CN110366431B - 具有自分解肽接头的类美登素衍生物和其缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有自分解肽接头的新颖细胞结合剂‑类美登素缀合物并且更具体地说涉及式(I)的缀合物。本发明还提供式(II)、(III)、(IV)或(V)的新颖类美登素化合物。本发明还提供可用于使用本发明的所述化合物或缀合物在哺乳动物中抑制异常细胞生长或治疗增殖性病症的组合物和方法。

Description

具有自分解肽接头的类美登素衍生物和其缀合物
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年2月28日提交的美国临时申请号62/465,118和2017年3月31日提交的美国临时申请号62/480,209的申请日的权益。以上提到的申请中的每一者的全部内容以引用的方式并入本文中。
背景技术
抗体-药物缀合物(ADC)作为在一系列癌症中具有功效的强大抗肿瘤剂类别不断出现。ADC通常由三种不同元素组成：细胞结合剂；接头；以及细胞毒性剂。ADC的接头组分在研制具有最佳治疗窗(即在低、无毒剂量下具有高活性)的靶向型抗癌剂时为重要元素。
因此，对具有新接头组分类别的ADC存在需要。
发明内容
本发明是有关一种由下式表示的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
CB为细胞结合剂；
L2不存在或为间隔基；
A为氨基酸残基或包含2至20个氨基酸残基的肽；
R1和R2各自独立地为H或C1-3烷基；
L1为间隔基；
D-L1-SH为细胞毒性剂；并且
q为1至20的整数。
本发明还有关一种式(II)化合物：
L2′-A-NH-CR1R2-S-L1-D (II)
或其药学上可接受的盐，其中：
L2'不存在或为带有反应性部分的间隔基，所述反应性部分能与细胞结合剂形成共价键；
A为氨基酸或包含2至20个氨基酸的肽；
R1和R2各自独立地为H或C1-3烷基；
L1为间隔基；
D-L1-SH为细胞毒性剂；并且
q为1至20的整数。
本发明中还包括一种式(III)化合物：
A′-NH-CR1R2-S-L1-D (III)
或其药学上可接受的盐，其中：
A'为氨基酸或包含2至20个氨基酸的肽；
R1和R2各自独立地为H或C1-3烷基；
L1为间隔基；
D-L1-SH为细胞毒性剂；并且
q为1至20的整数。
本发明还有关一种式(IV)化合物：
L3-A-NH-CR1R2-S-L1-D (IV)
或其药学上可接受的盐，其中：
L3由下式表示：
Rx'和Ry'在每次出现时独立地为H、-OH、卤素、-O-(C1-4烷基)、-SO3H、-NR40R41R42 +或任选由-OH、卤素、SO3H或NR40R41R42 +取代的C1-4烷基，其中R40、R41以及R42各自独立地为H或C1-4烷基；
k为1至10的整数；
A为氨基酸或包含2至20个氨基酸的肽；
R1和R2各自独立地为H或C1-3烷基；
L1为间隔基；
D-L1-SH为细胞毒性剂；并且
q为1至20的整数。
本发明还有关一种包含缀合物(例如式(I)的缀合物)或化合物(例如式(II)、(III)或(IV)的化合物)以及载体(药学上可接受的载体)的组合物(例如药物组合物)。本发明还包括一种包含本文所描述的缀合物(例如式(I)的缀合物)或化合物(例如式(II)、(III)或(IV)的化合物)以及载体(药学上可接受的载体)的组合物(例如药物组合物)，所述组合物还包含第二治疗剂。本发明组合物可用于在哺乳动物(例如人)中抑制异常细胞生长或治疗增殖性病症。本发明组合物可用于治疗哺乳动物(例如人)的诸如以下疾患：癌症、类风湿性关节炎、多发性硬化、移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植排斥、狼疮、肌炎、感染、免疫缺陷(诸如艾滋病)以及炎性疾病。
本发明还包括一种在哺乳动物(例如人)中抑制异常细胞生长或治疗增殖性病症的方法，所述方法包括向所述异常细胞或所述哺乳动物单独或与第二治疗剂组合施用治疗有效量的缀合物(例如式(I)的缀合物)或化合物(例如式(II)、(III)或(IV)的化合物)或其组合物。
附图说明
图1展示所测试的Ab-sSPDB-DM4缀合物并与本发明的缀合物相比较。
图2展示所测试的肽苯氨基类美登素ADC并与本发明的缀合物相比较。
图3展示用于制备本发明的具有自分解肽接头的代表性类美登素化合物的合成方案。
图4展示用于制备本发明的代表性缀合物的合成方案。
图5展示用于制备本发明的具有自分解肽接头的代表性类美登素化合物的合成方案。
图6展示用于制备本发明缀合物的S-甲基化代谢产物的合成方案。
图7示出了本发明的代表性缀合物对T47D细胞上的靶抗原的结合亲和力。
图8示出了本发明的代表性缀合物对KB细胞的体外细胞毒性。
图9A、图9B、图9C以及图9D示出了本发明的代表性缀合物的旁观者杀伤效应。
图10示出了本发明的代表性缀合物在带有250mm2的大EGFR受体阳性异种移植物的小鼠中的体内抗肿瘤活性。
图11A和图11B示出了在5mg/kg(图11A)和2.5mg/kg(图11B)剂量下本发明的代表性缀合物在带有CanAg+HT-29异种移植物的小鼠中的体内抗肿瘤活性。
图12示出了本发明的代表性缀合物在带有NCI-H2110叶酸受体阳性异种移植物的小鼠中的体内抗肿瘤活性。以3mg/kg剂量给予小鼠缀合物17c或4b。
图13示出了用本发明的代表性缀合物处理的小鼠与用缀合物4b处理的小鼠相比的体重变化。
图14示出了本发明的代表性缀合物与1a相比对CA922细胞的体外细胞毒性。
图15示出了25a、25b以及25c的代谢产物与缀合物Ab-sSPDB-DM4的代谢产物种类3相比的体外细胞毒性。
图16示出了由缀合物17c的体外代谢研究检测到的代谢产物种类和建议的裂解位点。
图17A和图17B示出了本发明的代表性缀合物在带有具有异源FRα表达的OV-90卵巢异种移植物的小鼠中的体内抗肿瘤活性。以1.25mg/kg、2.5mg/kg或5mg/kg剂量给予小鼠缀合物17c或缀合物4b。
图18用本发明的具有不同肽接头的代表性缀合物处理的小鼠与用缀合物1a处理的小鼠相比的体重变化。
图19示出了来自未暴露于任何缀合物的COLO205细胞(顶部)和暴露于缀合物18c的COLO205细胞的DTT和NEM处理的细胞溶解产物的UPLC描记线。
图20示出了缀合物18c的SEC/MS图谱。
图21示出了缀合物16c的SEC/MS图谱。
图22示出了缀合物17c的SEC/MS图谱。
图23示出了缀合物26c的SEC/MS图谱。
图24A示出了给予1200μg/kg huML66-GMBS-Ala3-Immol-DM(缀合物16a、16b、16c以及16d)或huML66-s-SPDB-DM4(缀合物1a)的CD-1小鼠的体重(平均值±SD，g)。
图24B示出了给予1200μg/kg huML66-GMBS-Ala3-Immol-DM(缀合物16a、16b、16c以及16d)或huML66-s-SPDB-DM4(缀合物1a)的CD-1小鼠的体重变化(平均值±SD，g)。
图25A示出了给予1000或1250μg/kg Mov19v1.6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM(缀合物17c)或1250μg/kg Mov19v1.6-GMBS-dAlalAla-PAB-DM1(缀合物4b)的CD-1小鼠的体重(平均值±SD，g)。
图25B示出了给予1000或1250μg/kg Mov19v1.6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM(缀合物17c)或1250μg/kg Mov19v1.6-GMBS-dAlalAla-PAB-DM1(缀合物4b)的CD-1小鼠的体重变化(平均值±SD，g)。
图25C示出了给予1000或1250μg/kg Mov19v1.6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM(缀合物17c)或1250μg/kg Mov19v1.6-GMBS-dAlalAla-PAB-DM1(缀合物4b)的个别CD-1小鼠的体重变化。
图25D示出了给予1000或1250μg/kg Mov19v1.6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM(缀合物17c)或1250μg/kg Mov19v1.6-GMBS-dAlalAla-PAB-DM1(缀合物4b)的CD-1小鼠的个别体重。
图26示出了缀合物17c和M-SPDB-DM4缀合物在小鼠中的药代动力学型态。
图27示出了缀合物26c和M9346A-C442-mal-SPDB-DM4的相较于时间的规范化的降解百分比。
具体实施方式
现将详细提到本发明的某些实施方案，其实例是以伴随结构和式子加以说明。虽然将结合所列举的实施方案描述本发明，但应了解它们不旨在将本发明限于那些实施方案。相反地，本发明旨在涵盖可包括可包括在如权利要求书所界定的本发明范围内的所有替代、修改以及等效形式。本领域技术人员将认可可用于实践本发明的类似或等效于本文所描述的方法和材料的许多方法和材料。
应了解，除非明确否认或不适当，否则本文所描述的实施方案中的任一者，包括在本发明的不同方面(例如化合物、化合物-接头分子、缀合物、组合物、制备以及使用方法)和本说明书的不同部分下所描述的那些实施方案(包括仅在实施例中描述的实施方案)可与本发明的一个或多个其他实施方案组合。实施方案的组合不限于经由多个从属权利要求所要求的那些特定组合。
定义
如本文所用，术语“治疗(treating/treatment)”包括以改善或稳定受试者疾患的方式逆转、减轻或抑制疾患的症状、临床迹象以及潜在病变。如本文所用，并且如本领域中熟知的，“治疗”为用于获得有益或所需结果，包括临床结果的方法。有益或所需临床结果可包括但不限于可检测或不可检测的与疾患(例如癌症)相关的一种或多种症状或疾患的缓解、改善或减慢进展、疾病程度的消除、疾病状态的稳定(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或减缓以及缓和(部分或总体)。“治疗”还可意味与如果不接受治疗的预期存活相比延长存活。本文中描述示例性有益临床结果。
“任选的”或“任选地”意味随后描述的情况可能发生或可能不发生，使得本申请包括该情况发生的情况以及它不发生的情况。举例来说，短语“任选取代”意味着在给定原子上可能存在或可能不存在非氢取代基，并且因此，本申请包括存在非氢取代基的结构以及不存在非氢取代基的结构。
除非具体陈述为“未取代”，否则本文中提到化学部分应理解为包括经取代的变体。举例来说，提到“烷基”基团或部分隐含地包括取代与未取代的变体两者。化学部分上的取代基的实例包括但不限于卤素、羟基、羰基(诸如羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基)、硫羰基(诸如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、烷硫基、酰氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、氨基、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、硫氢基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、胺磺酰基、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳基或杂芳基部分。
如本文所用，术语“细胞结合剂”或“CBA”是指可优选以特异性方式结合细胞(例如在细胞-表面配体上)或结合与细胞相关或在细胞近端的配体的化合物。在某些实施方案中，与细胞或细胞上或细胞附近的配体的结合为特异性的。CBA可包括肽和非肽。
如本文所用的“烷基”是指饱和直链或分枝链单价烃基。在优选实施方案中，直链或分枝链烷基在其主链中具有三十个或更少个碳原子(例如对于直链为C1-C30、对于分枝链为C3-C30)，并且更优选为二十个或更少个。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基)、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基等。此外，如本说明书、实施例以及权利要求书中所用的术语“烷基”旨在包括“未取代的烷基”与“取代的烷基”两者，其中后者是指在烃主链的一个或多个碳上具有代替氢的取代基的烷基部分。在某些实施方案中，直链或分枝链烷基在其主链中具有或更少个碳原子(例如对于直链为C1-C30，对于分枝链为C3-C30)。在优选实施方案中，所述链在其主链中具有十个或更少个碳(C1-C10)原子。在其他实施方案中，所述链在其主链中具有六个或更少个碳(C1-C6)原子。在另一实施方案中，所述链在其主链中具有三个或更少个碳(C1-C3)原子。
如本文所用的“亚烷基”是指饱和直链或分枝链二价烃基。在优选实施方案中，直链或分枝链亚烷基在其主链中具有三十个或更少个碳原子(例如对于直链为C1-C30，对于分枝链为C3-C30)，并且更优选为二十个或更少个。此外，如本说明书、实施例以及权利要求书中所用的术语“亚烷基”旨在包括“未取代的亚烷基”与“取代的亚烷基”两者，其中后者是指在烃主链的一个或多个碳上具有代替氢的取代基的亚烷基部分。在某些实施方案中，直链或分枝链亚烷基在其主链中具有或更少个碳原子(例如对于直链为C1-C30，对于分枝链为C3-C30)。在优选实施方案中，所述链在其主链中具有十个或更少个碳(C1-C10)原子。在其他实施方案中，所述链在其主链中具有六个或更少个碳(C1-C6)原子。在另一实施方案中，所述链在其主链中具有三个或更少个碳(C1-C3)原子。
“烯基”是指具有两个至二十个碳原子以及至少一个不饱和位点(即碳-碳双键)的直链或分枝链单价烃基，其中烯基包括具有“顺式”和“反式”取向或者“E”和“Z”取向的基团。实例包括但不限于乙烯基(ethylenyl/vinyl)(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)等。优选地，烯基具有两个至十个碳原子。更优选地，烯基具有两个至四个碳原子。
“亚烯基”是指具有两个至二十个碳原子以及至少一个不饱和位点(即碳-碳双键)的直链或分枝链二价烃基，其中烯基包括具有“顺式”和“反式”取向或者“E”和“Z”取向的基团。实例包括但不限于亚乙烯基(ethylenylene/vinylene)(-CH＝CH-)、亚烯丙基(-CH2CH＝CH-)等。优选地，亚烯基具有两个至十个碳原子。更优选地，亚烯基具有两个至四个碳原子。
“炔基”是指具有两个至二十个碳原子以及至少一个不饱和位点(即碳-碳三键)的直链或分枝链单价烃基。实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、己炔基等。优选地，炔基具有两个至十个碳原子。更优选地，炔基具有两个至四个碳原子。
“亚炔基”是指具有两个至二十个碳原子以及至少一个不饱和位点(即碳-碳三键)的直链或分枝链二价烃基。实例包括但不限于亚乙炔基、亚丙炔基、1-亚丁炔基、2-亚丁炔基、1-亚戊炔基、2-亚戊炔基、3-亚戊炔基、亚己炔基等。优选地，亚炔基具有两个至十个碳原子。更优选地，亚炔基具有两个至四个碳原子。
术语“碳环(carbocycle/carbocyclic ring)”和“碳环基”是指作为单环具有3至12个碳原子或作为双环具有7至12个碳原子的单价非芳族、饱和或部分不饱和环。具有7至12个原子的双环碳环可被布置成例如双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统形式，并且具有9或10个环原子的双环碳环可被布置成双环[5,6]或[6,6]系统形式，或桥接系统形式，诸如双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷以及双环[3.2.2]壬烷。单环碳环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环已二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一基、环十二基等。
术语“环状烷基”与“环烷基”可互换使用。如本文所用，所述术语是指饱和环的基团。在优选实施方案中，环烷基在其环结构中具有3至10个碳原子，并且更优选在环结构中具有5至7个碳原子。在一些实施方案中，所述两个环可共同具有两个或更多个原子，例如所述环为“稠合环”。适合的环烷基包括环庚基、环己基、环戊基、环丁基以及环丙基。在一些实施方案中，环烷基为单环基团。在一些实施方案中，环烷基为双环基团。在一些实施方案中，环烷基为三环基团。
术语“亚环烷基”是指饱和碳环的二价基团。在优选实施方案中，亚环烷基在其环结构中具有3至10个碳原子，并且更优选在环结构中具有5至7个碳原子。在一些实施方案中，所述两个环可共同具有两个或更多个原子，例如所述环为“稠合环”。适合的亚环烷基包括亚环庚基、亚环己基、亚环戊基、亚环丁基以及亚环丙基。在一些实施方案中，亚环烷基为单环基团。在一些实施方案中，亚环烷基为双环基团。在一些实施方案中，亚环烷基为三环基团。
术语“环状烯基”是指在环结构中具有至少一个双键的碳环基团。
术语“环状炔基”是指在环结构中具有至少一个三键的碳环基团。
如本文所用的术语“芳基”包括取代或未取代的单环芳族基，其中环的每个原子为碳。优选地，所述环为5元至7元环，更优选为6元环。芳基包括苯基、苯酚、苯胺等。术语“芳基”还包括具有两个或更多个环的“多环基”、“多环”以及“多环的”环系统，其中两个或更多个原子为两个相邻环共同拥有的，例如所述环为“稠合环”，其中所述环中的至少一者为芳族环，例如其他环可为环烷基、环烯基、环炔基。在一些优选实施方案中，多环具有2至3个环。在某些优选实施方案中，多环系统具有两个环，其中所述环中的两者均为芳族环。多环的环中的每一者可为取代的或未取代的。在某些实施方案中，多环的每个环在环中含有3至10个原子，优选为5至7个。举例来说，芳基包括但不限于苯基(苯)、甲苯基、蒽基、芴基、茚基、薁基以及萘基以及苯并融合碳环部分(诸如5,6,7,8-四氢萘基)等。在一些实施方案中，芳基为单环芳族基。在一些实施方案中，芳基为双环芳族基。在一些实施方案中，芳基为三环芳族基。
如本文所用的“亚芳基”为上文所描述的芳基的二价基团。
如本文所用的术语“杂环(heterocycle/heterocyclic ring)”和“杂环基”是指3元至18元环、优选为3至10元环、更优选为3至7元环的取代或未取代的非芳族环结构，其环结构包括至少一个杂原子，优选为一至四个杂原子，更优选为一或两个杂原子。在某些实施方案中，环结构可具有两个环。在一些实施方案中，所述两个环可共同具有两个或更多个原子，例如所述环为“稠合环”。杂环基包括例如哌啶、哌嗪、吡咯烷、吗啉、内酯、内酰胺等。Paquette,Leo A.；“Principles of Modern Heterocyclic Chemistry”(W.A.Benjamin,New York,1968),特别是第1章、第3章、第4章、第6章、第7章以及第9章；“The Chemistry ofHeterocyclic Compounds,A series of Monographs”(John Wiley&Sons,New York,1950至今),特别是第13卷、第14卷、第16卷、第19卷以及第28卷；以及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566中描述了杂环。杂环的实例包括但不限于四氢呋喃、二氢呋喃、四氢噻吩、四氢吡喃、二氢吡喃、四氢噻喃基、硫代吗啉、噻噁烷、高哌嗪、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、高哌啶、氧杂环庚烷、硫杂环庚烷、氧氮杂环庚三烯、二氮杂环庚三烯、硫氮杂环庚三烯、2-吡咯啉、3-吡咯啉、吲哚啉、2H-吡喃、4H-吡喃、二氧杂环己烷基、1,3-二氧杂环戊烷、吡唑啉、二噻烷、二硫杂环戊烷、二氢吡喃、二氢噻吩、二氢呋喃、吡唑啶基咪唑啉、咪唑烷、3-氮杂双环[3.1.0]己基、3-氮杂双环[4.1.0]庚烷以及氮杂双环[2.2.2]己烷。螺部分也包括在此定义范围内。环原子用氧代(＝O)部分取代的杂环基的实例为嘧啶酮和1,1-二氧代-硫代吗啉。
术语“亚杂环基”是指上文所描述的杂环基团的二价基团。
如本文所用的术语“杂芳基”是指取代或未取代的芳族单环结构，优选为5至7元环，更优选为5至6元环，其环结构包括至少一个杂原子(例如O、N或S)，优选为一至四个或一至3个杂原子，更优选为一或两个杂原子。当杂芳基环中存在两个或更多个杂原子时，它们可为相同或不同的。术语“杂芳基”还包括具有两个或更多个环的“多环基”、“多环”以及“多环的”环系统，其中两个或更多个碳为两个相邻环共同拥有的，例如所述环为“稠合环”，其中所述环中的至少一者为杂芳族环，例如其他环可为环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环基。在一些优选实施方案中，优选多环具有2至3个环。在某些实施方案中，优选多环系统具有两个环，其中所述环中的两者均为芳族环。在某些实施方案中，多环的每个环在环中含有3至10个原子，优选为5至7个。举例来说，杂芳基包括但不限于吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、喹啉、嘧啶、吲哚嗪、吲哚、吲唑、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并呋喃、苯并噻吩、噌啉、酞嗪、喹唑啉、咔唑、吩噁嗪、喹啉、嘌呤等。在一些实施方案中，杂芳基为单环芳族基。在一些实施方案中，杂芳基为双环芳族基。在一些实施方案中，杂芳基为三环芳族基。
术语“亚杂芳基”是指上文所描述的杂芳基的二价基团。
杂环或杂芳基可在可能的情况下为碳连接(碳-键联)或氮连接(氮-键联)的。举例来说并且不限于，碳键合的杂环或杂芳基是键合于吡啶的位置2、3、4、5或6；哒嗪的位置3、4、5或6；嘧啶的位置2、4、5或6；吡嗪的位置2、3、5或6；呋喃、四氢呋喃、噻吩、噻吩、吡咯或四氢吡咯的位置2、3、4或5；噁唑、咪唑或噻唑的位置2、4或5；异噁唑、吡唑或异噻唑的位置3、4或5；氮杂环丙烷的位置2或3；氮杂环丁烷的位置2、3或4；喹啉的位置2、3、4、5、6、7或8；或异喹啉的位置1、3、4、5、6、7或8。
举例来说并且不限于，氮键合的杂环或杂芳基是键合于氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑的位置1；异吲哚或异吲哚啉的位置2；吗啉的位置4；以及咔唑或O-咔啉的位置9。
存在于杂芳基或杂环基中的杂原子包括氧化形式，诸如NO、SO以及SO2。
术语“卤基”或“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。
上文所描述的烷基、亚烷基、亚烯基、炔、亚炔基、环状烷基、亚环烷基、碳环基、芳基、亚芳基、杂环基、亚杂环烷基、杂芳基以及亚杂芳基可任选再用一个(例如2、3、4、5、6或更多个)取代基取代。
术语“经取代”是指在化合物主链的一个或多个碳上具有代替氢的取代基的部分。应了解“取代”或“用……取代”包括隐含前提条件：此类取代符合取代的原子和取代基允许的价数，并且取代产生稳定化合物，例如所述稳定化合物不诸如因重排、环化、消除等而自发地经历转化。如本文所用，术语“取代的”预期包括有机化合物的所有可允许的取代基。在广泛方面中，可允许的取代基包括有机化合物的非环和环状、分枝和不分枝、碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。对于适当的有机化合物，可允许的取代基可为一个或多个并且为相同或不同的。出于本发明的目的，诸如氮的杂原子可具有氢取代基和/或本文所描述的有机化合物的满足杂原子价数的任何可允许的取代基。取代基可包括本文所描述的任何取代基，例如卤素、羟基、羰基(诸如羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基)、硫羰基(诸如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、烷硫基、酰氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、氨基、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、硫氢基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、胺磺酰基、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳族或杂芳族部分。为了说明，单氟烷基为用一个氟取代基取代的烷基，并且二氟烷基为用两个氟取代基取代的烷基。应认识到，如果在取代基上存在超过一个取代，那么每个非氢取代基可为相同或不同的(除非另外说明)。“任选的”或“任选地”意味随后描述的情况可能发生或可能不发生，使得本申请包括该情况发生的情况以及它不发生的情况。举例来说，短语“任选取代”意味在给定原子上可能存在或可能不存在非氢取代基，并且因此，本申请包括存在非氢取代基的结构以及不存在非氢取代基的结构。如果将取代基的碳描述为任选由一系列取代基中的一个或多个取代，那么所述碳上的氢中的一个或多个(在存在任何氢的情况下)可分开地和/或一起用独立选择的任选取代基代替。如果将取代基的氮描述为任选由一系列取代基中的一个或多个取代，那么所述氮上的氢中的一个或多个(在存在任何氢的情况下)可各自用独立选择的任选取代基代替。可将一种示例性取代基描绘成-NR'R”，其中R'和R”与其所连接的氮原子一起可形成杂环。由R'和R”与其所连接的氮原子一起形成的杂环可为部分饱和或完全饱和的。在一些实施方案中，杂环由3至7个原子组成。在另一实施方案中，杂环选自由以下组成的组：吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、异噁唑基、吡啶基以及噻唑基。
本说明书可互换地使用术语“取代基”与“基团”。
如果将一组取代基统一描述为任选由一系列取代基中的一个或多个取代，那么该组可包括：(1)不可取代的取代基，(2)未用任选取代基取代的可取代的取代基，和/或(3)用任选取代基中的一个或多个取代的可取代的取代基。
如果将取代基描述为任选由最多特定数目的非氢取代基取代，那么所述取代基可为(1)未取代的；或(2)用最多所述特定数目的非氢取代基取代或最多在取代基上最大数目的可取代位置发生取代，无论哪个较小。因此，举例来说，如果将取代基描述为任选由最多3个非氢取代基取代的杂芳基，那么具有少于3个可取代位置的任何杂芳基将任选由最多仅与所述杂芳基所具有的可取代位置一样多的非氢取代基取代。在非限制性实例中，此类取代基可选自具有1至10个碳原子的线性、分枝或环状的烷基、烯基或炔基；芳基、杂芳基、杂环基、卤素、胍盐[-NH(C＝NH)NH2]、-OR100、NR101R102、-NO2、-NR101COR102、-SR100、由-SOR101表示的亚砜、由-SO2R101表示的砜、磺酸酯-SO3M、硫酸酯-OSO3M、由-SO2NR101R102表示的磺酰胺、氰基、叠氮基、-COR101、-OCOR101、-OCONR101R102以及聚乙二醇单元(-CH2CH2O)nR101，其中M为H或阳离子(诸如Na+或K+)；R101、R102以及R103各自独立地选自H、具有1至10个碳原子的线性、分枝或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-CH2CH2O)n-R104(其中n为1至24的整数)、具有6至10个碳原子的芳基、具有3至10个碳原子的杂环以及具有5至10个碳原子的杂芳基；并且R104为H或具有1至4个碳原子的直链或分枝链烷基，其中基团中由R100、R101、R102、R103以及R104表示的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基以及杂环基任选由一个或多个(例如2、3、4、5、6或更多个)独立地选自以下的取代基取代：卤素、-OH、-CN、-NO2以及未取代的具有1至4个碳原子的直链或分枝链烷基。优选地，用于上文所描述的任选取代的烷基、烯基、炔基、环状烷基、环状烯基、环状炔基、碳环基、芳基、杂环基以及杂芳基的取代基包括卤素、-CN、-NR102R103、-CF3、-OR101、芳基、杂芳基、杂环基、-SR101、-SOR101、-SO2R101以及-SO3M。
术语“化合物”或“细胞毒性化合物”可互换使用。它们旨在包括如下化合物，所述化合物的结构或化学式或其任何衍生物已在本发明中公开或者结构或化学式或其任何衍生物已以引用的方式并入本文中。所述术语还包括本发明中所公开的所有式子的化合物的立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂合物、代谢产物、盐(例如药学上可接受的盐)和前药以及前药盐。所述术语还包括前述各项中的任一者的任何溶剂合物、水合物以及多晶型物。在本申请中所描述的本发明的某些方面中，关于“立体异构体”、“几何异构体”、“互变异构体”、“溶剂合物”、“代谢产物”、“盐”、“前药”、“前药盐”、“缀合物”、“缀合物盐”、“溶剂合物”、“水合物”或“多晶型物”的特定叙述不应解释为在本发明的使用术语“化合物”而未叙述这些其他形式的其他方面中意在省略这些形式。
如本文所用的术语“缀合物”是指键联至细胞结合剂的本文所描述的化合物或其衍生物。
如本文所用的术语“可键联至细胞结合剂”是指本文所描述的化合物或其衍生物包含适合于将这些化合物或其衍生物键合至细胞结合剂的至少一个键联基团或其前体。
术语给定基团的“前体”是指可通过任何去保护、化学改性或偶联反应而产生所述基团的任何基团。
术语“键联至细胞结合剂”是指缀合物分子包含经由适合的键联基团或其前体结合于细胞结合剂的本文所描述的化合物中的至少一者或其衍生物。
术语“手性”是指分子具有镜像配偶体不可重叠的特性，而术语“非手性”是指分子可重叠于其镜像配偶体。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成和连接性，但原子在空间的取向不同从而不能通过围绕单键旋转而互变的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心并且分子不为彼此的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同物理特性，例如熔点、沸点、光谱特性以及反应性。非对映异构体的混合物可根据诸如结晶、电泳以及色谱等高拆分率分析程序加以分离。
“对映异构体”是指化合物的彼此为不能重叠的镜像的两种立体异构体。
本文中所用的立体化学定义和惯例总体上遵循S.P.Parker编,McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；以及Eliel,E.和Wilen,S.,“Stereochemistry of Organic Compounds”,John Wiley&Sons,Inc.,New York,1994。本发明的化合物可含有不对称或手性中心，并且因此以不同立体异构体形式存在。本发明的化合物的所有立体异构体形式(包括但不限于非对映异构体、对映异构体以及阿托异构体(atropisomer)以及其混合物，诸如外消旋混合物)旨在形成本发明的一部分。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有使平面偏振光的平面旋转的能力。在描述光学活性化合物时，使用前缀D和L或R和S来表示分子围绕其手性中心的绝对构型。使用前缀d和l或(+)和(-)来指定由化合物引起的平面偏振光旋转的符号，其中(-)或l意味化合物为左旋的。具有前缀(+)或d的化合物为右旋的。对于给定化学结构，这些立体异构体相同，除了它们为彼此的镜像。特定立体异构体也可被称为对映异构体，并且此类异构体的混合物常常被称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物被称为外消旋混合物或外消旋物，外消旋混合物或外消旋物可在化学反应或方法中在一直不存在立体选择或立体特异性的情况下存在。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”是指两种对映异构体种类的等摩尔混合物，没有光学活性。
术语“互变异构体”或“互变异构体形式”是指具有不同能量的结构异构体，所述结构异构体可经由低能量屏障互变。举例来说，质子互变异构体(也称为质子异变互变异构体)包括经由质子迁移而互变，诸如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。价互变异构体包括通过一些成键电子的再组织而互变。
如本申请中所用的术语“前药”是指本发明化合物的前体或衍生形式，本发明化合物的前体或衍生形式能够酶促或水解活化或转化成更具活性的母体形式。参见例如Wilman,“Prodrugs in Cancer Chem-otherapy”Biochemical Society Transactions,14,第375-382页,贝尔法斯特第615次会议(615th Meeting Belfast)(1986)以及Stella等,“Pro-drugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”,Directed DrugDelivery,Borchardt等,(编),第247-267页,Humana Press(1985)。本发明的前药包括但不限于含酯前药、含磷酸酯前药、含硫代磷酸酯前药、含硫酸酯前药、含肽前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化前药、含β-内酰胺前药、含任选取代的苯氧乙酰胺的前药、含任选取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶以及其他5-氟尿苷前药，该等前药可转化成更具活性的细胞毒性游离药物。可衍生为用于本发明中的前药形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于诸如上文所描述的本发明化合物和化学治疗剂。
术语“前药”还意在包括可在生物条件下(体外或体内)水解、氧化或以其他方式反应以提供本发明化合物的化合物衍生物。前药可仅在生物条件下在此类反应后变得具活性，或它们可以其未反应形式具有活性。本发明中所涵盖的前药的实例包括但不限于本文所公开的任一式子的化合物的类似物或衍生物，该等物质包含生物可水解部分，诸如生物可水解酰胺、生物可水解酯、生物可水解氨基甲酸酯、生物可水解碳酸酯、生物可水解酰脲以及生物可水解磷酸酯类似物。前药的其他实例包括本文所公开的任一式子的化合物的包含-NO、-NO2、-ONO或-ONO2部分的衍生物。前药可典型地使用熟知方法来制备，诸如由Burger,Medicinal Chemistry and Drug Discovery(1995)172-178,949-982(ManfredE.Wolff编,第5版)描述的那些方法；还参见Goodman和Gilman,The Pharmacologicalbasis of Therapeutics,第8版,McGraw-Hill,Int.编1992,“Biotransformation ofDrugs”。
如本文所用的短语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的药学上可接受的有机或无机盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲烷磺酸盐“甲磺酸盐”、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐以及双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可涉及包括另一分子，诸如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他反离子。反离子可为使母体化合物上的电荷稳定的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可具有超过一个带电荷原子。多个带电荷原子为药学上可接受的盐的一部分的情况可具有多个反离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电荷原子和/或一个或多个反离子。
如果本发明的化合物为碱，那么所需药学上可接受的盐可通过本领域中可获得的任何适合的方法来制备，例如用无机酸或用有机酸处理游离碱，所述无机酸为诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸等，所述有机酸为诸如乙酸、马来酸、琥珀酸、苦杏仁酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(诸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸)、α羟基酸(诸如柠檬酸或酒石酸)、氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)、芳族酸(诸如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(诸如对甲苯磺酸或乙磺酸)等。
如果本发明的化合物为酸，那么所需药学上可接受的盐可通过任何适合的方法来制备，例如用诸如以下的无机或有机碱处理游离酸：胺(伯、仲或叔)、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物等。适合的盐的说明性实例包括但不限于来源于氨基酸(诸如甘氨酸和精氨酸)、氨水、伯胺、仲胺以及叔胺以及环状胺(诸如哌啶、吗啉以及哌嗪)的有机盐以及来源于钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝以及锂的无机盐。
如本文所用，术语“溶剂合物”意味还包括通过非共价分子间作用力结合的化学计量或非化学计量量的诸如以下的溶剂的化合物：水、异丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸以及乙醇胺二氯甲烷、2-丙醇等。化合物的溶剂合物或水合物是通过将至少一摩尔当量的诸如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇等羟基溶剂或水添加至化合物中以引起亚胺部分的溶解或水合作用而容易地制备。
术语“异常细胞生长”和“增殖性病症”在本申请中可互换使用。如本文所用的“异常细胞生长”除非另外指出，否则是指与正常调控机制(例如接触抑制的损失)无关的细胞生长。此术语包括例如以下各项的异常生长：(1)通过表达突变酪氨酸激酶或受体酪氨酸激酶的过表达而增殖的肿瘤细胞(肿瘤)；(2)发生异常酪氨酸激酶活化的其他增殖性疾病的良性和恶性细胞；(3)因受体酪氨酸激酶而增殖的任何肿瘤；(4)因异常丝氨酸/苏氨酸激酶活化而增殖的任何肿瘤；以及(5)发生异常丝氨酸/苏氨酸激酶活化的其他增殖性疾病的良性和恶性细胞。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中典型地以无秩序细胞生长为特征的生理条件。“肿瘤”包含一个或多个癌细胞，和/或良性或癌前细胞。
“治疗剂”涵盖诸如抗体、肽、蛋白质、酶等生物制剂或化学治疗剂两者。
“化学治疗剂”为可用于治疗癌症的化合物。
“代谢产物”为通过指定化合物、其衍生物或其缀合物或其盐在体内的代谢产生的产物。可使用本领域中已知的常规技术来鉴定化合物、其衍生物或其缀合物的代谢产物并且使用诸如本文所描述的那些测试来测定其活性。可例如由所施用化合物的氧化、羟基化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、脱脂化、酶裂解等产生此类产物。因此，本发明包括本发明的化合物、其衍生物或其缀合物的代谢产物，包括通过如下方法产生的化合物、其衍生物或其缀合物，所述方法包括使本发明的化合物、其衍生物或其缀合物与哺乳动物接触足以产生其代谢产物的一段时间。
短语“医药学上可接受”表明物质或组合物必须与包含制剂的其他成分和/或用它处理的哺乳动物在化学上和/或毒理学上为相容的。
术语“保护基”或“保护部分”是指通常用于阻断或保护特定官能团，而使化合物、其衍生物或其缀合物上的其他官能团发生反应的取代基。举例来说，“胺保护基”或“氨基保护部分”为附接至氨基从而阻断或保护化合物中的氨基官能团的取代基。此类基团为本领域中熟知的(参见例如P.Wuts和T.Greene,2007,Protective Groups in OrganicSynthesis,第7章,J.Wiley&Sons,NJ)并且通过以下各项来例示：氨基甲酸酯(诸如氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯)、FMOC、取代的氨基甲酸乙酯、通过1,6-β-消除(也称为“自分解”)裂解的氨基甲酸酯、脲、酰胺、肽、烷基以及芳基衍生物。适合的氨基保护基包括乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧基羰基(BOC)、苯甲氧基羰基(CBZ)以及9-芴基亚甲氧基羰基(Fmoc)。关于保护基和其用途的一般描述，参见P.G.M.Wuts和T.W.Greene,Protective Groups inOrganic Synthesis,John Wiley&Sons,New York,2007。
术语“离去基”是指在取代或置换期间离开的带电荷或不带电荷部分的基团。此类离去基为本领域中熟知的并且包括但不限于卤素、酯、烷氧基、羟基、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、甲磺酸酯、腈、叠氮化物、氨基甲酸酯、二硫化物、硫酯、硫醚以及重氮化合物。
术语“双官能交联剂”、“双官能接头”或“交联剂”是指具有两个反应性基团的改性剂；其中的一者能够与细胞结合剂反应，而另一者与细胞毒性化合物反应，从而将两个部分键联在一起。此类双官能交联剂为本领域中熟知的(参见例如Isalm和Dent,Bioconjugation第5章,第218-363页,Groves Dictionaries Inc.,New York,1999)。举例来说，能够经由硫醚键实现键联的双官能交联剂包括用于引入马来酰亚胺基的N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(SMCC)或用于引入碘乙酰基的N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)。将马来酰亚胺基或卤乙酰基引至细胞结合剂上的其他双官能交联剂为本领域中熟知的(参见美国专利申请2008/0050310、20050169933，所述专利申请可从Pierce Biotechnology Inc.P.O.Box 117,Rockland,IL61105,USA获得)并且包括但不限于双马来酰亚胺基聚乙二醇(BMPEO)、BM(PEO)2、BM(PEO)3、N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯(BMPS)、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、5-马来酰亚胺基戊酸NHS、HBVS、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(其为SMCC的“长链”类似物(LC-SMCC))、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酰肼或盐酸盐(MPBH)、3-(溴乙酰胺基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SBAP)、碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SMPB)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基磺酰基)苯甲酸酯(SVSB)、二硫代双马来酰亚胺基乙烷(DTME)、1,4-双马来酰亚胺基丁烷(BMB)、1,4双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷(BMDB)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)、双马来酰亚胺基乙烷(BMOE)、4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)、(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SIAB)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS)、N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-EMCS)、N-(κ-马来酰亚胺基十一酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-KMUS)以及4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMPB)。
杂双官能交联剂为具有两个不同反应性基团的双官能交联剂。含有胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS基团)与羰基反应性肼基的杂双官能交联剂也可用于使本文所描述的细胞毒性化合物与细胞结合剂(例如抗体)键联。此类可商购获得的杂双官能交联剂的实例包括琥珀酰亚胺基6-肼基烟酰胺丙酮腙(SANH)、琥珀酰亚胺基4-酰肼基对苯二甲酸酯盐酸盐(SHTH)以及琥珀酰亚胺基烟酸肼盐酸盐(SHNH)。可使用的双官能交联剂的实例包括苯甲酸琥珀酰亚胺基-对甲酰酯(SFB)和琥珀酰亚胺基-对甲酰基苯氧基乙酸酯(SFPA)。
能够使细胞结合剂与细胞毒性化合物经由二硫键键联的双官能交联剂为本领域中已知的并且包括用于引入二硫代吡啶基的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)。可用于引入二硫基的其他双官能交联剂为本领域中已知的并且在美国专利6,913,748、6,716,821以及美国专利公布20090274713和20100129314中公开，所述专利全部以引用的方式并入本文中。或者，还可使用引入硫醇基的交联剂，诸如2-亚氨基硫杂环戊烷、高半胱氨酸硫代内酯或S-乙酰基琥珀酸酐。
如本文所定义的“反应性部分”或“反应性基团”是指与另一化学基团形成共价键的化学部分。举例来说，反应性部分可与细胞结合剂(CBA)上的某些基团反应以形成共价键。在一些实施方案中，反应性部分为胺反应性基团，所述胺反应性基团可与定位于CBA上的赖氨酸残基的ε-胺形成共价键。在另一实施方案中，反应性部分为醛反应性基团，所述醛反应性基团可与定位于CBA上的醛基形成共价键。在另一实施方案中，反应性部分为硫醇反应性基团，所述硫醇反应性基团可与定位于CBA上的半胱氨酸残基的硫醇基形成共价键。
如本文所定义的“接头”、“接头部分”或“键联基团”是指将两个基团(诸如细胞结合剂和细胞毒性化合物)连接在一起的部分。典型地，接头在键联与其连接的两个基团的条件下为大体上惰性的。双官能交联剂可包含两个反应性基团，接头部分的每个末端各一个，使得一个反应性基团可首先与细胞毒性化合物反应以提供带有接头部分和第二反应性基团的化合物，第二反应性基团然后可与细胞结合剂反应。或者，首先可使双官能交联剂的一个末端与细胞结合剂反应，以提供带有接头部分和第二反应性基团的细胞结合剂，第二反应性基团然后可与细胞毒性化合物反应。键联部分可含有化学键，所述化学键允许在特定位点释放细胞毒性部分。适合的化学键为本领域中熟知的并且包括二硫键、硫醚键、酸不稳定键、光不稳定键、肽酶不稳定键以及酯酶不稳定键(参见例如美国专利5,208,020；5,475,092；6,441,163；6,716,821；6,913,748；7,276,497；7,276,499；7,368,565；7,388,026以及7,414,073)。优选为二硫键、硫醚以及肽酶不稳定键。可用于本发明中的其他接头包括不可裂解接头，诸如美国公布号20050169933中详细描述的所描述那些不可裂解接头；或U.S.2009/0274713、US 2010/01293140以及WO 2009/134976中所描述的带电荷接头或亲水性接头，所述专利中的每一者明确地以引用的方式并入本文中，所述专利中的每一者明确地以引用的方式并入本文中。
术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸以及以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸为由遗传密码编码的那些氨基酸，以及随后修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、硒代半胱氨酸以及O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构(即结合于氢、羧基、氨基以及R基团的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。尤其可使用的一种氨基酸为瓜氨酸，瓜氨酸为精氨酸的衍生物并且参与肝脏中尿素的形成。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般化学结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的化合物。术语“非天然氨基酸”旨在表示上文所描述的二十种天然存在的氨基酸的“D”立体化学形式。应进一步理解，术语非天然氨基酸包括天然氨基酸的同系物或其D异构体，以及天然氨基酸的合成修饰形式。合成修饰形式包括但不限于侧链缩短或延长最多两个碳原子的氨基酸、包含任选取代的芳基的氨基酸和包含卤化基团(优选为卤化烷基和芳基)的氨基酸以及N取代的氨基酸，例如N-甲基-丙氨酸。氨基酸或肽可通过氨基酸或肽的未端胺或未端羧酸附接至接头/间隔基或细胞结合剂。氨基酸还可通过诸如但不限于以下的侧链反应性基团附接至接头/间隔基或细胞结合剂：半胱氨酸的硫醇基、赖氨酸的ε胺或丝氨酸或苏氨酸的侧链羟基。
在一些实施方案中，氨基酸由NH2-C(Raa'Raa)-C(＝O)OH表示，其中Raa和Raa'各自独立地为H、任选取代的具有1至10个碳原子的线性、分枝或环状烷基、烯基或炔基、芳基、杂芳基或杂环基，或者Raa和N端氮原子可一起形成杂环(例如如在脯氨酸中)。术语“氨基酸残基”是指当从胺移除一个氢原子和/或从氨基酸的羧基末端移除羟基时的对应残基，诸如-NH-C(Raa'Raa)-C(＝O)O-。
如本文所用，氨基酸可为L或D异构体。除非另外指明，否则当提到氨基酸时，它可为L或D异构体或其混合物。在某些实施方案中，除非另外指明，否则当通过氨基酸序列提到肽时，氨基酸中的每一者可为L或D异构体。除非另外指明，否则如果将肽中的氨基酸中的一者指定为D异构体，那么其他氨基酸为L异构体。举例来说，肽D-Ala-Ala意味D-Ala-L-Ala。
氨基酸和肽可由阻断基保护。阻断基为保护氨基酸或肽的N端不发生不希望的反应的原子或化学部分并且可在药物-配体缀合物的合成期间使用。它在整个合成中应保持附接至N端，并且在药物缀合物的合成完成之后可通过选择性实现其移除的化学条件或其他条件来移除。适合用于N端保护的阻断基为肽化学技术中熟知的。示例性阻断基包括但不限于甲酯、叔丁酯、氨基甲酸9-芴基甲酯(Fmoc)以及苄氧羰基(Cbz)。
术语“可由蛋白酶裂解的肽”是指含有蛋白酶的裂解识别序列的肽。如本文所用，蛋白酶为可裂解肽键的酶。蛋白酶的裂解识别序列为在蛋白水解裂解期间由蛋白酶识别的特定氨基酸序列。许多蛋白酶裂解位点为本领域中已知的，并且接头部分中可包括这些和其他裂解位点。参见例如Matayoshi等Science 247:954(1990)；Dunn等Meth.Enzymol.241:254(1994)；Seidah等Meth.Enzymol.244:175(1994)；Thornberry,Meth.Enzymol.244:615(1994)；Weber等Meth.Enzymol.244:595(1994)；Smith等Meth.Enzymol.244:412(1994)；Bouvier等Meth.Enzymol.248:614(1995)；Hardy等,AMYLOID PROTEIN PRECURSOR INDEVELOPMENT,AGING,AND ALZHEIMER'S DISEASE编,Masters等,第190-198页(1994)。
基于由蛋白酶裂解的能力来选择肽序列，所述蛋白酶的非限制性实例包括组织蛋白酶B、C、D、H、L和S以及弗林蛋白酶(furin)。优选地，肽序列能够由适当的分离的蛋白酶在体外裂解，这可使用本领域中已知的体外蛋白酶裂解分析来进行测试。
在另一实施方案中，基于由溶酶体蛋白酶裂解的能力选择肽序列。溶酶体蛋白酶为主要定位于溶酶体中的蛋白酶，但还可定位于内体中。溶酶体蛋白酶的实例包括但不限于组织蛋白酶B、C、D、H、L和S以及弗林蛋白酶。
在另一实施方案中，基于由肿瘤相关蛋白酶(诸如存在于癌细胞表面上或细胞外肿瘤细胞附近的蛋白酶)裂解的能力来选择肽序列，此类蛋白酶的非限制性实例包括甲拌磷寡肽酶(thimet oligopeptidase，TOP)、CD10(中性溶酶(neprilysin))、基质金属蛋白酶(诸如MMP2或MMP9)、II型跨膜丝氨酸蛋白酶(诸如Hepsin、睪蛋白、TMPRSS4或间质蛋白酶/MT-SP1)、豆荚蛋白以及以下参考文献中所描述的酶(Current Topics in DevelopmentalBiology:Cell Surface Proteases,第54卷Zucker S.2003,Boston,MA)。肽由肿瘤相关蛋白酶裂解的能力可使用本领域中已知的体外蛋白酶裂解分析来测试。
术语“阳离子”是指具有正电荷的离子。阳离子可为单价的(例如Na+、K+等)、二价的(例如Ca2+、Mg2+等)或多价的(例如Al3+等)。在一些实施方案中，阳离子为单价的。
术语“治疗有效量”意指活性化合物或缀合物在受试者中引发所需生物反应的量。此类反应包括正在治疗的疾病或病症的症状的缓解；疾病症状或疾病本身的复发的预防、抑制或延迟；与不进行治疗相比受试者的寿命增加；或疾病症状或疾病本身的进展的预防、抑制或延迟。有效量的测定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文所提供的详细公开内容。可通过标准医药程序在细胞培养物中和实验动物中确定化合物I的毒性和治疗功效。要向受试者施用的本发明化合物或缀合物或其他治疗剂的有效量将取决于多发性骨髓瘤的阶段、类别以及状态；以及受试者的特征，诸如总体健康、年龄、性别、体重以及耐药性。所要施用的本发明化合物或缀合物或其他治疗剂的有效量还将取决于施用途径和剂型。可个别调整剂量和时间间隔以提供足以维持所需治疗效果的活性化合物血浆水平。
细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物
在第一方面中，本发明提供细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物，所述细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物包含共价键联至本文所描述的细胞毒性化合物的本文所描述的细胞结合剂的一个或多个分子。
在第一实施方案中，本发明的缀合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
CB为细胞结合剂；
L2不存在或为间隔基；
A为氨基酸残基或包含2至20个氨基酸残基的肽；
R1和R2各自独立地为H或C1-6烷基(例如R1和R2各自独立地为H或C1-3烷基)；
L1为间隔基；
D-L1-SH为细胞毒性剂；并且
q为1至20的整数。
在一个实施方案中，L1为-L1'-C(＝O)-；并且L1'为亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基，其中L1中的-C(＝O)-基团连接至D。
在另一实施方案中，R1和R2中的至少一者为H。在一个更特定实施方案中，R1和R2中的一者为H并且另一者为Me。
在第1特定实施方案中，对于式(I)的缀合物，R1和R2各自独立地为H或Me。在一个更特定实施方案中，R1与R2均为H。
在第2特定实施方案中，对于式(I)的缀合物，L1为-L1'-C(＝O)-；并且L1'为亚烷基或亚环烷基，其中L1中的-C(＝O)-基团连接至D；并且其余变量如上文在第一实施方案或第1特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，L1'为C1-10亚烷基。在另一更特定实施方案中，L1'为C1-20亚烷基。
在第3特定实施方案中，对于式(I)的缀合物，L1为-CR3R4-(CH2)1-8-C(＝O)-；R3和R4各自独立地为H或Me；并且其余变量如上文在第一实施方案或第1特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，R3与R4均为Me。
在第4特定实施方案中，对于式(I)的缀合物，L1为-CR3R4-(CH2)2-5-C(＝O)-或-CR3R4-(CH2)3-5-C(＝O)-；R3和R4各自独立地为H或Me；并且其余变量如上文在第一实施方案或第1特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，R3与R4均为Me。在另一更特定实施方案中，R3与R4均为H。
在第5特定实施方案中，对于式(I)的缀合物，L1为-(CH2)4-6-C(＝O)-；并且其余变量如上文在第一实施方案或第1特定实施方案中所描述。
在第6特定实施方案中，对于式(I)的缀合物，L2由以下结构式表示：
-JCB-RA-V-W-RB-V′-RC-JA-；
其中：
RA为亚烷基、环烷基亚烷基、亚芳基、亚杂芳基或亚杂环基；
RB和RC各自独立地不存在，为亚烷基、亚环烷基或亚芳基；
V和V'各自独立地为-(O-CH2-CH2)p-或-(CH2-CH2-O)p-；
p为0或1至10的整数；
W不存在，为其中s2'指示连接至V、RA或JCB的位点并且s3'指示连接至RB、V'、RC或JA的位点；
JCB为-C(＝O)-、 其中s1指示连接至细胞结合剂CB的位点并且s2指示连接至RA的位点；
Ra、Rb、Rc以及Re在每次出现时独立地为H或烷基；
JA为-C(＝O)-；并且其余变量如上文在第一实施方案或第1、第2、第3、第4或第5特定实施方案中所描述。
在一个更特定实施方案中，对于第6特定实施方案中的缀合物，RA为亚烷基、环烷基亚烷基或亚芳基；W不存在或为并且JCB为-C(＝O)-、
在一个更特定实施方案中，p为0并且RC不存在；并且其余变量如上文在第6特定实施方案中所描述。
在另一更特定实施方案中，JCB为-C(＝O)-或并且其余变量如上文在第6特定实施方案中所描述。
在第7实施方案中，对于式(I)的缀合物，L2由以下结构式表示：
其中：
Rx、Ry、Rx'以及Ry'在每次出现时独立地为H、-OH、卤素、-O-(C1-4烷基)、-SO3H、-NR40R41R42 +或任选由-OH、卤素、-SO3H或NR40R41R42 +取代的C1-4烷基，其中R40、R41以及R42各自独立地为H或C1-4烷基；
l和k各自独立地为1至10的整数；
s1指示连接至CBA的位点并且s3指示连接至基团A的位点；
并且其余变量如上文在第一实施方案或第1、第2、第3、第4或第5特定实施方案中所描述。
在一个更特定实施方案中，Rx、Ry、Rx'以及Ry'全部为H；并且其余变量如上文在第7特定实施方案中所描述。
在另一更特定实施方案中，l和k各自独立地为2至6的整数整数；并且其余变量如上文在第7特定实施方案中所描述。
在一个甚至更特定实施方案中，Rx、Ry、Rx'以及Ry'全部为H；l和k各自独立地为2至6的整数整数；并且其余变量如上文在第7特定实施方案中所描述。
在另一更特定实施方案中，L2由以下结构式表示：
其中：
Rx与Ry均为H；
l和l1各自独立地为1至10的整数；并且
k1为1至12的整数(例如2、4、6、8、10或12)。
在一个实施方案中，l和l1各自为2至6的整数；并且k1为2至6的整数(例如2、4或6)。
在第8特定实施方案中，对于式(I)的缀合物，A为可由蛋白酶裂解的肽；其余变量如上文在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6或第7特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，A为可由在肿瘤组织中表达的蛋白酶裂解的肽。
在第9特定实施方案中，对于式(I)的缀合物，A为具有选自由以下组成的组的与-NH-CR1R2-S-L1-D共价键联的氨基酸的肽：Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、硒代-Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr以及Val，所述氨基酸各自独立地呈L或D异构体形式；其余变量如上文在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6或第7特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，连接至-NH-CR1R2-S-L1-D的氨基酸为L氨基酸。
在第10特定实施方案中，对于式(I)的缀合物，A选自由以下组成的组：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、D-Val-Ala、Val-Cit、D-Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:1)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:2)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:3)、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、D-Ala-Pro以及D-Ala-tBu-Gly，其中每种肽中的第一个氨基酸连接至L2基团并且每种肽中的最后一个氨基酸连接至-NH-CR1R2-S-L1-D；并且其余变量如上文在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6或第7特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。在另一更特定实施方案中，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
在第11特定实施方案中，对于式(I)的缀合物，D为类美登素；并且其余变量如上文在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9或第10特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，D由下式表示：
在一个更特定实施方案中，D由下式表示：
在第12特定实施方案中，本发明的缀合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
为通过氨基(例如Lys氨基)连接至L2基团的细胞结合剂；
为通过硫醇基(例如Cys硫醇基)连接至L2基团的细胞结合剂；
R3和R4各自独立地为H或Me；
m1、m3、p1、n1、r1以及t1各自独立地为1至10的整数；
m2、n2、p2、r2以及t2各自独立地为1至19的整数；
t3为1至12的整数；
D1由下式表示：
并且
A如上文在第8、第9或第10特定实施方案中所描述。
在一个更特定实施方案中，m1、m3、p1、n1以及r1各自独立地为1至6的整数；并且m2、n2、p2以及r2各自独立地为1至7的整数。
在一个更特定实施方案中，D1由下式表示：
在一个更特定实施方案中，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly(更具体地说，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly)；并且其余变量如上文在第12特定实施方案中所描述。
在另一更特定实施方案中，m1、r1、n1、p1以及m3各自独立地为2至4的整数；并且m2、p2、n2以及r2各自独立地为3至5的整数。在一个更特定实施方案中，m1、m3、p1、n1、r1以及t1各自独立地为2至10的整数。在一个更特定实施方案中，m1、m3、p1、n1、r1以及t1各自独立地为3至6的整数。
在一个更特定实施方案中，m2、n2、p2、r2以及t2各自独立地为2至10的整数。在一个更特定实施方案中，m2、n2、p2、r2以及t2各自独立地为3至6的整数。在一个更特定实施方案中，m2、n2、p2、r2以及t2各自独立地为5。
在一个更特定实施方案中，m1、m3、p1、n1、r1以及t1各自独立地为2至10的整数，并且m2、n2、p2、r2以及t2各自独立地为2至10的整数。在一个更特定实施方案中，m1、m3、p1、n1、r1以及t1各自独立地为3至6的整数，并且m2、n2、p2、r2以及t2各自独立地为2至10的整数。在一个更特定实施方案中，m1、m3、p1、n1、r1以及t1各自独立地为3至6的整数，并且m2、n2、p2、r2以及t2各自独立地为3至6的整数。
在一个更特定实施方案中，r2和t2各自独立地为2至6的整数，r1和t1各自独立地为2至6的整数，并且t3为1至12的整数。在一个更特定实施方案中，r2和t2各自独立地为2至6的整数，r1和t1各自独立地为2至6的整数，并且t3为1至6的整数。在一个更特定实施方案中，r2和t2各自独立地为2至6的整数，r1和t1各自独立地为2至6的整数，并且t3为1至4的整数。在一个更特定实施方案中，r2和t2各自独立地为3至5的整数，r1和t1各自独立地为2至6的整数，并且t3为1至12的整数。在一个更特定实施方案中，r2和t2各自独立地为3至5的整数，r1和t1各自独立地为2至6的整数，并且t3为1至6的整数。在一个更特定实施方案中，r2和t2各自独立地为3至5的整数，r1和t1各自独立地为2至6的整数，并且t3为1至4的整数。
在一个更特定实施方案中，r2和r1各自独立地为2至6的整数。在一个更特定实施方案中，r2为3至5的整数，并且r1为2至6的整数。在一个更特定实施方案中，r2为3至5的整数，并且r1为2至4的整数。在一个更特定实施方案中，r2为4并且r1为2。在一个更特定实施方案中，r2为4并且r1为3。在一个更特定实施方案中，r2为4并且r1为4。在一个更特定实施方案中，r2为4并且r1为5。在一个更特定实施方案中，r2为4并且r1为6。
在另一更特定实施方案中，R3与R4均为Me。或者，R3与R4均为H。
在另一特定实施方案中，所述缀合物由下式表示：
其中：
r1和t1各自为2至10的整数；
r2和t2各自为2至19的整数；并且
t3为2至12的整数(例如t3为2、4、6、8、10或12)。
在一个更特定实施方案中，r1和t1各自为2至6的整数；r2和t2各自为2至5的整数；并且t3为2至6的整数(例如t3为2、4或6)。
在第13特定实施方案中，本发明的缀合物由下式表示：
/>
/>
/>
/>
/>
或其药学上可接受的盐，其中：
A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly(更具体地说，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly)，并且
D1由下式表示：
在一个更特定实施方案中，D1由下式表示：
还在第13特定实施方案中，本发明的缀合物由下式表示：
/>
/>
/>
/>
或其药学上可接受的盐，其中：
A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly(更具体地说，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly)，并且
D1由下式表示：
在一个更特定实施方案中，D1由下式表示：
在另一更特定实施方案中，所述缀合物由下式表示：
/>
其中：D1由下式表示：
在一些实施方案中，对于上文所描述的本发明的缀合物(例如在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12或第13特定实施方案中所描述的缀合物)，细胞结合剂(CBA)可为本文所描述的细胞结合剂(CBA)中的任一者。
在一些实施方案中，对于上文所描述的本发明的缀合物(例如在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12或第13特定实施方案中所描述的缀合物)，细胞结合剂(CBA)结合于选自以下的靶细胞：肿瘤细胞、病毒感染细胞、微生物感染细胞、寄生虫感染细胞、自体免疫细胞、活化细胞、骨髓细胞、活化T细胞、B细胞或黑素细胞；表达CA6、CAK1、CD4、CD6、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD123、CD138、CanAg、CALLA、CEACAM5、FGFR3、LAMP1、p-钙粘蛋白、CA6、TROP-2、DLL-3、CDH6、AXL、SLITRK6、ENPP3、BCMA、组织因子(TF)、CD352、Her-2或Her-3抗原的细胞；或表达胰岛素生长因子受体、表皮生长因子受体、结合素-4(Nectin-4)、间皮素、GD3、泌乳素受体以及叶酸受体的细胞。
在一些实施方案中，对于上文所描述的本发明的缀合物(例如在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12或第13特定实施方案中所描述的缀合物)，细胞结合剂为特异性结合于靶细胞的抗体或其抗原结合片段、单链抗体、单链抗体片段、特异性结合于靶细胞的单克隆抗体、单链单克隆抗体或单克隆抗体片段、特异性结合于靶细胞的嵌合抗体、嵌合抗体片段、特异性结合于靶细胞的结构域抗体、结构域抗体片段、前抗体(probody)、纳米抗体(nanobody)、淋巴因子、激素、维生素、生长因子、集落刺激因子、营养物运送分子、肽或喷他林(pentarin)。
在一些实施方案中，对于上文所描述的本发明的缀合物(例如在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12或第13特定实施方案中所描述的缀合物)，细胞结合剂为抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，细胞结合剂为表面整修抗体或其表面整修抗体片段。在一些实施方案中，细胞结合剂为单克隆抗体或其单克隆抗体片段。在一些实施方案中，细胞结合剂为人源化抗体或其人源化抗体片段。在其他实施方案中，细胞结合剂为嵌合抗体或其嵌合抗体片段。在一些实施方案中，细胞结合剂为抗叶酸受体抗体或其抗体片段、抗EGFR抗体或其抗体片段、抗CD33抗体或其抗体片段、抗CD19抗体或其抗体片段、抗Muc1抗体或其抗体片段或抗CD37抗体或其抗体片段。
在一个实施方案中，本发明的缀合物由下式表示：
其中Ab为抗叶酸受体抗体。
在另一实施方案中，本发明的缀合物由下式表示：
其中Ab为抗叶酸受体抗体。在一个特定实施方案中，抗叶酸受体抗体包含(a)包含GYFMN(SEQ ID NO:4)的重链CDR1、包含RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(SEQ ID NO:5)的重链CDR2以及包含YDGSRAMDY(SEQ ID NO:6)的重链CDR3；以及(b)包含KASQSVSFAGTSLMH(SEQID NO:7)的轻链CDR1、包含RASNLEA(SEQ ID NO:8)的轻链CDR2以及包含QQSREYPYT(SEQ IDNO:9)的轻链CDR3；其中Xaa1选自K、Q、H以及R；Xaa2选自Q、H、N以及R；并且Xaa3选自G、E、T、S、A以及V。优选地，重链CDR2序列包含RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQ ID NO:10)。在另一特定实施方案中，抗叶酸受体抗体包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链可变域，以及具有SEQID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变域。在另一特定实施方案中，抗叶酸受体抗体包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链，以及具有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链。优选地，抗体包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链(huFOLR1)。在另一特定实施方案中，抗叶酸受体抗体是由于2010年4月7日保藏在ATCC并且具有ATCC保藏号PTA-10772和PTA-10773或10774的质粒DNA编码。参见WO2011/106528，该专利以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，对于上文所描述的本发明的缀合物(例如在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12或第13特定实施方案中所描述的缀合物)，q为1至10、1至8或2至5的整数。在一些实施方案中，对于通过Cys硫醇基共价键联至细胞毒性剂的缀合物，q为1或2。在一个实施方案中，q为2。
在一些实施方案中，对于包含上文所描述的本发明的缀合物(例如在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12或第13特定实施方案中所描述的缀合物)的组合物(例如药物组合物)，每一细胞结合剂(CBA，例如抗体)的细胞毒性剂平均数目(即q的平均值)也称为组合物中的药物-抗体比率(DAR)，在1.0至8.0范围内。在一些实施方案中，DAR在1.0至5.0、1.0至4.0、1.0至3.4、1.0至3.0、1.5至2.5、2.0至2.5或1.8至2.2范围内。
本发明的化合物
在第二方面中，本发明提供本文所描述的类美登素衍生物。
在第二实施方案中，本发明的化合物由式(II)、(III)或(IV)表示：
L2′-A-NH-CR1R2-S-L1-D (II)，
A′-NH-CR1R2-S-L1-D (III)，或
L3-A-NH-CR1R2-S-L1-D (IV)
或其药学上可接受的盐，其中：
L2'不存在或为带有反应性部分的间隔基，所述反应性部分可与细胞结合剂形成共价键；
A为氨基酸残基或包含2至20个氨基酸残基的肽；
R1和R2各自独立地为H或C1-6烷基(例如R1和R2各自独立地为H或C1-3烷基)；
L1为间隔基；
D-L1-SH为细胞毒性剂；
q为1至20的整数；
A'为氨基酸或包含2至20个氨基酸的肽；
L3由下式表示：
Rx'和Ry'在每次出现时独立地为H、-OH、卤素、-O-(C1-4烷基)、-SO3H、-NR40R41R42 +或任选由-OH、卤素、SO3H或NR40R41R42 +取代的C1-4烷基，其中R40、R41以及R42各自独立地为H或C1-4烷基；并且
k为1至10的整数。
在一个实施方案中，L1为-L1'-C(＝O)-；并且L1'为亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚杂环烷基、亚芳基或亚杂芳基，其中L1中的-C(＝O)-基团连接至D。
在另一实施方案中，R1和R2中的至少一者为H。在一个更特定实施方案中，R1和R2中的一者为H并且另一者为Me。
在第14特定实施方案中，对于式(II)、(III)以及(IV)的化合物，R1和R2各自独立地为H或Me；并且其余变量如上文在第二实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，R1与R2均为H。
在第15特定实施方案中，对于式(II)、(III)以及(IV)的化合物，L1为-L1'-C(＝O)-；并且L1'为亚烷基或亚环烷基，其中L1中的-C(＝O)-基团连接至D；并且其余变量如上文在第二实施方案或第14特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，L1'为C1-10亚烷基。在另一更特定实施方案中，L1'为C1-20亚烷基。
在第16特定实施方案中，对于式(II)、(III)以及(IV)的化合物，L1为-CR3R4-(CH2)1-8-C(＝O)-；R3和R4各自独立地为H或Me；并且其余变量如上文在第二实施方案或第14特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，R3与R4均为Me。
在第17特定实施方案中，对于式(II)、(III)以及(IV)的化合物，L1为-CR3R4-(CH2)2-5-C(＝O)-或-CR3R4-(CH2)3-5-C(＝O)-；R3和R4各自独立地为H或Me；并且其余变量如上文在第二实施方案或第14特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，R3与R4均为Me。在另一更特定实施方案中，R3与R4均为H。
在第18特定实施方案中，对于式(II)、(III)以及(IV)的化合物，L1为-(CH2)4-6-C(＝O)-；并且其余变量如上文在第二实施方案或第14特定实施方案中所描述。
在第19特定实施方案中，对于式(II)、(III)以及(IV)的化合物，A或A'为可由蛋白酶裂解的肽；其余变量如上文在第二实施方案或第14、第15、第16、第17或第18特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，A或A'为可由在肿瘤组织中表达的蛋白酶裂解的肽。
在第20特定实施方案中，对于式(II)、(III)以及(IV)的化合物，A或A'为具有选自由以下组成的组的与-NH-CR1R2-S-L1-D共价键联的氨基酸的肽：Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、硒代-Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr以及Val，所述氨基酸各自独立地呈L或D异构体形式；其余变量如上文在第二实施方案或第14、第15、第16、第17或第18特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，连接至-NH-CR1R2-S-L1-D的氨基酸为L氨基酸。
在第21特定实施方案中，对于式(II)、(III)以及(IV)的化合物，A或A'选自由以下组成的组：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、D-Val-Ala、Val-Cit、D-Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:1)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:2)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQID NO:3)、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、D-Ala-Pro以及D-Ala-tBu-Gly，其中每种肽中的第一个氨基酸连接至L2基团并且每种肽中的最后一个氨基酸连接至-NH-CR1R2-S-L1-D；并且其余变量如上文在第二实施方案或第14、第15、第16、第17或第18特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。在另一更特定实施方案中，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
对于本文所描述的A，当提到特定氨基酸或肽序列时，它意指如下氨基酸残基或包含氨基酸残基的肽，其中氢原子从连接至L2基团的氨基酸的氨基末端移除，并且羟基从连接至-NH-CR1R2-S-L1-D的氨基酸的羧基末端移除。举例来说，当A由Ala-Ala-Ala表示时，它指-NH-CH(CH3)-C(＝O)-NH-CH(CH3)-C(＝O)-NH-CH(CH3)-C(＝O)-。
对于本文所描述的A'，当提到特定氨基酸或肽序列时，它意指如下的氨基酸残基或包含氨基酸残基的肽，其中羟基从连接至-NH-CR1R2-S-L1-D的氨基酸的羧基末端移除。举例来说，当A'由Ala-Ala-Ala表示时，它指NH2-CH(CH3)-C(＝O)-NH-CH(CH3)-C(＝O)-NH-CH(CH3)-C(＝O)-。
在第22特定实施方案中，对于式(II)、(III)以及(IV)的化合物，D为类美登素；并且其余变量如上文在第二实施方案或第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20或第21特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，D由下式表示：
在另一更特定实施方案中，D由下式表示：
在第23特定实施方案中，对于式(II)的化合物，L2'由以下结构式表示：
JCB′-RA-V-W-RB-V′-RC-JA-；
其中：
RA为亚烷基、环烷基亚烷基、亚芳基、亚杂芳基或亚杂环基；
RB和RC各自独立地不存在，为亚烷基、亚环烷基或亚芳基；
V和V'各自独立地为-(O-CH2-CH2)p-或-(CH2-CH2-O)p-；
p为0或1至10的整数；
W不存在，为其中s2'指示连接至V、RA或JCB的位点并且s3'指示连接至RB、V'、RC或JA的位点；
JCB'为-C(＝O)OH、-COE、X1-CRbRc-C(＝O)-、X1-CRbRc-C(＝O)-NRe-、/>
Ra、Rb、Rc以及Re在每次出现时独立地为H或烷基；
X1为卤素(例如-Cl、-Br或-I)；
COE为反应性酯；
JA为-C(＝O)-；并且其余变量如上文在第二实施方案或第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21或第22特定实施方案中所描述。
在一个更特定实施方案中，对于第23特定实施方案中的化合物，RA为亚烷基、环烷基亚烷基或亚芳基；W不存在或为并且JCB'为-C(＝O)OH、-COE、并且其余变量如上文在第23特定实施方案中所描述。
在一个更特定实施方案中，p为0并且Rc不存在；并且其余变量如上文在第23特定实施方案中所描述。
在另一更特定实施方案中，JCB'为-C(＝O)OH、-COE或并且其余变量如上文在第23特定实施方案中所描述。
在第24实施方案中，对于式(II)的化合物，L2'由以下结构式表示：
其中：
Rx、Ry、Rx'以及Ry'在每次出现时独立地为H、-OH、卤素、-O-(C1-4烷基)、-SO3H、-NR40R41R42 +或任选由-OH、卤素、-SO3H或NR40R41R42 +取代的C1-4烷基，其中R40、R41以及R42各自独立地为H或C1-4烷基；
l和k各自独立地为1至10的整数；
JCB'为-C(＝O)OH或-COE；
并且其余变量如上文在第二实施方案或第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22或第23特定实施方案中所描述。
在一个更特定实施方案中，Rx、Ry、Rx'以及Ry'全部为H；并且其余变量如上文在第24特定实施方案中所描述。
在另一更特定实施方案中，l和k各自独立地为2至6的整数整数；并且其余变量如上文在第24特定实施方案中所描述。
在一个甚至更特定实施方案中，Rx、Ry、Rx'以及Ry'全部为H；l和k各自独立地为2至6的整数；并且其余变量如上文在第24特定实施方案中所描述。
在另一更特定实施方案中，L2'由以下结构式表示：
其中：
Rx与Ry均为H；
l和l1各自为1至10的整数；并且
k1为1至12的整数。
在一个甚至更特定实施方案中，l和l1各自为2至6的整数。
在第25特定实施方案中，对于式(IV)化合物，Rx'与Ry'均为H；并且其余变量如上文在第二实施方案或第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21或第22特定实施方案中所描述。
在一个更特定实施方案中，k为2至6的整数；其余变量如上文在第25特定实施方案中所描述。
在另一更特定实施方案中，k为3；其余变量如上文在第25特定实施方案中所描述。
在第26特定实施方案中，式(II)化合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R3和R4各自独立地为H或Me；
m1、m3、n1、r1、p1以及t1各自独立地为1至10的整数；
m2、n2、r2、p2以及t2各自独立地为1至19的整数；
t3为1至12的整数；
JCB'为-C(＝O)OH或-COE；
D1由下式表示：
并且
其余变量如在第二实施方案或第19、第20或第21特定实施方案中所描述。
在一个更特定实施方案中，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。在另一更特定实施方案中，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
在一个更特定实施方案中，m1、m3、p1、n1以及r1各自独立地为1至6的整数；并且m2、n2、p2以及r2各自独立地为1至7的整数。
在另一更特定实施方案中，m1、p1、r1、n1以及m3各自独立地为2至4的整数；并且m2、p2、n2以及r2各自独立地为3至5的整数。在一个更特定实施方案中，m1、m3、p1、n1、r1以及t1各自独立地为2至10的整数。在一个更特定实施方案中，m1、m3、p1、n1、r1以及t1各自独立地为3至6的整数。
在一个更特定实施方案中，m2、n2、p2、r2以及t2各自独立地为2至10的整数。在一个更特定实施方案中，m2、n2、p2、r2以及t2各自独立地为3至6的整数。在一个更特定实施方案中，m2、n2、p2、r2以及t2各自独立地为5。
在一个更特定实施方案中，m1、m3、p1、n1、r1以及t1各自独立地为2至10的整数，并且m2、n2、p2、r2以及t2各自独立地为2至10的整数。在一个更特定实施方案中，m1、m3、p1、n1、r1以及t1各自独立地为3至6的整数，并且m2、n2、p2、r2以及t2各自独立地为2至10的整数。在一个更特定实施方案中，m1、m3、p1、n1、r1以及t1各自独立地为3至6的整数，并且m2、n2、p2、r2以及t2各自独立地为3至6的整数。
在一个更特定实施方案中，r2和t2各自独立地为2至6的整数，r1和t1各自独立地为2至6的整数，并且t3为1至12的整数。在一个更特定实施方案中，r2和t2各自独立地为2至6的整数，r1和t1各自独立地为2至6的整数，并且t3为1至6的整数。在一个更特定实施方案中，r2和t2各自独立地为2至6的整数，r1和t1各自独立地为2至6的整数，并且t3为1至4的整数。在一个更特定实施方案中，r2和t2各自独立地为3至5的整数，r1和t1各自独立地为2至6的整数，并且t3为1至12的整数。在一个更特定实施方案中，r2和t2各自独立地为3至5的整数，r1和t1各自独立地为2至6的整数，并且t3为1至6的整数。在一个更特定实施方案中，r2和t2各自独立地为3至5的整数，r1和t1各自独立地为2至6的整数，并且t3为1至4的整数。
在一个更特定实施方案中，r2和r1各自独立地为2至6的整数。在一个更特定实施方案中，r2为3至5的整数，并且r1为2至6的整数。在一个更特定实施方案中，r2为3至5的整数，并且r1为2至4的整数。在一个更特定实施方案中，r2为4并且r1为2。在一个更特定实施方案中，r2为4并且r1为3。在一个更特定实施方案中，r2为4并且r1为4。在一个更特定实施方案中，r2为4并且r1为5。在一个更特定实施方案中，r2为4并且r1为6。
在另一更特定实施方案中，R3与R4均为Me。或者，R3与R4均为H。
在另一更特定实施方案中，所述化合物由下式表示：
其中：
r1和t1各自为2至10的整数；
r2和t2各自为2至19的整数；并且
t3为2至12的整数(例如t3为2、4、6、8、10或12)。
在一个更特定实施方案中，r1和t1各自为2至6的整数；r2和t2各自为2至5的整数；并且t3为2至6的整数(例如t3为2、4或6)。
在第27特定实施方案中，式(II)化合物由下式表示：
/>
/>
/>
或其药学上可接受的盐，其中：
A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly(更具体地说，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly)，
JCB'为-C(＝O)OH或-COE；并且
D1由下式表示：
在一个甚至更特定实施方案中，D1由下式表示：
还在第27特定实施方案中，式(II)化合物由下式表示：
/>
/>
/>
或其药学上可接受的盐，其中：
A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly(更具体地说，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly)，
JCB'为-C(＝O)OH或-COE；并且
D1由下式表示：
在一个甚至更特定实施方案中，D1由下式表示：
在另一更特定实施方案中，所述化合物由下式表示：
其中D1由下式表示：
在一些实施方案中，-COE为选自以下的反应性酯：N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、硝基苯基(例如2-或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如2,4-二硝基苯基)酯、磺基-四氟苯基(例如4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯以及五氟苯基酯。更具体地说，-COE为N-羟基琥珀酰亚胺酯或N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯。
在第28特定实施方案中，式(III)化合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R3和R4各自独立地为H或Me；
m2为1至19的整数；并且
D1由下式表示：
并且
其余变量如第二实施方案或第19、第20或第21特定实施方案中所描述。
在一个更特定实施方案中，D1由下式表示：
在一个更特定实施方案中，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。在一个甚至更特定实施方案中，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
在一个更特定实施方案中，m2为2至10的整数。在另一更特定实施方案中，m2为1至7的整数。在另一更特定实施方案中，m2为2至6的整数。在另一更特定实施方案中，m2为2至5的整数。在另一更特定实施方案中，m2为4。
在另一更特定实施方案中，R3与R4均为Me。或者，R3与R4均为H。
在第29特定实施方案中，式(III)化合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
A'为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly(更具体地说，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly)，
D1由下式表示：
在一个更特定实施方案中，D1由下式表示：
/>
还在第29特定实施方案中，式(III)化合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
A'为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly(更具体地说，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly)，
D1由下式表示：
在一个更特定实施方案中，D1由下式表示：
在第30特定实施方案中，式(IV)化合物由下式表示：
/>
或其药学上可接受的盐，其中：
R3和R4各自独立地为H或Me；
m3为1至10的整数；
m2为1至19的整数；
D1由下式表示：
并且
其余变量如第二实施方案或第19、第20或第21特定实施方案中所描述。在一个更特定实施方案中，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。在另一更特定实施方案中，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
在一个更特定实施方案中，m3为1至6的整数，并且m2为1至7的整数。在另一更特定实施方案中，m3为2至4的整数；并且m2为3至5的整数。在一个更特定实施方案中，m3为2至10的整数，并且m2为2至10的整数。在一个更特定实施方案中，m3为3至6的整数，并且m2为2至10的整数。在一个更特定实施方案中，m3为3至6的整数，并且m2为3至6的整数。
在另一更特定实施方案中，R3与R4均为Me。或者，R3与R4均为H。
在第31特定实施方案中，式(IV)化合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly(更具体地说，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly)并且
D1由下式表示：
在一个更特定实施方案中，D1由下式表示：
还在第31特定实施方案中，式(IV)化合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly(更具体地说，A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly)并且
D1由下式表示：
在一个更特定实施方案中，D1由下式表示：
代谢产物
在某些实施方案中，本发明的缀合物可经由在由变量A表示的肽部分处的键裂解继之以-NH-CR1R2-S-部分的自分解以释放具有硫醇基的游离细胞毒性剂来释放游离细胞毒性剂(例如类美登素)，所述细胞毒性剂可进一步被甲基化。
因此，在第三实施方案中，本发明是有关一种式(V)化合物：
D-L1-SZ0 (V)，
其中：
L1为间隔基；
Z0为H或Me，前提条件为当Z0为H时，L1不为-C(＝O)-(CH2)q-或-C(＝O)-CH2-CH2-C(CH3)2-，其中q为1至3的整数；并且当Z0为Me时，L1不为-C(＝O)-(CH2)2-或-C(＝O)-CH2-CH2-C(CH3)2-；并且D-L1-SH为细胞毒性剂。
在第32特定实施方案中，L1为-L1'-C(＝O)-；并且L1'为亚烷基或亚环烷基。更具体地说，L1'为C1-10亚烷基。在另一更特定实施方案中，L1'为C1-20亚烷基
在第33特定实施方案中，L1为-CR3R4-(CH2)1-8-C(＝O)-；并且R3和R4各自独立地为H或Me。
在第34特定实施方案中，L1为-CR3R4-(CH2)2-5-C(＝O)-或-CR3R4-(CH2)3-5-C(＝O)-。在一个更特定实施方案中，R3与R4均为Me。在另一更特定实施方案中，R3与R4均为H。
在第35特定实施方案中，L1为-(CH2)2-10-C(＝O)-。在一个更特定实施方案中，L1为-(CH2)4-6-C(＝O)-。在另一更特定实施方案中，L1为-(CH2)5-C(＝O)-。在另一更特定实施方案中，L1为-(CH2)6-C(＝O)-。在另一更特定实施方案中，L1为-(CH2)7-C(＝O)-。在另一更特定实施方案中，L1为-(CH2)8-C(＝O)-。在另一更特定实施方案中，L1为-(CH2)10-C(＝O)-。在另一更特定实施方案中，L1为-(CH2)15-C(＝O)-。
在第36特定实施方案中，对于(V)化合物，D由下式表示：
其中其余变量的定义如第二实施方案或第32、第33、第34或第35特定实施方案中所描述。
更具体地说，D由下式表示：
在第37特定实施方案中，式(V)化合物由下式表示：
细胞结合剂
本发明的缀合物作为治疗剂的有效性取决于适当细胞结合剂的谨慎选择。细胞结合剂可属于目前已知或变得已知的任何种类，包括肽和非肽。通常，这些细胞结合剂可为抗体(诸如多克隆抗体和单克隆抗体，尤其单克隆抗体)、淋巴因子、激素、生长因子、维生素(诸如叶酸等，其可结合于其细胞表面受体，例如叶酸受体)、营养物运送分子(诸如转铁蛋白)或任何其他细胞结合分子或物质。
适当细胞结合剂的选择为部分取决于所要靶向的特定细胞群体的选择问题，但在许多(但并非所有)情况下，如果适当的人单克隆抗体为可获得的，那么人单克隆抗体为良好选择。举例来说，单克隆抗体MY9为鼠IgG1抗体，所述鼠IgG1抗体特异性结合于CD33抗原(J.D.Griffin等,Leukemia Res.,8:521(1984))，并且如果如在急性骨髓性白血病(AML)中一般靶细胞表达CD33，那么可使用。
在某些实施方案中，细胞结合剂不为蛋白质。举例来说，在某些实施方案中，细胞结合剂可为结合于维生素受体(诸如细胞表面受体)的维生素。在此方面，维生素A结合于视黄醇结合蛋白(RBP)以形成复合物，所述复合物又以高亲和力结合STRA6受体并且增加维生素A摄入。在另一实例中，叶酸/叶酸盐/维生素B9以高亲和力结合细胞表面叶酸受体(FR)，例如FRα。叶酸或结合于FRα的抗体可用于靶向表达于卵巢和其他肿瘤上的叶酸受体。此外，维生素D和其类似物结合于维生素D受体。
在其他实施方案中，细胞结合剂为蛋白质或多肽或包含蛋白质或多肽的化合物，包括抗体、非抗体蛋白质或多肽。优选地，蛋白质或多肽包含一个或多个具有侧链-NH2基团的Lys残基。Lys侧链-NH2基团可共价键联至双官能交联剂，所述双官能交联剂又键联至本发明的二聚体化合物，由此使细胞结合剂缀合至本发明的二聚体化合物。每种基于蛋白质的细胞结合剂可含有可用于通过双官能交联剂键联本发明化合物的多个Lys侧链-NH2基团。
在一些实施方案中，可使用结合于骨髓细胞的GM-CSF(一种配体/生长因子)作为来自急性骨髓性白血病的患病细胞的细胞结合剂。可使用结合于活化T细胞的IL-2来预防移植排斥、治疗和预防移植物抗宿主疾病以及治疗急性T细胞白血病。可使用结合于黑素细胞的MSH来治疗黑素瘤，还可使用针对黑素瘤的抗体。可使用表皮生长因子来靶向鳞状癌症，诸如肺癌和头颈癌以及牙龈鳞状细胞癌。可使用体抑素来靶向成神经细胞瘤和其他肿瘤类型。可使用雌激素(或雌激素类似物)来靶向乳腺癌。可使用雄激素(或雄激素类似物)来靶向睾丸。
在某些实施方案中，细胞结合剂可为淋巴因子、激素、生长因子、集落刺激因子或营养物运送分子。
在某些实施方案中，细胞结合剂为抗体模拟物，诸如锚蛋白重复蛋白、生替素(Centyrin)或阿德奈汀(adnectin)/单体(monobody)。
在其他实施方案中，细胞结合剂为特异性结合于靶细胞的抗体、单链抗体、抗体片段、特异性结合于靶细胞的单克隆抗体、单链单克隆抗体、单克隆抗体片段(或“抗原结合部分”)、特异性结合于靶细胞的嵌合抗体、嵌合抗体片段(或“抗原结合部分”)、特异性结合于靶细胞的结构域抗体(例如sdAb)或结构域抗体片段。
在某些实施方案中，细胞结合剂为人源化抗体、人源化单链抗体或人源化抗体片段(或“抗原结合部分”)。在一个特定实施方案中，人源化抗体为huMy9-6或另一相关抗体，所述huMy9-6或另一相关抗体描述于美国专利号7,342,110和7,557,189中。在另一特定实施方案中，人源化抗体为WO2011/106528以及美国专利号8557966、9133275、9598490、9657100、9670278、9670279和9670280中所描述的抗叶酸受体抗体。所有这些申请的教示内容以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施方案中，细胞结合剂为表面整修抗体、表面整修单链抗体、表面整修抗体片段(或“抗原结合部分”)或双特异性抗体。
在某些实施方案中，细胞结合剂为微型抗体、avibody、双功能抗体、三抗体、四功能抗体、纳米抗体、前抗体、结构域抗体或单抗体(unibody)。
换言之，示例性细胞结合剂可包括特异性结合于靶细胞的抗体、单链抗体、抗体片段、特异性结合于靶细胞的单克隆抗体、单链单克隆抗体、单克隆抗体片段、特异性结合于靶细胞的嵌合抗体、嵌合抗体片段、双特异性抗体、特异性结合于靶细胞的结构域抗体、结构域抗体片段、干扰素(例如α、β、γ)、淋巴因子(例如IL-2、IL-3、IL-4以及IL-6)、激素(例如胰岛素、促甲状腺素释放激素(TRH)、促黑素细胞激素(MSH)以及类固醇激素(例如雄激素和雌激素))、维生素(例如叶酸)、生长因子(例如EGF、TGF-α、FGF、VEGF)、集落刺激因子、营养物运送分子(例如转铁蛋白；参见O'Keefe等(1985)J.Biol.Chem.260:932-937，该文献以引用的方式并入本文中)、生替素(基于III型纤连蛋白(FN3)重复的共同序列的蛋白质骨架；参见美国专利公布2010/0255056、2010/0216708以及2011/0274623，这些专利公布以引用的方式并入本文中)、锚蛋白重复蛋白(例如设计的锚蛋白重复蛋白，称为DARPin；参见美国专利公布号2004/0132028、2009/0082274、2011/0118146以及2011/0224100，该等专利公布以引用的方式并入本文中，并且还参见C.Zahnd等,Cancer Res.(2010)70:1595-1605；Zahnd等,J.Biol.Chem.(2006)281(46):35167-35175；以及Binz,H.K.,Amstutz,P.以及Pluckthun,A.,Nature Biotechnology(2005)23:1257-1268，这些文献以引用的方式并入本文中)、锚蛋白样重复蛋白或合成肽(参见例如美国专利公布号2007/0238667；美国专利号7,101,675；WO 2007/147213；以及WO 2007/062466，这些专利以引用的方式并入本文中)、阿德奈汀(一种纤连蛋白结构域骨架蛋白；参见美国专利公布号2007/0082365；2008/0139791，这些专利公布以引用的方式并入本文中)、Avibody(包括双功能抗体、三功能抗体以及四功能抗体；参见美国公布号2008/0152586和2012/0171115)、双重受体重靶向(DART)分子(P.A.Moore等,Blood,2011；117(17):4542-4551；Veri MC等,Arthritis Rheum,2010年3月30日；62(7):1933-43；Johnson S等,J.Mol.Biol.,2010年4月9日；399(3):436-49)、细胞穿透超荷蛋白(Methods in Enzymol.502,293-319(2012)以及其他细胞结合分子或物质。
在某些实施方案中，细胞结合剂可为配体，所述配体结合于靶细胞上的部分，诸如细胞表面受体。举例来说，配体可为生长因子或其结合于生长因子受体的片段；或可为细胞因子或其结合于细胞因子受体的片段。在某些实施方案中，生长因子受体或细胞因子受体为细胞表面受体。
在细胞结合剂为抗体或其抗原结合部分(包括抗体衍生物)或某些抗体模拟物的某些实施方案中，CBA可结合于靶细胞上的配体，诸如细胞表面配体，包括细胞表面受体。
特异性示例性抗原或配体可包括肾素；生长激素(例如人生长激素和牛生长激素)；生长激素释放因子；副甲状腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子(例如因子vmc、因子IX、组织因子以及冯威里氏因子(von Willebrands factor))；抗凝血因子(例如蛋白质C)；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原活化剂(例如尿激酶、人尿液或组织型纤溶酶原活化剂)；铃蟾素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；RANTES(即活化调节的正常T细胞表达和分泌的因子(regulated onactivation normally T-cell expressed and secreted))；人巨噬细胞炎性蛋白-1-α；血清白蛋白(人血清白蛋白)；穆勒氏抑制物质(Muellerian-inhibiting substance)；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白(β-内酰胺酶)；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(例如CTLA-4)；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；激素或生长因子受体；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子(例如骨胳源性神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4、神经营养素-5或神经营养素-6)、神经生长因子(例如NGF-β)；血小板源性生长因子；成纤维细胞生长因子(例如aFGF和bFGF)；成纤维细胞生长因子受体2；表皮生长因子；转化生长因子(例如TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4以及TGF-β5)；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)；胰岛素样生长因子结合蛋白；黑素转铁蛋白；CA6、CAK1、CALLA、CAECAM5、GD3；FLT3；PSMA；PSCA；MUC1；STEAP；CEA；TENB2；EphA受体、EphB受体；叶酸受体；FOLR1；间皮素；畸胎瘤衍生生长因子；αvβ6；整合素；VEGF；VEGFR；EGFR；FGFR3；LAMP1、p-钙粘蛋白、转铁蛋白受体；IRTA1；IRTA2；IRTA3；IRTA4；IRTA5；CD蛋白(例如CD2、CD3、CD4、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD123、CD134、CD137、CD138以及CD152)、一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体(参见美国公布号2008/0171040或美国公布号2008/0305044，这些公布以全文引用的方式并入本文中)；红血球生成素；骨生成诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白；干扰素(例如干扰素-α、干扰素-β以及干扰素-γ)；集落刺激因子(例如M-CSF、GM-CSF以及G-CSF)；白介素(例如IL-1至IL-10)；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原(例如HIV包膜的一部分)；转运蛋白、归巢受体；地址素；调控蛋白；整合素(例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4以及VCAM)；肿瘤相关抗原(例如HER2、HER3以及HER4受体)；内皮素；c-Met；c-kit；1GF1R；PSGR；NGEP；PSMA；PSCA；TMEFF2；LGR5；B7H4；TROP-2、DLL-3、CDH6、AXL、SLITRK6、ENPP3、BCMA、组织因子、CD352以及以上列举的多肽中的任一者的片段。
如本文所用，术语“抗体”包括免疫球蛋白(Ig)分子。在某些实施方案中，抗体为全长抗体，所述全长抗体包含四条多肽链，即通过二硫键相互连接的两条重链(HC)和两条轻链(LC)。每个重链包含重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2以及CH3。每个轻链包含轻链可变区(LCVR或VL)和轻链恒定区，轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可进一步再分成具有高变异性的区，称为互补决定区(CDR)。此类区中散布有较保守的构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列∶FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4。
在某些实施方案中，抗体为IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。在某些实施方案中，抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgA1或IgA2。
在某些实施方案中，细胞结合剂为单克隆抗体的“抗原结合部分”，所述抗原结合部分与抗体(诸如美国专利号7,342,110和7,557,189中所描述的huMy9-6或其相关抗体；美国专利号8557966、9133275、9598490、9657100、9670278、9670279和9670280以及WO2011106528中所描述的huMov19或其相关抗体，所述专利全部以引用的方式并入本文中)共同拥有对抗原结合来说重要的序列。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或有时可互换地称为“抗体片段”)包括抗体的保留特异性结合于抗原的能力的一个或多个片段。已证实抗体的抗原结合功能可由全长抗体的某些片段来执行。术语抗体的“抗原结合部分”内所涵盖的结合片段的实例包括(但不限于)：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL以及CH1结构域组成的单价片段(例如由木瓜蛋白酶消化的抗体产生三个片段：两个抗原结合Fab片段和一个不结合抗原的Fc片段)；(ii)F(ab')2片段，一种包含在铰链区由二硫键键联的两个Fab片段的二价片段(例如由胃蛋白酶消化的抗体产生两个片段：二价抗原结合F(ab')2片段和不结合抗原的pFc'片段)和其相关F(ab')单价单元；(iii)Fd片段，所述片段由VH和CH1结构域组成(即包括于Fab中的重链部分)；(iv)Fv片段，所述片段由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成，以及相关二硫键联Fv；(v)dAb(结构域抗体)或sdAb(单域抗体)片段(Ward等,Nature341:544-546,1989)，所述片段由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。在某些实施方案中，抗原结合部分为sdAb(单域抗体)。
在某些实施方案中，抗原结合部分还包括某些工程化或重组衍生物(或“衍生抗体”)，所述工程化或重组衍生物除了可能不存在于天然存在的抗体中的元素或序列之外还包括抗体的保留特异性结合于抗原的能力的一个或多个片段。
举例来说，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但它们可使用标准重组方法通过合成接头连接，所述合成接头使它们能够成为VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等Science 242:423-426,1988；以及Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。
在本文所描述的所有实施方案中，scFv的N-末端可为VH结构域(即N-VH-VL-C)，或VL结构域(即N-VL-VH-C)。
可通过键联两个scFv来工程化得到二价(或双价)单链可变片段(di-scFv、bi-scFv)。此举产生具有两个VH区和两个VL区的单一肽链，从而产生串联scFv(tascFv)。可类似地通过以头尾相接方式键联三个或更多个scFv产生更高程度的串联重复序列，诸如tri-scFv。
在某些实施方案中，可通过接头肽使scFv键联，所述接头肽对于两个可变区折叠在一起来说太短(约五个氨基酸)，从而迫使scFv二聚化，并且形成双功能抗体(参见例如Holliger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448,1993；Poljak等,Structure 2:1121-1123,1994)。双功能抗体可为双特异性或单特异性的。已显示双功能抗体具有比对应scFv低高达40倍的解离常数，即对靶标具有高得多的亲和力。
再更短的接头(一个或两个氨基酸)使得形成三聚体，或所谓的三功能抗体或三抗体。还已类似地产生四功能抗体。四功能抗体对其靶标展现甚至比双功能抗体更高的亲和力。双功能抗体、三功能抗体以及四功能抗体有时统称为“AVIBODYTM”细胞结合剂(或简称为“AVIBODY”)。换言之，具有两个、三个或四个靶标结合区(TBR)的AVIBODY通常称为双功能抗体、三功能抗体以及四功能抗体。关于细节参见例如美国公布号2008/0152586和2012/0171115，所述公布的全部教示以引用的方式并入本文中。
所有这些形式可由对两个或更多个不同抗原具有特异性的可变片段构成，在此情况下所述形式为双特异性或多特异性抗体类型。举例来说，某些双特异性串联di-scFv称为双特异性T细胞衔接器(BiTE)。
在某些实施方案中，串联scFv或双功能抗体/三功能抗体/四功能抗体中的每个scFv可具有相同或不同的结合特异性，并且各自可独立地具有N端VH或N端VL。
单链Fv(scFv)还可融合至Fc部分，诸如人IgG Fc部分以获得IgG样特性，然而它们仍由单一基因编码。因为在哺乳动物中瞬时制备此类scFv-Fc蛋白可轻易实现毫克量，所以此衍生抗体形式特别适合用于许多研究应用。
Fcab为从抗体的Fc恒定区工程化的抗体片段。Fcab可表达为可溶性蛋白，或它们可被工程化回全长抗体，诸如IgG，以形成mAb2。mAb2为具有代替正常Fc区的Fcab的全长抗体。使用这些额外结合位点，mAb2双特异性单克隆抗体可同时结合两个不同靶标。
在某些实施方案中，工程化的抗体衍生物具有尺寸减小的抗原结合性Ig衍生重组蛋白(“微型化”全尺寸mAb)，所述尺寸减小的抗原结合性Ig衍生重组蛋白是通过移除被认为对功能来说不必要的结构域而产生。最佳实例之一为SMIP。
小模块化免疫药物或SMIP为主要由抗体(免疫球蛋白)的部分构建的人造蛋白质，并且意在用作药物。SMIP具有与抗体类似的生物半衰期，但比抗体更小并且因此可具有更优选的组织穿透特性。SMIP为单链蛋白质，所述单链蛋白质包含一个结合区、一个作为连接物的铰链区以及一个效应子结构域。结合区包含修饰的单链可变片段(scFv)，并且蛋白质的其余部分可由抗体(诸如IgG1)的Fc(诸如CH2和CH3作为效应子结构域)以及铰链区构建。基因修饰的细胞产生呈抗体样二聚体形式的SMIP，所述SMIP比真正的抗体小约30％。
此类工程化微型化抗体的另一实例为“单抗体”，其中铰链区已从IgG4分子移除。IgG4分子为不稳定的并且可使轻-重链异二聚体彼此转换。铰链区的缺失完全阻止重链-重链配对，留下高度特异性的单价轻/重异二聚体，同时保留Fc区以确保在体内的稳定性和半衰期。
单域抗体(sdAb，包括但不限于那些由Ablynx称为纳米抗体的单域抗体)为由单一单聚可变抗体结构域组成的抗体片段。如整个抗体一般，它能够选择性结合于特定抗原，但小得多，因为其分子量仅为12-15kDa。在某些实施方案中，单域抗体是从重链抗体(hcIgG)工程化的。第一种此类sdAb是基于存在于骆驼中的称为VHH片段的hcIgG而工程化的。在某些实施方案中，使用VNAR片段从IgNAR(“免疫球蛋白新抗原受体”，参见下文)工程化出单域抗体。软骨鱼类(诸如鲨鱼)具有此类重链IgNAR抗体。在某些实施方案中，通过将来自普通免疫球蛋白G(IgG)(诸如来自人或小鼠的那些免疫球蛋白)的二聚体可变域分割成单体来工程化出sdAb。在某些实施方案中，从重链可变域衍生出纳米抗体。在某些实施方案中，从轻链可变域衍生出纳米抗体。在某些实施方案中，通过针对靶抗原结合剂对单域重链序列(例如人单域HC)的文库进行筛选来获得sdAb。
单一可变新抗原受体结构域抗体片段(VNAR或VNAR结构域)是源自于软骨鱼类(例如鲨鱼)免疫球蛋白新抗原受体抗体(IgNAR)。作为最小的已知基于免疫球蛋白的蛋白质骨架之一，此类单域蛋白质展示有利的尺寸和隐藏的表位识别特性。成熟IgNAR抗体由一个可变新抗原受体(VNAR)结构域和五个恒定新抗原受体(CNAR)结构域的均二聚体组成。此分子为高度稳定的，并且具有高效的结合特征。其固有稳定性可能是归因于以下两者：(i)基础Ig骨架，所述基础Ig骨架与存在于鼠抗体中的常规抗体VH和VL结构域相比呈现大量带电荷并且亲水的表面暴露残基；以及(ii)包括环间二硫桥的互补决定区(CDR)环中的稳定结构特征以及环内氢键的模式。
微型抗体为包含scFv的工程化抗体片段，所述scFv键联至CH结构域，诸如CH3γ1(IgG1的CH3结构域)或CH4ε(IgE的CH4结构域)。举例来说，已使对癌胚抗原(CEA)具特异性的scFv键联至CH3γ1以形成微型抗体，所述微型抗体先前已被证实具有优良肿瘤靶向，并且在体内快速清除(Hu等,Cancer Res.56:3055-3061,1996)。scFv可具有N端VH或VL。所述键联可为短肽(例如二氨基酸接头，诸如ValGlu)，所述短肽产生非共价、无铰链微型抗体。或者，所述键联可为IgG1铰链和GlySer接头肽，所述IgG1铰链和GlySer接头肽产生共价、铰链-微型抗体。
天然抗体为单特异性的，但为二价的，因为它们表达两个相同抗原结合域。相比之下，在某些实施方案中，某些工程化抗体衍生物为双特异性或多特异性分子，具有两个或更多个不同抗原结合域，所述两个或更多个不同抗原结合域各自具有不同的靶标特异性。双特异性抗体可通过融合各自具有不同特异性的两个产生抗体的细胞来产生。这些“四体瘤”产生多个分子种类，因为两个不同轻链和两个不同重链在四体瘤中以多种构型自由重组。从那时起，已使用多种技术(参见上文)产生了双特异性Fab、scFv以及全尺寸mAb。
双重可变域免疫球蛋白(DVD-Ig)蛋白质为一类双重特异性IgG，所述双重特异性IgG同时靶向两个抗原/表位(DiGiammarino等,Methods Mol.Biol.,899:145-56,2012)。所述分子含有呈类似于常规IgG的构型的Fc区和恒定区。然而，DVD-Ig蛋白质为独特的，因为分子的每个臂含有两个可变域(VD)。臂内的VD为串联连接的并且可具有不同结合特异性。
还可通过例如表达具有两个不同Fab和Fc的双特异性抗体来产生三特异性抗体衍生分子。一个实例为小鼠IgG2a抗Ep-CAM、大鼠IgG2b抗CD3四体瘤，称为BiUII，BiUII被认为容许表达Ep-CAM的肿瘤细胞、表达CD3的T细胞以及表达FcγRI的巨噬细胞共定位，因此加强免疫细胞的共刺激和抗肿瘤功能。
前抗体为完全重组、掩蔽的单克隆抗体，所述单克隆抗体在健康组织中保持惰性，但特定地在疾病微环境中为活化的(例如通过由在疾病微环境中富集或具特异性的蛋白酶进行蛋白酶裂解)。参见Desnoyers等,Sci.Transl.Med.,5:207,144,2013。类似掩蔽技术可用于本文所描述的抗体或其抗原结合部分中的任一者。
内抗体为已被修饰用于细胞内定位、在细胞内工作以结合于细胞内抗原的抗体。内抗体可保留在细胞质中，或可具有核定位信号，或可具有KDEL序列用于ER靶向。内抗体可为单链抗体(scFv)、经过修饰具有超稳定性的免疫球蛋白VL结构域、经过选择对更具还原性的细胞内环境具抗性的抗体或与麦芽糖结合蛋白或其他稳定细胞内蛋白质表达为融合蛋白。此类最佳化改善内抗体的稳定性和结构，并且可对本文所描述的抗体或其抗原结合部分中的任一者具有一般适用性。
本发明的抗原结合部分或衍生抗体与衍生/工程化出它们的抗体相比可具有大体上相同或同一的(1)轻链和/或重链CDR3区；(2)轻链和/或重链CDR1、CDR2以及CDR3区；或(3)轻链和/或重链区。这些区内的序列可含有保守氨基酸取代，包括CDR区内的取代。在某些实施方案中，存在不超过1、2、3、4或5个保守取代。在一个替代方案中，抗原结合部分或衍生抗体具有与衍生/工程化出它们的抗体至少约90％、95％、99％或100％同一的轻链区和/或重链区。这些抗原结合部分或衍生抗体可与所述抗体相比对靶抗原具有大体上相同的结合特异性和/或亲和力。在某些实施方案中，抗原结合部分或衍生抗体的Kd和/或k解离值在本文所描述的抗体的10倍(更高或更低)、5倍(更高或更低)、3倍(更高或更低)或2倍(更高或更低)以内。
在某些实施方案中，可从完全人抗体、人源化抗体或嵌合抗体衍生/工程化出抗原结合部分或衍生抗体，并且可根据任何领域认可的方法来产生。
单克隆抗体技术允许制备呈特异性单克隆抗体形式的极具特异性的细胞结合剂。本领域中特别熟知的为如下技术，所述技术用于通过用诸如以下的相关抗原对小鼠、大鼠、仓鼠或任何其他哺乳动物进行免疫而产生单克隆抗体：完整靶细胞、从靶细胞分离的抗原、全病毒、减毒全病毒以及诸如病毒外壳蛋白等病毒蛋白。还可使用经过敏化的人细胞。形成单克隆抗体的另一方法为使用scFv(单链可变区)，尤其是人scFv的噬菌体文库(参见例如Griffiths等,美国专利号5,885,793和5,969,108；McCafferty等,WO 92/01047；Liming等,WO 99/06587)。此外，还可使用美国专利号5,639,641中所公开的表面整修抗体，还可使用嵌合抗体和人源化抗体。
细胞结合剂还可为由噬菌体展示(参见例如Wang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2011)108(17),6909-6914)或肽文库技术(参见例如Dane等,Mol.Cancer.Ther.(2009)8(5):1312-1318)得到的肽。
在某些实施方案中，本发明的CBA还包括抗体模拟物，诸如DARPin、亲和体、亲和蛋白(affilin)、affitin、抗运载蛋白(anticalin)、高亲和性聚合体(avimer)、Fynomer、库尼茨(Kunitz)结构域肽、单体、纳米装配体(nanofitin)、肽(诸如US2014/0163201(以引用的方式并入本文中)中所描述的那些)以及喷他林，诸如摘要3674,2015年AACR第106届年会；2015年4月18-22日；Philadelphia,PA(以引用的方式并入本文中)中所描述的那些。
如本文所用，术语“DARPin”和“(设计的)锚蛋白重复蛋白”可互换地用于指典型地展现优先(有时为特异性)靶标结合的某些基因工程化抗体模拟蛋白。所述靶标可为蛋白质、碳水化合物或其他化学实体，并且结合亲和力可能相当高。DARPin可源自于含有天然锚蛋白重复序列的蛋白质，并且优选由这些蛋白质的至少三个、通常四个或五个锚蛋白重复基序(典型地每个锚蛋白重复基序中约33个残基)组成。在某些实施方案中，DARPin含有约四个或五个重复序列，并且分别可具有约14或18kDa的分子量。可在DNA层面产生多样性超过1012个变体的具有随机化潜在靶标相互作用残基的DARPin的文库，用于使用诸如核糖体展示或信号识别粒子(SRP)噬菌体展示的多种技术来选择以皮摩尔亲和力和特异性结合所需靶标(例如充当受体激动剂或拮抗剂、反向激动剂、酶抑制剂或简单目标蛋白质结合剂)的DARPin。关于DARPin制备参见例如美国专利公布号2004/0132028、2009/0082274、2011/0118146以及2011/0224100、WO 02/20565以及WO 06/083275(其全部教示内容以引用的方式并入本文中)，并且还参见C.Zahnd等(2010)Cancer Res.,70:1595-1605；Zahnd等(2006)J.Biol.Chem.,281(46):35167-35175；以及Binz,H.K.,Amstutz,P.以及Pluckthun,A.(2005)Nature Biotechnology,23:1257-1268(全部以引用的方式并入本文中)。关于相关锚蛋白样重复蛋白或合成肽还参见美国专利公布号2007/0238667；美国专利号7,101,675；WO 2007/147213；以及WO 2007/062466(这些专利全部教示内容以引用的方式并入本文中)。
亲和体分子为经过工程化以高亲和力结合于大量目标蛋白质或肽的小蛋白质，因此模仿了单克隆抗体。亲和体由具有58个氨基酸的三个α螺旋组成并且具有约6kDa的摩尔质量。已显示它们可承受高温(90℃)或酸性和碱性条件(pH 2.5或pH 11)，并且已从原初文库选择获得亲和力降至亚萘摩尔范围的结合剂，并且已在亲和力成熟之后获得具有皮摩尔亲和力的结合剂。在某些实施方案中，使亲和体缀合至弱亲电子剂以共价结合于靶标。
单体(也称为阿德奈汀)为能够结合于抗原的基因工程化抗体模拟蛋白。在某些实施方案中，单体由94个氨基酸组成并且具有约10kDa的分子量。它们是基于人纤连蛋白的结构，更具体地说是基于其第十个细胞外III型结构域，其第十个细胞外III型结构域具有类似于抗体可变域的结构，七个β折叠形成桶状并且每一侧的三个暴露的环对应于三个互补决定区。通过对环BC(第二个与第三个β折叠之间)和FG(第六个与第七个折叠之间)进行修饰可定制对不同蛋白质具有特异性的单体。
三抗体为基于小鼠和人软骨基质蛋白(CMP)的C端卷曲螺旋区设计的自组装抗体模拟物，所述自组装抗体模拟物自组装成平行三聚体复合物。它是通过使特定靶标结合部分与来源于CMP的三聚结构域融合而形成的高度稳定的三聚体靶向配体。所得融合蛋白可高效地自组装成具有高稳定性的明确界定的平行均三聚体。三聚体靶向配体的表面等离子体共振(SPR)分析展示与对应单体相比显著增强的靶标结合强度。细胞结合研究证实此类三抗体对其相应受体具有优良结合强度。
生替素为可使用基于共同FN3结构域序列的构架构建的文库来获得的另一抗体模拟物(Diem等,Protein Eng.Des.Sel.,2014)。此文库采用在FN3结构域的C-链、CD-环、F-链以及FG-环内的多样化位置，并且可针对特定靶标对高亲和力生替素变体加以选择。
在一些实施方案中，细胞结合剂为抗叶酸受体抗体。更具体地说，抗叶酸受体抗体为人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段特异性结合人叶酸受体1(也称为叶酸受体α(FR-α))。除非另外指出，否则如本文所用，术语“人叶酸受体1”、“FOLR1”或“叶酸受体α(FR-α)”是指任何天然人FOLR1。因此，所有这些术语均可指如本文中所指示的蛋白质或核酸序列。术语“FOLR1”涵盖“全长”、“未加工的FOLR1”以及由细胞内的加工产生的任何形式的FOLR1。FOLR1抗体包含：(a)包含GYFMN(SEQ ID NO:4)的重链CDR1、包含RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(SEQ ID NO:5)的重链CDR2以及包含YDGSRAMDY(SEQ IDNO:6)的重链CDR3；以及(b)包含KASQSVSFAGTSLMH(SEQ ID NO:7)的轻链CDR1、包含RASNLEA(SEQ ID NO:8)的轻链CDR2以及包含QQSREYPYT(SEQ ID NO:9)的轻链CDR3；其中Xaa1选自K、Q、H以及R；Xaa2选自Q、H、N以及R；并且Xaa3选自G、E、T、S、A以及V。优选地，重链CDR2序列包含RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQ ID NO:10)。
在另一实施方案中，抗叶酸受体抗体为人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段特异性结合包含具有以下氨基酸序列的重链的人叶酸受体1：
在一些实施方案中，重链氨基酸序列在SEQ ID NO:11的最后的甘氨酸之后具有C端赖氨酸。在另一实施方案中，抗叶酸受体抗体为由质粒DNA编码的人源化抗体或其抗原结合片段，所述质粒DNA于2010年4月7日保藏在ATCC并且具有ATCC保藏号PTA-10772和PTA-10773或10774。在一个实施方案中，抗叶酸受体抗体包含由具有ATCC保藏号PTA-10772的质粒DNA编码的重链HC以及由具有ATCC保藏号PTA-10773或10774的质粒DNA编码的轻链LC。在另一实施方案中，抗叶酸受体抗体包含由具有ATCC保藏号PTA-10772的质粒DNA编码的重链HC以及由具有ATCC保藏号PTA-10773的质粒DNA编码的轻链LC。在另一实施方案中，抗叶酸受体抗体包含由具有ATCC保藏号PTA-10772的质粒DNA编码的重链HC以及由具有ATCC保藏号PTA-10774的质粒DNA编码的轻链LC。
在另一实施方案中，抗叶酸受体抗体为人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段特异性结合包含具有以下氨基酸序列的轻链的人叶酸受体1：
或
在另一实施方案中，抗叶酸受体抗体为人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段特异性结合包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链以及具有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链的人叶酸受体1。优选地，抗体包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链(huFOLR1)。在一些实施方案中，hu FOLR1(huMov19)的重链序列在SEQ ID NO:11的最后一个甘氨酸之后包含C端赖氨酸。
在另一实施方案中，抗叶酸受体抗体为人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段特异性结合人叶酸受体1，并且包含与以下序列至少约90％、95％、99％或100％同一的重链可变域：QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:14)，以及与以下序列至少约90％、95％、99％或100％同一的轻链可变域：DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:15)；或DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:16)。
在另一实施方案中，抗叶酸受体抗体为huMov19或M9346A或M抗体(参见例如美国专利号8,709,432、8,557,966、9133275、9598490、9657100、9670278、9670279和9670280以及WO2011106528，这些专利全部以引用的方式并入本文中)。
在另一实施方案中，细胞结合剂为抗EGFR抗体或其抗体片段。在一些实施方案中，抗EGFR抗体为非拮抗剂抗体，包括例如以引用的方式并入本文中的WO2012058592中所描述的抗体。在另一实施方案中，抗EGFR抗体为非功能性抗体，例如人源化ML66或EGFR-8。更具体地说，抗EGFR抗体为huML66。
在另一实施方案中，抗EGFR抗体包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链。如本文所用，加双下划线的序列表示重链或轻链序列的可变区(即重链可变区或HCVR以及轻链可变区或LCVR)，而粗体序列表示CDR区(即从重链或轻链序列的N端到C端分别为CDR1、CDR2以及CDR3)。
在另一实施方案中，抗EGFR抗体包含SEQ ID NO:17的重链CDR1-CDR3和/或SEQ IDNO:18的轻链CDR1-CDR3，并且优选特异性结合EGFR。
在另一实施方案中，抗EGFR抗体包含与SEQ ID NO:17至少约90％、95％、97％、99％或100％同一的重链可变区(HCVR)序列和/或与SEQ ID NO:18至少约90％、95％、97％、99％或100％同一的轻链可变区(LCVR)序列，并且优选特异性结合EGFR。
在另一实施方案中，抗EGFR抗体为以引用的方式并入本文中的8,790,649和WO2012/058588中所描述的抗体。在一些实施方案中，抗EGFR抗体为huEGFR-7R抗体。
在一些实施方案中，抗EGFR抗体包含具有以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链区：
以及具有以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区：
或具有以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区：
在另一实施方案中，抗EGFR抗体包含具有SEQ ID NO:19中所列的氨基酸序列的免疫球蛋白重链区和具有SEQ ID NO:20中所列的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区。
在另一实施方案中，该抗EGFR抗体包含具有SEQ ID NO:19中所列的氨基酸序列的免疫球蛋白重链区和具有SEQ ID NO:21中所列的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区。
在另一实施方案中，抗EGFR抗体包含SEQ ID NO:19的重链CDR1-CDR3和/或SEQ IDNO:20或21的轻链CDR1-CDR3，并且优选特异性结合EGFR。
在另一实施方案中，抗EGFR抗体包含与SEQ ID NO:19至少约90％、95％、97％、99％或100％同一的重链可变区(HCVR)序列和/或与SEQ ID NO:20或21至少约90％、95％、97％、99％或100％同一的轻链可变区(LCVR)序列，并且优选特异性结合EGFR。
在另一实施方案中，细胞结合剂为抗CD19抗体，诸如以引用的方式并入本文中的美国专利号8,435,528和WO2004/103272中所描述的那些抗CD19抗体。在一些实施方案中，抗CD19抗体包含具有以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链区：
以及具有以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区：
在另一实施方案中，抗CD19抗体为huB4抗体。
在另一实施方案中，抗CD19抗体包含SEQ ID NO:22的重链CDR1-CDR3和/或SEQ IDNO:23的轻链CDR1-CDR3，并且优选特异性结合CD19。
在另一实施方案中，抗CD19抗体包含与SEQ ID NO:22至少约90％、95％、97％、99％或100％同一的重链可变区(HCVR)序列和/或与SEQ ID NO:23至少约90％、95％、97％、99％或100％同一的轻链可变区(LCVR)序列，并且优选特异性结合CD19。
在另一实施方案中，细胞结合剂为抗Muc1抗体，诸如以引用的方式并入本文中的美国专利号7,834,155、WO 2005/009369以及WO 2007/024222中所描述的那些抗Muc1抗体。在一些实施方案中，抗Muc1抗体包含具有以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链区：
以及具有以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区：
在另一实施方案中，抗Muc1抗体为huDS6抗体。
在另一实施方案中，抗Muc1抗体包含SEQ ID NO:24的重链CDR1-CDR3和/或SEQ IDNO:25的轻链CDR1-CDR3，并且优选特异性结合Muc1。
在另一实施方案中，抗Muc1抗体包含与SEQ ID NO:24至少约90％、95％、97％、99％或100％同一的重链可变区(HCVR)序列和/或与SEQ ID NO:25至少约90％、95％、97％、99％或100％同一的轻链可变区(LCVR)序列，并且优选特异性结合Muc1。
在另一实施方案中，细胞结合剂为抗CD33抗体或其片段，诸如以引用的方式并入本文中的美国专利号7,557,189、7,342,110、8,119,787和8,337,855以及WO2004/043344中所描述的抗体或其片段。在另一实施方案中，抗CD33抗体为huMy9-6抗体。
在一些实施方案中，抗CD33抗体包含具有以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链区：
以及具有以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区：
在另一实施方案中，抗CD33抗体包含SEQ ID NO:26的重链CDR1-CDR3和/或SEQ IDNO:27的轻链CDR1-CDR3，并且优选特异性结合CD33。
在另一实施方案中，抗CD33抗体包含与SEQ ID NO:26至少约90％、95％、97％、99％或100％同一的重链可变区(HCVR)序列和/或与SEQ ID NO:27至少约90％、95％、97％、99％或100％同一的轻链可变区(LCVR)序列，并且优选特异性结合CD33。
在另一实施方案中，细胞结合剂为抗CD37抗体或其抗体片段，诸如以引用的方式并入本文中的美国专利号8,765,917和WO 2011/112978中所描述的那些抗CD37抗体或其抗体片段。在一些实施方案中，抗CD37抗体为huCD37-3抗体。
在一些实施方案中，抗CD37抗体包含具有以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区：
以及具有以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链区：
或具有以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链区：
在另一实施方案中，抗CD37抗体包含具有SEQ ID NO:28中所列的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区和具有SEQ ID NO:29中所列的氨基酸序列的免疫球蛋白重链区。
在另一实施方案中，抗CD37抗体包含具有SEQ ID NO:28中所列的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区和具有SEQ ID NO:30中所列的氨基酸序列的免疫球蛋白重链区。
在另一实施方案中，抗CD37抗体包含SEQ ID NO:29或30的重链CDR1-CDR3和/或SEQ ID NO:28的轻链CDR1-CDR3，并且优选特异性结合CD37。
在另一实施方案中，抗CD37抗体包含与SEQ ID NO:29或30至少约90％、95％、97％、99％或100％同一的重链可变区(HCVR)序列和/或与SEQ ID NO:28至少约90％、95％、97％、99％或100％同一的轻链可变区(LCVR)序列，并且优选特异性结合CD37。
在另一实施方案中，抗CD37抗体包含具有以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区：
以及具有以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链区：
在另一实施方案中，抗CD37抗体包含SEQ ID NO:32的重链CDR1-CDR3和/或SEQ IDNO:31的轻链CDR1-CDR3，并且优选特异性结合CD37。
在另一实施方案中，抗CD37抗体包含与SEQ ID NO:32至少约90％、95％、97％、99％或100％同一的重链可变区(HCVR)序列和/或与SEQ ID NO:31至少约90％、95％、97％、99％或100％同一的轻链可变区(LCVR)序列，并且优选特异性结合CD37。
在另一实施方案中，抗CD37抗体为huCD37-50抗体。
在一个实施方案中，细胞结合剂为抗CD123抗体或其抗体片段，诸如以引用的方式并入本文中的WO2017/004026中所描述的那些抗CD123抗体或其抗体片段。
在一个实施方案中，所述抗CD123抗体或其抗体片段包含：a)具有SSIMH(SEQ IDNO:33)的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有YIKPYNDGTKYNEKFKG(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列的重链可变区CDR2以及具有EGGNDYYDTMDY(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列的重链可变区CDR3；以及b)具有RASQDINSYLS(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有RVNRLVD(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列的轻链可变区CDR2以及具有LQYDAFPYT(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在另一实施方案中，抗CD123抗体或其抗体片段包含具有以下氨基酸序列的重链可变区：QXQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSSIMHWVRQAPGQGLEWIGYIKPYNDGTKYNEKFKGRATLTSDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:39)以及具有以下氨基酸序列的轻链可变区：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRVNRLVDGVPSRFSGSGSGNDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDAFPYTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:40)。在某些实施方案中，从SEQ ID NO:39N端起的第二个残基X(或Xaa)为Phe(F)。。在某些实施方案中，SEQ ID NO:39中的X(或Xaa)为Val(V)。
在另一实施方案中，抗CD123抗体或其抗体片段包含具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区以及具有以下氨基酸序列的轻链可变区：SIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRVNRLVDGVPSRFSGSGSGNDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDAFPYTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:41)。
在另一实施方案中，抗CD123抗体包含具有以下氨基酸序列的重链：QXQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSSIMHWVRQAPGQGLEWIGYIKPYNDGTKYNEKFKGRATLTSDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLCLSPG(SEQ ID NO:42)以及具有以下氨基酸序列的轻链：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRVNRLVDGVPSRFSGSGSGNDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDAFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:43)。在一些实施方案中，从SEQ ID NO:42N端起的第二个残基X(或Xaa)为Val。
在另一实施方案中，抗CD123抗体包含具有以下氨基酸序列的重链：QXQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSSIMHWVRQAPGQGLEWIGYIKPYNDGTKYNEKFKGRATLTSDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:44)以及具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，从SEQ ID NO:44N端起的第二个残基X(或Xaa)为Val。
在某些实施方案中，本发明的细胞结合剂(例如抗体)具有N端丝氨酸，所述N端丝氨酸可用氧化剂氧化以形成具有N端醛基的氧化细胞结合剂。
在上文所描述的方法的步骤(a)中可使用任何适合的氧化剂。在某些实施方案中，氧化剂为过碘酸盐。更具体地说，氧化剂为过碘酸钠。
可使用相对于细胞结合剂过量的摩尔当量的氧化剂。在某些实施方案中，可使用约2-100、5-80、10-50、1-10或5-10摩尔当量的氧化剂。在某些实施方案中，可使用约10或约50当量的氧化剂。当使用大量氧化剂时，使用短反应时间来避免过氧化。举例来说，当使用50当量的氧化剂时，氧化反应进行约5至约60分钟。或者，当使用10当量的氧化剂时，反应进行约30分钟至约24小时。在一些实施方案中，使用5-10摩尔当量的氧化剂并且氧化反应进行约5至约60分钟(例如约10至约30分钟、约20至约30分钟)。
在某些实施方案中，氧化反应不引起显著的非靶向氧化。举例来说，在用于产生具有N端醛基的氧化细胞结合剂的N端丝氨酸氧化过程期间未氧化显著程度的甲硫氨酸和/或聚醣(例如不到20％、不到10％、不到5％、不到3％、不到2％或不到1％)。
在某些实施方案中，本发明的细胞结合剂(例如抗体)具有重组工程化Cys残基，诸如在抗体的EU/OU编号位置442处的Cys残基。因此，术语“半胱氨酸工程化的抗体”包括具有至少一个不正常存在于抗体轻链或重链的给定残基处的Cys的抗体。此类Cys还可称为“工程化Cys”，可使用任何常规分子生物学或重组DNA技术(例如通过将靶残基处的非Cys残基的编码序列用Cys的编码序列置换)来进行工程化。举例来说，如果原始残基为编码序列为5'-UCU-3'的Ser，那么可使所述编码序列突变(例如通过定点诱变)为编码Cys的5'-UGU-3'。在某些实施方案中，Cys工程化的本发明抗体在重链中具有工程化Cys。在某些实施方案中，工程化Cys位于重链的CH3结构域中或其附近。可将工程化的抗体重(或轻)链序列插入适合的重组表达载体中以产生具有替代原始Ser残基的工程化Cys残基的工程化抗体。
化合物和缀合物的细胞毒性
可评估本发明的细胞毒性化合物和细胞结合剂-药物缀合物在体外抑制各种癌细胞系增殖的能力。举例来说，可使用诸如人绒毛膜癌JEG-3细胞的细胞系来评估这些化合物和缀合物的细胞毒性。可使所要评估的细胞暴露于所述化合物或缀合物1-5天，并且在直接分析中通过已知方法测量细胞的存活分数。然后可由分析结果计算IC50值。或者或此外，可使用体外细胞系敏感度筛选，诸如由美国国家癌症协会(U.S.National CancerInstitute)描述的体外细胞系敏感度筛选(参见Voskoglou-Nomikos等,2003,ClinicalCancer Res.9:42227-4239，该文献以引用的方式并入本文中)作为一种指导来确定可能对用本发明的化合物或缀合物治疗敏感的癌症类型。
实施例6中描述了本发明的抗体-细胞毒性剂缀合物的体外效力和靶标特异性的实施例。当抗原阴性细胞系暴露于相同缀合物时仍然有活力。
组合物和使用方法
本发明包括一种包含本文所描述的新颖类美登素化合物、其衍生物或其缀合物(和/或其溶剂合物、水合物和/或盐)以及载体(药学上可接受的载体)的组合物(例如药物组合物)。本发明还包括一种包含本文所描述的新颖类美登素化合物、其衍生物或其缀合物(和/或其溶剂合物、水合物和/或盐)以及载体(药学上可接受的载体)的组合物(例如药物组合物)。本发明组合物可用于在哺乳动物(例如人)中抑制异常细胞生长或治疗增殖性病症。
本发明包括一种在哺乳动物(例如人)中抑制异常细胞生长或治疗增殖性病症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的本文所描述的新颖类美登素化合物、其衍生物或其缀合物(和/或其溶剂合物和盐)或其组合物。
本发明还提供治疗方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的上文所描述的缀合物中的任一者。
类似地，本发明提供一种在所选细胞群体中诱导细胞死亡的方法，所述方法包括使靶细胞或含有靶细胞的组织与有效量的细胞毒性剂接触，所述细胞毒性剂包含本发明的细胞毒性化合物-细胞结合剂、其盐或溶剂合物中的任一者。靶细胞为可与细胞结合剂结合的细胞。
适合的药学上可接受的载体、稀释剂以及赋形剂为熟知的，并且可由一般本领域技术人员根据临床情况加以确定。
适合的载体、稀释剂和/或赋形剂的实例包括：(1)杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's phosphate buffered saline)，pH约7.4，含有约1mg/mL至25mg/mL人血清白蛋白或不含人血清白蛋白，(2)0.9％生理盐水(0.9％w/v NaCl)，以及(3)5％(w/v)右旋糖；并且还可含有抗氧化剂，诸如色胺；以及稳定剂，诸如吐温20(Tween 20)。
在所选细胞群体中诱导细胞死亡的方法可在体外、体内或离体实施。
体外使用的实例包括在移植至同一患者中之前处理自体骨髓以杀死患病或恶性细胞：在移植之前处理骨髓以杀死胜任型T细胞并且预防移植物抗宿主疾病(GVHD)；处理细胞培养物以杀死除不表达靶抗原的所需变体以外的所有细胞；或杀死表达不需要的抗原的变体。
非临床体外使用的条件由一般本领域技术人员容易地确定。
临床离体使用的实例为在癌症治疗中或在自体免疫疾病的治疗中在自体移植之前从骨髓移除肿瘤细胞或淋巴样细胞，或在移植之前从自体或异体骨髓或组织移除T细胞和其他淋巴样细胞以预防GVHD。可如下进行治疗。从患者或其他个体收获骨髓并且然后在约37℃下在含有血清的培养基中孵育约30分钟至约48小时，培养基中添加了本发明的细胞毒性剂，浓度在约10μM至1pM范围内。浓度和孵育时间的确切条件(即剂量)由一般本领域技术人员容易地确定。在孵育之后，将骨髓细胞用含有血清的培养基洗涤并且根据已知方法使其以静脉内方式回到患者体内。在收获骨髓的时间与再输注所处理的细胞之间患者接受诸如一系列消融化学治疗或全身放射治疗等其他治疗的情况下，使用标准医疗设备将所处理的骨髓细胞冷冻储存于液氮中。
对于临床体内使用，将以溶液或冻干粉末形式供应本发明的细胞毒性剂，针对无菌性并且针对内毒素水平对其进行测试。
在一些实施方案中，可使用本发明的化合物和缀合物治疗癌症(例如肾癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌(TNBC))、结肠癌、脑癌、前列腺癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胃癌、鳞状癌症、肺癌(例如非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、睾丸癌、绒毛膜癌、默克尔细胞癌、肉瘤(例如骨肉瘤、软骨肉瘤、脂肪肉瘤以及平滑肌肉瘤)、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma))、骨髓增生异常综合征(MDS)、腹膜癌、输卵管癌、子宫癌或白血病(例如急性骨髓性白血病(AML)、急性单核细胞性白血病、前髓细胞性白血病、嗜酸粒细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病(例如B-ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)以及慢性骨髓性白血病(CML))。
类似物和衍生物
细胞毒性剂领域技术人员将容易理解，可以一种方式对本文所描述的细胞毒性剂中的每一者进行修饰，使得所得化合物仍保留起始化合物的特异性和/或活性。熟练技工还将理解，这些化合物中有许多可用于替代本文所描述的细胞毒性剂。因此，本发明的细胞毒性剂包括本文所描述的化合物的类似物和衍生物。
本文和以下实施例中所引用的所有参考文献以全文引用的方式明确并入本文中。
实施例
实施例1.DM-H(7)储备溶液的制备
将美登醇(5.0g，8.85mmol)溶解于无水DMF(125mL)中，然后在冰浴中冷却。然后在氩气氛围下在磁力搅拌下添加N-甲基丙氨酸的N-羧基酸酐(5.7g、44.25mmol)、无水DIPEA(7.70mL，44.25mmol)以及三氟甲烷磺酸锌(22.5g，62mmol)。移除冰浴并且在搅拌下使反应物升温。在16h之后，添加去离子水(10mL)。在30min之后，在剧烈搅拌下添加饱和碳酸氢钠水溶液:饱和氯化钠水溶液的1:1溶液(190mL)以及乙酸乙酯(250mL)。将混合物转移至分液漏斗中并且截留有机层。将水层用乙酸乙酯(100mL)萃取，然后将有机层合并并且用饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤。通过在不加热蒸发器浴槽的情况下在真空下旋转蒸发将有机层浓缩至其体积的约1/4，不进行纯化。通过用反应中所用美登醇的毫摩尔数(1.77mmol)除以给定DM-H储备溶液(0.06mmol/mL)的体积(150mL)来估计溶液的浓度。立即分配储备溶液的等分试样，然后将其用于反应中或储存于-80C冷冻器中，然后在需要时解冻。
实施例2.硫代-肽-类美登素的合成
如由FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-OAc所例示制备FMoc-肽-NH-CH2-OAc类型的化合物。
FMoc-肽-OAc化合物
FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-OAc(9a)：将FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-Gly-OH(500mg，0.979mmol)溶解于DMF(2mL)中，在氩气下在磁力搅拌下向其中添加乙酸铜(II)(17.8mg，0.098mmol)和乙酸(84μL，1.47mmol)。在固体溶解后，添加四乙酸铅(434mg，0.979mmol)，允许反应在60℃下进行20min，然后在C1830微米450g柱上纯化，在125mL/min的流速下用含有0.1％甲酸的去离子水以及历时26min 5％至55％的乙腈线性梯度进行洗脱。将含有纯所需产物的级分冷冻并且冻干，得到178mg(34％产率)的白色固体。HRMS(M+Na)+计算值547.2163；实验值547.2160。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.20(qd,J＝7.5,6.9,4.2Hz,9H),1.91-2.05(m,3H),3.26-3.38(m,1H),4.05(q,J＝7.3Hz,1H),4.23(td,J＝11.9,10.7,6.4Hz,5H),5.07(ddd,J＝11.2,6.9,4.3Hz,2H),7.32(q,J＝7.5Hz,2H),7.41(q,J＝7.4Hz,2H),7.52(t,J＝6.8Hz,1H),7.71(q,J＝7.5,7.0Hz,2H),7.82-8.08(m,4H),8.84(q,J＝7.1Hz,1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-OAc(9b)：HRMS(M+Na)+计算值547.2163，实验值547.2167。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.23(dd,J＝12.5,7.4Hz,9H),1.95(s,2H),4.00-4.13(m,1H),4.17-4.38(m,6H),5.06(q,J＝8.8Hz,2H),7.33(t,J＝7.3Hz,2H),7.42(t,J＝7.4Hz,2H),7.62(d,J＝6.8Hz,1H),7.71(t,J＝8.6Hz,2H),7.85-8.01(m,3H),8.21(d,J＝7.0Hz,1H),8.69(d,J＝6.9Hz,1H)。
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-OAc(9c)：HRMS(M+Na)+计算值547.2163，实验值547.2168。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.16-1.24(m,9H),1.97(s,3H),4.07(q,J＝7.0Hz,1H),4.16-4.34(m,5H),5.00-5.16(m,2H),7.33(td,J＝7.4,1.1Hz,2H),7.42(t,J＝7.4Hz,2H),7.58(d,J＝7.0Hz,1H),7.72(t,J＝8.1Hz,2H),7.90(d,J＝7.5Hz,2H),8.03(d,J＝7.5Hz,1H),8.14(d,J＝7.2Hz,1H),8.85(t,J＝6.9Hz,1H)。
FMoc-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH2-OAc(9d)：HRMS(M+Na)+计算值547.2163，实验值547.2167。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.18-1.25(m,9H),1.97(s,3H),3.96-4.15(m,1H),4.17-4.36(m,5H),5.09(d,J＝6.9Hz,2H),7.34(t,J＝7.4Hz,2H),7.42(t,J＝7.4Hz,2H),7.57(d,J＝7.2Hz,1H),7.71(d,J＝7.3Hz,2H),7.90(d,J＝7.5Hz,2H),8.07(s,2H),8.86(s,1H)。
FMoc-L-Ala-D-Ala-NH-CH2-OAc(9f)：HRMS(M+Na)+计算值476.1792，实验值476.1786。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.13(dd,J＝7.1,1.4Hz,6H),1.89(s,3H),3.99(q,J＝7.1Hz,1H),4.10-4.29(m,4H),4.95-5.08(m,2H),7.26(t,J＝7.4,1.3Hz,2H),7.35(t,J＝7.4Hz,2H),7.49(d,J＝7.2Hz,1H),7.66(t,J＝7.6Hz,2H),7.82(d,J＝7.5Hz,2H),8.11(d,J＝7.7Hz,1H),8.76(t,J＝7.0Hz,1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-OAc(9g)：HRMS(M+Na)+计算值476.1792，实验值476.1788。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.21(dd,J＝7.1,1.4Hz,6H),1.96(s,3H),4.08(t,J＝7.1Hz,1H),4.17-4.36(m,4H),5.05-5.14(m,2H),7.26-7.38(m,2H),7.42(t,J＝7.4Hz,2H),7.56(d,J＝7.3Hz,1H),7.73(t,J＝7.6Hz,2H),7.90(d,J＝7.6Hz,2H),8.18(d,J＝7.8Hz,1H),8.83(t,J＝6.9Hz,1H)。
FMoc-D-Ala-D-Ala-NH-CH2-OAc(9h)：HRMS(M+H)+计算值455.4877，实验值455.2051 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.14(dd,J＝7.1,3.3Hz,6H),1.21(d,J＝7.2Hz,1H),1.81(s,1H),1.91(s,2H),4.01(q,J＝7.7Hz,1H),4.09-4.27(m,5H),4.95-5.10(m,1H),7.26(td,J＝7.4,1.2Hz,3H),7.35(t,J＝7.4Hz,3H),7.45(d,J＝7.6Hz,1H),7.65(t,J＝7.1Hz,3H),7.82(d,J＝6.4Hz,2H),7.96(d,J＝7.4Hz,1H),8.78(t,J＝7.0Hz,1H)。
FMoc-肽-COOH化合物
如由FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO2H所例示制备FMoc-肽-NH-CH2-S-(CH2)n-CO2H类型的化合物。
FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO2H(10a)：将6-巯基己酸(287μL，2.07mmol)溶解于1:4TFA:二氯甲烷(5mL)的溶液中，然后添加至含有FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-OAc(178mg，0.339mmol)的小瓶中。允许反应在室温下在氩气氛围下在磁力搅拌下进行20min。将粗物质真空浓缩，再溶解于最小体积的DMF中并且在C18 30微米30g柱上纯化，在35mL/min下用含有0.1％甲酸的去离子水加上历时13min从5％到95％的乙腈线性梯度进行洗脱。将含有纯所需产物的级分冷冻并且冻干，得到200mg(96％产率)的白色固体。HRMS(M+H)+计算值613.2690；实验值613.2686。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.20(dt,J＝7.1,4.9Hz,10H),1.31(tt,J＝10.1,6.0Hz,2H),1.49(dq,J＝12.5,7.4Hz,4H),2.18(t,J＝7.3Hz,2H),4.05(t,J＝7.3Hz,1H),4.16-4.30(m,7H),7.33(td,J＝7.4,1.2Hz,2H),7.42(td,J＝7.3,1.1Hz,2H),7.54(d,J＝7.4Hz,1H),7.72(t,J＝7.0Hz,2H),7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.94-8.07(m,2H),8.44(t,J＝6.1Hz,1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO2H(10b)：HRMS(M+Na)+计算值635.2510，实验值635.2515。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.15(d,J＝6.8Hz,3H),1.18-1.25(m,10H),2.18(q,J＝7.5Hz,4H),2.40-2.48(m,1H),2.70(t,J＝7.2Hz,1H),4.15-4.30(m,6H),6.29(s,2H),7.34(q,J＝7.3Hz,3H),7.42(t,J＝7.4Hz,3H),7.63-7.78(m,1H),7.85(d,J＝7.3Hz,2H),7.89(d,J＝7.5Hz,3H),8.37-8.46(m,1H)。
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO2H(10c)：HRMS(M+Na)+计算值635.2510，实验值635.2514。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.18-1.23(m,10H),1.34(q,J＝3.4Hz,5H),2.24(s,2H),2.44(s,2H),4.05(t,J＝7.1Hz,1H),4.16-4.35(m,8H),7.33(t,J＝7.4Hz,2H),7.42(t,J＝7.5Hz,2H),7.58(d,J＝7.0Hz,1H),7.71(t,J＝8.4Hz,2H),7.90(s,1H),7.98(d,J＝7.5Hz,1H),8.15(d,J＝7.3Hz,1H),8.39(t,J＝6.2Hz,1H),11.98(s,1H)。
FMoc-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO2H(10d)：HRMS(M+Na)+计算值635.2510，实验值635.2510。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.15(d,J＝6.9Hz,3H),1.21(d,J＝7.1Hz,9H),1.28-1.38(m,3H),1.44-1.60(m,5H),2.13-2.22(m,3H),3.33(q,J＝6.9Hz,1H),4.20(s,2H),6.29(s,2H),7.29-7.40(m,3H),7.38-7.47(m,3H),7.85(d,J＝7.5Hz,2H),7.89(d,J＝7.5Hz,2H),8.26(d,J＝7.6Hz,1H),8.48(d,J＝6.2Hz,1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO2H(10g)：HRMS(M+H)+计算值542.2319，实验值542.2316。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.13(dd,J＝7.1,1.7Hz,6H),1.16-1.25(m,2H),1.32-1.47(m,4H),2.08(t,J＝7.3Hz,2H),3.25(s,2H),3.99(p,J＝7.0Hz,1H),4.07-4.27(m,6H),7.26(t,J＝7.4,1.2Hz,2H),7.35(t,J＝7.4Hz,2H),7.52(d,J＝7.0Hz,1H),7.65(t,J＝7.3Hz,2H),7.82(d,J＝7.5Hz,2H),8.08(d,J＝7.7Hz,1H),8.27(t,J＝6.2Hz,1H),11.82(s,1H)。
FMoc-L-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO2H(10f)：HRMS(M+H)+计算值542.2319，实验值542.2321。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.13(dd,J＝7.1,1.8Hz,7H),1.17-1.26(m,2H),1.32-1.48(m,5H),2.08(t,J＝7.3Hz,2H),3.99(p,J＝7.1Hz,1H),4.07-4.26(m,7H),7.26(t,J＝7.4Hz,2H),7.35(t,J＝7.4Hz,2H),7.53(d,J＝7.1Hz,1H),7.65(t,J＝7.3Hz,2H),7.82(d,J＝7.4Hz,2H),8.10(d,J＝7.7Hz,1H),8.28(t,J＝6.3Hz,1H)。
FMoc-D-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO2H(10h)：(16.7mg，0.031mmol，70％产率)。HRMS(M+H)+计算值542.2319，实验值542.2318。
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)3-CO2H(10j)：HRMS(M+H)+计算值585.2377，实验值585.2367。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.14-1.26(m,9H),1.75(p,J＝7.3Hz,2H),2.27(t,J＝7.3Hz,2H),2.54(d,J＝7.7Hz,2H),3.97-4.10(m,1H),4.13-4.34(m,7H),7.33(t,J＝7.5Hz,2H),7.42(t,J＝7.5Hz,2H),7.57(d,J＝6.9Hz,1H),7.71(t,J＝8.4Hz,2H),7.89(d,J＝7.6Hz,2H),7.97(d,J＝7.5Hz,1H),8.14(d,J＝7.0Hz,1H),8.41(s,1H),12.06(s,1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH)2-CO2H(10i)：HRMS(M+H)+计算值500.1850，实验值500.1843。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.20(dd,J＝7.2,1.9Hz,6H),2.53(d,J＝7.1Hz,2H),2.70(t,J＝7.1Hz,2H),4.07(q,J＝7.0Hz,1H),4.17-4.26(m,4H),4.29(d,J＝6.8Hz,2H),7.33(t,J＝7.4Hz,2H),7.41(t,J＝7.5Hz,2H),7.56(d,J＝7.1Hz,1H),7.72(t,J＝7.7Hz,2H),7.89(d,J＝7.5Hz,2H),8.14(d,J＝7.6Hz,1H),8.42(t,J＝6.3Hz,1H),12.22(s,1H)。
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-OAc(9c)的合成：
1：FMoc-L-Ala-D-Ala-OtBu(9c1)：
将FMoc-L-丙氨酸(10g，32.1mmol)和D-Ala-OtBu，HCl(7.00g，38.5mmol)溶解于CH2Cl2(100ml)中，用COMU(20.63g，48.2mmol)和DIPEA(11.22ml，64.2mmol)处理。允许反应在氩气下在室温下进行。在2小时之后，UPLC显示反应完成，用2-MeTHF(50ml)稀释，依次用10％柠檬酸水溶液(2x 100mL)、水(100mL)以及盐水(100mL)洗涤。将有机层经硫酸镁干燥，过滤并浓缩，得到粗FMoc-L-Ala-D-Ala-OtBu，假设100％产率。
步骤2：FMoc-L-Ala-D-Ala(9c2)
将FMoc-LAla-DAla-OtBu(11.25g，25.7mmol)用TFA:水(95:5)(50ml)处理。允许反应在室温下在氩气氛围下进行。在4小时之后，UPLC显示反应完成，用甲苯(25mL)稀释并共蒸发3次，得到FMoc-L-Ala-D-Ala，假设100％产率。
步骤3：FMoc-L-Ala-Gly-OtBu(9c3)
将Z-L-Ala-ONHS(10g，31.2mmol)和甘氨酸叔丁酯(6.28g，37.5mmol)溶解于CH2Cl2(100ml)中，用DIPEA(10.91ml，62.4mmol)处理。允许反应在氩气下在室温下进行。在2小时之后，UPLC显示完成，将反应物用2-MeTHF(50mL)稀释，用10％柠檬酸水溶液(100mL)、饱和碳酸氢钠(2x 100mL)、水(100mL)、盐水(100mL)洗涤。将有机层经硫酸镁干燥，过滤并浓缩，得到Z-L-Ala-Gly-OtBu，假设100％产率。
步骤4.L-Ala-Gly-OtBu(9c4)
将Z-Ala-Gly-OtBu(10.05g，29.9mmol)溶解于95:5MeOH:水(50ml)中，转移至氢化器烧瓶中，用Pd/C(1.272g，11.95mmol)处理。将氢化器烧瓶放置在振荡器上，在振荡烧瓶的同时真空移除空气。用氢气将烧瓶填充至30psi，将烧瓶振荡2分钟并且真空移除氢气。将此举再重复2次。允许氢气将烧瓶填充至30psi并且允许其振荡。在4h之后，UPLC显示完成，将反应物经硅藻土塞真空过滤，再溶解于2-MeTHF中，浓缩，得到LAla-Gly-OtBu，假设100％产率。
步骤5：FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OtBu(9c5)
将FMoc-LAla-D-ALa-OH(0.959g，2.508mmol)和L-Ala-Gly-OtBu(0.718g，3.01mmol)溶解于CH2Cl2(10ml)中，用COMU(1.181g，2.76mmol)和DIPEA(0.876ml，5.02mmol)处理。允许反应在氩气下在室温下进行。在2小时之后显示反应完成。将反应物浓缩以移除CH2Cl2，再溶解于2mL DMF中并且通过C18 com-biflash使用线性梯度纯化，将产物合并，产生FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OtBu(660mg，46％产率)。
步骤6.FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OH(9c6)
将FMoc-LAla-DAla-LAla-GlyOtBu(200mg，0.353mmol)用TFA:水(95:5)(2ml)处理。允许反应在氩气下在室温下进行。在1h之后，UPLC显示反应完成，用甲苯(1mL)稀释并与甲苯共蒸发2次，得到FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OH，假设100％产率。
步骤7.FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-CH2-OAc(9c7)
将FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Gly-OH(2.65g，5.19mmol)溶解于DMF(20mL)中，用乙酸铜(II)(0.094g，0.519mmol)和乙酸(0.446ml，7.79mmol)处理，在所有试剂溶解后，将反应物用四乙酸铅(3.45g，7.785mmol)处理。允许反应在氩气下在60℃下进行30分钟。将粗反应物经由Combiflash Rf 200i纯化，使用C18 450g柱，流速为125mL/min，使用含有0.1％甲酸的去离子水和乙腈作为溶剂，使用如下梯度(时间(分钟)，乙腈百分比)：(0,5)(8,50)(26,55)。所需产物具有11分钟的滞留时间，立即将产物级分冷冻并冻干，得到FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-CH2-OAc(843mg，1.607mmol，31.0％产率)。HRMS(M+Na)+计算值547.2163，实验值547.2167。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.23(dd,J＝12.5,7.4Hz,9H),1.95(s,2H),4.00-4.13(m,1H),4.17-4.38(m,6H),5.06(q,J＝8.8Hz,2H),7.33(t,J＝7.3Hz,2H),7.42(t,J＝7.4Hz,2H),7.62(d,J＝6.8Hz,1H),7.71(t,J＝8.6Hz,2H),7.85-8.01(m,3H),8.21(d,J＝7.0Hz,1H),8.69(d,J＝6.9Hz,1H)。
FMoc-肽-May-NMA化合物
如由FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM所例示制备FMoc-肽-NH-CH2-S-(CH2)n-CO2-DM类型的化合物。
FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(11a)：向DM-H储备溶液(8.2mL，0.49mmol)中添加FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-COOH(300mg，0.49mmol)、EDC(94mg，0.490mmol)以及DIPEA(90μL，0.49mmol)。允许反应在室温下在氩气氛围下在磁力搅拌下进行2h。通过在真空下旋转蒸发将粗物质浓缩并且将残余物溶解于最小体积的DMF中，然后在C18 30微米30g柱上纯化，用含有0.1％甲酸的去离子水以及历时25min从5％到50％的乙腈线性梯度进行洗脱。将含有纯所需产物的级分冷冻并冻干，得到151mg(37.2％产率)的白色固体。HRMS(M+Na)+计算值1266.5170；实验值1266.5141。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.77(s,3H),1.12(d,J＝6.4Hz,3H),1.14-1.22(m,12H),1.22-1.30(m,3H),1.35-1.49(m,4H),1.50-1.55(m,1H),1.59(s,3H),2.00-2.07(m,1H),2.14(ddd,J＝15.6,8.7,5.9Hz,1H),2.40(dtd,J＝17.0,7.9,7.0,4.9Hz,3H),2.69(s,3H),2.79(d,J＝9.6Hz,1H),3.08(s,3H),3.20(d,J＝12.6Hz,1H),3.24(s,3H),3.43(d,J＝12.4Hz,2H),3.48(d,J＝8.9Hz,1H),3.92(s,3H),4.08(ddd,J＝20.8,10.8,5.0Hz,3H),4.14-4.24(m,4H),4.26(d,J＝6.0Hz,3H),4.52(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),5.34(q,J＝6.7Hz,1H),5.56(dd,J＝14.7,9.0Hz,1H),5.91(s,1H),6.50-6.66(m,3H),6.88(s,1H),7.17(d,J＝1.8Hz,1H),7.33(td,J＝7.5,1.2Hz,2H),7.41(t,J＝7.4Hz,2H),7.53(d,J＝7.4Hz,1H),7.72(t,J＝7.0Hz,2H),7.89(d,J＝7.5Hz,3H),7.99(d,J＝7.3Hz,1H),8.36(t,J＝6.3Hz,1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(11b)：HRMS(M+Na)+计算值1266.5170，实验值1266.5164。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.78(s,3H),1.14(dd,J＝14.6,6.5Hz,6H),1.22(t,J＝6.8Hz,10H),1.33-1.57(m,4H),1.59(s,3H),2.04(d,J＝13.5Hz,1H),2.27-2.44(m,1H),2.69(s,3H),2.80(d,J＝9.7Hz,1H),3.08(s,3H),3.14-3.28(m,5H),3.37-3.55(m,3H),3.92(s,3H),3.98-4.16(m,3H),4.20(dd,J＝15.6,7.6Hz,7H),4.52(d,J＝12.7Hz,1H),5.34(d,J＝6.9Hz,1H),5.57(dd,J＝14.7,9.0Hz,1H),5.92(s,1H),6.46-6.72(m,4H),6.88(s,1H),7.17(s,1H),7.33(t,J＝7.5Hz,3H),7.41(t,J＝7.4Hz,3H),7.60-7.75(m,4H),7.80-7.93(m,4H),8.12(t,1H),8.29(d,J＝6.9Hz,1H)。
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(11c)：HRMS(M+Na)+计算值1266.5170，实验值1266.5170。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),0.96-1.16(m,10H),1.16-1.51(m,10H),1.52(s,4H),1.82-2.16(m,1H),2.17-2.56(m,11H),2.62(d,J＝5.8Hz,4H),2.68-2.87(m,3H),2.92-3.04(m,4H),3.09-3.22(m,7H),3.24(d,J＝7.4Hz,1H),3.33-3.50(m,2H),3.73-3.89(m,4H),3.92-4.07(m,2H),4.07-4.25(m,2H),4.45(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.40-5.55(m,1H),5.85(s,1H),6.33-6.66(m,4H),6.81(s,2H),7.03-7.19(m,1H),7.19-7.43(m,2H),7.62(d,J＝11.6Hz,1H),7.73-7.85(m,1H)。
FMoc-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(11d)：HRMS(M+Na)+计算值1266.5170，实验值1266.5158。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.78(s,3H),1.06-1.33(m,16H),1.44(d,J＝10.3Hz,11H),1.59(s,3H),1.99-2.22(m,3H),2.35-2.45(m,2H),2.55(d,J＝1.8Hz,1H),2.69(s,3H),2.80(d,J＝9.6Hz,1H),3.08(s,2H),3.25(s,3H),3.39-3.52(m,3H),3.92(s,3H),3.99-4.40(m,4H),4.52(d,J＝11.1Hz,1H),5.34(d,J＝6.8Hz,1H),5.57(dd,J＝14.5,9.2Hz,1H),5.92(s,1H),6.53-6.64(m,2H),6.88(s,2H),7.17(d,J＝1.9Hz,1H),7.33(t,J＝7.3Hz,3H),7.42(t,J＝7.4Hz,3H),7.57(d,J＝7.4Hz,1H),7.72(s,3H),7.89(d,J＝7.6Hz,3H),7.99(d,J＝7.6Hz,1H),8.07(s,1H),8.35(s,1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(11g)：HRMS(M+H)+计算值1173.4980，实验值1173.4964。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.79(s,3H),1.06-1.34(m,13H),1.36-1.54(m,4H),1.60(s,2H),1.88-2.10(m,1H),2.10-2.23(m,1H),2.31-2.51(m,13H),2.71(s,3H),2.80(d,J＝9.6Hz,1H),3.10(s,3H),3.26(s,4H),3.33-3.66(m,3H),3.98-4.32(m,4H),4.53(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),5.35(q,J＝6.7Hz,1H),5.49-5.65(m,1H),6.51-6.67(m,3H),6.89(s,1H),7.19(d,J＝1.8Hz,1H),8.25(s,2H),8.34(d,J＝7.1Hz,1H),8.58(t,J＝6.3Hz,1H)。
FMoc-L-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(11f)：HRMS(M+H)+计算值1173.4980，实验值1173.4969。
FMoc-D-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(11h)：HRMS(M+Na)+计算值1195.4907，实验值1195.4799。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.00-1.22(m,13H),1.28-1.45(m,2H),1.52(s,3H),1.91-2.14(m,1H),2.26(t,J＝1.9Hz,5H),2.48(t,J＝1.8Hz,2H),2.62(s,3H),2.66-2.77(m,2H),3.01(s,2H),3.10-3.21(m,5H),3.28-3.47(m,2H),3.86(d,J＝6.7Hz,4H),3.93-4.25(m,10H),4.37-4.54(m,1H),5.27(d,J＝6.7Hz,1H),5.40-5.56(m,1H),5.85(s,1H),6.31-6.66(m,3H),6.81(s,1H),7.11(d,J＝1.8Hz,1H),7.26(t,J＝7.4Hz,2H),7.35(t,J＝7.4Hz,2H),7.45(d,J＝7.5Hz,1H),7.65(t,J＝7.1Hz,2H),7.82(d,J＝7.5Hz,2H),7.89(d,J＝7.3Hz,1H)。
FMoc-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)3-CO-DM(11j)：HRMS(M+H)+计算值1216.5038，实验值1216.4999。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.78(s,3H),0.95-1.29(m,16H),1.37(d,J＝3.4Hz,1H),1.46(t,J＝12.5Hz,2H),1.59(s,3H),1.62-1.90(m,1H),1.99-2.07(m,1H),2.08(s,2H),2.18-2.43(m,1H),2.50-2.59(m,1H),2.69(s,3H),2.73-2.83(m,1H),3.10(s,2H),3.25(s,3H),3.38-3.55(m,2H),3.91(s,3H),3.99-4.13(m,4H),4.12-4.35(m,7H),4.52(dd,J＝12.0,2.9Hz,1H),5.34(q,J＝6.7Hz,1H),5.48-5.65(m,1H),5.92(s,1H),6.48-6.70(m,3H),6.88(s,1H),7.17(d,J＝1.7Hz,1H),7.33(t,J＝7.5Hz,2H),7.41(t,J＝7.4Hz,2H),7.58(d,J＝7.0Hz,1H),7.71(t,J＝8.3Hz,2H),7.89(d,J＝7.5Hz,3H),7.95(d,J＝7.6Hz,1H),8.15(d,J＝7.2Hz,1H),8.29-8.38(m,1H),8.41(s,1H)。
FMoc-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)2-CO-DM(11i)：HRMS(M+H)+计算值1131.4510，实验值1131.4507。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.76(s,3H),1.08-1.21(m,12H),1.24(d,J＝13.9Hz,1H),1.38-1.52(m,2H),1.58(s,3H),1.99-2.09(m,1H),2.33-2.44(m,1H),2.68(s,3H),2.80(dd,J＝14.4,8.6Hz,2H),3.08(s,3H),3.17(d,J＝12.5Hz,1H),3.23(s,3H),3.46(t,J＝10.3Hz,2H),3.91(s,3H),4.00-4.13(m,3H),4.13-4.34(m,5H),4.52(dd,J＝12.0,2.9Hz,1H),5.30(q,J＝6.8Hz,1H),5.55(dd,J＝13.4,9.1Hz,1H),5.91(s,1H),6.55(dd,J＝7.4,5.7Hz,3H),6.87(s,1H),7.16(d,J＝1.8Hz,1H),7.32(tt,J＝7.4,1.5Hz,2H),7.41(tt,J＝7.5,1.5Hz,2H),7.57(d,J＝7.0Hz,1H),7.71(dd,J＝10.5,7.5Hz,2H),7.88(d,J＝7.5Hz,2H),8.14(d,J＝7.6Hz,1H),8.37(t,J＝6.3Hz,1H)。
氨基-肽-类美登素
如由H2N-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM所例示制备H2N-肽-NH-CH2-S-(CH2)n-CO2-DM类型的化合物。
H2N-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(12a)：将FMoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(151mg，0.121mmol)用20％吗啉DMF溶液(2mL)处理。允许反应在室温下在氩气下在磁力搅拌下进行1h。将粗物质在C18 30微米150g柱上纯化，用含有0.1％甲酸的去离子水以及历时26min从5％到50％的乙腈线性梯度进行洗脱。立即将含有所需产物的级分冷冻并冻干，得到46mg(37.1％产率)的无色油状物。HRMS(M+H)+计算值1022.4670；实验值1022.4669。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.78(s,3H),1.12(d,J＝6.3Hz,3H),1.13-1.21(m,10H),1.21-1.31(m,3H),1.37-1.50(m,4H),1.51-1.57(m,1H),1.59(s,3H),2.04(dd,J＝14.4,2.8Hz,1H),2.15(ddd,J＝15.9,8.7,6.0Hz,1H),2.38(td,J＝7.0,3.6Hz,2H),2.70(s,3H),2.79(d,J＝9.6Hz,1H),3.09(s,3H),3.21(d,J＝12.5Hz,1H),3.25(s,3H),3.33-3.55(m,8H),3.93(s,3H),4.01-4.33(m,5H),4.52(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),5.34(q,J＝6.7Hz,1H),5.57(dd,J＝14.6,9.0Hz,1H),5.95(s,1H),6.48-6.65(m,3H),6.89(s,1H),7.18(d,J＝1.8Hz,1H),8.07(d,J＝7.5Hz,1H),8.13(s,1H),8.31(s,1H),8.40(t,J＝6.3Hz,1H)。
H2N-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(12b)：HRMS(M+H)+计算值1022.4670，实验值1022.4675。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.05(dd,J＝6.7,3.1Hz,7H),1.08-1.16(m,10H),1.19(t,J＝8.1Hz,3H),1.30-1.50(m,6H),1.52(s,3H),1.97(d,J＝13.3Hz,1H),2.01-2.21(m,2H),2.34(s,3H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.8Hz,1H),3.02(s,3H),3.14(d,J＝12.5Hz,1H),3.33-3.48(m,2H),3.86(s,3H),3.95-4.23(m,7H),4.45(dd,J＝13.1Hz,1H),5.27(q,J＝6.8Hz,1H),5.41-5.58(m,1H),5.85(s,1H),6.39-6.63(m,4H),6.81(s,1H),7.12(d,J＝1.8Hz,1H),8.02(s,1H),8.13(d,J＝7.7Hz,1H),8.26(s,1H),8.36(t,J＝6.2Hz,1H)。
H2N-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(12c)：HRMS(M+H)+计算值1022.4670，实验值1022.4680。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.01-1.26(m,19H),1.25-1.50(m,6H),1.52(s,3H),1.97(d,J＝13.7Hz,1H),2.02-2.22(m,1H),2.35(dd,J＝17.2,9.5Hz,2H),2.47(d,J＝11.5Hz,1H),2.63(s,4H),2.73(d,J＝9.6Hz,1H),3.02(s,3H),3.10-3.24(m,6H),3.32-3.50(m,2H),3.86(s,3H),3.95-4.18(m,4H),4.45(dd,J＝12.1,2.6Hz,1H),5.27(q,J＝6.9Hz,1H),5.44-5.55(m,1H),5.85(s,1H),6.42-6.59(m,4H),6.81(s,1H),7.12(d,J＝1.7Hz,1H),8.02(s,1H),8.13(d,J＝7.7Hz,1H),8.36(t,J＝6.3Hz,1H)。
H2N-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(12d)：HRMS(M+H)+计算值1022.4670，实验值1022.4675。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),0.98-1.14(m,13H),1.14-1.26(m,2H),1.30-1.49(m,4H),1.52(s,3H),2.24-2.41(m,2H),2.44(d,J＝1.8Hz,16H),2.63(s,2H),2.73(d,J＝9.6Hz,1H),3.02(s,2H),3.08-3.21(m,4H),3.32-3.49(m,2H),3.86(s,3H),3.92-4.23(m,3H),4.45(d,J＝11.8Hz,1H),5.26(t,J＝6.7Hz,1H),5.40-5.57(m,1H),5.86(s,1H),6.41-6.66(m,3H),6.81(s,1H),7.12(d,J＝1.7Hz,1H),8.02(s,1H),8.10(d,J＝7.7Hz,1H),8.35(t,J＝6.3Hz,1H)。
H2N-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(12g)：HRMS(M+H)+计算值951.4299，实验值951.4289。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.79(s,3H),1.06-1.34(m,13H),1.36-1.54(m,4H),1.60(s,2H),1.88-2.10(m,1H),2.10-2.23(m,1H),2.31-2.51(m,13H),2.71(s,3H),2.80(d,J＝9.6Hz,1H),3.10(s,3H),3.26(s,4H),3.33-3.66(m,3H),3.98-4.32(m,4H),4.53(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),5.35(q,J＝6.7Hz,1H),5.49-5.65(m,1H),6.51-6.67(m,3H),6.89(s,1H),7.19(d,J＝1.8Hz,1H),8.25(s,2H),8.34(d,J＝7.1Hz,1H),8.58(t,J＝6.3Hz,1H)。
H2N-L-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(12f)：HRMS(M+H)+计算值951.4226，实验值951.1299。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.00-1.13(m,11H),1.19(t,J＝8.9Hz,3H),1.29-1.45(m,4H),1.52(s,3H),1.92-2.03(m,1H),2.07(dd,J＝15.7,8.7Hz,1H),2.23-2.39(m,1H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.7Hz,1H),3.02(s,3H),3.07-3.32(m,14H),3.34-3.47(m,2H),3.86(s,3H),3.95-4.21(m,4H),4.45(dd,J＝11.9,2.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.8Hz,1H),5.50(dd,J＝14.7,9.0Hz,1H),5.85(s,1H),6.40-6.61(m,3H),6.81(s,1H),7.12(d,J＝1.8Hz,1H),8.41(t,J＝6.1Hz,1H)。
H2N-D-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(12h)：HRMS(M+H)+计算值950.4226，实验值951.4299。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),0.96-1.14(m,14H),1.19(t,J＝8.9Hz,3H),1.38(q,J＝10.5,7.0Hz,5H),1.52(s,3H),1.88-2.02(m,1H),2.02-2.18(m,1H),2.22-2.41(m,2H),2.48(s,1H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.6Hz,1H),3.02(s,3H),3.08-3.22(m,4H),3.34-3.48(m,2H),3.86(s,4H),3.95-4.23(m,5H),4.45(dd,J＝11.9,2.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.41-5.60(m,1H),5.85(s,1H),6.40-6.65(m,4H),6.81(s,1H),7.12(d,J＝1.8Hz,1H),8.44(t,J＝6.1Hz,1H)。
H2N-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)3-CO-DM(12j)：HRMS(M+H)+计算值994.4357，实验值994.4330。
H2N-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)2-CO-DM(12i)：HRMS(M+H)+计算值909.3830，实验值909.3826。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.77(s,3H),1.12(d,J＝6.7Hz,6H),1.17(dd,J＝7.0,5.2Hz,6H),1.25(d,J＝13.3Hz,1H),1.40-1.51(m,2H),1.59(s,3H),2.04(dd,J＝14.4,2.9Hz,1H),2.41(ddt,J＝18.6,10.1,5.4Hz,1H),2.61-2.70(m,1H),2.72(s,3H),2.76-2.90(m,3H),3.09(s,3H),3.20(d,J＝12.4Hz,1H),3.25(s,3H),3.33(q,J＝6.9Hz,1H),3.39-3.64(m,3H),3.93(s,3H),4.03-4.16(m,2H),4.24(dt,J＝15.1,7.6Hz,2H),4.53(dd,J＝12.0,2.9Hz,1H),5.32(q,J＝6.8Hz,1H),5.51-5.64(m,1H),5.93(s,1H),6.49-6.62(m,2H),6.88(s,1H),7.19(d,J＝1.8Hz,1H),8.10(s,1H),8.55(t,J＝6.3Hz,1H)。
SPDB-肽-类美登素
如由SPDB-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM所例示制备SPDB-肽-NH-CH2-S-(CH2)n-CO2-DM类型的化合物。
SPDB-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(13a)：将H2N-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(46mg，0.045mmol)溶解于DMF(2mL)中，向其中添加SPDB(14.7mg，0.045mmol)并且在室温下在磁力搅拌下在氩气氛围下反应1h。将粗物质在C18430微米30g柱上纯化，用含有0.1％甲酸的去离子水以及历时35min从5％到95％的乙腈线性梯度进行洗脱。将含有纯所需产物的级分冷冻并冻干，得到38mg(68.5％产率)的白色固体。HRMS(M+H)+计算值1233.4796；实验值1233.4783。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.78(s,3H),1.12(d,J＝6.4Hz,3H),1.14-1.21(m,10H),1.22-1.30(m,3H),1.44(qd,J＝10.2,4.5Hz,5H),1.50-1.56(m,1H),1.59(s,3H),1.84(p,J＝7.3Hz,2H),2.04(dd,J＝14.4,2.7Hz,1H),2.15(ddd,J＝15.8,8.6,5.9Hz,2H),2.24(t,J＝7.2Hz,2H),2.39(dtdd,J＝18.1,13.2,8.1,4.7Hz,3H),2.70(s,3H),2.76-2.86(m,3H),3.09(s,3H),3.21(d,J＝12.5Hz,1H),3.25(s,3H),3.43(d,J＝12.4Hz,1H),3.48(d,J＝9.0Hz,1H),3.92(s,3H),4.13(s,2H),4.19(h,J＝6.6Hz,4H),4.52(dd,J＝12.1,2.8Hz,1H),5.34(q,J＝6.8Hz,1H),5.56(dd,J＝14.7,9.0Hz,1H),5.92(s,1H),6.49-6.66(m,3H),6.85-6.97(m,2H),7.18(d,J＝1.8Hz,1H),7.23(ddd,J＝7.3,4.8,1.2Hz,1H),7.76(dt,J＝8.1,1.2Hz,1H),7.78-7.91(m,2H),8.00(d,J＝7.1Hz,1H),8.09(d,J＝7.0Hz,1H),8.33(t,J＝6.3Hz,1H),8.44(dt,J＝4.7,1.3Hz,1H),8.50(s,1H)。
SPDB-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(13b)：HRMS(M+H)+计算值1233.4796，实验值1233.4799。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.01-1.22(m,13H),1.27-1.45(m,2H),1.52(s,3H),1.91-2.16(m,1H),2.26(d,J＝7.4Hz,7H),2.26(t,J＝1.9Hz,4H),2.48(t,J＝1.8Hz,2H),2.57-2.65(m,3H),2.65-2.77(m,2H),3.01(s,2H),3.13(d,J＝12.2Hz,1H),3.18(s,3H),3.32-3.47(m,2H),3.86(d,J＝6.7Hz,4H),3.93-4.11(m,3H),4.18(t,J＝11.2Hz,7H),4.39-4.50(m,1H),5.27(d,J＝6.7Hz,1H),5.50(dd,J＝14.7,8.8Hz,1H),5.85(s,1H),6.37-6.61(m,3H),6.81(s,1H),7.11(d,J＝1.8Hz,1H),7.26(t,J＝7.4Hz,2H),7.35(t,J＝7.4Hz,2H),7.45(d,J＝7.5Hz,1H),7.65(t,J＝7.1Hz,2H),7.82(d,J＝7.5Hz,2H),7.89(d,J＝7.3Hz,1H)。
SPDB-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(13c)：HRMS(M+H)+计算值1233.4796，实验值1233.4795。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.02-1.25(m,18H),1.29-1.50(m,6H),1.52(s,3H),1.70-1.87(m,2H),1.87-2.14(m,2H),2.13-2.22(m,2H),2.27-2.40(m,3H),2.63(s,3H),2.69-2.84(m,4H),3.02(s,3H),3.14(d,J＝12.3Hz,1H),3.18(s,3H),3.32-3.45(m,2H),3.85(s,3H),3.95-4.07(m,2H),4.07-4.19(m,4H),4.45(dd,J＝11.9,2.7Hz,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.44-5.55(m,1H),5.85(s,1H),6.42-6.59(m,3H),6.81(s,1H),7.11(s,1H),7.13-7.19(m,1H),7.68(d,J＝8.2,2.7Hz,1H),7.72-7.80(m,1H),7.88(t,J＝6.6Hz,1H),8.04(d,J＝6.4Hz,1H),8.09(d,J＝7.4Hz,1H),8.25(t,J＝6.3Hz,1H),8.37(dd,J＝5.0,1.9Hz,1H)。
SPDB-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(13d)：HRMS(M+H)+计算值1233.4796，实验值1233.4797。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.72(d,J＝3.3Hz,3H),0.98-1.28(m,22H),1.30-1.46(m,3H),1.53(s,3H),1.78(q,J＝7.1Hz,2H),1.86-2.16(m,2H),2.19(q,J＝7.4,5.6Hz,2H),2.26-2.41(m,2H),2.41-2.55(m,4H),2.64(d,J＝3.2Hz,2H),2.81-2.92(m,1H),3.02(s,2H),3.14(d,J＝12.0Hz,1H),3.26(s,1H),3.31-3.48(m,2H),3.86(s,3H),3.97-4.30(m,7H),4.46(dd,J＝11.8,3.2Hz,1H),5.24-5.36(m,1H),5.45-5.62(m,1H),5.86(s,1H),6.40-6.65(m,3H),6.82(d,J＝3.4Hz,1H),7.11(d,J＝3.2Hz,1H),7.18(d,J＝12.1,6.1,4.9Hz,2H),7.69(d,J＝8.1Hz,1H),7.75(t,J＝7.6Hz,2H),7.89(d,J＝7.8,3.2Hz,1H),7.95-8.04(m,2H),8.26(d,J＝6.1Hz,1H),8.33-8.47(m,1H)。
SPDB-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(13g)：HRMS(M+H)+计算值1162.4425，实验值1162.4405。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.08(dt,J＝13.9,6.9Hz,15H),1.15-1.25(m,3H),1.28-1.44(m,5H),1.52(s,3H),1.77(p,J＝7.2Hz,2H),1.91-2.02(m,1H),2.02-2.13(m,1H),2.17(t,J＝7.2Hz,2H),2.22-2.40(m,2H),2.63(s,3H),2.68-2.80(m,3H),3.02(s,3H),3.13(d,J＝12.3Hz,1H),3.18(s,3H),3.33-3.45(m,2H),3.85(s,3H),3.95-4.16(m,5H),4.45(dd,J＝12.1,2.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.44-5.56(m,1H),5.85(s,1H),6.43-6.60(m,3H),6.82(s,1H),7.11(d,J＝1.8Hz,1H),7.12-7.18(m,1H),7.65-7.79(m,2H),8.06-8.16(m,2H),8.30(t,J＝6.3Hz,1H),8.35-8.40(m,1H)。
SPDB-L-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(13f)：HRMS(M+H)+计算值1162.4399，实验值1162.455。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.02-1.13(m,12H),1.14-1.25(m,3H),1.31-1.44(m,5H),1.52(s,3H),1.77(p,J＝7.3Hz,2H),1.97(d,J＝14.3,2.7Hz,1H),2.02-2.13(m,1H),2.17(t,J＝7.2Hz,2H),2.28-2.40(m,3H),2.43(m,J＝3.2Hz,3H),2.63(s,3H),2.69-2.80(m,3H),3.02(s,3H),3.13(d,J＝12.4Hz,1H),3.18(s,3H),3.39(dd,J＝21.0,10.7Hz,2H),3.85(s,3H),3.96-4.18(m,5H),4.45(dd,J＝12.1,2.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.45-5.55(m,1H),5.85(s,1H),6.43-6.60(m,3H),6.81(s,1H),7.10(d,J＝1.8Hz,1H),7.16(t,J＝7.2,4.9Hz,1H),7.68(d,J＝8.1Hz,1H),7.71-7.79(m,1H),8.02-8.15(m,2H),8.28(t,J＝6.3Hz,1H),8.37(d,J＝4.8,1.7Hz,1H)。
SPDB-D-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(13h)：HRMS(M+H)+计算值1162.4399，实验值1162.455。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.02-1.16(m,13H),1.14-1.25(m,3H),1.28-1.49(m,5H),1.52(s,3H),1.77(p,J＝7.2Hz,2H),1.92-2.14(m,2H),2.17(t,J＝7.2Hz,2H),2.23-2.40(m,2H),2.46-2.54(m,1H),2.63(s,3H),2.65-2.85(m,4H),3.02(s,3H),3.03-3.16(m,2H),3.18(s,3H),3.28-3.45(m,2H),3.85(s,3H),3.95-4.20(m,5H),4.45(dd,J＝12.1,2.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.44-5.55(m,1H),5.82-5.88(m,1H),6.42-6.59(m,3H),6.81(s,1H),7.11(d,J＝1.9Hz,1H),7.14-7.20(m,1H),7.67-7.72(m,1H),7.72-7.80(m,1H),7.88(d,J＝7.6Hz,1H),7.99(d,J＝7.1Hz,1H),8.28(t,J＝6.3Hz,1H),8.35-8.40(m,1H)。
SPDB-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)3-CO-DM(13j)：HRMS(M+H)+计算值1203.4337，实验值1203.4315。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),0.94-1.24(m,20H),1.38(s,3H),1.52(s,3H),1.57-1.87(m,1H),1.89-2.08(m,1H),2.26(t,J＝15.1Hz,1H),2.50(d,J＝5.2Hz,2H),2.54-2.79(m,7H),3.05(d,J＝3.8Hz,3H),3.18(s,5H),3.29-3.46(m,3H),3.86(d,J＝6.1Hz,4H),4.00(s,3H),4.05-4.24(m,4H),4.33-4.54(m,1H),5.17-5.38(m,1H),5.39-5.58(m,1H),5.85(s,1H),6.29-6.58(m,4H),6.63(s,1H),6.81(s,1H),7.04-7.19(m,1H),7.90(s,1H),8.14-8.39(m,1H),8.45(s,1H)。
SPDB-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)2-CO-DM(13i)：HRMS(M+H)+计算值1120.3955，实验值1120.3951。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.74-0.82(m,3H),1.10-1.22(m,13H),1.25(d,J＝14.1Hz,1H),1.46(t,J＝10.9Hz,2H),1.56-1.63(m,3H),1.85(ddd,J＝14.4,9.0,5.1Hz,2H),2.00(ddd,J＝14.7,9.3,5.4Hz,9H),2.24(dt,J＝10.8,5.0Hz,2H),2.72(d,J＝3.6Hz,2H),2.94(dq,J＝10.7,7.2,5.7Hz,9H),3.10(d,J＝3.7Hz,3H),3.20(d,J＝3.4Hz,1H),3.25(d,J＝3.6Hz,3H),3.32(d,J＝3.7Hz,1H),3.47(td,J＝10.7,10.0,3.8Hz,2H),3.93(t,J＝4.6Hz,3H),4.02-4.25(m,6H),4.49-4.57(m,1H),5.28-5.37(m,1H),5.53-5.62(m,1H),5.92(d,J＝3.6Hz,1H),6.57(q,J＝5.4,4.5Hz,3H),6.85-6.93(m,1H),7.17(d,J＝3.3Hz,1H),7.25(dq,J＝8.0,4.9Hz,6H),7.72-7.87(m,11H),8.16(dt,J＝15.4,4.9Hz,2H),8.45(tt,J＝9.9,5.9Hz,6H)。
硫代-肽-类美登素
如由HS-(CH2)3CO-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM所例示制备HS-(CH2)3CO-肽-NH-CH2-S-(CH2)n-CO2-DM类型的化合物。
HS-(CH2)3CO-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(14a)：将SPDB-L-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(38mg，0.031mmol)溶解于DMSO(1mL)中，向其中添加DTT(19mg，0.12mmol)于100mM磷酸钾、2mM EDTA pH 7.5缓冲液(1mL)中的溶液。允许反应在室温下在氩气下在磁力搅拌下进行1h。将粗反应在C1830微米30g柱上纯化，用含有0.1％甲酸的去离子水以及历时35min从5％到95％的乙腈线性梯度进行洗脱。立即将含有所需产物的级分冷冻并冻干，得到18.2mg(52.5％产率)的白色固体。HRMS(M+H)+计算值1124.4809；实验值1124.4798。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.78(s,3H),1.12(d,J＝6.4Hz,3H),1.14-1.21(m,10H),1.22-1.30(m,3H),1.37-1.50(m,5H),1.51-1.57(m,1H),1.59(s,3H),1.74(p,J＝7.2Hz,2H),2.04(dd,J＝14.4,2.8Hz,1H),2.09-2.18(m,1H),2.18-2.24(m,2H),2.27(t,J＝7.6Hz,1H),2.38(td,J＝7.1,4.7Hz,2H),2.44(t,J＝7.3Hz,2H),2.70(s,3H),2.79(d,J＝9.6Hz,1H),3.09(s,3H),3.21(d,J＝12.6Hz,1H),3.25(s,3H),3.43(d,J＝12.4Hz,1H),3.49(d,J＝9.0Hz,1H),3.93(s,3H),4.08(ddd,J＝21.6,11.4,4.1Hz,2H),4.13-4.28(m,4H),4.52(dd,J＝12.1,2.8Hz,1H),5.34(q,J＝6.7Hz,1H),5.56(dd,J＝14.7,9.0Hz,1H),5.91(d,J＝1.4Hz,1H),6.48-6.66(m,3H),6.88(s,1H),7.18(d,J＝1.8Hz,1H),7.86(d,J＝7.5Hz,1H),7.96(d,J＝7.3Hz,1H),8.05(d,J＝7.1Hz,1H),8.33(t,J＝6.3Hz,1H)。
HS-(CH2)3CO-D-Ala-L-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(14b)：HRMS(M+Na)+计算值1146.4629，实验值1146.4591。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.03-1.25(m,19H),1.30-1.45(m,6H),1.52(s,4H),1.65(p,J＝7.3Hz,2H),1.91-2.02(m,1H),2.02-2.13(m,1H),2.12-2.19(m,4H),2.29-2.39(m,4H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.6Hz,1H),3.02(s,3H),3.14(d,J＝12.5Hz,1H),3.33-3.47(m,2H),3.86(s,3H),4.01(td,J＝10.4,9.7,4.3Hz,2H),4.04-4.16(m,5H),4.45(dd,J＝12.0,2.9Hz,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.43-5.56(m,1H),5.85(s,1H),6.38-6.61(m,4H),6.81(s,1H),7.11(d,J＝1.8Hz,1H),7.82(d,J＝7.7Hz,1H),7.97(t,J＝6.3Hz,1H),8.10(d,J＝6.0Hz,1H),8.25(d,J＝6.9Hz,1H)。
HS-(CH2)3CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(14c)：HRMS(M+Na)+计算值1146.4629，实验值1146.4553。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),0.99-1.26(m,21H),1.31-1.45(m,5H),1.52(s,3H),1.67(p,J＝7.2Hz,2H),1.89-2.02(m,1H),2.02-2.24(m,4H),2.25-2.46(m,3H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.7Hz,1H),3.02(s,3H),3.18(s,3H),3.32-3.51(m,2H),3.86(s,3H),3.96-4.18(m,7H),4.45(dd,J＝12.0,2.9Hz,1H),5.27(q,J＝6.8Hz,1H),5.44-5.63(m,1H),5.85(s,1H),6.37-6.59(m,4H),6.81(s,1H),7.11(d,J＝1.8Hz,1H),7.89(d,J＝7.7Hz,1H),8.03(d,J＝6.5Hz,1H),8.08(d,J＝7.3Hz,1H),8.27(t,J＝6.3Hz,1H)。
HS-(CH2)3CO-L-Ala-L-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(14d)：HRMS(M+Na)+计算值1146.4629，实验值1146.4519。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),0.95-1.24(m,20H),1.27-1.45(m,5H),1.52(s,3H),1.67(p,J＝7.3Hz,2H),1.93-2.01(m,1H),2.02-2.22(m,4H),2.22-2.41(m,5H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.6Hz,1H),3.02(s,3H),3.18(s,4H),3.39(dd,J＝21.4,10.7Hz,2H),3.86(s,3H),3.94-4.24(m,6H),4.45(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.44-5.57(m,1H),5.85(s,1H),6.37-6.65(m,3H),6.81(s,1H),7.11(d,J＝1.8Hz,1H),7.89(d,J＝7.6Hz,1H),7.93-8.05(m,2H),8.26(t,J＝6.4Hz,1H)。
HS-(CH2)3CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(14g)：HRMS(M+H)+计算值1053.4438，实验值1053.4426。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.01-1.15(m,13H),1.15-1.27(m,3H),1.31-1.44(m,5H),1.53(s,3H),1.67(p,J＝7.1Hz,2H),1.93-2.03(m,1H),2.03-2.23(m,4H),2.22-2.41(m,5H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.7Hz,1H),3.02(s,3H),3.14(d,J＝12.5Hz,1H),3.18(s,3H),3.32-3.46(m,2H),3.86(s,3H),3.92-4.20(m,6H),4.45(dd,J＝11.9,2.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.42-5.58(m,1H),5.85(s,1H),6.42-6.60(m,3H),6.81(s,1H),7.12(d,J＝1.8Hz,1H),8.05(d,J＝6.5Hz,1H),8.10(d,J＝7.8Hz,1H),8.30(t,J＝6.3Hz,1H)。
HS-(CH2)3CO-L-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(14f)：HRMS(M+H)+计算值1053.4366，实验值1053.4438。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.02-1.14(m,13H),1.19(t,J＝9.7Hz,3H),1.31-1.43(m,6H),1.53(s,3H),1.67(p,J＝7.3Hz,2H),1.91-2.02(m,1H),2.02-2.22(m,4H),2.34-2.39(m,4H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.5Hz,1H),3.02(s,3H),3.19(d,J＝4.2Hz,4H),3.30-3.47(m,2H),3.86(s,3H),3.94-4.20(m,6H),4.45(d,J＝11.8,2.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.44-5.56(m,1H),5.85(s,1H),6.40-6.61(m,3H),6.81(s,1H),7.12(s,1H),8.03(d,J＝6.5Hz,1H),8.08(d,J＝7.8Hz,1H),8.29(t,J＝6.2Hz,1H)。
HS-(CH2)3CO-D-Ala-D-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(14h)：HRMS(M+H)+计算值1053.4366，实验值1053.4438。1H NMR(400MHz,DMSFO-d6)δ0.71(s,3H),1.02-1.15(m,13H),1.14-1.24(m,3H),1.30-1.45(m,5H),1.53(s,3H),1.67(p,J＝7.1Hz,2H),1.90-2.01(m,1H),2.01-2.24(m,4H),2.27-2.33(m,1H),2.33-2.42(m,4H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.7Hz,1H),3.02(s,3H),3.10-3.21(m,4H),3.33-3.46(m,2H),3.86(s,3H),3.95-4.18(m,6H),4.45(dd,J＝11.9,2.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.44-5.55(m,1H),5.85(s,1H),6.42-6.59(m,3H),6.81(s,1H),7.12(d,J＝1.8Hz,1H),8.05(d,J＝6.5Hz,1H),8.10(d,J＝7.8Hz,1H),8.30(t,J＝6.3Hz,1H)。
HS-(CH2)3CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)3-CO-DM(14j)：HRMS(M+H)+计算值1096.4496，实验值1096.4464。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.78(s,3H),1.02-1.31(m,19H),1.35-1.55(m,2H),1.60(s,3H),1.74(p,J＝7.4Hz,3H),1.78-1.93(m,1H),2.14-2.33(m,4H),2.41-2.49(m,2H),2.71(s,3H),2.80(d,J＝9.6Hz,1H),3.12(s,3H),3.22(d,J＝12.7Hz,1H),3.26(s,3H),3.47(dd,J＝21.3,10.6Hz,2H),3.93(s,4H),4.03-4.13(m,3H),4.13-4.25(m,3H),4.52(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),5.35(q,J＝6.8Hz,1H),5.50-5.64(m,1H),5.92(s,1H),6.47-6.69(m,4H),6.88(s,1H),7.18(d,J＝1.7Hz,1H),7.94(d,J＝7.3Hz,1H),8.09(d,J＝6.4Hz,1H),8.15(d,J＝7.3Hz,1H),8.32(t,J＝6.3Hz,1H)。
HS-(CH2)3CO-(CH2)3-CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)2-CO-DM(14i)：HRMS(M+H)+计算值1011.3969，实验值1011.3961。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.77(s,3H),1.12(d,J＝6.4Hz,3H),1.17(dd,J＝7.0,5.1Hz,9H),1.25(d,J＝13.0Hz,1H),1.40-1.51(m,2H),1.59(s,3H),1.74(q,J＝7.2Hz,2H),2.00-2.08(m,1H),2.23(dt,J＝16.8,7.6Hz,3H),2.43(q,J＝7.4Hz,2H),2.62-2.69(m,1H),2.72(s,3H),2.76-2.88(m,2H),3.10(s,3H),3.20(d,J＝12.6Hz,1H),3.25(s,3H),3.31(s,3H),3.39-3.54(m,2H),3.93(s,3H),4.01-4.26(m,5H),4.53(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),5.32(q,J＝6.8Hz,1H),5.49-5.63(m,1H),5.92(d,J＝1.4Hz,1H),6.48-6.62(m,3H),6.88(s,1H),7.18(d,J＝1.8Hz,1H),8.10(d,J＝6.5Hz,1H),8.16(d,J＝7.7Hz,1H),8.41(t,J＝6.3Hz,1H)。
NHS-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Imm-C6-May
如由HOOC-(CH2)3-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM所例示制备HOOC-(CH2)3-CO-肽-NH-CH2-S-(CH2)n-CO2-DM类型的化合物。
HOOC-(CH2)3-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(19a)：将L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(17.25mg，0.017mmol)用戊二酸酐(38.5mg，0.337mmol)处理并且在室温下在磁力搅拌下在氩气下反应过夜。将粗反应物通过HPLC纯化，使用XDB-C18 21.2x 5mm 5微米柱，在20ml/min下用含有0.1％甲酸的去离子水以及历时30min从5％到95％的乙腈线性梯度进行洗脱。立即将含有纯所需产物的级分合并，冷冻并冻干，得到3mg(15％产率)的白色固体。HRMS(M+H)+计算值1136.4987，实验值1136.4954。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),0.92-1.27(m,20H),1.26-1.48(m,5H),1.52(s,3H),1.63(q,J＝7.1Hz,2H),1.83-2.20(m,7H),2.23-2.41(m,5H),2.63(s,4H),2.73(d,J＝9.5Hz,1H),3.02(s,3H),3.36-3.50(m,2H),3.86(s,3H),3.91-4.24(m,7H),4.45(d,J＝11.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.41-5.57(m,1H),5.86(s,1H),6.32-6.66(m,3H),6.81(s,1H),7.12(s,1H),8.06(t,J＝9.1Hz,2H),8.35(d,J＝11.6Hz,1H),8.62(s,1H)。
HOOC-(CH2)3-CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(19g)：HRMS(M+H)+计算值1136.4987，实验值1136.4962。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),0.97-1.14(m,13H),1.14-1.26(m,3H),1.28-1.45(m,5H),1.52(s,3H),1.62(p,J＝7.5Hz,2H),1.93-2.00(m,1H),2.08(dt,J＝13.1,7.4Hz,6H),2.25-2.41(m,3H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.5Hz,1H),3.02(s,3H),3.18(s,3H),3.31-3.48(m,2H),3.86(s,3H),3.93-4.19(m,6H),4.45(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.8Hz,1H),5.43-5.58(m,1H),5.85(s,1H),6.40-6.61(m,3H),6.81(s,1H),7.11(d,J＝1.8Hz,1H),8.03(d,J＝6.5Hz,1H),8.13(d,J＝7.8Hz,1H),8.34(t,J＝6.3Hz,1H),11.94(s,1H)。
HOOC-(CH2)3-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)3-CO-DM(19i)：HRMS(M+H)+计算值1108.4674，实验值1108.4634。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.78(s,3H),1.04-1.32(m,16H),1.45(d,J＝12.6Hz,2H),1.60(s,3H),1.69(p,J＝7.2Hz,3H),1.77-1.95(m,1H),1.99-2.07(m,1H),2.11-2.20(m,4H),2.20-2.39(m,1H),2.55(s,1H),2.71(s,3H),2.80(d,J＝9.5Hz,1H),3.12(s,3H),3.40(d,J＝21.0Hz,8H),3.49(d,J＝9.1Hz,1H),3.93(s,3H),4.02-4.27(m,6H),4.48-4.61(m,1H),5.34(q,J＝6.6Hz,1H),5.48-5.65(m,1H),5.92(s,1H),6.50-6.71(m,3H),6.88(s,1H),7.18(s,1H),7.99(d,J＝7.6Hz,1H),8.08(d,J＝6.5Hz,1H),8.22(d,J＝7.4Hz,1H),8.30(s,1H),8.42(s,1H)。
如由NHS-OOC-(CH2)3-CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM所例示制备NHS-OOC-(CH2)3-CO-肽-NH-CH2-S-(CH2)n-CO2-DM类型的化合物。
NHS-OOC-(CH2)3-CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(20g)：将HOOC-(CH2)3-CO-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(8mg 7.5μmol)溶解于DMSO(1mL)中，用NHS(0.9mg，7.51μmol)和EDC(1.4mg，7.51μmol)处理。允许反应在室温下在氩气氛围下在磁力搅拌下进行2小时。将粗物质经由HPLC纯化，使用XDB-C18 21.2x 5mm 5μm柱，在20ml/min下用含有0.1％甲酸的去离子水以及历时30min从5％到95％的乙腈线性梯度进行洗脱。将含有所需产物的级分合并并且立即冷冻，然后冻干，得到6.5mg(74％产率)的白色固体。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.00-1.14(m,13H),1.14-1.25(m,3H),1.29-1.46(m,5H),1.52(s,3H),1.75(p,J＝7.5Hz,2H),1.92-2.12(m,2H),2.16(t,J＝7.3Hz,2H),2.22-2.39(m,3H),2.62(d,J＝10.8Hz,5H),2.73(d,J＝10.5Hz,5H),3.02(s,3H),3.18(s,3H),3.32-3.47(m,2H),3.86(s,3H),3.95-4.19(m,6H),4.45(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.8Hz,1H),5.42-5.57(m,1H),5.82-5.87(m,1H),6.41-6.60(m,4H),6.81(s,1H),7.11(d,J＝1.7Hz,1H),8.05(d,J＝6.5Hz,1H),8.10(d,J＝7.7Hz,1H),8.20(d,J＝4.8Hz,1H),8.29(t,J＝6.3Hz,1H)。
NHS-OOC-(CH2)3-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(20g)：HRMS(M+H)+计算值1233.5151，实验值1233.5135。
NHS-OOC-(CH2)3-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)3-CO-DM(20i)：HRMS(M+H)+计算值1205.4838，实验值1205.4808。
如由H2N-O-CH2-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM所例示制备H2N-O-CH2-CO-肽-NH-CH2-S-(CH2)n-CO2-DM类型的化合物。
H2N-O-CH2-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(22c)：
将H2N-L-Ala-D-Ala-L-Ala-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(23mg，0.022mmol)溶解于DMF(1mL)中，用FMoc-氨基氧基乙酸(14.09mg，0.045mmol)和EDC(8.62mg，0.045mmol处理。允许反应在室温下在氩气氛围下在磁力搅拌下进行3h。将所述粗物质用20％吗啉DMF溶液(1mL)处理并且允许反应进行2h。将粗物质经由半制备型HPLC纯化，使用XDB-C18 21.2x 5mm 5μm，在20ml/min下用含有0.1％甲酸的去离子水以及历时30min从5％到95％的乙腈线性梯度进行洗脱。将含有所需产物的级分汇集起来并且立即冷冻，然后冻干，得到5.5mg(22％产率)的白色固体。HRMS(M+H)+计算值1095.4834，实验值1095.4795。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.00-1.14(m,13H),1.14-1.25(m,6H),1.31-1.43(m,4H),1.52(s,3H),1.92-2.02(m,1H),2.02-2.14(m,1H),2.23-2.39(m,3H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.6Hz,1H),3.02(s,3H),3.14(d,J＝12.5Hz,1H),3.18(s,3H),3.29-3.46(m,3H),3.86(s,3H),3.90(d,J＝2.0Hz,2H),3.95-4.20(m,6H),4.25(p,J＝7.7,7.2Hz,1H),4.45(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.8Hz,1H),5.44-5.58(m,1H),5.85(s,1H),6.30(s,2H),6.43-6.60(m,3H),6.81(s,1H),7.12(d,J＝1.7Hz,1H),7.82(d,J＝7.4Hz,1H),7.97(d,J＝7.6Hz,1H),8.10(d,J＝7.2Hz,1H),8.29(t,J＝6.3Hz,1H)。
H2N-O-CH2CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)3-CO-DM(22i)：HRMS(M+H)+计算值1067.4521，实验值1067.4484。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.01-1.26(m,18H),1.30-1.46(m,2H),1.52(s,3H),1.55-1.69(m,1H),1.69-1.84(m,1H),1.97(d,J＝14.4,2.8Hz,1H),2.15-2.31(m,1H),2.56-2.61(m,1H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.6Hz,1H),3.04(s,3H),3.14(d,J＝12.6Hz,1H),3.18(s,3H),3.36(d,J＝12.3Hz,1H),3.42(dd,J＝9.1,3.3Hz,1H),3.85(s,3H),3.90(d,J＝2.3Hz,2H),3.95-4.05(m,3H),4.06-4.17(m,2H),4.15-4.35(m,2H),4.45(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.44-5.56(m,1H),5.85(s,1H),6.30(s,2H),6.42-6.61(m,3H),6.81(s,1H),7.11(d,J＝1.7Hz,1H),7.82(d,J＝7.3Hz,1H),7.96(d,J＝7.6Hz,1H),8.11(d,J＝7.2Hz,1H),8.22-8.40(m,1H)。
Mal-(CH2)3-CO-L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(23c)：将H2N-L-Ala-D-Ala-L-Ala-CH2-S-(CH2)5-CO-DM(8mg，7.82μmol)溶解于DMF(2mL)中，用3-马来酰亚胺基丙酸(1.32mg，7.82mol)、EDC(2.25mg，0.012mmol)以及HOBt(1.198mg，7.82μmol)处理。允许反应在室温下在氩气氛围下在磁力搅拌下进行2h。将粗物质经由半制备型HPLC纯化，使用XDB-C18 21.2x5mm 5μm，在20ml/min下用含有0.1％甲酸的去离子水以及历时30min从5％到95％的乙腈线性梯度进行洗脱。立即将含有所需产物的级分合并并且冷冻，然后冻干，得到1.8mg(19.60％产率)的白色固体。HRMS(M+H)+计算值1173.4940，实验值1173.4931。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.02-1.14(m,15H),1.16-1.25(m,3H),1.30-1.44(m,5H),1.52(s,3H),1.92-2.03(m,1H),2.03-2.17(m,1H),2.23-2.39(m,4H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.6Hz,1H),3.02(s,3H),3.18(s,4H),3.33-3.46(m,2H),3.52(t,J＝7.3Hz,2H),3.86(s,3H),3.95-4.17(m,7H),4.45(dd,J＝12.0,2.9Hz,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.44-5.56(m,1H),5.85(s,1H),6.39-6.64(m,3H),6.81(s,1H),6.86(s,1H),6.92(s,2H),7.11(d,J＝1.7Hz,1H),7.89(d,J＝7.4Hz,1H),8.10(d,J＝7.3Hz,1H),8.17(d,J＝6.7Hz,1H),8.28(t,J＝6.3Hz,1H),8.43(s,1H)。
Mal2-LAla-D-Ala-L-Ala-Imm-C6-May
Mal-C5-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Imm-C6-May：L-Ala-D-Ala-L-Ala-CH2-S-(CH2)5-CO-MayNMA(化合物I-1a)(25mg，0.024mmol)与6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(7.54mg，0.024mmol)之间的反应产生Mal-C5-L-Ala-D-Ala-L-Ala-Imm-C6-May(化合物I-2a)(20.8mg，0.017mmol，70.0％产率)。
LRMS(M+H)+计算值1215.52，实验值1216.4。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.05(d,J＝6.4Hz,3H),1.07-1.14(m,14H),1.15-1.25(m,3H),1.39(t,J＝9.2Hz,10H),1.52(s,3H),2.01(t,J＝7.6Hz,3H),2.26(t,J＝1.9Hz,1H),2.28-2.38(m,2H),2.57-2.62(m,1H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.6Hz,1H),3.02(s,3H),3.14(d,J＝12.5Hz,1H),3.18(s,3H),3.29(t,J＝7.1Hz,2H),3.36(d,J＝12.5Hz,1H),3.42(d,J＝9.0Hz,1H),3.86(s,3H),3.96-4.05(m,1H),4.04-4.15(m,4H),4.41-4.48(m,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.46-5.54(m,1H),5.82-5.88(m,1H),6.47-6.50(m,2H),6.54(t,J＝11.4Hz,2H),6.82(s,1H),6.92(s,2H),7.11(d,J＝1.8Hz,1H),7.86-7.93(m,2H),7.95(s,1H),8.05(d,J＝7.4Hz,1H),8.24(t,J＝6.2Hz,1H)。
Mal-(CH2)2-PEG2-CO-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-MayNMA
-(CH2)2-PEG2-CO-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-MayNMA：
L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-MayNMA(化合物I-1a)(25mg，0.024mmol)与Mal-酰胺基-PEG2-NHS(10.40mg，0.024mmol)之间的反应产生Mal-(CH2)2-PEG2-CO2-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-MayNMA(化合物I-3a)(14.1mg，10.58μmol，43.3％产率)。
LRMS(M+H)+计算值1332.58，实验值1332.95。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,4H),1.05(d,J＝6.3Hz,4H),1.07-1.14(m,15H),1.18(d,J＝9.0Hz,2H),1.37(d,J＝11.8Hz,6H),1.52(s,3H),2.23-2.38(m,5H),2.63(s,4H),2.72(d,J＝9.7Hz,1H),3.02(s,3H),3.07(q,J＝5.7Hz,2H),3.18(s,3H),3.39(s,4H),3.41(d,J＝9.9Hz,2H),3.47-3.56(m,4H),3.86(s,4H),3.95-4.08(m,2H),4.08-4.19(m,3H),4.41-4.51(m,1H),5.23-5.31(m,1H),5.44-5.54(m,1H),5.85(s,1H),6.46-6.50(m,2H),6.54(t,J＝11.3Hz,2H),6.83(s,1H),6.93(s,2H),7.12(s,1H),7.88-8.00(m,2H),8.01-8.08(m,2H),8.27(t,J＝6.2Hz,1H)。
Mal-(CH2)2-PEG4-CO-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-MayNMA
Mal-(CH2)2-PEG4-CO2-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-MayNMA：
L-Ala-D-Ala-L-Ala-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-MayNMA(化合物I-1a)(25mg，0.024mmol)与Mal-酰胺基-PEG4-NHS(12.55mg，0.024mmol)之间的反应产生Mal-(CH2)2-PEG4-CO2-L-Ala-D-Ala-L-ALa-NH-CH2-S-(CH2)5-CO-May NMA Mal-PEG4-CO2-C6-LDL-DM(化合物I-3b)(22.3mg，0.016mmol，64.2％产率)。
LRMS(M+H)+计算值1420.63，实验值1420.06
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,4H),1.05(d,J＝6.4Hz,3H),1.07-1.16(m,14H),1.19(t,J＝8.1Hz,2H),1.31-1.50(m,2H),1.52(s,4H),1.98(s,1H),2.02-2.17(m,2H),2.20-2.40(m,7H),2.63(s,4H),2.73(d,J＝9.6Hz,1H),3.02(s,3H),3.05-3.12(m,2H),3.18(s,3H),3.28-3.36(m,1H),3.37-3.45(m,15H),3.47-3.57(m,4H),3.86(s,4H),3.94-4.08(m,2H),4.12(ddt,J＝14.5,7.3,3.6Hz,4H),4.41-4.49(m,1H),5.27(q,J＝6.7Hz,1H),5.45-5.55(m,1H),5.86(s,1H),6.42-6.60(m,4H),6.83(s,1H),6.94(s,1H),7.12(d,J＝1.8Hz,1H),7.89-8.00(m,2H),8.00-8.09(m,2H),8.26(t,J＝6.2Hz,1H)。
实施例3.代谢产物的合成
DM-CO-(CH2)5-SH(24a)：在室温下在磁力搅拌下向DM-H储备溶液(1.5mL，0.100mmol)中添加EDC(29mg，0.150mmol)和DIPEA(17.5μL，0.100mmol)持续10min。然后添加6-巯基己酸(13.8μL，0.100mmol)。在30min之后，将粗物质经由半制备型HPLC纯化，使用XDB-C18 21.2x 5mm 5μm，在20ml/min下用含有0.1％甲酸的去离子水以及历时30min从5％到95％的乙腈线性梯度进行洗脱。立即将含有所需产物的级分合并并且冷冻，然后冻干，得到12mg(15％产率)的白色固体。HRMS(M+H)+计算值780.3291，实验值780.3281。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.79(s,3H),1.06-1.21(m,5H),1.21-1.57(m,6H),1.60(s,2H),2.00-2.12(m,2H),2.12-2.27(m,2H),2.27-2.37(m,2H),2.50(s,4H),2.70(s,3H),2.74-2.91(m,2H),2.91-3.09(m,1H),3.10(s,2H),3.19-3.24(m,2H),3.26(s,3H),3.39-3.53(m,2H),3.94(s,3H),4.03-4.11(m,1H),4.52(dd,J＝12.0,2.9Hz,1H),5.35(q,J＝6.8Hz,1H),5.52-5.62(m,1H),5.93(d,J＝1.3Hz,1H),6.49-6.67(m,3H),6.89(s,1H),7.20(d,J＝1.8Hz,1H)。
DM-CO-(CH2)5-SMe(25a)：将DM-CO-(CH2)5-SH(12mg，0.015mmol)溶解于DMF(2mL)中，用DIPEA(24μL，0.139mmol)和碘甲烷(2.88μL，0.046mmol)处理，允许反应在室温下在氩气下进行2h。以流速20ml/min将粗物质经由XDB-C18 21.2x 5mm 5μm柱纯化。在20ml/min下使用含0.1％甲酸的去离子水以及历时30min从5％到95％的乙腈线性梯度。立即将含有所需产物的级分合并，冷冻，然后冻干，得到2mg(16％产率)的白色固体。HRMS(M+H)+计算值794.3448，实验值794.3440。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.01-1.13(m,6H),1.13-1.27(m,3H),1.27-1.50(m,6H),1.53(s,3H),1.87(s,2H),1.93-2.04(m,2H),2.04-2.15(m,1H),2.15-2.27(m,2H),2.27-2.41(m,1H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.6Hz,1H),3.02(s,3H),3.10-3.22(m,5H),3.33-3.49(m,2H),3.86(s,3H),3.94-4.06(m,1H),4.45(dd,J＝12.1,2.8Hz,1H),5.28(q,J＝6.7Hz,1H),5.44-5.56(m,1H),5.85(s,1H),6.42-6.62(m,3H),6.81(s,1H),7.13(d,J＝1.7Hz,1H)。
DM-CO-(CH2)3-SSPy(26)：DM-CO-(CH2)3-SSPy(3267-50-R1)：在室温下在磁力搅拌下将SPDB(30.1mg，0.092mmol)添加至DM-H储备溶液(0.81mL，0.046mmol)中。在30min之后，将溶液以流速20ml/min在XDB-C18 21.2x 5mm 5μm柱上纯化。在20ml/min下使用含0.1％甲酸的去离子水以及历时30min从5％到95％的乙腈线性梯度。立即将含有所需产物的级分合并，冷冻，然后冻干，得到6mg(15％产率)的白色固体。HRMS(M+H)+计算值861.2964，实验值861.2963。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.70(s,3H),1.02-1.12(m,7H),1.13-1.21(m,1H),1.31-1.45(m,3H),1.52(s,3H),1.70-1.90(m,2H),1.96(dd,J＝14.2,2.9Hz,1H),2.19-2.31(m,1H),2.62(s,3H),2.68-2.81(m,4H),3.00(s,2H),3.18(s,4H),3.34(d,J＝12.4Hz,1H),3.41(d,J＝9.1Hz,1H),3.87(s,3H),4.00(t,J＝11.2Hz,1H),4.44(dd,J＝12.0,2.9Hz,1H),5.25(q,J＝6.8Hz,1H),5.41-5.52(m,1H),5.85(s,1H),6.43-6.53(m,3H),6.81(s,1H),7.09(d,J＝1.8Hz,1H),7.12-7.19(m,1H),7.50-7.61(m,1H),7.66-7.76(m,1H),8.31-8.39(m,1H)。
DM-CO-(CH2)3-SH(24b)：将DM-CO-(CH2)3-SSPy(6mg，6.96μmol)添加至DTT(1.1mg，6.96μmol)于2:1DMSO:磷酸钾2mM EDTA pH 7.5缓冲液(0.5mL)中的溶液中并且在室温下磁力搅拌20min。将粗溶液以流速20ml/min在XDB-C18 21.2x 5mm 5μm柱上纯化。在20ml/min下使用含0.1％甲酸的去离子水以及历时30min从5％到95％的线性梯度的乙腈。立即将含有所需产物的级分合并，冷冻，然后冻干，得到5mg(95％产率)的白色固体。HRMS(M+H)+计算值752.2978，实验值752.2962。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(d,J＝1.9Hz,3H),1.08(dd,J＝18.6,6.6Hz,7H),1.18(d,J＝12.4Hz,2H),1.27-1.49(m,3H),1.52(d,J＝2.7Hz,4H),1.55-1.68(m,1H),1.77(J＝14.2,8.5,6.5Hz,1H),1.91-2.05(m,1H),2.15(t,J＝7.9Hz,1H),2.38(s,2H),2.44-2.60(m,1H),2.64(s,2H),2.66-2.84(m,1H),3.03(d,J＝12.6Hz,3H),3.09-3.18(m,1H),3.18(s,3H),3.36(d,J＝12.2Hz,1H),3.42(d,J＝9.0Hz,1H),3.86(s,2H),3.93-4.08(m,1H),4.45(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),5.27(q,1H),5.42-5.58(m,1H),5.85(d,J＝1.3Hz,1H),6.40-6.61(m,4H),6.81(s,1H),7.12(d,J＝1.8Hz,1H)。
DM-CO-(CH2)3-SMe(25b)：将DM-CO-(CH2)3-SH(5mg，6.65μmol)溶解于无水DMF(0.3mL)中，在室温下在磁力搅拌下向其中添加DIPEA(3.57μL，0.020mmol)和碘甲烷(1.2μL，0.020mmol)。在1h之后，将粗溶液以流速20ml/min在XDB-C18 21.2x 5mm 5μm柱上纯化。在20ml/min下使用含0.1％甲酸的去离子水以及历时30min从5％到95％的线性梯度的乙腈。立即将含有所需产物的级分合并，冷冻，然后冻干，得到1mg(19％产率)的白色固体。HRMS(M+H)+计算值766.3135，实验值766.3121。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ0.71(s,3H),1.08(dd,J＝18.1,6.6Hz,7H),1.18(d,J＝12.9Hz,1H),1.30-1.47(m,2H),1.53(s,3H),1.56-1.68(m,1H),1.68-1.78(m,1H),1.78(s,3H),1.91-2.05(m,1H),2.18-2.31(m,1H),2.33-2.41(m,2H),2.63(s,3H),2.73(d,J＝9.7Hz,1H),3.05(s,3H),3.18(s,4H),3.33-3.48(m,2H),3.86(s,3H),4.00(t,J＝11.5Hz,1H),4.45(dd,J＝12.1,2.8Hz,1H),5.28(q,J＝6.7Hz,1H),5.43-5.57(m,1H),5.85(s,1H),6.41-6.62(m,3H),6.81(s,1H),7.12(d,J＝1.8Hz,1H),8.47(s,1H)。
实施例4.ADC(16a-16i、17a-17i、18a-18i)的制备.
用于制备ADC(16a-16i、17a-17i、18a-18i)的类美登素溶液的制备
将磺基-GMBS和带有硫醇的化合物(14a-14j)中的一者溶解于3:7(50mM琥珀酸钠，pH 5.0:DMA)的溶液中，各自分别得到1.5mM和1.9mM的浓度。将溶液在室温下轻轻搅拌30min，然后通过在轻柔搅拌下将溶液放至0.5mM N-乙基马来酰亚胺(NEM)中持续10min来将过量硫醇骤冷。
ADC(16a-16i、17a-17i、18a-18i)的制备
向抗体(2.5mg/mL)于含有15体积％的N,N-二甲基乙酰胺(DMA)，pH 8.0的60mMEPPS中的溶液中添加6.5摩尔当量的类美登素溶液。在16h之后，将反应混合物使用NAP-G25柱纯化，NAP-G25柱为经过预平衡的并且用10mM琥珀酸钠，pH 5.5、250mM甘氨酸、0.5％蔗糖以及0.01％吐温-20缓冲液进行操作。如先前由Widdison W.等J Med Chem(2006)49,4392-408所描述对纯化的缀合物进行分析，以测定类美登素/抗体比率(MAR)、聚集的缀合物的百分比、游离类美登素水平以及内毒素单位(EU)。在所有缀合物中蛋白质聚集物水平低于3％，游离类美登素水平低于1％并且内毒素水平低于0.2EU/mg。
使用ADC 1a-1d和4a-4c作为比较物来评估本发明的缀合物。如由Widdison W.等,Bioconjugate Chem.,(2015),26,2261-2278所描述制备ADC 1a-1d和4a-4c。
C242-sGMBS-LDL-DM(ADC 18c)的制备
在缀合之前，如下制备sGMBS-LDL-DM：在琥珀酸盐缓冲液pH5.0存在下，将磺基-GMBS(图4中的化合物15)于N-N-二甲基乙酰胺(DMA，SAFC)中的储备溶液与LDL-DM(图3中的化合物14c)于DMA中的储备溶液混合，以获得60/40有机/水溶液以及1.5mM磺基-GMBS和1.95mM LDL-DM的最终浓度。将反应物在25℃下孵育10min。将粗sGMBS-LDL-DM混合物添加至一种溶液中，所述溶液含有于磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4，外加300mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)pH 8.0的5x溶液和15％DMA(v/v)中的C242抗体，达到7.5mol磺基-GMBS-LDL-DM比1mol C242抗体的最终比率。将反应物在25℃下孵育过夜。
使用NAP脱盐柱(GE Healthcare)将反应物纯化至10mM琥珀酸盐、250mM甘氨酸、0.5％蔗糖、0.01％吐温20，pH 5.5配制缓冲液中，并且经具有0.22μm PVDF膜的针筒过滤器过滤。
通过UV-Vis发现纯化的缀合物具有每摩尔抗体3.8mol LDL-DM，通过SEC发现95％的单体，并且通过HPLC Hisep柱分析发现游离药物低于1％。图20中示出了C242-sGMBS- LDL-DM的SEC/MS图谱。
ML66-sGMBS-LDL-DM(ADC 16c)的制备
在缀合之前，如下制备sGMBS-LDL-DM：在琥珀酸盐缓冲液pH5.0存在下，将磺基-GMBS(图4中的化合物15)于N-N-二甲基乙酰胺(DMA，SAFC)中的储备溶液与LDL-DM(图3中的化合物14c)于DMA中的储备溶液混合，以获得60/40有机/水溶液以及1.5mM磺基-GMBS和1.95mM LDL-DM的最终浓度。将反应物在25℃下孵育10min。将粗sGMBS-LDL-DM混合物添加至一种溶液中，所述溶液含有于磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4外加300mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)pH 8.0的5x溶液和15％DMA(v/v)中的ML66抗体，达到8.0mol磺基-GMBS-LDL-DM比1mol ML66抗体的最终比率。
将反应物在25℃下孵育过夜。
使用NAP脱盐柱(GE Healthcare)将反应物纯化至10mM琥珀酸盐、250mM甘氨酸、0.5％蔗糖、0.01％吐温20，pH 5.5配制缓冲液中，并且经具有0.22μm PVDF膜的针筒过滤器过滤。
通过UV-Vis发现纯化的缀合物具有每摩尔抗体3.7mol LDL-DM，通过SEC发现98％的单体，并且通过HPLC Hisep柱分析发现游离药物低于1％。图21中示出了C242-sGMBS- LDL-DM的SEC/MS图谱。
M9346A-sGMBS-LDL-DM(缀合物17c)的制备
在缀合之前，如下制备sGMBS-LDL-DM(图4中的化合物15)：在琥珀酸盐缓冲液pH5.0存在下，将磺基-GMBS于N-N-二甲基乙酰胺(DMA，SAFC)中的储备溶液与LDL-DM(图3中的化合物14c)于DMA中的储备溶液混合，以获得60/40有机/水溶液以及3mM磺基-GMBS和3.9mMLDL-DM的最终浓度。将反应物在25℃下孵育2h。将粗sGMBS-LDL-DM混合物添加至一种溶液中，所述溶液含有于磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4外加300mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)pH 8.5的5x溶液和10％DMA(v/v)中的M9346A抗体，达到9.5mol磺基-GMBS-LDL-DM比1mol M9346A抗体的最终比率。将反应物在25℃下孵育过夜。
使用NAP脱盐柱(GE Healthcare)将反应物纯化至10mM琥珀酸盐、250mM甘氨酸、0.5％蔗糖、0.01％吐温20，pH 5.5制剂缓冲液中，并且经具有0.22μm PVDF膜的针筒过滤器过滤。
通过UV-Vis发现纯化的缀合物具有每摩尔抗体3.7mol LDL-DM，通过SEC发现99％的单体，并且通过SEC/逆相HPLC双柱分析发现游离药物低于1％。图22中示出了C242- sGMBS-LDL-DM的SEC/MS图谱。
M9346A-C442-MalC5-LDL-DM(缀合物26c)的制备
将含M9346A-C442(在位置442处具有工程化Cys的抗叶酸剂抗体)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4(Life Technologies)用50摩尔当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP，Sigma-Aldrich)处理并且在37℃下孵育1h。通过NAP脱盐柱(GE Healthcare)移除TCEP，并且将100摩尔当量的去氢抗坏血酸(Sigma-Aldrich)添加至于PBS pH 7.4、2mM EDTA(Sigma-Aldrich)中的纯化的还原的M9346A-C442中，并且在25℃下孵育90分钟至4小时。将经过还原并且再氧化的抗体溶液立即用于缀合至MalC5-LDL-DM(上文所示的化合物I-2a)。
向再氧化的M9346A-C442抗体中外加PBS pH 6.0、2mM EDTA，并且在含有10％N-N-二甲基乙酰胺(DMA，SAFC)和5当量的MalC5-LDL-DM的90％水溶液中进行缀合。将反应物在25℃下孵育过夜。
在反应后，使用NAP脱盐柱(GE Healthcare)将缀合物纯化至10mM乙酸盐、9％蔗糖、0.01％吐温-20，pH 5.0配制缓冲液中，并且经具有0.22μm PVDF膜的针筒过滤器过滤。
通过UV-Vis发现纯化的缀合物具有每摩尔抗体2mol LDL-DM，通过SEC发现97％的单体，并且通过SEC/逆相HPLC双柱分析发现游离药物低于3％。图23中示出了C242-sGMBS-LDL-DM的SEC/MS图谱。
实施例5.细胞结合分析
通过间接免疫荧光分析使用流式细胞术评估裸抗体或ADC与抗原阳性细胞的结合。将细胞(每孔5X 104个)涂铺于圆底96孔板中，并且在测试物品的连续稀释液存在下在0.2mL的补充有2％(v/v)正常山羊血清的α-MEM(Sigma,St.,Louis,MO)中在4℃下孵育3h。将每个样品一式三份进行分析。对照孔不含测试物品。然后将细胞用0.2-mL冷(4℃)培养基洗涤并且在4℃下用荧光素标记的山羊抗人免疫球蛋白G(IgG)抗体染色1h。将细胞再次用培养基洗涤，固定于1％甲醛/PBS溶液中，并且使用FACS Calibur流式细胞仪(BDBiosciences,San Jose,CA)进行分析。
如图7中所示，缀合仅适度影响裸抗体的结合亲和力。
实施例6.ADC和代谢产物的体外细胞毒性分析
在平底96孔板中对每个数据点一式三份进行分析。首先将测试物品在完全细胞培养基中使用5倍稀释系列进行稀释并且添加100μL至每个孔中。最终浓度典型地在3x 10-8M至8x 10-14M范围内。然后将靶细胞于100μL完全培养基中以1,500至3,000个细胞/孔添加至测试物品中。将混合物在37℃下在湿润的5％CO2孵育器中孵育5天。通过WST-8(四唑盐-8；2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓)基于比色分析使用细胞计数试剂盒-8(Dojindo Molecular Technologies,Inc.,Rockville,MD)测定剩余细胞的活力。在活细胞中用脱氢酶还原WST-8，得到黄色甲臜产物，所述甲臜产物可溶于组织培养基。甲臜染料的量与活细胞的数目成正比。添加WST-8，达到10％的最终体积并且将板在37℃下在湿润的5％CO2孵育器中再孵育4h。然后使用微板读板仪在450nm的光学密度下测量WST-8信号。通过用每个所处理的样品的值除以未处理的对照的平均值来计算存活分数，并且在半对数坐标图中关于每种处理对测试物品浓度进行作图。使用GraphPad Prism v5程序(GraphPad Software,La Jolla,CA)使用非线性回归(曲线拟合)确定IC50值。
如图8中所示，本发明的缀合物对KB细胞高度有效，并且体外细胞毒性为抗原特异性的，因为添加裸抗体显著降低缀合物的细胞毒性。
将本发明的缀合物的体外细胞毒性与具有可裂解二硫化物接头的Ab-sSPDB-DM4缀合物和肽苯氨基类美登素缀合物相比较(表1)。如表1中所示，与Ab-sSPDB-DM4缀合物相比本发明的缀合物总体上更具细胞毒性。此外，间隔基L1基团中的烷基链的长度对于对抗原阳性细胞的细胞毒性几乎没有影响。
表1.
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还针对CA922细胞测试了本发明的缀合物的体外细胞毒性。如图14中所示，缀合物的肽接头中的D-Ala如果直接附接至式(I)的缀合物的-NH-CR1R2-S-部分中的自分解氮那么对细胞毒性为有害的。
针对Colo720E、H1703、H1975以及COLO704细胞测试了主要ADC代谢产物的体外细胞毒性，并且在图15和下表2中示出数据。数据表明增加代谢产物疏水性(L1间隔基中的较长烷基链)会增加代谢产物细胞毒性。
表2主要ADC代谢产物对H1703、H1975以及COLO704细胞的体外细胞毒性
实施例7.体内功效研究
在带有确定的异种移植物(H1703 250mm3)、HT-29(100mm3)或NCI-H2110(100mm3)的小鼠中评估ADC的体内功效。在右侧为雌性SCID小鼠皮下接种于不含血清的培养基/基质胶中的所需细胞类型。使肿瘤生长至规定尺寸。然后将动物随机分成多个组(每组6个动物)。将对照小鼠用磷酸盐缓冲盐水处理。以研究中所指示的mg/kg水平给予小鼠ADC。异种移植模型中的所有给药是基于缀合物的抗体组分的重量。通过尾部静脉静脉内注射施以所有处理。使用卡尺每周两次以三维形式测量肿瘤尺寸，肿瘤体积以mm3表示，并且使用等式V＝1/2(长度×宽度×高度)来计算。体重也每周测量两次。
如图10、图11A、图11B以及图12中所示，本发明的缀合物在体内小鼠模型中对H1703(图10)、HT-29(图11A和图11B)、NCI-H2110(图12)异种移植肿瘤具高度活性。缀合物17c与肽苯氨基类美登素缀合物相比为良好耐受的(参见图13)。
还对具有不同肽接头(即式(I)中的A)的本发明缀合物进行小鼠耐受性研究。测量给予缀合物的小鼠的体重。如图18中所示，如果肽接头含有连续L-丙氨酸，那么小鼠耐受性降低。
实施例8.体外旁观者杀伤分析
如先前所描述使用相关图中指定的抗原阳性细胞与抗原阴性细胞的比率进行旁观者杀伤分析，其中在存在不同数目的抗原阳性细胞的情况下抗原阴性细胞的数目保持恒定。对抗原阴性细胞和抗原阳性细胞保持恒定的此分析作出如下改变：将3000个EGFR+Ca9-22细胞与2000个EGFR-MCF7细胞混合，并且将细胞混合物与0.66nM的所指示ADC一起孵育4天。使用WST-8分析来定量活细胞。在相同分析中，还评估ADC对Ca9-22或MCF7细胞的细胞毒性效力；所有ADC以类似水平杀死EGFR+Ca9-22细胞，但对EGFR-MCF7细胞没有影响，除非添加抗原阳性细胞。
在另一实验中，将各种比率的FRα(+)/FRα(-)细胞混合于低附着U型底孔中并且暴露于2nM的本发明缀合物，本发明缀合物对FRα(-)细胞(Namalwa，接种的1000个细胞)不具毒性，但杀死所有FRα(+)细胞(JEG-3，150K FRαABC)。在4天之后通过细胞效价Glo分析(Promega)测量FRα(-)细胞的存活率。图9C中示出了数据。特定而言，将本发明缀合物的旁观者杀伤作用与肽苯胺类美登素缀合物相比较，并且在下表3中示出数据。
表3
缀合物 杀死100％FRα(-)细胞所需的Jeg-3细胞数目
4b 3000
17c 1000
如图9A、图9B以及图9C中所示，与具有可裂解二硫化物接头的Ab-sSPDB-DM4缀合物和肽苯氨基类美登素缀合物相比，本发明的缀合物具有更高的旁观者杀伤效应。此外，当其他因素保持恒定时，增加代谢产物疏水性会增加代谢产物细胞毒性，这使得对应缀合物的旁观者杀伤作用增加。另外，数据似乎表明，本发明的缀合物在所释放代谢产物的类型和释放效率方面不同于Ab-sSPDB-DM4缀合物和肽苯胺类美登素缀合物。本发明的缀合物的旁观者杀伤效应大于肽苯氨基类美登素缀合物，肽苯氨基类美登素缀合物又大于Ab-sSPDB-DM4(17g>4b>1b)。
如图9D中所示，缀合物的肽接头中的D-Ala如果直接附接至式(I)的缀合物的-NH-CR1R2-S-部分中的自分解氮那么对旁观者杀伤作用为有害的。
实施例9.体外代谢研究
将表达FRα的KB细胞用饱和量的17c缀合物处理24小时。将含有分解产物的培养基与5mM NEM一起孵育以为存在的任何游离硫醇加盖，并且然后由预结合的蛋白质A-抗类美登素抗体复合物捕获。通过丙酮萃取来释放分解产物，并且通过UHPLC/HRMS进行分析。
图16中示出了检测到的代谢产物和建议的裂解位点。在细胞培养基中鉴定的主要流出分解产物为DM-SMe(25a)和DM-SH种类。
在另一实验中，将缀合物18c(抗CanAg-LDL-DM)与COLO205细胞一起孵育，随后通过先前描述的方法进行细胞溶解和任何二硫键的还原并且用N-乙基马来酰亚胺为所得硫醇加盖(参见Erickson HK,Park PU,Widdison WC,Kovtun YV,Garrett LM,Hoffman K等Antibody-maytansinoid conjugates are activated in targeted cancer cells bylysosomal degradation and linker-dependent intracellular processing.CancerRes 2006；66(8):4426-33)。也对未处理的对照进行，其中将未用缀合物处理的COLO205细胞溶解，并且还原二硫键，然后将所得硫醇用N-乙基马来酰亚胺加盖。通过UPLC/MS对两种样品进行分析，使用被设定用于Pos、Neg、DDA Top-10 MS/MS检测的Thermo Q-Exactive质谱仪，所述质谱仪与配备有Waters UPLC BEH C8 1.8微米100x 2.1mm柱的DionexUltiMate 3000UPLC串联。将柱室设定为30℃并且将uv检测器设定为252nm。注射体积为40μL。用含有0.1％甲酸的去离子水加上在0.35mL/min的流速下历时20min 20％至100％的含有0.1％甲酸的乙腈的线性梯度继之以含有0.1％甲酸的一股100％乙腈持续10min对柱进行洗脱。如图19中所示，顶部UPLC描记线属于来自未暴露于任何缀合物的COLO205细胞的DTT和NEM处理的细胞溶解产物。底部UPLC描记线属于来自用缀合物18c处理的COLO205细胞的DTT和NEM处理的细胞溶解产物。12.73min滞留时间峰具有与在实验室中制备的CH3S(CH2)5CO-DM化合物(化合物25a)相同的滞留时间和质谱。
在类似实验中，将100nM的C242-sGMBS-LDL-DM(18c)添加至COLO205细胞培养物中并且在37℃下孵育24h。将细胞和培养基分离并且将分解产物以亲和力捕获进行萃取并且用20％乙腈复溶。通过UHPLC/HRMS对分解产物进行分析。在细胞培养基中鉴定的主要分解产物种类包括DM-SMe、氧化的DM-Sme以及酸形式游离药物(参见以下结构)：
实施例10.在OV-90卵巢模型中的体内功效
使用类似于实例7中所描述的程序在带有OV-90异种移植物的小鼠中评估本发明的缀合物的体内功效。
如图17A和图17B以及表4中所示，本发明的缀合物对具有与肽苯氨基类美登素缀合物相比相对低的FRα表达水平(H-得分35)的异源卵巢肿瘤异种移植模型展现增强的活性。
表4.
实施例11.小鼠耐受性研究
a.在雌性CD-1小鼠中测试了1200μg/kg huML66-GMBS-LAlaLAlaLAla-Immol-DM(16a)、huML66-GMBS-DAlaLAlaLAla-Immol-DM(16b)、huML66-GMBS-LAlaDAlaLAla-Immol-DM(16c)、huML66-GMBS-LAlaLAlaDAla-Immol-DM(16d)以及huML66-sSPDB-DM4(1a)的耐受性。
材料：
huML66-s-SPDB-DM4(1a)
DM1的浓度：84.35μg/ml
抗体浓度：4.6mg/ml
药物与抗体的比率：3.4DM/Ab
内毒素：0.46EU/mg
单体：99.2％
游离药物：未检测到
组和处理：(2只小鼠/组)
1.媒介物对照
2.huML66-GMBS-LAlaLAlaLAla-Immol-DM(16a)，1200μg/kg
3.huML66-GMBS-DAlaLAlaLAla-Immol-DM(16b)，1200μg/kg
4.huML66-GMBS-LAlaDAlaLAla-Immol-DM(16c)，1200μg/kg
5.huML66-GMBS-LAlaLAlaDAla-Immol-DM(16d)，1200μg/kg
6.huML66-sSPDB-DM4(1a)，1200μg/kg
研究特定设计：
根据体重将三十只小鼠随机化至6个组中(2个小鼠/组)。体重在24.4至27.5克(26.2±0.96，平均值±SD)范围内。根据毛皮上带颜色的标记来鉴别每个组中的小鼠。在到达后第15天开始处理。基于个别体重给予小鼠缀合物。使用装配有27号1/2英寸针头的1.0ml注射器静脉内进行所有缀合物或PBS的施用。归因于给定剂量，将处理分成2次注射，相隔2小时。小鼠每次注射不允许超过350μl。
测量给予缀合物的小鼠的体重并且在图24A和图24B中示出。
b.在雌性CD-1小鼠中测试1000μg/kg和1250μg/kg Mov19v1.6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM(17c)以1250μg/kg Mov19v1.6-GMBS-dAlalAla-PAB-DM1(4b)的耐受性。
材料：
组和处理：(8只小鼠/组)
1.媒介物对照
2.Mov19v1.6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM，1250μg/kg
3.Mov19v1.6-GMBS-lAladAlalAla-Immol-DM，1000μg/kg
4.Mov19v1.6-GMBS-dAlalAla-PAB-DM1，1250μg/kg
研究特定设计：
根据体重将三十二只小鼠随机化至4个组中(8只小鼠/组)。体重在23.4至27.3克(25.5±1.02，平均值±SD)范围内。通过剪耳号(ear notching)来鉴别每个组中的小鼠。在到达后第8天开始处理。基于个别体重给予小鼠缀合物。使用装配有27号1/2英寸针头的1.0ml注射器静脉内进行所有缀合物或PBS的施用。归因于给定剂量，将处理分成2次注射，相隔2小时。小鼠每次注射不允许超过350μl。
测量给予缀合物的小鼠的体重并且在图25A至图25D中示出。
实施例12.药代动力学研究
1.缀合物17c
在雌性CD-1小鼠中评估M-LDL-IMM-DM(缀合物17c)和M-SPDB-DM4的药代动力学。基于体重将小鼠随机分配至每组六只小鼠的2个组中。组A中的小鼠经由尾部静脉接受10mg/kg M-LDL-IMM-DM的单次静脉内注射。组B中的小鼠经由尾部静脉接受10mg/kg M-SPDB-DM4的单次静脉内注射。在2分钟、6、24、48、72、168、336、504、672以及840小时时收集血液。轮流对小鼠进行采血以确保在24小时时间内没有小鼠被采血超过两次。将血清与血液分离并且将样品冷冻在-80℃下直到通过ELISA进行分析。对样品进行总抗体和ADCELISA，并且在图26中示出浓度与时间曲线。总抗体ELISA定量带有至少一个类美登素的抗体以及未附接类美登素的抗体。通过用抗人IgG抗体捕获，然后使用酶标记的抗人IgG抗体定量来测定浓度。ADC ELISA涉及使用抗类美登素抗体捕获带有至少一个附接类美登素的缀合物，然后捕获缀合物的抗体组分并且用酶标记的抗人Fc抗体进行检测。为了被检测到，缀合物必须含有至少一个共价键联的类美登素。
使用非房室药代动力学分析程序Phoenix WinNonlin专业版v 6.1(Certara,Princeton,NJ)的标准算法得到PK参数并且在表5中示出。
表5
2.缀合物26c
为CD-1小鼠注射单次10mg/kg剂量的26c或M9346A-C442-mal-SPDB-DM4。在注射后2分钟、24小时以及72小时时收集血液。使用叶酸受体α-Fc融合蛋白使用亲和力捕获从血浆纯化ADC并且通过尺寸排阻色谱法(SEC)和质谱法(MS)分析样品。以相较于时间的规范化的降解百分比的形式对DM或DM4的损失进行测量并且在图27中绘图。如由在2分钟(-0.2％相较于7.3％)和24小时时间点(5.2％相较于16.5％)观测到的较少降解所证实，26c的体内稳定性大于M9346A-C442-mal-SPDB-DM4。M9346A-C442-mal-SPDB-DM4的72小时样品浓度太稀而不能得到规范化的降解百分比值。

Claims (143)

1.一种细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物，其由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
CB为细胞结合剂，其中所述细胞结合剂为抗体或其抗原结合片段；
L2由以下结构式表示：
其中：
Rx与Ry均为H；
l和l1各自为1至10的整数；并且
k1为1至12的整数；和
s1指示连接至所述细胞结合剂CB的位点并且s3指示连接至所述A基团的位点；
A为氨基酸残基或包含2至20个氨基酸残基的肽；
R1和R2各自独立地为H或C1-3烷基；
L1为-L1'-C(＝O)-；并且L1'为亚烷基或亚环烷基，其中L1中的所述-C(＝O)-部分连接至D；
D为由下式表示的类美登素：
并且
q为1至20的整数。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中R1和R2中的至少一者为H。
3.如权利要求1所述的缀合物，其中R1和R2各自独立地为H或Me。
4.如权利要求3所述的缀合物，其中R1和R2中的一者为H，并且另一者为Me。
5.如权利要求1所述的缀合物，其中R1与R2均为H。
6.如权利要求1所述的缀合物，其中L1'为C1-10亚烷基。
7.如权利要求1所述的缀合物，其中L1为-CR3R4-(CH2)1-8-C(＝O)-；R3和R4各自独立地为H或Me。
8.如权利要求7所述的缀合物，其中L1为-CR3R4-(CH2)3-5-C(＝O)-。
9.如权利要求7所述的缀合物，其中R3与R4均为Me。
10.如权利要求1所述的缀合物，其中L1为-(CH2)4-6-C(＝O)-。
11.如权利要求1所述的缀合物，其中A为可由蛋白酶裂解的肽。
12.如权利要求11所述的缀合物，其中A为可由在肿瘤组织中表达的蛋白酶裂解的肽。
13.如权利要求1所述的缀合物，其中A为具有选自由以下组成的组的与-NH-CR1R2-S-L1-D共价键联的氨基酸的肽：Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、硒代-Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr以及Val，所述氨基酸各自独立地呈L或D异构体形式。
14.如权利要求13所述的缀合物，其中连接至-NH-CR1R2-S-L1-D的所述氨基酸为L氨基酸。
15.如权利要求1所述的缀合物，其中A选自由以下组成的组：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、D-Val-Ala、Val-Cit、D-Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、D-Ala-Pro以及D-Ala-tBu-Gly，其中每种肽中的第一个氨基酸连接至L2基团并且每种肽中的最后一个氨基酸连接至-NH-CR1R2-S-L1-D。
16.如权利要求15所述的缀合物，其中A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
17.如权利要求1所述的缀合物，其中D由下式表示：
18.如权利要求1所述的缀合物，其中所述缀合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
为通过Cys硫醇基连接至所述L2基团的所述细胞结合剂；
R3和R4各自独立地为H或Me；
r1以及t1各自独立地为1至6的整数；
r2以及t2各自独立地为1至7的整数；
t3为1至12的整数；
D1由下式表示：
19.如权利要求18所述的缀合物，其中D1由下式表示：
20.如权利要求18所述的缀合物，其中A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
21.如权利要求18所述的缀合物，其中r1为2至4的整数；并且r2为3至5的整数。
22.如权利要求18所述的缀合物，其中
r1和t1各自为2至6的整数；
r2和t2各自为2至5的整数；并且
t3为2至12的整数。
23.如权利要求18所述的缀合物，其中R3与R4均为Me。
24.如权利要求18所述的缀合物，其中R3与R4均为H。
25.如权利要求18所述的缀合物，其中所述缀合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
26.如权利要求25所述的缀合物，其中所述缀合物由下式表示：
其中D1由下式表示：
27.如权利要求1所述的缀合物，其中所述细胞结合剂为特异性结合于靶细胞的单链抗体、单链抗体片段、特异性结合于靶细胞的单克隆抗体、单克隆抗体片段、特异性结合于靶细胞的嵌合抗体、嵌合抗体片段、特异性结合于靶细胞的结构域抗体或结构域抗体片段。
28.如权利要求1所述的缀合物，其中所述细胞结合剂为表面整修抗体或其表面整修抗体片段。
29.如权利要求1所述的缀合物，其中所述细胞结合剂为单克隆抗体或其单克隆抗体片段。
30.如权利要求29所述的缀合物，其中所述细胞结合剂为特异性结合于靶细胞的单链单克隆抗体或单链单克隆抗体片段。
31.如权利要求1所述的缀合物，其中所述细胞结合剂为人源化抗体或其人源化抗体片段。
32.如权利要求1所述的缀合物，其中所述细胞结合剂为嵌合抗体或其嵌合抗体片段。
33.如权利要求1所述的缀合物，其中所述细胞结合剂为抗叶酸受体抗体或其抗体片段、抗EGFR抗体或其抗体片段、抗CD33抗体或其抗体片段、抗CD19抗体或其抗体片段、抗Muc1抗体或其抗体片段或抗CD37抗体或其抗体片段。
34.如权利要求1所述的缀合物，其中所述细胞结合剂为抗CD123抗体或其抗体片段。
35.如权利要求34所述的缀合物，其中所述抗CD123抗体或其抗体片段包含a)具有SEQID NO:33的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链可变区CDR2以及具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链可变区CDR3；以及b)具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链可变区CDR2以及具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
36.如权利要求34所述的缀合物，其中所述抗CD123抗体或其抗体片段包含具有SEQ IDNO.39的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区。
37.如权利要求36所述的缀合物，其中从SEQ ID NO:39N端起的第二个残基X为Phe。
38.如权利要求36所述的缀合物，其中从SEQ ID NO:39N端起的第二个残基X为Val。
39.如权利要求34所述的缀合物，其中所述抗CD123抗体包含具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链。
40.如权利要求34所述的缀合物，其中所述抗CD123抗体包含具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链。
41.如权利要求39所述的缀合物，其中从SEQ ID NO:42N端起的第二个残基X为Val。
42.如权利要求40所述的缀合物，其中从SEQ ID NO:44 N端起的第二个残基X为Val。
43.如权利要求25所述的缀合物，其中所述缀合物由下式表示：
44.一种由下式表示的化合物：
L2′-A-NH-CR1R2-S-L1-D (II)
或其药学上可接受的盐，其中：
L2'由以下结构式表示：
其中：
Rx与Ry均为H；
l和l1各自为1至10的整数；并且
k1为1至12的整数；
A为氨基酸或包含2至20个氨基酸的肽；
R1和R2各自独立地为H或C1-3烷基；
L1为-L1'-C(＝O)-；并且L1'为亚烷基或亚环烷基，其中L1中的所述-C(＝O)-部分连接至D；并且
D为由下式表示的类美登素：
45.如权利要求44所述的化合物，其中R1和R2中的至少一者为H。
46.如权利要求44所述的化合物，其中R1和R2各自独立地为H或Me。
47.如权利要求44所述的化合物，其中R1和R2中的一者为H；并且另一者为Me。
48.如权利要求44所述的化合物，其中R1与R2均为H。
49.如权利要求44所述的化合物，其中L1'为C1-10亚烷基。
50.如权利要求44所述的化合物，其中L1为-CR3R4-(CH2)1-8-C(＝O)-；R3和R4各自独立地为H或Me。
51.如权利要求50所述的化合物，其中L1为-CR3R4-(CH2)3-5-C(＝O)-。
52.如权利要求50所述的化合物，其中R3与R4均为Me。
53.如权利要求49所述的化合物，其中L1为-(CH2)4-6-C(＝O)-。
54.如权利要求44所述的化合物，其中A为可由蛋白酶裂解的肽。
55.如权利要求54所述的化合物，其中A为可由在肿瘤组织中表达的蛋白酶裂解的肽。
56.如权利要求44所述的化合物，其中A为具有选自由以下组成的组的与-NH-CR1R2-S-L1-D共价键联的氨基酸的肽：Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、硒代-Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr以及Val，所述氨基酸各自独立地呈L或D异构体形式。
57.如权利要求56所述的化合物，其中连接至-NH-CR1R2-S-L1-D的所述氨基酸为L氨基酸。
58.如权利要求44所述的化合物，其中A选自由以下组成的组：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、D-Val-Ala、Val-Cit、D-Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、D-Ala-Pro以及D-Ala-tBu-Gly，其中每种肽中的第一个氨基酸连接至L2基团并且每种肽中的最后一个氨基酸连接至-NH-CR1R2-S-L1-D。
59.如权利要求58所述的化合物，其中A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
60.如权利要求44所述的化合物，其中D由下式表示：
61.如权利要求44所述的化合物，其中所述化合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R3和R4各自独立地为H或Me；
r1以及t1各自独立地为1至6的整数；
r2以及t2各自独立地为1至7的整数；
t3为1至12的整数；
D1由下式表示：
62.如权利要求61所述的化合物，其中A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
63.如权利要求61所述的化合物，其中r1为2至4的整数；并且r2为3至5的整数。
64.如权利要求61所述的化合物，其中
r1和t1各自为2至6的整数；
r2和t2各自为2至5的整数；并且
t3为2至12的整数。
65.如权利要求61所述的化合物，其中R3与R4均为Me。
66.如权利要求61所述的化合物，其中R3与R4均为H。
67.如权利要求61所述的化合物，其中所述化合物由下式表示：
/>
或其药学上可接受的盐，其中：
A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
68.如权利要求67所述的化合物，其中所述化合物由下式表示：
/>
其中D1由下式表示：
69.一种由下式表示的化合物：
A′-NH-CR1R2-S-L1-D (III)
或其药学上可接受的盐，其中：
A′为氨基酸或包含2至20个氨基酸的肽；
R1和R2各自独立地为H或C1-3烷基；
L1为-L1′-C(＝O)-；并且L1′为亚烷基或亚环烷基，其中L1中的所述-C(＝O)-部分连接至D；并且
D为由下式表示的类美登素：
70.如权利要求69所述的化合物，其中R1和R2中的至少一者为H。
71.如权利要求69所述的化合物，其中R1和R2各自独立地为H或Me。
72.如权利要求71所述的化合物，其中R1和R2中的一者为H，并且另一者为Me。
73.如权利要求69所述的化合物，其中R1与R2均为H。
74.如权利要求69所述的化合物，其中L1'为C1-10亚烷基。
75.如权利要求69所述的化合物，其中L1为-CR3R4-(CH2)1-8-C(＝O)-；R3和R4各自独立地为H或Me。
76.如权利要求75所述的化合物，其中L1为-CR3R4-(CH2)3-5-C(＝O)-。
77.如权利要求75所述的化合物，其中R3与R4均为Me。
78.如权利要求69所述的化合物，其中L1为-(CH2)4-6-C(＝O)-。
79.如权利要求69所述的化合物，其中A'为可由蛋白酶裂解的肽。
80.如权利要求79所述的化合物，其中A'为可由在肿瘤组织中表达的蛋白酶裂解的肽。
81.如权利要求69所述的化合物，其中A'为具有选自由以下组成的组的与-NH-CR1R2-S-L1-D共价键联的氨基酸的肽：Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、硒代-Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr以及Val，所述氨基酸各自独立地呈L或D异构体形式。
82.如权利要求69所述的化合物，其中连接至-NH-CR1R2-S-L1-D的所述氨基酸为L氨基酸。
83.如权利要求69所述的化合物，其中A'选自由以下组成的组：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、D-Val-Ala、Val-Cit、D-Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、D-Ala-Pro以及D-Ala-tBu-Gly，其中每种肽中的第一个氨基酸连接至L2基团并且每种肽中的最后一个氨基酸连接至-NH-CR1R2-S-L1-D。
84.如权利要求83所述的化合物，其中A'为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
85.如权利要求69所述的化合物，其中D由下式表示：
86.如权利要求69所述的化合物，其中所述化合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R3和R4各自独立地为H或Me；
m2为1至7的整数；并且
D1由下式表示：
87.如权利要求86所述的化合物，其中D1由下式表示：
88.如权利要求86所述的化合物，其中A'为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
89.如权利要求86所述的化合物，其中m2为3至5的整数。
90.如权利要求86所述的化合物，其中R3与R4均为Me。
91.如权利要求86所述的化合物，其中R3与R4均为H。
92.如权利要求86所述的化合物，其中所述化合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
A'为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
93.如权利要求92所述的化合物，其中D1由下式表示：
94.一种由下式表示的化合物：
L3-A-NH-CR1R2-S-L1-D (IV)
或其药学上可接受的盐，其中：
L3由下式表示：
Rx'和Ry'均为H；
k为1至10的整数；
A为氨基酸残基或包含2至20个氨基酸残基的肽；
R1和R2各自独立地为H或C1-3烷基；
L1为-L1'-C(＝O)-；并且L1'为亚烷基或亚环烷基，其中L1中的所述-C(＝O)-部分连接至D；并且
D为由下式表示的类美登素：
95.如权利要求94所述的化合物，其中R1和R2中的至少一者为H。
96.如权利要求94所述的化合物，其中R1和R2各自独立地为H或Me。
97.如权利要求96所述的化合物，其中R1和R2中的一者为H，并且另一者为Me。
98.如权利要求94所述的化合物，其中R1与R2均为H。
99.如权利要求94所述的化合物，其中L1'为C1-10亚烷基。
100.如权利要求94所述的化合物，其中L1为-CR3R4-(CH2)1-8-C(＝O)-；R3和R4各自独立地为H或Me。
101.如权利要求100所述的化合物，其中L1为-CR3R4-(CH2)3-5-C(＝O)-。
102.如权利要求100所述的化合物，其中R3与R4均为Me。
103.如权利要求94所述的化合物，其中L1为-(CH2)4-6-C(＝O)-。
104.如权利要求94所述的化合物，其中k为2至6的整数整数。
105.如权利要求94所述的化合物，其中k为3。
106.如权利要求94所述的化合物，其中A为可由蛋白酶裂解的肽。
107.如权利要求106所述的化合物，其中A为可由在肿瘤组织中表达的蛋白酶裂解的肽。
108.如权利要求94所述的化合物，其中A为具有选自由以下组成的组的与-NH-CR1R2-S-L1-D共价键联的氨基酸的肽：Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、硒代-Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr以及Val，所述氨基酸各自独立地呈L或D异构体形式。
109.如权利要求94所述的化合物，其中连接至-NH-CR1R2-S-L1-D的所述氨基酸为L氨基酸。
110.如权利要求94所述的化合物，其中A选自由以下组成的组：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、D-Val-Ala、Val-Cit、D-Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、D-Ala-Pro以及D-Ala-tBu-Gly，其中每种肽中的第一个氨基酸连接至L2基团并且每种肽中的最后一个氨基酸连接至-NH-CR1R2-S-L1-D。
111.如权利要求110所述的化合物，其中A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
112.如权利要求94所述的化合物，其中D由下式表示：
113.如权利要求94所述的化合物，其中所述化合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
R3和R4各自独立地为H或Me；
m3为1至6的整数；
m2为1至7的整数；
D1由下式表示：
114.如权利要求113所述的化合物，其中A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
115.如权利要求113所述的化合物，其中m3为2至4的整数；并且m2为3至5的整数。
116.如权利要求113所述的化合物，其中R3与R4均为Me。
117.如权利要求113所述的化合物，其中R3与R4均为H。
118.如权利要求113所述的化合物，其中所述化合物由下式表示：
或其药学上可接受的盐，其中：
A为Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
119.如权利要求118所述的化合物，其中D1由下式表示：
120.一种由下式表示的化合物：
D-L1-SZ0 (V)，
其中：
L1为-L1'-C(＝O)-；并且L1'为亚烷基或亚环烷基，其中L1中的所述-C(＝O)-部分连接至D；
Z0为H或Me，前提条件为当Z0为H时，L1不为-C(＝O)-(CH2)q-或-C(＝O)-CH2-CH2-C(CH3)2-，其中q为1至3的整数；并且当Z0为Me时，L1不为-C(＝O)-(CH2)2-或-C(＝O)-CH2-CH2-C(CH3)2-；并且
D为由下式表示的类美登素：
121.如权利要求120所述的化合物，其中L1'为C1-10亚烷基。
122.如权利要求120所述的化合物，其中L1为-CR3R4-(CH2)1-8-C(＝O)-；并且R3和R4各自独立地为H或Me。
123.如权利要求122所述的化合物，其中L1为-CR3R4-(CH2)3-5-C(＝O)-。
124.如权利要求122所述的化合物，其中R3与R4均为Me。
125.如权利要求120所述的化合物，其中L1为-(CH2)4-6-C(＝O)-。
126.如权利要求120所述的化合物，其中D由下式表示：
127.一种药物组合物，其包含如权利要求1-43中任一项所述的缀合物和药学上可接受的载体。
128.如权利要求1-43中任一项所述的缀合物或用于制备在哺乳动物中抑制异常细胞生长或治疗增殖性病症的药物的用途。
129.如权利要求128所述的用途，其中所述药物用于治疗癌症。
130.如权利要求129所述的用途，其中所述癌症选自肾癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、黑素瘤、结肠直肠癌、胃癌、鳞状癌症、肺癌、睾丸癌、绒毛膜癌、默克尔细胞癌、肉瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、腹膜癌、输卵管癌、子宫癌或白血病。
131.如权利要求130所述的用途，其中所述癌症为乳腺癌、卵巢癌或肾癌。
132.如权利要求130所述的用途，其中所述癌症为卵巢癌、子宫癌或输卵管癌。
133.如权利要求132所述的用途，其中所述癌症为子宫颈癌。
134.如权利要求132所述的用途，其中所述癌症为子宫内膜癌。
135.如权利要求130所述的用途，其中所述癌症为三阴性乳腺癌。
136.如权利要求130所述的用途，其中所述癌症为结肠癌。
137.如权利要求130所述的用途，其中所述癌症为脑癌。
138.如权利要求130所述的用途，其中所述癌症为上皮卵巢癌。
139.如权利要求130所述的用途，其中所述癌症为非小细胞肺癌或小细胞肺癌。
140.如权利要求130所述的用途，其中所述癌症为骨肉瘤、软骨肉瘤、脂肪肉瘤以及平滑肌肉瘤。
141.如权利要求130所述的用途，其中所述癌症为非霍奇金淋巴瘤。
142.如权利要求130所述的用途，其中所述癌症为急性骨髓性白血病、急性单核细胞性白血病、前髓细胞性白血病、嗜酸粒细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病或慢性骨髓性白血病。
143.如权利要求130所述的用途，其中所述癌症为B-ALL。
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