KR20220128629A - 화학요법 부작용의 예방 및 치료에 사용하기 위한 아미노산을 포함하는 조성물(compositions comprising amino acids for use in the prevention and treatment of chemotherapy side effects) - Google Patents
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Abstract
화학요법을 받는 대상체에서 적어도 하나의 화학요법제에 의해 유발된 심장 독성의 예방 및/또는 치료에 사용되는 조성물로서, 상기 조성물은 활성제를 포함하고, 상기 활성제는 아미노산 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 리신 및 시트르산, 숙신산, 말산을 함유한다. 상기 화학요법제는 안트라사이클린, HER2/ErbB2 저해제, 티로신-키나아제 저해제, 혈관 내피 성장 인자 저해제, 면역 체크포인트 저해제로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
Description
본 발명은 일반적으로 화학요법 부작용의 예방 및 치료에 사용하기 위한 아미노산을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
유방암은 전 세계 여성들에게 가장 만연하는 종양 질환이다. 2012년에 대략 167만 건의 이러한 종양의 새로운 사례가 진단되었다. 2018에는, 거의 210만 명(11.6%)의 여성에게서 유방암의 새로운 사례가 진단되었고, 약 627,000명(6.6%)의 여성들이 이러한 유형의 암으로 사망하였다. 이것의 예후는 몇 가지 유형의 유방암이 여성의 높은 사망율을 초래하는 여전히 치유 불가능한 질환임을 시사한다.
안트라사이클린, 예컨대 독소루비신(DOX)은 널리 사용되는 매우 성공적인 항암 화학요법제이다. 불행하게도, DOX 투여는 호흡 곤란, 운동 불내성, 간독성 및 신장병증 외에도, 심근병증의 발병을 포함한, 비암 조직에 투여량-의존 부작용을 일으킨다. 안트라사이클린 외에, 인간 표피 성장 인자(HER) 2(HER2/ErbB2 저해제), 몇몇 티로신-키나아제 저해제, 혈관 내피 성장 인자 저해제 및 면역 체크포인트 저해제를 표적으로 하는 것들을 포함한 새로운 요법은 극심한 심혈관 독성을 보여주었다. HER2-양성 유방암 환자의 경우, 트라스투주맙에 의한 치료는 또한 치료 후 좌심실 박출 분율의 손실을 특징으로 하는 심근병증과 관련된다. 암 치료-관련 심근병증이 발병된 암 환자는 심장 독성이 없는 환자와 비교하여 상당히 나쁜 생존율을 갖는다. 이러한 독성은 다른 방식으로 치료가능한 몇몇 종양의 치료에서 제한 인자에 해당하며, 심장 예비력 부전이 있는 노령화 집단은 이러한 효과에 훨씬 더 취약할 수 있다. 따라서, 심장 독성의 위험은 이들 약물의 임상적 사용에 대한 가장 큰 제한 인자 중 하나로서, 급성 및 만성 심혈관 사건 둘 모두를 일으킨다. 예로서, DOX의 급성 심장 독성은 투여 후 수분 내지 수일 내에 발생될 수 있고, 보통은 저혈압, 부정맥 및 가장 중요하게는 좌심실 부전을 특징으로 한다. 또한 DOX가 다양한 세포내 과정에 영향을 미치기 때문에, 이러한 부작용의 분자 메커니즘이 완전히 이해되지는 않지만, DOX에 의한 심장 손상의 주요 매개체가 증가된 활성 산소 종(ROS)-의존 지질 과산화 및 감소된 수준의 항산화제 및 설프히드릴 기에 의한 산화적 스트레스임을 시사하는 증거가 증가하고 있다. 증가된 산화적 스트레스는 심근병증 및 심부전의 발병으로 이어진다. 미토콘드리아 기능 장애는 DOX 및 일반적으로 다른 화학요법제에 의해 유발된 부작용에 수반될 수 있는데, ROS의 높은 생성은 감소된 ATP 합성 및 심장 세포의 세포자멸사에 의해 미토콘드리아 손상을 유발하기 때문이다.
그럼에도 불구하고, 화학요법제에 의해 유발된 심근병증 및 심부전은 심혈관 원인에 의해 유발된 심부전과 비교하여 해부-병리학적 및 병태생리학 관점에서 상이하다. 이것이 전형적으로 화학요법-유발 심근병증 및 심부전이 통상적인 치료에 불응하는 이유이다.
또한, 화학요법에 의해 유발된 심장 독성의 효과적인 치료법과 관련하여 확인된 추가적인 중대한 문제는, 심근병증 또는 심부전의 치료에 잠재적으로 적합한 접근법이 특정한 그룹의 환자, 즉 암에 걸린 환자에게는 적합하지 않을 수도 있다는 것이 입증되고 있다는 사실이다. 암 세포는 건강한 대상체의 세포와 상이한 대사 프로파일을 가지며, 암 세포의 증식에서 미토콘드리아 활성의 역할에 대해 상충되는 증거가 나타나고 있다. 미토콘드리아 기능을 회복시킬 수 있는 치료적 시도는 암 세포의 증식을 증가시켜, 화학요법제에 의해 발휘된 항종양 효과를 감소시킬 수 있다.
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본 발명의 목적은 암에 걸려 화학요법을 받는 대상체에서 화학요법제에 의해 유발된 심장 독성을 중화하는 데 특히 효과적인 신규한 아미노산계 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라, 상기 목적은 하기 청구범위에서 구체적으로 재차 언급되는 청구대상에 의해 달성되며, 이는 본 개시내용의 완전한 부분을 형성하는 것으로 이해해야 한다.
본 발명의 실시형태는 화학요법을 받는 대상체에서 적어도 하나의 화학요법제에 의해 유발된 심장 독성을 예방하고/하거나 치료하기 위한 조성물을 제공하며, 그러한 조성물은 활성제를 포함하고, 상기 활성제는 아미노산 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 리신 및 시트르산, 숙신산, 말산을 함유한다.
적어도 하나의 화학요법제는 안트라사이클린, HER2/ErbB2 저해제, 티로신-키나아제 저해제, 혈관 내피 성장 인자 저해제, 면역 체크포인트 저해제로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 안트라사이클린은 바람직하게는 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 픽산트론, 사바루비신, 발루비신 및 이의 유도체로 이루어진 군 중에서 선택된다.
하나 이상의 실시형태에서, 조성물의 활성제는 히스티딘, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 시스테인 및 티로신으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산을 추가로 함유한다.
이제 첨부 도면을 참조하여 단지 예로서 본 발명에 대해 설명할 것이다.
- 도 1은 HL-1 심장 세포 처리를 나타내는 도식이다.
- 도 2는 생체내 마우스 처리를 나타내는 도식이다.
- 도 3은 특정한 아미노산 조성물이 DOX에 급성으로 노출된 HL-1 심근세포에서 미토콘드리아 기능 장애를 예방함을 보여준다. (A) 미토콘드리아 생체발생 표지자 발현: 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체-γ 공활성화제 1α(PGC1-α), 핵 호흡 인자-1(NRF1), 전사 인자 A(Tfam), 사이토크롬 c(cyt c), 및 사이토크롬 c 옥시다아제 아단위 IV(COX IV) mRNA 수준을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였다. 비처리된(CTRL) 세포에 대한 상대적 발현 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (B) COX IV 및 cyt c 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 검출하였다. 상대적인 값을 GAPDH 수준에 대해 농도계 분석으로 결정하였고; 비처리된(CTRL) 세포에 대한 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (C) 시트레이트 신타아제 활성. 값을 단백질 함량으로 정규화하였다(n = 3 실험). *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001 vs. 비처리된 세포; †p < 0.01 vs. DOX-처리된 세포; §p < 0.01 vs. BCAAem-처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 4는 TCA 중간체가 HL-1 심근세포에서 미토콘드리아 생체발생 유전자의 DOX-유발된 감소를 예방하지 않음을 보여준다. (A 내지 C) 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체-γ 공활성화제 1α(PGC-1α) (A), 핵 호흡 인자-1(NRF1) (B), 및 전사 인자 A(Tfam) (C). mRNA 수준을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였다. 비처리된(CTRL) 세포에 대한 상대적 발현 값을 1.0으로서 취하였다(n = 3 실험). C, 시트르산; S, 숙신산, M, 말산. *p < 0.05 vs. 비처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 5는 α5 보충이 HL-1 심근세포에서 DOX-유발된 산화적 스트레스를 예방함을 보여준다. (A) 미토콘드리아 H2O2 방출, (B) 기본 아코니타아제/총 아코니타아제 비, 및 (C) HL-1 세포에서 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD) 활성(n=3 실험). (D) 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 1(SOD1) 및 글루타티온 퍼옥시다아제 1(GPX1) mRNA 수준을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였다. 비처리된(CTRL) 세포에 대한 상대적 발현 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (E) 비처리된(CTRL) 세포 및 DOX-처리된 세포(n=3 실험)에서 8-히드록시-2'-데옥시구아노신(8-OHdG) 생성으로서 측정된 전체 DNA 산화적 손상. *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001 vs. 비처리된 세포; †p < 0.01 vs. DOX-처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 6은 α5 조성물이 HL-1 세포에서 DOX-유발된 사망을 예방함을 보여준다. HL-1 심근세포의 세포 독성을 MTT 검정에 의해 평가하였다. 세포를 48시간 동안 1 % α5 및 16시간 동안 1 μM DOX로 처리하였다. *p < 0.05 vs. 비처리된 세포; †p < 0.05 vs. DOX-처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 7은 α5 조성물이 DOX-처리된 마우스의 좌심실에서 미토콘드리아 기능 장애를 예방함을 보여준다. (A 및 F) 미토콘드리아 생체발생 표지자 발현. (A) PGC1-α, NRF1, Tfam, cyt c, COX IV 및 (F) SOD1, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 2(SOD2), 카탈라아제(Cat), 및 GPX1 mRNA 수준을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였다. 비히클-처리된(Veh) 마우스에 대한 상대적 발현 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (B) 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 양을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였다. 1.0으로서 취한 Veh-처리된 마우스에 대한 것과 비교하여 상대적인 단위로 표현하였다(n = 5 실험). (C) COX IV 및 cyt c 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 결정하였다. 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나아제(GAPDH) 수준에 대해 농도계 분석하여 상대적인 값을 결정하였고; Veh-처리된 마우스에 대한 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (D) 시트레이트 신타아제 활성. 값을 단백질 함량으로 정규화하였다(n = 3 실험). (E) 기초 산소 소모율. DOX 및 α5로 처리된 또는 처리되지 않은 마우스의 좌심실로부터 미토콘드리아를 분리하였다. 산소 소모율을 미토콘드리아 단백질 양으로 정규화하였다(n = 3 실험). *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001 vs. Veh-처리된 마우스; †p < 0.05 및 ††p < 0.01 vs. DOX-처리된 마우스. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 8은 상이한 신호 경로가 DOX-처리된 마우스에서 α5 보충의 보호 효과와 관련됨을 보여준다. (A, E 및 F) 유전자 발현. (A) 내피 산화질소 신타아제(eNOS), (E) 세스트린(Sestrin)2, 및 (F) Kr
ppel-유사 인자 15(KLF15) mRNA 수준을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였다. 비히클(Veh)-처리된 마우스의 상대적 발현 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (B, C, D 및 G) 단백질 수준. (B) 포스포-eNOS, (C) 포스포-S6, (D) 포스포-mTOR 및 (G) 포스포-BCKDH 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 검출하였다. 상대적인 값을 농도계로 분석하였고, 각각 총 eNOS, S6, mTOR 및 BCKDH 수준에 대한 비로서 기록하였다. Veh-처리된 마우스에 대한 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). *p < 0.05 및 **p < 0.01 vs. Veh-처리된 마우스; †p < 0.05 vs. DOX-처리된 마우스. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 9는 상이한 신호 경로가 DOX-처리된 HL-1 심근세포에서 α5 보충의 보호 효과와 관련됨을 보여준다. (A, D 및 F) 유전자 발현. (A) eNOS, (D) 세스트린2, (F) KLF15 mRNA 수준을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였다. 비처리된(CTRL) 세포에 대한 상대적 발현 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (B, C, E 내지 H) 단백질 수준. (B) 포스포-eNOS, (C) 포스포-S6, (E) 포스포-Akt, (F) KLF15, (G) PGC-1α 및 COXIV, 및 (H) 포스포-S6 및 포스포-BCKDH 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 검출하였다. 상대적인 값을 농도계 분석하였고, 각각 총 eNOS, S6, Akt, 및 BCKDH 수준에 대한 비로서 기록하였고; KLF15, PGC-1α 및 COXIV를 GAPDH로 정규화하였다. 비처리된 HL-1 세포에 대한 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (G) 특이적 KLF15 siRNA 또는 비표적 siRNA 중 어느 하나로 형질주입되고, DOX 또는 α5를 단독으로 또는 병용하여 처리된 HL-1 세포에서 PGC1-α 및 COX IV 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 측정하였다. 비처리된 HL-1 세포에 대한 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (H) S6 및 BCKDH 인산화를 (G)에서와 같이 HL-1 세포에서 면역블로트 분석에 의해 측정하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001 vs. 비처리된 세포; †p < 0.05 vs. DOX-처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 10은 HL-1 심근세포에서 특이적 Klf15, eNOS 및 Raptor 침묵을 보여준다. (A 내지 C) Klf15, eNOS 및 Raptor mRNA 수준을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였고, KLF15, eNOS 및 Raptor 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 검출하였다. 비처리된(CTRL) 세포에 대한 상대적 발현 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). *p < 0.05 vs. 비처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 11은 HL-1 심근세포에서 특이적 eNOS 및 Raptor 침묵을 보여준다. (A) 특이적 eNOS siRNA 또는 비표적 siRNA 중 어느 하나로 형질주입되고, DOX 또는 α5를 단독으로 또는 병용하여 처리된 HL-1 세포에서 PGC1-α 및 COX IV 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 측정하였다. (B) 특이적 Raptor siRNA 또는 비표적 siRNA 중 어느 하나로 형질주입되고, DOX 또는 α5를 단독으로 또는 병용하여 처리된 HL-1 세포에서 PGC1-α 및 COX IV 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 측정하였다. 비처리된(CTRL) 세포에 대한 값을 1.0으로서 취하였다(n = 3 실험). *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001 vs. 비처리된 세포; †p < 0.05 vs. DOX-처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 12는 심근세포에서 독소루비신(DOX)에 의해 유발된 미토콘드리아 손상에 대한 α5 보호 작용의 제안된 모델을 보여준다. 플러스(+) 및 마이너스(-) 부호는 DOX, 및, 잠재적으로, α5 표적 부위에 의해 유발된 자극 또는 저해를 나타낸다. DOX는 감소된 TCA 사이클 중간체 및 미토콘드리아 에너지 생성 외에, 다음과 같이 미토콘드리아 생체발생 및 기능을 감소시킨다: 1) Ppargc1a 및 Ppargc1b의 촉진제와 복합체화되고, ROS 방어 유전자를 포함한 미토콘드리아 유전자의 전사를 차단하는, 토포이소머라아제 IIβ(TOP2B)에 결합, 2) 미토콘드리아 생리학의 중요한 조절자인, eNOS 발현 및 mTORC1 활성의 감소, 3) 높은 수준에서의 독성인, α-케토산 및 BCAA 축적에 의한 KLF15 유전자 발현 및 아마도, BCAA 산화의 제한. DOX의 미토콘드리아 축적은 ROS 증가를 수반한다.
- 도 13은 MCF7 유방암 세포 증식에 관한 것이다. DOX의 항증식 효과는 아미노산 혼합물의 존재하에 MCF7 세포에서 변하지 않은 채로 남아 있다. (A) 산 포스파타아제 검정: 세포(96-웰 판에서 5,000 내지 20,000/웰)를 48시간 동안 1% α5 및 16시간 동안 1 μM DOX로 처리하였다. (B) 증식 검정: 세포(12-웰 판 중 50,000/웰)를 (A)에서와 같이 처리하였고, 트립판 블루 배제 검정을 사용하였다. n = 3 실험. *p < 0.05 및 **p < 0.01 vs. 비처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 1은 HL-1 심장 세포 처리를 나타내는 도식이다.
- 도 2는 생체내 마우스 처리를 나타내는 도식이다.
- 도 3은 특정한 아미노산 조성물이 DOX에 급성으로 노출된 HL-1 심근세포에서 미토콘드리아 기능 장애를 예방함을 보여준다. (A) 미토콘드리아 생체발생 표지자 발현: 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체-γ 공활성화제 1α(PGC1-α), 핵 호흡 인자-1(NRF1), 전사 인자 A(Tfam), 사이토크롬 c(cyt c), 및 사이토크롬 c 옥시다아제 아단위 IV(COX IV) mRNA 수준을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였다. 비처리된(CTRL) 세포에 대한 상대적 발현 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (B) COX IV 및 cyt c 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 검출하였다. 상대적인 값을 GAPDH 수준에 대해 농도계 분석으로 결정하였고; 비처리된(CTRL) 세포에 대한 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (C) 시트레이트 신타아제 활성. 값을 단백질 함량으로 정규화하였다(n = 3 실험). *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001 vs. 비처리된 세포; †p < 0.01 vs. DOX-처리된 세포; §p < 0.01 vs. BCAAem-처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 4는 TCA 중간체가 HL-1 심근세포에서 미토콘드리아 생체발생 유전자의 DOX-유발된 감소를 예방하지 않음을 보여준다. (A 내지 C) 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체-γ 공활성화제 1α(PGC-1α) (A), 핵 호흡 인자-1(NRF1) (B), 및 전사 인자 A(Tfam) (C). mRNA 수준을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였다. 비처리된(CTRL) 세포에 대한 상대적 발현 값을 1.0으로서 취하였다(n = 3 실험). C, 시트르산; S, 숙신산, M, 말산. *p < 0.05 vs. 비처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 5는 α5 보충이 HL-1 심근세포에서 DOX-유발된 산화적 스트레스를 예방함을 보여준다. (A) 미토콘드리아 H2O2 방출, (B) 기본 아코니타아제/총 아코니타아제 비, 및 (C) HL-1 세포에서 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD) 활성(n=3 실험). (D) 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 1(SOD1) 및 글루타티온 퍼옥시다아제 1(GPX1) mRNA 수준을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였다. 비처리된(CTRL) 세포에 대한 상대적 발현 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (E) 비처리된(CTRL) 세포 및 DOX-처리된 세포(n=3 실험)에서 8-히드록시-2'-데옥시구아노신(8-OHdG) 생성으로서 측정된 전체 DNA 산화적 손상. *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001 vs. 비처리된 세포; †p < 0.01 vs. DOX-처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 6은 α5 조성물이 HL-1 세포에서 DOX-유발된 사망을 예방함을 보여준다. HL-1 심근세포의 세포 독성을 MTT 검정에 의해 평가하였다. 세포를 48시간 동안 1 % α5 및 16시간 동안 1 μM DOX로 처리하였다. *p < 0.05 vs. 비처리된 세포; †p < 0.05 vs. DOX-처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 7은 α5 조성물이 DOX-처리된 마우스의 좌심실에서 미토콘드리아 기능 장애를 예방함을 보여준다. (A 및 F) 미토콘드리아 생체발생 표지자 발현. (A) PGC1-α, NRF1, Tfam, cyt c, COX IV 및 (F) SOD1, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 2(SOD2), 카탈라아제(Cat), 및 GPX1 mRNA 수준을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였다. 비히클-처리된(Veh) 마우스에 대한 상대적 발현 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (B) 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 양을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였다. 1.0으로서 취한 Veh-처리된 마우스에 대한 것과 비교하여 상대적인 단위로 표현하였다(n = 5 실험). (C) COX IV 및 cyt c 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 결정하였다. 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나아제(GAPDH) 수준에 대해 농도계 분석하여 상대적인 값을 결정하였고; Veh-처리된 마우스에 대한 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (D) 시트레이트 신타아제 활성. 값을 단백질 함량으로 정규화하였다(n = 3 실험). (E) 기초 산소 소모율. DOX 및 α5로 처리된 또는 처리되지 않은 마우스의 좌심실로부터 미토콘드리아를 분리하였다. 산소 소모율을 미토콘드리아 단백질 양으로 정규화하였다(n = 3 실험). *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001 vs. Veh-처리된 마우스; †p < 0.05 및 ††p < 0.01 vs. DOX-처리된 마우스. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 8은 상이한 신호 경로가 DOX-처리된 마우스에서 α5 보충의 보호 효과와 관련됨을 보여준다. (A, E 및 F) 유전자 발현. (A) 내피 산화질소 신타아제(eNOS), (E) 세스트린(Sestrin)2, 및 (F) Kr
- 도 9는 상이한 신호 경로가 DOX-처리된 HL-1 심근세포에서 α5 보충의 보호 효과와 관련됨을 보여준다. (A, D 및 F) 유전자 발현. (A) eNOS, (D) 세스트린2, (F) KLF15 mRNA 수준을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였다. 비처리된(CTRL) 세포에 대한 상대적 발현 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (B, C, E 내지 H) 단백질 수준. (B) 포스포-eNOS, (C) 포스포-S6, (E) 포스포-Akt, (F) KLF15, (G) PGC-1α 및 COXIV, 및 (H) 포스포-S6 및 포스포-BCKDH 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 검출하였다. 상대적인 값을 농도계 분석하였고, 각각 총 eNOS, S6, Akt, 및 BCKDH 수준에 대한 비로서 기록하였고; KLF15, PGC-1α 및 COXIV를 GAPDH로 정규화하였다. 비처리된 HL-1 세포에 대한 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (G) 특이적 KLF15 siRNA 또는 비표적 siRNA 중 어느 하나로 형질주입되고, DOX 또는 α5를 단독으로 또는 병용하여 처리된 HL-1 세포에서 PGC1-α 및 COX IV 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 측정하였다. 비처리된 HL-1 세포에 대한 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). (H) S6 및 BCKDH 인산화를 (G)에서와 같이 HL-1 세포에서 면역블로트 분석에 의해 측정하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001 vs. 비처리된 세포; †p < 0.05 vs. DOX-처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 10은 HL-1 심근세포에서 특이적 Klf15, eNOS 및 Raptor 침묵을 보여준다. (A 내지 C) Klf15, eNOS 및 Raptor mRNA 수준을 정량 RT-PCR에 의해 분석하였고, KLF15, eNOS 및 Raptor 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 검출하였다. 비처리된(CTRL) 세포에 대한 상대적 발현 값을 1.0으로서 취하였다(n = 5 실험). *p < 0.05 vs. 비처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 11은 HL-1 심근세포에서 특이적 eNOS 및 Raptor 침묵을 보여준다. (A) 특이적 eNOS siRNA 또는 비표적 siRNA 중 어느 하나로 형질주입되고, DOX 또는 α5를 단독으로 또는 병용하여 처리된 HL-1 세포에서 PGC1-α 및 COX IV 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 측정하였다. (B) 특이적 Raptor siRNA 또는 비표적 siRNA 중 어느 하나로 형질주입되고, DOX 또는 α5를 단독으로 또는 병용하여 처리된 HL-1 세포에서 PGC1-α 및 COX IV 단백질 수준을 면역블로트 분석에 의해 측정하였다. 비처리된(CTRL) 세포에 대한 값을 1.0으로서 취하였다(n = 3 실험). *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001 vs. 비처리된 세포; †p < 0.05 vs. DOX-처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
- 도 12는 심근세포에서 독소루비신(DOX)에 의해 유발된 미토콘드리아 손상에 대한 α5 보호 작용의 제안된 모델을 보여준다. 플러스(+) 및 마이너스(-) 부호는 DOX, 및, 잠재적으로, α5 표적 부위에 의해 유발된 자극 또는 저해를 나타낸다. DOX는 감소된 TCA 사이클 중간체 및 미토콘드리아 에너지 생성 외에, 다음과 같이 미토콘드리아 생체발생 및 기능을 감소시킨다: 1) Ppargc1a 및 Ppargc1b의 촉진제와 복합체화되고, ROS 방어 유전자를 포함한 미토콘드리아 유전자의 전사를 차단하는, 토포이소머라아제 IIβ(TOP2B)에 결합, 2) 미토콘드리아 생리학의 중요한 조절자인, eNOS 발현 및 mTORC1 활성의 감소, 3) 높은 수준에서의 독성인, α-케토산 및 BCAA 축적에 의한 KLF15 유전자 발현 및 아마도, BCAA 산화의 제한. DOX의 미토콘드리아 축적은 ROS 증가를 수반한다.
- 도 13은 MCF7 유방암 세포 증식에 관한 것이다. DOX의 항증식 효과는 아미노산 혼합물의 존재하에 MCF7 세포에서 변하지 않은 채로 남아 있다. (A) 산 포스파타아제 검정: 세포(96-웰 판에서 5,000 내지 20,000/웰)를 48시간 동안 1% α5 및 16시간 동안 1 μM DOX로 처리하였다. (B) 증식 검정: 세포(12-웰 판 중 50,000/웰)를 (A)에서와 같이 처리하였고, 트립판 블루 배제 검정을 사용하였다. n = 3 실험. *p < 0.05 및 **p < 0.01 vs. 비처리된 세포. 모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시되어 있다.
실시형태의 충분히 이해를 제공하기 위해 수많은 구체적인 상세 사항에 대한 설명이 이하에서 이루어질 것이다. 실시형태는 하나 이상의 구체적인 상세 사항에 대한 설명이 없더라도, 또는 다른 방법, 구성성분, 재료 등과 함께 실행될 수 있다. 다른 경우에, 실시형태의 양태를 모호하게 하는 것을 방지하기 위하여 공지된 구조, 재료 또는 작업에 대해서는 상세하게 도시하거나 설명하지 않는다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "일 실시형태" 또는 "실시형태"에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 기재된 구체적인 특징, 구조 또는 특성이 적어도 하나의 실시형태에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 위치에서 구 "일 실시형태에서" 또는 "실시형태에서"의 출현은 반드시 모두 동일한 실시형태를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 구체적인 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 본원에 제공된 표제는 오직 편의를 위한 것이며, 실시형태의 범위 또는 의미로 해석되지 않는다.
본 발명의 목적은 화학요법을 받는 대상체에서 화학요법제에 의해 유발된 심장 독성을 중화하는 데 특히 효과적인 신규한 아미노산계 조성물을 제공하는 것이다. 상기 조성물은 심장 세포에서 화학요법제에 의해 특이적으로 유발된 미토콘드리아 기능 장애를 예방하고 회복시킬 수 있다. 화학요법제에 의해 유발된 심장 독성은 심근병증 또는 심부전을 포함할 수 있다.
본 발명은 암에 걸려 화학요법을 받는 대상체에서 적어도 하나의 화학요법제에 의해 유발된 심장 독성을 예방하고/하거나 치료하기 위한 조성물을 제공하며, 그러한 조성물은 활성제를 포함하고, 상기 활성제는 아미노산 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 리신 및 시트르산, 숙신산, 말산을 함유한다.
또한 항종양제로 지칭되는 화학요법제는 빠르게 성장하는 세포의 증식을 직접적으로 또는 간접적으로 저해하여, 항종양 효과를 발휘하기 위해 사용된다. 본원에 개시된 조성물은 안트라사이클린, HER2/ErbB2 저해제, 티로신-키나아제 저해제, 혈관 내피 성장 인자 저해제, 면역 체크포인트 저해제에 의해 유발된 심장 독성을 예방하고/하거나 치료하는 데 효과적이다. 안트라사이클린은 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 픽산트론, 사바루비신, 발루비신 및 이의 유도체로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 개시내용은 추가로 암에 걸린 대상체에서 상기 적어도 하나의 화학요법제에 의해 유발된 심장 독성을 예방하고/하거나 치료하는데 있어서, 동시에, 개별적으로 및 순차적으로 사용되는 본원에 개시된 조성물과 적어도 하나의 화학요법제를 포함하는 병용 제제를 제공한다.
분지형 사슬의 아미노산-풍부 혼합물(BCAAem)을 사용한 만성(3개월) 식이 보충이 중간-연령의 마우스의 심장 및 골격 근육에서 미토콘드리아 생체발생을 촉진한다는 것이 입증되었다. 국제 특허 WO 2019/021135 A1호에 개시된 바와 같이, 트레오닌, 리신 및 시트르산, 숙신산, 말산과 함께 분지형 사슬의 아미노산 류신, 이소류신, 발린을 포함하는 조성물이 미토콘드리아 기능을 개선시키는 데 효과적이라는 것이 또한 입증되었다. 그럼에도 불구하고, 잠재적으로 효험있는 약물의 투여를 포함하여, 화학요법제에 의해 특이적으로 유발된 심장 독성을 예방하고 치료하려는 많은 노력이 결정적으로 제안되지 않은 것으로 또한 나타났다[선행기술문헌 1].
이제, 본 출원의 발명자들은 놀랍게도 본원에 개시된 조성물이 화학요법을 받는 대상체에서 화학요법제에 의해 유발된 심장 독성의 치료에 유리하게 사용될 수 있음을 발견하였다. 구체적으로, 시험관내 및 생체내에서 수행된 시험은 i) 화학요법제로서 독소루비신으로 치료된 심장 세포가 미토콘드리아 기능의 회복에 있어서 본원에 개시된 조성물에 의한 치료에 불응하지 않고, ii) 상기 조성물은 화학요법제에 의해 유발된 심장 독성을 중화시킬 수 있음을 보여준다.
또한, 하기 섹션에 나타낸 바와 같이, 상기 조성물은 특정한 그룹의 대상체, 즉 화학요법을 받고 그에 따라 종양 병리를 겪는 대상체에게도 또한 안전하게 투여될 수 있다. 이러한 증거의 놀라운 양태는 선행하는 섹션에 개시된 바와 같이, 암 세포가 건강한 대상체의 세포와 상이한 대사 프로파일을 가지며, 암 세포의 증식에서 미토콘드리아 활성의 역할에 중점을 둔 상충되는 증거가 있다는 것을 고려하여 도출된다. 예를 들어, 암 세포의 미토콘드리아 DNA 삭제는 그의 성장 및 종양 형성을 감소시키는 것으로 나타났고; 이러한 관찰에 기초하여, 미토콘드리아 기능의 회복은 반대로 종양 세포의 증식 증가를 초래하여, 화학요법제에 의해 발휘된 항종양 효과를 감소시키는 것으로 또한 결정될 수 있다.
반대로, 본원에 개시된 조성물은 i) 독소루비신으로 치료된 심장 세포에서 미토콘드리아 기능을 회복하는 데 효과적이고, ii) 종양 세포의 증식에 유리하지 않으며, iii) 독소루비신에 의해 발휘된 항종양 효과를 변경시키지 않고, iv) 매우 놀랍게도, 독소루비신의 항증식 효과를 강화시킬 수 있다.
하기 개시된 바와 같이, 필수 아미노산 및 트리카복실산 사이클 중간체를 포함하는 조성물, 즉 α5 조성물을 시험하였고, DOX로 처리된 HL-1 심근세포 및 마우스에서의 상기 조성물의 효과를 조사하였다. 트리카복실산 없이, 분지형 사슬의 필수 아미노산을 포함하는 조성물, 즉 BCAAem 조성물과 비교하여, α5 조성물 보충은 DOX-유발된 미토콘드리아 기능 장애에 대한 보호 효과를 촉진하는 데 상당히 더 효과적이었다. 그 결과는 급성 DOX 처리에 노출된 새끼 마우스의 생체내로 연장되었다. 그 결과는 다음의 증거를 보여준다: i) 급성 DOX 투여 후 미토콘드리아 기능 장애의 발생, ii) α5 조성물에 의한 단기간 보충의 현저한 방어 효력. 따라서, 조성물은 화학요법제-유발된 심장 독성의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있고, 따라서 또한 그러한 유발된 심장 독성으로부터 발생할 수 있는 심근병증 및/또는 심부전을 예방할 수 있다.
본원에 개시된 조성물은 활성제를 포함하며, 상기 활성제는 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 리신과 함께 시트르산, 숙신산 및 말산을 함유하며, 시트르산, 숙신산 및 말산의 총량과 아미노산 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 리신의 총량의 중량비는 0.05 내지 0.3, 바람직하게는 0.1 내지 0.25로 구성될 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 조성물은 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 리신, 시트르산, 숙신산 및 말산, 및 선택적으로 비타민 B1 및/또는 비타민 B6으로 이루어질 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 활성제는 히스티딘, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 시스테인 및 티로신으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 조성물은 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 리신, 히스티딘, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 시스테인 및 선택적으로 티로신, 뿐만 아니라 시트르산, 숙신산 및 말산으로 이루어진 활성제를 포함할 수 있으며, 상기 아미노산은 조성물에 함유된 유일한 아미노산이다.
하나 이상의 실시형태에서, 조성물에는 임의의 다른 활성제, 예컨대 임의의 화학요법제, 즉 빠르게 성장하는 세포의 증식을 직접적으로 또는 간접적으로 저해하여 항종양 효과를 발휘하는 임의의 활성제가 부재할 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 조성물은 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 리신, 히스티딘, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 시스테인, 티로신, 시트르산, 숙신산 및 말산, 및 선택적으로 비타민 B1 및/또는 비타민 B6으로 이루어질 수 있다.
조성물은 활성제 중량에 대해 35 중량% 내지 65 중량%, 바람직하게는 42 중량% 내지 56 중량%의 양으로 아미노산 이소류신, 류신 및 발린을 포함할 수 있다.
류신과 시트르산의 중량비는 5 내지 1, 바람직하게는 2.50 내지 3.50으로 구성된다.
하나 이상의 실시형태에서, 시트르산의 중량 또는 몰량은 말산 및 숙신산 각각의 중량 또는 몰량보다 더 높다. 바람직하게는, 시트르산의 중량 또는 몰량은 말산 + 숙신산의 총 중량 또는 몰량보다 더 높다. 추가의 실시형태에서, 시트르산과 말산 및 숙신산의 합의 중량비는 1.0 내지 4.0, 바람직하게는 1.5 내지 2.5로 구성된다. 바람직한 실시형태에서, 시트르산:말산:숙신산 중량비는 10:1:1 내지 2:1.5:1.5, 바람직하게는 7:1:1 내지 1.5:1:1, 보다 바람직하게는 5:1:1 내지 3:1:1로 구성된다. 바람직한 실시형태에서, 시트르산:말산:숙신산 중량비는 4:1:1이다.
바람직한 이소류신:류신 몰비는 0.2 내지 0.7 범위, 바람직하게는 0.30 내지 0.60 범위로 구성되고/되거나 바람직한 발린:류신 중량비는 0.2 내지 0.70 범위, 바람직하게는 0.30 내지 0.65 범위로 구성된다.
트레오닌:류신 몰비는 0.10 내지 0.90 범위, 바람직하게는 0.20 내지 0.70 범위로 구성될 수 있고/있거나 리신:류신 중량비는 0.20 내지 1.00 범위, 바람직하게는 0.40 내지 0.90 범위로 구성된다.
바람직한 실시형태에서, 시트르산, 말산, 숙신산의 총 몰량과 메티오닌, 페닐알라닌, 히스티딘 및 트립토판의 총 몰량의 비는 1.35보다 높다.
하나 이상의 실시형태에서, 시트르산, 말산, 숙신산의 합과 분지형 사슬 아미노산 류신, 이소류신, 발린의 합의 중량비는 0.1 내지 0.4, 바람직하게는 0.15 내지 0.35로 구성된다.
추가의 실시형태에서, 분지형 사슬 아미노산 류신, 이소류신, 발린 + 트레오닌 및 리신의 총 중량은 3개의 산, 즉 시트르산, 말산, 숙신산의 총 중량보다 높다. 바람직하게는, 단일 산(시트르산, 숙신산 또는 말산)의 중량은 단일 아미노산 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌 및 리신 각각의 중량보다 적다.
추가의 실시형태에서, 리신 및 트레오닌의 총 몰량은 3개의 산, 즉 시트르산, 숙신산, 말산의 총 몰량보다 높다. 바람직하게는, 3개의 산, 즉 시트르산, 숙신산, 말산의 총 몰량과 리신 및 트레오닌의 총 몰량의 비는 0.1 내지 0.7, 바람직하게는 0.15 내지 0.55로 구성된다.
하나 이상의 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은, 바람직하게는 비타민 B, 예컨대 비타민 B1 및/또는 비타민 B6의 군 중에서 선택되는 비타민을 추가로 포함한다. 또한, 조성물은 탄수화물 및/또는 향미 물질을 추가로 포함할 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 비히클을 추가로 포함하는 약학 조성물일 수 있다. 조성물은, 예를 들어 단백질, 비타민, 탄수화물, 천연 및 인공 감미료 및/또는 향미 물질과 같은 약학적으로 허용가능한 부형제를 또한 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 약학적으로 허용가능한 부형제는 유청 단백질, 말토덱스트린, 프룩토스, 칼슘 카제네이트, 어유, 시트르산 또는 이의 염, 수크랄로스, 수크로스 에스테르, 비타민 D3, 그룹 B 비타민으로부터 선택될 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 조성물의 활성제는 적어도 하나의 화학요법제를 추가로 함유할 수 있다. 화학요법제는 안트라사이클린, HER2/ErbB2 저해제, 티로신-키나아제 저해제, 혈관 내피 성장 인자 저해제, 면역 체크포인트 저해제로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 안트라사이클린은 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 픽산트론, 사바루비신, 발루비신 및 이의 유도체로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
추가로, 특히 본 개시내용에 따른 조성물 및 구체적으로 활성제를 제조할 때, 아미노산 아르기닌은 회피된다. 또한, 본원에 개시된 조성물에 의해 구체적으로 배제된 추가의 아미노산은 세린, 프롤린, 알라닌이다. 그러한 아미노산은 역효과를 낳거나, 심지어 조성물 내의 일부 농도 또는 화학량론 비에 해로울 수 있다.
본 발명에 개시된 아미노산은 각각의 약학적으로 허용가능한 유도체, 즉 염으로 대체될 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물은 화학요법을 받는 대상체에서 화학요법제에 의해 유발된 심근병증 및/또는 심부전의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
경구 용도를 위해, 본 발명에 따른 조성물은 정제, 캡슐, 과립, 젤, 젤리화 산제, 산제의 형태일 수 있다.
또한, 본 개시내용은 바람직하게는 미토콘드리아 기능 장애 및 산화적 스트레스를 예방함으로써, 화학요법을 받는 대상체에서 화학요법제에 의해 유발된 심장 독성을 예방하고/하거나 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 아미노산 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌, 리신, 및 카복실산 시트르산, 숙신산, 및 말산을 함유하는, 활성제를 포함하는 조성물을 선택하는 단계 및 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 활성제는 본원에 개시된 바와 같이 히스티딘, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 시스테인 및 티로신으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.
조성물은 단독으로 투여될 수 있고, 따라서, 본 방법은 조성물을 선택하는 단계 및 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로 이루어진다. 하나 이상의 실시형태에서, 조성물은 적어도 하나의 화학요법제와 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 병용하여 투여될 수 있다. 화학요법제는 안트라사이클린, HER2/ErbB2 저해제, 티로신-키나아제 저해제, 혈관 내피 성장 인자 저해제, 면역 체크포인트 저해제로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 안트라사이클린은 바람직하게는 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 픽산트론, 사바루비신, 발루비신 및 이의 유도체로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
조성물에 의해 제공된 다양한 아미노산 중에서 양 및 비와 관련한 추가의 사양이 첨부된 청구범위에 함유되고, 이는 본 발명과 관련하여 본원에 제공된 기술적 교시의 완전한 부분을 형성한다.
실시예
하기 개시된 바와 같은 표 1은 HL-1 세포에 대해 시험된 2개의 상이한 아미노산계 조성물을 나타낸다. 2개의 조성물은 유럽 특허 EP 2 196 203 B1호에 또한 개시된 "BCAAem" 조성물, 및 아미노산 및 시트르산, 숙신산 및 말산을 함유하는 활성제를 포함하는 "α5" 조성물이다.
[표 1]
먼저 모든 성분을 0.8 메시로 체질하여 상기 표 1의 조성물을 제조하였다. 예비혼합물을 수득하기 위해, 각각의 성분(총량의 <10 중량%의 양)을 전체 조성물의 중량의 약 10%를 수득하도록, L-리신 HCl의 일부와 함께 폴리에틸렌 백에 넣는다. 이어서, 백을 5분 동안 수동으로 진탕한다. 이어서, 예비혼합물을 나머지 성분들과 함께 혼합기(Planetaria)로 로딩하고, 120 rpm으로 15분간 혼합하여 최종 균질 혼합물을 수득한다.
방법
세포 배양 및 처리
Helsinki 선언 규칙(Rules of the Declaration of Helsinki)을 준수하였다. W.C. Claycomb(Millipore Cat# SCC065)로부터 HL-1 심근세포를 얻었고, 피브로넥틴/젤라틴-코팅된 플라스크에서 평판 배양하고, 100 μM 노르에피네프린(30 mM L-아스코르브산[Sigma-Aldrich]에 용해된 10 mM 노르에피네프린[Sigma-Aldrich] 원액으로부터의 것), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 10% 우 태아 혈청(FBS, Sigma-Aldrich)으로 보충된 Claycomb 배지(Sigma-Aldrich)에서 70 내지 80% 컨플루언스(confluence)로 성장시켰다[선행기술문헌 2 및 3]. P. Limonta(이탈리아 밀라노 소재의 밀라노 대학교(University of Milan), 약리 및 생체 분자 과학(Pharmacological and Biomolecular Sciences))로부터 또한 입수가능한 MCF-7 인간 유방암 세포주(ATCC®HTB-22TM)를 스트렙토마이신(100 U/ml), 페니실린(200 mg/ml) 및 젠타마이신(50 mg/ml)을 함유하고, 10 % FBS로 보충된, pH 7.4 DMEM에서 배양하였다. 두 가지 세포 유형을 48시간 동안 1% BCAAem 또는 α5로 그리고 16시간 동안 1 μM DOX로 처리하였다(도 1). 혼합물의 상세한 조성 비율은 표 1에 나타나 있다.
포스포-단백질 연구를 위해, HL-1 세포를 2시간 동안 1% α5로 그리고 마지막 60분 동안 1 μM DOX(Sigma-Aldrich D15D15로부터의 Doxo-HCl)로 처리하였다. Klf15, eNOS 및 Raptor 녹다운(knockdown) 실험을 위해, HL-1 세포를 Dharmafect 1 형질주입 시약을 사용하여 50 내지 100 nM Klf15, eNOS, 및 Raptor siRNA SMARTpool(Dharmacon; 미국 콜로라도주 라피엣 소재) 또는 siGENOME 비표적 siRNA로 형질주입하였다. 24시간 형질주입 후, 세포를 24시간 동안 1% α5 및 16시간 동안 1 μM DOX로 처리하였다. 형질주입 효능을 형광 검출(흡광/방출 557/570)에 의해 siGLO-RISC-부재 비표적 siRNA 및 siRNA 흡수로 결정하였다. 이어서, Western 블로팅 분석을 위해 단백질을 추출하였다.
동물 및 처리
사용된 실험 프로토콜은 밀라노 대학의 윤리 위원회 기관(Institutional Ethical Committee)(n. 16/09)에 의해 승인되었고, 국가 동물 보호 지침(National Animal Protection Guideline)을 준수하였다. 40마리의 수컷 C57BL6/J 마우스(9주령)를 깨끗한 폴리프로필렌 우리에 따로따로 수용하고 4개의 그룹으로 나누었다(도 2): 1) 표준 식단(4.3 kcal% 지방, 18.8 kcal% 단백질, 76.9 kcal% 탄수화물; Laboratorio Dottori Piccioni)을 섭식하고, 단일 i.p. 식염수 주사(비히클)를 맞은 대조군(CTRL, n = 10 마우스); 2) 표준 식단 및 α5 보충(음용수 중 1.5 mg/g 체중/1일)을 섭식하고, 단일 i.p. 식염수 주사(비히클)를 맞은 α5 그룹(n = 10 마우스). 처리 시작 2주 전에 평균 일일 음용량(drinking volume)을 계산한 후 α5 조성물을 수돗물에 용해시키고, 일일 투여 전에 4℃에 저장하였다; 3) 표준 식단을 섭식하고, 심장 독성이 나타나는 투여량인, 20 mg/kg로 i.p. DOX(Sigma-Aldrich로부터 Doxo-HCl) 주사를 맞은 DOX 그룹(n = 10 마우스)[선행기술문헌 4 내지 6]; 및 4) 표준 식단을 섭식하고, i.p. 20 mg/kg DOX 주사 + α5 보충(음용수 중 1.5 mg/g 체중/1일)된 DOX + α5 그룹(n = 10 마우스). 조용한 온도- 및 습도-제어실에서 22℃에서 12시간 명(light)/12시간 암(dark) 사이클로 α5 보충을 10일 동안 수행하였다; α5 처리 종료 3일 전에 DOX의 단일 투여를 수행하였다(도 2). 음용량, 음식물 섭취량 및 체중을 매주 2회 체크하였다. 처리 종료 시에, 마우스를 경추 탈구시켜 희생시키고, 재빨리 심장을 꺼내고, 신선하게 사용하거나(산소 소모 분석을 위해) 액체 질소에 동결시키고 -80℃에서 저장하였다(시트레이트 신타아제 활성 분석 외에도, mtDNA, mRNA 및 단백질 수준 측정을 위해).
정량 RT-PCR 분석
정량 RT-PCR을 iCycler iQ 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad) 상에서 iQ SybrGreenI SuperMix(Bio-Rad; 이탈리아 세그라테 소재)에 의해 종래에 기재된 바와 같이[선행기술문헌 3 내지 7] 수행하였다. 요약하면, RNeasy Tissue Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 좌심실로부터 또는 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 HL-1 세포로부터 RNA를 분리하였다. iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. Premier Biosoft International로부터의 Beacon Designer 2.6 소프트웨어를 사용하여 프라이머를 설계하였고, 이는 표 2에 나타나 있다.
[표 2]
ΔCT로 지칭되는, 다양한 전사물을 검출할 수 있는 사이클 횟수(임계 사이클, CT)를 TBP의 것과 비교하였다. 상대적 유전자 수준을 2-(ΔΔCT)로 표현하였고, 여기서 ΔΔCT는 DOX-, α5-, 또는 DOX + α5-처리된 마우스(또는 처리된 HL-1 세포)의 ΔCT - 대조군 마우스(또는 비처리된 HL-1 세포)의 ΔCT와 같다.
Western 블로트 분석
1 mM NaVO4, 10 mM NaF 및 프로테아제 저해제의 칵테일(Sigma-Aldrich, 이탈리아 밀라노 소재)의 존재하에, 제조자가 지시한 바와 같이, T-PER 포유류 단백질 추출 시약(Pierce, ThermoScientific, 미국 록퍼드 소재)에 의해 좌심실로부터 또는 M-PER 포유류 단백질 추출 시약(Pierce, ThermoScientific, 미국 록퍼드 소재) 내의 HL-1 세포로부터 단백질 추출물을 수득하였다. 비신초닌산 단백질 검정(BCA, Pierce, Euroclone, 이탈리아 밀라노 소재)에 의해 단백질 함량을 결정하였고, 50 μg의 단백질 추출물을 환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 이어서, 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 전기영동적으로 전달하였다(Bio-Rad Laboratories, 이탈리아 세그라테 소재)[선행기술문헌 3 내지 8]. 관심있는 단백질을 각각 1:1000 희석으로 특이적 항체: 항-COX IV(사이토크롬 c 옥시다아제 아단위 IV, Cell Signaling Technology Cat #4844, Euroclone, 이탈리아 밀라노 소재), 항-cyt c(사이토크롬 복합체, Cell Signaling Technology Cat #4280), 항-PGC-1α(증식자-활성화된 수용체 γ 공활성화제 1α, Cell Signaling Technology Cat #2178), 항-포스포-AKT(Ser473)(Cell Signaling Technology Cat #4060), 항-AKT(Cell Signaling Technology Cat #4685), 항-포스포-eNOS(Ser1177)(포스포-내피 산화질소 신타아제, Cell Signaling Technology Cat #9571), 항-eNOS(Cell Signaling Technology Cat #9572), 항-포스포-S6(Ser235/236)(포스포-S6, Cell Signaling Technology Cat #4858), 항-S6(Cell Signaling Technology Cat #2217), 항-포스포-mTOR(Ser2481)(Cell Signaling Technology Cat#2974), 항-mTOR(Cell Signaling Technology Cat#2972), 항-포스포-BCKDH(Ser293)(Abcam Cat #200577), 항-BCKDH(Abcam Cat #138460), 및 항-GAPDH(1:1000, Cell Signaling Technology Cat #2118)로 검출하였다. 포스포-eNOS, 포스포-AKT, 포스포-mTOR, 포스포-S6 및 항-포스포-BCKDH의 가시화 후에, 필터를 RestoreTM western 블로트 스트리핑 완충제(Euroclone, 이탈리아 밀라노 소재)로 스트리핑하고, 총 eNOS, 총 AKT, 총 mTOR, 총 S6 또는 총 BCKDH의 가시화를 위해 추가로 사용하였다. 실온에서 1시간 동안 겨자무 퍼옥시다아제-결합된 항-토끼 또는 항-마우스 면역글로불린을 사용하여 면역염색법을 수행하였다. SuperSignal 기질(Pierce, Euroclone, 이탈리아 밀라노 소재)을 사용하여 단백질을 검출하고, ImageJ 이미지 분석 소프트웨어와 농도계에 의해 정량화하였다.
미토콘드리아 DNA
mtDNA 분석을 위해, 전체 DNA를 QIAamp DNA Extraction Kit(Qiagen)로 추출하였다. mtDNA를 mtDNA에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭시켰고, 18S 유전자로 정규화하였다(표 2)[선행기술문헌 9]. 비처리된 대조군 마우스 외에도 DOX-, α5- 또는 DOX + α5-처리된 마우스의 좌심실에서 mtDNA 유전자의 임계 사이클 비(ΔCT) 대 핵 인코딩된 유전자(18S)의 임계 사이클 비를 측정함으로써 qRT-PCR을 사용하여 mtDNA 함량을 결정하였다[선행기술문헌 10 및 11].
시트레이트 신타아제 활성
좌심실 추출물에서 30℃, 412 nm에서 분광광도계로 활성을 측정하였다[선행기술문헌 12 및 13]. 0.1 mM 5,5-디티오-비스-(2-니트로벤조) 산, 0.5 mM 옥살로아세테이트, 50 μM EDTA, 0.31 mM 아세틸 CoA, 5 mM 트리에탄올아민 히드로클로라이드 및 0.1 M Tris-HCl을 함유하는 완충제(pH 8.1)에 조직을 첨가하였다. 시트레이트 신타아제 활성을 단백질 mg당 분당 생성된 시트레이트 nmol로서 표현하였다. 데이터를, 상기 기록된 바와 같은 비신초닌산 검정에 의해 결정된 총 단백질 함량으로 정규화하였다.
산소 소모
산소 소모를 기재된 바와 같이 측정하였다[선행기술문헌 14 및 15]. 대조군 및 처리된 마우스의 좌심실로부터 미토콘드리아를 분리하였다. 샘플을 37℃에서 차트 기록기에 연결된 Clark-유형 산소 전극(Rank Brothers Ltd.)을 장착한 기밀 용기에서 분석하였다. 인큐베이션 배지 중 산소의 농도를 37℃에서 200 μmol/l로 가정하여 산소 전극을 보정하였다.
미토콘드리아 산화적 스트레스
미토콘드리아 산화적 스트레스를 조사하기 위해, Qproteome Mitochondria 분리 키트(Qiagen)를 사용하여 미토콘드리아를 분리하였다. Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit(Molecular Probes)를 사용하여 겨자무 퍼옥시다아제(HRP)의 존재하에 미토콘드리아 H2O2 방출을 측정하였다. 550 nm에서의 여기 필터 및 590 nm에서의 방출 필터를 갖는 Fusion Universal Microplate Analyzer(Packard/PerkinElmer)를 사용하여 형광 측정이 이루어졌다. 표준 곡선으로부터 계산된 H2O2 생성을 기재된 바와 같이 nmol/min/mg 단백질로서 표현하였다[선행기술문헌 9]. 또한, 미토콘드리아 아코니타아제 및 SOD 활성을 종래에 기재된 바와 같이 측정하였다[선행기술문헌 16]. 요약하면, NADPH의 형성은 25℃에서 분광광도계(340 nm)로 추적하였고(아코니타아제 활성에 대해), SOD 활성은 Superoxide Dismutase Assay Kit(Calbiochem)로 측정하였다. SOD 활성의 한 단위는 수퍼옥사이드 라디칼의 50% 불변화를 나타내는 데 필요한 효소의 양으로서 정의된다. 마지막으로, 산화적 스트레스의 추가 표지자로서 DNA의 산화적 손상을 측정하였다. 고감도 8-히드록시-2'-데옥시구아노신(8-OHdG) Check ELISA Kit(JaICA, 일본 하마마츠 소재)를 사용하였다[선행기술문헌 17]. 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다. 전체 DNA를 QIampDNAMini Kit(Qiagen)를 사용하여 추출하였고, 뉴클레아제 P1 및 알칼리 포스파타아제(Sigma)로 절단하였다. NanoDrop ND-1000 분광광도 분석에 의해 DNA의 정성 및 정량을 확인하였다. ELISA 반응 생성물의 흡광도를 1차 파로서 450 nm를 사용하여 분광광도계로 결정하였다.
생존력 검정
HL-1 세포 생존력을 MTT[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드] 시약(Sigma, 이탈리아 밀라노 소재)에 의해 평가하였다. HL-1을 20,000 세포/웰 밀도(100 μl)로 96-웰 배양판으로 시딩하였다. 자색 포르마잔 결정을 5% SDS/0.1 M HCl(100 μl/웰)에 용해시키고, 흡광도를 570 nm의 파장에서 마이크로판 판독기(ELx800, BioTek Instruments, 미국 버몬트주 소재) 상에 기록하였다. 각각의 시험을 4벌씩 적어도 4회 반복하였다.
산 포스파타아제 검정
MCF7 세포 성장을 정량화하기 위해, 산 포스파타아제 검정을 기재된 바와 같이 사용하였다[선행기술문헌 30]. 요약하면, MCF7 세포를 웰당 5,000 내지 20,000 세포 밀도로 96-웰 판에 놓고, 1% α5(48시간 동안) 및 1 μM DOX(16시간)로 처리하였다. 배양 배지를 제거하고, 각각의 웰을 포스페이트-완충 식염수(PBS, pH 7.2)로 1회 세척하고, 0.1 M 아세트산나트륨(pH 5.0), 0.1% Titon X-100 및 5 mM p-니트로페닐 포스파타아제(pNPP)를 함유하는 100 μl 완충제를 첨가하였다. 이어서, 판을 2시간 동안 37℃ 인큐베이터에 놓았다. 10 μl 1 N NaOH를 첨가하여 반응을 중단시키고, 405 nm에서 발색을 평가하였다. 세포가 없는 웰에서 비효소 pNPP 가수분해를 측정하였다.
통계적 분석 및 데이터 표시
통계적 분석을 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 후에 Student-Newman-Keuls' 시험 또는 Student's t-시험으로 수행하였다. 데이터는 달리 명시되지 않는 한 평균 ± 표준 편차(SD)로서 표시되어 있다. 통계적 유의차는 p < 0.05에서 허용되었다.
결과
특이적 아미노산계 조성물은 DOX에 급성으로 노출된 HL-1 심근세포에서 미토콘드리아 기능 장애를 예방한다
DOX 독성으로부터 심근세포를 보호하기 위해서, 화학요법제에 노출된 HL-1 세포에서 미토콘드리아 기능 부전 및 산화적 스트레스를 치유하였다. HL-1 심근세포에서 산화적 대사를 최대한으로 증가시킬 수 있는 관련 대사 전구체의 최적 조합을 평가하였다. 구체적으로, 분화하는 HL-1 세포에 대한 2개의 아미노산계 조성물(표 1)의 효과를 시험하였다. 이 스크리닝을 위해, 분화하는 심근세포를 DOX와 함께 또는 없이, 48시간 동안 1) 분지형 사슬 아미노산을 포함하는 조성물(즉, BCAAem) 또는 2) 트리카복실산을 또한 포함하는 본 발명의 목적 조성물 "α5"로 처리하였다(도 1). α5(1% w/v)는 PGC-1α, 핵 호흡 인자 1(NRF1), 미토콘드리아 전사 인자 A(Tfam), 사이토크롬 c(cyt c), 및 사이토크롬 c 옥시다아제 복합체 IV(COX IV)를 포함한, HL-1 세포에서의 미토콘드리아 생체발생 표지자의 mRNA 수준을 기본 값 이상으로 증가시킨 한편, BCAAem에 의해 오직 PGC-1α 발현만이 증가하였다(도 3a). 반대로, 이러한 유전자의 발현은 심근세포가 16시간 동안 1 μM DOX에 노출된 경우 감소하였다(도 3a). 특히, α5 보충은 유전자 발현의 완전 구조(rescue)와 함께 이러한 DOX 독성을 예방하였다(도 3a). cyt c 및 COX IV를 제외하고, BCAAem은 통계적으로 유의하게 DOX 효과를 반전시킬 수 없었다(도 3a). 따라서, α5 조성물을 이후에 사용하였다. 특히, 도 4는 α5에서 동일한 농도로 개별적으로 또는 모두 함께 보충된 TCA 중간체, 즉 시트르산, 숙신산 및 말산이 단독으로 보충될 때 미토콘드리아 유전자 발현을 변화시킬 수 없을뿐만 아니라 DOX-유발된 미토콘드리아 생체발생의 감소를 예방할 수 없음을 보여준다. 미토콘드리아 건강에 대한 α5 보충의 보호 능력은 단백질 수준에서 또한 명백하였다(예를 들어, COX IV 및, 추세에 따라, cyt c)(도 3b). 추가적으로, 감소된 미토콘드리아 질량 및 기능의 지표인 DOX 노출에 의해 촉진된 시트레이트 신타아제 활성의 감소는 α5 보충에 의해 완전히 길항되었고, 이는 HL-1 세포에 단독으로 첨가될 때 또한 효소 활성을 상승시켰다(도 3c). DOX-유발된 미토콘드리아 손상에 대한 α5의 이러한 유익한 효과를 산화적 스트레스의 감소에 의해 추가로 확인하였다. 비처리된 세포와 비교할 경우, H2O2 방출(미토콘드리아 수퍼옥사이드 음이온 생성의 지표)은 DOX 처리에 의해 현저하게 증가하였고; α5 보충은 이러한 효과를 예방하였다(도 5a). α5는 또한 단독으로 첨가될 때 H2O2 방출을 감소시켰다. 따라서, 미토콘드리아 ROS 생성의 측정(기본/총 아코니타아제 활성 비에 의해 평가됨) 및 SOD 활성을 통한 수퍼옥사이드의 제거 능력은 α5 보충이 단독으로 첨가될 때 또한 이로운 효과를 가지면서, DOX에 의해 유발된 산화적 스트레스를 예방함을 입증하였다(도 5, b 및 c). 산화적 스트레스는 항-ROS 방어 시스템을 점화시키기 때문에, 항-ROS 효소의 발현을 조사하였다. 특히, 글루타티온 퍼옥시다아제 1(GPX1) 및 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 1(SOD1) 유전자의 발현은 일관적으로 ROS 생성의 증가에 따라, 비처리된 HL-1 세포(도 5d)에 비해 DOX-처리된 세포에서 증가하였다.
이는 DOX에 노출된 세포에서 산화적 DNA 손상의 표지자인, 많은 양의 8-히드록시-2'-데옥시구아노신(8-OHdG)에 의해 확인되었다(도 5e). DOX-처리된 세포에서 α5 보충은 ROS 생성을 중화시킬 수 있고, 이는 SOD1 및 GPX1 유전자 둘 모두의 감소된 발현(도 5d)에 의해 그리고 비처리된 세포에서 관찰된 양으로 회복된 8-OHdG 생성(도 5e)에 의해 입증된다. 도 5d는 또한 항-ROS 보호에서 BCAAem보다 α5가 더 효과적임을 보여준다. 동시에, 이러한 결과는 α5 혼합물이 HL-1 심근세포에서 DOX에 급성 노출하여 유발된 미토콘드리아 손상을 예방할 수 있다는 생각을 지지한다. 특히, 이는 세포 생존에 적절한 영향을 줄 수도 있다. 실제로 HL-1 세포의 DOX-유발된 사망은 α5 혼합물이 함께 보충될 때 예방되었다(도 6). HL-1 세포가 α5 단독에 노출될 때 세포 생존에 대한 효과는 명백하지 않았다(도 6).
α5 조성물은 DOX-처리된 마우스의 심장에서 미토콘드리아 기능 장애를 예방한다
시험관내 결과를 확인하기 위해, 급성 생체내 DOX 처리를 기재된 바와 같이 수행하였다[선행기술문헌 6]. 10일 동안 수행한 α5 처리 종료 3일 전에, 20 mg/kg DOX의 단일 i.p. 주사를 수행하였다(도 2). 표 3은 DOX 처리가 대조군에 비해 체중 및 심장 중량을 상당히 감소시켰음을 보여주고, 이는 그의 현저한 식욕억제 효과에 좌우될 수 있다. α5는 단독으로 보충될 때 및 DOX와 함께 보충될 때 둘 모두에서 체중, 심장 중량 및 음식물 섭취량을 변경시킬 수 없었다(표 3). 반면에, DOX-처리된 마우스에서 수분 소모는 대조군 동물과 비교하여 변하지 않은 반면, α5는 단독으로 보충될 때 또는 DOX와 함께 보충될 때 중 어느 하나에서 수분 섭취를 증가시켰다.
[표 3]
미토콘드리아 생체발생 유전자의 mRNA 수준은 대조군에 비해 DOX-처리된 마우스의 좌심실에서 감소하였다(도 7a). α5 혼합물은 단독으로 보충될 때 PGC-1α, cyt c 및 COX IV mRNA 수준을 증가시키는 것 외에, DOX-유발된 PGC-1α, Tfam 및 cyt c의 감소를 상당히 예방할 수 있었다(도 7a). 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 양, 호흡 단백질(특히, COX IV), 및 시트레이트 신타아제 활성으로서 측정된 미토콘드리아 질량 및 기능은 식염수-처리된 마우스에서보다 DOX-처리된 마우스에서 상당히 낮았고, 이러한 감소는 마우스를 α5로 보충시킬 때 예방되었다(도 7, b 내지 d). 또한, 다양한 처리 그룹의 좌심실로부터 분리된 미토콘드리아에서 Clark's 전극을 사용하여 산소 소모율(OCR)을 측정함으로써 미토콘드리아 호흡 기능을 조사하였다. 도 7e는 DOX 주사가 OCR을 감소시킨 반면, α5 보충은 DOX-처리된 마우스의 미토콘드리아 호흡을 완전히 보존하였음을 보여준다. 아미노산 혼합물은 또한 단독으로 보충될 때 OCR을 증가시켰다(도 7e). 마지막으로, 도 7f에 기록된 결과는 생체외 샘플에서 DOX가 SOD1, SOD2, 카탈라아제 및 GPX1를 포함한, ROS 방어 효소의 발현을 증대시킨 반면, α5 보충은 이러한 효과를 거의 완전히 차단하였음을 확인시켜준다. α5 단독으로 처리된 마우스에서 어떠한 변화도 보이지 않았다(도 7f). 총괄적으로, 이러한 발견은 α5 보충이 산화적 스트레스를 감소시킬뿐만 아니라 미토콘드리아 생체발생 및 기능을 촉진시킴으로써 심장에서 DOX-유발된 미토콘드리아 독성을 적어도 일부 예방한다는 것을 시사한다.
상이한 신호 경로는 α5
보충의 보호 효과와 관련된다
DOX 및 α5로 처리된 마우스의 좌심실에서의 신호 경로를 분석하였다. 도 8a 및 8b는 DOX-주사가 eNOS 발현을 감소시켰지만, eNOS 활성은 단지 부분적으로만 감소시켰음을 보여준다[즉, (Ser1177)포스포-eNOS 대 총 eNOS 비]. 특히, α5 보충은 이러한 효과를 완전히 무력화시켰다. α5 조성물은 단독으로 보충될 때 eNOS 발현을 증가시킬 수 있었다(도 8a). eNOS-의존성 산화질소(NO) 생성이 결국 mTOR 복합체 1(mTORC1) 신호 경로를 조절하는 것으로 알려져 있고, 상이한 세포 유형에서 (Ser1177)-eNOS 인산화를 위해 mTORC1 활성이 필요 충분하다는 것을 고려하여, mTORC1 활성화의 하류 표지자로서 S6의 인산화를 측정하였다. DOX 처리는 식염수 주사에 비해 좌심실에서 (Ser235/236)포스포-S6 대 총 S6 비를 감소시킨 반면, α5 보충은 이러한 효과를 적어도 부분적으로 예방하였다(도 8c). α5 혼합물을 단독으로 보충할 때 상당한 변화가 관찰되지 않았다. 다양한 생리학적 자극은 부위-특이적 mTOR 인산화에 의해 mTORC1 신호를 조절한다. 본원에 개시된 데이터는 DOX 및 α5 작용에서 Ser2481 mTOR 인산화에 대한 기능적 역할을 가리키며, 여기서 DOX는 감소시켰고 α5는 심장 내의 이러한 선택적 mTOR 인산화 감소를 구조하였다(도 8d). mTOR 인산화는 α5가 단독으로 첨가될 때 또한 증가하였다. 동시에, 상기 결과는 eNOS 및 mTORC1 둘 모두가 DOX 및 α5 처리 효과에 있어서 일정 역할을 할 수 있음을 시사하였다.
이 가정에 중점을 두어, 세스트린2는 mTORC1 경로에 대한 류신 센서로서 최근에 제안되었는데, 높은 세스트린2 수준이 세포내 류신 농도가 낮을 때 mTORC1 활성을 저해하기 때문이다. 반대로, mTORC1 저해제 GATOR2로부터 세스트린2를 대신한, 낮은 세스트린2 수준 또는 높은 세포내 류신 농도 중 어느 하나는 mTORC1 활성을 촉진한다. α5 조성물이 높은 류신 양을 함유한다는 것을 고려하여, 세스테린2 발현을 측정하였다. DOX 처리는 좌심실에서 세스테린2 mRNA를 현저하게 증가시켰다(도 8e). 특히, α5는 이러한 DOX-유발된 효과를 완전히 예방하였지만, 단독으로 보충될 때 세스트린2 발현을 변화시킬 수 없었다(도 8e).
마찬가지로, Kr
ppel-유사 인자 15(KLF15)는 특히 심장에서 아미노산 대사, 구체적으로 BCAA 이화(즉, 아세틸-CoA 및 석시닐-CoA, 2개의 TCA 중간체의 생성에 의한 BCAA 산화)의 중요한 전사 조절제로서뿐만 아니라 내피 세포에서 eNOS 발현의 유도자로서 최근에 부각되었다. 따라서, 상이한 처리 그룹의 좌심실에서 KLF15 발현을 분석하였다. Klf15 mRNA 수준은 DOX 처리에 의해 상당히 감소하였고, 이러한 감소는 α5 보충에 의해 완전히 예방되었다(도 8f). α5를 단독으로 보충할 때 상당한 변화가 관찰되지 않았다(도 8f). 심장 조직에서 미토콘드리아 BCAA 이화 효소, 예컨대 분지형 사슬 α-케토산 데히드로게나아제(BCKDH) 복합체의 발현 또는 활성이 Klf15-눌(null) 마우스 및 심부전에서 감소된 것을 고려하여, DOX-처리된 동물에서 BCKDH 인산화 외에도, BCKDH 단백질 전사를 조사하였다. 인산화될 때 실제로 BCKDH는 비활성인 반면, 역으로 탈인산화될 때 이는 활성이다. 특히, (Ser293)-BCKDH 인산화는 식염수-처리된 마우스와 비교하여 DOX-처리된 마우스에서 변하지 않았지만, α5 보충은 DOX의 존재하에 현저하게 이를 감소시켰고, 단독으로 보충될 때 또한 저해 추세 효과가 있었다(도 8g). 동시에, 이러한 결과는 α5 보충에 의한 심장 조직 내의 미토콘드리아 항상성의 생체내 보호가 BCAA 이화를 수반하는 KLF15/eNOS/mTORC1 신호 전달 축과 관련될 수 있음을 시사하였다.
DOX 및 α5에 노출된 HL-1 세포에서 미토콘드리아 항상성에 대한 KLF15, eNOS 및 mTORC1의 영향을 또한 평가하였다. 먼저, eNOS 유전자 발현은 1 μM DOX 노출에 의해 단지 약간만 감소되었지만, (Ser1177)-eNOS 인산화는 현저하게 감소하였다(도 9, a 및 b). α5(1% w/v)는 완전히 DOX 저해 효과 둘 모두를 길항하여, 단독으로 보충될 때 또한 eNOS 발현을 대규모 상향 조절하였다(도 9, a 및 b). 두 번째로, (Ser235/236)-S6 인산화는 DOX에 의해 현저하게 감소되었고, 이러한 감소는 α5에 의해 완전히 길항되었다(도 9c). 반대로, 아미노산 혼합물은 단독으로 첨가될 때 비효과적이었다. mTORC1 제어자로서의 역할에 따라, 세스트린2 발현은 DOX에 의해 현저하게 증가하였고, 이러한 증가는 α5 보충에 의해 완전히 길항되었다(도 9d). 아미노산 조성물은 단독으로 첨가될 때 비효과적이었다. 세 번째로, 단백질 키나아제 B(PKB)로도 알려진 Akt의 조절 역할과, eNOS 및 mTORC1 활성화 둘 모두에 기초하여, DOX 및 α5로 처리된 HL-1 세포에서 (Ser 473)-Akt 인산화를 또한 연구하였다. DOX는 현저하게 Akt 인산화를 감소시킨 한편, α5는 이러한 효과를 예방하였다(도 5e). Akt/PKB 신호 경로가 KLF15 발현에 대한 BCAA의 효과를 매개하는 것으로 최근에 밝혀졌기 때문에, DOX-매개된 미토콘드리아 손상에 대한 α5 보충의 보호 효과에 있어서 이러한 전사 조절자의 역할을 조사하였다. 특히, KLF15 발현은 HL-1 세포가 DOX에 노출될 때 mRNA 및 단백질 수준 둘 모두에서 감소되었고, α5는 이러한 효과를 완전히 길항하였다(도 9f). KLF15 발현은 α5 단독에 노출된 HL-1 심근세포에서 통계적으로 유의하지 않지만 약간만 증가한 것으로 보였다(도 9f).
이어서, HL-1 세포를 Klf15 siRNA 또는 비표적 siRNA로 형질주입하였다. 침묵 효능을 mRNA 및 단백질 수준 둘 모두에서 측정하였다(도 10). DOX 노출은 Klf15 siRNA-형질주입된 또는 다르게는 비처리된 세포에서 PGC-1α 및 COX IV 단백질 둘 모두를 상당히 감소시켰다(도 9g). 반대로, Klf15 녹다운은 PGC1-α 및 COX IV 수준 그 자체를 현저하게 감소시키고, DOX와 함께 투여될 때 단백질 수준을 구조하는 α5 보충의 능력을 폐지시켰다(도 9g). 또한, Klf15 녹다운은 α5가 단독으로 첨가될 때 PGC1-α 및 COX IV 발현을 촉진시키는 α5의 능력을 현저하게 감소시켰다(도 9g). 두드러지게는, Klf15 녹다운은 DOX-감소된 (Ser235/236)-S6 인산화를 회복시키는 α5의 능력을 대규모로 손상시켰다(도 9h). 마지막으로, (Ser293)-BCKDH 인산화는 DOX-처리된 및 비처리된 대조군 HL-1 심근세포에서 상이하지 않지만, p-BCKDH는 세포가 DOX와 함께 또는 없이 α5에 노출되었을 때 완전히 사라졌다(도 9h). Klf15 녹다운은 DOX-처리된 및 비처리된 세포 둘 모두에서 (Ser293)-BCKDH 인산화에 대한 α5의 저해 효과를 부분적으로 예방하였지만, DOX는 단독으로 첨가될 때 인산화를 변화시킬 수 없었다(도 9h). 마찬가지로, mTORC1의 골격 단백질 중 하나(mTOR의 조절-관련 단백질)인, eNOS 및 Raptor의 특이적 siRNA에 의한 침묵은 PGC1-α 및 COX IV 수준 그 자체를 감소시켰고, DOX와 함께 투여될 때 감소된 단백질 수준을 구조하는 α5 보충의 능력을 폐지시켰다(도 11, a 및 b). eNOS 및 Raptor 녹다운 둘 모두는 α5가 단독으로 첨가될 때 PGC1- α 및 COX IV 발현을 변화시키지 않았다(도 11, a 및 b). 특이적 침묵의 효능을 RT-PCR 및 Western 블로트에 의해 평가하였고; 거의 70% 및 60%의 eNOS 및 mTORC1의 하향 조절이 각각 eNOS 및 Raptor siRNA에 의해 얻어졌다(도 10, b 및 c). 종합적으로, 이러한 발견은 심근세포에서 DOX-매개된 미토콘드리아 기능 장애에 대한 α5 혼합물의 보호 효과가 KLF15/eNOS/mTORC1 신호 전달 축 및 BCAA 이화와 관련될 수 있음을 시사한다.
DOX의 항증식 효과는 α5 조성물의 존재하에 MCF7 유방암 세포에서 변하지 않은 채로 남아 있다
MCF7 유방암 세포주의 α5 조성물에의 노출은 2개의 상이한 검정에 따라 평가된 바와 같이 MCF7 세포 증식을 촉진하지 않았다(도 13a 및 13b). 마찬가지로, MCF7 세포에서 DOX의 항증식 효과는 아미노산 존재에 의해 완전히 영향을 받지 않았다(도 13a 및 13b). 매우 흥미롭게도, DOX의 효과는 α5 조성물과 함께 투여될 때 강력해진다.
상기 섹션에 개시된 바와 같이, 안트라사이클린 DOX(상표명 Adriamycin)는 1960년대에 도입된 이후로, 매우 효과적이고 빈번하게 사용되는 항종양 약물이지만, 이는 중증 심부전을 초래할 수 있는 투여량-관련 심장 독성을 유발한다. 심장이 DOX에 의해 손상되었다면, 치료 옵션은 거의 없다. 전형적으로, DOX-유발된 심근병증 및 심부전은 통상적인 치료에 불응한다[선행기술문헌 1]. 환자-특이적 인간 유발된 다능성 줄기 세포-유도된 심근세포의 분석을 포함한, DOX 심장 독성이 걸릴 환자를 예측하고, 이러한 위험을 적절하게 예방하려는 노력이 증가하였지만, 철킬레이트제, 안지오텐신-전환 효소 저해제, β-차단제, 항산화제 및 천연 제품 또는 식품 보충제와 같은 약물의 포함이 결정적으로 제안되지 않았다. 여기서는, 배양된 HL-1 심근세포에서 DOX-유발된 미토콘드리아 손상을 예방하는 데 있어서 α5 조성물 및 BCAAem 조성물의 효능을 시험하였다. α5는 미토콘드리아 생체발생 표지자의 DOX-유발된 결핍을 중화하는 데 있어서 BCAAem보다 통계적으로 더 효율적이었다. α5의 식이 보충은 KLF15/Akt/eNOS/mTORC1 신호 전달 축을 활성화시킨다(도 12). 이러한 결과는 또한, mTORC2의 역할, 즉 정상적인 심장 발달 및 출생후 심장 구조 및 기능의 유지를 위해 필수적이며, 특히 스트레스 조건에 적응하는 것으로 보이는 신호 경로를 제외하지 않는다. 그러나, mTORC2는 DOX 심장 독성에서 지금까지 암시되지 않았다. 또한, KLF15 및 세스트린2에 대한 본 발견은 이러한 실험 모델에서 mTORC2 신호의 관련성에 유사하게 의문을 제기한다. 본 출원에 나타낸 가장 관련성 높은 발견들 중 하나는 HL-1 심근세포에서 KLF15 침묵에 의해 유발된, 미토콘드리아 생체발생 표지자인 PGC-1α 및 COX-IV 단백질의 대량 하향조절이다. Cys2/His2 아연-집게 전사 조절자의 Kruppel-유사 인자(KLF) 패밀리는 심근세포 및 미토콘드리아의 구조와 기능의 다양한 양태를 제어한다. 중요하게는, KLF15는 Wnt/β-카테닌 전사를 조절하고, 심장 발달에서의 역할을 제시하는, 출생후 심장 내의 심장 전구세포 운명을 제어한다.
본 출원은 Klf15-, eNOS 및 Raptor-침묵 심근세포가 α5에 대해 비응답성이며, 이는 미토콘드리아 생체발생 그 자체를 촉진하여 DOX로 보충될 때 미토콘드리아 손상을 보호할 수 없음을 보여준다. 또한, DOX로 72시간 처리 후, Klf15 유전자 발현은 심장 조직에서 감소하였다.
α5 보충은 1) 미토콘드리아 생체발생, 2) 항-ROS 방어 시스템, 및 3) 명백히 mTORC1-의존 방식으로, 가능하게는 TCA 중간체의 생성에 의한, BCAA 산화를 촉진함으로써 급성 DOX에 의해 유발된 미토콘드리아 기능 장애를 예방한다(도 12).
실제로 Klf15-녹다운은 HL-1 세포에서 mTORC1 활성을 현저하게 감소시켰고, α5 혼합물의 DOX-약화된 S6 인산화를 회복시키는 능력을 손상시켰다. 마찬가지로, Klf15 침묵은 DOX-처리된 및 비처리된 심근세포 둘 모두에서 BCKDH 인산화에 의해 측정된 BCAA 이화의 α5-유발된 활성화를 부분적으로 예방하였다. 이는 심장 세포에서, α5의 보호 효과가 mTORC1 활성화에 의해 적어도 부분적으로 매개되고, KLF15 발현 및 이에 따른 BCAA 산화에 좌우됨을 시사한다. 또한, 심장 세포 및 조직에서, α5는 DOX 처리 후 고도로 발현되는 세스트린2 수준을 제어하도록 회복된다. 세스트린은 스트레스-유도성 단백질(세스트린1 내지 3)의 패밀리이며, 세스트린2가 mTORC1 경로의 류신 센서임을 가리키는 다양한 증거가 있다. 따라서 스트레스를 받지 않는 조건하에 저해되는 GATOR2에 정상적으로 결합된, 세스트린2는 류신이 마이크로몰 세포내 농도로 존재할 때 GATOR2를 대신하여, mTORC1을 활성화시킨다. α5 조성물은 DOX-처리된 및 비처리된 심장 세포 및 조직 둘 모두에서 eNOS 발현 및 활성을 촉진시켰다. 아마도, 이러한 효과는 (Ser473)-Akt 인산화에 의해 매개되었다.
흥미롭게도, 암 환자의 영양 지원에 있어서 아미노산계 조성물의 역할이 지금까지 명확하게 정의되었지만, 본 출원은 MCF7 유방암 세포주의 α5 조성물에의 노출은 2개의 상이한 검정에 따라 평가된 바와 같이 MCF7 세포 증식을 촉진하지 않았음을 보여준다(도 13a 및 13b). 마찬가지로, MCF7 세포에서 DOX의 항증식 효과는 아미노산 존재에 의해 완전히 영향을 받지 않았다(도 13a 및 13b). 매우 흥미롭게도, 증식율은 α5 조성물이 투여될 때 감소한다.
종합적으로, 본원에 기록된 결과는 다음을 보여주었다: 1) 급성 DOX 치료는 심장 조직 및 심근세포 둘 모두에서 미토콘드리아 기능 장애를 유발하고, 2) α5 조성물은 이러한 손상을 현저하게 예방하고, 3) eNOS 및 mTORC1 신호 경로는 이러한 보호자로서의 작용에 결정적으로 관여하고, 4) KLF15, 즉 심장 발달 및 일주기 조절에 특히 중요한 특이적 전사 인자는 이러한 신호 전달 축을 제어하는 데 있어서 관련 역할을 하며, 5) MCF7 세포에서 DOX의 항증식 효과는 아미노산 존재에 의해 완전히 영향을 받지 않는다.
이러한 발견은 화학요법을 받는 대상체에서, 예를 들어 독소루비신과 같은 화학요법제에 의해 유발된 심장 독성의 예방 및 치료에 있어서 α5 조성물의 효능을 강조한다.
Claims (15)
- 화학요법을 받는 대상체에서 적어도 하나의 화학요법제에 의해 유발된 심장 독성의 예방 또는 치료에 사용되는 조성물로서, 상기 조성물은 활성제를 포함하고, 상기 활성제는 아미노산 시트르산, 숙신산 및 말산을 함유하고,
상기 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 트레오닌 및 리신을 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 화학요법제는 안트라사이클린, HER2/ErbB2 저해제, 티로신-키나아제 저해제, 혈관 내피 성장 인자 저해제 및 면역 체크포인트 저해제로 이루어진 군 중에서 선택되고, 상기 안트라사이클린은 바람직하게는 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 픽산트론, 사바루비신, 발루비신 및 이의 유도체로 이루어진 군 중에서 선택되는, 조성물. - 제1항에 있어서,
시트르산, 말산 및 숙신산의 합과 분지형 사슬 아미노산, 리신 및 트레오닌의 합의 중량비는 0.05 내지 0.3으로 구성되고, 상기 분지형 사슬 아미노산은 류신, 이소류신 및 발린인 것인, 조성물. - 제1항에 있어서,
시트르산, 말산 및 숙신산의 총량과 분지형 사슬 아미노산인 류신, 이소류신 및 발린의 총량의 중량비는 0.1 내지 0.4로 구성되는, 조성물. - 제1항에 있어서,
시트르산과 말산 및 숙신산의 합의 중량비는 1.0 내지 4.0으로 구성되는, 조성물. - 제1항에 있어서,
시트르산:말산:숙신산 중량비는 10:1:1 내지 2:1.5:1.5로 구성되는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 활성제는 히스티딘, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 티로신 및 시스테인으로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 추가로 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 활성제는 히스티딘, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판 및 시스테인을 추가로 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
시트르산, 말산, 숙신산의 총 몰량과 메티오닌, 페닐알라닌, 히스티딘 및 트립토판의 총 몰량의 비는 1.35보다 높은, 조성물. - 제1항에 있어서,
3개의 산, 즉 시트르산, 숙신산, 말산의 총 몰량과 리신 및 트레오닌의 총 몰량의 비는 0.10 내지 0.70으로 구성되는, 조성물. - 제1항에 있어서,
시트르산의 중량 또는 몰량은 말산 및 숙신산 둘 모두의 총 중량 또는 몰량보다 더 높은, 조성물. - 제1항에 있어서,
류신과 시트르산의 중량비는 1 내지 5로 구성되는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 아미노산에는 아르기닌이 부재하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 아미노산에는 세린, 프롤린 및 알라닌이 부재하는, 조성물. - 암에 걸린 대상체에서 적어도 하나의 화학요법제에 의해 유발된 심장 독성을 예방하거나 치료하는 데 동시에, 개별적으로, 순차적으로 사용되는 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 적어도 하나의 화학요법제를 포함하는 병용 제제.
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