JP2023509627A - 化学療法の副作用の予防および治療における使用のためのアミノ酸を含む組成物 - Google Patents

Abstract

【要約】
化学療法を受ける被験者において、少なくとも１種の化学療法剤によって誘発される心毒性の予防、および／または治療における使用のための組成物であって、活性剤を有し、前記活性剤は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リジンのアミノ酸、およびクエン酸、コハク酸、リンゴ酸を含有する、使用のための組成物。前記化学療法剤は、アントラサイクリン、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２阻害剤、チロシン‐キナーゼ阻害剤、血管内皮増殖因子阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤からなる群において選択されてもよい。

Description

本明細書は、一般に、化学療法の副作用の予防および治療における使用のための、アミノ酸を含む組成物に関する。

乳癌は世界的に、女性に最もよく見られる腫瘍性疾患である。２０１２年には、およそ１６７万人のこの腫瘍の新患が診断された。２０１８年には、ほぼ２１０万人（１１．６％）の女性において乳癌の新患が診断され、約６２７，０００人（６．６％）の女性がこのタイプのがんにより死亡した。この予後により、いくつかのタイプの乳癌は依然として不治の疾患であり、女性の高い死亡率をもたらしていることが示唆される。

ドキソルビシン（ＤＯＸ）などのアントラサイクリンは、広く使用されており、非常に成功している抗がん化学療法である。残念ながら、ＤＯＸの投与は、心筋症、それに加えて、呼吸困難、運動耐容能低下、肝機能障害、および腎障害の発症などの、非がん組織への用量依存的副作用をもたらす。アントラサイクリン以外には、ヒト上皮増殖因子（ＨＥＲ）２を標的とするもの（ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２阻害剤）、いくつかのチロシン‐キナーゼ阻害剤、血管内皮増殖因子阻害剤、および免疫チェックポイント阻害剤などの、より新たな治療法が、重度の心血管毒性を示している。ＨＥＲ２陽性乳癌を有する患者に関しては、トラスツズマブを用いた治療も、治療後の左心室駆出分画の低下によって特徴付けられるように、心筋症と関連付けられている。がん治療関連心筋症を発症するがん患者は、心毒性のない患者と比較して著しく不良な生存期間を有する。これらの毒性は、それ以外の場合であれば治療可能な腫瘍の治療における制限要因を表し、損なわれた心予備能を有する高齢人口は、これらの作用の影響をさらにより受けやすいおそれがある。したがって、心毒性のリスクは、これらの薬剤の臨床使用にとって最も制限的な要因のうちの１つであり、急性および慢性両方の心血管イベントが起こる結果となる。一例として、ＤＯＸの急性心毒性は、投与後数分から数日で発症し得、通常、低血圧、不整脈、および最も重要なことには左心室不全によって特徴付けられる。これらの副作用の分子機構は十分に理解されていないが、ＤＯＸは多くの種々の細胞内プロセスにも影響するため、増えつつある証拠により示唆されるのは、ＤＯＸによる心臓障害の主要なメディエータは酸化ストレスであり、活性酸素種（ＲＯＳ）依存性脂質過酸化反応が増大し、抗酸化物質およびスルフヒドリル基のレベルが低減することである。酸化ストレスが増大した後に、心筋症の発症および心不全が続く。ＲＯＳの高い産生量によりミトコンドリア障害が引き起こされ、ＡＴＰ合成が低減し、かつ心臓細胞がアポトーシスするため、ミトコンドリア機能障害は、ＤＯＸによって、および一般に他の化学療法剤によって誘発される副作用に関与し得る。

そうは言うものの、化学療法剤によって誘発される心筋症および心不全は、心血管に起因して誘発される心不全と比較して、解剖学的‐病理的および病態生理学的両方の観点から異なる。これが、典型的に、化学療法誘発性心筋症および心不全が伝統的療法に対して難治性である理由である。

さらに、その他の、化学療法によって誘発される心毒性の有効な治療法の特定に関連した極めて重要な問題は、心筋症または心不全の治療のために潜在的に好適であるアプローチは、特定の患者群、すなわちがんに罹患した患者には好適ではないことがあるという証拠から見出される。がん細胞は、健康な被験者の細胞のそれとは異なる代謝プロフィールを有し、がん細胞の増殖におけるミトコンドリア活性の役割に関して、対照的な証拠が明らかとなってきている。ミトコンドリア機能性を回復することが可能な治療的アプローチは、がん細胞の増殖の増大に、したがって化学療法剤が及ぼす抗腫瘍効果の低減にいたり得る。

本明細書は、がんに罹患し、化学療法を受ける被験者において、化学療法剤によって誘発される心毒性を中和することにおいて特に有効な新規のアミノ酸ベース組成物を提供する目標を有する。

本明細書によれば、上記目的は、本開示の不可欠な部分を形成するものとして理解される特許請求の範囲において具体的に想起される主題のおかげで達成される。

本明細書のある実施形態は、化学療法を受ける被験者において、少なくとも１種の化学療法剤によって誘発される心毒性を予防する、かつ／または治療するための組成物を提供し、組成物は、活性剤を有し、上記活性剤は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リジンのアミノ酸、およびクエン酸、コハク酸、リンゴ酸を含有する。

少なくとも１種の化学療法剤は、アントラサイクリン、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２阻害剤、チロシン‐キナーゼ阻害剤、血管内皮増殖因子阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤からなる群において選択されてもよい。アントラサイクリンは好ましくは、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピクサントロン、サバルビシン、バルルビシン、それらの誘導体からなる群において選択される。

１または複数の実施形態において、組成物の活性剤は、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、およびチロシンからなる群において選択される１または複数のアミノ酸をさらに含有する。

これから、同封の図面を参照しながら、例示のみを目的として本発明を説明する。

ＨＬ‐１心臓細胞の治療を示すスキームである。 マウスのｉｎ ｖｉｖｏ治療を示すスキームである。 ＤＯＸに急性に暴露されたＨＬ‐１心筋細胞において、特定のアミノ酸組成物がミトコンドリア機能障害を阻止するのを示す。（Ａ）ミトコンドリア生合成マーカ発現：ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体‐γコアクチベータ１α（ＰＧＣ１‐α）、核呼吸因子‐１（ＮＲＦ１）、転写因子Ａ（Ｔｆａｍ）、シトクロムｃ（ｃｙｔ ｃ）、およびシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶ（ＣＯＸ ＩＶ）のｍＲＮＡレベルは、定量的ＲＴ‐ＰＣＲによって分析された。未処理（ＣＴＲＬ）細胞に関する発現相対値は、１．０（ｎ＝５つの実験）とされた。（Ｂ）ＣＯＸ ＩＶおよびｃｙｔ ｃのタンパク質レベルは、イムノブロット解析によって検出された。相対値は、ＧＡＰＤＨレベルに対して濃度測定分析によって決定され、未処理（ＣＴＲＬ）細胞に関する値は、１．０（ｎ＝５つの実験）とされた。（Ｃ）クエン酸シンターゼ活性。値は、タンパク質含有量に正規化された（ｎ＝３つの実験）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１対未処理細胞；†ｐ＜０．０１対ＤＯＸ処理細胞；§ｐ＜０．０１対ＢＣＡＡｅｍ処理した細胞。すべてのデータは平均値±ＳＤとして呈示される。 ＴＣＡ中間体は、ＨＬ‐１心筋細胞において、ミトコンドリア生合成遺伝子のＤＯＸ誘発性低減を阻止しないことを示す。（Ａ～Ｃ）ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体‐γコアクチベータ１α（ＰＧＣ‐１α）（Ａ）、核呼吸因子‐１（ＮＲＦ１）（Ｂ）、および転写因子Ａ（Ｔｆａｍ）（Ｃ）。ｍＲＮＡレベルは、定量的ＲＴ‐ＰＣＲによって分析された。未処理（ＣＴＲＬ）細胞に関する発現相対値は、１．０（ｎ＝３つの実験）とされた。Ｃ、クエン酸；Ｓ、コハク酸、Ｍ、リンゴ酸。＊ｐ＜０．０５対未処理細胞。すべてのデータは平均値±ＳＤとして呈示される。 α５の補充によって、ＨＬ‐１心筋細胞において、ＤＯＸ誘発性酸化ストレスが阻止されることを示す。ＨＬ‐１細胞における、（Ａ）ミトコンドリアのＨ_２Ｏ_２放出、（Ｂ）基礎アコニターゼ／総アコニターゼの比、および（Ｃ）スーパーオキシドジスムターゼ活性（ＳＯＤ）（ｎ＝３つの実験）。（Ｄ）スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）およびグルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）のｍＲＮＡレベルは、定量的ＲＴ‐ＰＣＲによって分析された。未処理（ＣＴＲＬ）細胞に関する発現相対値は、１．０（ｎ＝５つの実験）とされた。（Ｅ）未処理（ＣＴＲＬ）細胞およびＤＯＸ処理した細胞における８‐ヒドロキシ‐２'‐デオキシグアノシン（８‐ＯＨｄＧ）の産生として測定された総ＤＮＡ酸化損傷（ｎ＝３つの実験）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１対未処理細胞；†ｐ＜０．０１対ＤＯＸ処理細胞。すべてのデータは平均値±ＳＤとして呈示される。 α５組成物によって、ＤＯＸ誘発性のＨＬ‐１細胞の死が阻止されることを示す。ＨＬ‐１心筋細胞の細胞毒性は、ＭＴＴアッセイを用いて評価された。細胞は、１％のα５で４８時間、１μＭのＤＯＸで１６時間処理された。＊ｐ＜０．０５対未処理細胞；†ｐ＜０．０５対ＤＯＸ処理細胞。すべてのデータは平均値±ＳＤとして呈示される。 α５組成物によって、ＤＯＸ処理マウスの左心室におけるミトコンドリア機能障害が阻止されることを示す。（ＡおよびＦ）ミトコンドリア生合成マーカ発現。（Ａ）ＰＧＣ１‐α、ＮＲＦ１、Ｔｆａｍ、ｃｙｔ ｃ、ＣＯＸ ＩＶ、ならびに（Ｆ）ＳＯＤ１、スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）、カタラーゼ（Ｃａｔ）、およびＧＰＸ１のｍＲＮＡレベルは、定量的ＲＴ‐ＰＣＲによって分析された。溶媒処理（Ｖｅｈ）マウスに関する発現相対値は、１．０（ｎ＝５つの実験）とされた。（Ｂ）ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）量は、定量的ＲＴ‐ＰＣＲによって分析された。相対単位は、溶媒処理マウスに関するものとの比較において表され、１．０（ｎ＝５つの実験）とされた。（Ｃ）ＣＯＸ ＩＶおよびｃｙｔ ｃのタンパク質レベルは、イムノブロット解析によって決定された。相対値は、グリセロアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）レベルに対して濃度測定分析によって決定され、溶媒処理マウスに関する値は、１．０（ｎ＝５つの実験）とされた。（Ｄ）クエン酸シンターゼ活性。値は、タンパク質含有量に正規化された（ｎ＝３つの実験）。（Ｅ）基礎酸素消費速度。ミトコンドリアは、ＤＯＸおよびα５で処理した、または処理されていないマウスの左心室から単離された。酸素消費速度は、ミトコンドリアタンパク質の量に正規化された（ｎ＝３つの実験）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１対溶媒処理マウス；†ｐ＜０．０５および††ｐ＜０．０１対ＤＯＸ処理マウス。すべてのデータは平均値±ＳＤとして呈示される。 種々のシグナル伝達経路は、ＤＯＸ処理マウスにおけるα５補充の防護効果に関係があることを示す。（Ａ、Ｅ、およびＦ）遺伝子発現。（Ａ）内皮型一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）、（Ｅ）Ｓｅｓｔｒｉｎ２、および（Ｆ）クルッペル様因子１５（ＫＬＦ１５）のｍＲＮＡレベルは、定量的ＲＴ‐ＰＣＲによって分析された。溶媒（Ｖｅｈ）処理マウスの発現相対値は、１．０（ｎ＝５つの実験）とされた。（Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＧ）タンパク質レベル。（Ｂ）ホスホ‐ｅＮＯＳ、（Ｃ）ホスホ‐Ｓ６、（Ｄ）ホスホ‐ｍＴＯＲ、および（Ｇ）ホスホ‐ＢＣＫＤＨのタンパク質レベルは、イムノブロット解析によって検出された。相対値は、濃度測定的に分析され、それぞれ、総ｅＮＯＳ、Ｓ６、ｍＴＯＲ、およびＢＣＫＤＨレベルに対する比として報告された。溶媒処理マウスの発現に関する値は、１．０（ｎ＝５つの実験）とされた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１対溶媒処理マウス；†ｐ＜０．０５対ＤＯＸ処理マウス。すべてのデータは平均値±ＳＤとして呈示される。 種々のシグナル伝達経路は、ＤＯＸ処理ＨＬ‐１心筋細胞におけるα５補充の防護効果に関係があることを示す。（Ａ、Ｄ、およびＦ）遺伝子発現。（Ａ）ｅＮＯＳ、（Ｄ）Ｓｅｓｔｒｉｎ２、（Ｆ）ＫＬＦ１５のｍＲＮＡレベルは、定量的ＲＴ‐ＰＣＲによって分析された。未処理（ＣＴＲＬ）細胞に関する発現相対値は、１．０（ｎ＝５つの実験）とされた。（Ｂ、Ｃ、Ｅ～Ｈ）タンパク質レベル。（Ｂ）ホスホ‐ｅＮＯＳ、（Ｃ）ホスホ‐Ｓ６、（Ｅ）ホスホ‐Ａｋｔ、（Ｆ）ＫＬＦ１５、（Ｇ）ＰＧＣ‐１αおよびＣＯＸＩＶ、ならびに（Ｈ）ホスホ‐Ｓ６およびホスホ‐ＢＣＫＤＨのタンパク質レベルは、イムノブロット解析によって検出された。相対値は、濃度測定的に分析され、それぞれ、総ｅＮＯＳ、Ｓ６、Ａｋｔ、およびＢＣＫＤＨレベルに対する比として報告され、ＫＬＦ１５、ＰＧＣ‐１α、およびＣＯＸＩＶはＧＡＰＤＨに正規化された。未処理ＨＬ‐１細胞に関する値は、１．０（ｎ＝５つの実験）とされた。（Ｇ）特異的ＫＬＦ１５ ｓｉＲＮＡまたは非標的ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクションされ、ＤＯＸまたはα５単独で、またはそれらの組み合わせで処理したＨＬ‐１細胞において、ＰＧＣ１‐αおよびＣＯＸ ＩＶタンパク質レベルは、イムノブロット解析によって測定された。未処理ＨＬ‐１細胞に関する値は、１．０（ｎ＝５つの実験）とされた。（Ｈ）Ｓ６およびＢＣＫＤＨリン酸化は、（Ｇ）におけるように、ＨＬ‐１細胞においてイムノブロット解析によって測定された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１対未処理細胞；†ｐ＜０．０５対ＤＯＸ処理細胞。すべてのデータは平均値±ＳＤとして呈示される。 ＨＬ‐１心筋細胞における、特異的なＫｌｆ１５、ｅＮＯＳ、およびＲａｐｔｏｒのサイレンシングを示す。（Ａ～Ｃ）Ｋｌｆ１５、ｅＮＯＳ、およびＲａｐｔｏｒのｍＲＮＡレベルは、定量的ＲＴ‐ＰＣＲによって分析され、ＫＬＦ１５、ｅＮＯＳ、およびＲａｐｔｏｒタンパク質レベルは、イムノブロット解析によって検出された。未処理（ＣＴＲＬ）細胞に関する発現相対値は、１．０（ｎ＝５つの実験）とされた。＊ｐ＜０．０５対未処理細胞。すべてのデータは平均値±ＳＤとして呈示される。 ＨＬ‐１心筋細胞における、特異的なｅＮＯＳおよびＲａｐｔｏｒのサイレンシングを示す。（Ａ）特異的ｅＮＯＳ ｓｉＲＮＡまたは非標的ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクションされ、ＤＯＸまたはα５単独で、またはそれらの組み合わせで処理したＨＬ‐１細胞において、ＰＧＣ１‐αおよびＣＯＸ ＩＶタンパク質レベルは、イムノブロット解析によって測定された。（Ｂ）特異的Ｒａｐｔｏｒ ｓｉＲＮＡまたは非標的ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクションされ、ＤＯＸまたはα５単独で、またはそれらの組み合わせで処理したＨＬ‐１細胞において、ＰＧＣ１‐αおよびＣＯＸ ＩＶタンパク質レベルは、イムノブロット解析によって測定された。未処理（ＣＴＲＬ）細胞に関する値は、１．０（ｎ＝３つの実験）とされた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１対未処理細胞；†ｐ＜０．０５対ＤＯＸ処理細胞。すべてのデータは平均値±ＳＤとして呈示される。 心筋細胞においてドキソルビシン（ＤＯＸ）によって誘発されるミトコンドリア損傷に対するα５防護的な働きの提示モデルを示す。プラス（＋）およびマイナス（‐）符号は、ＤＯＸによって誘発される刺激または抑制、および潜在的にα５の標的部位を表す。ＤＯＸは、１）トポイソメラーゼＩＩβ（ＴＯＰ２Ｂ）に結合して、Ｐｐａｒｇｃ１ａおよびＰｐａｒｇｃ１ｂプロモータと複合体を形成し、ＲＯＳ防御遺伝子などのミトコンドリア遺伝子の転写をブロックし、２）ミトコンドリア生理機能の重要な調節因子であるｅＮＯＳ発現およびｍＴＯＲＣ１活性を低減し、３）ＫＬＦ１５遺伝子発現、およびおそらくはＢＣＡＡ酸化を制限し、ＴＣＡ回路中間体およびミトコンドリアエネルギ産生が低減される以外に、α‐ケト酸およびＢＣＡＡの集積（高レベルの毒性がある）が伴うことにより、ミトコンドリア生合成および機能を低減する。ＤＯＸのミトコンドリア集積には、ＲＯＳの増大が伴う。 ＭＣＦ７乳癌細胞の増殖に関する。ＤＯＸの抗増殖効果は、アミノ酸混合物の存在下、ＭＣＦ７細胞において変わらないままであった。（Ａ）酸性ホスファターゼアッセイ：細胞（９６ウェルプレートにおいて５，０００～２０，０００／ウェル）は、１％のα５で４８時間、１μＭのＤＯＸで１６時間処理された。（Ｂ）増殖アッセイ：細胞（１２ウェルプレートにおいて５０，０００／ウェル）は（Ａ）におけるように処理され、トリパンブルー排除アッセイを使用した。ｎ＝３つの実験。＊ｐ＜０．０５、および＊＊ｐ＜０．０１対未処理細胞。すべてのデータは平均値±ＳＤとして呈示される。

以下の説明において、実施形態の十分な理解を提供するために、多数の具体的な詳細が与えられる。実施形態は、具体的な詳細の１または複数なしに、または他の方法、成分、材料などとともに実施することができる。他の例では、実施形態の態様を不明瞭にすることを避けるために、周知の構造、材料、または動作は詳細に示されないか、または説明されない。

本明細書を通して、「一実施形態」または「ある実施形態」への言及は、その実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通して様々な箇所における「一実施形態において」または「ある実施形態において」という語句が出現しても、必ずしもすべてが同じ実施形態に言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１または複数の実施形態において、任意の好適な方式で、組み合わされ得る。本明細書に提供される見出しは、便宜上のものにすぎず、実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。

本明細書は、化学療法を受ける被験者において、化学療法剤によって誘発される心毒性を中和することにおいて特に有効な新規のアミノ酸ベース組成物を提供する目標を有する。組成物は、心臓細胞において、特に化学療法剤によって誘発されるミトコンドリア機能障害を阻止し、かつ修復することが可能である。化学療法剤によって誘発される心毒性は、心筋症または心不全を含んでもよい。

本明細書は、がんに罹患し、化学療法を受ける被験者において、少なくとも１種の化学療法剤によって誘発される心毒性を予防する、かつ／または治療するための組成物を提供し、組成物は、活性剤を有し、上記活性剤は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リジンのアミノ酸、およびクエン酸、コハク酸、リンゴ酸を含有する。

抗腫瘍剤とも呼ばれる化学療法剤は、急速に成長する細胞の増殖を直接的または間接的に阻害し、抗腫瘍効果を及ぼすために使用される。本明細書に開示される組成物は、アントラサイクリン、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２阻害剤、チロシン‐キナーゼ阻害剤、血管内皮増殖因子阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤によって誘発される心毒性を予防する、かつ／または治療することにおいて有効である。アントラサイクリンは、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピクサントロン、サバルビシン、バルルビシン、それらの誘導体からなる群において選択されてもよい。

本開示は、がんに罹患した被験者において、上記少なくとも１種の化学療法剤よって誘発される心毒性を予防する、かつ／または治療することにおいて、同時に、別々に、および逐次的に使用するための、本明細書に開示される組成物と少なくとも１種の化学療法剤とを含む、組み合わせ製剤をさらに提供する。

分岐鎖アミノ酸強化混合物（ＢＣＡＡｅｍ）を用いた長期的な（３か月）栄養素補充により、中年のマウスの心筋および骨格筋におけるミトコンドリア生合成が促進されたことが示されている。文献ＷＯ２０１９／０２１１３５Ａ１に開示されるように、ロイシン、イソロイシン、バリンの分岐鎖アミノ酸をトレオニン、リジン、およびクエン酸、コハク酸、リンゴ酸との組み合わせで含む組成物は、ミトコンドリア機能の改善において有効であることも示されている。それにもかかわらず、潜在的に有効な薬剤の投与を包含する、特に化学療法剤によって誘発される心毒性を予防し、かつ治療するためのいっそうの努力が、結論が出ないまま提示されていることも示されている［１］。

ここで、本願の発明者は驚いたことに、本明細書に開示される組成物は、化学療法を受ける被験者において、化学療法剤によって誘発される心毒性を治療することにおいて有利に使用され得ることを見出した。具体的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで行った試験により、ｉ）ミトコンドリア機能性の回復において、化学療法剤としてのドキソルビシンで処理された心臓細胞は、本明細書に開示される組成物を用いた治療に対して難治性ではないこと、およびｉｉ）組成物は、化学療法剤によって誘発される心毒性を中和することが可能であることが示される。

さらに、以下のセクションに示すように、組成物は、特定の被験者、すなわち化学療法を受ける、したがって腫瘍病状に苦しむ被験者の群にも安全に投与され得る。この証拠の驚くべき態様は、前述のセクションで開示されるように、がん細胞は、健康な被験者の細胞のそれとは異なる代謝プロフィールを有し、がん細胞の増殖におけるミトコンドリア活性の役割に関して、相反する証拠が焦点を当てられているという考察に由来する。たとえば、がん細胞のミトコンドリアＤＮＡの欠失は、それらの成長および腫瘍形成能を低減させることが示されている。これらの観察に基づけば、ミトコンドリア機能性の回復はむしろ、腫瘍細胞の増殖の増大をもたらす可能性があり、また、化学療法薬剤が及ぼす抗腫瘍効果の低減を決定する。

本明細書に開示される組成物は、これに反して、ｉ）ドキソルビシンで処理した心臓細胞におけるミトコンドリア機能性を回復することにおいて有効であり、ｉｉ）腫瘍細胞の増殖に好都合に働かず、ｉｉｉ）ドキソルビシンが及ぼす抗腫瘍効果を変更せず、ｉｖ）非常に驚いたことに、ドキソルビシンの抗増殖効果を強力にすることが可能である。

以下に開示されるように、α５組成物と名付けられる、必須アミノ酸およびトリカルボン酸回路中間体を含む組成物が試験され、ＤＯＸで処理したＨＬ‐１心筋細胞およびマウスにおけるその作用が調べられた。ＢＣＡＡｅｍ組成物と名付けられる、トリカルボン酸を有しない必須分岐鎖アミノ酸を含む組成物と比較して、α５組成物の補充は、ＤＯＸ誘発性ミトコンドリア機能障害に対する防護効果を促進することにおいて著しくより有効であった。結果は、ＤＯＸ急性処理に暴露された幼若マウスのｉｎ ｖｉｖｏに及んだ。結果は以下の証拠、ｉ）ＤＯＸ急性投与後のミトコンドリア機能障害の発生、ｉｉ）α５組成物の短期的な補充の際立った防御効力を示した。したがって、組成物は、化学療法剤に誘発される心毒性の予防および／または治療において使用され、したがって、そのような誘発される心毒性から生じ得る心筋症および／または心不全も予防し得る。

本明細書に開示される組成物は、活性剤を有し、上記活性剤は、クエン酸、コハク酸、およびリンゴ酸をロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リジンと組み合わせて含有し、クエン酸、コハク酸、およびリンゴ酸の総量とロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リジンのアミノ酸の総量との重量比は、０．０５～０．３の間、好ましくは０．１～０．２５の間で含まれてもよい。

１または複数の実施形態において、組成物は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リジン、クエン酸、コハク酸、およびリンゴ酸、ならびに任意選択でビタミンＢ１および／またはビタミンＢ６からなってもよい。

１または複数の実施形態において、活性剤は、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、チロシンからなる群において選択される１または複数のアミノ酸をさらに含んでもよい。

１または複数の実施形態において、組成物は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、任意選択でチロシン、ならびにクエン酸、コハク酸、およびリンゴ酸からなる活性剤を含んでもよく、上記アミノ酸のみが組成物に含有されるアミノ酸である。

１または複数の実施形態において、組成物は、任意の化学療法剤、すなわち、急速に成長する細胞の増殖を直接的または間接的に阻害し、抗腫瘍効果を及ぼす任意の薬剤などの、任意の他の活性剤を含まなくてもよい。

１または複数の実施形態において、組成物は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、チロシン、クエン酸、コハク酸、およびリンゴ酸、ならびに任意選択でビタミンＢ１および／またはビタミンＢ６からなってもよい。

組成物は、イソロイシン、ロイシン、およびバリンのアミノ酸を、活性剤の重量に対して重量で３５％～６５％の間、好ましくは重量で４２％～５６％の間の量で含んでもよい。

ロイシンとクエン酸との重量比は、５～１の間、好ましくは２．５０～３．５０の間で含まれる。

１または複数の実施形態において、クエン酸の重量またはモル量は、リンゴ酸およびコハク酸の各々の重量またはモル量より多い。好ましくは、クエン酸の重量またはモル量は、リンゴ酸とコハク酸とを加えた全重量または全モル量より多い。さらなる実施形態において、クエン酸と、リンゴ酸およびコハク酸の合計との重量比は、１．０～４．０の間、好ましくは１．５～２．５の間で含まれる。好ましい実施形態において、クエン酸：リンゴ酸：コハク酸の重量比は、１０：１：１～２：１．５：１．５の間、好ましくは７：１：１～１．５：１：１の間、より好ましくは５：１：１～３：１：１の間で含まれる。好ましい実施形態において、クエン酸：リンゴ酸：コハク酸の重量比は、４：１：１である。

好ましいイソロイシン：ロイシンのモル比は、０．２～０．７の範囲で、好ましくは０．３０～０．６０の範囲で含まれ、かつ／または好ましいバリン：ロイシンの重量比は、０．２～０．７０の範囲で、好ましくは０．３０～０．６５の範囲で含まれる。

トレオニン：ロイシンのモル比は、０．１０～０．９０の範囲で、好ましくは０．２０～０．７０の範囲で含まれ、かつ／または好ましいリジン：ロイシンの重量比は、０．２０～１．００の範囲で、好ましくは０．４０～０．９０の範囲で含まれてもよい。

好ましい実施形態において、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の全モル量とメチオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、およびトリプトファンの全モル量との比は、１．３５より高い。

１または複数の実施形態において、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の合計と、ロイシン、イソロイシン、バリンの分岐鎖アミノ酸の合計との重量比は、０．１～０．４の間、好ましくは０．１５～０．３５の間で含まれる。

さらなる実施形態において、ロイシン、イソロイシン、バリンの分岐鎖アミノ酸にトレオニンおよびリジンを加えた全重量は、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の３つの酸の全重量より多い。好ましくは、単一の酸（クエン酸、コハク酸、またはリンゴ酸）の重量は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、およびリジンの単一のアミノ酸の各々の重量より少ない。

さらなる実施形態において、リジンとトレオニンとの全モル量は、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸の３つの酸の全モル量より多い。好ましくは、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸の３つの酸の全モル量と、リジンおよびトレオニンの全モル量との比は、０．１～０．７の間、好ましくは０．１５～０．５５の間で含まれる。

１または複数の実施形態において、本明細書に開示される組成物は、ビタミン類をさらに含み、このビタミン類は、好ましくは、ビタミンＢ_１および／またはビタミンＢ_６などのビタミンＢ群から選択される。それに加えて、組成物は、炭水化物および／または矯味剤をさらに含んでもよい。

１または複数の実施形態において、組成物は、薬学的に許容される溶媒をさらに含む医薬組成物であってもよい。組成物はまた、たとえば、タンパク質、ビタミン類、炭水化物、天然および人工甘味料、ならびに／または矯味剤などの薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。好ましい実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、ホエイタンパク質、マルトデキストリン、フルクトース、カゼインカルシウム、魚油、クエン酸またはその塩、スクラロース、ショ糖エステル、ビタミンＤ３、ビタミンＢ群から選択されてもよい。

１または複数の実施形態において、組成物の活性剤は、少なくとも１種の化学療法剤をさらに含有してもよい。化学療法剤は、アントラサイクリン、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２阻害剤、チロシン‐キナーゼ阻害剤、血管内皮増殖因子阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤からなる群において選択されてもよい。アントラサイクリンは、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピクサントロン、サバルビシン、バルルビシン、それらの誘導体からなる群において選択されてもよい。

さらに、特に本開示による組成物、および具体的には活性剤を調製する場合は、アミノ酸であるアルギニンは回避されるべきである。それに加えて、本明細書に開示される組成物によって具体的に除外されるさらなるアミノ酸は、セリン、プロリン、アラニンである。そのようなアミノ酸は、組成物内のある濃度または化学量論比において逆効果または有害でさえあり得る。

本明細書に開示されるアミノ酸は、それぞれの薬学的に許容される誘導体、すなわち塩で置き換えられ得る。

１または複数の実施形態において、本明細書に開示される組成物は、化学療法を受ける被験者において、化学療法剤によって誘発される心筋症および／または心不全の予防および／または治療において使用されてもよい。

経口使用に関して、本明細書に記載の組成物は、錠剤、カプセル、顆粒、ゲル、ゲル化可能な粉末、粉末の形態であってもよい。

本開示はまた、化学療法を受ける被験者において、化学療法剤によって誘発される心毒性を、好ましくはミトコンドリア機能障害および酸化ストレスを阻止することによって、予防する、かつ／または治療するための方法を提供し、方法は、活性剤を含む組成物を選択する段階と、被験者に組成物を投与する段階とを含み、上記活性剤は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リジンのアミノ酸、およびクエン酸、コハク酸、およびリンゴ酸のカルボン酸を含有する。本明細書で開示されるように、活性剤は、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、チロシンからなる群において選択される１または複数のアミノ酸をさらに含んでもよい。

組成物は、単独で投与されてもよく、したがって方法は、組成物を選択する段階および被験者に組成物を投与する段階に存在する。１または複数の実施形態において、組成物は、同時に、逐次的、または別々に、少なくとも１種の化学療法剤と組み合わせて投与されてもよい。化学療法剤は、アントラサイクリン、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２阻害剤、チロシン‐キナーゼ阻害剤、血管内皮増殖因子阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤からなる群において選択されてもよい、アントラサイクリンは、好ましくは、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピクサントロン、サバルビシン、バルルビシン、それらの誘導体からなる群において選択されてもよい。

組成物により提供される様々なアミノ酸の量および比に関するさらなる仕様は、添付の特許請求の範囲に含まれ、本発明に関して本明細書に提供される技術的教示の不可欠な部分を形成する。

［実施例］
表１は、以下に開示されるＨＬ‐１細胞で試験した異なる２つのアミノ酸ベース組成物を示す。２つの組成物とは、ＥＰ２，１９６，２０３Ｂ１でも開示されている「ＢＣＡＡｅｍ」組成物、ならびにアミノ酸およびクエン酸、コハク酸、およびリンゴ酸を含有する活性剤を含む「α５」組成物である。

上記表１の組成物は、最初に、０．８メッシュを用いてすべての成分を篩分けすることによって調製されてもよい。予備混合物を得るために、各成分（総量の＜１０重量％の量）をＬ‐リジンＨＣｌの一部と一緒にポリエチレン袋にとり、総組成の重量の約１０％を得る。次いで、袋を５分間手で振る。次いで、予備混合物を残りの成分と一緒にミキサ（Ｐｌａｎｅｔａｒｉａ）に入れ、１２０ｒｐｍで１５分間混合して均一な最終組成物を得る。
方法

細胞の培養および処理ヘルシンキ宣言の規則に従った。ＨＬ‐１心筋細胞をＷ．Ｃ．Ｃｌａｙｃｏｍｂ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ＃ＳＣＣ０６５）から得、フィブロネクチン／ゼラチンコートフラスコに播種し、１００μＭのノルエピネフリン（３０ｍＭのＬ‐アスコルビン酸［Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ］に溶解させた１０ｍＭのノルエピネフリン［Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ］ストック溶液から）、２ｍＭのＬ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）で補充されたＣｌａｙｃｏｍｂ培地（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）に７０～８０％コンフルエンスまで成長させた［２、３］。Ｐ．Ｌｉｍｏｎｔａ（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｌａｎ、イタリア、ミラノ）から入手可能なＭＣＦ‐７ヒト乳癌細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－２２（商標））も、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）、ペニシリン（２００ｍｇ／ｍｌ）、およびゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を含有し、１０％ＦＢＳで補充されたｐＨ７．４のＤＭＥＭ中で培養した。両方の細胞型を、１％のＢＣＡＡｅｍまたはα５で４８時間、１μＭのＤＯＸで１６時間処理した（図１）。混合物の詳細な組成百分率を表１に示す。

ホスホ‐タンパク質の検討のために、ＨＬ‐１細胞を、１％のα５で２時間、１μＭのＤＯＸ（Ｓｉｇｍａ‐ＡｌｄｒｉｃｈからのＤｏｘｏ‐ＨＣｌ、Ｄ１５Ｄ１５）で終わりの６０分間処理した。Ｋｌｆ１５、ｅＮＯＳ、およびＲａｐｔｏｒノックダウン実験のために、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ １トランスフェクション試薬を使用して、ＨＬ‐１細胞に５０～１００ｎＭのＫｌｆ１５、ｅＮＯＳ、およびＲａｐｔｏｒ ｓｉＲＮＡ ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ；Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）またはｓｉＧＥＮＯＭＥ ｎｏｎｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。２４時間のトランスフェクション後、細胞を、１％のα５で２４時間、１μＭのＤＯＸで１６時間処理した。蛍光検出（吸光度／発光度、５５７／５７０）によって、ｓｉＧＬＯ‐ＲＩＳＣ‐ｆｒｅｅ ｎｏｎｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ取り込みを用いてトランスフェクション効率を決定した。次いで、ウエスタンブロット分析のためにタンパク質を抽出した。

動物および処理
使用した実験プロトコルは、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｍｉｌａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ｎ．１６／０９）によって承認され、かつｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓに準拠した。雄のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス（９週齢）４０匹を、清浄なポリプロピレンの檻に別々に入れ、以下の４つの群に分けた（図２）。１）標準的な食事（脂質４．３ｋｃａｌ％、タンパク質１８．８ｋｃａｌ％、炭水化物７６．９ｋｃａｌ％；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ Ｄｏｔｔｏｒｉ Ｐｉｃｃｉｏｎｉ）を与えられ、かつ単回の腹腔内生理食塩水注射（溶媒）を受けた対照群（ＣＴＲＬ、ｎ＝１０匹のマウス）；２）標準的な食事およびα５補充（飲み水中に１日１．５ｍｇ／体重ｇ）を与えられ、かつ単回の腹腔内生理食塩水注射（溶媒）を受けたα５群（ｎ＝１０匹のマウス）。α５組成物を水道水に溶解し、処理開始前の２週間、１日当たりに飲む体積の平均を計算した後、毎日の投与まで４℃で保管した；３）標準的な食事を与えられ、かつ心毒性であることが示されている用量である２０ｍｇ／ｋｇで、ＤＯＸ（Ｓｉｇｍａ‐ＡｌｄｒｉｃｈからのＤｏｘｏ‐ＨＣｌ）腹腔内注射を受けたＤＯＸ群（ｎ＝１０匹のマウス）［４～６］；ならびに４）標準的な食事を与えられ、かつ２０ｍｇ／ｋｇのＤＯＸ腹腔内注射とα５補充（飲み水中に１日１．５ｍｇ／体重ｇ）とを受けた、α５を加えたＤＯＸ群（ｎ＝１０匹のマウス）。２２℃で温度と湿度とが制御された静かな部屋で、１２時間明るい／１２時間暗いサイクルでα５補充を１０日間行った；α５処理終了の３日前にＤＯＸの単回投与を行った（図２）。飲んだ体積、食糧摂取量、および体重を週２回調べた。処理期間の終了時に、頸椎脱臼によりマウスを犠牲にし、心臓を迅速に取り出して新鮮なまま使用した（酸素消費量分析のため）、または液体窒素中で凍結し、‐８０℃で保管した（ｍｔＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質レベルの測定、それに加えて、クエン酸シンターゼ活性分析のため）。

定量的ＲＴ‐ＰＣＲ分析
定量的ＲＴ‐ＰＣＲを、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ）でｉＱ ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ；イタリア、セグラーテ）を用いて、先に説明したように［３～７］行った。簡潔には、ＲＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを左心室から、またはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＨＬ‐１細胞から単離した。ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、ｃＤＮＡを合成した。Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌからのＢｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ２．６ソフトウェアで、プライマを設計した。表２に示す。

Ｔ_ａアニール温度（℃）；Ｃａｔ、カタラーゼ；ＣＯＸ ＩＶ、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶ；ｃｙｔ ｃ、シトクロムｃ；ｅＮＯＳ、内皮型一酸化窒素シンターゼ；ＧＰＸ１、グルタチオンペルオキシダーゼ１；ＫＬＦ１５、クルッペル様因子１５；ｍｔＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ；ＮＲＦ１、核呼吸因子１；ＰＧＣ‐１α、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体αコアクチベータ１‐α；ＳＥＳＮ２、Ｓｅｓｔｒｉｎ２；ＳＯＤ１、スーパーオキシドジスムターゼ１；ＳＯＤ２、スーパーオキシドジスムターゼ２；ＴＢＰ、ＴＡＴＡ結合タンパク質；Ｔｆａｍ、ミトコンドリア転写因子Ａ；１８Ｓ、１８ＳリボソームＲＮＡ。
受入番号Ｃａｔ：ＮＭ＿００９８０４．２；受入番号ＣＯＸ ＩＶ：ＮＭ＿００９９４１；受入番号Ｃｙｔ ｃ：ＮＭ＿００７８０８；受入番号ｅＮＯＳ：ＮＭ＿００８７１３．４；受入番号ＧＰＸ１：ＮＭ＿００８１６０．６；受入番号ＫＦＬ１５：ＮＭ＿０２３１８４．４；マウスミトコンドリア（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ）、全ゲノム：ＮＣ＿００５０８９．１；受入番号ＮＲＦ１：ＡＦ０９８０７７；ＰＧＣ‐１α：：ＡＦ０４９３３０；受入番号ＳＥＳＮ２：ＮＭ＿１４４９０７．１；受入番号ＳＯＤ１：ＮＭ＿０１１４３４；受入番号ＳＯＤ２：ＮＭ＿０１３６７１；受入番号ＴＢＰ：ＮＭ＿０１３６８４．３；受入番号Ｔｆａｍ：ＮＭ＿００９３６０．４；受入番号１８Ｓ：Ｘ０３２０５。

様々な転写産物が検出可能であるサイクル数（閾値サイクル、ＣＴ）を、ＴＢＰのそれと比較し、ΔＣＴと呼ぶ。相対的な遺伝子レベルを２^{‐（ΔΔＣＴ）}と表し、ここでΔΔＣＴは、ＤＯＸで、α５で、またはα５を加えたＤＯＸで処理したマウス（または処理したＨＬ‐１細胞）のΔＣＴから、対照マウス（または未処理ＨＬ‐１細胞）のΔＣＴを差し引いたものに等しい。

ウエスタンブロット分析
製造業者が示すように、１ｍＭのＮａＶＯ_４、１０ｍＭのＮａＦ、およびプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ、イタリア、ミラノ）のカクテルの存在下で、タンパク質抽出物を、Ｔ‐ＰＥＲ哺乳動物タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、ロックフォード）を用いて左心室から、またはＭ‐ＰＥＲ哺乳動物タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、ロックフォード）中でＨＬ‐１細胞から得た。ビシンコニン酸タンパク質アッセイ（ＢＣＡ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、イタリア、ミラノ）によって、タンパク質含有量を決定し、還元条件下でＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって５０μｇのタンパク質抽出物を分離した。次いで、分離したタンパク質を、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イタリア、セグラーテ）に電気泳動で移送させた［３～８］。特異的抗体：抗ＣＯＸ ＩＶ（シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃４８４４、Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、イタリア、ミラノ）、抗ｃｙｔ ｃ（シトクロム複合体、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ ＃４２８０）、抗ＰＧＣ‐１α（増殖因子活性化受容体γコアクチベータ１α、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ ＃２１７８）、抗ホスホ‐ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃４０６０）、抗ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃４６８５）、抗ホスホ‐ｅＮＯＳ（Ｓｅｒ１１７７）（ホスホ‐内皮型一酸化窒素シンターゼ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃９５７１）、抗ｅＮＯＳ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃９５７２）、抗ホスホ‐Ｓ６（Ｓｅｒ２３５／２３６）（ホスホ‐Ｓ６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃４８５８）、抗Ｓ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃２２１７）、抗ホスホ‐ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ２４８１）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃２９７４）、抗ｍＴＯＲ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃２９７２）、抗ホスホ‐ＢＣＫＤＨ（Ｓｅｒ２９３）（Ａｂｃａｍ Ｃａｔ＃２００５７７）、抗ＢＣＫＤＨ（Ａｂｃａｍ Ｃａｔ＃１３８４６０）、および抗ＧＡＰＤＨ（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｔ＃２１１８）を用いて、それぞれ１：１０００希釈で、対象のタンパク質を検出した。ホスホ‐ｅＮＯＳ、ホスホ‐ＡＫＴ、ホスホ‐ｍＴＯＲ、ホスホ‐Ｓ６、および抗ホスホ‐ＢＣＫＤＨの視覚化後、Ｒｅｓｔｏｒｅ（商標）ストリッピング緩衝液（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、イタリア、ミラノ）を用いてフィルタを除去し、総ｅＮＯＳ、総ＡＫＴ、総ｍＴＯＲ、総Ｓ６、または総ＢＣＫＤＨの視覚化のためにさらに使用した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役抗ウサギまたは抗マウス免疫グロブリンを使用して、室温で１時間、免疫染色を行った。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、イタリア、ミラノ）を使用して、タンパク質を検出し、ＩｍａｇｅＪ画像分析ソフトウェアを用いて濃度測定によって定量化した。

ミトコンドリアＤＮＡ
ｍｔＤＮＡ分析のために、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて総ＤＮＡを抽出した。ｍｔＤＮＡに特異的なプライマを使用して、ｍｔＤＮＡを増幅し、１８Ｓ遺伝子（表２）に正規化した［９］。ＤＯＸで、α５で、またはα５を加えたＤＯＸで処理したマウス、それに加えて対照の未処理マウスの左心室における、ｍｔＤＮＡ遺伝子の閾値サイクルの比（ΔＣＴ）対核コード化遺伝子（１８Ｓ）のそれを測定することによって、ｑＲＴ‐ＰＣＲを使用して、ｍｔＤＮＡ含有量を決定した［１０、１１］。

クエン酸シンターゼ活性
３０℃、４１２ｎｍで、左心室抽出物における活性を分光光度測定で測定した［１２、１３］。組織を、０．１ｍＭの５，５‐ジチオ‐ビス‐（２‐ニトロ安息香）酸、０．５ｍＭのオキサロ酢酸、５０μＭのＥＤＴＡ、０．３１ｍＭのアセチルＣｏＡ、５ｍＭのトリエタノールアミン塩酸塩、および０．１Ｍのトリス‐ＨＣｌ（ｐＨ８．１）を含有する緩衝液に加えた。クエン酸シンターゼ活性を、１ｍｇのタンパク質当たり毎分産生されるｎｍｏｌでのクエン酸として表した。データを総タンパク質含有量に正規化した。総タンパク質含有量は、上述で報告したようにビシンコニン酸アッセイによって決定された。

酸素消費量
酸素消費量を説明されるように［１４、１５］測定した。ミトコンドリアを、対照および処理マウスの左心室から単離した。チャート記録計に接続されたクラーク型酸素電極（Ｒａｎｋ Ｂｒｏｔｈｅｒｓ Ｌｔｄ．）を備えた気密容器中でサンプルを３７℃で分析した。培養培地中の酸素濃度を３７℃で２００μｍｏｌ／ｌと仮定して酸素電極を較正した。

ミトコンドリアの酸化ストレス
ミトコンドリアの酸化ストレスを調査するために、Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してミトコンドリアを単離した。Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ／Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ａｓｓａｙキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用してホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の存在下、ミトコンドリアのＨ_２Ｏ_２放出を測定した。Ｆｕｓｉｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ｐａｃｋａｒｄ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、５５０ｎｍの励起フィルタおよび５９０ｎｍの発光フィルタを用いて蛍光定量測定を行った。Ｈ_２Ｏ_２産生を標準曲線から計算し、説明されたように［９］、ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇでのタンパク質として表した。さらに、ミトコンドリアアコニターゼおよびＳＯＤ活性を、先に説明されたように測定した［１６］。簡潔には、ＮＡＤＰＨの形成を、２５℃で分光光度測定（３４０ｎｍ）で追跡し（アコニターゼ活性のため）、一方でＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて、ＳＯＤ活性を測定した。ＳＯＤ活性の１単位を、スーパーオキシドラジカルの５０％不均化を示すために必要とされる酵素の量と定義した。最後に、酸化ストレスのさらなるマーカとしてＤＮＡの酸化損傷を測定した。非常に感度の高い８‐ヒドロキシ‐２'‐デオキシグアノシン（８‐ＯＨｄＧ）Ｃｈｅｃｋ ＥＬＩＳＡキット（ＪａＩＣＡ、日本、浜松）を使用した［１７］。測定を製造業者のプロトコルに従って実行した。ＱＩａｍｐＤＮＡＭｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、総ＤＮＡを抽出し、ヌクレアーゼＰ１およびアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いて消化した。ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ‐１０００分光光度測定分析によってＤＮＡの質および量を確認した。一次波として４５０ｎｍを使用してＥＬＩＳＡ反応生成物の吸光度を分光光度測定で決定した。

生存率アッセイ
ＭＴＴ［３‐（４，５‐ジメチルチアゾール‐２‐イル）‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロミド］試薬（Ｓｉｇｍａ、イタリア、ミラノ）によってＨＬ‐１細胞生存率を評価した。ＨＬ‐１を、２０，０００細胞／ウェルの密度（１００μｌ）で９６ウェル培養プレートに播種した。紫色ホルマザン結晶を５％のＳＤＳ／０．１Ｍ ＨＣｌ（１００μｌ／ウェル）に溶解し、マイクロプレートリーダ（ＥＬｘ８００、ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国、バーモント州）に５７０ｎｍの波長で吸光度を記録した。それぞれの試験を、四連で少なくとも４回繰り返した。

酸性ホスファターゼアッセイ
ＭＣＦ７細胞増殖を定量化するために、酸性ホスファターゼアッセイを説明されるように［３０］使用した。簡潔には、ＭＣＦ７細胞を、ウェル当たり５，０００～２０，０００個の細胞密度で９６ウェルプレートに入れ、１％のα５（４８時間）および１μＭのＤＯＸ（１６時間）で処理した。培地を除去し、各ウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で１回洗浄し、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％のＴｉｔｏｎ Ｘ‐１００、および５ｍＭのｐ‐ニトロフェニルホスファターゼ（ｐＮＰＰ）を含有する１００μｌの緩衝液を加えた。次いで、プレートを３７℃のインキュベータに２時間置いた。１０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加えて反応を停止させ、発色現像を４０５ｎｍで評価した。細胞を有しないウェルにおいて、ｐＮＰＰの非酵素的加水分解を測定した。

統計分析およびデータの表示
一元配置分散解析、それに続いてスチューデント＝ニューマン＝コイルス検定またはスチューデントのｔ検定を用いて統計分析を行った。別段の指定がない限り、データを平均値±標準偏差（ＳＤ）として呈示する。統計的有意差をｐ＜０．０５で受け取った。
結果

ＤＯＸに急性に暴露されたＨＬ‐１心筋細胞において、特定のアミノ酸ベース組成物はミトコンドリア機能障害を阻止する。ＤＯＸ毒性に対して心筋細胞を防護するために、化学療法剤に暴露されたＨＬ‐１細胞における、損なわれたミトコンドリア機能および酸化ストレスは修正された。ＨＬ‐１心筋細胞における酸化代謝を最大限増大することが可能な、関連性のある代謝前駆体の最適な組み合わせを評価した。具体的には、２つのアミノ酸ベース組成物（表１）の作用をＨＬ‐１分化細胞について試験した。このスクリーニングのために、１）分岐鎖アミノ酸を含む組成物（すなわちＢＣＡＡｅｍ）、または２）本願の対象である組成物「α５」であって、トリカルボン酸も含み、ＤＯＸありもしくはなしの組成物を用いて、分化心筋細胞を４８時間処理した（図１）。α５（１％ｗ／ｖ）が、ＰＧＣ‐１α、核呼吸因子１（ＮＲＦ１）、ミトコンドリア転写因子Ａ（Ｔｆａｍ）、シトクロムｃ（ｃｙｔ ｃ）、およびシトクロムｃオキシダーゼ複合体ＩＶ（ＣＯＸ ＩＶ）などの、ＨＬ‐１細胞におけるミトコンドリア生合成マーカのｍＲＮＡレベルを基底値に対して増大させる一方で、ＢＣＡＡｅｍによってはＰＧＣ‐１α発現のみが増大された（図３のＡ）。逆に、これらの遺伝子の発現は、心筋細胞が１μＭのＤＯＸに１６時間暴露された場合、減少した（図３のＡ）。特に、α５補充により、このＤＯＸ毒性は阻止され、遺伝子発現は完全に救済された（図３のＡ）。ＢＣＡＡｅｍは、ｃｙｔ ｃおよびＣＯＸ ＩＶを除いては、ＤＯＸの作用を統計的有意性をもって逆転させることはできなかった（図３のＡ）。したがって、以下ではα５組成物を使用した。特に、図４は、α５におけるのと同濃度で、個別に、またはすべて一緒に補充されたクエン酸、コハク酸、およびリンゴ酸であるＴＣＡ中間体は、単独で補充された場合、ミトコンドリア生合成のＤＯＸ誘発性低減を阻止できず、かつミトコンドリア遺伝子発現を変化させることができなかったことを示す。ミトコンドリアの健康を防護するα５補充の能力はまた、タンパク質レベル（たとえば、ＣＯＸ ＩＶ、および傾向があるｃｙｔ ｃ）においても明らかであった（図３のＢ）。さらに、低減されたミトコンドリア質量および機能の指標である、ＤＯＸ暴露によって促進されるクエン酸シンターゼ活性の低減は、α５補充によって十分に拮抗された。α５補充は、単独でＨＬ‐１細胞に加えた場合にも酵素活性を上昇させた（図３のＣ）。ＤＯＸ誘発性ミトコンドリア損傷に対するα５のこれらの健康的作用は、酸化ストレスの低減によってさらに確認された。未処理細胞と比較すると、ＤＯＸ処理によってＨ_２Ｏ_２放出（ミトコンドリアスーパーオキシドアニオン産生の指標）は際立って増大し、α５補充はこの作用を阻止した（図５のＡ）。α５は単独で加えた場合にもＨ_２Ｏ_２放出を低減した。それに応じて、ミトコンドリアＲＯＳ産生の測定（基礎／総アコニターゼ活性比によって評価される）およびＳＯＤ活性によってスーパーオキシドを排除する能力は、α５補充は、ＤＯＸによって誘発された酸化ストレスを阻止し、単独で加えられた場合にも有益な作用があったことが示された（図５のＢおよびＣ）。酸化ストレスは、抗ＲＯＳ防御システムを発動するため、抗ＲＯＳ酵素の発現を調査した。特に、グルタチオンペルオキシダーゼ１（ＧＰＸ１）およびスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の発現は、未処理ＨＬ‐１細胞と比較して、ＤＯＸ処理において増大し（図５のＤ）、ＲＯＳ産生の増大と一貫していた。

これは、ＤＯＸに暴露された細胞における、酸化的ＤＮＡ損傷のマーカである８‐ヒドロキシ‐２'‐デオキシグアノシン（８‐ＯＨｄＧ）のより多い量によって確認された（図５のＥ）。ＳＯＤ１およびＧＰＸ１遺伝子発現の両方が低減したこと（図５のＤ）によって、かつ８‐ＯＨｄＧ産生が、未処理細胞において観察される量に回復したこと（図５のＥ）によって証明されるように、ＤＯＸ処理細胞におけるα５補充はＲＯＳ産生を中和することができた。図５のＤは、抗ＲＯＳ防護においてα５がＢＣＡＡｅｍより有効であることをさらに示す。これらの結果は一緒に、α５混合物が、ＨＬ‐１心筋細胞におけるＤＯＸへの急性暴露によって誘発されるミトコンドリア損傷を阻止することができるという概念を支持する。特に、これは、細胞生存に対して、関連性のある影響がある可能性がある。ＤＯＸ誘発性のＨＬ‐１細胞の死は実際、α５混合物を一緒に補充した場合に阻止された（図６）。ＨＬ‐１細胞をα５単独に暴露した場合の、細胞生存への明らかな作用はなかった（図６）。

α５組成物によって、ＤＯＸ処理マウスの心臓におけるミトコンドリア機能障害が阻止される。ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果を確認するために、急性のｉｎ ｖｉｖｏ ＤＯＸ処理を説明されるように［６］行った。１０日間行ったα５処理の終了３日前に、２０ｍｇ／ｋｇのＤＯＸの単回腹腔内注射を行った（図２）。表３は、ＤＯＸ処理が、対照群と比較して体重および心臓の重量を著しく減少させたこと、そしてこれはその際立った食欲抑制効果に依存する可能性があることを示す。α５は、単独で、およびＤＯＸとともに補充された場合の両方で、体重、心臓の重量、および食糧摂取量を改変させることはできなかった（表３）。これに反して、対照動物と比較して、ＤＯＸ処理マウスの水分消費量は変わらなかった一方で、α５は、単独で、またはＤＯＸとともに補充された場合のいずれでも、水分摂取量を増大させた。

測定は１群当たり１０匹のマウスで行った。値は平均値±Ｄ．Ｓを表す。＊ｐ＜０．０５対対照（すなわち生理食塩水注射マウス）。

ＤＯＸ処理マウスの左心室におけるミトコンドリア生合成遺伝子のｍＲＮＡレベルは、対照群と比較して低減した（図７のＡ）。α５混合物は、単独で補充された場合にＰＧＣ‐１α、ｃｙｔ ｃ、およびＣＯＸ ＩＶのｍＲＮＡレベルを増大させる以外に、ＤＯＸ誘発性のＰＧＣ‐１α、Ｔｆａｍ、およびｃｙｔ ｃの低減を著しく阻止することができた（図７のＡ）。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の量として測定したミトコンドリア質量および機能、呼吸タンパク質（特にＣＯＸ ＩＶ）、ならびにクエン酸シンターゼ活性は、ＤＯＸ処理において、生理食塩水処理マウスにおけるよりも低かった。これらの低減は、マウスにα５を補充した場合に阻止された（図７のＢ～Ｄ）。さらに、多様な処理群の左心室から単離されたミトコンドリアにおいて、クラーク電極を用いて酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定することによって、ミトコンドリア呼吸機能を調査した。図７のＥは、ＤＯＸ注射がＯＣＲを減少させる一方で、α５補充は、ＤＯＸ処理マウスのミトコンドリア呼吸を十分に保護したことを示す。アミノ酸混合物は、単独で補充された場合にもＯＣＲを増大させた（図７のＥ）。最後に、図７のＦに報告される結果により、ｅｘ ｖｉｖｏサンプルにおいて、ＤＯＸは、ＳＯＤ１、ＳＯＤ２、カタラーゼ、およびＧＰＸ１などのＲＯＳ防御酵素の発現を増強し、一方でα５補充はこの作用をほぼ完全にブロックすることが確認された。α５単独で処理したマウスにおいては変化は見られなかった（図７のＦ）。集合的にこれらの発見は、α５補充により、少なくとも部分的にミトコンドリア生合成および機能を促進することによって、ならびに酸化ストレスを低減することによって、心臓におけるＤＯＸ誘発性ミトコンドリア毒性が予防されることを示唆する。

種々のシグナル伝達経路は、α５補充の防護効果に関係がある
ＤＯＸおよびα５で処理したマウスの左心室におけるシグナル伝達経路を分析した。図８のＡおよびＢは、ＤＯＸ注射によりｅＮＯＳ発現は減少したが、ｅＮＯＳ活性［すなわち、総ｅＮＯＳに対する（Ｓｅｒ１１７７）ホスホ‐ｅＮＯＳの比］は部分的にのみ減少したことを示す。特に、α５補充はこれらの作用を十分に中和した。α５組成物は、単独で補充した場合、ｅＮＯＳ発現を増大することができた（図８のＡ）。そして次にｅＮＯＳ依存性一酸化窒素（ＮＯ）産生はｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）シグナル伝達経路を調節することが公知であること、およびｍＴＯＲＣ１活性が種々の細胞型における（Ｓｅｒ１１７７）‐ｅＮＯＳのリン酸化に必要十分であることから、ｍＴＯＲＣ１活性化の下流マーカとしてのＳ６のリン酸化を測定した。ＤＯＸ処理は、生理食塩水注射と比較して、左心室における総Ｓ６に対する（Ｓｅｒ２３５／２３６）ホスホ‐Ｓ６の比を減少させ、一方でα５補充は少なくとも部分的にこの作用を阻止した（図８のＣ）。α５混合物に関して、単独で補充した場合、大幅な変化は観察されなかった。多様な生理学的刺激は、部位特異的ｍＴＯＲリン酸化によって、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達を調整する。本明細書において開示されるデータにより、ＤＯＸおよびα５の働きにおけるＳｅｒ２４８１ ｍＴＯＲリン酸化に関する機能的役割が明らかにされ、当該機能的役割において、ＤＯＸは心臓における選択的ｍＴＯＲリン酸化を低減させ、α５はこの低減を救済する（図８のＤ）。ｍＴＯＲリン酸化は、α５を単独で加えた場合にも増大した。結果は一緒に、ｅＮＯＳおよびｍＴＯＲＣ１の両方は、ＤＯＸおよびα５処理の作用において役割を果たし得ることを示唆した。

この仮説を強調して、細胞内ロイシン濃度が低い場合、高いＳｅｓｔｒｉｎ２レベルがｍＴＯＲＣ１活性を阻害するために、近年、Ｓｅｓｔｒｉｎ２は、ｍＴＯＲＣ１経路に関するロイシンセンサとして提示されている。逆に、低いＳｅｓｔｒｉｎ２レベル、または高い細胞内ロイシン濃度（Ｓｅｓｔｒｉｎ２をｍＴＯＲＣ１阻害因子ＧＡＴＯＲ２から移動させる）のいずれかにより、ｍＴＯＲＣ１活性化は促進される。α５組成物はロイシンを高量で含有することから、Ｓｅｓｔｒｉｎ２発現を測定した。ＤＯＸ処理は、左心室におけるＳｅｓｔｒｉｎ２のｍＲＮＡを際立って増大させた（図８のＥ）。特に、α５は、このＤＯＸ誘発性作用を十分に阻止したが、単独で補充された場合、Ｓｅｓｔｒｉｎ２発現を変化させることはできなかった（図８のＥ）。

同様に、クルッペル様因子１５（ＫＬＦ１５）は、近年、特に心臓において、極めて重要なアミノ酸代謝、特にＢＣＡＡ異化（すなわちアセチルＣｏＡおよびスクシニルＣｏＡである２つのＴＣＡ中間体の産生を伴うＢＣＡＡ酸化）の転写調節因子として、ならびに内皮細胞におけるｅＮＯＳ発現の誘発因子として、登場してきた。したがって、種々の処理群の左心室におけるＫＬＦ１５発現を分析した。Ｋｌｆ１５のｍＲＮＡレベルは、ＤＯＸ処理によって著しく低減され、この低減はα５補充によって十分に阻止された（図８のＦ）。α５が単独で補充された場合、大幅な変化は観察されなかった（図８のＦ）。Ｋｌｆ１５‐ヌルマウスおよび心不全において、心臓組織における、分岐鎖α‐ケト酸脱水素酵素（ＢＣＫＤＨ）複合体などのミトコンドリアＢＣＡＡ異化酵素の発現または活性が低減されることから、ＢＣＫＤＨタンパク質転写産物、それに加えてＤＯＸ処理動物におけるＢＣＫＤＨリン酸化を調査した。実際に、リン酸化された場合、ＢＣＫＤＨは不活性であり、一方で、その逆に脱リン酸化された場合、それは活性である。特に、（Ｓｅｒ２９３）‐ＢＣＫＤＨリン酸化は、生理食塩水処理マウスと比較して、ＤＯＸ処理において変わらなかった一方で、α５補充は、ＤＯＸの存在下それを際立って低減し、単独で補充した場合も阻害傾向の作用を有した（図８のＧ）。結果は一緒に、α５補充による、心臓組織におけるミトコンドリアホメオスタシスのｉｎ ｖｉｖｏ防護は、ＢＣＡＡ異化を必然的に伴うＫＬＦ１５／ｅＮＯＳ／ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達軸に関連している可能性があることを示唆した。

ＤＯＸおよびα５に暴露されたＨＬ‐１細胞におけるミトコンドリアホメオスタシスへのＫＬＦ１５、ｅＮＯＳ、およびｍＴＯＲＣ１の影響も評価した。第１に、ｅＮＯＳ遺伝子発現は、１μＭのＤＯＸ暴露によってわずかにのみ減少し、（Ｓｅｒ１１７７）‐ｅＮＯＳリン酸化は際立って低減した（図９のＡおよびＢ）。α５（１％ｗ／ｖ）は、両方のＤＯＸ阻害作用を十分に拮抗させ、単独で補充された場合も、ｅＮＯＳ発現を非常に大きく上方調節した（図９のＡおよびＢ）。第２に、（Ｓｅｒ２３５／２３６）‐Ｓ６リン酸化は、ＤＯＸによって際立って減少し、この低減は、α５によって十分に拮抗された（図９のＣ）。逆に、アミノ酸混合物は単独で加えられた場合、効果的ではなかった。ｍＴＯＲＣ１制御因子としてのその役割に従って、Ｓｅｓｔｒｉｎ２発現はＤＯＸによって際立って増大し、この増大は、α５補充によって十分に拮抗された（図９のＤ）。アミノ酸組成物は単独で加えられた場合、効果的ではなかった。第３に、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）としても公知であるＡｋｔの調整的な役割に基づいて、ｅＮＯＳおよびｍＴＯＲＣ１活性化の両方に関して、ＤＯＸおよびα５で処理したＨＬ‐１細胞における（Ｓｅｒ ４７３）‐Ａｋｔリン酸化も検討した。ＤＯＸは、Ａｋｔリン酸化を際立って低減し、一方でα５はこの作用を阻止した（図５のＥ）。近年、Ａｋｔ／ＰＫＢシグナル伝達経路はＫＬＦ１５発現に対するＢＣＡＡの作用を媒介することが見出されたため、ＤＯＸ媒介性ミトコンドリア損傷に対するα５補充の防護的な影響におけるこの転写調節因子の役割を調査した。特に、ＨＬ‐１細胞がＤＯＸに暴露された場合、ＫＬＦ１５発現はｍＲＮＡおよびタンパク質レベル両方で低減され、α５はこの作用を十分に拮抗した（図９のＦ）。α５単独に暴露したＨＬ‐１心筋細胞において、ほんのわずかな統計的に有意ではないＫＬＦ１５発現の増大が見られた（図９のＦ）。

次いで、特異的Ｋｌｆ１５ ｓｉＲＮＡまたは非標的ｓｉＲＮＡのいずれかをＨＬ‐１細胞にトランスフェクションした。ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方において、サイレンシング効率を測定した（図１０）。ＤＯＸ暴露により、Ｋｌｆ１５のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした、または他については未処理細胞におけるＰＧＣ‐１αおよびＣＯＸ ＩＶタンパク質の両方が著しく減少した（図９のＧ）。逆に、Ｋｌｆ１５ノックダウンは、それ自体でＰＧＣ１‐αおよびＣＯＸ ＩＶレベルを際立って低減し、α５補充がＤＯＸとともに投与された場合にタンパク質レベルを救済する能力を無効とした（図９のＧ）。さらに、Ｋｌｆ１５ノックダウンにより、α５を単独で加えた場合、ＰＧＣ１‐αおよびＣＯＸ ＩＶ発現を促進するα５の能力が際立って低減した（図９のＧ）。注目すべきことに、Ｋｌｆ１５ノックダウンにより、ＤＯＸが低減した（Ｓｅｒ２３５／２３６）‐Ｓ６リン酸化を回復するα５の能力が非常に大きく損なわれた（図９のＨ）。最後に、（Ｓｅｒ２９３）‐ＢＣＫＤＨリン酸化は、ＤＯＸ処理と未処理の対照ＨＬ‐１心筋細胞との間で違いがなかった一方で、細胞をα５に暴露させた場合、ＤＯＸの有無にかかわらずｐ‐ＢＣＫＤＨは十分に消失した（図９のＨ）。Ｋｌｆ１５ノックダウンは、（Ｓｅｒ２９３）‐ＢＣＫＤＨリン酸化に対するα５の阻害作用を、ＤＯＸ処理および未処理細胞の両方において部分的に阻止した一方で、ＤＯＸは、単独で加えた場合、リン酸化を変化させることができなかった（図９のＨ）。同様に、特異的なｓｉＲＮＡを用いたｅＮＯＳおよびｍＴＯＲＣ１の足場タンパク質のうちの１つであるＲａｐｔｏｒ（ｍＴＯＲ調節関連タンパク質）のサイレンシングは、それ自体でＰＧＣ１‐αおよびＣＯＸ ＩＶレベルを低減させ、α５補充が、ＤＯＸとともに投与された場合に低減したタンパク質レベルを救済する能力を無効にした（図１１のＡおよびＢ）。ｅＮＯＳおよびＲａｐｔｏｒノックダウンの両方は、α５を単独で加えた場合、ＰＧＣ１‐αおよびＣＯＸ ＩＶの発現を変化させなかった（図１１のＡおよびＢ）。ＲＴ‐ＰＣＲおよびウエスタンブロットによって特異的なサイレンシングの効率を評価した。ｅＮＯＳおよびＲａｐｔｏｒ ｓｉＲＮＡを用いて、それぞれ、ほぼ７０％のｅＮＯＳおよび６０％のｍＴＯＲＣ１の下方調節を得た（図１０のＢおよびＣ）。全体として、これらの発見により、心筋細胞におけるＤＯＸ媒介性ミトコンドリア機能障害に対するα５混合物の防護効果は、ＫＬＦ１５／ｅＮＯＳ／ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達軸およびＢＣＡＡ異化に関連する可能性があることが示唆される。

ＤＯＸの抗増殖効果は、α５組成物の存在下、ＭＣＦ７乳癌細胞において変わらないままであった。２つの異なるアッセイを用いて評価したところ、α５組成物へのＭＣＦ７乳癌細胞株の暴露は、ＭＣＦ７細胞増殖を促進しなかった（図１３のＡおよび図１３のＢ）。同様に、ＭＣＦ７細胞におけるＤＯＸの抗増殖効果は、アミノ酸の存在によって全く影響を受けなかった（図１３のＡおよび図１３のＢ）。非常に興味深いことに、ＤＯＸの作用は、α５組成物と一緒に投与された場合に強力になる。

上述のセクションにおいて開示されるように、アントラサイクリンＤＯＸ（商品名Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）は非常に有効であり、１９６０年代に導入されてから頻繁に使用される抗腫瘍薬ではあるが、重度の心不全にいたるおそれがある用量関連の心毒性を引き起こしている。心臓がＤＯＸによって損傷を受けている場合、治療法の選択肢はほとんどない。典型的に、ＤＯＸ誘発性心筋症および心不全は伝統的療法に対して難治性である［１］。患者特異的ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞の分析などの、ＤＯＸ心毒性によって影響を受けることになる患者を予測するための、ならびにこのリスクを適切に阻止するための、鉄キレート剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、β‐ブロッカ、抗酸化剤などの薬剤、および天然物または栄養補助食品を包含する、いっそうの努力が結論が出ないまま提示されている。ここで、培養ＨＬ‐１心筋細胞におけるＤＯＸ誘発性ミトコンドリア損傷を阻止することにおけるα５組成物の、およびＢＣＡＡｅｍ組成物の効率が試験された。α５は、統計的にＢＣＡＡｅｍより効率的に、ミトコンドリア生合成マーカのＤＯＸ誘発性の欠損を中和した。α５の栄養素補充により、ＫＬＦ１５／Ａｋｔ／ｅＮＯＳ／ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達軸は活性化する（図１２）。これらの結果はまた、正常な心臓発達に、および特にストレス条件に適応するための生後の心臓の構造および機能の維持に、不可欠であると思われるシグナル伝達経路であるｍＴＯＲＣ２の役割を排除しない。しかしながら、ＤＯＸ心毒性において、ｍＴＯＲＣ２はここまで示されてこなかった。さらに、ＫＬＦ１５およびＳｅｓｔｒｉｎ２に関する本発明の発見は同様に、この実験モデルにおけるｍＴＯＲＣ２シグナル伝達の関連性に関して疑義を生じさせる。本願に示される最も関連性のある発見のうちの１つは、ＨＬ‐１心筋細胞におけるＫＬＦ１５サイレンシングによって誘発される、ミトコンドリア生合成マーカであるＰＧＣ‐１αおよびＣＯＸ‐ＩＶタンパク質の非常に大きい下方調節である。Ｃｙｓ２／Ｈｉｓ２ジンクフィンガ転写調節因子のクルッペル様因子（ＫＬＦ）ファミリは、心筋細胞ならびにミトコンドリア構造および機能の多くの様相を制御する。重要なことに、ＫＬＦ１５は、Ｗｎｔ／β‐カテニン転写を調節し、生後の心臓において心臓前駆細胞の運命を制御し、心臓発達における役割が示唆される。

本願は、Ｋｌｆ１５、ｅＮＯＳ、およびＲａｐｔｏｒがサンレンシングされた心筋細胞は、α５に対し無応答であったことを示し、α５は、それ自体でミトコンドリア生合成を促進することも、ＤＯＸとともに補充された場合にミトコンドリア損傷を防護することもできなかった。さらに、ＤＯＸで７２時間処理した後、Ｋｌｆ１５遺伝子発現は心臓組織において低減した。

α５補充は、１）ミトコンドリア生合成、２）抗ＲＯＳ防御システム、および３）ＢＣＡＡ酸化を、ＴＣＡ中間体の産生の可能性を伴って、見たところｍＴＯＲＣ１依存的に、促進することによって、急性ＤＯＸによって誘発されたミトコンドリア機能障害を阻止する（図１２）。

Ｋｌｆ１５ノックダウンは実際、ＨＬ‐１細胞におけるｍＴＯＲＣ１活性を際立って低減し、ＤＯＸで弱まったＳ６リン酸化を回復するα５混合物の能力を損なった。同様に、Ｋｌｆ１５サイレンシングにより、ＤＯＸ処理および未処理心筋細胞の両方において、ＢＣＫＤＨリン酸化として測定されたα５誘発性のＢＣＡＡ異化活性化が部分的に阻止された。これにより、心臓細胞において、α５の防護効果は、少なくとも部分的に、ＫＬＦ１５発現に、したがってＢＣＡＡ酸化に依存するｍＴＯＲＣ１活性化によって、媒介されることが示唆される。さらに、心臓細胞および組織において、α５は、ＤＯＸ処理後に高く発現されるＳｅｓｔｒｉｎ２を対照レベルに回復した。Ｓｅｓｔｒｉｎは、ストレス誘導性タンパク質（Ｓｅｓｔｒｉｎ１～３）のファミリであり、様々な証拠により、Ｓｅｓｔｒｉｎ２が、ｍＴＯＲＣ１経路のためのロイシンセンサであることが示される。通常ＧＡＴＯＲ２に結合されており、したがってストレスのない条件下で抑制されているＳｅｓｔｒｉｎ２は、細胞内マイクロモル濃度でロイシンが存在する場合、ＧＡＴＯＲ２から移動され、ｍＴＯＲＣ１を活性化する。α５組成物は、ＤＯＸ処理および未処理両方の心臓細胞および組織において、ｅＮＯＳ発現および活性を促進した。おそらく、これらの作用は（Ｓｅｒ４７３）‐Ａｋｔリン酸化によって媒介された。

興味深いことに、がん患者の栄養サポートにおけるアミノ酸ベース組成物の役割は、これまでは、明確に定義されるべきものであったが、本願は、２つの異なるアッセイを用いて評価したところ、α５組成物へのＭＣＦ７乳癌細胞株の暴露は、ＭＣＦ７細胞増殖を促進しなかったことを示す（図１３のＡおよび図１３のＢ）。同様に、ＭＣＦ７細胞におけるＤＯＸの抗増殖効果は、アミノ酸の存在によって全く影響を受けなかった（図１３のＡおよび図１３のＢ）。非常に興味深いことに、α５組成物が投与された場合、増殖速度は低減される。

全体として、本明細書において報告される結果により、１）心臓組織および心筋細胞の両方において、ＤＯＸ急性処理によりミトコンドリア機能障害が誘発されること、２）α５組成物はこの損傷を際立って阻止すること、３）ｅＮＯＳおよびｍＴＯＲＣ１シグナル伝達経路はこの防護物の働きに決定的に関与していること、４）心臓発達および日周調節において特に重要である特異的転写因子であるＫＬＦ１５は、これらのシグナル伝達軸の制御において関連性のある役割を果たすこと、５）ＭＣＦ７細胞におけるＤＯＸの抗増殖効果はアミノ酸の存在によって全く影響を受けなかったことが示された。

これらの発見は、化学療法を受ける被験者において、たとえばドキソルビシンなどの化学療法剤によって誘発される心毒性の阻止および治療におけるα５組成物の有効性を強調する。

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６．Ａｂｄｕｌｌａｈ，Ｃ．Ｓ．；Ａｌａｍ，Ｓ．；Ａｉｓｈｗａｒｙａ，Ｒ．；Ｍｉｒｉｙａｌａ，Ｓ．；Ｂｈｕｉｙａｎ，Ｍ．Ａ．Ｎ．；Ｐａｎｃｈａｔｃｈａｒａｍ，Ｍ．；Ｐａｔｔｉｌｌｏ，Ｃ．Ｂ．；Ｏｒｒ，Ａ．Ｗ．；Ｓａｄｏｓｈｉｍａ，Ｊ．；Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１９，９，２００２．
７．Ｔｅｄｅｓｃｏ，Ｌ．；Ｖａｌｅｒｉｏ，Ａ．；Ｃｅｒｖｉｎｏ，Ｃ．；Ｃａｒｄｉｌｅ，Ａ．；Ｐａｇａｎｏ，Ｃ．；Ｖｅｔｔｏｒ，Ｒ．；Ｐａｓｑｕａｌｉ，Ｒ．；Ｃａｒｒｕｂａ，Ｍ．Ｏ．；Ｍａｒｓｉｃａｎｏ，Ｇ．；Ｌｕｔｚ，Ｂ．；ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ｔｙｐｅ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００８，５７，２０２８－３６．
８．Ｆｒｏｎｔｉｎｉ，Ａ．；Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｉ，Ｐ．；Ｔｏｎｅｌｌｏ，Ｃ．；Ｖａｌｅｒｉｏ，Ａ．；Ｎｉｓｏｌｉ，Ｅ．；Ｃｉｎｔｉ，Ｓ．；Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ａ．Ｌｅｐｔｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＳＴＡＴ３ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｍｏｕｓｅ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２００８，１２１５，１０５－１１５．
９．Ｄ'Ａｎｔｏｎａ，Ｇ．；Ｒａｇｎｉ，Ｍ．；Ｃａｒｄｉｌｅ，Ａ．；Ｔｅｄｅｓｃｏ，Ｌ．；Ｄｏｓｓｅｎａ，Ｍ．；Ｂｒｕｔｔｉｎｉ，Ｆ．；Ｃａｌｉａｒｏ，Ｆ．；Ｃｏｒｓｅｔｔｉ，Ｇ．；Ｂｏｔｔｉｎｅｌｌｉ，Ｒ．；Ｃａｒｒｕｂａ，Ｍ．Ｏ．；ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｎｃｈｅｄ－Ｃｈａｉｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ Ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍｉｄｄｌｅ－Ａｇｅｄ Ｍｉｃｅ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１０，１２，３６２－３７２．
１０．Ｆｌａｍｍｅｎｔ，Ｍ．；Ｇｕｅｇｕｅｎ，Ｎ．；Ｗｅｔｔｅｒｗａｌｄ，Ｃ．；Ｓｉｍａｒｄ，Ｇ．；Ｍａｌｔｈｉｅｒｙ，Ｙ．；Ｄｕｃｌｕｚｅａｕ，Ｐ．－Ｈ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ＣＢ１ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ ｏｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ ｆｅｄ ａ ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２００９，２９７，Ｅ１１６２－７０．
１１．Ｓｐａｒｋｓ，Ｌ．Ｍ．；Ｘｉｅ，Ｈ．；Ｋｏｚａ，Ｒ．Ａ．；Ｍｙｎａｔｔ，Ｒ．；Ｈｕｌｖｅｒ，Ｍ．Ｗ．；Ｂｒａｙ，Ｇ．Ａ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｒ．Ａ ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｇｅｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２００５，５４，１９２６－３３．
１２．Ｌｏｐｅｚ－Ｌｌｕｃｈ，Ｇ．；Ｈｕｎｔ，Ｎ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｂ．；Ｚｈｕ，Ｍ．；Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ｈ．；Ｈｉｌｍｅｒ，Ｓ．；Ｃａｓｃａｊｏ，Ｍ．Ｖ．；Ａｌｌａｒｄ，Ｊ．；Ｉｎｇｒａｍ，Ｄ．Ｋ．；Ｎａｖａｓ，Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｃａｌｏｒｉｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００６，１０３，１７６８－１７７３．
１３．Ｔｅｄｅｓｃｏ，Ｌ．；Ｃｏｒｓｅｔｔｉ，Ｇ．；Ｒｕｏｃｃｏ，Ｃ．；Ｒａｇｎｉ，Ｍ．；Ｒｏｓｓｉ，Ｆ．；Ｃａｒｒｕｂａ，Ｍ．Ｏ．；Ｖａｌｅｒｉｏ，Ａ．；Ｎｉｓｏｌｉ，Ｅ．Ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｆｏｒｍｕｌａ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１８，３１４，Ｇ５６６－Ｇ５８２．
１４．Ｎｉｓｏｌｉ，Ｅ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｓ：Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０－．）．２００３，２９９，８９６－８９９．
１５．Ｖａｌｅｒｉｏ，Ａ．；Ｃａｒｄｉｌｅ，Ａ．；Ｃｏｚｚｉ，Ｖ．；Ｂｒａｃａｌｅ，Ｒ．；Ｔｅｄｅｓｃｏ，Ｌ．；Ｐｉｓｃｏｎｔｉ，Ａ．；Ｐａｌｏｍｂａ，Ｌ．；Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｏ．；Ｃｌｅｍｅｎｔｉ，Ｅ．；Ｍｏｎｃａｄａ，Ｓ．；ｅｔ ａｌ．ＴＮＦ－ａｌｐｈａ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅＮＯＳ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｆａｔ ａｎｄ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ｏｂｅｓｅ ｒｏｄｅｎｔｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００６，１１６，２７９１－８．
１６．Ｌｉｏｎｅｔｔｉ，Ｌ．；Ｍｏｌｌｉｃａ，Ｍ．Ｐ．；Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏ，Ｒ．；Ｄ'Ａｎｄｒｅａ，Ｅ．；Ｆｅｒｒａｒｏ，Ｍ．；Ｂｉａｎｃｏ，Ｆ．；Ｌｉｖｅｒｉｎｉ，Ｇ．；Ｉｏｓｓａ，Ｓ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓｕｂｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｆｅｄ ｒａｔｓ ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．２００７，３１，１５９６－１６０４．
１７．Ｐｅｒｖｉｎ，Ｓ．；Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．；Ｗｕ，Ｇ．；Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｇ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ／ｅＩＦ４Ｅ ｐａｔｈｗａｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７，６７，２８９－９９．

Claims (15)

1. 化学療法を受ける被験者において、少なくとも１種の化学療法剤によって誘発される心毒性の予防、および／または治療における使用のための組成物であって、前記組成物は、活性剤を備え、前記活性剤は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リジンのアミノ酸、およびクエン酸、コハク酸、リンゴ酸を含有する、使用のための組成物。
2. 前記化学療法剤は、アントラサイクリン、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２阻害剤、チロシン‐キナーゼ阻害剤、血管内皮増殖因子阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤からなる群において選択され、前記アントラサイクリンは好ましくは、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピクサントロン、サバルビシン、バルルビシン、それらの誘導体からなる群において選択される、請求項１に記載の使用のための組成物。
3. クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の合計と、ロイシン、イソロイシン、バリンの分岐鎖アミノ酸にリジンおよびトレオニンを加えた合計との重量比は、０．０５～０．３の間、好ましくは０．１～０．２５の間で含まれる、請求項１または２に記載の使用のための組成物。
4. クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の全量と、ロイシン、イソロイシン、バリンの分岐鎖アミノ酸の全量との重量比は、０．１～０．４の間、好ましくは０．１５～０．３５の間で含まれる、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
5. クエン酸と、リンゴ酸およびコハク酸の合計との重量比は、１．０～４．０の間、好ましくは１．５～２．５の間で含まれる、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
6. クエン酸：リンゴ酸：コハク酸の重量比は、１０：１：１～２：１．５：１．５の間、好ましくは７：１：１～１．５：１：１の間、より好ましくは５：１：１～３：１：１の間で含まれる、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
7. 前記活性剤は、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、システインからなる群において選択される少なくとも１種のアミノ酸をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
8. 前記活性剤は、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、および任意選択でチロシンをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
9. クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の全モル量と、メチオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、およびトリプトファンの全モル量との比は、１．３５より高い、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
10. クエン酸、コハク酸、リンゴ酸の３つの酸の全モル量と、リジンおよびトレオニン全モル量との比は、０．１０～０．７０の間、好ましくは０．１５～０．５５の間で含まれる、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
11. クエン酸の重量またはモル量は、リンゴ酸およびコハク酸の両方の全重量またはモル量より多い、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
12. ロイシンとクエン酸との重量比は、５～１の間、好ましくは２．５０～３．５０の間で含まれる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
13. アルギニンを含まない、請求項１から１２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
14. セリン、プロリン、アラニンを含まない、請求項１から１３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
15. がんに罹患した被験者において、少なくとも１種の化学療法剤によって誘発される心毒性を予防する、かつ／または治療することにおいて、同時に、別々に、または逐次的に使用するための、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物と、少なくとも１種の前記化学療法剤とを備える、組み合わせ製剤。

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