CN103372215B - 抗hiv治疗期间使用的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组合物，包括对HIV感染者的抗HIV治疗和对所述抗HIV治疗的副作用的治疗。本发明例如特别可用于治疗某些抗HIV治疗所产生的副作用，所述副作用例如有过早衰老和脂肪代谢障碍，它们可由蛋白酶抑制剂或逆转录酶抑制剂产生。本发明的组合物包含羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的至少一种抑制剂、法尼基焦磷酸酯合酶的至少一种抑制剂和至少一种抗HIV剂。用于治疗HIV感染者的一种方法以任何顺序包括以下步骤：(i)施用包含羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的至少一种抑制剂和法尼基焦磷酸酯合酶的至少一种抑制剂的混合物，和(ii)施用抗HIV剂，其中，所述施用相伴、连续或交替进行。

Description

抗HIV治疗期间使用的组合物和方法
本申请是申请日为2008年12月31日，申请号为“200880127741.9”，发明名称为“抗HIV治疗期间使用的组合物和方法”(此为变更后的发明名称，原发明名称为“用于治疗HIV阳性患者的二联疗法和三联疗法”)的申请的分案申请。
相关申请
本申请涉及2008年1月3日递交的法国专利申请第FR08/50019号。本申请还涉及2006年7月5日递交的法国专利申请第FR06/06097号及其于2007年7月5日递交的标题为“Médicamentdestineautraitementdesmaladiesavecpersistenceet/ouaccumulationdeproteinsprénylées”[“用于治疗异戊二烯化蛋白(prenylatedproteins)存留和/或积聚的疾病的药物”]的相应PCT申请。通过援引将上述各专利申请的全部内容并入本说明书中。
技术领域
本发明涉及治疗HIV感染患者的抗HIV组合物和方法。
本发明例如在对某些抗HIV治疗所引起的副作用的治疗方面非常有效，所述副作用例如为可由蛋白酶抑制剂或逆转录酶抑制剂引起的过早衰老和脂肪营养不良。
在下文的描述中，圆括中的标记(X)参见实施例结尾处的参考文献列表。圆括号中带有作者名和日期的标记也参见该参考文献列表。
背景技术
真核细胞的细胞核为多孔的双层膜(即，核被膜)所限定，核被膜控制着核区与胞质区这两个区之间的分子交换。该被膜部分地隔离了细胞核的内容物，即遗传物质和核基因组发挥作用所需的所有酶系统。
核被膜由两层同心膜构成，所述两层同心膜即与内质网连续的外膜和内膜。后者的内表面上相连有称作核纤层的致密的原纤维网。其为主要由核纤层蛋白的聚合物和相关蛋白构成的蛋白网络。在脊椎动物中，区分有两个亚类的核纤层蛋白：A型核纤层蛋白(核纤层蛋白A和C)和B型(核纤层蛋白B1、B2和B3)核纤层蛋白，它们全部与核纤层的发生有关。后者通过与附着于核被膜的内膜的其它蛋白缔合而保持在适当位置(见Gruenbaum等，2005(19))。
核纤层蛋白是属于中间丝家族(V型)的丝状蛋白，其全部具有共同结构：短球状N端(首)片段与另一球状C端(尾)片段通过以多个α螺旋(杆域)组织的长中心域分隔开。球状尾特别含有能在合成之后指向细胞核的核定位信号(NLS)。中心域能使两个平行的核纤层蛋白分子通过二聚体的“首尾”缔合而以丝的形式缔合和组织。此结构赋予了它们非常高的力学性能。
只有核纤层蛋白A和核纤层蛋白B在前体合成后进行熟化(见Gruenbaum等，2000(20))。核纤层蛋白C直接以其成熟的形式合成。
核纤层蛋白A和核纤层蛋白B的前体通过特征性CaaX基序结尾(C为半胱氨酸，a为具有不带电荷的脂肪链的氨基酸，并且X为任何氨基酸，此情形下为甲硫氨酸；见Levy&Cau2003(29))。
C端CaaX基序能够通过法尼基转移酶而发生脂肪酸的附着(通常为C15脂肪酸，法尼基)。此异戊二烯化(法尼基基序源于称作异戊二烯的C5类脂肪族单元)使得前核纤层蛋白(prelamin)在胞质溶胶中合成后能够插入内质网的膜中。它们受到自身插入在网的被膜中且活性位点在细胞质内的内切蛋白酶的作用。前核纤层蛋白A的特异性内切蛋白酶是Face1(或ZMPSTE24，锌金属蛋白酶，一种STE24酵母同系物)，而Face2(或Rce1，ras转化酶)对于前核纤层蛋白B是特异性的。这些酶催化半胱氨酸与下一个(脂肪族)氨基酸之间的肽键的水解，使前核纤层蛋白缩短3个氨基酸。法尼基化半胱氨酸的羧基端然后为异戊二烯半胱氨酸羧甲基转移酶(ICMT)所识别，后者通过酯化而于其上连接甲基。
只有前核纤层蛋白A的熟化通过由Face1进行的第二内切蛋白酶(endoproteolytic)裂解来继续进行，该裂解释放15个氨基酸的法尼基肽和成熟的核纤层蛋白A。这一不再包含脂肪酸的核纤层蛋白A变为可溶性、因其核定位信号而输入到细胞核中，并被定位在核纤层自身和核区的其余部分中，构成真正的核骨架(Gruenbaum等，2005(19))。另一方面，成熟的核纤层蛋白B在其C末端仍具有其法尼基化和甲基酯化的半胱氨酸。因此，其仍然插在网的被膜中，因而插在核被膜的核质面中，由此其专门位于在其锚定的核被膜的内膜的下方的核纤层中。
“异戊二烯化”在本说明书中是指在半胱氨酸的硫醇基上连接具有15个碳原子的法尼基链(法尼基化)或具有20个碳原子的香叶基-香叶基链(香叶基-香叶基化)(Reid等，2004(39))，或者任何其它异戊二烯衍生物。
由可识别C端共有序列(Caax)的法尼基转移酶(FTase)催化的法尼基化优选将法尼基连接在该基序的半胱氨酸残基上。
香叶基-香叶基化是通过香叶基-香叶基转移酶(GGTase)将香叶基-香叶基连接在该基序的半胱氨酸残基上。
这些脂肪酸通过生物合成来产生，细胞利用基于羟甲基戊二酰辅酶A的所述生物合成而专门生成胆固醇、类固醇、血红蛋白的血红素和泛醌(Hampton等，1996(20))。
异戊二烯化蛋白家族在人类基因组中包含约300个成员，其中大部分可以通过C端基序CaaX来识别(Reid等，2004(39))。特别是，Ras、Rho和Rab家族的蛋白(Leung等，2006(28))、某些确保输入线粒体的功能的蛋白(HDJ2)和某些有丝分裂蛋白(CENPE、CENPF)被异戊二烯化(Winter-Vann&Casey2005(51))。通常，如果在Caax基序中，则X为丝氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸或谷氨酸，优选接枝的类异戊二烯为法尼基。如果X为亮氨酸，则CaaL基序的识别优选由GGTase完成，GGTase将催化香叶基-香叶基的转移(Basso等，2006(1))。可能其它衍生自异戊二烯的基团也可以与此半胱氨酸连接，只是文献中未有描述。
在人体中，存在三种核纤层蛋白基因。位于1q21.2-q21.3处的LMNA基因(Wyder等，1996(52))通过选择性剪接而产生核纤层蛋白A和C。LMNA基因由12个外显子构成。外显子1的开头编码核纤层蛋白A和C共同的球状N末端；外显子1的末端至外显子7的开头编码中心螺旋部分；最后，其它外显子编码球状C末端(Levy&Cau2003(29))。
实际上，该基因编码4种不同剪接的产物，其中2种主要产物是核纤层蛋白C和前核纤层蛋白A(Lin&Worman1993(31))。核纤层蛋白A和C的差异化生成利用在前信使的外显子10处的选择性剪接位点来完成，因而核纤层蛋白C由外显子1～10编码，并且核纤层蛋白A由外显子1～9、外显子10的前90个碱基对以及外显子11和12(核纤层蛋白A特异性的)编码。
因此，前核纤层蛋白A和核纤层蛋白C肽在前566个氨基酸处相同，而核纤层蛋白C和前核纤层蛋白A的C末端则分别含有6个和98个特异性氨基酸。
B型核纤层蛋白包括三种不同蛋白(Shelto等，1981(43))：核纤层蛋白B1、B2(两种表示得最好的异构体)和B3。LMNB1基因位于5q23.3-q31.1，并包含编码核纤层蛋白B1的11个外显子(Lin&Worman1995(30))。LMNB2基因位于19p13.3，并通过选择性剪接机制编码核纤层蛋白B2和B3(Biamonti等，1992(2))。
核纤层蛋白B从发育的开始阶段起就在所有细胞中均有组成性表达，而A型核纤层蛋白通常不存在于胚胎干细胞中(Stewart等，1987(45))，但在所有分化的体细胞中均有表达。其表达根据组织和生命过程而受到调控(Duque等，2006(9))。看起来其表达并非不可或缺，因为核纤层蛋白A的表达被特异性阻断但仍能表达核纤层蛋白C和其它核纤层蛋白的小鼠不具有外显的表型(Fong等，2006(14))。
核纤层蛋白与功能繁多的大量蛋白伙伴(proteinpartners)相互作用；它们因此参与多种核过程，包括DNA复制和修复、转录和剪接的控制和染色质结构的组织(见Shumaker等，2003(44)，Zastrow等，2004(54)，Hutchison等，2004(26)，Gruenbaum等，2005(19))。核纤层的结构的改变是多种人类遗传病理的原因。它们由编码核纤层蛋白或者核纤层的其它蛋白的基因的突变引起。这些病理已经被统一归纳在专业术语“核纤层病”之下(Broers等，2006(5)，Mattout等，2006(33))。近来，负责核纤层蛋白(特别是Face1)熟化的酶的基因的突变已经得到确认，这使其病理也属于术语“核纤层病”之列(Navarro等，2004(36)和2005(35))。
目前，与LMNB1或2等基因的突变相关的人类的唯一病理为因LMNB1基因的完全重复所导致的脑白质病变(Padiath等，2006(37))。对于是否包含在巴-西二氏综合征患者的LMNB2中发现的序列变化仍然存疑(Hegele等，2006(22))。但是，通过体外RNAi(RNA-干扰)实验和鼠模型(Vergnes等，2004(50))已经证明，B型核纤层蛋白是细胞发育和完整性所必需的。实际上，核纤层蛋白B1缺陷将导致小鼠的围产期致死。此外，同样的LMNB1缺陷小鼠的胚胎成纤维细胞的细胞核显示了核形态的显著变化，这与在LMNA基因突变的患者中所观察到的情形相似。此外，近来显示，核纤层蛋白B对于有丝分裂过程中分裂纺锤体(divisionspindle)的形成是必不可少的，这倾向于证明，它们在细胞周期的整个过程中具有动态的、多方面的作用，并且其作用不限于维持细胞核结构(Tsai等，2006(48))。关于这最后一种作用，最近的文章证实了核纤层蛋白B的结构性功能：人工剥除核纤层蛋白B1的细胞具有在细胞中“漂浮的”细胞核，该核可旋转(Liu等，2007(45))。核纤层蛋白B1和B2这两种核纤层蛋白之间存在的功能冗余无疑也是它们的重要性的直接反映，其发挥了较强的选择压力，并且屏蔽了相应基因的序列中任何潜在突变的效应。
因LMNA基因突变而引起的核纤层蛋白A/C的功能变化是至少15种疾病的病因，这些疾病包括临床范围中的多种病理，从单独影响单一组织的温和形式至围产期可致命的全身形式。
LMNA基因的许多突变显著修改了核被膜中蛋白的组装并扰乱了其功能。在各种组织的细胞中，细胞核的形态发生改变：它们通常具有将遗传物质挤出至细胞质中的隆起(Goldman等，2004(18))。
这些隆起的边缘不存在通常与核被膜相关的蛋白、核纤层蛋白B、某些核孔蛋白和LAP2蛋白。
这些形态异常之后是功能变化，最终导致细胞死亡。在术语“核纤层病”下所包括的所有病理中，本发明只关注与异戊二烯化蛋白形式的异常积聚相关的那些病理。
这主要包括郝-吉综合征(Hutchinson-Gilfordsyndrome)或早衰综合征(DeSandre-Giovannoli等，2003(7)，(Eriksson等，2003(11))和限制性皮病(Navarro等，2004(36))。在这2种综合征中，生理病理学原因在于患者细胞中不成熟的法尼基化前核纤层蛋白的积聚和存留。
在诞生期前后可致死的限制性皮病的特征临床症状几乎总是由限制子宫内运动的皮肤缺乏所引起的。该病理极为罕见。皮肤僵硬且紧绷并在某些位置塌陷，例如可在腋窝或颈部导致撕裂。睫毛、眉毛和皮肤绒毛不存在或非常稀疏。通常存在羊水过多，并且观察到从怀孕第6个月起胎动减少。骨骼方面，射线照相显示所有关节挛缩、先天性凸底外翻足、薄而发育不良且二深裂的锁骨、薄肋骨、长管状臂骨和颅骨脱矿物质。可致死的限制性皮病的传递为常染色体隐性。
关于此病理，曾经报道过LMNA和ZMPSTE24/Face1突变(Navarro等，2004(36))。上述两种情形中生理病理学机制相同：前核纤层蛋白A不能成熟(Face1无效突变或者前核纤层蛋白A突变所劈开的位点消失)并保持法尼基化，因此插在核膜中。这些异常前体可能阻止核纤层蛋白B和C与其伙伴的相互作用，它们在细胞内的积聚和存留会导致细胞的死亡，并在短期后导致患者的死亡。已经清楚地证明，正是法尼基的存留而不是(可能是最初所想的)成熟核纤层蛋白A的缺乏造成了细胞毒性(Fong等，2004(16))。
2003年4月，基于上腭发育不良与某些引起过早衰老的疾病的共同症状的重叠，本发明人显示，作为最典型的最严重形式的过早衰老的早衰症是LMNA基因突变的结果(DeSandre-Giovannoli等，2003(7))。受此病(也称作郝-吉综合征)影响的儿童遭受了加速衰老，所述衰老的发生可比正常个体快十倍，并具有不超过13岁的预期寿命。在欧洲，约600万儿童中就由一个患有此病。症状为皮肤老化、脱发、颚尺寸减小和如关节僵硬和心血管病等与老化相关的问题。心血管病(包括心肌梗死或动脉粥样硬化)经常导致死亡。
被认为对此负责的位于LMNA基因的外显子11处的突变激活了pre-mRNA的隐蔽剪接位点，产生有150个核苷酸缺失的mRNA(DeSandre-Giovannoli等，2003(7)，Eriksson等，2003(11))。这一缺失的mRNA涉及异常的前核纤层蛋白A，即不能熟化为正常核纤层蛋白A的早衰蛋白(progerin)：包括蛋白酶识别位点在内的外显子11的50个氨基酸的缺少阻止了对早衰蛋白的第二次切割，该早衰蛋白的C末端保存有其法尼基。因此，其保持插在核被膜的核质面中，核被膜具有特性变化、核质在胞质溶胶中的隆起和周围异染色质的分布异常(Goldman等，2004(18))。同样，正是法尼基(法尼基对锚定在其中定位有负责熟化(切割、甲基化)的酶的网的被膜上也是必需的)的存留造成了早衰蛋白的细胞毒性(Fong等，2004(16))。
这些系统性病理具有的独特特征是与通常与老化相关的征侯的过早出现有关。它们共同的生理病理特征在于，它们生成具有所述后果的异戊二烯化核纤层蛋白。
两项新近研究显示，核内积聚的法尼基化前核纤层蛋白(无论截短与否)的减少有效地防止了所述细胞表型的出现。第一项研究对于Face1蛋白酶缺陷的类早衰的鼠动物模型进行(Pendas等，2002(38))。使它们与表达一半量的核纤层蛋白A的小鼠(Lmna+/-小鼠)杂交后，缺乏Face1的影响得到降低(Varela等，2005(49))。第二项研究显示，使用吗啉基(反义寡核苷酸)针对隐蔽剪接位点来处理HGPS患者的细胞可根除突变表型(Scaffidi&Misteli2005(43))。
大量新近研究(见Scaffidi&Mistelli2006(42))显示，核纤层蛋白A参与了生理老化过程。特别是，已经证实，在生理老化过程中，因外显子11的隐蔽剪接位点的默默使用，早衰蛋白在不存在任何LMNA基因突变的情况下可由细胞合成。所述早衰蛋白位于核纤层中，在细胞核周围。“正常”老化患者的细胞核可能具有由意外的剪接事件所导致的核纤层病(laminopathy)的隆起特征，这将导致异常的细胞功能，并且可能至少部分地引起了其老化。
在在体的皮肤中，早衰蛋白也由皮肤成纤维细胞和角质形成细胞的亚群合成，其中的细胞随老化而积聚。因此早衰蛋白可以作为皮肤老化的标记(McClintock等，2007(34))。
看起来，同一分子机制造成了患早衰症个体的过早衰老的征候，且以远低于此的程度参与了与不具有突变的个体的生理老化。
现有技术描述了改善由早衰蛋白的病理产生而引起的细胞表型的两种治疗方法。这两种解决方案中的第一种非常简单，通过使用反义寡核苷酸(Scaffidi&Misteli2005(41))，或者产生siRNA的逆转录酶病毒(Huang等，2005(25))的处理来“屏蔽”外显子11的隐蔽剪接位点，从而阻止剪接体对该隐蔽剪接位点的利用。体外的结果很有前途，但这是“基因”疗法，基于此方法的药物开发极为漫长而复杂，为了获得体内效果，还存在与OAS载体化(vectorization)相关的各种障碍。第二解决方案包括抑制法尼基转移酶，法尼基转移酶催化法尼基由法尼基焦磷酸酯(farnesyl-pyrophosphate)向前核纤层蛋白的转移。使用这种抑制剂(FTI)时，在培养的HGPS(早衰症)细胞中“正常”核被膜仅部分回复，并且RD小鼠(KOZMPSTE24)的存活率得到改善(Glynn&Glover2005(17)，Capell等，2005(6)，Toth等，2005(47)，Fong等，2006(15))。
不过，对法尼基化的阻断能够引起补偿性的香叶基-香叶基化(Bishop等，2003(3)，Varela等，2008(54bis))。
另外，近来报道，FTI通过阻断蛋白酶体而使细胞周期停止(Demyanets等，2006(8)，Efuet&Keyomarsi2006(10))。因此，该处理无疑会造成早衰蛋白在核质中的积聚，该早衰蛋白可能被泛素化，不能被蛋白酶体降解。
此外，近来的研究报道了早衰蛋白在体内的法尼基化速率的下降非常低，在5％左右(Young等，2006(53))，这不足以解释体外所观察到的核形态的恢复。
最后，FTI仅对蛋白异戊二烯化途径中的一种具有特异性，不能被视为通用的翻译后异戊二烯化抑制剂。
另外，据报道，此途径的酶中的一种(即，甲羟戊酸激酶)的完全缺失在婴儿期是致命的(编码此酶的基因的纯合突变功能丧失，Hoffmann等，2003(24)报道的综合征)。
抗HIV治疗和副作用
1.接受抗逆转录病毒治疗的HIV感染者显示了与遗传的类早衰综合征患者相当的加速老化的临床和生物学征候。
抗逆转录病毒治疗、逆转录酶抑制剂(核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)或非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI))和病毒蛋白酶抑制剂(PI)已可延长AIDS感染者的生命，在这些感染者中出现了“生理”老化的后果(Casau2005；Levy等，2003)。
然而，感染本身和抗逆转录病毒治疗显示了与在遗传的加速老化综合征患者中所见相似的临床和生物学征候(关于这些综合征的最新综述，请参考Navarro等，2006)。
某些表现似乎与病毒感染直接相关：
例如，维尔纳综合征(OMIM277700)是一种与癌症和动脉粥样硬化的诱因相关的早衰综合征，该综合征中突变的解旋酶会募集HIV-1的LTR的反式激活(transactivation)所必需的细胞蛋白辅因子，以复制病毒。受感染细胞中解旋酶最微量的存在也会导致老化和免疫抑制(Sharma等，2007)。
另一个实例是巨噬细胞中胆固醇转运的修改。病毒蛋白Nef抑制了负责胆固醇流出的ABC家族的透性酶(Bukrinsky和Sviridov，2006；Mujawar等，2006；Wang和Rader，2007)。胆固醇在巨噬细胞中的积聚使其转变为与血管壁中动脉粥样斑块形成相关的泡沫细胞(Pennings等，2006)。抗逆转录病毒药物也抑制巨噬细胞的胆固醇流出，并有助于形成动脉粥样斑(Azzam等，2006；Dressman等，2003；Wang等，2007)。
大量临床和生物学表现似乎也是抗逆转录病毒治疗的结果：
它们再现了在遗传的类早衰综合征中所观察到的征候，所述遗传的类早衰综合征例如有郝-吉早衰症(OMIM176670，见Hennekam，2006)、上腭发育不良(OMIM248370)和致死的新生儿型限制性皮病(OMIM275210)，上述疾病与编码核纤层蛋白A和C的LMNA基因的突变相关，或者与在前核纤层蛋白A熟化为核纤层蛋白A的过程中负责切割前核纤层蛋白A的ZMPSTE24蛋白酶(FACE1)的突变相关，所述征候为：
●脱发(Torres等，2007；Wiwanitkit，2004)，与感染性皮肤病表现无关(Maurer，2005)。
●骨骼系统异常，特别是骨质疏松(Brown和Qaqish，2006；Thomas和Doherty，2003)，对此已提出使用维生素D和双膦酸来纠正(Mondy等，2005)。
●肌萎缩(Restrepo等，2006；Restrepo等，2004；Tehranzadeh等，2004a；Tehranzadeh等，2004b)，与为某些抗逆转录病毒治疗(参考下文)所抑制的两种蛋白水解系统即泛素-蛋白酶体系统(Coistelli和Baccino，2003)或钙蛋白酶(Bartoli和Richard，2005；Costelli等，2005)有关。钙蛋白酶3肌突变是形成带型肌营养不良症的原因(LGMD2A，OMIM253600；Richard等，1995)，嗜酸性肌炎可能是其首先的征兆之一(Krahn等，2006)。
●心肌病(Barbaro，2003；Restrepo等，2006)，与心血管并发症(见下文)无关，与NRTI的线粒体毒性有关(Lewis，2003)。
●心血管异常(Mondy和Tebas，2007)与脂代谢紊乱(Hui，2003；Jones等，2005；Moyle，2007)、动脉粥样化(deSaintMartin等，2006；Thomas和Smart，2007；vanWijk等，2006)、内皮细胞损伤(Chen等，2005；Jiang等，2006；Zhong等，2002)和脂细胞分化异常(Kim等，2006；Roche等，2002)。血脂异常能够使用他汀类药物治疗(Benesic等，2004；Liang，2006；Malon等，2006)或使用胆固醇的肠吸收抑制剂治疗(Negredo等，2006)。应该注意，可部分纠正代谢综合征中所改变的一些参数的普伐他汀(Yamagishi等，2006)会导致皮下脂肪组织增加而未明显改善胆固醇血症(Gharakhanian等，2006；Mallon等，2006)。
●雄激素不足血症(hypoandrogenemia)相关的临床表现常见于男性中(Cohan，2006)，HIV阳性女性早绝经的情况也成为了许多出版物的主题(Cohan，2006；Ferreira等，2007)。
病毒蛋白酶抑制剂(PI)具有多个细胞靶，包括蛋白酶：
●蛋白酶体的抑制(Piccinini等，2005)具有高度不同的结果，原因在于此蛋白水解组装体对于大量细胞功能、蛋白质周转、细胞周期控制、细胞凋亡、基因转录、信号转导、衰老和应激反应等有作用(Naujokat等，2007)。例如，PI阻断脂肪细胞分化的途径之一中不产生NFkB转录调节因子，所述因子控制编码参与脂肪细胞分化的金属蛋白酶(锌)MMP9的基因的转录(Bourlier等，2005；DeBarros等，2007)。
●另一实例是胰岛素涉及的信号传递通路(Rudich等，2005；Schutt等，2004)。PI抑制胰岛素降解酶的活性(Hamel等，2006)，阻断负责胰岛素分泌的钾通道(Neye等，2006)，与Glut4葡萄糖转运体相互作用(Hertel等，2004)，并阻止其插入在其插入质膜中(Hruz，2006；Parker等，2005)。
●类似地，PI通过与酪氨酸激酶活性受体(包括IGF1)的活化相关的Akt激酶而阻断信号传递通路(Gupta等，2005)。IGF1直接控制肌萎缩或肌肥大(Glass，2003)。
●PI通过钙蛋白酶(Ca++依赖的胞浆蛋白酶)的抑制而发挥抗凋亡作用(Ghibelli等，2003；Lichtner等，2006)，并且其通过对形成自噬泡所必需的ATG5切割而控制凋亡-自噬平衡(Yousefi等，2006)。
●PI还阻断其它两种酶系统：肠或肝的亚族3A的某些细胞色素P450(Granfors等，2006)，而亚族2A的其它细胞色素P450同时被诱导(Yeh等，2006)作为其它转运体(Dixit等，2007；Yeh等，2006)；RE中、特别是胆红素的葡糖苷酸结合物(Zhang等，2005)。
●多种酶活性的抑制，其中，蛋白酶体诱发内质网应激，UPR(解折叠蛋白反应)的活化和随着转录调节因子的出现而涉及细胞核的网的信号传递机制(Zhou等，2006)。大量出版物显示了SREBP(固醇响应元件结合蛋白)异构体的量的增加，这些异构体控制调节包括胆固醇的脂代谢的基因的活化(Colgan等，2007；Miserez等，2002；Nguyen等，2000；Williams等，2004；Zhou等，2006；Zhou等，2005)。PI对SREBP转录的诱导还可由对于分化过程中脂肪细胞的转录组(芯片，定量PCR)的研究来显示(Pacenti等，2006)，该效果可以通过泛素-蛋白酶体系统使SREBP降解不发生来得到提高。
PI导致了在肝细胞和脂肪细胞中SREBP的核积聚及其对于脂代谢的影响(脂肪酸和胆固醇合成的增加)(Hui，2003；Riddle等，2001)。
●连续分析脂肪细胞体外分化的同一来自巴黎的小组的三篇文章显示，PI引起：胰岛素抵抗综合征，其为与核纤层蛋白A定位异常相关的SREBP在核质中的异常定位(Caron等，2001)；对SREBP切割的抑制(由高尔基体蛋白酶S-1P和S-2P造成，见Seidah等，2006)，其对脂代谢酶的合成的影响，对核纤层蛋白A的异常熟化的影响，而核纤层蛋白B的熟化未受改变(Caron等，2003)；在与LMNA基因突变相关的脂肪代谢障碍中观察到的线粒体应激与使用PI治疗获得的结果之间有相似性(Caron等，2007)。
这些研究的益处之一在于，它们强烈地暗示，某些PI可阻断参与前核纤层蛋白A熟化的蛋白酶(FACE1或ZMPSTE24)，其数据已得到来自美国的小组的证实(Coffinier等，2007)。相反，这些PI不仅对于引起前核纤层蛋白B的切割的蛋白酶FACE2(或Rce1(Ras转化酶1)的活性没有影响，而且对于Ras单体蛋白G的活性及其熟化所需的切割也没有影响(Wright和Philips，2006)。近来的定量RT-PCR研究显示，PI导致编码核纤层蛋白A的mRNA的量减少，但不改变编码核纤层蛋白C的mRNA的量(Miranda等，2007)。
●PI抑制线粒体蛋白酶，所述线粒体蛋白酶负责切割线粒体定位信号、线粒体蛋白更新和参与控制线粒体融合和凋亡的某些线粒体GTP酶(OPA1)的控制(Mukhopadhyay等，2002；RoehlWhite和Lauring，2007)。
●与其对钙蛋白酶的作用(见上文)无关，PI通过蛋白UCP2来阻断由促凋亡刺激所引起的内膜去极化，从而对T-淋巴细胞发挥抗凋亡作用(Matarrese等，2003；Matarrese等，2005)。
●因此，应该注意，PI由此可抑制对AIDS病毒具有特异性的天冬氨酸蛋白酶的不同酶(Dunn等，2002)。虽然关于这一点目前的文献还未记载，但是PI可能也会抑制某些真核生物的天冬氨酸蛋白酶(见网站“Degradome”：http://www.uniovi.es/degradome/)，例如能够同时结合蛋白酶体和泛素化蛋白以使后者降解的早老素、肽酶肽信号或Ddi1(DNA损伤诱导蛋白)(Sirkis等，2006)。
病毒的核苷逆转录抑制剂(NRTI)也具有多个细胞靶，所述细胞靶中线粒体是最重要的一项：
●较少研究的病毒的非核苷逆转录抑制剂似乎对于病毒酶具有更具特异性的作用，同时引发T细胞系的凋亡(Pilon等，2002)。
●NRTI结合至核DNA中(Olivero等，1999)，并且其诱变效应可导致细胞周期的阻断(Olivero等，2005)。负责线粒体DNA复制和修复的γ聚合酶DNA的突变已有报道(Yamanaka等，2007)(Hudson和Chinnery，2006)。
●少量出版物显示，通过干扰枝状引入糖(arborizationsincorporatingsugars)的前体的高尔基体中的核苷酸转运体，NRTI抑制枝状引入糖的N-糖基化(在内质网中)、O-糖基化和修饰(在高尔基体中)(Lizzi等，2007)。许多肌营养不良症都与糖基化的遗传异常有关(Muntoni等，2004；Percival和Froehner，2007)。
●NRTI通过一族专门的转运体转运至线粒体基质中并成为其脱氧核苷二磷酸形式，所述脱氧核苷二磷酸在通过DNA聚合酶γ而结合至线粒体DNA中之前被线粒体激酶磷酸化(Palmieri，2004)。
●NRTI的基因毒性引起线粒体DNA突变率上升和其在线粒体中的拷贝数下降(Kohler和Lewis，2007；Olivero，2007)。
●线粒体DNA异常和DNA聚合酶γ功能异常对于内膜的13种蛋白的合成具有影响，所述13种蛋白与由核基因组编码并输入的蛋白构成了呼吸链和ATP合酶的复合物。线粒体DNA及其聚合酶的破坏导致例如细胞色素氧化酶II的量的减少(Vidal等，2006)、活性氧物种(ROS)的产生(Jiang等，2007)，对于脂肪代谢障碍和心血管并发症所涉及的肝细胞、脂肪细胞、心肌细胞和内皮细胞具有影响。
●血浆乳酸水平的增加是抗逆转录病毒治疗所引起的线粒体功能障碍的标准之一(2007；John等，2001)。
●NRTI也抑制端粒酶活性并导致端粒缩短(Olivero，2007；Yamaguchi等，2001)。
总之，抗逆转录病毒治疗对于代谢机制和途径具有影响，所述代谢机制和途径在许多试图解释正常或加速老化的细胞理论中被组织在一起：
●“线粒体理论”，
●“核和核纤层蛋白”理论，该理论因发现LMNA基因引起早衰症而于2003年出现，
●“端粒理论”，
●“基因转录调节”理论，特别是利用蛋白p53、NF-kB的理论，
●涉及信号传递通路的“代谢”理论，其中一些信号传递通路由膜受体激活，
●许多过早衰老的动物模型或与之相反的寿命延长的动物模型显示了上述各理论所涉及的代谢途径之间的部分重叠，以及胞质溶胶特别是蛋白质降解机制(Grillari等，2006)、线粒体、细胞核和质膜之间在细胞尺度上的相互关系(Irminger-Finger，2007；Kenyon，2005；Martin和Loeb，2004；Quarrie和Riabowol，2004)。
许多过早衰老的动物模型或与之相反的寿命延长的动物模型显示了上述各理论所涉及的代谢途径之间的部分重叠，以及胞质溶胶特别是蛋白质降解机制(Grillari等，2006)、线粒体、细胞核和质膜之间在细胞尺度上的相互关系(Irminger-Finger，2007；Kenyon，2005；Martin和Loeb，2004；Quarrie和Riabowol，2004)。
2.老化的“线粒体”理论(附图6)
老化的线粒体理论的三个主要组成部分为：i/由呼吸链的复合物I和II产生的活性氧物种(ROS)的增加，ii/其功能障碍持续进展，和iii/线粒体DNA损伤的积累(Balaban等，2005；Meissner，2007；Wallace，2005)。
线粒体DNA比核DNA对于以DNA聚合酶γ为靶的ROS的作用更敏感(Graziewicz等，2002；Richter等，1988)。表达校对功能有缺陷的DNA聚合酶γ的2个鼠模型随着线粒体DNA突变显示了加速老化(Kujoth等，2005；Trifunovic等，2004)。ROS的线粒体毒性可以通过在转基因鼠模型中定位到线粒体的过氧化氢酶的过表达而消除，在该转基因鼠模型中寿命得到延长(Schriner等，2005)。
在人中，老化伴随着线粒体功能降低，包括呼吸链功能降低(Short等，2005；Trifunovic等，2005)，和线粒体DNA中缺失的增加，在神经退行性疾病中非常明确地观察到了这一点(Bender等，2006；Kraytsberg等，2006)。
尚不清楚的线粒体-细胞核信号传递机制使得蛋白p32被涉及，特别是在老化过程中或在ROS诱发的病理中(Jiang等，1999；Storz，2006)。由核基因组编码、之后输入到线粒体基质中的该蛋白被再输出至核质(Brokstad等，2001)，在该处其控制mRNA的转录(Chattopadhyay等，2004)和剪接(Petersen-Mahrt等，1999)。此蛋白与位于核被膜的核质面的核纤层蛋白B受体相互作用(Mylonis等，2004；Simos和Georgatos，1994)。
细胞核-线粒体信号传递机制涉及大约1500个由核基因组编码的蛋白，它们在胞质溶胶中合成，然后输入到线粒体中(Calvo等，2006；Truscott等，2003)。
在这些蛋白质中，p53在鼠模型中与加速老化相关(Tyner等，2002)，并且在“核”理论中参与了反调节(参考下文)。蛋白p53控制线粒体呼吸(Matoba等，2006)，并由于核基因转录的控制而发挥促氧化剂和抗氧化剂作用(Bensaad和Vousden，2005；Sablina等，2005)。其通过与DNA聚合酶γ相互作用而保持线粒体DNA的稳定性(Achanta等，2005)。
最后，涉及线粒体外膜(Drp1、mitofusins等)和线粒体内膜(OPA1)的多种GTP酶以及多种相关蛋白(Fis1等)的线粒体裂变(分裂)和融合机制调节细胞老化过程：线粒体网络通过永久融合的延伸引起细胞老化过程伴有内膜的两面之间势能差降低以及ROS产生和DNA损伤的增加。这些表型改变可被线粒体网络的片段化所中和(Lee等，2007)。
3.在“细胞核和核纤层蛋白”理论下的遗传加速老化综合征的机制
核纤层蛋白是专门位于核质中的中间丝形成蛋白。LMNA基因主要编码通过选择性剪接而产生的核纤层蛋白A和C。两种其它基因编码核纤层蛋白B1和B2。
核纤层蛋白A和B在胞质溶胶中以前体的形式合成，所述前体需多个多个熟化步骤。这3种蛋白在其C末端具有CaaX盒(半胱氨酸、两个脂肪族氨基酸、一个不重要的氨基酸)。此CaaX序列能够使核纤层蛋白A和B(以及人类基因组的大约300个其它蛋白)被法尼基化。法尼基残基(具有15个碳原子的类异戊二烯)在胆固醇合成路径(附图7)的中间步骤中合成。一种作为法尼基转移酶的胞浆酶将法尼基残基连接在半胱氨酸上。
脂肪酸残基的存在使前核纤层蛋白A和B能够锚定在内质网(ER)的被膜的胞浆层中。然后，前核纤层蛋白A和B分别被FACE1(ZMPSTE24)或FACE2(Rce1)切割，并失去其后三个C端氨基酸aaX。仍然锚定在ER的被膜中的蛋白受到第二种酶(即ICMT)的作用，ICMT将甲基连接在已经法尼基化的半胱氨酸上。
核纤层B的熟化在此步结束。这些蛋白先在ER的被膜的平面中滑移，然后在核被膜的胞浆面的平面上滑移，通过核孔，并定位在核被膜的核质层中，于此处它们参与核纤层的形成，并于此处与很多蛋白(包括核纤层蛋白B受体)相互作用。锚定在被膜导致位于核质内部并远离被膜的核基质中不存在核纤层蛋白B。
对在同一C端半胱氨酸上法尼基化且羧甲基化的前核纤层蛋白A进行最后的熟化步骤：由FACE1(可能也利用Rce1)来蛋白酶解切割后15个氨基酸。核纤层蛋白A失去其对ER的锚定，变为可溶性，并且就像所有可溶性蛋白那样按照其核定位信号通过核孔进入核质，该核定位信号可募集必要的输入复合物(附图8)。
在核质中，核纤层蛋白A(和核纤层蛋白C)位于在核被膜下方的核纤层中，在这里它与插入被膜的核质层中的大量蛋白相互作用。核纤层蛋白A和C(不像核纤层蛋白B那样)也分散在其余的核质中，在其余的核质中它们参与核基质或核骨架的形成(附图6)。
核基质控制核基因组的运行：复制、DNA修复、RNA转录、mRNA剪接、其它RNA熟化等，并且如遗传的核纤层病中观察到的异常所示的那样，核基质的成分(包括核纤层蛋白A和C)与输入到核质中的大量蛋白(p53、SREBP等)相互作用(Broers等，2006；Vlcek等，2001；Vlcek和Foisner，2006)。核被膜及其跨膜蛋白质以及核纤层的核纤层蛋白的核质斜率，有助于在转录调节因子使用之前和在基因表达调节中的转录调节因子的贮存(Heessen和Fornerod，2007；Shaklai等，2007)。
核纤层病首先发现于1999年，其主要表现为在指定组织、骨骼肌、心肌等中的疾病，但是核纤层蛋白却是遍在蛋白(Vlcek和Foisner，2007a；Vlcek和Foisner，2007b；Worman和Bonne，2007)。脂肪代谢障碍将脂代谢异常和胰岛素抵抗与脂肪组织的全身分布的紊乱联系起来，与抗逆转录病毒治疗过程中所观察的脂肪代谢障碍一致(Capeau等，2005)。
2002年之后发现了“系统性”核纤层病：上颚发育不良(OMIM248370；(Agarwal等，2003；Novelli等，2002))；郝-吉早衰症(OMIM176670；(DeSandre-Giovannoli等，2003；Eriksson等，2003))；限制性皮病(OMIM275210；(Navarro等，2005；Navarro等，2004))。它们涉及了患者身体的所有组织、皮肤及其附件、骨骼肌和心肌、骨和软骨组织、脂肪组织及其代谢产物，但特别是它们伴随有加速老化，最严重的是在出生时致死的限制性皮病。这三种疾病与编码核纤层蛋白A和C的LMNA基因的突变或编码ER的蛋白酶的FACE1基因(ZMPSTE24)的突变有关，该蛋白酶在两个阶段中切割前核纤层蛋白A。LMNA基因的突变导致前核纤层蛋白A的由FACE1识别的位点消失：该蛋白不被切割，因此保留了其法尼基残基，并且像核纤层蛋白B那样，通过沿被膜滑移而输入到核质中(Pan等，2007)。法尼基化前核纤层蛋白A保持锚定在核被膜的核质面中，在此处其破坏核纤层的组织和核纤层与核膜的膜蛋白之间的相互作用，这涉及特性核形变(Goldman等，2004)。
其余的核基质没有核纤层蛋白A，具有多种功能性后果，例如p53下游通路活化(Varela等，2005)、有丝分裂异常(Cao等，2007；Dechat等，2007)和DNA修复异常(Liu等，2005；Liu等，2006；Liu等，2007b)等，导致细胞老化(Kudlow等，2007)。早衰症患者细胞的转录组分析显示了涉及动脉粥样硬化的基因的表达异常(Csoka等，2004)。
看起来，似乎使用某些抗逆转录病毒剂，特别是抑制ZMPSTE24(FACE1)的PI治疗的患者的加速老化遵循同一机制。
造成早衰症的LMNA基因突变解除了对隐蔽剪切位点的屏蔽，这导致合成了编码早衰蛋白的缺失150个核苷酸的mRNA，缺失50个氨基酸并保留其法尼基的前核纤层蛋白A。生理老化过程中，在不存在LMNA基因突变的情况下，由于剪接机构的与年龄有关的错误也产生同一蛋白(Scaffidi和Misteli，2006)。早衰蛋白在位于基膜下方的皮肤成纤维细胞中和在角质形成细胞中积聚。它可以作为皮肤老化的标记(McClintock等，2007)。
在早衰症患者的细胞中观察到的核变化(核质向胞质溶胶的隆起、被膜的破坏和核轮廓不规则等)也与病毒蛋白Vpr诱发的瞬时变化类似，所述Vpr通过瞬时破坏核被膜和核纤层促进AIDS病毒的整合前复合物的进入，所述复合物太大以至于不能通过核孔输入核质(deNoronha等，2001)。关于这些核输入机制的近期综述见(Suzuki和Craigie，2007)。
还已证实，包括伊默菌素在内(突变从而造成Emery-Dreiffus肌营养不良症)的核被膜的核质面的多种蛋白是AIDS病毒穿入核质和感染未分裂的细胞所必需(Jacque和Stevenson，2006)。
因此，术语遗传的核纤层病不仅包括由编码核纤层蛋白的基因(尤其是编码核纤层蛋白A和C的LMNA)的突变所产生的病理，而且包括由相关蛋白(包括参与核纤层蛋白熟化的那些蛋白)的突变所产生的病理。
核基质水平上由PI诱发的异常因此代表了获得性和医源性核纤层病。无论是遗传的还是获得的，核基质中的这些异常都导致基因组不稳定和细胞老化(Mehta等，2007；Oberdoerffer和Sinclair，2007)。
4.老化的“端粒”理论
细胞老化由测量端粒长度的“时钟”控制，端粒在每次有丝分裂中缩短，这种现象可以由催化性端粒酶亚单位的活性来平衡(Gilson和Geli，2007；Stewart和Weinberg，2006)。
在出现能直接测量端粒长度(特别是在单核血细胞中)的定量PCR(Cawthon，2002；Gil和Coetzer，2004；Njajou等，2007)之前，对使用抗逆转录病毒剂治疗的患者的细胞进行端粒酶活性的测量(TRAP测试)，所述测量具有可变结果，特别是取决于所分析的T-淋巴细胞亚型(Effros，2000)。
NRTI抑制端粒酶活性(Olivero，2007；Yamaguchi等，2001)。
核纤层蛋白A的异常引起端粒酶活性降低，导致端粒缩短加速。从早衰症患者的细胞中可观察到这些结果，无论所述细胞是否被转染以过表达催化性端粒酶亚单位(Wallis等，2004)。在转染后过表达正常、突变或缺失(与早衰症中相同)的核纤层蛋白A的健康对象的成纤维细胞获得了相当的结果(Huang等，2008)。因此，核基质和与其在核纤层水平相关的核被膜的蛋白直接或间接控制端粒酶活性(Pandita等，2007)。
5.某些转录调节因子，特别是p53和NF-KB参与了老化或其调节
两个蛋白质家族，即p53(Zafon，2007)和NF-KB(Hayden和Ghosh，2004)，控制大量基因的转录并且与老化现象相关。这些蛋白也与老化的其它理论中描述的机制相关，并且彼此有关联。
除了在控制细胞周期、应激反应、肿瘤发生和DNA损伤修复方面具有充分确认的功能外(Fuster等，2007；Helton和Chen，2007；Sengupta和Harris，2005)之外，p53还与细胞老化相关(例如见：(Bauer和Helfand，2006；Ben-Porath和Weinberg，2005；Papazoglu和Mills，2007；Sharpless和DePinho，2002；Tyner等，2002)。蛋白p53还与核纤层病所诱发的异常相关(Varela等，2005)、与解旋酶的功能相关(所述解旋酶的突变引起维尔纳综合征)(Brosh等，2001；Sommers等，2005)、与端粒调节相关(Wynford-Thomas，1996)并与线粒体呼吸的控制相关(Matoba等，2006)，它们都与p53通过其与外膜的凋亡分子的相互作用而在凋亡的活化中的作用无关(Manfredi，2003；Mihara等，2003；Moll等，2005)。p53也调节“胰岛素-IGF1-克罗索”代谢途径(见下文)。
NF-KB也与许多代谢途径相关。在培养中的成纤维细胞的RNA干扰对其造成的失活使它们免于老化(Hardy等，2005)。类似地，通过用微阵列分析的大量基因表达的变化，可由小鼠上皮细胞中表达NF-KB而诱发的阻断延缓了其老化(Adler等，2007)。
6.通过热量限制和连接质膜、细胞核和线粒体的胰岛素、IGF1和克罗索(klotho)激素的信号传递通路的老化的“代谢”理论
热量限制可提高啮齿动物寿命(Borone和Guarente，2005)。其激活脱乙酰基酶斯坦素(sirtuin)，所述脱乙酰基酶斯坦素靶向组蛋白(重新塑造染色质)(Vijg和Suh，2006)、大量其它核蛋白(包括p53、参与DNA修复的蛋白在内的转录因子等)以及胞浆蛋白(微管蛋白)和线粒体蛋白(Guarente和Picard，2005；North和Verdin，2004；Porcu和Chiarugi，2005)。
热量限制通过内皮NO-合酶eNOS的表达而引起线粒体的生物产生(Nisoli和Carruba，2006；Nisoli等，2005)，导致ROS产量升高(Gredilla和Barja，2005)。
与老化相关的胰岛素和IGF信号传递通路(Bartke，2005；Russell和Kahn，2007)为热量限制所抑制(Holzenberger等，2004；Masoro，2004)。
热量限制也抑制克罗索激素所调节的信号传递通路(Kurosu等，2005；Unger，2006)，小鼠中克罗索激素的突变伴随着过早衰老(Kuro-o等，1997)。克罗索是FGF-23受体诱发的反应的调节子(Kurosu等，2006)。克罗索和FGF-23的突变诱发相同的过早衰老表型，所述过早衰老表型已知由维生素D过多症造成，并且通过提高维生素D作用的基因的缺失而纠正(Razzaque和Lanske，2006)。克罗索也阻断Wnt受体的反应(Liu等，2007a)，这表明了与老化相关的代谢途径的多样性。最后，胰岛素通过磷脂酰基-肌醇3激酶刺激ADAM家族的金属蛋白酶对克罗索的跨膜前体的切割并将克罗索释放至细胞外基质中(Chen等，2007)。
蛋白p53也与这些代谢途径的调节相关(Campisi，2004；deOliveira，2006；Kim等，2007；Schmid等，2007)。
蛋白p66shc代表胰岛素的质膜受体和IGF1的质膜受体、细胞核与线粒体之间的通信信号之一(Martin和Friedman，2004)。KOp66shc-/-小鼠显示了高应激耐受性和寿命的延长(Migliaccio等，1999)。P66shc是位于线粒体中的p53的靶，其控制代谢和ROS的产生(Migliaccio等，2006；Nemoto等，2006；Orsini等，2004；Trinei等，2002)。p66shc的缺失会抑制心干细胞老化并防止心脏病，所述心干细胞老化和心脏病是由糖尿病引起的两种现象(Rota等，2006)。P66shc也是氧化还原酶。在对细胞应激的响应中，p66shc被输入至线粒体中并定位于膜间隙中，于该处其利用细胞色素C所传递的电子来合成H2O2(即，30％的细胞H2O2，其余由过氧化物酶体产生)(Giorgio等，2005)。H2O2可以表示用于寿命调节的细胞内信号(Giorio等，2007)。
发明内容
经过长期的研究，本发明人显示，在下述意义上，羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂(他汀类)与法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂(氨基双膦酸类，NBP)的联合或一种它们的生理上可接受的盐的联合可有效治疗与异戊二烯化蛋白在细胞中的积聚和/或存留相关的情况(无论是否为病理性的)，所述意义在于，其在C15和C20处的或以不确定形式对整个蛋白异戊二烯化途径发挥作用。本发明人还观察到，羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂与法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的联合对于早衰症患者成纤维细胞的正常表型的恢复具有加性效应。联合的效果明显优于单独使用所述抑制剂中的一种或另一种的效果(Varela等，2008(54bis))。
对于早衰症患者细胞应用此联合会导致对蛋白的异戊二烯化的抑制，因此导致非法尼基化核纤层蛋白A的出现、核症状的改善和对反常的DNA再分配的部分纠正。在限制性皮病的小鼠模型中也观察到异戊二烯化抑制，其可部分恢复小鼠寿命(Varela等，2008(54bis))。抗逆转录病毒治疗靶向多个代谢途径和多个细胞区室，如胞质溶胶、核质和线粒体。
这些治疗的副作用复制了在因LMNA基因或ZMPSTE24基因的突变所引起的遗传的核纤层病患者中所观察到的一些临床和生物征候。这些突变之间的共同点在于，它们保留了连接于核纤层蛋白A或连接于前核纤层蛋白A的法尼基。这些法尼基将核纤层蛋白A在核纤层水平锚定在核被膜的核质面上，而其余的核质则没有可溶的核纤层蛋白A。
核纤层蛋白A分布的这两种异常在许多核代谢途径(DNA复制和修复、基因转录、端粒缩短等)的水平上产生了有害后果，并且在其它细胞区室(包括线粒体)也具有有害后果。细胞的普遍的功能障碍引起其加速老化及寿命缩短。
作为一类抗逆转录病毒治疗物的蛋白酶抑制剂抑制ZMPSTE24，阻断前核纤层蛋白A的熟化，并引起法尼基化前核纤层蛋白A在细胞中的存留。附图9示意性地显示了本发明人提出的基于前核纤层蛋白A熟化及其功能结果的老化理论。
另外，病毒蛋白酶抑制剂对于线粒体有间接作用，另一类抗逆转录病毒药物(即，病毒核苷酸逆转录酶抑制剂)直接破坏线粒体，线粒体是其功能异常已知与老化相关的细胞器。
因此，本发明的目的在于分析这两种抗逆转录病毒治疗引起AIDS病毒感染者加速老化的机制，和证实这些机制与引起患遗传核纤层病的患者加速老化的那些机制相类似。
本发明人推断，抗逆转录病毒治疗的上述副作用可以通过下述组合物或治疗得到最小化，所述组合物包含或所述治疗结合：
-至少一种羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂或一种其生理上可接受的盐，和
-至少一种法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂或一种其生理上可接受的盐。
本发明因此涉及一种抗HIV组合物，所述组合物包含至少一种羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂、至少一种法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂或者一种它们的生理上可接受的盐，和抗HIV剂。
该组合物可以用于例如治疗与异戊二烯化蛋白在细胞中的积聚和/或留存相关的情况(无论是否为病理性的)。特别是，根据本发明，所述组合物可用在HIV感染者的治疗中。
本发明还涉及一种根据本发明的组合物，其中，所述抗HIV剂为抗逆转录病毒剂或抗逆转录病毒剂的混合物。
本发明还涉及一种根据本发明的组合物，其中，所述抗HIV剂为蛋白酶抑制剂或逆转录酶抑制剂。
本发明还涉及一种根据本发明的组合物，其中，所述抗HIV剂为选自包括夫沙那韦(fosamprenavir)、洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)、安普那韦(amprenavir)、阿扎那韦(atazanavir)和茚地那韦(indinavir)的组的蛋白酶抑制剂。
本发明还涉及一种根据本发明的组合物，其中，所述抗HIV剂为选自包括齐多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、去羟肌苷(didanosine)和阿巴卡韦(epzicom)的组的逆转录酶抑制剂。
在本发明的组合物中，抗HIV剂还可以是病毒的一种或多种抗蛋白酶和/或病毒的一种或多种逆转录酶抑制剂和/或病毒进入细胞的一种或多种抑制剂和/或一种或多种整合酶抑制剂和/或具有抗病毒效果的任何其它治疗、特别是国家和/或国际管理机构和科学界公认的任何治疗的联合。
本发明还涉及一种根据本发明的组合物，其中，使用了同时是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂和法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的化合物。
非常具体而言，根据本发明的组合物用于治疗显现出与早衰蛋白在细胞中的积聚和/或留存相关的副作用的HIV感染者；更加具体而言，用于与法尼基化前核纤层蛋白A(无论其是否被缩短或被修饰)在细胞中的积聚和/或留存相关的情况的治疗。
根据本发明，任何法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂或一种其生理上可接受的盐都可以用于制备本发明的组合物。
生理上可接受的盐可以是例如与下述酸形成的盐：盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸或磷酸，诸如乙酸，甲酸、丙酸、苯甲酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、乙醛酸、天冬氨酸等羧酸，诸如甲基磺酸或乙基磺酸等烷基磺酸和诸如苯磺酸或对甲苯磺酸等芳烷基磺酸。
具体而言，法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂可以是聚膦酸类的一员，特别是氨基双膦酸(NBP)或其生理上可接受的盐。
聚膦酸是常用于治疗骨质疏松症和骨再生的合成分子。
术语膦酸酯适用于非常类似磷酸酯的分子：
膦酸酯
磷酸酯
双膦酸(BP)的核心相当于例如ATP中的P-O-P键，但其中氧由碳所代替。这使这些分子具有非常显著的稳定性。
简单的双膦酸相当于ADP，其中两个磷酸基(O3P-)为双膦酸基取代。
不同于膦酸酯的氧，中心碳可以还具有2个键，接枝在此碳上的基团的性质构成了双膦酸的特殊性。
当“侧”链(R1和R2)包含胺官能团(NH)或更常见的一个或多个氮原子时，其称为氨基双膦酸或NBP。
当然，其它取代基也可以连接于氧。
溶液中的焦磷酸或焦磷酸酯(PPi)
焦磷酸
在大量代谢反应中被用作底物转运体，并且其在反应结束时复原。利用偶联于焦磷酸酯的分子的代谢途径之一是蛋白质异戊二烯化。
将异戊烯基PP(基于C5的单元)接枝在香叶基PP(C10)上可得到法尼基PP并释放PPi，该反应由法尼基焦磷酸酯合酶(FPS)酶催化。
该步骤可被NBP特异性地抑制。
关于这一点，作为实例，氨基双膦酸(法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂)可以选自：
-阿仑膦酸或其离子形式阿伦膦酸根；
-氯膦酸或其离子形式氯膦酸根；
-羟乙磷酸或其离子形式羟乙磷酸根；
-伊班膦酸或其离子形式伊班膦酸根；
-亚甲磷酸或其离子形式亚甲磷酸根；
-奈立膦酸或其离子形式奈立膦酸根；
-奥帕膦酸或其离子形式奥帕膦酸根；
-帕米膦酸或其离子形式帕米膦酸根；
-利塞膦酸或其离子形式的利塞膦酸根；
-替鲁膦酸或其离子形式替鲁膦酸根；
-唑来膦酸或其离子形式唑来膦酸根；
-4-N,N-二甲基氨基甲烷双膦酸或其离子形式二甲基氨基甲烷双膦酸根；
-α-氨基-(4-羟基苯亚甲基)双膦酸。
优选的是，根据本发明，优选使用唑来膦酸(zoledronicacid，也称为zolendronicacid)或其离子形式的唑来膦酸根(zoledronate，也称为zolendronate)。
根据本发明，在组合物制备中可以使用任何HMG-CoA还原酶抑制剂或其生理上可接受的盐。
具体而言，HMG-CoA还原酶抑制剂可以是他汀类的分子(无论是脂溶性的还是水溶性的)或其生理上可接受的盐。
他汀已经在真菌中确定。它们对于作为胆固醇和类固醇的生物合成中的关键酶的HMG-CoA还原酶具有抑制活性，所述HMG-CoA还原酶在甲羟戊酸(溶液中的甲羟戊酸根)中催化偶联于辅酶A的羟甲基戊二酸(hydroxymethylglutarate)的还原。此抑制通过其与羟甲基戊二酸骨架的结构相似性而得到保证。所涉及的代谢途径确定有胆固醇生物合成，但还包括合成异戊二烯基、5个异戊二烯碳基本单元的聚合物用于修饰细胞中约300种蛋白和附加亲脂性尾部，特别是使其能够锚定在膜中。
全部来自丙酮酸和HMG-CoA的主要的聚戊二烯为香叶基(C10)、法尼基(C15)和香叶基-香叶基(C20)。
所有他汀都具有普遍的肝选择性，但是不是全都具有相同的进入细胞的模式。实际上，普伐他汀与瑞舒伐他汀都具亲水性，因而是水溶性的，与亲脂的所有其它他汀不同，因此可以通过质膜(脂双层)自由扩散，这无疑地说明了其较高的毒性。水溶性他汀需要特异性的转运体以进入细胞，所述转运体为有机阴离子转运体3或OAT3或SLC22A8(Takedaa等，2004(46))。
它们常用于治疗高胆固醇血症，其副作用罕见，且已得到详细确认。具体而言，这些副作用为横纹肌溶解的情况(根据所用分子存在1％～7％的情况，Evans等，2002(12))，其早期病征(受治疗患者肌肉痛)导致治疗立即中止。
关于这一点，作为实例，他汀可以选自阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、利伐他汀(rivastatin)、美伐他汀(mevastatin)(或康百汀(compactin))、氟朵他汀(fluindostatin)、伟络他汀(velostatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、达伐他汀(dalvastatin)、西伐他汀(cerivastatin)、喷妥司汀(pentostatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)，或一种其生理上可接受的盐。
洛伐他汀、普伐他汀和辛伐他汀是源于真菌代谢物的分子，而其它他汀(阿托伐他汀、西伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀和瑞舒伐他汀)完全是合成的。优选的是，根据本发明，使用普伐他汀，其为半天然、水溶性他汀。
当然，根据本发明，可以使用与一种、两种或更多种HMG-CoA还原酶抑制剂联合的一种、两种或更多种法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂。
根据本发明的具体形式，组合物既可用于治疗HIV感染者，也可用于治疗抗HIV治疗的副作用，如皮肤老化、体毛或头发脱落、骨质疏松症和脂肪代谢障碍。
根据本发明，法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂和HMG-CoA还原酶抑制剂有利地以生理有效剂量存在于组合物中。
通常，施用量可根据患者、病理、施用模式等调整。应该理解，可以重复使用，可选的是与其它活性成分或任何载体组合而重复使用。
一般而言，抑制剂的日剂量可以是获得目标效果所需的最低剂量。
根据本发明，羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂、法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂和抗HIV剂可以以与一种或多种惰性(即无生理活性且无毒性)赋形剂或载体的混合物的形式用在组合物中。可以列举例如常用于可治疗HIV感染者的药物中并且与抗HIV剂一起使用的成分。
本发明的组合物还包含至少一种其它活性成分，特别是另一种治疗活性的成分，所述成分例如可同时或分开使用，或者根据所用盖伦制剂而随时间扩散地使用。例如，所述其它成分可以是在例如治疗HIV感染者可发展出的机会致病症中所使用的活性成分。
本发明的组合物是既可用于治疗HIV感染者也可用于预防和/或治疗因使用抗HIV剂而导致的皮肤疾病的组合物。该组合物可以用作HIV感染者多联治疗的一部分。抗HIV剂可以是单剂或多剂(多种抗HIV剂的混合物)。在多联治疗(例如，二、三或四联治疗)中，抑制剂混合物可以伴有一种或多种抗HIV剂。
抗HIV剂也可以是病毒的一种或多种抗蛋白酶和/或病毒的一种或多种逆转录酶抑制剂和/或病毒进入细胞的一种或多种抑制剂和/或一种或多种整合酶抑制剂和/或具有抗病毒效果的任何其它治疗、特别是国家和/或国际管理机构和科学界公认的任何治疗的联合。
因此，本发明还涉及用于治疗HIV感染者的方法，所述方法包括施用本发明的组合物。本发明的组合物如上所述。
根据本发明，所述施用可以按照施用抗HIV组合物领域的技术人员所知的任何方式来进行。例如可以是口服或注射。
如上所示，本发明的组合物的施用剂量取决于患者的需要，还要考虑患者生理上接受性来确定。
本发明的组合物中的抑制剂的量可以为下述量：所述量例如能使羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂的施用剂量为0.01mg/kg体重～2mg/kg体重，并使法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的剂量为0.01mg/kg体重～40mg/kg体重。
根据本发明，例如，在本发明的组合物中，法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂与羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制的比例或它们的一种生理上可接受的盐的比例可以为0.01～0.2，优选为0.05～0.35。
本发明的组合物中抗HIV剂的量通常根据治疗HIV感染者领域的技术人员的现有知识确定。抗HIV剂的量例如可以选自常用于HIV感染者的那些量。
在本文所描述的各抗HIV剂实例和本文中所描述的抗HIV剂的各种混合物或联合物中，抗HIV剂浓度的实例如VIDALDictionary(《VIDAL辞典》，注册商标)(例如2007年版)中所提供。该辞典中所指示的浓度也是批准用于人类的浓度。
本发明还涉及用于治疗在接受抗HIV治疗的患者中所引发的过早衰老和/或脂肪代谢障碍等副作用的方法，所述方法包括施用包含至少一种羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂和至少一种法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的混合物。
在一些实施方式中，所述HMG-CoA还原酶抑制剂可为他汀类的分子或一种其生理上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述HMG-CoA还原酶抑制剂可为水溶性他汀。
在一些实施方式中，所述HMG-CoA还原酶抑制剂可选自包括阿托伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、利伐他汀、美伐他汀(或康百汀)、氟朵他汀、伟络他汀、氟伐他汀、达伐他汀、西伐他汀、喷妥司汀、瑞舒伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀和其生理上可接受的盐的组。
在一些实施方式中，所述法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂可选自包括氨基双膦酸(NBP)类的分子或一种其生理上可接受的盐的组。
在一些实施方式中，所述氨基双膦酸能够选自：
-阿仑膦酸或其离子形式阿伦膦酸根；
-氯膦酸或其离子形式氯膦酸根；
-羟乙磷酸或其离子形式羟乙磷酸根；
-伊班膦酸或其离子形式伊班膦酸根；
-亚甲磷酸或其离子形式亚甲磷酸根；
-奈立膦酸或其离子形式奈立膦酸根；
-奥帕膦酸或其离子形式奥帕膦酸根；
-帕米膦酸或其离子形式帕米膦酸根；
-利塞膦酸或其离子形式利塞膦酸根；
-替鲁膦酸或其离子形式替鲁膦酸根；
-唑来膦酸或其离子形式唑来膦酸根；
-4-N,N-二甲基氨基甲烷双膦酸或其离子形式二甲基氨基甲烷双膦酸根；
-α-氨基-(4-羟基苯亚甲基)双膦酸。
在一些实施方式中，所述法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂可为唑来膦酸或其离子形式唑来膦酸根。
在一些实施方式中，所述施用可以以下述剂量进行：所述羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂的剂量为0.01mg/kg体重～2mg/kg体重，并且所述法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的剂量为0.01mg/kg体重～40mg/kg体重。
在一些实施方式中，所述施用可口服或注射进行。
施用条件、量和路线可以如本文中所述(例如上文中所述)。抗HIV剂例如为如上所述的抗HIV剂或联合。
本发明主要涉及上述抑制剂混合物作为具有医源性结果(例如过早衰老)的治疗的辅药的应用，例如包括，特别是引起此医源性结果的“包含至少一种抗蛋白酶的抗HIV治疗的辅药”的应用。因此，引起本文中所引用的副作用的任何治疗均为本发明所关注。
本发明还涉及用于治疗HIV感染者的方法，所述方法可以以任何顺序包括以下步骤：
-施用包含至少一种羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂和至少一种法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的混合物，
-施用抗HIV剂。
其中，施用是相伴、连续或交替的。
根据本发明，所述混合物和所述抗HIV剂可以共同施用。这涉及上述本发明的方法。
在一些实施方式中，所述抗HIV剂可为蛋白酶抑制剂或逆转录酶抑制剂。
在一些实施方式中，所述抗HIV剂可为选自包括夫沙那韦、洛匹那韦、利托那韦、安普那韦、阿扎那韦和茚地那韦的组的蛋白酶抑制剂。
在一些实施方式中，所述抗HIV剂可为选自包括齐多夫定、拉米夫定、去羟肌苷和阿巴卡韦的组的逆转录酶抑制剂。
在一些实施方式中，至少一种所述施用可口服或注射进行。
在一些实施方式中，所述施用可以以下述剂量进行：所述羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂的剂量为0.01mg/kg体重～2mg/kg体重，并且所述法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的剂量为0.01mg/kg体重～40mg/kg体重。
根据本发明，抗HIV剂可以如上所定义。
根据本发明，至少一种施用可以口服或注射进行。两种施用可以以相同方式或不同方式进行。
换言之，尽管在本说明书中我们提到组合物，但应该理解，组合物的各化合物可以与其它化合物相伴施用(例如，在一种组合物或两种组合物或三种组合物中施用，这些组合物中每一种包含一种或几种上述化合物，各化合物或组合物的施用模式可以相同也可以不同)，或彼此独立地施用(例如连续地施用)，例如独立施用羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂、独立施用至少一种法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂和独立施用抗HIV剂，这些施用相伴、连续或交替地以上述顺序或另一种顺序对同一患者进行。这些不同的施用可以以下述方式彼此独立或联合(组合物或共同施用)的方式进行：通过相同或不同的施用模式(注射、吞服、局部施用等)、每日一次或数次、一日或连续(也可以不连续)数日。
根据本发明，所述的抑制剂混合物的施用可以如下进行，例如，羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂的剂量为0.01mg/kg体重～2mg/kg体重，并且法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的剂量为0.01mg/kg体重～40mg/kg体重。
抗HIV剂的施用可以以如上所述的方式进行。
仅作为一个实例，下表中描述了用于实施上述本发明的一种方法或另一种方法的剂量。本发明的组合物中抑制剂和抗HIV剂的量的实例可以从此表中导出。
剂量1 剂量2 路线 较宽范围的抗HIV剂
普伐他汀 10mg/d～20mg/d 20mg/d～40mg/d 口服 1mg/d～100mg/d
辛伐他汀 10mg/d 10mg/d～40mg/d 口服 1mg/d～100mg/d
阿伦膦酸 10mg/d 20mg/d～40mg/d 口服 1mg/d～50mg/d
唑来膦酸 4mg/3s 或0.20mg/d IV 0.01mg/d～0.50mg/d
帕米膦酸 15mg/d～90mg/d - IV 1mg/d～100mg/d
氯膦酸 1600mg/ 2倍 口服 100mg/d～2g/d
“IV”指静脉注射
“d”指“日”。剂量/d(Dose/d)＝剂量/日(dose/day)。
根据本发明，可用于实施例本发明的抗HIV剂的剂量可以为本领域技术人员已知。所述剂量可以是例如VIDALDictionary(注册商标)(例如2007年版)中描述的剂量。对于上述抗HIV剂和上述抗HIV剂的各混合物或联合的各个实例，也可以在VIDALDictionary(注册商标)(例如2007年版)中找到可用于实施本发明的剂量。
通过下述实例，本领域技术人员还可以了解本发明的其它优点，所述实例出于说明的目的而提供并如附图中所示。
附图说明
图1显示了对于使用递增剂量的水溶性他汀(普伐他汀P，20μM～100μM)和氨基双膦酸(NBP，唑来膦酸Z，20μM～100μM)处理的“正常的”对照成纤维细胞，利用Western印迹获得的结果(A道至I道，分别对应P20/Z20、P20/Z60、P20/Z100、P60/Z20、P60/Z60、P60/Z100、P100/Z20、P100/Z60、P100/Z100)。J道为存在前核纤层蛋白A(DR患者的成纤维细胞)的阳性测试，印迹K为单独使用溶剂(PBS)处理的阴性测试。
图2显示了以各产品的有效剂量获得的结果。
图3显示了通过将两种产品一起施用而获得的较好的效果。
图4显示了两种产品的联合对于老化的细胞的作用。
图5通过测量作为细胞培养条件的函数的有丝分裂指数显示了成纤维细胞的细胞增加。有丝分裂指数对应于被标记(进入分裂过程)的细胞核数与作为每次处理的函数而观察的区域的总细胞核数之间的比例。
图6：线粒体老化理论的示意图。抗逆转录病毒治疗的线粒体靶。图例：NRTI：逆转录酶的核苷抑制剂，PI：蛋白酶抑制剂，mtDNA：线粒体DNA，ROS：活性氧物种。
图7：类异戊二烯的生物合成途径及其抑制剂的示意图。
NBP：氨基双膦酸
FTI：法尼基转移酶抑制剂
GGTI：香叶基-香叶基转移酶抑制剂
图8：前核纤层蛋白A的转译后熟化、其核输入和其在核质中的定位的示意图。
a：正常前核纤层蛋白A
b：早衰症中缺失的前核纤层蛋白A(早衰蛋白)或限制性皮病中ZMPSTE24蛋白酶突变过程中的前核纤层蛋白A的熟化。AIDS病毒的蛋白酶抑制剂(PI)抑制ZMPSTE24。
NPC：核孔
NE：核被膜
HGPS：郝-吉早衰综合征
RD：限制性皮病
图9：基于核纤层蛋白异常及其功能结果的老化理论的示意图。图例：PI：病毒蛋白酶抑制剂。
图10：Western印记显示，前核纤层蛋白A苯基化的阻断需要同时抑制法尼基转移酶和I型香叶基-香叶基转移酶。使用法尼基转移酶抑制剂和/或I型香叶基-香叶基转移酶处理的HeLa细胞中的核纤层蛋白A/C的检测。LA＝核纤层蛋白A，LC＝核纤层蛋白C，Pre＝前核纤层蛋白A。
图11：由未处理的细胞的核膜(a)、使用FTI(2.5μM，b)处理的或使用普伐他汀+唑来膦酸混合物(各1μM，c)处理的早衰症患者的细胞的核膜中提取的蛋白的质谱分析。
图12：由Zmpste24-/-小鼠的未处理的成纤维细胞(a)或使用普伐他汀+唑来膦酸混合物(各1μM，b)处理的成纤维细胞的核膜中提取的蛋白的质谱分析。
图13：通过质谱(MALDI-ToF)分析核纤层蛋白A(对照细胞)和前核纤层蛋白A(Zmpste24-/-小鼠细胞)。a，b：对应于法尼基化(a)和香叶基-香叶基化(b)胰蛋白酶解肽的图谱部分。
图14：证实普伐他汀+唑来膦酸组合对于前核纤层蛋白A在对照细胞中的积聚和早衰症患者的协同效应的不同实验的结果的图：(a)未处理的、使用普伐他汀和/或唑来膦酸处理的人类成纤维细胞中的核纤层蛋白A/C和前核纤层蛋白A的免疫细胞化学检测。(b)正常人类成纤维细胞和来自使用普伐他汀+唑来膦酸组合处理的早衰症患者中的核纤层蛋白A/C和前核纤层蛋白A的免疫细胞化学检测。(c)普伐他汀+唑来膦酸处理对于早衰症患者细胞的核形态的效果的定量分析。(d)存在法尼醇、香叶基香叶醇或这两种化合物时，普伐他汀+唑来膦酸处理对于早衰症患者细胞的核形态的效果的定量分析。误差线＝平均值±平均值的标准误差。标度条＝10μm。
图15：使用普伐他汀+唑来膦酸处理的结果的图示，显示了早衰症患者细胞中核形态的纠正和对核质中核纤层的核纤层蛋白A/C和核纤层蛋白B1的异构体部分重新定位的诱导。(A)免疫荧光和共聚焦显微术。各画面的图像a至c为叠加的27个图像的平均强度的投影，并显示了在使用PBS孵育的早衰细胞中钙网蛋白所标记的核网的细管。图像d至l：以0.2μm的厚度分隔的共聚焦截面。普伐他汀+唑来膦酸处理(g)和(h)的效果。(B)核纤层蛋白B1和钙网蛋白的共定位。标度条＝5μm。
图16：普伐他汀和唑来膦酸(无论联合与否)在法尼醇、香叶基香叶醇或这两种分子存在下对于培养的Zmpste24-/-小鼠(a)和对照小鼠(b)的细胞的核形态的效果的图示。
图17：普伐他汀+唑来膦酸处理对于早衰症患者细胞中DNA的双链断裂修复(DSB)异常的效果。照射后24小时检测的H2AX磷酸化组蛋白的焦点的免疫检测，焦点对应于未修复的双链断裂(上方图像)。DAPI的核标记(下方图像)。底部曲线：使用PBS孵育的或使用普伐他汀+唑来膦酸处理的对照细胞(实心方块)和早衰细胞(空心圆圈)中H2AX磷酸化组蛋白的焦点数量在照射后随时间的变化。各曲线表示至少3次实验的平均值±平均值的标准误差。
图18：普伐他汀+唑来膦酸处理对于Zmpste24-/-小鼠的类早衰表型的效果：(a)表现3月龄的Zmpste24+/+、Zmpste24-/-和使用普伐他汀+唑来膦酸组合处理的Zmpste24-/-小鼠的照片。标度条＝1cm。(b)3月龄的Zmpste24+/+(n＝12)、Zmpste24-/-(n＝13)和经处理的Zmpste24-/-(n＝15)小鼠的体重。(c)显示经处理的Zmpste24-/-小鼠的寿命显著增加的Kaplan-Meier曲线。(d)经处理和未处理的Zmpste24-/-小鼠的胫骨的计算机显微断层成像的三维图示(上方图像)。下方画面表示未处理和经处理的Zmpste24-/-小鼠的相对骨体积和骨小梁数。(e)Zmpste24+/+、Zmpste24-/-和经处理的Zmpste24-/-小鼠的肝细胞的核异常的量化。白色箭头显示异常的核。标度条＝1μm。(f)通过定量RT-PCR分析获得的Zmpste24+/+、Zmpste24-/-和经处理的Zmpste24-/-小鼠的肝和心中的p53的靶基因的相对表达。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。误差线表示平均值±平均值的标准误差。
图19：单用普伐他汀或单用唑来膦酸对于Zmpste24-/-小鼠寿命的效果：仅用普伐他汀(a)和仅用唑来膦酸(b)处理Zmpste24-/-小鼠(空心菱形)和未处理的Zmpste24-/-小鼠(实心圆圈)的Kaplan-Meier曲线。
图20：普伐他汀+唑来膦酸处理对于Lmna-/-小鼠寿命的效果：使用由普伐他汀+唑来膦酸处理的Lmna-/-小鼠(n＝12，空心菱形)的Kaplan-Meier曲线，与未处理的小鼠(实心圆圈，n＝11)的Kaplan-Meier曲线相比较。
具体实施方式
实施例
实施例1：水溶性羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂(水 溶性他汀：普伐他汀)与法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂(氨基双膦酸：唑来膦酸)的联合对于正常和类早衰细胞培养物的加性效应
A.规程
A.1细胞及细胞培养物
细胞系是来自CoriellInstitute的对照成纤维细胞AG16409或来自限制性皮病患者活检物的成纤维细胞。将它们在P2室中于5％CO2下在37℃培养。
常用的完全培养基为：
-RPMI(Invitrogen)，补充有
-胎牛血清20％(Invitrogen)
-L-谷氨酰胺200mM(Invitrogen)
-青霉素/链霉素/两性霉素的混合物1X(储液100X，Cambrex)
A.2细胞收集
按照如下方式通过以胰蛋白酶处理进行细胞收集(针对大烧瓶的规程，75cm2，BDFalcon)：
-抽吸培养基；
-使用10mlPBS1X(Invitrogen)洗涤细胞；
-加入5ml胰蛋白酶/EDTA溶液1X(Cambrex)；
-将烧瓶在37℃孵育约6分钟，该时间为细胞分离所需的时间；
-通过在15ml完全培养基中稀释来抑制胰蛋白酶；
-通过在16℃以1000rpm离心使细胞沉淀。
-将沉淀重悬浮于2mlPBS1X中，并在相同条件下再次离心。
将获得的细胞冷冻以备后用或将其由此洗涤的沉淀分培养。
A.3处理
所用的普伐他汀溶液(水溶性他汀)制备如下：
将40mg普伐他汀(SigmaAldrich，P4498)置于无菌水中以形成10mM储液。
通过将该储液稀释于完全培养基中而获得为500nM、1μM、5μM、50μM和100μM的最终测试浓度。
所用的唑来膦酸溶液(NBP)制备如下：
将(1-羟基-2-咪唑-1-基-1-膦酰基-乙基)膦酸储液(0.8mg/ml，Novartis)调整至浓度为2mM。
通过将该储液稀释于完全培养基中而获得为500nM、1μM、5μM、50μM和100μM的最终测试浓度。
A.4Western印记
A.4.1细胞的制备
对于Western印记实验，如下处理细胞：
将约7.5x105个细胞接种在大烧瓶中，并在上述条件下培养，直至接近融合(4天)。
4天后，使用PBS1X洗涤细胞，并将其置于取代有处理物的完全培养基中。
在37℃的孵育器中孵育细胞，持续进行处理所需的时间(6小时～72小时，顺次或同时进行)。
处理后，将细胞以胰蛋白酶处理(上述规程)，并于蛋白提取前将获得的沉淀保存在-80℃。
A.4.2用于Western印记的蛋白提取
将细胞沉淀置于300μl的裂解缓冲液中
并立即加入以下物质：
原钒酸钠1mM
PMSF1mM
将细胞暴露于超声2次，共30秒(BrandsonSonifierCellDisruptorB15)。
在4℃以10,000rpm离心10分钟分离细胞碎片。
在使用之前将蛋白上清液保存在-80℃。
解冻时进行蛋白检测。
A.4.3Western印记
-凝胶
8％的丙烯酰胺凝胶常用于检测各种形式的核纤层蛋白A/C。
在分离胶上倾注浓缩胶。
检测样品的蛋白浓度，并将各部分调整为每试管在15μl的qsf中的裂解缓冲液中为50μg。
向各样品中加入5μl上样缓冲液。
通过在95℃加热5分钟使样品变性并沉积在壁上。
在下述缓冲液中，先以50伏、然后以100伏，进行迁移：
Tris-碱0.3％
甘氨酸1.44％
SDS0.1％
-转印
通过在乙醇中浸泡，然后在无菌水中洗浴5分钟、在下述转印缓冲液中洗浴10分钟来制备转印膜(HybonP，AmershamBioscineces)。
Tris-碱12mM
甘氨酸96mM
乙醇20％
使凝胶在转印缓冲液中增湿20分钟，然后组装夹心物(Miniproteansystem，Biorad)。
转印通常在10伏下于冷室中过夜进行。
在PBS1X中冲洗该膜，将其保存在湿润环境中，并用于检测。
-检测
在室温将膜于下述饱和溶液中孵育1小时：
酪蛋白10％
Tween200.1％
PBS1X
在洗涤缓冲液(Tween200.1％/PBS1X)中冲洗2次，共10分钟。
将一抗在饱和缓冲液中稀释(细节及稀释参加下文中的免疫标记)。
在搅拌下于室温将膜与一抗孵育1小时。
然后使用洗涤缓冲液冲洗该膜3次，然后使用同一缓冲液洗涤3次，共15分钟。
将二抗(偶联于过氧化物酶的系统，JacksonImmunoresearch)在饱和缓冲液中稀释至1/10000。
在搅拌下于室温将膜与此溶液孵育30分钟～45分钟。
然后使用洗涤缓冲液冲洗该膜3次，然后使用同一缓冲液洗涤3次，共15分钟。
使用AmershamBioscience的ECLPlusWesternBlottingSystem试剂盒根据产品说明书进行检测。
检测后，将该膜暴露在BiomaxMR膜(Kodak)上，保持获得满意信号所必需的时间。
A.5免疫标记
A.5.1细胞制备
将细胞培养物以胰蛋白酶处理，并用Neubauer细胞计数器对细胞计数。
以5x104个细胞/孔的量对Labtech培养孔(Nunc，编号177399)进行接种。
以处理物(他汀和/或NBP)补充完全培养基，并将细胞培养专门一段时间。
然后抽吸培养基，拆下所述孔。
在PBS1X中洗涤载玻片。
在室温将细胞在4％的多聚甲醛的PBS溶液中固定10分钟。
在PBS1X中进行10分钟的洗涤。
通过在乙醇百分比递增的溶液(70％、90％、100％，重复最后的洗浴)中的连续洗浴3分钟来使细胞脱水。
干燥后，使用前将载玻片储存在-80℃。
A.5.2标记
解冻后，在室温于湿度箱中将细胞在50μl下述渗透化溶液中孵育5分钟：
在50μl下述孵育液中进行3次预孵育洗浴，每次15分钟：
将一抗在50μl孵育液中稀释至1/100，并在湿度箱中在室温下使其与细胞接触放置1小时。
所用的一抗具有两种：
-小鼠抗核纤层蛋白A/C(N端侧)，克隆4A7，
G.Morris(Oswestry，UK)赠送
-山羊抗前核纤层蛋白A(C末端15aa)，产品SC6214，SantaCruzBiotchnology,Inc.。
在50μl的PBS1X中进行3次冲洗，每次15分钟。
在湿度箱中于室温在50ml孵育液中使用二抗孵育1小时。二抗具有两种：
-驴抗小鼠，JacksonImmunoresearch，稀释至1/100，
-驴抗山羊，JacksonImmunoresearch，稀释至1/200。
在50μl的PBS1X中进行3次冲洗，每次15分钟。
在湿度箱中于室温进行与100μlDAPI50ng/ml溶液(SERVA，编号18860)的孵育。
在载玻片插板槽中进行3次于PBX1X中的冲洗，每次历时5分钟。
在0.1％Tween20的PBS溶液中进行5分钟的最后冲洗。
A.5.3显现
将细胞浸入一滴VectaShield(Vector)中，覆盖上盖玻片(object-coverslide)，并在配备有coolSNAP照相机(Princeton)的荧光显微镜(LeicaDMR，LeicaMicrosystems)下观察。
B.结果
B.1.Western印记(图1)
使用水溶性他汀(普伐他汀P，20μM～100μM)和联用氨基双膦酸(NBP，唑来膦酸Z，20μM～100μM)处理“正常的”对照成纤维细胞(A道至I道，分别对应P20/Z20、P20/Z60、P20/Z100、P60/Z20、P60/Z60、P60/Z100、P100/Z20、P100/Z60、P100/Z100)。Western印记显示，对应于作为两种分子的浓度增加的函数的非成熟前核纤层蛋白A(未被截短)的大小出现条带，确认了法尼基化为核纤层蛋白A熟化所必需。此结果显示，至少在离体情况下，在代谢途径的2个位置对法尼基PP合成的阻断与仅在一个位置阻断相比，对前核纤层蛋白A的法尼基化的抑制更为有效。
B.2免疫组织化学中的响应剂量和时间(图2)
响应剂量和响应时间曲线使得可以通过先后对健康的对照细胞和HGPS患者细胞测量两个参数来确定最大效能。
在对健康细胞在24小时内施用1μM普伐他汀并在12小时内施用1μM唑来膦酸时，获得了普伐他汀(水溶性)/唑来膦酸(NBP)的最有效联合。未观察到毒性。利用相同施用规程，对于HGPS细胞(核异常的细胞)，“变形的”细胞核的数量由75％降低至40％。测量对健康细胞获得的前核纤层蛋白A的水平。该测量显示了最高水平。
B.3免疫组织化学处理的效果(图3)
普伐他汀与唑来膦酸的联合作用，下述处理：普伐他汀100μM12小时，唑来膦酸20μM6小时，显示了较高效能，因为所处理的健康细胞产生的前核纤层蛋白A水平(估计为35％)在联合时远高于单独加入所述分子的情况(分别为25％和15％)。此外，变形细胞核(对于健康细胞具有毒性的迹象)的比率也最小(低于10％)，且低于单独使用普伐他汀处理的细胞的情况(约12％)。
B.4免疫组织化学表明的对于老化细胞的作用(图4)
作为“传代”数(细胞分培养的次数)的函数，细胞的老化、异常细胞核的比例因此而增加。此特征是未处理的HGPS细胞的典型特征。若HGPS细胞以1PM普伐他汀处理24小时且以1μM唑来膦酸处理12小时，则该比例得到维持甚至会略有降低(低于40％，相比之下，以安慰剂处理的细胞中高于80％)。
B.5结论
以分开施用普伐他汀/唑来膦酸时几乎观察不到效果的剂量来联用这些分子时是有效的。
因此，可以以比公开的关于细胞培养的文章(Kusuyama等，2006(27)，对于血管细胞祖细胞(vascularcellprogenitors)单独使用10μM普伐他汀；Flint等，1997(13)，对于新生鼠肌细胞单独使用25μM普伐他汀)中单独处理所用的剂量低得多的剂量，获得阻断异戊二烯化途径的生理效果。
实施例2：包含水溶性羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制 剂和法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的本发明的组合物对于老化的人成纤维 细胞和对于年轻的人成纤维细胞的分裂的效果
A.实施例目的
在本实施例中，测量对包含水溶性羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂和法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的本发明的组合物对于成纤维细胞的细胞分裂率(有丝分裂指数)的体外效果的评价。还将所述组合物对于老化的人成纤维细胞的效果与年轻的人成纤维细胞的效果进行了比较。本实验中所使用的活性剂的数量有四种，这些产品成对组合使用。使用的活性剂为：
A1：唑来膦酸
A2：阿伦膦酸
B1：普伐他汀
B2：辛伐他汀
本实施例中所使用的具体组合为：A1B1、A1B2、A2B1、A2B2。
B.规程
本实施例中，在所提供的培养皿中以胰蛋白酶处理之后，将两批成纤维细胞，即老化的成纤维细胞(批号：952)和年轻的成纤维细胞(批号：7080)，置于含有10％胎牛血清且不含抗生素的RPMI(Invitrogen)培养基中培养24小时。
加入最终浓度为1μm的各种活性剂，每种保持24小时(对于化合物A1、A2和B1在水中的储液或对于化合物B2在100％乙醇中的储液稀释1000倍)。
在以活性剂组合中的一种组合孵育细胞24小时后，通过并入溴脱氧尿苷(BrdU)45分钟来评价有丝分裂指数。免疫组织化学检测显示了DNA合成阶段的细胞(分裂前的细胞)。通过结合二氨基-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核(遗传物质)的染色。
获得六个显微视野(OLYMPUSIX70)，使得可以通过图像分析(OLYMPUSAnalySIS)测量有丝分裂指数。有丝分裂指数对应于并入BrdU的细胞核的数目与结合DAPI的细胞核的数目的比率。利用0.005至0.061的标准偏差来统计计算平均指数。
双向学生检验(bilateralStudenttest)使得能够测定所获结果的统计显著性。
C.结果
C.1细胞的一般目视观察(Generalvisualobservation)
这些结果显示，在先于本研究的不存在任何处理的情况下老化的成纤维细胞的分裂能力非常低。
年轻的成纤维细胞显示了优于老化的成纤维细胞的分裂能力。老化的成纤维细胞的分裂能力低于5％，而年轻的成纤维细胞的分裂能力为15.6％。未处理的老化的成纤维细胞与未处理的年轻的成纤维细胞之间的分裂能力因此相差3倍。
在本实施例中，使用所测试的活性剂组合孵育成纤维细胞24小时后，目视观察未发现毒性。
在本实施例中，孵育24小时后未观察到乙醇(最终为0.1％)的毒性作用。
D.有丝分裂指数评价(图5)
通常，未进行任何处理的老化的成纤维细胞在DNA合成阶段中的数目极低：低于5％(参见图5，柱1)。
年轻的成纤维细胞的有丝分裂指数也不是很高：15％左右(参见图5，柱6)。
与未进行任何处理的老化的对照成纤维细胞相比，暴露于乙醇(0.1％-24小时)的对照成纤维细胞在其有丝分裂指数方面未显示出显著的差异(p＝0.11，n＝6)。然后将这些值结合起来(对照组，n＝12)。
图5中柱2所示结果显示了在老化成纤维细胞的有丝分裂指数方面A1B1(唑来膦酸-普伐他汀)相对于对照的激活作用(因数为2的最大刺激)(p<0.001，n≥6)。
本实施例因此而表明，唑来膦酸-普伐他汀组合的应用对于老化对象的成纤维细胞的细胞分裂具有激活作用。
实施例3：水溶性羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂和 法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的联合对于具有类早衰综合征的小鼠模型的 效果
此处所用的Zmpste24-/-KO小鼠是引用的文章(Varela等，2005(49))中所述的那些小鼠。两种分子(普伐他汀和唑来膦酸)联合的效能的证据在与西班牙实验室(C.Lopez-Otin)合作时已有报道。以联合剂量(所述剂量在分开使用两种产品时不具有效果)获得的效能证实了加性效应。
将两种分子(唑来膦酸(Zometa(注册商标))100μg/kg/日和普伐他汀100mg/kg/日)在PBS1X中稀释并按日对1月龄的小鼠进行腹腔内注射，直至其死亡。对照组为单独使用PBS1X处理的相同范围的野生小鼠。
经处理的小鼠的存活率得到明显改善，并且对于雌性最大，平均寿命延长约80％。与单独使用PBS处理的个体相比，疾病的临床症状也全部得到明显减轻。特别是，观察到处理对这些小鼠的皮肤和毛皮的再生的效果，相比之下，使用PBS处理的小鼠显示了很大的光秃区域。
实施例4：水溶性羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂和 法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的联合对于离体人类皮肤提取物的效果
A.规程
在本实施例中，对于约60岁的供体的皮肤进行试验。制造人类皮肤的21个外植体制品，并在BEM培养基(BIO-EC’sExplantsMedium)中保持其存活。
将外植体如下分为每批具有六个外植体的三批和具有三个外植体的一个C0批：
-C0-对照组成形术：3个外植体
-C–未处理的对照组：6个外植体
-R–阳性对照组：6个外植体
-P–由本发明的组合物处理的外植体：6个外植体。
A.1处理
在不同日进行处理，先在第一日(D0)(制备外植体后2小时)，之后在D+1日、D+2日、D+4日、D+6日、D+8日和D10+日。
如下对外植体应用产品：
-C-外植体不接受任何处理，
-R-外植体在D0、D+2和D+4日各自接受1mg阳性对照物(视黄醇乳膏)，
-P1-外植体在每次处理时各接受2mg产品P。
通过局部涂布本发明的组合物来进行处理。然后使用刮板将组合物分布在外植体的整个表面上。每两天更新一半培养基，并使外植体在富含5％CO2的潮湿氛围中于37℃保持存活。
A.2.组织学取样
在D0日，获得Co批的3个外植体。
在D+6日和D+11日，获得各批的三个外植体。按照BIO-EC程序“P006-PPEH”，将样品一切为二，一半固定在甲醛中，另一半在-80℃冷冻。
B.组织学研究
在甲醛中固定24小时后，将样品脱水，并使用石蜡浸渍和包埋。制作用于形态观察的5μm截面的切片。
B.1.第一步：形态学研究
利用Masson三色染色(Goldner的一种变体)，对于截面切片进行表皮和真皮结构的形态学研究。
B.2.第二步：
B.2.1KI67的免疫标记：
使用以DAB检测的抗KI67的多克隆抗体(NovoCastra)，对冷冻的截面切片进行有丝分裂中细胞的免疫标记。在整个表皮长度上对阳性细胞计数，并报告每cm标记的细胞数目的平均值。
B.2.2I型胶原蛋白的免疫标记：
使用以FITC检测的抗I型胶原蛋白的多克隆抗体，对冷冻的截面切片进行I型胶原蛋白的免疫标记。细胞核用碘化丙啶复染。
B.2.3III型胶原蛋白的免疫标记：
使用以DAB检测的抗III型胶原蛋白的多克隆抗体，对冷冻的截面切片进行III型胶原蛋白的免疫标记。细胞核用Masson’shemalun复染。
B.2.4IV型胶原蛋白的免疫标记：
使用以FITC检测的抗IV型胶原蛋白的多克隆抗体(Cliniscience)，对冷冻的截面切片进行IV型胶原蛋白的免疫标记。细胞核用碘化丙啶复染。
B.2.5VII型胶原蛋白的免疫标记：
使用以FITC检测的抗VII型胶原蛋白的单克隆抗体，对冷冻的截面切片进行VII型胶原蛋白的免疫标记。细胞核用碘化丙啶复染。
B.2.6PECAM1的免疫标记：
通过使用以Fast-red检测的抗PECAM-1的单克隆抗体对冷冻的截面切片进行PECAM-1免疫标记，可以查看内皮细胞。
实施例5：水溶性羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂和 法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的联合对于体外皮肤形成细胞培养物的效果
本实施例使用与上述实施例2中所使用的相同的活性剂组合。所述各种活性剂组合在体外使用，以评价其对于涉及皮肤老化的生理参数的效果。
本实施例中所使用的组合分别为A1B1、A1B2、A2B1、A2B2。这四种组合以多种浓度测试，并且实验进行3次(代表至少36个实验点)。
四种组合的浓度由申请人提出，因此，在此研究阶段并未想到体外细胞毒性(除简单试验之外)。对于如实施例1中所示的成纤维细胞系的细胞培养物进行实验。该试验也应用于角质形成细胞培养物。对所示浓度的活性剂的四种组合进行如下参数检查。
-有丝分裂指数的测量；
-通过胶原网架的收缩而进行的细胞外基质重新塑造的测量；
-UVB照射(类似日光浴条件的光诱导应激)后DNA基因组修复的测量。
在将细胞暴露于活性剂中一次后进行有丝分裂指数的测量。通过已结合提供荧光的胸腺嘧啶类似物的细胞核的图像分析计数相对于细胞核总数目之比来评价所述指数。对多个视野进行分析。这些照片作为图解而存档。
对通过将成纤维细胞暴露于活性剂而引发的细胞外基质的重新塑造，通过将这些细胞引入胶原网架中并通过量化其缩回这些网架的能力来进行评价。缩回表面的评价提供了重塑指数。这些照片作为图解而存档。
在以模拟暴露于太阳下的条件的UV-B剂量照射细胞后进行DNA基因组修复的测量。其目的首先在于评价在监控DNA修复3段时间的过程中活性剂的效果。利用免疫组织化学技术，通过经UVB照射的环丁烷嘧啶二聚体的图像检测和分析而进行量化。
这些照片作为图解而存档。
实施例6：主要目的：测量HIV病毒和抗逆转录病毒治疗对于细胞 核、线粒体和细胞老化的胞浆标记物的影响
次要目的
-分析HIV感染者的细胞核、线粒体和胞浆功能变化的普遍程度；
-测量这些异常的发生率；
-根据暴露于抗逆转录病毒的持续时间(总体而言，按类别或按分子)(累积暴露时间)分析这些异常的类型和频率；
-根据细胞内HIV病毒载量分析这些异常的类型和频率；
-根据HIV感染的随访时长分析这些异常的类型和频率。
A.实验计划
实验计划的选择
本观察研究包括三组患者：
-组A：未进行任何抗逆转录病毒治疗的HIV1-感染者；
-组B：抗逆转录病毒治疗至少12个月的HIV1感染者；
-组C：年龄和性别相匹配的HIV阴性对照组。
B.合格标准：
纳入标准：
-年龄>18岁且<65岁：
-已签署知情同意书；
-已通过Elisa和Western印记确认HIV1阳性至少5年；
-HIV2阴性；
-从未接受过抗逆转录病毒治疗，或者首期治疗至少12个月。
排除标准：
-年龄<18岁和>65岁：
-未签署知情同意书；
-HIV2阳性
-使用他汀或氨基双膦酸治疗的患者
-未批准的相伴治疗：睾酮、胰岛素依赖型糖尿病治疗。
C.研究程序
评价的患者数：
200位患者，包括：
-组A：n＝50
-组B：n＝100
-组C：n＝50
在其随访过程中需要开始抗逆转录病毒治疗的组A的患者，在开始该治疗时具有一个附加的评价，并与组B的患者在该日期开始进行分析。
在他们被纳入组A的期间测量的数据使得刻意测量HIV病毒对于细胞核和线粒体功能的可能的直接作用。
研究过程中需要抗逆转录病毒治疗改变的组B的患者具有与在治疗有改变时随访中提供的相同的临床和亚临床(paraclinical)评价。考虑关于这些患者的随访数据，以计算在暴露于抗逆转录病毒的患者中所观察到的细胞核和线粒体功能破坏的发生率。
研究期：
研究期为36个月。
对于组A和组B的患者
HIV感染史：
-HIV感染诊断的日期
-污染模式
-CDC阶段
-对于阶段C：AIDS确定条件的诊断
-进行中的抗逆转录病毒治疗(开始日期，所施用的分子)
临床检查：
-体重、身高、体重指数
-腰围、臀围、腰臀比
血液检查：
-HIV病毒载量的测量(检测阈40拷贝/ml)
-CD4和CD8淋巴细胞水平测定
-血糖、胰岛素血症(insulinemia)、HOMA计算
-总胆固醇、LDL、HDL胆固醇
-甘油三酯
-对7.5ml的3个EDTA试管取样，以分析细胞核和线粒体功能、测量HIV前病毒DNA和细胞文库。
抗逆转录病毒靶细胞核、线粒体和胞浆蛋白的分析：
-Western印记和免疫标记：
-作为蛋白酶体活性的对照的NFB和IB的产生；
-核纤层蛋白A和B的熟化、核蛋白模型；
-SREBP异构体的产生及其核输入；
-纯化且去糖基化的CD36(±30kDa糖)(Abcam)的N-和O-糖基化；
-具有切割的定位信号的Hsp70向线粒体中输入，作为对线粒体蛋白酶体活性(Abcam)的测量；
-线粒体的“呼吸”功能；ROS产生，细胞色素氧化酶亚单位II和IV(MolecularProbes)的研究。
通过对某些靶的基因分型而进行对抗逆转录病毒治疗的可能的易感性的搜索，如同病毒蛋白酶对PI的敏感性所示那样(Baxter等，2006)：
-ZMPSTE24和Rce1涉及前核纤层蛋白A和B1/B2的熟化(分子遗传学实验室的常规做法)；
-能够产生对于脂代谢基因转录具有活性的SREBP域的S1-P和S2-P蛋白酶；
-线粒体脱氧核苷转运体。
对于对照组C：
临床检查：
-体重、身高、体重指数
-腰围、臀围、腰臀比
-对7.5ml的3个EDTA试管取样，以分析细胞核、线粒体和胞浆功能，并置入DNA和文库中。
随访
评价包括：
临床检查：
-体重、身高、体重指数
-腰围、臀围、腰臀比
血液检查：
-HIV病毒载量的测量(检测阈40拷贝/ml)
-CD4和CD8淋巴细胞水平测定
-血糖、胰岛素血症、HOMA计算
-总胆固醇、LDL、HDL胆固醇
-甘油三酯
-对7.5ml的3个EDTA试管取样，以分析细胞核、线粒体和胞浆蛋白、测量HIV前病毒DNA和置入DNA和细胞文库。
抗逆转录病毒靶细胞核、线粒体和胞浆蛋白的分析(见上文)
对于组A的患者：
需要开始抗逆转录病毒治疗的组A的患者具有与开始治疗时在随访中提供的相同的临床和亚临床评价。在经治疗的患者组(组B)中，关于这些患者的随访数据从此日开始分析。
对于组B的患者：
如果在研究过程中改变抗逆转录病毒治疗，则在治疗改变时，进行与随访中所提供的相同的临床和亚临床评价。考虑关于这些患者的随访数据，以计算在暴露于抗逆转录病毒的患者中所观察到的细胞核和线粒体功能破坏的发生率。
D.预期结果、展望
在感染有AIDS病毒且进行抗逆转录病毒治疗的患者体内，证实了在细胞培养物中体外获得的结果：这些治疗，特别是蛋白酶抑制剂，引发了与遗传的核纤层病(产生法尼基化前核纤层蛋白A或早衰蛋白)或“生理”老化(产生早衰蛋白)机制相同的加速老化。
巩固了早衰症中所用的药物组合(他汀和氨基双膦酸)可用于对抗感染AIDS病毒且进行抗逆转录病毒治疗的患者的加速老化的假说，并能够建立治疗试验。
实施例7：联合他汀和氨基双膦酸的治疗延长了再现人类早老化综合 征的小鼠模型的寿命
本实施例也发表在Varela等，NatureMedicine2008，7，767(54bis)中。
装置和方法
小鼠：
Zmpste24-/-和Lmna-/-小鼠的产生已有描述(Pendas等，2002(38)；Sullivan等，1999(285)。使用显微CTSkyScan1172系统(SkyScan–商标)进行了小鼠的计算机骨显微断层成像。对于小鼠的所有实验都遵循Oviedo大学(西班牙)动物实验委员会制定的规则。每天对小鼠施用稀释于PBS中的普伐他汀(100mg/kg/日)和唑来膦酸(100mg/kg/日)。接受普伐他汀-唑来膦酸治疗的小鼠或仅接受PBS的对照组小鼠未显示任何明显损害或应激。
细胞培养
对照组对象(GM00038)和罹患早衰症的患者和G608G携带者(AG11498和AG01972)的皮肤成纤维细胞获自Coriell细胞库。Hela细胞来自美国模式培养物集存库(AmericanTypeCultureCollection)。细胞在补充有10％FBS(Gibco)和1％抗生素-抗真菌素(Gibco)的DMEM(Gibco)中培养。成纤维细胞来自12日龄的小鼠的尾部(Varela等，2005)。使用他汀和氨基双膦酸处理的浓度和持续时间如图中的图例所示。在法尼醇和/或香叶基香叶醇存在下在他汀+氨基双膦酸的联合处理过程中，向培养基中加入1mM普伐他汀和1mM唑来膦酸，同时增加法尼醇和/或香叶基香叶醇的浓度。处理开始48小时后测量异常细胞核的百分比。
免疫细胞化学
在LabTek室(LabTekchamber，NalgenNuncInternational)中培养成纤维细胞，将其在PBS中洗涤，然后在4％的多聚甲醛中固定15分钟。将细胞在浓度递增的乙醇浴中脱水，并于25℃在含有TritonX-100(0.5％)、5％血清(山羊或兔)的PBS中放置5分钟使其具有渗透性。将载玻片于25℃在PBS中预孵育5分钟。
对于山羊多克隆抗前核纤层蛋白A抗体(Sc-6214，SantaCruzBiotechnologies)而言一抗稀释至1/100，对于抗核纤层蛋白A/C抗体(G.Morris提供的4A7)而言一抗稀释至1/40，对于兔抗钙网蛋白抗体(Stressgen)而言一抗稀释至1/200，并且对于抗核纤层蛋白B1抗体(Abcam)而言一抗稀释至1/100。在PBS中洗涤后，将载玻片于25℃以在孵育液中稀释的二抗孵育1小时。二抗的稀释如下：对于与FITC偶联的驴抗小鼠的IgG(JacksonImmunoResearch)为1/100，对于与Alexa488偶联的驴抗山羊的IgG为1/400，对于与Alexa568偶联的驴抗山羊的IgG(MolecularProbes)为1/800，并且对于与四甲基罗丹明异硫氰酸酯偶联的驴抗兔的IgG(Sigma)为1/100。然后洗涤细胞，使用DAPI(100ng/ml，Sigma-Aldrich)在25℃对细胞核染色15分钟，最后使用含有0.5％Tween20的PBS洗涤3次。将载玻片安装在Vectashield(Vector)中。使用配备有CoolSnap照相机的LeicaDMR显微镜或LeicaTCSSP5共聚焦显微镜记录数字图像。标记核纤层蛋白A/C后观察在细胞中的细胞核。对于各处理，在对照组成纤维细胞中分析了超过100个细胞核。分析的罹患早衰症的患者的细胞的细胞核的数目为250(传8代)、198(传13代)和150(传20代)。
H2AX磷酸化组蛋白的X光照射和研究
使用PhilipsX设备照射早衰症患者的细胞和1BR3对照组细胞。使用直径为0.1mm的铜滤波器，通过在20mA的强度下经受200kV电压的钨阳极来产生X射线。剂量率为1.243Gy/min。使用稀释为1/800的特异性地识别磷酸化丝氨酸139(UpstateBiotechnology-Euromedex，Mundolsheim，法国)的抗体和与FITC共轭的抗小鼠抗体(1/100，Sigma-Aldrich)来检测H2AX磷酸化组蛋白。利用式Nt＝N0(1/1+βt)α来调整修复期间双链断裂(DSB)的数量，其中α和β是可调整的参数并且Nt和N0是时间t和时间0时的DSB数量。
Western印记
在蛋白酶抑制剂(完全抑制剂混合物，Roche)和磷酸酶抑制剂(磷酸酶抑制剂混合物I和II，Sigma)的存在下将细胞于以下介质中均质化：50mMTris(pH7.4)、150mMNaCl、1％NP-40、50mMNaF、1mM二硫苏糖醇、2mg/ml胃酶抑素A。电泳后，使用TBS-T缓冲液(20mMTrispH7.4、150mMNaCl和0.05％Tween-20)将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，以5％脱脂奶粉封闭，并使用特异性抗核纤层蛋白A/C抗体(4A7，1/500)或者特异性抗核纤层蛋白A抗体(C20，SantaCruzBiotechnology，1/250)或抗β-肌动蛋白抗体(A5441，Sigma，1/5000)孵育1小时。将抗体在含有3％的脱脂奶粉的TBS-T中稀释。然后含有1.5％脱脂奶粉的TBS-T中使用与过氧化物酶偶联的抗体(山羊抗小鼠或抗兔，JacksonImmunoResearch)孵育印迹，并且洗涤，最终通过化学发光(ImmobilonWestern化学发光HRP底物，Millipore–商标)来显示。
质谱分析
对照组和Zmpste24-/-小鼠的成纤维细胞和早衰症患者的细胞类淋巴母细胞已经被均质化，如Blobel和Potter，V.R.(Nucleifromratliver:isolationmethodthatcombinespuritywithhighyield,Science154，1662-1665，1966)所述通过超速离心分离细胞核并获得核蛋白。通过SDS-PAGE电泳分离核纤层的蛋白，并切下含有核纤层蛋白A、前核纤层蛋白A和早衰蛋白的条带。将凝胶的片段用180ml碳酸氢铵/乙腈混合物(70/30，25mM)洗涤两次、干燥(15分钟，90℃)并在碳酸氢铵(25mM)中使用胰蛋白酶(12ng/ml，Promega)消化(1小时，60℃)。在典型的实验中，将1mlCHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸，Waters)放置在MALDI-ToF光谱仪中。干燥后，将1ml肽溶液和1ml基质(CHCA)放置在配备有激光源的光谱仪(Voyager-DESTR(商标)，AppliedBiosystems)中。使用200次激光点火收集的数据形成可用DataExplorer程序(版本4.0.0.0，AppliedBiosystems)分析的光谱。
实时定量PCR
使用装置ABIPRISM7900HT序列检测系统(AppliedBiosystems)测量了p53的靶基因(Atf3，Gadd45g和Cdkn1a，其编码p21)的表达率。
统计分析
在学生检验过程中分析了不同的小鼠组和细胞(处理或未处理的)之间的差异。利用程序MicrosoftExcel进行计算。数据表达为平均数±平均数的标准误差。
结果
在指定浓度的法尼基转移酶抑制剂(FTI-277，Sigma-Aldrich)和/或I型香叶基香叶基转移酶(GGTI-2147)存在下，培养HeLa细胞。相对于单独使用各抑制剂的效果，只有两种抑制剂的联合才能充分在细胞中形成未异戊二烯化的前核纤层蛋白A。
这些结果如图10中所示，图10是得到的Western印记的照片，该照片显示了经法尼基转移酶抑制剂和/或I型香叶基-香叶基转移酶处理的HeLa细胞中核纤层蛋白A/C的检测。LA＝核纤层蛋白A，LC＝核纤层蛋白C，Pre＝前核纤层蛋白A。
这些结果确认，根据本发明，前核纤层蛋白A的异戊二烯化的阻断需要同时抑制法尼基转移酶和I型香叶基-香叶基转移酶。
法尼基转移酶(FTI)抑制剂诱发了早衰蛋白(在罹患早衰症的患者的细胞中)和Zmpste24-/-小鼠成纤维细胞中的补偿性异戊二烯化。
质谱分析表明，如预期那样，胰蛋白酶水解的法尼基化和羧甲基化的肽存在于Zmpste24小鼠细胞中，而不存在于对照组小鼠细胞中。这些结果如图13a中所示。法尼基化肽不具有3个SIM残基，这表明在前核纤层蛋白A的熟化过程中Zmpste24对于第一次切割而言并非必不可少的。在FTI处理的小鼠细胞中，观察到法尼基化前核纤层蛋白A数量的减少。在香叶基-香叶基化肽的图谱部分的观察中，在未处理的Zmpste24-/-小鼠细胞中不存在可检测到的源于前核纤层蛋白A的肽。但是，在FTI处理后检测到了质量与前核纤层蛋白A的香叶基-香叶基化片段一致的肽。这些结果如图13b中所示。
在早衰症患者的细胞中，未作任何处理，检测到法尼基化和羧甲基化早衰蛋白所对应的那些肽，如图11a中所示。FTI-127对细胞的处理促进了质量对应于早衰蛋白的香叶基-香叶基肽的质量的肽的出现，如图11b所示。
这些数据整体显示了早衰蛋白和前核纤层蛋白A在FTI的作用下以替代性方式被香叶基香叶基化，并提供了FTI处理在类早衰综合征的鼠模型中的低效能的解释。
将早衰症患者的细胞和Zmpste24-/-小鼠用于评价旨在防止前核纤层蛋白A和早衰蛋白的交叉异戊二烯化的治疗策略。我们确立了以下假说：药物可以抑制核纤层蛋白A的异常变体的法尼基化，所述药物对于法尼基焦磷酸酯、法尼基转移酶底物和香叶基-香叶基焦磷酸酯前体、I型香叶基香叶基转移酶的底物的生物合成途径具有影响。因此，我们测试了他汀和氨基双膦酸这两种药物的效果，已知它们可以在此代谢途径的两个步骤影响早衰症患者的细胞。质谱分析显示，普伐他汀(他汀)和唑来膦酸(氨基双膦酸)的联合刺激了对应于早衰蛋白的C末端未异戊二烯化的肽的出现，所述肽在FTI处理的细胞中不能检测到；同时也未检测到法尼基化肽或香叶基-香叶基化肽，如图11c所示。他汀+氨基双膦酸治疗抑制了早衰蛋白的异戊二烯化。对于前核纤层蛋白A，也观察到了同样的情况，如图12所示。其未异戊二烯化的C端肽在使用他汀和氨基双膦酸处理的细胞中被检测到，而在未处理的细胞中则没有；其中检测到了法尼基化和羧甲基化的肽。最后，普伐他汀+唑来膦酸处理不以香叶基香叶基化前核纤层蛋白A为特征，这与使用FTI的情况不同。
图13的说明：核纤层蛋白A(对照组细胞)和前核纤层蛋白A(Zmpste-/-小鼠细胞)已经通过质谱分析(MALDI-ToF)分析。a，b：对应于法尼基化胰蛋白酶水解肽(a)和香叶基香叶基化肽(b)的图谱部分。各峰均标记有核纤层蛋白A或前核纤层蛋白A的胰蛋白酶消化产生的肽的理论质量(在括号内)。残基的数量以蓝色显示。肽的序列及其质量以红色显示。Farn＝法尼基处理的；CM＝羧甲基处理的；Ger＝香叶基-香叶基处理的。
图11的说明：由未处理的细胞的核膜(a)、使用FTI(2.5μM，b)处理的或使用普伐他汀+唑来膦酸混合物(各1μM，c)处理的早衰症患者的细胞的核被膜中提取的蛋白的质谱分析。对应于未修饰的蛋白、法尼基化蛋白和香叶基香叶基化蛋白的图谱部分显示在图的上部、中部和下部。各峰对应于早衰蛋白的胰蛋白酶水解肽，并且标记有实验中测得的单一同位素质量和理论质量(在括号内)。氨基酸残基的数量以蓝色标示。肽的序列及其质量以红色标示。
早衰蛋白在未受影响的细胞(a，中央画面)中主要被法尼基化(F)和羧甲基化(Cm)；而在FTI作用下，该峰显著降低，并且早衰蛋白现实被香叶基香叶基化和磷酰基(b，下方画面)。使用普伐他汀和唑来膦酸处理后，未修饰的早衰蛋白为主要形式。
图12的说明：从源于Zmpste24-/-小鼠的未处理的成纤维细胞(a)或使用普伐他汀+唑来膦酸混合物(各1μM，b)处理的成纤维细胞的核被膜提取的蛋白质的质谱分析。对应于未修饰的蛋白、法尼基化蛋白和香叶基香叶基化蛋白的图谱部分显示在图的上部、中部和下部。各峰对应于早衰蛋白的胰蛋白酶水解肽，并且标记有实验测得的单一同位素质量和理论质量(在括号内)。氨基酸残基的数量以蓝色标示。肽的序列及其质量以红色标示。
在此图中可以看到，在未处理的细胞中前核纤层蛋白A主要被法尼基化(F)和羧甲基化(Cm)(a，中央画面)，而未检测到未修饰的或香叶基香叶基化的形式。使用普伐他汀和唑来膦酸处理之后，不再能检测到异戊二烯化的肽，前核纤层A的未修饰形式占据了主导地位(b，上方画面)。
使用普伐他汀+唑来膦酸处理纠正了早衰症患者细胞和培养中的Zmpste24-/-小鼠细胞的核异常；并且部分地恢复了X射线引发的DNA损伤的修复机制(图14、15、16和17)。
普伐他汀+唑来膦酸处理导致前核纤层蛋白A出现在对照组细胞的细胞核中(图14a)，如在早衰症患者细胞的细胞核中那样，但是显著改善了早衰症患者细胞的核形态(图14b)。定量分析显示，随着传代次数的增加，早衰症患者的细胞中的核异常增加；该异常的数量在普伐他汀+唑来膦酸治疗的作用下降低(图14c)。在共聚焦显微镜下观察时，早衰症患者的细胞含有核纤层蛋白A/C的聚集体和核被膜的核质表面向核质(核网)中的深入内陷，其由抗钙网蛋白所标记(图15Aa～f)。这些核纤层蛋白A/C聚集体不存在于对照组对象的细胞中(图15Aj～l)，并在普伐他汀+唑来膦酸处理的作用下从早衰症患者的细胞中消失(图15Ag～i)。作为核纤层的法尼基化组分的核纤层蛋白B1的定位在所述处理的作用下被改变，这确证了处理能够阻断核纤层蛋白的异戊二烯化。
通过使用法尼醇和/或香叶基香叶醇孵育细胞，我们验证了，因普伐他汀+唑来膦酸治疗而带来的细胞核形状的改善确实与早衰蛋白的异戊二烯化这一事实相关。对细胞补充法尼醇和香叶基香叶醇使得细胞即使在普伐他汀和唑来膦酸存在时也能合成法尼基焦磷酸酯和香叶基香叶基焦磷酸酯，由此对早衰蛋白异戊二烯化(图14d)。法尼醇消除了普伐他汀+唑来膦酸治疗的效果，这为通过抑制法尼基焦磷酸酯合成可以产生治疗作用提供了进一步的证明。应该注意，香叶基香叶醇也阻断治疗的作用，这证明早衰蛋白的香叶基香叶基化形式对于细胞也具有毒性(图14d)。在Zmpste24-/-细胞中观察到了同样的效果(图16a)，这表明，关于早衰蛋白的数据可以延伸至前核纤层蛋白A(积聚在Zmpste24-/-细胞中的蛋白)。法尼醇和香叶基香叶醇对于对照组成纤维细胞都不具任何效果，这排除了这些分子产生假相的可能性(图16b)。
最后，普伐他汀+唑来膦酸处理引起磷酸化组蛋白H2AX焦点数量的减少；这些焦点与未修复的DNA双链断裂数量直接相关(图17)。
总之，收集的体外数据显示，普伐他汀+唑来膦酸组合部分地抑制了法尼基化和香叶基香叶基化，并在Zmpste24-/-细胞和早衰症患者中导致了预期的未异戊二烯化的前核纤层蛋白A和早衰蛋白在核纤层内的定位改变和在核质中的重新分布。同样地，核纤层中法尼基化早衰蛋白量的减少及其向核质的重定位解释了治疗对于早衰症患者细胞的有益效果。
图14的说明：普伐他汀+唑来膦酸组合对于前核纤层蛋白A在早衰症患者的对照细胞中的积聚的协同效应。
(a)在正常、未处理的人类成纤维细胞和随后被单独或组合使用的普伐他汀(60μM，12小时)和/或唑来膦酸(60μM，12小时)所处理的人类成纤维细胞中，核纤层蛋白A/C和前核纤层蛋白A的免疫细胞化学检测。(b)在正常人类成纤维细胞和来自使用普伐他汀+唑来膦酸(各1μM)组合处理24小时的早衰症患者的成纤维细胞中，核纤层蛋白A/C和前核纤层蛋白A的免疫细胞化学检测。(c)普伐他汀+唑来膦酸处理(各1μM)对于早衰症患者细胞的核形态的效果的定量分析。处理和未处理的细胞在第8代(p8)、第13代(p13)和第20代(p20)以抗核纤层蛋白A/C抗体进行免疫标记。白色箭头显示异常的核。(d)在法尼醇、香叶基香叶醇存在下或这两种化合物同时存在下，普伐他汀+唑来膦酸处理(各1μM)对于早衰症患者细胞的核形态的效果的定量分析。误差线＝平均值±平均值的标准误差。标度条＝10μm。
图15的说明：在早衰症患者细胞中，普伐他汀+唑来膦酸处理纠正核形态，并导致核纤层蛋白A/C和核纤层蛋白B1异构体由核纤层部分地重定位至核质中。
(A)核纤层蛋白A/C和钙网蛋白在这些早衰细胞(无论处理或未处理)中的共同定位。利用免疫荧光和共聚焦显微术(LeicaTCSSP5，2048x2048像素图像的3D叠加，间隔0.2μm，平均3行，累积3个图像，1.7x缩放)的检查。各画面中的图像a～c是叠加的27个图像的平均强度投影，显示了PBS孵育的早衰细胞中钙网蛋白所标记的核网的细管。图像d至l：以0.2μm的厚度分隔的共聚焦截面。普伐他汀+唑来膦酸处理纠正早衰细胞核的形态，减少核网的细管的数量(g)并降低核纤层的厚度(h)。
(B)核纤层蛋白B1和钙网蛋白的共同定位。普伐他汀+唑来膦酸处理提高核纤层蛋白B1核质标记信号，这表明该蛋白的法尼基化得到部分抑制。标度条＝5μm。
图16的说明：法尼基焦磷酸酯和香叶基香叶基焦磷酸酯前体消除了普伐他汀+唑来膦酸治疗在培养的Zmpste24-/-小鼠细胞中的效果。
在法尼醇、香叶基香叶醇存在下或这两种分子同时存在下，单独或组合使用的普伐他汀(1μM)和唑来膦酸(1μM)对于培养的Zmpste24-/-小鼠细胞(a)和对照组小鼠细胞(b)的核形态的效果的量化。
单独或组合使用法尼醇、香叶基香叶醇消除了普伐他汀+唑来膦酸处理对Zmpste24-/-细胞的核形态的效果。
图17的说明：普伐他汀+唑来膦酸处理部分纠正早衰症患者细胞中DNA双链断裂(DSB)修复的异常。
使用普伐他汀+唑来膦酸混合物(各1μM)或使用PBS孵育对照组成纤维蛋白和来自早衰症患者的成纤维蛋白，并使用X射线(2Gy)照射。照射24小时后进行的磷酸化组蛋白H2AX焦点的免疫检测，其中焦点对应于未修复的双链断裂(上方图像)。DAPI标记的细胞核(下方图像)。
底部线图：照射后，在使用PBS孵育的或使用普伐他汀+唑来膦酸处理的对照组细胞(实心方块)和老化细胞(空心圆圈)中磷酸化组蛋白H2AX焦点的数量随时间的变化。各曲线显示了至少3次实验的平均值±平均值的标准误差。
联用普伐他汀+唑来膦酸处理改善Zmpste24-/-小鼠的类早衰表型(图18、19和20)：
以前文已显示对小鼠无毒的剂量，按日用普伐他汀和唑来膦酸或两种药物的组合，处理Zmpste24-/-小鼠和对照组小鼠。如对于早衰症患者的细胞已经观察到的那样，分开使用时，这两种药物中的任一种，即普伐他汀或唑来膦酸，都不能提高Zmpste24-/-小鼠的寿命(图19)。但是，两种药物的组合却显著改善了Zmpste24-/-小鼠的类早衰表型：所述处理导致改善的体重增加、增加了皮下脂肪量、缩小了脊柱后凸和脱毛的程度并延长了寿命。存活时间由101天增加至179天，并且最大存活时间由151天增加至222天日(P<0.001，图18c)。应该注意，小鼠的通过处理所纠正的所有表型征候也是人类早衰症的特征。联合处理纠正了作为Zmpste24-/-小鼠和早衰症或相关类早衰综合征患者的特征之一的骨密度降低。骨计算机显微断层成像显示了被处理的小鼠的骨矿化的提高和胫骨外层厚度的增加(图18d)。类似地，Zmpste24+/+、Zmpste24-/-和处理的Zmpste24-/-小鼠的肝中核形态的量化显示，普伐他汀+唑来膦酸处理使Zmpste24-/-细胞核的形状正常化(图18e)。所述处理还纠正了对于Zmpste24-/-小鼠曾描述过的p53蛋白的靶基因转录的提高(Varela等，2005(54bis))(图18f)。最后，我们来看所述处理是否对不能积聚前核纤层蛋白A的Lmna-/-小鼠具有效果。普伐他汀+唑来膦酸处理对于这些小鼠的寿命没有效果(图20)，这进一步证明此处理只能对在核被膜中积聚法尼基化前核纤层蛋白A的小鼠起作用。
图18的说明：普伐他汀+唑来膦酸处理改善Zmpste24-/-小鼠的类早衰表型
(a)显示3月龄的Zmpste24+/+小鼠、Zmpste24-/-小鼠和使用普伐他汀(100mg/kg/日)和唑来膦酸(100mg/kg/日)的组合处理的Zmpste24-/-小鼠的照片。标度条＝1cm。(b)3月龄的Zmpste24+/+(n＝12)、Zmpste24-/-(n＝13)和经处理的Zmpste24-/-(n＝15)小鼠的体重。(c)显示与未处理的小鼠(n＝13)相比，经处理的Zmpste24-/-(n＝15)小鼠的寿命显著延长的Kaplan-Meier曲线。(d)处理和未处理的Zmpste24-/-小鼠的胫骨的3D计算机显微断层成像表示(上方图像)。下方画面显示了未处理的(n＝6)和处理的(n＝5)Zmpste24-/-小鼠的相对骨体积(骨组织体积/胫骨体积)和骨小梁数。(e)Zmpste24+/+、Zmpste24-/-和经处理的Zmpste24-/-小鼠的肝细胞的核异常的量化。白色箭头指向异常的核。标度条＝10μm。(f)通过定量RT-PCR分析获得的Zmpste24+/+、Zmpste24-/-和经处理的Zmpste24-/-小鼠的肝和心中的p53的靶基因的相对表达。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。误差线表示平均值±平均值的标准误差。
图示19的说明：单独使用普伐他汀或单独使用唑来膦酸都不能延长Zmpste24-/-小鼠的寿命：
Kaplan-Meier曲线显示，单独使用普伐他汀(n＝5)(a)和单独使用唑来膦酸(n＝5)(b)不能纠正经处理的(空心菱形)和未处理的(实心圆圈，n＝11)Zmpste24-/-小鼠的寿命。
图20的说明：普伐他汀+唑来膦酸处理未纠正Lmna-/-小鼠的寿命：
Kaplan-Meier曲线显示了使用普伐他汀+唑来膦酸处理的Lmna-/-小鼠(n＝12，空心菱形)的寿命与未处理的小鼠(实心圆圈，n＝11)相当。普伐他汀+唑来膦酸处理对于不具核纤层蛋白A/C的小鼠没有效果。
归纳/结论/展望
几种人类类早衰综合征(包括郝-吉早衰症)由缺失的前核纤层蛋白A(早衰蛋白)或不缺失的前核纤层蛋白A的法尼基化形式在核被膜上的积聚而引起。生理老化过程中也产生早衰蛋白。近来，对罹患早衰症的患者的细胞进行的研究已经显示，法尼基转移酶抑制剂(FTI)可改善核形态，表明这些抑制剂可以代表对这些破坏性综合征的一种治疗。
本发明人在本说明书中表明，当法尼基转移酶被抑制时，前核纤层蛋白A和早衰蛋白通过香叶基-香叶基转移酶进行替代性的异戊二烯化，这可以解释FTI在改善这些类早衰综合征的鼠模型的表型方面的低效能程度。
本发明人还表明，他汀与氨基双膦酸的联合可以有效抑制前核纤层蛋白A和早衰蛋白的法尼基化和香叶基-香叶基化，显著改善小鼠衰老的表型，所述小鼠中编码参与前核纤层蛋白A熟化的金属蛋白酶Zmpste24的基因已被失活。表型的改善包括生长曲线、体重、脂肪代谢障碍、脱发和骨异常。
另外，这些小鼠的寿命也得到了显著延长。
这些数据开创了一种新型的治疗其中异戊二烯化蛋白在核被膜中积聚的人类类早衰综合征的疗法。
在未来三年中，在马赛普伐他汀+氨基双膦酸治疗将由NicolasLévy负责在Europeantherapeutictest(15位儿童)框架下对应用于罹患早衰症的儿童，该项目由卫生部(PHRC2008)和法国抗肌病协会(FrenchAssociationagainstMyopathies，AFM)资助，并已获得AFSSAPS和SouthMediterraneanCCP的授权。
同样的治疗很快也将在GiuseppeNovelli负责下在罗马向罹患上腭发育不良的患者提供，上腭发育不良是法尼基化前核纤层蛋白A积聚的另一种类早衰综合征。
参考文献列表
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Claims (22)

1.一种组合物，所述组合物包含：
-至少一种羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂或一种其生理上可接受的盐，所述至少一种羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂为他汀类的分子；
-至少一种法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂或一种其生理上可接受的盐，所述至少一种法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂为氨基双膦酸(NBP)类的分子；和
-至少一种抗HIV剂，所述至少一种抗HIV剂为蛋白酶抑制剂或逆转录酶抑制剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述HMG-CoA还原酶抑制剂为水溶性他汀。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中，所述HMG-CoA还原酶抑制剂选自包括阿托伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、利伐他汀、美伐他汀(或康百汀)、氟朵他汀、伟络他汀、氟伐他汀、达伐他汀、西伐他汀、喷妥司汀、瑞舒伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀或其生理上可接受的盐的组。
4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述氨基双膦酸能够选自：
-阿仑膦酸或其离子形式阿伦膦酸根；
-氯膦酸或其离子形式氯膦酸根；
-羟乙磷酸或其离子形式羟乙磷酸根；
-伊班膦酸或其离子形式伊班膦酸根；
-亚甲磷酸或其离子形式亚甲磷酸根；
-奈立膦酸或其离子形式奈立膦酸根；
-奥帕膦酸或其离子形式奥帕膦酸根；
-帕米膦酸或其离子形式帕米膦酸根；
-利塞膦酸或其离子形式利塞膦酸根；
-替鲁膦酸或其离子形式替鲁膦酸根；
-唑来膦酸或其离子形式唑来膦酸根；
-4-N,N-二甲基氨基甲烷双膦酸或其离子形式二甲基氨基甲烷双膦酸根；
-α-氨基-(4-羟基苯亚甲基)双膦酸。
5.如权利要求1-2和4中任一项所述的组合物，其中，所述法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂为唑来膦酸或其离子形式唑来膦酸根。
6.如权利要求3所述的组合物，其中，所述法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂为唑来膦酸或其离子形式唑来膦酸根。
7.如权利要求1-2、4和6中任一项所述的组合物，其中，所述抗HIV剂为选自包括夫沙那韦、洛匹那韦、利托那韦、安普那韦、阿扎那韦和茚地那韦的组的蛋白酶抑制剂。
8.如权利要求3所述的组合物，其中，所述抗HIV剂为选自包括夫沙那韦、洛匹那韦、利托那韦、安普那韦、阿扎那韦和茚地那韦的组的蛋白酶抑制剂。
9.如权利要求5所述的组合物，其中，所述抗HIV剂为选自包括夫沙那韦、洛匹那韦、利托那韦、安普那韦、阿扎那韦和茚地那韦的组的蛋白酶抑制剂。
10.如权利要求1-2、4和6中任一项所述的组合物，其中，所述抗HIV剂为选自包括齐多夫定、拉米夫定、去羟肌苷和阿巴卡韦的组的逆转录酶抑制剂。
11.如权利要求3所述的组合物，其中，所述抗HIV剂为选自包括齐多夫定、拉米夫定、去羟肌苷和阿巴卡韦的组的逆转录酶抑制剂。
12.如权利要求5所述的组合物，其中，所述抗HIV剂为选自包括齐多夫定、拉米夫定、去羟肌苷和阿巴卡韦的组的逆转录酶抑制剂。
13.权利要求1-12中任一项所述的组合物在制备用于治疗HIV感染者的药物中的用途，其中所述药物被施用至所述HIV感染者。
14.如权利要求13所述的用途，其中，所述施用口服或注射进行。
15.包含至少一种羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂和至少一种法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的混合物在制备用于治疗由抗HIV治疗在患者中引起的过早衰老的副作用的药物中的用途，其中所述药物被施用至所述患者，并且其中所述至少一种羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂为他汀类的分子或一种其生理上可接受的盐，所述至少一种法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂为氨基双膦酸(NBP)类的分子或一种其生理上可接受的盐，并且所述抗-HIV治疗经由蛋白酶抑制剂或逆转录酶抑制剂。
16.如权利要求15所述的用途，其中，所述HMG-CoA还原酶抑制剂为水溶性他汀。
17.如权利要求15所述的用途，其中，所述HMG-CoA还原酶抑制剂选自包括阿托伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、利伐他汀、美伐他汀(或康百汀)、氟朵他汀、伟络他汀、氟伐他汀、达伐他汀、西伐他汀、喷妥司汀、瑞舒伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀和其生理上可接受的盐的组。
18.如权利要求15所述的用途，其中，所述氨基双膦酸能够选自：
-阿仑膦酸或其离子形式阿伦膦酸根；
-氯膦酸或其离子形式氯膦酸根；
-羟乙磷酸或其离子形式羟乙磷酸根；
-伊班膦酸或其离子形式伊班膦酸根；
-亚甲磷酸或其离子形式亚甲磷酸根；
-奈立膦酸或其离子形式奈立膦酸根；
-奥帕膦酸或其离子形式奥帕膦酸根；
-帕米膦酸或其离子形式帕米膦酸根；
-利塞膦酸或其离子形式利塞膦酸根；
-替鲁膦酸或其离子形式替鲁膦酸根；
-唑来膦酸或其离子形式唑来膦酸根；
-4-N,N-二甲基氨基甲烷双膦酸或其离子形式二甲基氨基甲烷双膦酸根；
-α-氨基-(4-羟基苯亚甲基)双膦酸。
19.如权利要求15-17中任一项所述的用途，其中，所述法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂为唑来膦酸或其离子形式唑来膦酸根。
20.如权利要求15所述的用途，其中，所述施用以下述剂量进行：所述羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂的剂量为0.01mg/kg体重～2mg/kg体重，并且所述法尼基焦磷酸酯合酶抑制剂的剂量为0.01mg/kg体重～40mg/kg体重。
21.如权利要求15-18和20中任一项所述的用途，其中，所述施用通过口服或注射进行。
22.如权利要求19所述的用途，其中，所述施用通过口服或注射进行。
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