JP2002501721A - 多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスのメンバーをコードする核酸配列を同定するための新規方法およびファージ - Google Patents

多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスのメンバーをコードする核酸配列を同定するための新規方法およびファージ

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ポリファージ粒子をスクリーニングすることのより多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスのメンバーをコードする核酸配列を同定する方法に関する。さらに、本発明は、本発明に従って核酸配列を同定するための生成物およびその用途に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明はポリファージ粒子をスクリーニングすることにより多量体（ポリ）ペ
プチドコンプレックスのメンバーをコードする核酸配列を同定する方法に関する
。さらに、本発明は、本発明に従って核酸配列を同定するための生成物およびそ
の用途に関する。 1988年にLadner(WO88/06630)がその最初の概念を示して以来、ファージ表面に
タンパク質のレパートリーを表現する原理は劇的な進歩を遂げ、実質的な成功を
収めてきた。一本鎖Fv(scFv)断片の表現として最初に提唱された方法は、ウシ膵
臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）（WO90/02809）、ヒト成長ホルモン（WO
92/09690）、およびＦａｂ断片のような多量体タンパク質の表現を含む種々の他
のタンパク質(WO91/17271, WO92/01047)の表現へと発展してきた。
【０００２】 Ｆａｂ断片は、可変および定常ドメイン（ＶＨ−ＣＨ１）を含む重鎖と非共有
結合する可変および定常ドメイン（ＶＬ−ＣＬ）を含む軽鎖からなる。Ｆａｂの
表現において、該鎖の１つがファージコートタンパク質と融合してファージ表面
に表現され、第二鎖は遊離形で発現し、両鎖が接して、Ｆａｂはファージ表面に
組み立てられる。 Ｆａｂファージ表現ライブラリーを構築し、スクリーニングするために種々の
フォーマットが開発されている。その最も簡単な形では、例えば重鎖のただ１つ
のレパートリーのみがファージまたはファージミドベクター上にコードされる。
対応する軽鎖または軽鎖のレパートリーは別個に発現する。Ｆａｂ断片は、軽鎖
がプラスミドから同時に発現する時は宿主細胞の内側で、また、重鎖をそれぞれ
表現する分泌ファージ粒子のコレクションが異なる宿主細胞から発現した軽鎖と
接触している場合は細胞外の媒質中で組み立てられる。ファージまたはファージ
ミドベクターはファージ粒子中にパッケージされているので、そのようなＦａｂ
ライブラリーをスクリーニングすることにより、該ベクターにコードされた重鎖
に関する情報が回収される。フォーマットを元に戻し、軽鎖のライブラリーを表
現させ、第一回で同定された１またはそれ以上の重鎖を同時発現させるかまたは
加え、Ｆａｂ断片を組み立てることにより、対応する軽鎖−重鎖ペアを同定する
ことができる。
【０００３】 多工程の手順を避けるために、１本の鎖はファージコートタンパク質の少なく
とも部分との融合物として発現することができ、第二の鎖は遊離形で発現するこ
とができる、両レパートリーを１ファージまたはファージミドベクターにクロー
ンすることができよう。選択後に、ファージ粒子は選択したＦａｂ断片の両鎖に
関する配列情報を含むであろう。そのようなフォーマットの欠点は、該ライブラ
リーの全体の複雑さが形質転換効率により制限されることである。したがって、
該ライブラリーのサイズは通常１０10メンバー以下であろう。種々の応用におい
て、１０14までのライブラリーサイズが有利であろう。したがって、Cre/lox系 （WO92/20791)またはattλ系(WO95/21914)に基づく部位特異的組換えを用いる方
法が提唱されてきた。そのなかで、ベクターの２つのコレクションが実質的に宿
主細胞内に導入されている。個々のベクター上に適切な組換え部位を提供するこ
とにより、ベクター間の組換えは適切なレコンビナーゼまたはインテグラーゼの
作用により達成することができ、組換えライブラリーが達成される（ここで、全
体的なリブラリーのサイズは２つの個々のコレクションのサイズの積である）。
Cre/lox系の欠点は、組換えがあまり効率的ではなく、種々の生成物が生じ、可 逆的であることである。attλ系は一定の生成物を生じるが、ファージの産生に 否定的な影響を持つ１つの非常に大きなプラスミドを生じる。さらに、レコンビ
ナーゼまたはインテグラーゼの作用によりおそらく望ましくない組換えが生じる
。
【０００４】 すなわち、本発明の根本的な技術的課題は、ファージ表現系において、Ｆａｂ
断片の重および軽鎖の同定といった多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスのメ
ンバーを同時に同定することができる単純で信頼できる系を開発することである
。この技術的課題の解決は、請求の範囲に特徴づけられた態様を提供することに
より達成される。したがって、本発明では、多量体（ポリ）ペプチドコンプレッ
クスの大きなライブラリーについて、Ｆａｂ断片ライブラリーをスクリーニング
する場合のように標的と結合するような特性や、多量体酵素のライブラリーの場
合のように酵素活性のような特性を簡単に作りだし、スクリーニングすることが
できる。本発明の技術的アプローチ、すなわち、組換えを必要としない２つの異
なるベクターにコードされた多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの２つのメ
ンバーに関する情報の回収は、先行技術には開示も示唆もされていない。 したがって、本発明は、多くの多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスを表現
するファージ粒子の組合せライブラリー中に含まれる、予め決定された特性を有
する多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの２つのメンバーをコードする核酸
配列の組合せを同定するための、該組合せを含むポリファージ粒子のスクリーニ
ングまたは選択を特徴とする方法に関する。
【０００５】 驚くべきことに、ポリファージの現象は、ファージ表現系中の多量体（ポリ）
ペプチドコンプレックスの２またはそれ以上のメンバーの遺伝情報を同時にパッ
ケージするのに用いることができる。ポリファージ粒子の発生は30年前に観察さ
れており（Salivarら、Virology 32(1967)41-51)、そこには、ファージポピュレ
ーションの約５％が単位長より長く、ファージゲノムＤＮＡの２またはそれ以上
のコピーを含む粒子を形成すると記載されている。該粒子は、新しく形成される
ファージコートにより２またはそれ以上の一本鎖ＤＮＡ分子を被包するときに天
然に生じる。特定の場合には、ファージおよびファージミドまたは一本鎖プラス
ミドベクターの同時パッケージングの発生もみられた（RusselおよびModel,J.Vi
rol.63(1989)3284-3295）。ポリファージ粒子の形態形成に関する科学文献が時 々みられるにも関わらず、実際的応用については考察も開示もされていない。WO
92/20791の実施例２６には、別個のベクターから発現した組合せＦａｂ表現ライ
ブラリーのモデル実験が記載されている。しかしながら、記載された２つのベク
ターのいずれについてもスクリーニング法しか示されていない。すなわち、先行
技術は、ポリファージ粒子に２つのベクターが同時に存在するのをクリーニング
することについては開示していない。本発明の文脈において、用語「多量体（ポ
リ）ペプチドコンプレックス」は、該多量体コンプレックスの「メンバー」であ
る２またはそれ以上の（ポリ）ペプチドまたはタンパク質が相互作用してコンプ
レックスを形成し得る状況を表す。個々のメンバー間の相互作用は、通常、非共
有結合であるが、あらゆる２つのメンバー間にジスルフィド結合が形成されるよ
うな翻訳後修飾が生じるときは共有結合であってよい。「多量体（ポリ）ペプチ
ドコンプレックス」の例には、免疫グロブリン由来の断片（例えば、Ｆｖ、ジス
ルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆａｂ断片）、免疫グロブリンスーパーファミ
リーの他のメンバー由来の断片（例えば、Ｔ細胞レセプターのα,β−ヘテロ二 量体）、およびホモまたはヘテロ二量体レセプターまたは酵素由来の断片といっ
た構造が含まれる。ファージ表現において、該メンバーの１つがファージコート
タンパク質の少なくとも部分と融合してファージ表面に該メンバーが表現され、
多量体コンプレックスの組み立てが生じる。「組合せファージライブラリー」は
、遺伝的レベルにおいて少なくとも部分的に該多量体（ポリ）ペプチドコンプレ
ックスの少なくとも２つのメンバーを無作為化して適切なベクター中に遺伝的に
多様な核酸配列の２つのライブラリーを作製し、適切な宿主細胞に該ライブラリ
ーを組み込み、ファージ粒子のライブラリーが生成される方法で該少なくとも２
つのライブラリーの同時発現を達成することにより作製される（ここで、各粒子
は２つのライブラリーの中から考えられる組合せの１つを表現する）。予め決定
された特性に関してそのような多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスを表現す
る組合せファージライブラリーをスクリーニングすることにより、ファージ粒子
のコレクションが同定されよう。部分的に、これら粒子は多量体コンプレックス
のメンバーの１つの遺伝情報のみを含むであろう。本発明の進歩的原理は、ライ
ブラリーメンバーの組合せの遺伝情報を含むポリファージ粒子のスクリーニング
工程である。
【０００６】 さらに、本発明は、以下の工程を含む、予め決定された特性を有する多量体（
ポリ）ペプチドコンプレックスの２つのメンバーをコードする、多くの多量体（
ポリ）ペプチドコンプレックスを表現するファージ粒子の組合せライブラリー中
に含まれる核酸配列の組合せを同定する方法に関する： （ａ）ファージ表面に誘導され、表現され得る、ファージコートタンパク質の少
なくとも部分と融合した多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの最初のメンバ
ーの融合タンパク質をそれぞれコードする種々の核酸配列を含む遺伝的に広範な
核酸配列を含む、ファージ粒子中にパッケージされることができ、第一に選択お
よび／またはスクリーニングし得る特性を有するか、コードしている組換えベク
ター分子の第一ライブラリーを得、 （ｂ）多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの第二のメンバーをそれぞれコー
ドする種々の核酸配列を含む遺伝的に広範な核酸配列を含む、ファージ粒子中に
パッケージされることができ、該第一の特性とは異なる第二の選択および／また
はスクリーニングし得る特性を有するか、コードしている組換えベクター分子の
第二ライブラリーを得、 （ｃ）所望により、多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスのさらなるメンバー
をコードする核酸配列を得、 （ｄ）工程（ａ）、（ｂ）に示す組換えベクターの該ライブラリーのメンバー、
および所望により工程（ｃ）に示す核酸配列を、適切な条件下、適切な宿主細胞
中で発現させて、多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスをそれぞれ表現するフ
ァージ粒子の組合せライブラリーを作製し、 （ｅ）ファージ粒子の該ライブラリー中の、該予め決定した特性を有する多量体
（ポリ）ペプチドコンプレックスを表現するファージコレクションを同定し、 （ｆ）該コレクション中の、該第一および第二の選択および／またはスクリーニ
ングし得る特性が同時に存在するか生じるものをスクリーニングまたは選択する
ことにより該多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの第一および第二のメンバ
ーをコードする組換えベクター分子を同時に含むポリファージ粒子を同定し、 （ｇ）所望により、さらにスクリーニングおよび／または選択工程を行うか、ま
たは工程（ａ）〜（ｆ）を反復し、 （ｈ）核酸配列の該組合せを同定する工程。
【０００７】 ３、４、またはそれ以上の（ポリ）ペプチドコンプレックスの場合には、所望
により該多量体コンプレックスのさらなるメンバーを提供することができよう。
これらのさらなるメンバーは、例えば、ファージもしくはファージミドベクター
の１つ、またはプラスミドのような別個のベクターから同時に発現してよい。さ
らなるスクリーニングまたは選択可能な特性を対応するベクターに導入しなけれ
ばならない場合は、そのようなさらなるメンバーのライブラリーも用いられよう
。あるいはまた、そのようなさらなるメンバーは組換えベクター分子の第一また
は第二ライブラリーに含まれよう。別の選択肢において、さらなるスクリーニン
グおよび／または選択工程、または個々の工程の反復を実施し、該核酸配列を得
、同定される結果を最適化することができる。
【０００８】 さらに、本発明は、以下の工程を含む、予め決定された特性を有する多量体（
ポリ）ペプチドコンプレックスの２つのメンバーをコードする、多様な多量体（
ポリ）ペプチドコンプレックスを表現するファージ粒子の組合せライブラリー中
に含まれる核酸配列の組合せを同定する方法に関する： （ａ）適切な条件下、適切な宿主細胞中で、 （aa）ファージ表面に誘導され、表現され得る、ファージコートタンパク質の少
なくとも部分と融合した多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの最初のメンバ
ーの融合タンパク質をそれぞれコードする種々の核酸配列を含む、ファージ粒子
中にパッケージされ得る、第一の選択および／またはスクリーニングし得る特性
を有するか、コードしている組換えベクター分子の最初のライブラリー中に含ま
れる遺伝的に広範な核酸配列、 （ab）多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの第二のメンバーをそれぞれコー
ドする種々の核酸配列を含む、ファージ粒子中にパッケージされることができ、
該第一の特性とは異なる第二の選択および／またはスクリーニングし得る特性を
有するか、コードしている組換えベクター分子の第二ライブラリー中に含まれる
遺伝的に広範な核酸配列、 （ac）所望により、多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスのさらなるメンバー
をコードする核酸配列を発現させて、多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスを
それぞれ表現するファージ粒子の組合せライブラリーを作製し、 （ｂ）ファージ粒子の該ライブラリー中の、該予め決定した特性を有する多量体
（ポリ）ペプチドコンプレックスを表現するファージコレクションを同定し、 （ｃ）該コレクション中の、該第一および第二の選択および／またはスクリーニ
ングし得る特性が同時に存在するか、生じるものをスクリーニングまたは選択す
ることにより該多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの第一および第二のメン
バーをコードする組換えベクター分子を同時に含むポリファージ粒子を同定し、 （ｄ）所望により、さらにスクリーニングおよび／または選択工程を行うか、ま
たは工程（ａ）〜（ｃ）を反復し、 （ｅ）核酸配列の該組合せを同定する工程。
【０００９】 本発明の方法の好ましい態様において、該第一および該第二ライブラリーのベ
クターはファージベクターとファージミドベクターの組合せである。 本発明の方法のさらに好ましい態様において、該第一および該第二ライブラリ
ーのベクターは２つのファージミドベクターの組合せであり、該適切な条件はヘ
ルパーファージによるファージ遺伝子の補完を含む。 本発明の方法の最も好ましい態様において、該２つのファージミドベクターは
適合性である。 用語「適合性」は、宿主細胞中に同時に存在することができる２つのファージ
ミドの特性を表す。非適合性は、同じ非適合性群に属する非適合性プラスミド複
製起点の存在に関連する。適合性プラスミド複製起点の例には、高コピー数の起
点ColE1、および低コピー数の起点p15Aがある。 したがって、本発明の方法のさらに好ましい態様において、該２つのファージ
ミドベクターはColE1およびp15Aプラスミド複製起点を含む。 本発明の方法の最も好ましい態様において、該２つのファージミドベクターは
ColE1および突然変異ColE1起点を含む。いずれもColE1由来のプラスミド複製起 点を有する２つのファージミドはColE1起点の１つが突然変異を保有する限り細 胞中に同時に存在し得ることが示されよう。 該ベクターおよび／または該ヘルパーファージが異なるファージ複製起点を含
む方法が特に好ましい。
【００１０】 該ファージベクター、該ファージミドベクター、および／または該ヘルパーフ
ァージが干渉耐性である本発明の方法が最も好ましい態様である。用語「干渉」
は、ファージミドが子孫ファージのＤＮＡの複製に干渉することにより該ファー
ジ粒子の産生を阻害する特性を表す。「干渉耐性」はこの問題を克服する特性で
ある。遺伝子間領域および／または遺伝子II中の突然変異が干渉耐性に関与する
ことがわかってきた（EneaおよびZinder, Virology 122(1982),222-226; Russel
ら、Gene 45(1986）333-338)。IR1およびIR2と呼ばれるファージ（EneaおよびZi
nder, Virology 122(1982),222-226)、およびそれから誘導されるR176のような 突然変異体（RusselおよびModel, J.Bacteriol. 154(1983)1064-1076)、R382、R
407、およびR408(Russelら、Gene 45(1986)333-338)、およびR383(Russelおよび
Model、J.Virol.63(1989)3284-3295)が、遺伝子IIの上流の非翻訳領域、および 遺伝子IIコード領域に突然変異を有することにより干渉耐性である。 したがって、本発明の方法の好ましい態様において、該ファージベクター、該
ファージミドベクター、および／または該ヘルパーファージは、ファージ遺伝子
間領域、好ましくはｆ１の5986位に対応する位置、および／または遺伝子II、好
ましくはｆ１の143位に対応する位置に突然変異を有する。 最も好ましい態様において、該ファージベクター、該ファージミドベクター、
および／または該ヘルパーファージは、R176、R382、R383、R407、R408のような
IR1突然変異体またはIR2突然変異体であるかもしくはそれらから誘導される。 本発明の方法のさらなる態様において、該ベクターおよび／または該ヘルパー
ファージはｆ１、ｆｄ、および／またはＭ１３由来配列のハイブリッド核酸配列
を含む。
【００１１】 本発明の文脈において、用語「ハイブリッド核酸配列」は種々のファージ（ミ
ッド）ベクター起点の配列を含むベクターエレメントを表す。 驚くべきことに、ｆｄファージ由来の部分とｆ１ファージの誘導体であるR408
由来の第二部分が結合して構築されたベクターは干渉耐性であり、さらに主とし
てポリファージ粒子をもたらすことがわかった。したがって、本発明の方法の最
も好ましい態様は、図４に記載の配列を有するfpep3_1B-IR3seqであるか、また はそれ由来のベクターに関する。 本発明の方法のさらに好ましい態様において、該誘導体は、fpep3_1B-IR3seq 由来のファージ複製起点、fpep3_1B-IR3seq由来の遺伝子II、または該ファージ 複製起点および該遺伝子IIの組合せを実質的に含むファージである。 さらに好ましい態様において、本発明は、該誘導体がfpep3_1B-IR3seq由来の ファージ複製起点、fpep3_1B-IR3seq由来の遺伝子II、または該ファージ複製起 点および該遺伝子IIの組合せを実質的に含むファージミドである方法に関する。 さらに好ましい態様において、本発明は、該誘導体がfpep3_1B-IR3seq由来の ファージ複製起点、fpep3_1B-IR3seq由来の遺伝子II、または該ファージ複製起 点および該遺伝子IIの組合せを実質的に含むヘルパーファージである方法に関す
る。 該誘導体が突然変異G5737>A(fpep3_1B-IR3seq中2976）、および／またはgII中
の突然変異G343>A(3989)、およびgII/Ｘ中のG601>T(4247)を含む組合せｆｄ／ｆ
１起点を含む本発明の方法の態様が最も好ましい。
【００１２】 ポリファージ粒子の形成は別のグループがより詳細に試験した。遺伝子VIIお よびIX中のアンバー突然変異が感染性ポリファージ粒子の増幅された生成をもた
らすことがわかった（LopezおよびWebster, Virology 127(1983)177-193）。遺 伝子VII（R68、R100）および遺伝子IX（N18）中に数個の突然変異体を同定し、 さらに特徴づけた。したがって、本発明の方法の好ましい態様において、該ベク
ターのいずれにも含まれる遺伝子VIIはアンバー突然変異を含み、最も好ましく は、該突然変異はファージベクターR68またはR100中にみられるものと同じであ る。該ベクターのいずれかに含まれる遺伝子IXがアンバー突然変異を含み、最も
好ましくは該突然変異はファージベクターN18にみられるものと同じである態様 が特にさらに好ましい。 いくつかのファージコートタンパク質が遺伝子IIIタンパク質（gIIIP）、gVIp
、およびgVIIIpを含む外来タンパク質を表現するのに用いられた。本発明の方法
の好ましい態様において、該ファージコートタンパク質はgIIIpまたはgVIIIpで ある。
【００１３】 本発明の方法の特に好ましい態様において、該ファージ粒子はgIIIpの完全長 コピーを有することにより感染性である。gIIIpは３つのドメインを含むタンパ ク質である。Ｃ−末端ドメインは膜挿入に関与し、２つのＮ−末端ドメインはE.
coli(N2)のＦ線毛への結合、および感染工程（N1）に関与する。 本発明の方法の最も好ましい態様において、該ファージ粒子はgIIIpの完全長 コピーを有さないことにより非感染性であり、該融合タンパク質がgIIIpのトラ ンケート形を用いて形成され、表現された多量体（ポリ）ペプチドコンプレック
スと感染介在粒子と結合した対応するパートナーとの相互作用により感染性を回
復させることができる。本発明の文脈において、用語「感染介在粒子」(IMP)は 、N1ドメインまたはN1-N2ドメインのいずれかを含む構築物を表す。該ドメイン を欠く非感染性ファージとの相互作用により、ファージ粒子の感染性を回復させ
ることができる。非感染性ファージとIMPとの相互作用はIMPと融合したリガンド
によりもたらされ、これによりファージ上に表現されるパートナーと結合し得る
。標的リガンド−IMP構築物に対して非感染性ファージ表現ライブラリーをスク リーニングすることにより、感染性の回復を用いて標的と結合するライブラリー
のメンバーを選択することができる。 本発明の方法のさらに好ましい態様において、該トランケートgIIIpはgIIIpの
Ｃ−末端ドメインを含む。 本発明の方法のさらに好ましい態様において、該トランケートgIIIpはファー ジfCA55から誘導される。上記Lopey およびWebsterの研究に加えて、Crissmann およびSmith(Virology 132(1984)445-455)は、Ｎ−末端ドメインおよびＣ−末端
ドメインの大部分が除去された、遺伝子IIIに大きな欠失があるファージfCA55は
ポリファージの形成のみをもたらすことを示すことができた。 該予め決定された特性が標的に結合している本発明の方法の態様が特に好まし
い。
【００１４】 本発明の方法の好ましい態様において、該多量体（ポリ）ペプチドコンプレッ
クスは免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの断片である。 本発明の方法の最も好ましい態様において、該多量体（ポリ）ペプチドコンプ
レックスは免疫グロブリンの断片である。 本発明の方法のさらに最も好ましい態様において、該断片はＦｖ、ｄｓＦｖ、
またはＦａｂ断片である。本発明のさらに好ましい態様は、該予め決定された特
性が反応を実施または触媒する活性である方法に関する。 本発明の方法の好ましい態様において、該多量体（ポリ）ペプチドコンプレッ
クスは酵素である。 本発明の方法の最も好ましい態様において、該多量体（ポリ）ペプチドコンプ
レックスは触媒抗体の断片である。 本発明の方法のさらに最も好ましい態様において、該断片はＦｖ、ｄｓＦｖ、
またはＦａｂ断片である。 本発明のさらに好ましい態様は、選択および／またはスクリーニングし得る特
性がβ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはhis3およびleuな どの栄養マーカーのようなレポーター遺伝子、またはアンピシリン、クロラムフ
ェニコール、カナマイシン、ゼオシン、ネオマイシン、テトラサイクリン、また
はストレプトマイシンのような抗生物質に対する耐性をもたらす耐性遺伝子の転
写のトランス活性化である。 本発明の方法の最も好ましい態様において、該第一および第二のスクリーニン
グおよび／または選択し得る特性は、ファージ粒子の該コレクションの適切な宿
主細胞への感染後に達成される。 特に好ましいのは、該核酸配列の該同定がシーケンシングにより行われる方法
である。 さらに好ましいのは、該宿主細胞がE.coli XL-1 Blue、K91、または誘導体、T
G1、XL1kann、またはTOP10Fである方法である。
【００１５】 本発明のさらに好ましい態様は、 （ａ）（ｉ）ファージコートタンパク質の少なくとも部分と融合した多量体（ポ
リ）ペプチドコンプレックスの第一メンバーの融合タンパク質をコードし、第一
の選択および／またはスクリーニングし得る特性を保有もしくはコードする核酸
配列を含む第一組換えベクター分子、および （ii）多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの第二メンバーをコードし、該第
一の特性と異なる第二の選択および／またはスクリーニングし得る特性を保有も
しくはコードする核酸配列を含む第二組換えベクター分子を含み、 （ｂ）該多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスをその表面に表現するポリファ
ージ粒子を含むポリファージ粒子に関する。 本発明の最も好ましい態様は、該ファージコートタンパク質がgIIIpであるポ リファージ粒子に関する。 本発明のさらに好ましい態様は、該融合タンパク質またはさらなる野生型コピ
ー中のいずれかに存在するgIIIpの完全長コピーを有することにより感染性であ るポリファージ粒子に関する。
【００１６】 さらに、本発明は、該融合タンパク質がgIIIpのトランケート形で形成され、 表現された多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスと感染介在粒子と結合した対
応するパートナーとの相互作用により感染性を回復させることができる、gIIIp の完全長コピーを有さないことにより非感染性であるポリファージ粒子に関する
。 最も好ましくは、本発明は図４に記載の配列を有するファージベクターfpep3_
1B-IR3seqに関する。 さらに好ましくは、本発明は、fpep3_1B-IR3seq由来のファージ複製起点、fpe
p3_1B-IR3seq由来の遺伝子II、または該ファージ複製起点および該遺伝子IIの組
合せを実質的に含むファージベクターfpep3_1B-IR3seqから誘導されるファージ ベクターに関する。 fpep3_1B-IR3seq由来のファージ複製起点、fpep3_1B-IR3seq由来の遺伝子II、
または該ファージ複製起点および該遺伝子IIの組合せを実質的に含むファージベ
クターfpep3_1B-IR3seqから誘導されるファージミドベクターに関する本発明の 態様がさらに好ましい。
【００１７】 好ましくは、本発明は、fpep3_1B-IR3seq由来のファージ複製起点、fpep3_1B-
IR3seq由来の遺伝子II、または該ファージ複製起点および該遺伝子IIの組合せを
実質的に含むファージベクターfpep3_1B-IR3seqから誘導されるヘルパーファー ジベクターに関する。 該誘導体が、突然変異G5737>A(fpep3_1B-IR3seq中2976)、および／またはgII 中の突然変異G343>A(3989)、およびgII/X中の突然変異G601>T(4247)を含む組合 せｆｄ／ｆ１起点を含む態様がさらに好ましい。 少なくとも２つの異なるベクターの組合せを含むポリファージ粒子の産生にお
ける本発明のベクターのあらゆる使用がさらに好ましい。 異なるベクターの該組合せが多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスのメンバ
ーをコードする核酸配列を含む本発明のベクターの使用が最も好ましい。 異なるベクターの該組合せが相互作用する（ポリ）ペプチド／タンパク質をコ
ードする核酸配列を含むベクターの使用が本発明においてさらに好ましい。
【００１８】
【実施例】
実施例に本発明を例示する。 実施例１：ポリファージ形質導入体の選択 WO92/01047の83頁には、軽鎖をコードするファージベクター（fd-CAT2-IV）お
よび重鎖をコードするファージミドベクター（pHEN1-III）を用いる２ベクター 系のモデル実験が記載されている。E.coli HB2151中で増殖したファージミドはf
d-CAT2-IVファージの助けを受け、機能的ファージ（ミッド）が産生される。TG1
細胞を感染させ、テトラサイクリン（fd-CATを選択するため）およびアンピシリ
ン（pHEN1を選択するため）上に接種することにより、パッケージされたファー ジとファージミドの割合を求めた。この実験（ただし、両抗生物質を含むＴＹＥ
プレート上に接種）を繰り返すことにより、両耐性を同時に形質導入したポリフ
ァージ形質導入体を選択することができ、ファージおよびファージミドベクター
に含まれる遺伝情報を回収することができる。上記構築物中の１本の軽および重
鎖を対応するレパートリーで置換することにより、Ｆａｂを表現するファージ粒
子のライブラリーを作製することができる。固定化標的に対して該ライブラリー
をスクリーニングすることにより、ファージ粒子のコレクションを同定すること
ができる。該コレクションに含まれるポリファージ粒子は上記のごとく両耐性を
形質導入することにより同定することができる。
【００１９】 実施例２：同時に表現された相互作用タンパク質の遺伝情報を同時にパッケージ
するための干渉耐性繊維状ファージの作製と使用 導入 任意に組み合わせた遺伝情報の物理的連結は、発現したタンパク質のメンバー
の２つのライブラリーの相互作用スクリーニングのような方法、または適切な機
能に関して互いに相互作用に依存するタンパク質ペアの同時発現および同時表現
において極めて重要である。 ２.１.： 干渉耐性繊維状ファージの構築 ２.１.１.： fjun_1Bの構築： −fhag1A（図２参照） ａ．ファージベクターf17/9-hag（Krebberら、1995,FEBS Letters 377,227-231 ）をEcoRVおよびXmnIで消化する。抗HAG抗体遺伝子を含む1.1kb断片をアガロー スゲル電気泳動で単離し、Qiagenゲル抽出キットで精製する。この断片を予め消
化したpIG10.3ベクター（EcoRV−XmnI）に連結する。連結したＤＮＡをDH5a細胞
に形質転換し、陽性クローンを制限分析により確認する。組換えクローンをpIGh
ag1Aと呼ぶ。上記および下記のすべてのクローニングは標準的プロトコールに従
う（Sambrookら、1989, Molecular Cloning:a Laboratory Manual,第２版） ｂ．ベクターf17/9-hag（Krebberら、1995）をEcoRVおよびStuIで消化する。7.9
kb断片を単離し、自己連結によりベクターfhag2を形成する。 ｃ．鋳型pACYC（CardosoおよびSchwarz、J.Appl.Bacteriol.72（1992)289-293）
を用い、組み立てＰＣＲ(GeおよびRudolph,BioTechniques 22(1997)28-29)によ り組み立てたクロラムフェニコール耐性遺伝子（CAT）を、プライマー： CAT_BspEI（for）： 5'GAATGCTCATCCGGAGTTC CAT_Bsu36I（rev）： 5'TTTCACTGGCCTCAGGCTAGCACCAGGCGTTTAAG を用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅する。 ｄ．ＰＣＲは以下の標準的プロトコールに従って実施する（Sambrookら、1989）
。増幅した生成物をBspEIおよびBsu36Iで消化し、次いで、予め消化したfhag2ベ
クター（BspEI-Bsu36I；7.2kb断片）に連結し、fhag2Cを形成する。 ｅ．ベクターfhag2CをEcoRIで消化し、Klenow断片で充填して末端を平滑にした 。平滑末端化したベクターを自己連結させベクターfhag2CdelEcoRIを形成する。 ｆ．pIGhag1AをXbaIおよびHindIIIで消化する。繊維状ファージpIIIタンパク質 のＣ末端ドメインと融合した抗HAG遺伝子を含む1.3kb断片を単離し、予め消化し
たfhag2CdelEcoRIファージベクター（XbaI-HindIII; 6.4kb）と連結し、ベクタ ーfhag1Aを作製する。 −fjun_1B（図３参照） ａ．繊維状ファージpIIIのアミノ末端ドメインとＣ末端ドメインを分ける長いリ
ンカーを含むＣ末端ドメインをコードするＤＮＡ（gIII短）を、プライマー： gIII短（for）：5'GCTTCCGGAGAATTCAATGCTGGCGGCGGCTCT3' gIII短（rev）：5'CCCCCCCAAGCTTATCAAGACTCCTTATTACG3' ｂ．ＰＣＲは以下の標準的プロトコールに従って実施する（Sambrookら、1989）
。増幅した生成物をEcoRIおよびHindIIIで消化し、次いで、予め消化したfhag1A
ベクター（EcoRI-HindIII）に連結し、ベクターfjun_1Bを形成する。
【００２０】 ２.１.２.：fjun_1B-R408IRの構築： 干渉耐性表現系をもたらすことが記載されている突然変異を、非干渉耐性ｆｄ
ファージベクターfjun_1B（図３参照）に導入するために、ユニークな制限部位D
raIIIおよびBsrGI間の領域を含むヘルパーファージR408(Stratagene)の1.7kb断 片は組み立てＰＣＲにより増幅されたＰＣＲであった。1.7kb DraIII/BsrGI断片
のサブ断片は、プライマーの組合せFR604/FR605およびFR606/FR607を含むｆ１フ
ァージR408鋳型ＤＮＡから増幅され、部分的に相補的なプライマーFR605およびF
R606を介してレシピエント構築物fjun_1Bに存在することが解っているさらなるg
II突然変異を導入した。得られたＰＣＲ断片をゲル精製し、混合してプライマー
FR604およびFR607を用いる次の組み立てＰＣＲにおいて鋳型として用いる。ＰＣ
Ｒ条件は標準であり、鋳型約25ng、各プライマー10pmol、各dNTP 250pmol、2mM
Mg、2.5 U Pfu ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。増幅は、94Cで１m
in変性、50℃で１minアニーリング、72℃での１min伸長を、３０回行った。正し
いサイズの1.7kb組み立てＰＣＲ生成物をゲル精製し、DraIIIおよびBsrGIで消化
し、DraIII/BsrGI消化fjun_1B中にクローンし、fjun_1B-R408IRを作製した。 プライマー： FR604 5'GTTCACGTAGTGGGCCATCG 3' FR605 5'TGAGAGGTCTAAAAAGGCTATCAGG 3' FR606 5'TAGCCTTTTTAGACCTCTCAAAAATAG 3' FR607 5'CGGTGTACAGACCAGGCGC 3'
【００２１】 ２.２.： 基礎試験の証明 ２つの本来関連したＩＲ突然変異を欠くにも関わらず、ハイブリッドファージ
ベクターfjun_1B-R408IR（クロラムフェニコール耐性をもたらすクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼを保有する）は、ファージ複製起点を含むフ
ァージミド（アンピシリン耐性をもたらすβ−ラクタマーゼ遺伝子を保持するpO
K1deltajun）に同時形質転換されよう。さらに重要なことは、fjun_1B-R408IRは
、ファージミドpOK1deltajunと安定して同時に存在することができ、該ファージ
ミドはfjun_1B-R408IRファージゲノムと一緒にポリファージ粒子中に効率的に同
時にパッケージされた。クロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性を同時に
形質導入するポリファージの力価はK91接種細胞一夜細菌培養1mLあたり6x108形 質導入単位（t.u.）に達し、その数はクロラムフェニコールのみに対して選択し
た後にみられる力価109/mLとほぼ等しかった。アンピシリンのみに対してK91形 質導入体を選択すると力価は5x109/mLであった。これら力価は、fjun_1B-R408IR
を含むすべてのファージの50%以上がファージミドpOK1deltajunも含みポリファ ージであることを示した。このポリファージの比率の高さは、クロラムフェニコ
ールのみに対して選択した形質導入体の制限分析により確認された。これらクロ
ーンの50%以上がfjun_1B-R408IRファージゲノムに加えて該ファージミドも含ん でいた。個々の形質導入体から純粋な形のfjun_1B-R408IRを単離した（これはこ
のファージのみを含んでいた）。fos-junロイシンジッパー相互作用（wt gIII機
能を非共有結合的に回復させる）を介して選択的に感染するファージ（ＳＩＰ）
を産生するため、DH5α細胞の同時形質転換に、構築物fjun_1B-R408IRをpOK1del
tajunと共に使用した。この組合せを有する安定な二重耐性同時形質転換体を得 、個々のクローンをcam/amp存在下で一夜増殖させた。これらクローンの培養上 清を45μM膜フィルターでろ過し、これを用いて幾何級数的に増殖しているＦ＋ 細菌（K91株）に37℃で20分間感染させた。感染性ＳＩＰポリファージの存在を 試験するため、細胞をcamおよびampを含むLB寒天プレートに接種し、プレートを
37Cで一夜培養した。二重耐性形質導入体を生じる約500〜1000形質転換単位（t.
u.）/mLが個々の同時形質転換体から得られた。その形質導入体のＤＮＡを制限 分析により分析したところ、クローンの95%（15/16クローン）がfjun_1B-R408IR
およびpOK1deltajunについて予測された正しいパターンを有していた。いくつか
のポリファージ形質導入体の上清をK91細胞の再感染による持続的ＳＩＰファー ジ産生について試験した。これにより、ポリファージ形質導入体が感染性ＳＩＰ
ファージを産生し続けることが確認され、得られた第２回のポリファージ形質導
入体の制限分析は、44%（14/32クローン）が正しいベクターの組合せを含むこと
を示した。残りのクローンは正しいpOK1deltajunファージミドと回復したwt gII
Iを含む組換えファージベクターを含み、両ベクターがrec+K91株中で増殖する場
合は（IRファージとファージミドの同時形質転換に用いるrec-DH5α株に比べて ）組換え頻度が増加することを示した。より高い力価の感染性ＳＩＰファージを
もたらす他のタンパク質−タンパク質相互作用を試験し、ヘテロポリファージ（
モノファージまたはホモポリファージを同時感染させる代わりにファージとファ
ージミドを同時パッケージング）の存在を証明するため、p75ラットニューロト ロフィンレセプター(Chaoら、Science 232(1986)518-521)細胞内ドメイン（p75I
CD）と結合する２つのペプチドリガンド（ＳＩＰにより先に選択された、WO97/3
2017）をfjun_1B-R408IR（jun置換）およびファージミドpIG10.3中のＮ末端gIII
c融合物としてクローンし、jun配列の代わりにアミノ酸配列(CysIleValTyrHisAl
aHisTyrLeuValAlaLysCys)をコードするペプチドpep3：5'-TGTATTGTTTATCATGCTCA
TTATCTTGTTGCTAAGTGT-3'を含む構築物fpep3_1B-IR3seqおよびpIG10.3-pep10（WO
97/32017）をそれぞれ得た。fpep3_1B-IR3seq中の形質転換R408断片の各部分の シーケンシングは、２つのIR突然変異（fpep3_1B-IR3seq中の3225位にみいださ れる、gII 5'非翻訳領域中の相補グループIからのG5986>A突然変異、およびgII 中のThr>Ileアミノ酸置換をもたらす相補グループIIからのC143>T突然変異（fpe
p3_1B-IR3seq中3789）)はいずれも存在しないことが証明された。しかしながら 、組み立てＰＣＲにより導入された、Leu>Val置換をもたらすgII突然変異G6090>
T（fpep3_1B-IR3seq中3329）が存在した。さらに、ｆ１ファージに比べてさらに
３つの突然変異が同定されよう：ファージ複製起点中のG5737>A（fpep3_1B-IR3s
eq中2976）、gII中のG343>A（3989)、およびgII/X中のG601>T（4247）。 fpep3_1B-IR3seqの機能マップおよび配列を図４に示す。この配列は数回二重 に検討された。公表された配列データと比べたfpep3_1B-IR3seqの配列の相違は 、fjun_1B-R408IRおよびfpep3_1B-IR3seqをクローニングするのに用いた出発構 築物中にすでに存在する突然変異により説明されることが示されよう。 pIG10.3またはpOK1ファージミド（両方ともｆ１orisを含む）とfjun_1B（「ｗ
ｔ」ｆｄファージ）、fjun_1B-R408IR（R408からのDraIII/BsrGI断片を含む）、
またはfpep_1B-IR3（R408からのDraIII/BsrGI断片およびＰＣＲ突然変異を含む ）との組合せを用いる同時形質転換実験（図５）は、少なくともファージミドと
同時形質転換し得る能力および個々の同時形質転換体が液体培養中で増殖し得る
能力（cam/amp選択）から判断して、ＰＣＲ突然変異がIR表現系に必要でないこ とを証明した。 さらに、相互作用タンパク質パートナーp75ICDは、構築物fIMPp75-IR3およびp
IG10.3-IMPp75を生じるgIII（感染介在粒子（IMP)融合物）の感染介在ドメイン （N1-N2）に対するＣ末端融合物としてクローンされた。IRファージは、陰性コ ントロールの組合せfpep3_1B-IR3seq3/pIG10.3-IMPp75の存在下でＳＩＰペアリ ングfpep3_1B-IR3seq3/pIG10.3-IMPp75（fos/jun SIPより高い力価を与える）を
用いて試験された（図６）。1.5x105/mLのSIPヘテロ−ポリファージ力価（cam/a
mp耐性形質導入体）がfpep3_1B-IR3seq3/pIG10.3-IMPp75を用いて達成された。 モデルライブラリー対ライブラリーセッティングにおけるSIP感受性を試験する ため、fpep3_1B-IR3seq3/pIG10.3-IMPp75の同時形質転換体を過剰のfjun_1B-IR3
/pIG10.3-IMPp75で希釈し、細菌同時培養の上清のSIPヘテロポリファージをアッ
セイした。これにより10-5〜10-6の希釈まで回収できることが示された（図７）
。
【００２２】 SIPポリファージ形質導入体中に正しいファージベクターのみが存在すること を証明するため、陽性（fpep3_1B-IR3seq3/pIG10.3-IMPp75）および陰性（fjun_
1B-IR3/pIG10.3-IMPp75）コントロール同時形質転換体のＤＮＡ、ならびに陽性 および陰性対照細菌の混合により産生されるSIPファージから誘導されるSIPポリ
ファージ形質導入体からのＤＮＡがＰＣＲにより分析された（図８）。プライマ
ーFR614（5'-GCTCTAGATAACGAGGGC-3')およびFR627（5'-CGCAAGCTTAAGACTCCTTATT
ACGC-3'）は、ompAの出発点からgIIIの末端までのファージ領域を増幅する。fpe
p3_1B-IR3seq3およびfjun_1B-IR3から誘導されたＰＣＲ産物はサイズにより識別
することができる。上記試料のゲル分析は、予期したfpep3_1B-IR3seq3ファージ
のみがSIPポリファージ形質導入体中に存在することを証明した（６個を分析） 。 IRファージベクターを用いるときはヘテロ-ポリファージ（同時にパッケージ されたファージおよびファージミドを有する）の存在を物理的に証明するため、
fIR3/pIG10.3-IMPp75の同時形質転換体により産生されるファージとコントロー ルとしてfjun_1B/JB61（「ｗｔ」ファージおよび相補gIIIプラスミド）をアガロ
ースゲル上で分離した（図９）。これにより、fIR3/pIG10.3-IMPp75の組合せはf
jun_1B/JB61コントロールの組合せよりも実質的によりゆっくりと移動する（す なわち、より大きい）ファージを生じることが示された。その比率はほとんど逆
であった。ゲルの種々の領域からファージを溶出し、次いで接種細胞について溶
出液を力価測定することにより、上部ゲル領域に二重耐性形質導入ファージのか
なりの部分が含まれ、ヘテロポリファージとみなし得ることが示された。
【００２３】 fpep3_1B-IR3とpIG10.3-IMPp75のペアおよびfIMPp75-IR3およびpIG10.3-pep10
のペアをDH5αに同時形質転換し、個々のcam/amp耐性クローンを増殖させ、培養
上清を用い、K91細胞のSIPファージ産生について試験した（図１０）。cam/amp 耐性形質導入体についてアッセイしたとき、組合せfpep3_1B-IR3/pIG10.3-IMPp7
5およびfIMPp75-IR3/pIG10.3-pep10の力価は、それぞれ1.5x105 t.u./mLおよび5
x103 t.u./mLであった。LBcamについてアッセイすると各組合せの力価はLBcam/a
mpについてアッセイしたときとほぼ同じであった。これにより、ファージおよび
ファージミドＤＮＡの有効な同時パッケージングは、最初のfjun_1B-R408IRおよ
びpOK1deltajun組合せを用いて以前にみられたようにほぼ100%であることが証明
された。ファージおよびファージミドＤＮＡを同時に個々に同時形質導入するポ
リファージの存在を証明し、パッケージされたファージまたはファージミドのみ
を有する２つの異なるファージによる独立した（すなわち任意の）同時感染によ
る２つの耐性マーカーの形質導入の可能性を除外するため、統計的検定を行った
。上記２つのSIPベクター結合体のそれぞれを示す個々の同時形質転換体の細菌 培養上清の一定の等しい部分標本を個々に用いて、K91細胞に感染させ、次いでL
BcamおよびLBampプレート上で選択するか、または該２つのベクターの組合せか らの同じ上清部分標本を混合し、次いでK91細胞に感染させ、LBcam/amp上で選択
した。117cam耐性形質転換単位、328amp耐性形質転換単位、および141cam/amp耐
性形質転換単位が、fIMPp75-IR3/pIG10.3-pep10の組合せからの上清部分標本に 存在し、40cam耐性形質転換単位、30amp耐性形質転換単位、および23cam/amp耐 性形質転換単位が、fpep3_1B-IR3/pIG10.3-IMPp75の組合せからの上清部分標本 中に存在した。両上清部分標本の混合物では、２つの個々の部分標本の形質導入
単位を合計して得られると予期される数に正確に対応する166cam耐性形質転換単
位および162cam/amp耐性形質転換単位が得られた。48cam/amp耐性形質導入体コ ロニーをプレートから選び、２つの個々の部分標本の混合物を用いて感染させ、
制限消化により分析した。これにより、正しいSIPファージ産生ベクターの組合 せのみが（fpep3_1B-IR3/pIG10.3-IMPp75を含む５コロニー、およびfIMPp75-IR3
/pIG10.3-pep10の組合せを含む43コロニー、これは、本実験中の二重耐性導入フ
ァージの比1:6.1（fpep3_1B-IR3/pIG10.3-IMPp75：fIMPp75-IR3/pIG10.3-pep10 ）と非常に似た分析した形質導入体中の２つの導入ベクターの組合せの比1:8.6 （fpep3_1B-IR3/pIG10.3-IMPp75：fIMPp75-IR3/pIG10.3-pep10）を示す）分析し
たすべての形質導入体に生じることを示し、これにより、それぞれ１種類のベク
ター（ファージまたはファージミド）のみを含む、４つの考えられるモノファー
ジおよび／またはホモポリファージポピュレーション（fpep3_1B-IR3、pIG10.3-
IMPp75、fIMPp75-IR3およびpIG10.3-pep10）のうちの２つによる無作為な同時感
染、すなわち正しくない無作為な組合せの可能性を除外することによりヘテロポ
リファージの存在が証明された。統計的には、２つの別個のファージによる同じ
細菌への同時感染は、上記実験において用いられた少なくとも１つの耐性マーカ
ーを含む少数の感染ファージ（166cam耐性ファージおよび358amp耐性ファージ）
によりすでに実質的に排除された。166cam耐性ファージの１つおよび358amp耐性
ファージの１つによる同じ細菌への同時感染（合計107個の細菌の）の確率は6x1
0-10である。さらに、このシナリオにおいて、個々のファージおよびミッドファ
ージベクターの正しくない組合せ（例えば、fpep3_1B-IR3/pIG10.3-pep10および
fIMPp75-IR3/pIG10.3-IMPp75）が考えられる。正しいベクターの組合せのみがこ
の実験から分析されたすべての48形質導入体にみられた事実は、さらに、ホモポ
リファージまたはモノファージによる無作為な同時感染でなくヘテロポリファー
ジによる同時形質導入が二重耐性を形質導入するメカニズムであることを証明し
た。
【００２４】 ２.３．：Ｆａｂ表現のためのファージ表現系の構築 ３.２.に記載の構築物を簡単に修飾し、ＦａｂまたはＦａｂライブラリーの表
現を達成することができる。fpep3_1B-IR3seqにおいて、jun部分をpep_3につい て記載したのと同様の適切な3'-および5'-制限部位を有するＶＬ−ＣＬ軽鎖レパ
ートリーにより置換し、fVL_1B-R408IRを構築することができる。pIG10.3-IMPp7
5において、IMPp75構築物をVH-CH1重鎖のレパートリーで置換することができる 。宿主細胞中の両レパートリーの同時形質転換および発現後に、Ｆａｂ断片を表
現するファージ粒子のライブラリーを作製する。fpep3_1B-IR3seqはgIIIのＣ末 端ドメインのみを有することによりSIP実験に供給されるため、対応するＦａｂ 表現ファージ粒子は非感染性である。感染介在粒子と融合した標的分子（gIIIp のN1-N2ドメイン）を加えることにより、標的と結合するＦａｂ断片を表現する ファージを宿主細胞に感染させることにより選択することができる。 上記トランケートgIII部分をgIIIの完全長コピーで置換することにより、感染
性ファージ粒子のＦａｂ表現ライブラリーを得、これを固定化標的に対してスク
リーニングすることができる。結合したファージを溶出し、これを用いて宿主細
胞を感染させることができる。 宿主細胞にcam/amp耐性をもたらす形質導入体を選択することにより、両方の 場合でポリファージ感染を選択することができる。これにより、選択したＦａｂ
断片の両鎖に関する情報を回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｆａｂライブラリーを表現するためのポリファージの原理の概説
：例えば、ライブラリー１：ＶＬ鎖のライブラリー；ライブラリー２：ＶＨ鎖；
適合性ファージミド上の両ライブラリー；ａ中：ライブラリーは宿主細胞内に形
質転換される；ｂ中：ライブラリー１はヘルパーファージの助けを受ける；ｃ中
：ライブラリーは感染により組み合わされる。ｄ中：重および軽鎖の同時発現；
ｅ中：ヘルパーファージによる取り出し、ファージ粒子の産生、ファージ上での
Ｆａｂの組み立て、標的の選択；注１：ファージ粒子のある分画は、２つのゲノ
ムの１つのみを含む正常な単位長の粒子であろう（図１に示さず）。さらに、ポ
リファージはどちらのゲノムがパッケージするか識別しない。したがって、図１
に示す組合せが起こり得る。正しくパッケージされたゲノムを選択するには、次
の工程が必要である；ｆ中：感染宿主細胞；ｇ中：感染細胞に２つの抗生物質に
対する耐性をもたらす能力について選択；注２：ｇ）に示す条件を満たすファー
ジのみが、結合Ｆａｂの重および軽鎖の正しい組合せを含むポリファージ粒子を
示す(ヘテロ−ポリファージ）。単位長ファージおよび２つの同じゲノムを保持 するポリファージは１抗生物質に対する耐性のみをもたらすであろう。
【図２】 ファージベクターfhag1Aの機能マップと配列。
【図３】 ファージベクターfjun_1Bの機能マップと配列。
【図４】 ファージベクターfpep3_1B-IR3seqの機能マップと配列。
【図５】 種々のファージおよびファージミドベクターの適合性：異なるベ
クターペアの同時形質転換および液体培養における増殖（can/amp選択）： Ａ．fjun_1B-R408-IR/pIG10_pep10; Ｂ．fjun_1B/pIG10_pep10(1コロニーのみ) ；Ｃ．fpep3_1B-IR3/pIG10_pep10； Ｄ．fjun_1B-R408-IR/pOK1Djun; Ｅ．fjun_
1B/pOK1Djun: 増殖せず; Ｆ．fpep3_1B-IR3/pOK1Djun； ａ．fjun_1B；ｂ．fjun_1B-R408-IR；ｃ．fpep3_1B-IR3；ｄ．pIG10_pep10; ｅ ．pOK1Djun。
【図６】 陽性（pep3/p75ICD組合せ、レーン９）および陰性（jun/p75ICD 、レーン１０）ペアの同時形質転換；レーン１〜８：ＳＩＰ形質導入体。
【図７】 溶液中で選択するためのＳＩＰヘテロ−ポリファージ系の感受性
：＃ＳＩＰヘテロ−ポリファージ形質導入体、形質導入単位（t.u.）/mL、示し た割合で混合した図６の同時形質転換体の同時培養により作製。
【図８】 ＳＩＰポリファージ形質導入体中に存在するファージベクターを
同定するためのＰＣＲ：レーン１〜６：ＳＩＰポリファージ形質導入体；レーン
Ａ：fpep3_1B-IR3/pIG10.3-IMPp75同時形質転換体；レーンＢ：fjun_1B-IR3/pIG
10.3-IMPp75同時形質転換体。
【図９】 ＩＲファージおよびファージミドはポリファージ中に同時にパッ
ケージされる：１：ΔgIIIファージ＋gIIIプラスミド；２：ＩＲファージ＋ファ
ージミド。
【図１０】 ＳＩＰ情報はポリファージにより同時形質導入される：ａ：フ
ァージベクター上のIMPp75；ｂ：ファージベクター上のpep10-gIII-CT融合物； ｃ：ファージミドベクター上のIMPp75；ｄ：ファージミドベクター上のpep10-gI
II-CT融合物。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴィック・イラグ ドイツ連邦共和国デー−89897ミュンヘン、 クノールシュトラーセ85番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 CA20 DA06 EA03 FA05 FA10 GA11 HA01

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 多数の多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスを表現するフ
    ァージ粒子の組合せライブラリー中に含まれる、予め決定された特性を有する多
    量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの２つのメンバーをコードする核酸配列の
    組合せを同定するための方法であって、該組合せを含むポリファージ粒子をスク
    リーニングまたは選択することを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 （ａ）ファージ表面に誘導され、表現され得る、ファージコ
    ートタンパク質の少なくとも部分と融合した多量体（ポリ）ペプチドコンプレッ
    クスの最初のメンバーの融合タンパク質をそれぞれコードする種々の核酸配列を
    含む遺伝的に広範な核酸配列を含む、ファージ粒子中にパッケージされることが
    でき、第一に選択および／またはスクリーニングし得る特性を有するか、コード
    している組換えベクター分子の第一ライブラリーを得、 （ｂ）多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの第二のメンバーをそれぞれコー
    ドする種々の核酸配列を含む遺伝的に広範な核酸配列を含む、ファージ粒子中に
    パッケージされることができ、該第一の特性とは異なる第二の選択および／また
    はスクリーニングし得る特性を有するか、コードしている組換えベクター分子の
    第二ライブラリーを得、 （ｃ）所望により、多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスのさらなるメンバー
    をコードする核酸配列を得、 （ｄ）工程（ａ）、（ｂ）に示す組換えベクターの該ライブラリーのメンバー、
    および所望により工程（ｃ）に示す核酸配列を、適切な条件下、適切な宿主細胞
    中で発現させて、多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスをそれぞれ表現するフ
    ァージ粒子の組合せライブラリーを作製し、 （ｅ）ファージ粒子の該ライブラリー中の、該予め決定した特性を有する多量体
    （ポリ）ペプチドコンプレックスを表現するファージコレクションを同定し、 （ｆ）該コレクション中の、該第一および第二の選択および／またはスクリーニ
    ングし得る特性が同時に存在するか生じるものをスクリーニングまたは選択する
    ことにより該多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの第一および第二のメンバ
    ーをコードする組換えベクター分子を同時に含むポリファージ粒子を同定し、 （ｇ）所望により、さらにスクリーニングおよび／または選択工程を行うか、ま
    たは工程（ａ）〜（ｆ）を反復し、 （ｈ）核酸配列の該組合せを同定する工程を含む請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 （ａ）適切な条件下、適切な宿主細胞中で、 （aa）ファージ表面に誘導され、表現され得る、ファージコートタンパク質の少
    なくとも部分と融合した多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの最初のメンバ
    ーの融合タンパク質をそれぞれコードする種々の核酸配列を含む、ファージ粒子
    中にパッケージされ得る、第一の選択および／またはスクリーニングし得る特性
    を有するか、コードしている組換えベクター分子の最初のライブラリー中に含ま
    れる遺伝的に広範な核酸配列、 （ab）多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの第二のメンバーをそれぞれコー
    ドする種々の核酸配列を含む、ファージ粒子中にパッケージされることができ、
    該第一の特性とは異なる第二の選択および／またはスクリーニングし得る特性を
    有するか、コードしている組換えベクター分子の第二ライブラリー中に含まれる
    遺伝的に広範な核酸配列、 （ac）所望により、多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスのさらなるメンバー
    をコードする核酸配列を発現させて、多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスを
    それぞれ表現するファージ粒子の組合せライブラリーを作製し、 （ｂ）ファージ粒子の該ライブラリー中の、該予め決定した特性を有する多量体
    （ポリ）ペプチドコンプレックスを表現するファージコレクションを同定し、 （ｃ）該コレクション中の、該第一および第二の選択および／またはスクリーニ
    ングし得る特性が同時に存在するか、生じるものをスクリーニングまたは選択す
    ることにより該多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの第一および第二のメン
    バーをコードする組換えベクター分子を同時に含むポリファージ粒子を同定し、 （ｄ）所望により、さらにスクリーニングおよび／または選択工程を行うか、ま
    たは工程（ａ）〜（ｃ）を反復し、 （ｅ）核酸配列の該組合せを同定する工程を含む請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 該第一および該第二ライブラリーのベクターがファージベク
    ターとファージミドベクターの組合せである請求項１〜３のいずれかに記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 該第一および該第二ライブラリーのベクターが２つのファー
    ジミドベクターの組合せであり、該適切な条件がヘルパーファージによるファー
    ジ遺伝子の補完を含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】 該２つのファージミドベクターが適合性である請求項５記載
    の方法。
  7. 【請求項７】 該２つのファージミドベクターがColE1およびp15Aプラスミ ドの複製起点を含む請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 該２つのファージミドベクターがColE1および突然変異ColE1
    の起点を含む請求項６記載の方法。
  9. 【請求項９】 該ベクターおよび／または該ヘルパーファージが異なるファ
    ージの複製起点を含む請求項４〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 該ファージベクター、該ファージミドベクター、および／
    または該ヘルパーファージが干渉耐性である請求項４〜９のいずれかに記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 該ファージベクター、該ファージミドベクター、および／
    または該ヘルパーファージが、該ファージの遺伝子間領域、好ましくはｆ１の59
    86位に対応する位置、および／または遺伝子II中、好ましくはｆ１の143位に対 応する位置に突然変異を有する請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 該ファージベクター、該ファージミドベクター、および／
    または該ヘルパーファージが、Ｒ１７６、Ｐ３８２、Ｒ３８３、Ｒ４０７、Ｒ４
    ０８のようなＩＲ１突然変異体、またはＩＲ２突然変異体であるか、またはそれ
    らから誘導される請求項１０〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 【請求項１３】 該ベクターおよび／または該ヘルパーファージがｆ１、ｆ
    ｄ、および／またはＭ１３由来配列のハイブリッド核酸配列を含む請求項４〜１
    １のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】 該ベクターが図４の記載の配列を含むfpep3_1B-IR3seqで あるかまたはそれから誘導される請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 【請求項１５】 該誘導体が本質的にfpep3_1B-IR3seq由来のファージ複製 起点、fpep3_1B-IR3seq由来の遺伝子II、または該ファージ複製起点および該遺 伝子IIの組合せを含むファージである請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 該誘導体が本質的にfpep3_1B-IR3seq由来のファージ複製 起点、fpep3_1B-IR3seq由来の遺伝子II、または該ファージ複製起点および該遺 伝子IIの組合せを含むファージミドである請求項１４記載の方法。
  17. 【請求項１７】 該誘導体が本質的にfpep3_1B-IR3seq由来のファージ複製 起点、fpep3_1B-IR3seq由来の遺伝子II、または該ファージ複製起点および該遺 伝子IIの組合せを含むヘルパーファージである請求項１４記載の方法。
  18. 【請求項１８】 該誘導体が突然変異G5737>A（fpep3_1B-IR3seq中2976）、
    および／またはgII中の突然変異G343>A（3989）、およびgII/X中のG601>T（4247
    ）を含む組合せfd/f1起点を含む請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 【請求項１９】 該ベクターのいずれかに含まれる遺伝子VIIがアンバー突 然変異を含む請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. 【請求項２０】 該突然変異がファージベクターR68またはR100中にみいだ されるものと同じである請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 該ベクターのいずれかに含まれる遺伝子ＩＸがアンバー突
    然変異を含む請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
  22. 【請求項２２】 該突然変異がファージベクターN18中にみいだされるもの と同じである請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 該ファージコートタンパク質がgIIIpまたはgVIIIpである 請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
  24. 【請求項２４】 該ファージ粒子がgIIIpの完全長コピーを有することによ り感染性である請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
  25. 【請求項２５】 該ファージ粒子がgIIIpの完全長コピーを有さないことに より非感染性であり、該融合レセプターがgIIIpのトランケート形を用いて形成 されており、表現された多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスと、感染性に関
    与する粒子と結合した対応するパートナーとの相互作用により感染性を回復させ
    ることができる請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
  26. 【請求項２６】 該トランケートgIIIpがgIIIpのＣ末端ドメインを含む請求
    項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 該トランケートgIIIpがファージfCA55由来である請求項２
    ６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 該予め決定された特性が標的と結合することである請求項
    １〜２７のいずれかに記載の方法。
  29. 【請求項２９】 該多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスが免疫グロブリ
    ンスーパーファミリーのメンバーの断片である請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 該多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスが免疫グロブリ
    ンの断片である請求項２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 該断片がＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂ断片である請求項
    ３０記載の方法。
  32. 【請求項３２】 該予め決定された特性が反応を行うかまたは触媒する活性
    である請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
  33. 【請求項３３】 該多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスが酵素である請
    求項３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 該多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスが触媒抗体の断
    片である請求項３３記載の方法。
  35. 【請求項３５】 該断片がＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂ断片である請求項
    ３４記載の方法。
  36. 【請求項３６】 該選択および／またはスクリーニングし得る特性がβ−ガ
    ラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、もしくはｈｉｓ３およびｌｅｕなど
    の栄養マーカーのようなレポーター遺伝子、またはアンピシリン、クロラムフェ
    ニコール、カナマイシン、ゼオシン、ネオマイシン、テトラサイクリン、もしく
    はストレプトマイシンのような抗生物質に対する耐性を与える耐性遺伝子の転写
    のトランス活性化である請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
  37. 【請求項３７】 該第一および／または第二のスクリーニングおよび／また
    は選択し得る特性の発生が、適切な宿主細胞にファージ粒子の該コレクションが
    感染した後に達成される請求項１〜３６のいずれかに記載の方法。
  38. 【請求項３８】 該核酸配列の同定がシーケンシングにより行われる請求項
    １〜３７のいずれかに記載の方法。
  39. 【請求項３９】 宿主細胞がE.coli XL-1 Blue、K91もしくはその誘導体、T
    G1、XL1kann、またはTOP10Fである請求項１〜３８のいずれかに記載の方法。
  40. 【請求項４０】 （ａ）（ｉ）ファージコートタンパク質の少なくとも部分
    と融合した多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの第一メンバーの融合タンパ
    ク質をコードし、第一の選択および／またはスクリーニングし得る特性を保有も
    しくはコードする核酸配列を含む第一組換えベクター分子、および （ii）多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスの第二メンバーをコードし、該第
    一の特性と異なる第二の選択および／またはスクリーニングし得る特性を保有も
    しくはコードする核酸配列を含む第二組換えベクター分子を含み、 （ｂ）該多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスをその表面に表現するポリファ
    ージ粒子。
  41. 【請求項４１】 該ファージコートタンパク質がgIIIpである請求項４０記 載のポリファージ粒子。
  42. 【請求項４２】 該粒子が該融合タンパク質もしくはさらなる野生型コピー
    中に存在するgIIIpの完全長コピーを有することにより感染性である請求項４１ 記載のポリファージ粒子。
  43. 【請求項４３】 該粒子がgIIIpの完全長コピーを有さないことにより非感 染性であり、該癒合タンパク質がgIIIpのトランケート形を用いて形成されてお り、表現された多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスと感染性に関与する粒子
    と結合した対応するパートナーとの相互作用により感染性を回復することができ
    る請求項４１記載のポリファージ粒子。
  44. 【請求項４４】 図４記載の配列を有するファージベクターfpep3_1B-IR3se
    q。
  45. 【請求項４５】 実質的にfpep3_1B-IR3seq由来のファージ複製起点、fpep3
    _1B-IR3seq由来の遺伝子II、または該ファージ複製起点および該遺伝子IIの組合
    せを含むファージベクターfpep3_1B-IR3seq由来のファージベクター。
  46. 【請求項４６】 実質的にfpep3_1B-IR3seq由来のファージ複製起点、fpep3
    _1B-IR3seq由来の遺伝子II、または該ファージ複製起点および該遺伝子IIの組合
    せを含むファージベクターfpep3_1B-IR3seq由来のファージミドベクター。
  47. 【請求項４７】 実質的にfpep3_1B-IR3seq由来のファージ複製起点、fpep3
    _1B-IR3seq由来の遺伝子II、または該ファージ複製起点および該遺伝子IIの組合
    せを含むファージベクターfpep3_1B-IR3seq由来のヘルパーファージベクター。
  48. 【請求項４８】 該誘導体がgII中の突然変異G5737>A（fpep3_1B-IR3seq中2
    976）および／または突然変異G343>A（3989）、およびgII/X中のG601>T（4247）
    を含む組合せfd/f1起点を含む請求項４５〜４７のいずれかに記載のベクター。
  49. 【請求項４９】 少なくとも２つの異なるベクターの組合せを含むポリファ
    ージ粒子の生成における請求項４４〜４８のいずれかに記載のあらゆるベクター
    の用途。
  50. 【請求項５０】 異なるベクターの該組合せが多量体（ポリ）ペプチドコン
    プレックスのメンバーをコードする核酸配列を含む請求項４９記載の用途。
  51. 【請求項５１】 異なるベクターの該組合せが相互作用（ポリ）ペプチド／
    タンパク質をコードする核酸配列を含む請求項５０記載の用途。
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