TW201609152A - 包含細胞結合劑及細胞毒性劑之偶聯物 - Google Patents

包含細胞結合劑及細胞毒性劑之偶聯物 Download PDF

Info

Publication number
TW201609152A
TW201609152A TW104128984A TW104128984A TW201609152A TW 201609152 A TW201609152 A TW 201609152A TW 104128984 A TW104128984 A TW 104128984A TW 104128984 A TW104128984 A TW 104128984A TW 201609152 A TW201609152 A TW 201609152A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
ala
group
antibody
conjugate
val
Prior art date
Application number
TW104128984A
Other languages
English (en)
Inventor
路克Ｂ 哈利思
丹尼爾 塔法瑞
路林元
納森 艾利特 費雪金
馬納迷 席斯卡
麥克 路易斯 米勒
拉維Ｖ Ｊ 洽里
Original Assignee
免疫原公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 免疫原公司 filed Critical 免疫原公司
Publication of TW201609152A publication Critical patent/TW201609152A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A61K31/5517—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine condensed with five-membered rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. imidazobenzodiazepines, triazolam
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Abstract

本發明係關於新穎的細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物，其中該細胞結合劑(CBA)經由自該CBA上2-羥基乙胺部分之氧化得到的醛基共價連接至該細胞毒性劑。本發明亦提供製備本發明之偶聯物之方法。本發明進一步提供可用於使用本發明之偶聯物在哺乳動物中抑制異常細胞生長或治療增生性病症的組成物及方法。

Description

包含細胞結合劑及細胞毒性劑之偶聯物 相關申請案之引用
本申請案依據35 U.S.C.§119(e)要求在2014年9月3日提交之美國臨時申請案號62/045,264、2014年12月3日提交之美國臨時申請案號62/086,986、2015年4月17日提交之美國臨時申請案號62/149,379及2015年6月29日提交之美國臨時申請案號62/186,235之提交日之權益，各案之完整內容，包括所有附圖、化學式、說明書及申請專利範圍，均以引用之方式併入本文中。
抗體-藥物偶聯物(ADC)及細胞結合劑-藥物偶聯物係作為對多種癌症具有功效的一類有效抗腫瘤劑而出現。細胞結合劑-藥物偶聯物(諸如ADC)常常由三種不同成分構成：細胞結合劑(例如抗體)；連接子；及細胞毒性部分。通常，細胞毒性藥物部分係共價附接至抗體上之離胺酸，產生偶聯物，該等偶聯物為在抗體分子上不同位置處附接不同數量藥物之 ADC的非均質混合物。
意外地發現，細胞結合劑(諸如抗體)上之N末端絲胺酸殘基的2-羥基乙胺部分可選擇性氧化成醛基，同時抗體不會過度氧化。所得到的具有醛基之抗體能夠與具有醛反應性基團之細胞毒性藥物或經由具有醛反應性基團之連接子化合物進行位點特異性偶聯。所得抗體-藥物偶聯物意外地保持與未偶聯抗體類似之抗原結合親和力，不過事實上，偶聯位點係位於抗體之N末端。此外，所得偶聯物儘管每個抗體僅連接有兩個分子之藥物負載，但出乎意料地展現出高效力，且耐受性優於離胺酸連接之偶聯物。
在某些實施例中，該細胞結合劑，諸如抗體，係經由肟鍵聯(-C=N-O-)共價連接至細胞毒性劑。意外的是，相比最近公開之發現(參見Agarwal等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110：46-51,2013)，肟鍵聯在活體內具有高度穩定性。
本發明提供一種由以下結構式表示之細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：CBA係共價連接至JcB’基團之細胞結合劑；JCB’係藉由使該CBA上之醛基與連接至基團L之醛反應性基團反應所形成的部分，其中該醛基係衍生自由以下結構式表示之2-羥基乙胺部分的 氧化： 其中該2-羥基乙胺部分係絲胺酸、蘇胺酸、羥基離胺酸、4-羥基鳥胺酸或2,4-二胺基-5-羥基戊酸殘基之一部分；L係間隔子或鍵；JD’係將該細胞毒性劑D與基團L連接之連接部分，或當L係鍵時不存在；D係經由該連接部分JD’共價連接至L或當L係鍵時經由JCB’連接至CBA之細胞毒性劑；且w係1、2、3或4。
本發明亦提供一種重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分，其包含具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的異源信號肽。
本發明進一步提供一種重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分，其包含緊鄰該重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之信號肽之最後一個殘基之C末端的Ser或Thr殘基。
亦提供一種經修飾抗體，其係由在該重鏈、輕鏈或其抗原結合部分之成熟加工序列上具有N末端Ser或Thr的抗體氧化得到，其中在該經修飾抗體中，該N末端Ser或Thr已氧化成醛基。
本發明亦包括編碼本文所描述之重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分的多聚核苷酸及產生本文所描述之重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分的方法。
在一個實施例中，本發明係針對一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物之方法，該方法包括以下步驟：(a)用氧化劑將細胞結合劑之2-羥基乙胺部分氧化以形成具有醛基之經氧化細胞結合劑；其中該2-羥基乙胺部分為絲胺酸、蘇胺酸、羥基離胺酸、4-羥基鳥胺酸或2,4-二胺基-5-羥基戊酸殘基之一部分，且由以下結構式表示： (b)使該經氧化細胞結合劑：(i)與具有醛反應性基團之細胞毒性劑-連接子化合物或具有醛反應性基團之細胞毒性劑接觸，由此形成該細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物；或(ii)與具有醛反應性基團之連接子化合物接觸，由此形成與連接子結合之經修飾抗體或其經修飾抗原結合部分，隨後使該經修飾抗體或其經修飾抗原結合部分與細胞毒性劑反應，以形成該細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物；或(iii)與細胞毒性劑接觸，隨後添加具有醛反應性基團及可與該細胞毒性劑形成共價鍵之反應性基團的連接子化合物，以形成該細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物。
在一個實施例中，本發明係針對一種由下式表示之細胞毒性化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：LD’、LD’’及LD'''之一係由下式表示： -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)r-Zd1-(CRaRb)r-JCB (A’)
且其餘兩個相同或不同，且獨立地選自-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(OCH2CH2)n-Rc；鹵素；胍鎓[-NH(C=NH)NH2]；-OR；-NR’R’’；-NO2；-NR’COR’’；-SR；-SOR’；-SO2R’；-SO3H；-OSO3H；-SO2NR’R’’；氰基；疊氮基；-COR’；-OCOR’；及-OCONR’R’’；Zd1為不存在、-C(=O)-NR9-或-NR9-C(=O)-；P為胺基酸殘基或含有介於2至20個之間之胺基酸殘基的肽；Ra及Rb在每次出現時獨立地為-H、(C1-C3)烷基或帶電荷之取代基，或可離子化之基團Q；r及r’獨立地為1至6之整數；在N與C之間之雙線表示單鍵或雙鍵，條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，且當其為單鍵時，X為-H或胺保護基；Y為選自以下之離去基團：-OR、-OCOR’、-OCOOR’、-OCONR’R’’、-NR’R’’、-NR’COR’’、-NR’NR’R’’、視情況經取代之5員或6員含氮雜環(例如，經由氮原子附接之哌啶、四氫吡咯、吡唑、嗎啉等)、由-NR’(C=NH)NR’R’’表示之胍鎓、胺基酸或由-NRCOP’表示之肽、-SR、-SOR’、鹵素、氰基、疊氮基、-OSO3H、亞硫酸酯基(-SO3H或-SO2H)、偏亞硫酸酯(H2S2O5)、單-、二-、三-及四-硫代磷酸酯(PO3SH3、PO2S2H2、POS3H2、PS4H2)、硫代磷酸酯(RiO)2PS(ORi)、RiS-、RiSO、RiSO2、RiSO3、硫代硫酸酯(HS2O3)、連二亞硫酸酯(HS2O4)、二硫代磷酸酯 (P(=S)(ORk’)(S)(OH))、羥肟酸(Rk’C(=O)NOH)及甲醛次硫酸根(HOCH2SO2 -)，或其混合物，其中Ri為具有1至10個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，且經至少一個選自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H及-PO3H之取代基取代；Ri可進一步視情況經本文關於烷基所描述之取代基取代；Rj為具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；Rk’為具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、芳基、雜環基或雜芳基；P’為胺基酸殘基或含有介於2至20個之間之胺基酸殘基的肽；R在每次出現時獨立地選自由以下各物組成之群：-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(CH2CH2O)n-Rc；視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基；視情況經取代的含有一個或多個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的5員至18員雜芳基環；或視情況經取代的含有1至6個獨立地選自O、S、N及P之雜原子的3員至18員雜環；R’及R’’各自獨立地選自-H；-OH；-OR；-NHR；-NR2；-COR；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(CH2CH2O)n-Rc；及視情況經取代的具有1至6個獨立地選自O、S、N及P之雜原子的3員至18員雜環；Rc為-H，或視情況經取代的具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；n為1至24之整數；X’係選自-H；胺保護基；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(CH2CH2O)n-Rc；視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基；視情況經取代的含有一個或多個 獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的5員至18員雜芳基環；及視情況經取代的含有1至6個獨立地選自O、S、N及P之雜原子的3員至18員雜環；Y’係選自-H；側氧基；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；視情況經取代之6員至18員芳基；視情況經取代的含有一個或多個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的5員至18員雜芳基環；視情況經取代的含有1至6個雜原子之3員至18員雜環；R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’及R4’各自獨立地選自由以下各物組成之群：-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(OCH2CH2)n-Rc；鹵素；胍鎓[-NH(C=NH)NH2]；-OR；-NR’R’’；-NO2；-NCO；-NR’COR’’；-SR；-SOR’；-SO2R’；-SO3 -H；-OSO3H；-SO2NR’R’’；氰基；疊氮基；-COR’；-OCOR’；及-OCONR’R’’；R6為-H、-R、-OR、-SR、-NR’R’’、-NO2或鹵素；A與A’相同或不同，且獨立地選自-O-、側氧基(-C(=O)-)、-CRR’O-、-CRR’-、-S-、-CRR’S-、-NR5及-CRR’N(R5)-；R5及R9各自獨立地為-H，或視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；JCB係醛反應性基團。
本發明中亦包括一種醫藥組成物，其包含式(I)之偶聯物或式(D18’)-(D23’)之細胞毒性化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之載劑。
該醫藥組成物可進一步包括第二治療劑(例如化學治療劑)。
本發明亦包括一種在哺乳動物(例如人類)中抑制異常細胞生長或治療增生性病症、破壞性骨病、自體免疫病症、移植物抗宿主疾病、移植排斥反應、免疫缺陷、炎症性疾病、感染性疾病、病毒疾病、纖維化疾病、神經退化性病症、胰腺炎或腎病之方法，該方法包括向該哺乳動物施用治療有效量的式(I)之偶聯物或式(D18’)-(D23’)表示之細胞毒性化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在一相關實施例中，上述方法進一步包括向該哺乳動物依序或連續施用第二治療劑(例如化學治療劑)。
【發明詳述】
現將更詳細地提及本發明某些實施例，其實例以所附結構及化學式說明。儘管本發明將結合所列舉之實施例進行描述，但應瞭解，其不意欲將本發明局限於該等實施例。正相反，本發明意欲涵蓋可包括在由申請專利範圍所界定之本發明之範圍內的所有替代方案、修改及等效內 容。熟習此項技術者將認識到與本文所描述之方法及材料類似或等效的許多方法及材料，其可用於實踐本發明。
應瞭解，除非清楚地否定或不恰當，否則本文所描述之任何實施例，包括在本發明不同態樣及本說明書不同部分(包括僅在實例中描述之實施例)下描述之該等實施例(例如化合物、偶聯物、組成物、製備及使用方法)可與本發明之一個或多個其他實施例組合。實施例組合不限於經由多個附屬申請專利範圍要求之該等具體實施例。
定義
如本文所使用，「直鏈或分支鏈烷基」係指具有一至二十個碳原子之飽和直鏈或分支鏈單價烴基。烷基之實例包括但不限於，甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、-CH2CH(CH3)2、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基及類似基團。較佳地，烷基具有一至十個碳原子。更佳地，烷基具有一至四個碳原子。
「直鏈或分支鏈烯基」係指具有兩個至二十個碳原子及至少一個不飽和位點(亦即，碳-碳雙鍵)之直鏈或分支鏈單價烴基，其中烯基包括具有「順式」及「反式」取向，或替代地具有「E」及「Z」取向之基團。實例包括但不限於，乙烯基(-CH=CH2)、丙烯基(-CH2CH=CH2)及類似基團。較佳地，烯基具有兩個至十個碳原子。更佳地，烯基具有兩個至四個碳原子。
「直鏈或分支鏈炔基」係指具有兩個至二十個碳原子及至少一個不飽和位點(亦即，碳-碳參鍵)之直鏈或分支鏈單價烴基。實例包括但不限於，乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、己炔基及類似基團。較佳地，炔基具有兩個至十個碳原子。更佳地，炔基具有兩個至四個碳原子。
術語「碳環」、「碳環基」及「碳環狀環」係指具有3至12個碳原子(單環形式)或具有7至12個碳原子(雙環形式)的單價非芳族飽和或部分不飽和環。具有7至12個碳原子之雙環碳環可例如按雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統形式佈置，且具有9或10個環原子之雙環碳環可按雙環[5,6]或[6,6]系統形式佈置，或按橋接系統形式佈置，諸如雙環[2.2.1]庚烷、雙環[2.2.2]辛烷及雙環[3.2.2]壬烷。單環碳環之實例包括但不限於，環丙基、環丁基、環戊基、1-環戊-1-烯基、1-環戊-2-烯基、1-環戊-3-烯基、環己基、1-環己-1-烯基、1-環己-2-烯基、1-環己-3-烯基、環己二烯基、環庚基、環辛基、環壬基、環癸基、環十一烷基、環十二烷基及類似基團。
術語「環狀烷基」及「環烷基」可互換使用。該等術語係指單價飽和碳環基團。較佳地，環狀烷基為3員至7員單環基團。更佳地，環狀烷基為環己基。
術語「環狀烯基」係指在環結構中具有至少一個雙鍵之碳環基團。
術語「環狀炔基」係指在環結構中具有至少一個參鍵之碳環基團。
「芳基」意思指藉由自母體芳族環系統之單一碳原子移除一 個氫原子得到的具有6至18個碳原子之單價芳族烴基。一些芳基在示例性結構中以「Ar」表示。芳基包括含與飽和、部分不飽和環或芳族碳環或雜環稠合之芳族環的雙環基團。典型的芳基包括但不限於，衍生自苯(苯基)、經取代苯、萘、蒽、茚基、二氫茚基、1,2-二氫萘、1,2,3,4-四氫萘基及類似基團之基團。較佳地，芳基為苯基。
術語「雜環」、「雜環基」及「雜環狀環」在本文中可互換使用，且指至少一個環原子為選自氮、氧、磷及硫之雜原子且其餘環原子為C的具有3至18個環原子之飽和或部分不飽和(亦即，在環內具有一個或多個雙鍵及/或參鍵)碳環基團，其中一個或多個環原子視情況獨立地經一個或多個以下描述之取代基取代。雜環可為具有3至7個環成員(2至6個碳原子及1至4個選自N、O、P及S之雜原子)之單環，或具有7至10個環成員(4至9個碳原子及1至6個選自N、O、P及S之雜原子)之雙環，例如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。雜環描述於Paquette,Leo A.；「Principles of Modern Heterocyclic Chemistry」(W.A.Benjamin,New York,1968)，具體言之，第1、3、4、6、7及9章；「The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs」(John Wiley & Sons,New York,1950至今)，具體言之，第13、14、16、19及28卷；及J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566中。「雜環基」亦包括雜環基團與飽和、部分不飽和環或芳族碳環或雜環稠合的基團。雜環之實例包括但不限於，吡咯啶基、四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫哌喃基、二氫哌喃基、四氫硫代哌喃基、N-哌啶基(piperidino)、N-嗎啉基(morpholino)、硫代嗎啉基、氧硫雜環己基、哌嗪基、高哌嗪基、吖丁啶基、氧雜環丁基、硫雜環丁基、高哌啶基、氧雜環庚基、硫雜環庚基、氧 氮呯基、二氮呯基、硫氮呯基(thiazepinyl)、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吲哚啉基、2H-哌喃基、4H-哌喃基、二噁烷基、1,3-二氧雜環戊基、吡唑啉基、二硫雜環己基、二硫雜環戊烯基、二氫哌喃基、二氫噻吩基、二氫呋喃基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、3-氮雜雙環[3.1.0]己基、3-氮雜雙環[4.1.0]庚基及氮雜雙環[2.2.2]己基。在此定義之範圍內亦包括螺部分。環原子經側氧基(=O)部分取代之雜環基團的實例有嘧啶酮基及1,1-二側氧基-硫嗎啉基。
術語「雜芳基」係指含有一個或多個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的具有5員或6員環之單價芳族基團，且包括具有5-18個原子之稠環系統(其中至少一個為芳族環)。雜芳基之實例為吡啶基(包括例如，2-羥基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基(包括例如，4-羥基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噻唑基、噁唑基、異噻唑基、吡咯基、喹啉基、異喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲哚嗪基、呔嗪基、噠嗪基、三嗪基、異吲哚基、喋啶基、嘌呤基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、呋呫基、苯并呋呫基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喏啉基、萘啶基及呋喃并吡啶基。
若可能，雜環或雜芳基可為碳附接的(碳連接的)或氮附接的(氮連接的)。舉例而言且非限制，碳鍵結之雜環或雜芳基係在吡啶之2、3、4、5或6位鍵結，在噠嗪之3、4、5或6位鍵結，在嘧啶之2、4、5或6位鍵結，在吡嗪之2、3、5或6位鍵結，在呋喃、四氫呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氫吡咯之2、3、4或5位鍵結，在噁唑、咪唑或噻唑之2、4或5位鍵結，在異噁唑、吡唑或異噻唑之3、4或5位鍵結，在氮丙啶之2 或3位鍵結，在吖丁啶之2、3或4位鍵結，在喹啉之2、3、4、5、6、7或8位鍵結，或在異喹啉之1、3、4、5、6、7或8位鍵結。
舉例而言且非限制，氮鍵結之雜環或雜芳基係在氮丙啶、吖丁啶、吡咯、吡咯啶、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑之1位；異吲哚或異吲哚啉之2位；嗎啉之4位；及咔唑或O-咔啉之9位處鍵結。
雜芳基或雜環基中存在之雜原子包括氧化形式，諸如NO、SO及SO2。
術語「鹵基」或「鹵素」係指F、Cl、Br或I。
上述烷基、烯基、炔基、環狀烷基、環狀烯基、環狀炔基、碳環基、芳基、雜環基及雜芳基可視情況經超過一個(例如2、3、4、5、6或更多個)取代基取代。
若取代基被描述為「經取代」，則非氫取代基係在該取代基之碳、氧、硫或氮上氫取代基之位置。因此，例如，經取代之烷基取代基係至少一個非氫取代基處於烷基取代基上氫取代基之位置的烷基取代基。為了說明，單氟烷基係經氟取代基取代之烷基，且二氟烷基係經兩個氟取代基取代之烷基。應認識到，若在一個取代基上存在超過一個取代，則每一非氫取代基可相同或不同(除非另作陳述)。
若一個取代基被描述為「視情況經取代」，則該取代基可為(1)未經取代，或(2)經取代的。若取代基之碳被描述為視情況經取代基清單中之一個或多個取代，則該碳上之一個或多個氫(其範圍為存在之任何數量) 可獨立地及/或一起經獨立選擇的視情況存在之取代基置換。若取代基之氮被描述為視情況經取代基清單中之一個或多個取代，則該氮上之一個或多個氫(其範圍為存在之任何數量)可各自經獨立選擇的視情況存在之取代基置換。一個示例性取代基可以-NR’R’’描繪，其中R’及R’’連同其所附接之氮原子一起可形成雜環。由R’及R’’連同其所附接之氮原子一起形成之雜環可為部分或完全飽和的。在一個實施例中，雜環由3至7個原子組成。在另一個實施例中，該雜環係選自由吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、異噁唑基、吡啶基及噻唑基組成之群。
本說明書使用了可互換之術語「取代基」、「基團(radical)」及「基團(group)」。
若一組取代基共同地描述為視情況經取代基清單中之一個或多個取代，則該組可包括：(1)不可取代之取代基；(2)未經視情況存在之取代基取代的可取代之取代基；及/或(3)經一個或多個視情況存在之取代基取代的可取代之取代基。
若一個取代基被描述為視情況經特定數量之非氫取代基取代，則該取代基可(1)未經取代；或(2)經至多該特定數量之非氫取代基或經至多該取代基上最大數量之可取代位置取代，以數量較小的為準。因此，例如，若一個取代基被描述為視情況經至多3個非氫取代基取代之雜芳基，則具有少於3個可取代位置之任何雜芳基將視情況經至多僅該雜芳基所具有之可取代位置之數量的非氫取代基取代。在非限制性實例中，此類取代基可選自具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；芳基；雜芳基；雜環基；鹵素；胍鎓[-NH(C=NH)NH2]；-OR100；NR101R102；-NO2； -NR101COR102；-SR100；以-SOR101表示之亞碸；以-SO2R101表示之碸；a磺酸酯基-SO3M；硫酸酯基-OSO3M；以-SO2NR101R102表示之磺醯胺；氰基；疊氮基；-COR101；-OCOR101；-OCONR101R102；及聚乙二醇單元(-OCH2CH2)nR101，其中M為H或陽離子(諸如Na+或K+)，R101、R102及R103各自獨立地選自H；具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元(-OCH2CH2)n-R104，其中n係1至24之整數；具有6至10個碳原子之芳基；具有3至10個碳原子之雜環，及具有5至10個碳原子之雜芳基，且R104為H，或具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，其中以R100、R101、R102、R103及R104表示之基團中的烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基及雜環基視情況經一個或多個(例如2、3、4、5、6或更多個)獨立地選自以下之取代基取代：鹵素、-OH、-CN、-NO2，及具有1至4個碳原子之未經取代之直鏈或分支鏈烷基。較佳地，上述視情況經取代之烷基、烯基、炔基、環狀烷基、環狀烯基、環狀炔基、碳環基、芳基、雜環基及雜芳基的取代基包括鹵素、-CN、-NR102R103、-CF3、-OR101、芳基、雜芳基、雜環基、-SR101、-SOR101、-SO2R101及-SO3M。
術語「化合物」或「細胞毒性化合物」、「細胞毒性二聚體」及「細胞毒性二聚體化合物」可互換使用。其意欲包括結構或化學式或其任何衍生物已在本發明中揭示，或結構或化學式或其任何衍生物已以引用之方式併入的化合物。該術語亦包括本發明中所揭示之所有化學式之化合物的立體異構體、幾何異構體、互變異構體、溶劑化物、代謝物、鹽(例如醫藥學上可接受之鹽)及前藥，以及前藥鹽。該術語亦包括前述任一種之任何溶劑化物、水合物及多晶形物。在本申請案中所描述的本發明之某些態 樣中，有關「立體異構體」、「幾何異構體」、「互變異構體」、「溶劑化物」、「代謝物」、「鹽」、「前藥」、「前藥鹽」、「偶聯物」、「偶聯物鹽」、「溶劑化物」、「水合物」或「多晶形物」之具體陳述不應解釋為意圖在未使用該等其他形式陳述術語「化合物」的本發明之其他態樣中省略該等形式。
如本文所使用，術語「免疫偶聯物」或「偶聯物」係指連接至細胞結合劑(亦即，抗CD123/IL-3R α抗體或抗FR α抗體，或其片段)之化合物或其衍生物，且其由以下通式定義：A-L-C，其中C=細胞毒素，L=連接子，且A=細胞結合劑(CBA)，諸如抗CD123/IL-3R α抗體或抗FR α抗體，或抗體片段。免疫偶聯物亦可藉由顛倒次序之通式表示：C-L-A。
如本文所使用，術語「可連接至細胞結合劑」係指包含至少一個適於將化合物或其衍生物鍵結至細胞結合劑之連接基團或其前驅物的本文所描述之化合物或其衍生物。
術語給定基團之「前驅物」係指可藉由任何脫保護、化學改質或偶合反應而產生該基團的任何基團。
術語「連接至細胞結合劑」係指包含經由適合連接基團或其前驅物結合至細胞結合劑的本文所描述之細胞毒性劑化合物或細胞毒性劑-連接子化合物(例如式(D1’)-(D29’)之化合物及式(II)之細胞毒性劑-連接子化合物)或其衍生物中至少一種的偶聯物分子。
術語「手性」係指具有鏡像搭配物不可重疊性之特性的分子，而術語「非手性」係指在其鏡像搭配物可重疊上之分子。
術語「立體異構體」係指具有相同化學構造及連接性，但其原子在空間中之取向不同且無法藉由關於單鍵旋轉而互變的化合物。
「非對映異構體」係指具有兩個或更多個手性中心且分子間不呈鏡像之立體異構體。非對映異構體具有不同的物理特性，例如熔點、沸點、光譜特性及反應性。非對映異構體混合物可依據高解析度分析程序，諸如結晶、電泳及層析法分離。
「對映異構體」係指一種化合物的具有彼此不可重疊之鏡像的兩種立體異構體。
本文所使用之立體化學定義及慣例一般遵循S.P.Parker編輯，McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；以及Eliel,E.及Wilen,S.,「Stereochemistry of Organic Compounds」,John Wiley & Sons,Inc.,New York,1994。本發明之化合物可含有不對稱或手性中心，且因此以不同立體異構形式存在。預期本發明化合物之所有立體異構形式，包括但不限於，非對映異構體、對映異構體及構型異構體，以及其混合物，諸如外消旋混合物，形成本發明之一部分。許多有機化合物以光學活性形式存在，亦即，其能夠旋轉平面偏振光之平面。在描述光學活性化合物時，使用了前綴D及L，或R及S來指示該分子關於其手性中心之絕對構型。前綴d及I或(+)及(-)用於指示化合物旋轉平面偏振光之標記，其中(-)或I意味著該化合物為左旋的。具有前綴(+)或d之化合物為右旋的。對於指定化學結構，該等立體異構體係相同的，不過其彼此呈鏡像。特定立體異構體亦可稱為對映異構體，且此類異構體之混合物常稱為對映異構體混合物。對映異構體之50：50混合物稱為外消旋混合物或外消旋物，其可在化學反應過程中無立體選擇性或立體特異性情況下出現。術語「外消旋混合物」及「外消旋物」係指兩種對映異構物質之等莫耳量 混合物，不管光學活性如何。
術語「互變異構體」或「互變異構形式」係指可經由低能量障壁互變的具有不同能量之結構異構體。舉例而言，質子互變異構體(亦稱為質子轉移互變異構體)包括經由質子移動引起之互變，諸如酮-烯醇及醯亞胺-烯胺異構。價鍵異構體包括由一些鍵結電子再組織引起的互變。
如本申請案中所使用，術語「前藥」係指能夠酶促或水解活化或者轉化成更具活性之活性母體形式的本發明化合物之前驅物或衍生物形式。參見例如，Wilman,「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」,Biochemical Society Transactions,14：375-382,615th Meeting Belfast(1986)；及Stella等人，「Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」,Directed Drug Delivery,Borchardt等人(編輯)，第247-267頁，Humana Press(1985)。本發明之前藥包括但不限於，含酯前藥、含磷酸酯前藥、含硫代磷酸酯前藥、含硫酸酯前藥、含肽前藥、D-胺基酸修飾之前藥、糖基化前藥、含β-內醯胺之前藥、含視情況經取代之苯氧基乙醯胺的前藥、含視情況經取代之苯基乙醯胺的前藥、5-氟胞嘧啶及其他5-氟尿嘧啶前藥，其可轉化成更具活性之細胞毒性游離藥物。可衍生化成用於本發明中之前藥形式的細胞毒性藥物之實例包括但不限於，本發明之化合物及化學治療劑，如以上所描述。
術語「前藥」亦意欲包括在生物條件(活體外或活體內)下可水解、氧化或以其他方式反應而提供本發明化合物的化合物之衍生物。前藥可能僅在生物條件下反應時變得有活性，或其可在呈其未反應形式時具有活性。本發明所涵蓋之前藥的實例包括但不限於，具有本文所揭示之任一化學式之化合物的類似物或衍生物，其包含可生物水解部分，諸如可生 物水解之醯胺、可生物水解之酯、可生物水解之胺基甲酸酯、可生物水解之碳酸酯、可生物水解之醯脲及可生物水解之磷酸酯類似物。前藥之其他實例包括了包含-NO、NO2、-ONO或-ONO2部分的具有本文所揭示之任一化學式之化合物的衍生物。前藥可典型地使用熟知方法製備，諸如Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery(1995)172-178,949-982(Manfred E.Wolff編輯，第5版)所描述之方法；亦參見Goodman及Gilman,The Pharmacological basis of Therapeutics，第8版，McGraw-Hill,Int.編輯，1992,「Biotransformation of Drugs」。
本發明前藥之一種較佳形式包括含本發明之化合物/偶聯物之亞胺鍵與亞胺反應性試劑之間形成之加合物的本發明化合物(存在或不存在連接基團)及偶聯物。本發明前藥之另一較佳形式包括諸如具有式(I)-(IV)之化合物，其中當N與C之間之雙線表示單鍵時，X為H或胺保護基，且該化合物變為前藥。本發明之前藥可含有本文所述前藥之一種或兩種形式(例如含有在化合物/偶聯物之亞胺鍵與亞胺反應性試劑之間形成的加合物，及/或當X為-H時含有Y離去基團)。
術語「亞胺反應性試劑」係指能夠與亞胺基團反應之試劑。亞胺反應性試劑之實例包括但不限於，亞硫酸鹽(H2SO3、H2SO2，或HSO3 -、SO3 2-或HSO2 -與陽離子形成之鹽)；偏亞硫酸氫鹽(H2S2O5，或S2O5 2-與陽離子形成之鹽)；單-、二-、三-及四-硫代磷酸鹽(PO3SH3、PO2S2H3、POS3H3、PS4H3，或PO3S3-、PO2S2 3-、POS3 3-或PS4 3-與陽離子形成之鹽)；硫代磷酸酯((RiO)2PS(ORi)、RiSH、RiSOH、RiSO2H、RiSO3H)；各種胺(羥胺(例如NH2OH)、肼(例如NH2NH2)、NH2O-Ri、Ri’NH-Ri、NH2-Ri)、NH2-CO-NH2、NH2-C(=S)-NH2； 硫代硫酸鹽(H2S2O3，或S2O3 2-與陽離子形成之鹽)；連二亞硫酸鹽(H2S2O4，或S2O4 2-與陽離子形成之鹽)；二硫代磷酸鹽(P(=S)(ORk)(SH)(OH)，或其與陽離子形成之鹽)；異羥肟酸(RkC(=O)NHOH，或與陽離子形成之鹽)；醯肼(RkCONHNH2)；甲醛次硫酸鹽(HOCH2SO2H，或HOCH2SO2 -與陽離子形成之鹽，諸如HOCH2SO2 -Na+)；糖化核苷酸(諸如GDP-甘露糖)；氟達拉濱(fludarabine)；或其混合物，其中Ri及Ri’各自獨立地為具有1至10個碳原子之直鏈或分支鏈烷基且經至少一個選自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H及-PO3H之取代基取代；Ri及Ri’可進一步視情況本文所述之烷基取代基取代；Rj係具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；且Rk係具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；芳基；雜環基；或雜芳基(較佳Rk係具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；更佳Rk為甲基、乙基或丙基)。較佳地，該陽離子為單價陽離子，諸如Na+或K+。較佳地，亞胺反應性試劑係選自亞硫酸鹽、羥胺、尿素及肼。更佳地，亞胺反應性試劑為NaHSO3或KHSO3。
如本文所使用且除非另作指示，否則術語「可生物水解之醯胺」、「可生物水解之酯」、「可生物水解之胺基甲酸酯」、「可生物水解之碳酸酯」、「可生物水解之醯脲」及「可生物水解之磷酸酯類似物」分別意謂這樣一種醯胺、酯、胺基甲酸酯、碳酸酯、醯脲或磷酸酯類似物，其1)不會破壞該化合物之生物活性且賦予該化合物有利的活體內特性，諸如吸收、作用持續時間或作用起始；2)本身不具生物活性，但在活體內轉化成生物活性化合物。可生物水解之醯胺的實例包括但不限於，低級烷基醯胺、α-胺基酸醯胺、烷氧基醯基醯胺及烷基胺基烷基羰基醯胺。可生物水解之 酯之實例包括但不限於，低級烷基酯、烷氧基醯氧基酯、烷基醯胺基烷基酯及膽鹼酯。可生物水解之胺基甲酸酯之實例包括但不限於，低級烷基胺、經取代之伸乙基二胺、胺基酸、羥基烷基胺、雜環及雜芳族胺，及聚醚胺。特別有益之前藥及前藥鹽係當將本發明化合物施用給哺乳動物時，增加該等化合物之生物利用率者。
如本文所使用，短語「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之醫藥學上可接受之有機或無機鹽。示例性鹽包括但不限於，硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異煙鹼酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、丹寧酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲烷磺酸鹽(「甲磺酸鹽」)、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、雙羥萘酸鹽(亦即，1,1’-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘酸鹽))、鹼金屬(例如鈉及鉀)鹽、鹼土金屬(例如鎂)鹽，及銨鹽。醫藥學上可接受之鹽可涉及包含另一分子，諸如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其他相對離子。該相對離子可為使母體化合物上之電荷穩定的任何有機或無機部分。另外，醫藥學上可接受之鹽可在其結構中具有超過一個帶電原子。多個帶電原子作為該醫藥學上可接受之鹽之一部分的情形可具有多個相對離子。因此，醫藥學上可接受之鹽可具有一個或多個帶電原子及/或一個或多個相對離子。
若本發明之化合物為一種鹼，則所需醫藥學上可接受之鹽可藉由此項技術中可用之任何適合方法製備，例如，用諸如鹽酸、氫溴酸、 硫酸、硝酸、甲烷磺酸、磷酸及類似物之無機酸，或用諸如乙酸、順丁烯二酸、琥珀酸、扁桃酸、反丁烯二酸、丙二酸、酮戊酸、草酸、乙醇酸、水楊酸、哌喃糖苷酸(諸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸)、α羥基酸(諸如檸檬酸或酒石酸)、胺基酸(諸如天冬胺酸或麩胺酸)、芳族酸(諸如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(諸如對甲苯磺酸或乙烷磺酸)或類似物處理游離鹼。
若本發明之化合物為一種酸，則所需醫藥學上可接受之鹽可藉由任何適合方法製備，例如，用無機或有機鹼，諸如胺(一級胺、二級胺或三級胺)、鹼金屬氫氧化物或鹼土金屬氫氧化物，或類似物處理游離酸。適合鹽的說明性實例包括但不限於，衍生自胺基酸(諸如甘胺酸及精胺酸)、氨、一級胺、二級胺及三級胺，以及環狀胺(諸如哌啶、嗎啉及哌嗪)之有機鹽，以及衍生自鈉、鈣、鉀、鎂、錳、鐵、銅、鋅、鋁及鋰之無機鹽。
如本文所使用，術語「溶劑化物」意思指進一步包括藉由非共價分子間力結合的化學計算量或非化學計算量之溶劑的化合物，該溶劑為諸如水、異丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸及乙醇胺、二氯甲烷、2-丙醇或類似物。化合物之溶劑化物或水合物易於藉由向該化合物中添加至少一莫耳當量羥基溶劑(諸如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或水)以引起亞胺部分之溶劑化或水合作用來製備。
術語「異常細胞生長」及「增生性病症」在本申請案中可互換使用。除非另作指示，否則如本文中所使用，「異常細胞生長」係指獨立於正常調控機制(例如喪失接觸抑制作用)的細胞生長。此包括例如以下各物之異常生長：(1)藉由表現突變之酪胺酸激酶或過表現受體酪胺酸激酶來增殖的腫瘤細胞(腫瘤)；(2)發生異常酪胺酸激酶活化之其他增生性疾病之良性 及惡性細胞；(3)在受體酪胺酸激酶作用下增殖之任何腫瘤；(4)藉由異常絲胺酸/蘇胺酸激酶活化而增殖之任何腫瘤；及(5)發生異常絲胺酸/蘇胺酸激酶活化之其他增生性疾病的良性及惡性細胞。
術語「癌症」及「癌」係指或描述哺乳動物中典型地以不受調控之細胞生長為特徵的生理病狀。「腫瘤」包含一個或多個癌細胞，及/或良性或癌變前細胞。
「治療劑」涵蓋生物試劑，諸如抗體、肽、蛋白質、酶或化學治療劑。
「化學治療劑」係可用於治療癌症之化合物。
「代謝產物」係經由特定化合物、其衍生物或其偶聯物，或其鹽在體內代謝產生的產物。化合物、其衍生物或其偶聯物之代謝產物可使用此項技術中已知之常規技術鑑別，且其活性可使用多項測試(諸如本文所描述之該等測試)測定。此類產物可例如由所施用之化合物的氧化、羥基化、還原、水解、醯胺化、脫醯胺、酯化、去酯化、酶促裂解及類似反應產生。因此，本發明包括本發明之化合物、其衍生物或其偶聯物的代謝產物，包括藉由使本發明之化合物、其衍生物或其偶聯物與哺乳動物接觸一段足以得到其代謝產物之時間的方法產生的化合物、其衍生物或其偶聯物。
短語「醫藥學上可接受」指示，該物質或組成物必須在化學上及/或毒理學上與構成配製物之其他成分及/或用其治療之哺乳動物相容。
術語「保護基」或「保護部分」係指在化合物、其衍生物或其偶聯物上之其他官能基反應時，常用於阻斷或保護特定官能基之取代基。舉例而言，「胺保護基」或「胺保護部分」係附接至胺基以阻斷或保護 化合物中之胺基官能基的取代基。此類基團係此項技術中熟知的(參見例如，P.Wuts及T.Greene,2007,Protective Groups in Organic Synthesis，第7章，J.Wiley & Sons,NJ)，且其實例有胺基甲酸酯，諸如胺基甲酸甲酯及胺基甲酸乙酯、FMOC、經取代之胺基甲酸乙酯、經1,6-β-消除裂解之胺基甲酸酯(亦稱為「自降解」)、尿素、醯胺、肽、烷基及芳基衍生物。適合胺基保護基包括乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧基羰基(BOC)、苯甲氧基羰基(CBZ)及9-茀基甲氧羰基(Fmoc)。有關保護基及其用途之一般說明，參見P.G.M.Wuts & T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley & Sons,New York,2007。
術語「離去基團」係指在取代或置換期間離開的帶電荷基團或不帶電荷部分。此類離去基團為此項技術中熟知的且包括但不限於，鹵素、酯、烷氧基、羥基、甲苯磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基、甲磺酸酯基、腈、疊氮化物、胺基甲酸酯基、二硫化物、硫酯及重氮鎓化合物。
術語「雙官能交聯劑」、「雙官能連接子」、「交聯劑」或「連接子化合物」係指具有兩個反應性基團之改質劑；其中一個反應性基團能夠與細胞結合劑反應，而另一個與細胞毒性化合物反應，由此將兩個部分連接在一起。此類雙官能交聯劑係此項技術中熟知的(參見例如，Isalm及Dent,Bioconjugation，第5章，第218-363頁，Groves Dictionaries Inc.New York,1999)。舉例而言，能夠經由硫酯鍵來鍵聯的雙官能交聯劑包括用以引入順丁烯二醯亞胺基的N-琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸酯(SMCC)，或用以引入碘代乙醯基的N-琥珀醯亞胺基-4-(碘代乙醯基)-胺基苯甲酸酯(SIAB)。在細胞結合劑上引入順丁烯二醯亞胺基或鹵代乙醯基 之其他雙官能交聯劑係此項技術中熟知的(參見美國專利申請案號2008/0050310、20050169933，自Pierce Biotechnology Inc.P.O.Box 117、Rockland、IL 61105、USA獲得)，且包括但不限於，雙-順丁烯二醯亞胺基聚乙二醇(BMPEO)、BM(PEO)2、BM(PEO)3、N-(β-順丁烯二醯亞胺基丙氧基)琥珀醯亞胺酯(BMPS)、γ-順丁烯二醯亞胺基丁酸N-琥珀醯亞胺基酯(GMBS)、ε-順丁烯二醯亞胺基己酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(EMCS)、5-順丁烯二醯亞胺基戊酸NHS、HBVS、N-琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸酯)(其為SMCC之「長鏈」類似物(LC-SMCC))、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)、4-(4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基)-丁酸醯肼或鹽酸鹽(MPBH)、N-琥珀醯亞胺基3-(溴代乙醯胺基)丙酸酯(SBAP)、N-琥珀醯亞胺基碘代乙酸酯(SIA)、κ-順丁烯二醯亞胺基十一烷酸N-琥珀醯亞胺基酯(KMUA)、N-琥珀醯亞胺基4-(p-順丁烯二醯亞胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)、琥珀醯亞胺基-6-(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸酯(SMPH)、琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基磺醯基)苯甲酸酯(SVSB)、二硫代雙-順丁烯二醯亞胺基乙烷(DTME)、1,4-雙-順丁烯二醯亞胺基丁烷(BMB)、1,4雙順丁烯二醯亞胺基-2,3-二羥基丁烷(BMDB)、雙-順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)、雙-順丁烯二醯亞胺基乙烷(BMOE)、磺基琥珀醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基-甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)、磺基-琥珀醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-MBS)、N-(γ-順丁烯二醯亞胺基丁氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-GMBS)、N-(ε-順丁烯二醯亞胺基辛醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基-EMCS)、N-(κ-順丁烯二醯亞胺基十一烷醯氧基)磺基琥珀醯亞胺酯(磺基 -KMUS)及磺基琥珀醯亞胺基4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)。
雜雙官能交聯劑為具有兩個不同反應性基團之雙官能交聯劑。含有胺反應性N-羥基琥珀醯亞胺基(NHS基團)及羰基反應性肼基之雜雙官能交聯劑亦可用於連接本文所描述之細胞毒性化合物與細胞結合劑(例如抗體)。此類可商購之雜雙官能交聯劑的實例包括琥珀醯亞胺基6-肼基煙鹼醯胺丙酮腙(SANH)、琥珀醯亞胺基4-肼基對苯二甲酸酯鹽酸鹽(SHTH)及琥珀醯亞胺基肼煙鹼酸酯鹽酸鹽(SHNH)。帶有酸不穩定性鍵聯之偶聯物亦可使用本發明之帶有肼之苯并二氮呯衍生物製備。可使用之雙官能交聯劑的實例包括琥珀醯亞胺基-對甲醯基苯甲酸酯(SFB)及琥珀醯亞胺基-對甲醯基苯氧基乙酸酯(SFPA)。
能夠經由二硫鍵連接細胞結合劑與細胞毒性化合物的雙官能交聯劑係此項技術中已知的且包括用以引入二硫代吡啶基的N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)、N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫基)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)。可用於引入二硫基團之其他雙官能交聯劑係此項技術中已知的且揭示於美國專利6,913,748、6,716,821，及美國專利公開案20090274713及20100129314中，全部以引用之方式併入本文中。或者，亦可使用引入硫醇基團之交聯劑，諸如2-亞胺基硫雜環戊烷、高半胱胺酸硫代內酯或S-乙醯基琥珀酸酐。
如本文所定義，「連接子」、「連接部分」或「連接基團」係指將兩個基團(諸如細胞結合劑及細胞毒性化合物)連接在一起的部分。典型 地，該連接子在連接其所連接之兩個基團的條件下基本上呈惰性。雙官能交聯劑可包含兩個反應性基團，連接部分之每一端一個，由此使一個反應性基團可首先與細胞毒性化合物反應以提供帶有連接部分及第二反應性基團之化合物，接著該第二反應性基團可與細胞結合劑反應。或者，雙官能交聯劑之一端可首先與細胞結合劑反應以提供帶有連接部分及第二反應性基團之細胞結合劑，接著該第二反應性基團可與細胞毒性化合物反應。連接部分可含有允許該細胞毒性部分在特定位點釋放的化學鍵。適合化學鍵係此項技術中熟知的且包括二硫鍵、硫醚鍵、酸不穩定性鍵、光不穩定性鍵、肽酶不穩定性鍵及酯酶不穩定性鍵(參見例如，美國專利5,208,020、5,475,092、6,441,163、6,716,821、6,913,748、7,276,497、7,276,499、7,368,565、7,388,026及7,414,073)。較佳為二硫鍵、硫醚鍵及肽酶不穩定性鍵。可用於本發明中之其他連接子包括不可裂解之連接子，諸如美國公開案號20050169933中詳細描述的該等連接子；或帶電荷之連接子或親水性連接子，其描述於US 2009/0274713、US 2010/01293140及WO 2009/134976，各專利以引用之方式明確地併入本文中。
術語「胺基酸」係指天然存在之胺基酸或非天然存在之胺基酸。其可由NH2-C(Raa’Raa)-C(=O)OH表示，其中Raa及Raa’各自獨立地為H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；芳基；雜芳基；或雜環基，或Raa與N末端氮原子一起可形成雜環(例如在脯胺酸中)。術語「胺基酸殘基」係指當自胺基酸之胺端及/或羧基端移除一個氫原子時的相應殘基，諸如-NH-C(Raa’Raa)-C(=O)O-。
術語「陽離子」係指帶有正電荷之離子。陽離子可為單價的 (例如Na+、K+等)、二價的(例如Ca2+、Mg2+等)或多價的(例如Al3+等)。較佳陽離子為單價的。
術語「治療有效量」意思指，在受試者體內引起所希望之生物反應的活性化合物或偶聯物之量。此類反應包括相較於不存在該治療，或預防、抑制或延遲疾病症狀或疾病本身之發展的情況，減輕所治療之疾病或病症的症狀，預防、抑制或延遲疾病症狀或疾病本身之復發，增加受試者之壽命。有效量之確定恰在熟習此項技術者之能力範圍內，尤其是依據本文所提供之詳細揭示內容。化合物I之毒性及治療功效可藉由在細胞培養及實驗動物中進行的標準醫藥程序確定。本發明化合物或偶聯物或者擬施用給受試者之其他治療劑的有效量將取決於多發性骨髓瘤之分期、類別及狀態，以及受試者之特徵，諸如一般健康狀況、年齡、性別、體重及耐藥性。本發明化合物或偶聯物或者擬施用之其他治療劑的有效量亦將取決於施用途徑及劑型。可單獨地調整劑量及時間間隔以提供足以維持所希望之治療效果的活性化合物之血漿含量。
術語「人類化抗體」係指非人類(例如鼠類)抗體之形式，其為特定免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其含有最少非人類(例如鼠類)序列之片段。典型地，人類化抗體係來自互補決定區(CDR)之殘基經來自具有所希望之特異性、親和力及能力之非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠)之CDR之殘基置換的人類免疫球蛋白(Jones等人，Nature 321：522-525,1986；Riechmann等人，Nature 332：323-327,1988；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536,1988)。
在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基係經來 自具有所希望之特異性、親和力及能力之非人類物種之抗體中的相應殘基置換。人類化抗體可進一步藉由取代Fv構架區中及/或經置換非人類殘基內之其他殘基進行修飾以精製並優化抗體特異性、親和力及/或能力。一般而言，人類化抗體將包含至少一個，且典型地兩個或三個可變結構域之基本上全部，該等結構域含有所有或基本上所有的與非人類免疫球蛋白對應之CDR區，而所有或基本上所有的FR區為人類免疫球蛋白序列之FR區。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型地為人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。用於產生人類化抗體之方法的實例描述於美國專利5,225,539及5,639,641；Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(3)：969-973,1994；及Roguska等人，Protein Eng.9(10)：895-904,1996(全部以引用之方式併入本文中)中。在一些實施例中，「人類化抗體」為表面重塑之抗體。在一些實施例中，「人類化抗體」為CDR移植之抗體。
細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物
本發明提供細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物，其包含經由多種連接子，包括但不限於，二硫化物連接子、硫醚連接子、醯胺鍵結之連接子、酸不穩定性連接子及酯酶不穩定性連接子，共價連接至一個或多個本發明細胞毒性劑分子的本文所描述之細胞結合劑。
在第一實施例中，本發明提供一種具有結構式(I)之細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： CBA係共價連接至JCB’基團之細胞結合劑；JCB’係藉由使該CBA上之醛基與連接至基團L之醛反應性基團反應所形成的部分，其中該醛係衍生自由以下結構式表示之2-羥基乙胺部分的氧化： 其中該2-羥基乙胺部分係絲胺酸、蘇胺酸、羥基離胺酸、4-羥基鳥胺酸或2,4-二胺基-5-羥基戊酸殘基之一部分；L係間隔子或鍵；JD’係連接細胞毒性劑D與基團L之連接部分；D係經由該連接部分JD’共價連接至L或當L係鍵時連接至CBA之細胞毒性劑；且w係1、2、3或4。
任何醛反應性基團均可用於本發明中。示例性醛反應性基團包括但不限於，R.C.Larock,1999,Comprehensive Organic Transformations，第2版，Wiley-VCH中描述之該等基團。
在一個實施例中，醛反應性基團為肼、醯肼或羥基胺。
在另一實施例中，醛反應性基團係選自： 其中：Xa為CH2、O或NCH3；U’為NH、O、S或CH2；U為H或供電子基團；Xb及Xb’各自獨立地為-OH、-SH或-NH2；RZ及RZ’各自獨立地為H或烷基(較佳為-Me)；RZ’’為H或烷基；及Xc為N或CH。更具體言 之，該醛反應性基團為、或。
在第1個具體實施例中，對於具有結構式(I)之偶聯物或其醫藥學上可接受之鹽，JCB’係由以下結構式之一表示： 其中：Xa為CH2、O或NCH3；U’為NH、O、S或CH2；U為H或供電子基團；Xb1及Xb1’各自獨立地為-O-、-S-或-NH-；RZ及RZ’各自獨立地為H或烷基(較佳為-Me)；且RZ’’為H或烷基；s1為共價連接至該細胞結合劑之位點；且s2為共價連接至基團L之位點。更具體言之，JCB’為
在第2個具體實施例中，對於具有式(I)之偶聯物或其醫藥學上可接受之鹽，-L-JD’-係由以下結構式表示：
其中：s3為共價連接至基團JCB’之位點；s4為共價連接至基團D之位點；Za1為不存在、-SO2NR9-、-NR9SO2-、-C(=O)-NR9-、-NR9-C(=O)-、-(CH2CH2)p’NR9-C(=O)-、-C(=O)-NR9(CH2CH2)p’、-(CH2CH2)p’-C(=O)NR9-、-NR9C(=O)(CH2CH2)p’-、-C(=O)-O-或-O-C(=O)-；Ra2為不存在、-SO2NR9-、-NR9SO2-、-C(=O)-NR9-、-NR9-C(=O)-、-C(=O)-O-、-O-C(=O)-、-C(=O)-NR9-(CH2CH2O)p-、-NR9-C(=O)-(CH2CH2O)p-、-(OCH2CH2)p-C(=O)NR9-或-(OCH2CH2)p-NR9-C(=O)-；R9為H或視情況經取代之烷基；p及p’各自獨立地為1至10之整數；Q為H、帶電荷之取代基或可離子化之基團；Ra1、Ra2、Ra3、Ra4在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基；q1及r1各自獨立地為0至10之整數，條件為q1及r1不同時為0；且其餘變數係如以上第一實施例或第1個具體實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例中所描述。
在一個實施例中，Q為i)H；ii)-SO3H、-Z’-SO3H、-OPO3H2、-Z’-OPO3H2、-PO3H2、-Z’-PO3H2、-CO2H、-Z’-CO2H、-NR11R12或-Z’-NR11R12，或其醫藥學上可接受之鹽；或iii)-N+R14R15R16X-或-Z’-N+R14R15R16X-；Z’為視 情況經取代之伸烷基、視情況經取代之伸環烷基或視情況經取代之伸苯基；R14至R16各自獨立地為視情況經取代之烷基；X-為醫藥學上可接受之陰離子；且其餘變數係如以上在第2個具體實施例中所描述。更具體言之，Q為-SO3H或-CO2H，或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，Za1不存在；Za2為-C(=O)-NR9-或-NR9-C(=O)-；且其餘變數係如以上在第2個具體實施例之任何實施例中所描述。更具體言之，R9為H。
在又另一實施例中，Za1及Za2均不存在；且其餘變數係如以上在第2個具體實施例之任何實施例中所描述。
在另一實施例中，Ra1、Ra2、Ra3及Ra4均為-H；q及r各自獨立地為0至4之整數；且其餘變數係如以上在第2個具體實施例之任何實施例中所描述。
在又另一實施例中，對於具有式(I)之偶聯物或其醫藥學上可接受之鹽，-L-JD’-係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽；且其餘變數係如以上第一實施例或第1個具體實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例中所描述。
在第3個具體實施例中，對於具有式(I)之偶聯物或其醫藥學上可接受之鹽，-L-JD’-係由以下結構式表示： 其中：s3為共價連接至基團JCB’之位點；s4為共價連接至基團D之位點；Zb1及Zb2各自獨立地為不存在、-SO2NR9-、-NR9SO2-、-C(=O)-NR9-、-NR9-C(=O)-、-C(=O)-O-、-O-C(=O)-、-CH2-O-、-O-CH2-、-(CH2CH2O)p-或-(OCH2CH2)p’-、-NR9-C(=O)-CH2-或-CH2-C(=O)-NR9-，其中p及p’獨立地為1至1000之整數；E1及E2之一為-C(=O)-，且另一個為-NR9-；或E1及E2之一為-C(=O)-或-NR9-，且另一個不存在；R9為H或視情況經取代之烷基；P為[XX]1-10，其中每個XX為獨立選擇之胺基酸之殘基，或P為-(NRm-CH2CH2)s-；s為1至5之整數；Rm為H，或視情況經帶電荷之取代基或可離子化之基團取代的烷基；Rb1、Rb2、Rb3、Rb4、Rb5及Rb6在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基；m1及n1在每次出現時獨立地為0至10之整數；且其餘變數係如以上第一實施例或第1個具體實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例中 所描述。
在一個實施例中，對於具有式(I)之偶聯物或其醫藥學上可接受之鹽，-L-JD’-係由以下結構式表示： 其中：Zb1及Zb2不存在，或Zb1及Zb2之一不存在且另一個為-CH2-O-或-O-CH2-；n1為1至6之整數；且其餘變數係如以上第一實施例或第1個具體實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例中所描述。更具體言之，Rb1及Rb2均為H。
在另一個實施例中，對於具有式(I)之偶聯物或其醫藥學上可接受之鹽，-L-JD’-係由以下結構式表示： 其中：Zb1及Zb2各自獨立地為不存在、-CH2-O-、-O-CH2-、-NR9-C(=O)-CH2-或-CH2-C(=O)-NR9-；n1及m1各自獨立地為1至6之整數；且其餘變數係如以上第一實施例或第1個具體實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例中所描述。
在一個更具體之實施例中，對於以上任何實施例中所描述之式(L2)，Zb1及Zb2均不存在。在又另一更具體之實施例中，對於上述式(L2)， Zb1為-CH2-O-；且Zb2不存在。或者，對於上述式(L2)，Zb1為-CH2-C(=O)-NR9-；且Zb2為-O-CH2-或不存在。甚至更具體言之，R9為-H。
在一個實施例中，對於以上任何實施例中所描述之式(L2)，P為[XX]2-4。在又另一個實施例中，對於以上任何實施例中所描述之式(L2)，P為[XX]2或[XX]3。如本文所使用，每一XX為獨立選擇之胺基酸的殘基。
在另一個實施例中，對於以上任何實施例中所描述之式(L2)，P為蛋白酶可裂解之肽。更具體言之，P為腫瘤組織中表現之蛋白酶可裂解之肽。在又另一個更具體之實施例中，P為溶酶體蛋白酶可裂解之肽。
在又另一個實施例中，對於以上任何實施例中所描述之式(L2)，P係選自由以下各物組成之群：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：17)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：18)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：19)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、andD-Ala-D-Ala.、Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、d-Ala-Ala-Ala、Ala-d-Ala-Ala、Ala-Ala-d-Ala、Ala-Val-Cit及Ala-Val-Ala。更具體言之，P為Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、d-Ala-Ala-Ala、Ala-d-Ala-Ala、Ala-Val-Ala、Gly-Gly或Ala-Ala。
在另一個實施例中，對於具有式(I)之偶聯物或其醫藥學上可接受之鹽，-L-JD’-係由以下結構式表示： 且其餘變數係如以上第一實施例或第1個具體實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例中所描述。
在第4個具體實施例中，對於具有式(I)之偶聯物或其醫藥學上可接受之鹽，-L-JD’-係由以下結構式表示： s3為共價連接至基團JCB’之位點；s4為共價連接至基團D之位點；Zc1為不存在、-SO2NR9-、-NR9SO2-、-C(=O)-NR9、-NR9-C(=O)-、-C(=O)-O-、-O-C(=O)-、-CH2-O-、-O-CH2-、-(CH2CH2O)p-或-(OCH2CH2)p’-，其中p及p’獨立地為1至1000之整數； JD’為、、 ，其中s1’係共價連接至細胞毒性劑D之位點；s2’ 係共價連接至基團A’之位點；A及A’各自獨立地為視情況經取代之伸烷基、視情況經取代之伸烯基、視情況經取代之伸炔基、視情況經取代之伸環烷基、視情況經取代之伸環烯基或視情況經取代之伸環炔基；Q為-Z1-P-Z2-；Q’為-Z1’-P’-Z2’-；Z1及Z2之一為-C(=O)-，且另一個為-NRh-；Z1’及Z2’之一為-C(=O)-，且另一個為-NRh’-；P及P’各自獨立地為不存在、視情況經取代之伸烷基、-(CH2-CH2-O)j-、-(O-CH2-CH2)j-或[XX]1-10，其中每個XX為獨立選擇之胺基酸的殘基；j為介於1與500之間之整數；k為0或1；L為-(CR5R6)v-、-(CR7R8)q-N(Rg)-(CR9R10)r-、-(CR7R8)q-C(Ra)(Rg)-(CR9R10)r或-(CR11R12)s-N(Rg)-(CR13R14)t-N(Rg’)-(CR15R16)u-；Rg及Rg’各自獨立地為-(CR17R18)p-Z-V；p為介於1與5之間之整數；V為H、帶電荷之取代基或可離子化之基團；Z為不存在、-C(=O)NRh-伸烷基-或-NRh-C(=O)-伸烷基-； Rh及Rh’在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基；R5至R18在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基；q、r、s、t、u及v各自獨立地為介於0與10之間之整數；且其餘變數係如以上第一實施例或第1個具體實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例中所描述。
在一個實施例中，對於具有式(I)之偶聯物或其醫藥學上可接受之鹽，-L-JD’-係由以下結構式表示： 其中：R19至R22在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基；m及n各自獨立地為0至10；且其餘變數係如以上在第一實施例或第1個具體實施例中所描述。更具體言之，R19至R22各自為H；R5及R6各自為H；R7至R10各自為H；且R11至R16各自為H。
在一個實施例中，對於式(L4)-(L11)，P及P’在每次出現時獨立地為[XX]1-10。更具體言之，P及P’在每次出現時獨立地為[XX]2-5；且其餘變數係如以上所描述。
在另一個實施例中，對於式(L4)-(L11)，P及P’各自為可經蛋白酶裂解之肽。在又另一個實施例中，P及P’各自為腫瘤組織中表現之蛋白酶可裂解之肽。或者，P及P’各自為溶酶體蛋白酶可裂解之肽。
在另一個實施例中，對於式(L4)-(L11)，P及P’各自選自由以下各物組成之群：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：17)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：18)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：19)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala及D-Ala-D-Ala、Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、 Ala-Ala-D-Ala、Ala-Val-Cit、Ala-Val-Ala及β-Ala-Gly-Gly-Gly。更具體言之，P及P’各自為Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Val-Ala或β-Ala-Gly-Gly-Gly。
在某些實施例中，以上所描述之任何實施例中之[XX]在每次出現時為獨立選擇之胺基酸的殘基，該胺基酸係選自：天然存在之胺基酸、合成胺基酸、胺基酸類似物，或以與該等天然存在之胺基酸類似之方式起作用的胺基酸模擬物。
在某些實施例中，以上所描述之任何實施例中之[XX]在每次出現時為獨立選擇之胺基酸的殘基，該胺基酸係選自由以下各物組成之群：組胺酸、丙胺酸、異白胺酸、精胺酸、白胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、天冬胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸、苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、甘胺酸、纈胺酸、脯胺酸、絲胺酸、酪胺酸、N-甲基-組胺酸、N-甲基-丙胺酸、N-甲基-異白胺酸、N-甲基-精胺酸、N-甲基-白胺酸、N-甲基-天冬醯胺酸、N-甲基-離胺酸、N-甲基-天冬胺酸、N-甲基-甲硫胺酸、N-甲基-半胱胺酸、N-甲基-苯丙胺酸、N-甲基-麩胺酸、N-甲基-蘇胺酸、N-甲基-麩醯胺酸、N-甲基-色胺酸、N-甲基-甘胺酸、N-甲基-纈胺酸、N-甲基-脯胺酸、N-甲基-絲胺酸、N-甲基-酪胺酸、羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、硒代半胱胺酸、O-磷酸絲胺酸、高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶、瓜胺酸、鳥胺酸、半胱胺酸磺酸、半胱胺酸亞磺酸、3-胺基丙胺酸、3-二甲基胺基丙胺酸、2-胺基-4-(二甲基胺基)丁酸、2,4-二胺基丁酸、2-胺基-6-(二甲基胺基)己酸、2-胺基-5-(二甲基胺基)戊酸及β-丙胺酸，其各自獨立地為L或D異構體。更具體言之，每個XX獨立地為甘胺酸或丙胺酸 的殘基。
在第5個具體實施例中，對於具有式(I)之偶聯物，D為類美登素；且其餘變數係如以上在第一實施例或第1、2、3或4個實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例中所描述。
在一個更具體之實施例中，D係由以下結構式表示之類美登素： 其中：RM、RM’及RM”在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基；R1’、R2’、R3’及R4’在每次出現時獨立地為H、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之環烷基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；i為介於0與15之間之整數；且s5為共價連接至基團JD’之位點；-L-JD’-係如以上在第一實施例或第2或4個具體實施例，或其中所描述之更具體之實施例中所描述。
更具體言之，D係由以下結構式表示：
在又另一具體實施例中，D係由以下結構式表示： 其中：RM、RM’及RM”在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基；s5為共價連接至基團JD’之位點；且-L-JD’-係如以上在第一實施例或第3個具體實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例中所描述。
更具體言之，D係由以下結構式表示：
在第6個具體實施例中，D為苯并二氮呯化合物；且其餘變數係如以上在第一實施例或第1、2、3或4實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例中所描述。示例性苯并二氮呯化合物包括但不限於，美國專利號8,765,740、8,426,402、US2014/0088089、WO2011/130613、WO2011/130616、WO2010/091150及WO2009/016516中所描述之該等化合物。該等參考文獻之完整教示內容以引用之方式併入本文中。
在一個更具體之實施例中，D係由以下結構式表示之苯并二氮呯： 其中：在N與C之間之雙線表示單鍵或雙鍵，條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，並且當其為單鍵時，X係選自-H、鍵結至該反應性基團之連接基團或胺保護基(較佳X為-H)；Y係選自-H、-OR、-OCOR’、-SR、-NR’R”、-SO3M、-SO2M或-OSO3M，其中M為-H或陽離子，諸如Na+或K+； R為-H、視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基，或PEG基團-(CH2CH2O)n-Rc，其中n為1至24之整數，且Rc為具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；R’與R”相同或不同，且選自-H；-OH；-OR；-NRRg’；-COR；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基；視情況經取代的具有1至6個選自O、S、N及P之雜原子之3員至18員雜環；PEG基團-(CH2CH2O)n-Rc，其中n為1至24之整數，較佳n為2、4或8；且Rg’為-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；或PEG基團-(CH2CH2O)n-Rc；X’係選自由以下各物組成之群：-H；-OH；經取代或未經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；苯基；及胺保護基；Y’係選自由以下各物組成之群：-H；側氧基；經取代或未經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；A及A’係選自-O-及-S-；W’不存在，或選自-O-、-N(Re)-、-N(Re)-C(=O)-、-N(C(=O)Re)-、-S-或-CH2-S-、-CH2NRe-；Rx不存在，或選自具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基；Re為-H；具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；或-(CH2-CH2-O)n-Rk，其中Rk為-H；具有1至6個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基，視情況帶有二級胺基(例如-NHR101)或三級胺基(-NR101R102)； 或者5員或6員含氮雜環，諸如哌啶或嗎啉，其中R101及R102各自獨立地為具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；且G係選自-CH-或-N-；X’’與X'''相同或不同，且獨立地選自-(CH2)n’-、-NR’-、-CO-、-BH-、-SO-或-SO2-；Y’’與Y'''相同或不同，且獨立地選自-O、-(CH2)n’-、-NR’-或-S-；Z’’與Z'''相同或不同，且獨立地選自-(CH2)n’-、-CR7’R8’-、-NR9’-、-O-及-S-；n’係選自0、1、2及3；R7’與R8’相同或不同，並且各自獨立地選自-H、-OH、-SH、-COOH、-NHR’、聚乙二醇單元-(OCH2CH2)n-、胺基酸、帶有2至6個胺基酸之肽單元、視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基；R9 ’獨立地選自-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基；聚乙二醇單元-(OCH2CH2)n-；RA、RA’、RB及RB’相同或不同，並且各自獨立地選自由以下各物組成之群：-H、鹵基，或視情況經取代的具有1至10個碳原子之分支鏈、直鏈或環狀烷基；或RA與RA’及/或RB與RB’一起分別形成含有雙鍵之基團=B及=B’；=B與=B’相同或不同，且獨立地選自視情況經取代的分支鏈或直鏈烯基或羰基；QA為QA1-Ar-QA2；QA’為QA1’-Ar’-QA2’； QA1及QA1’各自獨立地為不存在、具有1至6個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基，或-CH=CH單元；Ar及Ar’各自獨立地不存在，或表示芳基；QA2及QA2’各自獨立地選自-H；與該反應性基團鍵結之連接基團；經取代或未經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-Rc’-(OCH2CH2)n-Rc；或選自鹵素、胍鎓[-NH(C=NH)NH2]、-OR、-NR’R’’、-NO2、-NCO、-NR’COR’’、-SR、由-SOR’表示之亞碸、由-SO2R’表示之碸、磺酸酯基-SO3M、硫酸酯基-OSO3M、由SO2NR’R’’表示之磺醯胺、氰基、疊氮基、-COR’、-OCOR’或-OCONR’R’’之取代基；且Rc’不存在，或選自具有1至5個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基。
在又另一更具體之實施例中，D係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中RA”與RB”相同或不同，且選自-H及-Me；且其餘變數係如以上所描述。
在某些實施例中，對於式(D6)-(D17)，在N與C之間之雙線表示單鍵或雙鍵，條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H；Y為-OH或-SO3M；M為-H或醫藥學上可接受之陽離子(例如Na+)；X’及Y’均為-H；A及A’均為-O-；R6為-OMe；且Rx為具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基。
在一個更具體之實施例中，D係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中Y為-H或-SO3M，且M為H+或陽離子。甚至更具體言之，Y為-SO3M，且M為H+、Na+或K+。
在第7個具體實施例中，對於具有式(I)之偶聯物，-L-JD’-為鍵；且D係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：L’、L’’及L'''之一係由下式表示：
且其餘兩個相同或不同，且獨立地選自-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(OCH2CH2)n-Rc；鹵素；胍鎓[-NH(C=NH)NH2]；-OR；-NR’R’’；-NO2；-NR’COR’’；-SR；-SOR’；-SO2R’；-SO3H；-OSO3H；-SO2NR’R’’；氰基；疊氮基；-COR’；-OCOR’；及-OCONR’R’’；Zd1為不存在、-C(=O)-NR9-或-NR9-C(=O)-；P為胺基酸殘基或含有介於2至20個之間之胺基酸殘基的肽；Ra及Rb在每次出現時獨立地為-H、(C1-C3)烷基或帶電荷之取代基，或可離子化之基團Q；r及r’獨立地為1至6之整數；在N與C之間之雙線表示單鍵或雙鍵，條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，且當其為單鍵 時，X為-H或胺保護基；Y為選自以下之離去基團：-OR、-OCOR’、-OCOOR’、-OCONR’R’’、-NR’R’’、-NR’COR’’、-NR’NR’R’’、視情況經取代之5員或6員含氮雜環(例如，經由氮原子附接之哌啶、四氫吡咯、吡唑、嗎啉等)、由-NR’(C=NH)NR’R’’表示之胍鎓、胺基酸或由-NRCOP’表示之肽、-SR、-SOR’、鹵素、氰基、疊氮基、-OSO3H、亞硫酸酯基(-SO3H或-SO2H)、偏亞硫酸酯(H2S2O5)、單-、二-、三-及四-硫代磷酸酯(PO3SH3、PO2S2H2、POS3H2、PS4H2)、硫代磷酸酯(RiO)2PS(ORi)、RiS-、RiSO、RiSO2、RiSO3、硫代硫酸酯(HS2O3)、連二亞硫酸酯(HS2O4)、二硫代磷酸酯(P(=S)(ORk’)(S)(OH))、羥肟酸(Rk’C(=O)NOH)及甲醛次硫酸根(HOCH2SO2 -)，或其混合物，其中Ri為具有1至10個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，且經至少一個選自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H及-PO3H之取代基取代；Ri可進一步視情況經本文關於烷基所描述之取代基取代；Rj為具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；Rk’為具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、芳基、雜環基或雜芳基；P’為胺基酸殘基或含有介於2至20個之間之胺基酸殘基的肽；R在每次出現時獨立地選自由以下各物組成之群：-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(CH2CH2O)n-Rc；視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基；視情況經取代的含有一個或多個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的5員至18員雜芳基環；或視情況經取代的含有1至6個獨立地選自O、S、N及P之雜原子的3員至18員雜環； R’及R’’各自獨立地選自-H；-OH；-OR；-NHR；-NR2；-COR；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(CH2CH2O)n-Rc；及視情況經取代的具有1至6個獨立地選自O、S、N及P之雜原子的3員至18員雜環；Rc為-H，或視情況經取代的具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；n為1至24之整數；X’係選自-H；胺保護基；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(CH2CH2O)n-Rc；視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基；視情況經取代的含有一個或多個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的5員至18員雜芳基環；及視情況經取代的含有1至6個獨立地選自O、S、N及P之雜原子的3員至18員雜環；Y’係選自-H；側氧基；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；視情況經取代之6員至18員芳基；視情況經取代的含有一個或多個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的5員至18員雜芳基環；視情況經取代的含有1至6個雜原子之3員至18員雜環；R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’及R4’各自獨立地選自由以下各物組成之群：-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(OCH2CH2)n-Rc；鹵素；胍鎓[-NH(C=NH)NH2]；-OR；-NR’R’’；-NO2；-NCO；-NR’COR’’；-SR；-SOR’；-SO2R’；-SO3 -H；-OSO3H；-SO2NR’R’’；氰基；疊氮基；-COR’；-OCOR’；及-OCONR’R’’；R6為-H、-R、-OR、-SR、-NR’R’’、-NO2或鹵素； A與A’相同或不同，且獨立地選自-O-、側氧基(-C(=O)-)、-CRR’O-、-CRR’-、-S-、-CRR’S-、-NR5及-CRR’N(R5)-；且R5及R9各自獨立地為-H或視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；且其餘變數係如以上在第一實施例或第1個具體實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例中所描述。
在一個更具體之實施例中，對於式(D18)-(D23)，L’係由式(A)表示，且L”及L”’均為-H。
在另一個更具體之實施例中，對於式(D18)-(D23)：在N與C之間之雙線表示單鍵或雙鍵，條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，Y為-OH或-SO3M；R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’及R4’均為-H；R6為-OMe；X’及Y’均為-H；A及A’為-O-；且M為H+、Na+或K+；且其餘變數係如以上第7個具體實施例或以上所描述之任何更具體之實施例中所描述。
在又另一更具體之實施例中，對於式(D18)-(D23)，Ra及Rb均為H；且其餘變數係如以上第7個具體實施例或以上所描述之任何更具體之實施例中所描述。
在另一更具體之實施例中，對於式(D18)-(D23)，R5及R9各自獨立地為H或Me；且其餘變數係如以上第7個具體實施例或以上所描述之任何更具體之實施例中所描述。更具體言之，R5及R9均為H。
在另一更具體之實施例中，對於式(D18)-(D23)，P為含有2至10個胺基酸殘基之肽；且其餘變數係如以上第7個具體實施例或以上所描述之任何更具體之實施例中所描述。更具體言之，P為含有2至5個胺基酸殘基之肽。甚至更具體言之，P係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：17)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：18)及Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：19)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala及D-Ala-D-Ala。
在另一更具體之實施例中，對於具有式(I)之偶聯物，-L-JD’-D係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中Y為-H或-SO3M，且M為H+、Na+或K+。
在第8個具體實施例中，式(I)之偶聯物係由以下結構式表示：
以上所描述之任一實施例(諸如第一實施例或第1至8個具體實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例)之偶聯物中的CBA可為本文所描述之任何細胞結合劑，諸如以下第二實施例中所描述之該等細胞結合劑。
在某些實施例中，以上所描述之任一實施例(諸如第一實施例或第1至8個具體實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例)之偶聯物可包含每個細胞結合劑(例如抗體)分子結合之1-4個細胞毒性劑分子。在某些實施例中，該等偶聯物可包含每個細胞結合劑分子2或4個細胞毒性劑分子。每個細胞結合劑(例如抗體)分子所結合之細胞毒性劑分子的數量可經光譜法，藉由量測類美登素化合物在280nm與252nm下之吸光度比率，及苯并二氮呯化合物在280nm與330nm下之吸光度比率來確定。或者，每個細胞結合劑(例如抗體)分子所結合之細胞毒性劑分子的數量可藉由質譜法確定。
本發明進一步提供一種組成物，其包含以上所描述之任一實 施例(諸如第一實施例或第1至8個具體實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例)之偶聯物。在某些實施例中，該組成物中至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.5%、99.9%或更高百分比之偶聯物具有2或4個細胞毒性劑共價連接至每一CBA。在某些實施例中，在以上所描述之組成物中，不超過約20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%之偶聯物僅具有1個細胞毒性劑共價連接至每一CBA。
細胞結合劑
在第二實施例中，本發明提供一種用於製備本文所描述之細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物之細胞結合劑(CBA)。此類CBA可為一種蛋白質(例如自然界中所發現之蛋白質，或者工程改造的或重組蛋白質)，諸如抗體、其抗原結合部分(其可包括抗體衍生物)或抗體模擬蛋白。此類蛋白質CBA之N末端可包含2-羥基乙胺部分，其可為絲胺酸、蘇胺酸、羥基離胺酸、4-羥基鳥胺酸或2,4-二胺基-5-羥基戊酸殘基之一部分。2-羥基乙胺部分可使用本發明之方法氧化而變為醛基，醛基可接著與醛反應性基團反應以形成主題偶聯物。
在一相關態樣中，本發明亦提供某些工程改造之蛋白質CBA，諸如工程改造之抗體、其抗原結合部分(或抗體衍生物)，或抗體模擬蛋白，其可具有Ser或Thr作為N末端殘基，與此類抗體、其抗原結合部分(或抗體衍生物)或抗體模擬蛋白之無Ser、無Thr天然序列相對。
可藉由緊接著信號肽序列之後插入Ser/Thr密碼子來添加N末端Ser/Thr。該信號肽序列可為抗體、其抗原結合部分(或抗體衍生物)或抗 體類比蛋白之天然信號肽，或可為N末端與該抗體、其抗原結合部分(或抗體衍生物)或抗體模擬蛋白之成熟加工序列融合之異源信號肽。
此處，「成熟加工序列(例如重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列)」係指某些分泌蛋白，諸如該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之經過加工的序列，該分泌蛋白經合成而具有N末端信號肽(天然存在之信號肽，或使用重組技術N末端融合之異源信號肽)。在包括信號肽裂解在內之正常成熟過程之後，所得到的成熟加工序列一般缺乏所有信號肽序列。
SEQ ID NO：1及6可用作此類天然或異源信號肽。抗體、其抗原結合部分(或抗體衍生物)或抗體模擬蛋白之成熟加工序列中的N末端殘基可能存在另外的序列變化，只要在信號肽裂解之後，N末端殘基為Ser/Thr即可。
具體言之，可藉由使用自鼠類抗FOLR1抗體FR1-2.1(由2013年4月16日保藏於ATCC且ATCC保藏號為PTA-120197之雜交瘤產生)之輕鏈信號肽獲得的特定信號肽序列來添加N末端Ser/Thr，該信號肽係由SEQ ID NO：1表示。已意外地發現，此信號肽序列以獨特方式進行加工而留下其最後一個Ser作為蛋白質之成熟加工序列的N末端殘基。
不管N末端Ser/Thr係天然存在於CBA中，抑或使用本文所描述之任何重組技術工程改造的，本發明之另一態樣進一步提供一種經修飾之CBA(例如經修飾抗體、其抗原結合部分(或抗體衍生物)或抗體模擬蛋白)，其中其N末端Ser/Thr已氧化成醛基。在某些實施例中，醛係衍生自抗體或其抗原結合部分之重鏈上N末端Ser/Thr之氧化。該氧化可使用本文所 描述的本發明之任何方法進行。該經修飾CBA可與帶有醛反應性基團(諸如本文所描述之該等基團)之連接子反應以形成本發明之偶聯物。
因此，本發明亦提供一種使用本發明之經修飾CBA(例如，抗體、其抗原結合部分(或抗體衍生物)或抗體模擬蛋白)製備本文所描述之本發明偶聯物的方法。本發明進一步提供一種編碼任何經工程改造之CBA(例如，抗體、其抗原結合部分(或抗體衍生物)或抗體模擬蛋白)之多聚核苷酸，其產生具有N末端Ser/Thr之CBA的成熟加工序列。
在某些實施例中，醛基係位於蛋白質CBA(例如抗體或其抗原結合部分)之N末端。舉例而言，N末端醛基可衍生自N末端絲胺酸或蘇胺酸之氧化。
在一個實施例中，N末端絲胺酸或蘇胺酸可天然存在於蛋白質CBA(例如抗體或其抗原結合部分)中。舉例而言，該抗體或其抗原結合部分可包含SEQ ID NO：3之輕鏈序列，或源自於編碼SEQ ID NO：1之信號肽之相同小鼠生殖系序列的輕鏈序列。在一相關實施例中，該抗體或其抗原結合部分係包含SEQ ID NO：3之輕鏈序列，或源自於編碼SEQ ID NO：1之信號肽之相同小鼠生殖系序列之輕鏈序列的鼠類抗體或其抗原結合部分之嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體，或其抗原結合部分。
類似地，該抗體或其抗原結合片段可包含源自於鼠類IGKV6-32*01序列(亦即，SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSP，SEQ ID NO：20)之輕鏈序列。在一相關實施例中，該抗體或其抗原結合部分係包含源自 於IGKV6-32*01序列SEQ ID NO：20之輕鏈序列的鼠類抗體或其抗原結合部分之嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體，或其抗原結合部分。
此外，該抗體或其抗原結合部分可包含源自於以下所列人類λ V3家族V基因序列(亦即，SEQ ID NO：21-41)中任一個的輕鏈序列。在一相關實施例中，該抗體或其抗原結合部分係包含源自於以下所列人類λ V3家族V基因序列之輕鏈序列的鼠類抗體或其抗原結合部分之嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體，或其抗原結合部分。
人類λ V3家族V基因序列
IGLV3-1*01
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTA(SEQ ID NO：21)
IGLV3-10*01
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCGGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDSKRPSGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSTDSSGNHX(SEQ ID NO：22)
IGLV3-10*02
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYKDSKRPSGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEDDYYCYSADYSGN(SEQ ID NO：23)
IGLV3-12*01
SYELTQPHSVSVATAQMARITCGGNNIGSKAVHWYQQKPGQDPVLVIYSDSNRPSGIPERFSGSNPGNTTTLTISRIEAGDEADYYCQVWDSSSDHP(SEQ ID NO：24)
IGLV3-12*02
SYELTQPHSVSVATAQMARITCGGNNIGSKAVHWYQQKPGQDPVLVIYSDSNRPSGIPERFSGSNPGNTATLTISRIEAGDEADYYCQVWDSSSDHP(SEQ ID NO：25)
IGLV3-13*01
SYELTQPPAVSVSPGQTARISCSGDVLRDNYADWYPQKPGQAPVLVIYKDGERPSGIPERFSGSTSGNTTALTISRVLTKGGADYYCFSGD*NNL(SEQ ID NO：26)
IGLV3-16*01
SYELTQPPSVSVSLGQMARITCSGEALPKKYAYWYQQKPGQFPVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGTIVTLTISGVQAEDEADYYCLSADSSGTYP(SEQ ID NO：27)
IGLV3-19*01
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHL(SEQ ID NO：28)
IGLV3-21*01
SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHP(SEQ ID NO：29)
IGLV3-21*02
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHP(SEQ ID NO：30)
IGLV3-21*03
SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHP(SEQ ID NO：31)
IGLV3-22*01
SYELTQLPSVSVSPGQTARITCSGDVLGENYADWYQQKPGQAPELVIYEDSERYPGIPERFSGSTSGNTTTLTISRVLTEDEADYYCLSGDEDNP(SEQ ID NO：32)
IGLV3-25*01
SYELMQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKQYAYWYQQKPGQAPVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQSADSSGTYP(SEQ ID NO：33)
IGLV3-25*02
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKQYAYWYQQKPGQAPVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQSADSSGTYP(SEQ ID NO：34)
IGLV3-25*03
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKQYAYWYQQKPGQAPVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQSADSSG(SEQ ID NO：35)
IGLV3-27*01
SYELTQPSSVSVSPGQTARITCSGDVLAKKYARWFQQKPGQAPVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGAQVEDEADYYCYSAADNNL(SEQ ID NO：36)
IGLV3-31*01
SSELSQEPAVSVALG*TARITCQGDSIEDSVVNWYKQKPSQAPGLVI*LNSVQSSGIPKKFSGSSSGNMATLTITGIQVEDKADYYCQSWDSSRTHS(SEQ ID NO：37)
IGLV3-31*02
SSELSQEPAVSVSLG*TARITCQGDSIEDSVVNWYKQKPSQAPGLVI*LNSVQSSGIPKKFSGSSSGNMATLTITGIQVEDKADYYCQSWDSSRTHS(SEQ ID NO：38)
IGLV3-32*01
SSGPTQVPAVSVALGQMARITCQGDSMEGSYEHWYQQKPGQAPVLVIYDSSDRPSRIPERFSGSKSGNTTTLTITGAQAEDEADYYYQLIDNHAT(SEQ ID NO：39)
IGLV3-9*01
SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTA(SEQ ID NO：40)
IGLV3-9*02
SYELTQPLSVSVALGQAARITCGGNNLGYKSVHWYQQKPGQAPVLVIYRDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAHP(SEQ ID NO：41)
人類化抗體或其抗原結合部分可為表面重塑或CDR移植之抗體，或其抗原結合部分。
在另一個實施例中，N末端絲胺酸或蘇胺酸可經工程改造至蛋白質CBA(例如抗體或其抗原結合部分)中。舉例而言，該抗體或其抗原結合部分可為本文所描述的本發明重組抗體中之任一種(參見下文)。
在某些實施例中，N末端醛基係位於該抗體或其抗原結合部分之一條或兩條重鏈上，或該抗體或其抗原結合部分之一條或兩條輕鏈上，或其組合上。
在某些實施例中，CBA為抗體或其抗原結合部分。在某些實施例中，抗原結合部分可為Fab、F(ab)2、F(ab’)、F(ab’)2、F(ab’)3、Fd、Fv、二硫鍵連接之Fv、dAb或sdAb(或奈米抗體)、CDR、scFv、(scFv)2、di-scFv、bi-scFv、tascFv(串聯scFv)、AVIBODY(例如雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體)、T細胞接合物(BiTE)、scFv-Fc、Fcab、mAb2、小模組免疫藥物(SMIP)、Genmab/單抗體或duobody、V-NAR結構域、IgNAR、微型抗體、IgG△CH2、DVD-Ig、probody、內抗體或多特異性抗體。在某些具體實施例中，抗原結合部分可為單結構域抗體(sdAb)或奈米抗體。
在某些實施例中，CBA為抗體模擬物，諸如DARPin、Centyrin、親和體、人類泛素、affitin、抗運載蛋白、高親和性多聚體、Fynomer、Kunitz結構域肽、單抗體(或adnectin)、三鏈抗體或nanofitin。在某些具體實施例中，CBA為DARPin。在其他具體實施例中，CBA為Centyrin。在又另一具體實施例中，CBA為單抗體或adnectin。在某些實施例中，CBA為雙受體重靶向(dual receptor retargeting，DART)分子(P.A.Moore等人，Blood,2011；117(17)：4542-4551；Veri MC等人，Arthritis Rheum.,2010年3月30日；62(7)：1933-43；Johnson,S等人，J.Mol.Biol.,2010 Apr 9；399(3)：436-49)或細胞穿透超荷電蛋白(cell penetrating supercharged protein)(Methods in Enzymol. 502,293-319(2012))。
在另一態樣中，本發明提供一種重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC) 或其抗原結合部分，其包含具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的異源信號肽。
本發明之這一態樣部分係基於意外地發現，SEQ ID NO：1，即抗體FR1-2.1之輕鏈信號肽可剛好在SEQ ID NO：1中最後一個Ser之前天然地裂解，由此在所得到的加工多肽(例如，以SEQ ID NO：1作為信號肽表現之重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分)中留下N末端絲胺酸。因此，SEQ ID NO：1之信號肽可與異源多肽(例如重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分)重組融合，且用於通用方法中以產生具有N末端Ser之多肽。
在某些實施例中，異源信號肽係與重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列的N末端融合。
在某些實施例中，異源信號肽係與重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列N末端之第2個胺基酸殘基融合。因此，在該實施例中，該加工多肽因SEQ ID NO：1中之N末端Ser而不具有一個額外的胺基酸殘基。在其他相關實施例中，異源信號肽係與重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列N末端部分之任何殘基(例如第3個殘基、第4個殘基、第5個殘基等)融合，引起一個或多個N末端殘基之「缺失」，只要該抗體或其抗原結合部分之結合能力基本上不受影響即可。或者或另外，可在N末端Ser之後添加一個或多個另外的殘基，只要N末端殘基係Ser，諸如來自SEQ ID NO：1最後一個殘基之Ser。
在一相關態樣中，本發明提供一種重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分，其包含緊鄰該重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之(天然)信號肽最後一個殘基之C末端的Ser或Thr殘基。此可藉由緊接 著該天然信號肽之編碼序列之後插入Ser或Thr之密碼子來實現。舉例而言，可在緊接著單株抗體huMov19輕鏈或重鏈之天然信號肽序列之後插入Ser殘基，以產生序列MGWSCIILFLVATATGVHSS(SEQ ID NO：42)。在天然信號肽序列之天然加工(裂解)之後，預期所得到的N末端殘基為Ser。
舉例而言，在某些實施例中，Ser或Thr殘基可緊鄰該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列第一個殘基之N末端。
在另一個實施例中，Ser或Thr殘基置換該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列之一個或多個N末端胺基酸殘基。或者或另外，可添加、缺失或置換另外的胺基酸殘基，只要在信號肽加工後得到的多肽之第1個殘基為Ser/Thr。
示例性重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分可具有序列：SEQ ID NO：10或14。其他可包括包含SEQ ID NO：42之序列。
本發明之又另一態樣提供一種重組抗體，其包含源自於本文所描述之主題重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之重鏈、輕鏈或其抗原結合部分的成熟加工序列。
舉例而言，該重組抗體可為或可包含Fab、F(ab)2、F(ab’)、F(ab’)2、F(ab’)3、Fd、Fv、二硫鍵連接之Fv、dAb或sdAb(或奈米抗體)、CDR、scFv、(scFv)2、di-scFv、bi-scFv、tascFv(串聯scFv)、AVIBODY(例如雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體)、T細胞接合物(BiTE)、scFv-Fc、Fcab、mAb2、小模組免疫藥物(SMIP)、Genmab/單抗體或duobody、V-NAR結構域、IgNAR、微型抗體、IgG△CH2、DVD-Ig、probody、內抗體或多特異性抗體。在某些 具體實施例中，抗原結合部分可為單結構域抗體(sdAb)或奈米抗體。
在某些實施例中，該重組抗體可包含1、2、3或4個分別源自於本文所描述之主題重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之重鏈、輕鏈或其抗原結合部分的成熟加工序列。
在某些實施例中，該重組抗體可為異二聚體抗體，其包含第一重鏈多肽及第二重鏈多肽，其中該第一重鏈多肽之Fc區及該第二重鏈多肽之Fc區在界面處接觸，且該第二重鏈多肽之Fc區的界面包含凸起，該凸起可定位於該第一重鏈多肽Fc區之界面中的空腔中。在某些實施例中，可基於例如Genentech/Roche之CrossMab技術，例如藉由交換CH1及κ恆定區以進一步減少或消除輕鏈錯配對來進一步改進結進孔(knob-into-hole)技術，該技術用以促進雙特異性抗體中重鏈之特異性配對。
或者，亦可使用LC異二聚體，諸如Zymeworks AZYMETRICTM異二聚IgG1輕鏈平臺技術來達到類似結果，該技術在開發完整雙特異性抗體時完整地補充了多種其他生物方法，包括共有輕鏈、結構域抗體及單鏈形式。
在某些實施例中，第二重鏈多肽之Fc區已自模板/原始多肽改變以編碼凸起，或第一重鏈多肽之Fc區已自模板/原始多肽改變以編碼空腔，或兩者。
在某些實施例中，該凸起及該空腔各自包含天然存在之胺基酸殘基。
在某些實施例中，構成凸起之第二重鏈多肽之Fc區係藉由用側鏈體積大於原始殘基之輸入殘基置換模板/原始多肽之界面中的原始殘 基來產生。
在某些實施例中，構成凸起之第二重鏈多肽之Fc區係藉由以下方法產生，該方法包括以下步驟，其中用編碼側鏈體積大於原始殘基之輸入殘基的核酸置換編碼該多肽之界面中之原始殘基的核酸。
本發明之又另一態樣提供一種經修飾抗體，其係由在重鏈、輕鏈或其抗原結合部分之成熟加工序列上具有N末端Ser或Thr的抗體氧化得到，其中在該經修飾抗體中，該N末端Ser或Thr已氧化成醛基。
在某些實施例中，該抗體係源自於重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分，其包含：(1)具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的異源信號肽；(2)緊鄰該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列第一個殘基之N末端的Ser或Thr殘基；或(3)置換該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列之一個或多個N末端胺基酸殘基的Ser或Thr殘基。
在某些實施例中，該抗體為包含SEQ ID NO：3之輕鏈序列的鼠類抗體或其抗原結合部分。
在某些實施例中，該抗體為包含SEQ ID NO：3之輕鏈序列的鼠類抗體或其抗原結合部分之嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體，或其抗原結合部分。人類化抗體或其抗原結合部分可為表面重塑或CDR移植之抗體，或其抗原結合部分。
本發明之另一態樣提供一種編碼本文所描述之主題重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分的多聚核苷酸。
在某些實施例中，該多聚核苷酸經密碼子優化以在哺乳動物 表現系統中表現。
本發明之另一態樣提供一種產生主題重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之方法，該方法包括在表現系統，諸如哺乳動物表現系統中表現本文所描述之主題多聚核苷酸。
如本文所使用，術語「細胞結合劑」或「CBA」係指可結合細胞(例如，在細胞表面配體上)或結合與細胞相連或鄰近細胞之配體(較佳以一種特異性方式結合)之化合物。在某些實施例中，與細胞或者細胞上或細胞附近之配體結合係特異性的。CBA可包括肽及非肽。對於具有凸起性質之CBA，若天然N末端殘基不為Ser或Thr，則可使用本文所描述之任何重組方法，例如藉由使用SEQ ID NO：1之異源信號肽，或藉由插入Ser/Thr密碼子以編碼N末端殘基，對該N末端殘基進行工程改造。
適當細胞結合劑之選擇係一個選擇問題，其部分取決於欲靶向之特定細胞群，而在許多(但非全部)情形中，人類化單株抗體係良好的選擇，若適當抗體係可獲得的。舉例而言，單株抗體MY9係特異性結合至CD33抗原之鼠類IgG1抗體(J.D.Griffin等人，Leukemia Res.,8：521(1984))，且在靶細胞表現CD33，如在急性骨髓性白血病(AML)中時可使用。
在某些實施例中，細胞結合劑不為蛋白質。舉例而言，在某些實施例中，細胞結合劑可為結合至維生素受體(諸如細胞表面受體)之維生素。就此而言，維生素A結合至視黃醇結合蛋白(RBP)，形成複合物，該複合物又以高親和力結合STRA6受體且增加維生素A之攝入。在另一實例中，葉酸/葉酸鹽/維生素B9以高親和力結合細胞表面葉酸受體(FR)，例如FR α。可使用葉酸或結合至FR α之抗體靶向在卵巢腫瘤及其他腫瘤(包括 過表現FR α之實體腫瘤，包括非小細胞肺癌(NSCLC))上表現之葉酸受體。此外，維生素D及其類似物結合至維生素D受體。
在其他實施例中，細胞結合劑為一種蛋白質或多肽，或包含蛋白質或多肽的化合物，包括抗體、非抗體蛋白質或多肽。
舉例而言，GM-CSF，一種結合至骨髓細胞之配體/生長因子因子，可用作針對來自急性骨髓性白血病之患病細胞的細胞結合劑。結合至活化T細胞之IL-2可用於預防移植物排斥反應，用於治療及預防移植物抗宿主疾病，及用於治療急性T細胞白血病。結合至黑素細胞之MSH及可針對黑素瘤之抗體可用於治療黑素瘤。表皮生長因子可用於靶向鱗狀細胞癌，諸如肺及頭頸部之鱗狀細胞癌。生長抑素可用於靶向神經母細胞瘤及其他腫瘤類型。雌激素(或雌激素類似物)可用於靶向乳癌。雄激素(或雄激素類似物)可用於靶向睪丸。
因此，在某些實施例中，細胞結合劑可為淋巴因子、激素、生長因子、集落刺激因子或養分轉運分子。
在某些實施例中，細胞結合劑為抗體模擬物，諸如錨蛋白重複序列蛋白、Centyrin、或adnectin/單抗體。
在其他實施例中，細胞結合劑為抗體、單鏈抗體、特異性結合至靶細胞之抗體片段、單株抗體、單鏈單株抗體、特異性結合至靶細胞之單株抗體片段(或「抗原結合部分」)、嵌合抗體、特異性結合至靶細胞之嵌合抗體片段(「抗原結合部分」)、結構域抗體(例如sdAb)，或特異性結合至靶細胞之結構域抗體片段。在某些實施例中，細胞結合劑為人類化抗體、人類化單鏈抗體或人類化抗體片段(或「抗原結合部分」)。
在另一實施例中，細胞結合劑為抗CD33抗體或其片段，諸如美國專利號7,557,189、7,342,110、8,119,787及8,337,855以及WO2004/043344(以引用之方式併入本文中)中所描述之抗體或其片段。在一具體實施例中，人類化抗體為huMy9-6或另一相關抗體，如美國專利號7,342,110及7,557,189中所描述。在另一實施例中，抗CD33抗體為huMy9-6抗體。
如本文所使用，帶雙底線之序列表示重鏈或輕鏈序列之可變區(亦即，重鏈可變區或HCVR，及輕鏈可變區或LCVR)，而粗體序列表示CDR區(亦即，自N末端至C末端，分別為來自重鏈或輕鏈序列之CDR1、CDR2及CDR3)。
在一個實施例中，抗CD33抗體包含具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：43)之免疫球蛋白 重鏈區，及具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：44)之免疫球蛋白輕鏈區。
在又另一實施例中，抗CD33抗體包含SEQ ID NO：43之重鏈CDR1-CDR3，及/或SEQ ID NO：44之輕鏈CDR1-CDR3，且較佳特異性結合CD33。
在又另一實施例中，抗CD33抗體包含與SEQ ID NO：43具有至少約90%、95%、97%、99%或100%同一性之重鏈可變區(HCVR)序列，及/或與SEQ ID NO：44具有至少約90%、95%、97%、99%或100%同一性之輕鏈可變區(LCVR)序列，且較佳特異性結合CD33。
在另一具體實施例中，人類化抗體為本文所描述之抗葉酸受體抗體。在另一具體實施例中，該抗體為美國專利號8,577,966中所描述之抗葉酸受體抗體。更具體言之，抗葉酸受體抗體為特異性結合人葉酸受體1之人類化抗體或其抗原結合片段。除非另外指示，否則如本文所使用，術語「人葉酸受體1」、「FOLR1」或「葉酸受體α(FR-α)」係指任何天然人FOLR1。因此，所有該等術語均可指如本文所指示之蛋白質或核酸序列。術語「FOLR1」涵蓋「全長」未加工之FOLR1以及由在細胞中加工得到的任何FOLR1形式。FOLR1抗體包含：(a)包含GYFMN(SEQ ID NO：45)之重鏈CDR1、包含RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(SEQ ID NO：46)之重鏈CDR2，及包含YDGSRAMDY(SEQ ID NO：47)之重鏈CDR3；及(b)包含KASQSVSFAGTSLMH(SEQ ID NO：48)之輕鏈CDR1、包含RASNLEA(SEQ ID NO：49)之輕鏈CDR2，及包含QQSREYPYT(SEQ ID NO：50)之輕鏈CDR3；其中Xaa1係選自K、Q、H及R；Xaa2係選自Q、H、N及R；且Xaa3係選自G、E、T、S、A及V。較佳地，重鏈CDR2序列包含RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQ ID NO：51)。
在另一實施例中，抗葉酸受體抗體為特異性結合人葉酸受體1之人類化抗體或其抗原結合片段，該人葉酸受體1包含具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：52)之重鏈。
在另一實施例中，抗葉酸受體抗體係由2010年4月7日保藏在ATCC且ATCC保藏號為PTA-10772及PTA-10773或PTA-10774之質體DNA編碼的人類化抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，抗葉酸受體抗體為特異性結合人葉酸受體1之人類化抗體或其抗原結合片段，該人葉酸受體1包含具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：53)；或 (SEQ ID NO：54)之輕鏈。
在另一實施例中，抗葉酸受體抗體為特異性結合人葉酸受體1之人類化抗體或其抗原結合片段，該人葉酸受體1包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：52之重鏈，及具有胺基酸序列SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：54之輕鏈。較佳地，該抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：52之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO：54之輕鏈(hu FOLR1)。
在另一實施例中，抗葉酸抗體係由2010年4月7日保藏在ATCC且ATCC保藏號為PTA-10772及PTA-10773或10774之質體DNA編碼的人類化抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，抗葉酸受體抗體係特異性結合人葉酸受體1且包含與 (SEQ ID NO：55)具有至少約90%、95%、99%或100% 同一性之重鏈可變結構域，及與 (SEQ ID NO：56)或 (SEQ ID NO：57)具有至少約90%、95%、99%或100%同一性之輕鏈可變結構域的人類化抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，抗葉酸受體抗體為huMov19或M9346A(參見例如，美國專利號8,709,432、美國專利號8,557,966，及WO2011106528，均以引用之方式併入本文中)。
在某些實施例中，人類化抗體為美國專利號8,765,917中所描述之抗CD37抗體(例如抗CD37-3)。在另一實施例中，細胞結合劑為抗CD37抗體或其抗原結合片段，如美國專利號8,765,917及WO 2011/112978(以引用之方式併入本文中)中所描述之該等抗體。在一個實施例中，抗CD37抗體為huCD37-3抗體。
在一個實施例中，抗CD37抗體包含具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：58)之免疫球蛋白輕鏈區，及具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：59)之免疫球蛋白重鏈 區，或具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：60)之免疫球蛋白重鏈區。
在另一實施例中，抗CD37抗體包含具有SEQ ID NO：58中陳述之胺基酸序列之免疫球蛋白輕鏈區，及具有SEQ ID NO：59中陳述之胺基酸序列之免疫球蛋白重鏈區。
在又另一實施例中，抗CD37抗體包含具有SEQ ID NO：58中陳述之胺基酸序列之免疫球蛋白輕鏈區，及具有SEQ ID NO：60中陳述之胺基酸序列之免疫球蛋白重鏈區。
在又另一實施例中，抗CD37抗體包含SEQ ID NO：59或60之重鏈CDR1-CDR3，及/或SEQ ID NO：58之輕鏈CDR1-CDR3，且較佳特異性結合CD37。
在又另一實施例中，抗CD37抗體包含與SEQ ID NO：59或60具有至少約90%、95%、97%、99%或100%同一性之重鏈可變區(HCVR)序列，及/或與SEQ ID NO：58具有至少約90%、95%、97%、99%或100%同一性之輕鏈可變區(LCVR)序列，且較佳特異性結合CD37。
在又另一實施例中，抗CD37抗體包含具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：61)之免疫球蛋白輕鏈區，及具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：62)之免疫球蛋 白重鏈區。
在又另一實施例中，抗CD37抗體包含SEQ ID NO：62之重鏈CDR1-CDR3，及/或SEQ ID NO：61之輕鏈CDR1-CDR3，且較佳特異性結合CD37。
在又另一實施例中，抗CD37抗體包含與SEQ ID NO：62具有至少約90%、95%、97%、99%或100%同一性之重鏈可變區(HCVR)序列，及/或與SEQ ID NO：61具有至少約90%、95%、97%、99%或100%同一性之輕鏈可變區(LCVR)序列，且較佳特異性結合CD37。
在又另一實施例中，抗CD37抗體為huCD37-50抗體。
在某些實施例中，人類化抗體為美國專利號8,790,649中所描述之抗EGFR抗體。在另一實施例中，該抗體為抗EGFR抗體。在一個實施例中，該抗EGFR抗體為非拮抗劑抗體，包括例如WO2012058592(以引用之方式併入本文中)中所描述之抗體。在另一實施例中，抗EGFR抗體為非功能性抗體，例如人類化ML66或EGFR-8。更具體言之，抗EGFR抗體為huML66。所有該等申請案之教示內容以引用之方式整體併入本文中。
在又另一實施例中，抗EGFR抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：63之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO：64之輕鏈。
在又另一實施例中，抗EGFR抗體包含SEQ ID NO：63之重鏈CDR1-CDR3，及/或SEQ ID NO：64之輕鏈CDR1-CDR3，且較佳特異性結合EGFR。
在又另一實施例中，抗EGFR抗體包含與SEQ ID NO：63具有至少約90%、95%、97%、99%或100%同一性之重鏈可變區(HCVR)序列，及/或與SEQ ID NO：64具有至少約90%、95%、97%、99%或100%同一性之輕鏈可變區(LCVR)序列，且較佳特異性結合EGFR。
在另一實施例中，抗EGFR抗體為8,790,649及WO 2012/058588(以引用之方式併入本文中)所描述之抗體。在一個實施例中，抗EGFR抗體為huEGFR-7R抗體。
在一個實施例中，抗EGFR抗體包含具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：65)之免疫 球蛋白重鏈區，及具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：66)之免疫球蛋白輕鏈區，或具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：67)之免疫球蛋白輕鏈區。
在另一實施例中，抗EGFR抗體包含具有SEQ ID NO：65中陳述之胺基酸序列之免疫球蛋白重鏈區，及具有SEQ ID NO：66中陳述之胺基酸序列之免疫球蛋白重鏈區。
在另一實施例中，抗EGFR抗體包含具有SEQ ID NO：65中 陳述之胺基酸序列之免疫球蛋白重鏈區，及具有SEQ ID NO：67中陳述之胺基酸序列之免疫球蛋白重鏈區。
在又另一實施例中，抗EGFR抗體包含SEQ ID NO：65之重鏈CDR1-CDR3，及/或SEQ ID NO：66或67之輕鏈CDR1-CDR3，且較佳特異性結合EGFR。
在又另一實施例中，抗EGFR抗體包含與SEQ ID NO：65具有至少約90%、95%、97%、99%或100%同一性之重鏈可變區(HCVR)序列，及/或與SEQ ID NO：66或67具有至少約90%、95%、97%、99%或100%同一性之輕鏈可變區(LCVR)序列，且較佳特異性結合EGFR。
在另一實施例中，細胞結合劑為抗CD19抗體，諸如美國專利號8,435,528及WO2004/103272(以引用之方式併入本文中)中所描述之該等抗體。在一個實施例中，抗CD19抗體包含具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：68)之免 疫球蛋白重鏈區，及具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：69)之免疫球蛋白輕鏈區。
在另一實施例中，抗CD19抗體為huB4抗體。
在又另一實施例中，抗CD19抗體包含SEQ ID NO：68之重鏈CDR1-CDR3，及/或SEQ ID NO：69之輕鏈CDR1-CDR3，且較佳特異性結合CD19。
在又另一實施例中，抗CD19抗體包含與SEQ ID NO：68具有至少約90%、95%、97%、99%或100%同一性之重鏈可變區(HCVR)序列，及/或與SEQ ID NO：69具有至少約90%、95%、97%、99%或100%同一性之輕鏈可變區(LCVR)序列，且較佳特異性結合CD19。
在又另一實施例中，細胞結合劑為抗Muc1抗體，諸如美國專利號7,834,155、WO 2005/009369及WO 2007/024222(以引用之方式併入本文中)中所描述之該等抗體。在一個實施例中，抗Muc1抗體包含具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：70)之免疫球蛋 白重鏈區，及具有胺基酸序列 (SEQ ID NO：71)之免疫球蛋白輕鏈區。
在另一實施例中，抗Muc1抗體為huDS6抗體。
在又另一實施例中，抗Muc1抗體包含SEQ ID NO：70之重鏈CDR1-CDR3，及/或SEQ ID NO：71之輕鏈CDR1-CDR3，且較佳特異性結合Muc1。
在又另一實施例中，抗Muc1抗體包含與SEQ ID NO：70具有至少約90%、95%、97%、99%或100%同一性之重鏈可變區(HCVR)序列，及/或與SEQ ID NO：71具有至少約90%、95%、97%、99%或100%同一性之輕鏈可變區(LCVR)序列，且較佳特異性結合Muc1。
在某些實施例中，細胞結合劑為表面重塑之抗體、表面重塑之單鏈抗體、表面重塑之抗體片段(或「抗原結合部分」)或雙特異性抗體。
在某些實施例中，細胞結合劑為微型抗體、avibody、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、奈米抗體、probody、結構域抗體或單抗體。
換言之，示例性細胞結合劑可包括抗體、單鏈抗體、特異性結合至靶細胞之抗體片段、單株抗體、單鏈單株抗體、特異性結合至靶細胞之單株抗體片段、嵌合抗體、特異性結合至靶細胞之嵌合抗體片段、雙特異性抗體、結構域抗體、特異性結合至靶細胞之結構域抗體片段、干擾素、淋巴因子(例如IL-2、IL-3、IL-4及IL-6)、激素(例如胰島素、促甲狀腺激素釋放激素、黑素細胞刺激激素及類固醇激素(例如雄激素及雌激素))、維生素(例如葉酸)、生長因子(例如EGF、TGF-α、FGF、VEGF)、集落刺激因子、養分轉運分子(例如轉鐵蛋白；參見O'Keefe等人(1985)J.Biol.Chem.260：932-937，以引用之方式併入本文中)、Centyrin(基於III型纖維連接蛋白(FN3)重複序列之共同序列的蛋白質支架；參見美國專利公開案2010/0255056、2010/0216708及2011/0274623，以引用之方式併入本文中)、錨蛋白重複序列蛋白(例如經設計之錨蛋白重複序列蛋白，稱為DARPin；參見美國專利公開案號2004/0132028、2009/0082274、2011/0118146及2011/0224100，以引用之方式併入本文中；且亦參見C.Zahnd等人，Cancer Res.(2010)70：1595-1605；Zahnd等人，J.Biol.Chem.(2006)281(46)：35167-35175；及Binz,H.K.,Amstutz,P.& Pluckthun,A.,Nature Biotechnology(2005)23：1257-1268，以引用之方式併入本文中)、錨蛋白樣重複序列蛋白或合成肽(參見例如，參見美國專利公開案號2007/0238667；美國專利號7,101,675；WO 2007/147213；及WO 2007/062466，以引用之方式併入本文中)、Adnectin(纖維連接蛋白結構域支架蛋白；參見美國專利公開案號2007/0082365、2008/0139791，以引用之方式併入本文中)、Avibody(包括雙鏈抗體、三鏈抗體及四鏈抗體；參見美國公開案號2008/0152586及2012/0171115)，及其他 細胞結合分子或物質。
在某些實施例中，細胞結合劑可為結合至靶細胞上之部分(諸如細胞表面受體)之配體。舉例而言，該配體可為生長因子或其結合至生長因子受體之片段，或可為細胞因子或其結合至細胞因子受體之片段。在某些實施例中，該生長因子受體或細胞因子受體為細胞表面受體。
在細胞結合劑為抗體或其抗原結合部分(包括抗體衍生物)，或某些抗體模擬物之某些實施例中，CBA可結合至靶細胞上之配體，諸如細胞表面配體，包括細胞表面受體。
具體示例性抗原或配體可包括腎素；生長激素(例如人生長激素及牛生長激素)；生長激素釋放因子；副甲狀腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血糖素；凝血因子(例如因子vmc、因子IX、組織因子及血管性血友病因子)；抗凝血因子(例如蛋白質C)；心房利鈉肽；肺表面活性物質；纖溶酶原活化物(例如尿激酶、人尿或組織型纖溶酶原活化物)；蛙皮素；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α及腫瘤壞死因子-β；腦啡肽酶；RANTES(亦即，正常T細胞表現及分泌之活性調控蛋白)；人巨噬細胞炎性蛋白-1-α；血清白蛋白(人血清白蛋白)；苗勒抑制物質(Muellerian-inhibiting substance)；鬆弛素A鏈；鬆弛素B鏈；鬆弛素原；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白(β-內醯胺酶)；DNA酶；IgE；細胞毒性T-淋巴細胞相關抗原(例如CTLA-4)；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；激素或生長因子受體；蛋白質A或D；類風濕因子；神經營養因子(例如骨源性神經營養因子、神經營養素-3、神經營養素-4、神經營養素-5或神 經營養素-6)、神經生長因子(例如NGF-β)；血小板源性生長因子；纖維母細胞生長因子(例如aFGF及bFGF)；纖維母細胞生長因子受體2；表皮生長因子；轉化生長因子(例如TGF-α、TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-β 4及TGF-β 5)；胰島素樣生長因子-I及胰島素樣生長因子-II；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)；胰島素樣生長因子結合蛋白；黑素轉鐵蛋白；EpCAM；GD3；FLT3；PSMA；PSCA；MUC1；MUC16；STEAP；CEA；TENB2；EphA受體；EphB受體；葉酸受體；FOLR1；間皮素；cripto；αv β 6；整合素；VEGF；VEGFR；EGFR；轉鐵蛋白受體；IRTA1；IRTA2；IRTA3；IRTA4；IRTA5；CD蛋白(例如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80 CD81、CD103、CD105、CD123、CD134、CD137、CD138及CD152)、一種或多種腫瘤相關抗原或細胞表面受體(參見美國公開案號20080171040或美國公開案號20080305044，以引用之方式整體併入)；紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白；干擾素(例如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ)；集落刺激因子(例如M-CSF、GM-CSF及G-CSF)；介白素(例如IL-1至IL-10)；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原(例如HIV包膜蛋白之一部分)；轉運蛋白、歸巢受體；地址素；調控蛋白；整合素(例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4及VCAM)；腫瘤相關抗原(例如HER2、HER3及HER4受體)；內皮素；c-Met；c-kit；1GF1R；PSGR；NGEP；PSMA；PSCA；TMEFF2；LGR5；B7H4；及以上所列多肽中任一種之片段。
如本文所使用，術語「抗體」包括免疫球蛋白(Ig)分子。在某些實施例中，該抗體為全長抗體，其包含四條多肽鏈，即，藉由二硫鍵互連之兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)。每一重鏈包含重鏈可變區(HCVR或VH)及重鏈恆定區(CH)。重鏈恆定區包含三個結構域，即CH1、CH2及CH3。每一輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR或VL)及輕鏈恆定區(CL)，該輕鏈恆定區包含一個結構域，即CL。VH區及VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)。在該等區域中間雜有保守性較強之構架區(FR)。每一VH及VL係由自胺基末端至羧基末端按以下次序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。
在某些實施例中，該抗體為IgG、IgA、IgE、gD或IgM。在某些實施例中，該抗體為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgA1或IgA2。
在某些實施例中，細胞結合劑為單株抗體之「抗原結合部分」，其共有對於抗原與抗體結合至關重要之序列(諸如美國專利號7,342,110及7,557,189中所描述之huMy9-6或其相關抗體，該等專利以引用之方式併入本文中)。
如本文所使用，術語抗體之「抗原結合部分」(或有時可互換稱為「抗體片段」)包括抗體之保持特異性結合至抗原之能力的一個或多個片段。經顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之某些片段執行。術語抗體之「抗原結合部分」內所涵蓋之結合片段的實例包括(但不限於)：(i)Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段(例如，由木瓜蛋白酶消化之抗體得到三個片段：兩個抗原結合Fab片段，及一個不結合抗原之Fc片段)；(ii)F(ab’) 2 片段，一種包含在鉸鏈區藉由二硫橋連接之 兩個Fab片段的二價片段(例如，由胃蛋白酶消化之抗體得到兩個片段：二價抗原結合F(ab’)2片段，及不結合抗原之pFc’片段)及其相關F(ab’)單價單元；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段(亦即，重鏈中包括在Fab中之部分)；(iv)由抗體單一臂之VL及VH結構域組成之Fv片段，及相關二硫鍵連接之Fv；(v)dAb(結構域抗體)或sdAb(單結構域抗體)片段(Ward等人，Nature 341：544-546,1989)，其由VH結構域組成；及(vi)分離之互補決定區(CDR)。在某些實施例中，該抗原結合部分為sdAb(單結構域抗體)。
在某些實施例中，抗原結合部分亦包括某些工程改造或重組之衍生物(或「衍生物抗體」)，該等衍生物除可能未見於天然存在之抗體中之元件或序列外，亦包括抗體中保持特異性結合至抗原之能力的一個或多個片段。
舉例而言，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH係由獨立基因編碼，但其可使用重組法由合成連接子接合，該連接子能夠使其製造成VL區與VH區配對形成單價分子之單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird等人，Science 242：423-426,1988；及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883,1988)。
在本文所描述之所有實施例中，scFv之N末端可為VH結構域(亦即，N-VH-VL-C)或VL結構域(亦即，N-VL-VH-C)。
二價(或雙價)單鏈可變片段(di-scFv、bi-scFv)可藉由連接兩個scFv進行工程改造。由此產生具有兩個VH區及兩個VL區之單一肽鏈，得到串聯scFv(tascFv)。可藉由以頭至尾之方式連接三個或更多個scFv，類似地產生更多串聯重複序列，諸如tri-scFv。
在某些實施例中，scFv可經由連接肽連接，該等連接肽過短(約五個胺基酸)而無法使兩個可變區折疊在一起，迫使scFv二聚合，並形成雙鏈抗體(參見例如，Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448,1993；Poljak等人，Structure 2：1121-1123,1994)。雙鏈抗體可為雙特異性或單特異性的。經顯示，雙鏈抗體之解離常數比相應scFv低40倍，即對於靶具有高得多的親和力。
又，較短之連接子(一個或兩個胺基酸)導致形成三聚體，或所謂的三鏈抗體(triabody/tribody)。四鏈抗體亦以類似之方式產生。其對其靶之親和力甚至高於雙鏈抗體。雙鏈抗體、三鏈抗體及四鏈抗體有時統稱為「AVIBODY TM 」細胞結合劑(或簡稱為「AVIBODY」)。即，具有兩個、三個或四個靶結合區(TBR)之AVIBODY常稱為雙鏈抗體、三鏈抗體及四鏈抗體。有關詳情，參見例如，美國公開案號2008/0152586及2012/0171115，其完整教示內容以引用之方式併入本文中。
所有該等形式均可由對兩種或更多種不同抗原具有特異性之可變片段構成，在此情形中，其為雙特異性或多特異性抗體類型。舉例而言，某些雙特異性串聯di-scFv稱為雙特異性T細胞接合物(BiTE)。
在某些實施例中，串聯scFv或雙鏈抗體/三鏈抗體/四鏈抗體中之每個scFv可具有相同或不同之結合特異性，且各自可獨立地具有N末端VH或N末端VL。
單鏈Fv(scFv)亦可與Fc部分，諸如人IgG Fc部分融合以獲得類IgG特性，但儘管如此，其仍由單一基因編碼。由於此類scFv-Fc蛋白質在哺乳動物體內之短暫產生可易於達到毫克量，故此衍生物抗體形式特 別適合於許多研究應用。
Fcab為由抗體之Fc恆定區工程改造之抗體片段。Fcab可表現為可溶性蛋白質，或其可重新工程改造成全長抗體，諸如IgG，由此產生mAb2。mAb2係Fcab代替正常Fc區之全長抗體。利用該等另外之結合位點，mAb2雙特異性單株抗體可同時結合兩種不同靶。
在某些實施例中，該等工程改造之抗體衍生物具有減小之大小的抗原結合Ig源性重組蛋白(「微型化」之完整大小mAb)，其係藉由移除認為對功能不重要之結構域而產生。一個最佳實例為SMIP。
小模組免疫藥物或SMIP係主要由抗體(免疫球蛋白)之部分構建的人工蛋白質且擬用作藥物。SMIP具有與抗體類似之生物半衰期，但小於抗體，且因此可具有更佳之組織滲透特性。SMIP係包含一個結合區、作為連接子之一個鉸鏈區及一個效應子結構域之單鏈蛋白質。該結合區包含經修飾之單鏈可變片段(scFv)，且該蛋白質之其餘部分可由抗體(諸如IgG1)之Fc(諸如CH2及作為效應子結構域之CH3)及鉸鏈區構造。經遺傳修飾之細胞產生呈抗體樣二聚體形式之SMIP，其比實際抗體小約30%。
此類工程改造之微型化抗體的另一實例為「單抗體」，其中鉸鏈區已自IgG4分子移除。IgG4分子不穩定且可彼此交換輕鏈-重鏈異二聚體。鉸鏈區之缺失防止重鏈-重鏈完全配對，留下高度特異性之單價輕鏈/重鏈異二聚體，同時保持Fc區以確保活體內穩定性及半衰期。
單結構域抗體(sdAb，包括但不限於Ablynx稱為奈米抗體之該等抗體)係由單一單體可變抗體結構域組成之抗體片段。與完整抗體相同，其能夠選擇性結合至特定抗原，但由於其分子量僅為12-15kDa而小得 多。在某些實施例中，單結構域抗體係由重鏈抗體(hcIgG)工程改造得到。首例此類sdAb係基於在駱駝中發現之hcIgG工程改造得到，稱為VHH片段。在某些實施例中，單結構域抗體係使用VNAR片段，由IgNAR(「免疫球蛋白新抗原受體」，參見下文)工程改造得到。軟骨魚類(諸如鯊魚)具有此類重鏈IgNAR抗體。在某些實施例中，sdAb係藉由將來自常見免疫球蛋白G(IgG)，諸如來自人類或小鼠之免疫球蛋白G的二聚體可變結構域分離成單體來進行工程改造。在某些實施例中，奈米抗體係衍生自重鏈可變結構域。在某些實施例中，奈米抗體係衍生自輕鏈可變結構域。在某些實施例中，sdAb係藉由針對與靶抗原之結合篩選單結構域重鏈序列(例如人單結構域HC)文庫來獲得。
單一可變新抗原受體結構域抗體片段(V NAR ，或V NAR 結構域)係衍生自軟骨魚類(例如鯊魚)免疫球蛋白新抗原受體抗體(IgNAR)。作為已知最小的基於免疫球蛋白之蛋白質支架之一，此類單結構域蛋白質展現出有利的大小及隱蔽表位識別特性。成熟IgNAR抗體由一個可變新抗原受體(VNAR)結構域及五個恆定新抗原受體(CNAR)結構域之同二聚體組成。此分子具有高度穩定性，且具有高效之結合特徵。其固有穩定性可能歸因於(i)潛在的Ig支架，相較於鼠類抗體中所見之習知抗體VH及VL結構域，其呈現相當大數量的帶電荷及親水性表面暴露殘基；及(ii)使包括環間二硫橋及環內氫鍵模式在內之互補決定區(CDR)環中的結構特徵穩定。
微型抗體係包含連接至CH結構域，諸如CH3 γ 1(IgG1之CH3結構域)或CH4 ε(IgE之CH4結構域)之scFv的工程改造之抗體片段。舉例而言，癌胚抗原(CEA)特異性scFv連接至CH3 γ 1，產生微型抗體，先 前已證實，其結合活體內快速清除作用而具有優良的腫瘤靶向性(Hu等人，Cancer Res.56：3055-3061,1996)。scFv可具有N末端VH或VL。連接可為產生非共價、無鉸鏈之微型抗體的短肽(例如，兩個胺基酸之連接子，諸如ValGlu)。或者，該連接可為產生共價、鉸鏈-微型抗體之IgG1鉸鏈及GlySer連接肽。
天然抗體為單特異性但二價的，因為其表現兩個相同的抗原結合結構域。相比之下，在某些實施例中，某些工程改造之抗體衍生物為雙特異性或多特異性分子，其具有兩個或更多個不同的抗原結合結構域，各自具有不同的靶特異性。雙特異性抗體可藉由融合兩個抗體產生細胞來產生，其各自具有不同的特異性。該等「四源雜交瘤」產生多種分子物質，因為兩個不同的輕鏈與兩個不同的重鏈在四源雜交瘤中以多種配置自由重組。自此，已使用多種技術(參見上文)產生雙特異性Fab、scFvs及完整大小之mAb。
雙可變結構域免疫球蛋白(DVD-Ig)係一類同時靶向兩個抗原/表位之雙特異性IgG(DiGiammarino等人，Methods Mol Biol.899：145-56,2012)。該分子含有Fc區及恆定區，其配置類似於習知IgG。然而，DVD-Ig蛋白之獨特性在於，該分子之每個臂均含有兩個可變結構域(VD)。一個臂內的VD係串聯連接且可具有不同結合特異性。
DuoBody®係一種雙特異性經修飾IgG1抗體異二聚體。IgG1鉸鏈區一般包括(i)含有CPPC序列且不容許在活體內交換Fab臂之穩定鉸鏈區；及(ii)經修飾以含有F405L及K409R殘基之IgG4樣CH3結構域，該修飾使其容許在活體內交換Fab臂。(參見例如，WO2008119353及 WO2011131746)。
亦可藉由例如表現具有兩個不同Fab及一個Fc之雙特異性抗體來產生三特異性抗體衍生物分子。一個實例為小鼠IgG2a抗Ep-CAM、大鼠IgG2b抗CD3四源雜交瘤(稱為BiUII)，其被認為容許表現Ep-CAM之腫瘤細胞、表現CD3之T細胞及表現FC γ RI之巨噬細胞共定位，由此增強免疫細胞之共刺激及抗腫瘤功能。
Probody為在健康組織中保持惰性，但在疾病環境中特異性活化(例如，經由疾病環境中富集或特有之蛋白酶的蛋白酶裂解)的完全重組之經掩蔽單株抗體。參見Desnoyers等人，Sci.Transl.Med.,5：207ra144,2013。可對本文所描述之任何抗體或其抗原結合部分使用類似掩蔽技術。
內抗體係經修飾以在細胞內定位，在細胞內作用以結合至細胞內抗原之抗體。內抗體可保留在細胞質中，或可具有核定位信號，或可具有供ER靶向之KDEL序列。內抗體可為單鏈抗體(scFv)、具有超穩定性之經修飾免疫球蛋白VL結構域、選擇的對還原性較強之細胞內環境具有抗性之抗體，或以與麥芽糖結合蛋白或其他穩定細胞內蛋白質之融合蛋白形式表現。此類優化使內抗體之穩定性及結構得到改善，且可大體上適用於本文所描述之任何抗體或其抗原結合部分。
本發明之抗原結合部分或衍生物抗體與衍生/工程改造得到其之抗體相比較，可具有基本上相同或同一的(1)輕鏈及/或重鏈CDR3區；(2)輕鏈及/或重鏈CDR1、CDR2及CDR3區；或(3)輕鏈及/或重鏈區。在該等區域內之序列可含有保守性胺基酸取代，包括在CDR區內之取代。在某些實施例中，存在不超過1、2、3、4或5個保守性取代。在一替代方案中， 該等抗原結合部分或衍生物抗體具有與衍生/工程改造得到其之抗體至少約90%、95%、99%或100%同一的輕鏈區及/或重鏈區。相較於該抗體，該等抗原結合部分或衍生物抗體可對靶抗原具有基本上相同之特異性及/或親和力。在某些實施例中，該等抗原結合部分或衍生物抗體之Kd及/或k off 值在本文所描述之抗體的10倍(更高或更低)、5倍(更高或更低)、3倍(更高或更低)或2倍(更高或更低)內。
在某些實施例中，該等抗原結合部分或衍生物抗體可衍生自/工程改造自完全人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體，且可根據任何技術認可之方法製備。
單株抗體技術允許產生特異性極高的呈特異性單株抗體形式之細胞結合劑。此項技術中尤其熟知的是藉由用所關注之抗原，諸如完整靶細胞、自靶細胞分離之抗原、完整病毒、減毒之完整病毒及病毒蛋白(諸如病毒外殼蛋白)使小鼠、大鼠、倉鼠或任何其他哺乳動物免疫來產生單株抗體的技術。亦可使用敏化之人類細胞。產生單株抗體之另一方法係使用scFv(單鏈可變區)，尤其是人scFv之噬菌體文庫(參見例如，美國專利號5,885,793及5,969,108；McCafferty等人，WO 92/01047；Liming等人，WO 99/06587)。此外，亦可使用美國專利號5,639,641中所揭示之表面重塑抗體，以及嵌合抗體及人類化抗體。
細胞結合劑亦可為由噬菌體呈現技術(參見例如，Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2011)108(17),6909-6914)或肽文庫技術(參見例如，Dane等人，Mol.Cancer.Ther.(2009)8(5)：1312-1318)得到之肽。
在某些實施例中，本發明之CBA亦包括抗體模擬物，諸如 DARPin、親和體、人類泛素、affitin、抗運載蛋白、高親和性多聚體、Fynomer、Kunitz結構域肽、單抗體或nanofitin。
如本文所使用，術語「DARPin」及「(經設計)錨蛋白重複序列蛋白」可互換使用，指典型地展現優先(有時特異性)靶結合的某些遺傳工程改造之抗體模擬蛋白。該靶可為蛋白質、碳水化合物或其他化學實體，且結合親和力可相當高。DARPin可衍生自含天然錨蛋白重複序列之蛋白質，且較佳由該等蛋白質之至少三個、通常四個或五個錨蛋白重複基元(典型地，每一錨蛋白重複基元中約33個殘基)組成。在某些實施例中，DARPin含有約四個或五個重複序列，且分子質量可分別為約14或18kDa。可在DNA層面上，使用多種技術，諸如核糖體呈現或信號識別顆粒(SRP)噬菌體呈現來產生具有隨機化潛在靶相互作用殘基及超過1012個變異體之多樣性的DARPin文庫，以用於選擇以皮莫耳濃度之親和力及特異性結合所希望靶之DARPin(例如，充當受體促效劑或拮抗劑、反促效劑、酶抑制劑或簡單的靶蛋白結合劑)。有關DARPin製備，參見例如美國專利公開案號2004/0132028、2009/0082274、2011/0118146及2011/0224100；WO 02/20565及WO 06/083275(其完整教示內容以引用之方式併入本文中)，且亦參見C.Zahnd等人(2010)Cancer Res.,70：1595-1605；Zahnd等人(2006)J.Biol.Chem.,281(46)：35167-35175；及Binz,H.K.,Amstutz,P.& Pluckthun,A.(2005)Nature Biotechnology,23：1257-1268(皆以引用之方式併入本文中)。有關相關錨蛋白樣重複序列蛋白或合成肽，亦參見美國專利公開案號2007/0238667；美國專利號7,101,675；WO 2007/147213；及WO 2007/062466(其完整教示內容以引用之方式併入本文中)。
親和體分子係工程改造成以高親和力結合至大量靶蛋白或肽，由此模擬單株抗體的小蛋白質。親和體由含58個胺基酸之三個α螺旋組成且莫耳質量為約6kDa。經顯示，其可經受住高溫(90℃)或酸性及鹼性條件(pH 2.5或pH 11)，且已藉由原生文庫選擇獲得親和力低至亞奈莫耳濃度範圍之結合劑，且已在親和力成熟後獲得具有皮莫耳濃度親和力之結合劑。在某些實施例中，親和體與弱親電子試劑偶聯以共價結合至靶。
單抗體(又稱為Adnectin)係能夠結合至抗原的遺傳工程改造之抗體模擬蛋白。在某些實施例中，單抗體由94個胺基酸組成且分子質量為約10kDa。其係基於人纖連蛋白之結構，更具體言之基於其III型第十個細胞外結構域，其結構類似於抗體可變結構域，具有形成桶狀之七個β折疊且在每一側上具有對應於三個互補決定區的三個暴露之環。可藉由修飾環BC(在第二個β折疊與第三個β折疊之間)及FG(在第六個折疊與第七個折疊之間)來定制對不同蛋白質具有特異性的單抗體。
三鏈抗體係基於小鼠及人軟骨基質蛋白(CMP)之C末端捲曲螺旋區設計的自組裝抗體模擬物，其自組裝成為平行的三聚體複合物。其係藉由使特定靶結合部分與衍生自CMP之三聚化結構域融合而產生的高度穩定之三聚體靶向配體。所得融合蛋白可高效地自組裝成為充分確定的具有高穩定性之平行同源三聚體。關於該等三聚體靶向配體之表面電漿共振(SPR)分析證實相較於相應單體明顯增強之靶結合強度。細胞結合研究確定，此類三鏈抗體對於其對應受體具有優良結合強度。
Centyrin係可使用基於共同FN3結構域序列之構架構建之文庫獲得的另一抗體模擬物(Diem等人，Protein Eng.Des.Sel.,2014)。該文庫採 用FN3結構域之C鏈、CD環、F鏈及FG環內之各種位置，且可針對特定靶選擇高親和力Centyrin變異體。
用於引入N末端Ser/Thr且隨後氧化得到醛基以與醛反應性基團反應的所有方法均適用於作為抗體及不為抗體之細胞結合劑，包括例如，centyrin、Darpin、Avibody、adnectin、抗體片段、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、奈米抗體、probody、duobody、結構域抗體或單抗體等。
以下某些實例提及各種人類化抗CD123抗體，該等抗體之命名法在此簡要描述。一類huCD123-6抗體係藉由移植來自鼠類抗CD123抗體muCD123-6之重鏈及輕鏈之6個CDR進行人類化。在該等抗體中，字母「G」緊接著純系名稱(亦即，huCD123-6)之後，該純系名稱又繼之以版本號，其指定人輕鏈及重鏈可變區序列之起源。因此，huCD123-6Gv4.6係指基於將來自相應muCDR123-6抗體之6個CDR區移植(「G」)至人輕鏈可變區Gv4及重鏈可變區Gv6上的人類化CD123抗體。類似地，-6-Gv4.7包含人輕鏈可變區Gv4及重鏈可變區Gv7。
另一類huCD123-6抗體係藉助於表面重塑進行人類化。具有表面重塑之重鏈序列huCD123-6rhv1.1及表面重塑之輕鏈序列huCD123-6rlv1.0的表面重塑抗體為huCD123-6Rv1.1。
如本文所使用，NTS#2或簡稱「S2」係指在重鏈N末端處具有工程改造之Ser的抗體。因此，huCD123-6Gv4.7抗體之S2變異體稱為huCD123-6Gv4.7S2。同樣，NTS#3或簡稱「S3」係指在輕鏈N末端處具有工程改造之Ser的抗體。huCD123-6Gv4.7抗體之S3變異體稱為 huCD123-6Gv4.7S3。
當包含工程改造之N末端Ser(S2或S3)之抗體經由氧化之N末端Ser與細胞毒性藥物/細胞毒性劑偶聯時，該偶聯物之名稱可含有「SeriMab」名稱。舉例而言，huCD123-6Gv4.7S3-SeriMab-D8係指D8(有關D8或sD8結構，參見圖17)與人類化CD123抗體huCD123-6Gv4.7S3之間經由輕鏈上經氧化之N末端Ser形成的偶聯物。
應注意，實例23-30，以及圖17、18、22A-24、26A-26C及29中所使用之細胞毒性劑，諸如「D8」及其磺酸化形式「sD8」及相關「D2」、「D1」及其磺酸化形式「sD1」可在主題偶聯物中不遵循藥物分子「D」之通式，但該等細胞毒性劑之結構係以相關附圖及文本描繪。
某些人類化抗CD123抗體描述於2015年6月29日提交的題為「ANTI-CD123 ANTIBODIES AND CONJUGATES AND DERIVATIVES THEREOF」之美國臨時申請案號62/186,161中，該62/186,161申請案之完整教示內容以引用之方式整體併入本文中，包括所有蛋白質(例如，抗體及其CDR、HCVR、LCVR、全長HC及LC序列)及核酸序列，以及相關SEQ ID NO，特別是具有一個或多個工程改造之N末端Ser/Thr殘基之CD123-SeriMab之該等序列。
細胞毒性劑
在第三實施例中，本發明提供可共價連接至本文所描述之細胞結合劑以形成本發明之偶聯物的細胞毒性劑(以D’表示)。
在一個實施例中，該細胞毒性劑為類美登素。更具體言之，該細胞毒性劑D’係由以下結構式表示： 其中該等變數係如第一實施例之第5個具體實施例中關於式(D1)所描述。更具體言之，細胞毒性劑D’為DM1(D2’)或DM4(D3’)：
在另一更具體之實施例中，該細胞毒性劑D’係由下式表示： 其中該等變數係如以上第一實施例之第5個具體實施例中關於式(D4) 所描述。
在又另一更具體之實施例中，該細胞毒性劑D’係由下式表示：
在另一具體實施例中，細胞毒性劑D’係包含醛反應性基團之類美登素化合物，其可直接連接至細胞結合劑。更具體言之，該類美登素化合物係由下式表示：
在另一實施例中，該細胞毒性劑為苯并二氮呯化合物。示例性苯并二氮呯化合物包括但不限於，美國專利號8,765,740、8,426,402、US2014/0088089、WO2011/130613、WO2011/130616、WO2010/091150及WO2009/016516中所描述之該等化合物。
在一個更具體之實施例中，細胞毒性劑D’係由以下結構式表示之苯并二氮呯化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中該等變數係如以上第一實施例之第6個具體實施例中關於式(D6)-(D17)所描述。
在一個更具體之實施例中，D’係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中Y為-H或-SO3M，且M為H+或陽離子。甚至更具體言之，Y為-SO3M，且M為H+、Na+或K+。
在另一更具體之實施例中，細胞毒性劑D’係包含醛反應性基團之苯并二氮呯化合物，其可直接連接至細胞結合劑。更具體言之，苯并二氮呯化合物係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：LD’、LD’’及LD'''之一係由下式表示：-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)r-Zd1-(CRaRb)r'-JCB (A’)
且其餘兩個相同或不同，且獨立地選自-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(OCH2CH2)n-Rc；鹵素；胍鎓[-NH(C=NH)NH2]；-OR；-NR’R’’；-NO2；-NR’COR’’；-SR；-SOR’；-SO2R’；-SO3H；-OSO3H；-SO2NR’R’’；氰基；疊氮基；-COR’；-OCOR’；及-OCONR’R’’；JCB係如以上在第一實施例中所描述之醛反應性基團；且其餘變數係如以上在第一實施例之第7個具體實施例及其中所描述之任何更具體之實施例中關於結構式(D18)-(D23)中所描述。
更具體言之，對於式(D18’)-(D23’)，JCB為； ；或。
在另一更具體之實施例中，對於式(D18’)-(D23’)，L’係 由式(A)表示，且L”及L”’均為-H；且其餘變數係如以上任何實施例中所描述。
在另一個更具體之實施例中，對於式(D18’)-(D23’)：在N與C之間之雙線表示單鍵或雙鍵，條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，Y為-OH或-SO3M；R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’及R4’均為-H；R6為-OMe；X’及Y’均為-H；A及A’為-O-；且M為H+、Na+或K+；且其餘變數係如以上任何實施例中所描述。
在又另一更具體之實施例中，對於式(D18’)-(D23’)，Ra及Rb均為H；且其餘變數係如以上任何實施例中所描述。
在另一更具體之實施例中，對於式(D18’)-(D23’)，R5及R9各自獨立地為H或Me；且其餘變數係如以上任何實施例中所描述。更具體言之，R5及R9均為H。
在另一更具體之實施例中，對於式(D18’)-(D23’)，P為含有2至10個胺基酸殘基之肽；且其餘變數係如以上任何實施例中所描述。更具體言之，P為含有2至5個胺基酸殘基之肽。甚至更具體言之，P係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：17)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO： 18)及Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：19)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala及D-Ala-D-Ala。
在另一更具體之實施例中，該細胞毒性劑D’係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中Y為-H或-SO3M，且M為H+、Na+或K+。
細胞毒性劑-連接子化合物
在第四實施例中，本發明提供具有醛反應性基團之細胞毒性劑-連接子化合物，其可共價連接至本文所描述之細胞結合劑。
在某些實施例中，細胞毒性劑-連接子化合物係由下式表示：JCB-L-JD’-D (II)，其中JCB係第一實施例中所描述之醛反應性基團；且其餘變數係如以上在第一實施例或第一實施例之第2或6個具體實施例，或其中所描述之任 何更具體之實施例中所描述。
更具體言之，JCB為肼、醯肼或羥基胺。
在另一實施例中，JCB選自： 其中：Xa為CH2、O或NCH3；U’為NH、O、S或CH2；U為H或供電子基團；Xb及Xb’各自獨立地為-OH、-SH或-NH2；RZ及RZ’各自獨立地為H或烷基(較佳為一Me)；RZ’’為H或烷基；及Xc為N或CH。更具體言 之，該醛反應性基團為、或。
在一個實施例中，細胞毒性劑-連接子化合物係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，且Y為-H或-SO3M，且M為H+、Na+或K+。
經修飾之細胞結合劑
在第五實施例中，本發明提供藉由使本文所描述之細胞結合劑與具有醛反應性基團之連接子化合物反應所形成的經修飾之細胞結合劑。
在某些實施例中，該經修飾之細胞結合劑係由下式表示： 其中JD係可與細胞毒性劑D’形成共價鍵之反應性基團；且其餘變數係如以上在第一實施例或其中所描述之任何更具體之實施例中所描述。
在第1個具體實施例中，對於具有結構式(III)之經修飾細胞結合劑或其醫藥學上可接受之鹽，JCB’係由以下結構式之一表示： 或；；或 其中：Xa為CH2、O或NCH3；U’為NH、O、S或CH2；U為H或供電子基團；Xb1及Xb1’各自獨立地為-O-、-S-或-NH-；RZ及RZ’各自獨立地為H或烷基(較佳為-Me)；且RZ’’為H或烷基；s1為共價連接至該細胞結合劑之位點；且s2為共價連接至基團L之位點。更具體言之，JCB’為
在第2具體實施例中，對於式(III)，-L-JD係由下式表示： 其中JD為-SH、-SSRd或-SC(=O)Rg，其中Rd為苯基、硝基苯基、二硝基苯基、羧基硝基苯基、吡啶基或硝基吡啶基；且Rg為烷基；JCB’係如以上在第1個具體實施例中所描述；且其餘變數係如以上在第一實施例之第2個具體實施例及其中所描述之任何更具體之實施例中關於式(L1)所描述。更具體言之，JD為-SH或-SSRd。
在一更具體之實施例中，-L-JD係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中JCB’及JD係如以上在第2個具體實施例中所描述。更具體言之，JD為-SH或-SSRd。
在第3具體實施例中，對於式(III)，-L-JD係由下式表示： 其中JD為-OH或鹵素；或-C(=O)-JD為反應性酯；JCB’係如以上在第1個具體實施例中所描述；且其餘變數係如以上在第一實施例之第3個具體實施例及其中所描述之任何更具體之實施例中關於式(L2)及(L3)所描述。更具體言之，-C(=O)-JD為N-羥基琥珀醯亞胺酯。
在一更具體之實施例中，-L-JD係由以下結構式表示： 其中JCB’及JD係如以上在第3個具體實施例中所描述。更具體言之，-C(=O)-JD為N-羥基琥珀醯亞胺酯。
在第4個具體實施例中，對於式(III)，-L-JD係由下式表示： 其中JD為順丁烯二醯亞胺、X’-CRbRc-C(=O)-、X’-CRbRc-C(=O)-NRe-、 、或；X’為鹵素；JCB’係如以上在第1 個具體實施例中所描述；且其餘變數係如以上在第一實施例之第4個具體 實施例及其中所描述之任何更具體之實施例中關於結構式(L4)所描述。
在某些實施例中，對於以上任一實施例(諸如第五實施例或第五實施例之第1至4個具體實施例，或其中所描述之任何更具體之實施例)中所描述之式(III)，CBA可為第二實施例中所描述之任何細胞結合劑。
雙官能交聯劑(或連接子化合物)
在第六實施例中，本發明提供具有醛反應性基團之雙官能交聯劑(亦即，連接子化合物)，其可與本文所描述之細胞毒性劑形成共價鍵。
在一個實施例中，該連接子化合物係由下式表示：JCB-L-JD(IV)，其中該等變數係如以上式(I)、(II)及(III)所描述。
在一個實施例中，該連接子化合物係由下式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中JCB係第一實施例中所描述之醛反應性基團；且其餘變數係如以上關於結構式(L1’)所描述。更具體言之，JD為-SH 或-SSRd。甚至更具體言之，JCB為、或。
在一更具體之實施例中，該雙官能交聯劑係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中JCB及JD係如以上所描述。更具體言之， JD為-SH或-SSRd。甚至更具體言之，JCB為、或
在另一實施例中，該連接子化合物係由以下結構式表示： 其中JCB係第一實施例中所描述之醛反應性基團；且其餘變數係如以上關於結構式(L2’)及(L3’)所描述。更具體言之，-C(=O)-JD為N-羥基琥珀 醯亞胺酯。甚至更具體言之，JCB為、或。
在一更具體之實施例中，該雙官能交聯劑係由以下結構式表示： 其中JCB及JD係如以上所描述。更具體言之，-C(=O)-JD為N-羥基琥珀 醯亞胺酯。甚至更具體言之，JCB為、或。
在另一實施例中，該雙官能交聯劑係由以下結構式表示： 其中JD為順丁烯二醯亞胺、X’-CRbRc-C(=O)-、X’-CRbRc-C(=O)-NRe-、 、或；X’為鹵素；且其餘變數係如以上 關於結構式(L4’)所描述。更具體言之，JD為順丁烯二醯亞胺。甚至更具體 言之，JCB為、或。
細胞結合劑-藥物偶聯物之製備
在第七實施例中，本發明提供用於製備本文所描述之細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物之方法。
在一個實施例中，本發明提供一種製備本文所描述之細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物之方法，該方法包括以下步驟：(a)用氧化劑將細胞結合劑之2-羥基乙胺部分氧化以形成具有醛基之經氧化細胞結合劑；其中該2-羥基乙胺部分為絲胺酸、蘇胺酸、羥基離胺酸、4-羥基鳥胺酸或2,4-二胺基-5-羥基戊酸殘基之一部分，且由以下結構式 表示： (b)使該經氧化細胞結合劑：(i)與具有醛反應性基團之細胞毒性劑-連接子化合物或具有醛反應性基團之細胞毒性劑接觸，由此形成該細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物；或(ii)與具有醛反應性基團之連接子化合物接觸，由此形成與連接子結合之經修飾抗體或其經修飾抗原結合部分，隨後使該經修飾抗體或其經修飾抗原結合部分與細胞毒性劑反應，以形成該細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物；或(iii)與細胞毒性劑接觸，隨後添加具有醛反應性基團及可與該細胞毒性劑形成共價鍵之反應性基團的連接子化合物，以形成該細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物。
在第1個具體實施例中，該細胞結合劑係抗體或其抗原結合部分且該方法包括以下步驟：(a)用氧化劑氧化抗體或其抗原結合部分之2-羥基乙胺部分，以形成具有醛基之經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分， 其中該2-羥基乙胺部分係N末端絲胺酸、蘇胺酸、羥基離胺酸、4-羥基鳥胺酸或2,4-二胺基-5-羥基戊酸殘基之一部分；及(b)使該經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分與具有醛反應性基團之 細胞毒性劑-連接子化合物或具有醛反應性基團之細胞毒性劑反應，以形成該抗體-細胞毒性劑偶聯物 其中：Ab係本文所描述之抗體或其抗原結合部分；JCB係如以上所描述之醛反應性基團；L係如以上所描述之間隔子或鍵；JD’係將該細胞毒性劑D與基團L連接之連接部分，或當L係鍵時不存在；D係經由該連接部分JD’共價連接至L之細胞毒性劑；且w係1、2、3或4。
在某些實施例中，對於以上第1個具體實施例中所描述之方法，可使用以上第四實施例中所描述之任何細胞毒性劑-連接子化合物或第三實施例中所描述之細胞毒性劑。
在某些實施例中，對於以上第1個具體實施例中所描述之方法，在步驟(b)中與經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分反應之前，使具有亞胺官能基(-C=N-)之細胞毒性劑-連接子化合物或細胞毒性劑與亞胺反應性試劑反應，以形成經修飾之細胞毒性劑-連接子化合物或經修飾之細胞毒性劑。在一個實施例中，經修飾之細胞毒性劑-連接子化合物或經修飾之細胞毒性劑係原位產生，且在不純化情況下與經氧化抗體或其經氧化抗原結 合部分反應。
在第2個具體實施例中，該細胞結合劑係抗體或其抗原結合部分且該方法包括以下步驟：(a)用氧化劑氧化抗體或其抗原結合部分之N末端2-羥基乙胺部分，以形成具有N末端醛基之經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分， 其中該2-羥基乙胺部分係N末端絲胺酸、蘇胺酸、羥基離胺酸、4-羥基鳥胺酸或2,4-二胺基-5-羥基戊酸殘基之一部分；及(b)使該經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分與具有醛反應性基團之連接子化合物反應以形成與連接子結合之經修飾抗體或其經修飾抗原結合部分，隨後使該經修飾抗體或其經修飾抗原結合部分與細胞毒性劑反應，以形成該抗體-細胞毒性劑偶聯物， 其中D’為細胞毒性劑；JD為可與細胞毒性劑D’形成共價鍵之反應性基團；且其餘變數係如第1個具體實施例中所描述。
在某些實施例中，對於以上第2個具體實施例中所描述之方法，可使用以上第六實施例中所描述之任何連接子。
在某些實施例中，對於第2個具體實施例中所描述之方法，在步驟(b)中與結合至連接子之經修飾抗體或其經修飾抗原結合部分反應之前，使具有亞胺官能基(-C=N-)之細胞毒性劑與亞胺反應性試劑反應，以形成經修飾之細胞毒性劑。在一個實施例中，經修飾細胞毒性劑係原位產生 且在與結合至連接子之經修飾抗體或其經修飾抗原結合部分反應之前未經純化。
在第3個具體實施例中，該細胞結合劑係抗體或其抗原結合部分且該方法包括以下步驟：(a)用氧化劑氧化抗體或其抗原結合部分之N末端2-羥基乙胺部分，以形成具有N末端醛基之經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分， 其中該2-羥基乙胺部分係N末端絲胺酸、蘇胺酸、羥基離胺酸、4-羥基鳥胺酸或2,4-二胺基-5-羥基戊酸殘基之一部分；及(b)使該經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分與細胞毒性劑反應，隨後添加具有醛反應性基團之連接子化合物，以形成該抗體-細胞毒性劑偶聯物， 其中該等變數係如以上在第1及2個具體實施例中所描述。
在某些實施例中，對於以上第3個具體實施例中所描述之方法，可使用以上第六實施例中所描述之任何連接子化合物或第三實施例中所描述之細胞毒性劑。
任何適合氧化劑均可用於以上所描述之方法之步驟(a)中。在某些實施例中，氧化劑為過碘酸鹽。更具體言之，氧化劑為過碘酸鈉。
可使用相對於細胞結合劑(例如抗體)莫耳當量過量之氧化劑。在某些實施例中，可使用約2-100、5-80、10-50、1-10或5-10莫耳當量之氧化劑。在某些實施例中，可使用約10或約50當量之氧化劑。當使用大 量氧化劑時，使用較短反應時間來避免過度氧化。舉例而言，當使用50當量氧化劑時，氧化反應進行約5至約60分鐘。或者，當使用10當量氧化劑時，氧化反應進行約30分鐘至約24小時。在一個實施例中，使用5-10莫耳當量之氧化劑且反應時間進行約5至約60分鐘(例如約10至約30分鐘、約20至約30分鐘)。
在某些實施例中，氧化反應不會導致顯著非靶向氧化。舉例而言，在N末端絲胺酸氧化產生具有N末端醛基之經氧化CD123/IL-3R α-結合劑之氧化過程期間，無顯著量(例如，低於20%、低於10%、低於5%、低於3%、低於2%或低於1%)甲硫胺酸及/或聚糖經氧化。
在某些實施例中，在以上所描述之方法中步驟(b)之反應中存在催化劑。此項技術中之任何適合催化劑均可使用。在一個實施例中，該催化劑為苯胺或經取代苯胺。示例性苯胺催化劑包括但不限於，丙胺酸、鄰伸苯基二胺、間伸苯基二胺、3,5-二胺基苯甲酸、對伸苯基二胺、2-甲基-對伸苯基二胺、N-甲基-對伸苯基二胺、鄰胺基苯酚、間胺基苯酚、對胺基苯酚、對甲氧基苯胺、5-甲氧基-鄰胺基苯甲酸、鄰胺基苯甲酸及4-胺基苯乙醇。在一個實施例中，該催化劑為4-胺基苯乙醇。在某些實施例中，步驟(b)之反應係在約pH 5.0至約pH 6.5下進行。在某些實施例中，步驟(b)之反應係在約pH 5.0下進行。
在某些實施例中，對於本文所描述之方法之步驟(b)，所使用的具有醛反應性基團之化合物(例如，本文所描述之細胞毒性劑-連接子化合物、細胞毒性劑或連接子化合物)係相對於經氧化細胞結合劑(例如經氧化抗體或經氧化抗原結合部分)莫耳過量。在某些實施例中，具有醛反應性基 團之化合物與經氧化細胞結合劑之比率介於約10：1與約1.1：1之間，介於約5：1至約2：1之間。在一個實施例中，該比率為約4：1。
在某些實施例中，對於以上所描述之方法，諸如第三實施例或第1至3個具體實施例中之該等方法，可藉由本文所描述之任何方法獲得細胞結合劑，諸如抗體或其抗原結合部分。
在第4個具體實施例中，本發明提供一種製備抗體-細胞毒性劑偶聯物之方法，該方法包括以下步驟：(a)用氧化劑氧化抗體或其抗原結合部分之N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基的2-羥基乙胺部分，以形成具有N末端醛基之經氧化抗體或其經氧化抗 原結合部分，其中該2-羥基乙胺部分係由以下結構式表示：，及 (b)使該經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分：(i)與具有醛反應性基團之細胞毒性劑-連接子化合物接觸，以形成抗體-細胞毒性劑偶聯物；或(ii)與具有醛反應性基團之連接子化合物接觸，以形成結合至連接子之經修飾抗體或其經修飾抗原結合部分，隨後使該經修飾抗體或其經修飾抗原結合部分與細胞毒性劑反應以形成抗體-細胞毒性劑偶聯物；或(iii)與細胞毒性劑接觸，隨後添加具有醛反應性基團及可與細胞毒性劑形成共價鍵之反應性基團的連接子化合物，以形成抗體-細胞毒性劑偶聯物。
在某些實施例中，對於以上所描述之任何方法，諸如第七實施例或第1至4個具體實施例或任何更具體之實施例中之該等方法，抗體或其抗原結合部分係藉由表現編碼重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之多聚核苷酸來獲得，該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合 部分包含：(1)具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的異源信號肽；(2)緊鄰該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列第一個殘基之N末端的Ser或Thr殘基；或(3)置換該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列之一個或多個N末端胺基酸殘基的Ser或Thr殘基。
在某些實施例中，對於以上所描述之任何方法，諸如第七實施例或第1至4個具體實施例或任何更具體之實施例中之該等方法，該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO：3之輕鏈序列。
在某些實施例中，對於以上所描述之任何方法，諸如第七實施例或第1至4個具體實施例或任何更具體之實施例中之該等方法，該抗體或其抗原結合部分係包含SEQ ID NO：3之輕鏈序列之鼠類抗體或其抗原結合部分的嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體，或其抗原結合部分。人類化抗體或其抗原結合部分可為表面重塑或CDR移植之抗體，或其抗原結合部分。
在某些實施例中，根據以上所描述之任何方法製備的偶聯物可接著經純化。此項技術中已知的任何純化方法均可用於純化本發明之偶聯物(參見例如，Bioconjugate Techniques，第2版，Greg T.Hermanson,Academic Press,Inc.出版，2008)。在一個實施例中，本發明之偶聯物可使用切向流過濾(TFF)、非吸附層析法、吸附層析法、吸附過濾法、選擇性沈澱法、高效液相層析法(HPLC)、透析或任何其他適合純化方法，以及其組合來進行純化。
任何適合之TFF系統均可用於純化，包括Pellicon型系統(Millipore,Billerica,MA)、Sartocon Cassette系統(Sartorius AG,Edgewood,NY) 及Centrasette型系統(Pall Corp.,East Hills,NY)。
任何適合吸附層析樹脂均可用於純化。較佳之吸附層析樹脂包括羥基磷灰石層析、疏水電荷誘導層析(HCIC)、疏水相互作用層析(HIC)、離子交換層析、混合型離子交換層析、固定化金屬親和層析(IMAC)、染料配體層析、親和層析、反相層析及其組合。適合羥基磷灰石樹脂之實例包括羥基磷灰石陶瓷(I型及II型CHT；Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)、HA Ultrogel羥基磷灰石(Pall Corp.,EastHills,NY)及氟磷灰石陶瓷(I型及II型CFT；Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。適合HCIC樹脂之實例為MEP Hypercel樹脂(Pall Corp.,East Hills,NY)。適合HIC樹脂之實例包括丁基-瓊脂糖、己基-瓊脂糖、苯基-瓊脂糖及辛基瓊脂糖樹脂(均購自GE Healthcare,Piscataway,NJ)，以及Macro-prep甲基樹脂及Macro-Prep第三丁基樹脂(Biorad Laboratories,Hercules,CA)。適合離子交換樹脂之實例包括SP-瓊脂糖、CM-瓊脂糖及Q-瓊脂糖樹脂(均購自GE Healthcare,Piscataway,NJ)，及Unosphere S樹脂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。適合混合型離子交換劑之實例包括Bakerbond ABx樹脂(JT Baker,Phillipsburg NJ)。適合IMAC樹脂之實例包括螯合性瓊脂糖樹脂(Chelating Sepharose resin；GE Healthcare,Piscataway,NJ)及Profinity IMAC樹脂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。適合染料配體樹脂之實例包括藍色瓊脂糖樹脂(Blue Sepharose resin；GE Healthcare,Piscataway,NJ)及Affi-gel藍色樹脂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。適合親和樹脂之實例包括蛋白質A瓊脂糖樹脂(例如，MabSelect,GE Healthcare,Piscataway,NJ)、His標記之金屬親和樹脂、抗FLAG親和樹脂，及卵磷脂親和樹脂，例如Lentil卵磷脂親和樹脂(GE Healthcare,Piscataway,NJ)，其中抗體帶有適當卵磷脂結 合位點。適合反相樹脂之實例包括C4、C8及C18樹脂(Grace Vydac,Hesperia,CA)。
任何適合非吸附性層析樹脂均可用於純化。舉例而言，可使用尺寸排阻層析法純化本發明之偶聯物。適合非吸附性層析樹脂之實例包括但不限於，SEPHADEXTM G-10、G-25、G-50、G-100，SEPHACRYLTM樹脂(例如S-200及S-300)、SUPERDEXTM樹脂(例如SUPERDEXTM 75及SUPERDEXTM 200)、BIO-GEL®樹脂(例如P-6、P-10、P-30、P-60及P-100)。
在一個實施例中，當細胞結合劑為表位點標記之Avibody時，可使用羥基磷灰石層析、尺寸排阻層析、切向流過濾、凝膠電泳、透析及親和層析，較佳使用親和層析，更佳使用His標記之金屬親和樹脂及抗FLAG M2親和樹脂來純化偶聯物(參見例如，US 2008/0152586及US 2012/0171115)。
在另一實施例中，當細胞結合劑為centyrin時，可使用蛋白質A純化、硫酸銨或乙醇沈澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、尺寸排阻層析、切向流過濾、親和層析、羥基磷灰石層析及卵磷脂層析法來純化偶聯物。或者，可使用HPLC來純化偶聯物。較佳地，可藉由使用親和層析，更佳使用His標記之金屬親和層析來純化偶聯物。參見例如，美國專利公開案號US 2010/0255056、US 2010/0216708及US 2011/0274623。
在另一實施例中，當細胞結合劑為DARPin時，可藉由親和層析、尺寸排阻層析、羥基磷灰石層析、切向流過濾，較佳藉由親和層析，更佳藉由His標記之親和層析來純化偶聯物。參見例如，美國專利公開案號 20040132028、2009/0082274、2011/0118146及2011/0224100；WO 02/20565及WO 06/083275。
細胞毒性之活體外評價
可對本發明之細胞毒性化合物及細胞結合劑-藥物偶聯物在活體外抑制各種癌細胞增殖之能力進行評價。可使待評價之細胞暴露於該等化合物或偶聯物1-5天，且藉由已知方法在直接分析中量測細胞之存活分數。接著，可由該等分析之結果計算IC50值。或者或另外，可使用活體外細胞株敏感性篩選，諸如美國國家癌症協會(U.S.National Cancer Institute)所描述之篩選法(參見Voskoglou-Nomikos等人，2003,Clinical Cancer Res.9：42227-4239，以引用之方式併入本文中)作為一種指導以確定可能對本發明之化合物或偶聯物治療敏感的癌症類型。
組成物及使用方法
本發明包括一種組成物(例如醫藥組成物)，其包含本文所描述之新穎苯并二氮呯化合物(例如，吲哚啉并苯并二氮呯或噁唑啶并苯并二氮呯)、其衍生物或其偶聯物(及/或其溶劑化物、水合物及/或鹽)及載劑(醫藥學上可接受之載劑)。本發明亦包括一種組成物(例如醫藥組成物)，其包含本文所描述之新穎苯并二氮呯化合物、其衍生物或其偶聯物(及/或其溶劑化物、水合物及/或鹽)及載劑(醫藥學上可接受之載劑)，另外包含第二治療劑。本發明之組成物可用於在哺乳動物(例如人類)中抑制異常細胞生長或治療增生性病症。本發明之組成物亦可用於治療哺乳動物(例如人類)之抑鬱症、焦慮症、應激症、恐怖症、驚慌、煩躁、心理障礙、疼痛及炎性疾病。本發明包括一種在哺乳動物(例如人類)中抑制異常細胞生長或治療增生性病 症之方法，該方法包括向該哺乳動物施用單獨或與第二治療劑組合的治療有效量之本文所描述之新穎苯并二氮呯化合物(例如，吲哚啉并苯并二氮呯或噁唑啶并苯并二氮呯)、其衍生物或其偶聯物(及/或其溶劑化物、水合物及/或鹽)或其組成物及載劑(醫藥學上可接受之載劑)。
在一個實施例中，該增生性病症為癌症。癌症可包括血液科癌症或實體腫瘤。更具體言之，該癌症為白血病(例如急性骨髓性白血病(AML)；急性單核細胞白血病、早幼粒細胞性白血病、嗜伊紅性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)，諸如急性B淋巴母細胞性白血病(B-ALL)；慢性骨髓性白血病(CML)；慢性淋巴細胞性白血病(CLL))或淋巴瘤(例如非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma))、骨髓增生異常症候群(MDS)、黑素瘤、肺癌(例如非小細胞肺癌(NSCLC))、卵巢癌、子宮內膜癌、腹膜癌、胰腺癌、乳癌、前列腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌及子宮頸癌。
本發明亦提供治療方法，該方法包括向需要治療之受試者施用有效量的以上所描述之任何偶聯物。類似地，本發明提供一宗用於誘導所選細胞群中細胞死亡之方法，該方法包括使靶細胞或含有靶細胞之組織與有效量的本發明之包含細胞毒性劑之任何細胞毒性化合物-結合劑(例如連接至細胞結合劑之吲哚啉并苯并二氮呯或噁唑啶并苯并二氮呯二聚體)、其鹽或溶劑化物接觸。靶細胞係細胞結合劑能結合之細胞。
必要時，可與該偶聯物一起施用其他活性劑，諸如其他抗腫瘤劑。
適合醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及賦形劑係熟知的且可由熟習此項技術者依據臨床情況所允許來確定。適合載劑、稀釋劑及/或賦 形劑之實例包括：(1)杜貝卡氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(Dulbecco’s phosphate buffered saline)，約pH 7.4，含有或不含約1mg/mL至25mg/mL人血清白蛋白；(2)0.9%生理食鹽水(0.9% w/v NaCl)；及(3)5%(w/v)右旋葡萄糖；且亦可含有抗氧化劑(諸如色胺)及穩定劑(諸如Tween 20)。
用於誘導所選細胞群中細胞死亡之方法可在活體外、活體內或離體實行。
活體外應用之實例包括自體骨髓移在植入同一患者體內之前進行處理以便殺死患病細胞或惡性細胞；骨髓在移植之前進行處理以便殺死勝任T細胞且防止移植物抗宿主疾病(GVHD)；處理細胞培養物以便殺死除所需變異體外的不表現靶抗原之所有細胞；或殺死表現非所需抗原之變異體。非臨床活體外應用之條件易於由熟悉此項技術者決定。
臨床上離體應用之實例係在自體移植以治療癌症或治療自體免疫疾病之前自骨髓移除腫瘤細胞或淋巴樣細胞，或在移植之前由自體或異體骨髓移除T細胞及其他淋巴樣細胞以便防止GVHD。治療可進行如下。自患者或其他個體採集骨髓，且接著在約37℃下，在添加有濃度範圍為約10μM至1pM之本發明細胞毒性劑的含血清培養基中孵育約30分鐘至約48小時。濃度及孵育時間(亦即，劑量)之確切條件易於由熟習此項技術者決定。在孵育之後，用含血清之培養基洗滌骨髓細胞且根據已知方法，將其經靜脈內回輸給患者。在患者接受在骨髓採集時間與經處理細胞回輸之間接受其他治療，諸如消融性化學療法或全身照射療程之情況下，使用標準醫療設備將經處理骨髓細胞冷凍儲存在液氮中。
對於臨床上活體內應用，所供應的本發明之細胞毒性劑將係 針對無菌性及內毒素含量進行測試之溶液或凍乾粉。適合施用偶聯物之方案的實例如下。偶聯物係每週一次以靜脈內推注給與，持續4周。推注劑量係在添加有5至10mL人血清白蛋白之50至1000mL標準生理食鹽水中給與。每次靜脈內施用的劑量將為10μg至2000mg(在每天100ng至20mg/kg範圍內)。治療四周之後，患者可每週繼續接受治療。關於施用途徑、賦形劑、稀釋劑、劑量、時間等具體臨床方案可由熟習此項技術者依據臨床情況所允許決定。可根據誘導所選細胞群中細胞死亡之活體內或離體方法治療的醫療病況之實例包括任何類型之惡性疾病，包括例如，癌症；自體免疫疾病；諸如全身性狼瘡、類風濕性關節炎及多發性硬化；移植物排斥，諸如腎移植排斥反應、肝移植排斥反應、肺移植排斥反應、心臟移植排斥反應及骨髓移植排斥反應；移植物抗宿主疾病；病毒感染，諸如CMV感染、HIV感染、AIDS等；及寄生蟲感染，諸如賈第鞭毛蟲病、阿米巴病、血吸蟲病及普通熟習此項技術者所確定之其他疾病。
癌症療法及其劑量、施用途徑及推薦劑量係此項技術中已知的且已描述於如Physician's Desk Reference(PDR)之文獻中。PDR揭示了用於治療各種癌症之藥劑的劑量。該等以上提及的在治療上有效之化學治療藥物之給藥方案及劑量將取決於所治療之特定癌症、疾病程度及熟習此項技術之醫師所熟悉之其他因素，且可由醫師決定。PDR之內容係以引用之方式清楚地整體併入本文中。熟習此項技術者可評述PDR，使用以下一個或多個參數來確定可根據本發明之教示內容使用的化學治療藥物及偶聯物之給藥方案及劑量。該等參數包括：
●綜合指數
●製造商
●產品(公司或商標藥物名)
●種類索引
●通用名/化學物質索引(非商標通用藥物名)
●藥物之彩色圖像
●產品資訊，與FDA標貼相符
●化學特性資訊
●功能/作用
●適應症與禁忌症
●試驗研究、副作用、警告
類似物及衍生物
熟習細胞毒性劑領域之技術人員將易於瞭解，本文所描述之每一細胞毒性劑可藉由使所得化合物仍保持起始化合物之特異性及/或活性之方式進行修飾。熟練技術人員亦應瞭解，該等化合物中有許多可代替本文所描述之細胞毒性劑使用。因此，本發明之細胞毒性劑包括本文所描述之偶聯劑的類似物及衍生物。
本文及以下實例中引用之所有參考文獻均以引用之方式清楚地整體併入本文中。
實例
實例1 構建帶有N末端Ser/Thr之重組抗體
先前已描述帶有N末端絲胺酸之鼠類抗葉酸受體α抗體FR1-2.1輕鏈(LC)之序列(美國專利申請案號61/872,407，2013年8月30日提 交；61/875,475，2013年9月9日提交；及61/940,184，2014年2月14日提交；及主張其優先權之WO 2015/031815，全部以引用之方式併入)。此N末端Ser係利用獲得FR1-2.1輕鏈之IGKV1-99*01鼠類生殖系序列(登錄號CAB46122；SEQ ID NO：2)之信號肽中的常用裂解位點，由信號肽酶得到。不同於在抗體表現期間裂解時完全移除之典型抗體信號肽，IGKV1-99*信號肽之最後一個絲胺酸(Kabat之1位)保留在FR1-2.1輕鏈之N末端。經證實，FR1-2.1抗體係用於評價本文所描述之絲胺酸氧化修飾方法的一種有用工具，且此外，FR1-2.1信號肽(表1；SEQ ID NO：1)提供一種用於產生在輕鏈或重鏈N末端具有絲胺酸之重組抗體的可能機制。使用天然抗體信號肽併入N末端絲胺酸能夠避免抗體工程改造可能存在之負面結果，包括但不限於，可能由非天然構建體引起之表現問題及裂解位點異質性。
為了展示FR1-2.1信號肽在經轉染哺乳動物細胞株中表現之重組抗體的N末端留下絲胺酸殘基，利用FR1-2.1輕鏈信號肽合成新抗體表現構建體。將先前在美國專利號8,557,966中描述之人類化Mov19輕鏈(LC)之可變區胺基酸序列(表1：SEQ ID NO：3)與FR1-2.1信號肽組合以代替標準抗體信號肽(SEQ ID NO：6)，產生huMov19 LC NTS1序列(SEQ ID NO：10)。接著將該輕鏈序列提供至Blue Heron Biotechnology，在此處對其進行密碼子優化，合成且將其選殖至含有人κ恆定區序列之pAbKZeo哺乳動物表現質體的EcoRI及BsiWI位點中。
產生在N末端具有絲胺酸/蘇胺酸殘基之重組抗體的一種替代性方法係用絲胺酸或蘇胺酸置換N末端殘基(Kabat之+1位)。為了展示這一技術，用絲胺酸置換人類化Mov19重鏈(HC)(SEQ ID NO：8)N末端殘基(麩 醯胺酸)以產生huMov19 HC NTS2序列(SEQ ID NO：11)。接著對重鏈序列進行密碼子優化，合成且藉由Blue Heron Biotechnology與人IgG1恆定區同框選殖至pAbG1Neo質體之HindIII及Apa1位點。
使用以上描述的N末端絲胺酸添加與N末端絲胺酸置換方案之各種組合來產生帶有至多4個N末端絲胺酸(例如，2個在重鏈上且2個在輕鏈上)之另外的重組抗體。合成以上所描述之構建體之反向序列，以使得人類化Mov19輕鏈(LC)之N末端天冬胺酸經絲胺酸置換(huMov19LC NTS3，SEQ ID NO：12)，或相反，合成FR1-2.1信號肽添加N末端絲胺酸之人類化Mov19重鏈(huMov19HC NTS4；SEQ ID NO：14)。此外，將該等輕鏈及重鏈構建體混合在一起以產生在兩個N末端帶有絲胺酸之重組抗體，每個抗體總計帶有4個N末端絲胺酸(例如huMov19LC NTS3及huMov19HC NTS4)。該等構建體局限於2個(輕鏈N末端絲胺酸)或4個(兩條鏈均帶有N末端絲胺酸)併入位點，而且利用異二聚體抗體技術，諸如「結進孔」突變(WO 2005/063816 A2，以引用之方式併入)。亦可能構建帶有1或3個N末端絲胺酸之抗體。
最後，儘管可遵循產生帶有N末端絲胺酸之重組抗體的另外方法，諸如多胺基酸N末端附接或N末端截短，但所述方法提供附加益處，即，其不太可能影響至關重要之抗體屬性，諸如結合特異性或結構完整性。
除絲胺酸外，可藉由用蘇胺酸簡單地置換N末端殘基(Kabat之+1位)產生在N末端帶有蘇胺酸殘基之重組抗體，以便藉由本文所描述之方法偶聯該等抗體。舉例而言，用蘇胺酸置換人類化Mov19輕鏈(LC)之N 末端天冬胺酸(huMov19 LC NTT1，SEQ ID NO：15)，或用蘇胺酸置換人類化Mov19重鏈(HC)之N末端麩醯胺酸(huMov19 HC NTT2，SEQ ID NO：16)。接著，如以上所描述，將該等構建體選殖至對應哺乳動物表現質體中。表1.所選序列
實例1A. 構建帶有N末端Ser/Thr之重組抗體
使用與以上實例1中所描述基本上相同之方法，使用SEQ ID NO：6作為其天然huMov19 LC及HC之信號肽，或作為異源LC或HC之信號肽，其修飾在於緊接著SEQ ID NO：6之後插入Ser或Thr殘基，以使得在加工信號肽之裂解產物之後，插入的Ser/Thr成為成熟LC或HC加工序列之第一個(N末端)殘基。
實例2 重組抗體表現
在搖瓶中，在懸浮適應之HEK-293T細胞中，使用修改的PEI程序(Durocher Y,Perret S,&Kamen A High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.Nucleic Acids Res.2002年1月15日；30(2)：E9)短暫地產生嵌合抗體構建體及人類化抗體構建體。如先前所描述(Durocher，見上文)進行PEI短暫轉染，不過使HEK-293T細胞在Freestyle 293(Invitrogen)中生長，且培養物體積在添加PEI-DNA複合物後保持未稀釋。將貼壁及懸浮之短暫轉染物孵育一周，接著依序藉由如下文所描述之蛋白質A管柱及CM管柱離子交換層析法純化澄清之上清液。
實例3 重組抗體純化
使用標準方法，諸如蛋白質A或蛋白質G層析法(HiTrap蛋白質A或蛋白質G HP，1mL，Amersham Biosciences)從澄清之細胞培養物上清液中純化得到抗體。簡言之，藉由添加1/10體積之1M Tris/HCl緩衝液(pH 8.0)來製備用於層析法之上清液。使pH經調整之上清液濾過0.22μm濾膜且將其裝載至用結合緩衝液(PBS，pH 7.3)平衡之管柱上。用結合緩衝液洗滌管柱，直至獲得在280nm下無吸光度之穩定基線。用含0.15M NaCl之0.1M乙酸緩衝液(pH 2.8)，使用流速0.5mL/min對抗體進行溶離。收集約0.25mL溶離份且藉由添加1/10體積之1M Tris/HCl緩衝液(pH 8.0)進行中和。針對1×PBS將峰溶離份透析隔夜兩次，且藉由濾過0.2μm濾膜進行滅菌。藉由在A280下之吸光度對純化抗體進行定量。
使用離子交換層析法(IEX)及羧甲基(CM)層析法進一步純化經蛋白質A純化之溶離份。簡言之，將由蛋白質A純化得到的樣品緩衝液交換成起始緩衝液(10mM磷酸鉀、10mM氯化鈉，pH 7.5)並使其濾過0.22μm篩檢程序。接著將所製備之樣品以120cm/hr流速裝載至經起始緩衝器 平衡之CM fast flow樹脂(GE Lifesciences)上。所選管柱大小應具有足夠容量以結合樣品中之所有抗體。接著用結合緩衝液洗滌管柱，直至獲得在280nm下無吸光度之穩定基線。藉由以20個管柱體積(CV)起始10mM至500mM氯化鈉梯度來溶離抗體。收集UV讀數高於50mAu主峰之溶離份。使用Agilent HPLC 1100系統(Agilent,Santa Clara,CA)，在TSK凝膠G3000SWXL 7.8×300mm及SWXL guard管柱6.0×40mm(Tosoh Bioscience,Montgomeryville,PA)上以尺寸排阻層析法評估純度(單體及可溶性高分子聚集體之百分含量)。彙集具有所需純度(>95%)之溶離份，使用TFF系統緩衝液交換成PBS(pH 7.4)且藉由濾過0.2μm濾膜進行滅菌。藉由SEC進一步測試純化抗體之純度且使用消光係數1.47，藉由在280nm下之吸光度量測值來測定IgG濃度。必要時，進行稀釋。或者，可使用羥基磷灰石陶瓷(CHT)對具有改善之選擇性的鼠類及人類化抗體進行精製。應用細微性為40μm之II型CHT樹脂(Bio-Rad Laboratories)，以與IEX層析法類似之方案精製抗體。CHT之起始緩衝液為20mM磷酸鈉(pH 7.0)，且用20-160mM磷酸鈉梯度經20 CV溶離抗體。
實例4 N末端抗體偶聯-兩步法
用5mM過碘酸鈉水溶液處理(50當量，25℃，30分鐘)工程改造成在重鏈上帶有N末端絲胺酸之huMOV19-NTS#2抗體([1]，如圖1中所示之方案1；3mg/mL於pH7.4之PBS中)。接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成乙酸鈉緩衝液，pH5.0。
在反應容器中，用含有10% v/v DMA(N,N-二甲基乙醯胺)共 溶劑之4-胺基苯乙醇(100mM於DMA[N,N-二甲基乙醯胺]中)處理所得溶液，達到10mM濃度。隨後引入連接子1([3]，方案1；4或5當量)，且密封反應容器，並在37℃下孵育24小時。
接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)緩衝液，pH8.5。接著用DMA(N,N-二甲基乙醯胺)共溶劑(10% v/v)調整溶液，且在25℃下用化合物A(或磺酸化DGN462(sDGN462)或磺酸化D1(或sD1))([5]，方案1；游離硫醇；5當量)處理6小時。
使用NAP過濾柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將所得偶聯物緩衝液交換成250mM甘胺酸、10mM組胺酸、1%蔗糖、0.01% Tween-20、50μM亞硫酸氫鈉配製緩衝液(pH 6.2)。在25℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific 10,000 MWCO)以相同緩衝液透析4小時。
發現純化之偶聯物([6]，方案1)每個抗體均勻地平均連接有兩個化合物A分子(經由Q-ToF質譜法，圖2)，具有>98%單體(經由尺寸排阻層析法)、<2%游離藥物(經由丙酮沈澱之反相HPLC分析)及0.14mg/mL之最終蛋白質濃度(經由UV-Vis，對於huMOV19-NTS#2抗體，使用莫耳消光係數ε280=201400M-1cm-1)。
實例5 N末端抗體偶聯-DMx直接連接
在25℃下，用5mM過碘酸鈉水溶液(50莫耳當量)處理工程改造的含N末端Ser之huMOV19-NTS#2抗體([1]，方案2，圖3；3mg/mL於PBS中，pH7.4)達30分鐘。接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成乙酸鈉緩衝液，pH5.0。
在反應容器中，用含有10% v/v DMA(N,N-二甲基乙醯胺)共溶劑之4-胺基苯乙醇(100mM於DMA[N,N-二甲基乙醯胺]中)處理所得溶液，達到10mM濃度。隨後引入胺氧基-乙醯基MayNMA([3]，方案2；4或5莫耳當量)，且密封反應容器，並在37℃下孵育24小時。
接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成250mM甘胺酸、10mM組胺酸、1%蔗糖緩衝液，pH6.2。在25℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific 10,000 MWCO)以相同緩衝液透析4小時。
發現純化之偶聯物([4]，方案2)每個抗體均勻地平均連接有兩個MayNMA分子(經由Q-ToF質譜法，圖4)，具有>98%單體(經由尺寸排阻層析法)、<2%游離藥物(經由HISEP反相HPLC分析)及0.31mg/mL之最終蛋白質濃度(經由UV-Vis，對於huMov19-NTS#2抗體，使用莫耳消光係數ε280=201400M-1cm-1)。
實例6 N末端抗體偶聯-針對MOV19-NTS#1之兩步方案
在25℃下，用5mM過碘酸鈉水溶液(50莫耳當量)處理經由前導肽序列工程改造成在輕鏈上含N末端絲胺酸之huMov19-NTS#1抗體([1]，方案3，圖5；3mg/mL於PBS中，pH7.4)達30分鐘。接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成乙酸鈉緩衝液，pH5.0。
在反應容器中，用含有10% v/v DMA(N,N-二甲基乙醯胺)共溶劑之4-胺基苯乙醇(100mM於DMA[N,N-二甲基乙醯胺]中)處理所得溶 液，達到10mM濃度。隨後引入連接子1([3]，方案3；4或5莫耳當量)，且密封反應容器，並在37℃下孵育24小時。
接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)緩衝液，pH8.5。接著用DMA(N,N-二甲基乙醯胺)共溶劑(10% v/v)調整溶液，且在25℃下用化合物A([5]，方案3；游離硫醇；5莫耳當量)處理6小時。
使用NAP過濾柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將所得偶聯物緩衝液交換成250mM甘胺酸、10mM組胺酸、1%蔗糖、0.01% Tween-20、50μM亞硫酸氫鈉配製緩衝液(pH 6.2)。在25℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific 10,000 MWCO)以相同緩衝液透析4小時。
發現純化之偶聯物([6]，方案3)每個抗體平均連接有1.4個化合物A分子(經由Q-ToF質譜法，圖6)，具有>98%單體(經由尺寸排阻層析法)、<2%游離藥物(經由丙酮沈澱之反相HPLC分析)及0.14mg/mL之最終蛋白質濃度(經由UV-Vis，對於huMov19-NTS#1抗體，使用莫耳消光係數ε280=201400M-1cm-1)。
實例7 T47D細胞上N末端Ser偶聯物之結合與對照物相當
使用T47D細胞分析N末端Ser-藥物偶聯物(SERIMab ADC)之結合親和力，先前已顯示，該等細胞每個細胞結合約1×105個葉酸受體α(FR-α)抗原。人類化單株抗體huMOV19特異性結合FR α。
為了評價結合親和力，在96孔盤(Falcon，圓底)中，一式兩份以FACS緩衝液(1% BSA，1×PBS)稀釋起始濃度為約3×10-8M的每孔約100 μl之ADC或對照抗體(例如未偶聯之天然huMOV19，或M9346A)，隨後在4℃下以FACS緩衝液進行連續3倍稀釋。使人乳癌細胞株T47D細胞在補充有熱滅活10% FBS(Life Technologies)、0.1mg/mL慶大黴素(gentamycin)(Life Technologies)及0.2IU牛胰島素/mL(Sigma)之RPMI-1640(Life Technologies)中生長，且在PBS中洗滌一次，隨後用Versene(Life Technologies)移除。接著將T47D細胞再懸浮於生長培養基(參見上文)中以中和胰蛋白酶，並在Coulter計數器上計數。接著在冷FACS緩衝液中洗滌細胞兩次，在每次洗滌之間以1200rpm離心5分鐘。
將約100μl/mL之2×104個細胞/孔添加至含ADC、抗體或僅含FACS緩衝液之孔中，且在4℃下孵育2小時。孵育之後，如先前所述對細胞進行離心，且在每孔200μL之冷FACS緩衝液中洗滌一次。接著，在4℃下用每孔200μL偶聯FITC之山羊抗人IgG-Fc γ二次抗體(所包括之對照物為未染色細胞及僅用二次抗體染色之該等細胞)對細胞染色，保持40分鐘，離心且在每孔200μL之冷PBS-D中洗滌一次。將細胞固定於每孔200μL之1%甲醛/PBS-D中且在4℃下儲存。
儲存之後，使用流動式細胞測量術，在FACS Calibur(BD Biosciences)上偵測偶聯物或抗體之細胞表面染色。使用GraphPad Prism將幾何平均值對ADC或抗體之對數濃度作圖，且經由非線性4參數邏輯斯蒂回歸分析(non-linear 4-parameter logistic regression analysis)計算EC50。參見圖8。
亦使用以下各物進行類似實驗：(1)huMOV19-NTS#2-連接子1-化合物A(又稱為「SeriMab-sDGN462」)，每個Ab具有平均兩個化合物A分子；(2)經由磺基-SPDB連接子連接至huMOV-19上離胺酸殘基之ε-胺 基的huMOV19-sSPDB-化合物A，每個huMOV19具有平均2.4個化合物A分子；(3)未偶聯之天然huMOV19抗體(M9346A)；及(4)具有工程改造之N末端Ser的未偶聯工程改造之huMOV19-NTS#2抗體。參見圖7A。
如圖7A及7B中所示，SERIMAb ADC以與未偶聯抗體(M9346A)對照物類似之方式結合至表現靶抗原之T47D細胞的表面。參見例如，圖7B中之EC50值。在圖8A及8B中所示之類似實驗中獲得基本上相同之結果。該等實驗展示，抗原結合不受在N末端絲胺酸殘基處之偶聯過程影響。
對於huMOV19-NTS#2-D8偶聯物亦觀察到類似結果。該偶聯物以與未偶聯對照物(M9346A抗體)或未偶聯工程改造之huMOV19-NTS#2抗體(或SeriMab)類似之方式結合至表現靶抗原之T47D細胞的表面。參見圖23。
實例8 huMOV19NTS#2-連接子1-化合物A對KB子宮頸癌細胞株之細胞毒性的評價
本實驗展示，與工程改造之N末端Ser之位點特異性抗體偶聯不僅提供可預測且可靠的每個抗體之藥物負載，而且亦意外地賦予所得ADC偶聯物比抗體連接至Lys側鏈之偶聯物高的效力。
在環境溫度下，在96孔盤(Corning，平底)中，一式三份用補充有熱滅活10% FBS(Life Technologies)及0.1mg/ml慶大黴素(Life Technologies)之RPMI-1640(Life Technologies)稀釋起始濃度為3.5x10-9M至3.5x10-8M的每孔100μl/各ADC，並在上述培養基中進行3倍連續稀釋。在PBS中洗滌在補充有熱滅活10% FBS(Life Technologies)及0.1mg/ml慶大 黴素(Life Technologies)之EMEM(ATCC)中生長的KB細胞(口腔上皮腫瘤)一次，並用0.05%胰蛋白酶-EDTA(Life Technologies)移除。所測試的其他細胞為在補充有熱滅活10% FBS(Life Technologies)及0.1mg/ml慶大黴素(Life Technologies)之RPMI-1640(LifeTechnologies)中生長的NCI-H2110(NSCLC)及T47D(乳房上皮細胞)。T47D培養基還補充有0.2IU/ml牛胰島素。所有細胞再懸浮於生長培養基(參見上文)中以中和胰蛋白酶，並在Coulter計數器上計數。將100μl/ml之1000-2000個細胞/孔添加至含有ADC或僅含培養基之孔中，且在37℃且含5% CO2之恆溫箱中，在存在及不存在1μM阻斷性huMOV19抗體情況下孵育5天。總體積為每孔200μl。孵育之後，藉由添加每孔20μl WST-8(Dojindo)並使其顯影2小時來分析細胞活力。在板讀取器上，在450及620nm下讀取吸光度。用450nm下之吸光度減去620nm下之吸光度。進一步用經校正之吸光度減去僅含培養基之孔中的背景值且以Excel計算未處理細胞之存活分數(SF)。使用Graph Pad Prism創建ADC濃度(M)隨SF變化之XY曲線。
圖9A中之資料顯示，化合物A可連接至工程改造之N末端Ser，且得到每一抗體分子精確地具有兩個化合物A分子的ADC。相比之下，經由Lys側鏈連接至相同huMOV19抗體之化合物A得到每一抗體具有平均2.4個化合物A分子之ADC，表明連接不同數量化合物A的相對不均勻之ADC群。
圖7A及7B先前已顯示，不管所用鍵聯(經由工程改造之N末端Ser，或經由天然Lys側鏈)如何，所得ADC對抗原具有與未偶聯抗體基本上相同之結合親和力。
然而，儘管在Lys偶聯之ADC中具有較高藥物負載(亦即，2.4對比2.0個化合物A)，但帶有N末端Ser鍵聯之ADC之效力基於抗體濃度比離胺酸偶聯之ADC高約3倍，且基於化合物A之濃度比離胺酸偶聯之ADC高約5倍。參見圖9A之IC50量測值。
另外，添加過量(1μM)未偶聯之huMOV19可阻斷所觀察之殺滅作用，不僅表明所觀察之細胞毒性為特異性的且取決於huMOV19與靶細胞上其抗原之結合，而且亦表明兩種ADC對靶細胞具有相同的不依賴於抗原之活性。
對於與huMOV19偶聯之不同細胞毒素及其帶有N末端Ser偶聯之工程改造形式亦獲得類似結果。參見圖9B中之類美登素偶聯物。帶有N末端Ser鍵聯之ADC具有與Lys偶聯之ADC類似的效力，不過事實是Lys偶聯之ADC具有較高藥物負載(3.5對比2)。
對於huMOV19亦觀察到與不相關抗體類似的結果，如以上所描述。
實例9.
DM4-SPDB-醯肼及DM4-磺基-SPDB-醯肼將藉由使DM4-SPDB或DM4-磺基-SPDB與肼反應來製備，如以上所示。
實例10.
可使先前所述之磺基-SPDB(美國專利號8,236,319)與肼反應以得到磺基-SPDB-肼連接子。
室溫下，在快速攪拌下，向肼(0.015ml，0.242mmol)於DMA 中之0.24M溶液中逐滴添加1-((2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基)-1-側氧基-4-(吡啶-2-基二硫基)丁烷-2-磺酸(25.9mg，0.0635mmol)於DMA中之0.06M溶液。在50℃下，在氬氣下攪拌40分鐘之後，藉由反相HPLC(C18，21.2 x 250mm)，以含有0.1%甲酸之去離子水，使用5-25%之乙腈梯度經30分鐘溶離來純化粗反應混合物。合併含有所需產物之溶離份，冷凍且凍乾，得到3.1mg(15%產率)呈白色固體狀之所需產物。MS(M+1)+實驗值：324.05，計算值：324.01。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 2.13-2.26(m,2H),2.82-2.91(m,2H),3.52(t,J=7.8,6.1Hz,1H),7.24(t,J=7.3,4.7Hz,1H),7.76(d,J=8.0Hz,1H),7.83(t,1H),8.45(d,J=3.5,2.0Hz,1H)。
可使所得化合物與帶有醛或酮之細胞結合劑反應，接著可視情況還原醯肼鍵聯。可使所得連接子與帶有醛或酮之細胞結合劑反應，接著與帶有硫醇之類美登素(諸如DM1或DM4)反應，得到偶聯物。
或者，一旦連接子與細胞結合劑反應，即可使用諸如二硫蘇糖醇或TCEP之試劑還原所得分子之反應性二硫化物，得到硫醇，可使硫醇與帶有類美登素之反應性二硫化物，諸如PyS-DM1或PyS-DM4反應。
實例11.
Boc-羥基胺將與1,3-二溴丙烷反應，接著與硫代乙酸反應。藉由依序用NaOH及HCl處理來使硫醇及胺脫保護，接著使硫醇部分與2,2’-二吡啶基二硫化物反應，得到W1。使DM4與W1反應，得到W2。1,3-二溴丙烷可經其他對稱性二溴化物置換，得到在DM與二硫化物部分之間的具有其他長度之間隔子。
連接子W1亦可用於使帶有酮或醛之細胞結合劑衍生化，以引入反應性二硫化物。肟亦可視情況經還原。任一方法均允許添加帶有硫醇之類美登素，諸如DM1或DM4以完成偶聯。
實例12.
將烷氧胺基乙醯基-Cys(S-2-NO2-苯基)--OH(1mg，2.88μmol，如先前Org.Biomol.Biochem. 2006,4：1313-1419中所描述製備)及 DM4(6mg，7.7μmol)溶解於DMF(250μL)及去離子水(25μL)中且磁力攪拌1小時。反應混合物使用21 x 150mm C18管柱，用含0.1%甲酸之95%去離子水及5%-95%乙腈梯度以20mL/min經30分鐘溶離來進行HPLC純化。收集所需產物，冷凍並凍乾，得到約0.25mg(9%產率)呈白色固體狀之所需產物。MS(M+H)+實驗值972.5；計算值972.3；MS(M-1)實驗值970.4；計算值970.3。
實例13.
將磺基-SPDB-肼(1mg，3.1μmol)及DM4(4mg，5.1μmol)溶解於DMF(300μL)及1/4飽和碳酸氫鈉水溶液(100μL)中且磁力攪拌1小時。反應混合物使用21 x 150mm C18管柱，用含0.1%甲酸之95%去離子水及5%-95%乙腈梯度以20mL/min經30分鐘溶離來進行HPLC純化。收集所需產物，冷凍並凍乾，得到約1mg(19%產率)呈白色固體狀之所需產物。MS(M+H)+實驗值992.6，計算值992.3；MS(M-1)實驗值990.5，計算值990.3。
實例14.
Boc保護之Ala-Ala-Ala-OH(化合物25)可藉由與N-羥基琥珀醯亞胺及EDC偶合劑反應，隨後與肼反應來活化。所得醯肼(化合物26)可藉由與FMoc-Cl反應而經FMoc保護，且Boc保護基可藉由與稀HCl反應來移除。所得化合物27可與1,4-二噁烷-2,6-二酮在DIPEA存在下反應，得到化合物28。DM’可使用EDC而與化合物28偶合且FMoc保護基可藉由與嗎啉反應來移除，得到所需化合物29。
該方案可藉由用Boc保護之胺基酸或肽置換Boc-Ala-Ala-Ala-OH(化合物25)而一般化且戊二酸酐亦可藉由不同環狀酸酐或用單保護之二酸置換，得到在DM’與肽部分之間之其他間隔子。
實例15.
Boc保護之H-Gly-Gly-Gly-OH(化合物8)可藉由與9-茀甲醇DIC偶合劑及二甲基胺基吡啶(DMAP)反應進行保護。所得化合物30可用三氟乙酸進行Boc保護，得到化合物31，其可與1,4-二噁烷-2,6-二酮反應，隨後與三甲基矽烷基乙醇在DIC及DMAP存在下進行保護反應，得到化合物32。接著，化合物32可用嗎啉處理以使9-茀甲烷酯脫保護，得到化合物33。接著，DM’可在EDC偶合劑及HOBT存在下與化合物33偶合，得到化合物34。化合物34之三甲基矽烷基乙烷酯可藉由用氟化第三丁基銨處理來移除，隨後與N-羥基琥珀醯亞胺反應以活化羧酸基團且接著與肼反應，得到所需化合物35。
該方法可藉由用所選Boc保護之胺基酸或肽置換Boc-Gly-Gly-Gly-OH來一般化。1,4-二噁烷-2,6-二酮亦可經不同環狀酸酐或單三甲基矽烷基乙烷保護之二酸置換，得到在DM’與肽部分之間具有其他間隔子的本發明之其他化合物。
實例16.
Boc保護之Ala-Ala-Ala-OH(化合物25)可藉由N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)及EDC反應來活化，隨後與1,2-二胺基乙烷反應，得到化合物36。化合物36可用FMoc-胺氧基乙酸在EDC偶合劑存在下處理，隨後用稀HCl脫除Boc保護基。所得化合物37可與1,4-二噁烷-2,6-二酮反應，得到化合物38。DM’與化合物38在EDC存在下偶合，隨後用嗎啉脫除羥基胺保護基，得到最終產物化合物39。
可以Boc保護之胺基酸或Boc保護之肽使用類似方法，以產生具有不同肽側鏈之本發明化合物。1,4-二噁烷-2,6-二酮亦可經不同環狀酸 酐或單保護之二酸置換，在DM’與肽部分之間得到其他間隔子。
實例17.
合成化合物36b
在含有磁力攪拌棒之燒瓶中，將Boc-Gly3-OH(25b，6g，20.7mmol)溶解於DMF(40mL)中，向其中添加N-羥基琥珀醯亞胺(2.4g，20.7mmol)及EDC(4g，20.7mmol)。磁力攪拌反應1小時，接著在室溫下，在劇烈磁力攪拌下將其緩慢傾入磁力攪拌的乙二胺(8g，133mmol)於DMF(20mL)中之溶液中。添加乙醚(200mL)以沈澱固體。接著渦旋燒瓶且將其放入音波處理槽中，保持15分鐘。真空過濾該物質，接著在室溫下真空乾燥，接著將其溶解於DMF(20mL)中且使用大致相等之注射體積在50mm x 220mm load and lock C18管柱上，前5分鐘用含0.2%甲酸之去離子水及5%乙腈之乙 腈梯度，接著自5分鐘至32分鐘用5%-95%乙腈之線性梯度以100mL/min溶離來純化三輪，且在220nm下偵測。合併含有純所需產物之溶離份，冷凍並凍乾，得到4.5g(65%產率)所需產物36b。
合成化合物36c
將Fmoc胺氧基乙酸(187mg，0.60mmol)溶解於無水DMF(1mL)中，向其中添加TBTU(243mg，0.76mmol)及DIPEA(95μL，0.54mmol)並磁力攪拌3分鐘。接著在磁力攪拌下，添加Boc-Gly3NH-(CH2)2-NH2(200mg，0.54mmol)於無水DMF(1mL)中之溶液。1小時之後，直接在27mm x 220mm load and lock C18管柱上，前5分鐘用含0.2%甲酸之去離子水及10%乙腈之乙腈梯度，接著自5分鐘至32分鐘用10%-95%乙腈之線性梯度以40mL/min溶離來純化反應物，且在254nm下偵測。合併含有純所需產物之溶離份，冷凍並凍乾，得到60mg(17%產率)所需產物36c。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 1.37(s,9H),3.15(dt,J=10.0,5.6Hz,4H),3.58(d,J=6.0Hz,2H),3.67(d,J=5.8Hz,2H),3.74(d,J=5.6Hz,2H),4.16(s,2H),4.26(t,J=6.7Hz,1H),4.43(d,J=6.7Hz,2H),7.01(t,J=6.0Hz,1H),7.33(td,J=7.4,1.2Hz,2H),7.42(t,J=7.4Hz,2H),7.68(d,J=7.4Hz,2H),7.85(d,J=6.0Hz,1H),7.89(d,J=7.5Hz,2H),7.97(d,J=5.7Hz,1H),8.05(t,J=5.6Hz,1H),8.10(t,J=6.0Hz,1H)。HRMS計算值649.2592，實驗值649.2588。
合成化合物37b
在25mL圓底燒瓶中裝入Boc-Gly3-NH(CH2)2NHCOCH2-O-NH-FMoc(76mg，0.122mmol)且將其溶解於95/5三氟乙酸水溶液(10mL)中。在室溫下磁力攪拌反應1小時。在真空中減少反應物體積且將粗殘餘物再溶解於1：1的二氯甲烷與甲苯之混合物(10mL)中，接著真空濃縮。重複共蒸發三次且所得產物(37b)不經進一步純化即使用。MS(m+H+)實驗值：527.4，計算值527.2；(m-1)。
合成化合物38b
在10mL圓底燒瓶中裝入第三丁基保護之H-Gly3-NH(CH2)2NHCOCH2ONH-Fmoc(64mg，0.122mmol)及DMF(3mL)。攪拌該溶液，同時依序添加二甘醇酐(15.52mg，0.134mmol)及N,N-二異丙基乙胺(0.042mL,0.243mmol)。該燒瓶裝備有隔膜且在室溫下磁力攪拌1小時。所需產物藉由半製備型C18 HPLC，用含0.1%甲酸之去離子水及5-95%乙腈之線性梯度經25分鐘溶離來進行分離。合併含產物之溶離份且真空濃縮，得到40mg(0.062mmol，51.2%產率)呈白色殘餘物形式之所需產物(38b)。MS(m+H+)實驗值：643.4，計算值643.2；(m-1)實驗值：641.2，計算值：641.2。
合成化合物38c
在10mL圓底燒瓶中裝入May-NMA(5.06mg，7.78μmol)於乙酸乙酯(1.500mL)中之溶液。接著添加N-(3-二甲基胺基丙基)-N′-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC，3.73mg，0.019mmol)及N,N-二異丙基乙胺(3.39μl，0.019mmol)，隨後添加HOCOCH2OCH2CO-Gly3NH(CH2)2NHCOCH2ONH-FMoc(10mg，0.016mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(1.5mL)中之溶液。在室溫下攪拌反應1小時。將反應物體積在真空中減少一半且產物藉由半製備型C18HPLC，用含0.1%甲酸之去離子水及5-95%乙腈之線性梯度經25分鐘溶離來進行分離。合併含產物之溶離份，冷凍並凍乾，得到1.4mg(13%產率)呈白色固體狀之所需產物(38c)。MS(m+Na+)實驗值：1296.7，計算值：1296.5。
合成化合物39b
將May-NMA-COCH2OCH2CO-Gly3NH(CH2)2NHCH2ONH-Fmoc(1.4mg，1.098μmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(1.5mL)中且將其轉移至裝備有攪拌棒之3mL玻璃小瓶中。攪拌溶液，同時提交20% v/v嗎啉(300μL，3.44mmol)。反應在室溫下在攪拌下進行，直至確定完成。粗反應混合物藉由半製備型C18 HPLC，經3次注射來純化。合併含產物之溶離份，將其轉移至閃爍小瓶中，在乾冰及丙酮浴中冷凍並凍乾，得到1.1mg(95%產率)所需產物(39b)。MS(m+Na+)實驗值：1074.7，計算值：1074.4；高解析度MS(m+H)+實驗值：1052.4331，計算值：1052.4338；(m+Cl-)實驗值：1086.5，計算值：1086.4。
實例18.
Fmoc-Gly 3 -MayNMA
在100mL燒瓶中裝入MayNMA(200mg，0.308mmol)於乙酸乙酯(19mL)中之溶液。真空濃縮反應燒瓶以移除EtOAC。將該物質再溶解於DMSO(10mL)中，用FMoc-Gly3-OH(165mg，0.400mmol)、HOBT(12.25mg，0.080mmol)、EDC(77mg，0.400mmol)及DIPEA(53.7μL，0.308mmol)處理。在室溫下，在氬氣下進行反應。1小時之後，反應物使用Combiflash Rf 200i，使用C18高效金30g管柱以35mL/min進行純化。用含0.1%甲酸之去離子水及5-95%乙腈梯度經20分鐘溶離。合併含所需產物之溶離份，冷凍並凍乾，得到所需產物296mg(93%產率)。MS(M)+實驗值1043.4；計算值：1043.4
H-Gly 3 -MayNMA
將FMoc-Gly3-MayNMA(37.7mg，0.036mmol)溶解於20%嗎啉之DMSO溶液(5mL)中且磁力攪拌1小時。反應物使用Combiflash Rf 200i，使用C18高效金30g管柱以35mL/min進行純化。用含0.1%甲酸之去離子水及2-95%乙腈梯度經25分鐘溶離。合併含所需產物之溶離份，冷凍並凍乾，得到所需產物20mg(75%產率)。LRMS(M)+實驗值821.40，計算值：821.34
Fmoc-胺氧基-Gly 3 -MayNMA
將H-Gly3-MayNMA(15mg，0.018mmol)溶解於DMSO(2mL)中，向其中添加FMoc-胺氧基乙酸(11.44mg，0.037mmol)、DIPEA(3.19μL，0.018mmol)及EDC(7.0mg，0.037mmol)。1小時之後，粗物質藉由半製備型C18 HPLC，使用XB-C18 21.2x150mm，5μm管柱以21.2mL/min流速進行純化。用含0.1%甲酸及5%乙腈之去離子水溶離3分鐘，接著在5-25分鐘內以5%-95%乙腈之線性梯度溶離。合併含所需產物之溶離份，冷凍並凍乾，得到2mg(8%產率)所需產物。MS(M+Na)+實驗值1138.6，計算值：1138.4
胺氧基-Gly 3 -MayNMA
在室溫下，在磁力攪拌下用20%嗎啉之DMSO溶液(1mL)處理FMoc-胺氧基-Gly3-MayNMA(2mg，18μmol)2小時。反應物藉由半製備型C18 HPLC，使用XB-C18 21.2x150mm，5μm管柱以21.2mL/min流速進行純化。用含0.1%甲酸及5%乙腈之去離子水溶離5分鐘，接著在5分鐘-25分鐘內用5%-95%乙腈之線性梯度溶離。立即收集含所需產物之溶離份，冷凍並凍乾，得到胺氧基-Gly3-MayNMA(0.2mg，0.224μmol)。LRMS(M+Na)+實驗值916.60，計算值：916.36；HRMS(M+Na)+實驗值：916.3466；計算值：916.3466。
實例19.
FMoc保護之胺氧基MayNMA
在100mL燒瓶中裝入溶於乙酸乙酯(35mL)中之MayNMA(150mg，0.231mmol)。真空濃縮反應燒瓶以移除EtOAC。在磁力攪拌下，將該物質再溶解於DMF(5mL)中，用FMoc-胺氧基乙酸(72.3mg，0.231 mmol)，隨後EDC(44.2mg，0.231mmol)處理。使反應在氬氣下在室溫下進行4小時，接著藉由半製備型C18 HPLC，使用XB-C18 21.2x150mm，5μm管柱以21.2mL/min流速純化。前5分鐘用含0.1%甲酸之去離子水及5%乙腈梯度溶離，接著自5分鐘至25分鐘用5%-95%乙腈梯度溶離。合併含所需產物之溶離份，冷凍並凍乾，得到24.2mg(11%產率)所需產物。LRMS(M)+實驗值945.35，計算值：945.36
胺氧基-MayNMA
用20%嗎啉之DMF溶液(2mL)處理FMoc保護之胺氧基MayNMA(24.2mg，0.026mmol)。1小時之後，在磁力攪拌下，反應物藉由半製備型C18 HPLC，使用XB-C18 21.2x150mm，5μm管柱以21.2mL/min流速進行純化。前5分鐘用含0.1%甲酸之去離子水及5%乙腈梯度溶離，接著用5%-95%線性梯度經25分鐘溶離。合併含所需產物之溶離份，冷凍並凍乾，得到10mg(54.0%產率)所需產物。MS(M)+實驗值：723.3，計算值：723.3；高解析度MS實驗值：723.2995；計算值：723.3003。
實例20. 單次劑量之SeriMab位點特異性huMOV19NTS#2-連接子1-化合物A針對雌性SCID小鼠中NCI-H2110 NSCLC異種移植物之抗腫瘤活性
自Charles River Laboratories獲得6周齡之雌性CB.17 SCID小鼠。藉由在右側腹中皮下注射，用懸浮於0.1ml 50%基質膠/無血清培養 基中之1 x 107個NCI-H2110腫瘤細胞接種小鼠。當腫瘤體積達到約100mm3(接種後第7天)時，基於腫瘤體積將動物隨機分入4個組中，每組6只小鼠。第1天(接種後第8天)，小鼠接受單次靜脈內施用的媒劑對照物(每只小鼠0.2ml)或基於化合物A濃度之10、25或50μg/kg之huMOV19NTS#2-連接子1-化合物A([6]，方案1)偶聯物。
每週兩到三次使用測徑器以三個尺寸量測腫瘤大小。腫瘤體積係使用式V=長度×寬度×高度×½計算，以mm3表示。當腫瘤體積減小50%或更多時，認為小鼠具有部分消退(PR)，當無法偵測到明顯腫瘤時，認為具有完全腫瘤消退(CR)。腫瘤體積係藉由StudyLog軟體測定。
腫瘤生長抑制(T/C值)係使用下式測定：T/C(%)=治療組之中值腫瘤體積/對照組之中值腫瘤體積×100。
當媒劑對照組之腫瘤體積達到預定大小1000mm3時，同時測定治療組(T)及媒劑對照組(C)之腫瘤體積。測定每一治療組之每日中值腫瘤體積，包括無腫瘤小鼠(0mm3)。根據NCI標準，T/C42%為抗腫瘤活性之最低水準。T/C<10%被視為高抗腫瘤活性水準。
如圖13中所示，偶聯物在25μg/kg及50μg/kg劑量下具有高活性。
實例21. 藉由用蛋白質A樹脂親和力捕獲來富集分解代謝物
在5 x T150組織培養盤中培養表現葉酸受體α(FR α)之KB細胞。37℃下，在用5% CO2緩衝之潮濕恆溫箱中將飽和量的FR α靶向性huMOV19NTS#2-連接子1-化合物A(或SeriMab-sDGN462)偶聯物與KB細胞一起孵育24小時。24小時之後，採集含有細胞流出之分解代謝物之培養基 且彙集用於隨後分析。
藉由在4℃下孵育隔夜，使飽和量之抗異吲哚啉並苯并二氮呯化合物抗體結合至蛋白質A樹脂之漿液。在端至端旋轉器(end-to-end rotator)上，用25ml培養基孵育1ml預先結合之蛋白質A/抗苯并二氮呯化合物抗體複合物數小時。以1000rpm輕柔地離心樹脂且傾析上清液。用PBS(5x)洗滌結合至IGN分解代謝物之蛋白質A/抗IGN抗體樹脂，以移除培養基組分。藉由丙酮萃取將分解代謝物釋放至有機相中。將分解代謝物真空乾燥隔夜，直至有機溶液完全蒸發。分解代謝物用20%乙腈水溶液複水，且藉由LC-MS進行分析。
在5 x T150組織培養盤中培養表現葉酸受體α(FR α)之KB細胞。37℃下，在用5% CO2緩衝之潮濕恆溫箱中將飽和量的FR α靶向性huMOV19-NTS#2-胺氧基-乙醯基-MayNMA(又稱「SeriMab-May」)偶聯物與KB細胞一起孵育24小時。24小時之後，採集含有細胞流出之分解代謝物之培養基且彙集用於隨後分析。
藉由在4℃下孵育隔夜，使飽和量之抗美登素抗體結合至蛋白質A樹脂之漿液。在端至端旋轉器上，用20ml培養基孵育1ml預先結合之蛋白質A/抗美登素抗體複合物數小時。以1000rpm輕柔地離心樹脂且傾析上清液。用PBS(5x)洗滌結合至類美登素分解代謝物之蛋白質A/抗美登素抗體樹脂，以移除培養基組分。藉由丙酮萃取將分解代謝物釋放至有機相中。將分解代謝物真空乾燥隔夜，直至有機溶液完全蒸發。分解代謝物用20%乙腈水溶液複水，且藉由LC-MS進行分析。
MS分析
藉由完整質量分析，使用Waters LCT ESI-TOF表徵huMOV19-NTS#2偶聯物之藥物分佈特徵。藉由LC/MS/MS，使用Waters QTOF進行該偶聯物之胰蛋白酶酶解肽譜定位(樣品經還原，烷基化，隨後以胰蛋白酶消化)。藉由UHPLC/MS/MS，使用Q-Exactive高解析度質譜儀(Thermo)鑑別細胞分解代謝物。使用萃取離子層析圖(XIC)鑑別並表徵靶細胞分解代謝物。對含有特徵性美登森(547 m/z)及DGN(286 m/z)質量特徵的所有分解代謝物質進行鑑別。
在24小時處理之後，SeriMab-sDGN462及SeriMab-May偶聯物均產生由靶細胞流出之分解代謝物。含有末端羧酸的DGN及類美登素代謝物與在抗體重鏈上之N末端絲胺酸或相鄰纈胺酸是殘基之蛋白水解一致。該等分解代謝物為SeriMab偶聯平臺所特有的，因為預期由半胱胺酸或離胺酸偶聯得到的代謝產物將為兩性的。sDGN462偶聯物產生另外的分解代謝物，與硫醇基(DGN-苯胺)之二硫鍵裂解(sDGN462)及自降解一致。離胺酸連接之DGN462偶聯物亦產生該等代謝產物。
實例22. 旁觀者活性
在96孔盤(Falcon，圓底)中，一式六份在補充有熱滅活之10% FBS(Life Technologies)、0.1mg/ml慶大黴素(Life Technologies)及β ME(Life Technologies)之RPMI-1640(Life Technologies)中分別稀釋濃度為1e-10M及4e-10M的每孔50μl偶聯物。在血細胞計數器上對表現重組FOLR1(FR1#14)或無表現載體(親本)之300.19細胞(小鼠)進行計數。將50μl/ml每孔1000個FR1#14細胞添加至含有ADC或僅含培養基之孔中，將50μl/ml每孔2000個親本細胞體積至含有ADC或僅含培養基之孔中且將FR1#14與親本細胞 一起添加至含有ADC或僅含培養基之孔中。所有盤在含5% CO2之37℃恆溫箱中孵育4天。總體積為每孔150μl。孵育之後，藉由添加每孔75μl Cell Titer Glo(Promega)且使其顯影30分鐘來分析細胞活力。在光度計上讀取發光度且自所有值減去僅含培養基之孔的背景值。使用Graph Pad Prism繪製每一細胞處理之平均值的直條圖。
如圖16中所示，經由離胺酸或N末端絲胺酸偶聯的二硫鍵連接之sDGN462 ADC顯示對鄰近抗原陰性細胞有效的旁觀者殺滅作用。
對於絲胺酸連接之D8偶聯物觀察到類似結果。參看圖27。
實例23. 合成化合物D8
步驟1：將羥基胺基甲酸第三丁酯(1.490g，11.19mmol)溶解於無水DMF(22.38mL)中。添加2-(3-溴丙基)異吲哚啉-1,3-二酮(3g，11.19mmol)及碳酸鉀(3.09g，22.38mmol)且在室溫下攪拌反應隔夜。將其用冷水稀釋且用EtOAc萃取。有機物用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且粗殘餘物藉由矽膠急驟層析法(EtOAc/Hex，梯度0%至45%)純化，得到呈黏稠固體狀之化合物8a(2.41g，67%產率)。LCMS=4.99min(8分鐘方法)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.86-7.83(m,2H),7.73-7.77(m,2H),7.28(bs,1H),3.92(t,2H,J=6.0Hz),3.82(t,2H,6.9Hz),2.05-1.98(m,2H),1.47(s,9H)。
步驟2：將化合物8a(2.41g,7.52mmol)溶解於無水DCM (18.81mL)中且在冰浴中冷卻至0℃。添加DCM(9.40ml)與TFA(9.40ml)的新鮮混合之溶液。在室溫下攪拌反應1小時且用DCM稀釋，並用飽和碳酸氫鈉洗滌。有機層用鹽水洗滌，乾燥，過濾並濃縮，得到化合物8b(1.32g，80%產率)。粗物質不經進一步純化即使用。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.85-7.82(m,2H),7.72-7.69(m,2H),3.78(t,2H,J=7.0Hz),3.72(t,2H,6.0Hz),1.99-1.93(m,2H)。
步驟3：將化合物8b(100mg，0.454mmol)溶解於無水DCM(4.5mL)中。添加TEA(127μl，0.908mmol)及(2-(三甲基矽烷基)乙基)碳酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(177mg，0.681mmol)且在室溫下攪拌反應隔夜。反應物用DCM稀釋，用鹽水洗滌，乾燥，過濾並蒸發。粗殘餘物藉由矽膠急驟層析法(EtOAc/Hex，梯度0%至40%)純化，得到化合物8c(148mg，89%產率)。LCMS=5.91min(8分鐘方法)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.86-7.83(m,2H),7.73-7.69(m,2H),7.39(bs,1H),4.26-4.20(m,2H),3.94(t,2H,J=6.0Hz),3.83(t,2H,6.9Hz),2.06-1.98(m,2H),1.05-0.98(m,2H),0.04(s,9H)。
步驟4：將化合物8c(148mg，0.406mmol)溶解於乙醇(2.7mL)中且攪拌直至完全溶解。添加肼(63.7μl，2.030mmol)且在室溫下攪拌反應，直至在1小時之時迅速形成白色沈澱。使反應物濾過矽藻土且再用乙醇沖 洗。蒸發濾液且藉由矽膠急驟層析法(A=MeOH，B=EtOAc梯度，100%至10%)純化。藉由質量偵測產物溶離份且蒸發，得到呈黏稠固體狀之化合物8d(67.5mg，71%產率)。1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ 4.27-4.21(m,2H),3.98(t,2H,J=5.9Hz),2.92-2.87(m,2H),1.85-1.77(m,2H),1.06-0.99(m,2H),0.04(s,9H)。
步驟5：將(S)-2-(((苯甲氧基)羰基)胺基)丙酸(5g，22.40mmol)及(S)-2-胺基丙酸第三丁基酯鹽酸鹽(4.48g，24.64mmol)溶解於無水DMF(44.8mL)中。添加EDC．HCl(4.72g，24.64mmol)、HOBt(3.43g，22.40mmol)及DIPEA(9.75mL，56.0mmol)。在氬氣下，在室溫下攪拌反應隔夜。反應混合物用二氯甲烷稀釋且接著用飽和氯化銨、飽和碳酸氫鈉、水及鹽水洗滌。有機層經硫酸鈉乾燥且濃縮。粗油狀物經由矽膠層析法(己烷/乙酸乙酯)純化，得到化合物2a(6.7g，85%產率)。1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.38-7.31(m,5H),6.53-6.42(m,1H),5.42-5.33(m,1H),5.14(s,2H),4.48-4.41(m,1H),4.32-4.20(m,1H),1.49(s,9H),1.42(d,3H,J=6.8Hz),1.38(d,3H,J=7.2Hz)。
步驟6：將化合物2a(6.7g,19.12mmol)溶解於甲醇(60.7mL)及水(3.03mL)中。用氬氣淨化溶液五分鐘。緩慢添加鈀/碳(潮濕，10%)(1.017g，0.956mmol)。在氫氣氛圍下攪拌反應隔夜。使溶液濾過矽藻土，用甲醇沖洗並濃縮。將其與甲醇和乙腈共沸，且將所得油狀物直接放於高真空下， 得到化合物2b(4.02g，97%產率)，直接用於下一步驟。1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.78-7.63(m,1H),4.49-4.42(m,1H),3.55-3.50(m,1H),1.73(s,2H),1.48(s,9H),1.39(d,3H,J=7.2Hz),1.36(d,3H,J=6.8Hz)。
步驟7：將化合物2b(4.02g，18.59mmol)及己二酸單甲酯(3.03mL，20.45mmol)溶解於無水DMF(62.0mL)中。添加EDC．HCl(3.92g，20.45mmol)、HOBt(2.85g，18.59mmol)及DIPEA(6.49mL，37.2mmol)。在室溫下，攪拌混合物隔夜。反應物用二氯甲烷/甲醇(150mL，5：1)稀釋並用飽和氯化銨、飽和碳酸氫鈉及鹽水洗滌。其經硫酸鈉乾燥，過濾並汽提。使化合物與乙腈共沸(5x)，接著在高真空下在35℃下泵浦，得到化合物2c(6.66g，100%產率)。粗物質不經純化即用於下一步驟。1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ 6.75(d,1H,J=6.8Hz),6.44(d,1H,J=6.8Hz),4.52-4.44(m,1H),4.43-4.36(m,1H),3.65(s,3H),2.35-2.29(m,2H),2.25-2.18(m,2H),1.71-1.60(m,4H),1.45(s,9H),1.36(t,6H,J=6.0Hz)。
步驟8：在室溫下，將化合物2c(5.91g，16.5mmol)在TFA(28.6mL，372mmol)及去離子水(1.5mL)中攪拌三小時。反應混合物在乙腈存在下濃縮且放於高真空下，得到呈黏稠固體狀之粗化合物2d(5.88g，100%產率)。1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.21(d,1H,J=6.8Hz),6.81(d,1H,J=7.6Hz),4.69-4.60(m,1H),4.59-4.51(m,1H),3.69(s,3H),2.40-2.33(m,2H),2.31-2.24(m,2H),1.72-1.63(m,4H),1.51-1.45(m,3H),1.42-1.37(m,3H)。
步驟9：將化合物2d(5.6g，18.52mmol)溶解於無水二氯甲烷(118mL)及無水甲醇(58.8mL)中。添加(5-胺基-1,3-伸苯基)二甲醇(2.70g，17.64mmol)及EEDQ(8.72g，35.3mmol)且在室溫下攪拌反應隔夜。汽提溶劑且添加乙酸乙酯。過濾所得漿液，用乙酸乙酯洗滌且在真空/N2下乾燥，得到化合物2e(2.79g，36%產率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)：δ 9.82(s,1H),8.05,(d,1H,J=9.2Hz),8.01(d,1H,J=7.2Hz),7.46(s,2H),6.95(3,1H),5.21-5.12(m,2H),4.47-4.42(m,4H),4.40-4.33(m,1H),4.33-4.24(m,1H),3.58(s,3H),2.33-2.26(m,2H),2.16-2.09(m,2H),1.54-1.46(m,4H),1.30(d,3H,J=7.2Hz),1.22(d,3H,J=4.4Hz)。
步驟10：將化合物2e(0.52g，1.189mmol)及四溴化碳(1.183g，3.57mmol)溶解於無水DMF(11.89mL)中。添加三苯基膦(0.935g，3.57mmol)且在氬氣下攪拌反應四小時。反應混合物用DCM/MeOH(10：1)稀釋且用水及鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且濃縮。粗物質藉由矽膠層析法(DCM/MeOH)純化，得到化合物2f(262mg，39%產率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)：δ 10.01(s,1H),8.11(d,1H,J=6.8Hz),8.03(d,1H,J=6.8Hz),7.67(s,2H),7.21(s,1H),4.70-4.64(m,4H),4.40-4.32(m,1H),4.31-4.23(m,1H),3.58(s,3H),2.34-2.26(m,2H),2.18-2.10(m,2H),1.55-1.45(m,4H),1.31(d,3H,J=7.2Hz), 1.21(d,3H,J=7.2Hz)。
步驟11：將二溴化物化合物2f及IGN單體化合物I-1溶解於DMF中。添加碳酸鉀且在室溫下攪拌隔夜。向反應混合物中添加水以移出產物。漿液在室溫下攪拌5分鐘且接著過濾，並在真空/N2下乾燥1小時。粗物質藉由矽膠層析法(二氯甲烷/甲醇)純化，得到化合物2g(336mg，74%產率)。LCMS=5.91min(15分鐘方法)。MS(m/z)：990.6(M+1)+。
步驟12：將二亞胺化合物2g溶解於1,2-二氯乙烷中。向反應混合物中添加NaBH(OAc)3且在室溫下攪拌1小時。反應物用CH2Cl2稀釋且NH4Cl飽和水溶液淬滅。分離各層且用鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥並濃縮。粗物質經由RPHPLC(C18管柱，乙腈/水)純化，得到化合物2h(85.5mg，25%產率)。LCMS=6.64min(15分鐘方法)。MS(m/z)：992.6(M+1)+。
步驟13：將甲酯化合物2h溶解於1,2-二氯乙烷中。向反應混合物中添加三甲基氫氧化錫且在80℃下加熱隔夜。將反應混合物冷卻至室溫且用水稀釋。用1M HCl將水層酸化至約pH 4。混合物用CH2Cl2/MeOH(10：1,3 x 20mL)萃取。合併之有機層用鹽水洗滌且經Na2SO4乾燥，並濃縮。 使粗物質通過二氧化矽塞，得到化合物2i(48.8mg，80%產率)。LCMS=5.89min(15分鐘方法)。MS(m/z)：978.6(M+1)+。
步驟14：將化合物2i(30mg，0.031mmol)懸浮於無水DCM(613μl)中。逐滴添加無水DMF，直至溶液變澄清。添加化合物8d(21.57mg，0.092mmol)、EDC．HCl(29.4mg，0.153mmol)及DMAP(0.749mg，6.13μmol)且在室溫下攪拌反應1小時。將其用DCM/MeOH 10：1稀釋，且接著用水洗滌。水層用DCM/MeOH 10：1萃取且乾燥合併之有機物並濃縮，得到化合物8e(49mg)，不經進一步純化即使用。LCMS=5.94min(8分鐘方法)。MS(m/z)：1194.4(M+1)+。
步驟15：將化合物8e(49mg，0.041mmol)溶解於THF(820μl)中且在冰浴中將反應物冷卻到0℃。添加TBAF(205μl，0.205mmol)且攪拌反應15分鐘，隨後移除冰浴。在室溫下攪拌，直至反應完成。將反應物冷卻到0℃，用飽和氯化銨淬滅且用DCM/MeOH 10：1萃取。有機物用鹽水洗滌，用硫酸鈉乾燥並蒸發。粗物質經由RPHPLC(C18管柱，乙腈/水)純化，得到化合物D8(17.6mg，經2個步驟54%產率)。LCMS=5.1mim(8分鐘方法)。MS(m/z)：1050.4(M+1)+。
實例24. 合成化合物D9
步驟1：將化合物9a(17mg，0.016mmol)溶解於DCM(328μl)中。在室溫下添加化合物8d(5.76mg，0.025mmol)及DIPEA(5.71μl，0.033mmol)，且攪拌反應直至完成。將其用10：1 DCM：MeOH稀釋且用鹽水洗滌。乾燥有機物並濃縮，得到化合物9b，將其直接使用。
步驟2：化合物D9係以與實例23中化合物D8類似地方式製備。粗物質經由RPHPLC(C18管柱，乙腈/水)純化，得到化合物D9(5mg，經2個步驟31%產率)。LCMS=5.68min(8分鐘方法)。MS(m/z)：1012.5(M+1)+。
實例25. 製備huCD123-6抗體之SeriMab偶聯物
a)N末端抗體偶聯-兩步法
用5mM過碘酸鈉水溶液(50當量，25℃，30分鐘)處理huCD123-6Gv4.6/7S3抗體([1]，方案3，如圖5中所示；3mg/mL於PBS中，pH7.4)。接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成乙酸鈉緩衝液，pH5.0。
用含有10% v/v共溶劑之4-胺基苯乙醇(100mM於DMA[N,N-二甲基乙醯胺]中)處理所得溶液。隨後引入異雙官能連接子1([3]，方案3；5當量)，且密封反應容器，並在37℃下孵育24小時。
接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)緩衝液，pH8.5。接著用DMA(N,N-二甲基乙醯胺)共溶劑(10% v/v)調整溶液， 且在25℃下用磺酸化DGN462(sDGN462)([5]，方案3；游離硫醇；5當量)處理6小時。
使用NAP過濾柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將所得偶聯物緩衝液交換成250mM甘胺酸、10mM組胺酸、1%蔗糖、0.01% Tween-20、50μM亞硫酸氫鈉配製緩衝液(pH 6.2)。在25℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific 10,000 MWCO)以相同緩衝液透析4小時。
發現純化之偶聯物([6]，方案3)每個抗體均勻地平均連接有兩個DGN462分子(經由Q-ToF質譜法)，具有>98%單體(經由尺寸排阻層析法)、<2%游離藥物(經由丙酮沈澱之反相HPLC分析)及0.18mg/mL之最終蛋白質濃度(經由UV-Vis，對於huCD123-6Gv4.6/7S3抗體，使用莫耳消光係數ε280=213320M-1cm-1)。
b)N末端抗體偶聯-IGN直接連接
在25℃下，用5mM過碘酸鈉水溶液(50莫耳當量)處理工程改造成在重鏈上具有N末端絲胺酸的工程改造之含N末端Ser之huCD123-6Gv4.7S2抗體([1]，方案4，圖17；3mg/mL於PBS中，pH7.4)達30分鐘。接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成乙酸鈉緩衝液，pH5.0。
用含有10% v/v共溶劑之對伸苯基二胺(100mM於DMA[N,N-二甲基乙醯胺]中)處理所得溶液。隨後引入原位磺酸化-D8(或sD8)([3]，方案4；5莫耳當量)，且密封反應容器，並在37℃下孵育24小時。
接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成250mM甘胺酸、10mM組胺酸、1%蔗糖緩衝液，pH6.2。在25℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific 10,000 MWCO)以相同緩衝液透析4小時。
發現純化之偶聯物([4]，方案4)每個抗體均勻地平均連接有兩個D8分子(經由Q-ToF質譜法)，具有>96%單體(經由尺寸排阻層析法)、<3%游離藥物(經由HISEP反相HPLC分析)及1.4mg/mL之最終蛋白質濃度(經由UV-Vis，對於huCD123-6Gv4.7S2抗體，使用莫耳消光係數ε280=213320M-1cm-1)。
以上描述之原位磺酸化-D8(或sD8)係根據以下程序製備：將凍乾呈白色固體形式之D8試劑溶解於DMA(N,N-二甲基乙醯胺)中，達到10-20mM儲備液濃度。添加新制的亞硫酸氫鈉(500mM水溶液，5莫耳當量)且使所得溶液在25℃下反應4-6小時，隨後在4℃保持15小時。引入另一等分試樣之新制亞硫酸氫鈉(500mM水溶液，2莫耳當量)且使其在25℃下反應4小時，隨後在-80℃下儲存待用。
c)N末端抗體偶聯-對於CD123-6Gv4.7S3或S2之兩步方案
在25℃下，用5mM過碘酸鈉水溶液(50莫耳當量)處理工程改造成在具有N末端絲胺酸之huCD123-6Gv4.7S3(或S2-Ab之示意圖係關於S3，但，該方案亦適用於S2)抗體([1]，方案5，圖18；3mg/mL於PBS中，pH7.4)達30分鐘。接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成乙酸鈉緩衝液，pH5.0。
用含有10% v/v共溶劑之4-胺基苯乙醇(100mM於DMA[N,N-二甲基乙醯胺]中)處理所得溶液。隨後引入異雙官能連接子1([3]，方 案5；5莫耳當量)，且密封反應容器，並在37℃下孵育24小時。
接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)緩衝液，pH8.5。接著用DMA(N,N-二甲基乙醯胺)共溶劑(10% v/v)調整溶液，且在25℃下用磺酸化-D1(或sD1)([5]，方案5；游離硫醇；5莫耳當量)處理6小時。
使用NAP過濾柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將所得偶聯物緩衝液交換成250mM甘胺酸、10mM組胺酸、1%蔗糖、0.01% Tween-20、50μM亞硫酸氫鈉配製緩衝液(pH 6.2)。在25℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific 10,000 MWCO)以相同緩衝液透析4小時。
發現純化之偶聯物([6]，方案5)每個抗體平均連接有2.0個sD1分子(經由Q-ToF質譜法)，具有>96%單體(經由尺寸排阻層析法)、<3%游離藥物(經由丙酮沈澱之反相HPLC分析)及0.4mg/mL之最終蛋白質濃度(經由UV-Vis，對於huCD123-6Gv4.7S3抗體，使用莫耳消光係數ε280=213320M-1cm-1)。
實例26 用於製備帶有4個DAR之偶聯物的N末端抗體偶聯
(a)兩步法
用5mM過碘酸鈉水溶液處理(50當量，25℃，30分鐘)工程改造成在重鏈及輕鏈上帶有N末端絲胺酸之huMOV19-NTS2S3抗體([1]，如圖19中所示之方案6；3mg/mL於pH7.4之PBS中)。接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成 乙酸鈉緩衝液，pH5.0。
在反應容器中，用含有10% v/v DMA(N,N-二甲基乙醯胺)共溶劑之4-胺基苯乙醇處理所得溶液，達到10mM濃度。隨後引入連接子1([3]，方案6；10當量)，且密封反應容器，並在37℃下孵育24小時。
接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)緩衝液，pH8.5。接著用DMA(N,N-二甲基乙醯胺)共溶劑(10% v/v)調整溶液，且在25℃下用化合物A(或磺酸化DGN462(sDGN462))([5]，方案6；游離硫醇；10當量)處理6小時。
使用NAP過濾柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將所得偶聯物緩衝液交換成250mM甘胺酸、10mM組胺酸、1%蔗糖、0.01% Tween-20、50μM亞硫酸氫鈉配製緩衝液(pH 6.2)。在25℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific 10,000 MWCO)以相同緩衝液透析4小時。
發現純化之偶聯物([6]，方案6)每個抗體均勻地平均連接有四個化合物A分子(經由Q-ToF質譜法，圖20)，具有>93%單體(經由尺寸排阻層析法)、<2%游離藥物(經由丙酮沈澱之反相HPLC分析)及0.1mg/mL之最終蛋白質濃度(經由UV-Vis，對於huMOV19-NTS2S3抗體，使用莫耳消光係數ε280=201400M-1cm-1)。
(b)DMx直接連接
在25℃下，用5mM過碘酸鈉水溶液(50莫耳當量)處理工程改造的含N末端Ser之huMOV19-NTS2S3抗體([1]，方案7，圖21A；3mg/mL 於PBS中，pH7.4)達30分鐘。接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成乙酸鈉緩衝液，pH5.0。
在反應容器中，用含有10% v/v DMA(N,N-二甲基乙醯胺)共溶劑之4-胺基苯乙醇處理所得溶液，達到10mM濃度。隨後引入胺氧基-乙醯基MayNMA([3]，方案7；10莫耳當量)，且密封反應容器，並在37℃下孵育24小時。
接著，經由NAP脫鹽管柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)將混合物緩衝液交換成250mM甘胺酸、10mM組胺酸、1%蔗糖緩衝液，pH6.2。在25℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific 10,000 MWCO)以相同緩衝液透析4小時。
發現純化之偶聯物([4]，方案7)每個抗體均勻地平均連接有四個MayNMA分子(經由Q-ToF質譜法，圖21B)，具有>95%單體(經由尺寸排阻層析法)、<2%游離藥物(經由HISEP反相HPLC分析)及0.2mg/mL之最終蛋白質濃度(經由UV-Vis，對於huMov19-NTS2S3抗體，使用莫耳消光係數ε280=201400M-1cm-1)。
實例27 huCD123-6抗體之位點特異性偶聯物之活體外細胞毒性
使用活體外細胞毒性分析，將huCD123-6與各種IGN化合物之位點特異性偶聯物(huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8)殺死在細胞表面上表現CD123之細胞的能力與含有相配抗體及有效負載之離胺酸連接之偶聯物(huCD123-6Rv1.1-D2)殺死該等細胞之能力相比較。如以下所描述，進行並分析細胞毒性分析法。
在由細胞供應商(ATCC或DSMZ)所推薦之細胞培養基中培 養細胞株。將細胞以100μL培養基中2,000至10,000個添加至平底96孔盤之每個孔中。為了阻斷細胞表面上之Fc受體，細胞培養基補充有100nM chKTI抗體(屬於相同同型之抗體)。使用3倍連續稀釋在培養基中稀釋偶聯物，且每孔添加100μL。為了確定不依賴於CD123之細胞毒性貢獻，在測試偶聯物之前，向一些孔中添加CD123阻斷抗體(100nM chCD123-6抗體)。在每一分析盤中納入含有細胞及培養基但無偶聯物之對照孔，以及僅含培養基之孔。對於每一資料點，一式三份進行分析。在37℃下，在含6% CO2之潮濕恆溫箱中孵育該等盤4至7天。接著，使用基於WST-8之Cell Counting Kit-8(Dojindo Molecular Technologies,Inc.,Rockville,MD)測定每個孔中存活細胞之相對數量。藉由首先針對培養基背景吸光度校正，且接著用每一值除以對照孔(未處理孔)中該等值之平均值來計算每個孔中細胞之表觀存活分數。將細胞存活分數針對偶聯物濃度以半對數曲線作圖。
在多個細胞株上，huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8偶聯物保持靶(CD123)結合，且活性至少與離胺酸連接之huCD123-6Rv1.1-D2偶聯物相同。使用AML細胞株SHI-1及HNT-34，以及CML細胞株MOLM-1進行細胞毒性分析之若干實例分別顯示於圖22A-22C中。兩種偶聯物均以劑量依賴性方式殺死細胞，且SHI-1細胞、HNT-34細胞及MOLM-1細胞之IC50值分別為約0.01nM、0.002nM及0.03nM。殺滅作用係CD123依賴性的，因為當CD123抗原經未偶聯之huCD123-6抗體阻斷時，該等偶聯物對於該等細胞之毒性低至少100倍。
在另一實驗中，帶有連接子1殘基之huCD123-6-Gv4.7S3-SeriMab-sD1偶聯物(參見圖18)在EOL-1細胞中顯示出與 huCD123-6Gv4.7S2(或S3)-SeriMab-D8偶聯物(圖24)類似的效力。
在另一實驗中，發現在較高DAR下，經Ser連接huCD123抗體之DGN462化合物針對EOL-1細胞的抗原特異性效力為離胺酸連接形式之3倍(參見圖25)。離胺酸連接之偶聯物之DAR為2.9；而Ser連接之偶聯物之DAR為2.0。相比之下，當使用抗原陰性Namalwa細胞時，離胺酸連接之偶聯物與絲胺酸連接之偶聯物均展現明顯較低之活性，指示在EOL-1細胞中之抗原特異性活性。
實例28. SeriMab-D8偶聯物之活體外效力
使用與實例8中所描述類似之分析方案，在KB細胞(圖26A)、Ishikawa細胞(人子宮內膜腺癌細胞)(圖26B)及HEC-1B細胞(人子宮內膜腺癌細胞)(圖26C)上測試SeriMab-D8偶聯物(huMOV19-NTS#2-SeriMab-D8)之活體外效力。
如圖26A-26C中所示，SeriMab-D8偶聯物具有與離胺酸偶聯物(huMOV19-D2)相當之抗原特異性效力及靶結合。
實例29. 具有肟鍵聯之SeriMab偶聯物的活體內穩定性
親和力捕獲LC-MS
用洗滌緩衝液(50mM Tris．HCl，0.15M NaCl，pH 8.0)洗滌可商購之xMag-Streptavidin Microparticles(Biochain,CA)兩次且將其再懸浮於相同緩衝液中達到其初始體積。接著，將生物素化之Fc-FR α(2.6個生物素/Fc-FR α；約114μg)添加至抗生蛋白鏈菌素顆粒(200μL)中且在室溫下旋轉2小時。用洗滌緩衝液洗滌珠粒3次，且將其再懸浮於含0.4% Tween 20之洗滌緩衝液中，達到其初始體積。
從在2分鐘、1天及3天時給與10mg/kg huMOV19-NTS#2-胺氧基-乙醯基-MayNMA偶聯物之CD-1小鼠收集血漿樣品，且將其連同最終20%洗滌緩衝液及0.2% Tween-20一起添加至抗生蛋白鏈菌素-生物素-FR α-Fc顆粒(每一樣品200μL)中。在室溫下輕柔振盪2小時之後，用1mL洗滌緩衝液洗滌樹脂3次且使用50μL的0.1M檸檬酸/檸檬酸鈉(pH 3.0)、50%乙二醇溶離。含有純化之huMOV19偶聯物質的溶離物立即用9μL 1M Tris．HCl(pH 8.5)中和，且接著如先前所描述(Lazar,Wang等人，2005)，藉由SEC或SEC-LC/MS進行分析。
如圖28中所示，在小鼠循環中，肟鍵聯經3天仍穩定。標為D2之峰對應於完整偶聯物。標為A及B之峰為由肟水解及美登森消除得到的裂解產物。在約17天之半衰期下，亦觀察到利用離胺酸連接之Ab-SMCC-DM1偶聯物已觀察到的少量美登素消除。
實例30. 活體內耐受性研究
自Charles River Laboratories獲得雌性CD-1小鼠(7周齡)。接收後，在研究開始之前，觀察動物8天。動物在到達後或在治療之前未顯示疾病或不適跡象。
根據體重，將小鼠隨機分成三組。體重在25.6至24.1公克範圍內，且平均值為25公克。基於個體體重，八隻小鼠給與100μg/kg及150μg/kg(D2藥物劑量)之huMOV19-D2，且2只小鼠給與200μg/kg(D8藥物劑量)之huMOV19-SeriMab-D8。所有偶聯物之施用均以配備有27號½吋針之1.0ml注射器經靜脈內進行。在指定時間點量測個體之體重(圖29)且將變化%對時間(天)作圖。每條線表示一隻小鼠之體重變化。將瀕死或體重減輕>20%之動物處死，因為此被定義為不可耐受之劑量。
如圖29中所示，離胺酸連接之huMOV19-D2具有約100μg/kg之最大耐受劑量(MTD)；而絲胺酸連接之偶聯物huMOV19-SeriMab-D8在200μg/kg下耐受性良好，且經2周具有極少體重減輕跡象。
實例31. 合成化合物D11
將NHS酯11a(10.5mg，9.47μmol)溶解於DMF(0.316mL)中。在室溫下將肼(1.2μL,38μmol)添加至該溶液中且攪拌2小時。粗反應混合物直接藉由RPHPLC(C18管柱，CH3CN/H2O，40%至55%梯度)純化，得到呈白色固體狀之醯肼D11(6.5mg，68%產率)。LCMS=4.923min(8分鐘方法)。質量觀測值(ESI+)：992.70(M+H)。
實例32.
可使用與實例25中所描述類似的程序，製備huMOV19NTS2抗體與sD11或sD1之偶聯物(參見圖30、31A及31B)。
本文引用之所有出版物、專利、專利申請、網際網站及登錄 號/資料庫序列(包括多聚核苷酸及多肽序列)均以引用之方式整體併入本文中用於所有目的，其引用程度就如同特定且個別地指示每一個別出版物、專利、專利申請、互聯網站或登錄號/資料庫序列如此以引用之方式併入一般。
圖1顯示了使用工程改造的含N末端Ser之人類化單株抗體huMOV19-NTS#2合成huMOV19-NTS#2-連接子1-化合物A ADC的方案1。
圖2為完整huMOV19-NTS#2-連接子1-化合物A之Q-ToF質譜(MS)資料。很明顯，反應產物係每個抗體併有兩個化合物A分子之均質ADC。
圖3顯示了使用工程改造的含N末端Ser之人類化單株抗體huMOV19-NTS#2合成huMOV19-NTS#2-胺氧基-乙醯基-MayNMA ADC的方案2。
圖4為完整huMOV19-NTS#2-胺氧基-乙醯基-MayNMA之Q-ToF質譜(MS)資料。很明顯，反應產物係每個抗體併有兩個MayNMA分子之均質ADC。
圖5顯示了使用工程改造的含N末端Ser之人類化單株抗體(例如huMOV19-NTS#1)合成抗體(諸如huMOV19-NTS#1)-連接子1-化合物A ADC的方案3。
圖6顯示了完整huMOV19-NTS#1-連接子1-化合物A之Q-ToF質譜(MS)資料。
圖7A證實，N末端Ser特異性偶聯不會明顯地影響抗體與抗原之結合。huMOV19-NTS#2-MayNMA(或SeriMab-May)及huMOV19-NTS#2-化合物A(或SeriMab-sDGN462)為包含分別經由工程改造之N末端Ser殘基連接至類美登素及細胞毒性化合物A(或磺酸化DGN462(sDGN462))之人類化IgG單株抗體huMOV19的ADC。藉由FACS偵測結合至T47D表面上任何ADC(或對照Ab)的FITC偶聯之山羊抗人類IgG-Fc γ二次抗體來量測T47D(亦即，該表面上之FR α抗原)與ADC(或對照抗體或FACS緩衝液對照物)之間的結合。
圖7B顯示了huMOV19-NTS#2-連接子1-化合物A與表現FR α抗原之T47D細胞的FACS結合資料。離胺酸裝載之huMOV19-sSPDB-化合物A與N末端修飾之huMOV19-NTS#2-連接子1-化合物A具有類似之細胞結合，該結合亦類似於未偶聯之天然huMOV19及工程改造之huMOV19-NTS#2的細胞結合(參見表中的EC50值)。
圖8A顯示，N末端Ser特異性修飾或偶聯不會明顯地影響抗體與抗原之結合。如以上圖7A及7B中所示，如藉由FACS所量測，野生型抗FR α抗體huMOV19、其N末端Ser修飾形式huMOV19-NTS#2(「SeriMab」)，及其各自與類美登素之偶聯物，即Ab-SMCC-DM1(野生型huMOV19之離胺酸殘基經由SMCC連接子連接至DM1)及SeriMab-May(huMOV19-NTS#2經由工程改造之N末端Ser連接至類美登素)，與帶有FR α 之T47D細胞具有基本上相同之結合親和力。
圖8B顯示，N末端Ser特異性修飾或偶聯不會明顯地影響抗體與抗原之結合。如以上圖7A及7B中所示，如藉由FACS所量測，野生型抗FR α抗體huMOV19、其N末端Ser修飾形式huMOV19-NTS#2(「SeriMab」)及其與細胞毒性化合物A之偶聯物(SeriMab-sDGN462)與帶有FR α之T47D細胞具有基本上相同之結合親和力。
圖9A顯示出ADC偶聯物MOV19-NTS#2-連接子1-化合物A對KB子宮頸細胞株之細胞毒性之評估的結果。資料顯示，本發明之位點特異性N末端Ser連接之SERIMab-化合物A偶聯物的效力以抗體濃度計為離胺酸偶聯之sSPDB-化合物A的約3倍，且以化合物A之濃度計為約5倍。兩種偶聯物具有相同的不依賴於抗原之活性，因為在1μM未偶聯之huMOV19存在下，該兩種所測試之偶聯物阻斷KB細胞上之抗原結合位點的效力大致相同。
圖9B顯示出ADC偶聯物SeriMab-May對KB子宮頸細胞株之細胞毒性之評估的結果。資料顯示，SeriMab-May偶聯物在較高DAR(細胞毒性化合物與抗體比率)下具有與離胺酸偶聯物Ab-SMCC-DM1相同之效力。
圖10及11顯示出可用於製備本發明之偶聯物的示例性細胞毒性化合物。
圖12A-12D顯示出用於製備本發明之偶聯物的示例性方案。
圖13顯示了在帶有NCI-H2110之SCID小鼠中huMOV19-NTS#2-連接子1-化合物A之活體內功效。
圖14A顯示了具有二硫化物連接子之SeriMab-sDGN462偶聯物的結構。虛線指示產生所觀察之靶細胞分解代謝物的裂解位點之位置。圖14B顯示了在KB子宮頸癌細胞中活體外形成之SeriMab-sDGN462偶聯物之分解代謝物的孵育、純化及分離方案。顯示出由LC-MS鑑別之四種分解代謝物以及m/z比率之計算值及觀測值。
圖15A顯示了具有不可裂解連接子之SeriMab-May偶聯物的結構。虛線指示產生所觀察之靶細胞分解代謝物的裂解位點之位置。圖15B顯示了在KB子宮頸癌細胞中活體外形成之SeriMab-May偶聯物的分解代謝物的孵育、純化及分離方案。顯示出由LC-MS鑑別之兩種分解代謝物以及m/z比率之計算值及觀測值。
圖16顯示了有關SeriMab-sDGN462及相應Lys連接之Ab-sSPDB-sDGN462偶聯物之旁觀者殺滅分析(bystander killing assay)的結果。
圖17顯示了使用工程改造的含N末端Ser之人類化單株抗體合成huCD123-sD8偶聯物之示例性方案。
圖18顯示了用於合成帶有連接子1殘基之huCD123-6-SeriMab-sD1偶聯物的示例性方案。
圖19顯示了用於合成huMOV19NTS2S3-SeriMab-DGN462偶聯物或具有4 DAR之huMOV19NTS2S3-SeriMab-sDGN462偶聯物(huMov19NTS2S3-SeriMab-sDGN462)之示例性方案，該偶聯物帶有連接子1殘基。
圖20顯示了具有4 DAR之huMOV19NTS2S3-SeriMab-sDGN462偶聯物 (huMov19NTS2S3-SeriMab-sDGN462)的Q-ToF質譜(MS)資料。
圖21A顯示了用於合成具有4 DAR之huMOV19NTS2S3-SeriMab-MayNMA偶聯物的示例性方案。圖21B顯示了具有4 DAR之Ser連接之huMOV19-SeriMab-MayNMA偶聯物的Q-ToF質譜(MS)資料。
圖22A-22C顯示，在AML細胞株SHI-1(圖22A)及HNT-34(圖22B)，以及CML細胞株MOLM-1(圖22C)中，huCD123-6(huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8，實心黑色圓圈)中之SeriMab的活性至少與同一抗體之離胺酸連接之偶聯物(huCD123-6Rv1.1-D2，實心黑色三角形)相同。在每個圖中連接空心資料點之虛線曲線表示在阻斷濃度(500nM)之未偶聯huCD123-6抗體存在下對應偶聯物(亦即，huCD123-6Rv1.1S2-SeriMab-D8為空心圓圈，及huCD123-6Rv1.1-D2為空心倒三角形)之活性。有關Lys連接之抗體-D2偶聯物之結構，參見實例28(示出huMOV19-D2結構，而且huCD123-6Rv1.1-D2偶聯物具有相同結構)。
圖23顯示，N末端Ser特異性修飾或偶聯不會明顯地影響抗體與抗原之結合。如藉由FACS所量測，野生型抗FR α huMOV19抗體、其N末端Ser修飾形式huMOV19-NTS2(「huMOV19-SeriMab抗體」)及其與細胞毒性化合物D8之偶聯物(huMOV19-SeriMab-D8)與帶有FR α之T47D細胞具有基本上相同之結合親和力。
圖24顯示，huCD123-6Gv4.7S3-SeriMab-sD1偶聯物(參見圖18)在EOL-1細胞中顯示出與huCD123-6Gv4.7S2(或S3)-SeriMab-D8偶聯物類似的效力。亦示出了Lys連接之huCD123-6Gv4.7S3-sSPDB-D1及 huCD123-6Gv4.7S3-D2偶聯物之結果。
圖25顯示了在較高DAR下，經Ser連接huCD123抗體之DGN462化合物針對EOL-1細胞的抗原特異性效力為離胺酸連接形式之3倍。
圖26A-26C顯示，SeriMab-D8(huMOV19-NTS#2-SeriMab-D8)偶聯物具有與離胺酸偶聯物(huMOV19-D2)類似的抗原特異性效力及靶結合。
圖27顯示了有關huMOV19-SeriMab-D8及相應Lys連接之huMOV19-D2偶聯物之旁觀者殺滅分析的結果。
圖28顯示了在huMOV19-NTS#2-胺氧基-乙醯基MayNMA偶聯物中肟鍵聯之活體內穩定性。
圖29顯示了用100μg/kg或150μg/kg離胺酸連接之huMOV19-D2偶聯物或者200μg/kghuMOV19-SeriMab-D8處理之雌性CD-1小鼠之個體體重變化百分比。
圖30顯示了用於合成本發明之偶聯物之示例性方案。
圖31A及31B顯示了用於合成本發明之偶聯物的示例性方案。
<110> 免疫原公司
<120> 包含細胞結合劑及細胞毒性劑之偶聯物
<130> 121162-02020
<150> 62/045264
<151> 2014-09-03
<150> 62/086,986
<151> 2014-12-03
<150> 62/149,379
<151> 2015-04-17
<150> 62/186,235
<151> 2015-06-29
<160> 71
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1-2.1抗體輕鏈信號肽(NCBI CAB46122)
<400> 1
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGKV1-99*01登錄號CAB46122
<400> 2
<210> 3
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1-2.1輕鏈(呈表現之形式)
<400> 3
<210> 4
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶有信號肽之FR1-2.1全長輕鏈
<400> 4
<210> 5
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1-2.1重鏈
<400> 5
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huMov19 LC及HC信號肽
<400> 6
<210> 7
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huMov19 LC
<400> 7
<210> 8
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huMov19 HC
<400> 8
<210> 9
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huMov19 LC NTS1(呈表現之形式)
<400> 9
<210> 10
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶有FR1-2.1輕鏈信號肽之huMov19 LC NTS1
<400> 10
<210> 11
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huMov19 HC NTS2
<400> 11
<210> 12
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huMov19 LC NTS3
<400> 12
<210> 13
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huMov19 HC NTS4(呈表現之形式)
<400> 13
<210> 14
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帶有FR1-2.1輕鏈信號肽之huMov19 HC NTS4
<400> 14
<210> 15
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huMov19 LC NTT1
<400> 15
<210> 16
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huMov19 HC NTT2
<400> 16
<210> 17
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 17
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> X
<222> (1)..(1)
<223> β-ala
<400> 18
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 19
<210> 20
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 源自于鼠類IGKV6-32*01序列之輕鏈序列
<400> 20
<210> 21
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-1*01
<400> 21
<210> 22
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-10*01
<220>
<221> X
<222> (97)..(97)
<400> 22
<210> 23
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-10*02
<400> 23
<210> 24
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-12*01
<400> 24
<210> 25
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-12*02
<400> 25
<210> 26
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-13*01
<220>
<221> X
<222> (92)..(92)
<400> 26
<210> 27
<211> 97
<212> PRT
<213> IGLV3-16*01
<400> 27
<210> 28
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-19*01
<400> 28
<210> 29
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-21*01
<400> 29
<210> 30
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-21*02
<400> 30
<210> 31
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-21*03
<400> 31
<210> 32
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-22*01
<400> 32
<210> 33
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-25*01
<400> 33
<210> 34
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-25*02
<400> 34
<210> 35
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-25*03
<400> 35
<210> 36
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-27*01
<400> 36
<210> 37
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-31*01
<400> 37
<210> 38
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-31*02
<400> 38
<210> 39
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-32*01
<400> 39
<210> 40
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-9*01
<400> 40
<210> 41
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人λ V3家族V基因序列IGLV3-9*02
<400> 41
<210> 42
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾之huMov19輕鏈或重鏈信號肽
<400> 42
<210> 43
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33抗體重鏈
<400> 43
<210> 44
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD33抗體輕鏈
<400> 44
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLR1抗體重鏈CDR1
<400> 45
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLR1抗體重鏈CDR2
<220>
<221> X
<222> (14)..(14)
<223> Lys、Gln、His或Arg
<220>
<221> X
<222> (16)..(16)
<223> Gln、His、Asn或Arg
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> Gly、Glu、Thr、Ser、Ala或Val
<400> 46
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLR1抗體重鏈CDR3
<400> 47
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLR1抗體輕鏈CDR1
<400> 48
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLR1抗體輕鏈CDR2
<400> 49
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLR1抗體輕鏈CDR2
<400> 50
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLR1抗體重鏈CDR2
<400> 51
<210> 52
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLR1抗體重鏈
<400> 52
<210> 53
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLR1抗體輕鏈
<400> 53
<210> 54
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLR1抗體輕鏈
<400> 54
<210> 55
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLR1抗體重鏈可變結構域
<400> 55
<210> 56
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLR1抗體輕鏈可變結構域
<400> 56
<210> 57
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FOLR1抗體輕鏈可變結構域
<400> 57
<210> 58
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD37抗體免疫球蛋白輕鏈
<400> 58
<210> 59
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD37抗體免疫球蛋白重鏈
<400> 59
<210> 60
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD37抗體免疫球蛋白重鏈
<400> 60
<210> 61
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD37抗體免疫球蛋白輕鏈區
<400> 61
<210> 62
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD37抗體免疫球蛋白重鏈區
<400> 62
<210> 63
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huML66HC全長重鏈
<400> 63
<210> 64
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huML66LC全長輕鏈
<400> 64
<210> 65
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗EGFR抗體免疫球蛋白重鏈
<400> 65
<210> 66
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗EGFR抗體免疫球蛋白輕鏈
<400> 66
<210> 67
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗EGFR抗體免疫球蛋白輕鏈
<400> 67
<210> 68
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19抗體免疫球蛋白重鏈
<400> 68
<210> 69
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19抗體免疫球蛋白輕鏈
<400> 69
<210> 70
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗Muc1抗體免疫球蛋白重鏈
<400> 70
<210> 71
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗Muc1抗體免疫球蛋白輕鏈
<400> 71

Claims (169)

  1. 一種由以下結構式表示的細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：CBA係共價連接至JCB’基團之細胞結合劑；JCB’係藉由使該CBA上之醛基與連接至基團L之醛反應性基團反應所形成的部分，其中該醛基係衍生自由以下結構式表示之2-羥基乙胺部分的氧化： 其中該2-羥基乙胺部分係絲胺酸、蘇胺酸、羥基離胺酸、4-羥基鳥胺酸或2,4-二胺基-5-羥基戊酸殘基之一部分；L係間隔子或鍵；JD’係將該細胞毒性劑D與該基團L連接之連接部分，或當L係鍵時不存在；D係經由該連接部分JD’共價連接至L或當L係鍵時經由JCB’連接至CBA之細胞毒性劑；且w係1、2、3或4。
  2. 如申請專利範圍第1項之偶聯物，其中該細胞結合劑為抗體或其抗原結合部分，或抗體模擬物，諸如DARPin、Centyrin、親和體、人類泛素 (affilin)、affitin、抗運載蛋白、高親和性多聚體(avimer)、Fynomer、Kunitz結構域肽、單抗體(或adnectin)、三鏈抗體或nanofitin。
  3. 如申請專利範圍第1項之偶聯物，其中該細胞結合劑為抗體或其抗原結合部分，諸如Fab、F(ab)2、F(ab’)、F(ab’)2、F(ab’)3、Fd、Fv、二硫鍵連接之Fv、dAb或sdAb(或奈米抗體)、CDR、scFv、(scFv)2、di-scFv、bi-scFv、tascFv(串聯scFv)、AVIBODY(例如雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體)、T細胞接合物(BiTE)、scFv-Fc、Fcab、mAb2、小模組免疫藥物(SMIP)、Genmab/單抗體或duobody、V-NAR結構域、IgNAR、微型抗體、IgG△CH2、DVD-Ig、probody、內抗體或多特異性抗體。
  4. 如申請專利範圍第3項之偶聯物，其中該醛基係位於該抗體或其抗原結合部分之N末端。
  5. 如申請專利範圍第4項之偶聯物，其中該N末端醛基係衍生自N末端絲胺酸之氧化。
  6. 如申請專利範圍第5項之偶聯物，其中該N末端絲胺酸係工程改造至該抗體或其抗原結合部分中。
  7. 如申請專利範圍第6項之偶聯物，其中該抗體或其抗原結合部分係如申請專利範圍第90項至第93項中任一項之重組抗體中的任一種。
  8. 如申請專利範圍第4項之偶聯物，其中該N末端絲胺酸天然存在於該抗體或其抗原結合部分中。
  9. 如申請專利範圍第3項之偶聯物，其中該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO：3之輕鏈序列。
  10. 如申請專利範圍第3項之偶聯物，其中該抗體或其抗原結合部分係包 含SEQ ID NO：3之輕鏈序列的鼠類抗體或其抗原結合部分之嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體，或其抗原結合部分。
  11. 如申請專利範圍第10項之偶聯物，其中該人類化抗體或其抗原結合部分係表面重塑或CDR移植之抗體，或其抗原結合部分。
  12. 如申請專利範圍第4項至第11項中任一項之偶聯物，其中該N末端醛基係位於該抗體或其抗原結合部分之一條或兩條重鏈上，或該抗體或其抗原結合部分之一條或兩條輕鏈上，或其組合上。
  13. 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之偶聯物，其中該醛反應性基團為肼、醯肼或羥基胺。
  14. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之偶聯物，其中該醛反應性基團係選自： 其中Xa為CH2、O或NCH3；U’為NH、O、S或CH2；U為H或供電子基團；Xb及Xb’各自獨立地為-OH、-SH或-NH2；RZ及RZ’各自獨立 地為H或烷基(較佳為-Me)；RZ’’為H或烷基；及Xc為N或CH。
  15. 如申請專利範圍第14項之偶聯物，其中該醛反應性基團為、
  16. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之偶聯物，其中JCB’係由以下結構式中的任一個表示： 其中Xa為CH2、O或NCH3；U’為NH、O、S或CH2；U為H或供電子基團；Xb1及Xb1’各自獨立地為-O-、-S-或-NH-；RZ及RZ’各自獨立地為H或烷基(較佳為-Me)；且RZ’’為H或烷基；s1為共價連接至該細胞結合劑之位點；且s2為共價連接至該基團L之位點。
  17. 如申請專利範圍第16項之偶聯物，其中JCB’為、
  18. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之偶聯物，其中-L-JD’-係由以下結構式表示： 其中：s3為共價連接至該基團JCB’之位點；s4為共價連接至該基團D之位點；Za1為不存在、-SO2NR9-、-NR9SO2-、-C(=O)-NR9-、-NR9-C(=O)-、-(CH2CH2)p’NR9-C(=O)-、-C(=O)-NR9(CH2CH2)p’、-(CH2CH2)p’-C(=O)NR9-、 -NR9C(=O)(CH2CH2)p’-、-C(=O)-O-或-O-C(=O)-；Za2為不存在、-SO2NR9-、-NR9SO2-、-C(=O)-NR9-、-NR9-C(=O)-、-C(=O)-O-、-O-C(=O)-、-C(=O)-NR9-(CH2CH2O)p-、-NR9-C(=O)-(CH2CH2O)p-、-(OCH2CH2)p-C(=O)NR9-或-(OCH2CH2)p-NR9-C(=O)-；R9為H或視情況經取代之烷基；p及p’各自獨立地為1至10之整數；Q為H、帶電荷之取代基或可離子化之基團；Ra1、Ra2、Ra3、Ra4在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基；q1及r1各自獨立地為0至10之整數，條件為q1及r1不同時為0。
  19. 如申請專利範圍第18項之偶聯物，其中Q為i)H；ii)-SO3H、-Z’-SO3H、-OPO3H2、-Z’-OPO3H2、-PO3H2、-Z’-PO3H2、-CO2H、-Z’-CO2H、-NR11R12或-Z’-NR11R12，或其醫藥學上可接受之鹽；或iii)-N+R14R15R16X-或-Z’-N+R14R15R16X-；Z’為視情況經取代之伸烷基、視情況經取代之伸環烷基或視情況經取代之伸苯基；R14至R16各自獨立地為視情況經取代之烷基；且X-為醫藥學上可接受之陰離子。
  20. 如申請專利範圍第19項之偶聯物，其中Q為-SO3H或-CO2H，或其醫藥學上可接受之鹽。
  21. 如申請專利範圍第18項至第20項中任一項之偶聯物，其中Za1不存在；且Za2為-C(=O)-NR9-或-NR9-C(=O)-。
  22. 如申請專利範圍第21項之偶聯物，其中R9為H。
  23. 如申請專利範圍第18項至第20項中任一項之偶聯物，其中Za1及Za2均不存在。
  24. 如申請專利範圍第18項至第23項中任一項之偶聯物，其中Ra1、Ra2、Ra3及Ra4均為-H；且q及r各自獨立地為0至4之整數。
  25. 如申請專利範圍第18項之偶聯物，其中-L-JD’-係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中R為H或-SO3H。
  26. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之偶聯物，其中-L-JD’-係由以下結構式表示： 其中：s3為共價連接至該基團JCB’之位點；s4為共價連接至該基團D之位點；Zb1及Zb2各自獨立地為不存在、-SO2NR9-、-NR9SO2-、-C(=O)-NR9-、-NR9-C(=O)-、-C(=O)-O-、-O-C(=O)-、-CH2-O-、-O-CH2-、-(CH2CH2O)p-或-(OCH2CH2)p’-、-NR9-C(=O)-CH2-或-CH2-C(=O)-NR9-，其中p及p’獨立地為1至1000之整數；E1及E2之一為-C(=O)-，且另一個為-NR9-；或E1及E2之一為-C(=O)- 或-NR9-，且另一個不存在；R9為H或視情況經取代之烷基；P為[XX]1-10，其中每個XX為獨立選擇之胺基酸之殘基，或P為-(NRm-CH2CH2)s-；s為1至5之整數；Rm為H，或視情況經帶電荷之取代基或可離子化之基團取代的烷基；Rb1、Rb2、Rb3、Rb4、Rb5及Rb6在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基；m1及n1在每次出現時獨立地為0至10之整數。
  27. 如申請專利範圍第26項之偶聯物，其中-L-JD’-係由以下結構式表示： 其中：Zb1及Zb2不存在，或Zb1及Zb2之一不存在且另一個為-CH2-O-或-O-CH2-；且n1為1至6之整數。
  28. 如申請專利範圍第27項之偶聯物，其中Rb1及Rb2均為H。
  29. 如申請專利範圍第26項之偶聯物，其中-L-JD’-係由以下結構式表示： 其中：Zb1及Zb2各自獨立地為不存在、-CH2-O-、-O-CH2-、-NR9-C(=O)-CH2- 或-CH2-C(=O)-NR9-；且n1及m1各自獨立地為1至6之整數。
  30. 如申請專利範圍第29項之偶聯物，其中Zb1及Zb2均不存在。
  31. 如申請專利範圍第29項之偶聯物，其中Zb1為-CH2-O-；且Zb2不存在。
  32. 如申請專利範圍第29項之偶聯物，其中Zb1為-CH2-C(=O)-NR9-；且Zb2為-O-CH2-或不存在。
  33. 如申請專利範圍第26項、第29項或第32項之偶聯物，其中R9為-H。
  34. 如申請專利範圍第26項及第29項至第33項中任一項之偶聯物，其中P為[XX]2-4。
  35. 如申請專利範圍第34項之偶聯物，其中P為[XX]2或[XX]3。
  36. 如申請專利範圍第26項及第29項至第35項之偶聯物，其中每個XX為獨立選擇之胺基酸的殘基，該胺基酸選自：天然存在之胺基酸、合成胺基酸、胺基酸類似物，或以與該等天然存在之胺基酸類似之方式起作用的胺基酸模擬物。
  37. 如申請專利範圍第36項之偶聯物，其中每個XX為獨立選擇之胺基酸的殘基，該胺基酸選自由以下各物組成之群：組胺酸、丙胺酸、異白胺酸、精胺酸、白胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、天冬胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸、苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、甘胺酸、纈胺酸、脯胺酸、絲胺酸、酪胺酸、N-甲基-組胺酸、N-甲基-丙胺酸、N-甲基-異白胺酸、N-甲基-精胺酸、N-甲基-白胺酸、N-甲基-天冬醯胺酸、N-甲基-離胺酸、N-甲基-天冬胺酸、N-甲基-甲硫胺酸、N-甲基-半胱胺酸、N-甲基-苯丙胺酸、N-甲基-麩胺酸、N-甲基-蘇胺酸、N-甲基- 麩醯胺酸、N-甲基-色胺酸、N-甲基-甘胺酸、N-甲基-纈胺酸、N-甲基-脯胺酸、N-甲基-絲胺酸、N-甲基-酪胺酸、羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、硒代半胱胺酸、O-磷酸絲胺酸、高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶、瓜胺酸、鳥胺酸、半胱胺酸磺酸、半胱胺酸亞磺酸、3-胺基丙胺酸、3-二甲基胺基丙胺酸、2-胺基-4-(二甲基胺基)丁酸、2,4-二胺基丁酸、2-胺基-6-(二甲基胺基)己酸、2-胺基-5-(二甲基胺基)戊酸及β-丙胺酸，其各自獨立地為L或D異構體。
  38. 如申請專利範圍第37項之偶聯物，其中每個XX獨立地為甘胺酸或丙胺酸之殘基。
  39. 如申請專利範圍第26項及第29項至第38項之偶聯物，其中P為蛋白酶可裂解之肽。
  40. 如申請專利範圍第39項之偶聯物，其中P為腫瘤組織中表現之蛋白酶可裂解之肽。
  41. 如申請專利範圍第39項之偶聯物，其中P為溶酶體蛋白酶可裂解之肽。
  42. 如申請專利範圍第26項、第29項至第34項及第36項至第41項之偶聯物，其中P選自由以下各物組成之群：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：17)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：18)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：19)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、 D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala及D-Ala-D-Ala、Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、d-Ala-Ala-Ala、Ala-d-Ala-Ala、Ala-Ala-d-Ala、Ala-Val-Cit及Ala-Val-Ala。
  43. 如申請專利範圍第26項及第28項至第41項之偶聯物，其中P為Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、d-Ala-Ala-Ala、Ala-d-Ala-Ala、Ala-Val-Ala、Gly-Gly或Ala-Ala。
  44. 如申請專利範圍第26項及第34項至第43項中任一項之偶聯物，其中-L-JD’-係由以下結構式表示：
  45. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之偶聯物，其中-L-JD’-係由以下結構式表示： s3為共價連接至該基團JCB’之位點；s4為共價連接至該基團D之位點； Zc1為不存在、-SO2NR9-、-NR9SO2-、-C(=O)-NR9、-NR9-C(=O)-、-C(=O)-O-、-O-C(=O)-、-CH2-O-、-O-CH2-、-(CH2CH2O)p-或-(OCH2CH2)p’-，其中p及p’獨立地為1至1000之整數； JD’為、、、 、或，其中s1’ 為共價連接至該細胞毒性劑D之位點，s2’為共價連接至基團A’之位點；A及A’各自獨立地為視情況經取代之伸烷基、視情況經取代之伸烯基、視情況經取代之伸炔基、視情況經取代之伸環烷基、視情況經取代之伸環烯基或視情況經取代之伸環炔基；Q為-Z1-P-Z2-；Q’為-Z1’-P’-Z2’-；Z1及Z2之一為-C(=O)-，且另一個為-NRh-；Z1’及Z2’之一為-C(=O)-’且另一個為-NRh’-；P及P’各自獨立地為不存在、視情況經取代之伸烷基、-(CH2-CH2-O)j-、-(O-CH2-CH2)j-或[XX]1-10，其中每個XX為獨立選擇之胺基酸的殘基；j為介於1與500之間之整數；k為0或1；L為-(CR5R6)v-、-(CR7R8)q-N(Rg)-(CR9R10)r-、-(CR7R8)q-C(Ra)(Rg)-(CR9R10)r或-(CR11R12)s-N(Rg)-(CR13R14)t-N(Rg’)-(CR15R16)u-； Rg及Rg’各自獨立地為-(CR17R18)p-Z-V；p為介於1與5之間之整數；V為H、帶電荷之取代基或可離子化之基團；Z為不存在、-C(=O)NRh-伸烷基-或-NRh-C(=O)-伸烷基-；Rh及Rh’在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基；R5至R18在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基；q、r、s、t、u及v各自獨立地為介於0與10之間之整數。
  46. 如申請專利範圍第45項之偶聯物，其中-L-JD’-係由以下結構式表示： 其中：R19至R22在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基，m及n各自獨立地為0至10。
  47. 如申請專利範圍第46項之偶聯物，其中R19至R22各自為H；R5及R6各自為H；R7至R10各自為H；且R11至R16各自為H。
  48. 如申請專利範圍第45項至第47項之偶聯物，其中P及P’在每次出現時獨立地為[XX]1-10。
  49. 如申請專利範圍第45項至第48項之偶聯物，其中每個XX為獨立選擇之胺基酸的殘基，該胺基酸選自：天然存在之胺基酸、合成胺基酸、胺基酸類似物，或以與該等天然存在之胺基酸類似之方式起作用的胺基酸模擬物。
  50. 如申請專利範圍第49項之偶聯物，其中每個XX為獨立選擇之胺基酸的殘基，該胺基酸選自由以下各物組成之群：組胺酸、丙胺酸、異白胺酸、精胺酸、白胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、天冬胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸、苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、甘胺酸、纈胺酸、脯胺酸、絲胺酸、酪胺酸、N-甲基-組胺酸、N-甲基-丙胺酸、N-甲基-異白胺酸、N-甲基-精胺酸、N-甲基-白胺酸、N-甲基-天冬醯胺酸、N-甲基-離胺酸、N-甲基-天冬胺酸、N-甲基-甲硫胺酸、N-甲基-半胱胺酸、N-甲基-苯丙胺酸、N-甲基-麩胺酸、N-甲基-蘇胺酸、N-甲基-麩醯胺酸、N-甲基-色胺酸、N-甲基-甘胺酸、N-甲基-纈胺酸、N-甲基- 脯胺酸、N-甲基-絲胺酸、N-甲基-酪胺酸、羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、硒代半胱胺酸、O-磷酸絲胺酸、高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶、瓜胺酸、鳥胺酸、半胱胺酸磺酸、半胱胺酸亞磺酸、3-胺基丙胺酸、3-二甲基胺基丙胺酸、2-胺基-4-(二甲基胺基)丁酸、2,4-二胺基丁酸、2-胺基-6-(二甲基胺基)己酸、2-胺基-5-(二甲基胺基)戊酸及β-丙胺酸，其各自獨立地為L或D異構體。
  51. 如申請專利範圍第50項之偶聯物，其中每個XX為獨立選擇之甘胺酸或丙胺酸之殘基。
  52. 如申請專利範圍第45項至第51項中任一項之偶聯物，其中P及P’各自為蛋白酶可裂解之肽。
  53. 如申請專利範圍第52項之偶聯物，其中P及P’各自為腫瘤組織中表現之蛋白酶可裂解之肽。
  54. 如申請專利範圍第52項之偶聯物，其中P及P’各自為溶酶體蛋白酶可裂解之肽。
  55. 如申請專利範圍第45項至第54項中任一項之偶聯物，其中P及P’各自選自由以下各物組成之群：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：17)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：18)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：19)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、 D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala及D-Ala-D-Ala、Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Val-Cit、Ala-Val-Ala及β-Ala-Gly-Gly-Gly。
  56. 如申請專利範圍第45項至第54項中任一項之偶聯物，其中P及P’各自為Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Val-Ala或β-Ala-Gly-Gly-Gly。
  57. 如申請專利範圍第1項至第56項中任一項之偶聯物，其中D為類美登素。
  58. 如申請專利範圍第1項至第25項及第45項至第56項中任一項之偶聯物，其中D為由以下結構式表示之類美登素： 其中：RM、RM’及RM”在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基；R1’、R2’、R3’及R4’在每次出現時獨立地為H、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之環烷基、視情況經取代之雜環基、、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；i為介於0與15之間之整數；且s5為共價連接至該基團JD’之位點。
  59. 如申請專利範圍第58項之偶聯物，其中D係由以下結構式表示：
  60. 如申請專利範圍第1項至第17項及第26項至第44項中任一項之偶聯物，其中D為由以下結構式表示之類美登素： 其中：RM、RM’及RM”在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基；且s5為共價連接至該基團JD’之位點。
  61. 如申請專利範圍第60項之偶聯物，其中D係由以下結構式表示：
  62. 如申請專利範圍第1項至第56項中任一項之偶聯物，其中D為苯并二氮呯化合物。
  63. 如申請專利範圍第1項至第17項及第45項至第56項中任一項之偶聯物，其中D係由以下結構式表示： 其中：在N與C之間之雙線表示單鍵或雙鍵，條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，並且當其為單鍵時，X係選自-H、鍵結至該反應性基團之連接基團或胺保護基(較佳X為-H)；Y係選自-H、-OR、-OCOR’、-SR、-NR’R”、-SO3M、-SO2M或-OSO3M，其中M為-H或陽離子，諸如Na+或K+； R為-H、視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基，或PEG基團-(CH2CH2O)n-Rc，其中n為1至24之整數，且Rc為具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；R’與R”相同或不同，且選自-H；-OH；-OR；-NRRg’；-COR；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基；視情況經取代的具有1至6個選自O、S、N及P之雜原子之3員至18員雜環；PEG基團-(CH2CH2O)n-Rc，其中n為1至24之整數，較佳n為2、4或8；且Rg’為-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；或PEG基團-(CH2CH2O)n-Rc；X’係選自由以下各物組成之群：-H；-OH；經取代或未經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；苯基；及胺保護基；Y’係選自由以下各物組成之群：-H；側氧基；經取代或未經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；A及A’係選自-O-及-S-；W’不存在，或選自-O-、-N(Re)-、-N(Re)-C(=O)-、-N(C(=O)Re)-、-S-或-CH2-S-、-CH2NRe-；Rx不存在，或選自具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基；Re為-H；具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；或-(CH2-CH2-O)n-Rk，其中Rk為-H；具有1至6個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基，視情況帶有二級胺基(例如-NHR101)或三級胺基 (-NR101R102)；或者5員或6員含氮雜環，諸如哌啶或嗎啉，其中R101及R102各自獨立地為具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；且G係選自-CH-或-N-；X’’與X'''相同或不同，且獨立地選自-(CH2)n’-、-NR’-、-CO-、-BH-、-SO-或-SO2-；Y’’與Y'''相同或不同，且獨立地選自-O、-(CH2)n’-、-NR’-或-S-；Z’’與Z'''相同或不同，且獨立地選自-(CH2)n’-、-CR7’R8’-、-NR9’-、-O-及-S-；n’係選自0、1、2及3；R7’與R8’相同或不同，並且各自獨立地選自-H、-OH、-SH、-COOH、-NHR’、聚乙二醇單元-(OCH2CH2)n-、胺基酸、帶有2至6個胺基酸之肽單元、視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基；R9’獨立地選自-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基；聚乙二醇單元-(OCH2CH2)n-；RA、RA’、RB及RB’相同或不同，並且各自獨立地選自由以下各物組成之群：-H、鹵基，或視情況經取代的具有1至10個碳原子之分支鏈、直鏈或環狀烷基；或RA與RA’及/或RB與RB’一起分別形成含有雙鍵之基團=B及=B’；=B與=B’相同或不同，且獨立地選自視情況經取代的分支鏈或直鏈烯基或羰基； QA為QA1-Ar-QA2；QA’為QA1’-Ar’-QA2’；QA1及QA1’各自獨立地為不存在、具有1至6個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基，或-CH=CH單元；Ar及Ar’各自獨立地不存在，或表示芳基；QA2及QA2’各自獨立地選自-H；與該反應性基團鍵結之連接基團；經取代或未經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-Rc’-(OCH2CH2)n-Rc；或選自鹵素、胍鎓[-NH(C=NH)NH2]、-OR、-NR’R’’、-NO2、-NCO、-NR’COR’’、-SR、由-SOR’表示之亞碸、由-SO2R’表示之碸、磺酸酯基-SO3M、硫酸酯基-OSO3M、由SO2NR’R’’表示之磺醯胺、氰基、疊氮基、-COR’、-OCOR’或-OCONR’R’’之取代基；且Rc’不存在，或選自具有1至5個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基。
  64. 如申請專利範圍第63項之偶聯物，其中D係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中RA”與RB”相同或不同，且選自-H及-Me。
  65. 如申請專利範圍第63項之偶聯物，其中：在N與C之間之雙線表示單鍵或雙鍵，條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H；Y為-OH或-SO3M；M為-H或醫藥學上可接受之陽離子(例如Na+)；X’及Y’均為-H；A及A’均為-O-；R6為-OMe；且Rx為具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基。
  66. 如申請專利範圍第65項之偶聯物，其中D係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中Y為-H或-SO3M，且M為H+或陽離子。
  67. 如申請專利範圍第63項至第66項中任一項之偶聯物，其中Y為-SO3M，且M為H+、Na+或K+。
  68. 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之偶聯物，其中-L-JD’-為鍵，且D係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：L’、L’’及L'''之一係由下式表示： 且其餘兩個相同或不同，且獨立地選自-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(OCH2CH2)n-Rc；鹵素；胍鎓[-NH(C=NH)NH2]；-OR；-NR’R’’；-NO2；-NR’COR’’；-SR；-SOR’；-SO2R’；-SO3H；-OSO3H；-SO2NR’R’’；氰基；疊氮基；-COR’；-OCOR’；及-OCONR’R’’；Zd1為不存在、-C(=O)-NR9-或-NR9-C(=O)-； P為胺基酸殘基或含有介於2至20個之間之胺基酸殘基的肽；Ra及Rb在每次出現時獨立地為-H、(C1-C3)烷基或帶電荷之取代基，或可離子化之基團Q；r及r’獨立地為1至6之整數；在N與C之間之雙線表示單鍵或雙鍵，條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，且當其為單鍵時，X為-H或胺保護基；Y為選自以下之離去基團：-OR、-OCOR’、-OCOOR’、-OCONR’R’’、-NR’R’’、-NR’COR’’、-NR’NR’R’’、視情況經取代之5員或6員含氮雜環(例如，經由氮原子附接之哌啶、四氫吡咯、吡唑、嗎啉等)、由-NR’(C=NH)NR’R’’表示之胍鎓、胺基酸或由-NRCOP’表示之肽、-SR、-SOR’、鹵素、氰基、疊氮基、-OSO3H、亞硫酸酯基(-SO3H或-SO2H)、偏亞硫酸酯(H2S2O5)、單-、二-、三-及四-硫代磷酸酯(PO3SH3、PO2S2H2、POS3H2、PS4H2)、硫代磷酸酯(RiO)2PS(ORi)、RiS-、RiSO、RiSO2、RiSO3、硫代硫酸酯(HS2O3)、連二亞硫酸酯(HS2O4)、二硫代磷酸酯(P(=S)(ORk’)(S)(OH))、羥肟酸(Rk’C(=O)NOH)及甲醛次硫酸根(HOCH2SO2 -)，或其混合物，其中Ri為具有1至10個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，且經至少一個選自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H及-PO3H之取代基取代；Ri可進一步視情況經本文關於烷基所描述之取代基取代；Rj為具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；Rk’為具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基，芳基、雜環基或雜芳基； P’為胺基酸殘基或含有介於2至20個之間之胺基酸殘基的肽；R在每次出現時獨立地選自由以下各物組成之群：-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(CH2CH2O)n-Rc；視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基；視情況經取代的含有一個或多個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的5員至18員雜芳基環；或視情況經取代的含有1至6個獨立地選自O、S、N及P之雜原子的3員至18員雜環；R’及R’’各自獨立地選自-H；-OH；-OR；-NHR；-NR2；-COR；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(CH2CH2O)n-Rc；及視情況經取代的具有1至6個獨立地選自O、S、N及P之雜原子的3員至18員雜環；Rc為-H，或視情況經取代的具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；n為1至24之整數；X’係選自-H；胺保護基；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(CH2CH2O)n-Rc；視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基；視情況經取代的含有一個或多個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的5員至18員雜芳基環；及視情況經取代的含有1至6個獨立地選自O、S、N及P之雜原子的3員至18員雜環；Y’係選自-H；側氧基；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；視情況經取代之6員至18員芳基；視情況經取代的含有一個或多個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的5員 至18員雜芳基環；視情況經取代的含有1至6個雜原子之3員至18員雜環；R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’及R4’各自獨立地選自由以下各物組成之群：-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(OCH2CH2)n-Rc；鹵素；胍鎓[-NH(C=NH)NH2]；-OR；-NR’R’’；-NO2；-NCO；-NR’COR’’；-SR；-SOR’；-SO2R’；-SO3 -H；-OSO3H；-SO2NR’R’’；氰基；疊氮基；-COR’；-OCOR’；及-OCONR’R’’；R6為-H、-R、-OR、-SR、-NR’R’’、-NO2或鹵素；A與A’相同或不同，且獨立地選自-O-、側氧基(-C(=O)-)、-CRR’O-、-CRR’-、-S-、-CRR’S-、-NR5及-CRR’N(R5)-；且R5及R9各自獨立地為-H或視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；且其餘變數係如以上在第二實施例或第1個具體實施例中所描述。
  69. 如申請專利範圍第68項之偶聯物，其中L’由式(A)表示，且L”及L”’均為-H。
  70. 如申請專利範圍第68項或第69項之偶聯物，其中：在N與C之間之雙線表示單鍵或雙鍵，條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，Y為-OH或-SO3M；R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’及R4’均為-H；R6為-OMe；X’及Y’均為-H； A及A’為-O-；且M為H+、Na+或K+。
  71. 如申請專利範圍第68項至第70項中任一項之偶聯物，其中Ra及Rb均為-H。
  72. 如申請專利範圍第68項至第71項中任一項之偶聯物，其中R5及R9各自獨立地為H或Me。
  73. 如申請專利範圍第72項之偶聯物，其中R5及R9均為H。
  74. 如申請專利範圍第68項至第73項中任一項之偶聯物，其中P為含有2至10個胺基酸殘基之肽。
  75. 如申請專利範圍第74項之偶聯物，其中P為含有2至5個胺基酸單元之肽。
  76. 如申請專利範圍第75項之偶聯物，其中P係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：17)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：18)及Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：19)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala及D-Ala-D-Ala。
  77. 如申請專利範圍第76項之偶聯物，其中P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala及D-Ala-D-Ala。
  78. 如申請專利範圍第68項之偶聯物，其中-L-JD’-D係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中Y為-H或-SO3M，且M為H+、Na+或K+。
  79. 如申請專利範圍第1項之偶聯物，其中該偶聯物係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中DM係由以下結構式表示： 且Y為H或-SO3M，且M為H+、Na+或K+。
  80. 如申請專利範圍第1項至第79項中任一項之偶聯物，其中w為2或4。
  81. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第1項至第79項中任一項之抗體-細胞毒性劑偶聯物，其中在至少約70%、80%、90%、95%或更高百分比之該等偶聯物中，w為2或4。
  82. 如申請專利範圍第81項之組成物，其中在不超過約10%或5%之該等偶聯物中，w為1。
  83. 一種重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分，其包含具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的異源信號肽。
  84. 如申請專利範圍第83項之重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分，其中該異源信號肽係與該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列之N末端融合。
  85. 如申請專利範圍第83項之重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分，其中該異源信號肽係與該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列之N末端的第2個胺基酸殘基融合。
  86. 一種重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分，其包含緊鄰該重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之信號肽之最後一個殘基之C末端的Ser或Thr殘基。
  87. 如申請專利範圍第86項之重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分，其中該Ser或Thr殘基係緊鄰該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列之第一個殘基的N末端。
  88. 如申請專利範圍第86項之重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分，其中該Ser或Thr殘基置換該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其 抗原結合部分之成熟加工序列之一個或多個N末端胺基酸殘基。
  89. 如申請專利範圍第86項之重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分，其具有SEQ ID NO：10或14之序列。
  90. 一種重組抗體，其包含源自於如申請專利範圍第86項至第89項中任一項之重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之重鏈、輕鏈或其抗原結合部分的成熟加工序列。
  91. 如申請專利範圍第90項之重組抗體，其為Fab、F(ab)2、F(ab’)、F(ab’)2、F(ab’)3、Fd、Fv、二硫鍵連接之Fv、dAb或sdAb(或奈米抗體)、CDR、scFv、(scFv)2、di-scFv、bi-scFv、tascFv(串聯scFv)、AVIBODY(例如雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體)、T細胞接合物(BiTE)、scFv-Fc、Fcab、mAb2、小模組免疫藥物(SMIP)、Genmab/單抗體或duobody、V-NAR結構域、IgNAR、微型抗體、IgG△CH2、DVD-Ig、probody、內抗體或多特異性抗體。
  92. 如申請專利範圍第91項之重組抗體，其為sdAb(單結構域抗體或奈米抗體)。
  93. 如申請專利範圍第90項之重組抗體，其包含分別源自於如申請專利範圍第86項至第89項中任一項之重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之重鏈、輕鏈或其抗原結合部分的1、2、3或4個成熟加工序列。
  94. 一種經修飾抗體，其係由在重鏈、輕鏈或其抗原結合部分之成熟加工序列上具有N末端Ser或Thr的抗體氧化得到，其中在該經修飾抗體中，該N末端Ser或Thr已氧化成醛基。
  95. 如申請專利範圍第94項之經修飾抗體，其中該抗體係源自於重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分，該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分包含：(1)具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的異源信號肽；(2)緊鄰該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列第一個殘基之N末端的Ser或Thr殘基；或(3)置換該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列之一個或多個N末端胺基酸殘基的Ser或Thr殘基。
  96. 如申請專利範圍第94項之經修飾抗體，其中該抗體為包含SEQ ID NO：3之輕鏈序列的鼠類抗體或其抗原結合部分。
  97. 如申請專利範圍第94項之經修飾抗體，其中該抗體為包含SEQ ID NO：3之輕鏈序列的鼠類抗體或其抗原結合部分之嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體，或其抗原結合部分。
  98. 如申請專利範圍第97項之經修飾抗體，其中該人類化抗體或其抗原結合部分係表面重塑或CDR移植之抗體，或其抗原結合部分。
  99. 一種編碼如申請專利範圍第86項至第89項中任一項之重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分的多聚核苷酸。
  100. 如申請專利範圍第99項之多聚核苷酸，其經密碼子優化以在哺乳動物表現系統中表現。
  101. 一種產生重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之方法，該方法包括在表現系統中表現如申請專利範圍第99項之多聚核苷酸。
  102. 如申請專利範圍第101項之方法，其中該表現系統為哺乳動物表現系 統。
  103. 一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物之方法，該方法包括以下步驟：(a)用氧化劑將細胞結合劑之2-羥基乙胺部分氧化以形成具有醛基之經氧化細胞結合劑；其中該2-羥基乙胺部分為絲胺酸、蘇胺酸、羥基離胺酸、4-羥基鳥胺酸或2,4-二胺基-5-羥基戊酸殘基之一部分，且由以下結構式表示： (b)使該經氧化細胞結合劑：(i)與具有醛反應性基團之細胞毒性劑-連接子化合物或具有醛反應性基團之細胞毒性劑接觸，由此形成該細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物；或(ii)與具有醛反應性基團之連接子化合物接觸，由此形成與連接子結合之經修飾抗體或其經修飾抗原結合部分，隨後使該經修飾抗體或其經修飾抗原結合部分與細胞毒性劑反應，以形成該細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物；或(iii)與細胞毒性劑接觸，隨後添加具有醛反應性基團及可與該細胞毒性劑形成共價鍵之反應性基團的連接子化合物，以形成該細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物。
  104. 如申請專利範圍第103項之方法，其中該細胞結合劑為抗體或其抗原結合部分，或抗體模擬物，諸如DARPin、Centyrin、親和體、人類泛素、affitin、抗運載蛋白、高親和性多聚體、Fynomer、Kunitz結構域肽、單 抗體(或adnectin)、三鏈抗體或nanofitin。
  105. 如申請專利範圍第103項之方法，其中該細胞結合劑為抗體或其抗原結合部分，諸如Fab、F(ab)2、F(ab’)、F(ab’)2、F(ab’)3、Fd、Fv、二硫鍵連接之Fv、dAb或sdAb(或奈米抗體)、CDR、scFv、(scFv)2、di-scFv、bi-scFv、tascFv(串聯scFv)、AVIBODY(例如雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體)、T細胞接合物(BiTE)、scFv-Fc、Fcab、mAb2、小模組免疫藥物(SMIP)、Genmab/單抗體或duobody、V-NAR結構域、IgNAR、微型抗體、IgG△CH2、DVD-Ig、probody、內抗體或多特異性抗體。
  106. 如申請專利範圍第103項之方法，其中該方法包括以下步驟：(a)用氧化劑氧化抗體或其抗原結合部分之2-羥基乙胺部分，以形成具有醛基之經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分， 其中該2-羥基乙胺部分係N末端絲胺酸、蘇胺酸、羥基離胺酸、4-羥基鳥胺酸或2,4-二胺基-5-羥基戊酸殘基之一部分；及(b)使該經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分與具有醛反應性基團之細胞毒性劑-連接子化合物或具有醛反應性基團之細胞毒性劑反應，以形成該抗體-細胞毒性劑偶聯物 其中： JCB係醛反應性基團；L係間隔子或鍵；JD’係將該細胞毒性劑D與該基團L連接之連接部分，或當L係鍵時不存在；D係經由該該連接部分JD’共價連接至L之細胞毒性劑；且w係1、2、3或4。
  107. 如申請專利範圍第103項之方法，其中該方法包括以下步驟：(a)用氧化劑氧化抗體或其抗原結合部分之N末端2-羥基乙胺部分，以形成具有N末端醛基之經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分， 其中該2-羥基乙胺部分係N末端絲胺酸、蘇胺酸、羥基離胺酸、4-羥基鳥胺酸或2,4-二胺基-5-羥基戊酸殘基之一部分；(b)使該經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分與具有醛反應性基團之連接子化合物反應以形成與連接子結合之經修飾抗體或其經修飾抗原結合部分，隨後使該經修飾抗體或其經修飾抗原結合部分與細胞毒性劑反應，以形成該抗體-細胞毒性劑偶聯物 其中：JCB係醛反應性基團；L係間隔子或鍵；D’係細胞毒性劑； JD為可與該細胞毒性劑D’形成共價鍵之反應性基團；JD’為藉由使該連接基團JD與該細胞毒性劑D’反應所形成的連接部分；D係經由該連接部分JD’共價連接至L之細胞毒性劑；且w係1、2、3或4。
  108. 如申請專利範圍第103項之方法，其中該方法包括以下步驟：(a)用氧化劑氧化抗體或其抗原結合部分之N末端2-羥基乙胺部分，以形成具有N末端醛基之經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分， 其中該2-羥基乙胺部分係N末端絲胺酸、蘇胺酸、羥基離胺酸、4-羥基鳥胺酸或2,4-二胺基-5-羥基戊酸殘基之一部分；及(b)使該經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分與細胞毒性劑反應，隨後添加具有醛反應性基團之連接子化合物，以形成該抗體-細胞毒性劑偶聯物 其中：JCB係醛反應性基團；L係間隔子或鍵；D’係細胞毒性劑；JD為可與該細胞毒性劑D’形成共價鍵之反應性基團；JD’為藉由使該連接基團JD與該細胞毒性劑D’反應所形成的連接部 分；D係經由該連接部分JD’共價連接至L之細胞毒性劑；且w係1、2、3或4。
  109. 如申請專利範圍第105項至第108項中任一項之方法，其中該2-羥基乙胺部分為N末端絲胺酸或蘇胺酸之一部分。
  110. 如申請專利範圍第109項之方法，其中該N末端絲胺酸天然存在於該抗體或其抗原結合部分中。
  111. 如申請專利範圍第109項之方法，其中該N末端絲胺酸係工程改造至該抗體或其抗原結合部分中。
  112. 如申請專利範圍第111項之方法，其中該抗體或其抗原結合部分係如申請專利範圍第90項至第93項中任一項之重組抗體中的任一種。
  113. 如申請專利範圍第103項至第108項中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合部分係藉由表現編碼重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之多聚核苷酸獲得，該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分包含：(1)具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列的異源信號肽；(2)緊鄰該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列第一個殘基之N末端的Ser或Thr殘基；或(3)置換該重組抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之成熟加工序列之一個或多個N末端胺基酸殘基的Ser或Thr殘基。
  114. 如申請專利範圍第103項至第108項中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO：3之輕鏈序列。
  115. 如申請專利範圍第103項至第108項中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合部分係包含SEQ ID NO：3之輕鏈序列的鼠類抗體或其抗原結合部分之嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體，或其抗原結合部分。
  116. 如申請專利範圍第115項之方法，其中該人類化抗體或其抗原結合部分係表面重塑或CDR移植之抗體，或其抗原結合部分。
  117. 如申請專利範圍第103項至第116項中任一項之方法，其中該步驟(b)之反應係在苯胺催化劑存在下進行。
  118. 如申請專利範圍第117項之方法，其中該苯胺催化劑為4-胺基苯乙醇。
  119. 如申請專利範圍第103項至第118項中任一項之方法，其中該醛反應性基團與該經氧化抗體或其經氧化抗原結合部分之莫耳比為約4：1。
  120. 如申請專利範圍第103項至第119項中任一項之方法，其中步驟(a)中之該氧化劑為過碘酸鹽。
  121. 如申請專利範圍第103項至第120項中任一項之方法，其中步驟(b)係在pH5-6或pH5下進行。
  122. 如申請專利範圍第103項至第121項中任一項之方法，其中該細胞結合劑-細胞毒性劑偶聯物為如申請專利範圍第1項至第80項中任一項之偶聯物。
  123. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項至第80項中任一項之偶聯物及醫藥學上可接受之載劑。
  124. 一種在哺乳動物中抑制異常細胞生長或治療增生性病症、自體免疫病症、破壞性骨病、感染性疾病、病毒疾病、纖維化疾病、神經退化性疾病、胰腺炎或腎病之方法，該方法包括向該哺乳動物施用治療有效 量的如申請專利範圍第1項至第80項中任一項之偶聯物及視情況使用之化學治療劑。
  125. 如申請專利範圍第124項之方法，其中該方法係用於治療選自由以下組成之群之病狀：癌症、類風濕性關節炎、多發性硬化、移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植排斥反應、狼瘡、肌炎、感染及免疫缺陷。
  126. 如申請專利範圍第125項之方法，其中該方法係用於治療癌症。
  127. 如申請專利範圍第126項之方法，其中該癌症為白血病、淋巴瘤、黑素瘤、肺癌(諸如NSCLC)、前列腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、胰腺癌、乳癌、腹膜癌、頭頸部鱗狀細胞癌、骨髓增生異常症候群(MDS)及子宮頸癌。
  128. 如申請專利範圍第126項之方法，其中該癌症為急性骨髓性白血病(AML)。
  129. 如申請專利範圍第126項之方法，其中該癌症為非小細胞肺癌。
  130. 一種由以下結構式表示之細胞毒性化合物， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：LD’、LD’’及LD'''之一係由下式表示：-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)r-Zd1-(CRaRb)r-JCB (A’)且其餘兩個相同或不同，且獨立地選自-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(OCH2CH2)n-Rc；鹵素；胍鎓[-NH(C=NH)NH2]；-OR；-NR’R’’；-NO2；-NR’COR’’；-SR；-SOR’；-SO2R’；-SO3H；-OSO3H；-SO2NR’R’’；氰基；疊氮基；-COR’；-OCOR’；及-OCONR’R’’；Zd1為不存在、-C(=O)-NR9-或-NR9-C(=O)-； P為胺基酸殘基或含有介於2至20個之間之胺基酸殘基的肽；Ra及Rb在每次出現時獨立地為-H、(C1-C3)烷基或帶電荷之取代基，或可離子化之基團Q；r及r’獨立地為1至6之整數；在N與C之間之雙線表示單鍵或雙鍵，條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，且當其為單鍵時，X為-H或胺保護基；Y為選自以下之離去基團：-OR、-OCOR’、-OCOOR’、-OCONR’R’’、-NR’R’’、-NR’COR’’、-NR’NR’R’’、視情況經取代之5員或6員含氮雜環(例如，經由氮原子附接之哌啶、四氫吡咯、吡唑、嗎啉等)、由-NR’(C=NH)NR’R’’表示之胍鎓、胺基酸或由-NRCOP’表示之肽、-SR、-SOR’、鹵素、氰基、疊氮基、-OSO3H、亞硫酸酯基(-SO3H或-SO2H)、偏亞硫酸酯(H2S2O5)、單-、二-、三-及四-硫代磷酸酯(PO3SH3、PO2S2H2、POS3H2、PS4H2)、硫代磷酸酯(RiO)2PS(ORi)、RiS-、RiSO、RiSO2、RiSO3、硫代硫酸酯(HS2O3)、連二亞硫酸酯(HS2O4)、二硫代磷酸酯(P(=S)(ORk’)(S)(OH))、羥肟酸(Rk’C(=O)NOH)及甲醛次硫酸根(HOCH2SO2 -)，或其混合物，其中Ri為具有1至10個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，且經至少一個選自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H及-PO3H之取代基取代；Ri可進一步視情況經本文關於烷基所描述之取代基取代；Rj為具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；Rk’為具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、芳基、雜環基或雜芳基； P’為胺基酸殘基或含有介於2至20個之間之胺基酸殘基的肽；R在每次出現時獨立地選自由以下各物組成之群：-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(CH2CH2O)n-Rc；視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基；視情況經取代的含有一個或多個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的5員至18員雜芳基環；或視情況經取代的含有1至6個獨立地選自O、S、N及P之雜原子的3員至18員雜環；R’及R’’各自獨立地選自-H；-OH；-OR；-NHR；-NR2；-COR；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(CH2CH2O)n-Rc；及視情況經取代的具有1至6個獨立地選自O、S、N及P之雜原子的3員至18員雜環；Rc為-H，或視情況經取代的具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；n為1至24之整數；X’係選自-H；胺保護基；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(CH2CH2O)n-Rc；視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基；視情況經取代的含有一個或多個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的5員至18員雜芳基環；及視情況經取代的含有1至6個獨立地選自O、S、N及P之雜原子的3員至18員雜環；Y’係選自-H；側氧基；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；視情況經取代之6員至18員芳基；視情況經取代的含有一個或多個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子的5員 至18員雜芳基環；視情況經取代的含有1至6個雜原子之3員至18員雜環；R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’及R4’各自獨立地選自由以下各物組成之群：-H；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；聚乙二醇單元-(OCH2CH2)n-Rc；鹵素；胍鎓[-NH(C=NH)NH2]；-OR；-NR’R’’；-NO2；-NCO；-NR’COR’’；-SR；-SOR’；-SO2R’；-SO3 -H；-OSO3H；-SO2NR’R’’；氰基；疊氮基；-COR’；-OCOR’；及-OCONR’R’’；R6為-H、-R、-OR、-SR、-NR’R’’、-NO2或鹵素；A與A’相同或不同，且獨立地選自-O-、側氧基(-C(=O)-)、-CRR’O-、-CRR’-、-S-、-CRR’S-、-NR5及-CRR’N(R5)-；R5及R9各自獨立地為-H，或視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；JCB係醛反應性基團。
  131. 如申請專利範圍第130項之化合物，其中JCB為肼、醯肼或羥基胺。
  132. 如申請專利範圍第130項之化合物，其中JCB係選自： 其中Xa為CH2、O或NCH3；U’為NH、O、S或CH2；U為H或供電子基團；Xb及Xb’各自獨立地為-OH、-SH或-NH2；RZ及RZ’各自獨立地為H或烷基(較佳為-Me)；RZ’’為H或烷基；及Xc為N或CH。
  133. 如申請專利範圍第132項之化合物，其中JCB為、
  134. 如申請專利範圍第130項至第133項中任一項之化合物，LD’、LD”及LD’”之一係由式(A)表示，且其餘各自獨立地為-H、具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基、鹵素、-OH、(C1-C6)烷氧基或-NO2。
  135. 如申請專利範圍第134項之化合物，其中LD’、LD”及LD’”之一係由式(A)表示，且其餘為-H。
  136. 如申請專利範圍第135項之化合物，其中LD’係由式(A)表示，且其餘為-H。
  137. 如申請專利範圍第130項至第136項中任一項之化合物，其中在N與C之間之雙線表示單鍵，X為-H或胺保護基；且Y係選自-H、-OR、-OCOR’、-SR、-NR’R”、視情況經取代之5員或6員含氮雜環、-SO3H、-SO2H及-OSO3H。
  138. 如申請專利範圍第137項之化合物，其中Y係選自-H、-SO3M、-OH、-OMe、-OEt或-NHOH，其中M為-H、Na+或K+。
  139. 如申請專利範圍第138項之化合物，其中Y為-H、-SO3M或-OH。
  140. 如申請專利範圍第130項至第139項中任一項之化合物，其中X’係選自由以下各物組成之群：-H；-OH；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基；及苯基。
  141. 如申請專利範圍第140項之化合物，其中X’為-H、-OH、(C1-C3)烷基、鹵基(C1-C3)烷基或苯基。
  142. 如申請專利範圍第141項之化合物，其中X’為-H、-OH或-Me。
  143. 如申請專利範圍第142項之化合物，其中X’為-H。
  144. 如申請專利範圍第130項至第143項中任一項之化合物，其中Y’係選自由以下各物組成之群：-H；側氧基；視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基。
  145. 如申請專利範圍第144項之化合物，其中Y’為-H、側氧基、(C1-C3)烷基或鹵基(C1-C3)烷基。
  146. 如申請專利範圍第144項之化合物，其中Y’為-H或側氧基。
  147. 如申請專利範圍第144項之化合物，其中Y’為-H。
  148. 如申請專利範圍第130項至第147項中任一項之化合物，其中A與A’相同或不同，且選自-O-、-S-、-NR5-及側氧基-(C=O)-。
  149. 如申請專利範圍第148項之化合物，其中A與A’相同或不同，且選自-O-及-S-。
  150. 如申請專利範圍第149項之化合物，其中A及A’為-O-。
  151. 如申請專利範圍第130項至第150項中任一項之化合物，其中R6為-OMe。
  152. 如申請專利範圍第130項至第151項中任一項之化合物，其中R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’及R4’獨立地為-H、鹵素、-NO2、-OH、(C1-C3)烷基、鹵基(C1-C3)烷基或(C1-C3)烷氧基。
  153. 如申請專利範圍第152項之化合物，其中R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’及R4’均為-H。
  154. 如申請專利範圍第130項至第153項中任一項之化合物，其中R、R’、R”及R5各自獨立地為-H或(C1-C3)烷基。
  155. 如申請專利範圍第130項至第136項中任一項之化合物，其中：在N與C之間之雙線表示單鍵或雙鍵，條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，Y為-OH或-SO3M；R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’及R4’均為-H；R6為-OMe；X’及Y’均為-H；A及A’為-O-；且M為H、Na+或K+。
  156. 如申請專利範圍第130項至第155項中任一項之化合物，其中Ra及Rb均為H。
  157. 如申請專利範圍第130項至第156項中任一項之化合物，其中R5及R9各自獨立地為H或Me。
  158. 如申請專利範圍第157項之化合物，其中R5及R9均為H。
  159. 如申請專利範圍第130項至第158項中任一項之化合物，其中P為含有2至10個胺基酸殘基之肽。
  160. 如申請專利範圍第159項之化合物，其中P為含有2至5個胺基酸殘基之肽。
  161. 如申請專利範圍第160項之化合物，其中P係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：17)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：18)及Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：19)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala及D-Ala-D-Ala。
  162. 如申請專利範圍第160項之化合物，其中P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala及D-Ala-D-Ala。
  163. 如申請專利範圍第130項之化合物，其中該化合物係由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中Y為-H或-SO3M，且M為H+、Na+或K+。
  164. 如申請專利範圍第126項之方法，其中該癌症為卵巢癌。
  165. 如申請專利範圍第1項至第6項及第13項至第80項中任一項之偶聯物，其中該細胞結合劑(CBA)係特異性結合至FOLR1、CD37、EGFR、CD19、CD33、CD123或Muc1抗原之抗體或其抗原結合部分，其中Ser或Thr置換該抗體重鏈(HC)、輕鏈(LC)或其抗原結合部分之一個或多個N末端胺基酸殘基。
  166. 如申請專利範圍第1項至第6項及第13項至第80項中任一項之偶聯物，其中該抗體包含選自由以下組成之群之抗體的6個CDR或重鏈可變區(HCVR)或輕鏈可變區(LCVR)序列：huMOV19、huCD37-3、huCD37-50、huEGFR-7R、huML66、huB4、huMy9-6及huDS6。
  167. 如申請專利範圍第165項之偶聯物，其中特異性結合至FOLR1之抗葉酸受體抗體包含：a)SEQ ID NO：45之重鏈CDR1、SEQ ID NO：46之重鏈CDR2及SEQ ID NO：47之重鏈CDR3；及b)SEQ ID NO：48之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：49之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：50之輕鏈CDR3。
  168. 如申請專利範圍第165項之偶聯物，其中該特異性結合至FOLR1之抗葉酸受體抗體包含：a)具有與SEQ ID NO：55至少約90%、95%、99%或100%同一之胺基酸序列之重鏈可變區(HCVR)；及b)具有與SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：57至少約90%、95%、99%或100%同一之胺基酸序列之輕鏈可變區(LCVR)。
  169. 如申請專利範圍第167項或第168項之偶聯物，其中該特異性結合至FOLR1之抗葉酸受體抗體為huMOV19抗體。
TW104128984A 2014-09-03 2015-09-02 包含細胞結合劑及細胞毒性劑之偶聯物 TW201609152A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462045264P 2014-09-03 2014-09-03
US201462086986P 2014-12-03 2014-12-03
US201562149379P 2015-04-17 2015-04-17
US201562186235P 2015-06-29 2015-06-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201609152A true TW201609152A (zh) 2016-03-16

Family

ID=54147280

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104128984A TW201609152A (zh) 2014-09-03 2015-09-02 包含細胞結合劑及細胞毒性劑之偶聯物

Country Status (13)

Country Link
US (2) US10988531B2 (zh)
EP (1) EP3188733B1 (zh)
JP (1) JP2017529837A (zh)
KR (3) KR102508023B1 (zh)
CN (1) CN107580604A (zh)
AU (1) AU2015312075A1 (zh)
CA (1) CA2957964A1 (zh)
IL (1) IL250711A0 (zh)
MA (1) MA40415A (zh)
RU (1) RU2017110068A (zh)
SG (2) SG10201901825YA (zh)
TW (1) TW201609152A (zh)
WO (1) WO2016036794A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110366431A (zh) * 2017-02-28 2019-10-22 伊缪诺金公司 具有自分解肽接头的类美登素衍生物和其缀合物
TWI750194B (zh) * 2016-07-05 2021-12-21 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 Ｅｇｆｒ抗體-藥物偶聯物及其在醫藥上的應用

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3188761A4 (en) * 2014-09-02 2018-04-18 ImmunoGen, Inc. Methods for formulating antibody drug conjugate compositions
US9669102B2 (en) * 2014-09-03 2017-06-06 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
RU2017110068A (ru) 2014-09-03 2018-10-03 Иммуноджен, Инк. Конъюгаты, содержащие клеточносвязывающие агенты и цитотоксические агенты
AU2016215049B2 (en) 2015-02-06 2021-12-02 Cell Idx, Inc. Antigen-coupled immunoreagents
JP7203497B2 (ja) 2015-06-29 2023-01-13 イミュノジェン・インコーポレーテッド 抗ｃｄ１２３抗体、ならびにその複合体及び誘導体
WO2017015495A1 (en) * 2015-07-21 2017-01-26 Immunogen, Inc. Methods of preparing cytotoxic benzodiazepine derivatives
BR112018015917A2 (pt) * 2016-02-05 2018-12-26 Immunogen Inc conjugados de anticorpos-fármaco direcionados a gcc
EP3487538A1 (en) * 2016-07-22 2019-05-29 Nektar Therapeutics Conjugates of a factor viii moiety having an oxime-containing linkage
RU2019114863A (ru) * 2016-11-02 2020-12-03 Иммуноджен, Инк. Комбинированное лечение конъюгатами антитело-лекарственное средство и ингибиторами parp
PL3558391T3 (pl) * 2016-12-23 2022-05-16 Immunogen, Inc. Immunokoniugaty skierowane wobec białka adam9 i sposoby ich stosowania
WO2018183494A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Immunogen, Inc. Cd19-targeting antibody-drug conjugates
AU2018305726B2 (en) * 2017-07-26 2022-09-15 The University Of Queensland Disulfide bond containing compounds and uses thereof
CN111164208B (zh) 2017-09-29 2023-08-04 第一三共株式会社 抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物
KR20200088440A (ko) * 2017-11-21 2020-07-22 노파르티스 아게 종양-연관 항원에 대한 삼중특이성 결합 분자 및 이의 용도
WO2019140141A1 (en) * 2018-01-12 2019-07-18 Immunogen, Inc. Methods for antibody drug conjugation, purification, and formulation
WO2019177854A1 (en) 2018-03-13 2019-09-19 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-folate receptor 1 antibodies and uses thereof
CA3105415A1 (en) * 2018-07-09 2020-01-23 Multitude Inc. Antibodies specific to folate receptor alpha
WO2020092631A1 (en) * 2018-10-31 2020-05-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for detecting and treating cancers characterized by expression of mesothelin
US20210032285A1 (en) * 2019-03-11 2021-02-04 Cell Idx, Inc. Methods, compositions, and kits for trapping modified biomolecules
KR20220012839A (ko) 2019-03-19 2022-02-04 펀다시오 프리바다 인스티튜트 드인베스티가시오 온콜로지카 데 발 헤브론 Omomyc와 pd-1 또는 ctla-4에 결합하는 항체를 이용한 암 치료용 조합 요법
CN113631194A (zh) * 2019-03-21 2021-11-09 伊缪诺金公司 制备细胞结合剂-药物缀合物的方法
CN110922482B (zh) * 2019-12-25 2021-08-31 源道隆（苏州）医学科技有限公司 可结合cd19的多肽及其应用
CN112794911B (zh) * 2021-04-14 2021-08-03 上海偌妥生物科技有限公司 人源化抗叶酸受体1抗体及其应用
CN113908589B (zh) * 2021-10-08 2022-09-27 天津工业大学 一种表面印迹抗体的疏水电荷诱导模式膜层析介质及其制备方法

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5362852A (en) * 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
FR2801904B1 (fr) 1999-12-07 2002-02-08 Pasteur Institut Produits comprenant un support sur lequel sont fixes des acides nucleiques et leur utilisation comme puce a adn
US7531622B2 (en) 2002-09-19 2009-05-12 Centre National De La Recherche Scientifique- Cnrs Synthesis and characterization of novel systems for guidance and vectorization of molecules of therapeutic interest towards target cells
EA008866B1 (ru) 2002-12-26 2007-08-31 Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк. ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
GB0305704D0 (en) 2003-03-13 2003-04-16 Amersham Plc Radiofluorination methods
CN114053429A (zh) 2004-06-01 2022-02-18 健泰科生物技术公司 抗体-药物偶联物和方法
JP2008516621A (ja) 2004-10-18 2008-05-22 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 成長ホルモン結合体
EP1861417B1 (en) 2005-03-10 2013-05-15 BioNTech AG Dimeric or multimeric microproteins
WO2006115416A2 (en) 2005-04-25 2006-11-02 Ge Healthcare As Liposomes
JP4938263B2 (ja) * 2005-08-19 2012-05-23 独立行政法人農業生物資源研究所 一本鎖抗体によるサイトゾルタンパク質の機能阻害法およびその利用
JP2009512443A (ja) 2005-10-20 2009-03-26 ザ スクリップス リサーチ インスチチュート 免疫染色及び免疫標的化のためのＦｃ標識化
FR2897616B1 (fr) 2006-02-20 2008-05-30 Univ Grenoble 1 Presentation de motifs de reconnaissance par une matrice multivalente greffee sur un support solide
US7985783B2 (en) * 2006-09-21 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification
PE20090943A1 (es) 2007-07-16 2009-08-05 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd79b e inmunoconjugados
RU2476441C2 (ru) 2007-10-19 2013-02-27 Сиэтл Дженетикс, Инк. Cd19-связывающие средства и их применение
US20090181037A1 (en) 2007-11-02 2009-07-16 George Heavner Semi-Synthetic GLP-1 Peptide-FC Fusion Constructs, Methods and Uses
SG189817A1 (en) 2008-04-30 2013-05-31 Immunogen Inc Potent conjugates and hydrophilic linkers
DK2538976T3 (en) * 2010-02-24 2017-02-27 Immunogen Inc IMMUNCONJUGATES AGAINST FOLATRECEPTOR-1 AND APPLICATIONS THEREOF
US9381058B2 (en) * 2010-11-05 2016-07-05 Ethicon Endo-Surgery, Llc Recharge system for medical devices
KR20190089048A (ko) * 2011-02-15 2019-07-29 이뮤노젠 아이엔씨 컨쥬게이트의 제조방법
EP2844300B1 (en) 2012-05-01 2018-10-17 Genentech, Inc. Anti-pmel17 antibodies and immunoconjugates
BR112014029274B1 (pt) * 2012-05-24 2022-02-15 Mountgate Innotech (Hk) Limited Anticorpo isolado, composição farmacêutica, uso do anticorpo, e, kit para tratar infecção rábica
JP6310909B2 (ja) 2012-06-06 2018-04-11 ビオノール イミュノ エーエスＢｉｏｎｏｒ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓ 免疫原及び投薬反応物として使用するためのウイルスタンパク質に由来するペプチド
US9834597B2 (en) 2012-09-21 2017-12-05 The Regents Of The University Of California Modified FC polypeptides, FC conjugates, and methods of use thereof
EP2980871B1 (en) * 2013-03-28 2018-02-14 Toshiba Hokuto Electronics Corporation Light-emitting device and production method therefor
CA2911414C (en) 2013-05-13 2018-09-11 Vision Global Holdings Ltd. Pharmaceutical composition comprising modified hemoglobin-based therapeutic agent for cancer targeting treatment and diagnostic imaging
AU2014312086B2 (en) * 2013-08-30 2020-03-12 Immunogen, Inc. Antibodies and assays for detection of folate receptor 1
ES2729643T3 (es) 2013-11-26 2019-11-05 Novartis Ag Métodos para la conjugación de oxima con polipéptidos modificados con cetona
RU2017110068A (ru) 2014-09-03 2018-10-03 Иммуноджен, Инк. Конъюгаты, содержащие клеточносвязывающие агенты и цитотоксические агенты

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI750194B (zh) * 2016-07-05 2021-12-21 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 Ｅｇｆｒ抗體-藥物偶聯物及其在醫藥上的應用
CN110366431A (zh) * 2017-02-28 2019-10-22 伊缪诺金公司 具有自分解肽接头的类美登素衍生物和其缀合物
CN110366431B (zh) * 2017-02-28 2023-07-18 伊缪诺金公司 具有自分解肽接头的类美登素衍生物和其缀合物

Also Published As

Publication number Publication date
MA40415A (fr) 2016-03-10
KR102638901B1 (ko) 2024-02-22
KR102508023B1 (ko) 2023-03-10
US10988531B2 (en) 2021-04-27
CA2957964A1 (en) 2016-03-10
KR20170054430A (ko) 2017-05-17
SG11201701565PA (en) 2017-03-30
EP3188733B1 (en) 2019-11-06
IL250711A0 (en) 2017-08-31
SG10201901825YA (en) 2019-03-28
US11732038B2 (en) 2023-08-22
EP3188733A1 (en) 2017-07-12
RU2017110068A3 (zh) 2019-08-26
RU2017110068A (ru) 2018-10-03
JP2017529837A (ja) 2017-10-12
US20160095938A1 (en) 2016-04-07
KR20230039755A (ko) 2023-03-21
AU2015312075A1 (en) 2017-03-09
KR20240027148A (ko) 2024-02-29
CN107580604A (zh) 2018-01-12
WO2016036794A1 (en) 2016-03-10
US20210299271A1 (en) 2021-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11732038B2 (en) Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
JP7132311B2 (ja) 細胞障害性ベンゾジアゼピン誘導体
JP6843080B2 (ja) システイン改変抗体の複合体
TW202106691A (zh) 喜樹鹼衍生物
JP2018516539A (ja) 抗ｃ−Ｍｅｔ抗体および抗ｃ−Ｍｅｔ抗体−細胞毒性薬物複合体ならびにそれらの医薬用途
JP2017527562A (ja) 細胞毒性ベンゾジアゼピン誘導体
RU2765098C2 (ru) Производные майтанзиноида с саморасщепляющимися пептидными линкерами и их конъюгаты
TWI827575B (zh) 苯二氮平衍生物
TW201822819A (zh) 苯二氮平衍生物之選擇性磺化
JP2019534267A (ja) 抗ｃ ｍｅｔ抗体‐細胞傷害性薬物複合体の医学的使用
TW201839001A (zh) 細胞毒性苯并二氮平衍生物及其綴合物
TW202413360A (zh) 苯二氮平衍生物
WO2024082051A1 (en) Antibody-drug conjugates targeting glypican-3 and methods of use
CN116829551A (zh) 免疫调节抗体药物结合物