KR20190016938A

KR20190016938A - Paris의 파네실화에 의해 파킨슨병을 예방 또는 치료하기 위한 방법

Info

Publication number: KR20190016938A
Application number: KR1020187029930A
Authority: KR
Inventors: 신주호; 조아름; 이윤종; 테드 엠. 도슨; 발리나 엘. 도슨
Original assignee: 더 존스 홉킨스 유니버시티
Priority date: 2016-03-17
Filing date: 2017-03-16
Publication date: 2019-02-19
Also published as: WO2017161155A1; JP2019510088A; CN109414417A; KR20230038214A; EP3429569A4; US20230012209A1; US20190117586A1; EP3429569A1

Abstract

뇌 내 PGC-1α 발현 향상과 PARIS의 파네실화를 일으키는 약물이 유효량만큼 대상체에 투여되는, 대상체에 있어서 파킨슨병을 예방 또는 치료하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은, 도파민 뉴런의 소실을 예방함으로써 대상체에 있어 파킨슨병의 영향력을 부분적으로 약화시킨다.

Description

PARIS의 파네실화에 의해 파킨슨병을 예방 또는 치료하기 위한 방법

정부 이익에 관한 진술

본 발명은, 국립보건원에 의해 수여된 승인 번호 NS38377 하에 정부의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 모든 권리를 가진다.

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은, 그 개시내용이 전체로서 본원에 참조로 인용되어 있는 미국 가 명세서 특허 출원 제62/309,583호(2016년 3월 17일 출원)에 대한 우선권을 주장한다.

파킨슨병(Parkinson's Disease; PD)은 불치의 점진적 신경퇴행성 질환이다. 이는, 흑질(SN) 내 도파민작동성 뉴런의 우선적 소실로 말미암은 운동기능장애를 임상적 특징으로 한다. PD의 유전적 원인 몇 가지가 확인된 바 있는데, 이로 말미암아 PD의 진행에 근간이 되는 분자 기작을 이해할 기회가 제공되었다. 현재의 PD 치료 전략은 주로 L-DOPA 또는 도파민 수용체 효현제와 같은 약물 및 뇌 심부 자극술로써 운동기능 증상(motor symptom)을 관리하는 것에 제한되어 있는 실정이다. 불행하게도, 이러한 치료법들은 도파민작동성 뉴런(DA)의 점진적 사멸을 예방하는 데에 실패하였다. 뿐만 아니라, PD의 발병 또는 진행을 지연 또는 예방한다고 증명된 치료법은 존재하지 않는다. 그러므로 지금껏 달성되지 못하였던, PD를 치료하기 위한 신규의 약리학적 접근법이 절실하게 필요한 실정이다.

본 발명은 이처럼 달성되지 못하였던 목표를, 뇌 내 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체-γ 보조활성인자-1α(PGC-1 α) 발현의 향상과 파킨 상호작용성 기질(PARkin Interacting Substrate; PARIS)의 파네실화를 유도하기에 유효한 양으로 약물을 투여하여 대상체 내에서 파킨슨병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공함으로써 달성한다. 이러한 방법은, 부분적으로 도파민 뉴런의 소실을 예방함으로써 대상체 내에서 파킨슨병의 영향력을 줄여준다.

본 발명의 일 구현예는, 유효량의 PGC-1 α 유도제 하나 이상을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 파킨슨병을 예방 또는 치료하는 방법이다. 비록 임의의 직접적 또는 간접적 PGC-1 α 유도제가 본 발명의 방법에 사용될 수 있긴 하지만, 특정 구현예들에서, 유도제는 파네솔, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 인산염 유도체 또는 입체이성체이다. 파네솔의 구조는 다음과 같다:

(2E,6E)-3,7,11-트리메틸도데카-2,6,10-트리엔-1-올

본 발명의 또다른 구현예는, 유효량의 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체-γ 보조활성인자-1α(PGC-1 α) 발현 유도제 하나 이상을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내에서 파킨슨병을 예방 또는 치료하는 방법이다. 바람직한 유도제는 파네솔, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 인산염 유도체 또는 입체이성체이다. 유도제는 경구 투여될 수 있거나 주사에 의해 국소 투여될 수 있다. 만일 파네솔이 유도제이면, 파네솔은 대상체에 파네솔이 투여되지 않았을 때에 비하여 대상체 내 NRF-1의 mRNA 수준 증가를 초래하는 양으로 투여되는 것이 바람직하다. 파네솔은 대상체에 파네솔이 투여되지 않았을 때에 비하여 대상체 뇌 내 파네실 트랜스퍼라아제 활성을 증가시키는 양으로 투여되는 것 또한 바람직하다. 파네솔은 대상체에 파네솔이 투여되지 않았을 때에 비하여 대상체 뇌 내 파킨 상호작용 기질(PARIS) 파네실화를 증가시키는 양으로 투여되는 것 또한 바람직하다. 파네실화는 PARIS의 631번 잔기인 시스테인 잔기 상에서 일어나는 것 또한 바람직하다. 파네솔이, 이 파네솔이 투여되지 않은 대상체 내에서와 비교되었을 때 대상체 내에서 PARIS가 자체의 표적 DNA와 결합하는 것을 실질적으로 막는 것 또한 바람직하다. 파네솔이, 이 파네솔이 투여되지 않은 대상체 내에서와 비교되었을 때 대상체 내에서 도파민 뉴런의 소실을 예방하는 것 또한 바람직하다.

본 발명의 또다른 구현예는, AVS-3648, ABT-0529, 파네솔 및 이것들의 조합, 또는 이것들의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 인산염 유도체 또는 입체이성체로 이루어진 군으로부터 선택된 독립체 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내에서 파킨슨병을 예방 또는 치료하는 방법이다. AVS-3648 및 ABT-0529의 화학 구조에 대해서는 도 9를 참조하기 바란다. 독립체는, 이 독립체가 대상체에 투여되지 않을 때에 비하여 대상체 내 NRF-1의 mRNA 수준 증가를 초래하는 양으로 투여되는 것이 바람직하다. 독립체는, 이 독립체가 대상체에 투여되지 않을 때에 비하여 대상체 뇌 내 파네실 트랜스퍼라아제 활성을 증가시키는 양으로 투여되는 것이 바람직하다. 독립체는, 이 독립체가 대상체에 투여되지 않을 때에 비하여 대상체 뇌 내 PARIS 파네실화를 증가시키는 양으로 투여되는 것이 바람직하다. 파네실화는 PARIS의 631번 잔기인 시스테인 잔기에서 일어나는 것이 바람직하다. 독립체는, 이 독립체가 투여되지 않은 대상체 내에서와 비교되었을 때 대상체 내에서 PARIS가 자체의 표적 DNA와 결합하는 것을 실질적으로 방지하는 것이 바람직하다. 독립체는. 이 독립체가 투여되지 않은 대상체 내에서와 비교되었을 때 대상체 내에서 도파민 뉴런의 소실을 예방하는 것 또한 바람직하다.

본 발명의 또다른 구현예는, 독립체가 투여되지 않은 제2 대상체의 뇌 내 PGC-1α의 발현과 비교하였을 때 향상된, 대상체의 뇌 내 PGC-1α의 발현을 초래하는 독립체를 제1 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내에서 파킨슨병을 예방 또는 치료하는 약물을 동정하는 방법이다. 독립체는 경구 투여될 수 있거나, 또는 본 명세서에 언급된 다른 방법들에 의해서 투여될 수 있다. 본 방법은 제2 대상체 내 NRF-1의 mRNA 수준에 비한, 제1 대상체 내 NRF-1의 mRNA 수준의 증가를 초래한다. 본 방법은 제2 대상체의 뇌 내 파네실 트랜스퍼라아제 활성에 비한, 제1 대상체의 뇌 내 파네실 트랜스퍼라아제 활성의 증가를 초래한다. 본 방법은 제2 대상체의 뇌 내 PARIS 파네실화에 비한, 제1 대상체의 뇌 내 PARIS 파네실화의 증가를 초래한다. 파네실화는 PARIS의 631번 잔기인 시스테인 잔기에서 일어나는 것이 바람직하다. 제1 대상체 내 PARIS 및 자체의 표적 DNA의 결합은, 제2 대상체 내 PARIS 및 자체의 표적 DNA의 결합에 비하여 감소한다. 본 방법은 제2 대상체 내 도파민 뉴런 소실에 비한, 제1 대상체 내 도파민 뉴런 소실의 감소를 초래한다.

본 발명의 또다른 구현예는, 다음과 같은 단계들, 즉 PARIS 단백질 또는 이의 기능성 DNA 결합부를 발현하는 세포를 제공하는 단계; 하나 이상의 독립체를 세포에 적용하는 단계; 독립체로 처리된 세포 하나 이상이, 하나 이상의 독립체로 처리되지 않은 세포와 비교되었을 때 PARIS 단백질 또는 이의 기능성 DNA 결합부와 자체의 표적 서열의 결합 능을 잃는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 파킨슨병을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학 제제를 스크리닝하는 시험관 내 방법이다. 독립체는, 바람직하게 화학물질, 단백질, 펩티드, 핵산 서열 또는 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

도 1a~1d는, PGC-1α의 발현을 증가시키는 화합물을 동정하기 위한 고처리량 스크리닝을 도시하는 것이다.
도 2a~2j는, PARIS의 존재 시에 PGC-1α 촉진인자를 활성화하는 화합물들을 도시하는 것이다.
도 3a~3j는, PARIS의 존재 시에 PGC-1α 촉진인자를 활성화하는 화합물 9개 중 어느 화합물이 SH-SY5Y 세포 내 PGC-1α 수준을 유도하는지 확인하기 위해 화합물을 평가하는 것을 도시하는 것이다.
도 4a~4h는, PARIS의 파네실화 위치를 도시하는 것이다.
도 5a~5i는, 파네솔에 의해 도파민작동성 뉴런이 보호되는 것을 도시하는 것이다.
도 6a~6k는, 파네솔의 보호 효과를 도시하는 것이다.
도 7a~7g는, PARIS의 파네실화가 파네솔의 생체 내 보호 효과 발휘에 필요함을 도시하는 것이다.
도 8은, 본 발명에 의해 측정된 바와 같은, 파네솔의 작용 기작을 도시하는 것이다.
도 9는, AVS-3648, ABT-0529의 화학 구조를 도시하는 것이다.
도 10a~10d는, 본 발명에 사용된 검정이 고처리량 스크리닝(HTS)용으로 확고하였음을 도시하는 것이다.
도 11은, 본 발명에 사용된 고처리량 스크리닝 프로토콜을 도시하는 것이다.
도 12는 1차 스크리닝을 통해 동정된 화합물 17개를 도시하는 것이다.
도 13a~13f는, 실시간 qRT-PCR이, FXR mRNA가 간, 신장, 결장 및 난소에서 다량으로 관찰됨과 아울러 비장, 기관, 식도, 고환 및 전립선에서는 약간 발현됨을 보여주는 것을 도시하는 것이다.
도 14a 및 도 14b는, 파네솔이 세포질, 막 및 가용성 핵 분획 내 PARIS 분포는 변화시키지 않으면서, 염색질 결합 PARIS WT 수준은 0으로 만들되, 염색질 결합 PARIS C631S 수준은 그렇지 못하였음을 도시하는 것이다.
도 15a~15d는, 파네솔이 도파민작동성 뉴런 PGC-1α 면역반응성 증가를 유도하였음을 보여주는 동시면역염색 분석 결과를 도시하는 것이다.

본 발명의 구현예들은 파킨-PARIS-PGC1α 경로의 조절이 직접적으로나 간접적으로 관련되어 있는 신경 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법 및/또는 조성물에 관한 것이다. 임의의 구현예들에서, 파킨슨병과 같은 신경 장애를 앓는 개체들은 상기 경로의 조절제로 치료되고, 특정 구현예들에서, PD를 앓는 개체에는 예컨대 PGC1α 발현 유도제와 같은 PGC1α 발현 조절제가 제공된다.

임의의 구현예들에서, PGC1α 발현 유도제의 수준은 그것이 PD를 비롯한 신경 장애의 증상 적어도 하나의 완화를 제공할 수 있는 한 어떠한 수준도 될 수 있다. 발현 수준은 표준적인 적어도 몇몇 경우에 있어서의 발현 수준에 비하여 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 1000 배 또는 이 이상까지 증가할 수 있다. 개체는, 예컨대 노던 블럿 분석법(Northern Blot analysis) 또는 정량적 PCR과 같은 당 분야의 표준 방법을 이용하여 PGC1α의 발현 수준을 모니터링할 수 있다.

PD가 발병하였거나, PD가 발병한 것으로 의심되거나, 또는 PD가 발병할 위험이 있는 것으로 알려진 개체에게는 파네솔을 비롯한 PGC1α 발현 유도제 유효량이 제공될 수 있다. PD 위험이 있는 개체는, 예컨대 유전 인자 하나 이상을 가지는 개체일 수 있고, 고령일 수 있으며/있거나 가족력이 있을 수 있다.

본 발명의 구체적 구현예들에 있어서, 개체에게는 PGC1α 유도제 하나 이상 이외에도, PD 치료를 위한 제제가 제공된다. 이러한 추가의 치료는, 예컨대 L-DOPA 또는 도파민 수용체 효현제 및/또는 뇌 심부 자극술을 포함할 수 있다. PGC-1α 유도제 하나 이상과의 병용 치료법이 수행될 때, 추가의 치료법은 PGC-1α 유도제 투여 전, 투여와 동시에, 그리고/또는 투여 후에 제공될 수 있다.

본 발명의 임의의 방법들은 본 발명의 치료 방법 이전에 PD를 진단하는 방법을 제공하는데, 이러한 진단은 적어도 유전자 마커 검정, 단일광자방출컴퓨터단층촬영, 후각기관시험, 자율신경계시험 또는 이것들의 병행법을 비롯한 임의의 방법 또는 수단에 의해 이루어질 수 있다.

그 수준이 파킨 상호작용 모델과 인간 PD 뇌 내에서 증가하는 파킨 기질, PARIS(ZNF746)가 앞서 동정되었다. 증식인자 활성화 수용체-γ 보조활성인자-1α (PGC-1α) 촉진인자에 인슐린 반응 서열(IRS)이 점유함으로써, PARIS는 전사 단계에서 PGC-1α 및 이의 표적 유전자, 즉 핵 호흡 인자 1(NRF-1)의 발현을 억제한다. PARIS는 성체 동물 내 파킨의 조건부 녹아웃(knock-out)에 있어서 도파민작동성 뉴런의 점진적 소실에 필요하고, PARIS의 과발현은 선택적 DA 신경 퇴행을 유도한다. DA 신경 퇴행에는 미토콘드리아 질량의 PARIS 의존적 감소 및 호흡이 수반되는데, 이는 파킨 소실이 PGC-1α 결함과 일치하여 미토콘드리아 생물발생을 망친다는 것을 암시한다.

PGC-1α는 미토콘드리아 생물 발생에 중요한 전사 프로그램을 공동 조절하고, 미토콘드리아를 미토콘드리아 산화 스트레스로부터 보호하는, 미토콘드리아 기능의 주요 조절인자이다. 속속들이 나오는 증거는, PGC-1α가 PD에 있어서 어떤 역할을 한다는 것을 암시한다. PGC-1α 수준은 PD 환자의 경우 감소한다. PD에서의 PGC-1α 하향조절은 PGC-1α 촉진인자의 메틸화로 말미암을 수 있다. PGC-1α 녹아웃 마우스는 PD 신경독인 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP)의 퇴행적 효과에 더욱 감수성이고, PGC-1α의 과발현은 MPTP의 활성 대사물질인 N-메틸-4-페닐피리디늄 이온(MPP+) 독성에 대한 보호를 달성한다. 뿐만 아니라, PGC-1α의 과발현은 α-시누클레인, MPTP, 산화 스트레스 및 로테논 유도성 퇴행에 대한 보호를 달성한다. PD의 발병 및 발병 위험 나이는 PGC-1α의 다형성과 연관되어 있고, 파킨 연관 PD에 있어서 PGC-1α는 기능을 하지 못한다. PGC-1α 반응성 유전자는 PD 환자 유래 도파민작동성 뉴런에서 하향 조절되는데, 이는 이 PGC-1α가 PD 병인에 중요한 역할을 담당한다는 것을 암시한다. PARIS가 과발현될 때 도파민 뉴런의 소실은 PGC-1α 과발현에 의해 억제되는데, 이는 PGC-1α가 도파민작동성 신경 퇴행에 PARIS를 결부시키는 주요 표적임을 암시한다. 그러므로 PGC-1α 신호전달의 결함은 PD에 있어서 도파민작동성 퇴행에 중요한 원인으로서 부상하고 있으며, 파킨에 의한 PARIS의 조절은 PGC-1α를 PD에 결부시키는 내재적 기작일 수 있다.

파킨-PARIS-PGC-1α 경로는 PD에 있어서 도파민작동성 뉴런의 사멸에 중요한 역할을 담당하는 것으로 보이므로, PARIS가 상승하여 존재할 때 PGC-1α 기능을 유지시키는 화합물을 동정하기 위해 편파적이지 않은 스크리닝이 개발 및 수행되었다. 본 발명은, CSU-1806(파네솔)이, PARIS의 파네실화를 통한 PGC-1α의 강력한 유도제로서, PGC-1α의 전사 억제를 억제하는 것임을 보였다. 더욱이, 파네솔은 PARIS 유전자이식 마우스 및 성체 조건부 파킨 녹아웃 마우스에서 도파민 뉴런의 소실을 매우 강력하게 방지하는 것으로 입증되었다.

PGC-1α 유도제에 대한 고처리량 스크리닝

PGC-1α의 발현을 증가시키는 화합물을 동정하기 위하여, 1Kb의 인간 PGC-1α 촉진인자(SH-PGC-1α)의 제어 하에 탈안정화된 GFP(dscGFP)와 루시퍼라아제를 발현하는 안정한 리포터 세포주가 제조되었다(도 1a). 230,000개의 화합물로부터 이 화합물들의 구조적 특성, 약동학적 특성 및 약력학적 특성을 기반으로 대표적 화학 라이브러리가 선택되었다(대전에 소재하는 한국 화합물 은행). 이러한 대표적 화학 라이브러리는 액체크로마토그래피 질량분광분석법(LC-MS)에 의해 품질이 제어된 약리학적 활성 화합물 6000개를 함유하였다. 뿐만 아니라, 임상 승인된 약물(60%)과 천연 생성물(25%), 그리고 기타 생물활성 성분(15%)으로 이루어진 2320개의 화합물을 함유하는 스펙트럼 컬렉션(Spectrum Collection)(Microsource, (www)msdiscovery.com/spectrum.html)도 또한 스크리닝을 위해 사용되었다. 검정이 고처리량 스크리닝(HTS)에 대해 확고한지 여부를 확인하기 위하여, 평판마다의 변동(plate-to-plate variation), 그날 그날의 변동(day-to-day variation), 신호 대 백그라운드(S/B) 비율, 변동 계수(CV) 및 Z'인자를 비롯한 표준 매개변수들이 측정되었다. 평판 내 및 평판들 간 변동, 그리고 날마다의 변동은 극히 미미하였다(도 10a~10c). Z'인자들은, 일반적으로 HTS에 대한 검정 준비도 지수로서 취하여졌을 때 0.5 ~ 1 이내의 범위였다. 0.5% 이하의 DMSO는 검정의 감수성과 세포 자생력에 어떠한 영향도 미치지 않았다(도 10b 및 도 10d). 모든 HTS 절차들은 NIH 가이드라인(High-Throughput Screening Assay Guidance Criteria,(www)ncats.nih.gov/research/reengineering/ncgc/assay/criteria/criteria.html)(도 11: HTS 검정 프로토콜)에 따라 수행되었다.

SH-PGC-1α는 8320개 화합물 각각으로 48 시간 동안 처리되었다(최종 농도 10 μM). 루시퍼라아제 활성은 초기 판독 결과로서 평가된 후, DMSO에 대해 정규화되었다(도 1a). 처음의 스크리닝에 있어서, 128개의 화합물은 루시퍼라아제 활성을 1.5배 증가시켰다(도 1b). 이 화합물은 3회 재스크리닝되었다(도 1c). 모든 화합물은 루시퍼라아제 활성을 증가시켰으며, 이 화합물들 중 17개의 화합물은 루시퍼라아제 활성을 2.5배 이상 증가시켰다(도 1c). 이와 같은 17개의 화합물 중 그 어느 것도 적용 농도 10 μM에서 세포 독성을 보이지 않는다(도 10d 및 도 12). 이와 같은 17개의 화합물은, PARIS 과발현의 상황에서 PGC-1α의 활성인자를 동정하기 위해 평가되었다(도 1d). PARIS 또는 Mock 형질감염된 SH-PGC-1α 세포는 점점 증가하는 농도로(0, 0.01 μM, 0.1 μM, 1 μM, 및 10 μM) 각각의 화합물에 노출되었다. 48 시간 후 루시퍼라아제 활성이 모니터링되었다. 각각의 상황에서 PARIS 발현과 PGC-1α 억제가 동등하게 이루어지는 것이 확인되었다. 17개의 화합물 중 9개는 PARIS의 존재 하에 PGC-1α의 억제를 막았으며, 용량 의존적 방식으로 PGC-1α 촉진인자를 활성화하였다(도 1d). 이와 같은 9개의 화합물 중 어느 것이 중추신경계(CNS) 적용에 잠재성을 보이는지 여부를 평가하기 위하여, StarDrop^TM ((www)optibrium.com/stardrop/)에 의해 ADME 특성(흡수, 분포, 대사 및 배출)이 평가되었으며, 그 결과 AVS-3648, ABT-0529 및 CSU-1806(파네솔)이 혈액-뇌 장벽(BBB)의 높은 투과 가능성을 가지되 p-당단백 운반체(P-gp)와 상호작용하지 않음이 밝혀졌다.

파네솔(CSU-1806)은 PGC-1α를 유도하기 위해 PARIS를 억제한다.

어느 화합물이 SH-SY5Y 세포 내에서 PGC-1α 수준을 유도하는지를 확인하기 위하여, PARIS의 존재 하에 PGC-1α 촉진인자를 활성화하는 화합물 9개가 평가되었다(도 2a 및 2b). PGC-1α는 면역블럿 분석법에 의해 확인되는 바와 같이, 잠재적 CNS 침투 약물, AVS-3648, ABT-0529 및 파네솔(CSU-1806)에 의해 유의미하게 증가한다(도 2a 및 2b). PGC-1α 증가가, 산화물질 대사, 미토콘드리아 생물발생 및 산화물질 인산화에 수반되는 PGC-1α 표적 유전자들을 기능적으로 조절하는지 여부를 확인하기 위하여 AVS-3648, ABT-0529 및 파네솔(CSU-1806)이 사용되었다. 구리/아연 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD1), 망간 SOD(SOD2), 글루타치온 퍼옥시다아제(GPx1), 카탈라아제(CAT), 핵 호흡 인자-1(NRF-1), 미토콘드리아 전사 인자 A(TFAM), 미토콘드리아 비결합 단백질(UCP2 및 UCP3), 그리고 산화물질 인산화 조절인자, ATP5b, 시토크롬 C(CytC) 및 시토크롬 C 옥시다아제(COX II 및 IV)를 비롯하여 PGC-1α 표적 유전자의 mRNA 수준은, 실시간 정량 RT-PCR(qRT-PCR)에 의해 측정되었다(도 2c). PGC-1α, SOD1 및 ATP5B mRNA 수준은 AVS-3648, ABT-0529 또는 파네솔(CSU-1806) 처리에 따라 증가한다(도 2c). 흥미로운 점은, 오로지 파네솔(CSU-1806)만이 PD 모델에서 잠재적 PARIS/PGC-1α 표적 유전자로서 동정되었던 NRF-1의 mRNA 수준을 확고하게 증가시켰다는 점이다.

파킨 소실의 상황에서 파네솔이 PGC-1α를 유도하는지 여부를 확인하기 위해, 전술된 바와 같이 렌티바이러스 shRNA-파킨을 사용하여 SH-SY5Y 세포 내 파킨 발현을 감소시켰다. 파킨의 녹다운은 PARIS 수준의 2.7배 증가와 PGC-1α의 65% 감소를 유도한다(도 2d 및 2e). 파네솔은 파킨 및 PARIS 수준에 영향을 미치지 않으면서 PGC-1α 수준을 돌려놓는다(도 2d 및 2e). 파킨을 녹다운시킨 후, 실시간 qRT-PCR에 의해 PGC-1α 및 이의 표적 유전자의 mRNA 수준이 평가되었다. 전술된 바와 같이, 파킨 녹다운 SH-SY5Y 세포 내에서 PGC-1α 및 NRF-1의 mRNA는 감소하였는데, 이러한 감소는 파네솔에 의해 구제된다(도 2f). 더욱이, 파킨 녹다운 상황에서 SOD2, TFAM, ATP5B, CYTC 및 COX II의 mRNA 수준은 파네솔이 존재할 때 유의미하게 증가하였다(도 2f). 종합하여 보면, 이러한 결과들은 파킨이 존재할 때 파네솔이 PGC-1α 및 NRF-1의 수준을 돌려놓는다는 것을 보여준다.

파네솔은 식물과 동물 둘 다에 존재하는 천연 유기 화합물이다. 파네솔의 인산염 유도체는 포유동물 세포에 있어서 콜레스테롤의 구성 요소이다. 외인성 파네솔이 CNS를 투과하는지 여부를 확인하기 위해, 마우스에 파네솔 함유 먹이(AIN-76A 먹이 중 트랜스-파네솔 0.5% w/w; Research diet, NJ)가 7일 동안 공급되었고, 파네솔 농도는 뇌와 혈장 중에서 질량분광분석법에 의해 측정되었다(도 2g). 대조군 먹이(AIN-76A) 공급 마우스에 비하여, 파네솔 공급 마우스에서 파네솔의 혈장 중 수준은 검출 불가한 수준으로부터 혈장 1 ml당 113 ng까지 증가한다. 대조군 먹이 공급 마우스에 비하여, 파네솔 공급 마우스에서 뇌 내 파네솔 수준은 37%(파네솔 1 g당 155 ng)까지 유의미하게 증가한다(도 2g). 파네솔 공급 마우스에 있어 PGC-1α 수준은 이 마우스 뇌의 상이한 영역들을 대상으로 측정되었다. PGC-1α 수준은 보통 먹이를 먹은 마우스의 PGC-1α 수준에 비하여, 후신경구(OB)에 있어 2.7배 증가하고, 해마(HIP)에서는 1.6배 증가하며, 흑질(SN)에서는 1.7배 증가한다(도 2h 및 2i). 소뇌(CBM), 뇌간(BS), 선조체(STR) 또는 전두엽(CTX)에서 PGC-1α 수준의 유의미한 변화는 관찰되지 않는다(도 2h 및 2i). 이러한 데이터는, 파네솔에 의한 PGC-1α의 변경이 뇌 영역에 특이적인 것일 수 있음을 암시한다. 뿐만 아니라, 파네솔 공급 마우스의 STR, HIP 및 SN에 있어서 다양한 PGC-1α의 표적 유전자와 PGC-1α의 mRNA 수준이 측정되었다. 파네솔은 STR에 있어 PGC-1α 수준에 영향을 미치지 않았으므로, 이는 음성 대조군으로 사용되었다. 파네솔 공급 마우스의 PGC-1α의 mRNA 수준은, 보통 먹이를 먹은 마우스의 PGC-1α의 mRNA 수준에 비하여 HIP 및 SN에서 유의미하게 상향 조절되지만, STR에서는 그러하지 않는데, 이는 HIP 및 SN에서 PGC-1α의 증가한 단백질 수준이 주로 전사 과정으로 말미암는다는 것을 나타낸다(도 2j). 흥미롭게도, NRF-1, COX II 및 COX IV의 mRNA 수준은, 보통 먹이를 먹은 마우스의 HIP 및 SN 둘 다에 비하여 파네솔 공급 마우스에 있어, HIP 및 SN 둘 다에서는 상향조절된다는 점이다(도 2j). 그러나, 파네솔 공급 마우스에 있어 SOD2, TFAM, UCP2 및 CYTC의 mRNA 수준은 SN에서만 배타적으로 증가하지만, HIP와 STR에서는 그러하지 않다. 이러한 관찰 결과들은, 파네솔이 PGC-1α 표적 유전자의 상이한 하위세트와 함께 PGC-1α의 수준을 뇌 영역 특이적 방식으로 조절함을 암시한다.

파네솔은, 주로 간, 신장 및 소장에서 발견되는 파네소이드 X 수용체(FXR)를 활성화하는 것으로 공지되어 있다. FXR이 뇌에서 발현되는지 여부를 확인하기 위해, FXR의 mRNA가 심장, 뇌, 태반, 폐, 간, 골격근, 신장, 비장, 결장, 기관, 갑상샘, 흉선, 방광, 식도, 지방세포, 고환, 전립선, 자궁경부 및 난소를 비롯하여 다양한 인간 조직을 대상으로 실시간 qRT-PCR에 의해 측정되었다(Master panel II?, Clontech). 앞서 보고된 바와 같이, 실시간 qRT-PCR은, FXR mRNA가 간, 신장, 결장 및 난소에서 높은 수준으로 관찰됨과 아울러, 비장, 기관, 식도, 고환 및 전립선에서는 약간 발현됨을 보인다(도 13). 앞서 보고된 바와 같이, FXR mRNA는 뇌, 심장, 태반, 폐, 골격근, 갑상샘, 흉선, 방광, 지방세포 및 자궁경부에서는 검출되지 않는다. 이러한 조직에 있어 FXR mRNA 수준이 낮은지 여부를 확인하기 위해, RT-PCR이 45 회차 주기 꽉 채워 수행되었으며, FXR은 오로지 조직 하나 더, 즉 방광에서만 관찰되었다. FXR mRNA 발현은 HepG2 세포(간 기원), HEK293 세포(신장 기원) 및 SH-SY5Y 세포(신경 기원)에서 평가되었다. HepG2에서는 FXR의 확고한 mRNA 발현이 발견되었으나, HEK293 및 SH-SY5Y 세포에서는 그렇지 않았다. 그러나, SH-SY5Y에서 반정량 RT-PCR 45 회차 주기에 FXR mRNA 발현이 확인되었다. 파네솔 처리 SH-SY5Y 세포에 있어 FXR 및 PGC-1α 유도간에 어떤 관계가 있을 수 있는지 여부를 시험하기 위해, FXR을 녹다운하는 데에 FXR에 대한 siRNA가 사용되었다. FXR 녹다운 상황에서, 파네솔 처리는 PGC-1α 수준에 어떠한 영향도 미치지 않는다. 이러한 발견들은, 파네솔에 의한 PGC-1α 유도가 FXR과는 독립적임을 암시하는 것이다.

파네솔에 의한 PGC-1α 및 NRF-1 수준 증가가 PARIS 의존적인지 확인하기 위해, PARIS의 shRNA 녹다운 이후 파네솔이 SH-SY5Y 세포에 투여되었다. 전술된 바와 같이, PARIS의 녹다운은 PGC-1α 및 NRF-1 수준의 2배 이상의 증가를 초래한다. 파네솔은 그 수준을 더 이상 향상시키지 못하는데, 이는 PARIS가 PGC-1α 및 NRF-1 수준의 파네솔에 의한 상승에 필요함을 암시하는 것이다. 파네솔은 또한 PPARα 및 PPARγ 둘 다를 시험관 내에서 활성화할 수 있으므로, PPARα 및 PPARγ의 수준과, 이것들의 표적 유전자 몇몇이 평가되었다. 파네솔은 PPARα 및 PPARγ 단백질과, 이것들의 mRNA 또는 표적 유전자 몇몇, 즉 아실-코엔자임 A 옥시다아제 1(ACOX1), 카르니틴 O-팔미토일트랜스퍼라아제 1(CPT-1A), 중쇄 특이 아실-CoA 디하이드로게나아제(MCAD) 및 장쇄 특이 아실-CoA 디하이드로게나아제(LCAD)의 유전자 수준에 영향을 미치지 못한다. 흥미롭게도, PARIS 부재하에서 mRNA PPARγ 수준은 감소하고, ACOX1 및 CPT-1A는 상향 조절되는데, 이는 이 유전자가 PARIS 표적일 수 있음을 암시하는 것이다. 또한 파네솔 공급 마우스에서는 PPARα 및 PPARγ의 수준에는 변화가 없는 한편, PGC-1α 및 NRF-1 수준은 증가한다. 더욱이 파네솔 처리는 파네솔 공급 마우스의 SN 내 PPARγ mRNA 및 ACOX1 mRNA 수준을 감소시키고, MCAD의 수준은 증가시킨다. 파네솔은 또한 SH-SY5Y 세포 내에서 PPAR 반응성 요소의 활성화를 달성하지 못한다. 종합하여 보았을 때, 이러한 발견들은 뇌 내 파네솔의 효과는 PPARα 및 PPARγ와는 독립적으로 발휘되고, PARIS를 필요로 함을 암시한다.

PARIS의 파네실화는 PGC-1α를 전사 차원에서 조절한다

파네실화 트랜스퍼라아제(FT아제)는, CaaX 모티프에 의한 카복시 말단의 시스테인 잔기 변형을 통한 단백질 파네실화를 위하여 파네솔과 이의 중간물질을 이용한다. 파네실화는 이소프레노이드가 참여하는 단백질의 번역 후 지질화(post-translational lipidation)(지정된 단백질 프레닐화)의 한 형태이다. 생물 정보학적 분석은, PARIS의 C-말단 CGLS(631번 내지 634번 아미노산)에 있는 추정적 CaaX 모티프를 규명하였다(도 3a). FT아제는 공통 CaaX [여기서 C는 시스테인이고, A는 지방족 아미노산이며, X는 표적 단백질의 C-말단 아미노산임] 중간에 있는 시스테인을 인지한다. FT아제는 X 자리에 있는 메티오닌 또는 세린을 선호하고, 15개 탄소 파네실기를 운반한다. CGLS 서열은 PARIS의 예상 이소폼(isoform)들 가운데, 그리고 종들(인간, 마우스, 래트, 소 및 고릴라) 사이에 매우 보존적이다. PARIS가 파네실화되었는지를 확인하기 위해, [³H]-파네실 피로인산염(FPP) 처리된 SH-SY5Y 세포는 siRNA 대조군 또는 FT아제α에 대한 siRNA 중 어느 하나와 함께 Flag-태깅된 PARIS로 형질 감염되었다. 오토라디오그래피는, 면역침전된 Flag-태깅 PARIS가 파네실화된 반면에, FT아제α가 녹다운된 SH-SY5Y 세포에서는 PARIS의 파네실화가 일어나지 않았음을 보여준다(도 3b). α-파네실 항체가 사용되는 면역블럿 분석은, [³H]-FPP 처리 SH-SY5Y 세포 내 PARIS 파네실화와 FT아제α 녹다운이 PARIS의 파네실화를 줄여준다는 것을 확인시켜준다(도 3b).

그 다음, PARIS가 프레닐화됨을 확인하기 위한 생물공학적 접근법이 적용되었다(Nguyen et al., 2009). Flag-태깅 PARIS가 형질감염된 SH-SY5Y 세포의 전체 세포 용해물은 바이오틴 작용화 제라닐 피로인산염 유사체(바이오틴-GPP) 및 재조합 FT아제 W102T/Y154T 돌연변이체(지질 공여체로서 바이오틴-GPP를 이용하도록 조작됨)와 함께 항온처리되었다(Nguyen et al., 2009). Flag-태깅 PARIS가 면역침전된 후, 바이오틴-GPP 접합 PARIS는 α-스트렙타비딘 항체로 검출되는데, 이는 PARIS가 FT아제 프레닐화에 대한 기질임을 말해준다(도 3c). 또한 siRNA-대조군 또는 siRNA-FT아제α 중 어느 하나로 형질감염된 SH-SY5Y 세포 유래 Flag-태깅 PARIS의 면역침전물은 시험관 내 파네실화 검정(IVF)용 FPP의 Cy3 형광 유사체인 NBD-GPP와 혼합되었다. 면역침전된 Flag-태깅 PARIS에서 NBD-GPP 형광 신호가 관찰되는데, 이는 내인성 FT아제가 Flag-태깅 PARIS와 공동면역침전되고, 면역침전된 FT아제는 NBD-GPP를 PARIS로 성공적으로 옮겼음을 입증하는 것이다(도 3d). FT아제가 PARIS를 직접 파네실화하는지 여부를 확인하기 위하여, 재조합 GST-PARIS는 FT아제 억제제인 FTI-277의 존재 하에서, 그리고 부재 하에서 FT아제 및 FPP와 함께 항온처리되었다. GST-PARIS는 FT아제에 의한 파네실화를 수행하는데, 이 파네실화는 FT아제 억제제인 FTI-277이 첨가됨으로써 중지된다(도 3e).

파네솔이 PARIS의 향상된 파네실화를 유도하는지 여부를 알아내기 위하여, SH-SY5Y 세포는 Flag-태깅 PARIS로 형질감염되었고, 이후 48 시간 동안 파네솔로 처리되었으며, 그 다음에는 면역침전이 실시되었다(도 3f). 파네솔은 PARIS 파네실화를 용량 의존적 방식으로 증가시킨다(도 3f 및 3g). PARIS 파네실화의 증가에 수반하여, PGC-1α의 증가가 초래된다(도 3f 및 3g). 파네솔의 특이성을 알아내기 위하여, 제라니올 또는 제라닐제라니올이 사용되었는데, 그 이유는 이것들이 파네솔과 유사한 구조를 가지기 때문이다. 제라니올 또는 제라닐제라니올은 PGC-1α 수준에 영향을 미치지 않는다(도 3h). 파네솔이 생체 내에서 PARIS 파네실화를 증가시키는지 여부를 확인하기 위하여, 파네솔 공급 마우스의 SN으로부터 PARIS가 면역침전되었다. 면역블럿 분석은, 내인성 PARIS가 파네실화되고, 파네솔은 PGC-1α의 상향조절을 초래함과 아울러 파네실화된 PARIS의 수준을 향상시킴을 보여준다(도 3i 및 3j).

PARIS의 CGLS(631번 내지 634번 아미노산)가 파네실화 위치를 함유하는지 확인하기 위하여, IVF에 의해 파네실화된 PARIS를 대상으로 질량분광분석법이 수행되었다(마이크로TOF-Q 및 HCT 울트라 이온-포집)(도 4a). 펩티드(⁶¹⁸GPLASTDLVTDWT C GLSVLGPTDGGDM⁶⁴⁴)가 산성이 큰 아미노산과 소수성인 지질기를 함유하므로, MS/MS를 위한 이온 단편화가 방해되었고, 이런 이유로 본 발명자들은 파네실기가 부가됨에 따라 분자량도 또한 증가하였음을 토대로 파네실기가 ⁶¹⁸GPLASTDLVTDWTCGLSVLGPTDGGDM⁶⁴⁴ 펩티드 상에 존재함을 확인할 수 있을 뿐이었다. 이 펩티드는 오로지 하나의 시스테인 잔기(631번 잔기)만을 보유하므로, 이 시스테인은 PARIS의 파네실화 위치일 가능성이 매우 높다(도 4a). 631번 잔기가 파네실화 위치임을 확인하기 위해, PARIS의 보존된 C631S 돌연변이를 발생시켰다.

FLAG-PARIS WT 또는 FLAG-PARIS C631S 돌연변이체는 면역침전되었고, 파네실화 수준은 파네솔의 존재 하에 측정되었다. PARIS WT는 파네실화되고, 이의 파네실화는 파네솔 처리가 이루어짐에 따라 증가한 반면에, PARIS C631S 돌연변이체의 파네실화는 일어나지 않는다(도 4b). 파네솔에 의한 PARIS WT의 파네실화에 수반하여 PGC-1α의 상향조절이 일어난다(도 4b). 반면에, 파네솔은 PARIS C631S 돌연변이체 환경에서 PGC-1α 수준의 회복에 어떠한 영향도 미치지 않는다(도 4b). PARIS의 파네실화는 FT아제를 필요로 함을 확인하기 위하여, PARIS 과발현의 상황에서 FT아제의 FTI-277 억제 또는 siRNA-FT아제α 녹다운이 수행되었다(도 4c). FT아제α 녹다운 또는 FTI-277 억제는 파네솔에 의한 PARIS의 파네실화를 강력하게 막는다(도 4c). PARIS의 파네실화가 PGC - 1α 촉진인자 상 IRS 모티프에서의 PARIS의 DNA 결합 활성에 영향을 미치는지 여부를 알아내기 위하여, GFP-태깅 PARIS WT 또는 GFP-태깅 PARIS C631S으로 형질 감염된 SH-SY5Y를 대상으로 염색질 면역침전 검정(ChIP)이 수행되었다. 파네솔은 PGC - 1α 촉진인자 상 PARIS WT의 염색질 점유를 감소시키지만, PARIS C631S의 염색질 점유는 감소시키지 못한다(도 4d 및 4e). PARIS의 파네실화가 세포 이하의 분포를 변경할 가능성을 검사할 목적으로, 세포 이하의(subcellular) 분획화가 사용되어 면역블럿 분석법에 의해 세포기질, 막, 가용성 핵, 그리고 염색질 결합 핵 분획 내 PARIS의 수준을 모니터링하였다(도 4f). ChIP 검정과 일관되게, 파네솔은 염색질 결합 PARIS WT의 수준은 0으로 만들었지만 PARIS C631S의 수준은 그러하지 않았으며, 이때 세포질, 막 및 가용성 핵 분획 중 PARIS 분포에는 변화가 없었다(도 4f 및 14). 파네솔 처리에 의한 PARIS WT의 파네실화에 수반하여, PARIS C631S 돌연변이체에서는 관찰되지 않는 PGC - 1α 촉진인자 활성 증가가 초래된다(도 4g). 전기영동 이동성 변화 검정(EMSA)은, 시험관 내 파네실화된 GST-태깅 PARIS WT는 PGC - 1α 촉진인자 내 인슐린 반응성 서열(IRS)에 결합하지 못하는 반면, 비변형 GST-태깅 PARIS WT 및 C631S는 DNA-단백질 복합체를 형성함을 보여준다. 종합하여 보았을 때, 이러한 데이터는, PARIS가 파네실화되고, PARIS의 파네실화는 이의 DNA 결합 친화성을 없애줌으로써 이의 PGC-1α 억제도 막아줌을 보여준다.

파네솔은 PD 모델에서 도파민작동성 뉴런 소실에 대한 보호기능을 발휘한다.

파네솔이 도파민작동성 뉴런을 생체 내 PARIS 발현 증가 및 PGC-1α 수준 감소로부터 보호할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, Tet 유도성 조건부 PARIS 유전자이식 마우스(Tg-PARIS)가 제조되었다. 테트라사이클린 반응성 유전자이식 마우스를 제조하기 위해 테트라사이클린 반응성 조절인자(TetP-PARIS-Flag)의 제어 하에 있는 C-말단 FLAG 태깅 인간 PARIS가 사용되었다(도 5a). TetP-PARIS를 발현하는 유전자이식 마우스 29 마리가 테트라사이클린 촉진인자에 대한 PCR 스크리닝을 통해 동정되었다(도 5b). 복사체 수가 가장 많은 수컷 유전지이식 마우스 중 3 마리는 CamKIIα -tTA 유전자이식 마우스와 교배되었으며, 그 결과 마우스 전뇌 전반에 걸친 이식유전자 발현이 달성되었다(Mayford et al., 1996). CamKIIα-tTA 및 PARIS 둘 다를 발현하는 마우스가 태어나지 않았는데, 이는 발생 중의 PARIS 과발현이 배에 치사적임을 암시하는 것이다. 그러므로 PARIS 발현을 억제하기 위하여 어미 마우스는 계속하여 독시사이클린에 노출되었고, 새끼 마우스는 출생 후 3주 동안 계속 독시사이클린을 섭취하였다. 이와 같은 조건 하에 CamKIIα-tTA 및 PARIS 둘 다를 발현하는 마우스가 PCR에 의해 동정되었다(도 5c). 5주령일 때, PARIS의 과발현은, CamKIIα -tTA 또는 TetP -PARIS 중 어느 하나만을 발현하는 새끼 대조군(대조군 - CTL)에 비하여 Tg-PARIS의 후신경구(OB), 전두엽(CTX), 선조체(STR) 및 배쪽 중뇌(Ventral Midbrain; VM)에서 검출된다(도 5a). Tg-PARIS 158번 주(line)에 있어서, PARIS는 OB, CTX 및 STR에서 15 ~ 20 배 과발현된다(도 5a 및 5b). VM에 있어서, PARIS는 3배로 발현되는데, 이는 산발성 PD 환자(인간)의 시신의 뇌와 조건부 파킨 녹아웃 마우스 내에서의 향상된 PARIS 발현과 유사하다(Shin et al., 2011)(도 5b). 독시사이클린의 투여는 PARIS의 상향조절을 완전히 억제하므로 PARIS의 과발현은 테트라사이클린 반응성이다(도 5d). 추가의 독립적 Tg-PARIS 주 2 마리(121번 주 및 158번 주)는 CTX 및 VM에서 PARIS를 동일한 수준으로 발현한다(도 5e). 모든 주(3 마리)는 유도 후 3주만에 폐사하였다(몸을 웅크리고 발작하다가 움직이지 않음)(6주령). PARIS가 도파민 뉴런에서 발현되는지 확인하기 위하여, 티로신 하이드록실라아제(TH) 및 FLAG 항체가 사용되어 공동면역염색이 수행되었다(도 5c). FLAG 면역염색에 의해 확인되는 바와 같이 PARIS는 TH 양성 뉴런과 함께 SN 전반에 걸쳐 공동 국소화된다. 뿐만 아니라, 도파민 뉴런 내 CamKII 촉진인자의 발현은, CamKIIα -tTA 마우스와 tetP-LacZ 리포터 마우스의 교배에 의해 확인되었다(도 5g). 비록 CamKII 촉진인자가 해마(HIP) 및 전뇌에서 LacZ 리포터의 발현을 높은 수준으로 유도하지만, VM 및 SN에서도 LacZ 리포터의 발현을 유도하긴 한다(도 5a~5c 및 도 5g). 마우스가 폐사하였을 때(6주령) 도파민 뉴런 수가 TH 및 Nissl 양성 뉴런의 편파적이지 않은 입체학적 카운팅에 의해 측정되었다. Tg-PARIS 158번 주의 경우, 도파민 뉴런은 30% 넘게 감소하고, 선조체 TH 면역반응성은 45% 넘게 감소한다(도 5d ~ 5f). Tg-PARIS 121번 주에서 도파민 뉴런은 약 25% 감소한다. CTX에서 Tg-PARIS의 뉴런 소실은 일어나지 않는데, 이는 PARIS 과발현에 의해 유도된 SN 도파민 뉴런의 소실은 도파민 뉴런에 대해 선택적임을 말해준다. Tg-PARIS 158번 주에서 도파민 뉴런의 소실에 수반하여, 선조체에서는 HPLC에 의해 확인되는 바와 같이 도파민과 이의 대사물질의 감소가 일어난다(도 5g 및 5h). 도파민 교체율(dopamine turnover ratio)의 측정은, Tg-PARIS의 STR에서 도파민 이화작용은 CTL 마우스에서의 도파민 이화작용에 비하여 유의미하게 증가함을 보여주었다. 노르에피네프린과 에피네프린의 수준은 바뀌지 않았다. 5 ~ 6 주령일 때, 감수성이 뛰어난 도파민 기능 측정법인 폴 실험(Pole Test)에서 밑으로 하강하는 시간은 유의미하게 지연된다(도 5i).

이 같은 신규 마우스 모델이 사용되어, 파네솔 처리의 잠재적 보호 효과가 평가되었다. 독시사이클린을 공급중단하기 전 3일 동안 Tg-PARIS 마우스에는 파네솔 함유 먹이가 공급되었다. 독시사이클린을 공급중단하기 전 Tg-PARIS 마우스의 두 번째 코호트에는 보통의 마우스 먹이가 계속 공급되었다. 유전자이식되지 않은 대조군 마우스 군 2개(CamKIIα -tTA 또는 TetP -PARIS)를 대상으로 동일한 먹이 공급계획이 진행되었다. 파네솔이 도파민 뉴런 소실에 대해 보호기능을 발휘하는지 여부를 확인하기 위해, TH 및 Nissl 입체학적 연구가 수행되었다. 파네솔 처리는 Tg-PARIS의 SN에서 도파민 뉴런의 소실을 완전히 방지한다(도 6a 및 6b). 더욱이, 폴 실험에 의해 평가되는 바에 따르면 완전한 행동 구조(behavioral rescue)가 달성된다(도 6c). 뿐만 아니라, 파네솔은 PARIS 과발현으로 말미암은 조기 폐사를 지연시킨다(도 6a). 보통의 마우스 먹이를 공급받은 Tg-PARIS 마우스는 PGC-1α 수준의 약 50%의 감소와 NRF-1 수준의 약 40%의 감소를 보이는데, 이러한 감소는 파네솔 처리에 의해 억제된다(도 6d 및 6e). 대조군 마우스의 파네솔 처리는 PGC-1α 및 NRF-1 수준을 증가시킨다(도 6d 및 6e). 파네솔 처리는, FLAG가 사용되는 면역침전법과 파네실에 대한 항체로의 프로빙(probing)에 의해 확인되는 바에 따라 PARIS의 향상된 파네실화를 유도한다(도 6d 및 6e). 뿐만 아니라, PGC-1α 및 다양한 PGC-1α 표적 유전자의 mRNA 수준은, 파네솔 공급 마우스 SN에서 측정되어, 보통 먹이가 공급된 마우스 SN에서의 경우와 비교된다. 파네솔 공급 마우스에서 NRF-1 및 PGC-1α의 mRNA 수준은 유의미하게 상향조절된다(도 6f). Tg-PARIS SN의 도파민작동성 뉴런에 있어서 PGC-1α의 감소한 수준이 파네솔에 의해 복구되는지 여부를 알아내기 위하여, 공동 면역염색 분석법이 적용되었는데, 이는 파네솔이 도파민작동성 뉴런 PGC-1α 면역반응성 증가를 유도하였음을 나타낸다(도 15b 및 15c).

그 다음, 파네솔 처리의 잠재적 보호 효과는, PARIS 의존적인, 도파민 뉴런의 점진적 소실이 일어나는 조건부 성체 파킨 녹아웃(cPK-KO) 마우스에서 평가되었다. cPK-KO는 Parkin^flox ^/ ^flox 마우스 SN으로의 AAV-GFPCre 정위 주사에 의해 일어났다. 바이러스 주사 7일 전 cPK-KO 마우스에는 분석이 실시될 때까지 파네솔 함유 먹이 또는 보통의 마우스 먹이 중 어느 하나가 공급되었다. 야생형 Parkin^flox/flox 새끼(WT^flox ^/ ^flox)는 대조군으로서 사용되었으며, 바이러스 주사 7일 전 분석이 실시될 때까지 파네솔 함유 먹이 또는 보통의 마우스 먹이 중 어느 하나가 공급된 야생형 마우스에는 AAV-GFPCre가 주사되었다. 파네솔 처리는, cPK-KO 마우스의 SN에서 관찰되는 도파민 뉴런의 소실을 완전히, 그리고 유의미하게 방지한다(도 6g 및 6h). 이러한 상황에서, 먹이를 먹이거나 또는 파네솔을 먹이거나 이 둘 중 어느 하나가 실시된 cPK-KO 마우스의 SN에서 파네실화된 PARIS의 수준이 모니터링되었다. cPK-KO 마우스의 경우 PARIS 수준은 2배 넘게 증가하는데, 이는 산발성 PD의 SN에서 관찰되는 바와 동일하다(도 6i 및 6j). 보통의 마우스 먹이가 공급될 때 cPK-KO 마우스는 PGC-1α 및 NRF-1 수준의 감소를 보이는데, 이는 Tg-PARIS 마우스에서 관찰되는 바와 유사하다(도 6i 및 6j). 파네솔 처리는 대조군 마우스 SN에서 PGC-1α 및 NRF-1 수준을 증가시켜, PARIS의 향상된 파네실화를 초래하고, cPK-KO 마우스 SN에서 PGC-1α 및 NRF-1 수준의 감소를 방지한다(도 6i 및 6j). 다양한 PGC-1α 표적 유전자 및 PGC-1α의 mRNA 수준은 파네솔 공급 마우스 SN과 보통 먹이가 공급된 마우스 SN에서 측정되었고, 여기에서 PGC-1α, NRF-1, SOD2, TFAM, UCP2, CytC, COX II 및 COX 1이 상향조절되는 것이 발견되는데, 이는 파네솔이 PGC-1α와 이의 다수의 표적 유전자를 증가시킴을 입증하는 것이다(도 6k).

PARIS의 파네실화가 파네솔의 생체 내 보호 효과 발휘에 필요한지 여부를 확인하기 위하여, C57BL/6J 마우스 SN에 AAV-PARIS WT, AAV-PARIS C631S 또는 AAV-GFP가 정위 주사되었다. AAV-PARIS WT, AAV-PARIS C631S 또는 AAV-GFP가 정위 주사되기 전, 마우스에는 1 주일 동안 보통의 마우스 먹이 또는 파네실 먹이가 공급되었다(도 7a). 형질도입된 AAV 벡터의 균등한 발현이 확인되었다. AAV-PARIS WT 및 AAV-PARIS C631S 둘 다는 PARIS 발현의 3 ~ 4 배 증가를 유도하는데, 이는 조건부 파킨 녹아웃 마우스와 산발성 PD의 흑질에서 관찰되는 바와 동일하다(도 7b 및 7c). 파네솔은 PARIS WT 또는 PARIS C631S 수준에 영향을 미치지 않았다(도 7b 및 7c). 파네솔 공급 마우스에 AAV 주사한지 2 주 후, 면역침전된 PARIS를 파네실에 대한 항체로 프로빙함으로써 PARIS의 파네실화가 평가되었다. 파네실화된 PARIS는, AAV-PARIS C631S 주사 마우스의 경우와 비교되었을 때, AAV-PARIS WT 주사 마우스에서 확고하게 관찰된다(도 7b 및 7c). AAV-PARIS C631S 주사 마우스에 있어서 파네실화된 PARIS의 최소 수준은 내인성 PARIS로 말미암았다. 영역 특이적 PARIS 파네실화가 일어나는지 여부를 평가하기 위하여 AAV-PARIS WT가 파네실 공급 마우스의 CTX 및 SN에 주사되었다. 흥미롭게, SN에서의 PARIS 파네실화는 SN에서 FT아제 수준이 확고한 것과 일치하는 반면에, CTX에서의 파네실화는 CTX에서의 FT아제 수준이 낮다는 것과 일치하여 낮다(도 7d). TH 및 Nissl 입체학 연구에 의하여 평가되는 바에 따르면, AAV-PARIS WT 및 AAV-PARIS C631S 둘 다는 도파민 뉴런의 소실을 유도한다(도 7e 및 7f). 파네솔 처리는 AAV-PARIS WT 마우스에서 도파민 뉴런의 소실을 완전히 방지하는데, 이는 Tg- PARIS 마우스 및 성체 cPK-KO에서의 보호효과와 유사하고, 한편 이 파네솔 처리는 AAV-PARIS C631S 마우스에서 도파민 뉴런 생존에 어떠한 영향도 미치지 않는다(도 7e 및 7f). 파네솔에 의한 도파민작동성 뉴런 구조에 수반하여, AAV-PARIS WT에 있어서 암페타민 유도성 회전 행동의 회복이 달성된다(도 7g).

본 발명의 주요 발견은, 파네솔, 즉 (3,7,11-트리메틸-2,6,10-도데카트리엔-1-올), 15개 탄소 세스퀴테르페노이드 분자가 PARIS의 파네실화와 억제를 통한, PGC-1α의 강력한 유도제라는 것이다. PARIS가 발현되는 상황에서 PGC-1α 유도제를 스크리닝한 후, PGC-1α 유도제를 2차 스크리닝함으로써, PARIS에 의해 PGC-1α가 억제되는 것을 방지하였던 화합물 몇 가지의 동정이 달성되었다. 파네솔은 ADME 특성들을 가졌기 때문에 추가의 특성규명을 위하여 선택되었는데, 이는 이 파네솔이 PGC-1α 수준을 변경할 수 있었던, 실행 가능한 경구 생체이용가능성 화합물이자 뇌 투과성 화합물일 수 있었음을 암시한다. 마우스 먹이를 통한 파네솔의 경구 투여는 BBB를 효과적으로 침투하여 PGC-1α 수준을 향상시킨다. 파네솔이 PGC-1α 수준을 향상시키는 기작의 탐구는, PARIS의 631번 시스테인에서 파네실화가 일어남을 발견해냈다. PARIS의 파네실화는, 이것이 염색질과 결합하여 유전자 전사를 억제하는 능력을 눌러준다. 파네솔에 의한 PARIS의 억제는, PD 모델에서 PARIS 과발현에 의해 유도되는 도파민 뉴런의 소실에 대한 보호 기능 발휘를 유도한다.

파네실화와 제라닐제라닐화(단백질 프레닐화)는, 파네실 또는 제라닐제라닐 이소프레노이드 중 어느 하나의, 다수 단백질의 C-말단에 보존된 시스테인 잔기에의 공유 부가를 수반하는 지질 변형이다. 다수의 단백질이 프레닐화되는 것으로 공지되어 있는데, 이 프레닐화는 막으로의 단백질 표적화, 단백질-단백질 상호작용에 수반되고, 결과적으로는 단백질의 세포 내 활성을 변화시킨다.

PARIS는 이의 파네실화에 관여하는 FT아제와 상호작용한다. 본 발명의 발명자들이 아는 한, 단백질 프레닐화에 의한 전사 조절은 전례가 없다. 아라비돕시스 MADS 박스 전사 인자 APETALA1(AP1)의 파네실화가 기술된 바 있지만, AP1의 기능과 특이성에 있어서 이의 역할은 확인될 필요가 있다. PARIS의 파네실화는, 유전자 전사에 영향을 미칠 수 없는 염색질과 PARIS의 결합(이는 전사 제어의 유일무이한 기작임)을 방지한다. 기타 전사 조절인자가 단백질 프레닐화에 의해 제어되는지를 확인하는 것이 중요할 것이다.

눈에 띄는 점은, 조건부 유전자이식 접근법을 통한 PARIS의 과발현, 즉 조건부 파킨 녹아웃 마우스 및 산발성 PD 시신(인간)의 흑질에서 관찰되는 수준과 동일한 수준으로의 과발현은, 도파민 뉴런의 선택적 소실을 유도함이 발견되었다는 점이다. PARIS 유전자이식 마우스에서의 뉴런 퇴행은, PARIS의 수준이 훨씬 높음에도 불구하고 퇴행을 보이지 않았던 기타 뇌 영역, 예컨대 피질에 비하여 SN에서의 도파민 뉴런에 한정되어 있다. PARIS의 AAV 매개 과발현은, 파킨 또는 PGC-1α 과발현에 의해 구조되는 DA 뉴런의 소실을 유도함이 앞서 보였다. 흥미롭게도, PARIS 유전자이식 마우스는 조기에 폐사하였다. 조기 폐사의 원인은 알려져있지 않지만, 아마도 CamKIIα 촉진인자에 의해 유도된, 구역들 내 PARIS의 발현으로 말미암는 것으로 추정된다. 파네솔은 DA 뉴런의 소실을 완전히 방지하고, PARIS 유전자이식 마우스의 조기 폐사를 부분적으로나마 구조하는데, 이는 PGC-1α 감소가 조기 폐사뿐만 아니라 도파민 뉴런의 소실을 설명해줄 수 있음을, 적어도 부분적으로 암시하는 것이다. 파네솔의 보호 효과는, PARI의 파네실화를 향상시킴으로써 이의 전사 억제를 방지하여 PARIS를 억제하는 것을 통해 발휘된다. 파네솔이 파네실화 결손 돌연변이 PARIS 631S에 대해 보호 기능을 발휘할 수 없다는 관찰은 이러한 개념과 일치한다. 파네솔은 또한 파킨의 성체 조건부 녹아웃으로 말미암은 도파민 뉴런의 소실을 완전히 방지한다. PARIS의 결실은 PGC-1α 감소를 방지하고, 감소한 PGC-1α의 유해한 결과들이 발생하는 것을 막음으로써 성체 조건부 파킨 녹아웃 마우스에서 도파민 뉴런의 소실을 방지하므로, 성체 조건부 파킨 녹아웃 마우스 내 파네솔의 PARIS 파네실화 향상 및 PGC-1α 수준 및 PGC-1α 표적 유전자 복구는 파네솔의 보호작용을 설명해줄 수 있을 것이다.

파네솔은 파렌소이드 X 수용체(FXR, NR1H4라고도 공지됨)에 대한 공지의 효현제이다. 본 발명의 발명자들과 그 외 사람들은 FXR이 뇌 내에서 발현되지 않음을 보였기 때문에, 본원에 보고된 파네솔의 효과는 FXR 독립적인 것일 수 있다. 파네솔은 또한 시험관 내에서 PPARα와 PPARγ 둘 다를 활성화할 수 있는데, 이 경우 파네솔은 PPARα에 더 강력한 효과를 보인다. 파네솔은, 마우스 뇌와 SH-SY5Y 세포 내에서 PPARα와 PPARγ에 어떠한 영향도 미치지 않음이 발견되었는데, 이는 뇌에서 PGC-1α에 대한 파네솔의 작용이 PPARα와 PPARγ에 독립적임을 말해준다. 더욱이 파네솔은 PARIS의 파네실화를 통해 PGC-1α의 수준을 향상시키지만, PARIS의 부재 하에서는 PGC-1α의 수준을 증가시키지는 못하고, PPARγ는 PGC-1α의 수준을 조절하는 것으로 공지되어 있지 않으므로, PGC-1α에 대한 파네솔의 작용은 파네솔의 PARIS 파네실화를 통하고, 이의 PPAR에 대한 작용과는 독립적일 가능성이 가장 크다.

본원에 적용된 바와 같은 농도와 유사한 농도로 래트 먹이 중에 존재하는 파네솔이 탄수화물 및 지질 대사의 관점에서 연구된 바 있는데, 이 연구에 의하면 파네솔은 FXR 및 PPARα에 대한 자체의 작용을 통하여 혈청 중 트리글리세라이드, 콜레스테롤 수준을 낮춘다. 설치류 먹이 중 파네솔은 또한 FXR 및 PPAR에 대한 자체의 작용과는 독립적으로, 단백질의 제라닐제라닐화 향상을 통해 심장보호 효과를 보인다. 파네솔은 보통 부분적으로 지질 대사 질환과 심혈관 건강에 유리한 효과를 발휘할 수 있는 약초, 장과류 및 과일류에서 발견된다. 파네솔은 생체 내에서 인산화되어 FPP를 생성할 수 있는데, 이 경우 파네솔은 단백질의 파네실화와 제라닐제라닐화를 향상시킬 수 있다. 그러므로 단백질 프레닐화의 파네솔에 의한 향상은 뇌와 심장 둘 다에 있어 이것의 유리한 효과에 관한 주요 기작인 것으로 보인다.

파네솔은 또한 담배에 공통으로 들어가 있는 첨가제이다. 아마도 파네솔은 담배 연기의 구성성분으로서, 담배 연기가 PD 발생에 대하여 보호효과를 보이는 것에 대한 역학 데이터를 설명해 줄 수 있을 것이다. 인간에 있어서 안전하게 관용될 수 있는 파네솔의 양을 측정하는 것뿐만 아니라, 이의 약동학적 특성과, 파네솔이 인간에 있어 PD의 퇴행 효과에 대해 보호기능을 발휘하는지를 확인하는 것은 중요할 것이다.

방법/실시예

리포터 세포주의 제조 및 화학적 스크리닝

안정한 리포터 SH-SY5Y 세포(SH-PGC-1α-Luc)를 위해, 1-Kb 인간 PGC-1α 촉진인자를 렌티바이러스 pGreenFire(System Biosciences)에 삽입하였다. SH-SY5Y 세포에 농축 바이러스를 형질도입하고 나서, 추가 정보에 기술된 바와 같이 퓨로마이신(1 ㎍/ml)으로 선택하였다. SH-PGC-1α-Luc 세포를 96웰 백색 편평 바닥 평판에 DMEM 100 ㎕ 중 웰당 10,000개 세포로 도말하고 나서, 37℃ 및 5% CO₂에서 밤새도록 항온처리하였다. 다음 날, 화합물로 처리한 다음, 48 시간 동안 항온처리 후 SteadyGlo 시약(Promega)으로 루시퍼라에제 활성을 측정하였다. 각각의 평판은 내부 대조군을 3개, 다이드제인(양성 대조군 10μM) 및 음성 대조군 2개(미처리 및 DMSO 처리)를 가졌다. 각각의 웰에 대한 미가공 루시퍼라아제 데이터를 추가 정보에 기술된 바와 같이 정규화하였다.

플라스미드 구성

문헌(Shin et al., 2011)에 기술된 바와 같이 pCMV-PARIS 야생형(pCMV-Tag2A, Stratagene)을 제조하였고, QuikChange 위치 특이적 돌연변이유발 키트(Stratagene)를 사용하여 pCMV-PARIS C631S 돌연변이체를 제조하였다. 더욱 상세한 설명은 추가 정보를 통해 확인 가능하다.

시험관 내 파네실화 검정

문헌(Nguyen et al., 2009; Nguyen et al., 2010; Wu et al., 2007)에 기술된 바와 같이, 시험관 내 파네실화 검정(IVF)을 수행하였다. 요약하면, 전반적 대사성 파네실화를 위해 [³H]-파네실 피로인산염(FPP)(NET1042001MC, PerkinElmer) 5 μCi로 SH-SY5Y 세포를 처리하였고, 파네실 항체를 사용하는 면역블럿 분석에 의해 면역침전체를 모니터링하였다. 인공 IVF를 위해 세포 용해물을 바이오틴-제라닐 피로인산염(Biotin-GPP, RabGGTase의 특이적인 기질, LI-015, Jena Bioscience) 및 재조합 FT아제 W102T/Y154T 돌연변이체(PR-952, Jena Bioscience)와 함께 6 시간 동안 항온처리하였다. 형광도 기반 IVF를 위해, 면역침전된 Flag-태깅 PARIS를 NBD-GPP(LI-014, Jena Bioscience)와 함께 20분 동안 항온처리하였다. SDS-PAGE 이후, 형광분광복사계(fluorescent imager)(FluorChem^TM Q 시스템)로 겔을 스캔하였다. 더욱 상세한 설명은 추가 정보를 통해 확인 가능하다.

CAST, EMSA, ChIP, qRT-PCR 검정

추가 정보에 기술된 바와 같이, 전기영동 이동성 변화 검정(EMSA)을 위해 GST, GST-PARIS, GST-PARIS-C631S를 사용하였다. 추가 정보에 기술된 바와 같이, 제조자의 지침에 따라 염색질 면역침전법을 수행하였다.

조건부 PARIS 유전자이식 마우스 및 조건부 파킨 녹아웃 마우스

tet-오프(tet-off) 상태인 조건부 PARIS 유전자이식 마우스를 제조하기 위해, 선형화된 유전자이식 구조물(NotI 절단, 8 kbp)을 배에 미세주사하고, 이 배를 B6D2F1 가임신 암컷 마우스로 옮겼다(국립 암 연구소 유전자이식 동물 코어; Transgenic Animal Core of National Cancer Institute). 고 복사체 마우스 3 마리(121번, 158번, 179번 주)를 C57/BL6 마우스와 짝 짓기시켜(2 ~ 3세대) 유전자이식 주를 확립하였다. 조건부 유전자이식 마우스 내 PARIS 유도를, 마우스에 독시사이클린 함유 먹이를 공급함으로써 억제하였다(독시사이클린 먹이(멸균), 독시사이클린 1 kg당 200 mg, Bio-Serv).

파킨 녹아웃의 Cre이 플록스(flox)된 조건부 모델을 제조하기 위하여, GFP 융합 Cre 리콤비나아제를 발현하는 아데노 연관 벡터(AAV-GFPCre)를, 엑손 7이 플록스된 파킨 마우스(파킨^Flox/Flox)의 SN에 정위 도입하였다.

통계학적 분석

일반적으로 정량 데이터를 평균 ± SEM으로 제시하였다. 통계학적 유의성은 비대응 표본 양측 스튜던트 t 검정(unpaired two-tailed Student's t test), 또는 스튜던트-뉴먼-쾰스(Student-Newman-Keuls) 사후비교분석에 의한 ANOVA 검정 중 어느 하나를 통해 평가되었다. p < 0.05일 때, 그 차이는 유의미한 것으로 간주되었다.

약학 제제

본 발명의 약학 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 담체 중에 용해 또는 분산된, 파네솔과 같은 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체-γ 보조활성인자-1α(PGC-1 α)의 발현 유도체 하나 이상 유효량만큼을 포함한다. "약학적 또는 약학적으로 허용 가능한"이란 어구는, 어떤 분자 독립체 및 조성물이, 예컨대 인간과 같은 동물에 적절히 투여되었을 때 부작용, 알러지 반응 또는 기타 지향하지 않는 반응을 일으키지 않는 경우를 지칭한다. PGC-1α의 발현 유도제 적어도 하나 또는 추가의 활성 성분을 포함하는 약학 조성물의 제조는, 본원에 참조로 인용되어 있는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Ed. Lippincott Williams and Wilkins, 2005]에 예시된 바와 같이 본 발명에 비추어 볼 때 당 업자가 알 것이다. 더욱이 제제가 동물(예컨대 인간)에 투여되기 위해서는, 생물학적 표준품 관리 FDA 사무국(FDA Office of Biological Standards)에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 기준을 충족하여야 함이 이해될 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 당 업자에게 공지될 바와 같이(예컨대 본원에 참조로서 인용된 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329) 참조), 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예컨대 항균제, 항진균제), 등장제, 흡수지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료와 같은 물질들과 이것들의 조합을 포함한다. 종래의 임의의 담체가 활성 성분과 비혼화성인 경우를 제외하고, 약학 조성물에 이 종래 담체를 사용하는 것이 고려된다.

PGC-1α 발현 유도제는 그것이 고체 형태로 투여되는지, 액체 형태로 투여되는지, 아니면 에어로졸 형태로 투여되는지 여부에 따라서, 그리고 그것이 주사와 같은 투여 경로용으로서 멸균되어야 하는지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 당 업자에게 공지될 바와 같이(예컨대 본원에 참조로서 인용된 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990) 참조), 정맥 내, 피내, 경피, 척추강 내, 동맥 내, 복막 내, 비내, 질내, 직장내, 국소, 근육내, 피하, 점막, 경구, 국소, 국부, 흡입(예컨대 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입, 표적 세포를 직접 담그는 (카테터, 세척을 통한) 국부 관류에 의해 투여될 수 있거나, 크림, 액체 조성물(예컨대 리포좀) 중에 포함되어 투여될 수 있거나, 또는 다른 방법, 또는 이와 같은 방법들의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다. (파네솔을 비롯한) PGC-1α 발현 유도제는, 유도제를 포함하는 식품 하나 이상이 약초, 장과류 및/또는 과일과 같은 음식물로서 섭취됨으로써 이를 필요로 하는 개체에 제공될 수 있다.

PGC-1α 발현 유도제는 유리 베이스(중성) 또는 염의 형태로서 조성물로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 산 부가 염, 예컨대 단백성 조성물의 유리 아미노기로 생성되었거나, 또는 무기산, 예컨대 염화수소산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 주석산 또는 만델산으로 생성된 산 부가염을 포함한다. 유리 카복실기로 생성된 염은 또한, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물과 같은 무기 염기; 또는, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유래할 수 있다. 제제화 시 용액은 투여 제제와 양립 가능한 방식으로, 치료적으로 유효한 양만큼 투여될 것이다. 본 제제는 다양한 투여형, 예컨대 주사 용액과 같이 비경구 투여용으로 제제화된 투여형, 또는 폐로의 전달을 위한 에어로졸, 또는, 예컨대 약물 방출 캡슐과 같이 영양 투여용으로 제제화된 투여형 등으로 용이하게 투여된다.

또한 본 발명에 따라, 투여에 적합한 본 발명의 조성물은 비활성 희석제와 함께 또는 비활성 희석제 없이 약학적으로 허용 가능한 담체 중에 제공된다. 담체는 동화될 수 있어야 하며, 액체, 반고체, 즉 페이스트, 또는 고체 담체를 포함한다. 종래의 매질, 제제, 희석제 또는 담체 임의의 것이 투여받는 개체 또는 이것들에 함유된 조성물의 치료 효능에 유해한 경우를 제외하고, 본 발명의 방법을 수행하는 데에 사용되기 위한 투여가능 조성물 중 이 담체를 사용하는 것이 적절하다. 담체 또는 희석제의 예들로서는 지방, 오일, 물, 염수 용액, 지질, 리포좀, 수지, 결합제, 충전제 등, 또는 이의 조합을 포함한다. 본 조성물은 또한 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키는 다양한 항산화제를 포함할 수 있다. 추가로, 예컨대 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤(예컨대 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 또는 이것들의 조합(이에 한정되는 것은 아님)과 같은 보존제에 의해 미생물 활동의 방지가 달성될 수 있다. 본 발명에 따라, 조성물은 편리하고 실용적인 임의의 양태, 즉 용해, 현탁, 유화, 혼합, 캡슐화 및 흡수 등에 의해 담체와 합하여진다. 이러한 방법은 당 업자에게는 통상적인 것이다.

본 발명의 특정 구현예에 있어서, 조성물은 반고체 또는 고체 담체와 철저히 합하여지거나 혼합된다. 혼합은 분쇄(grinding)와 같은 편리한 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 안정화제도 또한 혼합 공정에 첨가되어 조성물이 치료 활성을 상실하는 것(즉 위 내에서의 변성)을 막아줄 수 있다. 본 조성물에 사용되기 위한 안정화제의 예들로서는 완충제, 예컨대 글리신 및 리신과 같은 아미노산, 예컨대 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 솔비톨, 만니톨과 같은 탄수화물 등을 포함한다.

추가의 구현예들에서, 본 발명은 PGC-1α의 발현 유도제, 하나 이상의 지질 및 수성 용매를 포함하는 약학적 지질 비이클 조성물의 용도에 관한 것일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "지질"이라는 용어는, 특질상 물에 불용성이고 유기 용매로 추출될 수 있는 광범위한 물질 중 임의의 것을 포함하는 것으로 정의될 것이다. 이처럼 광범위한 화합물 군은 당 업자에게 널리 공지되어 있으며, 본원에 사용된 "지질"이라는 용어는 어떤 특정의 구조를 가지는 것에 한정되는 것은 아니다. 그 예들로서는, 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체를 함유하는 화합물을 포함한다. 지질은 천연 발생된 것이거나 합성된 것(즉 인간에 의해 디자인 또는 생산된 것)일 수 있다. 그러나 지질은 보통 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 예컨대 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 라이소지질, 글리코스핑고지질, 당지질, 설파타이드, 에테르 및 에스테르-결합 지방산을 가지는 지질, 중합 가능한 지질, 그리고 이것들의 조합을 포함한다. 물론 본원에 특별히 기재된 것들 이외의 화합물로서, 당 업자에 의해 지질이라고 이해되는 화합물도 또한 본 발명의 조성물 및 방법에 포함된다.

당 업자는, 지질 비이클 중에 조성물을 분산시키기 위하여 사용될 수 있는 여러가지 기술을 잘 알 것이다. 예컨대 PGC-1α의 발현 유도제는 지질을 함유하는 용액 중에 분산될 수 있거나, 지질로 용해될 수 있거나, 지질로 유화될 수 있거나, 지질과 혼합될 수 있거나, 지질과 합하여질 수 있거나, 지질에 공유 결합할 수 있거나, 액체 중 현탁액으로서 함유될 수 있거나, 미셀 또는 리포좀에 함유되거나 이와 복합체화될 수 있거나, 아니면 당 업자들에게 공지된 임의의 방법에 의해 지질 또는 지질 구조와 회합될 수 있다. 분산은 리포좀의 형성을 초래할 수 있거나 초래할 수 없다.

대상체에 투여된 본 발명의 조성물의 실제 투여량은, 예컨대 체중, 병태의 심각성, 치료중인 질환의 유형, 선행하거나 동시에 행하여지는 치료적 개입, 환자의 특발성질환 및 투여 경로와 같은 물리적 및 생리학적 요인들에 의해 결정될 수 있다. 투여형과 투여 경로에 따라, 바람직한 투여형의 투여 횟수 및/또는 유효량은 대상체의 반응에 따라 달라질 수 있다. 투여에 관여하는 실무자는, 임의의 경우 조성물 중 활성 성분(들)의 농도, 개별 대상체에 적절한 투여량(들)을 결정할 것이다. 임의의 구현예들에서, 약학 조성물은, 예컨대 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 구현예들에서, 활성 화합물은 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%, 그리고 상기 범위 내에서 추론될 수 있는 임의의 범위로 포함될 수 있다. 자연에서 치료학적으로 유용한 조성물 각각 중 활성 화합물(들)의 양은, 적합한 투여형이 화합물의 주어진 임의의 단위 용량으로 수득될 방법으로 마련될 수 있다. 요인들, 예컨대 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품의 유통기한, 그리고 기타 약리학적 고려사항들은 이러한 약학 제제를 제조하는 분야의 당 업자에 의해 고려될 것이고, 보통 말하는 다양한 투여형과 치료 계획이 요망될 수 있다.

기타 비 제한적 예들에 있어서, 용량은 또한 투여당 약 1 마이크로그램/체중 1kg, 약 5 마이크로그램/체중 1kg, 약 10 마이크로그램/체중 1kg, 약 50 마이크로그램/체중 1kg, 약 100 마이크로그램/체중 1kg, 약 200 마이크로그램/체중 1kg, 약 350 마이크로그램/체중 1kg, 약 500 마이크로그램/체중 1kg, 약 1 밀리그램/체중 1kg, 약 5 밀리그램/체중 1kg, 약 10 밀리그램/체중 1kg, 약 50 밀리그램/체중 1kg, 약 100 밀리그램/체중 1kg, 약 200 밀리그램/체중 1kg, 약 350 밀리그램/체중 1kg, 약 500 밀리그램/체중 1kg으로부터 약 1000 mg/체중 1kg 또는 이 이상, 그리고 상기 범위 내에서 추론될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 나열된 수치들로부터 추론 가능한 범위의 비 제한적 예들에 있어서, 전술된 수치들을 기준으로 약 5 mg/체중 1kg 내지 약 100 mg/체중 1kg, 약 5 마이크로그램/체중 1kg 내지 약 500 밀리그램/체중 1kg의 범위만큼이 투여될 수 있다.

A. 영양 조성물 및 제제

본 발명의 일 구현예에서, PGC-1α의 발현 유도제는 영양 경로(alimentary route)를 통해 투여되도록 제제화된다. 영양 경로는 조성물이 소화관과 직접 접촉하는 모든 가능한 투여 경로를 포함한다. 구체적으로 본원에 개시된 약학 조성물은 경구, 협측, 직장 또는 설하 투여될 수 있다. 그러므로 이와 같은 조성물은 비활성 희석제 또는 동화될 수 있는 식용 담체와 함께 제제화될 수 있거나, 또는 경질 또는 연질 외피 젤라틴 캡슐 내에 내포될 수 있거나, 또는 정제로 압축될 수 있거나, 또는 식사 음식에 직접 혼입될 수 있다.

임의의 구현예들에서, 활성 화합물은 부형제와 혼입될 수 있으며, 삼킬 수 있는 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다[Mathiowitz et al., 1997; Hwang et al., 1998; 미국특허 제5,641,515호; 동 제5,580,579호 및 동 제5,792,451호; 이들 문헌은 각각 그 전체로서 본원에 참조로 인용되어 있음]. 정제, 트로키, 알약 및 캡슐 등은 또한 다음과 같은 것들을 함유할 수도 있다: 예컨대 트래거칸트 검, 아카시아 검, 옥수수 전분, 젤라틴 또는 이것들의 조합과 같은 결합제; 예컨대 인산이칼슘, 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 또는 이것들의 조합과 같은 부형제; 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 또는 이것들의 조합과 같은 붕해제; 예컨대 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제; 예컨대 수크로스, 락토스, 사카린 또는 이것들의 조합과 같은 감미제; 예컨대 페퍼민트, 윈터그린 오일, 체리향, 오렌지향 등과 같은 풍미제. 단위 투여형이 캡슐이면, 상기 유형의 물질들에 더하여 액체 담체를 함유할 수 있다. 기타 다양한 물질이 코팅물로서 존재할 수 있으며, 그렇지 않다면 투여 단위의 물리적 형태를 변형할 수 있다. 예컨대 정제, 알약 또는 캡슐은 셸락 또는 당, 아니면 이 둘 다로 코팅될 수 있다. 투여형이 캡슐이면, 상기 유형의 물질들에 더하여, 예컨대 액체 담체와 같은 담체를 함유할 수 있다. 젤라틴 캡슐, 정제 또는 알약은 장용 코팅될 수 있다. 장용 코팅은 조성물이 위나 상부 장(upper bowel)(즉 pH가 산성인 장기) 내에서 변성되는 것을 막아준다. 예컨대 미국특허 제5,629,001호를 참조한다. 소장에 도달할 때, 그 안의 염기성인 pH는 코팅을 용해하고, 조성물이 방출되어 특화된 세포(예컨대 상피 장세포 및 Peyer반 M 세포)에 의해 흡수된다. 엘릭시르 시럽은 활성 화합물, 수크로스(감미제), 메틸- 및 프로필파라벤(보존제), 염료 그리고, 예컨대 체리향 또는 오렌지향과 같은 풍미제를 함유할 수 있다. 물론 임의의 단위 투여형을 제조하는 데에 사용된 임의의 물질은 약학적으로 순수하고, 사용 량일 때 실질적으로 무독성이어야 한다. 더욱이 활성 화합물은 지연 방출형 제제 및 제제들에 혼입될 수 있다.

경구 투여의 경우, 본 발명의 조성물은 대안적으로 하나 이상의 부형제와 함께 혼입되어, 구강 세척제, 치약, 협측 정제, 경구 스프레이 또는 설하 경구 투여 제제의 형태를 가질 수 있다. 예컨대 구강 세척제는 활성 성분을 필요량만큼, 예컨대 붕산나트륨 용액(Dobell 용액)과 같은 적절한 용매 중에 혼입하여 제조될 수 있다. 대안적으로 활성 성분은 경구 용액, 예컨대 붕산나트륨, 글리세린 및 중탄산칼륨 함유 용액에 혼입될 수 있거나, 또는 치약에 분산될 수 있거나, 또는 치료적 유효량으로 조성물, 즉 물, 결합제, 연마제, 풍미제, 발포제 및 흡습제를 포함할 수 있는 조성물 중에 첨가될 수 있다. 대안적으로 본 조성물은 혀 밑에 넣어지거나 입 안에서 용해될 수 있는 정제 또는 용액의 형태로 만들어질 수 있다.

영양 투여의 기타 형태에 적합한 추가의 제제는 좌제를 포함한다. 좌제는 다양한 중량과 형상을 가지고, 일반적으로는 직장에 삽입되는 형태로 투약되는 고체 투여형이다. 삽입 후 좌제는 연화, 용융 또는 강 내 체액 중에 용해된다. 일반적으로 좌제의 경우 통상의 담체는, 예컨대 폴리알킬렌 글리콜, 트리글리세라이드 또는 이것들의 조합을 포함할 수 있다. 임의의 구현예들에서, 좌제는, 예컨대 활성 성분을, 약 0.5% 내지 약 10%, 바람직하게 약 1% 내지 약 2% 범위의 양으로 함유하는 혼합물로 제조될 수 있다.

B. 비경구 조성물 및 제제

추가의 구현예들에서, PGC-1α의 발현 유도제는 비경구 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "비경구"란 용어는, 소화관을 우회하는 경로를 포함한다. 구체적으로, 본원에 개시된 약학 조성물은, 예컨대 정맥 내, 피내, 근육내, 동맥내, 척추강 내, 피하 또는 복막 내로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다(각각 본원에 전체로서 참조로 특별히 인용된 미국특허 제6,7537,514호, 동 제6,613,308호, 동 제5,466,468호, 동 제5,543,158호; 동 제5,641,515호; 및 동 제5,399,363호를 참조한다).

유리 베이스 또는 약리학적으로 허용 가능한 염으로서의 활성 화합물의 용액은 수 중에서, 예컨대 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 혼합될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 지질 폴리에틸렌 글리콜, 그리고 이것들의 혼합물 및 오일 중에 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하는 보존제를 함유한다. 주사제로서 사용되기 적합한 약학 제형은 멸균 수용액 또는 분산액과, 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다(전체로서 본원에 참조로 특별히 인용된 미국특허 제5,466,468호 참조). 모든 경우에 있어서, 제형은 멸균된 것이어야 하고, 주사의 용이함을 달성할 정도로 유체이어야 한다. 이는, 제조 및 보관 조건 하에 안정하여야 하고, 미생물, 예컨대 세균 및 진균의 오염 활동에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(즉 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이것들의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 분산 매질 또는 용매일 수 있다. 예컨대 레시틴과 같은 코팅을 사용하고, 분산액의 경우에는 요구 입도를 유지하며, 계면활성제를 사용함으로써 적당한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 활동의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산 및 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 다수의 경우, 등장제, 예컨대 당이나 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는, 조성물 중에 흡수 지연제, 예컨대 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴을 사용함으로써 달성될 수 있다.

수용액으로서의 비경구 투여를 위해, 예컨대 용액은 필요하다면 적합하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 처음에 충분한 염수나 글루코스로 등장성이 되어야 한다. 이러한 구체적인 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복막내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 발명에 비추어 볼 때 당 업자들이 알 것이다. 예컨대 하나의 투여형은 등장성 NaCl 용액 중에 용해될 수 있으며, 피하주입액에 첨가되거나, 아니면 제안된 주입 위치에 주사될 수 있다(예를 들어 문헌("Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580)을 참조한다). 치료중인 대상체의 상태에 따라 투여형에 있어 약간의 변동은 필연적으로 생길 것이다. 투여를 책임지고 있는 자는 어떠한 경우에 개별 대상체에 적당한 용량을 결정할 것이다. 더욱이, 인간에의 투여를 위해서 제제는 생물학적 표준품 관리 FDA 사무국에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 기준을 충족하여야 한다. 멸균 주사액은 필요에 따라, 상기 나열된 기타 다양한 성분들과 함께, 필요한 양만큼의 활성 화합물을 적당한 용매에 혼입한 후 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로 분산액은 멸균된 다양한 활성 성분을, 염기성 분산 매질과 상기 나열된 기타 필요 성분들을 함유하는 멸균 비이클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법으로서는, 앞서 멸균 여과된, 활성 성분과 추가의 요망되는 임의 성분의 용액으로부터 이러한 활성 성분과 임의 성분으로 이루어진 분말을 만들어내는 진공 건조 및 동결 건조 기술이 있다. 분말형 조성물은 안정화제와 함께, 또는 안정화제 없이, 예컨대 물이나 염수 용액과 같은 액체 담체와 합하여진다.

C. 여러가지 약학 조성물 및 제제

기타 본 발명의 바람직한 구현예들에서, 활성 화합물, 즉 PGC-1α의 발현 유도제는 다양한 여러가지 경로, 예컨대 국소(즉 경피) 투여, 점막 투여(비내, 질 등) 및/또는 흡입을 통한 투여용으로서 제제화될 수 있다.

국소 투여용 약학 조성물은 연고, 페이스트, 크림 또는 분말과 같은 투약 적용을 위하여 제제화된 활성 화합물을 포함할 수 있다. 연고는 모든 유질, 흡수성, 유화 및 수용성 베이스 국소 적용 조성물을 포함하는 한편, 크림과 로션은 유액 베이스만을 포함하는 조성물이다. 국소 투여되는 의약은 활성 성분이 피부를 관통하여 흡수되는 것을 촉진하는 경피흡수촉진제를 함유할 수 있다. 적합한 경피흡수촉진제로서는 글리세린, 알코올, 알킬 메틸 설폭사이드, 피롤리돈 및 라우로카프람을 포함한다. 국소 적용용 조성물에 사용 가능한 베이스는 폴리에틸렌 글리콜, 라놀린, 콜드 크림 및 석유뿐만 아니라, 기타 임의의 적합한 흡수, 유화 또는 수용성 연고 베이스를 포함한다. 국소 제제는 또한 활성 성분을 보존하고 균질한 혼합물을 제공하는 데에 필요한 바에 따라 유화제, 겔화제 및 항미생물 보존제를 포함할 수도 있다. 본 발명의 경피 투여는 또한 "패치(patch)"를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 예컨대 패치는 소정의 속도로 일정한 기간에 걸쳐 연속적인 방식으로 활성 성분 하나 이상을 공급할 수 있다.

임의의 구현예들에서, 약학 조성물은 점안액, 비내 스프레이, 흡입 및/또는 기타 에어로졸 전달 비이클에 의해 전달될 수 있다. 비강 에어로졸 스프레이를 통하여 조성물을 폐에 직접 전달하기 위한 방법은, 예컨대 미국특허 제5,756,353호 및 동 제5,804,212호(각각 전체로서 본원에 특별히 인용됨)에 기술된 바 있다. 이와 유사하게, 비내 미립자 수지를 이용한 약물의 전달(Takenaga et al., 1998) 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물을 이용한 약물의 전달(전체로서 본원에 특별히 인용된 미국특허 제5,725,871호)도 또한 약학 분야에 널리 공지되어 있다. 이와 유사하게, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지 매트릭스 형태인 경점막 약물 전달은 미국특허 제5,780,045호(전체로서 본원에 특별히 인용됨)에 기술되어 있다. "에어로졸"이란 용어는, 액화 또는 가압 가스 추진제 중에 분산된 액체 입자들의 미분 고체로 이루어진 콜로이드 시스템을 지칭한다. 본 발명에 있어 흡입을 위한 것으로서 통상적인 에어로졸은 액체 추진제, 또는 액체 추진제와 적합한 용매의 혼합물 중 활성 성분의 현탁액으로 이루어질 것이다. 적합한 추진제는 탄화수소 및 탄화수소 에테르를 포함한다. 적합한 용기는 추진제의 압력 요구조건에 따라 달라질 것이다. 에어로졸의 투여는 대상체의 나이, 체중 및 증상의 심각성과 반응에 따라 달라질 것이다.

본 발명의 키트

본원에 기술된 조성물들 중 임의의 것은 키트 안에 포함될 수 있다. 비 제한적 예에서, PGC-1α의 발현 유도제(예컨대 파네솔)가 키트 안에 포함될 수 있다.

키트는 적합하게 분액된 PGC-1α의 발현 유도제를 포함할 수 있으며, 몇몇 경우에는 하나 이상의 추가 제제를 포함할 수도 있다. 키트 내 성분(들)은 수성 매질 중에 포장되거나 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은, 일반적으로 내부에 성분이 담길 수 있고, 바람직하게는 내부에서 성분이 적합하게 분액될 수 있는 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 시린지 또는 기타 용기 수단을 적어도 하나 포함할 것이다. 키트 내에 하나를 초과하는 성분이 존재할 경우, 키트는 또한 일반적으로 내부에 추가의 성분들이 별도로 담길 수 있는 제2, 제3 또는 기타 추가의 용기를 포함할 것이다. 그러나 성분들의 다양한 조합이 바이알 안에 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 시판을 위해 통상 PGC-1α의 발현 유도제를 담기 위한 수단과 기타 임의의 시약 용기를, 빽빽하게 채워진 상태로 포함할 것이다. 이러한 용기들은 내부에 원하는 바이알들이 들어가 일체를 이루는 블로우 성형 플라스틱 용기 및 주사 용기를 포함할 수 있다.

키트의 성분들이 하나 및/또는 그 이상의 액체 용액 중에 포함되어 제공될 때, 액체 용액은 수용액으로서, 특히 바람직하게는 멸균 수용액이다. PGC-1α의 발현 유도제 조성물(들)은 주사용 조성물로 제제화될 수 있다. 이러한 경우, 용기 수단 자체는 시린지, 피펫 및/또는 기타 이러한 류의 장치일 수 있고, 이러한 용기 수단으로부터 유래하는 제제는 몸의 감염된 부위에 적용될 수 있으며, 동물에 주사될 수 있고/있거나, 키트의 다른 성분들에 적용될 수 있으며/있거나, 이와 혼합될 수 있다. 그러나 키트의 성분들은 건조 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약 및/또는 성분이 건조 분말로서 제공되면, 이 분말은 적합한 용매를 첨가함으로써 재구성될 수 있다. 용매는 또한 다른 용기 수단에 담겨 제공될 수도 있음이 상상될 수 있다.

본원에 언급된 모든 참고문헌, 예컨대 공보, 특허출원 및 특허는, 마치 각각의 참고문헌이 참조로서 인용되었으며, 본원에 전체로서 제시되었다고 개별적으로, 그리고 구체적으로 명시된 바와 동일한 정도로, 참조로서 본원에 인용되어 있다.

(특히 하기 특허청구범위의 청구항들에서) 본 발명을 기술하는 과정 중에 용어 "하나", "한" 및 "본", 그리고 이와 유사한 지시어의 사용은, 본원에 달리 명시되지 않거나 본원의 내용과 명백히 상충되지 않는 한 단수와 복수 둘다를 커버하는 것으로 해석될 것이다. 용어 "~를 포함하는", "~를 가지는", "~를 포함하여" 그리고 "~를 함유하는"은, 달리 명시되지 않는 한, 그 범위가 한정되지 않는 용어(open-ended term)(즉 "~를 포함하되, 그에 한정되는 것은 아닌"을 의미하는 용어)로서 해석될 것이다. 본원에 있어서 수치 범위의 인용은 오로지, 본원에 달리 명시되지 않는 한, 해당 범위에 속하는 각각의 별도 수치를 개별적으로 언급하는 간단한 방법으로 사용되어야 하고, 각각의 별도 수치는 그것이 본원에 개별적으로 나열된 것과 같이 명세서에 인용되어 있다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에 달리 명시되지 않는 한, 아니면 내용과 명확히 상충되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 임의의, 그리고 본원에 제공된 모든 예시들, 또는 예시를 나타내는 어구(예컨대 "~와 같은")를 사용하는 것은, 오로지 본 발명이 더 잘 이해되기 쉽게 만들기 위한 것으로서, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위에 제한을 부여하는 것은 아니다. 본 명세서의 어느 어구도, 청구되지 않은 임의의 요소가 본 발명의 실시에 필수적인 것임을 나타낸다고 해석되어서는 안될 것이다.

본 발명을 수행하는 데에 최선의 것이라고 발명자들에게 공지된 양태를 포함하여 본 발명의 바람직한 구현예들이 본원에 기술되어 있다. 이와 같이 바람직한 구현예들의 변형예들은 전술된 발명의 설명이 읽어졌을 때 당업자들에게 명백해질 수 있다. 본 발명의 발명자들은, 당업자들이 이러한 변형예들을 적절히 사용할 것으로 예상하며, 본 발명의 발명자들은, 본 발명이 본원에 구체적으로 기술된 바와는 달리 수행되도록 하고자 한다. 그러므로 본 발명은, 적용될 수 있는 법에 의해 허용되는 바와 같이, 본원에 첨부된 특허청구범위의 청구항들에 언급된 특허 대상의 모든 변형예와 균등물 모두를 포함한다. 더욱이 본 특허 대상의 가능한 모든 변형예들에 있어 전술된 요소들의 임의의 조합은, 본원에 달리 명시되지 않는 한, 아니면 내용과 명확히 상충되지 않는 한, 본 발명에 의해 포함된다.

Claims

퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체-γ 보조활성인자-1α(PGC-1 α) 발현 유도제 하나 이상을 유효량만큼 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에 있어서 파킨슨병을 예방 또는 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 유도제는 파네솔, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 인산염 유도체 또는 입체이성체인 방법.
제2항에 있어서, 파네솔은 경구 투여되는 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 파네솔은 대상체에 파네솔이 투여되지 않았을 때에 비하여 대상체 내 NRF-1의 mRNA 수준 증가를 초래하는 양으로 투여되는 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 파네솔은 대상체에 파네솔이 투여되지 않았을 때에 비하여 대상체 뇌 내 파네실 트랜스퍼라아제 활성을 증가시키는 양으로 투여되는 방법.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 파네솔은 대상체에 파네솔이 투여되지 않았을 때에 비하여 대상체 뇌 내 파킨 상호작용 기질(PARIS) 파네실화를 증가시키는 양으로 투여되는 방법.
제6항에 있어서, 파네실화는 PARIS의 631번 잔기인 시스테인 잔기 상에서 일어나는 방법.
제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 파네솔은, 파네솔이 투여되지 않은 대상체 내에서와 비교되었을 때 대상체 내에서 PARIS가 자체의 표적 DNA와 결합하는 것을 실질적으로 막는 방법.
제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 파네솔은, 파네솔이 투여되지 않은 대상체 내에서와 비교되었을 때 대상체 내에서 도파민 뉴런의 소실을 예방하는 방법.
AVS-3648, ABT-0529, 파네솔 및 이것들의 조합, 또는 이것들의 약학적으로 허용 가능한 염, 용매화물, 인산염 유도체 또는 입체이성체로 이루어진 군으로부터 선택된 독립체 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내에서 파킨슨병을 예방 또는 치료하는 방법.
제10항에 있어서, 독립체는 경구 투여되는 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 독립체는, 독립체가 대상체에 투여되지 않을 때에 비하여 대상체 내 NRF-1의 mRNA 수준 증가를 초래하는 양으로 투여되는 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 독립체는, 독립체가 대상체에 투여되지 않을 때에 비하여 대상체 뇌 내 파네실 트랜스퍼라아제 활성을 증가시키는 양으로 투여되는 방법.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 독립체는, 독립체가 대상체에 투여되지 않을 때에 비하여 대상체 뇌 내 PARIS 파네실화를 증가시키는 양으로 투여되는 방법.
제14항에 있어서, 파네실화는 PARIS의 631번 잔기인 시스테인 잔기 상에서 일어나는 방법.
제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 독립체는, 독립체가 투여되지 않은 대상체 내에서와 비교되었을 때 대상체 내에서 PARIS가 자체의 표적 DNA와 결합하는 것을 실질적으로 막는 방법.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 독립체는. 독립체가 투여되지 않은 대상체 내에서와 비교되었을 때 대상체 내에서 도파민 뉴런의 소실을 예방하는 방법.
제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 독립체는 AVS-3648인 방법.
제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 독립체는 ABT-0529인 방법.
독립체가 투여되지 않은 제2 대상체의 뇌 내 PGC-1α의 발현과 비교하였을 때 향상된, 대상체의 뇌 내 PGC-1α의 발현을 초래하는 독립체를 제1 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체 내에서 파킨슨병을 예방 또는 치료하는 약물을 동정하는 방법.
제20항에 있어서, 독립체는 경구 투여되는 방법.
제20항 또는 제21항에 있어서, 제2 대상체 내 NRF-1의 mRNA 수준에 비한, 제1 대상체 내 NRF-1의 mRNA 수준의 증가가 초래되는 방법.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 대상체의 뇌 내 파네실 트랜스퍼라아제 활성에 비한, 제1 대상체의 뇌 내 파네실 트랜스퍼라아제 활성의 증가가 초래되는 방법.
제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 대상체의 뇌 내 PARIS 파네실화에 비한, 제1 대상체의 뇌 내 PARIS 파네실화의 증가가 초래되는 방법.
제24항에 있어서, 파네실화는 PARIS의 631번 잔기인 시스테인 잔기에서 일어나는 방법.
제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 대상체 내에서 PARIS와 자체의 표적 DNA의 결합은, 제2 대상체 내에서의 PARIS와 자체의 표적 DNA의 결합에 비하여 감소한 방법.
제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 대상체 내 도파민 뉴런 소실에 비한, 제1 대상체 내 도파민 뉴런 소실의 감소가 초래되는 방법.
하기 단계들, 즉
a. PARIS 단백질 또는 이의 기능성 DNA 결합부를 발현하는 세포를 제공하는 단계;
b. 하나 이상의 독립체를 세포에 적용하는 단계;
c. 독립체로 처리된 세포 하나 이상이, 하나 이상의 독립체로 처리되지 않은 세포와 비교되었을 때 PARIS 단백질 또는 이의 기능성 DNA 결합부와 자체의 표적 서열의 결합 능을 잃는지 여부를 확인하는 단계
를 포함하는, 파킨슨병을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학 제제를 스크리닝하는 시험관 내 방법.
제28항에 있어서, 독립체는 화학물질, 단백질, 펩티드, 핵산 서열 또는 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.