un resto que se une de forma no covalente directamente al antígeno; (b) un resto adyacente a una CDR; (c) un resto que interacciona con CDR; y (d) un resto que participa en la interfaz VL-VH.

En una realización, se identifica un resto que interacciona con CDR realizando el modelo de la cadena ligera de 15C11 basándose en la estructura resuelta de una cadena ligera de inmunoglobulina murina que comparte al menos el 70% de identidad de secuencia con la cadena ligera de 15C11.

En otra realización, se identifica un resto que interacciona con CDR realizando el modelo de la cadena ligera de 15C11 basándose en la estructura resuelta de una cadena ligera de inmunoglobulina murina que comparte al menos el 80% de identidad de secuencia con la cadena ligera de 15C11.

En una realización, se identifica un resto que interacciona con CDR realizando el modelo de la cadena ligera de 15C11 basándose en la estructura resuelta de una cadena ligera de inmunoglobulina murina que comparte al menos el 90% de identidad de secuencia con la cadena ligera de 15C11.

En otra realización, se identifica un resto que interacciona con CDR realizando el modelo de la cadena pesada de 15C11 basándose en la estructura resuelta de una cadena pesada de inmunoglobulina murina que comparte al menos el 70% de identidad de secuencia con la cadena pesada de 15C11.

En otra realización más, se identifica un resto que interacciona con CDR realizando el modelo de la cadena pesada de 15C11 basándose en la estructura resuelta de una cadena pesada de inmunoglobulina murina que comparte al menos el 80% de identidad de secuencia con la cadena pesada de 15C11.

En otra realización, se identifica un resto que interacciona con CDR realizando el modelo de la cadena pesada de 15C11 basándose en la estructura resuelta de una cadena pesada de inmunoglobulina murina que comparte al menos el 90% de identidad de secuencia con la cadena pesada de 15C11.

En otra realización, la cadena ligera el de inmunoglobulina humanizada comprende (i) las regiones determinantes de complementariedad de región variable (CDR) de la secuencia de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina 15C11 expuesta como SEC ID Nº: 2, y (ii) una región marco variable de una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina aceptora humana, que tiene opcionalmente al menos un resto marco sustituido con el resto de aminoácido correspondiente de la secuencia de región variable de cadena ligera de 15C11 de ratón, en la que el resto marco es un resto capaz de afectar a la conformación o función de la región variable de cadena ligera como se identifica por análisis de un modelo tridimensional de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina 15C11.

En otra realización, la cadena pesada de inmunoglobulina humanizada comprende (i) las regiones determinantes de complementariedad de región variable (CDR) de la secuencia de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina 15C11 expuesta como SEC ID Nº: 4, y (ii) una región marco variable de una cadena pesada de inmunoglobulina aceptora humana, que tiene opcionalmente al menos un resto marco sustituido con el resto de aminoácido correspondiente de la secuencia de región variable de cadena pesada de 15C11 de ratón, en la que el resto marco es un resto capaz de afectar a la conformación o función de región variable de cadena pesada como se identifica por análisis de un modelo tridimensional de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina 15C11.

En otra realización, el resto marco se selecciona del grupo que consiste en un resto capaz de interaccionar con antígeno, un resto próximo al sitio de unión a antígeno, un resto capaz de interaccionar con una CDR, un resto adyacente a una CDR, un resto a una distancia de 6 Å de un resto de CDR, un resto canónico, un resto de zona de vernier, un resto de empaquetamiento intercatenario, un resto poco habitual y un resto de sitio de glicosilación en la superficie del modelo estructural.

En otra realización más, el resto marco se selecciona del grupo que consiste en un resto capaz de interaccionar con antígeno, un resto próximo al sitio de unión de antígeno, un resto capaz de interaccionar con una CDR, un resto adyacente a una CDR, un resto a una distancia de 6 Å de un resto de CDR, un resto canónico, un resto de zona de vernier, un resto de empaquetamiento intercatenario, un resto poco habitual y un resto de sitio de glicosilación en la superficie de modelo estructural.

En otra realización más, el resto marco se sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste en la posición 2, 4, 35, 64 y 71 de la cadena ligera como se numeran de acuerdo con Kabat. En otra realización, el resto marco se sustituye en una posición seleccionada del grupo que consiste en la posición 26-30, 71, 93, 94 y 103 de la cadena pesada como se numera de acuerdo con Kabat.

En otra realización, el resto marco se identifica realizando el modelo de la cadena ligera de 15C11 basándose en la estructura resuelta de una cadena ligera de inmunoglobulina murina que comparte al menos el 70% de identidad de secuencia con la cadena ligera de 15C11.

En otra realización más, el resto marco se identifica realizando el modelo de la cadena ligera de 15C11 basándose en la estructura resuelta de una cadena ligera de inmunoglobulina murina que comparte al menos el 80% de identidad de secuencia con la cadena ligera de 15C11.

En otra realización, el resto marco se identifica realizando el modelo de la cadena ligera de 15C11 basándose en la estructura resuelta de una cadena ligera de inmunoglobulina murina que comparte al menos el 90% de identidad de secuencia con la cadena ligera de 15C11.

En otra realización más, el resto marco se identifica realizando el modelo de la cadena pesada de 15C11 basándose en la estructura resuelta de una cadena pesada de inmunoglobulina murina que comparte al menos el 70% de identidad de secuencia con la cadena pesada de 15C11.

En otra realización, el resto marco se identifica realizando el modelo de la cadena pesada de 15C11 basándose en la estructura resuelta de una cadena pesada de inmunoglobulina murina que comparte al menos el 80% de identidad 5 de secuencia con la cadena pesada de 15C11.

En otra realización, el resto marco se identifica realizando el modelo de la cadena pesada de 15C11 basándose en la estructura resuelta de una cadena pesada de inmunoglobulina murina que comparte al menos el 90% de identidad de secuencia con la cadena pesada de 15C11.

En algunas realizaciones, una inmunoglobulina de la invención comprende una o más alteraciones de aminoácidos

10 en la región bisagra, por ejemplo, en las posiciones de EU 234, 235, 236 y 237. En una realización particular, una inmunoglobulina de acuerdo con la invención es un anticuerpo humanizado que incluye alteraciones de aminoácidos en las posiciones 234 y 237 de la región bisagra (es decir, L234A y G237A).

En realizaciones adicionales, las inmunoglobulinas de la invención comprenden fragmentos de anticuerpo pegilados, por ejemplo, Fab y Fab’. En otras realizaciones más, las inmunoglobulinas de la invención comprenden una región

15 constante aglicosilada. En una realización ejemplar, una inmunoglobulina incluye una sustitución de aminoácidos de una asparagina en la posición 297 a una alanina, evitando de este modo la glicosilación de la inmunoglobulina.

Adicionalmente, los anticuerpos de la presente invención son útiles en procedimientos de tratamiento, como se describe en el presente documento.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une específicamente a péptido beta amiloide

20 (A∀) con una afinidad de unión de al menos 10-7 M. En otra realización más, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une específicamente a péptido beta amiloide (A∀) con una afinidad de unión de al menos 10-8 M. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une específicamente a péptido beta amiloide (A∀) con actividad de unión de al menos 10-9 M.

En una realización, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención comprende un isotipo de cadena 25 pesada #1.

En otra realización, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención se une a péptido beta amiloide (A∀) soluble.

En una realización, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a péptido beta amiloide (A∀) oligomérico.

En una realización, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno captura péptido beta amiloide (A∀).

30 En otra realización, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención cruza la barrera hematoencefálica en un paciente.

En otra realización, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención reduce la carga de placa de péptido beta amiloide (A∀) en un paciente. En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo humanizado como se ha definido anteriormente que comprende una cadena pesada humanizada y una cadena ligera 35 humanizada, en el que (a) la cadena ligera humanizada comprende las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tiene secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad correspondientes del dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina 15C11 de ratón designado SEC ID Nº: 2, y una región marco variable de una secuencia de región marco variable de cadena ligera humana que tiene opcionalmente al menos un resto marco seleccionado del grupo que consiste en un resto 40 canónico, un resto de vernier, un resto de empaquetamiento y un resto poco habitual, ocupado por el mismo resto de aminoácido presente en la posición equivalente de la región marco variable de cadena ligera de inmunoglobulina 15C11 de ratón; y (b) la cadena pesada humanizada comprende las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad correspondientes del dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina 15C11 de ratón 45 designado SEC ID Nº: 4, y una región marco variable de una secuencia marco de región variable de cadena pesada humana que tiene opcionalmente al menos un resto marco seleccionado de un segundo grupo que consiste en un resto canónico, un resto de vernier, un resto de empaquetamiento y un resto poco habitual, ocupado por el mismo resto de aminoácido presente en la posición equivalente de la región marco variable de cadena pesada de inmunoglobulina 15C11 de ratón; en el que la inmunoglobulina humanizada se une específicamente a péptido beta

50 amiloide (“A∀”) con una afinidad de unión de al menos 10-7 M.

En una realización, la región marco variable de cadena ligera humana es de una región variable de cadena ligera kappa.

En otra realización, la región marco variable de cadena pesada humana es de una región variable de cadena pesada de IgG1.

En otra realización, la región marco variable de cadena pesada humana es de una región variable de cadena pesada de IgG4.

En una realización, la región marco variable de cadena ligera es de una cadena ligera de inmunoglobulina humana que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera de la inmunoglobulina 15C11.

5 En una realización, la región marco variable de cadena pesada es de una cadena pesada de inmunoglobulina humana que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de cadena pesada de la inmunoglobulina 15C11.

Una cadena ligera humanizada comprende regiones determinantes de complementariedad que son idénticas a las regiones determinantes de complementariedad correspondientes de la cadena pesada de 15C11 de ratón, y una

10 cadena pesada humanizada comprende regiones determinantes de complementariedad que son idénticas a las regiones determinantes de complementariedad correspondientes de la cadena pesada de 15C11 de ratón.

En una realización, la invención concierne a un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) de la secuencia de cadena ligera variable de 15C11 expuesta como SEC ID Nº: 2 y que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR1,

15 CDR2 y CDR3) de la secuencia de cadena pesada variable de 15C11 expuesta como SEC ID Nº: 4.

En otra realización más, la invención concierne a una inmunoglobulina humanizada, o fragmento de unión a antígeno de la misma, que se une específicamente a péptido beta amiloide (A∀), que comprende una región variable que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo 15C11 de ratón.

En otra realización más, la invención concierne a una inmunoglobulina quimérica que comprende secuencia de

20 región variable sustancialmente como se expone en SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4, y secuencias de región constante de una inmunoglobulina humana.

La divulgación también concierne a un procedimiento para prevenir o tratar una enfermedad amiloidogénica en un paciente, que comprende administrar al paciente una dosificación eficaz de la inmunoglobulina humanizada descrita en el presente documento.

25 En otra divulgación, procedimiento para prevenir o tratar enfermedad de Alzheimer en un paciente, que comprende administrar al paciente una dosificación eficaz de la inmunoglobulina humanizada descrita en el presente documento.

En una realización, la dosificación eficaz de inmunoglobulina humanizada es 1 mg/kg de peso corporal. En otra realización, la dosificación eficaz de inmunoglobulina humanizada es de 10 mg/kg de peso corporal. En otra

30 realización más, la dosificación eficaz de inmunoglobulina humanizada es 30 mg/kg de peso corporal.

En otra realización, la invención concierne a una composición farmacéutica que comprende una molécula de inmunoglobulina descrita en el presente documento y un vehículo farmacéutico. La primera, segunda y tercera CDR de cadena ligera comprenden: los aminoácidos 24-39 de SEC ID Nº: 2, aminoácidos 55-61 de SEC ID Nº: 2 y aminoácidos 94-101 de SEC ID Nº: 2, respectivamente. La primera, segunda y tercera CDR de cadena pesada

35 comprenden: los aminoácidos 26-35 de SEC ID Nº: 4, aminoácidos 50-66 de SEC ID Nº: 4 y aminoácidos 99-101 de SEC ID Nº: 4, respectivamente.

En una realización, la invención concierne a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento como se describe en el presente documento.

En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 o

40 3.

En otra realización, la invención concierne a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención. En otra realización, la invención concierne a una célula huésped no humana o una célula huésped humana no embrionaria aislada que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención.

En otra realización, la invención concierne a un animal transgénico no humano que expresa un polipéptido 45 codificado por una molécula de ácido nucleico de la invención.

En una realización, el polipéptido se expresa en la leche de dicho animal.

En otra realización, la invención concierne a un procedimiento para producir el anticuerpo, o fragmento del mismo, que comprende cultivar la célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención en condiciones tales que se produzca anticuerpo o fragmento y aislar dicho anticuerpo de la célula o cultivo huésped.

50 El anticuerpo, o fragmento del mismo, comprende CDR de región variable de cadena ligera que comprenden: los aminoácidos 24-39 de SEC ID Nº: 2, los aminoácidos 55-61 de SEC ID Nº: 2 y los aminoácidos 94-101 de SEC ID Nº: 2, y comprende CDR de región variable de cadena pesada que comprenden: los aminoácidos 26-35 de SEC ID Nº: 4, los aminoácidos 50-66 de SEC ID Nº: 4 y los aminoácidos 99-101 de SEC ID Nº: 4.

La divulgación también concierne a un procedimiento para identificar restos susceptibles de sustitución en una región marco variable de inmunoglobulina 15C11 humanizada, que comprende realizar el modelo de la estructura tridimensional de la región variable de 15C11 basándose en una estructura de inmunoglobulina resuelta y analizar

5 dicho modelo con respecto a restos capaces de afectar a la conformación o función de la región variable de inmunoglobulina 15C11, de modo que se identifiquen restos susceptibles de sustitución.

La divulgación también concierne a una secuencia de región variable expuesta como SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4, o cualquier parte de la misma, en la producción de una imagen tridimensional de una inmunoglobulina 15C11, cadena de inmunoglobulina 15C11 o dominio de la misma.

10 La divulgación también concierne a un procedimiento para tomar imágenes de depósitos amiloides en el cerebro de un paciente que comprende administrar al paciente un agente que se una específicamente a A∀, y detectar el anticuerpo unido a A∀. En una realización, el agente es un anticuerpo que comprende una secuencia variable de cadena ligera como se expone en SEC ID Nº: 2 y una secuencia de región variable de cadena pesada como se expone en SEC ID Nº: 4, o un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo. En una realización, el fragmento

15 de unión a antígeno es un fragmento Fab.

En otro aspecto, la invención concierne a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: un anticuerpo 15C11, un anticuerpo 15C11 humanizado y un anticuerpo 15C11 quimérico, o un fragmento del mismo. En otro aspecto más, la invención concierne a una línea celular que produce dicho anticuerpo.

En un aspecto, la invención concierne a un uso médico para efectuar mejora rápida en la cognición de un paciente,

20 que comprende administrar al paciente una dosis eficaz de un anticuerpo de la invención de modo que se consiga la mejora rápida de la cognición.

En una realización, el paciente tiene o está en riesgo de tener un trastorno o una enfermedad relacionada con A∀. En otra realización, el paciente tiene o está en riesgo de tener una enfermedad o trastorno amiloidogénico. En otra realización, el paciente tiene o está en riesgo de tener enfermedad de Alzheimer.

25 En una realización, el paciente es humano.

En una realización, la dosis eficaz de un anticuerpo de la invención es de aproximadamente 100 !g/kg a 100 mg/kg de peso corporal del paciente. En otra realización, la dosis eficaz de un anticuerpo de la invención es de aproximadamente 300 !g/kg a 30 mg/kg de peso corporal del paciente. En otra realización, la dosis eficaz de un anticuerpo de la invención es de aproximadamente 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal del paciente.

30 En una realización, se consigue mejora rápida de la cognición en un periodo de 12 horas después de la administración del anticuerpo. En otra realización, se consigue mejora rápida de la cognición en un período de 24 horas después de la administración del anticuerpo. En otra realización más, se consigue mejora rápida de la cognición en un periodo de 36 horas después de la administración del anticuerpo. En otra realización más, se consigue mejora rápida de la cognición en un periodo de 48 horas después de la administración del anticuerpo.

35 En una realización, el agente anticuerpo es un anticuerpo 15C11 o fragmento de unión a antígeno del mismo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una gráfica que representa el efecto de 15C11, 2B1 y 1C2 (30 mg/kg) en la memoria contextual en ratones Tg2576, como se determinó por ensayos de condicionamiento de miedo contextual. La inversión de déficit de memoria fue completa y significativa en ratones Tg2576 a los que se había administrado 15C11. El

40 asterisco (*) indica diferencias significativas de tipo silvestre y la almohadilla (#) indica diferencias significativas de los heterocigotos tratados con vehículos. La Figura 2 es una gráfica que representa el efecto de dosis baja (3 mg/kg y 10 mg/kg) de 15C11 en la memoria contextual en ratones Tg2576 como se determinó por ensayos de condicionamiento de miedo contextual. Los datos muestran una tendencia hacia ausencia de deterioro a medida que se aumenta la dosificación de 15C11.

45 La mejora de la memoria contextual es significativa para ratones Tg2576 que recibieron 30 mg/kg de 15C11. El asterisco (*) indica diferencias significativas del tipo silvestre. La Figura 3 representa los resultados de un ensayo de mapa epitópico para 15C11. Los resultados indican que 15C11 reconoce los restos 19-22 (FFAE) de A∀. La Figura 4 es un alineamiento de los dominios variables de cadena pesada de los anticuerpos anti-A∀ 15C11,

50 9G8, 266 y 6H9. Se muestra encima de la secuencia la numeración de Kabat de los aminoácidos para 15C11. Se muestra la secuencia líder en minúsculas y las CDR están en negrita. La Figura 5 es un alineamiento de los dominios variables de cadena ligera de los anticuerpos anti-A∀ 15C11, 9G8 y 266. Se muestra encima de la secuencia la numeración de Kabat de los aminoácidos para 15C11. La secuencia líder se muestra en minúsculas y las CDR están en negrita.

55 La Figura 6 representa una transferencia de Western de inmunoprecipitados de preparación de A∀1-42

oligomérico tratada con peroxinitrito precipitados con diversos anticuerpos de A∀ (3D6, 6C6, 12A11, 12B4, 3A3, 266, 9G8, 15C11 y 6H9) y con captura de imágenes con 3D6. Las posiciones aproximadas de bandas de monómero, dímero, trímero y tetrámero de A∀1-42 se indican en el lateral izquierdo de la figura. Se indica debajo de cada anticuerpo de A∀ el epítopo de A∀ reconocido por el anticuerpo y los resultados del ensayo de CFC para el anticuerpo, una notación “+” indica una observación de cognición aumentada tras el tratamiento con el anticuerpo, una notación de “-“ indica una observación de ausencia de cambio en la cognición tras el tratamiento con el anticuerpo, una anotación de “+/-“ indica una observación de una tendencia de aumento de la cognición tras el tratamiento con el anticuerpo pero la tendencia observada no fue estadísticamente suficientemente significativa para indicarse como una observación de cognición aumentada, y una notación de “ND” indica que no hay datos de ensayo de CFC comparados para este anticuerpo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención presenta nuevos reactivos inmunológicos como se han definido en la reivindicación 1, que son útiles en procedimientos para prevenir o tratar enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades amiloidogénicas. La invención se basa, al menos en parte, en la caracterización de una inmunoglobulina monoclonal, por ejemplo, 15C11, eficaz en la unión de proteína beta amiloide (A∀, por ejemplo, oligómeros de A∀) y en la mejora de la cognición de un paciente (por ejemplo, en un sujeto que tenga una enfermedad o trastorno amiloidogénico).

La invención se basa además en la determinación y caracterización estructural de la estructura primaria y secundaria de las cadena ligera y pesada variables de la inmunoglobulina 15C11, por ejemplo, la identificación de restos importantes para la unión y/o actividad de antígeno.

Se presentan inmunoglobulinas que incluyen una cadena ligera variable y/o pesada variable de la inmunoglobulina monoclonal 15C11 descrita en el presente documento. Se presentan inmunoglobulinas preferidas, por ejemplo inmunoglobulinas terapéuticas, que incluyen una cadena ligera variable humanizada y/o pesada variable humanizada. Las cadenas ligera variable y/o pesada variable incluyen tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la inmunoglobulina 15C11 (por ejemplo, inmunoglobulina donadora) y regiones marco variables derivadas de o sustancialmente derivadas de una inmunoglobulina aceptora humana. La frase “sustancialmente de una inmunoglobulina aceptora humana” significa que la mayoría o los principales de los restos marco son de la secuencia aceptora humana, permitiendo, sin embargo, la sustitución de restos en ciertas posiciones con restos seleccionados para mejorar o no reducir la actividad de la inmunoglobulina humanizada (por ejemplo, alterar la actividad de modo que se asemeje de forma más cercana a la actividad de la inmunoglobulina donadora) o seleccionados para reducir la inmunogenicidad de la inmunoglobulina humanizada.

La invención presenta un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que incluye regiones determinantes de complementariedad (CDR) de región variable de 15C11 (por ejemplo, se incluyen tres CDR (es decir, CDRL1, CDRL2 o CDRL3) de la secuencia de región variable de cadena ligera expuesta como SEC ID Nº: 2 e incluye tres CDR (es decir, CDRH1, CDRH2 y CDRH3) de la secuencia de región variable de cadena pesada expuesta como SEC ID Nº: 4 e incluye una región marco variable derivada de o sustancialmente derivada de una secuencia de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina aceptora humana.

En una realización, un anticuerpo de la invención o fragmento del mismo es monoclonal. En otra realización, un anticuerpo de la invención o fragmento del mismo es quimérico. En otra realización, un anticuerpo de la invención o fragmento del mismo es humanizado.

En una realización, al menos un resto de aminoácido de la región marco derivada sustancialmente de una secuencia de cadena pesada o ligera de Ig humana en un anticuerpo humanizado, cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de la misma se retromuta a (es decir, se sustituye con) un resto de aminoácido correspondiente de la secuencia de anticuerpo de ratón (por ejemplo, secuencia de región variable de cadena ligera o pesada de 15C11), en la que dicha retromutación no afecta sustancialmente a la capacidad de la cadena para dirigir la unión de A∀.

Como se desvela en el presente documento, las CDR de anticuerpos monoclonales de epítopos centrales que son eficaces en la prevención o tratamiento de una enfermedad amiloidogénica en un paciente están altamente conservadas. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 4, las regiones CDRH1 de los anticuerpos 15C11, 9G8 y 266 están conservadas, mientras que la del anticuerpo 6H9 es más divergente en su secuencia. Sucede lo mismo para las CDRH2 y CDRH3 de estos anticuerpos. Con respecto a la región variable de cadena ligera, como se muestra en la Figura 5, las regiones CDRL1 de los anticuerpos 15C11, 9G8 y 266 están todas conservadas. De forma similar, las regiones CDRL2 y CDRL3 de estos anticuerpos también están conservadas.

La secuencia de aminoácidos VL de 15C11 se muestran en SEC ID Nº: 2 y la secuencia de aminoácidos VH se muestra en SEC ID Nº: 4.

En una realización, al preparar un anticuerpo humanizado de la invención al menos un resto flanqueante se sustituye con el resto de aminoácido correspondiente de la secuencia de región variable de cadena pesada o ligera de ratón (por ejemplo, secuencia de 15C11), cuando se selecciona el resto flanqueante para sustitución del grupo que consiste en (a) un resto que se une directamente al antígeno de forma no covalente; (b) un resto adyacente a una

CDR; (c) un resto que interacciona con CDR (por ejemplo, identificado realizando el modelo de la cadena ligera o pesada en la estructura resuelta de una cadena de inmunoglobulina conocida homóloga); y (d) un resto que participa en la interfaz VL-VH.

En otra realización, la invención presente una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina humanizada que incluye CDR de región variable y regiones marco variables de una secuencia de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina aceptora humana, siempre que al menos un resto flanqueante se sustituya con el resto de aminoácido correspondiente de la secuencia de región variable de cadena ligera o pesada de ratón, en la que el resto flanqueante es un resto capaz de afectar a la conformación o función de región variable de cadena ligera como se identifica por análisis de un modelo tridimensional de la región variable, por ejemplo un resto capaz de interaccionar con un antígeno, un resto próximo al sitio de unión a antígeno, un resto capaz de interaccionar con una CDR, un resto adyacente a una CDR, un resto a una distancia de 6 Å de un resto de CDR, un resto canónico, un resto de zona de vernier, un resto de empaquetamiento intercatenario, un resto inusual, o un resto de sitio de glicosilación en la superficie del modelo estructural.

En otra realización, la invención presenta, además de las sustituciones descritas anteriormente, una sustitución de al menos un resto flanqueante humano poco habitual. Por ejemplo, puede sustituirse un resto poco habitual con un resto de aminoácido que es habitual para las secuencias de cadena variable humana en esa posición. Como alternativa, un resto poco habitual puede sustituirse con un resto de aminoácido correspondiente de una secuencia de cadena variable de línea germinal homóloga.

En otra realización, la invención presenta una inmunoglobulina humanizada que incluye una cadena ligera y una cadena pesada, como se ha descrito anteriormente, o un fragmento de unión a antígeno o CDR de dicha inmunoglobulina. En una realización ejemplar, la inmunoglobulina humanizada se une (por ejemplo, se une específicamente) a péptido beta amiloide (A∀) con una afinidad de unión de al menos 107 M-1, 108 M-1 o 109 M-1. En otra realización, la inmunoglobulina o fragmento de unión a antígeno incluye una cadena pesada que tiene isotipo #1. En otra realización, la inmunoglobulina o fragmento de unión a antígeno se une (por ejemplo, se une específicamente) a uno o ambos de péptido beta amiloide (A∀) soluble y A∀ agregado. En otra realización, la inmunoglobulina o fragmento de unión a antígeno captura A∀ soluble (por ejemplo, A∀1-42 soluble) que circula en la sangre o está presente en el sistema nervioso central (SNC) de un paciente, evitando de este modo la acumulación de A∀ en el SNC y/o promoviendo la retirada de A∀ del SNC. La captura de A∀ soluble puede conducir a la mejora rápida de la cognición en el paciente. En otra realización, la invención presenta inmunoglobulinas quiméricas que incluyen CDR de 15C11. En otra realización más, la inmunoglobulina, o fragmento de unión a antígeno de la misma, incluye además al menos una región constante de IgG1. En otra realización más, la inmunoglobulina, o fragmento de unión a antígeno de la misma, incluye además al menos una región constante de IgG4.

Las inmunoglobulinas descritas en el presente documento son particularmente adecuadas para su uso en procedimientos terapéuticos dirigidos a la prevención o tratamiento de enfermedades amiloidogénicas y/o los síntomas y/o déficits conductuales asociados con enfermedades o trastornos amiloidogénicos. En una realización, la invención presenta un procedimiento para prevenir o tratar una enfermedad amiloidogénica (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) que implica administrar al paciente una dosificación eficaz de una inmunoglobulina humanizada como se ha descrito en el presente documento. En otra realización, la invención presenta composiciones farmacéuticas que incluyen una inmunoglobulina humanizada como se ha descrito en el presente documento y un vehículo farmacéutico. También se presentan moléculas de ácido nucleico aisladas, vectores y células huésped para producir las inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulina o cadenas descritas en el presente documento, así como procedimientos para producir dichas inmunoglobulinas, fragmentos de inmunoglobulina o cadenas de inmunoglobulina.

La presente divulgación presenta además un procedimiento para identificar restos de aminoácidos de 15C11 susceptibles de sustitución cuando se produce una inmunoglobulina humanizada. Por ejemplo, un procedimiento para identificar restos de región marco variable susceptibles de sustitución implica realizar el modelo de la estructura tridimensional de una región variable en una estructura de inmunoglobulina homóloga resuelta y analizar dicho modelo con respecto a restos capaces de afectar a la conformación o función de la región variable de inmunoglobulina, de modo que se identifiquen restos susceptibles de sustitución. La divulgación presenta además el uso de la secuencia de región variable expuesta como SEC ID Nº: 2, 4 o cualquier parte de la misma (o partes de la misma), en la producción de una imagen tridimensional de una inmunoglobulina, cadena de inmunoglobulina o dominio de la misma.

La presente invención presenta además inmunoglobulinas que tienen función efectora alterada, tal como la capacidad para unir moléculas efectoras, por ejemplo, complemento o un receptor en una célula efectora. En particular, la inmunoglobulina de la invención tiene una región constante alterada, por ejemplo, región Fc, en la que al menos un resto de aminoácido en la región Fc se ha reemplazado con un resto o cadena lateral diferente. En una realización, la inmunoglobulina modificada es de la clase IgG, comprende al menos un reemplazo de resto de aminoácido en la región Fc de modo que la inmunoglobulina tiene una función efectora alterada, por ejemplo, en comparación con una inmunoglobulina no modificada. En realizaciones particulares, la inmunoglobulina de la invención tiene una función efectora alterada de modo que es menos inmunógena (por ejemplo, no provoca actividad celular efectora no deseada, lisis o unión del complemento), tiene propiedades de eliminación de amiloides

mejorada y/o tiene una semivida deseable.

Las inmunoglobulinas de la presente invención son capaces de mejorar rápidamente la cognición en un paciente. En una realización, las inmunoglobulinas de la invención son capaces de capturar A∀ soluble (por ejemplo, A∀1-42 soluble) que circula en la sangre o presente en el SNC, evitando de este modo la acumulación y/o promoción de la 5 retirada de A∀ soluble de la sangre y/o SNC. Esa actividad, por ejemplo, mejora rápida de la cognición, se demuestra en ensayos in vivo en los que la inmunoglobulina, por ejemplo, 15C11, se administra en un modelo animal de enfermedad de Alzheimer, por ejemplo, un ratón Tg2576 y el animal se ensaya con respecto a condicionamiento de miedo contextual. Se ha visto mejora significativa en memoria contextual en ratones a los que se administró 15C11 durante un periodo de tiempo relativamente corto, lo que sugiere que la eliminación de placas

10 A∀ puede no ser necesaria para la eficacia. En consecuencia, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento, por ejemplo 15C11, pueden administrarse a un paciente, por ejemplo, un sujeto que padezca enfermedad de Alzheimer, para mejorar rápidamente el estado de deterioro. En una realización, se administra una dosis única de anticuerpo al paciente, por ejemplo, aproximadamente 30 mg/kg.

Antes de describir adicionalmente la invención, puede ser útil para un entendimiento de la misma exponer 15 definiciones de ciertos términos que van a usarse en lo sucesivo en el presente documento.

La expresión “enfermedad o trastorno relacionado con A∀” como se usa en el presente documento se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con, o caracterizado por, el desarrollo o presencia de un péptido A∀. En una realización, la enfermedad o trastorno relacionado con A∀ se asocia con, o se caracteriza por la presencia de A∀ soluble. En otra realización, la enfermedad o trastorno relacionado con A∀ se asocia con o se caracteriza por la 20 presencia de A∀ insoluble. En otra realización, la enfermedad o trastorno relacionado con A∀ se asocia con o se caracteriza por la presencia de una especie de A∀ neuroactiva (NA∀). En otra realización, la enfermedad o trastorno relacionado con A∀ también es un trastorno amiloidogénico. En otra realización, la enfermedad o trastorno relacionado con A∀ se caracteriza por un déficit cognitivo o trastorno relacionado con A∀, por ejemplo, un trastorno de demencia relacionado con A∀. Las enfermedades o trastornos relacionados con A∀ ejemplares incluyen

25 enfermedad de Alzheimer (AD), síndrome de Down, angiopatía amiloide cerebral, ciertas demencias vasculares y deterioro cognitivo leve (MCI).

Las expresiones “proteína ∀-amiloide”, “péptido ∀-amiloide”, “∀-amiloide”, “A∀” y “péptido A∀” se usan de forma intercambiable en el presente documento. El péptido A∀ (por ejemplo A∀39, A∀40, A∀41, A∀42 y A∀43) es un fragmento interno de ∃4 kDa de 39-43 aminoácidos de la glicoproteína transmembrana mayor denominada Proteína 30 Precursora de Amiloide (APP). Existen múltiples isoformas de APP, por ejemplo APP695, APP751 y APP770. Se asignan números a los aminoácidos dentro de APP de acuerdo con la secuencia de la isoforma APP770 (véase, por ejemplo, Nº de Acceso de GenBank P05067). Son ejemplos de isotipos específicos de APP que se sabe en la actualidad que existen en seres humanos el polipéptido de 695 aminoácidos descrito por Kang y col. (1987) Nature

325: 733-736 que se designa el APP “normal”; el polipéptido de 751 aminoácidos descrito por Ponte y col. (1988)

35 Nature 331: 525-527 (1988) y Tanzi y col. (1988) Nature 331: 528-530; y el polipéptido de 770 aminoácidos descrito por Kitaguchi y col. (1988) Nature 331: 530-532. Como resultado del procesamiento proteolítico de APP por diferentes enzimas secretasa in vivo o in situ, se encuentra A∀ tanto en una “forma corta”, de 40 aminoácidos de longitud, como en una “forma larga”, que varía de 42-43 aminoácidos de longitud. La forma corta, A∀40, consiste en los restos 672-711 de APP. La forma larga, por ejemplo, A∀42 o A∀43, consiste en los restos 672-713 o 672-714,

40 respectivamente. Parte del dominio hidrófobo de APP se encuentra en el extremo carboxilo de A∀, y puede explicar la capacidad de A∀ para agregarse, particularmente en el caso de la forma larga. Puede encontrarse péptido A∀ en,

o purificarse de, los fluidos corporales de seres humanos y otros mamíferos, por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, incluyendo tanto individuos normales como individuos que padecen trastornos amiloidogénicos.

Las expresiones “proteína ∀-amiloide”, “péptido ∀-amiloide”, “∀-amiloide”, “A∀” y “péptido A∀” incluyen péptidos que

45 resultan de la escisión por secretasa de APP y péptidos sintéticos que tienen la misma o esencialmente la misma secuencia que los productos de escisión. Los péptidos A∀ pueden derivar de una diversidad de fuentes, por ejemplo, tejidos, líneas celulares o fluidos corporales (por ejemplo, suero o líquido cefalorraquídeo). Por ejemplo, un A∀ puede derivar de células que expresan APP tales como células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas de forma estable con APP717V→F, como se describe, por ejemplo, en Walsh y col., (2002), Nature, 416, pp 535-539. Una

50 preparación de A∀ puede derivarse de fuentes tisulares usando procedimientos previamente descritos (véase, por ejemplo, Johnson-Wood y col., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1550). Como alternativa, pueden sintetizarse péptidos A∀, usando procedimientos que se conocen bien por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Fields y col., Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed. Grant, W.H. Freeman & Co., Nueva York, NY, 1992, p 77). Por lo tanto, pueden sintetizarse péptidos usando las técnicas automáticas de Merrifield de síntesis en fase sólida con el

55 grupo %-amino protegido por química de t-Boc o F-moc usando aminoácidos de cadena lateral protegida en, por ejemplo, un Sintetizador Peptídico de Applied Biosystems Modelo 430A o 431. Pueden sintetizarse antígenos peptídicos más largos usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas. Por ejemplo, puede sintetizarse o clonarse molecularmente un polinucleótido que codifique el péptido o péptido de fusión e insertarse en un vector de expresión adecuado para la transfección y expresión heteróloga por una célula huésped adecuada. El péptido A∀

60 también se refiere a secuencias de A∀ relacionadas que resultan de mutaciones en la región A∀ del gen normal.

La expresión “A∀ soluble” o “A∀ disociado” se refiere a polipéptido A∀ disgregado o no agregante, incluyendo polipéptido A∀ monomérico soluble así como oligomérico soluble (por ejemplo, dímeros, trímeros de A∀ soluble, y similares). Puede encontrarse A∀ soluble in vivo en fluidos biológicos tales como líquido cefalorraquídeo y/o suero. También puede prepararse A∀ soluble in vitro, por ejemplo, solubilizando péptido A∀ en disolventes y/o soluciones

5 apropiadas. Por ejemplo, puede prepararse A∀ disolviendo péptido liofilizado en alcohol, por ejemplo, HFIP seguido de dilución en solución acuosa fría. Como alternativa, puede prepararse A∀ soluble disolviendo péptido liofilizado en DMSO puro con sonicación. La solución resultante puede centrifugarse (por ejemplo, a 14.000 x g, 4ºC, 10 minutos) para retirar cualquier partícula insoluble.

La expresión “A∀ insoluble” o “A∀ agregado” se refiere a polipéptido A∀ agregado, por ejemplo, A∀ que se mantiene

10 unido por enlaces no covalentes y que puede aparecer en forma de lámina ∀ fibrilar, tóxica, de péptido A∀ que se encuentra en placas neuríticas y vasos sanguíneos cerebrales de pacientes con AD. Se cree que A∀ (por ejemplo, A∀42) se agrega, al menos en parte, debido a la presencia de restos hidrófobos en el extremo C terminal del péptido (parte del dominio transmembrana de APP).

Como se usa en el presente documento, la frase “especie de A∀ neuroactiva” se refiere a una especie de A∀ (por

15 ejemplo, un péptido A∀ o forma de péptido A∀) que afecta al menos a una actividad o característica física de una célula neuronal. Las especies de A∀ neuroactivas afectan, por ejemplo, a la función, actividad biológica, viabilidad, morfología y/o arquitectura de una célula neuronal. El efecto en células neuronales puede ser celular, por ejemplo, efectuando la potenciación a largo plazo (LPT) de una célula neuronal o viabilidad de una célula neuronal (neurotoxicidad). Como alternativa, el efecto puede ser en un sistema neuronal in vivo, por ejemplo, efectuando un

20 resultado conductual en un ensayo animal apropiado (por ejemplo, un ensayo cognitivo). El término “neutralizar” como se usa en el presente documento, significa hacer neutro, contrarrestrar o hacer ineficaz una actividad o un efecto.

Como se usa en el presente documento, la expresión “enfermedad de neurodegenerativa” se refiere en general a trastornos o enfermedades asociadas con o caracterizadas por degeneración de neuronas y/o tejidos nerviosos, por

25 ejemplo, una enfermedad amiloidogénica.

La expresión “enfermedad amiloidogénica” o “trastorno amiloidogénico” incluye cualquier enfermedad asociada con (o causada por) la formación o deposición de fibrillas amiloides insolubles. Las enfermedades amiloidogénicas ejemplares incluyen, pero sin limitación, amiloidosis sistémica, enfermedad de Alzheimer (AD), angiopatía amiloide cerebral (CAA), diabetes de aparición madura, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, demencia 30 fronto-temporal y las encefalopatías espongiformes transmisibles relacionadas con priones (kuru y enfermedad de Creutzfeldt-Jacob en seres humanos y tembladera y BSE en ovejas y vacas, respectivamente). Diferentes enfermedades amiloidogénicas se definen o se caracterizan por la naturaleza del componente polipeptídico de las fibrillas depositadas. Por ejemplo, en sujetos o pacientes que tienen enfermedad de Alzheimer, la proteína ∀amiloide (por ejemplo, proteína ∀-amiloide de tipo silvestre, variante o truncada) es el principal componente 35 polipeptídico del depósito amiloide. En consecuencia, la enfermedad de Alzheimer es un ejemplo de una “enfermedad caracterizada por depósitos de A∀” o una “enfermedad asociada con depósitos de A∀”, por ejemplo, en el cerebro de un sujeto o paciente. Otras enfermedades caracterizadas por depósitos de A∀ pueden incluir enfermedades no caracterizadas en las que se encuentran depósitos amiloidogénicos en una o más regiones del cerebro asociadas con el aprendizaje y/o la memoria, por ejemplo, el hipocampo, amígdala, subículo, corteza

40 cingulada, corteza prefrontal, corteza perirrinal, corteza sensorial y lóbulo temporal medio.

El término “cognición” se refiere a procesos mentales cognitivos realizados por un paciente incluyendo, pero sin limitación, aprendizaje o memoria (por ejemplo, aprendizaje o memoria a corto plazo o largo plazo), conocimiento, consciencia, atención y concentración, juicio, reconocimiento visual, pensamiento abstracto, funciones ejecutivas, lenguaje, habilidades visuoespaciales (es decir, orientación visuoespacial), reconocimiento visual, equilibrio/agilidad

45 y actividad sensomotriz. Los procesos cognitivos ejemplares incluyen aprendizaje y memoria.

Las expresiones “trastorno cognitivo”, “déficit cognitivo” o “deterioro cognitivo” se usan de forma intercambiable en el presente documento y se refieren a una deficiencia o deterioro de uno o más procesos mentales cognitivos de un paciente. Los déficits cognitivos pueden tener varios orígenes: un mecanismo funcional (ansiedad, depresión), envejecimiento fisiológico (deterioro de la memoria asociado con la edad), lesión cerebral, trastornos psiquiátricos

50 (por ejemplo, esquizofrenia), fármacos, infecciones, productos tóxicos, o lesiones anatómicas. Los déficits cognitivos ejemplares incluyen deficiencia o deterioro del aprendizaje o la memoria (por ejemplo, en pérdida de memoria y/o aprendizaje a corto plazo o largo plazo de capacidades intelectuales, juicio, lenguaje, habilidades motoras y/o pensamiento abstracto).

Como se usa en el presente documento, la expresión “trastorno cognitivo relacionado con A∀” (o “déficit” o

55 “deterioro”) se refiere a un trastorno cognitivo asociado con, o caracterizado por, el desarrollo o presencia de un péptido A∀. En una realización, el trastorno o enfermedad relacionado con A∀ se asocia con o se caracteriza por la presencia de A∀ soluble. En otra realización, el trastorno o enfermedad relacionada con A∀ se asocia con o se caracteriza por la presencia de A∀ insoluble. En otra realización, el trastorno o enfermedad relacionado con A∀ se asocia con o se caracteriza por la presencia de una especie de A∀ neuroactiva (NA∀).

La expresión “trastorno de demencia”, como se usa en el presente documento, se refiere a un trastorno caracterizado por demencia (es decir, deterioro general o declive progresivo de las capacidades cognitivas o síntomas de tipo demencia). Los trastornos de demencia se asocian con frecuencia con, o están provocados por, uno o más procesos aberrantes en el cerebro o sistema nervioso central (por ejemplo, neurodegeneración). Los trastornos de demencia progresan habitualmente de estadios leves a graves e interfieren con la capacidad de un paciente para actuar de forma independiente en la vida diaria. La demencia puede clasificarse como cortical o subcortical dependiendo del área del cerebro afectada. Los trastornos de demencia no incluyen trastornos caracterizados por una pérdida de consciencia (como en el delirio) o depresión, u otros trastornos mentales funcionales (pseudodemencia). Los trastornos de demencia incluyen las demencias irreversibles tales como enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, demencia de cuerpos de Lewy, enfermedad de Jakob-Creutzfeldt, enfermedad de Pick, parálisis supranuclear progresiva, demencia del lóbulo frontal, calcificación de ganglios basales idiopática, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple y enfermedad de Parkinson, así como demencias reversibles debidas a traumatismo (encefalopatía postraumática), tumores intracraneales (primarios o metastásicos), hematomas subdurales, afecciones metabólicas y endocrinológicas (hipo e hipertiroidismo, enfermedad de Wilson, encefalopatía urémica, demencia de diálisis, demencia anóxica y post-anóxica, y perturbaciones electrolíticas crónicas), estados de deficiencia (deficiencia en Vitamina B12 y pelagra (vitamina B6)), infecciones (SIDA, meningoencefalitis sifilítica, encefalitis límbica, leucoencefalopatía multifocal progresiva, infecciones fúngicas, tuberculosis), y exposición crónica a alcohol, aluminio, metales pesados (arsénico, plomo, mercurio, manganeso), o fármacos de prescripción (anticolinérgicos, sedantes, barbitúricos, etc.).

Como se usa en el presente documento, la expresión “trastorno de demencia relacionado con A∀” se refiere a un trastorno de demencia asociado con, o caracterizado por, el desarrollo o presencia de un péptido A∀.

Como se usa en el presente documento, la frase “mejora de la cognición” se refiere a una potenciación o aumento de una habilidad o función cognitiva. De forma similar, la frase “mejorar la cognición” se refiere a potenciar o aumentar una habilidad o función cognitiva. Una mejora de la cognición es relativa, por ejemplo, a la cognición en el paciente antes de un tratamiento de acuerdo con la presente invención. Preferentemente, la mejora de la cognición tiende a la de un sujeto normal o hacia un nivel convencional o esperado.

El término “rápido”, como se usa, por ejemplo, en la frase “mejora rápida de la cognición” o (“mejorar rápidamente la cognición”) se refiere a tardar un tiempo relativa o comparativamente corto o suceder en un intervalo de tiempo comparativamente corto; es decir, que un efecto (por ejemplo, mejora) se consigue, observa o alcanza comparativamente rápido, con respecto a la relevancia clínica.

Se consigue, observa o alcanzar una “mejora rápida de la cognición” ejemplar en un periodo de un día (es decir, en un período de 24 horas). Puede conseguirse, observarse o alcanzarse una “mejora rápida de la cognición” en menos de un día (es decir, menos de 24 horas), por ejemplo, en un periodo de 23, 22, 21, 20, 29, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 horas. Puede, como alternativa, conseguirse, observarse o alcanzarse una “mejora rápida de la cognición” en más de un día pero preferentemente en un periodo de un mes, por ejemplo, en un periodo de 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 días. Son intervalos de tiempo ejemplares para conseguir, observar o alcanzar una mejora rápida de la cognición, por ejemplo, un periodo de tres semanas, un periodo de dos semanas o un periodo de una semana o un periodo, por ejemplo, de 120 horas, 96 horas, 72 horas, 48 horas, 24 horas, 18 horas, 12 horas y/o 6 horas.

El término “prolongado”, como se usa, por ejemplo, en la frase “mejora prolongada de la cognición” significa que se produce durante un intervalo de tiempo comparativa o relativamente mayor que un control adecuado; es decir, que un efecto deseado (por ejemplo, mejora) se produce o se observa que se mantiene sin interrupción durante un periodo de tiempo prolongado o extendido, con respecto a relevancia clínica.

Se consigue, observa o alcanza una “mejora prolongada de la cognición” ejemplar durante al menos una semana. Puede conseguirse, observarse o alcanzarse una “mejora prolongada de la cognición” durante más de un día (es decir, más de 24 horas), por ejemplo, durante más de 36 horas, 48 horas (es decir, 2 días), 72 horas (es decir, 3 días), 96 horas (es decir, 4 días), 108 horas (es decir, 5 días) o 132 horas (es decir, 6 días). Como alternativa puede conseguirse, observarse o alcanzarse una “mejora prolongada de la cognición” durante más de una semana, por ejemplo, durante 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días (es decir, dos semanas), tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas, seis semanas o más. Los intervalos de tiempo ejemplares durante los que se consigue, observa o alcanza una mejora prolongada de la cognición incluyen 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 días.

El término “modulación” como se usa en el presente documento se refiere tanto a regulación positiva, es decir estimulación, como regulación negativa, es decir supresión, de una respuesta.

El término “tratamiento” como se usa en el presente documento, se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico a un paciente, o aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido aislado o línea celular de un paciente, que tiene una enfermedad, un síntoma de enfermedad o una predisposición hacia una enfermedad, con el fin de curar, sanar, aliviar, disipar, alterar, remediar, mejorar, progresar o afectar a la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición a la enfermedad. La expresión “dosis eficaz” o “dosificación eficaz” se define como una cantidad suficiente para conseguir al menos conseguir parcialmente el efecto deseado. La expresión “dosis terapéuticamente eficaz” se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la enfermedad, la fisiología general del paciente, por ejemplo, la masa corporal del paciente, edad, sexo, la vía de administración y otros factores bien conocidos para

5 los médicos y/o farmacólogos. Pueden expresarse dosis eficaces, por ejemplo, como la masa total de anticuerpo (por ejemplo, en gramos, miligramos o microgramos) o como una relación de masa de anticuerpo y masa corporal (por ejemplo, como gramos por kilogramo (g/kg), miligramos por kilogramo (mg/kg) o microgramos por kilogramo (!g/kg). Una dosis eficaz de anticuerpo usado en los presentes procedimientos variará, por ejemplo, entre 1 !g/kg y 500 mg/kg. Un intervalo ejemplar para dosis eficaces de anticuerpos usados en los procedimientos de la presente invención está entre 0,1 mg/kg y 100 mg/kg. Las dosis eficaces ejemplares incluyen, pero sin limitación, 10 !g/kg, 30 !g/kg, 100 !g/kg, 300 !g/kg, 1 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg.

Como se usa en el presente documento, el término “administrar” se refiere al acto de introducir un agente farmacéutico en el cuerpo de un paciente. Una vía ejemplar de administración es la vía parenteral, por ejemplo, administración subcutánea, intravenosa o intraperitoneal.

15 El término “paciente” incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico con uno o más agentes (por ejemplo, agentes inmunoterapéuticos) de la invención. Los pacientes ejemplares reciben tratamiento profiláctico o terapéutico con los agentes inmunoterapéuticos de la invención.

La expresión “modelo animal” o “animal modelo”, como se usa en el presente documento, incluye un miembro de una especie de mamífero, tal como roedores, primates no humanos, ovejas, perros y vacas que muestran elementos

o características de un cierto sistema de enfermedad o trastorno, por ejemplo, un sistema, enfermedad o trastorno humano. Los animales no humanos ejemplares seleccionados de la familia de los roedores incluyen conejos, cobayas, ratas y ratones, más preferentemente ratones. Un “modelo animal” de, o “animal modelo” que tiene, un trastorno de demencia muestra, por ejemplo, déficits cognitivos prominentes asociados con un trastorno relacionado con la demencia (por ejemplo, AD). Preferentemente el modelo animal muestra un empeoramiento progresivo del

25 déficit cognitivo al aumentar la edad, de modo que la progresión de enfermedad del animal modelo es paralela a la progresión de enfermedad en un paciente que padece el trastorno de demencia.

La expresión “agente inmunológico” o “reactivo inmunológico” se refiere a un agente que comprende o consiste en una o más inmunoglobulinas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o cadenas de anticuerpo, como se define en el presente documento, o combinaciones de los mismos. La expresión “agente inmunológico” también incluye ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o cadenas de anticuerpo. Tales ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN. Un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina se une típicamente a elementos reguladores, tales como un promotor y potenciador, que permiten la expresión del ácido nucleico en una célula o tejido apropiado.

La expresión “agente inmunoterapéutico” se refiere a un agente que comprende o consiste en una o más

35 inmunoglobulinas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o cadenas de anticuerpo, como se define en el presente documento, o combinaciones de los mismos, para su uso terapéutico. La expresión “agente inmunoterapéutico” también incluye ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o cadenas de anticuerpo, para su uso terapéutico. Tales ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN. Un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina se une típicamente a elementos reguladores, tales como un promotor y potenciador, que permiten la expresión del ácido nucleico en una cédula o tejido diana pretendido de un sujeto o paciente.

La expresión “inmunoglobulina” o “anticuerpo” (usados de forma intercambiable en el presente documento) se refiere a una proteína que tiene una estructura de cadena de cuatro polipéptidos básica consistente en dos cadenas pesadas y dos ligeras, estabilizándose dichas cadenas, por ejemplo, por enlaces disulfuro intercatenarios, que tienen la capacidad de unirse específicamente al antígeno. Se pretende que el término “anticuerpo” abarque

45 cualquier clase de Ig o cualquier subclase de Ig (por ejemplo, las subclases IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4 de IgG) obtenida de cualquier fuente (por ejemplo, en realizaciones ejemplares, seres humanos y primates no humanos, y en realizaciones adicionales, roedores, lagomorfos, caprinos, bovinos, equinos, ovinos, etc.).

La expresión “clase de Ig” o “clase de inmunoglobulina”, como se usa en el presente documento, se refiere a las cinco clases de inmunoglobulinas que se han identificado en seres humanos y mamíferos superiores, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. La expresión “subclase de Ig” se refiere a las dos subclases de IgM (H y L), tres subclases de IgA (IgA1, IgA2 e IgA secretora) y cuatro subclases de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) que se han identificado en seres humanos y mamíferos superiores.

La expresión “subclase de IgG” se refiere a las cuatro subclases de la clase de inmunoglobulina IgG: IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 que se han identificado en seres humanos y mamíferos superiores por las cadenas pesadas # de las

55 inmunoglobulinas, #1-#4, respectivamente.

La expresión “inmunoglobulina de cadena sencilla” o “anticuerpo de cadena sencilla” (usados de forma intercambiable en el presente documento) se refiere a una proteína que tiene una estructura de cadena de dos polipéptidos que consiste en una cadena pesada y una ligera, estabilizándose dichas cadenas, por ejemplo,

mediante engarces peptídicos intercatenarios, que tiene la capacidad de unirse específicamente a antígeno. El término “dominio” se refiere a un región globular de un polipéptido de un polipéptido de cadena pesada o ligera que comprende bucles peptídicos (por ejemplo, que comprenden de 3 a 4 bucles peptídicos) estabilizados, por ejemplo, por lámina plegada en ∀ y/o enlace disulfuro intracatenario. Los dominios se denominan adicionalmente en el presente documento “constantes” o “variables”, basándose en la falta relativa de variación de secuencia dentro de los dominios de miembros de diversas clases en el caso de un dominio “constante”, o la variación significativa dentro de los dominios de miembros de diversas clases en el caso de un dominio “variable”. Los “dominios” de anticuerpo o polipéptido se denominan con frecuencia de forma intercambiable en la técnica “regiones” de anticuerpo o polipéptido. Los dominios “constantes” de una cadena ligera de anticuerpos se denominan de forma intercambiable, “regiones constantes de cadena ligera”, “dominios constantes de cadena ligera”, regiones “CL” o dominios “CL”. Los dominios “constantes” de una cadena pesada de anticuerpo se denominan de forma intercambiable “regiones constantes de cadena pesada”, “dominios constantes de cadena pesada”, regiones “CH” o dominios “CH”. Los dominios “variables” de una cadena ligera de anticuerpo se denominan de forma intercambiable “regiones variables de cadena ligera”, “dominios variables de cadena ligera”, regiones “VL” o dominios “VL”. Los dominios “variables” de una cadena pesada de anticuerpo se denominan de forma intercambiable “regiones constantes de cadena pesada”, dominios constantes de cadena pesada”, regiones “VH” o dominios “VH”.

El término “región” también puede referirse a una parte o porción de una cadena de anticuerpo o dominio de cadena de anticuerpo (por ejemplo, una parte o porción de una cadena pesada o ligera o una parte o porción de un dominio constante o variable, como se definen en el presente documento), así como partes o porciones más discretas de dichas cadenas o dominios. Por ejemplo, las cadenas ligeras y pesadas o dominios variables de cadena ligera y pesada incluyen “regiones determinantes de complementariedad” o “CDR” intercaladas entre “regiones marco” o “FR”, como se definen en el presente documento.

Las inmunoglobulinas o anticuerpos pueden existir en forma monomérica o polimérica, por ejemplo, anticuerpos IgM que existen en forma pentamérica y/o anticuerpos IgA que existen en forma monomérica, dimérica o multimérica. El término “fragmento” se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos restos de aminoácidos que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos pueden obtenerse mediante tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos también pueden obtenerse por medios recombinantes. Los fragmentos ejemplares incluyen fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, Fabc y/o Fv. La expresión “fragmento de unión a antígeno” se refiere a un fragmento polipeptídico de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une a antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que derivó) por unión al antígeno (es decir, unión específica).

El término “conformación” se refiere a la estructura terciaria de una proteína o polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo, cadena de anticuerpo, dominio o región del mismo). Por ejemplo, la frase “conformación de cadena ligera (o pesada)” se refiere a la estructura terciaria de una región variable de cadena ligera (o pesada), y la frase “conformación de anticuerpo” o “conformación de fragmento de anticuerpo” se refiere a la estructura terciaria de un anticuerpo o fragmento del mismo.

La “unión específica” de un anticuerpo significa que el anticuerpo muestra afinidad apreciable por un antígeno o epítopo particular y, en general, no muestra reactividad cruzada significativa. En realizaciones ejemplares, el anticuerpo no muestra reactividad cruzada (por ejemplo, no reacciona de forma cruzada con péptidos no A∀ o con epítopos remotos en A∀). La unión preferida o “apreciable” incluye unión con una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109 M-1 o 1010 M-1. Se prefieren más afinidades mayores de 107 M-1, preferentemente mayores de 108 M-1. También se pretende que los valores intermedios de los expuestos en el presente documento estén dentro del alcance de la presente invención y una afinidad de unión preferida puede indicarse como un intervalo de afinidades, por ejemplo 106 a 1010 M-1, preferentemente 107 a 1010 M-1, más preferentemente 108 a 1010 M-1. Un anticuerpo que “no muestra reactividad cruzada significativa” es uno que no se une de forma apreciable a una entidad no deseable (por ejemplo, una entidad proteínica no deseable). Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a A∀ se unirá de forma apreciable a A∀ pero no reaccionará significativamente con proteínas o péptidos no A∀ (por ejemplo, proteínas o péptidos no A∀ incluidos en placas). Un anticuerpo específico para un epítopo particular, por ejemplo, no reaccionará significativamente de forma cruzada con epítopos remotos en la misma proteína o péptido. La unión específica puede determinarse de acuerdo con cualquier medio reconocido en la técnica para determinar dicha unión. Preferentemente, la unión específica se determina de acuerdo con análisis Scatchard y/o ensayos de unión competitiva.

Como se usa en el presente documento, el término “afinidad” se refiere a la fuerza de la unión de un sitio de combinación con antígeno único con un determinante antigénico. La afinidad depende de la cercanía del ajuste estereoquímico entre los sitios de combinación con anticuerpo y determinantes antigénicos, del tamaño del área de contacto entre ellos, de la distribución de los grupos cargados e hidrófobos, etc. La afinidad de anticuerpo puede medirse por diálisis en equilibrio o por el procedimiento cinético BIACORE™. El procedimiento BIACORE™ se basa en el fenómeno de la resonancia de plasmón superficial (SPR), que se produce cuando se excitan ondas de plasmón superficial en una interfaz metal/líquido. Se dirige luz a, y se refleja de, el lateral de la superficie que no está en contacto con la muestra y la SPR provoca una reducción de la intensidad de la luz reflejada a una combinación específica de ángulo y longitud de onda. Los acontecimientos de unión biomoleculares provocan cambios en el

índice refractario en la capa superficial, que se detectan como cambios en la señal de SPR.

La constante de disociación, KD, y la constante de asociación, KA, son medidas de afinidad cuantitativas. En el equilibrio, el antígeno libre (Ag) y anticuerpo libre (Ab) están en equilibrio con el complejo de antígeno-anticuerpo (Ag-Ab), y las constantes de velocidad, ka y kd, cuantifican las velocidades de las reacciones individuales:

ka

En el equilibrio, ka [Ab] [Ag] = kd [Ag-Ab]. La constante de disociación, KD, se proporciona por: KD = kd/ka = [Ag] [Ab] / [Ag-Ab]. KD tiene unidades de concentración, más típicamente M, mM, !M, nM, pM, etc. cuando se comparan afinidades de anticuerpos expresadas como KD, la mayor afinidad por A∀ se indica por un valor menor. La constante de asociación KA, se proporciona por: KA = KA/KD = [Ag-Ab] / [Ag] [Ab]. KA tiene unidades de concentración inversa, más típicamente M-1, mM-1, !M-1, nM-1, pM-1, etc. Como se usa en el presente documento, el término “avidez” se refiere a la fuerza del enlace antígeno-anticuerpo después de la formación de complejos reversibles.

Se producen fragmentos de unión por técnicas de ADN recombinante, o por escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab’, F(ab’)2, Fabc, Fv, cadenas sencillas y anticuerpos de cadena sencilla. Además de inmunoglobulinas o anticuerpos “biespecíficos” o “bifuncionales”, se entiende que una inmunoglobulina o anticuerpo tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un “anticuerpo bifuncional” o “biespecífico” es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Pueden producirse anticuerpos biespecíficos por una diversidad de procedimientos incluyendo fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab’. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny y col., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

Como se usa en el presente documento, la expresión “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo derivado de una población de clones de células productoras de anticuerpos (por ejemplo, linfocitos B o células B) que es homogénea en estructura y especificidad de antígenos. La expresión “anticuerpo policlonal” se refiere a una pluralidad de anticuerpos que se origina de diferentes poblaciones clonales de células productoras de anticuerpos que son heterogéneos en su estructura y especificidad de epítopos pero que reconocen un antígeno común. Pueden existir anticuerpos monoclonales y policlonales dentro de los fluidos corporales, como preparaciones en bruto, o pueden purificarse, como se describe en el presente documento.

La expresión “inmunoglobulina humanizada” o “anticuerpo humanizado” se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo que incluye al menos una inmunoglobulina o cadena de anticuerpo humanizada (es decir, al menos una cadena ligera o pesada humanizada). La expresión “cadena de inmunoglobulina humanizada” o “cadena de anticuerpo humanizada” (es decir, una “cadena ligera de inmunoglobulina humanizada” o “cadena pesada de inmunoglobulina humanizada”) se refiere a una inmunoglobulina o cadena de anticuerpo (es decir, una cadena ligera

o pesada, respectivamente) que tiene una región variable que incluye una región marco variable sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano y regiones determinantes de complementariedad (CDR) (por ejemplo, al menos una CDR, preferentemente dos CDR, más preferentemente tres CDR) sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo no humano, e incluye además regiones constantes (por ejemplo, al menos una región constante o parte de la misma, en el caso de una cadena ligera, y preferentemente tres regiones constantes en el caso de una cadena pesada). La expresión “región variable humanizada” (por ejemplo, “región variable de cadena ligera humanizada” o “región variable de cadena pesada humanizada”) se refiere a una región variable que incluye una región marco variable sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano y regiones determinantes de complementariedad (CDR) sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo no humano. Véase, Queen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989), documentos US 5.530.101, US 5.585.089, US 5.693.761, US 5.693.762, Selick y col., documento WO 90/07861 y Winter, documento US 5.225.539.

Una “inmunoglobulina humanizada” o un “anticuerpo humanizado” de la invención puede prepararse usando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento o los que se conocen bien en la técnica.

La frase “sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo humano” o “sustancialmente humano” significa que, cuando se alinea con una secuencia de aminoácidos de anticuerpo o inmunoglobulina humano para fines de comparación, la región comparte al menos 80-90%, 90-95% o 95-99% de identidad (es decir, identidad de secuencia local) con la secuencia de región marco o constante humana, permitiendo, por ejemplo, sustituciones conservativas, sustituciones de secuencia consenso, sustituciones de línea germinal, retromutaciones y similares. La introducción de sustituciones conservativas, sustituciones de secuencia consenso, sustituciones de línea germinal, retromutaciones, y similares, se denomina con frecuencia “optimización” de un anticuerpo o cadena humanizado. La frase “sustancialmente de una inmunoglobulina o anticuerpo no humano” o “sustancialmente no humano” significa que tiene una secuencia de inmunoglobulina o anticuerpo al menos 80-95%, preferentemente al menos 90-95%, más preferentemente, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la de un organismo no humano, por ejemplo, un mamífero no humano.

En consecuencia, todas las regiones o restos de una inmunoglobulina o anticuerpo humanizado, o de una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo humanizado, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las regiones o restos correspondientes de una o más secuencias de inmunoglobulina humana nativas. La expresión “región correspondiente” o “resto correspondiente” se refiere a una región o resto en una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos que ocupa la misma posición (es decir, equivalente) que una región o resto en una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos, cuando la primera y segunda secuencia se alinean de forma óptima para fines de comparación.

La expresión “identidad significativa” significa que dos secuencias polipeptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten al menos 6070% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos 70-80% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos 80-90% de identidad, aún más preferentemente al menos 90-95% de identidad y aún más preferentemente al menos 95% de identidad de secuencia o más (por ejemplo, 99% de identidad de secuencia o más). La expresión “identidad sustancial” significa que dos secuencias polipeptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten al menos 8090% de identidad de secuencia, preferentemente al menos 90-95% de identidad de secuencia y más preferentemente al menos 95% de identidad de secuencia o más (por ejemplo, 99% de identidad de secuencia o más). Para comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de ensayo y referencia en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencias calcula después el porcentaje de identidad de secuencias para la secuencia o las secuencias de ensayo en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros de programa designados.

Pueden realizarse un alineamiento óptimo de secuencias para comparación, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), por el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software genético de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección visual (véase en general Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology). Un ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y col., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). Está disponible públicamente el software para realizar análisis de BLAST a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (accesible públicamente a través del servidor de Internet del NCBI de los Institutos Nacionales de Salud). Típicamente, pueden usarse los parámetros del programa por defecto para realizar la comparación de secuencia, aunque también pueden usarse parámetros adaptados. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

Preferentemente, las posiciones que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Para el fin de clasificar las sustituciones de aminoácidos como conservativas o no conservativas, los aminoácidos se agrupan como sigue: Grupo I (cadenas laterales hidrófobas): leu, met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (los restos influyen en la orientación de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservativas implican sustituciones entre aminoácidos en la misma clase. Las sustituciones no conservativas constituyen intercambiar un miembro de una de estas clases con un miembro de otra clase.

Preferentemente, las inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados se unen a antígeno con una afinidad que está dentro de un factor de tres, cuatro o cinco de la del anticuerpo no humanizado correspondiente. Por ejemplo, si el anticuerpo no humanizado tiene una afinidad de unión de 109 M-1, los anticuerpos humanizados tendrán una afinidad de unión de al menos 3 x 109 M-1, 4 x 109 M-1 o 5 x 109 M-1. Cuando se describen las propiedades de unión de una inmunoglobulina o cadena de anticuerpo, la cadena puede describirse basándose en su capacidad para “dirigir la unión a antígeno (por ejemplo, A∀)”. Se dice que una cadena “dirige la unión a antígeno” cuando confiere a una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmento de unión a antígeno del mismo) una propiedad de unión o afinidad de unión específica. Se dice que una mutación (por ejemplo, una retromutación) afecta sustancialmente a la capacidad de una cadena pesada o ligera para dirigir la unión a antígeno si afecta a (por ejemplo, reduce) la afinidad de unión de una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que comprende dicha cadena en al menos un orden de magnitud en comparación con la del anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que comprende una cadena equivalente que carece de dicha mutación. Una mutación “no afecta sustancialmente a (por ejemplo, reduce) la capacidad de una cadena para dirigir la unión de antígeno” si afecta a (por ejemplo, reduce) la afinidad de unión de una inmunoglobulina o anticuerpo intacto (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que comprende dicha cadena en un factor de solamente dos, tres o cuatro de la del anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que comprende una cadena equivalente que carece de dicha mutación.

La expresión “inmunoglobulina quimérica” o anticuerpo se refiere a una inmunoglobulina o anticuerpo cuyas regiones variables derivan de una primera especie y cuyas regiones constantes derivan de una segunda especie. Pueden construirse inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, por ejemplo por ingeniería genética, a partir de segmentos génicos de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. No se pretende que las expresiones

5 “inmunoglobulina humanizada” o “anticuerpo humanizado” abarquen inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, como se definen posteriormente. Aunque las inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados son quiméricos en su construcción (es decir, comprenden regiones de más de una especie de proteína), incluyen elementos adicionales (es decir, regiones variables que comprenden restos de CDR donadores y restos marco aceptores) no hallados en inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, como se define en el presente documento.

10 Un “antígeno” es una entidad (por ejemplo, una entidad proteínica o péptido) con la que se une específicamente una inmunoglobulina o anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo).

La expresión “epítopo” o “determinante antigénico” se refiere a un sitio en un antígeno con el que se une específicamente una inmunoglobulina o anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo). Pueden formarse epítopos a partir de aminoácidos contiguos o de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario 15 de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos típicamente se conservan en la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario típicamente se pierden en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo típicamente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Los procedimientos para determinar la conformación espacial de epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia

20 magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).

Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo sencillo que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo con un antígeno diana, es decir, un ensayo de unión competitiva. La unión competitiva se determina en un ensayo en el que la inmunoglobulina que se ensaya 25 inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia con un antígeno común, tal como A∀. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto de fase sólida (RIA), inmunoensayo enzimático directo o indirecto de fase sólida (EIA), ensayos de competición de tipo sándwich (véase Stahli y col., Methods in Enzymology 9: 242 (1983)); EIA de biotina-avidina directo de fase sólida (véase, Kirkland y col., Immunol. 137: 3614 (1986)); ensayo de marcaje directo de fase sólida, ensayo de tipo sándwich de 30 marcaje directo de fase sólida (véase Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de marcaje directo de fase sólida usando marcador I-125 (véase Morel y col., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); EIA de biotina-avidina directo de fase sólida (Cheung y col., Virology 176: 546 (1990)); y RIA de marcaje directo (Moldenhauer y col., Scand. J. Immunol. 32: 77 (1990)). Típicamente, dicho ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que portan uno de éstos, una inmunoglobulina de ensayo

35 no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Habitualmente la inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso. Habitualmente, cuando está presente un anticuerpo competidor en exceso, este inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia con un antígeno común en al menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% o más.

40 También se reconoce un epítopo por células inmunológicas, por ejemplo, linfocitos B y/o o linfocitos T. El reconocimiento celular de un epítopo puede determinarse por ensayos in vitro que miden la proliferación dependiente de antígeno, como se determina por incorporación de 3H timidina, por secreción de citocinas, por secreción de anticuerpos, o por destrucción dependiente de antígeno (ensayo de linfocitos T citotóxicos).

Pueden encontrarse epítopos ejemplares o determinantes antigénicos con los que se une un anticuerpo de la

45 invención dentro de la proteína precursora amiloide humana (APP), pero se encuentran preferentemente dentro del péptido A∀ de APP. Se localizan epítopos ejemplares o determinantes antigénicos dentro de A∀, como se describe en el presente documento, dentro del extremo N terminal, región central o extremo C terminal de A∀.

Un “epítopo N terminal” es un epítopo o determinante antigénico que comprende restos localizados dentro del extremo N terminal del péptido A∀. Los epítopos N terminales ejemplares incluyen restos dentro de los aminoácidos

50 1-10 de A∀, preferentemente de los restos 1-3, 1-4, 1-5,1-6, 1-7, 2-6, 3-6 o 3-7 de A∀42. Otros epítopos N terminales ejemplares comienzan en los restos 1-3 y terminan en los restos 7-11 de A∀. Los epítopos N terminales ejemplares adicionales incluyen restos 2-4, 5, 6, 7 u 8 de A∀, restos 3-5, 6, 7, 8 o 9 de A∀, o restos 4-7,8,9 o 10 de A∀42.

Los “epítopos centrales” son epítopos o determinantes antigénicos que comprenden restos localizados dentro de la parte central o media del epítopo A∀. Los epítopos centrales ejemplares incluyen restos dentro de los aminoácidos

55 10-18, 16-21, 16-22, 16-23, 16-24, 18-21, 19-21, 19-22, 19-23 o 19-24 de A∀.

Los “epítopos C terminales” son epítopos o determinantes antigénicos que comprenden restos localizados dentro de la parte central o media del péptido A∀. Los epítopos o determinantes antigénicos ejemplares adicionales incluyen los restos 33-40 o 33-42 de A∀. Tales epítopos pueden denominarse “epítopos C terminales”.

Cuando se dice que un anticuerpo se une a un epítopo dentro de restos específicos, tal como dentro de 13-28 de A∀, lo que se entiende es que el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que contiene los restos específicos (es decir, 13-28, inclusive, de A∀, en este ejemplo). Dicho anticuerpo no entra en contacto necesariamente con cada resto dentro de 13-28 de A∀. La sustitución o deleción de cada resto de aminoácido individual dentro de 13-28 de A∀ tampoco afecta necesariamente de forma significativa a la afinidad de unión.

Las expresiones “anticuerpo de A∀” y “anti-A∀” se usan de forma intercambiable en el presente documento para referirse a un anticuerpo que se une a uno o más epítopos o determinantes antigénicos dentro de la proteína A∀. Los anticuerpos de A∀ ejemplares incluyen anticuerpos de A∀ N terminales, anticuerpos de A∀ centrales y anticuerpos de A∀ C terminales. Como se usa en el presente documento, la expresión “anticuerpo de A∀ N terminal” se referirá a un anticuerpo de A∀ que reconoce al menos un epítopo o determinante antigénico N terminal. Como se usa en el presente documento, la expresión “anticuerpo de A∀ central” se referirá a un anticuerpo de A∀ que reconoce al menos un epítopo o determinante antigénico central. Como se usa en el presente documento, la expresión “anticuerpos de A∀ C terminal” se refiere a un anticuerpo de A∀ que reconoce al menos un epítopo o determinante antigénico C terminal.

Como se usa en el presente documento, la expresión “sitio de unión a antígeno” se refiere a un sitio que se une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno (por ejemplo, un antígeno soluble o de superficie celular). Los anticuerpos de la invención preferentemente comprenden al menos dos sitios de unión a antígeno. Un sitio de unión a antígeno incluye habitualmente CDR de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina y el sitio de unión formado por estas CDR determina la especificidad del anticuerpo. Una “región de unión a antígeno” o “dominio de unión a antígeno” es una región o dominio (por ejemplo, una región o dominio de anticuerpo que incluye un sitio de unión a anticuerpo como se define en el presente documento).

Un “agente inmunogénico” o “inmunógeno” es capaz de inducir una respuesta inmunológica contra sí mismo al administrarse a un mamífero, opcionalmente junto con un adyuvante.

Como se usa en el presente documento, el término “inmunoterapia” se refiere a un tratamiento, por ejemplo, tratamiento terapéutico o profiláctico, de una enfermedad o trastorno pretendido para y/o que produce una respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta inmune activa o pasiva).

El término “adyuvante” se refiere a un compuesto que cuando se administra junto con un antígeno aumenta la respuesta inmune al antígeno, pero cuando se administra solo no genera una respuesta inmune al antígeno. Los adyuvantes pueden aumentar una respuesta inmune por varios mecanismos incluyendo reclutamiento de linfocitos, estimulación de linfocitos B y/o T y estimulación de macrófagos.

Como se usa en el presente documento, el término “kit” se usa en referencia a una combinación de reactivos y otros materiales que facilitan el análisis de muestras. En algunas realizaciones, el kit de inmunoensayo de la presente invención incluye un antígeno adecuado, agente de unión que comprende un resto detectable, y reactivos de detección. También puede incluirse o no en el kit un sistema para amplificar la señal producida por restos detectables. Además, en otras realizaciones, el kit incluye, pero sin limitación, componentes tales como aparato para recogida de muestras, tubos de muestra, soportes, bandejas, rejillas, platos, placas, instrucciones para el usuario del kit, soluciones u otros reactivos químicos y muestras para usar para estandarización, normalización y/o muestras de control.

Diversas metodologías de la presente invención incluyen una etapa que implica comparar un valor, nivel, elemento, característica, propiedad, etc. con un “control adecuado”, denominado de forma intercambiable en el presente documento “control apropiado”. Un “control adecuado” o “control apropiado” es cualquier control o patrón familiar para un experto habitual en la materia útil para fines de comparación. En una realización, un “control adecuado” o “control apropiado” es un valor, nivel, elemento, característica, propiedad, etc., determinado antes de realizar una metodología de la invención, como se describe en el presente documento. En otra realización, un “control adecuado”

o “control apropiado” es un valor, nivel, elemento, característica, propiedad, etc., determinado en un paciente, por ejemplo, un sujeto de control o normal que muestra, por ejemplo, rasgos normales. En otra realización más, un “control adecuado” o “control apropiado” es un valor, nivel, elemento, característica, propiedad, etc. predefinido.

“Capturar A∀ soluble” se refiere a la unión de A∀ que está presente en el plasma, por ejemplo, como parte de complejos proteicos o en el sistema nervioso central, por una inmunoglobulina, evitando de este modo la acumulación de A∀ y/o promoviendo la retirada de A∀ del SNC.

La expresión “variante de inmunoglobulina Fc” o “variante de anticuerpo Fc” incluye inmunoglobulinas o anticuerpos (por ejemplo, inmunoglobulinas humanizadas, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos de anticuerpo, etc.) que tienen una región Fc alterada. Las regiones Fc pueden alterarse, por ejemplo, de modo que la inmunoglobulina tenga una función efectora alterada. En algunas realizaciones, la región Fc incluye una o más alteraciones de aminoácidos en la región bisagra, por ejemplo, en las posiciones de EU 234, 235, 236 y/o

237. Pueden prepararse anticuerpos que incluyen mutaciones en la región bisagra en una o más de las posiciones de aminoácidos 234, 235, 236 y/o 237, como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº

5.624.821 y la Patente de Estados Unidos Nº 5.648.260.

La expresión “función efectora” se refiere a una actividad que reside en la región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo IgG) e incluye, por ejemplo, la capacidad del anticuerpo para unirse a moléculas efectoras tales como receptores de Fc y/o complemento, que pueden controlar varias funciones inmunitarias del anticuerpo tales como actividad de células efectoras, lisis, actividad mediada por complemento, eliminación de anticuerpos y semivida de

5 anticuerpos.

La expresión “molécula efectora” se refiere a una molécula que es capaz de unirse a la región Fc de un anticuerpo, (por ejemplo, un anticuerpo IgG) que incluye, pero sin limitación, una proteína del complemento o un receptor de Fc.

La expresión “célula efectora” se refiere a una célula capaz de unirse a la parte Fc de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo IgG) típicamente mediante un receptor Fc expresado en la superficie de la célula efectora incluyendo,

10 pero sin limitación, linfocitos, por ejemplo, células presentadoras de antígeno y linfocitos T.

La expresión “región Fc” se refiere a una región C terminal de un anticuerpo IgG, en particular, la región C terminal de la cadena o las cadenas pesadas de dicho anticuerpo IgG. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, se define típicamente que una región Fc abarca desde aproximadamente el resto de aminoácido Cys226 al extremo carboxilo terminal de una cadena o cadenas pesadas de IgG humana.

15 La expresión anticuerpo “aglicosilado” se refiere un anticuerpo que carece de uno o más carbohidratos debido a un procedimiento químico o enzimático, mutación de uno o más sitios de glicosilación, expresión en bacterias, etc. Un anticuerpo aglicosilado puede ser un anticuerpo desglicosilado, es decir un anticuerpo del que se ha retirado el carbohidrato Fc, por ejemplo de forma química o enzimática. Como alternativa, el anticuerpo aglicosilado puede ser un anticuerpo no glicosilado o desglicosilado, es decir un anticuerpo que se expresó sin carbohidrato Fc, por ejemplo

20 por mutación de uno o más restos que codifican el patrón de glicosilación o por expresión en un organismo que no une carbohidratos a las proteínas, por ejemplo, bacterias.

La “numeración de Kabat” a no ser que se indique de otro modo, es como se enseña en Kabat y col. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). La “numeración de EU” a no ser que se indique de otro modo, también se enseña en Kabat y col. (Sequences of

25 Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y, por ejemplo, se refiere a la numeración de los restos en las secuencias de anticuerpo de cadena pesada usando el índice EU como se describe en dicho documento. Este sistema de numeración se basa en la secuencia del anticuerpo EU descrito en Edelman y col., 63(1):78-85 (1969).

La expresión “receptor de Fc” o “FcR” se refiere a un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. Los

30 receptores de Fc típicos que se unen a una región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo IgG) incluyen, pero sin limitación, receptores de las subclases Fc#RI, Fc#RII y Fc#RIII, incluyendo variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativos de estos receptores. Otros receptores de Fc incluyen los receptores de Fc neonatales (FcRn) que regulan la semivida del anticuerpo. Se revisan receptores de Fc en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol

9: 457-92 (1991); Capel y col., Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas y col., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 35 (1995).

I. Reactivos inmunológicos y terapéuticos

Los reactivos inmunológicos y terapéuticos de la invención comprenden o consisten en inmunoglobulinas o anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno o funcionales de los mismos, como se definen en el presente documento. Se sabe que la unidad estructural de anticuerpo básica comprende un tetrámero de subunidades. Cada

40 tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ligera” (de aproximadamente 25 kDa) y una “pesada” (de aproximadamente 50-70 kD). La parte amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. La parte carboxilo terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora.

45 Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda y son de aproximadamente 230 restos de longitud. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma (#), mu (!), alfa (%), delta (&), o épsilon (∋), son de aproximadamente 450-600 restos de longitud, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Tanto las cadenas pesadas como las ligeras se pliegan en dominios. El término “dominio” se refiere a una región globular de una proteína, por ejemplo, una inmunoglobulina o anticuerpo. Los dominios de inmunoglobulina o anticuerpo

50 incluyen, por ejemplo, tres o cuatro bucles peptídicos estabilizados por lámina plegada en ∀ y un enlace disulfuro intercatenario. Las cadenas ligeras intactas tienen, por ejemplo, dos dominios (VL y CL) y las cadenas pesadas intactas tienen, por ejemplo, cuatro o cinco dominios (VH, CH1, CH2 y CH3).

Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región “J” de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región “D” de

55 aproximadamente 10 aminoácidos más. (Véase en general, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y. (1989), C. 7.

Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forma el sitio de unión a anticuerpo. Por lo tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son iguales. Todas las cadenas muestran la misma estructura general de regiones marco relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Pueden expresarse cadenas de origen natural o cadenas producidas de forma recombinante con una secuencia líder que se retira durante el procesamiento celular para producir una cadena madura. También pueden producirse de forma recombinante cadenas maduras que tienen una secuencia líder de origen no natural, por ejemplo, para potenciar la secreción o alterar el procesamiento de una cadena particular de interés.

Las CDR de las dos cadenas maduras de cada par se alinean por las regiones flanqueantes, permitiendo la unión a un epítopo específico. Del extremo N terminal al C terminal, las cadenas tanto ligera como pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. “FR4” también se denomina en la técnica la región D/J de la cadena pesada variable y la región J de la cadena ligera variable. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991). Se ha propuesto una definición estructural alternativa por Chothia y col., J. Mol. Biol. 196: 901 (1987); Nature 342: 878 (1989); y J. Mol. Biol. 186: 651 (1989) (denominada de forma colectiva en lo sucesivo en el presente documento “Chothia y col.”).

A. Anticuerpos de A∀

Los agentes terapéuticos de la invención son anticuerpos que se unen específicamente a A∀. Los anticuerpos preferidos son anticuerpos monoclonales. Algunos de tales anticuerpos se unen específicamente a la forma agregada de A∀ sin unirse a la forma soluble. Algunos se unen específicamente a las formas solubles sin unirse a la forma agregada. Algunos se unen tanto a la forma agregada como a la soluble. Algunos anticuerpos se unen a A∀ en placas. Algunos anticuerpos pueden cruzar la barrera hematoencefálica. Algunos anticuerpos pueden reducir la carga amiloide en un paciente. Algunos anticuerpos pueden reducir la distrofia neurítica en un paciente. Algunos anticuerpos pueden mantener la arquitectura sináptica (por ejemplo, sinaptofisina). Los anticuerpos usados en los procedimientos terapéuticos pueden tener una región constante intacta o al menos suficiente de la región constante para interaccionar con un receptor de Fc. Algunos anticuerpos son eficaces en la estimulación de fagocitosis mediada por Fc de A∀ en placas. El isotipo humano ejemplar incluye IgG1 e IgG4. IgG1 humano es el equivalente de IgG2a murino e IgG4 humano es el equivalente de IgG1 murino. Por lo tanto, los últimos son adecuados para ensayar la eficacia in vivo en modelos animales (por ejemplo, de ratón) de Alzheimer. También pueden usarse fragmentos Fab biespecíficos, en los que una rama del anticuerpo tiene especificidad por A∀, y la otra por un receptor de Fc. En realizaciones ejemplares, los anticuerpos se unen a A∀ con una afinidad de unión mayor de (o igual a) aproximadamente 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1 o 1010 M-1 (incluyendo afinidades intermedias de estos valores). En otras realizaciones ejemplares, los anticuerpos se unen a A∀ con una unión.

Los anticuerpos preferidos también incluyen los anticuerpos que son capaces de capturar A∀ soluble, por ejemplo en el torrente sanguíneo o SNC de un paciente. Los anticuerpos preferidos son capaces de mejorar rápidamente la cognición en un paciente, por ejemplo, mediante captura de A∀ soluble.

Los anticuerpos monoclonales se unen a un epítopo específico dentro de A∀ que puede ser un epítopo conformacional o no conformacional. La eficacia profiláctica y terapéutica de los anticuerpos puede ensayarse en un modelo animal, por ejemplo, usando los procedimientos de modelos animales transgénicos descritos en los Ejemplos. Los anticuerpos monoclonales preferidos se unen a un epítopo dentro de los restos 13-28 de A∀ (con el primer resto N terminal de A∀ natural designado 1), más preferentemente a un epítopo dentro de los restos 19-22 de A∀. En algunos procedimientos, se usan múltiples anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por diferentes epítopos, por ejemplo, un anticuerpo específico para un epítopo dentro de los restos 19-22 de A∀ puede coadministrarse con un anticuerpo específico para un epítopo fuera de los restos 19-22 de A∀. Tales anticuerpos pueden administrarse de forma secuencial o simultánea. También pueden usarse anticuerpos para componentes amiloides distintos de A∀ en combinación con los presentes reactivos (por ejemplo, administrados o coadministrados).

La especificidad epitópica de un anticuerpo puede determinarse, por ejemplo, formando una biblioteca de presentación de fagos en la que los diferentes miembros de la biblioteca presentan diferentes subsecuencias de A∀. La biblioteca de presentación de fagos después se explora con respecto a miembros que se unen específicamente a un anticuerpo que se ensaya. Se selecciona y aísla una familia de secuencias. Típicamente, dicha familia contiene una secuencia central común y diversos tramos de secuencias flanqueantes en diferentes miembros. La secuencia central más corta que muestra unión específica con el anticuerpo define el epítopo al que se une el anticuerpo. Los anticuerpos también pueden ensayarse con respecto a especificidad de epítopo en un ensayo de competición con un anticuerpo cuya especificidad de epítopo ya se ha determinado. Por ejemplo, los anticuerpos que compiten con el anticuerpo 15C11 por la unión con A∀ se unen al mismo epítopo o uno similar que 15C11, es decir, dentro de los restos 19-22 de A∀. La exploración de anticuerpos con respecto a especificidad de epítopo es un predictor útil de la eficacia terapéutica. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha determinado que se une a un epítopo dentro de los restos 13-28 (por ejemplo, a 19-22 de A∀) de A∀ es probablemente eficaz en la prevención y tratamiento de enfermedad de

Alzheimer de acuerdo con las metodologías de la presente invención.

Los anticuerpos que se unen específicamente a un segmento preferido de A∀ sin unirse a otras regiones de A∀ tienen varias ventajas en relación con anticuerpos monoclonales que se unen a otras regiones o sueros policlonales para A∀ intacto. En primer lugar, para dosificaciones de masa igual, las dosificaciones de anticuerpos que se unen específicamente a segmentos preferidos contienen una mayor dosificación molar de anticuerpos eficaces en la eliminación de placas amiloides. En segundo lugar, los anticuerpos que se unen específicamente a segmentos preferidos pueden inducir una respuesta de eliminación contra depósitos amiloides sin inducir una respuesta de eliminación contra polipéptido APP intacto, reduciendo de este modo los efectos secundarios potenciales.

1. Producción de anticuerpos no humanos.

La presente invención presenta anticuerpos no humanos, por ejemplo, anticuerpos que tienen especificidad para los epítopos de A∀ preferidos de la invención. Tales anticuerpos pueden usarse en la formulación de diversas composiciones terapéuticas de la invención o, preferentemente, proporcionan regiones determinantes de complementariedad para la producción de anticuerpos humanizados o quiméricos (descritos en detalle posteriormente). La producción de anticuerpos monoclonales humanos, por ejemplo murinos, de cobaya, de primate, de conejo o de rata, pueden conseguirse, por ejemplo, inmunizando al animal con A∀. También puede usarse un polipéptido más largo que comprende A∀ o un fragmento inmunogénico de A∀ o anticuerpos anti-idiotípicos para un anticuerpo para A∀. (Véase Harlow & Lane, mencionado anteriormente). Dicho inmunógeno puede obtenerse de una fuente natural, por síntesis peptídica o por expresión recombinante. Opcionalmente, el inmunógeno puede administrarse fusionado o en complejo de otro modo con una proteína vehículo, como se describe posteriormente. Opcionalmente, el inmunógeno puede administrarse con un adyuvante. El término “adyuvante” se refiere a un compuesto que cuando se administra junto con un antígeno aumenta la respuesta inmune al antígeno, pero cuando se administra solo no genera una respuesta inmune al antígeno. Los adyuvantes pueden aumentar una respuesta inmune por varios mecanismos incluyendo reclutamiento de linfocitos, estimulación de linfocitos B y/o T, y estimulación de macrófagos. Pueden usarse varios tipos de adyuvantes, como se describe posteriormente. Se prefiere adyuvante completo de Freund seguido de adyuvante incompleto para inmunización de animales de laboratorio.

Se usan típicamente conejos o cobayas para preparar anticuerpos policlonales. La preparación ejemplar de anticuerpos policlonales, por ejemplo, para protección pasiva, puede realizarse como sigue. Se inmunizan 125 ratones no transgénicos con 100 !g de A∀1-42, más adyuvante CFA/IFA, y se sacrifican a los 4-5 meses. Se recoge sangre de ratones inmunizados. La IgG se separa de otros componentes sanguíneos. El anticuerpo específico para el inmunógeno puede purificarse parcialmente por cromatografía de afinidad. Se obtiene una media de aproximadamente 0,5-1 mg de anticuerpo específico de inmunógeno por ratón, dando un total de 60-120 mg.

Los ratones se usan típicamente para preparar anticuerpos monoclonales. Pueden prepararse monoclonales contra un fragmento inyectando el fragmento o forma más larga de A∀ en un ratón, preparando hibridomas y explorando los hibridomas con respecto al anticuerpo que se une específicamente a A∀. Opcionalmente, los anticuerpos se exploran con respecto a unión con una región específica o fragmento deseado de A∀ sin unión a otros fragmentos no solapantes de A∀. Esta última exploración puede conseguirse determinando la unión de un anticuerpo con una colección de mutantes de deleción de un péptido A∀ y determinando qué mutantes de deleción se unen al anticuerpo. La unión puede evaluarse, por ejemplo, por transferencia de Western o ELISA. El fragmento más pequeño que muestra unión específica con el anticuerpo define el epítopo del anticuerpo. Como alternativa, la especificidad de epítopo puede determinarse por un ensayo de competición en el que un anticuerpo de ensayo y de referencia compiten por la unión con A∀. Si los anticuerpos de ensayo y de referencia compiten, entonces se unen al mismo epítopo o epítopos suficientemente próximos de modo que la unión de un anticuerpo interfiere con la unión del otro. Los isotipos ejemplares para tales anticuerpos son isotipo de ratón IgG2a o IgG1, o isotipos equivalentes en otras especies. El isotipo de ratón IgG2a es el equivalente del isotipo humano IgG1. El isotipo de ratón IgG1 es el equivalente del isotipo humano IgG4.

2. Anticuerpos quiméricos y humanizados.

La presente invención también presenta anticuerpos quiméricos y/o humanizados (es decir, inmunoglobulinas quiméricas y/o humanizadas) específicas para péptido beta amiloide. Los anticuerpos quiméricos y/o humanizados tienen la misma o similar especificidad y afinidad de unión que un anticuerpo de ratón u otro no humano que proporciona material de partida para la construcción de un anticuerpo humanizado o quimérico. El anticuerpo para humanización es el anticuerpo 15C11 de ratón descrito en el presente documento.

a. Producción de anticuerpos quiméricos.

La expresión “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo cuyos genes de cadena pesada y ligera se han construido, típicamente por ingeniería genética, a partir de segmentos génicos de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse con segmentos constantes humanos (C), tales como IgG1 e IgG4. Los isotipos humanos IgG1 e IgG4 son ejemplares. Un anticuerpo quimérico típico es por lo tanto una proteína híbrida que consiste en el dominio de

unión a antígeno o V de un anticuerpo de ratón y el dominio efector o C de un anticuerpo humano.

b. Producción de anticuerpos humanizados

La expresión “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo que comprende al menos una cadena que comprende restos marco de región variable sustancialmente de una cadena de anticuerpo humana (denominada la inmunoglobulina o el anticuerpo aceptor) y al menos una región determinante de complementariedad sustancialmente de un anticuerpo de ratón, (denominado la inmunoglobulina o el anticuerpo donador). Véase, Queen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989), documentos US 5.530.101, US 5.585.089, US 5.693.761, US 5.693.762, Selick y col., documento WO 90/07861 y Winter, documento US 5.225.539. La región o regiones constantes, si están presentes, también son sustancialmente o completamente de una inmunoglobulina humana.

La sustitución de CDR de ratón en un marco de dominio variable humano probablemente dé como resultado la conservación de su orientación espacial correcta si el marco de dominio variable humano adopta la misma o similar conformación que el marco variable de ratón del que se originaron las CDR. Esto se consigue obteniendo los dominios variables humanos a partir de anticuerpos humanos cuyas secuencias marco muestran un alto grado de identidad de secuencia con los dominios marco variables murinos de los que se derivaron las CDR. Las regiones marco variables de cadena variable pesada y ligera pueden derivar de las mismas o diferentes secuencias de anticuerpo humano. La secuencia de anticuerpo humano pueden ser las secuencias de anticuerpos humanos de origen natural o pueden ser secuencias consenso de varios anticuerpos humanos. Véase Kettleborough y col., Protein Engineering 4: 773 (1991); Kolbinger y col., Protein Engineering 6: 971 (1993) y Carter y col., documento WO 92/22653.

Habiendo identificado las regiones determinantes de complementariedad de la inmunoglobulina donadora murina e inmunoglobulinas aceptoras humanas apropiadas, la siguiente etapa es determinar qué restos, si los hubiera, de estos componentes deberían sustituirse para optimizar las propiedades del anticuerpo humanizado resultante. En general, debería minimizarse la sustitución de restos de aminoácidos humanos, con murinos, debido a que la introducción de restos murinos aumenta el riesgo de que el anticuerpo induzca una respuesta de anticuerpo antiratón humano (HAMA) en seres humanos. Pueden realizarse procedimientos reconocidos en la técnica para determinar respuesta inmune para supervisar una respuesta HAMA en un paciente particular o durante ensayos clínicos. Puede proporcionarse a pacientes tratados con anticuerpos humanizados una evaluación de inmunogenicidad al comienzo y durante la administración de dicha terapia. La respuesta HAMA se mide, por ejemplo, detectando anticuerpos para el reactivo terapéutico humanizado, en muestras de suero del paciente usando un procedimiento conocido por los expertos en la materia, incluyendo tecnología de resonancia de plasmón superficial (BIACORE) y/o análisis de ELISA de fase sólida.

Ciertos restos de aminoácidos de los restos marco de región variable humana se seleccionan para sustitución basándose en su posible influencia en la conformación de CDR y/o unión con antígeno. La yuxtaposición no natural de regiones CDR murinas con región marco variable humana puede dar como resultado restricciones conformacionales no naturales, que, a no ser que se corrijan por sustitución de ciertos restos de aminoácidos, pueden conducir a la pérdida de afinidad de unión.

En una realización, la selección de restos de aminoácidos para sustitución se determina, en parte, por realización de modelos informáticos. Se describe hardware y software informáticos en el presente documento para producir imágenes tridimensionales de moléculas de inmunoglobulina. En general, se producen modelos moleculares comenzando a partir de estructuras resueltas para cadenas de inmunoglobulina o dominios de las mismas. Las cadenas para modelar se comparan con respecto a similitud de secuencia de aminoácidos con cadenas o dominios de estructuras tridimensionales resueltas, y las cadenas o dominios que muestran la mayor similitud de secuencia se seleccionan como puntos de partida para la construcción de modelo molecular. Se seleccionan para realización de modelos cadenas o dominios que compartan al menos el 50% de identidad de secuencia y preferentemente se seleccionan para realización de modelos las que comparten al menos el 60%, el 70%, el 80%, el 90% de identidad de secuencia o más. Las estructuras de partida resueltas se modifican para permitir diferencias entre los aminoácidos reales en las cadenas de inmunoglobulina o dominios que se están modelando, y los de la estructura de partida. Las estructuras modificadas se ensamblan después en una inmunoglobulina compuesta. Finalmente, el modelo se refina por minimización de energía y verificando que todos los átomos están a distancias apropiadas entre sí y que las longitudes y ángulos de enlace están dentro de límites químicamente aceptables.

La selección de restos de aminoácidos para sustitución también puede determinase, en parte, examinando las características de los aminoácidos en localizaciones particulares, o por observación empírica de los efectos de la sustitución o mutagénesis de aminoácidos particulares. Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre un resto marco de región variable murina y un resto marco de región variable humana seleccionado, el aminoácido marco humano debería sustituirse habitualmente por el aminoácido marco equivalente del anticuerpo de ratón cuando se espera razonablemente que el aminoácido:

(1)

se una de forma no covalente directamente al antígeno,

(2)

esté adyacente a una región CDR,

(3)

interaccione de otro modo con una región CDR (por ejemplo, esté a una distancia de aproximadamente 3-6Å de una región CDR como se determina por realización de modelos informáticos), o

(4)

participe en la interfaz VL-VH.

Los restos que “se unen de forma no convalece directamente al antígeno” incluyen aminoácidos en posiciones de

5 regiones marco que tienen una buena probabilidad de interaccionar directamente con aminoácidos en el antígeno de acuerdo con fuerzas químicas establecidas, por ejemplo, mediante enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrófobas y similares.

Las regiones CDR y marco son como se definen por Kabat y col. o Chothia y col., mencionado anteriormente. Cuando los restos marco, como se definen por Kabat y col., mencionado anteriormente, constituyen restos de bucle

10 estructural como se define por Chothia y col., mencionado anteriormente, los aminoácidos presentes en el anticuerpo de ratón puede seleccionarse para sustitución en el anticuerpo humanizado.

Los restos que están “adyacentes a una región CDR” incluyen restos de aminoácidos en posiciones inmediatamente adyacentes a una o más de las CDR en la secuencia primaria de la cadena de inmunoglobulina humanizada, por ejemplo, en posiciones inmediatamente adyacentes a una CDR como se define por Kabat o una CDR como se

15 define por Chothia (véase por ejemplo, Chothia y Lesk JMB 196: 901 (1987)). Es particularmente probable que estos aminoácidos interaccionen con los aminoácidos en las CDR y, si se seleccionan del aceptor, distorsionen las CDR donadoras y reduzcan la afinidad. Además, los aminoácidos adyacentes pueden interaccionar directamente con el antígeno (Amit y col., Science, 233: 747 (1986)) y puede ser deseable la selección de estos aminoácidos del donador para mantener todos los contactos de antígeno que proporcionen afinidad en el anticuerpo original.

20 Los restos que “interaccionan de otro modo con una región CDR” incluyen los que se determina por análisis estructural secundario que están en una orientación espacial suficiente para afectar a una región CDR. En una realización, se identifican restos que “interaccionan de otro modo con una región CDR” analizando un modelo tridimensional de la inmunoglobulina donadora (por ejemplo, un modelo generado por ordenador). Un modelo tridimensional, típicamente del anticuerpo donador original, muestra que ciertos aminoácidos fuera de las CDR están

25 cerca de las CDR y tienen una buena probabilidad de interaccionar con aminoácidos en las CDR por enlace de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrófobas, etc. En esas posiciones de aminoácidos, puede seleccionarse el aminoácido de inmunoglobulina donadora en lugar del aminoácido de inmunoglobulina aceptora. Los aminoácidos de acuerdo con este criterio generalmente tendrán un átomo de cadena lateral a una distancia de 3 unidades Ángstrom (Å) de algún átomo de las CDR y deben contener un átomo que pueda interaccionar con los

30 átomos de CDR de acuerdo con fuerzas químicas establecidas, tales como las enumeradas anteriormente.

En el caso de átomos que puedan formar un enlace de hidrógeno, los 3 Å se miden entre sus núcleos, pero para los átomos que no forman un enlace, los 3 Å se miden entre sus superficies de Van der Waals. Por lo tanto, en el último caso, los núcleos deben estar a una distancia de aproximadamente 6 Å (3 Å más la suma de los radios de Van der Waals) para que los átomos se consideren capaces de interaccionar. En muchos casos los núcleos estarán de 4 o 5

35 a 6 Å de distancia. En la determinación de si un aminoácido puede interaccionar con las CDR, se prefiere no considerar los 8 últimos aminoácidos de CDR2 de cadena pesada como parte de las CDR, debido a que desde el punto de vista de la estructura, estos 8 aminoácidos se comportan más como parte del marco.

Los aminoácidos que son capaces de interaccionar con aminoácidos de las CDR, pueden identificarse de otra manera. El área de superficie accesible al disolvente de cada aminoácido marco se calcula de dos maneras: (1) en 40 el anticuerpo intacto, y (2) en una molécula hipotética que consiste en el anticuerpo con sus CDR retiradas. Una diferencia significativa entre estos números de aproximadamente 10 ángstrom cuadrados o más muestra que el acceso del aminoácido marco al disolvente está al menos parcialmente bloqueado por las CDR, y por lo tanto que el aminoácido está en contacto con las CDR. El área de superficie accesible al disolvente de un aminoácido puede calcularse basándose en un modelo tridimensional de un anticuerpo, usando algoritmos conocidos en la técnica (por

45 ejemplo, Connolly, J. Appl. Cryst. 16: 548 (1983) y Lee y Richards, J. Mol. Biol. 55: 379 (1971)). Los aminoácidos marco también pueden interaccionar ocasionalmente con las CDR indirectamente, afectando a la conformación de otro aminoácido marco que a su vez entra en contacto con las CDR.

Se sabe que los aminoácidos en varias posiciones en el marco, son importantes para determinar la conformación de CDR (por ejemplo, capaces de interaccionar con las CDR) en muchos anticuerpos (Chothia y Lesk, mencionado 50 anteriormente, Chothia y col., mencionado anteriormente y Tramontano y col., J. Mol. Biol. 215: 175 (1990)). Estos autores identificaron restos marco conservados importantes para la conformación de CDR por análisis de las estructuras de varios anticuerpos conocidos. Los anticuerpos analizados quedan en un número limitado de clases estructurales o “canónicas” basándose en la conformación de las CDR. Los restos marcos conservados dentro de miembros de una clase “canónica” se denominan restos “canónicos”. Los restos canónicos incluyen los restos 2, 25, 55 29, 30, 33, 48, 64, 71, 90, 94 y 95 de la cadena ligera y los restos 24, 26, 29, 34, 54, 55, 71 y 94 de la cadena pesada. Pueden identificarse restos adicionales (por ejemplo, restos determinantes de estructuras de CDR) de acuerdo con la metodología de Martin y Thorton (1996) J. Mol. Biol. 263: 800. De forma notable, se sabe que los aminoácidos en las posiciones 2, 48, 64 y 71 de la cadena ligera y 26-30, 71 y 94 de la cadena pesada (numeración de acuerdo con Kabat) son capaces de interaccionar con las CDR en muchos anticuerpos. También es probable que 60 los aminoácidos en las posiciones 35 en la cadena ligera y 93 y 103 en la cadena pesada interaccionen con las

CDR. Pueden identificarse restos adicionales que pueden efectuar la conformación de las CDR de acuerdo con la metodología de Foote y Winter (1992) J. Mol. Biol. 224: 487. Tales restos se denominan restos de “vernier” y son los restos de la región marco que subyacen cerca de (es decir, que forman una “plataforma” debajo de) las CDR. En todas estas posiciones numeradas, se prefiere la elección del aminoácido donador en lugar del aminoácido aceptor

5 (cuando difieren) para que esté en la inmunoglobulina humanizada. Por otro lado, ciertos restos capaces de interaccionar con la región CDR, tales como los primeros 5 aminoácidos de la cadena ligera, pueden en ocasiones seleccionarse a partir de la inmunoglobulina aceptora sin pérdida de afinidad en la inmunoglobulina humanizada.

Los restos que “participan en la interfaz VL-VH” o “restos de empaquetamiento” incluyen los restos en el interfaz entre VL y VH como se define, por ejemplo, en Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4592-66 (1986) o

10 Chothia y col. mencionado anteriormente. En general, deberían conservarse restos de empaquetamiento poco habituales en el anticuerpo humanizado si difieren de los de los marcos humanos.

En general, puede sustituirse uno o más de los aminoácidos que cumplen los criterios anteriores. En algunas realizaciones, todos o la mayoría de los aminoácidos que cumplen los criterios anteriores se sustituyen. Ocasionalmente, hay cierta ambigüedad acerca de si un aminoácido particular cumple los criterios anteriores, y se

15 producen inmunoglobulinas variantes alternativas, una de las cuales tiene esa sustitución particular, la otra de las cuales no. Las inmunoglobulinas variantes alternativas producidas de este modo pueden ensayarse en cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento con respecto a la actividad deseada, y seleccionarse la inmunoglobulina preferida.

Habitualmente las regiones de CDR en anticuerpos humanizados son sustancialmente idénticas y, más

20 habitualmente, idénticas a las regiones CDR correspondientes del anticuerpo donador. Sin embargo, en ciertas realizaciones, puede ser deseable modificar una o más regiones CDR para modificar la especificidad de unión a antígeno del anticuerpo y/o de reducir la inmunogenicidad del anticuerpo. Típicamente, uno o más restos de una CDR se alteran para modificar la unión para conseguir una tasa de asociación de la unión más favorecida, una tasa de disociación de la unión más favorecida, o ambas, de modo que se consiga una constante de unión idealizada.

25 Usando esta estrategia, puede conseguirse un anticuerpo que tenga afinidad de unión extremadamente alta de, por ejemplo, 1010 M-1 o más. Brevemente, la secuencia de CDR donadora se refiere a una secuencia de bases de la que se alteran después uno o más restos. Pueden usarse técnicas de maduración de afinidad, como se describe en el presente documento, para alterar la región o las regiones CDR seguido de exploración de las moléculas de unión resultantes para el cambio deseado de la unión. El procedimiento también puede usarse para alterar la CDR

30 donadora, típicamente una CDR de ratón, para que sea menos inmunogénica de modo que se minimice o se evite una respuesta de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) potencial. En consecuencia, a medida que se alteran la CDR o las CDR, pueden supervisarse los cambios de la afinidad de unión así como inmunogenicidad y puntuarse de modo que se consiga un anticuerpo optimizado para la mejor unión combinada y baja inmunogenicidad (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 6.656.467 y Patente de Estados Unidos Publicada US20020164326A1).

35 En otro enfoque, las regiones CDR del anticuerpo se analizan para determinar las contribuciones de cada CDR individual a la unión y/o inmunogenicidad del anticuerpo reemplazando sistemáticamente cada una de las CDR donadoras con un homólogo humano. El panel resultante de anticuerpos humanizados se puntúa después con respecto a afinidad de antígenos e inmunogenicidad potencial de cada CDR. De esta manera, se determinan las dos propiedades clínicamente importantes de una molécula de unión candidata, es decir, unión a antígeno y baja

40 inmunogenicidad. Si están disponibles sueros del paciente contra una forma del anticuerpo correspondiente murina

o con injertos de CDR (humanizada), entonces el panel completo de anticuerpos que representa los intercambios de CDR humanas sistemáticos puede explorarse para determinar la respuesta anti-idiotípica de los pacientes contra cada CDR donadora (para los detalles técnicos, véase, por ejemplo, Iwashi y col., Mol. Immunol. 36: 1079-91 (1999)). Dicho enfoque permite identificar regiones CDR donadoras esenciales a partir de CDR donadoras no 45 esenciales. Las regiones CDR donadoras no esenciales pueden después intercambiarse con una CDR homóloga humana. Cuando una región CDR esencial no pueda intercambiarse sin pérdida inaceptable de función, se realiza la identificación de los restos determinantes de especificidad (SDR) de la CDR, mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida. De esta manera, la CDR puede volver a modificarse por ingeniería genética para conservar solamente los SDR y ser humana y/o mínimamente inmunogénica en las posiciones de aminoácido restantes en toda la CDR.

50 Dicho enfoque, en el que solo se injerta una parte de la CDR donadora, también se denomina injerto de CDR abreviado (para detalles técnicos sobre las técnicas anteriores, véase, por ejemplo, Tamura y col., J. of Immunology 164(3): 1432-41. (2000); Gonzales y col., Mol. Immunol 40: 337-349 (2003); Kashmiri y col., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38: 3-16 (2001); y De Pascalis y col., J. of Immunology 169(6): 3076-84. (2002).

Además, es posible en ocasiones realizar una o más sustituciones de aminoácidos conservativas de restos de CDR

55 sin afectar de forma apreciable a la afinidad de unión de la inmunoglobulina humanizada resultante. Por sustituciones conservativas se entienden combinaciones tales como gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; y phe, tyr.

Son candidatos adicionales para la sustitución aminoácidos marco humanos aceptores que son “poco habituales” para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos pueden sustituirse con aminoácidos de la 60 posición equivalente del anticuerpo donador de ratón o de las posiciones equivalentes de inmunoglobulinas humanas más típicas. Por ejemplo, puede ser deseable la sustitución cuando el aminoácido en una región marco humana de la inmunoglobulina aceptora es poco habitual para esa posición y el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donadora es habitual para esa posición en secuencias de inmunoglobulina humanas; o cuando el aminoácido en la inmunoglobulina aceptora es poco habitual para esa posición y el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donadora también es poco habitual, en relación con otras secuencias humanas. También debería 5 considerarse si un resto es poco habitual para secuencias marco humanas aceptoras cuando se seleccionan restos para retromutación basándose en la contribución a la conformación de CDR. Por ejemplo, si la retromutación da como resultado sustitución de un resto que es poco habitual para secuencias marco humanas aceptoras, puede ensayarse un anticuerpo humanizado con y sin con respecto a actividad. Si la retromutación no es necesaria para la actividad, ésta puede eliminarse para reducir las preocupaciones sobre inmunogenicidad. Por ejemplo, la 10 retromutación en los siguientes restos puede introducir un resto que es poco habitual en las secuencias marco humanas aceptoras; vl= V2(2,0%), L3 (0,4%), T7 (1,8%), Q18 (0,2%), L83 (1,2%), I85 (2,9%), A100 (0,3%) y L106 (1,1%); y vh = T3 (2,0%), K5 (1,8%), I11 (0,2%), S23 (1,5%), F24 (1,5%), S41 (2,3%), K71 (2,4%), R75 (1,4%), I82 (1,4%), D83 (2,2%) y L109 (0,8%). Estos criterios ayudan a asegurar que un aminoácido atípico en el marco humano no altere la estructura del anticuerpo. Además, reemplazando un aminoácido aceptor humano poco habitual con un

15 aminoácido del anticuerpo donador que resulta ser típico de anticuerpos humanos, el anticuerpo humanizado puede hacerse menos inmunogénico.

La expresión “poco habitual”, como se usa en el presente documento, indica un aminoácido que aparece en esa posición en menos de aproximadamente el 20%, preferentemente menos de aproximadamente el 10%, más preferentemente menos de aproximadamente el 5%, aún más preferentemente menos de aproximadamente el 3%, 20 aún más preferentemente menos de aproximadamente el 2% y aún más preferentemente menos de aproximadamente el 1% de las secuencias en una muestra de secuencia representativa, y el término “habitual” como se usa en el presente documento, indica un aminoácido que aparece en más de aproximadamente el 25%, pero habitualmente más de aproximadamente el 50% de secuencias en una muestra representativa. Por ejemplo, cuando se decide si un aminoácido en una secuencia aceptora humana es “poco habitual” o “habitual”, con frecuencia será 25 preferible considerar solamente secuencias de región variable humanas y cuando se decida si un aminoácido de ratón es “poco habitual” o “habitual”, solo secuencias de región variable de ratón. Además, todas las secuencias de región variable de cadena ligera y pesada humanas se agrupan respectivamente en “subgrupos” de secuencias que son especialmente homólogas entre sí y tienen los mismos aminoácidos en ciertas posiciones críticas (Kabat y col., mencionada anteriormente). Cuando se decide si un aminoácido en una secuencia aceptora humana es “poco

30 habitual” o “habitual” entre secuencias humanas, será con frecuencia preferible considerar solamente las secuencias humanas en el mismo subgrupo que la secuencia aceptora.

Son candidatos adicionales para sustitución los aminoácidos marco humanos aceptores que se identificarían como parte de una región CDR con la definición alternativa propuesta por Chothia y col., mencionada anteriormente. Son candidatos adicionales para sustitución aminoácidos marco humanos aceptores que se identificarían como parte de

35 una región CDR con las definiciones de AbM y/o de contacto.

Son candidatos adicionales para la sustitución restos marco aceptores que se corresponden a un resto marco donador poco habitual. Son restos marco donadores poco habituales los que son poco habituales (como se definen en el presente documento) para anticuerpos murinos en esa posición. Para anticuerpos murinos, el subgrupo puede determinarse de acuerdo con Kabat e identificarse posiciones de restos que difieren del consenso. Estas diferencias

40 específicas de donador pueden apuntar a mutaciones somáticas en la secuencia murina que potencian la actividad. Se conservan restos poco habituales que se ha predicho que afectan a la unión (por ejemplo, restos de empaquetamiento canónicos y/o de vernier), mientras que los restos que se ha predicho que no son importantes para la unión pueden sustituirse.

Son candidatos adicionales para sustitución restos no de línea germinal que aparecen en una región marco

45 aceptora. Por ejemplo, cuando se alinea una cadena de anticuerpo aceptora (es decir, una cadena de anticuerpo humana que comparte identidad de secuencia significativas con la cadena de anticuerpo donadora) con una cadena de anticuerpo de línea germinal (que comparte de forma similar identidad de secuencia significativa con la cadena donadora), los restos no coincidentes entre el marco de cadena aceptora y el marco de cadena de línea germinal pueden sustituirse con restos correspondientes de la secuencia de línea germinal.

50 Además de las sustituciones de aminoácidos específicas analizadas anteriormente, las regiones marco de inmunoglobulinas humanizadas son habitualmente sustancialmente idénticas y, más habitualmente, idénticas a las regiones marco de los anticuerpos humanos de los que derivaron. Por supuesto, muchos de los aminoácidos en la región marco realizan poca o no realizan ninguna contribución directa a la especificidad o afinidad de un anticuerpo. Por lo tanto, muchas sustituciones conservativas individuales de los restos marco pueden tolerarse sin un cambio

55 apreciable de la especificidad o afinidad de la inmunoglobulina humanizada resultante. Por lo tanto, en una realización la región marco variable de la inmunoglobulina humanizada comparte al menos el 85% de identidad de secuencia con una secuencia de región marco variable humana o consenso de tales secuencias. En otra realización, la región marco variable de la inmunoglobulina humanizada comparte al menos el 90%, preferentemente el 95%, más preferentemente el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de identidad de secuencia con una secuencia de región

60 marco variable humana o consenso de tales secuencias. En general, sin embargo, tales sustituciones no son deseables.

Los anticuerpos humanizados preferentemente muestran una afinidad de unión específica por el antígeno de al

M-1 M-1

menos 107 M-1, 108 M-1, 109 o 1010 . Habitualmente el límite superior de la afinidad de unión de los anticuerpos humanizados por el antígeno está dentro de un factor de tres, cuatro o cinco de la de la inmunoglobulina donadora. Con frecuencia el límite inferior de la afinidad de unión también está dentro de un factor de tres, cuatro o 5 cinco de la de la inmunoglobulina donadora. Como alternativa, la afinidad de unión puede compararse con la de un anticuerpo humanizado que no tenga sustituciones (por ejemplo, un anticuerpo que tenga CDR donadoras y FR aceptoras, pero no sustituciones de FR). En tales casos, la unión de un anticuerpo optimizado (con sustituciones) es preferentemente de al menos dos a tres veces mayor, o de tres a cuatro veces mayor, que la del anticuerpo no sustituido. Para realizar comparaciones, puede determinarse la actividad de los diversos anticuerpos, por ejemplo,

10 por BIACORE (es decir, resonancia de plasmón superficial usando reactivos no marcados) o ensayos de unión competitiva.

En una realización, los anticuerpos humanizados de la invención incluyen una secuencia marco de región variable seleccionada de genes de anticuerpo humanos (por ejemplo, segmentos génicos de anticuerpo de línea germinal) que incluyen uno o más tipos de estructura de CDR canónica que son idénticos o similares a los tipos de estructura

15 CDR canónica para el anticuerpo no humano correspondiente (por ejemplo, murino) que se humaniza. Véase, Patente de Estados Unidos Nº 6.881.557 y Tan y col., Journal of Immunol1 69: 1119-1125 (2002).

También se presentan anticuerpos humanizados que comprenden una región marco que tiene una secuencia de aminoácidos consenso, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.300.064. La siguiente tabla enumera diversas secuencias consenso que pueden usarse como regiones marco en los anticuerpos

20 humanizados descritos en el presente documento. Por lo tanto, puede usarse una cualquiera de las secuencias consenso mostradas a continuación en combinación con una o más CDR descritas en el presente documento, dando como resultado de este modo una inmunoglobulina humanizada o anticuerpo humanizado de la invención.

Secuencias consenso pararegiones marco de cadena ligera

Secuencia de aminoácidos

Cadena Kappa

(SEC ID Nº: 14)

Cadena Kappa

15) (SEC ID Nº:

Cadena Kappa

(SEC ID Nº: 16)

Cadena Kappa

(SEC ID Nº: 17)

Cadena Lambda

(SEC ID Nº: 18)

Cadena Lambda

(SEC ID Nº: 19)

Cadena Lambda

(SEC ID Nº: 20)

(continuación)

Secuencias consenso pararegiones marco de cadena pesada

Secuencia de aminoácidos

Cadena pesada

(SEC ID Nº: 21)

Cadena pesada

(SEC ID Nº: 22)

Cadena pesada

(SEC ID Nº: 23)

Cadena pesada

(SEC ID Nº: 24)

Cadena pesada

(SEC ID Nº: 25)

Cadena pesada

(SEC ID Nº: 26)

Cadena pesada

(SEC ID Nº: 27)

Otra estrategia más que puede usarse para producir los anticuerpos humanizados de la invención es seleccionar la secuencia de línea germinal humana más cercana como el marco que recibe las CDR de un anticuerpo murino para inmunizar. Véase, Mercken y col., documento US 2005/0129695. Las secuencias de línea germinal se originan de 5 genes de inmunoglobulina no reordenados y por lo tanto no presentan hipermutación somática que es potencialmente inmunogénica. Este enfoque se basa en la búsqueda de la secuencia de línea germinal humana más cercana. En particular, pueden identificarse dominios variables de secuencias de línea germinal que muestran un alto grado de identidad de secuencia con las regiones marco VL y VH murinas usando las bases de datos V-Base y/o IMGT (accesibles públicamente a través del servidor de Internet del Centro del Consejo de Investigación Médica

10 para Ingeniería Proteica y el servidor de Internet del Instituto Europeo de Bioinformática, respectivamente). Las CDR murinas se injertan después en las secuencias aceptoras de región variable de línea germinal seleccionadas.

Adicionalmente, pueden analizarse restos marco usando cualquiera de las técnicas descritas anteriormente para determinar qué restos, si los hubiera, deberían sustituirse para optimizar las propiedades del anticuerpo humanizado resultante. Por ejemplo, puede usarse la realización de modelos informáticos para identificar restos que tengan

15 buena probabilidad de influir directa o indirectamente en la unión a antígeno.

Pueden usarse las siguientes secuencias aceptoras marco de línea germinal de cadena pesada humana.

Xaa31-Xaa40 = restos de CDR1 1-10; Xaa41-Xaa42 = restos de CDR1 11 a 12, si están presentes

Xaa57-Xaa62 = restos de CDR2 1-6; Xaa63-Xaa75 = restos de CDR2 7 a19, si están presentes

Xaa108-Xaa110= restos de CDR3 1-3; Xaa111-Xaa132= restos de CDR3 4 a 25, si están presentes Xaa31-Xaa40= restos de CDR1 1-10; Xaa41-Xaa42 = restos de CDR1 11 a 12, si están presentes

Xaa57-Xaa62 = restos de CDR2 1-6; Xaa63-Xaa75 = restos de CDR2 7 a 19, si están presentes

Xaa108-Xaa110= restos de CDR3 1-3; Xaa111-Xaa132= restos de CDR3 4 a 25, si están presentes Se pueden usar las siguientes secuencias aceptoras marco de línea germinal de cadena ligera humana.

Xaa24-Xaa33 = restos de CDR1 1-10; Xaa34-Xaa35 = restos de CDR1 11 a 12, si están presentes

Xaa51-Xaa56 = restos de CDR2 1-6; Xaa57-Xaa69= restos de CDR2 7 a 19, si están presentes

10 Xaa102-Xaa104= restos de CDR3 1-3; Xaa105-Xaa126 = restos de CDR3 4 a 25, si están presentes

La siguiente tabla enumera las CDR de los anticuerpos de la invención que pueden injertarse en secuencias marco aceptoras de línea germinal humana

Anticuerpo

CDRL1 CDRL2 CDRL3

15C11

RSSQSLVHSDGNTYLH KVSNRFS SQSTHVWT

Anticuerpo

CDRL1 CDRL2 CDRL3

15C11

GFTFSRYSMS KISNSGDNTYYPDTLKG GDY

Estas CDR de cadena ligera son los aminoácidos 24-39, 55-61 y 94-101 de SEC ID Nº 2. Las CDR de cadena pesada son los aminoácidos 26-35, 50-66 y 99-101 de SEC ID Nº 4.

En realizaciones adicionales, los restos marco pueden analizarse usando cualquiera de las técnicas como se han descrito anteriormente para determinar qué restos, si los hubiera, deberían sustituirse para optimizar las propiedades 5 del anticuerpo humanizado resultante. Por ejemplo, puede usarse realización de modelos por ordenador para identificar restos que tengan una buena probabilidad de influir directa o indirectamente en la unión de antígenos.

Se describen técnicas de humanización ejemplares adicionales que pueden usarse para humanizar las inmunoglobulinas de la invención en, por ejemplo, Presta y col., J. Immunol., 151: 2623-2632 (1993); Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89: 4285-4289 (1992); Couto y col., Cancer Res., 55: 5973s-77s (1995); O’Conner y

10 col., Protein Eng., 11: 321-328 (1998); y Antibody Engineering-Methods and Protocols de Lo, Vol. 248 (2004).

c. Producción de anticuerpos 15C11 humanizados

Una realización preferida de la presente invención presenta un anticuerpo humanizado para la parte central de A∀, en particular, para su uso en las metodologías terapéuticas y/o de diagnóstico descritas en el presente documento. El material de partida para producción de anticuerpos humanizados es 15C11. 15C11 es específico para la parte

15 central de A∀, por ejemplo, la parte entre el extremo N terminal y el C terminal (por ejemplo, dentro de A∀ 13-28) y se ha mostrado que (1) se une específicamente a A∀ 1-42 (por ejemplo, oligómero de A∀), (2) captura A∀ soluble y (3) mejora la cognición en un paciente. La eficacia in vivo del anticuerpo 15C11 se describe en el Ejemplo 1. La clonación y secuenciación de ADNc que codifica las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo 15C11 se describe en el Ejemplo III.

20 Se identifican secuencias de anticuerpo aceptor humano adecuadas por comparaciones por ordenador de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de ratón con las secuencias de anticuerpos humanos conocidos. La comparación se realiza por separado para cadenas pesadas y ligeras pero los principios son similares entre sí. En particular, los dominios variables de anticuerpos humanos cuyas secuencias marco muestran un alto grado de identidad de secuencia con las regiones marco VL y VH murinas se identificaron por consulta de la Base

25 de Datos de Kabat usando NCBI BLAST (accesible públicamente a través del servidor del Internet de NCBI de los Institutos Nacionales de Salud) con las secuencias marco murinas respectivas. En una realización, se seleccionan secuencias aceptoras que comparten más del 50% de identidad de secuencia con secuencias donadores murinas. Preferentemente, se seleccionen secuencias de anticuerpo aceptoras que comparten 60%, 70%, 80%, 90% o más.

En una realización, la elección del marco aceptor es del mismo subgrupo humano que el que corresponde a la

30 región V murina, no tiene restos marco poco comunes, y en las que las CDR pertenecen a los mismos grupos de estructura canónica de Chothia. Por ejemplo, CDR L1 de 15C11 pertenece a la clase equivalente de Chothia 4, CDR L2 pertenece a la clase 1, CDR L3 es similar a la clase 3, CDR H1 es similar a la clase 1 y CDR H2 es similar a la clase 3.

Puede usarse una comparación por ordenador de cadenas pesadas y ligeras de 15C11 para identificar cadenas

35 pesadas y ligeras humanas que tengan un alto grado de identidad de secuencia. Pueden derivarse regiones marco humanas ligeras y pesadas de tales anticuerpos humanos, o a partir de secuencias consenso de tales anticuerpos.

A continuación se seleccionan restos para sustitución como sigue. Cuando un aminoácido difiere entre una región marco variable de 15C11 y una región marco variable humana equivalente, el aminoácido marco humano debería habitualmente sustituirse por el aminoácido de ratón equivalente si se espera razonablemente que el aminoácido:

40 (1) se una de forma no covalente directamente al antígeno,

(2)

esté adyacente a una región CDR, sea parte de una región CDR según la definición alternativa propuesta por Chothia y col., mencionada anteriormente, o interaccione de otro modo con una región CDR (por ejemplo,esté a una distancia de aproximadamente 3Å de una región CDR), o

(3)

participe en la interfaz VL-VH.

45 Se realiza un modelo informático de las regiones variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo 15C11 como sigue. Brevemente, se genera un modelo tridimensional basándose en las estructuras de anticuerpo murino resueltas más cercanas para las cadenas pesadas y ligera. El modelo se ajusta adicionalmente mediante una serie de etapas de minimización de energía para disipar contactos atómicos desfavorables y optimizar las interacciones electroestáticas y de van der Walls.

50 La información estructural tridimensional para los anticuerpos descritos en el presente documento está públicamente disponible, por ejemplo, del Banco de Datos de Proteínas (PDB) del Colaboratorio de Investigación para Bioinformática Estructural. El PDB está libremente accesible a través de Internet y se describe en Berman y col. (2000) Nucleic Acids Research, 28: 235. La realización de modelos informáticos permite la identificación de restos que interaccionan con CDR. El modelo informático de la estructura de 15C11 puede a su vez actuar como un punto

55 de partida para predecir la estructura tridimensional de un anticuerpo que contiene las regiones determinantes de complementariedad de 15C11 sustituidas en estructuras marco humanas. Pueden construirse modelos adicionales que representan la estructura a medida que se introducen sustituciones de aminoácidos adicionales.

En general, es deseable la sustitución de uno, la mayoría o todos los aminoácidos que cumplen los criterios anteriores. En consecuencia, los anticuerpos humanizados de la presente invención contendrán habitualmente una sustitución de un resto marco de cadena ligera humana con un resto de 15C11 correspondiente en al menos 1, 2, 3

o más de las posiciones seleccionadas. Los anticuerpos humanizados también contienen habitualmente una sustitución de un resto marco de cadena pesada humana con un resto 15C11 correspondiente en al menos 1, 2, 3 o más de las posiciones seleccionadas.

Ocasionalmente, sin embargo, existe cierta ambigüedad acerca de si un aminoácido particular cumple los criterios anteriores y se producen inmunoglobulinas variantes alternativas, una de las cuales tiene esa sustitución particular, la otra de las cuales no. En casos en los que la sustitución con un resto murino introduciría un resto que es poco habitual en inmunoglobulinas humanas en una posición particular, puede ser deseable ensayar el anticuerpo con respecto a actividad con o sin la sustitución particular. Si la actividad (por ejemplo, afinidad de unión y/o especificidad de unión) es aproximadamente la misma con o sin la sustitución, el anticuerpo sin sustitución puede preferirse, ya que se esperaría que indujera menos de una respuesta HAMA, como se describe en el presente documento.

Otros candidatos para sustitución son aminoácidos marco humanos aceptores que son poco comunes para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos pueden sustituirse con aminoácidos de la posición equivalente de inmunoglobulinas humanas más típicas. Como alternativa, pueden introducirse aminoácidos de posiciones equivalentes en el 15C11 de ratón en las regiones marco humanas cuando tales aminoácidos sean típicos de inmunoglobulina humana en las posiciones equivalentes.

Otros candidatos para sustitución son restos no de línea germinal que aparecen en una región marco. Realizando una comparación por ordenador de 15C11 con secuencias de línea germinal conocidas, pueden identificarse secuencias de línea germinal con el mayor grado de identidad de secuencia con la cadena pesada o ligera. El alineamiento de la región marco y la secuencia de línea germinal final revelará qué restos pueden seleccionarse para sustitución con restos de línea germinal correspondientes. Los restos no coincidentes entre un marco aceptor de cadena ligera seleccionado y una de estas secuencias de línea germinal podría seleccionarse para sustitución con el resto de línea germinal correspondiente.

Se identifican restos de ratón poco habituales comparándolas la secuencias VL y/o VH donadoras con la secuencias de otros miembros del subgrupo al que pertenecen las secuencias VL y/o VH donadoras (de acuerdo con Kabat) e identificando las posiciones de los restos que difieren del consenso. Estas diferencias específicas de donadores pueden apuntar a mutaciones somáticas que potencian la actividad. Los restos poco comunes o poco habituales cerca del sitio de unión pueden posiblemente entrar en contacto con el antígeno, haciendo deseable conservar el resto de ratón. Sin embargo, si el resto de ratón poco común no es importante para la unión, se prefiere el uso del resto aceptor correspondiente ya que el resto de ratón puede crear neoepítopos inmunogénicos en el anticuerpo humanizado. En la situación en la que un resto poco común en la secuencia donadora sea de hecho un resto habitual en la secuencia aceptora correspondiente, el resto preferido es claramente el resto aceptor.

Están públicamente disponibles secuencias de ID de Kabat referidas en el presente documento, por ejemplo, de la Bases de Datos de Kabat de Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad Northwestern. Está públicamente disponible información estructural tridimensional para anticuerpos descritos en el presente documento, por ejemplo, del Banco de Datos de Proteínas del Colaboratorio de Investigación para Bioinformática Estructural (PDB). El PDB es libremente accesible a través de Internet y se describe en Berman y col. (2000) Nucleic Acids Research, pág. 235-242. Están públicamente disponibles secuencias genéticas de línea germinal referidas en el presente documento, por ejemplo, de la Base de Datos de Secuencias del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) en colecciones de genes Igh, Ig kappa e Ig lambda de línea germinal V (como una división de la Biblioteca Nacional de Medicina (NLM) en los Institutos Nacionales de Salud (NIH)). Se proporciona búsqueda de homología de la base de datos de NCBI “Genes de Línea germinal Ig” por IgG BLAST™.

En una realización preferida, un anticuerpo humanizado de la presente invención contiene (i) una cadena ligera que comprende un dominio variable que comprende CDR VL de 15C11 murino y un marco aceptor humano, teniendo el marco cero, uno o más restos sustituidos con el resto de 15C11 correspondiente y (ii) una cadena pesada que comprende CDR VH de 15C11 y un marco aceptor humano, teniendo el marco al menos uno, preferentemente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más restos sustituidos con el resto de 15C11 correspondiente y, opcionalmente, al menos uno, preferentemente dos o tres restos sustituidos con un resto de línea germinal humana correspondiente.

En otra realización preferida, un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene elementos estructurales, como se describe en el presente documento, y además tiene al menos una (preferentemente dos, tres, cuatro o todas) de las actividades siguientes: (1) se une a A∀ soluble; (2) se une a A∀ 1-42 agregado (por ejemplo, como se determina por ELISA); (3) captura A∀ soluble; (4) se une a A∀ en placas (por ejemplo, tinción de placas de AD y/o PDAPP); (5) se une a A∀ con una afinidad de al menos dos a tres veces menor que 15C11 quimérico (por ejemplo, 15C11 que tiene secuencias de región variable murinas y secuencias de región constante humanas); (6) media en la fagocitosis de A∀ (por ejemplo, en un ensayo de fagocitosis ex vivo, como se describe en el presente documento); y

(7)

cruza la barrera hematoencefálica (por ejemplo, demuestra localización en cerebro a corto plazo, por ejemplo, en un modelo animal de PDAPP, como se describe en el presente documento).

En otra realización preferida, un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene elementos estructurales, como se describe en el presente documento, de modo que se une a A∀ de una manera o con una afinidad suficiente para inducir al menos uno de los siguientes efectos in vivo: (1) reduce la carga de placas A∀; (2) evita la formación de placas; (3) reduce los niveles de A∀ soluble; (4) reduce la patología neurítica asociada con un trastorno amiloidogénico; (5) disminuye o alivia al menos un síntoma fisiológico asociado con un trastorno amiloidogénico; y/o

(6)

mejora la función cognitiva, por ejemplo, mejora rápidamente la cognición sin cruzar la barrera hematoencefálica.

En otra realización preferida, un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene elementos estructurales como se describe en el presente documento, y específicamente se une a un epítopo dentro de los restos 13-28 de A∀, por ejemplo que comprende los restos 19-22 de A∀.

Las actividades descritas anteriormente pueden determinarse utilizando uno cualquiera de una diversidad de ensayos descritos en el presente documento o en la técnica (por ejemplo, ensayos de unión, ensayos de fagocitosis, etc.). Las actividades pueden ensayarse in vivo (por ejemplo, usando componentes de ensayo marcados y/o técnicas de captura de imágenes) o in vitro (por ejemplo, usando muestras o muestras de ensayo derivadas de un paciente). Las actividades pueden ensayarse directa o indirectamente. En ciertas realizaciones preferidas, se ensayan criterios de valoración neurológicos (por ejemplo, carga amiloide, carga neurítica, etc.). Tales criterios de valoración pueden ensayarse en sujetos vivos (por ejemplo, en modelos animales de enfermedad de Alzheimer o en sujetos humanos, por ejemplo, que se están sometiendo a inmunoterapia) usando metodologías de detección no invasivas. Como alternativa, tales criterios de valoración pueden ensayarse en sujetos post mórtem. El ensayo de tales criterios de valoración en modelos animales y/o en sujetos humanos post mórtem es útil para evaluar la eficacia de diversos agentes (por ejemplo, anticuerpos humanizados) para utilizar en aplicaciones inmunoterapéuticas similares. En otras realizaciones preferidas, los parámetros conductuales o neurológicos pueden evaluarse como indicadores de los criterios de valoración o actividades neuropatológicas anteriores.

3. Producción de regiones variables.

Habiendo seleccionado conceptualmente los componentes CDR y marco de inmunoglobulinas humanizadas, está disponible una diversidad de procedimientos para producir tales inmunoglobulinas. En general, una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) murinas de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo pueden humanizarse, por ejemplo, situarse en el contexto de una o más regiones marco humanas, usando reacción en cadena de la polimerasa basada en cebador (PCR). Brevemente, se diseñan cebadores que son capaces de hibridar con región o regiones CDR murinas diana que también contienen secuencia que solapa y puede hibridar con una región marco humana. En consecuencia, en condiciones apropiadas, los cebadores pueden amplificar una CDR murina a partir de un ácido nucleico molde de anticuerpo murino y añadir al molde amplificado una parte de una secuencia marco humana. De forma similar, pueden diseñarse cebadores que son capaces de hibridar con una región o regiones marco humanas diana en las que una reacción de CDR usando estos cebadores da como resultado una región o regiones marco humanas amplificadas. Cuando cada producto de amplificación después se desnaturaliza, combina e hibrida con el otro producto, la región CDR murina, que tiene secuencia marco humana solapante con la secuencia marco humana amplificada, pueden ligarse genéticamente. En consecuencia, en una o más de tales reacciones, una o más regiones CDR murinas pueden ligarse genéticamente con regiones marco humanas intermedias.

En algunas realizaciones, los cebadores también pueden comprender secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción deseables para facilitar la modificación por ingeniería genética de las secuencias amplificadas por PCR resultantes en un segmento genético mayor, por ejemplo, un segmento de cadena ligera o pesada variable, cadena pesada o vector. Además, los cebadores usados para amplificar las regiones CDR murinas o regiones marco humanas pueden tener emparejamientos erróneos deseables de modo que se introduzca un codón diferente en la CDR murina o región marco humana. Los emparejamientos erróneos típicos introducen alteraciones en las regiones marco humanas que conservan o mejoran la orientación estructural de la CDR murina y por lo tanto su afinidad de unión, como se describe en el presente documento.

Debería entenderse que el enfoque anterior puede usarse para introducir una, dos o las tres regiones CDR murinas en el contexto de regiones marco humanas intermedias. Se describen procedimientos para amplificar y ligar diferentes secuencias usando PCR basada en cebador en, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); DNA Cloning, Vols. 1 y 2, (D.N. Glover, Ed. 1985); PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, Ed. John Wiley & Sons (1999) (Editor); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y col., John Wiley & Sons (1992).

Debido a la degeneración del código, una diversidad de secuencias de ácido nucleico codificará cada secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina. Las secuencias de ácido nucleico deseadas pueden producirse por síntesis de ADN en fase sólida de novo o por mutagénesis por PCR de una variante previamente preparada del polinucleótido deseado. La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es un procedimiento preferido para preparar variantes de sustitución, deleción e inserción de ADN del polipéptido diana. Véase, Adelman y col., DNA 2: 183 (1983).

Brevemente, el ADN del polipéptido diana se altera hibridando un oligonucleótido que codifica la mutación deseada con un molde de ADN monocatenario. Después de la hibridación, se usa una ADN polimerasa para sintetizar una segunda hebra complementaria completa del molde que incorpore el cebador oligonucleotídico, y codifique la alteración seleccionada en el ADN del polipéptido diana.

4. Selección de regiones constantes

Los segmentos variables de anticuerpos producidos como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, las regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos quiméricos o humanizados) se ligan típicamente al menos a una parte de una región constante de inmunoglobulina (región Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Las secuencias de ADN de región constante humana pueden aislarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos a partir de una diversidad de células humanas, pero preferentemente linfocitos B inmortalizados (véase, Kabat y col., mencionado anteriormente y Liu y col., documento WO97/02671). Habitualmente, el anticuerpo contendrá regiones constantes tanto de cadena ligera como de cadena pesada. La región constante de cadena pesada habitualmente incluye regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4. Los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen anticuerpos que tienen todos los tipos de regiones constantes, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE y cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Cuando se desea que el anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo humanizado) muestre actividad citotóxica, el dominio constante habitualmente es un dominio constante de fijación de complemento y la clase es típicamente IgG1. Cuando se desea que el anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo humanizado) muestre actividad citotóxica reducida, el dominio constante y la clase es típicamente IgG4. Los isotipos humanos ejemplares incluyen IgG1 e IgG4. Las regiones constantes de cadena ligera pueden ser lambda o kappa. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo. Los anticuerpos pueden expresarse como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv o como anticuerpos de cadena sencilla en los que los dominios variables de cadena pesada y ligera están unidos a través de un espaciador.

En una realización, un anticuerpo humanizado de la invención incluye la región VH de 15C11 ligada a una región constante de IgG1. En otra realización, un anticuerpo humanizado de la invención incluye la región VH de 15C11 unida a una región constante de IgG4.

En una realización, un anticuerpo humanizado de la invención incluye una región VH de 15C11 humanizada unida a una región constante de IgG1, codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 28. En otra realización, un anticuerpo humanizado incluye una región de 15C11 humanizada unida con una región constante de IgG1, como se muestra posteriormente en SEC ID Nº: 29. En otra realización, un anticuerpo humanizado de la invención incluye una región de 15C11 humanizada unida a una región constante de IgG1, como se muestra posteriormente en SEC ID Nº: 32.

En una realización, un anticuerpo humanizado de la invención incluye una región VL de 15C11 humanizada unida a una región constante de IgG1, codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 30. En otra realización, un anticuerpo humanizado de la invención incluye una región VH de 15C11 humanizada unida a una región constante de IgG1, como se muestra posteriormente en SEC ID Nº: 31.

En otra realización, un anticuerpo humanizado de la invención incluye una región VH de 15C11 humanizada unida a una región constante de IgG4, como se muestra posteriormente en SEC ID Nº: 33.

En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento se modifican para potenciar su actividad de citotoxicidad celular dependiente de antígenos (ADCC) usando técnicas, tales como, por ejemplo, las descritas en la Patente de Estados Unidos Nº 6.946.292. Se cree en general que la actividad ADCC de anticuerpos requiere la unión de la región Fc de un anticuerpo con un receptor de anticuerpo existente en la superficie de una célula efectora, tal como, por ejemplo, una célula citolítica, una célula citolítica natural y un macrófago activado. Alterando la fucosilación (por ejemplo, reduciéndola o eliminándola) de la estructura de carbohidratos de un anticuerpo humanizado (es decir, en la región Fc), la actividad ADCC del anticuerpo puede potenciarse in vitro en, por ejemplo, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces, en relación con un anticuerpo humanizado no modificado. Debido al aumento de la actividad ADCC, tales anticuerpos modificados pueden usarse a dosificaciones menores que sus homólogos no modificados y generalmente tienen menos efectos secundarios o reducidos en pacientes.

En algunas realizaciones, se presentan versiones aglicosiladas de anticuerpos humanizados, en las que tales anticuerpos incluyen una región constante aglicosilada. El oligosacárido en Asn-297 es un elemento característico de anticuerpos IgG humanos normales (véase, Kabat y col., 1987, Sequence of Proteins of Immunological Interest,

U.S. Department of Health Human Services Publication). Cada una de las dos cadenas pesadas en moléculas IgG tienen un grupo carbohidrato de cadena ramificada sencilla que está ligado a un grupo amida del resto de asparagina, por ejemplo, en la posición 297. La sustitución de, por ejemplo, asparagina con alanina evita la glicosilación del anticuerpo, como se describe en, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.706.265. En una realización particular, el resto de aminoácido Asn en la posición 297 se muta a alanina.

5. Expresión de anticuerpos recombinantes

Los anticuerpos quiméricos y humanizados se producen típicamente por expresión recombinante. Los ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadena ligera y pesada, opcionalmente ligados a regiones constantes, se insertan en vectores de expresión. Las cadenas ligera y pesada pueden clonarse en el mismo o diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ADN que codifican cadenas de inmunoglobulina están unidos operativamente a secuencias de control en el vector o los vectores de expresión que aseguran la expresión de polipéptidos de inmunoglobulinas. Las secuencias de control de la expresión incluyen, pero sin limitación, promotores (por ejemplo, promotores heterólogos o asociados de forma natural), secuencias señal, elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción. Preferentemente, las secuencias de control de la expresión son sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas (por ejemplo, células COS o CHO). Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos, y la recogida y purificación de los anticuerpos de reacción cruzada.

Estos vectores de expresión típicamente pueden replicarse en los organismos huésped como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico del huésped. Habitualmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a kanamicina o resistencia a neomicina) para permitir la detección de las células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase, por ejemplo, Itakura y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.704.362).

E. coli es un huésped procariota particularmente útil para clonar los polinucleótidos (por ejemplo, secuencias de ADN) de la presente invención. Otros huéspedes microbacterianos adecuados para su uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis y otras enterobacterias, tales como Salmonella, Serratia y diversas especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procariotas, también se pueden realizar vectores de expresión, que típicamente contendrán secuencias de control de la expresión compatibles con la célula huésped (por ejemplo, un origen de replicación). Además, estará presente cualquier número de una diversidad de promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de betalactamasa o un sistema promotor de fago lambda. Los promotores típicamente controlarán la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora y tienen secuencias de sitios de unión de ribosomas y similares, para iniciar y completar la transcripción y traducción.

Otros microbios, tales como levadura, también son útiles para expresión. Saccharomyces es un huésped de levadura preferido, teniendo los vectores adecuados secuencias de control de la expresión (por ejemplo, promotores), un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee. Los promotores típicos incluyen 3-fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glicolíticas. Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.

Además de los microorganismos, también puede usarse cultivo de células tisulares de mamífero para expresar y producir los polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, polinucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas). Véase Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Se prefieren de hecho células eucariotas, debido a que se han desarrollado en la técnica varias líneas celulares huésped adecuadas capaces de secretar proteínas heterólogas, (por ejemplo, inmunoglobulinas intactas) e incluyen líneas celulares CHO, diversas líneas celulares COS, células HeLa, preferentemente, líneas celulares de mieloma, o linfocitos B transformados o hibridomas. Preferentemente, las células no son humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador (Queen y col., Immunol. Rev. 89: 49 (1986)), y sitios de procesamiento de la información necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Son secuencias de control de la expresión preferidas promotores derivados de genes de inmunoglobulina, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino, citomegalovirus y similares. Véase Co y col., J. Immunol. 148: 1149 (1992).

Como alternativa, pueden incorporarse secuencias que codifican anticuerpos en transgenes para su introducción en el genoma de un animal transgénico y expresión posterior en la leche del animal transgénico (véase, por ejemplo, Deboer y col., documento US 5.741.957, Rosen, documento US 5.304.489, y Meade y col., documento US 5.849.992). Los transgenes adecuados incluyen secuencias codificantes para cadenas ligeras y/o pesadas en unión operativa con un promotor y potenciador de un gen específico de glándula mamaria, tal como caseína o beta lactoglobulina.

Los vectores que contienen las secuencias polinucleotídicas de interés (por ejemplo, las secuencias que codifican cadena pesada y ligera y secuencias de control de la expresión) pueden transferirse a la célula huésped por procedimientos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, se utiliza habitualmente transfección de cloruro cálcico para células procariotas, mientras que puede usarse tratamiento de fosfato cálcico, electroporación, lipofección, biolística o transfección basada en virus para otros huéspedes celulares. (Véase en general Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2ª ed., 1989)). Otros procedimientos usados para transformar células de mamífero incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplastos, liposomas, electroporación y microinyección (véase, en general Sambrook y col, mencionado anteriormente). Para producción de animales transgénicos, los transgenes pueden microinyectarse en oocitos fertilizados, o pueden incorporarse en el genoma de células madre embrionarias, y transferirse los núcleos de tales células a oocitos enucleados.

5 Cuando se clonan cadenas pesadas y ligeras en vectores de expresión separados, los vectores se co-transfectan para obtener expresión y ensamblaje de inmunoglobulinas intactas. Una vez expresados, los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligeras y pesadas individuales u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención pueden purificarse de acuerdo con procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, purificación de HPLC, electroforesis en gel y similares

10 (véase en general Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Se prefieren inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad y se prefiere más de 98 a 99% o más homogeneidad, para usos farmacéuticos.

6. Fragmentos de anticuerpo

También se contemplan dentro del alcance de la presente invención fragmentos de anticuerpo. En una realización,

15 se proporcionan fragmentos de anticuerpos no humanos y/o quiméricos. En otra realización, se proporcionan fragmentos de anticuerpos humanizados. Típicamente, estos fragmentos muestran unión específica con antígeno con una afinidad de al menos 107, y más típicamente 108 o109 M-1. Los fragmentos de anticuerpo humanizados incluyen cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fabc y Fv. Se producen fragmentos por técnicas de ADN recombinante o por separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.

20 En algunas realizaciones, la semivida generalmente corta de fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab o Fab’) se extiende por pegilación. Esto se consigue generalmente por fusión con polietilenglicol (PEG), como describe en, por ejemplo, Leong, y col. Cytokine 16, 106-119 (2001). La pegilación tiene la ventaja añadida de eliminar la función mediada por receptor de Fc, cuando se desee, y/o reducir la inmunogenicidad. En realizaciones ejemplares, se unen covalentemente moléculas de PEG de 2-20 kDa, por ejemplo, a una región bisagra de cadena pesada de anticuerpo

25 mediante un K-engarce-C (véase, por ejemplo, Choy y col., Rheumatol. 41: 1133-1137 (2002)).

7. Mapeo epitópico

Puede realizarse un mapeo epitópico para determinar qué determinante antigénico o epítopo de A∀ se reconoce por el anticuerpo. En una realización, se realiza mapeo epitópico de acuerdo con análisis de NET de Reemplazo (rNET). En ensayo de mapa epitópico de rNET proporciona información acerca de la contribución de restos individuales 30 dentro del epítopo a la actividad de unión global del anticuerpo. El análisis de rNET usa análogos peptídicos sustituidos únicos sistemáticos sintetizados. La unión de un anticuerpo que se ensaya se determina frente a péptido nativo (antígeno nativo) y frente a 19 péptidos alternativos “de sustitución única”, sustituyéndose cada péptido en una primera posición con uno de 19 aminoácidos no nativos para esa posición. Se genera un perfil que refleja el efecto de sustitución en esa posición con los diversos restos no nativos. Se generan de forma similar perfiles en

35 posiciones sucesivas a lo largo del péptido antigénico. El perfil combinado, o mapa epitópico, (que refleja la sustitución en cada posición con los 19 restos no nativos) puede después compararse con un mapa generado de forma similar para un segundo anticuerpo. Los mapas sustancialmente similares o idénticos indican que los anticuerpos que se comparan tienen la misma especificidad de epítopos o similar.

8. Ensayos de anticuerpos con respecto a eficacia terapéutica (por ejemplo, actividad de eliminación de placas) en 40 modelos animales

Se inyectaron 0,5 mg en PBS de anticuerpos policlonales anti-A∀ o específicos anti-A∀ monoclonales, humanizados

o quiméricos a cada uno de grupos de ratones PDAPP de 7-9 meses de edad. Todas las preparaciones de anticuerpos se purificaron para tener niveles de endotoxina bajos. Los monoclonales se pueden preparar contra un fragmento inyectando el fragmento o forma más larga de A∀ en un ratón, preparando hibridomas y explorando los

45 hibridomas con respecto a un anticuerpo que se une específicamente a un fragmento deseado de A∀ sin unirse a otros fragmentos no solapantes de A∀. Se preparan anticuerpos humanizados y/o quiméricos como se describe en el presente documento.

Se inyecta a los ratones por vía intraperitoneal según se necesite durante un periodo de 4 meses para mantener una concentración de anticuerpos en circulación medida por título de ELISA de más de 1/1000 definido por ELISA para

50 A∀42 u otro inmunógeno. Los títulos se supervisan y los ratones se sacrifican al final de 6 meses de inyecciones. Se realiza histoquímica, niveles de A∀ y toxicología post mórtem. Se usan diez ratones por grupo.

9. Ensayos de anticuerpos con respecto a unión con A∀ oligomérico soluble

La divulgación también proporciona procedimientos para ensayar la capacidad de un anticuerpo para unirse a A∀ soluble, oligomérico, en un ensayo bioquímico. El ensayo bioquímico se basa, al menos en parte, en una 55 comparación de la unión de un anticuerpo con una o más formas de A∀ soluble, oligomérico (por ejemplo, dímeros A∀, trímeros A∀, tetrámeros A∀, pentámeros A∀ y similares) en comparación con la unión del anticuerpo con A∀

monomérico. Esta comparación puede usarse para determinar una unión relativa del anticuerpo con A∀ oligomérico soluble en comparación con A∀ monomérico. En diversas realizaciones, esta unión relativa se compara con una unión relativa correspondiente de un reactivo de control con una o más especies de A∀ oligomérico soluble frente a A∀ monomérico. En otros aspectos, la afinidad de un anticuerpo para una o más especies de A∀ oligomérico se compara con la afinidad del anticuerpo por A∀ monomérico en la preparación de A∀. Se ha descubierto que existe una correlación fuerte entre la capacidad de un anticuerpo de A∀ para unirse preferentemente a especies de A∀ oligoméricas solubles y la capacidad del anticuerpo para mejorar rápidamente la cognición como se evalúa por un ensayo de CFC en un animal modelo apropiado, como se describe en detalle posteriormente. Se cree además que la capacidad de un anticuerpo para mejorar la cognición en el ensayo de CFC es un indicador o predictor potente de la eficacia terapéutica humana final del anticuerpo (en particular, la eficacia en la mejora rápida de la cognición en un paciente). En consecuencia, una comparación de las preferencias de unión del anticuerpo A∀ y/o las afinidades conduce a la identificación de ciertos anticuerpos como candidatos para su uso de los procedimientos terapéuticos de la invención, en particular, para su uso en un procedimiento para efectuar mejora rápida de la cognición en un paciente.

Los anticuerpos candidatos muestran una unión preferente o mayor con una o más especies de A∀ oligomérico soluble en comparación con A∀ monomérico. Los anticuerpos que se une preferentemente a, por ejemplo, dímeros, trímeros y tetrámeros de A∀ en comparación con A∀ monomérico son candidatos preferidos para su uso en procedimiento para efectuar una rápida mejora de la cognición en un paciente. Por ejemplo, se seleccionan anticuerpos candidatos que muestran una unión de dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, diez veces, veinte veces o más con especies de A∀ oligomérico soluble en comparación con A∀ monomérico para su uso en los procedimientos terapéuticos.

La unión de un anticuerpo con una o más especies de A∀ oligomérico soluble o con A∀ monomérico pueden determinarse cualitativamente, cuantitativamente, o una combinación de ambas. En general, se puede usar cualquier técnica capaz de distinguir especies de A∀ oligomérico de A∀ monomérico en una preparación de A∀ que comprenda las especies. En realizaciones ejemplares, puede usarse una o más de inmunoprecipitación, separación electroforética y separación cromatográfica (por ejemplo, cromatografía líquida) para distinguir especies de A∀ oligomérico de A∀ monomérico en una preparación de A∀ que comprenda las especies.

En realizaciones preferidas, la unión del anticuerpo con una o más especies de A∀ oligomérico soluble o con A∀ monomérico se determina por inmunoprecipitación de la especie de A∀ de la preparación. El inmunoprecipitado se somete después a una separación electroforética (por ejemplo, SDS-PAGE) para distinguir especies oligoméricas de A∀ monomérico en el precipitado. La cantidad de especies de A∀ oligomérico y A∀ monomérico presentes en las bandas electroforéticas pueden visualizarse, por ejemplo, por inmunotransferencia del gel electroforético o por cuantificación directa de las especies respectivas en las bandas del gel electroforético. La cantidad de precipitado de una especie de A∀ puede determinarse, por ejemplo, a partir de la intensidad de las bandas electroforéticas correspondientes, bandas de inmunotransferencia, o una combinación de ambas. La determinación de intensidad puede ser cualitativa, cuantitativa o una combinación de ambas.

La evaluación de intensidad de banda puede realizarse, por ejemplo, usando exposiciones de película apropiadas que pueden explorarse y la densidad de las bandas puede determinarse con software, por ejemplo, software AlphaEase™ (AlphaInnotech™). Puede realizarse evaluación de la intensidad en banda, por ejemplo, usando cualquiera de varios marcadores incorporados en el anticuerpo, un reactivo de captura de imágenes (por ejemplo, un anticuerpo usado en una inmunotransferencia), o ambos. Los marcadores adecuados incluyen, pero sin limitación, marcadores fluorescentes, marcadores radiactivos, marcadores paramagnéticos o combinaciones de los mismos.

En diversas realizaciones, la cantidad de una o más especies de A∀ oligomérico y/o A∀ monomérico que se unen a un anticuerpo puede evaluarse usando espectrometría de masas, por ejemplo, en la preparación de A∀ en sí misma un tiempo adecuado después de que se haya puesto en contacto con el anticuerpo, o en A∀ monomérico y/o una o más especies de A∀ oligomérico soluble unidas con el anticuerpo que se ha extraído de la preparación de A∀.

En ciertos aspectos, la afinidad de un anticuerpo por una o más especies de A∀ oligomérico se compara con la afinidad del anticuerpo por A∀ monomérico para identificar el anticuerpo como un candidato para su uso en los procedimientos terapéuticos de la invención, en particular, para su uso en un procedimiento para efectuar mejora rápida de la cognición en un paciente. La afinidad del anticuerpo de ensayo (por ejemplo un anticuerpo de A∀) por A∀ oligomérico en comparación con A∀ monomérico puede compararse con las afinidades de unión de un reactivo de control. Pueden usarse marcadores para evaluar la afinidad de un anticuerpo por A∀ monomérico, A∀ oligomérico, o ambos. En diversas realizaciones, un reactivo primario con afinidad por A∀ no está marcado y se usa un agente de marcaje secundario para unirse al reactivo primario. Los marcadores adecuados incluyen, pero sin limitación, marcadores fluorescentes, marcadores paramagnéticos, marcadores radiactivos y combinaciones de los mismos.

10. Exploración de anticuerpos con respecto a actividad de eliminación

La divulgación también proporciona procedimientos para explorar un anticuerpo con respecto a actividad en la eliminación de un depósito amiloide o cualquier otro antígeno, o entidad biológica asociada, para la que se desea actividad de eliminación. Para explorar con respecto a actividad frente a un depósito amiloide, se pone en contacto una muestra tisular del cerebro de un paciente con enfermedad de Alzheimer o un modelo animal que tenga patología de Alzheimer característica con células fagocíticas que portan un receptor Fc, tales como células microgliales, y el anticuerpo que se ensaya en un medio in vitro. Las células fagocíticas pueden ser un cultivo primario o una línea celular, y pueden ser de origen murino (por ejemplo, células BV-2 o C8-B4) o humano (por ejemplo, células THP-1). En algunos procedimientos, los componentes se combinan en un portaobjetos de microscopio para facilitar la exploración microscópica. En algunos procedimientos, se realizan múltiples reacciones en paralelo en los pocillos de una placa de microtitulación. En dicho formato, puede montarse un portaobjetos de microscopio en miniatura por separado en los pocillos separados, o puede usarse un formato de detección no microscópica, tal como detección de A∀ por ELISA. Preferentemente, se realiza una serie de mediciones de la cantidad de depósito amiloide en la mezcla de reacción in vitro, comenzando partir de un valor de línea basal antes de que se haya producido la reacción, y uno o más valores de ensayo durante la reacción. El antígeno puede detectarse por tinción, por ejemplo, con un anticuerpo marcado con fluorescencia para A∀ u otro componente de placas amiloides. El anticuerpo usado para tinción puede o no ser el mismo que el anticuerpo que se ensaya con respecto a actividad de eliminación. Una reducción en relación con la línea basal durante la reacción de los depósitos amiloides indica que el anticuerpo que se ensaya tiene actividad de eliminación. Tales anticuerpos probablemente sean útiles en la prevención o tratamiento de Alzheimer y otras enfermedades amiloidogénicas. Los anticuerpos particularmente útiles para prevenir o tratar Alzheimer y otras enfermedades amiloidogénicas incluyen los capaces de eliminar placas amiloides, tanto compactas como difusas, por ejemplo, el anticuerpo 15C11 o 9G8 de la presente invención, o versiones humanizadas o quiméricas de los mismos.

Pueden usarse procedimientos análogos para explorar anticuerpos con respecto a actividad en la eliminación de otros tipos de entidades biológicas. El ensayo puede usarse para detectar la actividad de eliminación frente a prácticamente cualquier tipo de entidad biológica. Típicamente, la entidad biológica tiene algún papel en la enfermedad humana o animal. La entidad biológica puede proporcionarse como una muestra tisular o en forma aislada. Si se proporciona como una muestra tisular, la muestra tisular preferentemente no está fijada para permitir el acceso fácil a los componentes de la muestra tisular y para evitar la perturbación de la conformación de los componentes secundaria a la fijación. Los ejemplos de muestras tisulares que pueden ensayarse en este ensayo incluyen tejido canceroso, tejido precanceroso, tejido que contiene crecimientos benignos tales como verrugas o lunares, tejido infectado con microorganismos patógenos, tejido infiltrado con células inflamatorias, tejido que porta matrices patológicas entre las células (por ejemplo, pericarditis fibrinosa), tejido que porta antígenos aberrantes, y tejido cicatrizante. Los ejemplos de entidades biológicas aisladas que pueden usarse incluyen A∀, antígenos virales

o virus, proteoglicanos, antígenos de otros microorganismos patógenos, antígenos tumorales y moléculas de adhesión. Tales antígenos pueden obtenerse de fuentes naturales, expresión recombinante o síntesis química, entre otros medios. La muestra tisular o entidad biológica aislada se pone en contacto con células fagocíticas que portan receptores de Fc, tales como monocitos o células microgliales y un anticuerpo para ensayar en un medio. El anticuerpo puede dirigirse a la entidad biológica que se ensaya o a un antígeno asociado con la entidad. En la segunda situación, el objeto es ensayar si la entidad biológica se fagocita con el antígeno. Habitualmente, aunque no necesariamente, el anticuerpo y la entidad biológica (en ocasiones con un antígeno asociado), se ponen en contacto entre sí antes de la adición de las células fagocíticas. Después se supervisa la concentración de la entidad biológica y/o el antígeno asociado que permanece en el medio, si está presente. Una reducción de la cantidad o concentración de antígeno o la entidad biológica asociada en el medio indica que el anticuerpo tiene una respuesta de eliminación frente al antígeno y/o entidad biológica asociada junto con las células.

11. Ensayos de anticuerpos con respecto a una mejora rápida o prolongada de la cognición en un ensayo de CFC

En diversos aspectos, un anticuerpo de la invención puede ensayarse con respecto a la capacidad para mejorar la cognición en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, se puede usar la capacidad de un anticuerpo para mejorar la cognición en un modelo animal para AD, como se evalúa mediante un ensayo de condicionamiento de miedo contextual (CFC), para seleccionar el anticuerpo como candidato para su uso en los procedimientos terapéuticos de la invención, en particular, en procedimientos para efectuar mejora rápida de la cognición en un paciente.

El condicionamiento de miedo contextual es una forma habitual de aprendizaje que es excepcionalmente fiable y se adquiere rápidamente en la mayoría de los animales, por ejemplo, mamíferos. Los animales de ensayos aprenden a temer un estímulo previamente neutro debido a su asociación con una experiencia aversiva y/o señal o señales ambientales. (Véase, por ejemplo, Fanselow, Anim. Learn. Behav. 18: 264-270 (1990); Wehner y col., Nature Genet.

17: 331-334. (1997); Caldarone y col., Nature Genet. 17: 335-337 (1997)).

El condicionamiento de miedo contextual es especialmente útil para determinar la función o disfunción cognitiva, por ejemplo, como resultado de una enfermedad o un trastorno, tal como una enfermedad o trastorno neurodegenerativo, una enfermedad o trastorno relacionado con A∀, una enfermedad o trastorno amiloidogénico, la presencia de una función cognitiva afectiva con alteración genética desfavorable (por ejemplo, mutación genética, alteración génica o genotipo no deseado) y/o la eficacia de un agente, por ejemplo, un agente de anticuerpo, en la

capacidad cognitiva. En consecuencia, el ensayo de CFC proporciona un procedimiento para ensayar de forma independiente y/o validar el efecto terapéutico de agentes para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno cognitivo y, en particular, una enfermedad o trastorno que afecta una o más regiones de los cerebros, por ejemplo, el hipocampo, subículo, corteza cingulada, corteza prefrontal, corteza perirrinal, corteza sensorial y lóbulo temporal medio.

Típicamente, el ensayo de CFC se realiza usando cámaras animales convencionales y el empleo de entrenamiento de condicionamiento que comprende un choque suave, (por ejemplo, choque en el pie de 0,35 m) acompañado de una señal auditiva (por ejemplo, un período de ruido uniforme de 85 db), olfativa (por ejemplo, extracto de almendra

o limón), táctil (por ejemplo, textura del suelo de la jaula), y/o visual (destello de luz). Como alternativa, el entrenamiento de condicionamiento comprende administración del choque sin una señal acompañante (es decir, choque asociado con el contexto). La respuesta a la experiencia aversiva (choque) es típicamente de inmovilización (ausencia de movimiento excepto por la respiración) pero también puede incluir guiño de los ojos, o cambio en el reflejo de membrana nictitante, dependiendo del animal de ensayo seleccionado. La respuesta aversiva se caracteriza habitualmente el primer día de ensayo para determinar una línea basal para el miedo no condicionado con resultados de respuesta aversiva en días de ensayo posteriores (por ejemplo, inmovilización en el mismo contexto pero en ausencia del estímulo aversivo y/o inmovilización en presencia de la señal pero en ausencia de la experiencia aversiva) que se caracterizan como miedo condicionado contextualmente. Para mejorar la fiabilidad, los animales de ensayo se ensayan típicamente por separado por técnicos independientes y se puntúan a lo largo del tiempo. Pueden encontrarse detalles de diseño experimental adicionales en la técnica, por ejemplo, en Crawley, JN, What’s Wrong with my Mouse; Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice, Wiley-Liss, NY (2000).

Los animales de ensayo ejemplares (por ejemplo, animales modelo), incluyen mamíferos (por ejemplo, roedores o primates no humanos) que muestran síntomas prominentes o patología que es característica de un trastorno amiloidogénico tal como Alzheimer. Pueden crearse animales modelo por endogamia selectiva para una deseada o pueden modificarse por ingeniería genética usando técnicas transgénicas que se conocen bien en este campo, de modo que una alteración genética diana (por ejemplo, una mutación genética, alteración génica) en un gen que se asocia con el trastorno de demencia, conduzca a expresión o función aberrante del gen diana. Por ejemplo, están disponibles varias cepas de ratón transgénicas que sobreexpresan APP y desarrollan patología de placas amiloides y/o desarrollan déficits cognitivos que son característicos de la enfermedad de Alzheimer (véase por ejemplo, Games y col., mencionado anteriormente, Johnson-Wood y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1550 (1997); Masliah E y Rockenstein E. (2000) JNeural Transm Suppl.; 59: 175-83).

Como alternativa, el animal modelo puede crearse usando compuestos químicos (por ejemplo, neurotoxinas, anestésicos) o técnicas quirúrgicas (por ejemplo, ablación estereotáctica, axotomización, transfección, aspiración), que supriman o interfieran de otro modo con la función normal de una región anatómica del cerebro (por ejemplo, hipocampo, amígdala, corteza perirrinal, núcleo septal medio, locus coeruleus, cuerpos mamilares) o neuronas específicas (por ejemplo neuronas serotonérgicas, colinérgicas o dopaminérgicas) que se asocian con síntomas característicos o patología del trastorno amiloidogénico. En ciertas realizaciones preferidas, el modelo animal muestra un déficit cognitivo prominente asociado con aprendizaje o memoria además de la patología neurodegenerativa que se asocia con un trastorno amiloidogénico. Más preferentemente, el déficit cognitivo empeora progresivamente con mayor edad, de modo que la progresión de la enfermedad en el animal modelo se iguala a la progresión de la enfermedad en un sujeto que padece el trastorno amiloidogénico.

Puede realizarse condicionamiento de miedo condicional y otros ensayos in vivo para ensayar la funcionalidad de los anticuerpos descritos en el presente documento usando ratones de tipo silvestre o ratones que tengan una cierta alteración genética que conduce a memoria alterada o modelos de ratón de enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, incluyendo modelos de ratón que presenten niveles elevados de A∀ soluble en el líquido cefalorraquídeo (LCR) o plasma. Por ejemplo, los modelos animales para enfermedad de Alzheimer incluyen ratones transgénicos que sobreexpresan la mutación “Swedish” de proteína precursora amiloide humana (hAPPswe; Tg2576) que muestran déficit de memoria dependiente de la edad y placas (Hsiao y col. (1996) Science

274: 99-102). La funcionalidad in vivo de los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden ensayarse usando ratones transgénicos PDAPP, que expresan una forma mutante de APP humano (APPV71F) y desarrollan enfermedad de Alzheimer a una edad temprana (Bard, y col. (2000) Nature Medicine 6: 916-919; Masliah E, y col. (1996) JNeurosci. 15; 16(18): 5795-811). Otros modelos de ratón para enfermedad de Alzheimer incluyen el ratón PSAPP, un ratón doblemente transgénico (PSAPP) que sobreexpresa los transgenes de APP y PS1 mutantes, descrito en Holcomb, y col. (1998) Nature Medicine 4: 97-110, y el ratón mutante PS-1 descrito en Duff, y col. (1996) Nature 383, 710-713. Otro modelos transgénicos genéticamente alterados de enfermedad de Alzheimer se describen en Masliah E y Rockenstein E. (2000) JNeural Transm Suppl. 59: 175-83.

12. Anticuerpos humanizados quiméricos que tienen función efectora alterada

Para los anticuerpos anteriormente descritos de la invención que comprenden una región constante (región Fc), también puede ser deseable alterar la función efectora de la molécula. En general, la función efectora de un anticuerpo reside en la región constante o Fc de la molécula que puede mediar en la unión con diversas moléculas efectoras, por ejemplo, proteínas del complemento o receptores de Fc. La unión de complemento con la región Fc es importante, por ejemplo, en la opsonización y lisis de patógenos celulares y la activación de respuestas

inflamatorias. La unión del anticuerpo con receptores de Fc, por ejemplo, en la superficie de células efectoras puede desencadenar varias respuestas biológicas importantes y diversas incluyendo, por ejemplo, envolvimiento y destrucción de patógenos o partículas revestidos de anticuerpo, eliminación de complejos inmunes, lisis de células diana revestidas de anticuerpo por células citolíticas (es decir, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo o ADCC), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria de anticuerpos y control de la producción de inmunoglobulina.

En consecuencia, dependiendo de una aplicación terapéutica o de diagnóstico particular, pueden ser deseables las funciones inmunitarias anteriormente mencionadas o solamente funciones inmunitarias seleccionadas. Alterando la región Fc del anticuerpo, se consiguen diversos aspectos de la función efectora de la molécula incluyendo potenciación o supresión de diversas reacciones del sistema inmune, con efectos beneficiosos en el diagnóstico y terapia.

Pueden producirse anticuerpos de la invención que reaccionan solamente con ciertos tipos de receptores de Fc, por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden modificarse para unirse a solamente ciertos receptores de Fc o, si se desea, carecer de unión al receptor de Fc completamente, por deleción o alteración del sitio de unión al receptor de Fc localizado en la región Fc del anticuerpo. Otras alteraciones deseables de la región Fc de un anticuerpo de la invención se catalogan posteriormente. Típicamente, se usa el sistema de numeración de EU (es decir, como en el índice EU de Kabat y col., mencionado anteriormente) para indicar qué resto o restos de aminoácidos de la región Fc (por ejemplo, de un anticuerpo IgG) se alteran (por ejemplo, por sustitución de aminoácidos) para conseguir un cambio deseado en la función efectora. El sistema de numeración también se emplea para comparar anticuerpos entre especies de modo que una función efectora deseada observada, por ejemplo, en un anticuerpo de ratón, pueda después introducirse por ingeniería genética sistemáticamente en un anticuerpo humano, humanizado o quimérico de la invención.

Por ejemplo, se ha observado que los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos IgG) pueden agruparse en los que se ha descubierto que muestran unión estrecha, intermedia o débil con un receptor de Fc (por ejemplo, un receptor de Fc en monocitos ((Fc#RI)). Por comparación de las secuencias de aminoácidos en estos grupos de afinidad diferentes, se ha identificado un sitio de unión a monocitos en la región de unión a bisagra (Leu234-Ser239 de acuerdo con el sistema de numeración de EU). Además, el receptor Fc#RI humano se une a IgG1 humana e IgG2a de ratón como un monómero, pero la unión de IgG2b de ratón es 100 veces más débil. Una comparación de la secuencia de estas proteínas en la región de unión a bisagra muestra que la secuencia de las posiciones de numeración EU 234 a 238, es decir, Leu-Leu-Gly-Gly-Pro en los agentes de unión fuertes se convierte en Leu-Glu-Gly-Gly-Pro en gamma 2b de ratón, es decir, agentes de unión débiles. En consecuencia, puede hacerse un cambio correspondiente en una secuencia bisagra de anticuerpo humano si se desea una unión al receptor de Fc#I reducida. Se entiende que pueden realizarse otras alteraciones para conseguir el mismo o similares resultados. Por ejemplo, la afinidad de la unión con Fc#RI puede alterarse reemplazando el resto especificado con un resto que tenga un grupo funcional inapropiado en su cadena lateral, o introduciendo un grupo funcional cargado (por ejemplo, Glu o Asp) o por ejemplo un resto no polar aromático (por ejemplo, Phe, Tyr o Trp).

Estos cambios pueden aplicarse igualmente a los sistemas murino, humano y de rata dada la homología de secuencia entre las diferentes inmunoglobulinas. Se ha mostrado que para IgG3 humana, que se une al receptor Fc#RI humano, el cambio de Leu en la posición EU 235 a Glu destruye la interacción del mutante para el receptor. El sitio de unión para este receptor puede por lo tanto activarse o desactivarse realizando la mutación apropiada.

Las mutaciones en sitios adyacentes o cercanos en la región de unión a bisagra (por ejemplo, reemplazo de restos en las posiciones EU 234, 236 o 237 por Ala) indican que las alteraciones en los restos 234, 235, 236 y 237 afectan al menos a la afinidad por el receptor Fc#RI. En consecuencia, los anticuerpos de la invención también pueden tener una región Fc alterada con afinidad de unión alterada por Fc#RI en comparación con el anticuerpo no modificado. Dicho anticuerpo tiene convenientemente una modificación en las posiciones de aminoácidos EU 234, 235, 236 o

237.

En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo humanizado que incluye alteraciones de aminoácidos en una o más posiciones EU 234, 235, 236 y 237. En una realización particular de la invención, un anticuerpo humanizado incluye alteraciones de aminoácidos en las posiciones EU 234 y 237 de la región de unión a bisagra derivada de IgG1 (es decir, L234A y G237A).

La afinidad por otros receptores de Fc puede alterarse por un enfoque similar, para controlar la respuesta inmune de diferentes maneras.

Como un ejemplo adicional, pueden alterarse las propiedades líticas de los anticuerpos IgG, después de la unión del componente de complemento Cl.

El primer componente del sistema de complemento, Cl, comprende tres proteínas conocidas como Clq, Clr y Cls que se unen estrechamente entre sí. Se ha mostrado que Clq es responsable de la unión del complejo de tres proteínas con un anticuerpo.

En consecuencia, la actividad de unión con Clq de un anticuerpo puede alterarse proporcionando un anticuerpo con un dominio CH2 alterado en el que al menos uno de los restos de aminoácidos en las posiciones de aminoácido EU 318, 320 y 322 de la cadena pesada se ha cambiado a un resto que tiene una cadena lateral diferente. Otras alteraciones adecuadas para alterar, por ejemplo, reducir o suprimir unión con Clq específica para un anticuerpo

5 incluyen cambiar uno cualquiera de los restos en las posiciones EU 318 (Glu), 320 (Lys) y 322 (Lys) a Ala.

Además, realizando mutaciones en estos restos, se ha mostrado que la unión de Clq se conserva siempre que el resto 318 tenga una cadena lateral con el enlace de hidrógeno y los restos 320 y 322 tengan ambos una cadena lateral cargada positivamente.

La actividad de unión de Clq puede suprimirse reemplazando uno cualquiera de los tres restos especificados con un

10 resto que tenga una funcionalidad inapropiada en su cadena lateral. No es necesario reemplazar los restos iónicos solamente con Ala para suprimir la unión de Clq. También es posible usar otros restos no iónicos sustituidos con alquilo, tales como Gly, Ile, Leu o Val, o tales restos no polares aromáticos como Phe, Tyr, Trp y Pro en lugar de uno cualquiera de los tres restos para suprimir la unión de Clq. Además, también es posible usar restos no iónicos polares tales como Ser, Thr, Cys y Met en lugar de los restos 320 y 322, pero no 318, para suprimir la actividad de

15 unión de Clq.

También se ha observado que las cadenas laterales en restos polares iónicos y no iónicos serán capaces de formar enlaces de hidrógeno de una manera similar a los enlaces formados por el resto Glu. Por lo tanto, el reemplazo del resto 318 (Glu) por un resto polar puede modificar pero no suprimir la actividad de unión de Clq.

También se sabe que el reemplazo del resto 297 (Asn) con Ala da como resultado la retirada de la actividad lítica

20 mientras que solamente reduce ligeramente (aproximadamente tres veces más débil) la afinidad por Clq. Esta alteración destruye el sitio de glicosilación y la presencia de carbohidrato que se requiere para la activación del complemento. Cualquier otra sustitución en este sitio también destruirá el sitio de glicosilación.

La invención también proporciona un anticuerpo que tiene una función efectora alterada en la que el anticuerpo tiene una región bisagra modificada. La región bisagra modificada puede comprender una región bisagra completa 25 derivada de un anticuerpo de diferente clase o subclase de anticuerpo de la del dominio CH1. Por ejemplo, el dominio constante (CH1) de un anticuerpo de clase lgG puede unirse a una región bisagra de un anticuerpo de clase lgG4. Como alternativa, la nueva región bisagra puede comprender parte de una bisagra natural o una unidad de repetición en la que cada unidad en la repetición deriva de una región bisagra natural. En un ejemplo, la región bisagra natural se altera convirtiendo uno o más restos de cisteína en un resto neutro, tal como alanina, o

30 convirtiendo restos situados de forma adecuada en restos de cisteína. Tales alteraciones se llevan a cabo usando química proteica reconocida en la técnica y, preferentemente, técnicas de ingeniería genética, como se describe en el presente documento.

En una realización de la invención, el número de restos de cisteína en la región bisagra del anticuerpo se reduce, por ejemplo, a un resto de cisteína. Esta modificación tiene la ventaja de facilitar el ensamblaje del anticuerpo, por

35 ejemplo, moléculas de anticuerpo biespecífico y moléculas de anticuerpo en las que la parte Fc se ha reemplazado por una molécula efectora o indicadora, puesto que solamente es necesario formar un enlace disulfuro único. Esta modificación también proporciona una diana específica para unir la región bisagra a otra región bisagra o a una molécula efectora o indicadora, directa o indirectamente, por ejemplo, por medios químicos.

Por el contrario, el número de restos de cisteína en la región bisagra del anticuerpo se aumenta, por ejemplo, al

40 menos uno o más que el número de restos de cisteína que aparecen normalmente. El aumento del número de restos de cisteína puede usarse para estabilizar las interacciones entre bisagras adyacentes. Otra ventaja de esta modificación es que facilita el uso de grupos tiol de cisteína para unir moléculas efectoras o indicadoras con el anticuerpo alterado, por ejemplo, un radiomarcador.

En consecuencia, la invención posibilita un intercambio de regiones bisagra entre clases de anticuerpos, en

45 particular, clases lgG, y/o un aumento o una reducción en el número de restos de cisteína en la región bisagra para conseguir una función efectora alterada (véase por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 5.677.425). Se realiza una determinación de función efectora de anticuerpo alterada usando los ensayos descritos en el presente documento u otras técnicas reconocidas en este campo.

Resulta importante que el anticuerpo resultante puede someterse a uno o más ensayos para evaluar cualquier

50 cambio de la actividad biológica en comparación con el anticuerpo de partida. Por ejemplo, la capacidad del anticuerpo con una región Fc alterada para unirse a complemento o receptores de Fc puede evaluarse usando los ensayos desvelados en el presente documento así como cualquier ensayo reconocido en la técnica.

Se lleva a cabo producción de los anticuerpos de la invención por cualquier técnica adecuada incluyendo técnicas descritas en el presente documento así como técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo puede

55 sintetizarse una secuencia proteica apropiada, por ejemplo que forme parte de, o todo de, un dominio constante relevante, por ejemplo, región Fc, es decir, dominio o dominios CH2 y/o CH3, de un anticuerpo, e incluya un resto o restos alterados de forma apropiada, y después unirse químicamente en el lugar apropiado en una molécula de anticuerpo.

Preferentemente, se usan técnicas de ingeniería genética para producir un anticuerpo alterado. Las técnicas preferidas incluyen, por ejemplo, preparar cebadores adecuados para su uso en reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de modo que se altera una secuencia de ADN que codifica al menos parte de una cadena pesada de lgG, por ejemplo, una región Fc o constante (por ejemplo, CH2 y/o CH3), en uno o más restos. El segmento

5 puede después unirse operativamente a la parte restante del anticuerpo, por ejemplo, la región variable del anticuerpo y elementos reguladores requeridos para la expresión en una célula.

La presente invención también incluye vectores que codifican al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención usados para transformar la línea celular, vectores usados para producir los vectores transformantes, líneas celulares transformadas con los vectores transformantes y líneas celulares transformadas con vectores

10 preparatorios.

Preferentemente, la línea celular que se transforma para producir el anticuerpo con una región Fc alterada (es decir, de función efectora alterada) es una línea celular de mamífero inmortalizada (por ejemplo, célula CHO).

Aunque la línea celular usada para producir el anticuerpo con una región Fc alterada es preferentemente una línea celular de mamífero, puede usarse como alternativa cualquier otra línea celular adecuada, tal como una línea celular

15 bacteriana o una línea celular de levadura.

B. Moléculas de ácido nucleico que codifican agentes inmunológicos y terapéuticos

También pueden inducirse respuestas inmunes contra depósitos amiloides por administración de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos y sus cadenas componentes usados para inmunización pasiva. Tales ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN. Un segmento de ácido nucleico que codifica un inmunógeno típicamente se une a 20 elementos reguladores, tales como un promotor y potenciador, que permiten la expresión del segmento de ADN en las células diana pretendidas de un paciente. Para expresión en células sanguíneas, como es deseable para inducción de una respuesta inmune, los elementos promotores y potenciadores ejemplares incluyen los de genes de inmunoglobulina de cadena ligera o pesada y/o el potenciador y promotor temprano intermedio principal de CMV (Stinski, Patentes de Estados Unidos Nº 5.168.062 y 5.385.839). Los elementos reguladores unidos y secuencias

25 codificantes se clonan con frecuencia en un vector. Para administración de anticuerpos de doble cadena, las dos cadenas pueden clonarse en el mismo vector o vectores separados.

Están disponibles varios sistemas de vector viral incluyendo sistemas retrovirales (véase por ejemplo Lawrie y Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109 (1993)); vectores adenovirales (véase, por ejemplo, Bett y col., J. Virol. 67: 5911 (1993)); vectores de virus adenoasociados (véase, por ejemplo Zhou y col., J. Exp. Med. 179: 1867 30 (1994)), vectores virales de la familia de la viruela incluyendo virus vaccinia y los virus de la varicela aviar, vectores virales del género virus alfa tales como los derivados de virus Sindbis y del Bosque de Semliki (véase, por ejemplo., Dubensky y col., J. Virol. 70: 508 (1996)), virus de la encefalitis equina venezolana (véase Johnston y col., documento US 5.643.576), y rabdovirus, tales como virus de estomatitis vesicular (véase Rose, documento 6.168.943) y papilomavirus (Ohe y col., Human Gene Therapy 6: 325 (1995); Woo y col., documento WO 94/12629 y

35 Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)).

El ADN que codifica un anticuerpo de la invención, por ejemplo, 15C11, o un vector que contenga el mismo, puede empaquetarse en liposomas. Se describen lípidos adecuados y análogos relacionados por Eppstein y col., documento US 5.208.036, Felgner y col., documento US 5.264.618, Rose, documento US 5.279.833, y Epand y col., documento US 5.283.185. Los vectores y ADN que codifican un inmunógeno también pueden absorberse en o

40 asociarse con vehículos particulados, ejemplos de los cuales incluyen polímeros de polimetracrilato y polilactidas y poli (lactida-co-glicolidas), véase, por ejemplo, McGee y col., J. Micro Encap. (1996).

Pueden suministrarse vectores de terapia génica o polipéptidos desnudos (por ejemplo, ADN) in vivo por administración a un paciente individual, típicamente por administración sistémica (por ejemplo, infusión intravenosa, intraperitoneal, nasal, gástrica, intradérmica, intramuscular, subdérmica o intracraneal) o aplicación tópica (véase, 45 por ejemplo, Anderson y col., documento US 5.399.346). La expresión “polinucleótido desnudo” se refiere a un polinucleótido que no se suministra en asociación con un agente facilitador de la transfección. Los polinucleótidos desnudos en ocasiones se clonan en un vector plasmídico. Tales vectores pueden incluir además agentes facilitadores tales como bupivacaína (Weiner y col., documento US 5.593.972). También puede administrarse ADN usando una pistola génica. Véase Xiao & Brandsma, mencionado anteriormente. El ADN que codifica un 50 inmunógeno se precipita en la superficie de perlas metálicas microscópicas. Los microproyectiles se aceleran con una onda de choque o gas helio en expansión, y penetran en los tejidos hasta una profundidad de varias capas celulares. Por ejemplo, el dispositivo de suministro génico Accel™ fabricado por Agricetus, Inc. Middleton WI es adecuado. Como alternativa, el ADN desnudo puede pasar a través de la piel al torrente sanguíneo simplemente aplicando puntualmente el ADN en la piel con irritación química o mecánica (véase Howell y col., documento WO

55 95/05853).

En una variación adicional, los vectores que codifican inmunógenos pueden suministrarse a células ex vivo, tales como células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia tisular) o células madre hematopoyéticas de donadores universales, seguido de reimplantación de las células en un paciente, habitualmente después de selección de células que tengan el vector incorporado.

II. Procedimientos profilácticos y terapéuticos

La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que son útiles en el tratamiento de Alzheimer y otras enfermedades amiloidogénicas mediante administración de reactivos inmunológicos terapéuticos 5 (por ejemplo, inmunoglobulinas humanizadas) para epítopos específicos dentro de A∀ a un paciente en condiciones que generen una respuesta terapéutica beneficiosa en un paciente (por ejemplo, captura de A∀ soluble, reducción de carga de placas, inhibición de formación de placas, reducción de distrofia neurítica, mejora de la función cognitiva, por ejemplo, mejora rápida de la cognición y/o inversión, tratamiento o prevención del deterioro cognitivo) en el paciente, por ejemplo, para la prevención o tratamiento de una enfermedad amiloidogénica. La invención

10 también se refiere al uso de los reactivos inmunológicos desvelados (por ejemplo, inmunoglobulinas humanizadas) en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad amiloidogénica.

En un aspecto, la divulgación proporciona procedimientos para prevenir o tratar una enfermedad asociada con depósitos amiloides de A∀ en el cerebro de un paciente. Tales enfermedades incluyen enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down y deterioro cognitivo. Este último puede aparecer con o sin otras características de una 15 enfermedad amiloidogénica. Algunos procedimientos comprenden administrar una dosificación eficaz de un anticuerpo que se une específicamente a un componente de un depósito amiloide al paciente. Tales procedimientos son particularmente útiles para prevenir o tratar enfermedad de Alzheimer en pacientes humanos. Los procedimientos ejemplares comprenden administrar una dosificación eficaz de un anticuerpo que se une a A∀. Los procedimientos preferidos comprenden administrar una dosificación eficaz de un anticuerpo que se une 20 específicamente a un epítopo dentro de los restos 13-28 de A∀, por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo dentro de los restos 14-27 de A∀, anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo dentro de los restos 15-26 de A∀, anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo dentro de los restos 16-25 de A∀, anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo dentro de los restos 17-24 de A∀, anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo dentro de los restos 18-23 de A∀, o anticuerpos que se unen

25 específicamente a un epítopo dentro de los restos 19-22 de A∀. En otro aspecto, se administran anticuerpos que se unen específicamente a péptido A∀ sin unirse a proteína precursora amiloide de longitud completa (APP). En otro aspecto más, el isotipo del anticuerpo es IgG1 humano. En otro aspecto más, el isotipo del anticuerpo es IgG4 humano. En otra realización más, la divulgación presenta administración de anticuerpos que se unen a y/o capturan A∀ soluble.

30 En otro aspecto más, el isotipo del anticuerpo es IgG4. En otro aspecto, un anticuerpo de la invención se modifica por ingeniería genética para tener un isotipo que tenga función efectora reducida (por ejemplo, fagocitosis mediada por Fc reducida, capacidad reducida para opsonizar placas, etc.). En una realización particular, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo 15C11 humanizado que tiene un isotipo IgG4.

En otro aspecto más, el procedimiento presenta administración de anticuerpos que se unen a un depósito amiloide

35 en el paciente e inducen una respuesta de eliminación contra el depósito amiloide. Por ejemplo, dicha respuesta de eliminación puede efectuarse por fagocitosis mediada por receptor de Fc. Dicha respuesta de eliminación puede introducirse por ingeniería genética en un anticuerpo, por ejemplo, incluyendo un dominio de unión al receptor de Fc (por ejemplo, una región constante de IgG2a).

Los agentes terapéuticos de la invención típicamente están sustancialmente puros de contaminantes no deseados.

40 Esto significa que un agente es típicamente al menos aproximadamente el 50% p/p (peso/peso) puro, así como está sustancialmente sin proteínas y contaminantes que interfieran. En ocasiones los agentes son al menos aproximadamente 80% p/p y más preferentemente al menos 90 o aproximadamente 95% p/p puros. Sin embargo, usando técnicas de purificación de proteínas convencionales, pueden obtenerse péptidos homogéneos de al menos 99% p/p puros.

45 Los procedimientos pueden usarse en pacientes tanto asintomáticos como los que muestran en la actualidad síntomas de enfermedad. Los anticuerpos usados en tales procedimientos pueden ser anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o no humanos, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno) y pueden ser monoclonales o policlonales, como se describe en el presente documento. En un aspecto más, la invención presenta administración de anticuerpos preparados a partir de un ser humano inmunizado con péptido A∀,

50 pudiendo ser dicho ser humano el paciente para tratar con anticuerpo.

En otro aspecto, la divulgación presenta administración de un anticuerpo con un vehículo farmacéutico como una composición farmacéutica. Como alternativa, el anticuerpo puede administrarse a un paciente administrando un polinucleótido que codifica al menos una cadena de anticuerpo. El polinucleótido se expresa para producir la cadena de anticuerpo en el paciente. Opcionalmente, el polinucleótido codifica cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo. El

55 polinucleótido se expresa para producir las cadenas pesada y ligera en el paciente. En realizaciones ejemplares, el paciente se supervisa con respecto al nivel de anticuerpo administrado en la sangre del paciente.

La invención satisface por lo tanto una necesidad duradera de regímenes terapéuticos para prevenir o aliviar la neuropatía y, en algunos pacientes, el deterioro cognitivo asociado con enfermedad de Alzheimer.

A. Mejora rápida de cognición

La presente invención proporciona anticuerpos para su uso en procedimientos para efectuar mejora rápida de la cognición en un paciente que tenga o esté en riesgo de padecer una enfermedad o trastorno relacionado con A∀ o enfermedad o trastorno amiloidogénico (por ejemplo, AD). En aspectos preferidos, los procedimientos presentan administración de una dosis eficaz de un agente de anticuerpo de modo que se consiga mejora rápida de la cognición. En aspectos ejemplares de la invención, se consigue mejora de uno o más déficits cognitivos en el paciente (por ejemplo, déficits de aprendizaje y/o memoria procesal). El déficit cognitivo puede ser un deterioro de la memoria explícita (también conocida como memoria “declarativa” o “de trabajo”), que se define como la capacidad para almacenar y recuperar información específica que está disponible para la consciencia y que puede por lo tanto expresarse por el lenguaje (por ejemplo, la capacidad para recordar un hecho o acontecimiento específico). Como alternativa, el déficit cognitivo puede ser un deterioro de la memoria procesal (también conocida como memoria “implícita” o “contextual”), que se define como la capacidad para adquirir, conservar y recuperar información general

o conocimiento que no está disponible a la consciencia y que requiere el aprendizaje de habilidades, asociaciones, hábitos o que se expresen reflejos complejos, por ejemplo, la capacidad para recordar cómo ejecutar una tarea específica. Los individuos que padecen déficits de memoria procesal tienen su capacidad para actuar normalmente mucho más alterada. Como tales, son altamente deseables y ventajosos tratamientos que son eficaces para mejorar déficits en memoria procesal.

B.

Pacientes susceptibles de tratamiento

Los pacientes susceptibles de tratamiento incluyen individuos en riesgo de tener enfermedad o trastorno relacionado con A∀ o enfermedad o trastorno amiloidogénico pero que no muestran síntomas, así como pacientes que muestran síntomas en la actualidad. En el caso de enfermedad de Alzheimer, prácticamente cualquiera está en riesgo de padecer enfermedad de Alzheimer si vive el tiempo suficiente. Por lo tanto, los presentes anticuerpos pueden administrarse de forma profiláctica a la población general sin necesidad de ninguna evaluación de riesgo del paciente objeto.

Los presentes procedimientos son especialmente útiles para individuos que están en riesgo de tener AD, por ejemplo los que muestran factores de riesgo de AD. El principal factor de riesgo de AD es la edad avanzada. A medida que la población envejece, la frecuencia de AD continúa creciendo. Las estimaciones actuales indican que hasta el 10% de la población por encima de la edad de 65 y hasta el 50% de la población por encima de la edad de 85 tienen AD.

Aunque es poco habitual, puede identificarse que ciertos individuos a una edad temprana están genéticamente predispuestos a desarrollar AD. Pueden identificarse individuos que portan la forma heredable de AD, conocida como “AD familiar” o “AD de aparición temprana”, a partir de un historial familiar bien documentado de AD, del análisis de un gen que se sabe que confiere AD cuando se muta, por ejemplo el gen de APP o presenilina. Las mutaciones de APP bien caracterizadas incluyen las mutaciones “Hardy” en los codones 716 y 717 de APP770 (por ejemplo, valina717 a isoleucina (Goate y col., (1991), Nature 349: 704); valina717 a glicina (Chartier y col. (1991) Nature 353: 844; Murrell y col.(1991), Science 254: 97); valina717 a fenilalanina (Mullan y col. (1992), Nature Genet.

1: 345-7)), las mutaciones “Swedish” en el codón 670 y 671 de APP770, y la mutación “Flemish” en el codón 692 de APP770. Se cree que tales mutaciones provocan enfermedad de Alzheimer por procesamiento aumentado o alterado de APP a A∀, particularmente el procesamiento de APP a cantidades aumentadas de la forma larga de A∀ (es decir, A∀1-42 y A∀1-43). Se cree que las mutaciones de otros genes, tales como los genes de presenilina, PS1 y PS2, afectan indirectamente al procesamiento de APP para generar cantidades aumentadas de la forma larga de A∀ (véase, Hardy, TINS 20: 154 (1997); Kowalska y col., (2004), Polish J. Pharmacol., 56: 171-8). Además de AD, las mutaciones en el aminoácido 692 ó 693 de la isoforma de 770 aminoácidos de APP se ha implicado en un trastorno amiloidogénico cerebral llamado Hemorragia Cerebral Hereditaria con Amiloidosis del tipo Dutch (HCHWA-D).

Más habitualmente, AD no se hereda por un paciente sino que se desarrolla debido a la interacción compleja de una diversidad de factores genéticos. Se dice que estos individuos tienen “AD esporádica” (también conocida como “AD de aparición tardía”), una forma que es mucho más difícil de diagnosticar. No obstante, la población de pacientes puede explorarse con respecto a la presencia de alelos o rasgos de susceptibilidad que no provocan AD pero que se sabe que segregan con AD a una frecuencia mayor que en la población general, por ejemplo, los alelos ∋2, ∋3 y ∋4 de apolipoproteína E (Corder y col. (1993), Science, 261: 921-923). En particular, los pacientes sin el alelo ∋4, preferentemente además de algún otro marcador para AD, pueden identificarse como “en riesgo” de AD. Por ejemplo, los pacientes sin el alelo ∋4 que tienen parientes que tienen AD o que padecen hipercolesterolemia o aterosclerosis pueden identificarse como “en riesgo” de AD. Otro biomarcador potencial es la evaluación combinada de los niveles A∀42 y tau en líquido cefalorraquídeo (LCR). Los niveles bajos de A∀42 y altos de tau tienen un valor predictivo en la identificación de pacientes en riesgo de AD.

Otros indicadores de pacientes en riesgo de AD incluyen datos neuropatológicos dinámicos in vivo, por ejemplo detección in vivo de beta amiloide en el cerebro, patrones de activación del cerebro, etc. Tales datos pueden obtenerse usando, por ejemplo, formación de imágenes de resonancia magnética tridimensional (IRM), exploración de tomografía de emisión de positrones (PET) y tomografía computarizada por emisión de fotones individuales (SPECT). Los indicadores de pacientes que tienen AD probable incluyen, pero sin limitación, pacientes (1) que

tienen demencia, (2) de una edad de 40-90 años de edad, (3), déficits cognitivos, por ejemplo, en dos o más dominios cognitivos, (4) progresión de déficits durante más de seis meses, (5) consciencia inalterada y/o (6) ausencia de otros diagnósticos razonables.

Los individuos que padecen formas esporádicas o familiares de AD se diagnostican, sin embargo, habitualmente después de la presentación de uno o más síntomas característicos de AD. Los síntomas habituales de AD incluyen déficits cognitivos que afectan a la realización de tareas o habilidades rutinarias, problemas con el lenguaje, desorientación de tiempo o espacio, juicio reducido o bajo, alteraciones del pensamiento abstracto, pérdida de control motor, alteración anímica o conductual, cambio de personalidad o pérdida de iniciativa. El número de déficits

o el grado del déficit cognitivo presentado por el paciente habitualmente refleja el grado en el que ha progresado la enfermedad. Por ejemplo, el paciente puede mostrar solamente un deterioro cognitivo leve, de modo que el paciente muestre problemas con la memoria (por ejemplo, memoria contextual) pero sea capaz de actuar bien en lo demás.

Los presentes procedimientos también son útiles para individuos que tengan un déficit cognitivo relacionado con A∀, por ejemplo, demencia relacionada con A∀. En particular, los presentes procedimientos son especialmente útiles para individuos que tengan una anomalía o déficit cognitivo provocado por o atribuido a la presencia de A∀ oligomérico soluble en el sistema nervioso central (SNC), por ejemplo, en el cerebro o LCR. Los déficits cognitivos provocados por o asociados con A∀ también incluyen los provocados por o asociados con: (1) el desarrollo de placas ∀-amiloides en el cerebro; (2) tasas anómalas de síntesis, procesamiento, degradación o eliminación de A∀;

(3)

la formación o actividad de especies de A∀ oligomérico soluble (por ejemplo, en el cerebro); y/o (4) la formación de formas anómalas de A∀. No es necesario que se establezca un verdadero lazo causal entre una anomalía de A∀ y un déficit cognitivo en un paciente particular, sin embargo, debería haber algún indicio de lazo, por ejemplo, por uno de los marcadores anteriormente descritos de AD para distinguir pacientes que padecen déficits cognitivos no relacionados con A∀ que no se esperaría que se beneficiaran del tratamiento con un agente inmunoterapéutico de A∀.

Se han desarrollado varios ensayos para evaluar las habilidades o el rendimiento cognitivo en sujetos humanos, por ejemplo, sujetos en riesgo de o que tienen síntomas o patología de trastornos de demencia (por ejemplo, AD). Pueden identificarse déficits cognitivos por rendimiento alterado de estos ensayos, y se han propuesto muchos tratamientos basándose en su capacidad para mejorar el rendimiento en estos ensayos. Aunque algunas tareas han evaluado comportamientos o función motora de los sujetos, la mayoría de las tareas se han diseñado para ensayar el aprendizaje o la memoria.

Puede evaluarse la cognición en seres humanos usando una amplia diversidad de ensayos incluyendo, pero sin limitación, los siguientes ensayos. El ADAS-Cog (Escala de Evaluación de Enfermedad de Alzheimer-Cognitiva) es un ensayo de 11 partes que se tarda en completar 30 minutos. El ADAS-Cog es un examen breve preferido para el estudio de las habilidades del lenguaje y la memoria. Véase Rosen y col. (1984) Am J Psychiatry. 141(11): 1356-64; Ihl y col. (2000) Neuropsychobiol. 41(2): 102-7; y Weyer y col. (1997) Int Psychogeriatr. 9(2): 123-38.

El Ensayo Blessed es otro ensayo rápido (∃10 minutos) de cognición que evalúa las actividades de la vida diaria y memoria, concentración y orientación. Véase Blessed y col. (1968) Br J Psychiatry 114(512): 797-811.

La Batería Automática de Ensayos Neurofisiológicos de Cambridge (CANTAB) se usa para la evaluación de déficits cognitivos en seres humanos con enfermedades neurodegenerativas o daño cerebral. Consiste en trece ensayos computarizados interrelacionados de memoria, atención y función ejecutiva, y se administra mediante una pantalla sensible al tacto de un ordenador personal. Los ensayos son independientes de lenguaje y en gran medida de la cultura, y se ha mostrado que son altamente sensibles en la detección temprana y exploración rutinaria de enfermedad de Alzheimer. Véase, Swainson y col. (2001) Dement Geriatr Cogn Disord.; 12: 265-280; y Fray y Robbins (1996) Neurotoxicol Teratol. 18(4): 499-504. Robbins y col. (1994) Dementia 5(5): 266-81.

Los Ensayos Clínicos y Neurofisiológicos del Consorcio para Establecer un Registro de Enfermedad de Alzheimer (CERAD) incluyen un ensayo de fluidez verbal, Ensayo de Nombramiento de Boston, Mini Examen de Estado Mental (MMSE), recuerdo de palabras de diez elementos, praxis construccional y recuerdo retardado de elementos de praxis. El ensayo típicamente tarda 20-30 minutos y es conveniente y eficaz en la evaluación y seguimiento del deterioro cognitivo. Véase, Morris y col. (1988) Psychopharmacol Bull. 24(4): 641-52; Morris y col. (1989) Neurology 39(9): 1159-65; y Welsh y col. (1991) Arch Neurol. 48(3): 278-81.

El Mini Examen de Estado Mental (MMSE) desarrollado en 1975 por Folestein y col., es un breve ensayo de estado mental y función cognitiva. No mide otros fenómenos mentales y por lo tanto no es un sustituto de un examen de estado mental completo. Es útil en la exploración de demencia y su sistema de puntuación ayuda al seguimiento del progreso a lo largo del tiempo. El Mini Examen de Estado Mental MMSE se usa ampliamente, con normas ajustadas para la edad y educación. Puede usarse para explorar con respecto a deterioro cognitivo, para estimar la gravedad del deterioro cognitivo en un momento dado en el tiempo, para seguir el ciclo de cambios cognitivos en un individuo a lo largo del tiempo, y para documentar la respuesta de un individuo al tratamiento. Las evaluaciones cognitivas de los sujetos pueden requerir ensayos neurofisiológicos formales, con ensayos de seguimiento separados por nueve meses o más (en seres humanos). Véase Folstein y col. (1975) J Psychiatr Res.12: 196-198; Cockrell y Folstein (1988) Psychopharm Bull. 24(4): 689-692; y Crum y col. (1993) J. Am. Med. Association 18: 2386-2391.

La Exploración de Siete Minutos es una herramienta de exploración para ayudar a identificar pacientes que deberían evaluarse con respecto a enfermedad de Alzheimer. La herramienta de exploración es altamente sensible a las señales tempranas de AD, usando una serie de preguntas para evaluar diferentes tipos de funcionalidad intelectual. El ensayo consiste en 4 conjuntos de preguntas que se centran en la orientación, memoria, habilidades visuoespaciales y lenguaje expresivo. Puede distinguir entre cambios cognitivos debido al proceso de envejecimiento normal y déficits cognitivos debido a la demencia. Véase, Solomon y Pendlebury (1998) Fam Med. 30(4): 265-71, Solomon y col. (1998) Arch Neurol. 55(3): 349-55.

Los individuos que padecen en la actualidad enfermedad de Alzheimer pueden reconocerse a partir de demencia característica, así como la presencia de factores de riesgo descritos anteriormente. Además, están disponibles varios ensayos de diagnóstico para identificar individuos que tienen AD. Estos incluyen medición de los niveles de tau y A∀42 en LCR. Los niveles de tau elevado y A∀42 reducido significan la presencia de AD. Los individuos que padecen enfermedad de Alzheimer también pueden diagnosticarse por criterios de ADRDA como se analiza en la sección de Ejemplos.

C. Regímenes y dosificaciones de tratamiento

En aplicaciones profilácticas, se administran composiciones o medicamentos farmacéuticos a un paciente susceptible de, o de otro modo en riesgo de, enfermedad de Alzheimer en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, reducir la gravedad, o retardar la aparición de la enfermedad, incluyendo síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, se administran composiciones o medicamentos a un paciente sospechoso de, o que ya padece dicha enfermedad en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad (bioquímicos, histológicos, y/o conductuales), incluyendo sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad.

En algunos procedimientos, la administración de agente reduce o elimina el deterioro miocognitivo en pacientes que aún no han desarrollado patología de Alzheimer característica. Una cantidad adecuada para conseguir tratamiento terapéutico o profiláctico se define como una dosis eficaz terapéutica o profilácticamente. En los regímenes tanto profilácticos como terapéuticos, se administran habitualmente agentes en varias dosificaciones hasta que se ha conseguido una respuesta inmune suficiente. La expresión “respuesta inmune” o “respuesta inmunológica” incluye el desarrollo de una respuesta humoral (mediada por anticuerpos) y/o una celular (mediada por linfocitos T específicos de antígeno o sus productos de secreción) dirigida contra un antígeno en un sujeto receptor. Dicha respuesta puede ser una respuesta activa, es decir, inducida por administración de inmunógeno, o una respuesta pasiva, es decir, inducida por administración de inmunoglobulina o anticuerpo o linfocitos T estimulados. Típicamente, se supervisa la respuesta inmune y se proporcionan dosificaciones repetidas si la respuesta inmune comienza a disminuir.

Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención para el tratamiento de las afecciones anteriormente descritas varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo medio de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o animal, otras medicaciones administradas, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Habitualmente, el paciente es un ser humano pero también pueden tratarse mamíferos no humanos incluyendo mamíferos transgénicos. Las dosificaciones de tratamiento deben titularse para optimizar la seguridad y eficacia.

Para inmunización pasiva con un anticuerpo, la dosificación varía de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg (por ejemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), del peso corporal del huésped. Por ejemplo las dosificaciones pueden ser 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg, preferentemente al menos 1 mg/kg. En otro ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 0,5 mg/kg de peso corporal o 15 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 0,5-15 mg/kg, preferentemente al menos 1 mg/kg. En otro ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 0,5 mg/kg de peso corporal o 20 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 0,5-20 mg/kg, preferentemente al menos 1 mg/kg. En otro ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 0,5 mg/kg de peso corporal o 30 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 0,5-30 mg/kg, preferentemente al menos 1 mg/kg. En un ejemplo preferido, las dosificaciones pueden ser de aproximadamente 30 mg/kg. En un ejemplo particularmente preferido, el anticuerpo 15C11 se administra por vía intraperitoneal a un intervalo de dosificación de aproximadamente 0,3 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg.

También se pretende que las dosis intermedias en los intervalos anteriores estén dentro del alcance de la invención. Se pueden administrar a los sujetos dichas dosis diariamente, en días alternos, semanalmente o de acuerdo con cualquier otro programa determinado por análisis empírico. Un tratamiento ejemplar implica administración en múltiples dosificaciones durante un periodo prologando, por ejemplo, de al menos seis meses. Los regímenes de tratamiento ejemplares adicionales implican administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los programas de dosificación ejemplares incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos o 60 mg/kg semanalmente. En algunos procedimientos, se administran dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión simultáneamente, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado queda dentro de los intervalos indicados.

Habitualmente se administra anticuerpo en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosificaciones únicas pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica por la medición de los niveles en sangre de anticuerpo para A∀ en el paciente. En algunos procedimientos, la dosificación se ajusta para conseguir una concentración de anticuerpo en plasma de 1-1000 !g/ml y en algunos procedimientos

5 25-300 !g/ml. Como alternativa, se puede administrar anticuerpo como una formulación de liberación prolongada, en cuyo caso se requiere administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia varía dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanizados muestran la semivida más larga, seguido de anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos.

La dosificación y frecuencia de administración puede variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o

10 terapéutico. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los presentes anticuerpos o un cóctel de los mismos se administran a un paciente que no tenga ya la patología para potenciar la resistencia del paciente. Se define que dicha cantidad es una “dosis profiláctica eficaz”. En este uso, las cantidades precisas dependen de nuevo del estado de salud del paciente y la inmunidad general, pero en general varían de 0,1 a 25 mg por dosis, especialmente de 0,5 a 2,5 mg por dosis. Se administra una dosificación relativamente baja a intervalos

15 relativamente infrecuentes durante un periodo de tiempo largo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de su vida.

En pacientes asintomáticos, el tratamiento puede comenzar a cualquier edad (por ejemplo, 10, 20, 30). Habitualmente, sin embargo, no es necesario comenzar el tratamiento hasta que un paciente alcanza 40, 50, 60 ó

70. El tratamiento implica típicamente múltiples dosificaciones durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede

20 supervisarse ensayando los niveles de anticuerpo a lo largo del tiempo. Si la respuesta cae, se indica una dosificación de refuerzo. En el caso de pacientes con síndrome de Down potencial, el tratamiento puede comenzar antes del nacimiento administrando agente terapéutico a la madre o poco después del nacimiento.

En aplicaciones terapéuticas, en ocasiones se requiere una alta dosificación (por ejemplo, de aproximadamente 1 a 200 mg de anticuerpo por dosis, usándose más habitualmente dosificaciones de 5 a 25 mg) a intervalos

25 relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduce o termina, y preferentemente hasta que el paciente muestra alivio parcial o completo de los síntomas de la enfermedad. A continuación, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico.

Las dosis para ácidos nucleicos que codifican anticuerpos varían de aproximadamente de 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 !g a 10 mg, o 30-300 !g de ADN por paciente. Las dosis para vectores virales infecciosos varían de 10-100 o

30 más, viriones por dosis.

Pueden administrarse agentes terapéuticos por medios parenterales, tópicos, intravenosos, orales, subcutáneos, intraarteriales, intracraneales, intraperitoneales, intranasales o intramusculares para tratamiento profiláctico y/o terapéutico. La vía más típica de administración de un agente inmunógeno es subcutánea aunque otras vías pueden ser igualmente eficaces. La siguiente vía más habitual es la inyección intramuscular. Este tipo de inyección se 35 realiza más típicamente en los músculos del brazo o la pierna. En algunos procedimientos, se inyectan agentes directamente en un tejido particular en el que se han acumulado depósitos, por ejemplo inyección intracraneal. Se prefiere inyección intramuscular o infusión intravenosa para administración del anticuerpo. En algunos procedimientos, se inyectan anticuerpos terapéuticos particulares directamente en el cráneo. En algunos procedimientos, se administran anticuerpos como una composición o dispositivo de liberación prolongada, tal como

40 un dispositivo MEDIPAD™.

Pueden administrarse opcionalmente agentes de la invención en combinación con otros agentes que son al menos parcialmente eficaces en el tratamiento de enfermedad amiloidogénica. En ciertas realizaciones, se administra un anticuerpo humanizado de la invención (por ejemplo, 15C11 humanizado) en combinación con un segundo agente inmunogénico o inmunológico. Por ejemplo, puede administrarse un anticuerpo 15C11 humanizado de la invención 45 en combinación con otro anticuerpo humanizado para A∀. En otras realizaciones, se administra un anticuerpo humanizado a un paciente que ha recibido o está recibiendo una vacuna de A∀. En el caso de enfermedad de Alzheimer y síndrome de Down, en los que aparecen depósitos amiloides en el cerebro, también se pueden administrar agentes de la invención junto con otros agentes que aumentan el paso de los agentes de la invención a través de la barrera hematoencefálica. Los agentes de la invención también pueden administrarse en combinación

50 con otros agentes que potencian el acceso del agente terapéutico a una célula o un tejido diana, por ejemplo, liposomas y similares. La coadministración de tales agentes puede reducir la dosificación de un agente terapéutico (por ejemplo, anticuerpo o cadena de anticuerpo terapéutico) necesaria para conseguir un efecto deseado.

D. Composiciones farmacéuticas

Con frecuencia se administran agentes de la invención como composiciones farmacéuticas que comprenden un

55 agente terapéutico activo, es decir, y una diversidad de otros componentes farmacéuticamente aceptables. Véase, Remington’s Pharmaceutical Science (15ª ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980)). La forma preferida depende del modo pretendido de administración y aplicación terapéutica. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables no tóxicos, que se definen como vehículos habitualmente usados para formular composiciones farmacéuticas para administración animal o humana. El diluyente se selecciona para no afectar a la actividad biológica de la combinación. Los ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solución salina tamponada con fosfato fisiológica, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica puede incluir también otros vehículos, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y

5 similares.

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir macromoléculas grandes, que se metabolizan lentamente tales como proteínas, polisacáridos tales como quitosán, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (tales como Sepharose (TM) funcionalizado con látex, agarosa, celulosa y similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados lipídicos (tales como gotas de aceite o liposomas). Adicionalmente, estos

10 vehículos pueden actuar como agentes inmunoestimuladores (es decir, adyuvantes).

Para administración parenteral, los agentes de la invención pueden administrarse como dosificaciones inyectables de una solución o suspensión de la sustancia en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéutico que puede ser un líquido estéril tal como agua, aceites, solución salina, glicerol o etanol. Adicionalmente, pueden estar presentes en composiciones sustancias adyuvantes, tales como agentes humectantes 15 o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponantes de pH y similares. Otros componentes de composiciones farmacéuticas son las de origen animal, vegetal, sintético o del petróleo, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja y aceite mineral. En general, son vehículos líquidos preferidos glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol, particularmente para soluciones inyectables. Los anticuerpos puede administrarse en forma de una inyección de depósito o preparación de implante, que pueden formularse de tal manera que permita una liberación

20 prolongada del principio activo. Una composición ejemplar comprende un anticuerpo monoclonal a 5 mg/ml, formulado en tampón acuoso que consiste en L-histidina 50 mM, NaCl 150 mM, ajustado a pH 6,0 con HCl.

Típicamente, las composiciones se preparan como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución, o suspensión, en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas o micropartículas tales como

25 polilactida, poliglicolida o copolímero para potenciar el efecto adyuvante, como se ha analizado anteriormente, (véase, Langer, Science 249: 1527 (1990) y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97 (1997)). Los agentes de la presente invención pueden administrarse en forma de una inyección de depósito o preparación de implante, que puede formularse de tal manera que permita una liberación prolongada o pulsátil del principio activo.

Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales,

30 intranasales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas. Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos incluyen, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos. Tales supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contengan el principio activo en el intervalo de 0,5% a 10%, preferentemente 1%-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes, tales como usos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones toman la forma de soluciones,

35 suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación prolongada o polvos y contienen 10%95% de principio activo, preferentemente 25%-70%.

La aplicación tópica puede dar como resultado suministro transdérmico o intradérmico. La administración tópica puede facilitarse por coadministración del agente con toxina del cólera o derivados detoxificados o subunidades de los mismos u otras toxinas bacterianas similares (véase, Glenn y col., Nature 391, 851 (1998)). Puede conseguirse

40 coadministración usando los componentes como una mezcla o como moléculas unidas obtenidas por reticulación química o expresión como una proteína de fusión.

Como alternativa, puede conseguirse suministro transdérmico usando un parche cutáneo o usando transferosomas (Paul y col., Eur. J. Immunol. 25: 3521 (1995); Cevc y col., Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15 (1998)).

E. Supervisión del ciclo de tratamiento.

45 La divulgación proporciona procedimientos para supervisar el tratamiento en un paciente que padezca o sea susceptible a enfermedad de Alzheimer, es decir, para supervisar un ciclo de tratamiento que se administre a un paciente. Los procedimientos pueden usarse para supervisar tanto tratamiento terapéutico en pacientes sintomáticos como tratamiento profiláctico en pacientes asintomáticos. En particular, los procedimientos son útiles para supervisar la inmunización pasiva (por ejemplo, medir el nivel de anticuerpo administrado).

50 Algunos procedimientos implican determinar un valor de línea basal, por ejemplo, de un nivel o perfil de anticuerpo en un paciente, antes de administrar una dosificación de agente, y comparar este con un valor para el perfil o nivel después del tratamiento. Un aumento significativo (es decir, mayor que el margen típico de error experimental en mediciones de repetición de la misma muestra, expresado como una desviación típica de la media de tales mediciones) en el valor del nivel o perfil señala un posible resultado del tratamiento (es decir, que la administración

55 del agente ha conseguido una respuesta deseada). Si el valor para respuesta inmune no cambia significativamente,

o se reduce, se indica un resultado del tratamiento negativo.

En otros procedimientos, se determina un valor de control (es decir, una media y desviación típica) del nivel o perfil para una población de control. Típicamente los individuos en la población de control no han recibido tratamiento previo. Los valores medidos del nivel o perfil en un paciente después de administrar un agente terapéutico se comparan después con el valor de control. Un aumento significativo en relación con el valor de control (por ejemplo, mayor que una desviación típica de la media) señala un resultado de tratamiento positivo o suficiente. Una falta de aumento significativo o una reducción señala un resultado de tratamiento negativo o insuficiente. La administración

5 del agente generalmente se continúa mientras el nivel aumenta en relación con el valor de control. Como antes, la consecución de una meseta en relación con los valores de control es un indicador de que la administración de tratamiento puede detenerse o reducirse en su dosificación y/o frecuencia.

En otros procedimientos, se determina un valor de control del nivel o perfil (por ejemplo, una media y desviación típica) a partir de una población de control de individuos que se han sometido a tratamiento con un agente 10 terapéutico y cuyos niveles o perfiles han alcanzado una meseta en respuesta a tratamiento. Los valores medidos de niveles o perfiles en un paciente se comparan con el valor de control. Si el nivel medido en un paciente no es significativamente diferente (por ejemplo, más de una desviación típica) del valor de control, el tratamiento puede detenerse. Si el nivel en un paciente es significativamente inferior al valor de control, se garantiza la administración continuada del agente. Si el nivel en el paciente persiste por debajo del valor de control, entonces puede indicarse

15 un cambio en el tratamiento.

En otros procedimientos, se supervisa un paciente que no está recibiendo en la actualidad tratamiento pero ha experimentado un ciclo previo de tratamiento con respecto a niveles o perfiles de anticuerpo para determinar si se requiere una reanudación de tratamiento. El nivel o perfil medido en el paciente puede compararse con un valor previamente conseguido en el paciente después de un ciclo previo de tratamiento. Una reducción significativa en 20 relación con la medición previa (es decir, mayor que un margen típico de error en las mediciones repetidas de la misma muestra) es un indicio de que el tratamiento puede reanudase. Como alternativa, el valor medido en un paciente puede compararse con un valor de control (media más desviación típica) determinado en una población de pacientes después someterse a un ciclo de tratamiento. Como alternativa, el valor medido en un paciente puede compararse con un valor de control en poblaciones de pacientes tratados profilácticamente que permanecen sin

25 síntomas de enfermedad, o poblaciones de pacientes tratados terapéuticamente que muestran alivio de las características de la enfermedad. En todos estos casos, una reducción significativa en relación con el nivel de control (es decir, más de una desviación típica) es un indicio de que debería reanudarse el tratamiento en un paciente.

La muestra tisular para análisis es típicamente sangre, plasma, suero, fluido mucoso o líquido cefalorraquídeo del

30 paciente. La muestra se analiza, por ejemplo, con respecto a niveles o perfiles de anticuerpos para péptido A∀, por ejemplo, niveles o perfiles de anticuerpos humanizados. Se describen procedimientos de ELISA para detectar anticuerpos específicos para A∀ en la sección de Ejemplos. En algunos procedimientos, el nivel o perfil de un anticuerpo administrado se determina usando un ensayo de eliminación, por ejemplo, en un ensayo de fagocitosis in vitro, como se describe en el presente documento. En tales procedimientos, se pone en contacto una muestra tisular

35 de un paciente que se ensaya con depósitos amiloides (por ejemplo, de un ratón PDAPP) y células fagocíticas que portan receptores de Fc. Después se supervisa la eliminación posterior del depósito amiloide. La existencia y el alcance de la respuesta de eliminación proporciona un indicio de la existencia y nivel de anticuerpos eficaces para eliminar A∀ en la muestra tisular del paciente que se ensaya.

El perfil de anticuerpos después de inmunización pasiva típicamente muestra un pico inmediato en la concentración

40 de anticuerpo seguido de una caída exponencial. Sin una dosificación adicional, la caída se acerca a los niveles previos al tratamiento en un periodo de días a meses dependiendo de la semivida del anticuerpo administrado.

En algunos procedimientos, se realiza una medición de línea basal del anticuerpo para A∀ en el paciente antes de la administración, se realiza una segunda medición poco después para determinar el nivel pico del anticuerpo, y se realizan una o más mediciones adicionales a intervalos para supervisar la caída de los niveles de anticuerpo. 45 Cuando el nivel de anticuerpo se ha reducido hasta la línea basal o un porcentaje predeterminado del pico menos la línea basal (por ejemplo, 50%, 25% o 10%), se administra la administración de una dosificación adicional de anticuerpo. En algunos procedimientos, los niveles de pico o medidos posteriormente menos el fondo se comparan con niveles de referencia que se ha determinado previamente que constituyen un régimen de tratamiento profiláctico

o terapéutico beneficioso en otros pacientes. Si el nivel de anticuerpo medido es significativamente menor que un

50 nivel de referencia (por ejemplo, menor que la media menos una desviación típica del valor de referencia en la población de pacientes que se beneficia del tratamiento) se indica la administración de una dosificación adicional del anticuerpo.

Los procedimientos adicionales incluyen supervisión, durante el ciclo de tratamiento, de cualquier síntoma fisiológico reconocido en la técnica (por ejemplo, síntoma físico o mental) en el que se basan rutinariamente los investigadores

55 o médicos para diagnosticar o supervisar enfermedades amiloidogénicas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer). Por ejemplo, se puede supervisar el deterioro cognitivo. Este último es un síntoma de enfermedad de Alzheimer y síndrome de Down pero también puede aparecer sin otras características de una de estas enfermedades. Por ejemplo, el deterioro cognitivo puede supervisarse determinando la puntuación en un paciente en el Mini Examen de Estado Mental de acuerdo con la convención durante el ciclo de tratamiento.

F. Kits

La divulgación proporciona además kits para realizar los procedimientos de supervisión descritos anteriormente. Típicamente, tales kits contienen un agente que se unen específicamente a anticuerpos para A∀. El kit también puede incluir un marcador. Para detección de anticuerpos para A∀, el marcador típicamente está en forma de 5 anticuerpos anti-idiotípicos marcados. Para detección de anticuerpos, el agente puede proporcionarse previamente unido a una fase sólida, tal como a los pocillos de una placa de microtitulación. Los kits también contienen típicamente etiquetas que proporcionan instrucciones para el uso del kit. Las etiquetas también pueden incluir un diagrama u otro régimen de correspondencia que correlaciona niveles de marcador medidos con niveles de anticuerpos para A∀. El término etiquetado se refiere a cualquier material escrito o grabado que se une a, o

10 acompaña de otro modo un kit en cualquier momento durante su fabricación, transporte, venta o uso. Por ejemplo, el término etiquetado abarca folletos y octavillas de publicidad, materiales de envasado, instrucciones, casetes de audio o video, discos para ordenador, así como escritura impresa directamente en los kits.

La divulgación también proporciona kits de diagnóstico, por ejemplo, kits de investigación, detección y/o diagnóstico (por ejemplo, para realizar captura de imágenes in vivo). Tales kits típicamente contienen un anticuerpo para unión a

15 un epítopo de A∀, en el que el epítopo es accesible para el anticuerpo (por ejemplo, el epítopo es accesible en A∀ asociado a placas o depósitos amiloides), por ejemplo, restos 13-28. Preferentemente, el anticuerpo está marcado o se incluye un segundo reactivo de marcaje en el kit. Preferentemente, el kit está etiquetado con instrucciones para realizar la aplicación pretendida, por ejemplo, para realizar un ensayo de formación de imágenes in vivo. Son anticuerpos ejemplares los descritos en el presente documento.

20 F. Formación de imágenes in vivo

La divulgación describe procedimientos para formación de imágenes in vivo de depósitos amiloides en un paciente. Tales procedimientos son útiles para diagnosticar o confirmar el diagnóstico de enfermedad de Alzheimer, o susceptibilidad a la misma. Por ejemplo, los procedimientos pueden usarse en un paciente que presente síntomas de demencia. Si el paciente tiene depósitos amiloides anómalos, entonces el paciente probablemente padezca

25 enfermedad de Alzheimer. Los procedimientos también pueden usarse en pacientes asintomáticos. La presencia de depósitos anómalos de amiloide indica susceptibilidad a enfermedad sintomática futura. Los procedimientos también son útiles para supervisar la progresión de enfermedad y/o respuesta a tratamiento en pacientes a los que se ha diagnosticado previamente enfermedad de Alzheimer.

Los procedimientos funcionan administrando un reactivo, tal como un anticuerpo que se une a A∀, al paciente y a

30 continuación detectando el agente después de que se haya unido. Los anticuerpos preferidos se unen a depósitos de A∀ en un paciente sin unirse a polipéptido APP de longitud completa. Ciertos anticuerpos se unen sin inducir una respuesta de eliminación sustancial. Otros anticuerpos se unen e inducen una respuesta de eliminación para A∀. Sin embargo, la respuesta de eliminación puede evitarse usando fragmentos de anticuerpo que carezcan de una región constante de longitud completa, tales como Fab. En algunos procedimientos, el mismo anticuerpo puede actuar

35 como un reactivo tanto de tratamiento como de diagnóstico.

Pueden administrarse reactivos de diagnóstico por inyección intravenosa al cuerpo del paciente, o directamente al cerebro por inyección intracraneal o taladrando un orificio a través del cráneo. La dosificación de reactivo debería estar dentro de los mismos intervalos que para los procedimientos de tratamiento. Típicamente, el reactivo está marcado, aunque en algunos procedimientos el reactivo primario con afinidad por A∀ no está marcado y se usa un

40 agente de marcaje secundario para unirse al reactivo primario. La elección de marcador depende del medio de selección. Por ejemplo, un marcador fluorescente es adecuado para detección óptica. El uso de marcadores paramagnéticos es adecuado para detección tomográfica sin intervención quirúrgica. Los marcadores radiactivos también pueden detectarse usando PET o SPECT.

Se realiza diagnóstico comparando el número, tamaño y/o intensidad de lugares marcados, con valores de línea

45 basal correspondientes. Los valores de línea basal pueden representar los niveles medios en una población de individuos no enfermos. Los valores de línea basal también pueden representar niveles previos determinados en el mismo paciente. Por ejemplo, los valores de línea basal pueden determinarse en un paciente antes de comenzar el tratamiento, y los valores medidos a continuación compararse con los valores de línea basal. Una reducción de los valores en relación con la línea basal señala una posible respuesta al tratamiento.

50 La presente invención se describirá más completamente por los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Los siguientes identificadores de Secuencia se usan a lo largo de la sección de Ejemplos para referirse a secuencias de aminoácidos y nucleótidos de región variable de cadena de inmunoglobulina.

Anticuerpo Secuencia de Secuencia de Secuencia de Secuencia de nucleótidos VL aminoácidos VL nucleótidos VH aminoácidos VH

15C11

SEC ID Nº: 1 SEC ID Nº: 2 SEC ID Nº: 3 SEC ID Nº: 4

(codificante)

(codificante)

9G8

SEC ID Nº: 8 SEC ID Nº: 5

266

SEC ID Nº: 9 SEC ID Nº: 6

Como se usa a lo largo de la memoria descriptiva, una secuencia de inmunoglobulina o anticuerpo que comprende una secuencia VL y/o VH como se expone en una cualquiera de SEC ID Nº: 1-9 puede comprender (o codificar) la secuencia completa o puede comprender la secuencia madura (es decir, péptido maduro sin el péptido señal o líder).

Ejemplo I. Eficacia in vivo de anticuerpo 15C11 de ratón

El anticuerpo de ratón 15C11 mejora la cognición in vivo.

Para determinar la eficacia in vivo de 15C11, se administraron anticuerpos (incluyendo 15C11) a ratones de tipo silvestre y Tg2576 a 3 mg/kg, 10 mg/kg y 30 mg/kg. Los ratones se ensayaron con respecto a condicionamiento de miedo contextual como se ha descrito en el presente documento.

Los ratones Tg2576 a los que se administraron 30 mg/kg de 15C11 presentaron inversión del déficit de memoria completa y significativa (véase Figura 1). Además, se descubrió una tendencia hacia ausencia de alteración en animales que recibieron 3 mg/kg y 10 mg/kg (véase Figura 2) (p valor = 0,1246 a 3 mg/kg de 15C11; 0,1156 a 10 mg/kg de 15C11; 0,0274 a 30 mg/kg de 15C11).

Los ratones que presentaron inversión en déficit de memoria lo hicieron en un periodo de tiempo corto. Sin quedar ligado a lo siguiente, esta mejora rápida de la cognición en ratones a los que se administró 15C11 sugiere un mecanismo de acción de 15C11 que implica la captura de A∀ soluble en la sangre y la posterior retirada de A∀ del SNC al plasma.

Ejemplo II. Capacidad de captura de 15C11 de ratón

Se ensayó la capacidad de diversos anticuerpos (incluyendo 15C11) para capturar A∀ soluble como sigue. Se incubaron diversas concentraciones de anticuerpo (hasta 10 !g/ml) con 50.000 CPM de 125I-A∀ 1-42 (o 125I-A∀ 1-40). Se determinó la concentración de anticuerpo suficiente para unir el 25% de las cuentas radiactivas en un radioinmunoensayo de captura. Ciertos anticuerpos no se unieron al 25% de las cuentas a la mayor concentración ensayada (es decir, 10 !g/ml). Para tales anticuerpos, se determinó el porcentaje de cuentas unidas a 10 !g/ml. A 3 !g/ml, 15C11 se unió al 25% de las cuentas radiactivas (es decir, 125I-A∀). Esta captura fue significativa en comparación con otros anticuerpos monoclonales inducidos contra fragmentos de A∀ centrales (por ejemplo, A∀ 1328 o A∀ 17-28). El intervalo de concentraciones necesario para capturar el 25% del A∀ marcado para tales anticuerpos es de aproximadamente 0,1 !g/ml a 10 !g/ml capturando algunos anticuerpos menos del 25% de A∀ marcado (por ejemplo, 10-20%) cuando se ensayan a 10 !g/ml.

La capacidad de 15C11 también se ensayó con respecto a su capacidad para unirse a oligómeros de A∀ solubles, por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. (y monómeros de A∀). Se solubilizó el péptido A∀ 1-42 (sintético, purificado) en hexafluoroisopropanol (HFIP), se secó en vacío, se resuspendió en DMSO y se diluyó en medio de cultivo F12 frío. Se formaron oligómeros en presencia de agente de reticulación de peroxinitrato. El reactivo oligomérico se inmunoprecipitó. Los inmunoprecipitados se visualizaron después de SDS-PAGE usando el anticuerpo 3D6 como agente detector. 15C11 mostró afinidad preferente por especies de A∀ oligoméricas en comparación con A∀ monomérico. Esta unión preferente se correlaciona con la eficacia en el modelo animal de CFC descrito anteriormente y es predictiva de la eficacia terapéutica del anticuerpo (por ejemplo, consecución de mejora rápida de la cognición) in vivo.

Ejemplo III. Clonación y secuenciación de las regiones variables de 15C11 de ratón

Clonación y análisis de secuencia de VL de 15C11. La región variable de cadena ligera VL de 15C11 se clonó de una manera análoga a la región VH. La secuencia de nucleótidos (codificante SEC ID Nº: 1) y secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº: 2) derivadas de dos clones de ADNc independientes que codificaban el dominio de VL de 15C11 supuesto, se exponen en la Tabla 1 y Tabla 2, respectivamente.

Tabla 1: Secuencia de ADN de VL de 15C11 de ratón

Tabla 2: Secuencia de aminoácidos de VL de 15C11 de ratón

5 * El péptido líder y las CDR en minúsculas.

Clonación y análisis de secuencia de VH de 15C11.

Las regiones VL y VH de 15C11 de células de hibridoma se clonaron por RT-PCR y 5’ RACE usando ARNm de células de hibridoma y metodología de clonación convencional. La secuencia de nucleótidos (codificante, SEC ID Nº: 3) y secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº: 4) derivadas de clones de ADNc independientes que

10 codificaban el dominio de VH de 15C11 supuesto, se exponen en la Tabla 3 y Tabla 4 respectivamente.

Tabla 3. Secuencia de ADN de VH de 15C11 de ratón

Tabla 4: Secuencia de aminoácidos de VH de 15C11 de ratón

* El péptido líder y las CDR en minúsculas.

Las secuencias VL y VH de 15C11 cumplen los criterios de regiones V funcionales porque contienen una ORF contigua desde la metionina de inicio a la región C, y comparten restos conservados característicos de genes de región V de inmunoglobulina. Del extremo N terminal al C terminal, las cadenas tanto ligeras como pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.

5 Se realizó un ensayo de mapa epitópico que identificó los restos 19-22 de A∀, como el epítopo para 15C11 (véase Figura 3).

Ejemplo IV. Eficacia in vitro de diversos anticuerpos de A que se unen a A∀ oligomérico, soluble

En este ejemplo, la preparación de A∀ se derivó de oligómeros A∀ sintéticos sustancialmente como sigue:

(1) se disolvió péptido A∀1-42 liofilizado a 1 mM en hexafluoroisopropanol al 100% (HFIP) (mezclado y después

10 incubado a temperatura ambiente durante 1 hora) y se separó en alícuotas en tubos de microcentrífuga (conteniendo cada tubo 0,5 mg de péptido A∀1-42);

(2)

el HFIP se retiró por evaporación seguido de liofilización para retirar HFIP residual;

(3)

la película/resto de péptido A∀ resultante se almacenó, desecado, a -20 ºC;

(4)

el resto de péptido A∀ se resuspendió en DMSO a una concentración final de 5 mM de péptido, después se

15 añadió a medio de cultivo F-12 (sin rojo fenol) de Ham helado para llevar el péptido a una concentración final de 100 !M;

(5)

el péptido se incubó a 4 ºC durante 24 horas para producir oligómeros de A∀ sintéticos a una concentración de aproximadamente 100 !M; y

(6)

los oligómeros de A∀ sintéticos se trataron con peroxinitrito.

20 Se puso después en contacto cada una de las partes de la preparación de A∀ con un reactivo inmunológico de ensayo, en este caso anticuerpos, y se extrajeron los monómeros de A∀ y uno o más oligómeros de A∀ que se unieron al reactivo inmunológico de ensayo a partir de la preparación de A∀ por inmunoprecipitación. Los diversos inmunoprecipitados se separaron por electroforesis en gel y se inmunotransfirieron con el anticuerpo 3D6 sustancialmente como sigue. Se diluyeron muestras de inmunoprecipitado de la Figura 6 en tampón de muestra y se

25 separaron por SDS-PAGE en un gel de Tricina 16%. La proteína se transfirió a membranas de nitrocelulosa, las membranas se hirvieron en PBS, y después se bloquearon durante una noche a 4 ºC en una solución de TBS/Tween/leche en polvo Carnation 5%. Las membranas se incubaron después con 3D6, un anticuerpo de A∀ monoclonal de ratón para los restos 1-5. Para la detección, las membranas se incubaron con Ig anti-ratón-HRP, desarrollado usando ECL Plus, y se visualizó usando película. La base molecular se estimó por marcadores de peso

30 molecular Plus2 SeeBlue™.

La Figura 6 representa los resultados del contacto de las muestras de la preparación de A∀1-42 anterior con diversos anticuerpos A∀ para determinar la unión con monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, etc. de A∀ en la preparación de A∀. La Figura 6 representa transferencias de Western (con imágenes realizadas con 15C11) de inmunoprecipitados de una preparación de A∀1-42 oligomérico tratado con peroxinitrito puesta en contacto con 35 diversos anticuerpos de A∀. Las posiciones aproximadas de bandas de monómero, dímero, trímero y tetrámero de A∀1-42 se indican en el lateral izquierdo de cada figura. Se indica debajo de cada anticuerpo de A∀ el epítopo de A∀ reconocido por el anticuerpo y los resultados de ensayo de CFC para el anticuerpo. Una notación “+” indica una observación de cognición aumentada tras el tratamiento con el anticuerpo, una notación “-“ indica una observación de ausencia de cambio en la cognición tras el tratamiento con el anticuerpo, una notación “+/-“ indica una

40 observación de una tendencia de cognición aumentada tras el tratamiento con el anticuerpo pero que no es estadísticamente suficientemente significativa para indicarse como una observación de cognición aumentada, y la anotación “ND” indica que no hay datos de ensayo de CFC disponibles o comparados para este anticuerpo.

En la Figura 6, un aumento de la unión de un anticuerpo de A∀ para dímeros de A∀ u oligómeros de orden mayor en la preparación de A∀, en relación con la unión del anticuerpo de A∀ para monómeros de A∀ en la preparación de A∀,

45 predice que el anticuerpo de A∀ tiene eficacia terapéutica para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer. Notablemente, los anticuerpos de A∀ 3D6, 15C11, 10D5, 12A11 y 266 mostraron unión preferente para especies de A∀ oligoméricas en comparación con A∀ monomérico mostrando 12A11 la unión preferente más significativa con A∀ oligomérico. En consecuencia, se predice que estos anticuerpos tendrán eficacia terapéutica en el tratamiento de déficits cognitivos, por ejemplo, los asociados con AD.

50 Ejemplo V. Prevención y tratamiento de pacientes humanos

Se realiza un ensayo de fase I de una dosis para determinar la seguridad en seres humanos. Se administra un agente terapéutico en dosis crecientes a diferentes pacientes a partir de aproximadamente 0,01 del nivel de eficacia supuesta, y aumentando en un factor de tres hasta que se alcanza un nivel de aproximadamente 10 veces la dosificación eficaz de ratón.

55 Se realiza un ensayo de fase II para determinar la eficacia terapéutica. Se seleccionan pacientes con enfermedad de Alzheimer de temprana a media definida usando los criterios de la Asociación de enfermedad de Alzheimer y

Trastornos Relacionados (ADRDA) para AD probable. Los pacientes adecuados puntúan en el intervalo de 12-26 en el Mini Examen de Estado Mental (MMSE). Otros criterios de selección son si los pacientes probablemente sobreviven durante el transcurso del estudio y carecen de factores de complicación tales como el uso de medicaciones conjuntas que puedan interferir. Las evaluaciones de línea basal de la función del paciente se realizan usando medidas psicométricas clásicas, tales como el MMSE, y el ADAS, que es una escala exhaustiva para evaluar pacientes con estado y función de enfermedad de Alzheimer. Estas escalas psicométricas proporcionan una medida de la progresión de la afección del Alzheimer. También pueden usarse escalas cualitativas de vida adecuadas para supervisar el tratamiento. La progresión de enfermedad también puede supervisarse por MRI. También pueden supervisarse los perfiles sanguíneos de los pacientes incluyendo ensayos de respuestas de linfocitos T y anticuerpos específicos de inmunógenos.

Después de las mediciones de línea basal, los pacientes comienzan a recibir tratamiento. Se seleccionan aleatoriamente y se tratan con agente terapéutico o placebo en un ensayo ciego. Los pacientes se supervisan al menos cada seis meses. La eficacia se determina por una reducción significativa de la progresión de un grupo de tratamiento en relación con un grupo de placebo.

Se realiza un segundo ensayo de fase II para evaluar la conversión de los pacientes de pérdida de memoria temprana no de enfermedad de Alzheimer, en ocasiones denominada deterioro de la memoria asociada con la edad (AAMI) o deterioro cognitivo leve (MCI), a probable enfermedad de Alzheimer como se define por los criterios de ADRDA. Se seleccionan pacientes con alto riesgo de conversión a enfermedad Alzheimer a partir de una población no clínica explorando las poblaciones de referencia con respecto a señales tempranas de pérdida de memoria u otras dificultades asociadas con sintomatología previa a Alzheimer, un historial familiar de enfermedad de Alzheimer, factores de riesgo genéticos, edad, sexo y otras características que se ha descubierto que predicen alto riesgo para enfermedad de Alzheimer. Se recogen puntuaciones de línea basal en medidas adecuadas incluyendo el MMSE y el ADAS junto con otras medidas diseñadas para evaluar a una población más normal. Estas poblaciones de pacientes se dividen en grupos adecuados con comparación con placebo frente a alternativas de dosificación con el agente. Estas poblaciones de pacientes se siguen a intervalos de aproximadamente seis meses, y el criterio de valoración para cada paciente es si evoluciona o no a enfermedad de Alzheimer probable como se define por los criterios de ADRDA al final de la observación.

Aunque la invención anterior se ha descrito en detalle para fines de claridad de entendimiento, resultará obvio que pueden realizarse ciertas modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

A partir de lo anterior resultará evidente que la invención posibilita varios usos. Por ejemplo, la invención posibilita el uso de cualquiera de los anticuerpos para A∀ descritos anteriormente en el tratamiento, profilaxis o diagnóstico de enfermedad amiloidogénica, o en la fabricación de un medicamento o composición de diagnóstico para su uso en la misma.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Wyeth y Neuralab y col.

<120> ANTICUERPOS HUMANIZADOS QUE RECONOCEN PÉPTIDO BETA AMILOIDE

<130> ELN-055PC

<150> 60/636684

<151>

<160> 27

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 390

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<221> sig_peptide

<222> (1)...(57)

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(390)

<400> 1

<210> 2

<213> Mus musculus

<220>

<221>

SEÑAL 10 <222> (1)...(19)

<400> 2

<210> 3

<213> Mus musculus

<220>

<221>

sig_peptide 10 <222> (1)...(57)

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(393) 15

<400> 3

<210> 4

<213> Mus musculus

<220>

<221>

SEÑAL 10 <222> (1)...(19)

<400> 4

<210> 6

<213> Mus musculus

<220>

<221>

SEÑAL 10 <222> (1)...(19)

<400> 6

<210> 8

<213> Mus musculus

<220>

<221>

SEÑAL 10 <222> (1)...(9)

<400> 8

<210> 10

<213> Mus musculus

<220>

<221>

VARIANTE 10 <222> 6

<223> Xaa = Arg o Asp

<220>

<221>

VARIANTE 15 <222> 8

15

<210> 5

<211> 131

<212> PRT

<213> Mus musculus

20

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(19)

25

<400> 5

15

<210> 7

<211> 133

<212> PRT

<213> Mus musculus

20

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(12)

25

<400> 7

15

<210> 9

<211> 131

<212> PRT

<213> Mus musculus

20

<220>

<221> SEÑAL

<222> (1)...(19)

25

<400> 9

<223> Xaa = Ser o Thr

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT 25 <213> Mus musculus

<220>

<220>

30 <221> VARIANTE

<222> 1,5,7

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<220>

35 <221> VARIANTE

<222> 3,4,8

<223> Xaa = Ser o Asn

<220>

40 <221> VARIANTE

<222> 15

<223> Xaa = Leu o Val

<400> 11 45

<210> 12

<211> 16 5 <212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221>

VARIANTE 10 <222> 7

<223> Xaa = Val o Ile.

<220>

<221>

VARIANTE 15 <222> 8

<223> Xaa = His o Tyr

<220>

<221>

VARIANTE 20 <222> 10

<223> Xaa = Asp o Asn

<220>

<221>

VARIANTE 25 <222> 13

<223> Xaa = Thr o Ala

<220>

<221>

VARIANTE 30 <222> 14

<223> Xaa = Tyr o Phe

<220>

<221>

VARIANTE 35 <222> 15

<223> Xaa = Leu o Phe

<400> 12

<210> 13

<211> 9

<212> PRT 45 <213> Mus musculus

<220>

<221> VARIANTE

<222>

4 50 <223> Xaa = Thr o Ala

<220>

<221> VARIANTE

<222>

7 55 <223> Xaa = Pro, puede estar o no presente

<400> 13

<210> 14

<211> 109

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> construcción sintética, secuencia consenso para la cadena kappa

<400> 14 10

<210> 15

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción sintética, secuencia consenso para la cadena kappa 20

<400> 15

25 <210> 16

<211> 110

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> construcción sintética, secuencia consenso para la cadena kappa

<400> 16

<210> 17

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción sintética, secuencia consenso para la cadena kappa 10

<400> 17

<210> 18

<211> 109

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

<223> construcción sintética, secuencia consenso para la cadena lambda

<400> 18 25

<210> 19

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción sintética, secuencia consenso para la cadena lambda 10

<400> 19

15 <210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> construcción sintética, secuencia consenso para la cadena lambda

<400> 20

<210> 21

<211> 120

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> construcción sintética, secuencia consenso para la región marco de cadena pesada

<400> 21 10

<210> 22

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción sintética, secuencia consenso para la región marco de cadena pesada 20

<400> 22

<400> 23

5 <210> 24

<211> 120

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> construcción sintética, secuencia consenso para la región marco de cadena pesada

<400> 24

<210> 25

<211> 119

<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción sintética, secuencia consenso para la región marco de cadena pesada

25 <400> 25 <210> 26

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> construcción sintética, secuencia consenso para la región marco de cadena pesada 10

<400> 26

15 <210> 27

<211> 123

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> construcción sintética, secuencia consenso para la región marco de cadena pesada

<400> 27

<210> 28

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética, ADN de región constante de cadena pesada de IgG 1 (solamente codones) 10

<400> 28

15 <210> 29

<211> 330

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Construcción sintética, proteína de región constante de cadena pesada de IgG1

<400> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Construcción sintética, ADN de región constante de cadena ligera kappa

<400> 30

<210> 31

<211> 106

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética, proteína de región constante de cadena ligera kappa

<400> 31

10 <210> 32

<211> 330

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> región constante de cadena pesada de IgG1

<400> 32

<210> 33

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Región constante de cadena pesada de IgG4 10

<400> 33

Claims (32)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo que se une a A∀, o un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo, en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende:

   a) una región variable de cadena ligera que comprende una primera, una segunda y una tercera región determinante de complementariedad (CDR), en la que la primera CDR comprende los aminoácidos 24-39 de SEC ID Nº: 2; la segunda CDR comprende los aminoácidos 55-61 de SEC ID Nº: 2; y la tercera CDR comprende los aminoácidos 94-101 de SEC ID Nº: 2; y b) una región variable de cadena pesada que comprende una primera, una segunda y una tercera CDR, en la que la primera CDR comprende los aminoácidos 26-35 de SEC ID Nº: 4 la segunda CDR comprende los aminoácidos 50-66 de SEC ID Nº: 4 y la tercera CDR comprende los aminoácidos 99-101 de SEC ID Nº: 4.

2. 2.

   Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la región variable de cadena ligera comprende un polipéptido que tiene al menos 85% de identidad con los aminoácidos 1-111 de SEC ID Nº: 2; y la región variable de cadena pesada comprende un polipéptido que tiene al menos 85% de identidad con los aminoácidos 1-112 de SEC ID Nº: 4.

3. 3.

   Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 que es un anticuerpo monoclonal.

4. 4.

   Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que es un anticuerpo quimérico que comprende regiones constantes humanas.

5. 5.

   Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que es un anticuerpo humanizado.

6. 6.

   Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 5 que comprende

   a) una región de cadena ligera humanizada que comprende las tres CDR de SEC ID Nº: 2 como se define en la reivindicación 1 (a), y un marco de región variable de una secuencia marco de región variable de cadena ligera humana que tiene opcionalmente al menos un resto marco seleccionado del grupo que consiste en un resto canónico, un resto de vernier, un resto de empaquetamiento y un resto poco habitual, ocupado por el mismo resto de aminoácido presente en la posición equivalente del marco de región variable de cadena ligera de SEC ID Nº: 2; y b) una cadena pesada humanizada que comprende las tres CDR de SEC ID Nº: 4 como se define en la reivindicación 1(b), y un marco de región variable de una secuencia marco de región variable de cadena pesada humana que tiene opcionalmente al menos un resto marco seleccionado del grupo que consiste en un resto canónico, un resto de vernier, un resto de empaquetamiento y un resto poco habitual, ocupado por el mismo resto de aminoácido presente en la posición equivalente del marco de la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 4.

7. 7.

   Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 6 en el que el marco de región variable de cadena ligera humana es de una región variable de cadena ligera kappa.

8. 8.

   Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 6 o la reivindicación 7 en el que el marco de región variable de cadena pesada humana es de una región variable de cadena pesada de IgG1 o IgG4.

9. 9.

   Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8 en el que:

   a) el marco de región variable de cadena ligera es de una cadena ligera humana que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEC ID Nº: 2; y/o b) el marco de región variable de cadena pesada es de una cadena pesada humana que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEC ID Nº: 4.

10. 10.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que se une específicamente a A∀ con una afinidad de unión de al menos 10-7 M como se midió por diálisis en equilibrio o el procedimiento BIACORE cinético.

11. 11.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que se une a péptido beta amiloide (A∀) soluble.

12. 12.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que se une a péptido beta amiloide (A∀) oligomérico.

13. 13.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que captura

    péptido beta amiloide (A∀).

14. 14.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que cruza la barrera hematoencefálica en un paciente.

15. 15.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que reduce la carga de placas de péptido amiloide en un paciente.

16. 16.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente para uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad amiloidogénica en un paciente.

17. 17.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso de acuerdo con la reivindicación 16 en el que la enfermedad amiloidogénica es enfermedad de Alzheimer.

18. 18.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso de acuerdo con la reivindicación 16 o la reivindicación 17 en el que el anticuerpo se administra a 1 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg.

19. 19.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente para uso como un medicamento.

20. 20.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 19 para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno amiloidogénico o relacionado con A∀.

21. 21.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 20 para uso en el tratamiento de enfermedad de Alzheimer

22. 22.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso de acuerdo con las reivindicaciones 19-21, en el que el paciente es humano.

23. 23.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso de acuerdo con las reivindicaciones 19-22, en el que el anticuerpo se administra a una dosis de 100 !g/kg a 100 mg/kg de peso corporal del paciente.

24. 24.

    Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso de acuerdo con las reivindicaciones 19-23 en el que se consigue mejora rápida de la cognición en un período de 48 horas desde la administración del anticuerpo.

25. 25.

    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-15 y un vehículo farmacéutico.

26. 26.

    Una molécula de ácido nucleico aislada o moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

27. 27.

    Una molécula o moléculas de ácido nucleico aisladas de acuerdo con la reivindicación 26 que comprenden las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 3.

28. 28.

    Un vector que comprende la molécula o moléculas de ácido nucleico de la reivindicación 26 o la reivindicación

29. 27.

30. 29.

    Una célula huésped no humana o una célula huésped humana no embrionaria aislada, que comprende la molécula o moléculas de ácido nucleico de la reivindicación 26 o la reivindicación 27.

31. 30.

    Un animal transgénico no humano que expresa un polipéptido codificado por la molécula o las moléculas de ácido nucleico de la reivindicación 26 o la reivindicación 27.

32. 31.

    Un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1-15 que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 29 en condiciones tales que se produzca el anticuerpo o fragmento y aislar dicho anticuerpo o fragmento del cultivo de células huésped.

    Figura 1

    Efecto de mAb de A CENTRALES 2B1, 1C2 y 15C11 en la memoria contextual en ratones Tg2576

    Figura 2

    Efecto de 15C11 de dosis baja en la memoria contextual en ratón Tg2576

    Figura 3

    Figura 4

    Figura 5

    FIGURA 6