PT2234620E - Terapia tripla usada para o tratamento dum paciente infetado por hiv - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

TERAPIA TRIPLA USADA PARA O TRATAMENTO DUM PACIENTE

INFETADO POR HIV

Pedidos relacionados 0 presente pedido refere-se ao pedido de Patente Francesa n° FR 08/50019, pedida em 3 de janeiro de 2008. Refere-se, também, ao Pedido de Patente Francesa n° FR 06/06097, pedida em 5 de julho de 2006 e ao seu pedido PCT correspondente, pedido em 5 de julho de 2007, intitulada "Médicament destiné au traitement des maladies avec persistance e/ou accumulation de protéines prénylées".

Descrição Domínio técnico A invenção refere-se a uma composição que compreende: pelo menos, um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) , ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, sendo o referido inibidor uma molécula da familia das estatinas ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis - pelo menos, um inibidor da sintase de farnesil-pirofosfato ou um seu sal fisiologicamente aceitável, sendo o referido inibidor uma molécula da família dos aminobifosfonatos (NBP) ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, e - pelo menos, um agente anti-HIV, sendo o referido agente anti-HIV um inibidor da protéase ou um inibidor da transcriptase reversa. A presente invenção encontra aplicação no tratamento de efeitos secundários gerados por um agente anti-HIV, por exemplo, envelhecimento prematuro, lipodistrofia, que pode ser gerado por inibidores da protéase ou inibidores da transcriptase reversa.

Na descrição que se segue, as referências entre parênteses (x) referem-se à lista de referências no final dos exemplos. As referências entre parênteses com o nome do autor e a data também se referem a esta lista de referências. Técnica anterior 0 núcleo da célula eucariótica é delimitado por uma dupla membrana perfurada com poros, o envelope nuclear, que controla a troca molecular entre compartimentos nucleares e citoplasmáticos. Este envelope isola, parcialmente, o conteúdo do núcleo, isto é, o material genético e toda a maquinaria enzimática necessária para a realização do genoma nuclear. 0 envelope nuclear é constituído por duas membranas concêntricas, a membrana exterior, em continuidade com o reticulo endoplasmático, e a membrana interna. Esta última é revestida na sua face interna por uma rede fibrilar densa chamada lâmina nuclear. É uma rede de proteínas que consiste essencialmente em polímeros lâminados e proteínas associadas. Nos vertebrados, existem duas subclasses de lâminas: lâmina do tipo A (lâmina A e C) e do tipo B (lâmina Bl, B2 e B3) que contribuem para o desenvolvimento da Lâmina. Esta última é mantida no lugar por associação com outras proteínas, ligadas à membrana interna do envelope nuclear (para revisão, Gruenbaum et al., 2005 (19)).

As lâminas são proteínas semelhantes a filamentos que pertencem à família dos filamentos intermediários (tipo V) que têm uma estrutura comum: um segmento globular curto do terminal N (cabeça) separado de um outro segmento globular do terminal C (cauda) por um domínio central longo que compreende uma série de hélices alfa (domínio haste). A cauda globular contém, em particular, um sinal de localização nuclear (NLS) para abordar o núcleo após a sintese. 0 dominio central permite a combinação de duas moléculas de lâmina paralelas e a sua organização em filamentos por associação dos dimeros "cabeça-cauda". Esta estrutura dá-lhes propriedades mecânicas muito resistentes.

Apenas a lâmina A e a lâmina B sofrem maturação após a sintese de um precursor (para revisão, Gruenbaum et al., 2000 (20)). A lâmina C é sintetizada diretamente na sua forma madura. O precursor da lâmina A e da lâmina B acaba com um motivo CAAX caracteristico (C é uma cisteina, a é um aminoácido alifático de cadeia não carregado e X qualquer aminoácido, aqui uma metionina, para avaliação, Levy & Cau 2003 (29)). O motivo CAAX do terminal C permite a ligação de um ácido gordo (geralmente um ácido gordo C15, farnesil) por uma transferase de farnesil. Este prenilação (o motivo farnesil é derivado a partir de uma base de unidade alifática em C5 chamado isopreno) permite às pré-laminas serem inseridas na membrana do reticulo endoplasmático após a sintese no citosol. Foram submetidas à ação de uma endoprotéase própria inserida no retículo da membrana do envelope e cujo centro ativo é citosólico. A endoprotéase especifica da pré-lâmina a é Facel (ou ZMPSTE24, zinco-metalo protéase homóloga de STE24 de levedura), enquanto a Face2 (ou Reel, enzima conversora ras) é especifica para as pré-lâminas B. Estas enzimas catalisam a hidrólise da ligação peptidica entre a cisteina e o aminoácido seguinte (alifático), encurtando as pré-lâminas de 3 aminoácidos. 0 terminal carboxilo da cisteina farnesilada é, em seguida, reconhecido por uma transferase isoprenilcisteína-carboximetil (ICMT) que vem fixar um grupo metilo por esterificação.

Apenas a maturação da pré-lâmina A continua com uma segunda clivagem endoproteolítica por Facel, que liberta um péptido de farnesil de 15 aminoácidos e a lâmina A madura. Esta lâmina A, que não inclui o ácido gordo, torna-se solúvel, é importada para o núcleo através do sinal de localização nuclear, e localiza na própria lâmina nuclear, bem como no resto do compartimento nuclear, constituindo um esqueleto nuclear genuino (Gruenbaum et al., 2005 (19)). A lâmina B madura, no entanto, ainda tem, no teriminal C, a sua a cisteína farnesilada e metilesterifiçada. Resta, portanto, inserida na membrana do envelope do retículo e, em seguida, para a face nucleoplásmica do envelope nuclear, daí a sua localização exclusiva na lâmina nuclear com a membrana interna do envelope nuclear, onde está ancorada. 0 termo prenilação significa a fixação num grupo tiol de uma cisteína, seja duma cadeia de farnesilo de 15 átomos de carbono, que é chamada de farnesilação ou uma cadeia de geranil-geranilo de 20 átomos de carbono, que é chamada de geranil-geranilação (Reid et al., 2004 (39)), ou outros derivados de isopreno. A farnesilação, catalisada pela transferase de farnesil (Ftase), que reconhece a sequência de consenso do terminal C (CAAX) fixa, preferencialmente, um grupo farnesilo no resíduo de cisteína do motivo. O geranil-geranilação é a fixação por transferase de geranil-geranilo (GGTase) de um grupo de geranil-geranilo ao resíduo de cisteína do motivo.

Estes ácidos gordos são gerados pela via biossintética, que, a partir da hidroximetil-glutaril-coenzima A, é utilizada pelas células para fabricar, nomeadamente, o colesterol, esteroides, heme na hemoglobina e ubiquinonas (Hampton & al., 1996 (20)). A família das proteínas preniladas tem cerca de 300 membros no genoma humano, a maioria dos quais é identificável pelo motivo do terminal C CAAX (Reid et al., 2004 (39)) . As proteínas das famílias Ras, Rho, Rab (Leung et al., 2006 (28)), certas proteínas que asseguram uma função de importação para a mitocôndria (HDJ2), certas proteínas mitóticas (CENPE, CENPF) são, geralmente, preniladas (Winter-Vann & Casey 2005 (51) ) . Em geral, se no motivoo CAAX, X é uma serina, metionina, cisteína, alanina ou glutamato, o isoprenóide, preferencialmente, enxertado é farnesil. Se X é uma leucina, o reconhecimento do motivo Caal é, preferencialmente, realizado por GGTase, que catalisa a transferência de um grupo geranil-geranilo (Basso et al., 2006 (1)). É provável que outros grupos derivados de isopreno possam, também, ser ligados a esta cisteína, embora isso não seja descrita na literatura.

Nos seres humanos, há três genes de lâminas. O gene LMNA, localizado em Iq21.2-q21.3 (Wydner & al., 1996 (52)), determinado por splicing alternativo das lâminas A e C. O gene LMNA é composto por 12 exões. O início do exão 1 codifica a extremidade globular do terminal N comum para as lâminas A e C; o final do exão 1 e até ao início do exão 7 codifica a parte helicoidal central; por fim, os outros exões codificam a extremidade globular do terminal C (Levy & Cau 2003 (29)).

De facto, o gene codifica para 4 produtos de splicing de forma diferente, cujas lâminas C e a pré-lamina A são as 2 principais (Lin & Worman 1993(31)). A produção diferencial das lâminas A e C, é feita através da utilização de um local de splicing alternativo no exão 10 do pré-mensageiro, de modo que a lâmina C é codificada pelos exões 1 a 10 e a lâmina A é codificada pelos exões 1 a 9, os primeiros 90 pares de bases do exão 10, e os exões 11 e 12 (específicos da lâmina A).

Portanto, os péptidos da pré-lâmina A e da lâmina C são idênticos nos primeiros 566 aminoácidos, as extremidades do terminal C das lâminas C e da pré-lâmina A contêm, em seguida, respetivamente, 6 e 98 aminoácidos específicos.

As lâminas do tipo B compreendem três proteínas diferentes (Shelton et al 1981. (43)): as lâminas Bl, B2 (as duas isoformas mais representadas) e B3. 0 gene LMNB1 está localizado em 5q23.3-q31.1 e é composto por 11 exões que codificam a lâmina Bl (Lin & Worman 1995 (30)). O gene LMNB2 está localizado em 19pl3.3 e codifica as lâminas B2 e B3 por um mecanismo de splicing alternativo (Biamonti & al., 1992 (2)).

As lâminas do tipo B são expressas constitutivamente em todas as células a partir das primeiras fases do desenvolvimento, enquanto que as lâminas do tipo A estão, geralmente, ausentes em células estaminais embrionárias (Stewart et al., 1987 (45)) e são expressas em todas as células somáticas diferenciadas. A sua expressão está sujeita a regulamentação por parte do tecido e durante a vida (Duque et al. 2006 (9)). Parece que a sua expressão não é necessário, uma vez que os ratinhos em que foi bloqueada, especificamente, a expressão da lâmina A, mas que, ainda assim, expressam a lâmina C e as outras lâminas, não têm fenótipo aparente (Fong et al. 2006 (14) ) .

As lâminas interagem com um número muito elevado de parceiros proteicos que têm funções muito diversas; estão, portanto, envolvidos num grande número de processos nucleares, incluindo a replicação e reparação do ADN, o controlo da transcrição e do splicing, organização da estrutura da cromatina (para revisão, ver Shumaker et al., 2003 (44), Zastrow et al., 2004 (54), Hutchison et al., 2004 (26),

Gruenbaum et al., 2005 (19)). Alterações na estrutura da lâmina são a causa de muitas doenças genéticas humanas. São devidas a mutações nos genes que codificam as lâminas, ou outras proteínas da lâmina. Agruparam-se estas condições sob o termo genérico de laminopatias (Broers et al., 2006 (5), Mattout et al. 2006 (33)). Recentemente, foram identificadas mutações nos genes de enzimas responsáveis pela maturação das lâminas (Facel, em particular), o que leva as patologias a pertencerem, também, ao grupo das laminopatias (Navarro et al. 2004 (36) e 2005 (35)).

Até à data, a única doença humana associada com mutações dos genes LMNA1 ou 2 é uma leucodistrof ia causada por uma duplicação completa do gene LMNB1 (Padiath et al. 2006 (37)). A dúvida permanece sobre o envolvimento potencial das variações da sequência encontradas em LMNB2 em pacientes de síndrome de Barraquer-Simon (Hegele et al. 2006 (22)) . No entanto, tem sido demonstrado in vitro por experiências de ARNi (ARN de interferência) (& Harborth al., 2001 (21)) e no modelo de ratinho (Vergnes et al., 2004 (50), que as lâminas do tipo B são essenciais para o desenvolvimento e a integridade celular. De facto, a deficiência da lâmina BI provoca letalidade perinatal nos ratinhos. Além disso, os núcleos de fibroblastos embrionários de rato deficientes em LMNB1 mostram alterações notáveis na morfologia nuclear, semelhantes aos observados em doentes com mutações no gene LMNA. além disso, demonstrou-se recentemente que as lâminas B são necessárias para a formação do fuso de divisão durante a mitose, o que tende a demonstrar que o seu papel é dinâmico e múltiplo durante o ciclo celular, e não se restringe apenas à manutenção da arquitetura do núcleo (Tsai et al. 2006 (48)). Neste último papel, um artigo recente demonstra a função estrutural dAS lâminaS B: células artificialmente privadas de lâminas BI têm um núcleo "flutuante" na célula, que roda sobre si mesmo (Liu et al. 2007 (45)). A redundância funcional existente entre as duas lâminas BI e B2 é, provavelmente, também um reflexo direto da sua indispensabilidade, exercendo uma forte pressão de seleção e mascarando o possivel efeito de mutações na sequência dos genes correspondentes.

As alterações funcionais das lâminas A/C, devido a mutações do gene LMNA, são a fonte de, pelo menos, 15 desordens envolvendo uma ampla variedade de patologias num espectro clinico variando de formas leves, que afetam um único tecido isoladamente, as formas sistémicas letais no período perinatal. 0 número de mutações no gene LMNA altera significativamente o conjunto de proteínas na membrana nuclear e afeta o funcionamento. Nas células de vários tecidos, a morfologia dos núcleos é alterada: a presentam, muitas vezes, hérnias que expulsam material genético no citoplasma (Goldman et al, 2004 . (18)) .

As proteínas que estão normalmente associados com o envelope nuclear, as lâminas B, certas proteínas dos poros nucleares e proteínas LAP2 estão ausentes na periferia dessas hérnias.

Estas anomalias morfológicas são seguidas de alterações funcionais, que conduzem eventualmente à morte celular. Entre todas as patologias agrupadas sob o nome de laminopatias, apenas, aquelas relacionadas com a acumulação anormal de uma forma prenilada da proteína estão abrangidas pela presente invenção. São, principalmente, o síndrome de Hutchinson-Gilford ou progeria (De Sandre-Giovannoli & al., 2003 (7), Eriksson et al., 2003 (11)) e a dermopatia restritiva (Navarro et al., 2004 (36)). Nestas 2 síndromes, a causa fisiopatológica é uma acumulação e persistência nas células de pacientes da pré-lâmina farnesilada não amadurecida. A dermopatia restritiva, letal em todo o periodo natal, é caracterizada por sinais clinicos que são todos a consequência de um défice cutâneo, que restringe os movimentos in utero . Esta condição é muito rara. A pele é rigida e tensa, cedendo por espaços, fazendo, por exemplo, rasgos nas axilas ou pescoço. As pestanas, sobrancelhas e a penugem Um hidrâmnio está, muitas vezes, presente, e a diminuição da movimentação fetal é relatada a partir do 6o mês de gravidez. No esqueleto, radiografia revela contraturas em todas as articulações, pés em machado de gelo, clavículas finas, displásicas e bipartidas, costelas em fita, ossos tubulares longos dos braços e desmineralização do crânio. A transmissão da dermopatia restritiva letal é autossómica recessiva.

Mutações no LMNA e ZMPSTE24/Facel foram relatadas para esta patologia (Navarro et al., 2004 (36)). Em 2 casos, o mecanismo fisiopatológico é o mesmo: a pré-lâmina A não pode amadurecer (mutação nula de Facel ou desaparecimento do local da clivagem por mutação da pré-lâmina A) e permanece farnesilada e, assim, inserida na membrana nuclear. A acumulação e a persistência nas células destes precursores anormais, o que, provavelmente, impede a interação normal das lâminas B e C com os seus parceiros, provoca a morte celular e, em breve, do paciente. Foi claramente demonstrado que é a persistência do grupo farnesilo, e não a ausência de lâmina A madura, como se poderia pensar à primeira vista, que é responsável pela toxicidade celular (Fong et al., 2004 (16 )) .

Em Abril de 2003, a partir de uma sobreposição de sintomas comuns para a displasia acromandibular e determinadas doenças resultantes do envelhecimento prematuro, os inventores mostraram que a progeria, a forma mais comum e mais grave do envelhecimento precoce, resulta duma mutação do gene LMNA (de Sandre-Giovannoli & al., 2003 (7)). As crianças com esta doença, também conhecida como sindrome de Hutchinson-Gilford, sofrem de envelhecimento acelerado, até dez vezes mais rápido do que a de um indivíduo normal, e têm uma esperança de vida que não excede 13 anos. Na Europa, uma criança em cerca de seis milhões é afetada. Os sintomas são um envelhecimento da pele, calvície, redução do tamanho da mandíbula e problemas relacionados com a velhice, como a rigidez das articulações e distúrbios cardiovasculares. Estes últimos, tais como enfarte do miocárdio ou aterosclerose, são muitas vezes a causa da morte. A mutação incriminatória, localizada no exão 11 do gene LMNA, ativa um local de splicing críptico pré-ARNm, resultando no ARNm apagado de 150 nucleótidos (Sander-Giovannoli & al., 2003 (7), Eriksson et al., 2003 (11)) . Este mARN excluído é traduzido numa pé-lâmina A anormal, a progerina, que não pode ser amadurecida na lâmina A normal: a ausência de 50 aminoácidos do exão 11 contendo o local de reconhecimento da protéase bloqueia a 2a clivagem da progerina, cujo terminal C preserva o seu grupo farnesilo. Resta, portanto, inserido na face nucleoplásmica do envelope nuclear, que apresenta as alterações características, hérnias do nucleoplasma no citosol e anormalidades na heterocromatina de distribuição periférica (Goldman et al., 2004 (18)). Mais uma vez, é a persistência do grupo farnesilo, além disso, necessária para a fixação da membrana do envelope do retículo no qual estão localizados alguns dos enzimas responsáveis pela maturação (clivagens, metilação) que é responsável pela toxicidade celular da progerina (Fong et al., 2004 (16)).

Estas patologias sistémicas têm a particularidade de estarem associadas com o início precoce de sinais normalmente associados com o envelhecimento. A sua caracteristica fisiopatológica comum é gerar uma lâmina prenilada, com as consequências descritas.

Dois estudos recentes têm demonstrado que a redução da acumulação intranuclear da pré-lâmina arnesilada, truncada ou não, impede, efetivamente, o aparecimento do fenótipo celular. 0 primeiro foi realizado no modelo de ratinho progeróide deficiente em protéase Facel (Pendas & al., 2002 (38)). Quando cruzados com ratinhos que expressam a metade da lâmina A (rato LMNA +/-) , os efeitos da ausência de Facel são diminuídos (Varela & al., 2005 (49)). O segundo estudo mostra que o tratamento de células de pacientes HGPS por morfolino (oligonucleotídeos antisentido) dirigindo o local de splicing críptico abolem o fenótipo mutante (Scaffidi & Misteli 2005 (43)). Vários estudos recentes (ver Scaffidi & Mistelli 2006 (42)), mostram o envolvimento da lâmina A no processo de envelhecimento fisiológico. Em particular, demonstrou-se que durante o envelhecimento fisiológico, a progerina é sintetizada pelas células na ausência de qualquer mutação do gene LMNA devido à utilização de baixo ruído do local de splicing críptico do exão 11. Esta progerina localiza-se na lâmina, na periferia do núcleo das células. O núcleo das células de pacientes idosos "normais" pode apresentar hérnias características duma laminopatia causada por estes eventos de splicing acidental, que resultam em anomalias da função celular e são, provavelmente, pelo menos em parte, responsáveis pelo envelhecimento.

Na pele in vivo, a progerina também é sintetizada por uma subpopulação de fibroblastos e queratinócitos, células dérmicas nas quais se acumula com a idade. A progerina poderia ser um marcador do envelhecimento da pele (McClintock et al., 2007 (34)).

Parece que os mecanismos moleculares idênticos são parcialmente responsáveis por sinais prematuros de envelhecimento nos indivíduos que sofrem de progeria e, em segundo lugar, a um nível muito mais baixo, estão envolvidos no envelhecimento fisiológico de indivíduos não portadores de mutações.

Existem no estado da técnica duas abordagens terapêuticas descritas para melhorar o fenótipo celular causado pela produção patológica da progerina. A primeira dessas soluções é simplesmente evitar o uso pelo spliceosoma deste local de splicing críptico dentro do exão 11, "mascarando-o" por tratamento com um oligonucleótido antessentido (Scaffidi Misteli 2005 (41)), ou com um retrovirus produzindo um siARN (Huang et al., 2005 (25)). Os resultados são promissores in vitro, mas trata-se de terapia "genética" e o desenvolvimento de fármacos em torno desta abordagem é inevitavelmente longo e complicado, com todas as desvantagens ligadas à vectorização dos OAS para conseguir um efeito in vivo. A segunda solução consiste em inibir a transferase de farnesil, a enzima que catalisa a transferência do grupo farnesilo nas pré-lâminas a partir do pirofosfato de farnesilo. Quando são utilizados esses inibidores (FTI), um envelope nuclear "normal" é apenas parcialmente restaurado em células HGPS (Progeria) em cultura, e a sobrevivência de ratos RD (KO ZMPSTE24) é melhorada (Glynn & Glover 2005 (17), Capell et al., 2005 (6),Toth et al., 2005 (47), Fong et al., 2006 (15)).

No entanto, o bloqueio da farnesilação pode induzir uma geranil-geranilação compensatória (Bishop et al., 2003 (3), Varela et al., 2008 (54 aa)).

Por outro lado, foi recentemente relatado que os FTI induzem uma paragem do ciclo celular, bloqueando o proteassoma (Demyanets et al., 2006 (8), Efuet & Keyomarsi 2006 (10)). Assim, o tratamento induz, provavelmente, uma acumulação no nucleoplasma da progerina, provavelmente, ubiquitinilada, não degradada pelo proteassoma.

Além disso, estudos recentes relatam que a redução na taxa de farnesilação da progerina in vivo é muito baixa, na ordem de 5% (Young et al., 2006 (53)), que não explica a restauração da morfologia nuclear observado in vitro.

Finalmente, os FTI são específicos para apenas uma das vias de prenilação proteica, e não podem ser considerados como inibidores globais das prenilações pós-traducionais.

Além disso, é relatado que a ausência total de uma das enzimas desta via, a quinase de mevalonato, é letal na infância (mutação homozigótica de perda de função do gene que codifica esta enzima, sindrome relatado por Hoffmann et al., 2003 (24)) .

Tratamentos anti-HIV e efeitos secundários 1. Os doentes infetados com HIV e submetidos ao tratamento antirretroviral têm sinais clínicos e laboratoriais de envelhecimento acelerado, semelhante aos apresentados por pacientes portadores de uma sindrome progeróide de origem genética.

Os tratamentos antirretrovirais, inibidores da transcriptase reversa, nucleosídicos (NRTI) ou não (NNRTI), inibidores da protéase virai (PI) permitiram uma extensão do tempo de vida de pacientes infetados com o vírus da SIDA, nos quais aparecem as consequências do envelhecimento "fisiológico" (Casau, 2005;. Levy et al, 2003).

No entanto, a própria infeção e tratamento antirretroviral apresentam os mesmos sinais clínicos e biológicos que os apresentados por pacientes com sindrome de aceleração de envelhecimento de origem genética (para uma revisão recente destas sindromes, consulte (Navarro et al., 2006).

Alguns eventos parecem diretamente relacionados com a infeção virai: - Por exemplo, a helicase mutada na sindrome de Werner (OMIM 277700), a sindrome do envelhecimento prematuro associado com predisposição para o cancro e a aterosclerose, recruta cofatores proteicos celulares necessários para a transativação da LTR do HIV-1 e à replicação do virus. A disponibilidade reduzida de helicase em células infetadas podem levar ao envelhecimento e à imunossupressão (Sharma et al., 2007).

Por exemplo, ainda, as mudanças de transporte de colesterol nos macrófagos. A proteína virai Nef inibe as permeases da família ABC responsáveis pelo efluxo do colesterol (Bukrinsky e Sviridov, 2006; Mujawar et al., 2006; Wang e Rader, 2007) . A acumulação de colesterol em macrófagos transforma-os em células espumosas (células espumosas) envolvidas na formação de placas ateroscleróticas nas paredes vasculares (Pennings et al., 2006). Os medicamentos antirretrovirais inibem, também, o efluxo do colesterol dos macrófagos, contribuindo para a formação de placa aterosclerótica (Azam et al., 2006; Dressman et al., 2003; Wang et al., 2007) .

Numerosas manifestações clínicas e laboratoriais também parecem ser a consequência de tratamentos antirretrovirais: - reproduzem os sinais observados em sindromes progeróides genéticas, como a progeria de Hutchinson-Gilford (OMIM 176670, consulte (Hennekam, 2006), a displasia acromandibular (OMIM 248370) e forma letal, neonatal, de dermopatia restritiva (OMIM 275210) associada a mutações no gene LMNA que codifica as lâminas A e C ou as mutações na protéase ZMPSTE24 (facel) responsável pela clivagem da pré-lâmina A durante a sua maturação em lâmina A: - a alopecia (Torres et al., 2007; Wiwanitkit, 2004), independente dos eventos infeciosos dermatológicas (Maurer 2005). anomalias do sistema esquelético, particularmente osteoporose (Brown e Qaqish, 2006; Thomas e Doherty, 2003) a que foi proposto a correção pela vitamina D e um bisfosfonato (Mondy et al., 2005) - perda de massa muscular (Restrepo et al., 2006;. Restrepo et al., 2004; Tehranzadeh et al., 2004a; Tehranzadeh et al., 2004b), em ligação com o sistema ubiquitina-proteassoma (Costelli e Baccino 2003) ou calpaína (Bartoli e Richard, 2005; Costelli et al., 2005), dois sistemas proteoliticos inibidos por certos fármacos antirretrovirais (ver abaixo). As mutações da calpaina 3 muscular são responsáveis por uma forma de distrofia muscular de Duchenne (LGMD2A, MIM 253600; (Richard et al., 1995) cuja miosite eosinofilica pode ser um dos primeiros sinais (Krahn et al., 2006). - cardiomiopatia (Barbaro, 2003; Restrepo et al., 2006), independente de complicações cardiovasculares (ver abaixo), relacionados com toxicidade mitocondrial dos NRTI (Lewis, 2003).

anomalias cardiovasculares (Mondy e Tebas, 2007) com distúrbios do metabolismo lipidico (Hui, 2003; Jones et al., 2005;. Moyle, 2007), aterosclerose (Saint Martin et al, 2006; Thomas e Smart, 2007; van Wijk et al., 2006), danos das células endoteliais (Chen et al., 2005 ; Jiang et al., 2006; Zhong et al., 2002) e diferenciação anormal de células adiposas Kim et al., 2006, Roche et al., 2002). A dislipidemia pode ser tratada com estatinas (Benesic et al., 2004; Liang et al., 2006; Mallon et al., 2006) ou um inibidor da absorção do colesterol intestinal (Negredo et al., 2006) . Note-se que a pravastatina, a qual corrige parcialmente alguns dos parâmetros alterados na sindrome metabólica (Yamagishi et al., 2006) induz um aumento no tecido adiposo subcutâneo, sem melhoria significativa no colesterol (Gharakhanian et al, 2006; Mallon al., 2006). - manifestações clinicas associadas ao hipoandrogenismo são frequentemente observadas em homens (Cohan, 2006) e casos de menopausa precoce em mulheres com HIV são objeto de várias publicações (Cohan, 2006; Ferreira et al., 2007).

Os inibidores da protéase virai (PI) têm diversos alvos celulares, incluindo protéases: inibição do proteassoma (Piccinini et al., 2005) tem consequências muito variadas em função do papel deste conjunto proteolitico em muitas funções celulares, rotatividade de proteínas, controlo do ciclo celular, apoptose, transcrição de genes, transdução de sinais, senescência, resposta ao stress... (Naujokat et al., 2007) . Por exemplo, um dos canais de bloqueio pelos PI de diferenciação dos adipócitos passa pela não-produção do fator regulador da transcrição NFkB que controla a transcrição do gene que codifica a metaloprotéase (zinco) MMP9 envolvida na diferenciação dos adipócitos (Bourlier et al., 2005; De Barros et al., 2007). outro exemplo é a via de sinalização realizada pela insulina (Rudich et al., 2005; Schutt et al., 2004). Os PI inibem a atividade da enzima de degradação da insulina (Hamel et al., 2006), bloqueando os canais de potássio responsáveis pela secreção de insulina (Neye et al., 2006), interagindo com transportadores de glucose GLUT 4 (Hertel et al., 2004) e impedindo a sua inserção na membrana plasmática (Hruz, 2006; Parker et al., 2005). - da mesma forma, os IP bloqueiam a via de sinalização da quinase Akt realizada pela ativação de recetores da atividade da tirosina quinase (Gupta et al., 2005), incluindo a de IGF1. Ou IGF1 controlando diretamente a atrofia ou hipertrofia muscular (Glass, 2003). - os PI exercem um efeito anti-apoptótico através da inibição da calpaina, protéases citosólicas dependentes de Ca++ (Ghibelli et al., 2003; Lichtner et al., 2006), e que controlam o equilíbrio da apoptose-autofagia por clivagem ATG5, essencial para a formação de vacúolos autofágicos (Yousefi et al., 2006). - dois outros sistemas enzimáticos são bloqueados pelos PI: alguns citocromos P450 da subfamília 3A, intestinais ou hepáticos (Granfors et al., 2006), ao passo que outros citocromos P450 da subfamília 2A são induzidos (Yeh et al., 2006) em conjunto com outros transportadores (Dixit et al., 2007; Yeh et al., 2006); a glucuronidação no ER, em particular, a bilirrubina (Zhang et al., 2005). - a inibição de diversas atividades enzimáticas em que o proteassoma induz o stress do retículo endoplasmático, o desbloqueio do UPR (Unfolded Protein Response), ativação e o envolvimento do retículo no mecanismo de sinalização para o núcleo com o aparecimento de fatores que regulam a transcrição (Zhou et al., 2006). Numerosas publicações demonstram o aumento na quantidade de isoformas de SREBP (Sterol Response Element Binding Protein), que controlam a ativação de genes que regulam o metabolismo dos lípidos, incluindo o do colesterol (Colgan et al., 2007; Miserez et al.. 2002;. Nguyen et al., 2000; Williams et al., 2004; Zhou et al., 2006; Zhou et al., 2005) . A indução pelos PI da transcrição de SREBP também foi demonstrada por um estudo do transcriptoma (PCR quantitativo) de adipócitos em vias de diferenciação (Pacenti et al., 2006) e o efeito é reforçado pela ausência de degradação de SREBP pelo sistema ubiquitina-proteassoma.

Os PI induzem a acumulação nuclear de SREBP em hepatócitos e adipócitos e os seus efeitos sobre o metabolismo lipídico (aumento da síntese de ácidos gordos e colesterol) (Hui, 2003; Riddle et al., 2001). três artigos da mesma equipa em Paris analisaram a diferenciação in vitro de adipócitos que mostram sucessivamente que os PI conduzem a uma sindrome de resistência à insulina, a localização anormal de SREBP no nucleoplasma, em relação a uma anomalia da localização da lâmina A (Caron et al., 2001); a inibição da clivagem de SREBP (por protéases de Golgi S-1P e 2P-S, ver (Seidah, et al., 2006), e o seu impacto sobre a síntese de enzimas do metabolismo lipídico, sobre a maturação anormal da lâmina A, enquanto a maturação da lâmina B não é alterada (Caron et al., 2003); a semelhança entre o stress mitocondrial observado em lipodistrofias associadas com a mutação do gene LMNA e a que resulta do tratamento pelos PI (Caron et al., 2007).

Um dos benefícios deste trabalho é sugerir fortemente que certos PI bloqueiam a protéase (Facel ou ZMPSTE24) envolvida na maturação da pré-lâmina A, dados que foram confirmados por uma equipa dos EUA (Coffinier et al., 2007). Estes PI, pelo contrário, não têm qualquer efeito sobre a atividade da protéase Face2 (ou Reel, enzima conversora Ras 1), responsável pela clivagem das pré-lâminas B, mas, também, a da proteína G monomérica Ras, clivagem necessária para a sua maturação (Wright e Philips, 2006). Um estudo recente de RT-PCR quantitativa mostra que os PI induzem uma diminuição na quantidade de ARNm que codificam para a lâmina A sem alterar a quantidade de ARNm que codifica a lâmina C (Miranda et al., 2007) . - os PI inibem as protéases mitocondriais responsáveis pela clivagem dos sinais de endereçamento para as mitocôndrias, a renovação das proteínas mitocondriais, o controlo de certas GTPases mitocondriais (OPA1) envolvidas na fusão das mitocôndrias e na apoptose (Mukhopadhyay et al. 2002; Roehl White e Lauring, 2007). independentemente da sua acção sobre a calpaina (ver acima), os PI exercem um efeito anti-apoptótico em células T por bloqueio, por meio da proteína UCP2, a despolarização da membrana interna induzida por estímulos pró-apoptóticos (Matarrese et al., 2003; Matarrese et al., 2005). - note-se que os PI, por conseguinte, inibem várias enzimas da protéase do aspartilo específicas para o vírus da SIDA (Dunn et al., 2002) . Embora a literatura não se pronuncie quanto a este ponto, os PI podem, também, inibir certas protéases eucarióticas de aspartilo (consulte o site "degradome" http://www.uniovi.es/degradome/) como a presenilina, o péptido de sinal da peptidase, ou Ddil (DNA damage inducible protein), capaz de ligar tanto o proteassoma e as proteínas ubiquitinadas para a degradação destas últimas (Sirkis et al., 2006).

Os nucleosídicos inibidores da transcriptase reversa do vírus (NRTIs) têm, também, vários alvos celulares, de que a mitocôndria é uma das mais importantes: - os não nucleósidos inibidores da transcriptase inversa do vírus, menos estudados, parecem ter uma ação específica sobre a enzima viral enquanto induzem a apoptose numa linha de células T (Pilon et al., 2002). - os NRTIs são incorporados no ADN nuclear (Olivero et al., 1999) e o seu efeito mutagénico pode causar um bloqueio do ciclo celular (Olivero et al., 2005). Foi relatada uma mutação da polimerase gama de ADN (Yamanaka et al., 2007), responsável pela replicação e reparação do ADN mitocondrial (Hudson e Chinnery, 2006). - um pequeno número de publicações mostram que os ITRN inibem a N-glicosilação (no reticulo endoplasmático), a 0-glicosilação e modificações da arborização açucaradas (no Golgi), interferindo com os nucleótidos transportadores de Golgi dos precursores das arborizações açucaradas (Lizzi et al., 2007). Várias distrofias musculares estão associadas com defeitos genéticos da glicosilação (Muntoni et al. 2004; Percival e Froehner, 2007). - os NRTIs são transportados na matriz mitocondrial por uma família de transportadores especializados nos desoxinucleósidos difosfato, que são fosforilados por uma quinase mitocondrial antes de serem incorporados no ADN mitocondrial por polimerase gama de ADN (Palmieri, 2004). - a genotoxicidade dos ITRN resulta num aumento da taxa de mutação do ADN mitocondrial e uma diminuição do número de cópias nas mitocôndrias (Kohler e Lewis, 2007; Olivero, 2007) . -as anomalias do ADN mitocondrial e aquelas do funcionamento da polimerase gama de ADN tem consequências para a síntese das 13 proteínas da membrana interior constituindo, com as proteínas codificadas pelo genoma nuclear e importadas, os complexos da cadeia respiratória e sintase ATP. As perturbações do ADN mitocondrial e da sua polimerase levam, por exemplo, à diminuição da quantidade de citocromo-oxidase II (Vidal et ai., 2006), a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) (Jiang et ai., 2007), com consequências sobre os hepatócitos, adipócitos, cardiomiócitos e células endoteliais envolvidas na lipodistrofia e complicações cardiovasculares. - o aumento da taxa de ácido láctico plasmático é um dos critérios da disfunção mitocondrial induzida por tratamento antirretroviral (2007; John et al., 2001). - os NRTIs inibem, também, a atividade da telomerase e induzem um encurtamento dos telómeros (Olivero, 2007; Yamaguchi et al., 2001).

Em conclusão, os tratamentos antirretrovirais têm um impacto sobre os mecanismos e vias metabólicas agrupadas em várias teorias celulares para explicar o envelhecimento normal ou acelerado: - a teoria "mitocondrial", - a teoria do "núcleo e lâminan", apareceu em 2003 com a descoberta de que o gene LMNA é responsável pela progeria, - a teoria "telomérica",

a teoria da "regulação da transcrição de genes", em particular, com as proteínas p53, NF-xkB - a teoria "metabólica", com o envolvimento de algumas vias de sinalização ativadas pelos recetores de membrana. - vários modelos animais de envelhecimento prematuro ou, pelo contrário, para aumentar o tempo de vida mostram um sobreposição parcial entre os percursos metabólicos envolvidos em cada uma destas teorias e as inter-relações, a nível celular, entre o citosol e, em especial, o mecanismos de degradação das proteínas (Grillari et al., 2006), mitocôndria, núcleo e membrana plasmática (Irminger-Finger, 2007; Kenyon, 2005; Martin e Loeb, 2004; Quarrie e Riabowol, 2004) . Vários modelos animais de envelhecimento prematuro ou, pelo contrário, para aumentar o tempo de vida mostram sobreposição parcial entre os percursos metabólicos envolvidos em cada uma destas teorias e interrelações, a nível celular entre o citosol e em especial (. Grillari et al, 2006) mecanismos de degradação de proteínas, mitocôndria, membrana núcleo e plasma (Irminger-Finger, 2007; Kenyon, 2005; Martin e Loeb, 2004; Quarrie e Riabowol, 2004) . 2. A teoria "mitocondrial" do envelhecimento (Figura 6 anexa).

Os três componentes principais da teoria do envelhecimento mitocondrial são i/ o aumento da produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) pelos complexos I e II da cadeia respiratória, ii/ disfunção progressiva desta última e iii/ acumulação de lesões do ADN mitocondrial (Balaban et al., 2005; Meissner, 2007; Wallace, 2005). O ADN mitocondrial é mais sensível do que o ADN nuclear para os efeitos de ROS, que dirigem a polimerase gama do ADN (Graziewicz et al., 2002; Richter et al., 1988) . Dois modelos de ratinhos que expressam uma polimerase gama de ADN deficiente na sua função de apresentação de leitura de prova mostram um envelhecimento acelerado com mutações no ADN mitocondrial (Kujoth et al., 2005; Trifunovic et al., 2004). A toxicidade mitocondrial de ROS pode ser abolida pela sobre-expressão da catalase peroxissomal dirigida para a mitocôndria num modelo de ratinho transgénico, cujo tempo de vida é aumentado (Schriner et al., 2005) .

Nos seres humanos, o envelhecimento é acompanhado por uma diminuição das funções mitocondriais, incluindo as da cadeia respiratória (Short et ai., 2005; Trifunovic et ai., 2005), um aumento de deleções no ADN mitocondrial, especialmente observado nas doenças neurodegenerativas (Bender et al., 2006; Kraytsberg et al., 2006).

Um mecanismo de sinalização, ainda muito pouco conhecido, da mitocôndria para o núcleo envolve a proteína p32, especialmente, durante o envelhecimento ou patologias induzidas por ROS (Jiang et al., 1999; Storz, 2006). Esta proteína, codificada pelo genoma nuclear e importada para a matriz mitocondrial, é reexportada para o nucleoplasma (Brokstad et al., 2001), onde controla a transcrição (Chattopadhyay et al., 2004) e o splicing (Petersen-Mahrt et al., 1999) do ARNm. Interage, por outro lado, com o recetor da lâmina B, localizado na face nucleoplásmica do envelope nuclear (Mylonis et al., 2004; Simos e Georgatos, 1994). O mecanismo de sinalização do núcleo para a mitocôndria envolve 1500 proteínas codificadas pelo genoma nuclear, que são sintetizadas no citoplasma e, em seguida, importadas para as mitocôndrias (Calvo et al., 2006; Truscott et al., 2003).

Entre estas proteínas, a p53 está envolvida no envelhecimento acelerado num modelo de ratinho (Tyner et al., 2002) e participa na desregulação no quadro da teoria "nuclear" (ver abaixo). A proteína P53 controla a respiração mitocondrial (Matoba et al., 2006), exerce os efeitos pro- e antioxidantes, controlando a transcrição de genes nucleares (Bensaad e Vousden, 2005; Sablina et al., 2005). Mantém a estabilidade do ADN mitocondrial, interagindo com a polimerase gama do ADN (Achanta et al., 2005).

Finalmente, os mecanismos de fissão (divisão) e de fusão de mitocôndrias, que envolvem vários GTPases das membranas mitocondriais externas (Drpl, as mitofusinas ...) e internas (0PA1) e várias proteinas associadas (Fisl ...) modulam a senescência celular: o alongamento da rede mitocondrial por fusão permanente induz a senescência celular com diminuição na diferença de potencial entre as duas faces da membrana interna, o aumento da produção de ROS e danos no ADN. Essas alterações fenotipicas são neutralizadas pela fragmentação da rede mitocondrial (Lee et al., 2007). 3. Mecanismos de sindromes de envelhecimento acelerado de origem genética no âmbito da teoria "núcleo e lâmina"

As lâminas são as proteinas constitutivas dos filamentos intermédios localizadas exclusivamente no nucleoplasma. O gene LMNA codifica, principalmente, para as lâminas A e C, produzidas por splicing alternativo. Dois outros genes codificam as lâminas BI e B2.

As lâminas A e B são sintetizadas no citosol sob a forma dum precursor que passa por várias fases de maturação. As 3 proteinas têm na sua extremidade do terminal C da caixa CAAX (uma cisteina, dois aminoácidos alifáticos, um aminoácido indiferente). Esta sequência CAAX permite a farnesilação das lâminas A e B (cerca de 300 outras proteinas do genoma humano). O resíduo de farnesilo (isoprenóides de 15 átomos de carbono) é sintetizado num passo intermediário na via de síntese do colesterol (Figura 7 anexa). Uma enzima citosólica, a farnesil transferase, fixa o resíduo farnesilo na cisteina. A presença do resíduo de ácido gordo permite a ancoragem das pré-lâminas A e B no folheto citosólico da membrana do invólucro do retículo endoplasmático (ER) . As pré-lâminas A e B são, em seguida, clivadas por FACEl (ZMPSTE24) ou FACE2 (Reel), respetivamente, e perdem os seus três últimos aminoácidos dos terminais C aaX. As proteínas sempre ancoradas na membrana do envelope RE, onde sofrem a ação de uma segunda enzima, a WSI, que define um grupo metilo na cisteína já farnesilada. A maturação das lâminas B termina nesta fase. Estas proteínas deslizam no plano do envelope da membrana do RE e na face citosólica do envelope nuclear, através do poro nuclear e estão localizadas na camada nucleoplásmica do envelope nuclear, onde entram na constituição da lâmina nuclear e onde interagem com várias proteínas, incluindo o recetor da lâmina B. A ancoragem no envelope tem por consequência a ausência de lâminas B na matriz nuclear, dentro do nucleoplasma e longe do envelope. A pré-lâmina A farnesilada e carboximetilada na mesma cisteína do terminal C é submetida a uma etapa final de maturação por clivagem proteolítica dos últimos 15 aminoácidos pela FACE1 (e talvez por Reel). A lâmina A perde a sua ancoragem no RE, torna-se solúvel, e é importada para o nucleoplasma (como a lâmina C) através do poro nuclear, como todas as proteínas solúveis, através do seu sinal de localização nuclear que recruta o complexo de importação necessário (Figura 8 em anexo).

No nucleoplasma, a lâmina A (e a lâmina C) está localizada na lâmina nuclear sob o envelope nuclear, onde interage com numerosas proteínas inseridas na folha nucleoplásmica do envelope. As lâminas A e C (ao contrário das lâminas B) também são dispersas no resto do nucleoplasma onde entram na constituição da matriz nuclear ou nucleoesqueleto (Figura 6 anexa) . A matriz nuclear controla o funcionamento do genoma nuclear: a replicação, a reparação do ADN, a transcrição de ARN, splicing de ARNm, maturação dos outros ARN ... e dos seus componentes, cujas âminas A e C interagem com numerosas proteínas importados para o nucleoplasma (p53, SREBP, ...) como mostram as anormalidades observadas nass laminopatias de origem genética (Broers et ai., 2006; Vlcek et ai., 2001; Vlcek e Foisner, 2006). A face nucleoplásmica do envelope nuclear e das suas proteínas transmembranares, e as lâminas da lâmina contribuem para o armazenamento dos elementos reguladores da transcrição, antes da sua utilização e a regulação da expressão dos genes (Heessen e Fornerod, 2007; Shaklai et al., 2007).

As primeiras laminopatias descobertas desde 1999 apareceram como doenças predominantes num determinado tecido, músculo esquelético, músculo cardíaco . . . enquanto as lâminas são proteínas ubíquas (Vlcek e Foisner 2007a; Vlcek e Foisner 2007b; Worman and Good, 2007). As lipodistrofias associam as anormalidades do metabolismo lipídico e resistência à insulina com uma desordem da distribuição de gordura corporal, ao ser comparado com a lipodistrofia observada no tratamento antirretroviral (Capeau et al., 2005).

As laminopatias "sistémicas" foram descobertas depois de 2002: displasia acromandibular (OMIM 248370; (Agarwal et al., 2003; Novelli et al., 2002); progeria de Hutchinson-Gilford (OMIM 176670; (De Sandre-Giovannoli et al., 2003; Eriksson et al., 2003) dermopatia restritiva (OMIM 275210; (Navarro et al., 2005; Navarro et al., 2004). Respeitam a todos os tecidos do corpo dos pacientes, pele e fâneros, músculos do esqueleto e cardíaco, osso e cartilagem, tecido adiposo e suas consequências metabólicas, mas, em geral, são associados com o envelhecimento acelerado, cujo o máximo é atingido com a dermopatia restritiva, letal no momento do nascimento. Estas três doenças estão ligadas quer a uma mutação no gene LMNA que codifica para as lâminas A e C, ou no gene FACE1 (ZMPSTE24) que codifica para a protéase do RE que cliva duas vezes a pré-lâmina A. A mutação do gene LMNA tem o efeito de eliminar o local de reconhecimento pelo FACE1 da pré-lâmina A: a proteína não é clivada, mantém o seu resíduo farnesil, é importada para o nucleoplasma, deslizando ao longo das membranas do invólucro como são as lâminas do tipo B (Pan et al. , 2007) . A pré-lâmina A permanece ancorada na face nucleoplásmica do envelope nuclear em que perturba a organização da lâmina farnesilada e as interações entre a lâmina e as proteínas de envelope da membrana, o que resulta em nucleares deformações características (Goldman et al., 2004). O resto da matriz nuclear é desprovida da lâmina A, com várias consequências funcionais, por exemplo, a ativação de vias a jusante de p53 (Varela et al., 2005), anomalias da mitose (Cao et al., 2007; Dechat et al., 2007), a reparação do ADN (Liu et al., 2005; Liu et al., 2006; Liu et al., 2007b) levando à senescência celular (Kudlow et al., 2007) . A análise do transcriptoma de células de pacientes com progeria mostrou anormalidades na expressão de genes envolvidos na aterosclerose (Csoka et al., 2004).

Parece provável que o envelhecimento acelerado apresentado por pacientes tratados com alguns medicamentos antirretrovirais, em particular os PI que inibem ZMPSTE24 (FACE1) obedecem aos mesmos mecanismos. A mutação no gene LMNA responsável pela progeria desmascara um local de splicing críptico que conduz à síntese de um ARNm apagado de 150 nucleótidos, que codifica para a progerina, uma pré-lâmina A suprimida de 50 aminoácidos e que mantém o seu grupo farnesilo. Esta mesma proteína é produzida durante o envelhecimento fisiológico, na ausência de qualquer mutação no gene LMNA, em resultado de um erro, relacionada com a idade, a maquinaria de splicing (Scaffidi e Misteli, 2006). A progerina acumula-se nos fibroblastos dérmicos localizados sob a lâmina basal, e nos queratinócitos. Pode representar um marcador do envelhecimento da pele (McClintock et al., 2007).

As alterações nucleares (hérnias do nucleoplasma no citosol, efração do envelope, contornos nucleares irregulares ...) observadas nas células de pacientes que sofrem de progeria assemelham-se, por sua vez, às alterações transitórias induzidas pela proteína virai Vpr, que facilita entrada, por efração transiente do envelope nuclear e da lâmina, do complexo de pré-integração do vírus da SIDA, complexo grande demais para ser importado para o nucleoplasm através dos poros nucleares (Noronha et al., 2001). Para uma recente revisão destes mecanismos de importação nuclear (Suzuki e Craigie, 2007) .

Demonstrou-se, ainda, que várias proteínas da face nucleoplásmica do envelope nuclear, do qual a emerina, mutadas numa forma de distrofia muscular de Emery-Dreiffus, são essenciais para a penetração no nucleoplasma do vírus da SIDA e na infeção de células que não se dividem (Jacque e Stevenson, 2006). O termo laminopatia genética reagrupa, portanto, as patologias resultantes de mutações nos genes que codificam para as lâminas, especialmente, o LMNA que codifica as lâminas A e C, mas também aqueles causados por mutações de proteínas associadas, incluindo aquelas envolvidas na maturação da lâmina.

As alterações induzidas pelos PI ao nível da matriz nuclear, por conseguinte, representam uma das laminopatias adquiridas, iatrogénicas. Quer seja de origem genética ou adquirida, estas anomalias da matriz nuclear tem implicações na instabilidade genómica e no envelhecimento celular (Mehta et al., 2007; Oberdoerffer e Sinclair, 2007). 4. A teoria "telomérica" do envelhecimento 0 envelhecimento celular é controlado por um "relógio" medindo o comprimento dos telómeros, que são encurtados em cada mitose, um fenómeno que pode ser compensado pela atividade da subunidade catalítica da telomerase (Gilson e Geli, 2007; Stewart e Weinberg, 2006).

Antes do advento da PCR quantitativo que permite a medição direta do comprimento dos telómeros, em particular, nas células mononucleares do sangue (Cawthon, 2002; Gil e Coetzer, 2004; Njajou et al,, 2007), a medição da atividade da telomerase (ensaio TRAP) foi realizada em células de pacientes tratados com antirretrovirais, com resultados variáveis, especialmente, segundo o subtipo de células T analisadas (Effros, 2000).

Os NRTIs inibem a atividade da telomerase (Olivero, 2007; Yamaguchi et al., 2001).

As anomalias da lâmina A causam uma diminuição da atividade da telomerase, levando ao encurtamento acelerado dos telómeros. Estes efeitos foram observados em células de doentes com progeria, as células foram transfectadas para sobre-expressar ou não a subunidade catalítica da telomerase (Wallis et al., 2004). Resultados comparáveis foram obtidos em fibroblastos de indivíduos saudáveis que sobre-expressam após a transfecção da lâmina A, normal, mutada ou eliminada, como na progeria (Huang et al., 2008). A matriz nuclear e as proteínas do envelope nuclear associado ao nível da lâmina, por conseguinte, controlam diretamente, ou indiretamente, a atividade da telomerase (Pandita et al., 2007). 5. Alguns fatores reguladores da transcrição, em particular, p53 e NF-kappaB estão envolvidos no fenómeno do envelhecimento ou da sua regulação.

Duas famílias de proteínas, p53 (Zafón, 2007) e NF-kB (Hayden e Ghosh, 2004), controlam a transcrição de numerosos genes e estão envolvidas, em particular, no fenómeno de envelhecimento. Estas proteínas participam, também, nos mecanismos descritos nas outras teorias do envelhecimento e na ligação entre elas.

Além das suas funções bem caracterizados no controlo do ciclo celular, resposta ao stress, oncogénese, reparação de danos no ADN (Fuster et al., 2007; Helton e Chen, 2007; Sengupta e Harris, 2005), a p53 está envolvida no envelhecimento celular (ver por exemplo, (Bauer e Helfand, 2006; Ben-Porath e Weinberg, 2005; Papazoglu e Mills, 2007; Sharpless e DePinho, 2002; Tyner et al., 2002) . A proteína p53 também está envolvida nas alterações induzidas por laminopatias (Varela et al., 2005), no funcionamento da helicase cuja mutação é responsável pela síndrome de Werner (Brosh et al., 2001; Sommers et al., 2005), a regulação dos telómeros (Wynford-Thomas, 1996), o controlo da respiração mitocondrial (Matoba et al., 2006) de forma independente da função de p53 no desencadeamento da apoptose pela sua interação com as moléculas apoptogénicas da membrana externa (Manfredi, 2003; Mihara et al., 2003; Moll et al., 2005). A p53 também regula a via metabólica "insulino-IGFl-Klotho" (ver abaixo). NF-kB está, também, na encruzilhada de muitas vias metabólicas. A sua inativação por interferência de ARN nos fibroblastos em cultura protege a senescência (Hardy et al., 2005). Da mesma forma, o blogueio indocível da expressão de NF-kB em células epidérmicas do rato retarda o seu envelhecimento através de alterações na expressão de vários genes analisados por microarranjo (Adler et ai., 2007). 6. A teoria "metabólica" do envelhecimento através da via de restrição calórica e vias de sinalização de insulina, de IGF1 e da hormona Klotho que liga a membrana plasmática, o núcleo e a mitocôndria A restrição calórica induz um aumento na vida útil em roedores (Bordone e Guarente, 2005). Ativa a sirtuina deacetilase, que tem como alvo tanto os histonas (com uma remodelação cromatina) (Vijg e Suh, 2006), inúmeras outras proteínas nucleares (incluindo fatores de transcrição como p53, proteínas envolvidas na reparação de ADN ...) mas também citosólica (tubulina) e mitocondriais (Guarente, e Picard, 2005; North e Verdin, 2004; Porcu e Chiarugi, 2005). A restrição calórica provoca a biogénese mitocondrial através da expressão de sintase de NO endotelial, eNOS (Nisoli e Carruba, 2006; Nisoli et al., 2005), resultando no aumento da produção de ROS (Gredilla e Barja, 2005).

As vias de sinalização da insulina e de IGF, envolvidas no envelhecimento (Bartke, 2005; Russell e Kahn, 2007) são inibidas pela restrição calórica (Holzenberger et al., 2004; Masoro, 2004). A restrição calórica inibe, também, as vias de sinalização reguladas pela hormona Klotho (Kurosu et al., 2005; Unger, 2006), cujas mutações estão associadas a um envelhecimento prematuro em ratinhos (Kuro-0 et al. 1997). Klotho é um regulador da resposta induzida pelo recetor FGF-23 (Kurosu et al., 2006) . Mutações de Klotho e FGF-23 induzem o mesmo fenótipo de envelhecimento prematuro, que é conhecido por ser causado por hipervitaminose D e é corrigido pela deleção de um gene do aumento do efeito da vitamina D (Razzaque e Lanske, 2006). Klotho bloqueia, também, a resposta dos recetores de Wnt (Liu et al., 2007a), o que mostra a variedade de percursos metabólicos envolvidos no envelhecimento. Finalmente, a insulina estimula, através da quinase fosfatidilinositol 3, a clivagem de precursor transmembranar de Klotho pelas metaloprotéases da família ADAM e a libertação de Klotho no meio extracelular (Chen et al., 2007) . A proteína p53 está, também, envolvida na regulação destas vias (Campisi, 2004; de Oliveira, 2006; Kim et al., 2007; Schmid et al., 2007). A proteína p66shc é um dos sinais de comunicação entre os recetores da membrana de plasmática para a insulina e para o IGF1, o núcleo e mitocôndrias (Martin e Friedman, 2004) . Os ratinhos KO p66shc_/_ apresentam uma maior resistência ao stress e um aumento da sua vida útil (Migliaccio et al., 1999) . p66shc é um alvo de p53, localizada nas mitocôndrias onde controla o metabolismo e a produção de ROS (Migliaccio et al., 2006. Nemoto et al., 2006; Orsini et al., 2004; Trinei et al., 2002). Uma deleção de p66shc inibe o envelhecimento das células estaminais cardíacas e impede os ataques cardíacos, dois fenómenos induzidos pela diabetes (Rota et al., 2006). p66shc é uma enzima redox. Em resposta ao stress celular, p66shc é importado para a mitocôndria e está localizada no espaço intermembranar em que sintetiza H2O2 (30% de H2O2 celular, sendo o restante produzido pelo peroxissoma) usando eletrões transferidos pelo citocromo C (Giorgio et al., 2005). H2O2 pode ser um sinal intracelular para controlar o tempo de vida (Giorgio et al., 2007) .

Divulgação da Invenção

Depois de extensas pesquisas, os inventores demonstraram que a combinação de um inibidor de redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (família das estatinas) e um inibidor da sintase do pirofosfato de farnesilo (família dos aminobifosfonado, NBP), ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, é um tratamento eficaz em situações patológicas, ou não, relativamente à acumulação e/ou à persistência de células de proteínas preniladas, na medida em que atua sobre todo o controlo de prenilação de proteínas, tanto em C15 como em C20 ou nas formas não caracterizadas. Os inventores verificaram, ainda, que a combinação de um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) e um inibidor da sintetase do pirofosfato de farnesilo tem um efeito aditivo na restauração de fenótipo normal nos fibroblastos de pacientes com progeria e em ratinhos com um modelo de dermopatia restritiva. 0 efeito da combinação é significativamente superior do que o efeito de ambos os inibidores utilizados individualmente (Varela et al., 2008 (54-A)). A utilização da combinação em células de pacientes com progeria leva a uma inibição da prenilação de proteínas, levando ao aparecimento da pré-lâmina A não farnesilada, a melhoria de sintomas nucleares e à correção parcial de anomalias de reparação de ADN. A inibição da prenilação é, também, observada em ratinhos com um modelo de dermopatia restritiva e restaura parcialmente a vida dos ratinhos (Varela et al., 2008 (54-A)).

Os tratamentos antirretrovirais tem como alvo múltiplas vias metabólicas e vários compartimentos celulares, citoplasma, nucleoplasma e a mitocôndria.

Os efeitos secundários destes tratamentos reproduzem alguns dos sinais clínicos e biológicos em pacientes com laminopatias genéticas causadas por mutações no gene LMNA ou no gene ZMPSTE24. A característica comum destas alterações é manter o grupo farnesilo ligado à lâmina A ou a pré-lâmina A. Este grupo farnesilo ancora a lâmina A à face nucleoplásmica do envelope nuclear da lâmina, enquanto o resto do nucleoplasma é desprovido de lâmina A solúvel.

Estas duas anomalias de distribuição da lâmina A leva a consequências deletérias em várias vias metabólicas nucleares (replicação e reparação do ADN, transcrição de genes, encurtamento dos telómeros...), têm, também, consequências deletérias em outros compartimentos celulares, incluindo a mitocôndria. A disfunção geral celular provoca o envelhecimento acelerado e reduz a sua vida útil.

Uma familia de tratamentos antirretrovirais, os inibidores da protéase, inibem ZMPSTE24, bloqueiam a maturação da pré-lâmina A e provocam a persistência na célula da pré-lâmina A farnesilada. A Figura 9 anexa mostra esquematicamente a teoria do envelhecimento desenvolvida pelos inventores da presente e com base nas anomalias da maturação da pré-lâmina A e as suas consequências funcionais.

Por outro lado, ainda, os efeitos mais indiretos de inibidores de protéase virai na mitocôndria, uma segunda familia de medicamentos antirretrovirais, os nucleósidos inibidores da transcriptase reversa virai, perturbam diretamente a mitocôndria, um organelo que é conhecido por as anomalias do seu funcionamento estarem associadas com o envelhecimento. 0 objetivo consiste em analisar os mecanismos pelos quais estes dois tipos de tratamento antirretroviral provocam envelhecimento acelerado de pacientes infetados com o virus da SIDA e assegurar que estes mecanismos são semelhantes àqueles que causam o envelhecimento acelerado em doentes com laminopatia genética.

Os inventores da presente invenção concluíram que os efeitos secundários, descritos anteriormente, dos tratamentos antirretrovirais podem ser minimizados graças a uma composição compreendendo, ou tratamento combinando: pelo menos, um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) , ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, e - pelo menos, um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo, ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis. A presente invenção refere-se, portanto, a uma composição compreendendo: pelo menos, um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) , ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, sendo o referido inibidor uma molécula da familia das Estatinas, ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis - pelo menos, um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo, ou um seu sal fisiologicamente aceitável, sendo o referido inibidor uma molécula da familia dos aminobifosfonatos (NBP) , ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, e - pelo menos, um agente anti-HIV sendo, o referido agente anti-HIV, um inibidor da protéase ou um inibidor da transcriptase reversa.

Esta composição pode ser destinada, por exemplo, para o tratamento de situações, patológicas ou não, relativamente à acumulação e/ou persistência em células de proteínas preniladas. Em particular, esta composição é útil para o tratamento de um doente infetado com HIV. A presente descreve, também, uma composição em que o agente anti-HIV é um agente antirretroviral ou uma mistura de agentes antirretrovirais. A presente invenção refere-se a uma composição, em que o agente anti-HIV é um inibidor da protéase ou um inibidor da transcriptase reversa. A presente invenção relaciona-se, também, com uma composição, de acordo com a invenção, em que o agente anti-HIV é um inibidor da protéase selecionado a partir do grupo que compreende fosamprenavir, lopinavir, ritonavir, amprenavir, atazanavir e indinavir. A presente invenção relaciona-se, também, com uma composição de acordo com a invenção, em que o agente anti-HIV é um inibidor da transcriptase reversa selecionado a partir do grupo que consiste em zidovudina, lamivudina, didanosina e epzicom.

Na composição descrita, o agente anti-HIV pode ser uma combinação de um ou mais inibidores da protéase do virus e/ ou um ou mais inibidores da transcriptase inversa do virus e/ou um, ou mais, inibidores da entrada do virus nas células e/ou um ou mais inibidores da integrase e/ou qualquer outro tratamento com um efeito antiviral, em particular, qualquer tratamento reconhecido pelas agências reguladoras nacionais e/ou internacionais e pela comunidade cientifica. A presente invenção relaciona-se, também, com uma composição de acordo com a invenção, em que são utilizados compostos que são inibidores da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) e inibidores da sintase de pirofosfato de farnesilo.

Muito particularmente, a composição, de acordo com a invenção, é para o tratamento de um paciente infetado com HIV desenvolvendo efeitos secundários associados com a acumulação e/ou a persistência de células de progerina; mais especificamente, o tratamento de situações associadas com a acumulação e/ou a persistência de células da pré-lâmina A farnesilada, que é, ou não, truncada ou modificada.

Na presente, são descritos os inibidores da sintase do pirofosfato de farnesilo, ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis que podem ser utilizados na preparação da composição.

Os sais fisiologicamente aceitáveis descritos podem ser, por exemplo, os sais formados com o ácido cloridrico, bromidrico, nitrico, sulfúrico, fosfórico, ácidos carboxilicos, por exemplo, acético, fórmico, propiónico, benzoico, maleico, fumárico, sucinico, tartárico, cítrico, oxálico, aspártico, glioxílico, ácidos alcano-sulfónicos, tais como, o ácido metano ou etano sulfónico, ácidos arilsulfónicos, tais como, os ácidos benzeno ou paratolueno sulfónicos.

De acordo com a invenção, o inibidor da sintetase de pirofosfato de farnesilo é um membro da família dos aminobifosfonatos (NBP) , ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis.

Os polifosfonatos são moléculas sintéticas amplamente utilizadas no tratamento da osteoporose e da regeneração óssea. 0 termo fosfonato aplica-se a moléculas muito semelhantes ao fosfato:

0 núcleo do bisfosfonatos (BP) é o equivalente de uma ligação PO-P como no ATP, por exemplo, mas, em que o oxigénio é substituído por carbono. Isto dá uma estabilidade muito especial a estas moléculas.

Um bisfosfonato simples será equivalente ao ADP, sendo os dois grupos fosfato (03P-) substituídos pelo grupo de bisfosfonato.

0 carbono central, ao contrário do oxigénio dos fosfatos, pode estar, também, envolvido nas 2 ligações, e isso é a natureza dos grupos enxertados no carbono que fazem a especificidade dos bisfosfonatos.

Quando as cadeias "laterais" (RI e R2) têm uma função amina (NH), ou, mais geralmente, um ou mais átomos de azoto, fala-se de amino-bisfosfonato, ou NBP.

Claro, outros substituintes podem estar ligados nos oxigénios. 0 ácido pirofosfórico, ou solução de pirofosfato (PPI)

é utilizado em muitas reações metabólicas, como transportador de substratos, e é devolvido no final da reação. Uma das vias metabólicas que utilizam moléculas acopladas ao pirofosfato é o da prenilação de proteínas. 0 enxerto dum isopentenil-PP (unidade de base C5) sobre um geranilo-PP (CIO) para dar farnesil-PP, numa reação catalisada pela enzima sintetase de pirofosfato de farnesilo (FPS), liberta um PPI. É neste passo que é inibido especificamente pelos NBP. A este respeito, e a título de exemplo, o aminobifosfonato (inibidor da sintase do pirofosfato de farnesilo) pode ser selecionado a partir de - ácido alendrónico ou a sua forma iónica, alendronato; - ácido clodrónico ou a forma iónica, clodronato; - ácido etidrónico ou a forma iónica, etidronato; - ácido ibandrónico ou a sua forma iónica, ibandronato; - ácido medrónico onic ou a sua forma iónica, medronato; - ácido neridrónico ou a sua forma iónica, neridronato; - ácido olpadrónico ou a sua forma iónica, olpadronato; - ácido pamidrónico ou a sua forma iónica, pamidronato; - ácido risedrónico ou a sua forma iónica, risedronato; - ácido tiludrónico ou a sua forma iónica, tiludronato; - ácido zoledrónico ou a sua forma iónica, zoledronato; - ácido 4-N,N-dimetilaminometano difosfórico ou a sua forma iónica, dimetilaminometanodifosfonato; - α-amino (4-hidroxibenzilideno) difosfonato.

De preferência, de acordo com a invenção, é preferível utilizar o ácido zoledrónico (também designado por ácido zolendrónico) ou a sua forma iónica, zoledronato (também chamado zolendronato).

Na presente, são descritos os inibidores da redutase de HMG-CoA, ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, que podem ser utilizados na preparação da composição.

De acordo com a invenção, o inibidor da redutase de HMG-CoA é uma molécula da família da estatina, lipossolúvel ou solúvel em água, ou um dos seus sais f isiologicamente aceitáveis.

As estatinas têm sido identificadas em fungos. Têm uma atividade inibidora da redutase de HMG-CoA, uma enzima chave na biossíntese do colesterol e dos esteroides, que catalisa a redução do glutarato de hidroximetil acoplado à coenzima A em ácido mevalónico (mevalonato em solução). Esta inibição é assegurada pela sua analogia estrutural com o esqueleto do hidroximetilglutarato. A via metabólica envolvida é certamente a da biossíntese do colesterol, mas, também, a da síntese de grupos prenilados, polímeros da unidade de base de isopreno de 5 carbonos usados para modificar cerca de 300 proteínas em células e uni-las com uma cauda lipofílica, permitindo, em particular, a sua ancoragem nas membranas.

Os principais poliprenos, a partir de piruvato e da redutase de HMG-CoA, são o geranilo (CIO), o farnesilo (C15) e o geranil-geranilo (C20).

Todas as estatinas são geralmente hepatoseletivas, mas não têm todas o mesmo modo de entrada nas células. Na verdade, a pravastatina e a rosuvastatina são ambas hidrofilicas, portanto, solúveis em água, ao contrário de todos as outras que são lipofílicas, por isso, podem-se difundir livremente através das membranas celulares (bicamadas lipidicas), o que explica, sem dúvida, a sua maior toxicidade. As estatinas solúveis em água precisam de um transportador especifico para entrar na célula, aniões orgânicos transportadores 3, ou 0AT3, ou SLC22A8 (Takedaa & al., 2004 (46)). São amplamente utilizados para o tratamento da hipercolesterolémia, e os seus efeitos secundários, estndo alguns estão bem caracterizados. Estes incluem casos de rabdomiólise (1-7% dos casos de acordo com a molécula utilizada, Evans et al., 2002 (12)), prenúncio, dor muscular no paciente tratado, provoca uma paragem imediata tratamento. A este respeito, e a titulo de exemplo, uma estatina pode ser selecionada a partir de atorvastatina, simvastatina, pravastatina, rivastatina, mevastatina (ou compactina), fluindostatina, velostatina, fluvastatina, dalvastatina, cerivastatina pentostatina, rosuvastatina, lovastatina, pitavastatina, ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis. A lovastatina, pravastatina e simvastatina são moléculas de derivados de metabolitos de fungos, enquanto as outras (atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, pitavastatina e rosuvastatina) são totalmente sintéticas. De preferência, de acordo com a invenção, é utilizada pravastatina, uma estatina seminatural, solúvel em água.

Claro que é possível, de acordo com a invenção, a utilização de um, dois ou mais inibidores da sintetase de pirofosfato de farnesilo associado com um, dois ou mais inibidores da redutase de HMG-CoA.

Numa forma de realização particular da invenção, a composição pode ser destinada ao tratamento de efeitos secundários do tratamento do HIV, tais como o envelhecimento da pele, perda de pelos e/ou do cabelo, osteoporose e lipodistrofia. A presente invenção refere-se, também, à composição, de acordo com a invenção, para a sua aplicação como medicamento no tratamento de efeitos secundários do envelhecimento prematuro gerado num paciente por um tratamento anti-HIV.

De acordo com a invenção, o inibidor da sintase do pirofosfato de farnesilo e inibidores da redutase de HMG-CoA estão, vantajosamente, presentes na composição em doses fisiologicamente eficazes.

Em geral, as quantidades a serem administradas podem ser ajustadas de acordo com o paciente, a patologia, o modo de administração, etc. Entende-se que as aplicações repetidas podem ser realizadas, possivelmente, em combinação com outros ingredientes ativos ou qualquer veículo.

Em geral, a dose diária dos inibidores será a dose mínima para atingir o efeito desejado.

De acordo com a invenção, o inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA), inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo e o agente anti-HIV podem ser utilizados na composição, em mistura com um ou mais excipientes ou veículos inertes, ou seja, fisiologicamente inativos e não-tóxicos. Pode-se citar, por exemplo, os ingredientes vulgarmente utilizados em medicamentos para o tratamento de pacientes infetados com HIV e que acompanham o agente anti-HIV. A composição da presente invenção pode compreender, ainda, pelo menos, um outro ingrediente ativo, particularmente, um outro ingrediente terapeuticamente ativo, por exemplo, para utilização simultânea, separada ou escalonada no tempo de acordo com a formulação farmacêutica usada. Este outro ingrediente pode ser por exemplo um ingrediente ativo utilizado, por exemplo, no tratamento de infeções oportunistas que podem se desenvolver num doente infetado com HIV. A composição da presente invenção é uma composição utilizada, tanto para o tratamento de um paciente infetado com HIV e na prevenção e/ou tratamento de distúrbios cutâneos causados pelo uso de um agente anti-HIV. Esta composição pode ser utilizada numa terapia múltipla de um doente infetado com HIV. 0 agente anti-HIV pode ser único ou múltiplo(vários agentes anti-HIV em mistura). No caso de uma terapia múltipla (por exemplo, di-, tri- ou quadriterapia) , a mistura de inibidores podem acompanhar um, ou mais, agentes anti-HIV. 0 agente anti-HIV pode, também, ser uma combinação de um, ou mais, inibidores da protéase do virus e/ou um, ou mais, inibidores da transcriptase reversa do virus e/ou um, ou mais, inibidores de entrada de virus em células e/ou um, ou mais, inibidores da integrase e/ou qualquer outro tratamento com um efeito antiviral, em particular, qualquer tratamento reconhecido pelas agências reguladoras nacionais e/ou internacionais e pela comunidade cientifica. É descrito um método de tratamento dum paciente infetado por HIV compreendendo a administração de uma composição de acordo com a invenção. A composição da invenção é como definido acima.

De acordo com a invenção, a administração pode ser realizada seguindo todas as vias conhecidas na técnica ara a administração de uma composição anti-HIV. Pode ser, por exemplo, uma administração por via oral ou por injeção.

Como observado acima, a dose administrada da composição da presente invenção depende das necessidades do paciente e, também, é determinada tendo em conta o que é fisiologicamente aceitável pelo paciente. A quantidade de inibidores na composição da presente invenção pode ser tal permita, por exemplo, a administração de uma dose de inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) de 0,01 a 2 mg/kg de peso corporal e uma dose de inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo de 0,01-40 mg/kg de peso corporal.

De acordo com a invenção, a título de exemplo, na composição da invenção, a proporção do inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo sobre o inibidor da redutase hidroximetilglutaril-coenzima A, ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, pode ser entre 0,01 e 0,2, mais preferencialmente, de 0,05 a 0,35. A quantidade de agente anti-HIV na composição da presente invenção é determinada de uma maneira convencional de acordo com o atual conhecimento do perito no tratamento de pacientes infetados com HIV. Pode ser selecionado, por exemplo, a partir daqueles convencionalmente utilizados em pacientes infetados com HIV.

Exemplos da concentração do agente anti-HIV para cada um dos exemplos de agente anti-HIV descritos aqui em cada mistura ou combinação de agentes anti-HIV aqui descritas, são indicados no dicionário VIDAL (marca registada), por exemplo, edição de 2007. As concentrações indicadas no presente dicionário são, também, aquelas permitidas para os seres humanos. A presente invenção relaciona-se, também, com um método para tratar os efeitos secundários do envelhecimento prematuro e/ou lipodistrofia gerada num doente submetido a um tratamento anti-HIV, o referido método compreendendo a administração duma uma mistura compreendendo, pelo menos, um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) e, pelo menos, um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo. A presente invenção relaciona-se, também, com uma composição da invenção para a sua aplicação como medicamento no tratamento de efeitos secundários do envelhecimento prematuro gerado num paciente por um tratamento anti-HIV.

As condições, as quantidades e as vias de administração podem ser como descrito neste exemplo acima. 0 agente anti-HIV é por exemplo um agente anti-HIV ou de uma combinação, tal como definido acima.

Uma aplicação da mistura dos inibidores acima mencionados como adjuvante do tratamento tendo um efeito iatrogénico, por exemplo, envelhecimento prematuro, incluindo, por exemplo, a aplicação "adjuvante de terapias anti-HIV que compreendem, pelo menos, um anticorpo anti-protéase", que conduz, particularmente, a este efeito iatrogénico. Assim, qualquer tratamento que provoca os efeitos secundários mencionados acima está envolvido neste processo. A presente invenção relaciona-se, também, com uma composição da invenção para a sua aplicação como medicamento no tratamento de efeitos secundários do envelhecimento prematuro gerado num paciente por tratamentos anti-HIV usando um inibidor da protéase ou um inibidor da transcriptase reversa. 0 presente descreve, também, um método de tratamento dum paciente infetado por HIV compreendendo, em qualquer ordem, os passos de: i. administração de uma mistura compreendendo, pelo menos, um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) e, pelo menos, um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo, ii. a administração de um agente anti-HIV, em que as administrações são concomitantes, sucessivas ou alternativas. A presente invenção refere-se, também, a uma composição para a sua aplicação como medicamento no tratamento de HIV, compreendendo, em qualquer ordem, os passos de: i. administração de uma mistura compreendendo, pelo menos, um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA), em que o referido inibidor é uma molécula da familia das estatinas ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis e, pelo menos, um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo, sendo o referido inibidor uma molécula da familia dos aminobifosfonatos (NBP) ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis ii. a administração de um agente anti-HIV, sendo o referido agente anti-HIV um agente inibidor de protéase ou um inibidor da transcriptase reversa, em que as administrações são concomitantes, sucessivas ou alternativas.

De acordo com a invenção, a referida mistura e o referido agente anti-HIV podem ser coadministrados. Como definido acima no processo da invenção.

De acordo com a invenção, o agente anti-HIV pode ser como definido acima.

De acordo com a invenção, pelo menos, uma administração pode ser realizada por via oral ou por injeção. As duas administrações podem ser realizadas do mesmo modo ou de modo diferente.

Em outras palavras, mesmo que na presente descrição seja feita referência a uma composição, entende-se que cada um dos compostos da composição podem ser administrados concomitantemente com outros compostos (por exemplo, numa única composição ou em duas composições ou três composições, cada composição compreendendo um, ou mais, dos compostos acima, o modo de administração de cada composto ou composição podem ser os mesmos ou diferentes), ou independentemente um do outro, por exemplo, sucessivamente, por exemplo, administração independente de um inibidor d redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) , a administração independente de, pelo menos, um inibidor da sintase do pirofosfato de farnesilo e a administração independente de um agente anti-HIV, sendo estas administrações formadas no paciente concomitantemente, sucessivamente, ou alternativamente, por uma ordem que é a acima mencionado ou outra. Estas diferentes administrações podem ser realizadas independentemente umas das outras ou de forma ligada (composição ou coadministração) , com a mesma ou diferente via de administração (injeção, ingestão, aplicação tópica, etc.), ou várias vezes ao dia, durante um ou mais dias, consecutivos ou não. A administração da referida mistura de inibidores pode ser realizada, por exemplo, com uma dose de inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) de 0,01 a 2 mg/ kg de peso corporal com uma dose de inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo de 0,01-40 mg/kg de peso corporal. A administração do agente anti-HIV pode ser realizada como acima indicado. A titulo de exemplo, apenas, as dosagens são descritas na tabela a seguir para a aplicação de um ou outro dos processos definidos acima. Exemplos de quantidades de inibidores e agente anti-HIV numa composição de acordo com a presente invenção pode ser deduzida a partir desta tabela.

De acordo com a invenção, as dosagens para o agente anti-HIV usadas para implementar a presente invenção podem ser aquelas conhecidas pelos peritos na técnica. Podem ser, por exemplo, as dosagens descritas no dicionário VIDAL (marca registada), por exemplo, edição 2007. Para cada um dos exemplos de agente anti-HIV acima descrito e cada mistura ou combinação de agentes HIV descrito acima, encontramos também, no Dicionário VIDAL (marca registada) , por exemplo, edição de 2007, as dosagens utilizáveis para implementar a invenção.

Outras vantagens podem aparecer na técnica após a leitura dos seguintes exemplos, dados para fins ilustrativos e ilustrados pelas figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 ilustra os resultados obtidos no Western Blot nos fibroblastos de controlo "normais" tratados com doses crescentes de uma estatina solúvel em água (pravastatina P, 20 a 100 μΜ) , e um aminobifosfonato (NBP, zoledronato Z 20 a 100 μΜ) (Faixas A a I, respetivamente P20/Z20, P20/Z60, P20/Z100, P60/Z20, P60/Z60, P60/Z100, P100/Z20, P100/Z60, P100/Z100). A faixa J é um controlo positivo da presença da pré-lâmina A (fibroblastos de pacientes DR) , a faixa K é o controlo negativo, tratado com o solvente isoladamente (PBS) . A Figura 2 ilustra os resultados obtidos com a dose eficaz de cada produto. A Figura 3 mostra o efeito superior obtida com a administração dos dois produtos juntos. A Figura 4 mostra a ação da associação dos 2 produtos em células envelhecidas. A Figura 5 mostra a proliferação celular dos fibroblastos, medindo o indice mitótico com base nas condições de cultura de células. O indice mitótico é a razão entre o número de núcleos corados (divididos) em relação ao número total de núcleos do campo observados dependendo de cada tratamento.

Figura 6: Representação esquemática da teoria mitocondrial do envelhecimento, o alvo mitocondrial da terapia antirretroviral. Legenda: NRTI: nucleosideos inibidores da transcriptase reversa, PI: inibidor da protéase, mtDNA: ADN mitocondrial e ROS: espécies reativas de oxigénio

Figura 7: Representação esquemática da via de biossintese de isoprenóides e seus inibidores. - NBP: aminobifosfonato - FTI: inibidor da farnesiltransferase - GGTI: inibidor da transferase de geranil-geranilo

Figura 8: representação esquemática do processamento pós- translacional da pré-lâmina A, a sua importação nuclear e a sua localização no nucleoplasma. a: pré-lâmina A normal b: maturação da pré-lâmina A eliminado na progeria (progerina) ou quando da mutação da protéase ZMPSTE24 na dermopatia restritiva. Os inibidores da protéase do virus da SIDA (PI) inibem ZMPSTE24 NPC: poro nuclear NE: envelope nuclear HGPS: sindrome de progeria de Hutchinson-Gildford RD: dermopatia restritiva

Figura 9: Representação esquemática da teoria de envelhecimento com base em anomalias de lâminas e suas consequências funcionais. Legenda: PI: inibidores de protéases de origem virai.

Figura 10: Western blot mostrando que o bloqueio da prenilação da pré-lâmina A requer tanto a inibição da transferase de farnesilo e da transferase de geranil- geranilo tipo I. Deteção da lâmina A/C em células HeLa tratadas com inibidores da transferase de farnesil e/ou da transferase de geranil-geranilo tipo I. LA = lâmina A, LC = lâmina C, Pre = pré-lâmina A.

Figura 11: Análise de espectrometria de massa de proteínas extraídas a partir do envelope nuclear das células não tratadas (a), de células de pacientes de progeria tratados com FTI (2,5 μΜ, b) ou tratados com a mistura de pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada, c).

Figura 12: Análise por espectrometria de massa da proteína extraída a partir do envelope nuclear dos fibroblastos não tratado (a) ou tratados com a mistura de pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada, b) a partir de ratinhos ZMPSTE24~/~.

Figura 13: A lâmina A (células de controlo) e a pré-lâmina A (células de ratinho ZMPSTE24_/“) foram analisadas por espectrometria de massa (MALDI-TOF) a, b: porções do espectro correspondente aos péptidos trípticos farnesilados (a) e geranil-geranilados (b).

Figura 14: representação de resultados de experiências diferentes que demonstram o efeito sinérgico da combinação de pravastatina + zoledronato na acumulação da pré-lâmina A em células de controlo e pacientes de progeria: (a) deteção imunocitoquímica da lâmina A/C e pré-lâmina A em fibroblastos humanos normais, não tratados, tratados com pravastatina e/ou zoledronato. (b) deteção imunocitoquímica da lâmina A/C e pré-lâmina A em fibroblastos humanos normais e pacientes de progeria tratados com uma combinação de pravastatina + zoledronato. (c) análise quantitativa do efeito do tratamento com zoledronato + pravastatina sobre a morfologia nuclear de células de pacientes de progeria, (d) análise quantitativa do efeito do tratamento com zoledronato + pravastatina sobre a morfologia nuclear de células de pacientes de progeria na presença de farnesol, geranil-geraniol ou ambos os compostos. Barras de erro = média ± erro padrão da média. Escala da barra = 10 ym.

Figura 15: representação dos resultados do tratamento de pravastatina + zoledronato mostrando a correção da morfologia nuclear e a indução de uma deslocalização parcial das isoformas da lâmina A/C e da lâmina BI da lâmina nuclear no nucleoplasma, em células de pacientes de progeria. (A) imunofluorescência e microscopia confocal. As imagens de a a c de cada painel são projeções de intensidade média de 27 imagens da pilha e mostram os túbulos do reticulo nuclear marcado pela calreticulina nas células de progeria incubadas com PBS. Imagens dai: seções confocais isoladas de 0,2 ym de espessura. Efeito do tratamento de zoledronato + pravastatina (g) e (h. (B) Co-localização da lâmina BI e da calreticulina. Barra de escala = 5 ym.

Figura 16: representação do efeito da pravastatina e do zoledronato associados, ou não, na morfologia nuclear de células de ratinho ZMPSTE24~/~ (a) e ratinhos de controlo (b) em cultura na presença de farnesol, geranil-geraniol ou das duas moléculas.

Figura 17: Efeito do tratamento com zoledronato + pravastatina nas anomalias da reparação de quebras de cadeias duplas (DSB) de ADN em células de pacientes de progeria. Imunodeteção de focos de histona H2AX fosforilada detetada 24 h após a irradiação, focos correspondente às quebras de cadeia dupla não reparadas (imagens de topo). Coloração nuclear DAPI (imagens de fundo). Curvas do fundo: alterações no número de focos de histona H2AX fosforilada em função do tempo após a irradiação em células de controlo (quadrados) e de células de progeria (circulo vazio) incubadas com PBS ou tratados com pravastatina + zoledronato. Cada curva representa a média ± erro padrão da média de pelo menos 3 experiências.

Figura 18: efeito do tratamento pravastatina + zoledronato no fenótipo progeróide de ratos ZMPSTE24~/~: (a) fotografias representativas de ratos de 3 meses ZMPSTE24+/+, ZMPSTE24~ /- e ZMPSTE24~/~ tratados com a combinação de pravastatina + zoledronato. Escala da barra = 1 cm. (b) Peso dos ratos com 3 meses ZMPSTE24+/+ (n = 12), ZMPSTE24- /- (n = 13) e ZMPSTE24~ /_ tratados (n = 15) . (c) as curvas de Kaplan-Meier mostram um aumento significativo da vida de ratinhos ZMPSTE24-/- tratados, (d) representação tridimensional - por tomografia computadorizada da tibia de ratos Zmpsfe24~ ~ tratados e não tratados (imagem do topo). 0 painel inferior mostra o volume relativo do osso e o número de trabéculas ósseas em ratinhos ZMPSTE24~/~ não tratados e tratados, (e) quantificação das anomalias nucleares dos hepatócitos dos ratos ZMPSTE24+/+, ZMPSTE24~/~ e ZMPSTE24~ /- tratados. As setas brancas mostram os núcleos anormais. Escala da barra = 10 ym. (f) expressão relativa dos genes alvo da p53 no coração e no figado de ratos ZMPSTE24+/+, ZMPSTE24~/~ e ZMPSTE24~/~ tratados, analisados por RT-PCR quantitativo. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001. As barras de erro representam a média ± erro padrão da média.

Figura 19: Efeito da pravastatina por si só ou zoledronato no tempo de vida dos ratos ZMPSTE24_/~: Curvas de Kaplan-Meier pravastatina isolada (a) e zoledronato isolado (b) em ratinhos Zmpste2~ 1 ~ tratados (diamante vazio ) e não tratados (círculos fechados).

Figura 20: Efeito do tratamento da pravastatina + zoledronato no tempo de vida dos ratos LMNA~ 1 ~. Curvas de Kaplan-Meier de ratos LMNA~/~ tratados com zoledronato + pravastatina (n = 12, diamante vazio) comparada com a de ratos não tratados (círculos fechados, n = 11).

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Efeito aditivo de uma combinação de um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) solúvel em água (uma estatina solúvel em água: pravastatina) e um inibidor da sintase do pirofosfato de farnesilo (um aminobifosfonato: zoledronato) em culturas de células normais e progeróides

A. PROTOCOLOS A.l Células e cultura celular

As linhas de células são quer fibroblastos de controlo AG16409 provenientes do Instituto Coriell quer fibroblastos derivadas de biópsias de pacientes com dermopatia restritiva. São cultivadas a 37°C sob 5% de CO2 em P2 ambiente. 0 meio de cultura completo habitual é - RPMI (Invitrogen) suplementado com - soro de vitelo fetal a 20% (Invitrogen) - 200 mM de L-glutamina (Invitrogen)

Mistura de 1 X Penicilina/Estreptomicina/Fungizona (reserva 100 X, Cambrex) A.2 Colheita das células A colheita de células é realizada por tripsinização como se segue (protocolo para um frasco grande, 75 cm2, BD Falcon): - 0 meio é aspirado; - As células são lavadas com 10 ml de PBS IX (Invitrogen):

Foram adicionados 5 ml de uma solução de tripsina/EDTA IX (Cambrex); - A placa é incubada durante cerca de 6 minutos a 37°C, até as células se destacarem; - A tripsina foi inibida por diluição em 15 ml de meio completo; - As células são sedimentadas por centrifugação 10 min a 1000 rpm a 16°C; - O sedimento foi ressuspenso em 2 ml de IX PBS e re-centrifugado sob as mesmas condições.

As células obtidas são ou congelados para uso posterior ou subcultivadas a partir deste sedimento lavado. A.3 Tratamentos A solução de pravastatina (estatina solúvel em água) utilizada é preparado como se segue: - 40 mg de pravastatina (Sigma Aldrich, P4498) foram tomados em água esterilizada para formar uma solução de reserva a 10 mM.

As concentrações finais testadas foram de 500 nM, 1, 5, 50 e 100 μΜ, obtidas por diluição da solução de reserva em meio completo. A solução de zoledronato (NBP) usada é preparada como se segue: - Uma solução de reserva de ácido (l-hidroxi-2-imidazol-l-il-l-fosfono-etil) fosfónico (0,8 mg/ml, Novartis) é ajustada a uma concentração de 2 mM.

As concentrações testadas finais foram de 500 nM, 1, 5, 50 e 100 μΜ, obtidas por diluição da solução de reserva em meio completo. À.4 Western blot A.4.1 Preparação das Células

Para uma experiência de Western blot, as células são tratadas como se segue: - Aproximadamente 7,5 x 105 células são semeadas num frasco grande e cultivadas nas condições acima mencionadas, até quase confluência (4 dias).

Após 4 dias, as células foram lavadas com PBS IX, e listadas em meio completo suplementado com o tratamento

As células são incubadas no tempo de processamento (de 6 a 72 horas, sequencialmente ou simultaneamente) na incubadora a 37 °C.

No final do tratamento, as células foram tratadas com tripsina (protocolo acima) e o sedimento resultante armazenado a -80°C até à extração da proteína. A.4.2 Extração de proteínas para o Western Blot 0 sedimento de células foi recolhido em 300 μΐ de tampão de lise

Triton X-100 1% SDS 0,1%

Deoxicolato de sódio 0,5%

NaCl 50 mM

EDTA 1 mM

TrisHCl pH 7,4 20 mM

Inibidor da protéase 1 comprimido por 50 (Roche 11697498001) ml

Extemporaneamente acrescentou-se

Ortovanadato de sódio 1 mM PMSF 1 mM

As células são expostas a ultrassons 2 vezes por 30 segundos (Brandson Sonifier Cell Disruptor B15) .

Os detritos celulares foram centrifugados durante 10 min a 10000 rpm, a 4°C. O sobrenadante proteico foi armazenado a -80°C até à sua utilização. O ensaio de proteína é realizada no descongelamento. A.4.3 Western blot Gel

Um gel de acrilamida a 8% é convencionalmente utilizado para detetar várias formas de lâminas A/C

Acrilamida/bisacrilamida 37/1 8%

TrisHCl pH 8,8 375 mM SDS 0,1% APS 0,1% TEMED 0,01%

Um gel de concentração é derramado no gel separativo

Acrilamida / bisacrilamida 37,5/1 3%

Tris-HCl pH 6,8 375 mM SDS 0,1% APS 0,1% TEMED 0,01% A concentração de proteína da amostra é medido, e alíquotas foram ajustadas a 50 yg por tubo em tampão de lise em quantidades de 15 μΐ. 5 μΐ de tampão de carga é adicionado a cada amostra SDS 4%

TrisHCl pH 6,8 100 mM

Glicerol 20% β-mercaptoetanol 20%

Azul de bromofenol vestígios

As amostras são desnaturadas por aquecimento durante 5 min a 95°C e colocadas nas cavidades. A migração tem lugar a 50, em seguida, a 100 volts em tampão

Tris-base 0,3%

Glicina 1,44% SDS 0,1%

Transferência A membrana de transferência (Hybon P, Amersham Biosciences) foi preparado por imersão em etanol, seguido por um banho durante 5 min em água estéril e 10 minutos em tampão de transferência:

Tris-base 12 mM Glicina 96 mM

Etanol 20% O gel é humidificado durante 20 minutos em tampão de transferência, e então a sanduíche é montada (sistema Miniprotean, Biorad). A transferência ocorre geralmente de noite numa sala fria a 10 Volts. A membrana é lavada com PBS IX, retida a humidade, e usada como tal para a deteção. ^ Deteção A membrana foi incubada 1 h à temperatura ambiente numa solução de saturação:

Caseina 10%

Tween 20 0,1%

PBS 1 X

Enxaguada 2 vezes durante 10 minutos em tampão de lavagem (0,1% Tween 20/PBS IX). O anticorpo primário é diluído no tampão de saturação (detalhes e diluição, ver abaixo imunocoloração). A membrana foi incubada com o anticorpo primário durante 1 hora à temperatura ambiente sob agitação.

No final, é lavada 3x com tampão de lavagem, em seguida, lavou-se 3x 15 min com o mesmo tampão. O anticorpo secundário (sistema acoplado com peroxidase, Jackson Immunoresearch) foi diluído a 1/10000 em tampão de saturação. A membrana foi incubada com esta solução durante 30-45 minutos à temperatura ambiente sob agitação.

No final, é lavada 3x com tampão de lavagem, em seguida, lavou-se 3x 15 min com o mesmo tampão. A deteção é efectuada com o kit ECL Plus Western Blotting de Amersham Bioscience, de acordo com as instruções do fabricante.

Após o desenvolvimento, a membrana é exposta sob película Biomax MR (Kodak), o tempo necessário para obter um sinal satisfatório. A.5 Imunomarcação A.5.1 Preparação das Células

Uma cultura de células é tripsinizada, as células contadas sobre células de Neubauer.

Poços de cultura de estilo Labtech (Nunc, Ref. 177399) são semeados a uma taxa de 5x104 células por poço. O meio de cultura completo suplementado por ou com os tratamentos (estatina, NBP, ambos), e as células cultivadas durante o tempo ad hoc.

No final, o meio de cultura é aspirado, os poços removidos. As lâminas são lavadas em PBS IX.

As células são fixadas em solução de paraformaldeido a 4% (em PBS) durante 10 minutos à temperatura ambiente. É realizada lavagem durante 10 min em PBS IX.

As células são desidratadas por banhos sucessivos de 3 minutos, em percentagem crescente de soluções de etanol (70, 90, 100%, sendo este último banho repetido).

Após a secagem, as lâminas são armazenadas a -80°C até à sua utilização. A.5.2 Marcação

Após descongelação, as células são incubadas 5 min à temperatura ambiente numa câmara húmida, em 50 μΐ de uma solução de permeabilização:

PBS 1 X

Triton X-100 0,5% RNS 5% (Soro de coelho normal, Vector S5000)

Inibidor da protéase (Roche 1 comprimido por 50 11697498001) ml 3 banhos de pré-incubação de 15 min cada são realizados em 50 μΐ de solução de incubação:

PBS 1 X RNS 5%

Inibidor da protéase 1 comprimido por 50 ml (Roche 11697498001) 0 anticorpo primário é diluído a l/100e em 50 μΐ de solução de incubação e colocado em contacto com as células durante 1 h à temperatura ambiente numa câmara húmida.

Os anticorpos primários utilizados são de 2 tipos: - Rato anti-lâmina A/C (terminal N), clone 4A7, doação de G. Morris (Oswestry, Reino Unido) - Cabra anti-pré-lâmina A (15 aa extremidade do terminal C), produto SC6214, Santa Cruz Biotechnology, Inc. São realizadas 3 lavagens em 50 μΐ de PBS IX durante 15 minutos cada. A incubação com o anticorpo secundário tem lugar durante 1 h em 50 ml de solução de incubação à temperatura ambiente numa câmara húmida. Os anticorpos secundários são de dois tipos: - Burro anti-rato, Jackson Immunoresearch, diluição de l/100e - Burro anti-cabra, Jackson Immunoresearch, diluição de 1/2 0 0e São realizadas 3 lavagens em 50 μΐ de PBS IX durante 15 minutos cada. A incubação com 100 μΐ solução de DAPI 50 ng/ml (Serva, Ref. 18860) é levada a cabo durante 15 min à temperatura ambiente numa câmara húmida. São realizadas 3 lavagens em PBS IX em tabuleiros de cortador durante 5 min cada.

Uma lavagem final é realizada durante 5 min numa solução 0,1% de Tween 20 em PBS. A. 5.3 Montagem

As células são imersas numa gota de Vectashield (Vector), cobertas com uma lamela e observadas sob um microscópio de fluorescência (Leica DMR, Leica Microsystems), equipado com um sistema de câmara CoolSnap (Princeton).

B. RESULTADOS B.l. Western blot (Figura 1)

Os fibroblastos de controlo "normais" foram tratados com uma estatina solúvel em água (pravastatina P, 20 a 100 μΜ) , e com um aminobifosfonato (NBP zoledronato Z, 20 a 100 μΜ) em combinação (Faixas A a I, respetivamente, P20/Z20, P20/Z60, P20/Z100, P60/Z20, P60/Z60, P60/Z100, P100/Z20, P100/Z60, P100/Z100). O western-blot mostra o "aparecimento" de uma banda correspondente ao tamanho da pré-lâmina A imatura (não-truncada) como uma função do aumento da concentração das duas moléculas, que confirme que a farnesilação é necessária para a maturação de lâmina A. Este resultado mostra que o bloqueio da síntese de farnesilo-PP em 2 pontos da via metabólica é mais eficiente do que o bloqueio de um único ponto sobre a inibição da farnesilação da pré-lâmina A, pelo menos, ex-vivo. B.2. Dose e tempo de resposta em imuno-histoquimica (Figura 2)

As curvas de dose-resposta e do tempo de resposta foram utilizadas para determinar a eficácia máxima medindo 2 parâmetros sobre as células saudáveis de controlo, por um lado, e em células de pacientes HGPS. A combinação pravastatina (solúvel em água)/zoledronato (NBP) mais eficiente foi obtida por administração de 1 mM de pravastatina durante 24 horas, de zoledronato durante 12 horas sobre as células saudáveis. Não foi observada toxicidade. Em células HGPS (células com alterações nucleares), utilizando o mesmo protocolo de dosagem, o número de núcleos "deformados" diminuiu 75-40%. Foi realizada a medição da taxa de pré-lâmina A em células saudáveis. Isto mostrou que a taxa é máxima. B.3. Efeito do tratamento em imuno-histoquimica (Figura 3) A ação combinada da pravastatina e zoledronato, Tratamento: 100 μΜ de pravastatina durante 12 horas, 20 μΜ de zoledronato durante 6 horas, mostra uma maior eficiência, uma vez que a taxa de pré-lâmina A produzida em células saudáveis tratadas (estimada em 35%) é muito superior em associação que se as moléculas são adicionadas isoladamente (respetivamente, 25 e 15%). Além disso, a taxa de núcleos deformados (sinais de toxicidade para as células saudáveis) é minima (inferior a 10%), e menor do que nas células tratadas apenas com pravastatina (cerca de 12%). B.4. Ação sobre células envelhecidas em imuno-histoquimica (Figura 4)

Dependendo do número de "passagens" (Número de transplante de células), portanto, a idade das células, a proporção de núcleos anormais aumenta. Esta característica é típica de células HGPS não tratadas. Se se tratar as células HGPS com 1 μΜ de pravastatina durante 24 horas e 1 μΜ de zoledronato durante 12 horas, esta proporção é mantida, e diminui mesmo um pouco (menos de 40% contra 80% nas células tratadas com o placebo). B.5. Conclusão A combinação de pravastatina/zoledronato é eficaz em doses para as quais quase nenhum efeito é observado com as moléculas administradas separadamente. O efeito fisiológico de bloqueio do canal de prenilação é portanto obtido com doses muito inferiores aquelas utilizadas em tratamento único em artigos publicados sobre as culturas de células (Kusuyama &amp; al., 2006 (27), 10 μΜ de pravastatina por si só sobre progenitores das células vasculares. Flint et al 1997 (13), 25 μΜ de pravastatina por si só em células musculares de ratos neonatais). EXEMPLO 2: Efeito de uma composição de acordo com a invenção compreendendo um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) solúvel em água e um inibidor da sintetase de pirofosfato de farnesilo na divisão de fibroblastos humanos idosos e sobre fibroblastos humanos jovens

A. FINALIDADE DO EXEMPLO

No presente exemplo, a avaliação do efeito in vitro de uma composição de acordo com a invenção compreendendo um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) solúvel em água e um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo sobre a taxa de divisão celular (indice mitótico) dos fibroblastos. Uma comparação do efeito da composição em fibroblastos humanos idosos relativamente aos fibroblastos humanos jovens, também, foi realizada. 0 número de ativos utilizados nesta experiência é de quatro, os produtos foram utilizados em combinações dois a dois. Os ativos utilizados são: AI: zolendronato A2: Alendronato Bl: Pravastatina B2 : Sinvastatina

As associações especificas que foram utilizadas neste exemplo são os seguintes: A1B1, A1B2, A2B1, A2B2.

B. PROTOCOLO

Neste exemplo, dois lotes de fibroblastos, fibroblastos idosos (número do lote: 9052) e jovens (número do lote: 7080) foram cultivadas em meio RPMI (Invitrogen) contendo 10% de soro fetal de vitelo sem antibióticos por 24 horas após tripsinização das caixas fornecidas.

Os diferentes ativos foram adicionados a uma concentração de 1 μΜ final cada durante 24 horas (foi feita 1000 de diluição a partir de uma solução de reserva em água para os compostos Al, A2 e Bl, ou em etanol a 100% para o composto B2). O indice mitótico foi avaliada por incorporação de bromo-desoxi-uridina (BrdU) em 45 minutos depois de 24 h de incubação das células com uma das combinações de ativos. Uma revelação imuno-histoquímica permitiu revelar as células em fase de síntese de ADN (células em pré-divisão). Foi realizada uma coloração dos núcleos (material genético) por incorporação de diamino fenilo indole (DAPI). A avaliação de 6 campos microscópicos (Olympus IX 70) permitiu a medida do índice mitótico por análise de imagem (Olympus Analysis). O índice mitótico é a proporção entre o número de núcleos que tinham incorporado BrdU e o número de núcleos com DAPI incorporado. Um índice de média está estatisticamente calculado com um desvio padrão (DP) de 0,005-0,061.

Um teste de Student bilateral foi usado para medir a significância estatística dos resultados.

C. RESULTADOS C.l. Observação visual geral das células

Estes resultados demonstram uma capacidade muito baixa para a divisão de fibroblastos envelhecidos, na ausência de qualquer tratamento, antes do estudo.

Os fibroblastos jovens mostraram uma capacidade de divisão mais elevada do que os fibroblastos envelhecidos. A capacidade de divisão dos fibroblastos envelhecidos era inferior a 5%, enquanto a capacidade de divisão dos fibroblastos jovens foi de 15,6%. A diferença de capacidade de divisão entre os fibroblastos envelhecidos não tratados e os fibroblastos jovens não tratados foi, portanto, igual a 3.

Durante a realização deste exemplo, não foi observada nenhuma toxicidade visualmente após 24 horas de incubação dos fibroblastos com as combinações de ativos testados.

Na forma de realização deste exemplo, não se observou efeitos tóxicos do etanol (0,1% final) depois de 24 horas de incubação. D. AVALIAÇÃO DO ÍNDICE MITÓTICO (Figura 5)

Em geral, o número de fibroblastos envelhecidos sem qualquer tratamento em fase de síntese de ADN foi extremamente baixo: menor do que 5% (ver Figura 5, coluna 1). 0 índice mitótico não foi muito alto para fibroblastos jovens: cerca de 15% (ver Figura 5, na coluna 6).

Em comparação com os fibroblastos envelhecidos de controlo sem qualquer tratamento, os fibroblastos de controlo expostos ao etanol (0,1% - 24 h) não mostram uma diferença significativa (p = 0,11, n = 6) do seu índice mitótico. Os valores foram então agrupados (controlo, n = 12) .

Os resultados apresentados na Figura 5, coluna 2, mostram, sobre o índice mitótico de fibroblastos envelhecidos um efeito ativador de A1B1 - zolendronato-pravastatina versus controlo (estimulação por um fator de 2 máximo) (p <0,001, n> 6) .

Este exemplo mostra que, por conseguinte, a aplicação da combinação zolendronato-Pravastatina tem um efeito ativador na divisão celular de fibroblastos envelhecidos.

Exemplo 3: Efeito da combinação de um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) solúvel em água e um inibidor da sintetase de pirofosfato de farnesilo num modelo de ratinho possuindo toma síndrome progeróide

Os ratinhos KO Zmpste24-/ usados aqui são os descritos no artigo citado por Varela et al. 2005 (49). A prova da eficácia da combinação de duas moléculas (pravastatina e zoledronato) foi feita em colaboração com um laboratório espanhol (Pr C. Lopez-Otin) . A eficácia é obtida em doses combinadas que não têm efeito quando os produtos são utilizados separadamente, mostrando um efeito aditivo.

As 2 moléculas (ácido zoledrónico (Zometa (marca comercial)) 100 yg /kg/dia e pravastatina de 100 mg/kg/dia) foram diluída em IX PBS e injetadas por via intraperitoneal diariamente em ratinhos com 1 mês de idade e até à sua morte. Os controlos são de ratos selvagens da mesma idade, tratados apenas com IX PBS. A sobrevivência dos animais tratados foi muito melhorada, sendo máxima, particularmente, para as fêmeas, com uma vida média mais longa de cerca de 80%. Os sintomas clínicos da doença são muito reduzidos em comparação com os indivíduos tratados apenas com PBS. Em particular, observou-se um efeito do tratamento sobre a pele e crescimento do pelo destes ratos em comparação com os ratinhos tratados com PBS, que mostraram grandes áreas calvas. EXEMPLO 4: Efeitos da combinação de um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) solúvel em água e um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo em extratos de pele humana ex vivo. A. Protocolo

Neste exemplo, os testes são realizados na pele de um dador com cerca de 60 anos. É feita a preparação de 21 explantes de pele humana e posta em sobrevivência em meio BEM (BIO-EC's Explants Medium).

Os explantes foram divididos em três lotes de seis explantes e um lote de controlo T0, como segue: - TO Controlo plastia: 3 explantes - T Controlo não tratado: 6 explantes - R controlo positivo: 6 explantes - P explantes tratados com a composição da invenção: 6 explantes A.1. tratamento 0 tratamento é realizado em dias diferentes, no primeiro dia (dia 0), 2 horas após a preparação dos explantes, e, em seguida, a D + 1 dia, D + 2 dias, D + 4 dias, D + 6 dias, D + 8 dias e D10 + dias.

Os produtos são aplicados sobre os explantes como se segue: - T os explantes não recebem tratamento, - R os explantes recebem cada um no DO, D+2eD+4, 1 mg do controlo positivo (creme retinol) - PI os explantes recebem cada um o tratamento de 2 mg do produto P, O tratamento é efetuado por aplicação tópica da composição da invenção. A composição é então espalhada sobre toda a superfície do explante, usando uma espátula. A metade do meio de cultura é renovada a cada dois dias e os explantes foram postos em sobrevivência a 37°C numa atmosfera húmida enriquecida com 5% de CO2. A.2. Amostragem para histologia

No DO, são tomados os 3 explantes do lote TO. A D + 6 dias e D + 11 dias, 3 explantes de cada lote são recolhidos. As amostras são cortadas ao meio, uma metade é fixada em formalina e a outra metade é congelada a -80°C, de acordo com o procedimento de BIO-CE "P006-PPEH". B. Estudo histológico

Após 24 horas de fixação em formalina, as amostras foram secas, impregnadas e revestidas em parafina. Foram realizadas secções de 5 ym para observação morfológica. B.l. Primeiro passo: estudo morfológico 0 estudo morfológico das estruturas epidérmicas e dérmicas é realizado em secções coradas com tricromo de Masson, variante Goldner. B.2. Segundo passo: B.2.1 imunomarcação de Ki67: A imunocoloração de células em mitose é realizada em secções congeladas com anticorpo policlonal anti-Ki-67 (Novo Castra) revelado em DAB. As células positivas são contadas ao longo de todo o comprimento e a média epidérmica reduziu o número de células marcadas por cm. B.2.2 Imunocoloração de colagénio I: A imunocoloração de colagénio I será conduzida em secções congeladas com anticorpo policlonal anti-colagénio I revelado em FITC. Os núcleos são contra-corados com iodeto de propidio. B.2.3 Imunomarcação de colagénio III: A imunocoloração de colagénio III é levada a cabo em secções congeladas com anticorpo policlonal anti-colagénio III revelado em DAB. Os núcleos são contra-corados com hemalun de Masson. B.2.4 Imunocoloração de colagénio IV: A imunocoloração de colagénio IV é realizada em secções congeladas com anticorpo policlonal anti-colagénio IV (Cliniscience) revelado em FITC. Os núcleos são contra-corados com iodeto de propidio. B.2.5 Imunocoloração de colagénio VII: A imunocoloração de colagénio VII é realizada em secções congeladas com anticorpo monoclonal anti-colagénio VII revelado em FITC. Os núcleos são contra-coradas com iodeto de propidio. B.2.6 Imunocolaração de PECAM1: A visualização de células endoteliais é conseguida através de imunocoloração de PECAM-1, realizada em secções congeladas com o anticorpo monoclonal anti-PECAM-1 revelado em Fast-vermelho. EXEMPLO 5: Efeito da combinação de um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) solúvel em água e um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo em culturas in vitro de células constitutivas da pele

Este exemplo é realizado com as mesmas combinações de ativos presentes no Exemplo 2 acima. Estas diferentes combinações de ativos são utilizadas in vitro para avaliar o seu efeito sobre os parâmetros fisiológicos envolvidos no envelhecimento da pele.

As combinações utilizadas no presente exemplo são A1B1, A1B2, A2B1, A2B2, respetivamente. Estas quatro combinações são testadas em várias concentrações, as experiências são realizados em triplicado (representando pelo menos 36 pontos experimentais). São propostas pelo requerente as concentrações de 4 combinações e, por isso, não está prevista nesta fase o estudo (exceto como simples controlo) da citotoxicidade in vitro. A experiência foi realizada em culturas de células de fibroblastos, tal como apresentado no exemplo 1. Este teste também é aplicado a culturas de queratinócitos. Os seguintes parâmetros são examinados para as 4 combinações de ativos nas concentrações indicadas. - Medição do índice mitótico. - Medição da remodelação da matriz extracelular por contração do colagénio reticulado. - Medição da reparação do ADN genómico após a irradiação com UVB (stress foto induzido aproximando as condições de banhos de sol) A medição do índice mitótico é realizado após a exposição das células aos ativos durante uma única vez. 0 índice é medido por contagem de análise de imagens dos núcleos de células que tem incorporado um análogo da timidina tornada fluorescente, sobre o número de núcleos totais. Vários campos são analisados. As fotos são arquivadas para iconografia. A remodelação da matriz extracelular induzida por fibroblastos expostos ao ativo é avaliada pela incorporação dessas células em treliças de colagénio e quantificando a sua capacidade de retratar essas treliças. A avaliação da superfície retraída dá um índice de remodelação. As fotos são arquivadas para iconografia. A medição da reparação do ADN genómico é realizada após a irradiação das células com uma dose de UV-B que imita as condições de uma queimadura solar. Prevê-se, em primeiro lugar, avaliar o efeito do agente ativo de reparação de ADN durante a cinética de 3 dias. A quantificação é realizada por análise de deteção e imagem de dímeros de ciclobutano de pirimidina induzidos pela radiação UVB usando uma técnica de imuno-histoquímica.

As fotos são arquivadas para iconografia.

Exemplo 6: Objetivo principal: a medição do impacto do virus HIV e das terapias antirretrovirais em marcadores nucleares, mitocondriais e citosólicos do envelhecimento celular - Objetivos secundários

- Analisar a prevalência de alterações de funções nucleares, mitocondriais e citosólicas em pacientes infetados com HIV - Medir o impacto do aparecimento destas anomalias - Analisar o tipo e a frequência destas anormalidades de acordo com a duração da exposição aos antirretrovirais, em geral, por classe e por moléculas (duração total de exposição). - Analisar o tipo e a frequência destas anormalidades de acordo com a carga viral do HIV intracelular - Analisar o tipo e a frequência destas anormalidades de

acordo com o prazo de rastreio da infeção pelo HIV

A. PLANO EXPERIMENTAL - Escolha do plano experimental

Este estudo observacional incluiu três grupos de pacientes: - Grupo A: pacientes infetados com HIV-1 sem tratamento antirretroviral

Grupo B: pacientes infetados com HIV-1 em terapia antirretroviral por, pelo menos, 12 meses. - Grupo C: controlos seronegativos para o HIV divididos por idade e sexo. B. CRITÉRIOS DE ELEGIBILIDADE: - Critérios de inclusão: - idade> 18 anos e <65 anos: - assinatura dum termo de consentimento informado - seropositivos para o HIV confirmado por Elisa e Western Blott por, pelo menos, 5 anos - seronegativos para o HIV-2

Sem nunca terem recebido terapia antirretroviral ou tratamento de primeira linha por, pelo menos, 12 meses. - Critérios não-inclusão: - idade <18 anos e> 65 anos - não assinatura do termo de consentimento informado - seropositivos para o HIV-2 - doentes tratados com estatinas ou aminobifosfonados - tratamentos concomitantes não autorizados: testosterona, tratamento de diabetes dependente de insulina

C. CURSO DO ESTUDO - Número de pacientes avaliados: 200 pacientes, incluindo: - Grupo A: n = 50 - Grupo B: n = 100 - Grupo C: n = 50

Os pacientes do grupo A necessitam, durante a sua monitorização, a iniciação da terapia antirretroviral tendo uma avaliação adicional no inicio da terapia e sendo analisados a partir dessa data com os pacientes do grupo B.

Os dados medidos, durante o período em que foram incluídos no grupo A, permitiu determinar o possível papel direto do vírus HIV nas funções nucleares e mitocondriais.

Os pacientes do grupo B que necessitem duma mudança de tratamento antirretroviral durante o estudo, têm uma avaliação clínica e paraclínica idêntica às previstas na monitorização aquando da mudança de tratamento. Os dados de monitorização desses pacientes são tidos em conta para calcular a incidência de perturbações das funções nucleares e mitocondriais observadas em pacientes expostos aos antirretrovirais. - Duração do estudo: A duração do estudo é de 36 meses

Para pacientes dos Grupos A e B - História da infeção pelo HIV:

- Data do diagnóstico da infeção pelo HIV - Modo de contaminação

- Estágio CDC - Para os estágios C: diagnóstico da afeção classificada

como SIDA - Tratamentos antirretrovirais em curso (data de introdução, moléculas administradas) - Exame clínico: - Peso, altura, índice de massa corporal - circunferência da cintura, circunferência da anca, cálculo da relação cintura/anca - Exame de sangue:

Medição da carga viral do HIV (limite de deteção de 40 cópias/ml) - Determinação de taxas de CD4 e CD8

- Glicemia, insulina, cálculo de HOMA

- Colesterol total, LDL, colesterol HDL - Triglicéridos - Amostragem de 3 tubos EDTA de 7,5 ml para análise de funções nucleares e mitocondriais, medição de ADN proviral do HIV e banco de células

Análise de proteínas nucleares, mitocondriais e citosólicas alvo dos antirretrovirais: - Western blot e imunocolorações: - Produção de ΝΓΠΒ e IDB como testemunhas da atividade do proteassoma - Maturação das lâminas A e B, modelos de proteínas nucleares - Produção de isoformas de SREBP e a sua importação nuclear - N- e O-glicosilação de CD36 purificada e desglicosilada (± 30 kDa açúcares) (Abeam) - Importação para a mitocôndria de Hsp70 com um sinal de endereço clivado, como uma medida da atividade mitocondrial das protéases (Abeam) - Funções "respiratórias" mitocondriais: produção de ROS, estudo das subunidades II e IV do citocromo oxidase (Molecular Probes) A busca de uma possível suscetibilidade ao tratamento antirretroviral é realizada por genotipagem de certos alvos, como tem sido demonstrado para a sensibilidade da protéase virai para PI (Baxter et al., 2006): - ZMPSTE24 e Reel envolvidos na maturação das pré-lâminas A e B1/B2 (rotineiramente no Laboratório de Genética Molecular). - As protéases Sl-P e S2-P permitem a produção do domínio de SREBP ativo sobre a transcrição de genes do metabolismo lipídico - portadores mitocondriais dos desoxinucleósidos

Para o grupo de controlo C: - Exame clinico: - Peso, altura, índice de massa corporal - Circunferência da cintura, circunferência da anca, cálculo da relação cintura/anca - Amostragem de 3 tubos EDTA de 7,5 ml para a análise de proteínas nucleares, mitocondriais e citosólicas e aplicação no banco de ADN, banco de células

Visitas de acompanhamento A avaliação inclui: - Um exame clínico: - Peso, altura, índice de massa corporal - Circunferência da cintura, circunferência da anca, cálculo da relação cintura/anca - Um exame de sangue: - Medição da carga viral do HIV (limite de deteção: 40 cópias/ml) - Determinação de taxas de CD4 e CD8 - Glicemia, insulina, cálculo de ΗΟΜΔ

- Colesterol total, LDL, colesterol HDL - Triglicéridos - Amostragem de 3 tubos EDTA de 7,5 ml para a análise de proteínas nucleares, mitocondriais e citosólicas, medida do ADN proviral do HIV e definindo um banco de ADN, banco de células

Análise de proteínas nucleares, mitocondriais e citosólicas e metas antirretrovirais (ver acima)

Para os pacientes do Grupo A:

Pacientes que necessitam de iniciar o tratamento antirretroviral tem avaliação clínica e paraclínica idêntica à prevista no âmbito do acompanhamento no início do tratamento. Dados de monitorização destes pacientes foram analisados a partir dessa data, no grupo de pacientes tratados (grupo B).

Para os pacientes do Grupo B:

Em caso de mudança de tratamento antirretroviral durante o estudo, é realizada uma avaliação clínica e paraclinica idêntica às realizadas no follow-up aquando da mudança de tratamento. Dados de monitorização desses pacientes são tidos em conta para calcular a incidência de interrupções das funções nucleares e mitocondriais observados em pacientes expostos aos antirretrovirais. D. Resultados esperados, perspetivas

Confirmar in vivo, em pacientes infetados com o virus da SIDA e submetidos a terapia antirretroviral, os resultados in vitro em culturas de células: estes tratamentos, em particular, os inibidores da protéase induzem o envelhecimento acelerado de acordo com os mesmos mecanismos das laminopatias genéticos (com produção da pré-lâmina A farnesilada ou progerina) ou envelhecimento "fisiológico" (com a produção de progerina). A hipótese de que a combinação de fármacos (estatinas) e aminobifosfonatos utilizada na progeria poderia ser utilizada para combater o envelhecimento acelerado de pacientes infetados com o virus da SIDA e submetidos a tratamento antirretroviral permitindo o estabelecimento dum ensaio terapêutico.

Exemplo 7: Um tratamento associando uma estatina e um aminobifosfonato aumenta o tempo de vida de um modelo de rato reproduzindo uma sindrome humana de envelhecimento prematuro.

Este exemplo também é publicada em Varela et al, Nature Medicine 2008, 7, 767 (54a).

Materiais e Métodos Rato:

Foi descrita a produção de ratos ZMPSTE24~ e LMNA~f~ (Pendas et al., 2002 (38); Sullivan et al., 1999 (285). A tomografia computadorizada óssea do rato foi realizada utilizando um sistema micro-CT Skyscan 1172 (SkyScan - marca comercial)). Todas as experiências em ratos obedecem às normas expedidas pela Comissão de Experimentação Animal da Universidade de Oviedo (Espanha). A pravastatina (100 mg/kg/dia) e o zoledronato (100 mg/kg/dia) diluídos em PBS foram administrados aos ratinhos diariamente. Os ratinhos que receberam o tratamento pravastatina-zoledronato ou ratinhos de controlo que receberam apenas PBS não mostram nenhum dano aparente ou stress.

Cultura de células

Os fibroblastos dérmicos de um sujeito de controlo (GM00038) e pacientes com progeria e portadores da mutação G608G (AG11498 e AG01972) foram obtidos a partir do Repositório celular Coriell. As células HeLa a partir da American Type Culture Collection. As células são cultivadas em DMEM (Gibco) suplementado com 10% FBS (Gibco) e 1% de antibiótico antimicótico (Gibco). Os fibroblastos derivados de caudas de ratos com idade de 12 dias (Varela et al., 2005) . A concentração e a duração do tratamento com estatina e aminobifosfonato são indicados na legenda da figura. Quando do tratamento combinado com estatina + aminobifosfonato na presença de farnesol e/ou geranil-geraniol, 1 mM de pravastatina e 1 mM zoledronato foram adicionados ao meio de cultura com concentrações crescentes de farnesol e/ou geranil-geraniol. A percentagem de núcleos anormais é medida 48 horas após o início do tratamento.

Imunocitoquimica

Os fibroblastos são cultivadas em câmaras Lab Tek (Nunc Nalgen International), lavados em PBS, depois fixados em paraf ormaldeído a 4% durante 15 min. As células foram desidratadas em banhos de etanol em concentrações crescentes e são permeabilizadas durante 5 min a 2° C em PBS contendo Triton X-100 (0,5%), 5% de soro (coelho ou cabra). As lâminas foram pré-incubadas a 25°C em PBS durante 5 min. A diluição dos anticorpos primários foi de 1:100 para anticorpo policlonal de cabra anti-pré-lâmina A (SC-6214, Santa Cruz Biotechnology), 1:40 para o anticorpo anti-lâmina A/C (4A7 fornecida por G. Morris), 1:200 para o anticorpo de coelho anti-calreticulina (Stressgen) e 1:100 para o anticorpo anti-lâmina BI (Abeam). Após lavagem em PBS, as lâminas são incubadas lha 25°C com anticorpo secundário diluido na solução de incubação. A diluição do anticorpo secundário é a seguinte: 1:100 de IgG de burro anti-rato acoplada com FITC (Jackson ImmunoResearch), 1:400 de IgG de burro anti-cabra acoplado a Alexa 488, 1 : 800 para a IgG anti-cabra de burro acoplado a Alexa 568 (Molecular Probes) e 1:100 de IgG de burro anti-coelho acoplado ao isotiocianato de tetrametilrodamina (Sigma). As células são então lavadas, os núcleos corados durante 15 min a 25°C com DAPI (100 ng/mL, Sigma-Aldrich), e, finalmente, lavadas 3 vezes com PBS contendo 0,5% de Tween 20. As lâminas são montadas em Vectashield (Vector). As imagens digitais são gravados com um microscópio Leica DMR equipado com uma câmara CoolSnap ou com um microscópio confocal Leica TCS SP5. Os núcleos são observados nas células após marcação da lâmina A/C. Mais de 100 núcleos foram analisados em fibroblastos de controlo para cada tratamento. O número de núcleos de pacientes com células de progeria analisados é de 250 (passagem 8), 198 (passagem 13) e 150 (passagem 20).

Irradiação X e estudo da histona H2AX fosforilada

As células de pacientes de progeria e as células de controlo 1 BR3 são irradiadas com um equipamento Philips X. O feixe de raios X é produzida por um ânodo de tungsténio sujeito a uma tensão de 200 kV, com uma corrente de 20 mA com um filtro de cobre de 0,1 mm de diâmetro. A taxa de dose é 1,243 Gy/min. A histona H2AX fosforilada é detetada com anticorpos que reconhecem especificamente a serina 139 fosforilada (Upstate Biotechnology-Euromedex Mundolsheim, França) diluida a 1:800 e anticorpos anti-rato conjugados com FITC (1:100, Sigma-Aldrich). 0 número de quebras de cadeias duplas (DSB) em função da duração da reparação foi ajustado com a fórmula Nt = NO (1/1 + βί)“, onde α e β são parâmetros ajustáveis e Nt e NO o número de DSB no tempo t e no tempo 0.

Western blot

As células foram homogeneizadas no seguinte meio: 50 mM de Tris (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 50 mM de NaF, 1 mM de ditiotreitol, 2 mg/ml de pepstatina A, na presença de inibidores de protéase (cocktail inibidor completo, Roche) e inibidores de fosfatase (cocktail inibidor de fosfatase I e II, Sigma). Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose bloqueadas com 5% de leite em pó sem gordura, utilizando tampão de TBS-T (20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM de NaCl e 0,05% de Tween 20), e incubou-se durante 1 hora quer com um anticorpo anti-lâmina A/C especifica (4A7, 1:500) ou uma anti-lâmina A especifica (C20, Santa Cruz Biotechnology, 1:250) ou uma actina anti-beta (A5441, Sigma, 1:5000). Os anticorpos foram diluídos em TBS-T contendo 3% de leite em pó sem gordura. As membranas são então incubadas com um anticorpo acoplado a peroxidase (cabra anti-ratinho ou anti-coelho, Jackson ImmunoResearch) em TBS-T contendo 1,5% de leite em pó sem gordura, em seguida, lavou-se e, finalmente, revelou-se por quimioluminescência (substrato de HRP Immobilon quimioluminescente Western, Millipore - marca registada).

Análise por espectrometria de massa

Os fibroblastos de ratinhos de controlo ZMPSTE24~/~ e as células linfoblastóides de pacientes de progeria foram homogeneizados, os núcleos isolados por ultracentrifugação e as proteínas nucleares obtidos como descrito em Blobel e Potter, VR Nuclei from rat liver: isolation method that combines purity with high yield, Science 154, 1662-1665, 1966. As proteínas da lâmina nuclear foram separadas por SDS-PAGE e as bandas contendo a lâmina A, a pré-lâmina A e a progerina foram excisadas. Os fragmentos do gel foram lavados duas vezes com 180 ml de uma mistura de bicarbonatelacetonitrilo de amónio (70:30, 25 mm), secou-se (15 min, 90°C) e digeriu-se (1 h, 60°C) com tripsina (12 ng/mL, Promega) em 25 mM de bicarbonato de amónio. Numa experiência típica, 1 ml de CHCA (acido a-ciano-4-hidroxicinâmico, Waters) é colocada num espectrómetro de MALDI-TOF. Uma vez seca, 1 ml da solução de péptido e 1 ml de matriz (CHCA) são colocados no espectrómetro equipado com uma fonte de laser (Voyager-DE STR (marca registada), Applied Biosystems). Os dados recolhidos de 200 disparos de laser produzem espectros analisados com o programa Data Explorer (versão 4.0.0.0, Applied Biosystems). PCR quantitativa em tempo real O nível de expressão de genes alvo de p53 (ATF3,

Gadd45g e CDKN1A, que codificam p21) foi medida com o PRISM 7900HT Sequence Detection System ABI (Applied Biosystems).

Análise estatística A diferença entre os diferentes grupos de ratinhos e células, tratados ou não, foi analisada utilizando o teste de Student. Os cálculos foram realizados utilizando o programa Microsoft Excel. Os dados são expressos como média ± erro padrão da média (SEM).

Resultados

As células HeLa são cultivadas na presença de inibidores da transferase de farnesilo (FTI-277, Sigma-Aldrich) e/ou de transferase de geranil-geranilo tipo I (GGTI-2147, Sigma-Aldrich) nas concentrações indicadas. Apenas a combinação de dois inibidores leva a acumulação nas células de uma grande quantidade de pré-lâmina A não prenilado em relação ao efeito de cada inibidor sozinho.

Estes resultados são mostrados na Figura 10, que é uma fotografia de Western blot que mostra a deteção a partir da lâmina A/C em células HeLa tratadas com inibidores da transferase de farnesilo e/ou da transferase de geranil-geranilo tipo I. LA = lâmina A, LC = lâmina C, Pre = pré-lâmina A.

Estes resultados confirmam que o bloqueio da prenilação da pré-lâmina A requer tanto a inibição da transferase de farnesilo como a transferase de geranil-geranilo tipo I, de acordo com a presente invenção. O inibidor da transferase de farnesilo (FTI) induz a geranil-geranilação compensatória da progerina (em células de pacientes com progeria) e em fibroblastos de rato ZMPSTE24~!~ A análise por espectrometria de massa mostra, como esperado, a presença de péptidos tripticos da pré-lâmina A farnesilada e carboximetilada em células de ratinho ZMPSTE24~/~, mas não em células de ratinhos de controlo. Estes resultados são mostrados na Figura 13a. 0 péptido farnesilado carece dos 3 residuos SIM indicando que ZMPSTE24 não é essencial para a primeira clivagem durante a maturação da pré-lâmina A. Uma diminuição na quantidade da pré-lâmina A farnesilada é observada em células de ratinho tratado com FTI. Quando se observa a porção do espectro correspondente aos péptidos geranil-geranilados, nenhum péptido derivado da pré-lâmina A poderia ser detetado em células de ratinho ZMPSTE24~/~ não tratado. Mas um péptido cuja massa é compatível com um fragmento geranil-geranilado das pré-lâminas A é detetado após o tratamento com FTI. Estes resultados são mostrados na Figura 13b.

Nas células de pacientes de progeria, os péptidos correspondentes à progerina farnesilada e carboximetilada são detetados na ausência de qualquer tratamento, como mostrado na Figura 11a. 0 tratamento destas células com FTI-127 provoca o aparecimento de péptidos cuja massa corresponde à de péptidos geranil-geranilados da progerina, como pode ser visto na Figura 11b. 0 conjunto destes dados mostra que a progerina e a pré-lâmina A são geranil-geraniladas alternativamente, como resultado da FTI e fornece uma explicação para a baixa eficiência dos tratamentos FTI em modelos de ratinhos com sindrome progeróide.

As células de pacientes de progeria e ratinhos ZMPSTE24~ foram utilizados para avaliar estratégias terapêuticas para evitar a prenilação cruzada da pré-lâmina A e da progerina. A nossa hipótese é que a farnesilação de variantes anormais da lâmina A pode ser inibida por fármacos que atuam no caminho da biossintese do pirofosfato de farnesilo, substrato da transferase de farnesilo e precursor do pirofosfato de geranil-geranilo, substrato da transferase de geranil-geranilo tipo I. Assim, testou-se o efeito dos dois fármacos, uma estatina e um aminobifosfonato, conhecidos por agir em duas etapas desta via, em células de pacientes de progeria. A análise por espectrometria de massa mostra que a pravastatina (estatina) e o zoledronato (aminobifosfonato) provoca o aparecimento de um péptido correspondente ao terminal C não prenilado da progerina, péptido não detetável em células tratadas por FTI, enquanto que nem os péptidos farnesilados nem os péptidos geranil-geranilados são detetados, tal como é mostrado na Figura 11c). 0 tratamento com estatina + aminobifosfonato inibe bem a prenilação da progerina. 0 mesmo foi feito para as pré-lâminas A, tal como mostrado na Figura 12. 0 seu péptido do terminal C, não prenilado, é detetado nas células tratadas com a mistura de estatina + aminobifosfonato, enquanto está ausente das células não tratadas, nas quais se encontra o peptídeo farnesilado e carboximetilado. Finalmente, o tratamento pravastatina + zoledronato não aparece na pré-lâmina A geranil-geranilada, ao contrário do FTI.

Legenda da Figura 13: A lâmina A (células de controlo) e pré-lâmina A (células de ratinho ZMPSTE24~/~) foram analisadas por espectrometria de massa (MALDI-TOF). a, b: porções do espectro correspondente aos péptidos tripticos farnesilados (a) e geranil-geranilados (b) . Cada pico é marcado com a massa teórica (entre parêntesis) do péptido derivado a partir da digestão com tripsina da lâmina A ou da pré-lâmina A. 0 número residuo é gravado em azul. A sequência dos péptidos e a sua massa estão marcadas a vermelho. Farn = farnesilado; CM = carboximetilado; Ger = geranil-geranilado.

Legenda da Figura 11: A análise por espectrometria de massa das proteínas extraídas do envelope nuclear a partir de células não tratadas (a) de células de pacientes de progeria tratados com o FTI (2,5 μΜ, b) ou tratados com a mistura de pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada, c) . A porção do espectro correspondente às proteínas não modificadas, farnesiladas e geranil-geraniladas é mostrado na parte superior, média e inferior da figura. Cada pico corresponde ao péptido tríptico da progerina e é marcada com a massa monoisotópica medida na experiência e pela massa teórica (entre parêntesis) . 0 número de resíduos de aminoácidos está indicada a azul. A sequência dos péptidos e a sua massa estão marcadas a vermelho. A progerina é predominantemente farnesilada (F) e carboximetilada (Cm) em células não tratadas (a, painel central), enquanto sob a influência do FTI este pico é muito reduzido e a progerina aparece geranil-geranilada e fosforilada (b, painel inferior). Depois do tratamento de pravastatina + zoledronato, a progerina não modificada é a forma predominante.

Legenda da Figura 12: Análise por espectrometria de massa das proteínas extraídas do envelope nuclear dos fibroblastos não tratados (a) ou tratados com a mistura de pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada, b) a partir de ratinhos ZMPSTE24-/_. A porção do espectro correspondente à proteína não modificada, farnesiladas e geranil-geraniladas, é mostrada na parte superior, média e inferior da figura. Cada pico corresponde ao péptido tríptico da progerina e é marcado com a massa monoisotópica medida na experiência e com a massa teórica (entre parêntesis). 0 número de resíduos de aminoácidos é designada a azul. A sequência dos péptidos e a sua massa estão marcadas a vermelho.

Nesta figura, vemos que pré-lâmina A é, predominantemente, farnesilada (F) e carboximetilada (Cm) em células não tratadas (a, painel central), enquanto as formas não modificadas ou geranil-geraniladas não são detetadas. Após o tratamento com a pravastatina + zoledronato, os péptidos prenilados já não são detetáveis e a forma não modificada da pré-lâmina A é predominante (b, painel superior). O tratamento com pravastatina + zoledronato corrige anormalidades nucleares das células do paciente de progeria e de rato ZMPSTE24~/~ na cultura, e restaura, em parte, os mecanismos de reparação de lesões de ADN induzidos pela radiação X (Figuras 14, 15, 16 e 17 ). 0 tratamento com pravastatina + zoledronato provoca o aparecimento da pré-lâmina A no núcleo de células de controlo (Fig. 14a) , como no núcleo das células de pacientes de progeria, mas com uma melhoria significativa da morfologia nuclear neste último (Fig. 14b) . A análise quantitativa mostra um aumento em alterações nucleares em células de pacientes com progeria com o número de passagens, o número de anomalias que diminuem sob o efeito do tratamento com pravastatina + zoledronato (Fig. 14c). Observado sob um microscópio confocal, as células do paciente de progeria contêm agregados de lâmina A/C, invaginações profundas da face nucleoplásmica do envelope nuclear no nucleoplasma (retículo nuclear) marcada com anticorpo anti-calreticulina (Fig. 15a-f). Estes agregados da lâmina A/C estão em falta a partir das células de controlo (Fig. 14j-l) e desaparecem das células do paciente de progeria sob o efeito do tratamento da pravastatina + zoledronato (Fig. 14g-i). A localização da lâmina Bl, um componente farnesilado da lâmina nuclear é modificado sob o efeito do tratamento, o que confirma que o tratamento bloqueia a prenilação das lâminas.

Verificou-se que a melhoria da forma dos núcleos pelo tratamento Da pravastatina + zoledronato está relacionada com o bloqueio da prenilação da progerina, incubando as células com o farnesol e/ou o geranil-geraniol. A suplementação das células com o farnesol e o geranil-geraniol permite que as células sintetizem o pirofosfato de farnesilo e o pirofosfato de geranil-geranilo e, assim, prenilam a progerina mesmo na presença de pravastatina + zoledronato (Fig. 14d) . 0 farnesol suprime o efeito do tratamento da pravastatina + zoledronato, que é uma outra prova de que o efeito do tratamento passa pela inibição da síntese de pirofosfato de farnesilo. Note-se que o geranil-geraniol também bloqueia o efeito do tratamento, o que prova que a forma geranil-geranilada da progerina também é tóxica para as células (Fig. 14d). Os mesmos efeitos são observados nas células ZMPSTE24~/~ (Fig. 16a) , sugerindo que os dados relativos à progerina podem ser estendidoa para a pré-lâmina A, a proteína acumulada nas células ZMPSTE24~/~. Nem o farnesol ou o geranil-geraniol produzem efeito sobre os fibroblastos de controlo, o que elimina a possibilidade de um artefacto induzido por estas moléculas (Fig. 16b).

Finalmente, o tratamento com pravastatina + zoledronato provoca uma redução do número de focos de histona H2AX fosforilada, focos diretamente correlacionados com o número de quebras da cadeia dupla do ADN não reparado (Fig. 17).

Em conclusão, os dados obtidos in vitro mostram que a combinação de pravastatina + zoledronato inibe parcialmente a farnesilação e a geranil-geranilação, e faz as alterações de localização esperadas na lâmina e na redistribuição no nucleoplasma da pré-lâmina A e da progerina não preniladas em células ZMPSTE24~/~ e pacientes dee progeria. Além disso, a diminuição da quantidade de progerina farnesilada ao nivel da lâmina e a sua transferência para o nucleoplasma explica os efeitos benéficos do tratamento sobre as células de pacientes de progeria.

Legenda da figura 14: Efeito sinérgico da combinação de pravastatina + zoledronato na acumulação da pré-lâmina A em células de controlo e pacientes de progeria. (a) Deteção imunocitoquimica da lâmina A/C e pré-lâmina A em fibroblastos humanos normais, não tratados, tratados com pravastatina (60 μΜ, 12 h) , por zoledronato (60 μΜ, 6 H) , isoladamente ou em combinação. (b) Deteção imunocitoquimica da lâmina A/C e pré-lâmina A em fibroblastos humanos normais e pacientes de progeria tratadas durante 24 h com a combinação de pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada). (c) Análise quantitativa do efeito do tratamento de pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada) sobre a morfologia nuclear de células de paciente de progeria. As células tratadas, ou não, foram imunocoradas com um anticorpo anti-lâmina A/C nas passagens 8 (P8), 13 (pl3) e 20 (p20) . As setas brancas mostram os núcleos anormais. (d) Análise quantitativa do efeito do tratamento de pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada) sobre a morfologia nuclear de células do paciente de progeria na presença de farnesol, geranil-geraniol, ou ambos os compostos. Barras de erro = média ± erro padrão da média. Escala da barra = 10 ym.

Legenda da Figura 15: O tratamento com pravastatina + zoledronato corrige a morfologia nuclear e induz a uma deslocalização parcial das isoformas da lâmina A/C e da lâmina BI da lâmina nuclear no nucleoplasma, em células de pacientes com progeria. (A) a colocação da lâmina A/C e da calreticulina nas células de progeria tratadas ou não. Imunofluorescência e microscopia confocal (Leica TCS SP5, pilha tridimensional de imagens 2048 x 2048 pixels, e não de 0,2 ymi, média de 3 linhas, acumulação de 3 imagens, zoom x 1,7). As imagens a a c de cada painel são projeções de intensidade média de 27 imagens da pilha e mostram os túbulos do reticulo nuclear marcados pela calreticulina nas células de progeria incubadas com PBS. Imagens dal: seções confocais isoladas de 0,2 ym de espessura. O tratamento com pravastatina + zoledronato corrige a forma dos núcleos das células de progeria, diminui o número de túbulos do reticulo nuclear (g) e a espessura da lâmina nuclear (h). (B) colocação da lâmina BI e da calreticulina. O tratamento com pravastatina + zoledronato aumenta o sinal de marcação nucleoplásmica da lâmina Bl, indicando que a farnesilação desta proteina é parcialmente inibida. Barra de escala = 5 ym.

Legenda da Figura 16: Os precursores de pirofosfato de farnesilo e pirofosfato de geranil-geranilo abolem o efeito do tratamento da pravastatina + zoledronato em células de ratinho ZMPSTE24“/_ em cultura. A quantificação do efeito da pravastatina (1 μΜ) e do zoledronato (1 μΜ) associada, ou não, sobre a morfologia nuclear de células de ratinho ZMPSTE24~/~ (a) ratinhos de controlo e (b) em cultura na presença de farnesol, geranil-geraniol, ou ambas as moléculas.

Farnesol, geranil-geraniol, sozinhos ou associados, abolem o efeito do tratamento com pravastatina + zoledronato na morfologia nuclear de célulasZMPSTE24~f-.

Legenda da Figura 17: 0 tratamento com pravastatina + zoledronato corrige parcialmente as anomalias da reparação de quebras de cadeia dupla (DSB) do ADN nas células de pacientes com progeria.

Os fibroblastos de controlo e de pacientes de progeria foram incubados com a mistura de pravastatina + zoledronato (1 μΜ cada) ou com PBS e foram irradiadas com raios X (2 Gy) . Imunodeteção dos focos de histona H2AX fosforilada detetada 24 h após a irradiação, focos correspondentes às quebras de cadeia dupla não reparadas (imagens de topo). Coloração nuclear DAPI (imagens de fundo).

Curvas do fundo: alterações no número de focos de histona H2AX fosforilada em função do tempo após a irradiação em células de controlo (quadrados) e de células de progeria (circulo vazio) incubadas com PBS ou tratadas com pravastatina + zoledronato. Cada curva representa a média ± erro padrão da média de, pelo menos, 3 experiências. O tratamento de combinação com pravastatina + zoledronato aumenta o fenótipo progeróide rato ZMPSTE24~/~ (Figuras 18, 19 e 20):

Os ratos ZMPSTE24~/~ e ratos de controlo foram tratados diariamente com pravastatina, zoledronato ou a combinação de ambos os fármacos numa dose que foi anteriormente encontrada para ser desprovida de toxicidade em ratinhos. Como já foi observado para as células de pacientes de progeria, cada fármaco sozinho, pravastatina ou zoledronato, não melhoram o tempo de vida dos ratos ZMPSTE24~/~ (Fig. 19) . Em vez disso, a combinação de ambos os fármacos melhora significativamente o fenótipo de ratinhos progeróides ZMPSTE24~ /_ ; o tratamento melhora o ganho de peso, aumenta a quantidade de gordura subcutânea, reduz a importância da cifose e da alopecia e aumenta o tempo de vida. 0 valor médio de sobrevivência vai de 101 a 179 dias, a sobrevivência máxima vai de 151 a 222 dias (P <0,001, Fig. 18c). Deve notar-se que todos os sinais fenotipicos corrigidos pelo tratamento dos ratinhos são, também, as características da progeria em seres humanos. A terapia de combinação corrige a diminuição da densidade óssea, que é uma das características do rato ZMPSTE24e dos pacientes de progeria ou uma síndrome progeróide relacionada. A tomografia computadorizada óssea mostra um aumento da mineralização do osso e sa espessura cortical tibial dos ratinhos tratados (Fig. 18d). Adicionalmente, a quantificação de alterações morfológicas nucleares no fígado de rato ZMPSTE24~/~, ZMPSTE24~/~ e ZMPSTE24~/~ mostra que o tratamento da pravastatina + zoledronato normaliza a forma dos núcleos celulares ZMPSTE24~/~ (Fig. 18e) . O tratamento corrige, por outro lado, o aumento da transcrição dos genes alvo da proteína p53, um aumento que foi descrito em células de ratinho ZMPSTE24~/~ (Varela et al., 2005 (54) bis) (Figura 18f) . Finalmente, foi investigado se o tratamento poderia ter um efeito sobre ratinhos LMNA_/" que não podem acumular pré-lâminas A. O tratamento com pravastatina + zoledronato não tem nenhum efeito sobre o tempo de vida destes ratinhos (Fig. 20), que é mais uma prova de que este tratamento só pode agir em ratinhos que acumulam pré-lâmina A farnesilada para o envelope nuclear.

Legenda da Figura 18: 0 tratamento da pravastatina + zoledronato melhora o fenótipo do rato progeróide ZMPSTE24- (a) Fotografias representativas de ratos com 3 meses ZMPSTE24+/+, ZMPSTE24-/- e ZMPSTE24~/- tratados com a combinação de pravastatina (100 mg/kg/dia) e zoledronato (100 mg/kg/dia) . Escala da barra = 1 cm. (b) Peso de ratos com 3 meses ZMPSTE24+/+ (n = 12), ZMPSTE24~/~ (n = 13) e Zmpste2_/“ tratados (n = 15) . (c) As curvas de Kaplan-Meier mostram um aumento significativo da vida do ratinho ZMPSTE24~ tratado (n = 15) comparado com a de ratos não tratados (n = 13). (d) Representação tridimensional por tomografia computadorizada da tibia de ratos ZMPSTE24~/~ tratados e não tratados (em cima). O painel inferior mostra o volume ósseo relativo (volume ósseo/volume da tibia) e o número de trabéculas ósseas, em ratinhos ZMPSTE24~/~ não tratados (n = 6) e tratados (n = 5) . (e) Quantificação das anomalias nucleares dos hepatócitos de ratos ZMPSTE24+/+, ZMPSTE24~ !- e ZMPSTE24-/- tratados. As setas brancas mostram os núcleos anormais. Escala da barra = 10 ym. (F) Expressão relativa dos genes alvo da p53 no figado e no coração de ratos ZMPSTE24+/+, ZMPSTE24~/~ e ZMPSTE24~/- tratados, analisados por RT-PCR quantitativo. *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001. As barras de erro representam a média ± erro padrão da média.

Legenda da figura 19: Nem a pravastatina por si só, nem o zoledronato só aumenta o tempo de vida dos ratinhos ZMPSTE24-

As curvas de Kaplan-Meier mostram que a pravastatina só (n = 5) (a), e o zoledronato só (n = 5) (b) não corrigem o tempo de vida de ratinhos ZMPSTE24~/~ tratados (diamante vazio) e não tratados (circulos a cheio, n = 11).

Legenda da figura 20: O tratamento com pravastatina +

zoledronato não corrige o tempo de vida de ratos LMNA

As curvas de Kaplan-Meier mostram a vida útil de ratos LMNA~ 1 tratados com pravastatina + zoledronato (n = 12, diamantes vazios) comparada com a de ratos não tratados (circulos a cheio, n = 11). O tratamento com pravastatina + zoledronato não tem nenhum efeito sobre os ratinhos desprovidos de lâmina A/C.

Resumo/conclusão /perspetivas Várias sindromes progeróides humanas, incluindo progeria de Hutchinson-Gilford, são causadas pela acumulação no envelope nuclear de uma forma farnesilada da pré-lâmina A excluida (progerina) ou não. A progerina também é produzida durante o envelhecimento fisiológico. Estudos anteriores realizados com células de pacientes de progeria têm mostrado que os inibidores de farnesiltransferase (FTI) melhoram a morfologia dos núcleos, sugerindo que esses inibidores podem representar um tratamento para estas sindromes devastadoras.

Os inventores mostram aqui que a pré-lâmina A e a progerina sofrem uma prenilação alternativa pela transferase de geranil-geranilo quando a transferase de farnesilo é inibida, o que poderia explicar a baixa eficiência do FTI para melhorar o fenótipo destes modelos de rato das suas sindromes progeróides.

Mostram, também, que a combinação de uma estatina e um aminobifosfonato inibe eficazmente tanto a farnesilação como a geranil-geranilação de pré-lâminas A e da progerina, melhorando, significativamente, o fenótipo de envelhecimento dos ratos aos quais foi inativado o gene que codifica a metaloprotéase ZMPSTE24 envolvida na maturação das pré-lâminas A. A melhoria do fenótipo inclui a da curva de crescimento, peso, lipodistrofia, perda de pelo e anomalias ósseas.

Além disso, o tempo de vida destes ratinhos é aumentado substancialmente.

Estes dados dão uma nova abordagem terapêutica para as sindromes progeróides humanas com acumulação de proteínas preniladas no envelope nuclear. 0 tratamento com pravastatina + aminobiphosphonate está a ser implementado em Marselha para os próximos 3 anos em crianças com progeria sob um ensaio clinico europeu (15 crianças) sob a responsabilidade do Pr. Nicolas Lévy financiado pelo Ministério da Saúde (PHRC 2008) e pela Associação Francesa contra Miopatias (AFM) , que foi autorizado pela AFSSAPS e CCP-Sul do Mediterrâneo. O mesmo tratamento será dado em breve em Roma, sob a responsabilidade do Pr. Giuseppe Novelli em pacientes com displasia acromandibular, outra sindrome progeróide com a acumulação da pré-lâmina A farnesilada.

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Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição compreendendo: pelo menos, um inibidor da redutase de hidroximetilglutaril coenzima A (HMG-CoA) ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, sendo o referido inibidor de uma molécula da família das estatinas ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis - pelo menos, um inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo ou uma dos seus sais f isiologicamente aceitáveis, sendo o referido inibidor seleccionado de entre o grupo compreendendo uma molécula da família DOS aminobifosfonaTOS (NBP) ou um dos sais fisiologicamente aceitáveis, e - pelo menos, um anti-HIV agente, sendo o dito agente anti-HIV UM inibidor da protéase ou um inibidor da transcriptase reversa.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, na gual o inibidor da redutase de HMG-CoA é uma estatina solúvel em água.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1, na qual a redutase de HMG-CoA é uma estatina lipossolúvel.
4. 4. Composição de acordo com a reivindicação 1, na qual a redutase de HMG-CoA é seleccionada a partir do grupo compreendendo atorvastatina, sinvastatina, pravastatina, rivastatina, mevastatina (ou compactina) fluindostatina, velostatina, fluvastatina, dalvastatina, cerivastatina, pentostatina, rosuvastatina, lovastatina, pitavastatina, e os seus sais fisiologicamente aceitáveis.
5. 5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, na qual o aminobifosfonato pode ser seleccionado a partir de: - ácido alendrónico ou a sua forma iónica, alendronato; - ácido clodrónico ou a sua forma iónica, clodronato; - ácido etidrónico ou a sua forma iónica, etidronato; - ácido ibandrónico ou a sua forma iónica, ibandronato; - ácido medr+onico ou a sua forma iónica, medronato; - ácido neridrónico ou a sua forma iónica, neridronato; - ácido plpadrónico ou a sua forma iónica, olpadronato; - ácido pamidrónico ou a sua forma iónica, pamidronato; - ácido risedrónico ou a sua forma iónica, risedronato; - ácido tiludrónico ou a sua forma iónica, tiludronato; - ácido zoledrónico ou a sua forma iónica, zoledronato - ácido 4-N,N-dimetilaminometano difosfónico ou a sua forma iónica, dimetilaminometanodifosfonayo; - α-amino (4-hidroxibenzilideno) difosfonato.
6. 6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, na qual o inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo é o ácido zoledrónico ou a sua forma iónica, zoledronato.
7. 7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, na qual o agente anti-HIV é um inibidor da protéase seleccionado a partir do grupo compreendendo fosamprenavir, lopinavir, ritonavir, amprenavir, atazanavir e indinavir.
8. 8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, na qual o agente anti-HIV é um inibidor da transcriptase reversa seleccionado do grupo compreendendo zidovudina, lamivudina, didanosina e epzicom.
9. 9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para uso como medicamento no tratamento dos efeitos secundários do envelhecimento prematuro num paciente causado pelo tratamento anti-HIV.
10. 10. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 9, na qual a composição é uma composição para administração oral ou injeção.
11. 11. Composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, na qual o tratamento é o tratamento dos efeitos secundários do envelhecimento prematuro num paciente causados pelo tratamento anti-HIV usando um inibidor da protéase ou um inibidor da transcriptase reversa.
12. 12. Composição para utilização como um medicamento no tratamento do HIV compreendendo, em qualquer ordem, as seguintes etapas: i. administração de uma mistura compreedendo, pelo menos, um inibitor da redutase de hidroximetilglutaril coenzima A (HMG-CoA) , sendo o referido inibidor uma molécula da familia das estatinas ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis, e, pelo menos um, inibidor da sintase de pirofosfato de farnesilo, sendo o referido inibidor uma molécula da familia molécula dos aminobifosfonatos (NBP) ou um dos seus sais fisiologicamente aceitáveis ii. administração dum agente anti-HIV, sendo o dito agente anti-HIV um inibidor da protéase ou um inibidor da transcriptase reversa, na qual, as administrações são concomitantes, sucessivas ou alternativas.