KR20220012839A - Omomyc와 pd-1 또는 ctla-4에 결합하는 항체를 이용한 암 치료용 조합 요법 - Google Patents

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로라 수세크
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실비아 카사쿠베르타-세라
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펀다시오 프리바다 인스티튜트 드인베스티가시오 온콜로지카 데 발 헤브론
펀다시오 프리바다 인스티튜시오 카탈라나 드 르세르카 아이 에스투디스 아반카츠
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Abstract

본 발명은 면역항암제와, Omomyc, 이의 기능적으로 동등한 변이체, Omomyc 또는 기능적으로 동등한 변이체를 포함하는 접합체, 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 폴리펩타이드 또는 접합체를 분비할 수 있는 세포의 조합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 조합물을 함유한 약학적 조성물 및 이의 의학적 용도, 특히 암 치료에서의 용도에 관한 것이다.

Description

OMOMYC와 PD-1 또는 CTLA-4에 결합하는 항체를 이용한 암 치료용 조합 요법
본 발명은 암 분야에 관한 것이며, 보다 상세하게는 폴리펩타이드 및 면역항암제를 포함하는 조합물 및 이의 의약제 용도, 특히 암 예방 및/또는 치료 용도에 관한 것이다.
이상적인 암 치료제는, 종양을 유지하기 위해서는 지속적으로 필요하지만 임의의 정상 조직을 유지하고 기능하는 데에는 불필요한, 비-중복 기능을 타겟으로 하여야 한다. 그래서, 가장 일반적인 논리는 암에서 특이적으로 돌연변이된 유전자 산물을 타겟으로 하는 것으로, 이는 이들 돌연변이 분자가 암의 그럴듯한 "유발인자"이고, 아마도 정상 조직에는 거의 중요하지 않을 것이라는 점에 근거한다. 이러한 이유로, 특정 암 타입들에서 재발성 병변 리스트 작성에 많은 관심이 집중되었다. 불행하게도, 이러한 접근 방식에는 몇가지 문제점이 존재한다. 첫째, 대부분의 고형 인간 암은 게놈 불안정성의 에피소드를 거쳐, "유발인자" 돌연변이 및 그에 수반되는 작동자 경로를 불명료하게 만들 수 있는 돌연변이 노이즈 (mutational noise)를 보인다. 두 번째로, 암은 다수의 진화적 보틀넥 (evolutionary bottleneck)을 통한 이행을 수반하는 프로세스의 최종 결과물이다. 각각의 보틀넥은, 향후 어떤 시점에서 종양 유지에 불필요하여 결과적으로 종양의 진화에서 그 시점 이후에는 양호한 치료학적 타겟이 되지 못하는 기능을 가진, 특정 타입의 돌연변이를 요구할 수 있다.
Myc는 증식 조절 및 암에 관여하는 염기성의 나선-루프-나선 루신 지퍼 (b-HLH-LZ) 단백질이며, 이는 구조적으로 연관된 단백질들 Max, Mad 및 Mnt와 네트워크 형태로 작동한다. Myc/Max 다이머는 유전자 전사를 활성화하고, 세포 증식 또는 세포 자살을 유도한다. Mad/Max 및 Mnt/Max 복합체는 억제인자로서 작용하며, 세포 증식 정지 및 분화를 유발한다. 이들 다이머 모두 동일한 DNA 컨센서스 부위, 즉 CACGTG E-박스를 인지한다.
Myc는 정상 세포에서 엄격하게 조절되어, 그 수준이 증식 중인 세포에서는 높고, 비-증식 세포에서는 낮다. 비정상적으로 높거나 및/또는 통제되지 않은 Myc 활성은 대부분의 암에 원인으로 연루되어 있으며, 종종 공격적이고 덜 분화된 혈관신생 종양과 연관되어 있다. Myc 발현의 조절 이상은 유전자 증폭을 통한 과발현, 전사 조절 저하, 분해 손상 또는 안정화 증가가 원인이다. 이로써, 비정상적인 증식, 생존성 증가, 대사 변화, 혈관신생 및 염증이 발생하는데, 이것 모두 암의 주요 홀마크이다. 다수의 실험들에서 Myc가 종양 발생과 관련한 세포내 및 세포외 측면들을 지배하는데 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었으며, 이는 그 기능을 타겟으로 하는 것이 치료학적으로 유용할 것임을 시사해준다.
BET 브로모도메인 저해제에 의한 Myc의 하향 조절이 여러가지 종양 타입들을 퇴화시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 접근 방식은 잠재성이 양호하지만, 독성 및 다수의 오프 타겟 효과와 같은 일부 한계가 있다. Myc/Max 상호작용을 방해하는 다수의 소분자들은 세포에서 낮은 특이성을 보인다.
그러나, 아직까지 Myc 저해제는 임상적으로 이용가능해지지 않았으며, 이를 설계하는데 다양한 위험이 따른다: 첫째, Myc는 핵 전사 인자이므로, 결과적으로 막 또는 세포질 분자보다 도달하기가 어렵고; 둘째, Myc는 타겟이 될 수 있는 효소적 "활성 부위"가 없고; 셋째, Myc 패밀리는 3종의 단백질, 즉 c-Myc, N-Myc 및 L-Myc로 구성되는데, 이들 단백질이 어떤 상황에서는 기능적으로 과잉이어서 이들 모두를 동시 저해하여야 한다. 또한, Myc 저해가 정상 조직의 증식을 저해함으로써 심각한 부작용을 유도할 것이라는 우려도 존재한다. 이러한 모든 이유들로 인해, Myc 저해 약물을 구현하기가 매우 어렵다.
Omomyc는 Myc의 b-HLH-LZ 도메인을 포함하는 우성-네거티브 MYC 돌연변이로, Myc의 루신 지퍼에 4개의 아미노산 치환을 가지고 있다 (Soucek, L. et al., 1998, Oncogene 17, 2463-2472; Soucek, L. et al. (2002), Cancer Res 62: 3507-3510). 아미노산 치환 E61T, E68I, R74Q 및 R75N은 단백질에 변형된 다이머화 특이성 (altered dimerization specificity)을 부여하여, 천연 파트너인 Max에 대한 결합력과, 스스로 호모다이머 뿐만 아니라 야생형 c-Myc, N-Myc 및 L-Myc와 헤테로다이머를 형성하는 능력을 가지고 있다.
이러한 특성들로 인해, Omomyc는, Myc가 이의 DNA 인지 결합부위인 E 박스에 결합하는 Myc의 결합력을 무력화함으로써, 시험관내 및 생체내에서 Myc-의존적인 유전자 전사활성화 기능 (transactivation function)을 방지할 수 있다. 동시에, Omomyc는 Myc 발현 수준에 의존적인 방식으로 Myc-유도성 세포자살을 상당히 강화하여, Myc 전사억제 (transrepression) 활성을 강화한다. 따라서, Omomyc는, 프로모터에 대한 Miz-1-의존적인 결합 및 전사억제는 유지하면서, 프로모터 E-박스에의 Myc의 결합 및 타겟 유전자의 전사활성화는 방지한다. Omomyc 존재시, Myc 인터액톰 (Myc interactome)은 억제로 전환되고, 그 활성이 전암성에서 종양-억제성으로 전환된다.
EP2801370 A1에서, Omomyc 펩타이드 자체가 세포 막을 통해 효율적으로 형질도입되어 핵으로 전위될 수 있으며, 종양 억제 효과를 발휘하는 것으로, 입증되어 있다.
그러나, 본 기술 분야에서는 새로운 개선된 치료학적 암 치료 방법에 대한 개발이 여전히 요구되고 있다.
제1 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 조합물에 관한 것이다:
i) a) - e)로 이루어진 군으로부터 선택되는 제1 구성성분:
a) 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체,
b) 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체와, 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모어어티를 포함하는 접합체,
c) a)의 폴리펩타이드 또는 b)의 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
d) c)에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및
e) a)에 따른 폴리펩타이드 또는 b)에 따른 접합체를 배지로 분비할 수 있는 세포; 및
ii) 면역항암제인 제2 구성성분.
제2 측면에서, 본 발명은 약제학적 유효량의 본 발명에 따른 조합물 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 의약제에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조합물 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물에 관한 것이다.
제4 측면에서, 본 발명은 암 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 조합물 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물에 관한 것이다.
도 1. Omomyc 비강내 투여는 종양 부위로 T 세포를 동원한다. KRasG12D-유발된 NSCLC를 보유한 마우스에 4주간 주당 4회로 Omomyc를 비강내 처리하였다. (A) Omomyc 투여는 처리 개시 후 1주일 경과시 조기에 종양 부위로의 T 세포의 동원을 유도하며, T 세포는 치료 내내 거기에서 잔류한다. *p<0.05; **p<0.01. (B) Omomyc가 종양으로의 CD4 T 세포, 특히 PD-1과 PD-1 및 Tim-3 분자 둘다를 더 높은 수준으로 보이는 활성화된 CD4 T 세포로의 동원을 유도함을 보여주는 FACS 분석. Omomyc는 또한 T 조절성 세포 (Treg)의 증폭을 유도한다.
도 2. Omomyc 전신 투여는 T 세포를 종양 부위로 동원한다. Kras/p53 돌연변이된 NSCLC MuH-163 세포주를 동계 마우스에 피하 접종하였다. 마우스에 Omomyc를 3주간 전신 처리하였다. Omomyc는 종양 세포로 CD3+ T 세포를 더 많이 동원하였으며 (A), 비히클 카운터파트와 비교해 PD-1 및 Tim-3 분자를 둘다 발현하는 CD4 및 CD8 T 세포를 현저하게 더 많이 동원하였다 (B). **p<0.01.
도 3. Omomyc와 anti-PD-1의 조합은 CD4 + PD-1 + Tim-3 - T 세포를 종양 부위로 동원한다. KRasG12D-유발된 NSCLC를 보유한 마우스에 Omomyc를 주당 4회로 비강내로, anti-PD-1 (250 ㎍)을 주당 1회로 복막내로 4주간 처리하였다. Omomyc는 anti-PD-1과 조합하여 종양 부위로의 CD4+ PD-1+Tim-3- T 세포의 동원을 유도하였다.
도 4. Omomyc는 anti-PD-1과 조합하여 IFN -γ의 생산을 유도한다. Omomyc와 anti-PD-1의 조합은 종양내 CD4 (A) 및 CD8 (B) T 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하였다.
도 5. Omomyc와 anti-PD-1 항체의 조합은 건강한 폐의 비율을 상승적으로 증가시키고, 종양 부위로 T 세포를 동원한다. KRasG12D-유발된 NSCLC를 보유한 마우스에 Omomyc를 4주간 주당 4회로 비강내, 그리고 anti-PD-1 항체를 주당 1회로 복막내로 처리하였다. (A) Omomyc를 anti-PD-1과 조합하여 처리한 동물에서는 비히클 및 처리 단독과 비교해 건강한 폐의 비율 증가가 관찰되었다. (B) 치료 개시 및 종료 시점에 획득한 각 실험군의 대표적인 횡단 평면 CT 이미지. 어두운 영역은 건강한 폐에 해당하고, 회색 영역은 침범된 폐에 해당한다. (C) Omomyc와 anti-PD-1의 조합 투여가 종양 부위로의 T 세포, 특히 CD4 T 세포 및 Th1/Th17 세포의 동원을 유도함을 보여주는, FACS 분석. *p<0.05; **p<0.01; *** p<0.0001.
도 6. Omomyc와 anti- CTLA -4 항체의 조합은 종양 증식을 상승적으로 감소시키고, 종양 부위로 항-종양 T 세포를 동원한다. KRasG12D-유발된 NSCLC를 보유한 마우스에 Omomyc를 4주간 주당 4회로 비강내, 그리고 anti-CTLA-4 항체를 주당 1회로 복막내로 처리하였다. (A) Omomyc를 anti-CTLA-4와 조합하여 처리한 동물에서는 비히클 및 처리 단독과 비교해 종양의 증식 감소가 관찰되었다. 표는 각 처리군의 종양 증식의 평균을 보여준다. (B) Omomyc와 anti-CTLA-4의 조합 투여가 종양 부위로의 T 세포, 특히 CD4 T 세포 및 TCD4 및 CD8 PD-1+ T 세포의 동원을 유도함을 보여주는, FACS 분석. *p<0.05; **p<0.01; *** p<0.0001.
도 7. Omomyc와 anti-PD-1 항체를 순차적으로 투여하는 조합은 종양 부위로 항-종양 T 세포를 상승적으로 동원한다. KRasG12D-유발된 NSCLC를 보유한 마우스에 Omomyc를 4일 간격으로 10일간 정맥내 처리한 다음 anti-PD-1 항체를 주당 1회로 복막내로 처리하였다. FACS 분석에서, Omomyc 처리 후 anti-PD-1을 처리하는 순차적인 처리가 종양 부위로 T 세포, 특히 PD-1 및 Tim-3 분자 둘다를 발현하는 CD4 T 세포 및 PD-1을 발현하는 Th1/Th17 T 세포의 동원을 유도하는 것으로, 관찰되었다. *p<0.05; **p<0.01.
도 8. Omomyc와 anti-PD-1 항체의 조합은 T 세포를 종양 부위로 상승적으로 동원한다. KRasG12D/p53-유발된 NSCLC를 보유한 마우스에 Omomyc (정맥내) 및 anti-PD-1 (복막내)을 동시에 주당 1회로 처리하였다. (A) Omomyc와 anti-PD-1의 동시 처리가 T 세포를 종양 부위로 현저하게 동원함을 보여주는 IHC 염색 결과. (B) Omomyc와 anti-PD-1의 처리가 종양 부위로 전체 면역 세포 동원을 유도함을 보여주는, FACS 분석. *p<0.05; **p<0.01.
도 9. CD3, CD4, IL-17 및 IFN -γ의 높은 발현은 더 높은 생존율과 상관관계 를 보인다. CD3, CD4, IL-17 및 IFN-γ의 발현을 고려한 NSCLC 환자에 대한 대표적인 카플란-마이어 곡선. 그래프 하단 표는 상위 사분위수의 생존율을 나타낸다. 그래프는 카플란-마이어 플롯터로 작성하였다 http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background.
본 발명은 암을 예방 및 치료하기 위한 새로운 치료학적 조합물을 제공하는 것에 관한 것이다.
달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적인 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 측면과 관련하여 기술된 모든 구현예들은 다른 측면들에도 적용가능하다.
본 발명의 조합물 및 약학적 조성물
본원에 제공된 정의 및 본 발명의 다른 모든 측면들에 제공된 정의들은 본 발명 전체에 동일하게 적용가능하다.
본 발명의 발명자들은, Omomyc의 비강내 및 전신 투여가 종양 부위로 T 세포를 동원한다는 것을, 입증하였다 (도 1 및 2). 따라서, Omomyc는 면역항암제와 조합하여 암 치료에 유용할 수 있다. 아울러, Omomyc와 항암제의 조합물이 암 치료시 상승적인 효과가 있다는 것도, 밝혀졌다. 예를 들어, Omomyc와 anti-PD-1 요법의 조합물은 Tim-3가 아닌 PD-1을 발현하는 CD4+ T 세포의 종양 부위로의 동원을 비히클 및 anti-PD-1 단독 치료 군과 비교해 현저하게 증가시켰다 (도 3). 아울러, Omomyc 및 anti-PD-1 요법의 조합은 비히클 카운트파트와 비교해 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 종양내 T 세포 (도 4) 둘다에 의한 인터페론-γ (IFN-γ)의 생산을 현저하게 유도하였으며, 이는 Omomyc 처리군에서나 항PD-1 처리군에서는 관찰되지 않았다. 종양 부위로의 T 세포 동원은, 폐암을 앓고 있는 개체에 처리할 경우, 건강한 폐의 비율 증가로 이행된다 (도 5). 이러한 상승적인 효과는 경로, 투여량 및 투여 용법과 무관하게 유지된다 (도 7 및 8). 또한, Omomyc와 anti-CTLA-4 요법의 조합은 항-종양 T 세포의 종양 부위로의 동원 및 종양 증식을 상승적으로 감소시키는 것으로도, 밝혀졌다 (도 6).
이에, 제1 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 조합물에 관한 것이다:
i) a) - e)로 이루어진 군으로부터 선택되는 제1 구성성분:
a) 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체,
b) 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체와, 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모어어티를 포함하는 접합체,
c) a)의 폴리펩타이드 또는 b)의 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
d) c)에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및
e) a)에 따른 폴리펩타이드 또는 b)에 따른 접합체를 배지로 분비할 수 있는 세포; 및
ii) 면역항암제인 제2 구성성분.
본 발명에서, 표현 "조합물"은, 예를 들어 단일 제형으로서 제형화된 조성물, 각각의 구성성분에 대한 개별 제형들로 구성된 조합된 혼합물, 예를 들어 조합된 조제물로서 함께 사용하기 위해 조합될 수 있는 "탱크-믹스", 및 순차적인 방식으로, 즉 수시간 또는 수일과 같이 합리적인 기간으로 교대로 또는 동시에 투여하는 방식으로 적용할 경우에 단일 활성 성분들의 조합 사용 형태와 같이, 화합물 (i) 및 (ii)의 다양한 조합의 다양한 조합들을 의미한다. 본 발명에서, 화합물 (i)은 치료학적 유효량의 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 지칭하거나, 또는 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체 및 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모어어티를 포함하는 접합체를 지칭하는 것이거나, 또는 폴리펩타이드 또는 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하는 것이거나, 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭하는 것이거나, 또는 폴리펩타이드 또는 접합체를 배지로 분비할 수 있는 세포를 지칭하는 것이다. 본 발명에서, 화합물 (ii)는 치료학적 유효량의 면역항암제를 지칭하는 것이다. 바람직하게는, 화합물 (i) 및 (ii)의 적용 순서가 본 발명을 실시하는데 중요한 것은 아니다.
조합물은 각각의 구성성분이 개별 제형화 및 포장된 부품 키트일 수 있다.
화합물 (i)과 (ii)의 조합물은 동시에, 분리하여 또는 순차적인 투여하기 위해 제형화할 수 있다. 구체적으로, 투여가 동시적이지 않다면, 화합물들은 서로 가까운 시점에 투여된다. 아울러, 화합물은 동일한 또는 다른 투약 형태로, 또는 동일한 또는 다른 경로에 의해 투여되며, 예를 들어, 한가지 화합물은 경구로 투여하고 다른 화합물은 정맥내로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 화합물 (i)은 비강내로 투여하고, 화합물 (ii)는 전신, 더 바람직하게는 비경구, 보다 더 바람직하게는 복막내 투여한다. 다른 구현예에서, 화합물 (i)은 정맥내 투여하고, 화합물 (ii)는 비경구, 보다 더 바람직하게는 복막내 투여한다.
화합물 (i) 및 (ii) 2종의 조합물은 하기로서 투여할 수 있다:
- 동일한 약제 제형의 일부이고, 2가지 화합물이 항상 동시에 투여되는, 조합물로서.
- 동시, 순차적 또는 개별 투여가 가능한, 유닛 각각이 한가지 물질을 포함하는, 2가지 유닛들의 조합물로서.
특정 구현예에서, 본 발명의 조합물의 화합물 (i)은 화합물 (ii)와 독립적으로 투여되며, 즉 2개의 유닛 형태이지만, 동시에 투여된다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명의 조합물의 화합물 (i)을 먼저 투여한 다음 화합물 (ii)를 투여하며, 즉 화합물 (ii)는 분리하여 또는 순차적으로 투여된다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 조합물의 화합물 (ii)를 먼저 투여한 다음 화합물 (i)을 투여하고, 즉 화합물 (i)는 정의된 바와 같이 분리하여 또는 순차적으로 투여된다. 만일 분리 투여한다면, 본 발명의 조합물의 화합물 (i) 및 (ii)는 서로 소정의 시간 간격내에, 예를 들어 서로 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간 또는 24시간 이내에 투여할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조합물의 화합물 (i) 및 (ii)는 서로 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일 또는 24일 이내의 간격으로, 바람직하게는 서로 1일 이내, 더 바람직하게는 서로 10일 이내의 간격으로 투여할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 화합물 (i)을 먼저 투여한 후 10일 후 화합물 (ii)를 투여한다. 일 구현예에서, 제1 화합물의 투여는 제2 화합물의 투여를 개시하기 전에 중단한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 제1 화합물과 면역항암제를 상승적인 유효량으로 포함하는 조합물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 화합물 (i)은 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 임의 길이의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 지칭한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 삽입될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드는 아미노산으로만 구성된다. 바람직하게는, 접합체의 항목 (i)을 구성하는 폴리펩타이드는 아미노산 80-500개 길이, 더 바람직하게는 아미노산 80-300개 길이, 더 바람직하게는 아미노산 80-250개 길이, 더 바람직하게는 아미노산 80-150개 길이, 보다 더 바람직하게는 아미노산 80-130개 길이, 바람직하게는 아미노산 90-130개 길이, 바람직하게는 아미노산 125개 이상, 더 바람직하게는 아미노산 100개 이상의 길이를 가진다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드는 아미노산 90-98개 길이, 바람직하게는 아미노산 90-95개 길이, 더 바람직하게는 아미노산 91개 길이이다.
용어 "아미노산"은 자연 생성 아미노산 및 합성 아미노산뿐 아니라 자연 생성 아미노산과 비슷한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 아울러, 용어 "아미노산"은 D-아미노산 및 L-아미노산 (입체이성질체) 둘다이며, 바람직하게는 아미노산은 L-아미노산이다.
용어 "천연 아미노산" 또는 "자연 생성 아미노산"은 자연 생성 아미노산 20종; 흔히 생체내 번역 후 변형된 아미노산, 예를 들어, 하이드록시프롤린, 포스포세린 및 포스포트레오닌; 및 그외 특이 아미노산, 비-제한적인 예로, 2-아미노아디프산, 하이드록시라이신, 이소데스모신, 노르-발린, 노르-루신 및 오르니틴을 포함한다.
본원에서, 용어 "비-천연 아미노산" 또는 "합성 아미노산"은 카르복시산 또는 "a" 위치가 아민기로 치환된, 그리고 천연 아미노산과 구조적으로 비슷한, 이의 유도체를 지칭한다. 변형된 또는 특이 아미노산에 대한 예시적인, 비-제한적인 예로는 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, β-알라닌, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로익산, 2-아미노헵타노익산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜릭산, 2,4-다이아미노부티르산, 데스모신, 2,2'-다이아미노피멜릭산, 2,3-다이아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 하이드록시 라이신, 알로 하이드록시 라이신, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 이소데스모신, 알로이소루신, N-메틸글리신, N-메틸이소루신, 6-N-메틸-라이신, N-메틸발린, 노르발린, 노르루신, 오르니틴 등이 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 또한 예를 들어 펩타이드에 부착되는 소수성 모이어티 (다양한 선형, 분지형, 고리형, 다환식 또는 헤테로사이클릭 탄화수소 및 탄화수소 유도체); 화합물의 분해를 줄이기 위해 말단에 부착되는 다양한 보호기와 같은, 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 적합한 보호 관능기들은 Green and Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, Chapters 5 and 7, 1991에 기술되어 있다.
폴리펩타이드에 존재하는 화학적 (비-아미노산) 기들은, 분해 또는 소거 감소; 다양한 세포 펌프에 의한 반발 저하, 다양한 투여 방식 개선, 특이성 증가, 친화성 증가, 안정성 증가, 생체이용성, 용해성, 독성 감소 등과 같은 다양한 생리학적 특성을 개선하기 위해 함유될 수 있다.
"모방체"는 펩타이드 구조체의 화학 구조를 모방하고 펩타이드 구조체의 기능적인 특성을 유지하는 분자이다. 펩타이드 유사체, 유도체 및 모방체를 설계하는 방식은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 1의 서열로 이루어진 폴리펩타이드, 또는 서열번호 1에 대한 기능적으로 동등한 변이체로 이루어진 폴리펩타이드이며, 바람직하게는 서열번호 1의 서열로 이루어진 폴리펩타이드이다.
서열번호 1은 다음과 같다:
TEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSCA (서열번호 1)
서열번호 1의 서열의 폴리펩타이드는 Omomyc 단백질 서열에 해당한다. 본원에서, 용어 "Omomyc"은 Myc 단백질의 bHLHZip 도메인에 대한 E61T, E68I, R74Q 및 R75N 돌연변이를 가진 돌연변이 버전을 구성하는 폴리펩타이드를 의미한다 (여기서, 돌연변이되는 위치의 번호는 2015년 3월 15일에 공개된 NCBI 데이터베이스에서 등재번호 NP_002458에 따라 정의되는, 폴리펩타이드의 아미노산 365-454에 해당하는 Myc 영역의 서열을 기준으로 부여됨). NCBI 데이터베이스에서 등재번호 NP_002458로 제공된 c-Myc의 서열을 아래에 나타내며 (서열번호 2), Omomyc가 유래되는 영역은 밑줄로 표시한다:
Figure pct00001
Omomyc는 또한 서열 RQRRNELKRSF (서열번호 3)을 가진 c-Myc의 M2 도메인을 함유하며 (Dang and Lee, Mol.Cell. Biol., 1988, 8:4048-4054)(상기 이중 밑줄친 부분), 이는 핵 위치화 신호에 해당한다.
Omomyc는 모두 3종의 종양 생성 Myc 단백질 (c-Myc, N-Myc 및 L-Myc)과 함께 증가된 다이머 형성 능력을 나타내는 것을 특징으로 한다. Omomyc는, 종양 억제자 효과를 유발하는 돌연변이가 유지되는 한, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 Myc 단백질의 bHLHZip 도메인으로부터 유래할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 이용가능한 Omomyc는, 가축 및 농장 동물 (소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류), 영장류 및 인간 등의 모든 포유류 종들로부터 유래할 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, Omomyc 단백질은 인간 Myc 단백질로부터 유래한다 (등재번호 NP_002458, 공개일: 2015년 3월 12일).
본원에서, 용어 "Myc"는 c-Myc, N-Myc 및 L-Myc를 포함하는 전사 인자 패밀리를 지칭한다. Myc 단백질은 컨센서스 서열 CACGTG (인핸서 박스 서열 또는 E-박스) 상에 결합하여 히스톤 아세틸-트랜스퍼라제 또는 HAT를 동원함으로써, 다수 유전자들의 발현을 활성화한다. 그러나, Myc는 전사 억제자로도 작용할 수 있다. Miz-1 전사 인자에 결합하여 p300 공동-활성자를 대체함으로써, Miz-1 타겟 유전자의 발현을 저해한다. 또한, Myc는 DNA 복제 조절에 직접적인 역할을 담당한다.
Myc b-HLH-LZ 또는 Myc 염기성 영역 나선-루프-나선 루신 지퍼 도메인은, Max 단백질과의 Myc 다이머 형성 및 Myc-타겟 유전자에의 결합을 결정하는 영역이다. 이 영역은 인간 Myc의 아미노산 365-454에 해당하며, 루프에 의해 연결된 2개의 α 나선을 특징으로 한다 (Nair, S. K., & Burley, S. K., 2003, Cell, 112: 193-205).
바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 하기 나타낸 서열번호 4를 포함하거나, 서열번호 4로 구성되거나 또는 서열번호 4로 필수적으로 구성된다.
MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSCA (서열번호 4)
이러한 맥락에서, "필수적으로 구성된"다는 것은 명시된 분자가 서열번호 4의 활성을 변형시키는 어떠한 부가적인 서열을 함유하지 않는다는 것을 의미한다.
바람직하게는, 폴리펩타이드는 서열번호 4로 구성된다.
용어 "기능적으로 동등한 변이체"는, 서열번호 1의 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 부가로부터 및/또는 하나 이상의 아미노산의 결손으로부터 및/또는 하나 이상의 아미노산의 보존적인 치환으로부터 생기거나, 및/또는 서열번호 1의 폴리펩타이드의 화학적 변형으로부터 생성되며, 서열번호 1의 종양억제자 활성을 실질적으로 보존한, 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 바람직하게는, 기능적으로 동등한 변이체는 서열번호 1의 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 부가로부터 및/또는 하나 이상의 아미노산의 결손으로부터 및/또는 하나 이상의 아미노산의 보존적인 치환으로부터 생기고, 및/또는 서열번호 1의 종양억제자 활성을 실질적으로 보존한, 임의의 폴리펩타이드; 더 바람직하게는 서열번호 1의 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 부가로부터 생기는, 임의의 폴리펩타이드를 의미한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 종양억제자 활성의 보존에는 변이체가 Myc 및/또는 이의 절대 파트너 (obligate partner) p21/p22Max와 다이머를 형성하여 Myc 활성을 저해할 수, 즉 세포막을 통과해 전위할 수 있는 할 수 있어야 하며, 핵막을 통과해 전위할 수 있어야 함을 알 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 기능적으로 동등한 변이체는 Omomyc보다 호모다이머화가 낮거나, 또는 이황화 결합 성에 의해 호모다이머로 강제되지 않는다. 특히, 본 발명의 폴리펩타이드의 특정 구현예에 따른 호모다이머 형태에서 이황화 결합 형성은 폴리펩타이드 Omomyc에서보다 적다.
본원에서, "낮은 호모다이머화 (homodimerization)는, 본 발명의 폴리펩타이드가 심지어 환원 조건에서도 절대 호모다이머 (obligate homodimer)를 형성하는 능력이 낮다는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 능력은, Omomyc의 호모다이머 형성력보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45 %, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 낮다.
본원에서, 환원 조건은, 환원제, 즉 레독스 화학 반응에서 전자를 다른 화학종에게 주는 화합물이 존재하는 것을 의미한다. 환원제에 대한 예시적인 비-제한적인 예는 DTT (다이티오트레이톨), β-머캅토에탄올 또는 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀)이다. 호모다이머들의 양은 시험관내에서 동일할 수 있으며, 기능적으로 동등한 변이체와 Omomyc 간의 차이는, 이황화 결합의 부재가 헤테로다이머의 형성을 잠재적으로 높일 수 있는, 세포내 헤테로다이머화 파트너가 존재하는 조건에서만 존재할 가능성이 있다.
몇가지 분석을 이용해 펩타이드의 호모다이머화를 확인할 수 있으며, 예시적인 비-제한적인 예로는 원이색법 (Circular dichroism)으로 모니터링하는 열 변성이 있으며, 그래서 다이머화는 폴딩 및 열 안정성 정량화를 통해 검출할 수 있다.
적합한 기능적으로 동등한 변이체는 서열번호 1의 폴리펩타이드로 필수적으로 구성되는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 맥락에서, "필수적으로 구성되는"은, 명시된 분자가 서열번호 1의 활성을 변형시키는 임의의 부가적인 서열을 함유하지 않는다는 것을 의미한다.
바람직한 구현예에서, 서열번호 1에 대한 기능적으로 동등한 변이체는, 서열번호 1의 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 부가로 인해 생성되는 폴리펩타이드이다. 일 구현예에서, 기능적으로 동등한 변이체는 아미노산 10개 미만의 삽입으로, 더 바람직하게는 아미노산 5개 미만, 더 바람직하게는 아미노산 1개의 삽입으로부터 생성된다. 바람직한 구현예에서, 메티오닌인 아미노산 하나의 삽입으로 인해 생성된다.
다른 구현예에서, 서열번호 1에 대한 기능적으로 동등한 변이체는 서열번호 1의 폴리펩타이드에 대해 아미노산 하나 이상의 결손으로 인해 생성되는 폴리펩타이드이다. 일 구현예에서, 기능적으로 동등한 변이체는 아미노산 10개 미만, 더 바람직하게는 아미노산 5개 미만, 더 바람직하게는 아미노산 1개의 결손으로 인해 생성된다.
표적 펩타이드에 적합한 기능성 변이체는 서열번호 1의 펩타이드에 대해 25% 이상의 동일성 수준, 예를 들어 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가진 것이다. 2가지 폴리펩타이드 간의 동일성 정도는 당해 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 이용해 결정한다. 2가지 아미노산 서열 간의 동일성은 바람직하게는 기존에 공지된 BLASTP 알고리즘을 이용해 결정한다 [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 1990;215: 403-410]. 바람직한 구현예에서, 서열 동일성은 서열번호 1의 폴리펩타이드의 전장에 대해 또는 변이체의 전장에 대해 또는 이 둘다에 대해 결정한다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 기능적으로 동등한 변이체는 당화, 아세틸화, 이소프레닐화, 미리스토일화, 단백질 분해 프로세스 등과 같은 번역 후 수정을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 타겟팅 펩타이드에 대한 적합한 기능성 변이체는, 본 발명의 폴리펩타이드 내 하나 이상의 위치가 전술한 아미노산에 존재하는 아미노산에 대한 보존적인 치환인 아미노산을 함유하는, 것이다. "보존적인 아미노산 치환"은 아미노산을 비슷한 구조 및/또는 화학적 특성을 가진 다른 아미노산으로 대체함으로써 달성된다. 예를 들어, 다음과 같은 6가지 그룹은 각각 서로에 대해 보존적인 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 라이신 (K); 5) 이소루신 (I), 루신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W). 이러한 보존적인 아미노산 치환의 선택은 당해 기술 분야의 당업자의 기술에 속하며, 예를 들어 Dordo et al., (J. Mol. Biol, 1999, 217;721-739) 및 Taylor et al., (J. Theor. Biol., 1986, 119:205-218)에 기술되어 있다.
Omomyc에 대한 기능적으로 동등한 변이체는 인간 c-Myc로부터 유래된 Omomyc에서 발견되는 돌연변이 E61T, E68I, R74Q 및 R75N에 대응되는 위치에 돌연변이를 함유하는 것으로 이해될 것이다. 기능적으로 동등한 변이체에서 상기한 돌연변이가 달성되어야 하는 위치는 여러가지 Myc 서열들의 다중 서열 정렬에 의해 결정될 수 있으며, 인간 c-Myc에서 유래된 Omomyc 서열의 61번, 68번, 74번 및 75번 위치에 대응되는 위치들을 정렬함으로써 동정할 수 있다. 일 구현예에서, Omomyc에 대한 기능적으로 동등한 변이체는 인간 c-Myc로부터 유래된 Omomyc에서 발견되는 돌연변이 E61T, E68I, R74Q 및 R75N에 대응되는 위치에서 돌연변이를 가진다.
다른 구현예에서, Omomyc에 대한 기능적으로 동등한 변이체는 Omomyc 서열의 E61, E68, R74 및 R75에 대응되는 위치에서 돌연변이를 가지며, 여기서 E61은 E61A 또는 E61S으로 돌연변이되고; E68은 E68L, E68M 또는 E68V로 돌연변이되고; R74는 R74N으로 돌연변이되고; R75는 R75Q로 돌연변이된다.
다중 서열 정렬은 2개보다 많은 수의 서열을 한번에 대규모 쌍 정렬하는 것이다. 다중 정렬 방법은 모든 서열들을 주어진 쿼리 세트에서 정렬한다. 바람직한 다중 서열 정렬 프로그램 (및 이의 알고리즘)은 ClustalW, Clustal2W 또는 ClustalW XXL이다 (Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res 22:4673-4680). 본원에 기술된 바와 같이, 여러 유기체들의 c-Myc 서열 및 변이체의 서열을 비교 (정렬)하면, 당해 기술 분야의 당업자는 각 서열에서 Omomyc에서 발견되는 E61T, E68I, R74Q 및 R75N 위치에 해당하는 각각의 위치를 파악해, 인간 c-Myc로부터 유래된 Omomyc에서 발견되는 E61T, E68I, R74Q 및 R75N 돌연변이에 대응되는 돌연변이를 Omomyc 변이체에 쉽게 도입할 수 있다.
폴리펩타이드가 Omomyc의 기능적으로 동등한 변이체로 간주될 수 있는 지를 확인하는데 적합한 분석으로는 비-제한적인 예로 다음과 같다:
- Soucek et al. (Oncogene, 1998, 17: 2463 - 2472)에 기술된 리포터 유전자의 발현에 기초한 분석 뿐만 아니라 PLA (단백질 라이게이션 분석) 또는 공동-면역침강과 같이, Max 및 Myc와 다이머 복합체를 형성하는 폴리펩타이드의 능력을 측정하는 분석.
- 전술한 Soucek 문헌에 기술된 전기영동 이동성 쉬프트 분석 (EMSA)과 같이, DNA 내 Myc/Max 인지 부위 (CACGTG 부위)에 결합하는 폴리펩타이드의 결합력을 측정하는 분석.
- 전술한 Soucek 문헌에 기술된 바와 같이 Myc/Max에 특이적인 DNA 결합 부위의 통제 하에 놓인 리포터 유전자의 발현에 기초한 분석 등의, Myc-유도성 전사활성화 (transactivation)를 억제하는 억제력을 측정하는 분석.
- 전술한 Soucek 문헌에 기술된 바와 같이 myc 발암유전자를 발현하는 세포의 증식을 저해하는 폴리펩타이드의 저해력에 기초한 분석.
- Soucek et al. (Oncogene, 1998: 17, 2463 - 2472)에 기술된 분석 등의, myc-유발성 세포자살을 강화하는 폴리펩타이드의 능력을 측정하는 분석. 또한, 세포에서 세포자살을 평가하는 기술 분야에서 통상적으로 공지된 임의 분석, 예를 들어 훼스트 (Hoechst) 염색, 프로피듐 아이다이드 (PI) 또는 아넥신 V 염색, 트리판 블루, DNA 래더링/단편화 및 TUNEL을 이용할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드가 상기한 분석들 중 한가지 이상에서 천연 Omomyc의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%에 해당하는 활성을 보인다면, 그 폴리펩타이드는 기능적으로 동등한 변이체로 간주된다.
특정 구현예에서, 서열번호 1의 폴리펩타이드에 대한 기능적으로 동등한 변이체는 서열번호 1의 폴리펩타이드를 포함하되, 서열번호 1의 89번 위치의 X 잔기는 시스테인이 아니다. 바람직하게는, 서열번호 1에서 89번 위치의 잔기 X는 지방족 아미노산, 또는 황 결합된 (sulfured) 아미노산, 또는 다이카르복실릭 아미노산 또는 이의 아미드, 또는 2개의 염기성 기를 가진 아미노산, 또는 방향족 아미노산, 또는 사이클릭 아미노산, 또는 하이드록시화된 아미노산이다. 더 바람직하게는, 세린, 트레오닌 및 알라닌으로부터 선택되는 아미노산이며, 바람직하게는 세린 및 알라닌으로부터 선택되는 아미노산이다.
서열번호 1에서 89번 위치에 잔기 X를 가진 서열번호 1에 대해 적합한 기능적으로 동등한 변이체들은 하기 표에 기술된다.
서열 번호 서열
서열번호 5 TEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSXA (X는 Cys가 아닌 임의의 아미노산임)
서열번호 6 MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSXA (X는 Cys가 아닌 임의의 아미노산임)
서열번호 7 TEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSSA
서열번호 8 MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSSA
서열번호 9 TEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSAA
서열번호 10 MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSAA
따라서, 바람직한 구현예에서, 서열번호 1의 폴리펩타이드에 대한 기능적으로 동등한 변이체는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
아울러, Omomyc에 대한 기능적으로 동등한 변이체는 변이체가 세포와 접촉한 후 세포에 형질도입될 수 있다. Omomyc에 대한 기능적으로 동등한 변이체가 천연 Omomyc에서 발견되는 단백질 형질도입 도메인 또는 다른 기능적인 단백질 형질도입 도메인을 함유하는 것으로 이해될 것이다.
바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드가 서열번호 1과 비교해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%로 효율적으로 타겟 세포에 형질도입될 수 있다면, 서열번호 1의 기능적으로 동등한 변이체로 간주된다.
아울러, 서열번호 1에 대한 기능적으로 동등한 변이체는 또한 타겟 종양 세포의 핵으로 전위할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드가 서열번호 1과 비교해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%로 효율적으로 타겟 종양 세포의 핵으로 전위될 수 있다면, 서열번호 1의 기능적으로 동등한 변이체로 간주된다.
폴리펩타이드가 세포막을 통과해 핵으로 전위할 수 있는 능력 관점에서 서열번호 1에 대한 기능적으로 동등한 변이체인지를 확인하는데 적합한 분석은, 세포를 그 폴리펩타이드에 특이적인 시약과 세포 핵을 특이적으로 표지하는 염료 (예, DAPI 또는 Hoechst 염료)로 2중 표지하는 것을 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드 검출은 공초점 현미경법 또는 형광 현미경법에 의해 수행할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 화합물 (i)은 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체와 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모어어티를 포함하는 접합체이다.
본원에서, 용어 "접합체"는 2종 이상의 화합물이 각각의 화합물의 기능이 접합체에서 유지되도록 공유 연결된 것을 의미한다.
용어 "화학적 모이어티"는 하나 이상의 탄소 원자를 함유한 임의의 화학적 화합물을 지칭한다. 화학적 모이어티에 대한 예로는, 비-제한적으로, 소수성 아미노산 및 소수성 화학적 모이어티가 다량 존재하는 임의의 펩타이드 체인 등이 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 접합체는 폴리펩타이드 또는 상기한 폴리펩타이드에 대한 기능적으로 동등한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티를 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 그보다 많이 포함한다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티는 지질 또는 지방산이다.
지방산은 일반적으로 체인의 말단에 산성 모이어티 (예, 카르복시산)를 가진 탄소 체인을 포함하는 분자이다. 지방산의 탄소 체인은 임의 길이일 수 있지만, 바람직하게는, 탄소 체인의 길이는 탄소 원자 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그보다 많은 수의 길이이며, 이로부터 유추가능한 임의 범위의 길이이다. 특정 구현예에서, 탄소 체인의 길이는 지방산의 체인 영역에서 탄소 원자 4-18개이다. 특정 구현예에서, 지방산 탄소 체인은 탄소 원자를 홀수로 포함할 수 있지만, 특정 구현예에서 체인의 탄소 원자의 수가 짝수인 것도 바람직할 수 있다. 탄소 체인에 단일 결합만 포함하는 지방산은 포화된 것으로, 체인에 이중 결합을 하나 이상 포함하는 지방산은 불포화된 것으로 지칭한다. 지방산은 분지형일 수 있지만, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 비-분지형이다. 구체적인 지방산으로는, 비-제한적으로, 리놀레산, 올레산, 팔미트산, 리놀렌산, 스테아르산, 라우르산, 미리스트산, 아라키딘산, 팔미트올레산, 아라키돈산 등이 있다.
바람직한 구현예에서, 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티는 세포 침투성 펩타이드 서열이며, 이 경우, 접합체는 서열번호 1을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체와 세포 침투성 펩타이드 서열을 포함하는 융합 단백질일 것이다.
용어 "융합 단백질"은 여러가지 단백질로부터 유래되는 2 이상의 기능적 도메인들로 구성된, 유전자 기법에 의해 제작된 단백질을 지칭한다. 융합 단백질은 통상적인 수단에 의해, 예를 들어, 적합한 세포에서 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 유전자 발현시킴으로써, 수득할 수 있다. 세포 침투성 펩타이드는, 서열번호 1을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1에 대한 기능적으로 동등한 변이체의 일부를 형성하는 세포 침투성 펩타이드와는 다른 세포 침투성 펩타이드를 지칭하는 것으로, 이해될 것이다.
용어 "세포 침투성 펩타이드 서열"은 본 명세서에서 "CPP", "단백질 형질도입 도메인 (protein transducing domain)" 또는 "PTD"와 상호 호환적으로 사용된다. 이는 세포 내부로의 단백질의 이동을 지시하는 가변적인 길이의 펩타이드 체인을 지칭한다. 세포로의 전달 프로세스는 통상적으로 엔도사이토시스 (endocytosis)에 의해 이루어지지만, 펩타이드는 또한 직접적인 막 전위에 의해 세포 내 내재화될 수 있다. CPP는 전형적으로 라이신 또는 아르기닌과 같이 양으로 하전된 아미노산이 상대적으로 많은 아미노산 조성을 가지거나, 또는 극성/하전된 아미노산 및 비-극성, 소수성 아미노산의 교차 패턴 (alternating pattern)을 함유한 서열을 가진다.
본 발명에 이용가능한 CPP에 대한 예로는, 비-제한적으로, 드로소필라 안테나페디아 (Drosophila antennapedia ) 단백질에서 발견되는 CPP (RQIKIWFQNRRMKWKK. 서열번호 13), 헤르페스바이러스 심플렉스 1 (HSV-1) VP22 DNA-결합 단백질의 CPP (DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE, 서열번호 14), Bac-7의 CPP (RRIRPRPPRLPRPRPRPLPFPRPG; 서열번호 15), 아미노산 49-57 (RKKRRQRRR, 서열번호 16), 아미노산 48-60 (GRKKRRQRRRTPQ, 서열번호 17), 아미노산 47-57 (YGRKKRRQRRR; 서열번호 18)로 이루어진 HIV-1 TAT 단백질의 CPP, S413-PV 펩타이드의 CPP (ALWKTLLKKVLKAPKKKRKV; 서열번호 19), 페네트라틴 (penetratin)의 CPP (RQIKWFQNRRMKWKK; 서열번호 20), SynB1의 CPP (RGGRLSYSRRRFSTSTGR; 서열번호 21), SynB3의 CPP (RRLSYSRRRF; 서열번호 22), PTD-4의 CPP (PIRRRKKLRRLK; 서열번호 23), PTD-5의 CPP (RRQRRTSKLMKR; 서열번호 24), FHV Coat-(35-49)의 CPP (RRRRNRTRRNRRRVR; 서열번호 25), BMV Gag-(7-25)의 CPP (KMTRAQRRAAARRNRWTAR; 서열번호 26), HTLV-II Rex-(4-16)의 CPP (TRRQRTRRARRNR; 서열번호 27), D-Tat의 CPP (GRKKRRQRRRPPQ; 서열번호 28), R9-Tat의 CPP (GRRRRRRRRRPPQ; 서열번호 29), MAP의 CPP (KLALKLALKLALALKLA; 서열번호 30), SBP의 CPP (MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV; 서열번호 31), FBP의 CPP (GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; 서열번호 32), MPG의 CPP (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 33), MPG(ENLS)의 CPP (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya; 서열번호 34), Pep-1의 CPP (ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 35), Pep-2의 CPP (ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 36), 구조 RN의 폴리아르기닌 서열 (N = 4 - 17), GRKKRRQRRR 서열 (서열번호 37), RRRRRRLR 서열 (서열번호 38), RRQRRTS KLMKR 서열 (서열번호 39); 트란스포르탄 (Transportan) GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (서열번호 40); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (서열번호 41); RQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호 42), YGRKKRRQRRR 서열 (서열번호 43); RKKRRQRR 서열 (서열번호 44); YARAAARQARA 서열 (서열번호 45); THRLPRRRRRR 서열 (서열번호 46); GGRRARRRRRR 서열 (서열번호 47) 등이 있다.
바람직한 구현예에서, 상기한 세포 침투성 펩타이드는 서열번호 1에 포함된 내재된 것이 아니다.
바람직한 구현예에서, CPP는 아미노산 아미노산 49-57 (RKKRRQRRR, 서열번호 16)로 이루어진 HIV-1 TAT 단백질의 CPP이다. 바람직한 다른 구현예에서, CPP는 GRKKRRQRRR 서열 (서열번호 50) 또는 RRRRRRLR 서열 (서열번호 51)이다. 다른 구현예에서, CPP는 GRKKRRQRRR 서열 (서열번호 37) 또는 RRRRRRRR (서열번호 65)이다.
일부 구현예에서, CPP는 WO2019/018898에 기술된 바와 같은 CPP이며, 이 문헌의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 구현예에서, 세포 침투성 펩타이드 서열은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 상기한 폴리펩타이드의 기능적으로 동등한 변이체의 N-말단에 융합된다. 다른 구현예에서, 세포 침투성 펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 상기한 폴리펩타이드의 기능적으로 동등한 변이체의 C-말단에 융합된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물의 접합체 또는 융합 단백질은, 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 상기한 폴리펩타이드의 기능적으로 동등한 변이체에서 발견되는 자체 세포 침투성 펩타이드 외에도, 부가적인 세포 침투성 펩타이드를 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 그보다 많이 포함한다.
본 발명의 적합한 융합 단백질은 다음과 같이 정의되는 폴리펩타이드 Omomyc*TAT 및 Omomyc*LZArg를 포함한다:
명칭 서열번호 서열
Omomyc*TAT 11 MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSCAGRKKRRQRRR
Omomyc*LZArg 12 MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSCARRRRRRLR
이에, 바람직한 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 11 및 12로부터 선택되는 폴리펩타이드이다.
접합체가 Omomyc의 세포막 전위 능력을 보존하는 지를 확인하는데 적합한 분석으로는, 비-제한적으로, 접합체가 배양 중인 세포를 형질도입시킬 수 있는 능력을 측정하는 분석이다. 이러한 분석은 접합체를 배양 세포와 접촉시키고, 세포내 위치에서 접합체의 존재를 검출하는 것을 기반으로 한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조합물의 접합체는 추가적인 핵 위치화 신호를 더 포함한다.
본원에서, 용어 "핵 위치화 신호" (NLS)는 단백질을 핵으로 향하게 하는 아미노산 잔기 약 4-20개로 된 아미노산 서열을 지칭한다. 전형적으로, 핵 위치화 서열에는 염기성 아미노산이 풍부하게 존재하며, 서열의 예들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다 (Gorlich D. (1998) EMBO 5.17:2721-7). 일부 구현예에서, NLS는 SV40 라지 T 항원 NLS (PKKKRKV, 서열번호 48); 뉴클레오플라스민 NLS (KRPAATKKAGQAKKKK, 서열번호 49); CBP80 NLS (RRRHSDENDGGQPHKRRK, 서열번호 50); HIV-I Rev 단백질 NLS (RQARRNRRRWE, 서열번호 51); HTLV-I Rex (MPKTRRRPRRSQRKRPPT, 서열번호 52); hnRNP A NLS (NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFKPRNQGGY, 서열번호 53); rpL23a NLS (VHSHKKKKIRTSPTFTTPKTLRLRRQPKYPRKSAPRRNKLDHY, 서열번호 54)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 일 구현예에서, 핵 위치화 신호는 모티프 K (K/ R) X (K/ R)(서열번호 55)를 포함한다.
보다 더 바람직한 구현예에서, 핵 위치화 신호는 PKKKRKV (서열번호 48), PAAKRVKLD (서열번호 56) 및 KRPAATKKAGQ AKKKK (서열번호 49)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 구현예에서, NLS는 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 포함하는 접합체 또는 융합 단백질에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 접합체는 서열번호 1을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체, 세포 침투성 펩타이드 서열 및/또는 NLS를 연결하는 하나 이상의 플렉시블 펩타이드를 더 포함하는 것이 바람직할 수 있음을 이해할 것이다. 즉, 특정 구현예에서, 서열번호 1을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체는 세포 침투성 펩타이드 서열에 직접 연결된다. 다른 특정 구현예에서, 서열번호 1을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체는 플렉시블 펩타이드를 통해 세포 침투성 펩타이드에 연결된다. 일 구현예에서, 서열번호 1을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체는 NLS에 직접 연결된다. 다른 구현예에서, 서열번호 1을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체는 플렉시블 펩타이드를 통해 NLS에 연결된다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 접합체의 폴리펩타이드는 세포 침투성 펩타이스 서열 및 NLS에 직접 연결된다.
일 구현예에서, NLS는 M1 펩타이드 (PAAKRVKLD, 서열번호 56) 또는 M2 펩타이드 (RQRRNELKRSF, 서열번호 57)와 같은 Myc 서열에 내인성으로 보이는 NLS들 중 하나이다.
다른 구현예에서, 부가적인 NLS는 서열번호 1을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1에 대한 기능적으로 동등한 변이체에서 발견되는 내인성 NLS와는 다른 NLS를 지칭한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 접합체 또는 융합 단백질은, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에서 발견되는 내인성 NLS 외에도, NLS를 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 접합체의 폴리펩타이드는 제1 플렉시블 펩타이드 링커를 통해 세포 침투성 펩타이드 서열에, 제2 플렉시블 펩타이드 링커를 통해 NLS에 연결된다.
본원에서, 용어 "플렉시블 펩타이드", "스페이서 펩타이드" 또는 "링커 펩타이드"는 2종의 단백질 또는 모이어티와 공유 결합하지만 폴리펩타이드의 일부는 아닌, 펩타이드로서, 이는 단백질 또는 모이어티의 기능에 실질적으로 유해한 효과를 야기하지 않으면서 하나를 다른 것에 대해 움직일 수 있도록 하는 것이다. 즉, 플렉시블 링커는 폴리펩타이드 서열의 종양 추적 활성, 세포 침투성 폴리펩타이드의 세포 침투 활성 또는 NLS의 핵 위치화 능력에 영향을 미치지 않는다.
플렉시블 펩타이드는 하나 이상의 아미노산, 적어도 2개의 아미노산, 적어도 3개의 아미노산, 적어도 4개의 아미노산, 적어도 5개의 아미노산, 적어도 6개의 아미노산, 적어도 7개의 아미노산, 적어도 8개의 아미노산, 적어도 9개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 12개의 아미노산, 적어도 14개의 아미노산, 적어도 16개의 아미노산, 적어도 18개의 아미노산, 적어도 20개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 30개의 아미노산, 적어도 35개의 아미노산, 적어도 40개의 아미노산, 적어도 45개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 60개의 아미노산, 적어도 70개의 아미노산, 적어도 80개의 아미노산, 적어도 90개의 아미노산 또는 약 100개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 플렉시블 펩타이드는, 단백질의 용해성을 높이거나 및/또는 활성을 개선하기 위해, 하나의 단백질이 다른 것에 대해 움직일 수 있도록 허용할 것이다. 적합한 링커 영역으로는 폴리-글리신 영역, 글리신, 프롤린 및 알라닌 잔기들의 조합인 GPRRRR 서열 (서열번호 58) 등이 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 접합체는, 상기한 폴리펩타이드 또는 융합 단백질 또는 이의 변이체의 C-말단 또는 N-말단 도메인에 또는 접합체에 결합된, 태그를 포함한다. 이러한 태그는 일반적으로 융합 단백질을 분리 또는 정제하는데 이용할 수 있는 펩타이드 또는 아미노산 서열이다. 따라서, 이러한 태그는 하나 이상의 리간드, 예를 들어, 크로마토그래피 지지체 또는 비드와 같은 친화성 매트릭스의 하나 이상의 리간드에 고 친화성으로 결합할 수 있다. 이러한 태그에 대한 예는, 히스티딘 태그 (His-tag 또는 HT), 예를 들어, 니켈 (Ni2 +) 또는 코발트 (Co2 +) 컬럼에 고 친화성으로 결합할 수 있는 히스티딘 잔기 6개를 포함하는 (His6 또는 H6) 태그이다. His-tag는, 대부분의 단백질을 변성시키고 대부분의 단백질-단백질 상호작용을 파괴하는 조건에서, 이의 리간드에 결합할 수 있는, 바람직한 특징을 가진다. 이에, 이는 미끼 (bait) 단백질이 관여하는 단백질-단백질 상호작용을 교란한 다음 H6이 부착된 미끼 단백질을 제거할 수 있다.
접합체 또는 서열번호 1을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 융합 단백질을 분리 또는 정제하기 위해 사용가능한 태그에 대한 부가적인 예시적인 비-제한적인 예로는, Arg-tag, FLAG-tag (DYKDDDDK; 서열번호 59), Strep-tag (WSHPQFEK, 서열번호 60), 항체에 의해 인지가능한 에피토프, 예를 들어, c-myc-tag (anti-c-myc 항체에 의해 인지됨), HA tag (YPYDVPDYA, 서열번호 61), V5 tag (GKPIPNPLLGLDST, 서열번호 62), SBP-tag, S-tag, 칼모듈린 결합 펩타이드, 셀룰로스 결합 도메인, 키틴 결합 도메인, 글루타티온 S-트랜스퍼라제-tag, 말토스 결합 단백질, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, 등 (Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 60:523-525), 아미노산 서열, 예를 들어, AHGHRP (서열번호 63) 또는 PIHDHDHPHLVIHSGMTCXXC (서열번호 64), β-갈락토시다제 등이 있다.
태그는, 적절할 경우, 융합 단백질을 분리 또는 정제하는데 이용할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 화합물 (i)은 전술한 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 화합물 (i)은 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 화합물 (i)은 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체와 상기한 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모어어티를 포함하는 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고; 더 바람직하게는, 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체와 세포 침투성 펩타이드 서열 간의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "핵산 분자"는 상호 호환적으로 임의 길이의 뉴클레오티드로 된 폴리머 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 이의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 임의의 공지된 또는 비-공지된 기능을 수행할 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는, 예를 들어, 단일 가닥, 이중 가닥 및 삼중 나선 분자, 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머 등을 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 천연 핵산 분자 외에도 변형된 핵산 분자를 포함할 수도 있다. 본원에서, mRNA는 세포에서 번역될 수 있는 RNA를 의미한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다.
mRNA는 화학적으로 합성하거나, 시험관내 전사에 의해 수득하거나, 또는 타겟 세포에서 생체내 합성할 수 있다. 본 발명의 접합체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 형성하는 뉴클레오티드 서열은 이의 발현을 위해 동일한 올바른 리딩 프래임으로 배치된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조합물의 구성성분 (i)은 서열번호 1의 서열로 구성되는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1에 대한 기능적으로 동등한 변이체로 구성되는 폴리펩타이드 또는 서열번호 4로 구성되는 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 조합물의 구성성분 (i)은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다.
본원에서, 용어 "벡터"는, 세포에서 서열의 전사 및 번역에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드가 제조되도록, 필수 서열을 포함하는 핵산 서열을 지칭한다. 이 서열은 대상 숙주 세포에서 자율적인 복제를 제공하는 부가적인 세그먼트에 작동가능하게 연결된다. 바람직하게는, 벡터는 발현 벡터이며, 이는 숙주 세포에서의 자율적인 복제 영역 외에도 본 발명의 핵산에 작동가능하게 연결된 영역을 포함하며; 본 발명에 따른 핵산의 산물의 발현을 강화할 수 있는, 벡터로서 정의된다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에 널리 공지된 기법을 이용해 수득할 수 있다.
벡터의 예로는, 비-제한적으로, 바이러스 벡터, naked DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합 물질 (condensing agent)과 조합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터 및 특정 진핵생물 세포, 예를 들어 생산자 세포 등이 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적합한 벡터는 원핵생물의 발현 벡터, 예를 들어, pUC18, pUC19, pBluescript 및 이의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCRl, RP4, 파지 및 "셔틀" 벡터, 예를 들어 pSA3 및 pAT28, 효모에서의 발현 벡터, 예를 들어, 2-micron 플라스미드 타입의 벡터, 통합 플라스미드, YEP 벡터, 센트로미어 플라스미드 및 유사체, 곤충 세포에서의 발현 벡터, 예를 들어 pAC 시리즈의 벡터 및 pVL 시리즈의 벡터, 식물에서의 발현 벡터, 예를 들어 pIBI 시리즈 벡터, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE 및 유사 벡터, 및 바이러스 벡터 (아데노바이러스, 아데노바이러스 및 레트로바이러스 부속 바이러스, 특히 렌티바이러스) 및 비-바이러스 벡터에 기초한 고등 진핵생물에서의 발현 벡터, 예를 들어 pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL, pKSV-10, pBPV-1, pML2d 및 pTDT1으로부터 유래되는 벡터이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 pEGFP 또는 pBabe 레트로바이러스 벡터 및 pTRIPZ 또는 pSLIK 렌티바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터에 포함된다.
본 발명의 벡터는 벡터에 의한 형질전환, 형질감염 또는 감염이 가능한 세포를 형질전환, 형질감염 또는 감염시키기 위해 이용할 수 있다. 이 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다.
벡터는, 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 서열에 작동가능하게 결합된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 조절 서열은 핵 프로모터일 수 있으며, 또는 다른 예로 이종의 핵산 서열의 발현을 증가시키는 인핸서 서열 및/또는 기타 조절 서열일 수 있다. 원칙적으로, 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 세포에 적합한 한, 임의 프로모터가 본 발명에 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명을 구현하는데 적합한 프로모터로는 구성적인 프로모터, 예를 들어, 진핵생물 바이러스 게놈의 유도체, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, SV40, CMV, 조류 육종 바이러스, B형 간염 바이러스, 메탈로티오네인 유전자 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나제 유전자 프로모터, 레트로바이러스의 LTR 영역, 면역글로불린 유전자의 프로모터, 액틴 유전자의 프로모터, EF-1α 유전자의 프로모터뿐만 아니라 단백질 발현이 분자 또는 외인성 신호의 부가에 따라 단백질 발현이 결정되는 유도성 프로모터, 예를 들어 테트라사이클린 시스템, NFκB/UV 광 시스템, Cre/Lox 시스템 및 열 충격 유전자 프로모터, WO/2006/135436에 기술된 조절성 RNA 중합효소 II 프로모터 및 조직-특이 프로모터 등이 있지만, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
다른 구현예에서, 본 발명의 조합물의 구성성분 (i)은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 본 발명의 접합체, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 본 발명의 융합 단백질을 배지로 분비할 수 있는 세포이다.
본 발명의 폴리펩타이드를 분비할 수 있는 적절한 세포로는, 비-제한적으로, 심근세포, 지방세포, 내피 세포, 상피 세포, 림프구 (B 세포 및 T 세포), 비만세포, 호산구, 혈관 내막 세포, 여러가지 장기로부터 단리된 세포의 1차 배양물, 바람직하게는 랑게르한스섬으로부터 단리된 세포의 1차 배양물, 간세포, 단핵 백혈구를 포함한 백혈구, 간엽, 탯줄 또는 성체 (피부, 폐, 신장 및 간의), 파골세포, 연골 세포 및 기타 결합 조직 세포 등이 있다. Jurkat T 세포, NIH-3T3, CHO, Cos, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 세포, C2C12 근모세포 및 W138 세포와 같이 확립된 세포주 역시 적합하다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 세포가 환자에서 더욱 유용하도록 본 발명의 폴리펩타이드를 배지로 분비할 수 있는 세포가 미세입자 또는 미세캡슐로서 형성될 수 있음을 알 것이다. 본 발명의 미세입자 대상을 형성하는데 적합한 물질로는 세포의 지지체로서 작용하며 치료학적 제품의 계속적인 분비를 허용하는 임의의 생체적합한 폴리머 물질을 포함한다. 즉, 이러한 생체적합한 폴리머 물질은, 예를 들어, 열가소성 폴리머 또는 수소 폴리머일 수 있다. 특히 열가소성 폴리머로서, 아크릴산, 아크릴아미드, 2-아미노에틸 메타크릴레이트, 폴리(테트라플루오로에틸렌-코헥사플루오르프로필렌), 메타크릴-(7-쿠마르옥시) 에틸 에스테르 산, N-이소프로필 아크릴아미드, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, 폴리아미도아민, 폴리(아미노)-p-크실릴렌, 폴리(클로로에틸비닐에테르), 폴리카프로락톤, 폴리(카프로락톤-co-트리메틸렌 카보네이트), 폴리(카보네이트 우레아) 우레탄, 폴리(카보네이트) 우레탄, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 및 아크릴아미드 코폴리머, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(4-하이드록시부틸 아크릴레이트), 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트), 폴리(N-2-하이드록시프로필 메타크릴레이트), 폴리(락틱 글리콜산), 폴리(L-락트산), 폴리(γ-메틸, L글루타메이트), 폴리(메틸메타크릴레이트), 폴리(프로필렌 푸마레이트), 폴리(프로필렌 옥사이드), 폴리피롤, 폴리스티렌, 폴리(테트라플루오로에틸렌), 폴리우레탄, 폴리비닐 알코올, 초고분자량의 폴리에틸렌, 6-(p-비닐벤즈아미드)-헥산산 N-비닐벤질-D-말톤아미드 및 이들 폴리머 2종 이상을 함유한 코폴리머를 들 수 있다. 하이드로겔 타입의 폴리머로서 알기네이트, 아가로스, 콜라겐, 전분, 히알루론산, 소 혈청 알부민, 셀룰로스 및 이의 유도체, 펙틴, 콘드로이틴 설페이트, 피브린 및 피브로인과 같은 천연 물질뿐 아니라 Sepharose® 및 Sephadex®과 같은 합성 하이드로겔을 들 수 있다.
본 발명의 조합물의 화합물 (ii)는 면역항암제이다.
본원에서, 용어 "면역항암제"는 개체에서 면역 반응을 강화, 자극 및/또는 상향 조절하는데 효과적인 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 면역항암제를 본 발명의 조합물의 화합물 (i)과 함께 투여하면 암 치료에 상승적인 효과가 구현된다.
면역항암제는, 예를 들어, 소분자 약물, 항체 또는 생물학적 소분자일 수 있다. 생물학적 면역항암제에 대한 예로는, 비-제한적으로, 암 백신, 항체 및 사이토카인 등이 있다. 일부 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 구현예에서, 단일클론 항체는 인간화된 것이거나 또는 인간 항체이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 사이토카인이다.
"사이토카인"은 면역 반응을 조절하기 위한 목적으로 면역 시스템의 세포에 의해 합성되는 다양한 크기 및 분자량을 가진 펩타이드로서 이해되며, 이는 호르몬, 성장인자, 괴사 인자, 케모카인 등일 수 있다. 이는 천연 기원이거나 또는 재조합 세포 배양물로부터 유래할 수 있으며, 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물일 수 있다. 사이토카인의 예는, IL-6, IL-10, TGF-β, VEGF 및 기타 면역억제 사이토카인과 같이 T 세포 활성화를 저해하는 사이토카인; 또는 면역 반응을 자극하기 위해 T 세포 활성화를 자극하는 사이토카인일 수 있다. 사이토카인과 항체의 접합이 면역사이토카인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 재조합 인간 인터루킨 15 (rhIL-15), 재조합 인간 인터루킨 12 (rhIL-12), 예를 들어 NM-IL-12 (Neumedicines, Inc.) 또는 헤테로다이머 IL-15 (hetIL-15, Novartis/Admune), 용해성 IL-15 결합 단백질 IL-15 수용체 α 체인과 복합체를 형성한 내인성 IL-15의 합성 형태로 구성되는 융합 복합체 (IL15:sIL-15RA)이다.
다른 구현예에서, 사이토카인은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, II, 10, ILI I, IL13, IL 14, IL16, IL 17, IL 18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, 11,31, 1L32, IL33, 11,35, IL36, GM-CSF, IFN-γ, IL-1 α/IL-lFl, IL-1 β/IL-lF2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL- 17/1L-17A, IL-17A/F 헤테로다이머, IL-17F, IL-18/IL-1F4, 1L-23, IL-24, IL-32, TL-32 β, IL-32 γ, iL-33, LAP (TGF-β 1), 림포톡신-α/TNF-β, TGF-β, TNF-α, TRANCE/TNFSFl l/RANK L 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 면역항암제는 사이토카인이 아니다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 사이토카인은 본 발명의 범위에서 제외된다. 바람직하게는, 본 발명에서 제외되는 사이토카인은 TNF 인자 α, INF-γ, GM-GSF 인자 및 IL-2이다.
다른 바람직한 구현예에서, 사이토카인은, 조합물의 구성성분 (i)이 구성성분 (i)(a) 또는 (i)(b)일 경우에만, 본 발명의 범위에서 제외된다. 따라서, 일 구현예에서, 조합물의 구성성분 (i)이 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체이거나 또는 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체와 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모어어티를 포함하는 접합체일 경우, 면역항암제는 사이토카인이 아니며, 바람직하게는 TNF 인자 α, INF-γ, GM-GSF 인자 및 IL-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인이 아니다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 (i) 자극성 (공동-자극성 포함) 수용체의 작용제이거나 또는 (ii) T 세포에 대한 저해성 (공동-저해성 포함) 신호의 길항제이며, 이 둘다 항원-특이적인 T 세포 반응을 증폭시킨다.
특정 자극성 분자 및 저해성 분자는 면역글로불린 슈퍼 패밀리 (IgSF)의 구성원이다. 공동-자극성 또는 공동-저해성 수용체에 결합하는 막-결합형 리간드의 중요한 한가지 패밀리는 B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA) 및 B7-H6를 포함하는 B7 패밀리이다.
공동-자극성 또는 공동-저해성 수용체에 결합하는 막 결합형 리간드의 다른 패밀리는, CD40 및 CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137 (4-1BB), TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTβR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, 림포톡신 α/TNFβ, TNFR2, TNFα, LTβR, 림포톡신 α1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, NGFR을 포함하는, 동족 TNF 수용체 패밀리 구성원에 결합하는 분자들로 된 TNF 패밀리이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물 (i)과 면역항암제의 조합물은 T 세포 반응을 자극할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역항암제는, (i) T 세포 활성화를 저해하는 단백질의 길항제 (예를 들어, 면역 체크포인트 저해제), 예를 들어 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, 갈렉틴 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectin-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1 및 TIM-4이거나; 또는 (ii) T 세포 활성화를 자극하는 단백질의 작용제, 예를 들어 B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, CD40, DR3 및 CD28H이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 NK 세포 상의 저해성 수용체에 대한 길항제이거나 또는 NK 세포 상의 활성화 수용체에 대한 작용제이다. 일부 구현예에서, 면역항암제는 릴리루맵 (lirilumab)과 같은 KIR의 길항제이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 대식세포 또는 단핵구를 저해 또는 고갈시키는 물질, 비-제한적인 예로, RG7155 (WO11/70024, WO11/107553, WO11/131407, WO13/87699, WO13/119716, WO13/132044) 또는 FPA-008 (WO11/140249; WO13169264; WO14/036357)을 비롯한 CSF-1R 길항제 항체 등의 CSF-1R 길항제이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 양성의 공동-자극성 수용체를 라이게이션하는 작용제성 물질, 저해성 수용체를 통한 신호전달을 약화시키는 차단성 물질, 길항제, 및 항-종양 T 세포의 빈도를 전신 증가시키는 하나 이상의 물질, 종양 미세 환경에서 각각의 면역 억제성 경로를 극복하는 (예, 저해성 수용체의 결합 차단 (예, PD-L1/PD-1 상호작용), Treg를 고갈시키거나 또는 저해 (예, 항-CD25 단일클론 항체 (예를 들어, 다클리주맵 (daclizumab)를 이용하거나 또는 생체외 항-CD25 비드 고갈에 의해), IDO와 같은 대사 효소를 저해하거나 또는 T 세포 에너지 또는 소진을 반전/방지하는) 물질, 및 종양 부위에서 선천적인 면역 활성화 및/또는 염증을 촉발시키는 물질로부터 선택된다.
본원에서, 용어 "세포독성 T-림프구-관련 단백질 4" ("CTLA-4"로 약칭됨, 또한 분화 클러스터 152 (CD152)로도 알려짐)는, 면역 체크포인트로서 기능하는 단백질 수용체를 지칭한다. CTLA-4는 활성화된 T 세포에 의해 발현되며 T 세포에 저해성 신호를 전달하는 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 구성원이다. CTLA-4는 T 세포 공동-자극성 단백질, CD28에 상동적이며, 이들 분자 둘다 항원-제시 세포 상에서 각각 B7-1 및 B7-2로도 지칭되는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA-4는 CD28보다 더 높은 친화성 및 항원항체 결합성 (avidity)으로 CD80 및 CD86에 결합하며, 따라서 이의 리간드에 대해 CD28보다 경쟁에서 더 우수하다. CTLA-4는 T 세포에 저해 신호를 전달하는 반면, CD28은 자극성 신호를 전달한다. CTLA-4는 또한 조절성 T 세포 (Treg)에서도 발견되며, 이의 저해 기능에 기여한다. T 세포 수용체 및 CD28을 통한 T 세포 활성화는 CTLA-4의 발현 증가로 이어진다. CTLA-4 단백질은 인간 CTLA-4 유전자 (Ensembl ref: ENSG00000163599)에 의해 코딩된다. 정상적으로, CTLA-4는 T 세포 활성화 후, 원형질막 상에서 상향 조절되며, 여기서 이의 리간드 B7에 대해 CD28과 경쟁에서 우선함으로써 공동-자극을 방지하고 또한 T 세포 주기 정지를 유도하는 것을 비롯한 다양한 기전을 통해 T 세포 기능을 하향 조절하는 기능을 수행한다 (Postow et al (2015) J. Clinical oncology, Vol. 33, pages 1974-1983; Pardoll, D. et al (2012), Nature Reviews Cancer 12, 252-264).
일부 구현예에서, 면역항암제는 CTLA-4 길항제이다. 본원에서, 용어 "CTLA-4　길항제"는 비-제한적으로 리간드 B7-1 및/또는 B7-2와의 CTLA-4의 결합을 차단하는 임의의 화학적 화합물 또는 물질 또는 생물학적 분자를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 개체 (예, 인간 개체)를 CTLA-4 길항제 (예, CTLA-4 항체)로 치료하는 경우에, CTLA-4 길항제가 (인간) B7-1 및/또는 B7-2에의 (인간) CTLA-4의 결합을 차단하는 것으로, 이해된다.
현재 암 치료에서 임상 사용이 고려되는 CTLA-4 길항제 화합물에 대한 비-제한적인 예로는 CTLA-4에 대한 길항성 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, CTLA-4 길항제는 길항성 CTLA-4 항체이다. 일부 구현예에서, 길항성 CTLA-4 항체는 YERVOY (이필리무맵 (ipilimumab)) 또는 트레멜리무맵 (tremelimumab)이다.
CTLA-4 길항제에 대한 또 다른 비-제한적인 예는 CTLA-4에 특이적으로 결합하여 B7-1 및/또는 B7-2에의 결합을 차단할 수 있는 화합물인 이뮤노어드헤신 (immunoadhesins)(융합 단백질으로도 알려짐)이다.
본원에서, 용어 "프로그래밍화된 사멸-1 (PD-1)" 수용체는 CD28 패밀리에 속하는 면역-저해성 수용체를 지칭한다. 인간에서, PD-1은 PDCD1 유전자에 의해 코딩된다. PD-1은 생체내에서 기존에 활성화된 T 세포 상에 주로 발현되며, 2가지 리간드 PD-L1 및 PD-L2가 결합한다. 본원에서, 용어 "PD-1"은 인간 PD-1 (hPD-1), hPD-1의 변이체, 이소형 및 종 상동체, 및 hPD-1와 하나 이상의 공통 에피토프를 가진 유사체를 포함한다. 완전 hPD-1 서열은 GENBANK 등재번호 U64863에서 발견할 수 있다. PD-1은 활성화된 T 세포 (작동자 T 세포 등), B 세포, 골수 세포, 흉선세포 및 자연 살상 (NK) 세포와 같은 면역 세포 상에서 발현된다 (Suya Dai et al., (2014) Cellular Immunology, Vol:290, pages 72-79; Gianchecchi et al., (2013), Autoimmun. Rev. 12 1091-1 100).
일부 구현예에서, 면역항암제는 PD-1 길항제이다. 본원에서, 용어 "PD-1 길항제"는 비-제한적으로 암 세포 상에서 발현된 PD-L1이 면역 세포 (T 세포, B 세포 및/또는 NK 세포) 상에서 발현된 PD-1에 결합하는 것을 차단하거나, 및/또는 암 세포 상에 발현된 PD-L2가 면역-세포 발현된 PD-1에의 결합을 차단하는, 임의의 화학적 화합물 또는 물질 또는 생물학적 분자 (예, 항체)를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 개체 (예를 들어, 인간 개체)가 PD-1 길항제 (예를 들어, PD-1 항체)로 치료 중인 경우에, PD-1 길항제가 (인간) PD-L1의 (인간) PD-1에의 결합을 차단하거나, 또는 (인간) PD-L2의 (인간) PD-1에의 결합을 차단하고, 바람직하게는 (인간) PD-L1 및 PD-L2 둘다의 (인간) PD-1에의 결합을 차단하는 것으로 이해된다. 인간 PD-1 아미노산 서열은 NCBI Locus No.: NP_005009에서 확인할 수 있다. 인간 PD-L1 및 PD-L2 아미노산 서열은 NCBI Locus No.: NP_054862 및 NP_079515에서 각각 확인할 수 있다.
PD-1 길항제에 대한 비-제한적인 예는 PD-1에 대한 항체 (PD-1 항체 또는 항-PD-1 항체로도 지칭됨), 예를 들어 PD-1 단일클론 항체 (mAb), 또는 PD-1에 특이적으로 결합하는, 바람직하게는 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는, 이의 항원 결합 단편이다. mAb는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있으며, 인간 불변부를 함유할 수 있다. PD-1 길항제에 대한 비-제한적인 예로는 PD-1 항체, 예컨대 니볼루맵 (nivolumab)(Opdivo(R), Bristol-Myers Squibb), 펨브롤리주맵 (Keytruda(R), Merck), BGB-A317, 및 PDR001 (Novartis)과 같은 기타 물질들이 있다. PD-1 길항제에 대한 또 다른 비-제한적인 예로는 피딜리주맵 (pidilizumab)(Cure Tech), AMP-224 (GlaxoSmithKline), AMP-514 (GlaxoSmithKline), PDR001 (Novartis) 및 세미플리맵 (cemiplimab)(Regeneron and Sanofi) 등이 있다. 추가적인 PD-1 길항제는 또한 US8008449, US7521051 및 US8354509에 기술된 임의의 항-PD-1 항체를 포함한다.
PD-1 길항제에 대한 다른 비-제한적인 예로는, PD-1에 특이적으로 결합하여 PD-L1의 결합을 차단할 수 있는 화합물인, 이뮤노어드헤신 (융합 단백질로도 알려짐)을 포함한다. PD-1에 특이적으로 결합하는 이뮤노어드헤신 분자에 대한 예는 W02010/027827, US2016/0304969 및 WO2011/066342에 기술되어 있다. 예를 들어, 본 발명에서 PD-1 길항제로서 이용할 수 있는 융합 단백질에 대한 비-제한적인 예는 AMP-224이다 (이것은 PD-1 리간드 프로그래밍화된 세포 사멸 리간드 2 (PD-L2, B7-DC)의 세포외 도메인 및 인간 면역글로불린 (Ig) G1의 Fc 영역으로 구성된 재조합 B7-DC Fc-융합 단백질임).
본원에서, 용어 "항체" (예, PD-1 항체 및 CTLA-4 항체)는 요망하는 생물학적 또는 결합 활성을 나타내는 (예를 들어, 전술한 바와 같이, PD-1의 이의 리간드에의 결합을 차단하거나 또는 CTLA-4의 이의 리간드에의 결합을 차단하는), 임의의 항체 형태 및 이의 단편(들)을 지칭한다. 따라서, 이는 가장 넒은 의미로 사용되고 구체적으로 포괄하지만, 비-제한적으로, 단일클론 항체 (전장 단일클론 항체 포함) 및 이의 단편, 다클론 항체 및 이의 단편, 다중 특이성 항체 (예를 들어, 이중 특이성 항체) 및 이의 단편, 인간화된, 완전한 인간 항체 및 이의 단편, 키메라 항체 및 이의 단편, 및 카멜화 단일 도메인 항체, 및 이의 단편이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 프로그래밍화된 사멸-1 (PD-1) 수용체에 특이적으로 결합하여 PD-1 활성을 저해하는 항체 또는 이의 항원-결합성 영역이다. 일부 구현예에서, PD-1 길항제는 길항성 PD-1 항체이다. 일부 구현예에서, 길항성 PD-1 항체는 OPDIVO (니볼루맵 (nivolumab)), KEYTRUDA (펨브롤리주맵) 또는 MEDI-0680 (AMP-514; WO2012/145493)이다. 일부 구현예에서, 면역항암제는 피딜리주맵 (CT-011)일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역항암제는 AMP-224로 지칭되는 IgG1의 Fc 영역에 융합된 PD-L2 (B7-DC)의 세포외 도메인으로 구성된 재조합 단백질이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 PD-L1 길항제이다. 일부 구현예에서, PD-L1 길항제는 길항성 PD-L1 항체이다. 일부 구현예에서, PD-L1 항체는 MPDL3280A (RG7446; WO2010/077634), 두르발루맵 (durvalumab)(MEDI4736), BMS-936559 (WO2007/005874) 및 MSB0010718C (WO2013/79174)이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 LAG-3 길항제이다. 일부 구현예에서, LAG-3 길항제는 길항성 LAG-3 항체이다. 일부 구현예에서, LAG3 항체는 BMS-986016 (WO10/19570, WO14/08218) 또는 IMP-731 또는 IMP-321 (WO08/132601, WO009/44273)이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 CD137 (4-1BB) 작용제이다. 일부 구현예에서, CD137 (4-1BB) 작용제는 작용제성 CD137 항체이다. 일부 구현예에서, CD137 항체는 우렐루맵 (urelumab) 또는 PF-05082566 (WO12/32433)이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 GITR 작용제이다. 일부 구현예에서, GITR 작용제는 작용제성 GITR 항체이다. 일부 구현예에서, GITR 항체는 BMS-986153, BMS-986156, TRX-518 (WO006/105021, WO009/009116) 또는 MK-4166 (WO11/028683)이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 인돌아민 (2,3)-다이옥시게나제 (IDO) 길항제이다. 일부 구현예에서, IDO 길항제는 에파카도스타트 (epacadostat)(INCB024360, Incyte); 인독시모드 (indoximod)(NLG-8189, NewLink Genetics Corporation); 캅마니팁 (capmanitib)(INC280, Novartis); GDC-0919 (Genentech/Roche); PF-06840003 (Pfizer); BMS:F001287 (Bristol-Myers Squibb); Phy906/KD108 (Phytoceutica); 키누레닌 (kynurenine)을 분해하는 효소 (Kynase, Kyn Therapeutics); 및 NLG-919 (WO09/73620, WO009/1156652, WO11/56652, WO12/142237)부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 OX40 작용제이다. 일부 구현예에서, OX40 작용제는 작용제성 OX40 항체이다. 일부 구현예에서, OX40 항체는 MEDI-6383 또는 MEDI-6469이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 OX40L 길항제이다. 일부 구현예에서, OX40L 길항제는 길항성 OX40L 항체이다. 일부 구현예에서, OX40L 길항제는 RG-7888 (WO06/029879)이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 CD40 작용제이다. 일부 구현예에서, CD40 작용제는 작용제성 CD40 항체이다. 일부 구현예에서, 면역항암제는 CD40 길항제이다. 일부 구현예에서, CD40 길항제는 길항성 CD40 항체이다. 일부 구현예에서, CD40 항체는 루카투무맵 (lucatumumab) 또는 다세투주맵 (dacetuzumab)이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 CD27 작용제이다. 일부 구현예에서, CD27 작용제는 작용제성 CD27 항체이다. 일부 구현예에서, CD27 항체는 바를리루맵 (varlilumab)이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 (B7H3에 대한) MGA271 (WO11/109400)이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 아바고보맵 (abagovomab), 아데카투무맵 (adecatumumab), 아푸투주맵 (afutuzumab), 알렘투주맵 (alemtuzumab), 아나투모맵 (anatumomab) 마페나톡스 (mafenatox), 아폴리주맵 (apolizumab), 아테졸리맵 (atezolimab), 아벨루맵 (avelumab), 블리나투모맵 (blinatumomab), BMS-936559, 카투막소맵 (catumaxomab), 두르발루맵 (durvalumab), 에파카도스타트 (epacadostat), 에프라투주맵 (epratuzumab), 인독시모드 (indoximod), 이노투주맵 (inotuzumab) 오조가미신 (ozogamicin), 인텔루무맵 (intelumumab), 이필리무맵 (ipilimumab), 이사투시맵 (isatuximab), 람브롤리주맵 (lambrolizumab), MED14736, MPDL3280A, 니볼루맵 (nivolumab), 오비누투주맵 (obinutuzumab), 오카라투주맵 (ocaratuzumab), 오파투무맵 (ofatumumab), 올라타투맵 (olatatumab), 펨브롤리주맵 (pembrolizumab), 피딜리주맵 (pidilizumab), 리툭시맵 (rituximab), 티실리무맵 (ticilimumab), 사말리주맵 (samalizumab) 또는 트레멜리무맵 (tremelimumab)이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 면역자극성 물질이다. 예를 들어, PD-1 및 PD-L1 저해 축을 차단하는 항체는 활성화된 종양-반응성 T 세포를 촉발시킬 수 있으며, 임상 실험에서 통상적으로 면역요법에 민감성인 것으로 간주되지 않는 일부 종양을 비롯한 종양 조직의 개수를 증가시키는데 항구적인 항-종양 반응을 유도하는 것으로 입증된 바 있다. 항-PD-1 항체 니볼루맵 (Opdivo®, Bristol-Myers Squibb, ONO-4538, MDX1106 및 BMS-936558로도 알려짐)은 항-혈관신생 요법 중에 또는 이후에 질환 진행을 경험한 RCC 환자에서 전체 생존성을 개선할 가능성이 있는 것으로 입증된 바 있다.
일부 구현예에서, 면역조절 치료제는 종양 세포의 세포자살을 특이적으로 유도한다. 본 발명에서 이용가능할 수 있는 승인된 면역조절 치료제로는 포말리도미드 (pomalidomide)(Pomalyst®, Celgene); 레날리도미드 (lenalidomide)(Revlimid®, Celgene); 인게놀 메부테이트 (ingenol mebutate)(Picato®, LEO Pharma) 등이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 암 백신이다. 일부 구현예에서, 암 백신은 시풀레우셀-T (sipuleucel-T)(Provenge®, Dendreon/Valeant Pharmaceuticals) 및 탈리모겐 라헤르파레프벡 (talimogene laherparepvec)(Imlygic®, BioVex/Amgen, 종래에 T-VEC로 알려져 있음)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 면역항암제는 펙사스티모겐 데박시레프벡 (pexastimogene devacirepvec)(PexaVec/JX-594, SillaJen/종래에 Jennerex Biotherapeutics), 펠라레오렙 (pelareorep)(Reolysin®, Oncolytics Biotech), 에나데노투시레브 (enadenotucirev)(NG-348, PsiOxus, 기존에 ColoAd1으로 공지됨), ONCOS-102 (Targovax/종래에 Oncos), β-갈락토시다제 (β-gal)/β-글루코로니다제 및/또는 β-gal/인간 소듐 아이오다이드 심포터 (hNIS), 예를 들어 GL-ONC1 (GLV-1h68/GLV-1h153, Genelux GmbH)을 발현하도록 조작된 백시니아 바이러스 및 CG0070 (Cold Genesys)과 같이 GM-CSF를 발현하도록 조작된 아데노바이러스와 같이, 암살상 바이러스 요법으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 JX-929 (SillaJen/formerly Jennerex Biotherapeutics), TG01 및 TG02 (Targovax/formerly Oncos), TILT-123 (TILT Biotherapeutics) 및 VSV-GP (ViraTherapeutics)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 키메라 항원 수용체 또는 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포이다. 이러한 항원 수용체를 발현하도록 조작된 T 세포는 CAR-T 세포로 지칭된다. CAR은, 천연 리간드로부터 유래할 수 있는 결합성 도메인, T 세포 수용체 (TCR)의 기능적인 말단인 엔도도메인에 융합된 세포-표면 항원에 특이적인 단일클론 항체로부터 유래되는 단쇄 가변성 단편 (scFv), 예를 들어 T 림프구에서 활성화 신호를 발생시킬 수 있는, TCR 유래 CD3-제타 신호전달 도메인으로 구성되는 것으로, 구성된다. 이러한 CAR은, 항원 결합시, 작동자 세포에서 내인성 신호전달 경로와 연결되어, TCR 복합체에 의해 개시되는 신호와 비슷한 활성화 신호를 발생시킨다.
예를 들어, 일부 구현예에서, CAR-T 세포는, T 세포 항원 수용체 복합체 제타 체인 (예, CD3 zeta)의 세포내 신호전달 도메인과 융합된, 항원 결합성 도메인 (예, CD19에 결합하는 도메인)을 가진 세포외 도메인을 포함하도록 조작된 CAR-T 세포를 개시한, 미국 특허 8,906,682 (June; 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 언급된 것이다. CAR이 T 세포에서 발현되면, 항원 결합 특이성에 기반하여 항원 재인지를 재지시할 수 있다. CD19의 경우, 항원은 악성 B 세포 상에서 발현된다. 광범위한 적응증들에서 CAR-T를 이용하는 200건 이상의 임상 실험들이 현재 진행 중에 있다 [https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=chimeric+antigen+receptors&pg=1].
일부 구현예에서, 면역자극제는 레티노익산 수용체-관련 오르판 수용체 γ (RORγt)의 활성자이다. RORγt는 타입 17 작동자 서브세트 CD4+ (Th17) 및 CD8+ (Tc17) T 세포의 분화 및 유지뿐 아니라 NK 세포와 같이 IL-17을 발현하는 선천적인 면역 세포 하위 집단의 분화에 중요한 역할을 하는, 전사 인자이다. 일부 구현예에서, RORγt의 활성자는 고형 종양의 치료에 대해 현재 임상 실험 (NCT02929862) 중인 LYC-55716 (Lycera)이다.
일부 구현예에서, 면역자극제는 toll-유사 수용체 (TLR)의 작용제 또는 활성자이다. TLR의 적합한 활성자로는 SD-101 (Dynavax)과 같은 TLR9의 작용제 또는 활성자를 포함한다. 본 발명에서 이용가능할 수 있는 TLR8의 작용제 또는 활성자로는 모톨리모드 (motolimod)(VTX-2337, VentiRx Pharmaceuticals)를 포함한다.
본 발명에서 이용가능할 수 있는 또 다른 면역항암제로는 우렐루맵 (urelumab)(BMS-663513, Bristol-Myers Squibb), 즉, 항-CD137 단일클론 항체; 바를릴루맵 (varlilumab)(CDX-1127, Celldex Therapeutics), 즉 항-CD27 단일클론 항체; BMS-986178 (Bristol-Myers Squibb), 즉 항-OX40 단일클론 항체; 릴리루맵 (IPH2102/BMS-986015, Innate Pharma, Bristol-Myers Squibb), 즉 항-KIR 단일클론 항체; 모날리주맵 (monalizumab)(IPH2201, Innate Pharma, AstraZeneca), 즉 항-NKG2A 단일클론 항체; 안데칼릭시맵 (andecaliximab)(GS-5745, Gilead Sciences), 즉 항-MMP9 항체; MK-4166 (Merck & Co.), 즉 항-GITR 단일클론 항체 등이 있다.
일부 구현예에서, 면역자극제는 엘로투주맵 (elotuzumab), 미파무르티드 (mifamurtide), Toll-유사 수용체의 작용제 또는 활성자 및 RORγt의 활성자로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 Jerry L. Adams et al., "Big opportunities for small molecules in immuno-oncology," Cancer Therapy 2015, Vol. 14, pages 603-622에 기술된 것들로부터 선택되며, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 구현예에서, 면역항암제는 Jerry L. Adams et al.의 표 1에 기술된 예들로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 면역항암제는 Jerry L. Adams et al.의 표 2에 열거된 것으로부터 선택되는 면역-암 타겟을 타겟팅하는 소분자이다. 일부 구현예에서, 면역항암제는 Jerry L. Adams et al.의 표 2에 열거된 것으로부터 선택되는 소분자이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 Peter L. Toogood, "Small molecule immuno-oncology therapeutic agents," Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2018, Vol. 28, pages 319-329에 언급된 소 분자 면역항암제들로부터 선택되며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 구현예에서, 면역항암제는 Peter L. Toogood에 기술된 바와 같이 경로를 타겟팅하는 물질이다.
일부 구현예에서, 면역항암제는 Sandra L. Ross et al., "Bispecific T cell engager (BiTE®) antibody constructs can mediate bystander tumor cell killing", PLoS ONE 12(8): e0183390에 기술된 것들로부터 선택되며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 구현예에서, 면역항암제는 2중 특이성 T 세포 인게이저 (engager)(BiTE®) 항체 구조체이다. 일부 구현예에서, 2중 특이성 T 세포 인게이저 (BiTE®) 항체 구조체는 CD19/CD3 2중 특이성 항체 구조체이다. 일부 구현예에서, 2중 특이성 T 세포 인게이저 (BiTE®) 항체 구조체는 EGFR/CD3 2중 특이성 항체 구조체이다. 일부 구현예에서, 2중 특이성 T 세포 인게이저 (BiTE®) 항체 구조체는 T 세포를 활성화한다. 일부 구현예에서, 2중 특이성 T 세포 인게이저 (BiTE®) 항체 구조체는 방관자 세포 상의 세포내 부착 분자 1 (ICAM-1)과 FAS의 상향 조절을 유도하는 사이토카인을 분비하는 T 세포를 활성화한다. 일부 구현예에서, 2중 특이성 T 세포 인게이저 (BiTE®) 항체 구조체는 T 세포를 활성화하여, 방관자 세포의 세포용해가 유도된다. 일부 구현예에서, 방관자 세포는 고형 종양 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 세포용해 중인 방관자 세포는 BiTE®-활성화된 T 세포에 인접하게 위치한다. 일부 구현예에서, 방관자 세포는 종양-관련 항원 (TAA) 음성 암 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 방관자 세포는 EGFR-음성 암 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역항암제는 PD-L1/PD1 축 및/또는 CTLA4를 차단하는 항체이다. 일부 구현예에서, 면역항암제는 생체외 증폭된 종양-침윤성 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역항암제는 T 세포를 종양-관련 표면 항원 (TAA)과 직접 연결하는 2중 특이성 항체 구조체 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 조합물의 면역항암제는 T 세포 활성화를 저해하는 단백질의 길항제 또는 면역 체크포인트 저해제이다.
본원에서, 용어 "체크포인트 저해제"는 암 세포가 환자의 면역 시스템을 피하지 않게 방지하는데 유용한 물질을 지칭한다. 항-종양 면역성을 파괴하는 주요 기전들 중 하나는 "T 세포 소진 (T-cell exhaustion)"이라고 하며, 이는 저해성 수용체의 상향 조절을 유도하는 항원에 만성적으로 노출되어 발생한다. 이들 저해성 수용체는 통제되지 않은 면역 반응을 방지하기 위해 면역 체크포인트로서 작용한다.
PD-1 및 공동-저해성 수용체, 예를 들어 세포독성 T-림프구 항원 4 (CTLA-4, B 및 T 림프구 약독화제 (Attenuator)(BTLA; CD272), T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인-3 (Tim-3), 림프구 활성화 유전자-3 (Lag-3; CD223) 및 기타 등은 종종 체크포인트 제어제 (checkpoint regulator)로도 언급된다. 이는, 세포외 정보가 세포 주기 진행 및 기타 세포내 신호전달 과정을 진행하여야 하는지의 여부를 지시할 수 있는 "게이트키퍼" 분자로서 작용한다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1에 대한 항체이다. PD-1은 프로그래밍화된 세포 사멸 1 수용체 (PD-1)에 결합하여 수용체가 저해성 리간드 PDL-1에 결합하지 못하도록 방지하며, 따라서 종양이 숙주 항-종양 면역 반응을 억제하는 능력을 무력화한다.
일 측면에서, 체크포인트 저해제는 생물학적 치료제 또는 소분자이다. 다른 측면에서, 체크포인트 저해제는 단일클론 항체, 인간화 항체, 완전한 인간 항체, 융합 단백질 또는 이들의 조합이다. 다른 측면에서, 체크포인트 저해제는 CTLA-4, PDLl, PDL2, PDl, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, B-7 패밀리 리간드 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 체크포인트 단백질을 저해한다. 부가적인 측면에서, 체크포인트 저해제는 CTLA-4, PDLl, PDL2, PDl, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, B-7 패밀리 리간드 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 체크포인트 단백질의 리간드와 상호작용한다. 일 측면에서, 체크포인트 저해제는 면역자극제, T 세포 성장인자, 인터루킨, 항체, 백신 또는 이들의 조합이다. 다른 측면에서, 인터루킨은 IL-7 또는 IL-15이다. 특정 측면에서, 인터루킨은 당화된 IL-7이다. 부가적인 측면에서, 백신은 수지상 세포 (DC) 백신이다.
체크포인트 저해제는 통계학적으로 유의한 방식으로 면역 시스템의 저해성 경로를 차단 또는 저해하는 임의의 물질을 포함한다. 이러한 저해제는 소분자 저해제를 포함하거나, 또는 면역 체크포인트 수용체에 결합하여 이를 차단 또는 저해하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 면역 체크포인트 수용체 리간드에 결합하여 이를 차단 또는 저해하는 항체를 포함할 수 있다. 차단 또는 저해하기 위해 타겟팅할 수 있는 예시적인 체크포인트 분자로는, 비-제한적으로, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, LAG3, TIM3, VISTA, KIR, 2B4 (CD2 패밀리 분자에 속하며, 모든 NK, γδ, 및 기억 CD8+　(αβ) T 세포 상에서 발현됨), CD160 (BY55로도 언급됨), CGEN-15049, CHK 1 및 CHK2 키나제, A2aR, 및 다양한 B7 패밀리 리간드 등이 있다. B7 패밀리 리간드로는, 비-제한적으로, B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 및 B7-H7 등이 있다. 체크포인트 저해제로는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD 160 및 CGEN-15049 중 하나 이상에 결합하여 그 활성을 차단 또는 저해하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 기타 결합 단백질, 생물학적 치료제 또는 소분자 등이 있다. 예시적인 면역 체크포인트 저해제로는 트레멜리무맵 (Tremelimumab)(CTLA-4 차단성 항체), anti-OX40, PD-L1 단일클론 항체 (Anti-B7-Hl; MEDI4736), MK-3475 (PD-1 차단제), 니볼루맵 (Nivolumab)(anti-PDl 항체), CT-011 (anti-PDl 항체), BY55 단일클론 항체, AMP224 (anti-PDLl 항체), BMS- 936559 (anti-PDLl 항체), MPLDL3280A (anti-PDLl 항체), MSB0010718C (anti-PDLl 항체) 및 이필리무맵 (ipilimumab)(anti-CTLA-4 체크포인트 저해제) 등이 있다. 체크포인트 단백질 리간드로는, 비-제한적으로 PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, CD28, CD86 및 TIM-3 등이 있다.
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1 길항제, PD-L1 길항제 및 CTLA-4 길항제로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 체크포인트 저해제는 니볼루맵 (nivolumab)(Opdivo®), 이필리무맵 (ipilimumab)(Yervoy®) 및 펨브롤리주맵 (Keytruda®)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 체크포인트 저해제는 니볼루맵 (anti-PD-1 항체, Opdivo®, Bristol-Myers Squibb); 펨브롤리주맵 (anti-PD-1 항체, Keytruda®, Merck); 이필리무맵 (anti-CTLA-4 항체, Yervoy®, Bristol-Myers Squibb); 두르발루맵 (durvalumab)(anti-PD-L1 항체, Imfinzi®, AstraZeneca); 및 아테졸리주맵 (atezolizumab)(anti-PD-L1 항체, Tecentriq®, Genentech)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 체크포인트 저해제는 람브롤리주맵 (lambrolizumab)(MK-3475), 니볼루맵 (BMS-936558), 피딜리주맵 (CT-011), AMP-224, MDX-1105, MEDI4736, MPDL3280A, BMS-936559, 이필리무맵 (ipilimumab), 릴를루맵 (lirlumab), IPH2101, 펨브롤리주맵 (Keytruda®) 및 트레멜리무맵으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 기저 세포 암종 (NCT03132636); NSCLC (NCT03088540); 피부 편평 세포암 (NCT02760498); 림프종 (NCT02651662); 및 흑색종 (NCT03002376) 환자에서 검사된 anti-PD-1 항체인 REGN2810 (Regeneron); 미만성 거대 B 세포 림프종 및 다발성 골수종에 대한 임상 실험에서 PD-1에 결합하는 항체인, CT-011로도 알려진 피딜리주맵 (pidilizumab)(CureTech); 비-소 세포성 폐암, 메르켈 세포 암종, 중피종, 고형 종양, 신장암, 난소암, 방광암, 두경부암 및 위암에 대한 임상 실험에서 완전한 인간 IgG1 anti-PD-L1 항체인, MSB0010718C로도 알려진, 아벨루맵 (avelumab)(Bavencio®, Pfizer/Merck KGaA); 또는 비-소 세포성 폐암, 흑색종, 3중 음성 유방암 및 진행된 또는 전이성 고형 종양에 대한 임상 실험에서, PD-1에 결합하는 저해성 항체인 PDR001 (Novartis)이다. 트레멜리무맵 (CP-675,206; Astrazeneca)은, 중피종, 결장직장암, 신장암, 유방암, 폐암 및 비-소 세포성 폐암, 췌관선암종, 췌장암, 생식 세포 암, 두경부의 편평세포암, 간세포암, 전립선암, 자궁내막암, 간에서의 전이암, 간암, 거대 B 세포 림프종, 난소암, 자궁경부암, 전이성 역형성 갑상선암, 요로상피암, 자궁관암, 다발성 골수종, 방광암, 연조직 육종 및 흑색종을 비롯한, 다수의 적응증들에 대한 임상 실험에서 평가된, CTLA-4에 대한 완전한 인간 단일클론 항체이다. AGEN-1884 (Agenus)는 진행된 고형 종양에 대한 1상 임상 실험 (NCT02694822)에서 평가 중인 anti-CTLA4 항체이다.
일부 구현예에서, 체크포인트 저해제는 단백질-3를 함유한 T 세포 면역글로불린 뮤신 (TIM-3)의 저해제이다. 본 발명에서 이용가능할 수 있는 TIM-3 저해제로는 TSR-022, LY3321367 및 MBG453 등이 있다. TSR-022 (Tesaro)는 고형 종양 (NCT02817633)에서 연구 중인 anti-TIM-3 항체이다. LY3321367 (Eli Lilly)은 고형 종양 (NCT03099109)에서 연구 중인 anti-TIM-3 항체이다. MBG453 (Novartis)는 진행된 악성 (NCT02608268)에서 연구 중인 anti-TIM-3 항체이다.
일부 구현예에서, 체크포인트 저해제는 Ig 및 ITIM 도메인을 가진 T 세포 면역수용체의 저해제, 또는 특정 T 세포와 NK 세포 상의 면역 수용체인 TIGIT의 저해제이다. 본 발명에서 이용가능할 수 있는 TIGIT 저해제로는 anti-TIGIT 단일클론 항체 (NCT02913313)인 BMS-986207 (Bristol-Myers Squibb); OMP-313M32 (Oncomed); 및 anti-TIGIT 단일클론 항체 (NCT03119428) 등이 있다.
일부 구현예에서, 체크포인트 저해제는 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3)의 저해제이다. 본 발명에서 이용가능할 수 있는 LAG-3 저해제는 BMS-986016 및 REGN3767 및 IMP321을 포함한다. anti-LAG-3 항체인 BMS-986016 (Bristol-Myers Squibb)는 교모세포종 및 신경교육종 (NCT02658981)에서 연구 중이다. 또한, REGN3767 (Regeneron)은 anti-LAG-3 항체이며, 악성 (NCT03005782)에서 연구 중이다. IMP321 (Immutep S.A.)은 LAG-3-Ig 융합 단백질로서, 흑색종 (NCT02676869); 선암종 (NCT02614833); 및 전이성 유방암 (NCT00349934)에서 연구 중이다.
본 발명에서 이용가능할 수 있는 체크포인트 저해제는 OX40 작용제이다. 임상 실험에서 연구 중인 OX40 작용제로는 전이성 신장암 (NCT03092856) 및 진행성 암과 신생물 (NCT02554812; NCT05082566)에서, 작용제성 anti-OX40 항체인, PF-04518600/PF-8600 (Pfizer); 1상 암 실험 (NCT02528357) 중인 작용제성 anti-OX40 항체인, GSK3174998 (Merck); 진행성 고형 종양 (NCT02318394 및 NCT02705482)에서, 작용제성 anti-OX40 항체인, MEDI0562 (Medimmune/AstraZeneca); 결장직장암 (NCT02559024), 유방암 (NCT01862900), 두경부암 (NCT02274155) 및 전이성 전립선 암 (NCT01303705) 환자에서, 작용제성 anti-OX40 항체 (Medimmune/AstraZeneca)인, MEDI6469; 및 진행성 암 (NCT02737475)에서, 작용제성 anti-OX40 항체인, BMS-986178 (Bristol-Myers Squibb) 등이 있다.
본 발명에서 이용가능할 수 있는 체크포인트 저해제로는 CD137 (4-1BB라고도 함) 작용제를 포함한다. 임상 실험에서 연구 중인 CD137 작용제로는, 미만성 거대 B 세포 림프종 (NCT02951156) 및 진행성 암 및 신생물 (NCT02554812 및 NCT05082566)에서 작용제성 anti-CD137 항체인, 우토밀루맵 (utomilumab)(PF-05082566, Pfizer); 흑색종 및 피부암 (NCT02652455)과 교모세포종 및 신경교육종 (NCT02658981)에서 작용제성 anti-CD137 항체인, 우렐루맵 (urelumab)(BMS-663513, Bristol-Myers Squibb) 등이 있다.
본 발명에서 이용가능할 수 있는 체크포인트 저해제는 CD27 작용제를 포함한다. 임상 실험에서 연구 중인 CD27 작용제로는, 편평 세포 두경부암, 난소 암종, 결장직장암, 신장 세포 암 및 교모세포종 (NCT02335918); 림프종 (NCT01460134); 및 신경교종과 성상세포종 (NCT02924038)에서 작용제성 anti-CD27 항체인, 바를릴루맵 (varlilumab (CDX-1127, Celldex Therapeutics) 등이 있다.
본 발명에서 이용가능할 수 있는 체크포인트 저해제는 글루코코르티코이드-유발성 종양 괴사 인자 수용체 (GITR) 작용제를 포함한다. 임상 실험에서 연구 중인 GITR 작용제로는, 악성 흑색종 및 기타 악성 고형 종양 (NCT01239134 및 NCT02628574)에서 작용제성 anti-GITR 항체인, TRX518 (Leap Therapeutics); 고형 종양 및 림프종 (NCT02740270)에서 작용제성 anti-GITR 항체인, GWN323 (Novartis); 진행성 암 (NCT02697591 및 NCT03126110)에서 작용제성 anti-GITR 항체인, INCAGN01876 (Incyte/Agenus); 고형 종양 (NCT02132754)에서 작용제성 anti-GITR 항체인, MK-4166 (Merck), 및 진행성 고형 종양 (NCT02583165)에서 인간 IgG1 Fc 도메인과 함께 작용제성 헥사메릭 GITR-리간드 분자인, MEDI1873 (Medimmune/AstraZeneca) 등이 있다.
본 발명에서 이용가능할 수 있는 체크포인트 저해제는 유도성 T 세포 공동-자극자 (ICOS, CD278로도 공지됨) 작용제이다. 임상 실험에서 연구 중인 ICOS 작용제로는 림프종 (NCT02520791)에서 작용제성 anti-ICOS 항체인, MEDI-570 (Medimmune); 1상 (NCT02723955)에서 작용제성 anti-ICOS 항체인, GSK3359609 (Merck); 1상 (NCT02904226)에서 작용제성 anti-ICOS 항체인, JTX-2011 (Jounce Therapeutics) 등이 있다.
본 발명에서 이용가능할 수 있는 체크포인트 저해제로는 킬러 IgG-like 수용체 (KIR) 저해제를 포함한다. 임상 실험에서 연구 중인 KIR 저해제로는 백혈병 (NCT01687387, NCT02399917, NCT02481297, NCT02599649), 다발성 골수종 (NCT02252263) 및 림프종 (NCT01592370)에서 anti-KIR 항체인, 릴리루맵 (IPH2102/BMS-986015, Innate Pharma/Bristol-Myers Squibb); 골수종 (NCT01222286 및 NCT01217203)에서, IPH2101 (1-7F9, Innate Pharma); 및 림프종 (NCT02593045)에서, 긴 세포질 꼬리의 도메인 3개(KIR3DL2)에 결합하는 anti-KIR 항체인, IPH4102 (Innate Pharma) 등이 있다.
본 발명에서 이용가능할 수 있는 체크포인트 저해제는 CD47과 신호 조절성 단백질 α (SIRPa) 간의 상호작용의 CD47 저해제를 포함한다. 임상 실험에서 연구 중인 CD47/SIRPa 저해제로는 1상 (NCT03013218)에서 CD47에 결합하여 CD47/SIRPa-매개 신호전달을 방지하는 (SIRPa)의 길항성 변이체인, ALX-148 (Alexo Therapeutics); 1상 임상 실험 (NCT02890368 및 NCT02663518)에서, SIRPa의 N-말단 CD47-결합성 도메인을 인간 IgG1의 Fc 도메인과 연결함으로써 구축한 용해성 재조합 융합 단백질, 인간 CD47에 결합함으로써 작용하며, 대식 세포에 이의 "비-포식" 신호를 전달하지 못하게 방지하는, TTI-621 (SIRPa-Fc, Trillium Therapeutics); 백혈병 (NCT02641002)에서 anti-CD47 항체인, CC-90002 (Celgene); 및 결장직장 신생물과 고형 종양 (NCT02953782), 급성 골수성 백혈병 (NCT02678338) 및 림프종 (NCT02953509)에서 Hu5F9-G4 (Forty Seven, Inc.) 등이 있다. 바람직한 구현예에서, 체크포인트 저해제는 CD47 저해제이다.
본 발명에서 이용가능할 수 있는 체크포인트 저해제는 CD73 저해제를 포함한다. 임상 실험에서 연구 중인 CD73 저해제로는 고형 종양 (NCT02503774)에서 anti-CD73 항체인, MEDI9447 (Medimmune); 및 고형 종양 (NCT02754141)에서 anti-CD73 항체인, BMS-986179 (Bristol-Myers Squibb) 등이 있다.
본 발명에서 이용가능할 수 있는 체크포인트 저해제는 인터페론 유전자 단백질의 자극자의 작용제 (STING, 막관통 단백질 173 또는 TMEM173으로 공지됨)를 포함한다. 임상 실험에서 연구 중인 STING의 작용제로는 림프종 (NCT03010176)에서 작용제성 합성 사이클릭 다이뉴클레오티드인, MK-1454 (Merck); 및 1상 (NCT02675439 및 NCT03172936)에서 작용제성 합성 사이클릭 다이뉴클레오티드인, ADU-S100 (MIW815, Aduro Biotech/Novartis) 등이 있다.
본 발명에서 이용가능할 수 있는 체크포인트 저해제는 CSF1R 저해제를 포함한다. 임상 실험에서 연구 중인 CSF1R 저해제로는 결장직장암, 췌장암, 전이암과 진행성 암 (NCT02777710) 및 흑색종, 비-소 세포성 폐암, 편평 세포 두경부암, 위장관 기질 종양 (GIST)과 난소암 (NCT02452424)에서 CSF1R 소형 분자 저해제인, 펙시다르티닙 (pexidartinib)(PLX3397, Plexxikon); 및 췌장암 (NCT03153410), 흑색종 (NCT03101254) 및 고형 종양 (NCT02718911)에서 anti-CSF-1R 항체인, IMC-CS4 (LY3022855, Lilly); 및 진행성 고형 종양 (NCT02829723)에서 CSF1R의 경구 이용가능한 저해제인, BLZ945 (4-[2((1R,2R)-2-하이드록시사이클로헥실아미노)-벤조티아졸-6-일옥실]-피리딘-2-카르복시산 메틸아미드, Novartis) 등이 있다.
본 발명에서 이용가능할 수 있는 체크포인트 저해제는 NKG2A 수용체 저해제를 포함한다. 임상 실험에서 연구 중인 NKG2A 수용체 저해제로는 두경부 신생물 (NCT02643550) 및 만성 림프성 백혈병 (NCT02557516)에서 anti-NKG2A 항체인 모날리주맵 (monalizumab)(IPH2201, Innate Pharma) 등이 있다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 니볼루맵, 펨브롤리주맵, 이필리무맵, 아벨루맵, 두르발루맵, 아테졸리주맵 또는 피딜리주맵로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, T 세포 활성화를 저해하는 단백질의 길항제는 anti-PD-1 및 anti-CTLA-4로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 면역항암제는 CTLA-4 길항제, 바람직하게는 CTLA-4 항체, 더 바람직하게는 이필리무맵 또는 트레멜리무맵이다.
더 바람직한 구현예에서, T 세포 활성화를 저해하는 단백질의 길항제는 anti-PD-1이다. 바람직한 구현예에서, anti-PD-1은 항체 또는 이의 항원-결합 영역, 바람직하게는 OPDIVO (니볼루맵), KEYTRUDA (펨브롤리주맵), MEDI-0680 (AMP-514; WO2012/145493) 및 피딜리주맵 (CT-011)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체이다. 다른 바람직한 구현예에서, anti-PD-1은 AMP-224로 지칭되는 IgG1의 Fc 영역에 융합된 PD-L2 (B7-DC)의 세포외 도메인으로 구성된 재조합 단백질이다.
일 구현예에서, 본 발명의 조합물은 본 발명의 조합물의 구성성분 (i)과 구성성분 (ii) 간의 접합체, 특히 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체와 면역항암제 간의 접합체이다.
일부 구현예에서, 구성성분 (i)과 (ii) 간의 접합체는 비-절단성 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 구성성분 (i)과 (ii) 간의 접합체는 절단가능한 링커를 통해 연결된다. 비-절단성 링커 및 절단가능한 링커에 대한 예는 US8088387, US8142784, WO2013075048, US6630579, US8512707, US9120854, US9023351, US20160095938, US9446146, WO2005009369, US5773001, US6214345, US10111954, US8153768, US7829531, US20160082119, WO2018218004, US8568728, WO2015057699, US20170182181, US9198979에 기술되어 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조합물을 약제학적 유효량으로 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적 조성물"이라는 표현은 암과 같이 세포 분열이 통제되지 않는 세포, 세포 군, 장기, 조직 또는 동물에 하나 또는 수개의 치료학적으로 유용한 물질을 미리 결정된 용량으로 투여하는데 적합한, 제형을 지칭한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적 유효량의 본 발명에 따른 조합물과 약제학적 활성 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 이의 기능적으로 동등한 변이체, 본 발명에 따른 접합체, 폴리펩타이드 또는 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 폴리펩타이드 또는 접합체 및 면역항암제를 배지로 분비할 수 있는 세포를 포함한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물에 사용하기에 적합한 서열번호 1의 폴리펩타이드에 대한 기능적으로 동등한 변이체, 적합한 접합체, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포는 상기에 정의된 바와 같이 정의된다.
본원에서 "약학적 유효량"이라는 표현은 치료학적 효과를 제공할 수 있는 양으로서 이해되며, 이는 통상적으로 사용되는 수단을 통해 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물에 조합될 수 있는 본 발명의 Omomyc 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체, 접합체, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 면역항암제의 함량은, 개체 및 구체적인 투여 방식에 따라 변경될 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 투여량은 Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition (1996), Appendix II, pp. 1707-1711 및 Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Edition (2001), Appendix II, pp. 475-493의 지침에 따라 결정할 수 있음을, 알 것이다.
약학적 조성물 내 활성 성분 또는 성분들의 적절한 투여량은 치료할 암의 타입, 질병의 중증도 및 경로, 조성물이 예방 또는 치료 목적인지의 여부, 과거 치료, 환자의 임상적인 병력 및 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 결정될 것이다.
서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 이의 기능적으로 동등한 변이체, 융합 단백질, 접합체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포의 양은 적합하게는 환자에게 한번에 또는 연속 처리로 투여된다. 질병의 타입과 중증도에 따라, 적합한 투여량 수준은 일반적으로 1일 당 환자 체중 kg 당 약 0.01 - 500 mg일 것이며, 이는 1회 투여로 또는 다회 투여로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 투여량 수준은 약 0.1 내지 약 250 mg/kg/일 (day); 더 바람직하게는, 약 0.5 내지 약 100 mg/kg/일일 것이다.
바람직한 구현예에서, 제1 구성성분의 양은 1일 당 개체 체중 당 약 3.75 mg/kg이며, 바람직하게는 주당 4회로, 바람직하게는 비강내로 투여된다. 바람직한 구현예에서, 제1 구성성분의 양은 1일 당 약 8 내지 15 mg/m2, 바람직하게는 10 내지 12 mg/m2, 더 바람직하게는 11.25 mg/m2이며, 바람직하게는 주당 4회로, 바람직하게는 비강내로 투여된다.
바람직한 구현예에서, 제1 구성성분의 양은 1일 당 개체 체중 당 약 50 mg/kg, 바람직하게는 주당 2회로, 바람직하게는 정맥내 투여된다. 바람직한 구현예에서, 제1 구성성분의 양은 1일 당 약 100 내지 200 mg/m2, 바람직하게는 125 내지 175 mg/m2, 바람직하게는 140 내지 160 mg/m2, 더 바람직하게는 150 mg/m2이며, 바람직하게는 주당 2회로, 바람직하게는 정맥내 투여된다.
적절한 투여량 수준은 약 0.01 내지 250 mg/kg/day, 약 0.05 내지 100 mg/kg/day, 또는 약 0.1 내지 50 mg/kg/day일 수 있다. 이러한 범위에서, 투여량은 0.05 내지 0.5, 0.5 내지 5 또는 5 내지 50 mg/kg/day일 수 있다. 경구 투여할 경우, 조성물은, 바람직하게는, 치료할 환자에 대한 투여량을 증상에 따라 조정하기 위해, 활성 성분을 1.0 - 1000 mg, 특히 바람직하게는 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0 및 1000.0 mg으로 포함하는 정제 형태로 제공된다. 화합물은 1일 1-4회, 바람직하게는 1일 1 또는 2회 용법으로 투여할 수 있다.
일 구현예에서, 조합물 또는 조성물은 1회/주(week), 2회/주, 3회/주, 4회/주, 5회/주, 6회/주 또는 7회/주로 투여할 수 있다. 일 구현예에서, 조합물 또는 조성물은 1회/주로 할 수 있다. 다른 구현예에서, 조합물 또는 조성물은 2회/주로 투여할 수 있다. 다른 구현예에서, 조합물 또는 조성물은 4회/주로 투여할 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 조합물 또는 조성물의 제1 구성성분은 4회/주로 투여하고, 조합물 또는 조성물의 제2 구성성분은 1회/주로 투여한다. 다른 구현예에서, 조합물 또는 조성물의 제1 구성성분은 2회/주로 투여하고, 조합물 또는 조성물의 제2 구성성분은 1회/주로 투여한다. 양쪽 화합물은 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 화합물들을 순차적으로 투여할 경우, 제1 화합물의 투여는 제2 화합물의 투여를 개시하기 전에 중단한다.
치료 기간은 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 6주, 적어도 7주, 적어도 8주, 적어도 9주, 적어도 10주 또는 그 이상일 수 있다. 바람직하게는, 치료 기간은 적어도 4주이다. 다른 구현예에서, 치료 기간은 적어도 3주이다.
면역항암제의 양은 구체적인 사용 물질에 따라 결정되며, 원하는 치료학적 효과를 달성하기 위해 1일 당 1회 이상으로, 약 0.01 mg/체중 kg/일 내지 약 50 mg/체중 kg/일, 바람직하게는 약 1 mg/체중 kg/일 내지 약 25 mg/체중 kg/일일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 면역항암제의 양은 약 2.5 mg/체중 kg/일 또는 7.5 mg/m2/일이며, 바람직하게는 주당 1회로, 더 바람직하게는 비경구로 투여되며, 보다 더 바람직하게는 복막내로 투여된다. 바람직한 구현예에서, 면역항암제의 양은 약 5 mg/체중 kg/일 또는 15 mg/m2/일이며, 바람직하게는 주당 1회로, 더 바람직하게는 비경구로 투여되며, 보다 더 바람직하게는 복막내로 투여된다. 다른 바람직한 구현예에서, 면역항암제의 양은 약 10 mg/체중 kg/일 또는 30 mg/m2/일로, 바람직하게는 주당 1회로, 더 바람직하게는 비경구로 투여되며, 보다 더 바람직하게는 복막내로 투여된다.
본 발명에 따른 서열번호 1을 포함하는 폴리펩타이드, 이의 기능적으로 동등한 변이체, 융합 단백질, 접합체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포로부터 선택되는 제1 구성성분 (i)과 면역항암제인 제2 구성성분 (ii)을 함유한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은, 단일 제형으로서 (예를 들어, 구성성분들 각각 하나를 고정된 양으로 포함하는 정제 또는 캡슐제로서) 제공될 수 있거나, 또는 연합, 순차적 또는 분리 투여하기 위해 추후 조합될 별개의 제형들로서 제공될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은, 구성성분들이 분리되어 제형화되지만, 동일 용기 안에 포장된, 부품 키트로서의 제형을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명에 따른 약학적 조성물에서 여러가지 구성성분들의 제형이 비슷할 수 있으며, 다시 말해, 동일한 경로에 의한 투여가 가능하도록 비슷하게 (정제 또는 환제) 제형화된다. 본 발명의 여러가지 구성성분들을 분리하여 제형화할 경우, 2가지 구성성분은 블리스터 형태로 제공될 수 있다. 각 블리스터는 하루에 소비해야 하는 약물을 수용한다. 만일 약물을 1일 여러번 투여하여야 한다면, 각각의 투여에 해당하는 약물은 블리스터의 서로 다른 구획 안에 배치될 수 있으며, 바람직하게는 이를 투여하여야 하는 일시가 블리스터의 각 구획에 표시될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물의 구성성분들은 서로 다른 구성성분들이 차별적으로 투여되도록 차별적으로 제형화될 수 있다. 즉, 제1 구성성분은 경구 투여를 위해 정제 또는 캡슐제로서 제형화되고, 제2 구성성분은 정맥내 투여용으로 제형화되거나, 또는 그 역도 성립한다. 본 발명에 따른 조합물 또는 약학적 조성물의 일부인 구성성분들 간의 비율은 당해 기술 분야의 당업자에 의해 각각의 구체적인 사례에 사용되는 항종양제뿐 아니라 원하는 징후에 따라 조정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 구성성분 (i)과 구성성분 (ii)의 함량 비율이 50:1 내지 1:50, 특히 20:1 내지 1:20, 1:10 내지 10:1 또는 5:1 내지 1:5 범위일 수 있는 조성물을 고려한다. 보다 구체적인 구현예에서, 함량 비율은 1:1 내지 1:5, 바람직하게는 1:1 내지 1:3 범위이다. 바람직한 구현예에서, 그 비율은 1:1 내지 1:1.5, 바람직하게는 1:1.3 내지 1:1.4 범위, 더 바람직하게는 1:1.34이다. 다른 바람직한 구현예에서, 그 비율은 1:1 내지 1:2.8, 바람직하게는 1:2.6 내지 1:2.7, 더 바람직하게는 1:2.67 범위이다. 다른 특정 구현예에서, 함량 비율은 30:1 내지 5:1, 바람직하게는 30:1 내지 8:1, 더 바람직하게는 25:1 내지 15:1, 더 바람직하게는 20:1 내지 10:1 범위이다. 일 구현예에서, 그 비율은 20:1이다. 다른 구현예에서, 그 비율은 10:1이다. 바람직하게는. 이들 비율은 w/w 비율이다.
본 발명의 약학적 조성물 또는 조합물의 구성성분들은 동시적으로 투여할 수 있다. "동시 투여"는 각 물질의 투여 시기 또는 상대적인 빈도와 상관없이, 2가지 치료학적 물질의 동시 투여를 포괄한다. 따라서, 동시 투여는 2가지 치료학적 물질을 동시에 동일한 투여 빈도로 공동 투여하는 것을 포함한다. 아울러, 동시 투여는, 한가지 물질을 다른 것(들)보다 더 빈번하게 투여하는, 2가지 치료학적 물질의 공동 투여를 의미한다. 아울러, 동시 투여는, 한가지 물질을 다른 물질(들)을 투여 하는 중에 단 1회만 투여하는, 2가지 치료학적 물질들의 공동 투여를 의미한다.
일 구현예에서, 구성성분 (i)은 비강내로 투여한다. 다른 구현예에서, 구성성분 (i)은 정맥내로 투여한다. 다른 구현예에서, 구성성분 (ii)는 비경구로, 특히 복막내로 투여한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조합물 또는 약학적 조성물의 구성성분 (i)은 비강내로 투여하고, 면역항암제는 비경구로, 특히 복막내 또는 정맥내로 투여한다. 비강내 투여하는 경우, 본 발명의 조합물 또는 조성물의 구성성분 (i)의 바람직한 투여량, 바람직하게는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체, 융합 단백질 또는 접합체의 바람직한 투여량은 0.01 내지 250 mg/kg 범위이며, 이는 1회 투여로 또는 다회 투여로 투여할 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 내지 약 100 mg/kg/day일 수 있다. 복막내 투여하는 경우, 면역항암제의 바람직한 용량은 0.01 내지 150 mg/kg, 더 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 조합물 또는 약학적 조성물의 구성성분 (i)은 정맥내로 투여하고, 면역항암제는 비경구로, 특히 복막내 또는 정맥내로 투여한다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 암과 같이 통제되지 않는 세포 분열이 존재하는 병증을 예방 및/또는 치료하기 위한 하나 또는 수개의 부가적인 화합물들을 함유할 수 있다. 부가적인 화합물, 예를 들어 항종양제는 독립적인 물질로서 약학적 조성물의 일부를 구성할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조합물 또는 약학적 조성물은 세포독성제, 항혈관신생제, 항전이제 및 항증식제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항종양제를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 하나 또는 수종의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. "약제학적으로 허용가능한 부형제"는, 활성 성분을 통합하기 위해 사용되는 것으로 일컬어지며; 조성물, 제형, 안정성, 환자의 순응성 (acceptation) 및 생체이용성과 관련하여, 약리학적/독성학적 관점에서 환자에게 허용가능하며 물리학적/화학적 관점에서 이를 제조하는 약제 화학자에 허용가능한, 치료학적으로 비-활성인 물질로서 이해된다. 부형제는 담체일 수 있다. 본원에서, "담체"는 약학적 조성물의 활성 성분의 전달 및 효능을 개선하기 위해 제공되는 임의의 물질을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 담체는 구성성분 (i) 및/또는 (ii)를 세포의 세포질로 직접 전달하지 않으며, 즉 담체는 표적 세포의 혈장막 (plasmatic membrane)과 융합하지 못한다. 약제학적으로 허용가능한 담체에 대한 예로는 물, 식염수, 포스페이트 완충화된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 이의 조합물 중 하나 이상을 포함한다. 다수의 경우에, 등장성 물질, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 소듐 클로라이드가 조합물 또는 조성물에 포함되는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용가능한 담체는, 본 발명의 조합물 또는 조성물의 일부를 구성하는 구성성분들의 유통 기한 (shelf life) 또는 효능을 강화하는, 습윤제, 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 보조 물질을 소량으로 더 포함할 수 있다. 적절한 담체에 대한 예들은 문헌에 잘 알려져 있다 (예, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 담체에 대한 예로는, 비-제한적으로, 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨 및 말티톨과 같은 사카라이드 시리즈; 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분과 같은 전분 시리즈; 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 소듐 카르복시 메틸 셀룰로스 및 하이드록시 프로필메틸 셀룰로스와 같은 셀룰로스 시리즈; 및 젤라틴 및 폴리비닐 피롤리돈와 같은 충진제 시리즈 등이 있다. 일부 경우에, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 알긴산 또는 소듐 알기네이트와 같은 붕해제도 첨가할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 부형제의 개수와 특성은 원하는 투약 형태에 따라 결정된다. 약제학적으로 허용가능한 부형제들은 당해 기술 분야의 당업자에 공지되어 있다 (Fauliy Trillo C. (1993) "Tratado de Farmacia Galenica", Luzan 5, S.A. Ediciones, Madrid). 이러한 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 통상적인 방법을 이용해 제조할 수 있다 ("Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition (2003) Genaro A.R., ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, US).
핵산 분자 물질을 포함하는 약학적 조성물의 경우, 핵산 분자는, 핵산, 및 박테리아, 바이러스 및 포유류 발현 시스템, 예를 들어 본원에 제공된 재조합 발현 구조체 등의, 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 다양한 임의의 전달 시스템 내에 존재할 수 있다. DNA를 이러한 발현 시스템에 통합하는 기법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 또한, DNA는, 예를 들어, Ulmer et al., Science 259:1745-49, 1993 및 Cohen, Science 259:1691-1692, 1993에 기술된 바와 같이, "naked"일 수 있다. naked DNA의 흡수는, 효과적으로 세포에 전달되는 생분해성 비드에 DNA를 코팅함으로써 높일 수 있다.
핵산 분자는 당해 기술 분야에 개시된 여러가지 방법들 중 어느 한가지 방법에 따라 세포에 전달할 수 있다 (예, Akhtar et al., Trends Cell Bio. 2:139 (1992); Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., Mol. Membr. Biol. 16:129-40 (1999); Hofland and Huang, Handb. Exp. Pharmacol. 137:165-92 (1999); Lee et al., ACS Symp. Ser. 752:184-92 (2000); 미국 특허 6,395,713; 국제 특허 출원 공개공보 WO 94/02595); Selbo et al., Int. J. Cancer 87:853-59 (2000); Selbo et al., Tumour Biol. 23:103-12 (2002); 미국 특허 출원 공개공보 2001/0007666 및 2003/077829). 당해 기술 분야의 기술을 가진 당업자에게 공지된 이러한 전달 방법으로는 리포좀내 캡슐화, 이온영동 또는 생분해성 폴리머; 하이드로겐; 사이클로덱스트린 (예, Gonzalez et al., Bioconjug. Chem. 10: 1068-74 (1999); Wang et al., 국제 출원 공개공보 WO 03/47518 및 WO 03/46185); 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA) 및 PLCA 미소구 (이는 또한 펩타이드 및 폴리펩타이드 및 그외 물질을 전달하는데 이용가능함)(예, 미국 특허 6,447,796; 미국 특허 출원 공개공보 2002/130430); 생분해성 나노캡슐제; 및 생부착성 미소구, 또는 단백질성 벡터 (국제 출원 공개공보 WO 00/53722)와 같은 기타 비히클내의 통합에 의한 방법 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 구현예에서, 핵산 분자는 폴리에틸렌이민 또는 이의 유도체, 예를 들어, 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-N-아세틸갈락토사민 (PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-트리-N-아세틸갈락토사민 (PEI-PEG-트리GAL) 유도체 (예, 미국 특허 출원 공개공보 2003/0077829)를 이용해 제형화하거나 또는 이와 복합체를 형성할 수도 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 화합물이 핵산을 포함할 경우, 약학적 조성물은 유전자 요법에 사용하기 위해 고안된 조성물로서 제형화할 수 있으며; 비제한적인 예로서, 약학적 조성물은, 적절한 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 구조체를 포함하는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터를 함유할 수 있다. 예로서 비-제한적으로, 벡터는, 예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스 등에 기반한 바이러스성일 수 있거나, 또는 ADN-리포좀, ADN-폴리머, ADN-폴리머-리포좀 복합체 등과 같은 비-바이러스성일 수 있다 ["Nonviral Vectors for Gene Therapy", edited by Huang, Hung and Wagner, Academic Press (1999)]. 대응되는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 구조체를 함유한 상기한 벡터는 통례적인 방법에 의해 개체에 직접 투여할 수 있다. 대안적으로, 상기한 벡터는 세포, 예를 들어, 인간 등의 포유류 세포를 생체외에서 형질전환하거나 또는 형질감염시키거나 또는 감염시키기 위해 이용할 수 있으며, 이는 추후 인체 또는 동물에 이식해 원하는 치료학적 효과를 달성할 것이다. 인체 또는 동물에 투여하는 경우, 세포는 세포 생존성에 부정적인 영향이 없는 적절한 매질 중에 제형화될 것이다.
본 발명의 조합물 또는 약학적 조성물은 경구 경로, 국소 경로, 흡입 또는 비경구 경로 등의 임의 타입의 적합한 경로에 의해 투여할 수 있으며, 그래서 바람직한 투약 형태의 제형화에 필수적인 약제학적으로 허용가능한 부형제가 포함될 것이다. 약학적 조성물 또는 조합물의 바람직한 투여 경로는 정맥내 경로 (endovenous route)이다.
"경구 경로"는 약학적 조성물이 연하 행위 (deglutition)에 의해 유기체에 섭취되는 것으로 이해된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 액체 또는 고체에 무관하게 경구 경로에 의해 투여하기에 적합한 투약 형태일 수 있다. 경구 경로에 의한 투여에 적합한 투약 형태는 정제, 캡슐제, 시럽제 또는 용액제일 수 있으며, 결합제, 예를 들어 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨 또는 폴리비닐피롤리돈; 충진제, 예를 들어 락토스, 당 (sugar), 옥수수 전분, 칼슘 포스페이트, 소르비톨 또는 글리신; 압축용 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트; 붕해제, 예를 들어 전분, 폴리비닐피롤리돈, 전분의 소듐 글리콜레이트 또는 미세결정 셀룰로스; 또는 약제학적으로 허용가능한 습윤제, 예를 들어 소듐 라우릴 설페이트 등의 당해 기술 분야에 공지된 임의의 통상적인 부형제를 포함할 수 있다. 고체 경구 조성물은 통상적인 혼합, 충진 또는 압축 프로세스에 의해 제조할 수 있다. 반복적인 혼합 조작을 이용해, 충진제를 다량 사용하는 조성물에 활성 물질을 완전히 분산시킬 수 있다. 이러한 조작은 당해 기술 분야에서 통상적이다. 정제는, 예를 들어, 습식 또는 건식 과립화에 의해 제조할 수 있으며, 선택적으로 이를 통상적인 약학 실무에서 공지된 프로세스에 따라, 특히 장용 코팅을 적용해 이를 코팅할 수 있다.
한편, "국소 경로"는 비-전신 경로에 의한 투여로서 이해되며, 혈류에 현저하게 유입되지 않는, 구강 내 상피에의 본 발명의 약학적 조성물의 외용 적용 및 조성물의 눈, 귀 및 코 내 점적 (instillation)을 포함한다. 본 발명의 화합물의 국소 또는 경피 투여를 위한 투약 형태로는 연고제, 파스타제, 크림제, 로션제, 겔제, 산제, 용액제, 분무제, 흡입제 또는 패치 등이 있다.
안과용 제형, 점이제 및 점안제 역시 본 발명에 범위에 속하는 것으로 고려된다. 아울러, 본 발명은, 신체에 화합물에 조절 전달을 제공하는 부가적인 이점을 가진, 경피 패치의 사용을 고려한다. 이러한 투약 형태는 화합물을 적절한 매질에 용해 또는 분산함으로써 제조할 수 있다. 또한, 흡수 강화제를 이용해, 화합물의 피부를 통한 유입을 높일 수 있다. 그 속도는 폴리머 매트릭스 또는 겔에 화합물을 분산시키거나 또는 속도 제어 막을 구비함으로써 조절할 수 있다.
일 구현예에서, 조합물 또는 약학적 조성물은 전신으로 투여한다.
"전신 경로"는 경구 경로, 정맥내 경로, 복막내 경로 및 근육내 경로에 의한 투여로서 이해된다. 치료학적 또는 예방학적 효과에 필요한 구성성분 (i) 및 (ii)의 양은 본래 선택 화합물, 치료하고자 하는 질병의 특성과 중증도 및 환자에 따라 달라질 것이다.
다른 구현예에서, 조합물 또는 약학적 조성물은 비강내로 투여한다. 바람직한 구현예에서, 비강내 투여는 점적 또는 코 흡입에 의해 수행된다.
"흡입"은 비강내 경로 및 경구 흡입에 의한 투여로서 이해된다. 이러한 투여에 적합한 투약 형태, 예를 들어, 에어로졸 형태의 제형 또는 정량식 흡입기 (meter dosed inhaler) 형태의 제형은 통상적인 기법을 이용해 제조할 수 있다. 일 구현예에서, 투여 경로는 비강내 경로이다.
본원에서, 용어 "비경구"는 정맥내 경로, 복막내 경로, 근육내 경로 또는 피하 경로에 의한 투여를 포함한다. 비경구 투여의 피하, 근육내 및 정맥내 투약 형태가 일반적으로 바람직하다.
일 구현예에서, 본 발명의 조합물 또는 약학적 조성물은 적절한 투약 단위 형태의 무균성 용액제, 현탁제 또는 동결건조 산물 등의 비경구 투여용으로 적합할 수 있다. 주사가능한 용도로 적합한 조합물 또는 약학적 조성물은 무균성 수용액 (수 용해성인 경우) 또는 분산제 및 무균성 주사용 용액 또는 분산액을 즉석 제조하기 위한 무균성 산제를 포함한다. 정맥내 경로에 의해 투여하는 경우, 일부 적합한 담체는 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)이다. 모든 경우에, 조합물 또는 조성물은 무균성이어야 하며, 주사 용이한 정도로 유동성이어야 한다. 이는 조제 및 저장 조건에서 안정적이어야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 약제학적으로 허용가능한 폴리올, 예로, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 적합한 이의 혼합물을 포함하는, 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 사용하거나, 분산제의 경우 필요한 입자 크기를 유지함으로써, 그리고 계면활성제를 이용함으로써, 적합한 유동성을 유지시킬 수 있다. 미생물의 작용 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티오메르살 등을 이용함으로써 달성할 수 있다. 대부분의 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당; 폴리알코올, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨; 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수 (prolonged absorption)는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 및 젤라틴 모노스테아레이트를 포함시킴으로써 달성할 수 있다.
주사용 무균성 용액은, 적절한 용매에 필요에 따라 전술한 성분들 중 하나 또는 조합과 더불어 활성 화합물을 필요한 함량으로 첨가한 다음, 멸균 막을 통한 여과에 의해 멸균 처리함으로써, 제조할 수 있다. 통상적으로, 분산제는, 염기성 분산 매질을 포함하는 무균성 비히클에 활성 화합물과 상기 열거된 성분들 중 필요한 나머지 성분을 투입함으로써, 제조한다. 주사용 무균성 용액을 제조하기 위한 무균성 산제의 경우, 바람직한 제조 공정은, 이미 여과된 무균성 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 바람직한 부가적인 성분을 가진 산제를 제조하는, 진공 건조 및 동결건조이다.
본 발명의 조합물 또는 약학적 조성물은, 적합하게는, 예를 들어, 조성물의 용량을 줄이면서, 펄스 주입 방식으로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 투여량은, 부분적으로 투여가 급성 또는 만성인지에 따라, 주사 방식으로, 더 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여한다. 바람직한 구현예에서, PD-1 길항제는 주입에 의해 투여한다.
대안적으로, 전술한 바와 같이, 조성물의 여러가지 구성성분들은 차별적으로 투여한다.
이에, 일 구현예에서, 조합물 또는 조성물의 구성성분 (i), 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 기능적으로 동등한 변이체 또는 접합체는 비강내로 투여하고, 면역항암제는 전신 투여한다.
다른 바람직한 구현예에서, 조합물 또는 조성물의 구성성분 (i), 바람직하게는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체, 또는 조성물의 접합체는 비강내로 또는 흡입에 의해 투여한다.
비강내 및 폐내 투여용으로 의도되는 조성물의 투약 형태는, 바람직하게는, 액체, 현탁물 또는 고체이다. 현탁물은 액체 비히클에 분산된 고체 입자를 함유한 액체 조제물이다. 투약 형태는 바람직하게는 계량된다. 예를 들어, 정량식 점적제/스프레이제는 점적제/스프레이제를 수용한 분배기 (dispenser)가 본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물을 정량된 양 (지정된 함량)으로 함유한 점적제/스프레이제를 전달하는 것을 의미한다.
비강내 투여 경로 맥락에서 바람직한 한가지 투약 형태는 코 점적제를 포함한다. 점적제는 코의 후측부에서 대부분 침착하여, 코 인두로 빠르게 이동한다. 점적제와 관련한 문제는 흔히 약물의 투여량을 정확하게 제어하는 방법이며, 이는 접합체의 투여에 특히 중요하다.
본 발명의 약학적 조성물을 투여할 수 있는 또 다른 비강내 투약 형태는 코 스프레이제이다. 코 스프레이제는 전형적으로 부형제 (예, 보존제, 점성 개질제, 유화제, 완충화제) 혼합물 또는 용액에 용해 또는 현탁된 접합체를 비-가압식 분배기 안에 수용한다. 코 스프레이제는 전달 기구의 소형화, 편의성, 사용 간편성 및 투여량 25 - 200 pL의 전달 정확성을 비롯해 몇가지 이점을 가진다. 이는 코의 앞쪽 영역에 침작해, 점액섬모 청소에 의해 코 인두로 느리게 소거된다. 본원에서, 코 스프레이제는 액체 또는 현탁제일 수 있다.
또 다른 비강내 투약 형태는 코 에어로졸제이다. 코 에어로졸제는 조성물을 분배하는 방식에서 코 스프레이제와 차이가 있다: 에어로졸의 경우, 화합물은 과도한 압력으로 인해 분배되어 밸브를 통해 방출된다. 스프레이제의 경우, 화합물은 마이크로펌프 버킷에 의한 강제적인 이동으로 인해 분배되지만 바이얼 내부 압력은 대기압과 비슷하다. 에어로졸제는 스프레이제와 유사한 이점을 가지고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 대안적으로 코 에멀젼, 연고제, 겔제, 파스타제 또는 크림제에 의해 투여할 수 있다. 이는 코 점막에 적용되는 고 점성의 용액 또는 현탁물이다.
코 점막으로 효과적으로 전달가능한 조성물의 부피 제한으로 인해, 액체 비강내 투약 형태는 일반적으로 대응되는 정맥내 투약 형태보다 농도가 높다. 물질이 수 난용성이거나 또는 액체 형태에서 불안정할 경우, 산제를 이용해 본 발명의 조성물을 투여할 수 있다. 산제의 추가적인 이점은 보존제가 필요하지 않고, 일반적으로 액체 제형과 비교해 안정성이 더 높다는 것이다. 비강내 산제 적용에 있어 주요 한계는 코 점막에 대한 이의 자극 효과와 관련 있다.
폐내 투여 맥락에서 한가지 투약 형태는 흡입 에어로졸이다. 흡입 에어로졸은 통상적으로 가압 하에 패킹되며, 밸브 시스템의 구동시 호흡기, 특히 폐로 방출되는 본 발명에 따른 조성물을 포함한다. 방출된 에어로졸은 공기 또는 다른 기체 중의 미세 고체 입자 (현탁물) 또는 액체 액적 (용액) 콜로이드이다. 즉, 에어로졸은 용액 에어로졸 또는 현탁 에어로졸 (suspension aerosol)일 수 있다. 액체 액적 또는 고체 입자는 바람직하게는 직경이 100 pm 미만, 더 바람직하게는 10 pm 미만, 가장 바람직하게는 1 pm 미만이다.
폐내 투여 맥락에서 또 다른 투약 형태는 흡입 스프레이이다. 흡입 스프레이는 전형적으로 수성 기재이며, 임의의 추진체를 함유하지 않는다. 이는 경구 흡입에 의해 접합체를 폐로 전달한다.
분무된 흡입 용액 및 현탁제를 또한 이용해 접합체를 폐내 경로를 통해 전달할 수 있다. 분무된 흡입 용액 및 현탁제는 전형적으로 본 발명에 따른 조성물을 함유한 수성-기재의 제형이다. 분무된 흡입 용액 및 현탁제는 전신 효과를 위해 조성물을 경구 흡입에 의해 폐에 전달하며, 분무기를 사용해 이용한다.
건조 산제 흡입은 에어로졸 흡입의 대안이다. 조성물은 통상적으로 수동 탑재용 캡슐 안에 또는 흡입기 안에 수용된다. 건조 산제는 전형적으로 흡입기를 사용해 경구 흡입에 의해 폐로 전달된다. 본원에서, 건조 산제는 원액 (neat)으로 제형화할 수 있다. 원액 제형은 약물을 단독으로 포함하거나 또는 예를 들어 분무 건조된 산제로서 준-단독 (quasi-alone)으로 포함한다. 본원에서, 건조 산제는 또한 락토스와 같은 담체와 함께 제형화할 수 있다.
폐내 투약 형태는 바람직하게는 계량되며, 즉 폐에 지정된 함량으로 전달된다.
본 발명의 맥락에서 비강내 전달 기구는 스프레이 펌프 시스템, 액적 전달용 파이펫, 정량식 스프레이 펌프, 정량식 가압 코 흡입기, 분말 스프레이 시스템, 호흡-구동형 분말 흡입기 및 분말 코 점적기를 포함한다. 비강내 전달 기구에는 비강내 제형 1회분 또는 다회분이 충진될 수 있다.
폐내 경로를 이용하는 경우, 접합체는 정량식 흡입기를 사용해 투여할 수 있다. 정량식 흡입기 (MDI)는 일반적으로 공기역학적 입자 크기가 5 pm 미만인 접합체의 미세 미스트를 제공해준다.
건조 분말 흡입기를 대안적으로 사용해 조성물을 폐내 전달할 수 있다. 건조 분말 흡입기는 산제를 1회분 또는 다회분 산제로서 제공한다.
또 다른 폐내 전달 기구는 초음파 분무기 및 공기 제트 분무기 등의 분무기이다. 초음파 분무기의 경우, 전자 여기시 진동하는 세라믹 압전 결정에 의해 초음파가 초음파 분무기 챔버에서 생성된다. 이는 용액 표면에 에어로졸 클라우드 (aerosol cloud)를 형성한다. 공기 제트 분무기에 의해 생성되는 에어로졸은 압축된 공기가 강제로 오리피스를 통과할 때 발생한다. 액체는 수직 노즐 (베르누이 효과)로부터 배출시켜, 에어로졸 클라우드의 형성을 촉진하기 위해 배플을 이용해 원자화된 공기 제트와 혼합될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조합물 또는 약학적 조성물의 각각의 구성성분은, 구성성분, 특히 구성성분 (i)을 신체에서 빠른 제거로부터 보호하게 될 담체와 함께, 임플란트 및 미세캡슐화된 투여 시스템 등의 제어 방출형 제형으로서 준비된다. 에틸렌 비닐아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성 생체적합한 폴리머가 사용될 수 있다. 이러한 제형을 준비하기 위한 공정은 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다. 이들 물질은 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.에서 상업적으로 구입가능할 수 있다.
지속 방출 (sustained release) 조성물 역시 결정을 현탁물 내에 유지할 수 있는 적절한 제형에 현탁된 결정 조제물을 포함한다. 이들 조제물은, 피하 또는 복막내 경로에 의해 주사될 경우, 지속적인 방출 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 다른 조성물도 리포좀에 포집된 구성성분 (i) 및/또는 (ii)를 포함한다. 이들 구성성분을 함유한 리포좀은 Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949 등의 공지된 방법을 이용해 제조한다. 바람직한 구현예에서, 구성성분 (i) 및/또는 (ii)는 리포좀 내에 함유되며, 바람직하게는 2가지 구성성분들은 리포좀, 더 바람직하게는 동일 리포좀 내에 함유된다.
본 발명의 Omomyc, 이의 기능적으로 동등한 변이체, 접합체 및 융합 단백질이 생물학적 막을 통과하여 전위할 수 있다는 사실에도 불구하고, Omomyc, 이의 임의의 기능적으로 동등한 변이체, 접합체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 나노입자로 제형화하는 것도 가능하다. 나노입자는, 타겟 장기에 도달할 때까지, 생체 체액에서 구성성분들의 온전성을 유지하는데 기여할 수 있다. 아울러, 구성성분 (ii) 또는 기타 항종양제를 포함하는 조성물의 경우, 조성물의 캡슐화가 항종양제에 의해 유발되는 2차 효과를 낮출 수 있다. 또한, 나노입자는 대상 장기로의 나노입자의 타겟팅을 허용하는 모이어티를 포함하도록, 변형될 수 있다. 이런 방식으로, 본 발명의 조합물 또는 조성물의 구성성분 (i)은 타겟 장기에 인접하게 전달되어, 구성성분 (i)이 생물학적 활성이 요구되는 세포의 내부로 쉽게 접근하게 될 것이다.
이에, 다른 구현예에서, 나노입자의 일부를 구성하는 본 발명의 조합물 또는 조성물의 구성성분 (i)을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조합물 또는 조성물의 2가지 구성성분들이 나노입자의 일부를 형성하는 것으로, 바람직하게는 2가지 구성성분이 동일한 나노입자 내에 제공된다.
본원에서, 용어 "나노입자"는 1-1,000 nm 범위의 직경을 가진 임의 물질을 의미한다. 일부 구현예에서, 나노입자는 2-200 nm 범위, 바람직하게는 2-150 nm 범위, 보다 더 바람직하게는 2-100 nm 범위의 직경을 가진다. 본 발명에서 이용가능할 수 있는 나노입자로는 지질-기반의 나노입자, 초상자성 나노입자, 나노셀, 반도체 나노결정, 양자점 (quantum dot), 폴리머-기반의 나노입자, 실리콘-기반의 나노입자, 실리카-기반의 나노입자, 금속-기반의 나노입자, 플러렌 (fullerene) 및 나노튜브와 같은, 나노 크기의 물질 등이 있다. 분자는 나노입자 매트릭스에 함침될 수 있거나, 또는 그 표면에 흡수될 수 있으며, 바람직하게는 분자는 나노입자에 함침된다.
바람직한 구현예에서, 나노입자는 리포좀이다.
타겟화된 전달은, 리간드를 부가함으로써, 나노입자가 이의 함유물을 전달하는 전달력을 해치지 않으면서, 달성할 수 있다. 이는 특정 세포, 조직 및 장기로의 전달이 가능할 수 있을 것으로 고려된다. 리간드-기반의 전달 시스템의 타겟팅 특이성은 여러가지 세포 타입 상의 리간드 수용체의 분포를 기반으로 한다. 타겟팅 리간드는 나노입자에 비-공유적으로 또는 공유적으로 조합될 수 있으며, 본원에 논의된 다양한 방법으로 나노입자에 접합시킬 수 있다.
나노입자를 타겟팅하기 위해 이용가능할 수 있는 단백질 또는 펩타이드에 대한 예로는, 트랜스페린, 락토페린, TGF-β, 신경 성장인자, 알부민, HIV Tat 펩타이드, RGD 펩타이드 및 인슐린 뿐만 아니라 기타 물질 등이 있다.
본 발명의 나노입자 형태의 제형은 구성성분 (i) 및/또는 (ii)가 세포 내부로 접근하는 것을 용이하도록 하기 위한, 그러나 구성성분 (i) 및/또는 (ii)는 분해로부터 보호하거나 및/또는 나노입자의 대상 장기로의 타겟팅을 용이하게 위한 의도가 아니거나 전혀 아닌 것으로 이해될 것이다.
일 예에서, 나노입자는 폴리(부틸시아노아크릴레이트)(PBCA)와 같은 생분해성 폴리머로 구성될 수 있다. 원소 나노입자에 대한 예로는 탄소 나노입자 및 철 산화물 나노입자 등이 있으며, 이는 추후 올레산 (OA)-Pluronic(R)로 코팅될 수 있다. 이 방식에서, 약물 (예를 들어, 소수성 또는 수불용성 약물)은 나노입자 안에 탑재된다. 다른 나노입자는 실리카로 구성된다.
나노입자는 임의의 유용한 폴리머로부터 만들어질 수 있다. 폴리머에 대한 예로는 생분해성 폴리머, 예를 들어, 폴리(부틸 시아노아크릴레이트), 폴리(락티드), 폴리(글리콜라이드), 폴리-s-카프로락톤, 폴리(부틸렌 숙시네이트), 폴리(에틸렌 숙시네이트) 및 폴리(p-다이옥사논); 폴리(에틸렌글리콜); 폴리-2-하이드록시에틸메타크릴레이트 (폴리(HEMA)); 코폴리머, 예를 들어 폴리(락티드-co-글리콜라이드), 폴리(락티드)-폴리(에틸렌글리콜), 폴리(폴리(에틸렌글리콜)시아노아크릴레이트-코헥사데실시아노아크릴레이트 및 폴리 [HEMA-co-메타크릴산]; 단백질, 예를 들어 피브리노겐, 콜라겐, 젤라틴 및 엘라스틴; 및 다당류, 예를 들어, 아밀로펙틴, 아밀로스 및 키토산 등이 있다.
다른 나노입자로는 고체 지질 나노입자 (SLN)를 포함한다. 고체 지질 나노입자에서 지질 분자에 대한 예로는 스테아르산 및 변형된 스테아르산, 예를 들어 스테아르산-PEG 2000; 대두 레시틴; 및 유화 왁스 등이 있다. 고체 지질 나노입자는 선택적으로 계면활성제, 예를 들어 Epicuron(R) 200, poloxamer 188 (Pluronic(R) F68), Brij 72, Brij 78, 폴리소르베이트 80 (Tween 80); 및 염, 예를 들어 타우로콜레이트 소듐을 비롯하여 다른 성분을 함유할 수 있다. 물질들은 리포좀과 관련하여 기술된 다수 방법들을 통해 고체 지질 나노입자에 도입할 수 있으며, 이러한 방법은 마이크로에멀젼의 분산화 및 고압 호모게니제이션을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 나노입자는 나노미터 크기의 마이셀을 포함할 수 있다. 마이셀은 본원에 기술된 임의 폴리머로부터 만들어질 수 있다. 마이셀을 형성하는 폴리머에 대한 예로는 블록 공중합체, 예를 들어 폴리(에틸렌 글리콜) 및 폴리(ε-카프로락톤) 등이 있다 (예를 들어, ε-카프로락톤의 폴리머 및 α-메톡시-ω-하이드록시-폴리(에틸렌 글리콜)을 비롯한 PEO-b-PCL 블록 공중합체).
특정 구현예에서, 나노입자의 특성은 계면활성제로 코팅함으로써 변형한다. 예를 들어, 폴리소르베이트 20, 40, 60 및 80 (Tween 80)과 같은 폴리소르베이트 계면활성제; Epicuron(R) 200; 188 (Pluronic(R) F68) 폴록사머 908 및 1508과 같은 폴록사머 계면활성제; 및 Brij 72 및 Brij 78과 같은 Brij 계면활성제와 같은, 임의의 생체적합한 계면활성제를 이용할 수 있다.
나노입자는 선택적으로, 친수성 폴리머 기 (예를 들어, 폴리(에틸렌글리콜) 또는 폴리(프로필렌글리콜))를, 예를 들어, 친수성 폴리머 기를 표면에 공유 부착하거나 또는 이러한 친수성 폴리머 기 (예를 들어, 폴리[메톡시 폴리(에틸렌글리콜)시아노아크릴레이트-co-헥사데실 시아노아크릴레이트])를 함유한 폴리머를 이용함으로써, 함유하도록 변형할 수 있다. 나노입자는 선택적으로 가교될 수 있으며, 이는 단백질-기반의 나노입자에 특히 유용할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 나노에멀젼이다. 본원에서, "나노에멀젼"은 적어도 일부 액적이 나노미터 크기 범위인 액적 (또는 입자)의 콜로이드 분산물을 의미한다. 나노에멀젼은 수상에 ω-3, -6 또는 -9 지방산 풍부 오일로 구성되고, 계면 표면 막을 구성하는 양쪽성 계면활성에 의해 열 역학적으로 안정화되며, 고 전단 미세유동화 공정을 통상적으로 이용해 약 80-220 nm 범위의 액적 직경으로 제조된다.
본 발명의 치료학적 용도
일 측면에서, 본 발명은 의약제로서 사용하기 위한 본 발명의 조합물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 암 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 조합물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 암 예방 및/또는 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명의 조합물 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조합물 또는 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 암 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 조합물 또는 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 T 세포를 종양 부위로 동원함으로써 암을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 종양 부위로 동원되는 T 세포는 활성화된 CD4 T 세포이며, 특히 CD4+PD-1+ T 세포, 보다 특히 CD4+PD-1+Tim-3- T 세포이다. 다른 구현예에서, 종양 부위로 동원되는 T 세포는 CD4+PD-1+Tim-3+ T 세포이다. 다른 구현예에서, 종양 부위로 동원되는 T 세포는 CD8 T 세포, 특히 CD8+PD-1+ T 세포이다. 다른 구현예에서, 종양 부위로 동원되는 T 세포는 CD3+ T 세포이다. 다른 구현예에서, 종양 부위로 동원되는 T 세포는 CD3+ CD4+ T 세포. 다른 구현예에서, 종양 부위로 동원되는 T 세포는 Th1/Th17 세포, 특히 Th1/Th17 PD-1+ 세포, 보다 특히 CD4+ IFN+ IL-17+ T 세포, 보다 특히 CD4+ PD-1+ IFN+ IL-17+ T 세포이다. 다른 구현예에서, 종양 부위로 동원되는 세포는 CD45+ 세포이다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 조합물 또는 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, T 조절성 세포의 증폭을 유도함으로써 암을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 조합물 또는 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는, 종양내 CD4+ 및 CD8+ 세포에 의한 IFN-γ의 생산을 유도함으로써 암을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 예방적 또는 치료학적 방법은 Omomyc를 포함하는 폴리펩타이드, 이의 기능적으로 동등한 변이체, 접합체 또는 융합 단백질을 포함하는 조합물 또는 조성물의 직접 사용을 수반한다. 이에, 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 예방적 또는 치료학적 방법은 Omomyc를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체 또는 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 투여, 또는 이 핵산을 코딩하는 벡터 또는 상기한 핵산을 포함하는 세포의 투여를 수반하지 않는다.
"예방"은 질병의 최초 또는 초기 시점에 본 발명의 조합물 또는 조성물을 투여하거나 또는 이의 발병을 방지하기 위해 투여하는 것으로서 이해된다.
용어 "치료"는 임상 징후가 나타나기 전 또는 나타난 후 질병의 진행을 제어하기 위해 본 발명의 조합물 또는 조성물의 투여를 지시하는 것을 의미한다. 질병의 진행 제어는, 비-제한적으로, 증상의 감소, 질병의 기간 단축, 병리학적 병태 안정화 (특히 부가적인 손상 방지), 질병의 진행 지연, 병리학적 증상 개선 및 (부분 및 완전) 관해를 포함하는, 유익하거나 또는 요망하는 임상적인 결과로서 이해된다. 질병의 진행 제어는 또한 치료하지 않을 경우 예상되는 생존과 비교해 생존성 연장을 수반한다. 바람직한 구현예에서, 질병의 진행 제어는 건강한 폐/흉부 체적 비로서 측정한다. 다른 구현예에서, 질병의 진행 제어는 종양 체적 감소로서 측정한다.
용어 "암"은 통제되지 않은 세포 분열 (또는 생존 증가 또는 세포자살 내성), 다른 이웃 조직으로의 세포 침투성 (침입), 또는 림프관 또는 혈관을 통해 세포가 정상적으로 위치하지 않는 신체 다른 부위로의 전파 (전이)를 특징으로 하는 질병을 지칭한다. 종양이 침입 및 전이에 의해 전파할 수 있는 지의 여부에 따라, 이는 양성 또는 악성으로 분류되며; 양성 종양은 침입 또는 전이에 의해 전파될 수 없는 종양이며, 즉 이는 국소 부위에서만 증식하지만; 반면, 악성 종양은 침입 및 전이에 의해 전파가능한 종양이다. 본 발명에 따른 방법은 국소 종양 및 악성 종양을 치료하는데 유용하다.
암은, 일 구현예에서, 비-제한적으로, 백혈병 (예를 들어, 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수모구성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 급성 골수단핵구성 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 급성 적백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병), 모발상세포 백혈병, 진성 적혈구 증가증, 림프종 (예를 들어, 호지킨 질환 또는 비-호지킨 질환), AIDS-관련 백혈병, 발덴스트롬의 마크로글로불린혈증, 다발성 골수종, 중쇄 질환, 및 고형 종양, 예를 들어 육종 및 암종 (예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종 (mendotheliosarcoma), 림프관육종, 림프관내피육종 (lymphangioendotheliosarcoma), 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 카포시 육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 담관암, 식도암, 난소암, 전립선암, 구강암, 예를 들어 편평 세포암, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭성암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 기형종, 융모암, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 폐 암종, 소 세포 폐암, 방광 암종, 상피 암종, 상피내 신생물, 예를 들어 보웬 질환 및 파제트 질환, 신경교종 (neuroglioma 또는 glioma), 성상세포종, 다형성 교모세포종 (GBM, 교모세포종으로도 알려짐), 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종양, 핍지교종, 신경초종, 신경섬유육종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종)을 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 신경교종, 성상세포종, 다형성 교모세포종 (GBM, 교모세포종으로도 알려짐), 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종양, 핍지교종, 신경초종, 신경섬유육종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 또는 망막모세포종이다.
일부 구현예에서, 암은 청신경종양, 성상세포종 (예, 1기 - 털모양 성상세포종, 2기 - 저등급 성상세포종, 3기 - 역형성 성상세포종, 또는 4기 - 교모세포종 (GBM)), 척색종, CNS 림프종, 두개인두종, 뇌간 신경교종, 상의세포종, 혼합된 신경교종, 시신경 신경교종, 뇌실막하세포종, 수모세포종, 수막종, 전이성 뇌암, 핍지교종, 뇌하수체 종양, 원시 신경외배엽 (PNET) 종양 또는 신경초종이다. 일부 구현예에서, 암은 뇌간 신경교종, 두개인두종, 상의세포종, 소아 모양세포 성상세포종 (JPA), 수모세포종, 시신경 신경교종, 송과체 종양, 원시 신경외배엽 종양 (PNET) 또는 간상 종양과 같이, 성인보다는 소아에서 더 흔히 발견되는 유형이다. 일부 구현예에서, 환자는 성인 인간이다. 일부 구현예에서, 환자는 소아 또는 소아 환자이다.
암은, 다른 구현예에서, 비-제한적으로, 중피종, 간담도계 (간과 담관), 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 난소암, 대장암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 위장 (위, 결장직장 및 십이지장)암, 자궁암, 자궁관의 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음주 암종, 호지킨 질환, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 고환암, 만성 또는 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프성 림프종, 방광암, 신장암, 요관암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 비-호지킨 림프종, 척추 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 부신피질암, 담낭암, 다발성 골수종, 담관암, 섬유육종, 신경모세포종, 망막모세포종, 또는 전술한 암 하나 이상의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 간세포암, 난소암, 난소 상피 암 또는 자궁관 암; 유두상 장액성 낭성암종 또는 자궁 유두상 장액성 암종 (UPSC); 전립선암; 고환암; 담낭암; 간담관암; 연조직 및 뼈의 활막 육종; 횡문근육종; 골육종; 연골육종; 유잉 육종; 역형성 갑상선암; 부신피질 선종; 췌장암; 췌장관 암종 또는 췌장 선암종; 위장/위 (GIST) 암; 림프종; 두경부의 편평 세포암 (SCCHN); 침샘 암; 신경교종, 또는 뇌암; 신경섬유종증-1 관련 악성 말초 신경초 종양 (MPNST); 발덴스트롬의 마크로글로불린혈증; 또는 수모세포종으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 암은 간세포암 (HCC), 간모세포종, 대장암, 직장암, 난소암, 난소 상피 암, 자궁관 암, 유두상 장액성 낭성암종, 자궁 유두상 장액성 암종 (UPSC), 간담관암, 연조직 및 뼈의 활막 육종, 횡문근육종, 골육종, 역형성 갑상선암, 부신피질 선종, 췌장암, 췌장관 암종, 췌장 선암종, 신경교종, 신경섬유종증-1 관련 악성 말초 신경초 종양 (MPNST), 발덴스트롬의 마크로글로불린혈증 또는 수모세포종으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 암은 고형 종양, 예를 들어, 육종, 암종 또는 림프종이다. 고형 종양은 전형적으로 낭종 또는 액체 영역을 함유하지 않는 비정상적인 조직 덩어리를 일반적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 신장 세포 암종 또는 신장 암; 간세포암 (HCC) 또는 간모세포종 또는 간암; 흑색종; 유방암; 결장직장 암종 또는 결장직장암; 대장암; 직장암; 항문암; 폐암, 예를 들어 비-소 세포성 폐암 (NSCLC) 또는 소 세포성 폐암 (SCLC); 난소암, 난소 상피 암, 난소 암종 또는 자궁관 암; 유두상 장액성 낭성암종 또는 자궁 유두상 장액성 암종 (UPSC); 전립선 암; 고환암; 담낭암; 간담관암; 연조직 및 뼈의 활막 육종; 횡문근육종; 골육종; 연골육종; 유잉 육종; 역형성 갑상선암; 부신피질 암종; 췌장암; 췌장관 암종 또는 췌장 선암종; 위장/위 (GIST) 암; 림프종; 두경부의 편평 세포암 (SCCHN); 침샘 암; 신경교종, 또는 뇌암; 신경섬유종증-1 관련 악성 말초 신경초 종양 (MPNST); 발덴스트롬의 마크로글로불린혈증; 또는 수모세포종으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 암은 간세포암 (HCC), 간모세포종, 대장암, 직장암, 난소암, 난소 상피 암, 난소 암종, 자궁관 암, 유두상 장액성 낭성암종, 자궁 유두상 장액성 암종 (UPSC), 간담관암, 연조직 및 뼈의 활막 육종, 횡문근육종, 골육종, 역형성 갑상선암, 부신피질 암종, 췌장암, 췌장관 암종, 췌장 선암종, 신경교종, 신경섬유종증-1 관련 악성 말초 신경초 종양 (MPNST), 발덴스트롬의 마크로글로불린혈증 또는 수모세포종으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 암은 간세포암 (HCC)이다. 일부 구현예에서, 암은 간모세포종이다. 일부 구현예에서, 암은 대장암이다. 일부 구현예에서, 암은 직장암이다. 일부 구현예에서, 암은 난소암 또는 난소 암종이다. 일부 구현예에서, 암은 난소 상피 암이다. 일부 구현예에서, 암은 자궁관 암이다. 일부 구현예에서, 암은 유두상 장액성 낭성암종이다. 일부 구현예에서, 암은 자궁 유두상 장액성 암종 (UPSC)이다. 일부 구현예에서, 암은 간담관암이다. 일부 구현예에서, 암은 연조직 및 뼈의 활막 육종이다. 일부 구현예에서, 암은 횡문근육종이다. 일부 구현예에서, 암은 골육종이다. 일부 구현예에서, 암은 역형성 갑상선암이다. 일부 구현예에서, 암은 부신피질 암종이다. 일부 구현예에서, 암은 췌장암 또는 췌장관 암종이다. 일부 구현예에서, 암은 췌장 선암종이다. 일부 구현예에서, 암은 신경교종이다. 일부 구현예에서, 암은 악성 말초 신경초 종양 (MPNST)이다. 일부 구현예에서, 암은 신경섬유종증-1 관련 MPNST이다. 일부 구현예에서, 암은 발덴스트롬의 마크로글로불린혈증이다. 일부 구현예에서, 암은 수모세포종이다.
일부 구현예에서, 암은, 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 I (HTLV-I)에 의해 유발되며 백혈병 세포에서 HTLV-I의 클론 통합을 특징으로 하는 CD4+ T-세포 백혈병의 고 공격성 형태인, 인간면역결핍 바이러스 (HIV) 관련 고형 종양, 인간 유두종 바이러스 (HPV)-16 양성의 치유성 고형 종양 및 성인 T 세포 백혈병을 비롯한, 바이러스-관련 암 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/ NCT02631746); 및 위암, 비인두 암종, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 두경부의 편평 세포암 및 메르켈 세포 암종에서 바이러스-관련 종양이다 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT02488759; https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT0240886; https://clinicaltrials.gov/ct2/show/ NCT02426892 참조).
당해 기술 분야에서 당업자들에게 기타 암들도 공지되어 있을 것이다.
일부 구현예에서, 암은 흑색종 암이다. 일부 구현예에서, 암은 유방암이다.
다른 구현예에서, 암은 교모세포종이다.
"교모세포종"은 교모세포종 및 IV기 성상세포종으로도 알려져 있으며, 뇌에서 시작되는 가장 흔하고 가장 공격적인 암이다.
바람직한 구현예에서, 암은 폐암이다.
용어 "폐암" 또는 "폐 종양"은 폐의 조직에서 제어되지 않은 세포 증식을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 병태를 의미한다. 용어 폐암은 폐의 모든 암을 지칭하는 것을 의미하며, 비-소 세포성 폐 암종 및 소 세포 폐암을 포함한다. 일 구현예에서, 폐암은 비-소 세포성 폐암 (NSCLC)이다. 다른 구현예에서, 폐암은 소 세포성 폐암 (SCLC)이다.
본원에서, 용어 비-소 세포성 폐암 (NSCLC)은, 세계 보건기구/국제 폐암 연구 위원회의 조직 분류에 따르면, 이의 예후 및 관리가 대략적으로 동일하므로, 이를 총괄적으로 비-균일 질환 (heterogeneous disease) 군을 지칭하며, 하기를 포함한다 (Travis WD et al. Histological typing of lung and pleural tumours. 3rd ed. Berlin: Springer-Verlag, 1999):
(i) NSCLC의 30-40%를 차지하는 편평 세포암 (SCC)은 큰 호흡기에서 발생하여 서서히 커지며, 진단 시점에 이들 종양은 크기가 다양하다.
(ii) 선암종은 NSCLC의 50%-60%를 차지하는 NSCLC의 가장 흔한 서브타입으로, 폐의 가스-교환이 이루어지는 표면 주변에서 발생하고, 차별적인 치료 반응을 나타낼 수 있는 기관지 폐포암을 서브타입으로 포함한다.
(iii) 거대 세포 암종은 폐의 표면 근처에서 증식하는 빠르게 증식하는 형태이다. 이는 주로 배제 진단이며, 더 많은 조사가 행해지게 되면, 일반적으로 편평세포암 또는 선암종으로 재분류된다.
(iv) 아데노편평 상피암은 2가지 타입의 세포, 편평 세포 (특정 장기를 라이닝하는 얇고 평평한 세포) 및 샘-유사 세포를 포함하는 암 타입이다.
(v) 다형 (pleomorphic), 육종 (sarcomatoid) 또는 육종 인자 (sarcomatous element)를 가진 암종. 이는 조직학적인 이질성 (histological heterogeneity)과 상피 및 간엽 분화에서 연속성 (continuum)을 나타내는 희귀 종양 군이다.
(vi) 유암종 종양은 느리게 증식하는 신경내분비 폐 종양이며, 신경계에 의해 제공된 자극에 반응하여 호르몬을 방출할 수 있는 세포에서 발생한다.
(vii) 타액선 타입의 암종은 폐의 큰 기도 내부에 위치한 타액선 세포에서 발생한다.
(viii) 미-분류 암종은 상기한 폐암 범주로 분류되지 않는 암을 포함한다.
특정 구현예에서, NSCLC는 폐의 편평 세포암, 폐의 거대 세포 암종 및 폐의 선암종으로부터 선택된다.
본원에서, 용어 소 세포성 폐암 (SCLC)은 내분비/부종양성 증후군과 연관된, 이 종양을 제공하는 조밀한 신경분비성 과립을 함유한, 독특하고 엄격한 형태학적 특징을 가진 소형 세포의 증식을 의미한다. 대부분의 사례는 큰 기도 (1차 기관지 및 2차 기관지)에서 발생한다. 이들 암은 빠르게 증식하여, 질환 진행 초기에 전파된다.
보다 더 바람직한 구현예에서, 폐암은 선암종이며, 더 바람직하게는 KRas-유발성 폐 선암종이며, 바람직하게는 KRAS 유전자에 존재하는 돌연변이와 관련있는 암이다. 일 구현예에서, KRAS 유전자에서의 돌연변이는 12번 위치의 글리신, 13번 위치의 글리신 또는 61번 위치의 글루타민에서의 돌연변이이다. 더 바람직한 구현예에서, 돌연변이는 G12S 돌연변이, G12V 돌연변이, G12D 돌연변이, G13D 돌연변이, G12C 돌연변이, G12R 돌연변이, G12F 돌연변이, G12I 돌연변이, G13C 돌연변이, G13R 돌연변이 또는 Q61L 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 돌연변이는 G12D 돌연변이이다. 다른 구현예에서, 폐암은 KRasGD12/p53-유발성 폐암, 바람직하게는 KRasGD12/p53-유발성 NSCLC이다.
일 구현예에서, 암은 원발성 종양이다. 본원에서, 용어 "원발성 종양"은 이것이 존재하는 위치 또는 장기에서 기원하고 그 위치에서 다른 위치로 전이되지 않은 종양을 지칭한다.
다른 구현예에서, 암은 암 전이이다. 본 발명의 맥락에서, "전이"는 암이 시작된 장기에서 다른 장기로 전파되는 것으로서 이해된다. 일반적으로, 혈액 또는 림프 시스템을 통해 이루어진다. 암 세포가 퍼져 신생 종양이 발생될 경우, 신생 종양을 2차 또는 전이성 종양으로 지칭한다. 2차 종양을 형성하는 암 세포는 오리지널 종양의 세포와 유사하다. 만일 예를 들어 유방암이 폐로 퍼지면 (전이되면), 2차 종양은 악성 유방암 세포로 형성된다. 폐에서의 질환은 전이성 유방암이고, 폐암이 아니다. 본 발명의 발명자들은 또한, 본 발명의 조합물 또는 조성물은 암이 Myc 단백질의 발현 활성 증가를 보이는지와는 무관하게, 세포 증식을 낮출 수 있다는 것을, 관찰하였다. 바람직한 구현예에서, 예방 또는 치료할 암은 Myc-유발성 암이다.
일 구현예에서, 암은 고형 종양이다.
본 발명의 화합물들의 모든 조합물 및 암 타입들이 본 발명에 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조합물 또는 조성물은 종양의 증식 중단을 야기한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조합물 또는 조성물은 종양 크기 (예, 체적 또는 무게)를 치료전 종양의 크기에 대해 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% 또는 99%로 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조합물 또는 조성물은 치료 전 종양의 양과 비교해 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% 또는 99%로 환자의 종양의 양을 감소시킨다.
본원에서, "개체"는 암을 가지고 있거나 또는 암 증상을 보이거나 또는 암을 앓거나 암 증상을 보일 위험이 있는 임의의 동물을 포함한다. 적절한 개체 (환자)로는 실험 동물 (예, 마우스, 랫, 토끼 또는 기니아피그), 농장 동물 및 가축 또는 애완 동물 (예, 개 또는 고양이)를 포함한다. 인간을 제외한 영장류, 바람직하게는 인간 환자가 포함된다. 바람직하게는, 개체는 포유류이고, 가장 바람직하게는 인간이다.
암을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한 조합물 또는 조성물은 암을 치료하거나 또는 암의 심각성을 약화하는데 효과적인 임의의 투여 함량 및 및 임의의 경로를 이용해 투여할 수 있다. 필요한 정확한 양은 개체에 따라, 개체의 종, 나이 및 전반적인 상태, 질환 또는 병태의 중증도, 구체적인 물질, 이의 투여 방식 등에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 화합물은 바람직하게는 투여 용이성과 투여량 균일성을 위해 투여량 단위 (dosage unit)로 제형화된다. 본원에서, "투여량 단위 형태"라는 표현은 치료할 환자에 적절한 물질의 물리적인 개별 단위를 의미한다. 그러나, 본 발명의 화합물 및 조성물의 총 일일 사용 (total daily usage)은 적절한 의학적 판단 범위에서 주치의에 의해 결정될 것으로 이해될 것이다. 임의의 특정 환자 또는 유기체에 대해 특이적인 유효한 투여량 범위는 치료 중인 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 구체적인 화합물의 활성; 사용되는 구체적인 조성물; 환자의 나이, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 식이; 사용되는 구체적인 화합물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출율; 치료 지속 기간; 사용되는 구체적인 화합물과 조합하여 또는 동시에 사용되는 약물, 및 의학 기술 분야에서 잘 알려진 유사 인자 등의 다양한 인자들에 따라 결정될 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 구성성분 (i), 바람직하게는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체 또는 접합체는 조합물 또는 조성물의 면역항암제와 암 치료에서 상승적으로 상호작용한다 (치료학적 효과 달성).
구체적으로, 더 바람직한 구현예에서, 암 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 조합물 또는 약학적 조성물은, 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체 또는 접합체가 면역항암제와 암 치료에서 상승적으로 상호작용하는 양으로 존재하는, 조합물 또는 약학적 조성물이다.
용어 "상승적인 효과" 또는 "상승적인 상호작용"은 상호 호환적으로 사용된다. 상승적인 효과는 개별 물질의 시험관내 실제 효과들을 종합하여 예측되는 상가적인 효과보다 높은 효과이다. 생체내 상승적인 효과는 생체내 개별 물질의 실제 효과들을 합하여 예측되는 상가적인 효과보다 높은, 생리학적 효과, 특히 치료학적 효과이다.
이에, 2가지 물질을 투여할 경우, 만일 이들 물질들을 합한 실제 효과가 개별 물질들의 실제 치료 효과들을 합하여 예측되는 것보다 높다면, 이는 함께 측정가능한 생리학적 효과, 특히 치료학적 효과를 제공하는 것이다. 구체적으로, 제1 물질이 단독으로 일부 측정가능한 효과를 제공하고, 제2 물질이 단독으로 일부 측정가능한 효과를 제공하며, 이 2가지 물질이 함께 개별 물질들을 합하여 제공되는 효과보다 높은 측정가능한 효과를 제공한다면, 상승적인 효과가 제공되는 것이다. 보다 구체적으로, 제1 물질이 단독으로 측정가능한 효과를 제공하지 않고, 제2 물질이 단독으로 일부 측정가능한 효과를 제공하며, 이 2가지 물질이 함께 제2 물질 단독에 의해 제공되는 효과보다 높은 측정가능한 효과를 제공한다면, 상승적인 효과가 제공되는 것이다. 더욱 구체적으로, 제1 물질이 단독으로도 제2 물질이 단독으도로 임의의 측정가능한 효과를 제공하지 않지만 이들 2가지 물질이 함께 측정가능한 효과를 제공한다면, 상승적인 효과가 제공되는 것이다. 구성성분 (i) 및 (ii)가 상승적으로 작용하므로, 본 발명의 조합물 또는 조성물의 구성성분 (i) 및 (ii)의 양은 치료학적 물질로서 이들 중 단 한가지만 이용하는 단일요법에서 필요한 것보다 적을 수 있다. 바람직하게는, 이들 조합물 또는 조성물에서, 한가지 또는 다른 치료학적 물질의 투여량 0.01 내지 1.000 ㎍/체중 kg/일을 투여할 수 있다.
조합물 또는 조성물에 존재하는 치료학적 물질의 양은 치료학적 물질을 단독 활성 물질로서 포함하는 조성물로 정상적으로 투여할 양보다 많지 않을 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 치료학적 물질의 양은 물질을 단독 치료학적 활성 물질로서 포함하는 조성물에 정상적으로 존재하는 양의 약 50% 내지 100% 범위일 것이다. 일부 구현예에서, 한가지 치료학적 물질은 그 물질이 정상적으로 투여되는 양의 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%에 해당하는 투여량으로 투여된다. 본원에서, "정상적으로 투여된다"는 것은 FDA 허가된 치료학적 물질이 FDA 라벨 인서트에 따라 투여시 제공되는 것으로 허가된 양을 의미한다.
또한, 본 발명의 조합물 또는 조성물은 공지된 치료학적 공정과 조합하여, 예를 들어, 화학요법, 방사선 요법, 면역요법, 광요법, 외과적 개입, 호르몬 또는 이들의 조합과 조합하여, 이용할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 암 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 약학적 조성물 또는 조합물은 폐암, 바람직하게는 NSCLC, 더 바람직하게는 KRas-유발성 암, 보다 더 바람직하게는 KRASG12D-유발성 암을 치료하기 위한 것이며, 여기서 제1 구성성분, 바람직하게는 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 더 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 폴리펩타이드는 비강내 투여하고; 제2 구성성분, 바람직하게는 T 세포 활성화를 저해하는 단백질의 길항제, 더 바람직하게는 anti-PD-1 또는 anti-CTLA-4, 보다 더 바람직하게는 anti-PD-1 항체 또는 anti-CTLA-4 항체는 전신, 바람직하게는 비경구, 보다 더 바람직하게는 복막내로 투여한다. 바람직한 구현예에서, 제1 구성성분은 주당 4회 투여한다. 바람직한 구현예에서, 제2 구성성분은 주당 1회로 투여한다. 더 바람직한 구현예에서, 제1 구성성분은 주당 4회로 투여하고, 제2 구성성분은 주당 1회로 투여한다. 일 구현예에서, 제1 구성성분 및 제2 구성성분은 순차적으로 투여하며, 즉, 제1 구성성분의 투여는 제2 구성성분의 투여를 개시하기 전에 중단된다. 바람직한 구현예에서, 치료는 적어도 4주간 지속된다. 바람직한 구현예에서, 제1 구성성분과 제2 구성성분은 서로 다른 일자에 투여한다. 바람직한 구현예에서, 제1 구성성분은 1일, 2일, 4일 및 5일에 투여하고, 제2 구성성분은 3일에 투여한다. 공동-투여에 대한 바람직한 구현예에서, 제1 구성성분과 제2 구성성분은 서로 다른 일자에 투여하고, 바람직하게는 제1 구성성분은 1일, 2일, 4일 및 5일에 투여하고, 제2 구성성분은 3일에 투여한다. 바람직한 구현예에서, 구성성분 (i)과 구성성분 (ii) 간의 함량 비율은 50:1 내지 1:50 범위, 특히 20:1 내지 1:20, 1:10 내지 10:1 또는 5:1 내지 1:5 범위, 바람직하게는 1:1 내지 1:5, 더 바람직하게는 1:1 내지 1:3 범위일 수 있다. 더 바람직한 구현예에서, 그 비율은 1:1 내지 1:1.5, 바람직하게는 1:1.3 내지 1:1.4, 더 바람직하게는 1:1.34 범위일 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 그 비율은 1:1 내지 1:2.8, 바람직하게는 1:2.6 내지 1:2.7 범위, 더 바람직하게는 1:2.67이다. 이들 비율은 바람직하게는 w/w 비율이다.
바람직한 구현예에서, 암 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조합물 또는 약학적 조성물은 폐암, 바람직하게는 NSCLC, 더 바람직하게는 KRas-유발성 암, 보다 더 바람직하게는 KRASG12D-유발성 암, 바람직하게는 KRASG12D/p53-유발성 암을 치료하기 위한 것이며, 여기서 제1 구성성분, 바람직하게는 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 더 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 폴리펩타이드는 정맥내로 투여하고; 제2 구성성분, 바람직하게는 T 세포 활성화를 저해하는 단백질의 길항제, 더 바람직하게는 anti-PD-1 또는 anti-CTLA-4, 보다 더 바람직하게는 anti-PD-1 항체 또는 anti-CTLA-4 항체, 보다 더 바람직하게는 anti-PD-1 항체는 전신으로, 바람직하게는 비경구로, 보다 더 바람직하게는 복막내로 투여한다. 바람직한 구현예에서, 제1 구성성분은 주당 2회 투여한다. 바람직한 구현예에서, 제2 구성성분은 주당 1회로 투여한다. 더 바람직한 구현예에서, 제1 구성성분은 주당 2회로 투여하고, 제2 구성성분은 주당 1회로 투여한다. 일 구현예에서, 제1 구성성분 및 제2 구성성분은 순차적으로 투여하며, 즉, 제1 구성성분의 투여는 제2 구성성분의 투여를 개시하기 전에 중단된다. 다른 구현예에서, 제1 구성성분과 제2 구성성분은 동시에, 바람직하게는 주당 1회로 투여한다. 바람직한 구현예에서, 치료는 적어도 3주간, 바람직하게는 적어도 4주간 지속된다. 바람직한 구현예에서, 제1 구성성분과 제2 구성성분은 서로 다른 일자에 투여한다. 바람직한 구현예에서, 제1 구성성분은 2일 및 5일에 투여하고, 제2 구성성분은 3일에 투여한다. 공동-투여에 대한 바람직한 구현예에서, 제1 구성성분과 제2 구성성분은 서로 다른 일자에 투여하고, 바람직하게는 제1 구성성분은 2일 및 5일에 투여하고, 제2 구성성분은 3일에 투여한다. 더 바람직한 구현예에서, 제1 구성성분은, 제2 구성성분을 투여하기 전, 소정의 기간 동안, 바람직하게는 적어도 5일, 적어도 10일, 적어도 15일, 더 바람직하게는 10일 동안 투여된다. 일 구현예에서, 제1 구성성분의 투여는 제2 화합물의 투여를 개시하기 전에 중단된다. 바람직한 구현예에서, 구성성분 (i)과 구성성분 (ii) 간의 함량 비율은 50:1 내지 1:50 범위, 특히 20:1 내지 1:20, 1:10 내지 10:1 또는 5:1 내지 1:5 범위일 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 그 비율은 30:1 내지 5:1, 바람직하게는 30:1 내지 8:1, 더 바람직하게는 25:1 내지 15:1, 더 바람직하게는 20:1 내지 10:1 범위이다. 일 구현예에서, 그 비율은 20:1이다. 다른 구현예에서, 그 비율은 10:1이다. 이들 비율은 바람직하게는 w/w 비율이다.
본 발명의 조합물에 대한 모든 구현예들은 본 발명의 치료학적 방법에도 적용가능하다.
제조 물품 및 키트
본원은 또한 본원에 기술된 조합물 또는 약학적 조성물들 중 어느 하나를 하나 이상의 용기에 포함하는 제조 물품을 제공한다. 일부 구현예에서, 제조 물품은, 예를 들어, 책자, 인쇄된 설명서, 라벨 또는 사용자 (예, 유통업자 또는 최종 사용자)가 암 예방 및/또는 치료를 위해 제조 물품의 조성물을 조합 및/또는 사용하는 것을 지시하는 패키지 인서트를 포함한다.
일부 구현예에서, 제조 물품은, 예를 들어, 바틀(들), 바이얼(들), 카트리지(들), 박스(들), 주사기(들), 주입기(들) 또는 이들의 임의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 라벨은 본원에 기술된 방법에 따라 제조 물품의 조합물 또는 약학적 조성물을 투여 또는 사용을 언급한다. 일부 측면들에서, 라벨은 예를 들어 사용 용법, 암을 치료, 예방 또는 개선하기 위한 용법을 제안한다.
본 출원 전체에 인용될 수 있는 모든 인용된 참조문헌 (참조문헌, 특허, 특허 출원 및 웹사이트 등)의 내용은, 그 문헌에 인용된 참조문헌과 같이, 임의 목적에서 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다.
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본원에서 모든 용어는, 달리 언급되지 않은 한, 당해 기술 분야에 공지된 바와 같은 일반적인 의미로 이해될 것이다. 본 출원에서 사용되는 특정 용어들에 대한 다른 더 구체적인 정의는 아래에 기술한 바와 같으며, 달리 명시적으로 기술된 정의가 더 넓은 정의를 제공하지 않은 한 명세서 및 청구항 전체에서 균일하게 적용되는 것으로 의도된다. 명세서 및 청구항 전체에서, 용어 "포함한다" 및 이의 변형어는 다른 기술적인 특징, 첨가제, 구성성분 또는 단계를 배제하는 것으로 의도되지 않는다. 아울러, 용어 "포함한다"는 "로 구성되는"의 경우를 포괄한다. 본 발명의 부가적인 목적, 이점 및 특징들이 본원의 내용을 조사하는 경우에 당업자들에게 자명해지거나 또는 본 발명을 실시함으로써 학습할 수 있다. 또한, 본 발명은 본원에 기술된 특정 및 특정 구현예들의 모든 가능한 조합들을 포괄한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥상 명확하게 지시되지 않은 한 복수의 언급도 포함한다. 용어 "a" (또는 "an"), 뿐 아니라 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 아울러 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 본원에서 명시된 2가지 특징들 및 구성성분들을 구체적으로 기술하는 것으로 이해된다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B" 표현에서 사용되는 바와 같이, 용어 "및/또는"은 "A 및 B," "A 또는 B," "A" (단독) 및 "B" (단독)를 포괄하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"과 같은 표현에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음과 같은 측면들을 각각 포괄하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독). 명세서 및 청구항 전체에서 수치 값에 대해 사용된, 용어 "약"은, 당해 기술 분야의 당업자에게 익숙하고 허용가능한 정확도 범위를 나타낸다. 일반적으로, 이러한 정확도 범위는 ± 15 %이다. 달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본원과 관련있는 당해 기술 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 단위, 접두사 및 기호는 허용되는 국제 단위 (SI) 형태로 기재된다. 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 달리 언급되지 않은 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌에서 우측으로 기재된다. 본원에 기재된 제목은 본원의 다양한 측면들 또는 측면을 제한하는 것은 아니며, 명세서 전체에 원용될 수 있다. 이에, 바로 아래에서 정의되는 용어들은 그 전체가 명세서에 원용에 의해 보다 완전하게 정의된다.
본 발명은 주로 예시로서 간주되며 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 간주되는 후술한 실시예들을 들어 기술될 것이다.
실시예
Omomyc의 제조 및 정제
N-말단에 메티오닌을 함유한 Omomyc 펩타이드 서열 (서열번호 4)을 역전사하고, E. coli에서 발현을 위해 코돈 최적화한 다음 pET3a 발현 벡터 (Novagen)에 클로닝하여 BL21 (DE3) 아라비노스-유도성 (Invitrogen®) 박테리아 균주로부터 J.-F. Naud et al. 2003. J Mol Biol, 326:1577-1595; F.-O. and Mcduff et al. 2009. J Mol Recognit, 22:261-269에 기술된 Max° 정제 프로토콜로부터 수정한 프로토콜에 따라 정제하였다. 수득한 정제된 구조체는 서열번호 4의 폴리펩타이드였다. 각 정제한 구조체의 정체를 질량 분광 측정 및 웨스턴 블롯 분석으로 검증하였다. Omomyc는 양이온성 교환에 의해 정제하고, 순도를 질량 분광 측정 분석, SDS-PAGE 및 UV 분광측정에 의해 검증하였다. 생체내 투여하기 위한 경우, ToxinEraser™ 내독소 제거 키트 (Genscript)를 사용해 내독소를 제거하기 위해 추가적인 정제 단계를 수행하였다. 내독소 농도를 Pierce® LAL 발색성 내독소 정량 키트 (Thermo Scientific)를 사용해 정량하였다. Amicon Ultra-15 (MerckMillipore)에서 3 kDa 배제 제한을 적용해 완충제 교체를 수행하였다.
Omomyc 비강내 치료는 종양 부위로의 특이적으로 T 림프구의 동원을 증가시킨다
KRasLSL - G12D /+ 마우스를 Transnetyx에서 유전자형을 분석하고, 수컷 및 암컷 둘다에서 폐 종양의 생성을 전술한 바와 같이 수행하였다 (Jackson, E.L., et al., Genes Dev, 2001. 15(24): p. 3243-8). 동물은 C57BL/6J x FVBN 혼합 백그라운드로 유지시켰다. 시점 및 조건 당 마우스 최소 5마리를 무작위 분류하고, 마우스에서 micro-CT에 의해 검출가능한 종양의 존재가 확인되면 Adeno-Cre 감염 후 14-16주에 치료를 개시하였다. 동물을 이소플루란 흡입 (AbbVie Farmaceutica S.L.U.)으로 마취시키고, Omomyc 폴리펩타이드 (2.4 mg/kg) 또는 비히클 (10 mM 소듐 아세테이트 pH 6.5)을 총 부피 30 ㎕로 1주 또는 4주 동안 주당 4회로 (1101100) 비강내 처리하였다.
엔드포인트에서, 마우스를 안락사시키고, 폐를 적출하고, 기도를 통해 4% PFA를 관류시킨 다음 밤새 고정한 70% 에탄올로 옮겨 파라핀 포매한 후, 조직 단편을 4 ㎛ 두께로 잘랐다. CD3 면역형광성을 위해, 0.01 M 사이트레이트 완충제 pH 6.0에서 400 W 마이크로웨이브 하에 20분간 가열하여 항원 회복을 수행하였다. 3% BSA+0.05% Tween20에서 1시간 동안 차단 처리한 다음, 슬라이드를 Dako 레디 투 유스 희석제 (Dako S2022)에 1/100으로 희석한 anti-CD3 (Dako A0452)와 함께 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS로 헹군 다음, 염소 항-토끼 IgG (H+L)-AlexaFluor®488 접합체 (Thermo Fisher Scientific A-11008)와 인큐베이션하고, 1/10000으로 희석한 DAPI (Life Technologies D1306)로 염색한 다음 PBS로 헹군 후 형광 마운팅 매질 (Dako S3023)과 함께 마운팅하였다. Nikon C2+ 공초점 현미경 및 NIS-엘리먼트 소프트웨어를 사용해 이미지를 획득하였다. 마우스 당 대표적인 종양 사진 5개를 획득하고, 면적 당 CD3+ 세포의 평균을 표시하였다.
anti-CD3 면역염색 결과, Omomyc 처리는 치료 개시 후 1주일 정도로 조기에 종양 부위로 T 림프구의 동원을 증가시켰으며, 모든 처리에서 T 세포는 유지되는 것으로 확인되었으며 (도 1A), 이는 Omomyc 폴리펩타이드의 작동 기전의 일부로서 가능한 면역 기여를 입증해준다.
Omomyc 비강내 처리는 활성화된 CD4 T 세포를 종양 부위로 동원한다.
실험 모델과 Omomyc 처리는 전술한 바와 동일하다.
엔드포인트에서, 마우스를 안락사시키고, 폐를 적출하여 마우스 종양 해리 키트 (Miltenyi)를 사용해 해리한 후 접합 항체로 염색하여 유세포 측정에 의해 면역 세포 카운트를 분석하였다. 염색하기 전, 사멸 세포를 고정가능한 생활성 염료 510 (BD Biosciences 564406)으로 제조사의 지침에 따라 염색하였다. 그런 후, 비특이적인 유니온은 실온에서 10분간 anti-CD16/32 항체와 함께 인큐베이션하여 차단하였다. 표면 염색을 위해, 세포를 항체와 4℃에서 20분간 암조건에서 인큐베이션하였다. 사용 항체는 표 1에 열거하였다. FoxP3를 세포내 염색하기 위해, FoxP3 전사 완충제 세트 (eBioscience 00-5523-00)를 제조사의 지침에 따라 사용하였다. 세포를 CytoFlex 유세포 측정기 (Beckman Coulter)로 획득하고, 데이터를 CytoExpert 2.0 소프트웨어 (Beckman Coulter)를 사용해 분석하였다.
도 1B는 Omomyc가 종양으로의 CD4 T 세포의 동원을 유도하여 활성화됨을 보여주는 FACS 분석을 도시한다. 실제, 이들 세포는 PD-1 및 PD-1 Tim-3 분자들을 더 높은 수준으로 나타내었으며, 이는 Omomyc가 항-종양 면역 반응을 유도함을 시사해준다. 아울러, Omomyc는 또한 T 조절성 세포 (Treg)의 증폭을 유도한다.
Omomyc의 전신 투여는 종양 부위로 T 세포를 동원한다.
Kras/p53 동계 모델을 이용한 실험을 위해, MuH-163 세포 1x106개를 7주령의 암컷 C57BL/6 마우스 (JANVIER LABS)의 등쪽에 피하 접종하였다. 종양이 확립되어 체적 대략 100 mm3에 도달하면, 마우스를 군들로 무작위 분류한 다음 비히클 (PBS pH 7.0) 또는 Omomyc (32 mg/kg)를 주당 1회로 정맥내 처리하였다. 3주간 처리한 후, 마우스를 안락사시키고, 종양을 절단해 2개로 나누었다. 종양 절반을 밤새 4% PFA로 고정하고, 70% 에탄올로 옮겨 파라핀 포매한 다음 4 ㎛ 조직 단편으로 잘랐다. CD3 면역형광을 위해, 0.01 M 사이트레이트 완충제 pH 6.0에서 400 W 마이크로웨이브 하에 20분간 가열하여 항원 회복을 수행하였다. 3% BSA+0.05% Tween20에서 1시간 동안 차단 처리한 다음, 슬라이드를 Dako 레디 투 유스 희석제 (Dako S2022)에 1/100으로 희석한 anti-CD3 (Dako A0452)와 함께 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS로 헹군 다음, 염소 항-토끼 IgG (H+L)-AlexaFluor®488 접합체 (Thermo Fisher Scientific A-11008)와 인큐베이션하고, 1/10000으로 희석한 DAPI (Life Technologies D1306)로 염색한 다음 PBS로 헹군 후 형광 마운팅 매질 (Dako S3023)과 함께 마운팅하였다. Nikon Tie 형광 현미경 및 NIS-엘리먼트 소프트웨어를 사용해 이미지를 획득하였다. 마우스 당 대표적인 종양 부위에 대한 사진 4개를 획득하고, 필드 당 CD3+ 세포의 평균을 표시하였다.
유세포 측정을 분석하기 위해, 종양의 나머지 절반을 마우스 종양 해리 키트 (Miltenyi)를 사용해 해리시키고, 접합 항체로 염색해 유세포 측정을 통해 면역 세포 수를 분석하였다. 염색 전, 사멸 세포를 고정가능한 생활성 염료 510 (BD Biosciences 564406)으로 제조사의 지침에 따라 염색하였다. 그런 후, 비특이적인 유니온은 실온에서 10분간 anti-CD16/32 항체와 함께 인큐베이션하여 차단하였다. 표면 염색을 위해, 세포를 항체와 4℃에서 20분간 암조건에서 인큐베이션하였다. 사용 항체는 표 1에 열거한다. 세포를 CytoFlex 유세포 측정기 (Beckman Coulter)로 획득하고, 데이터를 CytoExpert 2.0 소프트웨어 (Beckman Coulter)를 사용해 분석하였다.
Omomyc 투여는 종양 부위로의 T 세포 동원을 유도하였다 (도 2A). Omomyc는 종양으로 CD8 T 세포를 더 많이 동원하였으며, PD-1 및 Tim-3 분자를 둘다 발현하는 CD4 및 CD8 T 세포를 현저하게 더 많이 동원하였다 (도 2B).
Omomyc는 anti-PD-1과 조합하여 CD4 + PD-1 + Tim-3 - T 세포를 종양으로 동원한다
KRasLSL - G12D /+ 마우스를 Transnetyx에서 유전자형을 분석하고, 수컷 및 암컷 둘다에서 폐 종양의 생성을 전술한 바와 같이 수행하였다 (Jackson, E.L., et al., Genes Dev, 2001. 15(24): p. 3243-8). 동물은 순수한 C57BL/6 혼합 백그라운드로 유지시켰다. 시점 및 조건 당 마우스 최소 5마리를 무작위 분류하고, 마우스에서 micro-CT에 의해 검출가능한 종양의 존재가 확인되면 Adeno-Cre 감염 후 14-16주에 치료를 개시하였다. 동물을 4개의 군으로 무작위 분류하였다: 비히클 + 이소형 랫 IgG2a,k, Omomyc + 이소형 랫 IgG2a,k, 비히클 + anti-PD-1 및 Omomyc + anti-PD-1. Omomyc 처리를 위해, 동물을 이소플루란 흡입 (AbbVie Farmaceutica S.L.U.)으로 마취시키고, Omomyc 폴리펩타이드 (2.4 mg/kg) 또는 비히클 (pH 7)을 총 부피 30 ㎕로 주당 4회로 (1101100) 비강내 처리하였다. Anti-PD-1 (BioXCell BE0146) 또는 이의 이소형 랫 IgG2a,k (BioXCell BE0089)를 4주 동안 주당 1회로 투여량 200 ㎍/마우스로 복막내 제공하였다 (0010000).
엔드포인트에서, 마우스를 안락사시키고, 폐를 적출하여 마우스 종양 해리 키트 (Miltenyi)를 사용해 해리한 후 접합 항체로 염색하여 유세포 측정에 의해 면역 세포 카운트를 분석하였다. 염색하기 전, 사멸 세포를 고정가능한 생활성 염료 510 (BD Biosciences 564406)으로 제조사의 지침에 따라 염색하였다. 비특이적인 상호작용을 실온에서 10분간 anti-CD16/32 항체와 함께 인큐베이션하여 차단하였다. 표면 염색을 위해, 세포를 항체와 4℃에서 20분간 암조건에서 인큐베이션하였다. 사용 항체는 표 1에 열거한다. 세포를 CytoFlex 유세포 측정기 (Beckman Coulter)로 획득하고, 데이터를 CytoExpert 2.0 소프트웨어 (Beckman Coulter)를 사용해 분석하였다.
Omomyc와 anti-PD-1 요법의 조합은 비히클 및 anti-PD-1 단독 처리군 둘다와 비교해, 종양 부위로 Tim-3가 아닌 PD-1을 발현하는 CD4+ T 세포의 동원을 유의하게 증가시켰다 (도 3). 이러한 발견 사실은, Omomyc와 anti-PD-1의 조합이 항-종양 면역 반응을 촉진하는데 상승적으로 작용한다는 것을 보여준다. 최상의 발견 사실은, 종양 침윤성 림프구 (TIL) 상에서 PD-1 발현이 클론 증폭된 종양-반응성 세포의 레페토리를 정확하게 식별함이 입증되어 있다는 것이다 (Gros A et al., J Clin Invest (2014) 124(5): 2246-2259). 이러한 생각에서, 이의 리간드 (PD-L1 및 PD-L2)와의 결합시 저해성 신호가 발생되지만, PD-1 발현이 T 세포 활성화 및 종양 항원에 특이적인 높은 항체항원 결합성 TIL의 제1 마커라는 사실은 현재 명확하다 (Simon S and Labarriere N.. OncoImmunology (2018). 7:1, e1364828에서 검토됨).
Omomyc는 anti-PD-1과 조합하여 IFN -γ의 생산을 유도한다
실험 모델, Omomyc 및 anti-PD-1 처리는 전술한 바와 동일하다.
엔드포인트에서, 마우스를 안락사시키고, 폐를 적출하여 마우스 종양 해리 키트 (Miltenyi)를 사용해 해리한 후 접합 항체로 염색하여 유세포 측정에 의해 면역 세포 카운트를 분석하였다. 염색하기 전, 사멸 세포를 고정가능한 생활성 염료 510 (BD Biosciences 564406)으로 제조사의 지침에 따라 염색하였다. 비특이적인 상호작용을 실온에서 10분간 anti-CD16/32 항체와 함께 인큐베이션하여 차단하였다. 표면 염색을 위해, 세포를 항체와 4℃에서 20분간 암조건에서 인큐베이션하였다. 사용 항체는 표 1에 열거한다. IFN-γ 염색하기 위해, 회수 및 해리시킨 종양 세포를 PMA + 이오노미신 (둘다 Sigma-Aldrich)으로 모넨신 및 베펠드린 A (둘다 BD Biosciences)의 존재 하에 12시간 동안 자극하였다. 그런 후, 세포를 회수하고, 유세포 측정 분석을 위해 염색하였다. 세포내 IFN-γ 염색을 위해, BD Cytofix/Cytoperm 완충제 세트 (BD Biosciences 554722)를 제조사의 지침에 따라 사용하였다. 세포를 CytoFlex 유세포 측정기 (Beckman Coulter)로 획득하고, 데이터를 CytoExpert 2.0 소프트웨어 (Beckman Coulter)를 사용해 분석하였다.
이들 실험을 통해, Omomyc와 anti-PD-1의 조합 요법이 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 종양내 T 세포 둘다에 의해 (도 4) 이의 비히클 카운터파트와 비교해 인터페론-γ (IFN-γ)의 생산을 현저하게 유도하는 것으로 확인되었으며, 이는 Omomyc 또는 anti-PD-1 처리군에서는 관찰되지 않았다.
최근 수년 동안, 종양 거부 및 소거를 촉진하는데 있어 IFN-γ의 중요한 역할을 입증해주는 상당한 양의 증거들이 축적되었다. 이 사이토카인은 주로 활성화된 T 및 NK 세포에 의해 생산되며, 종양 세포에 대해 항-증식성, 세포자살 촉진성 및 괴사성 (necroptotic) 효과를 직접 유도함으로써 이의 항-종양 효과를 발현하며, 주 조직접합성 분자의 상향 조절을 유도함으로써 면역원성을 강화한다 (Castro F et al., Front. Immunol. (2018). 9:847 및 Ikeda H et al., Cytokine & Growth Factors Reviews (2002). 13 95-109에서 광범위하게 검토됨). 아울러, 이 사이토카인은 종양 미세환경에 영향을 미쳐, 종양을 둘러싼 내피 세포의 증식 및 생존의 저해를 통해 혈관신생을 손상시키고, 따라서 종양 부위에서 허혈증을 유도하는데, 이는 종양 거부를 유도하는 주요 기전이다 (Beatty G and Paterson Y. J Immunol (2001) 166:2276-82, Kammertoens T et al., Nature (2017) 545:98-102 및 Briesemeister D et al., Int J Cancer (2011) 128:371-8). 아울러, IFN-γ는 종양 부위로의 T 및 NK 세포의 이동에 결정적이므로, Th1 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ 생산은 종양 소거를 강화한다 (Melero I et al., Cancer Discov (2014) 4:522-6). 또한, IFN-γ는 대식세포를 활성화하고 이의 종양살상 활성을 촉진하는데 중요한 역할을 담당한다 (Celada A et al., J Exp Med (1984) 160:55-74). 중요하게도, IFN-γ 수준 증가는 화학요법 및 방사선 요법뿐 아니라 anti-PD-1 및 CLTA-4 면역요법 둘다에 대한 반응을 예측하는 바이오마커이다 (Karachaliou N et al., Ther Adv Med Oncol (2018) 10:1758834017749748; 및 Mo X et al., Cancer Res (2018) 78:436-50). 일관적으로, 최근 임상 실험은, IFN-γ를 생산하는 작동자 T 세포와 종양 증식 저해 간의 연관성을 보여주는 이미 기대되는 결과들을 보여주었다 (Liakou CI et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2008) 105:14987-92, Peng W et al., Cancer Res (2012) 72:5209-18; 및 Overacre-Delgoffe AE et al., Cell (2017) 169:1130-41.e11).
항체 형광단 클론 제조사 카탈로그 번호
CD16/32 - 93 Biolegend 101302
CD45 BV605 30-F11 Biolegend 103140
CD3e FITC 145-2C11 eBioscience 11-0031
CD4 PerCP-eFluor710 RM4-5 eBioscience 46-0042
CD8a APC-H7 53-6.7 BD Biosciences 560182
PD-1 BV421 29F.1A12 Biolegend 135218
Tim-3 PE-CY7 RMT3-23 eBioscience 25-5870
IFN-γ APC XMG1.2 BD Bioscience 554413
표 1: 유세포 측정에 사용된 항-마우스 항체
Omomyc와 anti-PD-1 항체의 조합은 건강한 폐의 비율을 상승적으로 증가시키고, 종양 부위로 T 세포를 동원한다.
KRasLSL - G12D /+ 마우스를 Transnetyx에서 유전자형을 분석하고, 수컷 및 암컷 둘다에서 폐 종양의 생성을 전술한 바와 같이 수행하였다 (Jackson, E.L., et al., Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev, 2001. 15(24): p. 3243-8). 동물은 순수한 C57BL/6 백그라운드로 유지시켰다. 마우스에서 micro-CT에 의해 검출가능한 종양의 존재가 확인되면 Adeno-Cre 감염 후 14-16주에, 동물을 4주간 다음과 같은 처리하는 4개의 군으로 무작위 할당하였다: 비히클 + 이소형 랫 IgG2a,k, Omomyc + 이소형 랫 IgG2a,k, 비히클 + anti-PD-1 및 Omomyc + anti-PD-1. Omomyc 처리를 위해, 동물을 이소플루란 흡입 (AbbVie Farmaceutica S.L.U.)으로 마취시키고, Omomyc 폴리펩타이드 (3.75 mg/kg) 또는 비히클 (pH 7)을 총 부피 30 ㎕로 주당 4회로 (1101100) 비강내 처리하였다. Anti-PD-1 (BioXCell BE0146) 또는 이의 이소형 랫 IgG2a,k (BioXCell BE0089)를 4주 동안 주당 1회로 5 mg/kg으로 복막내 제공하였다 (0010000).
microCT 실험을 퀀텀 FX 이미징 시스템 (Perkin Elmer. 940 Winter St. Waltham, Massachusetts. EEUU)으로 수행하였으며, 영상 재구축은 Feldkamp의 방법을 기반으로 하였다. 흉부 체적의 경우, 퀀텀 FX 분석 소프트웨어를 사용하였다. 먼저, 대측 늑골 간의 거리를 카리나 (carina) 수준 (r2)에서 측정하였다. 2차 측정은 카리나 수준에서 횡격막 큐플 (diaphragmatic cupule)(h)까지의 최대 거리로서 정의하였다. 마지막 측정은 흉골에서 횡격막 큐플 수준에서 요추하 근육 구조까지의 거리로 정의되는 흉부 높이 (r1)이었다. 이들 3가지 수치로, 절단 원뿔 높이를 하기 수학식으로 계산하였다:
체적 = 높이 * pi/3*(r13-r23)/(r1-r2)
폐의 건강한 조직을 역치 방법을 이용해 AMIDE 소프트웨어 (Amideⓒ Andreas Loening)로 계산하였다. 이 역치는 -950/-350 회색조 범위에 포함된 강도 값을 가진 아미지의 전체 복셀 양을 선택한다. 이 회색조 범위는 여러가지 실험들에서 조사한 후 수동으로 선택하였다.
마지막으로, 완전한 흉부 체적은 유지되지만 건강한 폐 체적이 병리학적 진행에 따라 점차적으로 감소된다는 개념 하에, 건강한 폐/흉부 체적 비율을 계산하였다. Omomyc를 anti-PD-1과 조합 처리한 동물에서는 비히클 및 처리제 단독과 비교해 건강한 폐의 비율 증가가 관찰되었다 (도 5A 및 5B).
엔드포인트에서, 마우스를 안락사시키고, 폐를 적출하여 마우스 종양 해리 키트 (Miltenyi)를 사용해 해리한 후 접합 항체로 염색하여 유세포 측정에 의해 면역 세포 카운트를 분석하였다. 염색하기 전, 사멸 세포를 고정가능한 생활성 염료 510 (BD Biosciences 564406)으로 제조사의 지침에 따라 염색하였다. 그런 후, 비특이적인 교차 반응을 실온에서 10분간 anti-CD16/32 항체와 함께 인큐베이션하여 차단하였다. 표면 염색을 위해, 세포를 항체와 4℃에서 20분간 암조건에서 인큐베이션하였다. 사용 항체는 표 2에 열거한다.
항체 형광단 클론 제조사 카탈로그 번호
CD16/32 - 93 Biolegend 101302
CD45 BV605 30-F11 Biolegend 103140
CD3e FITC 145-2C11 eBioscience 11-0031
CD4 PerCP-eFluor710 RM4-5 eBioscience 46-0042
CD8a APC-H7 53-6.7 BD Biosciences 560182
PD-1 BV421 29F.1A12 Biolegend 135218
Tim-3 PE-CY7 RMT3-23 eBioscience 25-5870
IFN -γ APC XMG1.2 BD Bioscience 554413
IL-17 PE TC11-18H10 BD Bioscience 559502
표 2. 유세포 측정 분석에 사용된 항-마우스 항체
IFN-γ 및 IL-17을 염색하기 위해, 회수 및 해리한 종양 세포를 PMA + 이오노미신 (둘다 Sigma-Aldrich)으로 모넨신 및 베펠드린 A (둘다 BD Biosciences)의 존재 하에 12시간 동안 자극하였다. 그런 후, 세포를 회수하고, 유세포 측정 분석을 위해 염색하였다. 세포내 IFN-γ 염색을 위해, BD Cytofix/Cytoperm 완충제 세트 (BD Biosciences 554722)를 제조사의 지침에 따라 사용하였다. 세포를 CytoFlex 유세포 측정기 (Beckman Coulter)로 획득하고, 데이터를 CytoExpert 2.0 소프트웨어 (Beckman Coulter)를 사용해 분석하였다.
도 5C는 Omomyc와 anti-PD-1의 조합 투여가 종양 부위로의 T 세포의 동원을 유도하는 것으로, 특히 CD4 T 세포 및 Th1/Th17 세포의 동원을 유도한다는 것을 보여준다. 표 3은 수득되는 효과가 상승적임을 보여준다. 대상 면역 세포 집단에서의 증가는 개별 처리에 따른 증가들의 합보다 높을 경우에 상승적인 것으로 간주한다.
비히클 Omomyc PD - 1 Omo +PD-1
% CD3 (평균)
비히클 대비 증가
개별 처리의 합 		15.78 16.61 16.69 18.62
0.83 0.91 2.84
1.74 상승 작용
% CD4 (평균)
비히클 대비 증가
개별 처리의 합 		6.981 9.623 8.003 10.75
2.642 1.022 3.769
3.664 상승 작용
% Th1 / Th17 (평균)
비히클 대비 증가
개별 처리의 합 		3.424 6.707 3.148 8.054
3.283 -0.276 4.63
3.007 상승 작용
표 3. 각 면역 세포 집단의 평균 수치
Omomyc와 anti- CTLA -4 항체의 조합은 종양 증식을 상승적으로 감소시키고, 종양 부위로 항-종양 T 세포를 동원한다.
실험 모델, micro-CT 스캔 및 FACS 염색은 도 5에 기술된 바와 동일하게 수행하였다.
Adeno-Cre 감염 후 14-16주 후에, 마우스에서 micro-CT에 의해 검출가능한 종양의 존재가 확인되면, 동물을 4주간 다음과 같은 처리하는 4개의 군으로 무작위 할당하였다: 비히클 + 이소형 시리안 햄스터 IgG2, Omomyc + 이소형 시리안 햄스터 IgG, 비히클 + anti-CTLA-4 및 Omomyc + anti-CTLA-4. Omomyc 처리를 위해, 동물을 이소플루란 흡입 (AbbVie Farmaceutica S.L.U.)으로 마취시키고, Omomyc 폴리펩타이드 (3.75 mg/kg) 또는 비히클 (pH 7)을 총 부피 30 ㎕로 주당 4회로 (1101100) 비강내 처리하였다. Anti-CTLA-4 (BioXCell BE0131) 또는 이의 이소형 시리안 햄스터 IgG (BioXCell BE0087)를 4주 동안 주당 1회로 10 mg/kg으로 복막내 제공하였다 (0010000).
도 6A는, Omomyc를 anti-CTLA-4와 조합 처리한 동물에서는 비히클 및 처리 단독과 비교해 종양 증식 감소가 관찰됨을 보여준다. 도 6B는, Omomyc 및 anti-CTLA-4 조합 처리가 종양 세포로 T 세포, 특히 CD4 T 세포 및 CD4와 CD8 PD-1+ T 세포 둘다의 동원을 유도함을 보여준다. 표 4는, 수득된 효과가 상승적임을 보여준다. 대상 면역 세포 집단의 증가가 개별 처리 증가의 합보다 높을 경우에는 상승적인 것으로 간주한다.
비히클 Omomyc PD - 1 Omo +PD-1
% CD3 (평균)
비히클 대비 증가
개별 처리의 합 		25.53 27.61 29.38 31.58
2.08 3.85 6.05
5.93 상승 작용
% CD4 (평균)
비히클 대비 증가
개별 처리의 합 		9.394 10.96 11.97 15.29
1.566 2.576 5.896
4.142 상승 작용
% CD4+PD-1+ (평균)
비히클 대비 증가
개별 처리의 합 		43.49 52.69 46.45 67.66
9.2 2.96 24.17
12.16 상승 작용
% CD8+PD-1+ (평균)
비히클 대비 증가
개별 처리의 합 		35.8 38.87 42.33 52.5
3.07 6.53 16.7
9.6 상승 작용
표 4. 각 면역 세포 집단의 평균 수치
Omomyc를 정맥내 투여하고 anti-PD-1 항체를 투여하는 순차적이 조합은 종양 부위로 항=종양 T 세포를 상승적으로 동원한다.
실험 모델, micro-CT 스캔 및 FACS 염색은 도 5에 기술된 바와 동일하게 수행하였다.
Adeno-Cre 감염 후 14-16주 후에, 마우스에서 micro-CT에 의해 검출가능한 종양의 존재가 확인되면, 동물을 4주간 다음과 같은 처리하는 4개의 군으로 무작위 할당하였다: 비히클, Omomyc, 비히클 + anti-PD-1 및 Omomyc + anti-PD-1. Omomyc 처리를 위해, 동물에 Omomyc 폴리펩타이드 (50 mg/kg)으로 10일간 주당 2회로 또는 비히클 (NaAc 24mM + 150mM NaCl)(0100100)을 정맥내 처리하였다. 조합물을 처리하는 군은 처음 10일 동안 주당 2회로 Omomyc를 처리하였다. 10일간 Omomyc 처리한 후, 조합물을 처리하는 군은 Omomyc 처리를 중단하고, anti-PD-1 (BioXCell BE0146)을 2.5 mg/kg으로 실험 종료시까지 주당 1회로 복막내 처리를 개시하였다 (0010000). 단일요법 군, Omomyc 단독에는 처음 10일 동안 주당 2회로 Omomyc를 처리한 다음 처리를 계속하였으나, 실험 종료시까지 주당 1회로만 처리하였다.
도 7은, Omomyc 후 anti-PD-1을 투여하는 순차적인 처리가 종양 부위로 T 세포, 특히 PD-1 및 Tim-3 분자를 둘다 발현하는 CD4 T 세포, PD-1을 발현하는 Th1/Th17 T 세포의 동원을 유도함을, 보여준다. 표 5는 수득한 효과가 상승적이라는 것을 보여준다. 대상 면역 세포 집단의 증가가 개별 처리의 증가의 합보다 높을 경우 상승적인 것으로 간주한다.
비히클 Omomyc PD - 1 Omo +PD-1
% CD4+PD-1+Tim-3+ (평균)
비히클 대비 증가
개별 처리의 합 		3.281 3.5 2.739 5.442
0.219 -0.542 2.161
-0.323 상승 작용
% Th1 / Th17 (평균)
비히클 대비 증가
개별 처리의 합 		0.664 0.615 0.501 0.994
-0.049 -0.163 0.33
-0.212 상승 작용
표 5. 각 면역 세포 집단의 평균 수치
Omomyc를 anti-PD-1 항체와 동시에 정맥내 투여하는 조합은 T 세포를 종양 부위로 상승적으로 동원한다
매우 공격적인 Kras/p53 돌연변이된 NSCLC MuH-163 세포주를 C57/BL6 동계 마우스에 피하 (세포 1x106개) 접종하였다. 종양이 확립되면, 마우스를 4개의 군으로 무작위 분류하였다: 비히클, Omomyc, 비히클 + anti-PD-1 및 Omomyc + anti-PD-1. Omomyc 처리는 정맥내 50 mg/kg (0010000)로, anti-PD-1 항체는 복막내 5 mg/kg으로 3주간 주당 1회로 동시에 제공하였다. 마우스를 주당 2회 모니터링하고, 종양 증식은 캘리퍼 측정으로 추적하였다.
엔드포인트에서 종양을 수집하고, 종양 절반을 4% PFA로 고정한 다음 IHC 분석을 위해 파라핀 왁스로 포매하고, 나머지 절반은 마우스 종양 해리 키트 (Miltenyi)를 사용해 분해한 다음 접합 항체로 염색하여 유세포 측정에 의해 면역 세포 수를 분석하였다. FACS 염색 및 분석을 도 5에 기술된 바와 같이 수행하였다.
CD3 면역형광성을 위해, 0.01 M 사이트레이트 완충제 pH 6.0에서 400 W 마이크로웨이브 하에 20분간 가열하여 항원 회복을 수행하였다. 3% BSA에서 45분 동안 차단 처리하고 PBS에서 헹군 후, 슬라이드를 Dako 레디 투 유스 희석제 (Dako S2022)에 1/100으로 희석한 anti-CD3 (Dako A0452)와 함께 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS로 헹군 다음, 염소 항-토끼 IgG (H+L)-AlexaFluor®488 접합체 (Thermo Fisher Scientific A-11008) 1/200 희석물과 인큐베이션하고, 1/10000으로 희석한 DAPI (Life Technologies D1306)로 염색한 다음 물로 1회 헹군 후 형광 마운팅 매질 (Dako S3023)과 함께 마운팅하였다. 20x 배율에서 포착한 동물 당 대표적인 형광 현미경 이미지 5개로부터 CD3 양성을 측정하였다.
도 8은 Omomyc와 anti-PD-1의 동시 처리가 T 세포를 종양 부위로 현저하게 동원한다는 것을 보여준다. 표 6은 수득한 효과가 상승적이라는 것을 보여준다. 대상 면역 세포 집단의 증가가 개별 처리의 증가의 합보다 높으면 상승적인 것으로 간주한다.
비히클 Omomyc PD - 1 Omo +PD-1
% CD3 (평균)
비히클 대비 증가
개별 처리의 합 		190.3 303.6 254.3 368.8
113.3 64 178.5
177.3 상승 작용
% CD45 (평균)
비히클 대비 증가
개별 처리의 합 		19.25 21.26 23.9 28.03
2.01 4.65 8.78
6.66 상승 작용
표 6. 면역 세포 집단의 평균
CD3, CD4, IL-17 및 IFN -γ의 고 발현은 더 높은 생존율과 연관성이 있다
카플란-마이어 플롯을 온라인 소프트웨어 카플란-마이어 플롯터 (http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)를 사용해 행하였다. 이를 위해, 폐암 환자의 데이터베이스를 선별하였다. NSCLC의 모든 조직학적 타입, 모든 단계 및 모든 병기를 분석에 포함시켰다.
도 9는 CD3, CD4, IL-17 및 IFN-γ의 고 발현이 NSCLC 환자에서 더 높은 생존율과 연관성이 있음을 보여준다.
고찰
비강내 Omomyc와 anti-PD-1 항체의 조합이 전체 흉부 체적에 대한 건강한 폐의 비율 (평균 7.969)을 Omomyc (0.86) 및 anti-PD-1 (0.92) 단독 요법에서 확인된 개선과 비교해 상승적으로 증가시킨다 (도 5A 및 5B). 아울러, 동시 투여된 처리는 종양 부위로의 T 세포, 특히 강력한 항-종양 효과를 발휘하는 것으로 알려진 CD4 T 세포 및 Th1/Th17 세포의 동원을 상승적으로 유도하였다 (Chatterjee, S., et al., CD38-NAD(+)Axis Regulates Immunotherapeutic Anti-Tumor T Cell Response. Cell Metab, 2018. 27(1): p. 85-100 e8)(도 5C).
이러한 결과와 일관되게, 비강내 Omomyc와 anti-CTLA-4의 조합 역시 비히클 (3.85) 및 양쪽 처리의 단독 투여 (Omomyc: 2.3; a-CTLA-4: 3.0)와 비교해 종양 증식 (1.11)을 저하하는 것으로 확인되었다 (도 6A).
종양 증식에 대한 이러한 직접적인 효과와 더불어, 처리 조합은 또한 종양 부위로의 T 세포, 특히 CD4 T 세포 및 (종양-특이적인 T 세포를 식별하는 것으로 공지된 세포) PD-1 분자를 발현하는 CD4 및 CD8 T 세포 둘다의 동원을 상승적으로 유도하였다 (Gros, A., et al., PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest, 2014. 124(5): p. 2246-59)(도 6B). 요컨대, Omomyc와 anti-PD-1 또는 anti-CTLA-4의 비강내 조합 투여는 종양 증식을 감소시키고, 종양 부위로 항-종양 T 세포를 상승적으로 동원한다.
아울러, 본 발명자들은, 동일한 마우스 모델 (KrasG12D-유발성 NSCLC)을 이용하여, 순차적으로 투여되는 정맥내 Omomyc와 anti-PD-1의 조합 (Omomyc를 먼저 투여한 다음 anti-PD-1 항체 투여) 역시 종양 부위로의 T 세포, 특히 PD-1 및 Tim-3 분자 둘다를 발현하는 종양-특이적인 CD4 및 Th1/Th17 항-종양 T 세포의 동원을 상승적으로 유도한다는 것을 입증하였다 (도 7).
다른 모델에서 이러한 상승적인 효과를 검증하기 위해, 본 발명자들은 Kras 및 p53 둘다에서의 돌연변이에 의해 유발된 또 다른 매우 공격적인 NSCLC 모델에서 Omomyc와 anti-PD-1을 조합하여 조사하였다. 재차, 이들 2가지 약물은 상승적으로 작용해 종양 부위로 더 많은 T 세포를 현저하게 동원하였으며 (도 8A), 또한 전체 면역 세포를 더 많이 동원하였다 (도 8B).
요컨대, 본 발명자들은, Omomyc와 anti-PD-1 및 CTLA-4 요법 둘다의 조합 처리가 종양 증식을 감소시킬 수 있으며 종양 부위로 항-종양 T 세포를 상승적으로 동원할 수 있는 것으로, 결론 내렸다. 이러한 치료학적 효과는 여러가지 투여 경로, 여러가지 Omomyc 투여량 및 여러가지 PD-1 및 CTLA-4 투여량을 이용하여 관찰되었다.
이러한 면역 세포 동원은, 전체 CD3 T 세포, IFN-g 및 IL-17을 분비하는 CD4 및 T 세포의 비율 증가가 생존성 증가와 상관관계가 있으므로, NSCLC 암 환자에서 명확한 치료학적 효과를 가진다 (도 9). 이러한 증거는 Omomyc와 면역항암제의 조합과 관련하여 전술한 결과의 중요성을 부각시켜준다. 면역 시그니처에 기반한 데이터에 따르면, 높은 종양 침윤성 림프구 (TIL)가 신행 요법 (neoadjuvant therapy)에 대해 더 높은 반응율과 관련되어 있어, 강력한 면역 세포 구성성분이 유방암에서 화학요법에 대한 우수한 반응성을 예측하는 것으로 확립되었는 바, 동일한 결론을 다른 유형의 암에서도 추정할 수 있다. 결장직장암의 간 전이에서, CD8+ T 세포의 높은 침윤성은 화학요법에 대한 더 나은 반응성과 생존 연장을 예측해준다. 흑색종에서, 면역 시그니처 (즉, TH1 세포와 세포독성-관련 유전자의 높은 발현)의 발현은 흑색종-관련 항원 3 (MAGEA3)를 이용한 치료 백신에 대한 양호한 임상 반응과 상관관계를 나타낸다 (Fridman, W.H., et al., The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nat Rev Clin Oncol, 2017. 14(12): p. 717-734).
과거 수년간 종양 근절 및 면역항암 요법의 효능 둘다에서 TIL의 결정적인 역할을 입증하는 상당량의 증거들이 축적되었다. 실제, 면역항암요법에 대한 내성에 관여하는 주 인자는 소위 "차가운 종양"으로 특정되는 종양 T 세포 침윤의 결여이다. 이러한 면역 불활성 종양을 면역항암제로 치료하는 것은, 종양에 대해 어떠한 적응 면역 반응을 나타내지 않고 이러한 유형의 요법에 반응하지 않으므로, 상당한 도전 과제이다 (Bonaventura, P., et al., Cold Tumors: A Therapeutic Challenge for Immunotherapy . Front Immunol, 2019. 10: p. 168).
PD-1/PD-L1 차단시 임상 반응 또는 안정화된 질환을 전혀 보이지 않는 환자는 요법에 대해 "일차 내성"이 있는 것으로 언급된다. 대조적으로, 임상 실험의 초기 데이터에서, 종양 및 이의 주변부에 기-존재하는 TIL의 존재가, 각각 T 세포 및 종양 세포 상의 공동-위치된 PD-1 및 PD-L1 발현과 더불어, anti-PD-1 요법에 대한 치료학적 반응을 예측하는 것으로, 입증되었다 (Nowicki, T.S., S. Hu-Lieskovan, and A. Ribas, Mechanisms of Resistance to PD-1 and PD-L1 Blockade. Cancer J, 2018. 24(1): p. 47-53). 동일한 증거에서, 펨브롤리주맵 (anti-PD-1)의 효과는 종양내 T 세포의 존재와, 강력한 항종양 반응 (Tumeh, P.C., et al., PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature, 2014. 515(7528): p. 568-71) 및 anti-PD-1 물질의 효능 (Ribas, A., Tumor immunotherapy directed at PD-1. N Engl J Med, 2012. 366(26): p. 2517-9)에 대한 요건으로서 PD-1/PD-L1의 발현과 상관관계를 보인다.
이 모든 증거들을 고려해보면, Omomyc와 면역항암제의 조합이 T 세포 침윤을 상승적으로 유도하고, 자극이 궁극적으로 면역항암제에 대한 임상적인 반응율 개선으로 이어질 것으로, 입증된다.
<110> FUNDACIO PRIVADA INSTITUT D'INVESTIGACIO ONCOLOGICA DE VALL HEBRON INSTITUCIO CATALANA DE RECERCA I ESTUDIS AVANCATS PEPTOMYC, S.L. <120> COMBINATION THERAPY FOR THE TREATMENT OF CANCER <130> P17442PC00 <150> EP19382194.9 <151> 2019-03-19 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 1 Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln 1 5 10 15 Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile 20 25 30 Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu 50 55 60 Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His 65 70 75 80 Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala 85 90 <210> 2 <211> 454 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Phe Phe Arg Val Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met 1 5 10 15 Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp 20 25 30 Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln 35 40 45 Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile 50 55 60 Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg 65 70 75 80 Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser 85 90 95 Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp 100 105 110 Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln 115 120 125 Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile 130 135 140 Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val 145 150 155 160 Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser 165 170 175 Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr 180 185 190 Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val 195 200 205 Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala 210 215 220 Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser 225 230 235 240 Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His 245 250 255 Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu 260 265 270 Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro 275 280 285 Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys 290 295 300 Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His 305 310 315 320 Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala 325 330 335 Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser 340 345 350 Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn 355 360 365 Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu 370 375 380 Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu 385 390 395 400 Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala 405 410 415 Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 420 425 430 Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln 435 440 445 Leu Arg Asn Ser Cys Ala 450 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 3 Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 4 Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30 Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60 Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80 His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala 85 90 <210> 5 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <220> <221> VARIANT <222> (89) <223> Xaa may be any amino acid except Cysteine <400> 5 Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln 1 5 10 15 Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile 20 25 30 Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu 50 55 60 Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His 65 70 75 80 Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Xaa Ala 85 90 <210> 6 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <220> <221> VARIANT <222> (90) <223> Xaa may be any amino acid except Cysteine <400> 6 Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30 Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60 Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80 His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Xaa Ala 85 90 <210> 7 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 7 Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln 1 5 10 15 Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile 20 25 30 Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu 50 55 60 Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His 65 70 75 80 Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Ala 85 90 <210> 8 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 8 Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30 Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60 Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80 His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Ala 85 90 <210> 9 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 9 Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln 1 5 10 15 Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile 20 25 30 Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu 50 55 60 Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His 65 70 75 80 Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ala Ala 85 90 <210> 10 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 10 Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30 Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60 Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80 His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ala Ala 85 90 <210> 11 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 11 Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30 Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60 Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80 His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala Gly Arg Lys Lys Arg 85 90 95 Arg Gln Arg Arg Arg 100 <210> 12 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant protein <400> 12 Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30 Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60 Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80 His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala Arg Arg Arg Arg Arg 85 90 95 Arg Leu Arg <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence found in Drosophila antennapedia protein <400> 13 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 14 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence found in the herpesvirus simplex 1 (HSV-1) VP22 DNA-binding protein <400> 14 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Glu <210> 15 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of Bac-7 <400> 15 Arg Arg Ile Arg Pro Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Arg Pro Arg 1 5 10 15 Pro Leu Pro Phe Pro Arg Pro Gly 20 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of the HIV-1 TAT protein (amino acids 49-57) <400> 16 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of the HIV-1 TAT protein (amino acids 48-60) <400> 17 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Thr Pro Gln 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of the HIV-1 TAT protein (amino acids 47-57) <400> 18 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of S413-PV peptide <400> 19 Ala Leu Trp Lys Thr Leu Leu Lys Lys Val Leu Lys Ala Pro Lys Lys 1 5 10 15 Lys Arg Lys Val 20 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of penetratin <400> 20 Arg Gln Ile Lys Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of SynB1 <400> 21 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of SynB3 <400> 22 Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of PTD-4 <400> 23 Pro Ile Arg Arg Arg Lys Lys Leu Arg Arg Leu Lys 1 5 10 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of PTD-5 <400> 24 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg 1 5 10 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of the FHV COat (amino acids 35-49) <400> 25 Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg 1 5 10 15 <210> 26 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of BMV Gag (amino acids 7-25) <400> 26 Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp 1 5 10 15 Thr Ala Arg <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of HTLV-II Rex (amino acids 4-16) <400> 27 Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of D-Tat <400> 28 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of R9-Tat <400> 29 Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of MAP <400> 30 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Ala Leu Lys Leu 1 5 10 15 Ala <210> 31 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of SBP <400> 31 Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 32 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of FBP <400> 32 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 33 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of MPG <400> 33 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 34 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of MPG(ENLS) <400> 34 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 35 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of Pep-1 <400> 35 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 36 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of Pep-2 <400> 36 Lys Glu Thr Trp Phe Glu Thr Trp Phe Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 37 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 38 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Arg 1 5 <210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 39 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg 1 5 10 <210> 40 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transportan peptide <400> 40 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 41 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 41 Lys Ala Leu Ala Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala 1 5 10 15 Leu Ala Lys His Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Cys Glu 20 25 30 Ala <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 42 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 43 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 44 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 45 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 46 Thr His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 47 Gly Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS sequence of SV40 large T Antigen <400> 48 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS sequence of Nucleoplasmin <400> 49 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS sequence of CBP80 <400> 50 Arg Arg Arg His Ser Asp Glu Asn Asp Gly Gly Gln Pro His Lys Arg 1 5 10 15 Arg Lys <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS sequence of HIV-I Rev protein <400> 51 Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Trp Glu 1 5 10 <210> 52 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS sequence of HTLV-I Rex <400> 52 Met Pro Lys Thr Arg Arg Arg Pro Arg Arg Ser Gln Arg Lys Arg Pro 1 5 10 15 Pro Thr <210> 53 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS of hnRNP A <400> 53 Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Lys Pro Arg 20 25 30 Asn Gln Gly Gly Tyr 35 <210> 54 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS of rpL23a <400> 54 Val His Ser His Lys Lys Lys Lys Ile Arg Thr Ser Pro Thr Phe Thr 1 5 10 15 Thr Pro Lys Thr Leu Arg Leu Arg Arg Gln Pro Lys Tyr Pro Arg Lys 20 25 30 Ser Ala Pro Arg Arg Asn Lys Leu Asp His Tyr 35 40 <210> 55 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS sequence <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> /replace="R or K" <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> /replace="R or K" <400> 55 Lys Xaa Xaa Xaa 1 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1 peptide (Myc NLS) <400> 56 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M2 peptide (Myc NLS) <400> 57 Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe 1 5 10 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flexible peptide <400> 58 Gly Pro Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG-tag <400> 59 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Strep-tag <400> 60 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-tag <400> 61 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 62 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V5 tag <400> 62 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide tag <400> 63 Ala His Gly His Arg Pro 1 5 <210> 64 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 64 Pro Ile His Asp His Asp His Pro His Leu Val Ile His Ser Gly Met 1 5 10 15 Thr Cys Xaa Xaa Cys 20 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP <400> 65 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5

Claims (20)

  1. 하기를 포함하는 조합물:
    i) a) - e)로 이루어진 군으로부터 선택되는 제1 구성성분:
    a) 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체,
    b) 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체와 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모어어티를 포함하는 접합체,
    c) a)의 폴리펩타이드 또는 b)의 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,
    d) c)에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및
    e) a)에 따른 폴리펩타이드 또는 b)에 따른 접합체를 배지로 분비할 수 있는 세포; 및
    ii) 면역항암제인 제2 구성성분.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 기능적으로 동등한 변이체가 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티가 세포 침투성 펩타이드 서열이고, 상기 세포 침투성 펩타이드 서열이 상기 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체와 융합 단백질을 형성하는, 조합물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 세포 침투성 펩타이드 서열이 GRKKRRQRRR (서열번호 37) 및 RRRRRRLR (서열번호 38)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접합체가 추가적인 핵 위치화 신호를 더 포함하는, 조합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역항암제가 사이토카인이 아닌, 조합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역항암제가 T 세포 활성화를 저해하거나 또는 면역 체크포인트 저해제를 저해하는 단백질의 길항제인, 조합물.
  8. 제7항에 있어서,
    T 세포 활성화를 저해하는 단백질의 길항제가 anti-PD-1 및 anti-CTLA-4로부터 선택되는, 조합물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 T 세포 활성화를 저해하는 단백질의 길항제가 anti-PD-1인, 조합물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 길항제가 길항성 항체인, 조합물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 길항성 항체가 펨브롤리주맵 (pembrolizumab)인, 조합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 구성성분이 서열번호 1의 서열을 포함하는 폴리펩타이드인, 조합물.
  13. 약제학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 조합물과 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 또는 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    의약제로서 사용하기 위한 것인, 조합물 또는 약학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제12항 또는 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    암을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한 것인, 조합물 또는 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 암이 폐암인, 조합물 또는 약학적 조성물.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 전신 또는 비강내 투여되는, 조합물 또는 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 비강내 투여가 점적 주입 또는 코 흡입에 의해 수행되는, 조합물 또는 약학적 조성물.
  19. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 구성성분은 비강내 또는 정맥내 투여되고, 상기 제2 구성성분은 전신 투여되는, 조합물 또는 약학적 조성물.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체, 또는 상기 접합체가 암 치료에서 상기 면역항암제와 상승적으로 상호작용하는, 조합물 또는 약학적 조성물.
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