TW202102542A - 用於治療癌症的聯合療法 - Google Patents

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瑪麗 伊芙 博利厄
西維婭 卡薩庫伯塔·塞拉
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瓦爾希伯倫私人腫瘤研究基金會
卡塔蘭研究和高級研究院
西班牙商佩普托米克公司
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Abstract

本發明涉及腫瘤免疫劑與Omomyc、其功能等效變體、包含Omomyc或所述功能等效變體的綴合物、編碼所述多肽的多核苷酸、包含所述多核苷酸的載體、以及能夠分泌該多肽或綴合物的細胞的組合。本發明還涉及包含本發明的組合的藥物組合物及其醫藥用途，特別是其在治療癌症中的用途。

Description

用於治療癌症的聯合療法
本發明涉及癌症領域，更具體地，涉及包含多肽和腫瘤免疫劑的組合及其醫藥用途，更特別地在預防和/或治療癌症中的用途。
理想的癌症藥物應靶向持續地維持腫瘤所需的非冗餘功能，但對於任何正常組織的維持和功能都是非必要的。因此，最常見的邏輯是靶向在癌症中特異性突變的基因產物，其依據是這些突變分子可能是癌症的“驅動因子”，並且可能對正常組織而言不那麼重要。由於這些原因，很多注意力都集中在對特定癌症類型中的復發性病變進行分類上。不幸的是，這種方法存在一些問題。首先，大多數人實體癌經歷了基因組不穩定性事件，並表現出突變雜訊，這種雜訊可以掩蓋“驅動因子”突變及其伴隨的效應子途徑。其次，癌症是涉及通過多個進化瓶頸的轉變的過程的最終結果。每個瓶頸會需要特定類型的突變，此後其功能對於維持腫瘤是非必要的，因此，在腫瘤進化的那一點之後就不再是良好的治療靶標。
Myc是一種參與生長控制和癌症的基本螺旋-環-螺旋亮氨酸拉鍊（b-HLH-LZ）蛋白，其在結構相關蛋白Max、Mad和Mnt的網路中起作用。Myc/Max二聚體啟動基因轉錄並誘導細胞增殖或凋亡。Mad/Max和Mnt/Max複合物充當阻遏物，引起細胞生長停滯和分化。所有二聚體都識別相同的DNA共有位點，即CACGTG E-盒。
Myc在正常細胞中受到嚴格調節，在增殖細胞中Myc的水準較高，而在非增殖細胞中則較低。異常高和/或失調的Myc活性與大多數癌症有因果關係，並且通常與侵襲性的、低分化的和血管生成性腫瘤有關。Myc表達的失調歸因於通過基因擴增的過表達、轉錄控制的喪失、降解受損或穩定性增加。這導致異常的增殖、增加的存活率、新陳代謝的改變、血管生成和炎症，所有這些代表了癌症的主要特徵。多項研究證實了Myc在調控腫瘤發生的細胞內和細胞外方面的關鍵作用，這表明靶向Myc的功能具有治療價值。
已知BET溴結構域抑制劑對Myc的下調導致多種腫瘤類型的消退。儘管這種方法顯示出良好的潛力，但它存在一些局限性，例如毒性和大量脫靶效應。許多破壞Myc/Max相互作用的小分子在細胞中顯示出低特異性。
然而，Myc抑制劑尚未進入臨床應用，其設計提出了各種警告：首先，Myc是一種核轉錄因子，因此比膜或細胞質分子更難達到；其次，Myc沒有能夠被靶向的酶促“活性位點”；第三，Myc家族包括3種不同的蛋白，c-Myc、N-Myc和L-Myc，在某些情況下它們在功能上是冗餘的，因此所有這些蛋白都需要同時被抑制。此外，人們擔心對Myc的抑制會通過抑制正常組織的增殖而引起嚴重的副作用。由於所有這些原因，製造Myc抑制劑藥物是具有挑戰性的。
Omomyc是顯性陰性MYC突變體，包含Myc的b-HLH-LZ結構域，並在Myc的亮氨酸拉鍊中具有四個氨基酸置換（Soucek, L.等人1998, Oncogene 17, 2463-2472; Soucek, L. 等人(2002), Cancer Res 62: 3507-3510）。氨基酸置換E61T、E68I、R74Q和R75N賦予該蛋白質改變的二聚體特異性，保留了結合其天然配偶體Max並與自身形成同源二聚體的能力以及與野生型c-Myc、N-Myc和L-Myc形成異質二聚體的能力。
由於這些特性，Omomyc通過使Myc結合其DNA識別結合位點（E-盒）的能力無效，可以在體外(in vitro )和體內(in vivo )阻止Myc依賴性基因反式啟動功能。同時，Omomyc以依賴於Myc表達水準的方式強烈地增強Myc誘導的細胞凋亡，從而增強Myc的轉錄抑制活性。Omomyc因此阻止了Myc與啟動子E-盒的結合和靶基因的反式啟動，同時保留了與啟動子的Miz-1依賴性結合和轉錄抑制。在存在Omomyc的情況下，Myc相互作用組被引導用於抑制，並且其活性從致瘤基因轉變為腫瘤抑制基因。
在EP2801370A1中，已證明Omomyc肽本身能夠有效地穿過細胞膜轉導並易位至細胞核，在其中發揮其抑制腫瘤的作用。
然而，在現有技術中仍需要開發新的改進的用於治療癌症的治療方法。
在第一方面，本發明涉及一種組合，其包括： i) 第一組分，其選自由以下構成的群組： a) 包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體， b) 綴合物，包含：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體；以及促進細胞攝取所述多肽或所述其功能等效變體的化學部分， c) 多核苷酸，編碼a）的所述多肽或b）的所述綴合物， d) 載體，包含根據c）的所述多核苷酸，以及 e) 細胞，能夠將根據a）的所述多肽或根據b）的所述綴合物分泌至培養基中； 以及 ii) 第二組分，其是腫瘤免疫劑。
在第二方面，本發明涉及一種藥物組合物，包含藥學有效量的根據本發明的組合和藥學上可接受的賦形劑。
在第三方面，本發明涉及根據本發明的組合或根據本發明的藥物組合物用於藥物之用途。
在第四方面，本發明涉及根據本發明的組合或根據本發明的藥物組合物用於預防和/或治療癌症之用途。
本發明涉及提供用於預防和治療癌症的新的治療組合。
除非另外限定，本文所使用的所有技術術語都具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的含義相同的含義。
針對本發明的一個方面公開的所有實施方案均適用於其他方面。
本發明的組合和藥物組合物
在此以及在本發明的每個其他方面提供的定義同樣適用於整個發明。
本發明的作者已經證明，將Omomyc經鼻內和全身給藥可以將T細胞募集到腫瘤部位（圖1和2）。因此，Omomyc與腫瘤免疫劑的組合可以用於治療癌症。此外，已經發現Omomyc和腫瘤免疫劑的組合在治療癌症中具有協同作用。例如，與載體和僅抗PD-1處理組相比，Omomyc和抗PD-1療法的組合顯著增加了表達PD-1但不表達Tim-3的CD4+ T細胞向腫瘤部位的募集（圖3）。此外，Omomyc和抗PD-1療法的組合與它們的載體對照相比，顯著誘導了通過CD4+ 輔助細胞和CD8+細胞毒性腫瘤內T細胞產生幹擾素-γ （IFN-γ ）（圖4），這一事實在Omomyc或抗PD-1處理組中都沒有觀察到。
因此，在第一方面，本發明涉及一種組合，其包括：
i) 第一組分，選自由以下組成的群組：
a) 包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體，
b) 綴合物，包括：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體；以及和促進細胞攝取所述多肽或所述其功能等效變體的化學部分，以及
c) 多核苷酸，編碼a）的所述多肽或b）的所述綴合物，
d) 載體，包含根據c）的所述多核苷酸，以及
e) 細胞，能夠將根據a）的所述多肽或根據b）的所述綴合物分泌至培養基中；
以及
ii) 第二組分，其是腫瘤免疫劑。
根據本發明，表述“組合”代表化合物（i）和（ii）的各種組合，例如配製為單一制劑的組合物，由每種組分的分開的製劑構成的組合混合物（例如，可以組合作為組合製劑聯合使用的“桶混劑（tank-mix）”），以及以依序方式給藥（即在相當短的時間（例如幾個小時或幾天）內一個接一個地）或以同時給藥的方式的單個活性成分的組合使用。在本發明中，化合物（i）指有效治療量的包含序列SEQ ID NO: 1的多肽或其功能等效變體；或指包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體、以及促進細胞攝取所述多肽或所述其功能等效變體的化學部分的綴合物；或指編碼所述多肽或所述綴合物的多核苷酸；或指包含該多核苷酸的載體；或指能夠將所述多肽或所述綴合物分泌至培養基中的細胞。在本發明中，化合物（ii）是指治療有效量的腫瘤免疫劑。優選地，應用化合物（i）和（ii）的依序對於實施本發明不是必需的。
所述組合可以是組成套組（kit-of-parts），其中每種組分均單獨配製和包裝。
可以配製化合物（i）和（ii）的組合用於其同時、分開或依序給藥。特別地，如果給藥不是同時的，則在彼此接近的時間內給藥化合物。此外，化合物以相同或不同的劑型給藥或通過相同或不同的給藥途徑給藥，例如，一種化合物可以經口服給藥，而另一種化合物可以經靜脈給藥。優選地，化合物（i）經鼻內給藥，並且化合物（ii）經全身給藥，更優選地經腸胃外給藥，甚至更優選地經腹膜內給藥。在另一個實施方案中，化合物（i）經靜脈給藥，並且化合物（ii）經腸胃外給藥，甚至更優選經腹膜內給藥。
可以將兩種化合物（i）和（ii）的組合以如下方式給藥：
作為一個組合，其是同一藥物製劑的組成部分，兩種化合物則總是被同時給藥；
作為兩個單元的組合，每個單元具有引起同時、依序或分開給藥的可能性的物質之一。
在一個具體的實施方案中，本發明的組合的化合物（i）可以獨立於化合物（ii）給藥，但在相同的時間，即以兩個單位給藥。
在另一個具體的實施方案中，首先本發明的組合的化合物（i）被給藥，然後化合物（ii）被給藥，即化合物（ii）被分開或依序給藥。
在又一個具體的實施方案中，首先本發明的組合的化合物（ii）首先被給藥，然後化合物（i）被給藥，即如定義的那樣分開或依序給藥化合物（i）。如果分開給藥，則本發明的組合的化合物（i）和（ii）可以彼此間隔一段時間給藥，例如彼此間隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時內。在另一個實施方案中，本發明的組合的化合物（i）和（ii）可以彼此間隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24天內給藥，優選彼此間隔1天內給藥，更優選彼此間隔10天內給藥。在一個優選的實施方案中，在第一次給藥化合物（i）的10天后給藥化合物（ii）。
在另一方面，本發明涉及一種組合或藥物組合物，其包含協同有效量的根據本發明的第一方面的第一組分和腫瘤免疫劑。
在一個優選的實施方案中，本發明的化合物（i）是包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體。
術語“多肽”和“肽”在本文中可互換使用，是指任何長度的氨基酸的聚合物。本發明的多肽可以包含經修飾的氨基酸，並且可以被非氨基酸中斷。在一個優選的實施方案中，所述多肽僅由氨基酸形成。優選地，形成所述組合的項（i）的多肽的長度為80至500個氨基酸、更優選為80至300個氨基酸、更優選為80至250個氨基酸、更優選為80至150個氨基酸、甚至更優選為80至130個氨基酸、優選為90至130個氨基酸、優選不超過125個氨基酸、更優選不超過100個氨基酸。在一個優選的實施方案中，所述多肽的長度為90至98個氨基酸、優選為90至95個氨基酸、更優選為91個氨基酸。
術語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以類似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。此外，術語“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸（立體異構體）。優選地，氨基酸是L-氨基酸。
術語“天然氨基酸”或“天然存在的氨基酸”包括20個天然存在的氨基酸；通常在體內翻譯後修飾的那些氨基酸，包括例如羥脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；以及其他不常見的氨基酸，包括但不限於2-氨基己二酸、羥賴氨酸、異鎖鏈素、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸。
如本文所用，術語“非天然氨基酸”或“合成氨基酸”是指在位置“a”被胺基取代並且在結構上與天然氨基酸相關的羧酸或其衍生物。修飾的或不常見的氨基酸的示例性非限制性實例包括：2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、鎖鏈素（desmosine）、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬醯胺、羥基賴氨酸、別羥基賴氨酸（alio hydroxy lysine）、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、別異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、6-N-甲基賴氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸等。
本發明的多肽還可以包含非氨基酸部分，例如與肽連接的疏水性部分（各種直鏈、帶支鏈的、環狀、多環或雜環的烴和烴衍生物）；連接至化合物末端以減少降解的各種保護性基團。合適的保護性官能團在Green和Wuts的“Protecting Groups in Organic Synthesis”，John Wiley and Sons，1991，第5章和第7章中有描述。
可以包括多肽中存在的化學（非氨基酸）基團，以改善各種生理學特性，例如降低降解或清除，減少各種細胞泵的排斥，改善各種給藥方式，增加特異性，提高親和力，增加穩定性、生物利用度、溶解度，降低毒性等。
“模擬物”包括模擬肽結構的化學結構並保留肽結構的功能特性的分子。設計肽類似物、衍生物和模擬物的方法是本領域已知的。
在一個實施方案中，本發明的多肽是由序列SEQ ID NO：1組成的多肽或由SEQ ID NO：1的功能等效變體組成的多肽，優選地是由序列SEQ ID NO：1組成的多肽。SEQ ID NO: 1對應於 TEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSCA (SEQ ID NO: 1)。
序列SEQ ID NO：1的多肽對應於Omomyc蛋白序列。如本文所用，術語“Omomyc”是指由帶有E61T、E68I、R74Q和R75N突變的Myc的bHLHZip結構域的突變版本組成的多肽（其中，突變位置的編號相對於與NCBI資料庫中的登記號NP_002458所定義的多肽(2015年3月15日發佈)的氨基酸365-454相對應的Myc區的序列）。下麵顯示了NCBI資料庫中登記號NP_002458提供的c-Myc序列（SEQ ID NO：2），其中用下劃線表示Omomyc衍生的區域：
Figure 02_image001
Omomyc還包含c-Myc的M2結構域，所述M2結構域具有序列RQRRNELKRSF（SEQ ID NO：3）（參見Dang and Lee, Mol.Cell. Biol., 1988, 8:4048-4054）（以上雙下劃線部分），並對應於核定位信號。
Omomyc的特徵在於，它對所有三種致瘤的Myc蛋白（c-Myc、N-Myc和L-Myc）顯示出增強的二聚化能力。Omomyc可以衍生自本領域已知的任何Myc蛋白的bHLHZip結構域，條件是保留導致腫瘤抑制子作用的突變。因此，可以用於本發明的Omomyc可以衍生自任何哺乳動物，包括但不限於家畜和農場動物（牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒動物）、靈長類動物和人類。優選地，Omomyc蛋白衍生自人Myc蛋白（登記號NP_002458，2019年3月12日發佈）。
如本文所用，術語“Myc”是指轉錄因子家族，其包括c-Myc、N-Myc和L-Myc。Myc蛋白通過結合共有序列CACGTG（增強子盒序列或E-盒和募集組蛋白乙醯轉移酶或HAT）來啟動許多基因的表達。但是，Myc也可以充當轉錄阻遏物。通過結合Miz-1轉錄因子並置換p300輔助活化劑，它可以抑制Miz-1靶基因的表達。Myc還在控制DNA複製中起直接作用。
Myc b-HLH-LZ或Myc基本區域螺旋-環-螺旋亮氨酸拉鍊結構域是指確定Myc與Max蛋白二聚化和與Myc靶基因結合的區域。該區域對應於人Myc的第365-454位氨基酸，其特徵是通過環連接的兩個α螺旋（Nair，S. K.，＆Burley，S. K.，2003，Cell，112：193-205）。
在優選的實施方案中，本發明的多肽是包含如下所示的SEQ ID NO: 4、由如下所示的SEQ ID NO: 4組成、或基本上由如下所示的SEQ ID NO: 4組成的多肽： MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSCA (SEQ ID NO: 4)
在本文中，“基本上由……組成”是指指定分子將不包含任何將改變SEQ ID NO：4活性的其他序列。
優選地，多肽由SEQ ID NO：4組成。
術語“功能等效變體”是指相對於SEQ ID NO：1的多肽由一個或多個氨基酸的插入或添加和/或由一個或多個氨基酸的缺失和/或由一個或多個氨基酸的保守置換而得到的任何多肽，和/或指由對SEQ ID NO：1的多肽的化學修飾得到的並且其基本上保留了SEQ ID NO：1的腫瘤抑制活性的任何多肽。優選地，功能等效變體是指相對於SEQ ID NO：1的多肽由一個或多個氨基酸的插入或添加和/或由一個或多個氨基酸的缺失和/或由一個或多個氨基酸的保守置換而產生的並且基本上保留了SEQ ID NO：1的腫瘤抑制活性的任何多肽；更優選地是相對於SEQ ID NO：1的多肽由一個或多個氨基酸的插入或添加而產生的任何多肽。
技術人員將理解，腫瘤抑制活性的保留要求變體可以與Myc和/或其專屬配偶體p21/p22Max二聚並抑制Myc活性，其能夠跨細胞膜易位並且能夠易位穿過核被膜。在一些實施方案中，與Omomyc相比，本發明的多肽的功能等效變體較少同源二聚化，或不通過形成二硫橋而被迫形成同源二聚體。特別地，本發明多肽的某些實施方案的同源二聚體形式中的二硫橋形成少於多肽OmoMyc中。
如本文所用，“較少的同源二聚化”涉及甚至在還原條件下形成本發明的多肽的專屬同源二聚體的能力較低。在一個優選的實施方案中，該能力比形成Omomyc的同源二聚體的能力低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％。
如本文所用，還原條件涉及還原劑的存在，還原劑是在氧化還原化學反應中向另一化學物質提供電子的化合物。還原劑的示例性但非限制性實例是DTT（二硫蘇糖醇）、β-巰基乙醇、或TCEP（三（2-羧乙基）膦）。同源二聚體的量在體外可能是相同的，並且功能等效變體與Omomyc之間的差異僅存在於異質二聚體配偶體存在的細胞中，其中不存在二硫化物使得有可能更多地形成異質二聚體。
幾種測定法可以用於確定肽的同源二聚化，例如但非限制性的，通過圓二色性監測的熱變性，因此通過折疊和熱穩定性可以定量檢測二聚化。
合適的功能等效變體包括基本上由SEQ ID NO：1的多肽組成的多肽。在本文中，“基本上由……組成”是指指定分子不包含任何將改變SEQ ID NO：1的活性的其他序列。
在一個優選的實施方案中，SEQ ID NO：1的功能等效變體是相對於SEQ ID NO：1的多肽由插入或添加一個或多個氨基酸而得到的多肽。在一個實施方案中，功能等效變體是由於插入少於10個氨基酸、更優選插入少於5個氨基酸、更優選由於插入一個氨基酸而得到的。在一個優選的實施方案中，由於插入一個氨基酸即甲硫氨酸而得到。
在另一個實施方案中，SEQ ID NO：1的功能等效變體是相對於SEQ ID NO：1的多肽由一個或多個氨基酸的缺失而得到的多肽。在一個實施方案中，功能等效變體是由於缺失少於10個氨基酸、更優選缺失少於5個氨基酸、更優選由於缺失一個氨基酸而得到的。
靶向肽的合適的功能變體是顯示出相對於SEQ ID NO：1的肽具有約大於25％的氨基酸序列同一性例如25％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性程度的那些功能變體。使用本領域技術人員眾所周知的電腦演算法和方法確定兩個多肽之間的同一性程度。優選地，通過使用如前所述的BLASTP演算法來確定兩個氨基酸序列之間的同一性（BLAST Manual, Altschul, S. 等人，NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S. 等人，J. Mol. Biol. 1990;215: 403-410）。在一個優選的實施方案中，在SEQ ID NO：1的多肽的整個長度上、或在變體的整個長度上、或兩者上確定序列同一性。
本發明多肽的功能等效變體還可以包括翻譯後修飾，例如糖基化、乙醯化、異戊二烯化、豆蔻醯化、蛋白質水解加工等。
在另一個實施方案中，靶向肽的合適的功能變體是其中本發明的多肽中的一個或多個位置包含以下氨基酸的那些功能變體，所述氨基酸是上述蛋白質中存在的氨基酸的保守置換。“氨基酸的保守置換”是將一個氨基酸替換為具有相似結構和/或化學性質的另一個氨基酸。例如，以下六個群組均包含彼此為保守置換的氨基酸：1）丙氨酸（A）、絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）； 2）天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）； 3）天冬醯胺（N）、穀氨醯胺（Q）；4）精氨酸（R）、賴氨酸（K）；5）異亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、蛋氨酸（M）、纈氨酸（V）；以及6）苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）、色氨酸（W）。這樣的氨基酸的保守置換的選擇在本領域普通技術人員的能力範圍內，並且例如由Dordo等人（J.Mol.Biol，1999，217； 721-739）和Taylor等人（J. Theor. Biol., 1986, 119:205-218）描述。
應當理解，Omomyc的功能等效變體在與源自人c-Myc的Omomyc中存在的突變E61T、E68I、R74Q和R75N相對應的位置處包含突變。在功能等效變體中必須發生的突變位置可以通過不同Myc序列的多序列比對來確定，並且可以通過與衍生自人c-Myc的Omomyc序列中位置61、68、74和75對應的那些位置的比對來確定。在一個實施方案中，Omomyc的功能等效變體在對應於在源自人c-Myc的Omomyc中存在的突變E61T、E68I、R74Q和R75N的位置處含有突變。
在另一個實施方案中，Omomyc的功能等效變體在對應於Omomyc序列中的E61、E68、R74和R75的位置處包含突變，其中E61已被突變為E61A或E61S；E68已被突變為E68L、E68M或E68V；R74已被突變為R74N；並且R75已被突變為R75Q。
多序列比對是成對比對的擴展以一次合併多於兩個序列。多比對方法比對給定查詢集中的所有序列。優選的多序列比對程式（及其演算法）是ClustalW、Clusal2W或ClustalW XXL（參見Thompson等人(1994) Nucleic Acids Res 22:4673-4680）。一旦如本文所述比較了來自不同生物體的c-Myc和變體的序列（比對），本領域技術人員可以容易地確定每個序列內對應於在Omomyc中存在的位置E61T、E68I、R74Q和R75N的位置，並在Omomyc變體突變中對應於衍生自人c-Myc的Omomyc中出現的E61T、E68I、R74Q和R75N突變引入。
用於確定多肽是否可以被視為Omomyc的功能等效變體的合適測定法包括但不限於：
- 測量多肽與Max和Myc形成二聚體複合物的能力的測定法，例如基於Soucek等人（Oncogene，1998，17：2463-2472）描述的報告基因的表達以及PLA（蛋白質連接測定法）或免疫共沉澱的測定法。
- 測量多肽結合DNA內的Myc/Max識別位點（CACGTG位點）的能力的測定法，例如Soucek等人（同上）所述的電泳遷移率變動測定法（EMSA）。
- 測量抑制Myc誘導的反式激活的能力的測定法，例如基於Soucek等人（同上）所述的在Myc/Max特異性的DNA結合位點控制下的報導基因表達的測定法。
- 基於多肽抑制表達myc癌基因的細胞的生長的能力的測定法，如Soucek等人所述（同上）。
- 測量多肽增強myc誘導的凋亡的能力的測定法，例如Soucek等(Oncogene, 1998: 17, 2463 - 2472)所述的測定法。此外，可以使用本領域中公知的用於評估細胞凋亡的任何測定法，例如Hoechst染色、碘化丙啶（PI）或膜聯蛋白V染色、台盼藍、DNA梯化/片段化和TUNEL。
在一個優選的實施方案中，如果多肽在一種或多種上述測定中顯示出天然Omomyc的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的活性，則認為該多肽是Omomyc的功能等效變體。
在一個具體的實施方案中，SEQ ID NO：1的多肽的功能等效變體包含其中SEQ ID NO：1的位置89處的殘基X不是半胱氨酸的SEQ ID NO：1的多肽。優選地，SEQ ID NO：1的位置89處的殘基X是脂族氨基酸、或硫代氨基酸、或二羧酸氨基酸或其醯胺、或具有兩個鹼性基團的氨基酸、或芳族氨基酸、或環狀氨基酸、或羥基化氨基酸。更優選地，氨基酸選自絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸，優選地選自絲氨酸和丙氨酸。
下表中公開了合適的SEQ ID NO：1的功能等效變體，其在SEQ ID NO：1的位置89處具有殘基X而不是半胱氨酸。
SEQ ID NO 序列
SEQ ID NO: 5 TEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSXA (其中X是不同於Cys的任意aa)
SEQ ID NO: 6 MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSXA (其中X是不同於Cys的任意aa)
SEQ ID NO: 7 TEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSSA
SEQ ID NO: 8 MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSSA
SEQ ID NO: 9 TEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSAA
SEQ ID NO: 10 MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSAA
因此，在優選的實施方案中，SEQ ID NO: 1的功能等效變體選自由以下組成的群組：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
另外，Omomyc的功能等效變體也能夠在變體與所述細胞接觸後轉導細胞。應當理解，Omomyc的功能等效變體包含在天然Omomyc中存在的蛋白質轉導結構域或另一功能性蛋白質轉導結構域。
在一個優選的實施方案中，如果多肽能夠以SEQ ID NO：1的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的效率轉導靶細胞，則認為該多肽是SEQ ID NO：1的功能等效變體。
另外，SEQ ID NO：1的功能等效變體也能夠易位至靶腫瘤細胞的細胞核。
在一個優選的實施方案中，如果多肽能夠以SEQ ID NO：1的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的效率易位至靶腫瘤細胞的細胞核，則認為該多肽是SEQ ID NO：1的功能等效變體。
就多肽在穿過細胞膜並易位至細胞核內的能力而言，用於確定多肽是否為SEQ ID NO：1的功能等效變體的合適測定法包括用對多肽具有特異性的試劑和特異性標記細胞核的染料（例如DAPI或Hoechst染料）對細胞進行雙重標記。本發明的多肽的檢測可以通過共聚焦顯微鏡或螢光顯微鏡進行。
在另一個優選的實施方案中，本發明的化合物（i）是綴合物，包含：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體，以及促進細胞攝取多肽或其功能等效變體的化學部分，
如本文所用，術語“綴合物”是指兩個或更多個化合物共價連接在一起，使得每個個化合物的功能保留在綴合物中。
術語“化學部分”是指包含至少一個碳原子的任何化合物。化學部分的實例包括但不限於任何富含疏水性氨基酸和疏水性化學部分的肽鏈。
在優選的實施方案中，根據本發明的綴合物包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個，至少9個、至少10個、或更多個促進細胞攝取多肽或所述多肽的功能等效變體的化學部分。
在一個實施方案中，促進細胞攝取多肽的化學部分是脂質或脂肪酸。
脂肪酸通常是包含在鏈的末端具有酸性部分（例如，羧酸）的碳鏈的分子。脂肪酸的碳鏈可以具有任何長度，但是，優選地，碳鏈的長度為至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16、17個、18個、19個、20個或更多個碳原子數，以及其中可推出的任何範圍。在某些實施方案中，在脂肪酸的鏈部分中碳鏈的長度為4至18個碳原子。在某些實施方案中，脂肪酸碳鏈可以包含奇數個碳原子，然而，在某些實施方案中，鏈中有偶數個碳原子可能是優選的。在其碳鏈中僅包含單鍵的脂肪酸稱為飽和的，而在其鏈中包含至少一個雙鍵的脂肪酸稱為不飽和的。脂肪酸可以是支鏈的，儘管在本發明的優選實施方案中，它是非支鏈的。具體的脂肪酸包括但不限於亞油酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸、硬脂酸、月桂酸、肉豆蔻酸、花生酸、棕櫚油酸、花生四烯酸。
在一個優選的實施方案中，促進細胞攝取包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體的化學部分是細胞穿透肽序列，在這種情況下，綴合物將包含融合蛋白，所述融合蛋白包括：包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體和細胞穿透肽序列。
術語“融合蛋白”涉及通過基因技術產生的蛋白，其由兩個或更多個衍生自不同蛋白質的功能結構域組成。融合蛋白可以通過常規方式獲得，例如，通過在合適的細胞中基因表達編碼所述融合蛋白的核苷酸序列。應當理解，細胞穿透肽是指與形成包含SEQ ID NO：1的多肽或SEQ ID NO：1的功能等效變體的一部分的細胞穿透肽不同的細胞穿透肽。
術語“細胞穿透肽序列”在本說明書中與“CPP”、“蛋白質轉導結構域”或“PTD”互換使用。它是指可變長度的肽鏈，其指導蛋白質在細胞內運輸。向細胞內的遞送過程通常是通過內吞作用發生的，但也可以通過直接的膜易位將肽內化到細胞中。CPP具有的氨基酸組成通常包含高相對豐度的帶正電荷的氨基酸（如賴氨酸或精氨酸），或具有包含交替模式的極性/帶電荷氨基酸和非極性疏水性氨基酸的序列。
可以在本發明中使用的CPP的實例包括但不限於：在果蠅觸角足突變蛋白中存在的CPP（RQIKIWFQNRRMKWKK；SEQ ID NO:13）；在單純皰疹病毒1（HSV-1) VP22 DNA-結合蛋白中存在的CPP（DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE；SEQ ID NO:14）；Bac-7的CPP（RRIRPRPPRLPRPRPRPLPFPRPG；SEQ ID NO: 15）；由氨基酸49-57（RKKRRQRRR；SEQ ID NO: 16）、氨基酸48-60（GRKKRRQRRRTPQ；SEQ ID NO: 17）、氨基酸47-57（YGRKKRRQRRR；SEQ ID NO: 18）組成的HIV-1 TAT蛋白的CPP；S413-PV肽的CPP（ALWKTLLKKVLKAPKKKRKV；SEQ ID NO: 19）；穿透素（penetratin）的CPP（RQIKWFQNRRMKWKK；SEQ ID NO: 20）；SynB1的CPP（RGGRLSYSRRRFSTSTGR；SEQ ID NO: 21）；SynB3的CPP（RRLSYSRRRF；SEQ ID NO: 22）；PTD-4的CPP（PIRRRKKLRRLK；SEQ ID NO: 23）；PTD-5的CPP（RRQRRTSKLMKR；SEQ ID NO: 24）；FHV Coat-(35-49)的CPP（RRRRNRTRRNRRRVR；SEQ ID NO: 25）；BMV Gag-(7-25)的CPP（KMTRAQRRAAARRNRWTAR；SEQ ID NO: 26)；HTLV-II Rex-(4-16) 的CPP（TRRQRTRRARRNR；SEQ ID NO: 27）；D-Tat的CPP（GRKKRRQRRRPPQ；SEQ ID NO:28）；CPP R9-Tat（GRRRRRRRRRPPQ; SEQ ID NO: 29)；MAP的CPP（KLALKLALKLALALKLA；SEQ ID NO: 30）； SBP的CPP（MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV; SEQ ID NO: 31）；FBP的CPP（GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV；SEQ ID NO: 32）；MPG的CPP（ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya；SEQ ID NO: 33）；MPG（ENLS）的CPP（ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya；SEQ ID NO: 34)；Pep-1的CPP（ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cya；SEQ ID NO: 35）；Pep-2的CPP（ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-cya；SEQ ID NO: 36）；具有結構RN（其中N為4至17）的多聚精氨酸序列；GRKKRRQRRR序列（SEQ ID NO: 37）；RRRRRRLR序列（SEQ ID NO: 38）；RRQRRTS KLMKR序列（SEQ ID NO: 39）；運輸蛋白（Transportan）GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL（SEQ ID NO: 40）；KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA（SEQ ID NO: 41）；RQIKIWFQNRRMKWKK（SEQ ID NO: 42）；YGRKKRRQRRR序列（SEQ ID NO: 43）；RKKRRQRR序列（SEQ ID NO: 44）；YARAAARQARA序列（SEQ ID NO: 45）；THRLPRRRRRR序列（SEQ ID NO: 46）；GGRRARRRRRR序列（SEQ ID NO: 47）。
在一個優選的實施方案中，所述穿透細胞肽不是SEQ ID NO：1中包含的內源性肽。
在一個優選的實施方案中，CPP是HIV-1 TAT蛋白的CPP，其由氨基酸49-57（RKKRRQRRR，SEQ ID NO：16）組成。在另一個優選的實施方案中，CPP是GRKKRRQRRR序列（SEQ ID NO：37）或RRRRRRLR（SEQ ID NO：38）。在另一個實施方案中，CPP是GRKKRRQRRR序列（SEQ ID NO：37）或RRRRRRRR（SEQ ID NO：65）。
在一些實施方案中，CPP是如WO2019/018898中所述的CPP，WO2019/018898的全部內容通過引用整體併入本文。
在一個實施方案中，細胞穿透肽序列在本發明的多肽或所述多肽的功能等效變體的N-端處融合。在另一個實施方案中，所述細胞穿透肽融合在本發明的多肽或所述多肽的功能等效變體的C-端處融合。
在優選的實施方案中，除了在SEQ ID NO：1的多肽或所述多肽的功能等效變體中存在的自身細胞穿透肽外，根據本發明的組合的綴合物或融合蛋白還包含至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種、或更多種其他細胞穿透肽。
本發明的合適的融合蛋白包括如下定義的多肽Omomyc*TAT和Omomyc*LZArg：
名稱 SEQ ID NO: 序列
Omomyc*TAT 11 MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSCAGRKKRRQRRR
Omomyc*LZArg 12 MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSCARRRRRRLR
因此，在一個優選的實施方案中，融合蛋白是選自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的多肽。
用於確定綴合物是否保留Omomyc的細胞膜易位能力的合適測定法包括但不限於測量綴合物轉導培養中細胞的能力的測定法。該測定法基於使綴合物與培養細胞接觸並檢測在細胞內位置中綴合物的存在。
在另一個優選的實施方案中，本發明的組合的綴合物還包含另外的核定位信號。
如本文所用，術語“核定位信號”（NLS）是指長度為約4至20個氨基酸殘基的氨基酸序列，其用於將蛋白質引導至核。核定位序列富含鹼性氨基酸，示例性的序列是本領域熟知的（Gorlich D. (1998) EMBO 5.17:2721-7）。在一些實施方案中，NLS選自由以下組成的組：SV40大T抗原NLS（PKKKRKV, SEQ ID NO: 48）；核質蛋白NLS（KRPAATKKAGQAKKKK，SEQ ID NO: 49）；CBP80 NLS（RRRHSDENDGGQPHKRRK, SEQ ID NO: 50）；HIV-I Rev蛋白NLS（RQARRNRRRWE，SEQ ID NO: 51）；HTLV-I Rex（MPKTRRRPRRSQRKRPPT，SEQ ID NO: 52）；hnRNP A NLS（NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFKPRNQGGY，SEQ ID NO: 53）；rpL23a NLS（VHSHKKKKIRTSPTFTTPKTLRLRRQPKYPRKSAPRRNKLDHY, SEQ ID NO: 54）。在本發明的一個實施方案中，核定位信號包含基序K(K/R)X(K/R) （SEQ ID NO: 55）。
在甚至更優選的實施方案中，核定位信號選自由以下組成的組：PKKKRKV（SEQ ID NO: 48）、PAAKRVKLD（SEQ ID NO: 56）和KRPAATKKAGQ AKKKK（SEQ ID NO: 49）。
在另一個優選的實施方案中，NLS可以是包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體的綴合物或融合蛋白的N-端或C-端。
技術人員將理解，可以期望本發明的綴合物還包含一個或多個柔性肽，其連接包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體、細胞穿透肽序列和/或NLS。因此，在一個具體實施方案中，包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體直接連接至細胞穿透肽序列。在另一個具體實施方案中，包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體通過柔性肽連接至細胞穿透肽序列。在一個實施方案中，包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能變體直接連接至NLS。在另一個實施方案中，包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體通過柔性肽連接至NLS。
在一個具體實施方案中，根據本發明的綴合物的多肽直接連接至細胞穿透肽序列和NLS。
在一個實施方案中，NLS是在Myc序列中內源性出現的NLS之一，例如M1肽（PAAKRVKLD，SEQ ID NO：56）或M2肽（RQRRNELKRSF，SEQ ID NO：57）。
在另一個實施方案中，另外的NLS是指與包含SEQ ID NO：1的多肽中或SEQ ID NO：1的功能等效變體中存在的內源性NLS不同的NLS。
在優選的實施方案中，除了在本發明的多肽或其功能等效變體中存在的內源性NLS外，根據本發明的綴合物或融合蛋白還包含至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種、至少10種NLS。
在另一個具體實施方案中，根據本發明之用途的綴合物的多肽通過第一柔性肽接頭連接至細胞穿透肽序列，並通過第二柔性肽接頭連接至NLS。
如本文所用，術語“柔性肽”、“間隔肽”或“接頭肽”是指共價結合兩個蛋白質或部分但其不是任一多肽的一部分的肽，這允許一個相對於另一個移動，不會對蛋白質或部分的功能產生實質性的有害影響。因此，柔性接頭不影響多肽序列的腫瘤追蹤活性、細胞穿透肽的細胞穿透活性或NLS的核定位能力。
柔性肽包含至少一個氨基酸、至少兩個氨基酸、至少三個氨基酸、至少四個氨基酸、至少五個氨基酸、至少六個氨基酸、至少七個氨基酸、至少八個氨基酸酸、至少九個氨基酸、至少10個氨基酸、至少12個氨基酸、至少14個氨基酸、至少16個氨基酸、至少18個氨基酸、至少20個氨基酸、至少25個氨基酸、至少30個氨基酸、至少35個氨基酸、至少40個氨基酸、至少45個氨基酸、至少50個氨基酸、至少60個氨基酸、至少70個氨基酸、至少80個氨基酸、至少90個氨基酸、或約100個氨基酸。在一些實施方案中，柔性肽將允許一種蛋白質相對於另一種蛋白質運動，以增加蛋白質的溶解性和/或改善其活性。合適的接頭區域包括聚甘氨酸區域，甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸殘基的組合的GPRRRR序列（SEQ ID NO：58）。
在一個具體實施方案中，根據本發明的綴合物包含與所述綴合物或與所述多肽或融合蛋白或其變體的C-端或N-端結構域結合的標籤。所述標籤通常是可以用於所述融合蛋白的分離或純化的肽或氨基酸序列。因此，所述標籤能夠以高親和力結合一種或多種配體，例如親和基質(例如，色譜支持物或珠)的一種或多種配體。所述標籤的實例是組氨酸標籤（His標籤或HT），例如包含6個組氨酸殘基（His6或H6）的標籤，其可以以高親和力結合至鎳（Ni2+ ）柱或鈷（Co2+ ）柱。His標籤具有期望的特性，即其可以在使大多數蛋白質變性且破壞大多數蛋白質-蛋白質相互作用的條件下結合其配體。因此，在誘餌參與的蛋白質-蛋白質相互作用被破壞後，它可以用於除去用H6標記的誘餌蛋白質。
用於分離或純化綴合物或包含SEQ ID NO：1的多肽或其變體或融合蛋白的標籤的其他示例性的非限制性實例包括Arg-標籤、FLAG-標籤（DYKDDDDK；SEQ ID NO：59）、Strep-標籤（WSHPQFEK，SEQ ID NO：60）、能夠被抗體識別的表位如c-myc-標籤（被抗c-myc抗體識別）、HA標籤（YPYDVPDYA，SEQ ID NO：61）、V5標籤（GKPIPNPLLGLDST，SEQ ID NO：62）、SBP-標籤、S-標籤、鈣調蛋白結合肽、纖維素結合結構域、幾丁質結合結構域、谷胱甘肽S-轉移酶-標籤、麥芽糖結合蛋白、NusA、TrxA、DsbA、Avi-tag等（Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 60:523-525）、氨基酸序列如AHGHRP（SEQ ID NO：63）或PIHDHDHPHLVIHSGMTCXXC（SEQ ID NO：64）、β-半乳糖苷酶等。
如果需要，可以將標籤用於所述融合蛋白的分離或純化。
在另一個優選的實施方案中，本發明的化合物（i）是編碼上述多肽或融合蛋白的多核苷酸。在一個優選的實施方案中，本發明的化合物（i）是編碼包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體的多核苷酸。在另一個實施方案中，本發明的化合物（i）是編碼綴合物的多核苷酸，所述綴合物包含包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體以及促進細胞攝取該多肽或其功能等效變體的化學部分；更優選地是編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白是包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體與細胞穿透肽序列之間的融合蛋白。
術語“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互換使用，是指任何長度的聚合形式的核苷酸。多核苷酸可以包含去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其類似物。核苷酸可以具有任何三維結構，並且可以實施任何已知或未知的功能。術語“多核苷酸”包括例如，單鏈、雙鏈和三螺旋分子，基因或基因片段，外顯子，內含子，mRNA，tRNA，rRNA，核酶，cDNA，重組多核苷酸，帶分支的多核苷酸，質粒，載體，任何序列的分離的DNA，任何序列的分離的RNA，核酸探針和引物。除天然核酸分子外，本發明的核酸分子還可以包含修飾的核酸分子。如本文所用，mRNA是指可以在細胞中翻譯的RNA。
在優選的實施方案中，本發明的多核苷酸是mRNA。
mRNA可以是化學合成的，可以通過體外轉錄獲得，或者可以在靶細胞中體內合成。形成編碼本發明的綴合物或融合蛋白的多核苷酸的核苷酸序列在用於其表達的相同的正確閱讀框中。
在一個優選的實施方案中，本發明的組合的組分（i）是編碼由序列SEQ ID NO：1組成的多肽、或由SEQ ID NO：1的功能等效變體組成的多肽、或由SEQ ID NO：4組成的多肽的mRNA。
在另一個實施方案中，本發明的組合的組分（i）是包含本發明的多核苷酸的載體。
如本文所用，術語“載體”是指下述的核酸序列，其包含必需序列，從而使得在細胞中轉錄和翻譯所述序列後，會產生由本發明的多核苷酸編碼的多肽。所述序列可操作地連接至允許其在感興趣的宿主細胞中自主複製的其他區段。優選地，載體是表達載體，其被定義為除在宿主細胞中自主複製的區域外，還包含與本發明的核酸可操作地連接的區域並且能夠增強根據本發明的核酸的產物的表達的載體。本發明的載體可以通過本領域廣泛已知的技術獲得。
載體的實例包括但不限於病毒載體、裸DNA或RNA表達載體、質粒、粘粒或噬菌體載體、與陽離子縮合劑相關的DNA或RNA表達載體、包封在脂質體中的DNA或RNA表達載體、以及某些真核細胞，例如生產者細胞。包含本發明的多核苷酸的合適載體是衍生自以下的載體：原核生物中的表達載體（例如pUC18、pUC19、pBluescript及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4），噬菌體和“穿梭”載體（例如pSA3和pAT28），酵母中的表達載體（例如2-微米質粒類型的載體、整合質粒，YEP載體、著絲粒質粒和類似物），昆蟲細胞中的表達載體（例如pAC系列和pVL系列的載體），植物中的表達載體（例如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE和類似物），以及基於病毒載體（腺病毒、與腺病毒相關的病毒以及逆轉錄酶病毒和特別是慢病毒）的高等真核生物細胞中的表達載體，以及非病毒載體，例如pSilencer 4.1-CMV（Ambion）、pcDNA3、pcDNA3.1/hyg、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEFl/His、plND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVL、pKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDT1。在一個優選的實施方案中，本發明的多核苷酸包含在選自由pEGFP、或pBabe逆轉錄酶病毒載體和pTRIPZ、或pSLIK慢病毒載體組成的組的載體中。
本發明的載體可以用於轉化、轉染或感染能夠被所述載體轉化、轉染或感染的細胞。所述細胞可以是原核的或真核的。
載體優選包含本發明的多核苷酸，其可操作地結合至調節本發明的多核苷酸表達的序列。在本發明中使用的調節序列可以是核啟動子，或者是增強子序列和/或增加異源核酸序列表達的其他調節序列。原則上，任何啟動子都可以用於本發明，只要所述啟動子與待表達的多核苷酸的細胞相容即可。因此，適用於實現本發明的啟動子包括但不必限於組成型啟動子，例如真核病毒基因組的衍生物（例如多瘤病毒、腺病毒、SV40、CMV、禽肉瘤病毒、乙型肝炎病毒），金屬硫蛋白基因啟動子，單純皰疹病毒胸苷激酶基因啟動子，逆轉錄酶病毒的LTR區，免疫球蛋白基因啟動子，肌動蛋白基因啟動子，EF-1α基因啟動子，以及其中蛋白質表達取決於分子或外源信號的添加的誘導型啟動子（例如四環素系統、NFκB/UV光系統、Cre/Lox系統和熱休克基因啟動子），WO/2006/135436中所述的可調節RNA聚合酶Ⅱ啟動子和組織特異性啟動子。
在另一個實施方案中，本發明的組合的組分（i）是能夠將本發明的多肽或本發明的綴合物、優選本發明的多肽或本發明的融合蛋白分泌到培養基中的細胞。
能夠分泌本發明的多肽的合適細胞包括但不限於心肌細胞、脂肪細胞、內皮細胞、上皮細胞、淋巴細胞（B細胞和T細胞）、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、血管內膜細胞、不同器官的分離細胞的原代培養物（優選分離自胰島的細胞）、肝細胞、白細胞（包括單核白細胞）、間充質幹細胞、臍帶或成年（的皮膚、肺、腎和肝）、破骨細胞、軟骨細胞和其他結締組織細胞。建立的細胞系如Jurkat T細胞、NIH-3T3、CHO、Cos、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3細胞、C2C12成肌細胞和W138細胞也是合適的。本領域技術人員將理解，可以發現能夠將本發明的多肽分泌到培養基中的細胞形成微粒或微囊，從而使這些細胞在患者中具有更長的使用壽命。適用於形成本發明的微粒物體的材料包括允許連續分泌治療性產物並充當細胞的支持物的任何生物相容性聚合物材料。因此，所述生物相容性聚合物材料可以是例如熱塑性聚合物或氫聚合物。在熱塑性聚合物中，有丙烯酸、丙烯醯胺、甲基丙烯酸2-氨基乙酯、聚（四氟乙烯-共六氟丙烯）、甲基丙烯酸-（7-cumaroxy）乙酯酸、N-異丙基丙烯醯胺、聚丙烯酸、聚丙烯醯胺、聚醯胺-胺、聚（氨基）-對-二甲苯、聚（氯乙基乙烯基醚）、聚己酸內酯、聚（碳酸己內酯-共-三亞甲基）、聚（碳酸尿素）氨基甲酸乙酯、聚（碳酸鹽）氨基甲酸乙酯、聚乙烯、聚乙烯和丙烯醯胺共聚物、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸乙二醇酯、聚（對苯二甲酸乙二酯）、聚（丙烯酸4-羥基丁酯）、聚（甲基丙烯酸羥基乙酯）、聚（甲基丙烯酸N-2-羥基丙基酯）、聚（乳酸乙醇酸）、聚（L-乳酸）、聚（γ-甲基，L-谷氨酸酯）、聚（甲基丙烯酸甲酯）、聚（丙烯富馬酸酯）、聚（氧化丙烯）、聚吡咯、聚苯乙烯、聚（四氟乙烯）、聚氨酯、聚乙烯醇、超高分子量聚乙烯、6-（對乙烯基苯甲醯胺）-己酸，N-對乙烯基苄基-D-麥芽糖醯胺、以及含有多於一種所述聚合物的共聚物。在水凝膠型的聚合物中，有天然材料的海藻酸鹽、瓊脂糖、膠原蛋白、澱粉、透明質酸、牛血清白蛋白、纖維素及其衍生物、果膠、硫酸軟骨素、纖維蛋白和絲蛋白、以及合成水凝膠（例如Sepharose®和Sephadex®）。
本發明的組合的化合物（ii）是腫瘤免疫劑。
如本文所用，術語“腫瘤免疫劑”是指有效增強、刺激和/或上調受試者免疫反應的試劑。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑與本發明的組合的化合物（i）的給藥對治療癌症具有協同作用。
腫瘤免疫劑可以是例如小分子藥物、抗體、或生物分子、或小分子。生物腫瘤免疫劑的實例包括但不限於癌症疫苗、抗體和細胞因子。在一些實施方案中，抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，單克隆抗體是人源化的或人的。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是細胞因子。
“細胞因子”被理解為具有不同尺寸和分子量的肽，這些肽為了調節免疫反應的目的而合成免疫系統的細胞，它們可以是激素、生長因子、壞死因子、趨化因子等。它們可以是天然來源或來源於重組細胞培養物以及天然序列細胞因子的生物學活性等效物。示例性細胞因子可以是抑制T細胞活化的細胞因子，例如IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF和其他免疫抑制性細胞因子；或刺激T細胞活化的細胞因子，以刺激免疫反應。它們與抗體的結合產生免疫細胞因子。在一些實施方案中，細胞因子是重組人白介素15（rhIL-15）、重組人白介素12（rhIL-12）（例如，NM-IL-12（Neumedicines, Inc.）、或異質二聚體IL-15（hetIL-15，Novartis/Admune）、由與可溶性IL-15結合蛋白IL-15受體α鏈（IL15：sIL-15RA）復合的內源性IL-15的合成形式構成的融合複合物。
在另一個實施方案中，細胞因子選自由以下組成的組：IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、II、10、ILI I、IL13、IL 14、IL16、IL 17、IL 18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、11,31、1L32、IL33、11、35、IL36、GM-CSF、IFN-γ 、IL-1α/IL-lFl、IL-1 β/IL-lF2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL- 17/1L-17A、IL-17A/F異質二聚體、IL-17F、IL-18/IL-1F4、1L-23、IL-24、IL-32、TL-32β、IL-32γ、iL-33、LAP (TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β, TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSFl l/RANK L及其任意組合。
在優選的實施方案中，腫瘤免疫劑不是細胞因子。因此，在優選的實施方式中，細胞因子被排除在本發明的範圍之外。優選地，本發明排除的細胞因子是TNF因子α、INF-γ、GM-GSF因子和IL-2。
在另一個優選的實施方案中，僅當組合的組分（i）是組分（i）(a)或（i）(b)時，細胞因子才排除在本發明的範圍之外。因此，在一個實施方案中，如果組合的組分（i）是包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體，或包含包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體以及促進細胞攝取多肽或其功能等效變體的化學部分的綴合物，那麼腫瘤免疫劑不是細胞因子，優選地不是選自由TNF因子α、INF-γGM-GSF因子和IL-2組成的組的細胞因子。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是（i）刺激性（包括共刺激性）受體的激動劑，或（ii）T細胞上抑制性（包括共抑制性）信號的拮抗劑，兩者均導致放大抗原特異性T細胞反應。
某些刺激性和抑制性分子是免疫球蛋白超家族（IgSF）的成員。與共刺激性或共抑制性受體結合的一個重要的膜結合配體家族是B7家族，包括B7-1、B7-2、B7-H1（PD-L1）、B7-DC（PD-L2）、B7-H2（ICOS-L）、B7-H3、B7-H4、B7-H5（VISTA）和B7-H6。
另一個與共刺激性或共抑制性受體結合的膜結合配體家族是與同源TNF受體家族成員結合的TNF分子家族，其包括CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137 (4-1BB)、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、 LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDAR、EDA1、XEDAR、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFR。
在一些實施方案中，本發明的化合物（i）和腫瘤免疫劑的組合可以刺激T細胞應答。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是：（i）抑制T細胞活化的蛋白質（例如免疫檢查點抑制劑）的拮抗劑，所述蛋白質例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1、和TIM-4；（ii）刺激T細胞活化的蛋白質的激動劑，所述蛋白質例如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB (CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、DR3和CD28H。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是NK細胞上的抑制性受體的拮抗劑或NK細胞上激活性受體的激動劑。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是KIR的拮抗劑，例如lirilumab。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是抑制或消耗巨噬細胞或單核細胞的劑，包括但不限於CSF-1R拮抗劑，例如CSF-1R拮抗劑抗體，包括RG7155（WO11/70024、WO11/107553、WO11/131407、WO13/87699、WO13/119716、WO13/132044）或FPA-008（WO11/140249、WO13169264、WO14/036357）。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑選自連接（ligate）陽性共刺激性受體的激動劑，通過抑制性受體減弱信號傳導的阻斷劑，拮抗劑，以及全身性增加抗腫瘤T細胞頻率的一種或多種劑，克服腫瘤微環境中不同的免疫抑制路徑（例如，阻斷抑制性受體參與（例如，PD-L1/PD-1相互作用）、消耗或抑制Treg（例如，使用抗CD25單克隆抗體（例如，daclizumab）或通過體外抗CD25珠耗盡）、抑制代謝酶如IDO、或逆轉/預防T細胞能量或耗盡）的劑，以及在腫瘤部位觸發先天性免疫活化和/或炎症的劑。
如本文所用，術語“細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4”（縮寫為“CTLA-4”，也稱為分化簇152（CD152））是指作為免疫檢查點起作用的蛋白質受體。CTLA-4是免疫球蛋白超家族的成員，其由活化的T細胞表達並向T細胞傳遞抑制信號。CTLA-4與T細胞共刺激性蛋白CD28同源，並且兩個分子均結合至抗原呈遞細胞上的CD80和CD86(也被分別稱為B7-1和B7-2)。與CD28相比，CTLA-4以更大的親和力和親合力結合CD80和CD86，從而使其能夠競爭超過CD28以結合其配體。CTLA-4向T細胞傳遞抑制信號，而CD28則傳遞刺激信號。CTLA-4還存在於調節性T細胞（Treg）中，並有助於其抑制功能。通過T細胞受體和CD28的T細胞活化使得CTLA-4表達增加。CTLA-4蛋白是由人的CTLA-4基因編碼的（資料庫索引：ENSG00000163599）。通常，在T細胞活化後，CTLA-4在質膜上被上調，在這裡它通過多種機制下調T細胞功能，包括通過競爭超過CD28結合其配體B7以及通過誘導T細胞週期阻滯而阻止共刺激（Postow等人(2015) J. Clinical oncology, Vol. 33, 第1974-1983頁；Pardoll, D. 等人(2012), Nature Reviews Cancer 12, 252-264）。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是CTLA-4拮抗劑。
如本文所用，術語``CTLA-4拮抗劑''是指但不限於阻斷CTLA-4與其配體B7-1和/或B7-2結合的任何化合物或劑或生物分子。在本發明的上下文中，應理解，當用CTLA-4拮抗劑（例如，CTLA-4抗體）治療受試者（例如人類個體）時，CTLA-4拮抗劑阻斷（人）CTLA-4與（人）B7-1和/或B7-2的結合。
當前考慮用於臨床使用治療癌症的CTLA-4拮抗劑化合物的非限制性實例包括針對CTLA-4的拮抗性抗體。
在一些實施方案中，CTLA-4拮抗劑是拮抗性CTLA-4抗體。在一些實施方案中，拮抗性CTLA-4抗體是YERVOY（ipilimumab）或tremelimumab。
CTLA-4拮抗劑的其他非限制性實例包括免疫粘附素（也稱為融合蛋白），它們是能夠特異性結合CTLA-4並阻斷其結合至B7-1和/或B7-2的化合物。
如本文所用，術語“程式性死亡1（PD-1）”受體是指屬於CD28家族的免疫抑制性受體。在人類中，PD-1由PDCD1基因編碼。PD-1主要在體內先前活化的T細胞上表達，並與兩個配體PD-L1和PD-L2結合。如本文所用的，術語“PD-1”包括人PD-1（hPD-1），hPD-1的變體、亞型(isoform)和種同源物，以及具有至少一個與hPD-1共同的表位的類似物。完整的hPD-1序列可以在GENBANK登記號No. U64863下找到。PD-1在免疫細胞上表達，所述免疫細胞例如活化的T細胞（包括效應T細胞）、B細胞、骨髓細胞、胸腺細胞、以及自然殺傷（NK）細胞（Suya Dai等人(2014) Cellular Immunology, Vol:290,第72-79頁; Gianchecchi等人(2013), Autoimmun. Rev. 12 1091-1 100）。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是PD-1拮抗劑。如本文所用，術語“PD-1拮抗劑”是指但不限於阻斷在癌細胞上表達的PD-L1與在免疫細胞（T細胞，B細胞或NKT細胞）上表達的PD-1的結合的任何化合物或劑或生物分子（例如抗體），和/或阻斷在癌細胞上表達的PD-L2與在免疫細胞表達的PD-1的結合的任何化合物或劑或生物分子（例如抗體）。在本發明的上下文中，應理解，當用PD-1拮抗劑（例如，PD-1抗體）治療受試者（例如，人類個體）時，PD-1拮抗劑阻斷（人）PD-L1與（人）PD-1的結合，或阻斷（人）PD-L2與（人）PD-1的結合，並且優選地阻斷（人）PD-L1和PD-L2二者與（人）PD-1的結合。人PD-1氨基酸序列可以在NCBI位點No.: NP_005009中找到。人PD-L1和PD-L2氨基酸序列可以分別在NCBI位點No.:NP_054862和NP_079515中找到。
PD-1拮抗劑的非限制性實例是針對PD-1的抗體（也稱為PD-1抗體或抗PD-1抗體），例如PD-1單克隆抗體（mAb）或其抗原結合片段 ，其特異性結合PD-1，並且優選地特異性地結合人PD-1。mAb可以是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，並且可以包括人恒定區。PD-1拮抗劑化合物的非限制性實例包括PD-1抗體，例如nivolumab（Opdivo®，Bristol-Myers Squibb）、pembrolizumab（Keytruda®，Merck）、BGB-A317、和其他抗體，例如PDR001（Novartis）。PD-1拮抗劑的其他非限制性實例包括pidilizumab（Cure Tech）、AMP-224（GlaxoSmithKline）、AMP-514（GlaxoSmithKline）、PDR001（Novartis）和cemiplimab（Regeneron和Sanofi）。其他PD-1拮抗劑還包括在US8008449、US7521051和US8354509中描述的任何抗PD-1抗體。
PD-1拮抗劑的其他非限制性實例包括免疫粘附素（immunoadhesin, 也稱為融合蛋白），其是能夠特異性結合PD-1並阻斷其與PD-L1結合的化合物。特異性結合PD-1的免疫粘附分子的實例描述於WO2010/027827、US2016/0304969和WO2011/066342中。例如，可以在本發明中用作PD-1拮抗劑的融合蛋白的非限制性實例是AMP-224（其是由PD-1配體程式性細胞死亡配體2（PD-L2，B7-DC）的胞外域和人免疫球蛋白（Ig）G1的Fc區構成的重組B7-DC Fc融合蛋白）。
如本文所用，術語“抗體”（例如PD-1抗體和CTLA-4抗體）是指表現出期望的生物學活性或結合活性（例如，如上所述，阻斷PD-1與其配體的結合或阻斷CTLA-4與其配體的結合）的任何形式的抗體及其片段。因此，其以最廣泛的意義使用，並且具體覆蓋但不限於單克隆抗體（包括全長單克隆抗體）及其片段，多克隆抗體及其片段，多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）及其片段， 人源化抗體、完全人抗體、及其片段，嵌合抗體及其片段，以及駱駝化（camelized）的單結構域抗體及其片段。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是特異性結合至程式性死亡-1（PD-1）受體並抑制PD-1活性的抗體或其抗原結合部分。在一些實施方案中，PD-1拮抗劑是拮抗性的PD-1抗體。在一些實施方案中，拮抗性的PD-1抗體是OPDIVO（nivolumab）、KEYTRUDA（pembrolizumab）、或MEDI-0680（AMP-514；WO2012/145493）。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑可以是pidilizumab（CT-011）。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是由融合至IgG1的Fc部分的PD-L2的胞外結構域（B7-DC）構成的重組蛋白，被稱為AMP-224。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是PD-L1拮抗劑。在一些實施方案中，PD-L1拮抗劑是拮抗性PD-L1抗體。在一些實施方案中，PD-L1抗體是MPDL3280A（RG7446；WO2010/077634）、durvalumab（MEDI4736）、BMS-936559（WO2007/005874）、和MSB0010718C（WO2013/79174）。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是LAG-3拮抗劑。在一些實施方案中，LAG-3拮抗劑是拮抗性LAG-3抗體。在一些實施方案中，LAG3抗體是BMS-986016（WO10/19570、WO14/08218)或IMP-731或IMP-321 (WO08/132601、WO009/44273）。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是CD137（4-1BB）激動劑。在一些實施方案中，CD137（4-1BB）激動劑是激動性CD137抗體。在一些實施方案中，CD137抗體是urelumab或PF-05082566（WO12/32433）。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是GITR激動劑。在一些實施方案中，GITR激動劑是激動性GITR抗體。在一些實施方案中，GITR抗體是BMS-986153、BMS-986156、TRX-518（WO006/105021、WO009/009116）或MK-4166（WO11/028683）。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是吲哚胺（2,3）-雙加氧酶（IDO）拮抗劑。在一些實施方案中，IDO拮抗劑選自epacadostat（INCB024360, Incyte)；indoximod（NLG-8189, NewLink Genetics Corporation）；capmanitib（INC280, Novartis）；GDC-0919（Genentech/Roche）；PF-06840003（Pfizer）；BMS:F001287（Bristol-Myers Squibb）；Phy906/KD108（Phytoceutica）；分解kynurenine的酶（Kynase, Kyn Therapeutics）；以及NLG-919（WO09/73620、WO009/1156652、WO11/56652、WO12/142237）。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是OX40激動劑。在一些實施方案中，OX40激動劑是激動性OX40抗體。在一些實施方案中，OX40抗體是MEDI-6383或MEDI-6469。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是OX40L拮抗劑。在一些實施方案中，OX40L拮抗劑是拮抗性OX40L抗體。在一些實施方案中，OX40L拮抗劑是RG-7888（WO06/029879）。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是CD40激動劑。在一些實施方案中，CD40激動劑是激動性CD40抗體。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是CD40拮抗劑。在一些實施方案中，CD40拮抗劑是拮抗性CD40抗體。在一些實施方案中，CD40抗體是lucatumumab或dacetuzumab。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是CD27激動劑。在一些實施方案中，CD27激動劑是激動性CD27抗體。在一些實施方案中，CD27抗體是varlilumab。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是MGA271（針對B7H3）（WO11/109400）。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是abagovomab、adecatumumab、afutuzumab、alemtuzumab、anatumomab mafenatox、apolizumab、atezolimab、avelumab、blinatumomab、BMS-936559、catumaxomab、durvalumab、epacadostat、epratuzumab、indoximod、inotuzumab ozogamicin、intelumumab、ipilimumab、isatuximab、lambrolizumab、MED14736、MPDL3280A、nivolumab、obinutuzumab、ocaratuzumab、ofatumumab、olatatumab、pembrolizumab、pidilizumab、rituximab、ticilimumab、samalizumab或tremelimumab。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是免疫刺激劑。例如，阻斷PD-1和PD-L1抑制性軸的抗體可以釋放活化的腫瘤反應性T細胞，並且在臨床試驗中已顯示在越來越多的腫瘤組織學中誘導持久的抗腫瘤反應，包括傳統上尚未被認為對免疫療法敏感的某些腫瘤類型。抗PD-1抗體nivolumab（Opdivo®，Bristol-Myers Squibb，也稱為ONO-4538、MDX1106和BMS-936558）已顯示出改善患有RCC的患者的總存活率的潛力，患有RCC的患者是在先前的抗血管生成的療法期間或之後經歷了疾病進展。
在一些實施方案中，免疫調節治療劑特異性地誘導腫瘤細胞的凋亡。經批准的可以用於本發明的免疫調節治療劑包括pomalidomide（Pomalyst®，Celgene）；和lenalidomide（Revlimid®，Celgene）；巨大戟醇甲基丁烯酸酯（Picato®，LEO Pharma）。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是癌症疫苗。在一些實施方案中，所述癌症疫苗選自sipuleucel-T（Provenge®，Dendreon/Valeant Pharmaceuticals）和talimogene laherparepvec（Imlygic®，BioVex/Amgen，以前稱為T-VEC）。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑選自溶瘤病毒療法，例如pexastimogene devacirepvec（PexaVec/JX-594, SillaJen/formerly Jennerex Biotherapeutics）、pelareorep（Reolysin®, Oncolytics Biotech）、enadenotucirev（NG-348, PsiOxus, formerly known as ColoAd1）、ONCOS-102（Targovax/formerly Oncos）、工程化以表達β-半乳糖苷酶(β-gal)/β-葡萄糖醛酸酶和/或β-gal/人鈉碘轉運體(hNIS)的痘苗病毒如GL-ONC1（GLV-1h68/GLV-1h153, Genelux GmbH）、以及工程化以表達GM-CSF的腺病毒如CG0070 (Cold Genesys)
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑選自JX-929（SillaJen/以前的Jennerex Biotherapeutics）、TG01和TG02（Targovax /以前的Oncos）、TILT-123（TILT Biotherapeutics）和VSV-GP（ViraTherapeutics）。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是工程化以表達嵌合抗原受體或CAR的T細胞。工程化以表達這種嵌合抗原受體的T細胞被稱為CAR-T細胞。已經構建了由結合結構域組成的CAR，所述結合結構域可以衍生自天然配體、衍生自對細胞表面抗原具有特異性的單克隆抗體的單鏈可變片段（scFv），可以融合至作為T細胞受體（TCR）的功能末端的胞內結構域，例如TCR的CD3-ζ（zeta）信號結構域，其能夠在T淋巴細胞中產生活化信號。抗原一旦結合，此類CAR連接至效應細胞中的內源性信號通路，並產生類似於由TCR複合物引發的那些活化信號的活化信號。
例如，在一些實施方案中，CAR-T細胞是美國專利8,906,682（June；通過引用整體併入本文）中描述的那些，其公開了CAR-T細胞被工程化以包含具有抗原結合結構域（例如與CD19結合的結構域）的胞外結構域，融合至T細胞抗原受體複合物ζ鏈（例如CD3ζ）的胞內信號結構域。當在T細胞中表達時，CAR能夠基於抗原結合特異性來重定向抗原識別。對於CD19的情況，抗原在惡性B細胞上表達。目前正在進行200多個在各種適應症中使用CAR-T的臨床試驗。[https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=chimeric+antigen+receptors&pg=1]。
在一些實施方案中，免疫刺激劑是視黃酸受體相關的孤兒受體γ（RORγt）的活化劑。RORγt是一種轉錄因子，在CD4+ (Th17)和CD8+ (Tc17) T細胞的17型效應物子集的分化和維持以及表達IL-17的先天免疫細胞亞群如NK細胞的分化中起關鍵作用。在一些實施方案中，RORγt的活化劑是LYC-55716（Lycera），其目前正在用於治療實體瘤的臨床試驗中評估（NCT02929862）。
在一些實施方案中，免疫刺激劑是toll樣受體（TLR）的激動劑或活化劑。TLR的合適活化劑包括TLR9的激動劑或活化劑，例如SD-101（Dynavax）。可以用於本發明的TLR8的激動劑或活化劑包括motolimod（VTX-2337，VentiRx Pharmaceuticals）。
可以在本發明中使用的其他腫瘤免疫劑包括：urelumab (BMS-663513, Bristol-Myers Squibb)、抗CD137單克隆抗體、varlilumab（CDX-1127，Celldex Therapeutics）、抗CD27單克隆抗體、BMS-986178（Bristol-Myers Squibb）、抗OX40單克隆抗體、lirilumab（IPH2102/BMS-986015，Innate Pharma，Bristol-Myers Squibb）、抗KIR單克隆抗體、monalizumab（IPH2201，Innate Pharma，AstraZeneca）、抗NKG2A單克隆抗體、andecaliximab（GS-5745，Gilead Sciences）、抗MMP9抗體、MK-4166（Merck＆Co.）、抗GITR單克隆抗體。
在一些實施方案中，免疫刺激劑選自elotuzumab、mifamurtide、toll樣受體的激動劑或活化劑、以及RORγt的活化劑。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑選自Jerry L. Adams等人，“Big opportunities for small molecules in immuno-oncology,” Cancer Therapy 2015, Vol. 14，第603-622頁描述的那些，其全部內容通過引用整體併入本文。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑選自Jerry L. Adams等人的表1中描述的實例。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是靶向選自Jerry L. Adams等人的表2中列出的腫瘤免疫靶標的小分子。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是選自Jerry L.Adams等人的表2中列出的那些的小分子劑。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑選自Peter L. Toogood, “Small molecule immuno-oncology therapeutic agents,” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2018, Vol. 28，第319-329頁所描述的小分子腫瘤免疫劑，其全部內容通過引用整體併入本文。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是靶向如Peter L. Toogood所描述的通路的試劑。
在一些實施方案中，腫瘤免疫劑選自Sandra L. Ross等人，“Bispecific T cell engager (BiTE® ) antibody constructs can mediate bystander tumor cell killing”, PLoS ONE 12(8): e0183390所描述的那些，其全部內容通過引用整體併入本文。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是雙特異性T細胞銜接（BiTE®）抗體構建體。在一些實施方案中，雙特異性T細胞銜接（BiTE®）抗體構建體是CD19/CD3雙特異性抗體構建體。在一些實施方案中，雙特異性T細胞銜接（BiTE®）抗體構建體是EGFR/CD3 雙特異性抗體構建體。在一些實施方案中，雙特異性T細胞銜接（BiTE®）抗體構建體活化T細胞。在一些實施方案中，雙特異性T細胞銜接（BiTE®）抗體構建體活化T細胞，其釋放細胞因子，誘導旁觀者細胞上的細胞間粘附分子1（ICAM-1）和FAS上調。在一些實施方案中，雙特異性T細胞銜接 (BiTE®)抗體構建體活化T細胞，其導致誘導的旁觀者細胞裂解。在一些實施方案中，旁觀者細胞是實體瘤。在一些實施方案中，裂解的旁觀者細胞與BiTE®-活化的T細胞鄰近。在一些實施方案中，旁觀者細胞包含腫瘤相關抗原（TAA）陰性癌細胞。在一些實施方案中，旁觀者細胞包括EGFR陰性癌細胞。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是阻斷PD-L1/PD1軸和/或CTLA4的抗體。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是離體(ex-vivo )擴增的腫瘤浸潤T細胞。在一些實施方案中，腫瘤免疫劑是將T細胞與腫瘤相關表面抗原（TAA）直接連接的雙特異性抗體構建體或嵌合抗原受體（CAR）。
在另一個實施方案中，本發明的組合的腫瘤免疫劑是抑制T細胞活化的蛋白質的拮抗劑或免疫檢查點抑制劑。
如本文所用，術語“檢查點抑制劑”涉及可用於防止癌細胞避開患者免疫系統的劑。抗腫瘤免疫力破壞的主要機制之一是“T細胞衰竭”，它是由於長期暴露於導致抑制性受體上調的抗原所致。這些抑制性受體充當免疫檢查點，以防止不受控的免疫反應。
PD-1和共抑制性受體，例如細胞毒性T淋巴細胞抗原4（CTLA-4）、B和T淋巴細胞衰減因子（BTLA、CD272）、T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結構域3（Tim-3）、淋巴細胞活化基因-3（Lag-3、CD223）、以及其他，通常稱為檢查點調節子。它們充當分子“守門者(gatekeeper)”，使細胞外資訊能夠指示細胞週期進程和其他細胞內信號傳導過程是否應該繼續進行。
在一些實施方案中，免疫檢查點抑制劑是針對PD-1的抗體。PD-1與程式性細胞死亡1受體（PD-1）結合，以防止該受體與抑制性配體PDL-1結合，從而抑制（overriding）了腫瘤抑制宿主抗腫瘤免疫反應的能力。
一方面，檢查點抑制劑是生物治療劑或小分子。另一方面，檢查點抑制劑是單克隆抗體、人源化抗體、完全人抗體、融合蛋白、或其組合。在其他方面，檢查點抑制劑抑制選自以下的檢查點蛋白：CTLA-4、PDLl、PDL2、PDl、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、B-7家族配體或其組合物。在其他方面，檢查點抑制劑與選自以下的檢查點蛋白的配體相互作用：CTLA-4、PDLl、PDL2、PDl、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、B-7家族配體或其組合物。在一方面，檢查點抑制劑是免疫刺激劑、T細胞生長因子、白介素、抗體、疫苗或其組合。在另一方面，白介素是IL-7或IL-15。在一個具體方面，白介素是糖基化的IL-7。在另一方面，疫苗是樹突細胞（DC）疫苗。
檢查點抑制劑包括以統計學上顯著性的方式阻斷或抑制免疫系統的抑制性通路的任何劑。這樣的抑制劑可以包括小分子抑制劑，或者可以包括結合並阻斷或抑制免疫檢查點受體的抗體或其抗原結合片段，或者結合並阻斷或抑制免疫檢查點受體配體的抗體。可以被靶向以阻斷或抑制的示例性檢查點分子包括但不限於CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、LAG3、TIM3、VISTA、KIR、2B4（屬於CD2分子家族，並在所有NK、γδ和記憶性CD8+（αβ）T細胞上表達）、CD160（也稱為BY55）、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、A2aR、以及各種B7家族配體。B7家族配體包括但不限於B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7 。檢查點抑制劑包括下述的抗體、或其抗原結合片段、其他結合蛋白、生物治療劑、或小分子，它們結合至CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、BTLA、HVEM、 TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD 160和CGEN-15049中的一個或多個並阻斷或抑制其活性。示例性的免疫檢查點抑制劑包括Tremelimumab（CTLA-4阻斷抗體）、抗OX40、PD-L1單克隆抗體（抗B7-Hl；MEDI4736）、MK-3475（PD-1阻斷劑）、Nivolumab（抗PD1抗體）、CT-011（抗PD1抗體）、BY55單克隆抗體、AMP224（抗PDL1抗體）、BMS-936559（抗PDL1抗體）、MPLDL3280A（抗PDL1抗體）、MSB0010718C（抗PDL1抗體）和 ipilimumab（抗CTLA-4檢查點抑制劑）。檢查點蛋白配體包括但不限於PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD28、CD86和TIM-3。
在某些實施方案中，免疫檢查點抑制劑選自PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑和CTLA-4拮抗劑。在一些實施方案中，檢查點抑制劑選自由nivolumab（Opdivo®）、ipilimumab（Yervoy®）和pembrolizumab（Keytruda®）組成的組。在一些實施方案中，檢查點抑制劑選自nivolumab（抗PD-1抗體，Opdivo®，Bristol-Myers Squibb）；pembrolizumab（抗PD-1抗體，Keytruda®，Merck）；ipilimumab（抗CTLA-4抗體，Yervoy®，Bristol-Myers Squibb）；durvalumab（抗PD-L1抗體，Imfinzi®，AstraZeneca）； 和atezolizumab（抗PD-L1抗體，Tecentriq®，Genentech）。
在一些實施方案中，檢查點抑制劑選自由以下組成的組：lambrolizumab（MK-3475）、nivolumab (BMS-936558)、pidilizumab（CT-011）、AMP-224、MDX-1105、MEDI4736、MPDL3280A、BMS-936559、ipilimumab、lirlumab、IPH2101、pembrolizumab（Keytruda®）和tremelimumab。
在一些實施方案中，免疫檢查點抑制劑是REGN2810（Regeneron），其是一種在患有基底細胞癌(NCT03132636)、NSCLC（NCT03088540）、皮膚鱗狀細胞癌（NCT02760498）、淋巴瘤（NCT02651662）、和黑色素瘤（NCT03002376）的患者中測試的抗PD-1抗體（NCT03132636）；pidilizumab（CureTech），也稱為CT-011，其是一種在用於彌散性大B細胞淋巴瘤和多發性骨髓瘤的臨床試驗中的與PD-1結合的抗體；avelumab（Bavencio®，Pfizer/Merck KGaA），也稱為MSB0010718C，其是一種在用於非小細胞肺癌、梅克爾細胞癌、間皮瘤、實體瘤、腎癌、卵巢癌、膀胱癌、頭頸癌和胃癌的臨床試驗中的完全人IgG1抗PD-L1抗體；或PDR001（Novartis），其是一種在用於非小細胞肺癌、黑色素瘤、三陰性乳腺癌和晚期或轉移性實體瘤的臨床試驗中與PD-1結合的抑制性抗體。Tremelimumab（CP-675,206；Astrazeneca）是針對CTLA-4的完全人單克隆抗體，其已經在臨床試驗中針對多種適應症進行了研究，所述適應症包括：間皮瘤、結直腸癌、腎癌、乳腺癌、肺癌和非小細胞肺癌、胰腺導管腺癌、胰腺癌、生殖細胞癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肝細胞癌、前列腺癌、子宮內膜癌、肝臟轉移癌、肝癌、大B細胞淋巴瘤、卵巢癌、宮頸癌、轉移性間變性甲狀腺癌、尿路上皮癌、輸卵管癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、軟組織肉瘤和黑色素瘤。AGEN-1884（Agenus）是抗CTLA4抗體，其正在針對晚期實體瘤進行第一階段的臨床試驗（NCT02694822）。
在一些實施方案中，檢查點抑制劑是含T細胞免疫球蛋白粘蛋白的蛋白-3（TIM-3）的抑制劑。可以用於本發明的TIM-3抑制劑包括TSR-022、LY3321367和MBG453。TSR-022（Tesaro）是抗TIM-3抗體，其正在實體瘤中進行研究（NCT02817633）。LY3321367（Eli Lilly）是抗TIM-3抗體，其正在實體瘤中進行研究（NCT03099109）。MBG453（Novartis）是抗TIM-3抗體，其正在晚期惡性腫瘤中進行研究（NCT02608268）。
在一些實施方案中，檢查點抑制劑是具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體的抑制劑、或TIGIT（某些T細胞和NK細胞上的免疫受體）的抑制劑。可以用於本發明的TIGIT抑制劑包括BMS-986207（Bristol-Myers Squibb），其是一種抗TIGIT單克隆抗體（NCT02913313）；OMP-313M32（Oncomed）；以及抗TIGIT單克隆抗體（NCT03119428）。
在一些實施方案中，檢查點抑制劑是淋巴細胞活化基因-3（LAG-3）的抑制劑。可以用於本發明的LAG-3抑制劑包括BMS-986016和REGN3767和IMP321。BMS-986016（Bristol-Myers Squibb）是一種抗LAG-3抗體，其正在成膠質細胞瘤和神經膠質肉瘤中研究（NCT02658981）。REGN3767（Regeneron）也是一種抗LAG-3抗體，其正在惡性腫瘤中研究（NCT03005782）。IMP321（Immutep S.A.）是一種LAG-3-Ig融合蛋白，其正在黑色素瘤（NCT02676869）、腺癌（NCT02614833）、和轉移性乳腺癌（NCT00349934）中研究。
可以用於本發明的檢查點抑制劑包括OX40激動劑。  臨床試驗中正在研究的OX40激動劑包括以下：在轉移性腎癌（NCT03092856）和晚期癌症和腫瘤（NCT02554812；NCT05082566）中的激動性的抗OX40抗體PF-04518600/PF-8600（Pfizer）；第一階段癌症試驗（NCT02528357）中的激動性的抗OX40抗體GSK3174998（Merck）；晚期實體瘤（NCT02318394和NCT02705482）中的激動性的抗OX40抗體MEDI0562（Medimmune/AstraZeneca）；患有結直腸癌（NCT02559024）、乳腺癌（NCT01862900）、頭頸癌（NCT02274155）和轉移性前列腺癌（NCT01303705）的患者中的激動性的抗OX40抗體MEDI6469（Medimmune/AstraZeneca）；以及晚期癌症（NCT02737475）中的激動性的抗OX40抗體BMS-986178（Bristol-Myers Squibb）。
可以用於本發明的檢查點抑制劑包括CD137（也稱為4-1BB）激動劑。臨床試驗中正在研究的CD137激動劑包括：彌散性大B細胞淋巴瘤（NCT02951156）和晚期癌症和腫瘤（NCT02554812和NCT05082566）中的激動性的抗CD137抗體utomilumab（PF-05082566，Pfizer）；黑色素瘤和皮膚癌（NCT02652455）和成膠質細胞瘤和神經膠質肉瘤（NCT02658981）中的激動性的抗CD137抗體urelumab（BMS-663513，Bristol-Myers Squibb）。
可以用於本發明的檢查點抑制劑包括CD27激動劑。在臨床試驗中正在研究的CD27激動劑包括：鱗狀細胞頭頸癌、卵巢癌、結直腸癌、腎細胞癌和成膠質細胞瘤（NCT02335918）；淋巴瘤（NCT01460134）；以及膠質瘤和星形細胞瘤（NCT02924038）中的激動性抗CD27抗體varlilumab（CDX-1127，Celldex Therapeutics）。
可以用於本發明的檢查點抑制劑包括糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體（GITR）激動劑。在臨床試驗中正在研究的GITR激動劑包括：在惡性黑素瘤和其他惡性實體瘤（NCT01239134和NCT02628574）中的激動性抗GITR抗體TRX518（Leap Therapeutics）；在實體瘤和淋巴瘤（NCT 02740270）中的激動性抗GITR抗體GWN323（Novartis）；在晚期癌症（NCT02697591和NCT03126110）中的激動性的抗GITR抗體INCAGN01876（Incyte/Agenus）；在實體瘤（NCT02132754）中的激動性抗GITR抗體MK-4166（Merck）和在晚期實體瘤（NCT02583165）中的具有人IgG1 Fc結構域的激動性六聚GITR-配體分子MEDI1873（Medimmune/AstraZeneca）。
可以用於本發明的檢查點抑制劑包括可誘導的T細胞共刺激因子（ICOS，也稱為CD278）激動劑。在臨床試驗中正在研究的ICOS激動劑包括：淋巴瘤（NCT02520791）中的激動性抗ICOS抗體MEDI-570（Medimmune）；處於第1階段（NCT02723955）的激動性抗ICOS抗體GSK3359609（Merck）；處於第1階段（NCT02904226）的激動性抗ICOS抗體JTX-2011（Jounce Therapeutics）。
可以用於本發明的檢查點抑制劑包括殺傷性IgG樣受體（KIR）抑制劑。在臨床試驗中正在研究的KIR抑制劑包括：白血病（NCT01687387、NCT02399917、NCT02481297、NCT02599649）、多發性骨髓瘤（NCT02252263）、和淋巴瘤（NCT01592370）中的抗KIR抗體lirilumab（IPH2102/BMS-986015，Innate Pharma/Bristol-Myers Squibb）；骨髓瘤（NCT01222286和NCT01217203）中的IPH2101（1-7F9，Innate Pharma）；淋巴瘤（NCT02593045）中的與長胞質尾區（KIR3DL2）的三個結構域結合的抗KIR抗體IPH4102（Innate Pharma）。
可以用於本發明的檢查點抑制劑包括CD47和信號調節蛋白α（SIRPa）之間相互作用的CD47抑制劑。在臨床試驗中正在研究的CD47/SIRPa抑制劑包括：處於第一階段（NCT03013218）的與CD47結合並阻止CD47/SIRPa介導的信號傳導的（SIRPa）的拮抗性變體ALX-148（Alexo Therapeutics）；處於臨床試驗第一階段（NCT02890368和NCT02663518）的可溶性重組融合蛋白TTI-621（SIRPa-Fc，Trillium Therapeutics），其通過將SIRPa的N端CD47結合結構域與人IgG1的Fc結構域連接而產生，通過結合人CD47發揮作用並阻止其向巨噬細胞遞送“不要吃”的信號；白血病中（NCT02641002）中的抗CD47抗體CC-90002（Celgene）；以及在結直腸腫瘤和實體瘤（NCT02953782）、急性髓性白血病（NCT02678338）和淋巴瘤（NCT02953509）中的Hu5F9-G4（Forty Seven, Inc.）。在一個優選的實施方案中，檢查點抑制劑是CD47抑制劑。
可以用於本發明的檢查點抑制劑包括CD73抑制劑。在臨床試驗中正在研究的CD73抑制劑包括：實體瘤（NCT02503774）中的抗CD73抗體MEDI9447（Medimmune）；和實體瘤（NCT02754141）中的抗CD73抗體BMS-986179（Bristol-Myers Squibb）。
可以用於本發明的檢查點抑制劑包括幹擾素基因蛋白（STING，也稱為跨膜蛋白173或TMEM173）的刺激劑的激動劑。在臨床試驗中正在研究的STING激動劑包括：淋巴瘤（NCT03010176）中的激動性合成環狀二核苷酸MK-1454（Merck）；以及處於第1階段（NCT02675439和NCT03172936）中的激動性合成環狀二核苷酸ADU-S100（MIW815，Aduro Biotech/Novartis）。
可以用於本發明的檢查點抑制劑包括CSF1R抑制劑。在臨床試驗中正在研究的CSF1R抑制劑包括：在結直腸癌、胰腺癌、轉移性和晚期癌症（NCT02777710）和黑色素瘤、非小細胞肺癌、鱗狀細胞頭頸癌、胃腸道間質瘤（GIST）和卵巢癌（NCT02452424）中的CSF1R小分子抑制劑pexidartinib（PLX3397，Plexxikon）；以及胰腺腺癌（NCT03153410）、黑色素瘤（NCT03101254）和實體瘤（NCT02718911）中的抗CSF-1R抗體IMC-CS4（LY3022855，Lilly）；以及在晚期實體瘤（NCT02829723）中的口服獲得的CSF1R抑制劑BLZ945（4-[2((1R，2R)-2-羥基環己基氨基)-苯並噻唑-6-基氧基]-吡啶-2-羧酸甲基醯胺，Novartis）。
可以用於本發明的檢查點抑制劑包括NKG2A受體抑制劑。在臨床試驗中正在研究的NKG2A受體抑制劑包括：頭頸部腫瘤（NCT02643550）和慢性淋巴細胞性白血病（NCT02557516）中的抗NKG2A抗體monalizumab（IPH2201，Innate Pharma）。
在一些實施方案中，免疫檢查點抑制劑選自nivolumab、pembrolizumab、ipilimumab、avelumab、durvalumab、atezolizumab或pidilizumab。
在一個優選的實施方案中，抑制T細胞活化的蛋白質的拮抗劑選自抗PD-1和抗CTLA-4。
在一個優選的實施方案中，腫瘤免疫劑是CTLA-4拮抗劑，優選為CTLA-4抗體，更優選為ipilimumab或tremelimumab。
在一個更優選的實施方案中，抑制T細胞活化的蛋白質的拮抗劑是抗PD-1。在一個優選的實施方案中，抗PD-1是抗體或其抗原結合部分，優選的抗體選自由OPDIVO（nivolumab）、KEYTRUDA（pembrolizumab）、MEDI-0680（AMP-514； WO2012/145493）和pidilizumab（CT-011）組成的組。在另一個優選的實施方案中，抗PD-1是重組蛋白，其由PD-L2的胞外結構域（B7-DC）融合至IgG1的Fc部分組成，被稱為AMP-224。
在一個實施方案中，本發明的組合是本發明的組合的組分（i）和組分（ii）之間的綴合物，特別是在包含序列SEQ ID No：1的多肽或其功能等效變體與腫瘤免疫劑之間的綴合物。
在一些實施方案中，組分（i）和（ii）之間的綴合是經由不可切割的接頭。在一些實施方案中，組分（i）和（ii）之間的綴合是經由可切割的接頭。示例性不可切割的接頭和可切割的接頭描述於US8088387、US8142784、WO2013075048、US6630579、US8512707、US9120854、US9023351、US20160095938、US9446146、WO2005009369、US5773001、US6214345、US10111954、US8153768、US7829531、US20160082119、WO2018218004、US8568728、WO2015057699、US20170182181、US9198979中, 其各自的內容通過引用整體併入本文。
在另一方面，本發明涉及藥物組合物，其包含藥學有效量的本發明的組合以及藥學上可接受的賦形劑。
如在本發明中所使用的，表述“藥物組合物”涉及一種適於將預定劑量的一種或幾種治療有用的試劑給藥於其中細胞分裂不受控制的細胞、細胞群組、器官、組織或動物（例如癌症）的製劑。
本發明的藥物組合物包含藥學有效量的本發明的組合和藥物活性載體。本發明的藥物組合物包含包含序列SEQ ID NO：1的多肽、其功能等效變體、根據本發明的綴合物、編碼該多肽或綴合物的多核苷酸、包含該多核苷酸的載體、或能夠將多肽或綴合物分泌到培養基中的細胞，以及腫瘤免疫劑。用於本發明的藥物組合物中的SEQ ID NO：1的多肽的合適的功能等效變體、合適的綴合物、融合蛋白、多核苷酸、載體或細胞如上文所定義。
如本文所用，表述“藥學有效量”應理解為能夠提供治療效果的量，並且其可以由本領域技術人員通過常用手段來確定。可以組合在根據本發明的藥物組合物中的Omomyc多肽、其功能等效變體、綴合物、融合蛋白、多核苷酸、載體、細胞或腫瘤免疫劑的量會根據給藥受試者和特定的給藥模式而變化。本領域技術人員將理解，劑量還可以在Goodman和Goldman的“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第九版（1996），附錄II，第1707-1711頁以及Goodman和Goldman的“The Pharmacological Basis of Therapeutics”第十版（2001），附錄II，第475-493頁的指導下確定。
藥物組合物中一種或多種活性成分的合適劑量將取決於待治療的癌症類型、疾病的嚴重程度和進程、該組合物是否出於預防或治療目的給藥、先前的療法、患者的臨床病史和對肽或多肽的反應，以及主治醫師的診斷。
包含序列SEQ ID NO：1的多肽、其功能等效變體、融合蛋白、綴合物、多核苷酸、載體或細胞的量適合一次地或通過一系列治療給藥于患者。根據疾病的類型和嚴重程度，合適的劑量水準通常為約0.01mg/kg患者體重/天至500mg/kg患者體重/天，其可以單劑量或多劑量給藥。優選地，劑量水準為約0.1mg/kg/天至約250mg/kg/天、更優選為約0.5mg/kg/天至約100mg/kg/天。
在一個優選的實施方案中，第一組分的量為約3.75mg/kg受試者體重/天，優選每週給藥四次，優選經鼻內給藥。在一個優選的實施方案中，第一組分的量為約8mg/m2 /天至15mg/m2 /天，優選為10mg/m2 /天至12mg/m2 /天，更優選為11.25mg/m2 /天，優選每週給藥四次，優選經鼻內給藥。
在一個優選的實施方案中，第一組分的量為約50mg/kg受試者體重/天，優選每週給藥兩次，優選地經靜脈給藥。在一個優選的實施方案中，第一組分的量為約100mg/m2 /天至200mg/m2 /天，優選為125mg/m2 /天至175mg/m2 /天，優選為140mg/m2 /天至160mg/m2 /天，更優選為150mg/m2 /天，優選每週給藥兩次，優選地經靜脈注射。
合適的劑量水準可以是約0.01 mg/kg/天至250mg/kg/天、約0.05mg/kg/天至100mg/kg/天、或約0.1mg/kg/天至50mg/kg/天。在該範圍內，劑量可以是0.05mg/kg/天至0.5mg/kg/天、0.5mg/kg/天至5mg/kg/天、或5mg/kg/天至50mg/kg/天。對於口服給藥，優選地以包含1.0至1000毫克活性成分，特別是1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克活性成分的片劑形式提供組合物，用於對待治療的患者的劑量進行對症調整。化合物可以每天一至四次、優選每天一次或兩次的方案給藥。
在一個實施方案中，可以每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次、每週五次、每週六次、或每周七次給藥所述組合或組合物。在一個實施方案中，組合或組合物可以每週給藥一次。在另一個實施方案中，組合或組合物可以每週給藥兩次。在另一個實施方案中，組合或組合物可以每週給藥四次。在另一個優選的實施方案中，組合或組合物的第一組分每週給藥四次，並且組合或組合物的第二組分每週給藥一次。在另一個實施方案中，組合或組合物的第一組分每週給藥兩次，並且組合或組合物的第二組分每週給藥一次。
治療的持續時間可以是至少一周、至少兩周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至少八周、至少九周、至少十周、或更長時間。優選地，治療的持續時間至少為四周。在另一個實施方案中，治療的持續時間至少為三周。
腫瘤免疫劑的量取決於所用的具體試劑，並且可以是約0.01mg/kg受試者體重/天至約50mg/kg受試者體重/天，優選為約1mg/kg受試者體重/天至約25mg/kg受試者體重/天，一天一次或多次以獲得所需的治療效果。在一個優選的實施方案中，腫瘤免疫劑的量為約2.5mg/kg受試者體重/天或7.5mg/m2 /天，優選每週給藥一次，更優選經腸胃外給藥，甚至更優選經腹膜內給藥。在一個優選的實施方案中，腫瘤免疫劑的量為約5mg/kg受試者體重/天或15mg/m2 /天，優選每週給藥一次，更優選經腸胃外給藥，甚至更優選經腹膜內給藥。在另一個優選的實施方案中，腫瘤免疫劑的量為約10mg/kg受試者體重/天，或30mg/m2 /天，優選每週給藥一次，更優選經腸胃外給藥，甚至更優選腹膜內給藥。
根據本發明的藥物組合物，其包含第一組分（i），所述第一組分選自根據本發明的包含SEQ ID NO：1的多肽、其功能等效變體、融合蛋白、綴合物、多核苷酸、載體或細胞，以及和作為腫瘤免疫劑的第二組分（ii），其可以以單一制劑的形式（例如，以包含定量的每種組分的片劑或膠囊劑的形式），或另一方面可以以單獨的製劑形式出現，其後可以組合用於聯合、依序或單獨給藥。本發明的組合物還包括作為套組的一部分的製劑，其中組分被分別配製但包裝在同一容器中。本領域技術人員將理解，根據本發明的藥物組合物中的不同組分的製劑可以是相似的，換句話說，是類似地配製的（以片劑或丸劑形式），這允許它們通過相同途徑給藥。在分別配製本發明的不同組分的情況下，兩種組分可以泡罩（blister）形式存在。每個泡罩包含白天必須服用的藥物。如果藥物必須每天給藥數次，則可以將與每次給藥相對應的藥物放在泡罩的不同部分，優選地在泡罩的每個部分中記錄每天應給藥的時間。或者，可以不同地配製本發明的組合物的組分，使得不同的組分被不同地給藥。因此，有可能將第一組分配製為用於口服給藥的片劑或膠囊劑，並且將第二組分配製為用於經靜脈給藥，反之亦然。技術人員可以根據在每種具體情況下使用的抗腫瘤劑以及期望的適應症來調節作為根據本發明的組合或藥物組合物的一部分的組分之間的比例。因此，本發明設想了這樣的組合物，其中組分（i）和組分（ii）的量之間的比例可以為50：1至1：50，特別是20：1至1：20、1：10至10：1，或5：1至1：5。在一個更具體的實施方案中，量之間的比例範圍為1：1至1：5，優選為1：1至1：3。在更優選的實施方案中，該比例範圍為1：1至1：1.5，優選為1：1.3至1：1.4，更優選為1：1.34。在另一個優選的實施方案中，該比例範圍為1：1至1：2.8，優選為1：2.6至1：2.7，更優選為1：2.67。在另一個具體實施方案中，量之間的比例為30：1至5：1，優選為30：1至8：1，更優選為25：1至15：1，更優選為20：1至10：1。在一個實施方案中，該比例是20：1。在另一個實施方案中，該比例是10：1。
藥物組合物的組分或本發明的組合可以同時給藥。“同時給藥”包括兩種治療劑的共同給藥，而不管各個治療劑給藥的相對頻率或時間。因此，同時給藥包括兩種治療劑在相同時間和相同給藥頻率下的共同給藥。另外，同時給藥是指兩種治療劑的共同給藥，其中一種治療劑比另一種治療劑更頻繁地給藥。另外，同時給藥是指兩種治療劑的共同給藥，其中一種治療在另一種治療的給藥期間僅給藥一次。
在一個實施方案中，組分（i）經鼻內給藥，在另一個實施方案中，組分（i）經靜脈給藥。在另一個實施方案中，組分（ii）經腸胃外給藥，特別是經腹膜內給藥。
在一個優選的實施方案中，本發明的組合或藥物組合物的組分（i）經鼻內給藥，而腫瘤免疫劑經腸胃外給藥，特別是經腹膜內或靜脈給藥。對於鼻內給藥本發明的組合或組合物的組分（i）的優選劑量，優選多肽或其功能等效變體、融合蛋白、或綴合物的優選劑量範圍為0.01mg/kg/天至250mg/kg/天（其可以以單劑量或多劑量給藥），更優選每天0.1mg/kg/天至約100mg/kg/天。用於經腹膜內給藥的腫瘤免疫劑的優選劑量為0.01mg/kg至150mg/kg，更優選為0.1mg/kg至100mg/kg。
在另一個實施方案中，本發明的組合或藥物組合物的組分（i）是經靜脈給藥的，而腫瘤免疫劑是經腸胃外給藥的，特別是經腹膜內或靜脈給藥。
本發明的藥物組合物還可以包含一種或幾種另外的化合物，用於預防和/或治療其中細胞分裂不受控制的病狀，例如癌症。所述另外的化合物，例如抗腫瘤劑可以作為獨立實體形成藥物組合物的一部分。在一個優選的實施方案中，本發明的組合或藥物組合物包含一種或多種抗腫瘤劑，其選自由細胞毒性劑、抗血管生成劑、抗轉移劑和抗增殖劑組成的組。
本發明的藥物組合物還包含一種或幾種另外的藥學上可接受的賦形劑。“藥學上可接受的賦形劑”應理解為表示用於併入活性成分的療效上無活性的物質，並且從藥理學/毒理學的角度來看對於患者是可接受的，以及從物理/化學的角度來看在組成、製劑、穩定性、患者接受程度和生物利用度方面對於製造它的藥物化學家來說是可接受的。賦形劑可以是載體。如本文所用，“載體”是指用於改善藥物組合物中活性成分的遞送和有效性的任何物質。在一個優選的實施方案中，載體不能夠將組分（i）和/或（ii）直接遞送至細胞的細胞質，即載體不能與靶細胞的質膜融合。藥學上可接受的載體的實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一種或多種及其組合。在許多情況下，在組合或組合物中優選地包含等張劑，例如糖、多元醇（如甘露醇、山梨醇）或氯化鈉。藥學上可接受的載體還可以包含少量的輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，其延長了形成本發明的組合或組合物一部分的組分的貨架期或有效性。合適的載體的實例在文獻中是眾所周知的（參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第19版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1995）。載體的實例不受限制地為一系列糖，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇和麥芽糖醇；一系列澱粉，例如玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉和馬鈴薯澱粉；一系列纖維素，例如纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和羥丙基甲基纖維素；以及一系列填充劑，例如明膠和聚乙烯吡咯烷酮。在一些情況下，可以添加崩解劑，例如交聯的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或藻酸鈉。
藥物上可接受的賦形劑的數量和性質取決於期望的劑型。藥物上可接受的賦形劑是本領域技術人員已知的（Faulí y Trillo C. (1993) “Tratado de Farmacia Galénica”, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid）。所述組合物可以通過現有技術已知的傳統方法製備（“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20th edition (2003) Genaro A.R., ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, US）。
對於包含作為核酸分子的試劑的藥物組合物，核酸分子可以存在于本領域普通技術人員已知的多種遞送系統中的任何一種中，包括核酸、細菌、病毒、和哺乳動物表達系統，如本文提供的重組表達構建體。將DNA併入這種表達系統的技術是本領域普通技術人員眾所周知的。所述DNA也可以是“裸的”，例如在Ulmer等人，Science 259：1745-49，1993中所述，和由Cohen，Science 259：1691-1692，1993所綜述。通過將DNA包被到被有效地轉運到細胞中的生物可降解的珠上來增加裸DNA的攝取。
核酸分子可以根據本領域中所述的幾種方法中的任何一種被遞送到細胞中(參見例如 Akhtar等人，Trends Cell Bio. 2:139 (1992)；Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer等人，Mol. Membr. Biol. 16:129-40 (1999)；Hofland和Huang, Handb. Exp. Pharmacol. 137:165-92 (1999)；Lee等人，ACS Symp. Ser. 752:184-92 (2000)；美國專利No. 6,395,713；國際專利申請公開No. WO 94/02595)；Selbo等人，Int. J. Cancer 87:853-59 (2000)；Selbo等人，Tumour Biol. 23:103-12 (2002)；美國專利申請公開No. 2001/0007666, 以及No.2003/077829)。本領域技術人員已知的此類遞送方法包括但不限於：包封在脂質體內、通過離子電滲療法、或通過併入其他載體例如生物可降解的聚合物、水凝膠、環糊精（參見，例如Gonzalez等人，Bioconjug. Chem. 10: 1068-74 (1999)；Wang等人，國際專利公佈No.WO03/47518和No.WO03/46185）；聚（乳酸-共-乙醇酸）酸（PLGA）和PLCA微球（也可用於遞送肽和多肽以及其他物質）（參見，例如，美國專利No.6,447,796；美國專利申請公佈No.2002/130430）；生物可降解的納米膠囊；和生物粘附微球、或通過蛋白質載體（國際申請公佈No.WO00/53722）。在另一個實施方案中，核酸分子也可以與聚乙烯亞胺及其衍生物（例如聚乙烯亞胺-聚乙二醇-N-乙醯半乳糖胺（PEI-PEG-GAL）或聚乙烯亞胺-聚乙二醇-三-N-乙醯半乳糖胺（PEI-PEG-triGAL）衍生物）配製或複合（也參見例如美國專利申請公開No.2003/0077829）。
在一個具體的實施方案中，當根據本發明的化合物包含核酸時，可以將藥物組合物配製成旨在用於基因療法的組合物；示例性而非限制地，藥物組合物可以包含病毒或非病毒載體，其包含合適的多核苷酸或基因構建體。示例性而非限制地，所述載體可以是病毒的（例如基於逆轉錄病毒、腺病毒等），或非病毒的（例如ADN-脂質體、ADN-聚合物、ADN-聚合物-脂質體複合物等）[參見“Nonviral Vectors for Gene Therapy”, 由Huang, Hung和Wagner編輯, Academic Press (1999)]。所述載體含有相應的多核苷酸或基因構建體，可以通過常規方法直接給藥到受試者。或者，所述載體可以用於離體轉化、或轉染、或感染細胞，例如哺乳動物細胞，包括人，隨後將其植入人體或動物中以獲得期望的治療效果。為了向人體或動物給藥，將所述細胞配製成對細胞活性沒有不利影響的合適培養基。
本發明的組合或藥物組合物可以通過任何類型的合適途徑給藥，例如通過口服途徑、局部途徑、通過吸入、或腸胃外途徑，從而配製期望劑型所需的藥學上可接受的賦形劑將被包括。其他給藥途徑可以是經直腸、經腦池內或經陰道內。所述組合或藥物組合物的優選給藥途徑是靜脈途徑。
“口服途徑”應理解為藥物組合物在吞咽後併入生物體中。在一個具體的實施方案中，本發明的藥物組合物可以是適合通過口服途徑給藥的劑型，無論是固體還是液體。適於通過口服途徑給藥的劑型可以是片劑、膠囊劑、糖漿劑或溶液，並且可以包含本領域已知的任何常規賦形劑，例如粘結劑，例如糖漿劑、阿拉伯膠、明膠、山梨醇或聚乙烯吡咯烷酮；填充劑，例如乳糖、糖、玉米澱粉、磷酸鈣、山梨醇或甘氨酸；壓制的潤滑劑，例如硬脂酸鎂；崩解劑，例如澱粉、聚乙烯吡咯烷酮、澱粉的乙醇酸鈉或微晶纖維素；或藥學上可接受的潤濕劑，例如十二烷基硫酸鈉。固體的口服組合物可以通過常規的混合、填充或壓制方法製備。重複的混合操作可以用於將活性劑完全分散在使用大量填充劑的那些組合物中。所述操作是本領域常規的。可以例如通過濕法或幹法制粒來製備片劑，並任選地根據常規藥學實踐中已知的方法將其包衣，特別是用腸溶衣。
另一方面，“局部途徑”應理解為通過非全身途徑給藥，並且包括將本發明的藥物組合物施用於表皮的外部、口腔中，以及將所述組合物滴入耳朵、眼睛和鼻子中，並且不會顯著地進入血液。用於本發明的化合物的局部或透皮給藥的劑型包括軟膏劑、糊劑、霜劑、洗劑、凝膠劑、散劑、溶液、噴霧劑、吸入劑或貼劑。
眼科製劑、滴耳劑和滴眼劑也被認為在本發明的範圍內。另外，本發明考慮了透皮貼劑的使用，透皮貼劑具有提供化合物向身體的可控遞送的附加優點。這種劑型可以通過將化合物溶解或分散在適當的介質中來製備。吸收促進劑也可用于增加化合物穿過皮膚的流量。可以通過提供速率控制膜或通過將化合物分散在聚合物基質或凝膠中來控制速率。
在一個實施方案中，所述組合或藥物組合物經全身給藥。
“全身給藥”理解為通過口服途徑、靜脈途徑、腹膜內途徑和肌內途徑給藥。治療或預防作用所需的組分（i）和（ii）的量自然會根據所選化合物、待治療的疾病的性質和嚴重性、以及患者而變化。
在另一個實施方案中，所述組合或藥物組合物經鼻內給藥。在一個優選的實施方案中，鼻內給藥通過滴注或鼻吸入進行。
“吸入”應理解為通過鼻內途徑和口服吸入給藥。可以通過常規技術製備適用於所述給藥的劑型，例如氣霧劑或計量吸入器中的製劑。在一個實施方案中，給藥途徑是鼻內途徑。
如本文所用，術語“腸胃外”包括通過靜脈途徑、腹膜內途徑、肌內途徑、或皮下途徑給藥。腸胃外給藥的皮下、肌內和靜脈劑型通常是優選的。
在一個實施方案中，本發明的組合或藥物組合物可以適合於其腸胃外給藥，例如合適劑量單位形式的無菌溶液、混懸液或凍幹產品。適合於其可注射使用的組合或藥物組合物包括無菌水溶液（當它們溶于水中）、或分散體、以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散體的無菌散劑。對於其通過靜脈途徑給藥，一些合適的載體包括用磷酸鹽緩衝的鹽溶液（PBS）。在所有情況下，組合或組合物必須是無菌的，並且必須是流體，以到達易於注射的點。它必須在製備和儲存條件下穩定，並且必須受到保護以免受諸如細菌和真菌等微生物的污染。載體可以是溶劑或分散介質，其包含例如水、乙醇、藥學上可接受的多元醇（例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇）及其合適的混合物。例如，可以通過使用包衣如卵磷脂、通過保持分散情況下所需的顆粒大小、以及通過使用表面活性劑來保持適當的流動性。可以通過各種抗菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等，來實現對微生物作用的預防。在許多情況下，在組合物中優選地包含等張劑，例如糖、多元醇（如甘露醇、山梨醇）或氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可以通過包含延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠來實現。
注射用無菌溶液可以根據需要通過將所需量的活性化合物與上述成分中的一種或組合一起併入合適的溶劑中，然後通過無菌膜過濾滅菌來製備。通常，通過將活性化合物併入無菌載體中來製備分散體，所述無菌載體包含基礎分散介質和來自先前列出的那些的所需的其餘成分。在用於製備注射用無菌溶液的無菌散劑的情況下，優選的製備方法是真空乾燥和凍幹，這產生了來自先前過濾的無菌溶液的具有活性成分加上任何所需的附加成分的散劑。
本發明的組合或藥物組合物可以適當地通過脈衝輸注來給藥，使用例如遞減劑量的組合物。優選地，劑量是通過注射，更優選地是通過靜脈注射或皮下注射來給藥的，2部分地取決於給藥是急性還是慢性。在一個優選的實施方案中，PD-1拮抗劑通過輸注給藥。
或者，如上所述，組合物的不同組分被不同地給藥。
因此，在一個實施方案，本發明的組合或組合物的組分（i），優選為多肽或功能等效變體或綴合物，經鼻內給藥，而腫瘤免疫劑經全身給藥。
在另一個優選的實施方案中，組合或組合物的組分（i），優選多肽或其功能等效變體，或組合物的綴合物，經鼻內給藥或通過吸入給藥。
用於鼻內給藥和肺內給藥的組合物的劑型優選為液體、混懸液或固體。混懸液是含有分散在液體載劑中的固體顆粒的液體製劑。劑型優選是計量的。例如，計量的滴劑/噴霧劑是指包括滴劑/噴霧劑的分配器遞送包含計量的劑量（預定量）的根據本發明的用途的組合物的滴劑/噴霧劑。
在鼻內給藥途徑的背景下，一種優選的劑型包括滴鼻劑。滴劑大部分沉積在鼻子的後部，因此迅速移入鼻咽部。關於滴劑的問題通常是如何精確地控制藥物的劑量，這對於組合物的給藥特別重要。
可以給藥本發明的藥物組合物的另一種鼻內劑型是鼻噴霧劑。鼻噴霧劑通常在不加壓的分配器中包含溶解或懸浮在溶液中或賦形劑（例如防腐劑、粘度調節劑、乳化劑、緩衝劑）的混合物中的綴合物。鼻噴霧劑具有數個優點，包括遞送設備的簡潔性、便利性、使用的簡便性、以及25pL至200pL的輸送劑量的準確性。它們沉積在鼻子的前部，並通過粘膜纖毛清除而緩慢進入鼻咽部。本文所用的鼻噴霧劑可以是液體或混懸液。
另一種鼻內劑型是鼻氣霧劑。鼻氣霧劑與鼻噴霧劑的組合物分配方法不同：在氣霧劑中，由於壓力過量而分配化合物，並通過閥門釋放。在噴霧劑中，通過微型泵桶來被迫分配化合物，而小瓶中的壓力類似於大氣壓。 氣霧劑具有與噴霧劑相似的優點。
替代地，根據本發明的組合物可以優選地通過鼻乳劑、軟膏劑、凝膠劑、糊劑或霜劑給藥。這些是應用於鼻粘膜的高粘度溶液或混懸液。
由於可以有效遞送至鼻粘膜的組合物的體積有限，液體鼻內劑型如相應的靜脈劑型通常具有較高的濃度。當物質變得難溶或以液體形式不穩定時，可以使用散劑來給藥本發明的組合物。散劑的其他優點是它們不需要防腐劑，並且與液體製劑相比通常具有更高的穩定性。鼻內散劑的主要局限性在於其對鼻粘膜的刺激作用。
在肺內給藥的上下文中的一種劑型是吸入氣霧劑。吸入氣霧劑通常在壓力下包裝，並且包含根據本發明的組合物，該組合物在閥系統被啟動時被釋放進入呼吸道，特別是肺。釋放的氣溶膠是空氣或其他氣體中的細小固體顆粒（混懸液）或液滴（溶液）的膠狀體。因此，氣霧劑可以是溶液或混懸氣霧劑。液滴或固體顆粒的直徑優選地小於100 pm、更優選小於10 pm、最優選小於1 pm。
肺內給藥的另一種劑型是吸入噴霧劑。吸入噴霧劑通常是水基的，並且不含任何推進劑。通過口服吸入來將綴合物遞送至肺部。
霧化吸入溶液和混懸液也可以用於通過肺內途徑遞送綴合物。霧化吸入溶液和混懸液通常是含有根據本發明的組合物的水基製劑。霧化吸入溶液和混懸液通過口服吸入將所述組合物遞送到肺部，以產生全身效果，並與霧化器一起使用。
乾粉吸入是氣霧劑吸入的替代。組合物通常包括在用於手動裝載的膠囊中或吸入器中。乾粉通常通過吸入器經口服吸入遞送至肺部。這裡使用的乾粉可以未攙水（neat）配製的。未攙水的的製劑中僅包含藥物或准僅包含藥物，如作為噴霧（spry）的乾粉。本文所用的乾粉還可以與載體例如乳糖一起配製。
肺內劑型優選是計量的，即以預定量遞送至肺部。
在本發明的上下文中，用於鼻內遞送的裝置包括噴霧泵系統、用於遞送滴劑的吸液管、定量噴霧泵，鼻加壓定量吸入器、噴粉系統、呼吸致動的粉末吸入器和鼻粉吹入器。鼻內遞送裝置可以填充有單一劑量或多劑量的鼻內製劑。
使用肺內途徑，可以用定量吸入器給藥綴合物。定量吸入器（MDI）可以提供綴合物的細霧，其空氣動力學粒徑通常小於5 pm。
乾粉吸入器可以替代地用於將組合物遞送至肺內。乾粉吸入器將散劑製成單劑量或多劑量散劑。
用於肺內遞送的另一裝置是包括超聲的霧化器和噴氣霧化器。在超聲霧化器中，超聲波是在超聲波霧化器室中通過在電激發時振動的陶瓷壓電晶體形成的。這會在溶液表面生成氣霧劑雲。當壓縮空氣被迫通過孔口時，會產生由噴氣霧化器產生的氣霧劑。液體可以從垂直噴嘴中抽出（伯努利效應）以與使用擋板霧化的空氣噴射流混合，以促進氣霧劑雲的形成。
在一個實施方案中，本發明的組合或藥物組合物的每種組分均與載體一起製備，所述載體會保護組分，特別是組分（i），免於從體內快速清除（例如控釋製劑），包括植入物和微膠囊化的給藥系統。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。製備所述製劑的方法對本領域技術人員而言是清楚的。該材料也可以在Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.商業獲得。
持續釋放組合物還包括懸浮在合適製劑中的晶體的製備，所述合適製劑可以使晶體保持懸浮。當通過皮下或腹膜內途徑注射這些製劑時，可以產生持續釋放作用。其他組合物還包括捕獲在脂質體中的組分（i）和/或（ii）。含有此類組分的脂質體是通過已知方法製備的，例如Epstein等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692；Hwang等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034；EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046；EP 143,949。在一個優選的實施方案中，組分（i）和/或（ii）包含在脂質體內，優選兩種組分都包含在脂質體內，更優選在同一脂質體內。
儘管事實上本發明的Omomyc、其功能等效變體、綴合物和融合蛋白能夠跨生物膜易位，但將Omomyc、其功能等效變體、綴合物、多核苷酸、載體或細胞中的任何一種配製在納米顆粒中是可能的。納米顆粒可以有助於保持生物流體中組分的完整性，直到其到達靶器官為止。此外，在包含組分（ii）或其他抗腫瘤劑的組合物的情況下，組合物的包封可以減少由抗腫瘤劑引起的次級反應。另外，納米顆粒也可以被修飾以便包括允許納米顆粒能夠靶向感興趣器官的部分。以此方式，本發明的組合或組合物的組分（i）將在靶器官附近遞送，從而促進組分（i）進入需要其生物活性的細胞內部。
因此，在另一個實施方案中，提供本發明的組合或組合物的組分（i）形成納米顆粒的一部分。在另一個實施方案中，提供本發明的組合或組合物的兩個組分形成納米顆粒的一部分，優選將兩個組分提供在同一納米顆粒內部。
如本文所用，術語“納米顆粒”是指尺寸範圍為1nm至1000nm的任何材料。在一些實施方案中，納米顆粒的尺寸範圍為2nm至200nm，優選範圍為2nm至150nm，甚至更優選範圍為2nm至100nm。可以用於本發明的納米顆粒包括以下納米顆粒：諸如脂質基的納米顆粒、超順磁性納米顆粒、納米殼、半導體納米晶體、量子點、聚合物基的納米顆粒、矽基的納米顆粒、二氧化矽基的納米顆粒、金屬基納米顆粒、富勒烯和納米管。分子可以包埋在納米顆粒基質中，或可以吸附在其表面上，優選分子包埋在納米顆粒中。
在一個優選的實施方案中，納米顆粒是脂質體。
靶向遞送可以通過添加配體來實現，而不會損害納米顆粒遞送其內容物的能力。預期這將使得其能夠遞送至特定的細胞、組織和器官。基於配體的遞送系統的靶向特異性基於配體受體在不同細胞類型上的分佈。靶向配體可以與納米顆粒非共價或共價結合，並且可以通過本文討論的多種方法與納米顆粒綴合。
可以用於靶向納米顆粒的蛋白質或肽的實例包括轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、TGF-β、神經生長因子、白蛋白、HIV Tat肽、RGD肽、和胰島素，以及其他。
將理解的是，納米顆粒中的本發明製劑不旨在或不僅僅地旨在促進組分（i）和/或（ii）進入細胞內部，而且為了保護組分（i）和/或（ii）避免降解和/或用於促進納米顆粒靶向目標器官。
在一個實例中，納米顆粒可以由生物可降解的聚合物例如聚（氰基丙烯酸丁酯）（PBCA）製成。元素納米顆粒的實例包括碳納米顆粒和氧化鐵納米顆粒，其然後可以用油酸（OA）-普朗尼克（R）包被。在這種方法中，將藥物（例如，疏水性或不溶于水的藥物）載入到納米顆粒中。其他納米顆粒由二氧化矽製成。
納米顆粒可以由任何有用的聚合物形成。聚合物的實例包括：生物可降解的聚合物，例如，聚（氰基丙烯酸丁酯）、聚（丙交酯）、聚（乙交酯）、聚-s-己內酯、聚（丁丁二酸丁二醇酯）、聚（己二酸丁二醇酯）和聚（對二氧環己酮）；聚（乙二醇）；聚-2-羥乙基甲基丙烯酸酯（聚（HEMA））；共聚物，例如，聚（丙交酯-共-乙交酯）、聚（丙交酯）-聚（乙二醇）、聚（聚（乙二醇）氰基丙烯酸酯-共十六烷基氰基丙烯酸酯）、和聚[HEMA-共-甲基丙烯酸]；蛋白質，例如，纖維蛋白原、膠原蛋白、明膠和彈性蛋白；以及多糖，如支鏈澱粉、直鏈澱粉和殼聚糖。
其他納米顆粒包括固體脂質納米顆粒（SLN）。用於固體脂質納米顆粒的脂質分子的實例包括硬脂酸和改性的硬脂酸，例如硬脂酸-PEG 2000；大豆卵磷脂；以及乳化蠟。固體脂質納米顆粒可以任選地包含其他組分，包括表面活性劑，例如Epicuron(R) 200、poloxamer 188（Pluronic(R) F68）、Brij 72、Brij 78、聚山梨酯80（Tween 80）；和鹽，例如牛磺膽酸鈉。可以通過針對脂質體討論的許多方法將試劑引入到固體脂質納米顆粒中，其中這些方法還可以包括高壓均質化和微乳液的分散。
納米顆粒還可以包括納米尺寸的微膠粒。微膠粒可以由本文所述的任何聚合物形成。用於形成微膠粒的示例性聚合物包括嵌段共聚物，例如聚（乙二醇）和聚（ε-己內酯）。（例如，包括ε-己內酯和α-甲氧基-ω-羥基-聚（乙二醇）的PEO-b-PCL嵌段共聚物）。
在某些實施方案中，納米顆粒的性質通過用表面活性劑包被而改變。可以使用任何生物相容性表面活性劑，例如，聚山梨酯表面活性劑，例如聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60和聚山梨酯80（Tween 80）；Epicuron（R）200；泊洛沙姆（poloxamer）表面活性劑，例如188（Pluronic(R) F68）泊洛沙姆poloxamer908和1508；和Brij表面活性劑，例如Brij 72和Brij 78。
納米顆粒可以任選地被改性為包括親水性聚合物基團（例如，聚（乙二醇）或聚（丙二醇）），例如，通過將親水性聚合物基團共價附接於表面，或通過使用包含這種親水性聚合物基團的聚合物（例如，聚[甲氧基聚（乙二醇）氰基丙烯酸酯-共-十六烷基氰基丙烯酸酯]）。納米顆粒可以任選地交聯，這對於蛋白質基的納米顆粒可以特別有用。
在另一個實施方案中，本發明的藥物組合物是納米乳劑。如本文所用，“納米乳劑”是指液滴（或顆粒）的膠態分散體，其至少一些液滴的直徑為納米尺寸範圍。納米乳劑由水相中富含omega-3、omega-6或omega-9脂肪酸的油組成，並通過兩親性表面活性劑進行熱力學穩定化，該兩親性表面活性劑構成介面膜，使用高剪切微流化工藝生產，通常液滴的直徑範圍為約80nm至220nm。
本發明的治療用途
在一個方面，本發明涉及本發明的組合或藥物組合物，其用於藥物。
在另一個方面，本發明涉及本發明的組合或藥物組合物，其用於預防和/或治療癌症。
在另一個方面，本發明涉及用於製備預防和/或治療癌症的藥物的本發明的組合或藥物組合物。
在另一方面，本發明還涉及預防和/或治療癌症的方法，該方法包括向有需要的受試者給藥治療有效量的本發明的組合或藥物組合物。
在另一方面，本發明還涉及通過將T細胞募集到腫瘤部位來預防和/或治療癌症的方法，該方法包括向有此需要的受試者給藥治療有效量的本發明的組合或藥物組合物。在一個實施方案中，募集到腫瘤部位的T細胞是活化的CD4 T細胞，更具體是CD4+ PD-1+ T細胞，甚至更具體的是CD4+ PD-1+ Tim-3- T細胞。在另一個實施方案中，募集到腫瘤部位的T細胞是CD4+ PD-1+ Tim-3+ T細胞。在另一個實施方案中，募集到腫瘤部位的T細胞是CD8 T細胞，更具體是CD8+ PD-1+ T細胞。在另一個實施方案中，募集到腫瘤部位的T細胞是CD3+ T細胞。在另一個實施方案中，募集到腫瘤部位的T細胞是CD3+ CD4+ T細胞。在另一個實施方案中，募集到腫瘤部位的T細胞是Th1/Th17細胞，具體是Th1/Th17 PD-1+ 細胞，更具體是CD4+ IFN+ IL-17+ T細胞，甚至更具體是CD4+ PD-1+ IFN+ IL-17+ T細胞。在另一個實施方案中，募集到腫瘤部位的T細胞是CD45+ T細胞。
在另一方面，本發明還涉及通過誘導T調節性細胞的擴增來預防和/或治療癌症的方法，該方法包括向有此需要的受試者給藥治療有效量的本發明的組合或藥物組合物。
在另一方面，本發明還涉及通過腫瘤內CD4+ 和CD8+ 細胞誘導IFN-γ 產生來預防和/或治療癌症的方法，該方法包括向有此需要的受試者給藥治療有效量的本發明的組合或藥物組合物。
在優選的實施方案中，根據本發明的預防或治療方法涉及直接使用包括包含Omomyc的多肽、其功能等效變體、綴合物、或融合蛋白的組合或組合物。因此，在一個優選的實施方案中，根據本發明的預防或治療方法不涉及給藥編碼包含Omomyc的多肽、其功能等效變體、或融合蛋白的核酸，也不涉及給藥編碼所述核酸的載體或包含所述核酸的細胞。
“預防”應理解為在疾病的初期或早期給藥本發明的組合或組合物，或也預防其發作。
術語“治療”用於表示在臨床症狀出現之前或之後給藥本發明的組合或組合物以控制疾病的進展。疾病進展的控制被理解為有益或預望的臨床結果，包括但不限於症狀的減輕、疾病持續時間的減少、病理病況的穩定（特別是避免額外的損害）、延緩疾病的進展、改善病理病況和緩解（部分和完全）。與不應用該治療的預期生存相比，控制疾病進展還涉及生存期的延長。在一個優選的實施方案中，以健康的肺/胸體積比來測量疾病進展的控制。在另一個實施方案中，疾病進展的控制被測量為腫瘤體積的減少。
術語“癌症”是指由以下特徵的疾病：不受控制的細胞分裂（或以增加的存活或凋亡抗性）、所述細胞侵入其他鄰近組織（侵襲）或擴散至其中細胞通常不通過淋巴管和血管定位（轉移）的人體的其他區域的能力。根據腫瘤是否可以通過侵襲和轉移而擴散，將其分類為良性或惡性：良性腫瘤是不能通過侵襲或轉移而擴散的腫瘤，即它們僅在局部生長；而惡性腫瘤是能夠通過侵襲和轉移擴散的腫瘤。根據本發明的方法可用於治療局部和惡性腫瘤。
在一個實施方案中，癌症包括但不限於白血病（例如，急性白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性成髓細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、急性髓單核細胞白血病、急性單核細胞白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性粒細胞白血病、慢性淋巴細胞性白血病）、毛細胞白血病、真性紅細胞增多症、淋巴瘤（例如，霍奇金氏（Hodgkin）病或非霍奇金氏病）、AIDS相關的白血病、在華氏（Waldenstrom）巨球蛋白血症、多發性骨髓瘤、重鏈疾病、以及實體瘤例如肉瘤和癌（例如，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤（mendotheliosarcoma）、淋巴管肉瘤、淋巴管內內皮肉瘤（lymphangioendotheliosarcoma）、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏（Ewing）瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、卡波西（Kaposi）肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、膽道癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、包括鱗狀細胞癌的口腔癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、畸胎瘤、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威姆氏（Wilm）腫瘤、宮頸癌、子宮癌、睾丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、包括鮑恩氏（Bowen）病和佩吉特氏（Paget）病在內的上皮內瘤、神經膠質瘤、膠質瘤、星形細胞瘤、多形性成膠質細胞瘤（GBM，也稱為惡性膠質瘤）、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突膠質細胞瘤、神經鞘瘤、神經纖維肉瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤和視網膜母細胞瘤。
在一些實施方案中，癌症是膠質瘤、星形細胞瘤、多形性成膠質細胞瘤（GBM，也稱為惡性膠質瘤）、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突膠質細胞瘤、神經鞘瘤、神經纖維肉瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤和視網膜母細胞瘤。
在某些實施方案中，癌症是聽神經瘤、星形細胞瘤（例如，I級–毛細胞型星形細胞瘤、II級–低級星形細胞瘤、III級–間變型星形細胞瘤、或IV級–成膠質細胞瘤（GBM））、脊索瘤、CNS淋巴瘤、顱咽管瘤、腦幹膠質瘤、室管膜瘤、混合性膠質瘤、視神經膠質瘤、室管膜下瘤、成神經管細胞瘤、腦膜瘤、轉移性腦瘤、少突膠質細胞瘤、垂體瘤、原始神經外胚層（PNET）瘤、或神經鞘瘤。在一些實施方案中，癌症是在兒童中比成人更常見的類型，例如腦幹膠質瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、青少年毛細胞型星形細胞瘤（JPA）、成神經管細胞瘤、視神經膠質瘤、松果體瘤、原始神經外胚層腫瘤（PNET）、或橫紋肌樣瘤。在一些實施方案中，患者是成年人。在一些實施方案中，患者是兒童或兒科患者。
在另一個實施方案中，癌症包括但不限於間皮瘤、肝膽癌（肝膽管）、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內黑色素瘤、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、胃腸道癌（胃部、結腸直腸、和十二指腸）、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、睾丸癌、慢性或急性白血病、慢性粒細胞白血病、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、非霍奇金氏淋巴瘤、脊柱腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、腎上腺皮質癌、膽囊癌、多發性骨髓瘤、膽管癌、纖維肉瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、或上述一種或多種癌症的組合。
在一些實施方案中，所述癌症選自：肝細胞癌、卵巢癌、卵巢上皮癌或輸卵管癌；乳頭狀漿液性囊腺癌或子宮乳頭狀漿液性癌（UPSC）；前列腺癌；睾丸癌；膽囊癌；肝膽管癌（hepatocholangiocarcinoma）；軟組織和骨滑膜肉瘤；橫紋肌肉瘤；骨肉瘤；軟骨肉瘤；尤文氏（Ewing）肉瘤；間變型甲狀腺癌；腎上腺皮質腺瘤；胰腺癌；胰腺導管癌或胰腺腺癌；胃腸道/胃癌（GIST）；淋巴瘤；頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）；唾液腺癌；膠質瘤或腦癌；神經纖維瘤-1相關的惡性外周神經鞘膜瘤（MPNST）；在華氏巨球蛋白血症；或成神經管細胞瘤。
在一些實施方案中，所述癌症選自：肝細胞癌（HCC）、肝母細胞瘤、結腸癌、直腸癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、輸卵管癌、乳頭狀漿液性囊腺癌、子宮乳頭狀漿液性癌（UPSC）、肝膽管癌、軟組織和骨滑膜肉瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、間變型甲狀腺癌、腎上腺皮質腺瘤、胰腺癌、胰腺導管癌、胰腺腺癌、膠質瘤、神經纖維瘤-1相關的惡性外周神經鞘膜瘤（MPNST）、在華氏巨球蛋白血症、或成神經管細胞瘤。
在一些實施方案中，癌症是實體瘤，例如肉瘤、癌或淋巴瘤。實體瘤通常包括異常的組織塊，通常不包括囊腫或液體區域。在一些實施方案中，所述癌症選自：腎細胞癌或腎癌；肝細胞癌（HCC）、或肝母細胞瘤、或肝癌；黑色素瘤；乳腺癌；大腸癌、或結直腸癌；結腸癌；直腸癌；肛門癌；肺癌，例如非小細胞肺癌（NSCLC）或小細胞肺癌（SCLC）；卵巢癌、卵巢上皮癌或輸卵管癌；乳頭狀漿液性囊腺癌或子宮乳頭狀漿液性癌（UPSC）；前列腺癌；睾丸癌；膽囊癌；肝膽管癌（hepatocholangiocarcinoma）；軟組織和骨滑膜肉瘤；橫紋肌肉瘤；骨肉瘤；軟骨肉瘤；尤文氏肉瘤；間變型甲狀腺癌；腎上腺皮質瘤；胰腺癌；胰腺導管癌或胰腺腺癌；胃腸道/胃癌（GIST）；淋巴瘤；頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）；唾液腺癌；膠質瘤或腦癌；神經纖維瘤-1相關的惡性外周神經鞘膜瘤（MPNST）；在華氏巨球蛋白血症；或成神經管細胞瘤。
在一些實施方案中，所述癌症選自：肝細胞癌（HCC）、肝母細胞瘤、結腸癌、直腸癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢腫瘤、輸卵管癌、乳頭狀漿液性囊腺癌、子宮乳頭狀漿液性癌（UPSC）、肝膽管癌、軟組織和骨滑膜肉瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、間變型甲狀腺癌、腎上腺皮質瘤、胰腺癌、胰腺導管癌、胰腺腺癌、膠質瘤、神經纖維瘤-1相關的惡性外周神經鞘膜瘤（MPNST）、在華氏巨球蛋白血症、或成神經管細胞瘤。
在一些實施方案中，所述癌症是肝細胞癌(HCC)。在一些實施方案中，所述癌症是肝母細胞癌。在一些實施方案中，所述癌症是結腸癌。在一些實施方案中，所述癌症是直腸癌。在一些實施方案中，所述癌症是卵巢癌，或卵巢腫瘤。在一些實施方案中，所述癌症是卵巢上皮癌。在一些實施方案中，所述癌症是輸卵管癌。在一些實施方案中，所述癌症是乳頭狀漿液性囊腺癌。在一些實施方案中，所述癌症是子宮乳頭狀漿液性癌(UPSC)。在一些實施方案中，所述癌症是膽管肝癌。在一些實施方案中，所述癌症是軟組織和骨滑膜肉瘤。在一些實施方案中，所述癌症是橫紋肌肉瘤。在一些實施方案中，所述癌症是骨肉瘤。在一些實施方案中，所述癌症是間變型甲狀腺癌。在一些實施方案中，所述癌症是腎上腺皮質癌。在一些實施方案中，所述癌症是胰腺癌，或胰腺導管癌。在一些實施方案中，所述癌症是胰腺腺癌。在一些實施方案中，所述癌症是膠質瘤。在一些實施方案中，所述癌症是惡性外周神經鞘膜瘤（MPNST）。在一些實施方案中，所述癌症是神經纖維瘤-1相關的MPNST。在一些實施方案中，所述癌症是在華氏巨球蛋白血症。在一些實施方案中，所述癌症是成神經管細胞瘤。
在一些實施方案中，癌症是與病毒相關的癌症，包括人體免疫缺損病毒相關的實體瘤，人乳頭瘤病毒(HPV)-16陽性不可治癒實體瘤，以及成人T細胞白血病，其是由人T細胞白血病病毒I型（HTLV-1）引起的，並且是CD4+ T細胞白血病的一種高度侵襲性形式，其特徵在於HTLV-1在白血病細胞中的克隆整合（請參見https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/ NCT02631746）；以及胃癌、鼻咽癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、頭頸部鱗狀細胞癌、以及梅克爾細胞癌的病毒相關腫瘤。(參見https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT02488759；也參見https://clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT0240886；https://clinicaltrials.gov/ct2/show/ NCT02426892)。
其他癌症是本領域普通技術人員已知的。
在一些實施方案中，癌症是黑色素瘤癌。在一些實施方案中，癌症是乳腺癌。
在另一個實施方案中，癌症是成膠質細胞瘤。
“成膠質細胞瘤”，也稱為膠質母細胞瘤和IV級星形細胞瘤，是最常見和最具侵襲性的癌症，始於腦內。
在一個優選的實施方案中，所述癌症是肺癌。
術語“肺癌”或“肺腫瘤”是指哺乳動物中以肺組織中的細胞生長不受調節為特徵的生理病況。術語肺癌是指肺部的任何癌症，包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌。在一個實施方案中，肺癌是非小細胞肺癌（NSCLC）。在另一個實施方案中，肺癌是小細胞肺癌（SCLC）。
如本文所用，術語非小細胞肺癌（NSCLC）是指一組異質性疾病，因為它們的預後和管理方法大致相同，並且根據世界衛生組織（World Health Organization）/國際肺癌研究協會（International Association for the Study of Lung Cancer）的組織學分類（Travis WD等人，Histological typing of lung and pleural tumours，第三版，Berlin: Springer-Verlag, 1999）包括：
（i）鱗狀細胞癌（SCC），占NSCLC的30％至40％，始於較大的呼吸管，但生長緩慢，這意味著這些腫瘤的尺寸在診斷時會有所不同。
（ii）腺癌是NSCLC最常見的亞型，占NSCLC的50％至60％，其始於肺的氣體交換表面附近，並且其包括亞型支氣管肺泡癌，其對治療的反應可能不同 。
（iii）大細胞癌是一種在肺表面附近生長的快速生長形式。它主要是排除性診斷，當進行更多研究時，通常將其重新分類為鱗狀細胞癌或腺癌。
（iv）腺鱗癌是一種包含兩種類型細胞的癌症：鱗狀細胞（排列在某些器官內的細扁平細胞）和腺體樣細胞。
（v）具有多形性、肉瘤性或肉瘤性成分的癌。這是一組罕見的腫瘤，反映了組織學異質性以及上皮和間充質分化的連續性。
（vi）類癌腫瘤是一種生長緩慢的神經內分泌性肺腫瘤，始於能夠回應於由神經系統提供的刺激而釋放激素的細胞。
（vii）唾液腺型癌始於位於肺大氣道內的唾液腺細胞中。
（viii）未分類的癌症包括不屬於上述任何肺癌類別的癌症。
在一個具體實施方案中，NSCLC選自肺部鱗狀細胞癌、肺部大細胞癌和肺部腺癌。
如本文所用，術語小細胞肺癌（SCLC）是指具有獨特且嚴格的形態學特徵的小細胞的增殖，包含緻密的神經分泌顆粒，其使得該腫瘤伴有內分泌/附腫瘤綜合征。大多數病例發生在較大的氣道（主支氣管和次支氣管）中。這些癌症生長迅速，並在疾病的早期擴散。
在一個甚至更優選的實施方案中，肺癌是腺癌，更優選是KRas驅動的肺腺癌，優選與KRAS基因突變相關的癌症。在一個實施方案中，KRAS基因中的突變是在位置12處的甘氨酸、在位置13處的甘氨酸或在位置61處的穀氨醯胺處的突變。在一個更優選的實施方案中，所述突變選自由G12S突變、G12V突變、G12D突變、G13D突變、G12C突變、G12R突變、G12F突變、G12I突變、G13C突變、G13R突變或Q61L突變組成的群組。在一個優選的實施方案中，所述突變是G12D突變。在另一個實施方案中，肺癌是KRasGD12 /p53驅動的肺癌，優選是KRasGD12 /p53驅動的NSCLC。
在一個實施方案中，癌症是原發性腫瘤。如本文所用，術語“原發性腫瘤”是指起源於其存在的位置或器官並且沒有從另一位置轉移到該位置的腫瘤。
在另一個實施方案中，所述癌症是癌症轉移。在本發明的上下文中，“轉移”被理解為癌症從其開始的器官向不同器官的增殖。它通常通過血液或淋巴系統發生。當癌細胞擴散並形成新的腫瘤時，後者被稱為繼發性或轉移性腫瘤。形成繼發性腫瘤的癌細胞類似於原始腫瘤的癌細胞。例如，如果乳腺癌擴散（轉移）到肺部，則繼發性腫瘤由惡性乳腺癌細胞形成。肺部的疾病是轉移性乳腺癌而不是肺癌。本發明的作者還觀察到，本發明的組合或組合物能夠減少細胞增殖，而不考慮癌症是否表現出Myc蛋白的表達或活性增加。在一個優選的實施方案中，待預防或治療的癌症是Myc誘導的癌症。
在一個實施方案中，癌症是實體瘤。
本發明的化合物和癌症類型的所有組合都包括在本發明中。
在一些實施方案中，本發明的組合或組合物抑制了腫瘤的生長。在一些實施方案中，相對於治療前腫瘤的尺寸（例如體積或塊），本發明的組合或組合物使得腫瘤尺寸減少至少5％、10％、25％、50％、75％、90％或99％。在一些實施方案中，相對于患者治療前的腫瘤數量，本發明的組合或組合物使得腫瘤數量減少至少5％、10％、25％、50％、75％、90％或99％。
如本文所用，“受試者”包括患有癌症、或表現出癌症症狀、或有患癌症或表現出癌症症狀的風險的任何動物。合適的受試者（患者）包括實驗室動物（例如小鼠、大鼠、兔子或豚鼠）、農場動物和家畜或寵物（例如貓或狗）。包括非人類靈長類動物，優選人類患者。優選地，受試者是哺乳動物，最優選地是人類。
用於預防和/或治療癌症的組合或組合物可以使用有效治療或減輕癌症的嚴重程度的任何量和任何給藥途徑來給藥。所需的確切量因受試者而異，這取決於受試者的物種、年齡和一般病況，疾病或病況的嚴重性、具體試劑、其給藥方式等。本發明的化合物優選地配製成劑量單位形式，以易於給藥和劑量均勻。如本文所用的表述“劑量單位形式”是指適用於待治療患者的試劑的物理離散單位元。然而，應該理解，本發明化合物和組合物的每日總用量將由主治醫師在合理的醫學判斷範圍內決定。任何特定患者或生物體的具體有效劑量水準將取決於多種因素，包括正在治療的病症和病症的嚴重程度；所用的特定化合物的活性；使用的具體組成；患者的年齡、體重、總體健康狀況、性別和飲食；給藥時間、給藥途徑和所用特定化合物的排泄速率；治療的持續時間；與所使用的特定化合物組合或同時使用的藥物，以及醫學領域眾所周知的類似因素。
在一個優選的實施方案中，本發明的組分（i），優選為多肽或其功能等效變體或綴合物，與組合或組合物的腫瘤免疫劑協同地相互作用以治療癌症（以達到治療效果）。
特別地，在一個更優選的實施方案中，用於預防和/或治療癌症的組合或藥物組合物是其中多肽或其功能等效變體或綴合物的量與腫瘤免疫劑在治療癌症中協同地相互作用的組合或藥物組合物。
術語“協同作用”或“協同地相互作用”可互換使用。協同作用大於通過將單個試劑在體外的實際作用相加所預測的累加作用。在體內，協同作用是生理作用，特別是治療作用，其大於通過將單個試劑在體內的實際作用相加所預測的累加作用。
因此，如果給藥兩種試劑，則如果兩種藥劑一起的實際效果大於通過將單個試劑的實際治療效果相加所預期的效果，則它們一起提供了可測量的生理效果，尤其是治療效果。具體地，當單獨的第一試劑提供一些可測量效果，單獨的第二試劑提供一些可測量效果，並且兩種試劑一起提供的可測量效果大於兩種單獨試劑的總和所提供的效果時，則提供了協同作用。更具體地，當單獨的第一試劑沒有提供可測量效果，單獨的第二試劑提供一些可測量效果，並且兩種試劑一起提供的可測量效果大於單獨的第二試劑所提供的效果時，則提供了協同作用。更特別地，當單獨的第一試劑和單獨的第二試劑都不提供任何可測量的效果，但是兩種試劑一起提供可測量的效果時，則提供了協同作用。由於組分（i）和（ii）協同作用，因此本發明的組合或組合物的組分（i）和/或（ii）的量可以少於僅使用其中一種作為治療劑的單一療法所需要的量。優選地，在這些組合或組合物中，一種或另一種治療劑的給藥劑量可以為0.01μg/kg體重/天至1.000μg/kg體重/天。
組合或組合物中存在的治療劑的量可以不大於在包含該治療劑作為唯一活性劑的組合物中通常給藥的量。優選地，本發明組合物中治療劑的量為正常存在於包含該試劑作為唯一治療活性劑的組合物中的量的約50％至100％的範圍。在一些實施方案中，一種治療劑以該試劑的正常給藥量的約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％或約95％給藥。如本文所用，短語“正常給藥”是指FDA批准的治療劑的量是根據每個FDA標籤插頁批准的劑量。
本發明的組合或組合物也可以與已知的治療方法組合使用，例如與化學療法、放射療法、免疫療法、光療、外科手術、激素、或它們的組合。
在一個優選的實施方案中，用於治療和/或預防癌症的組合或藥物組合物用於治療肺癌，優選NSCLC，更優選Kras驅動的癌症，甚至更優選KRASG12D 驅動的癌症，其中第一組分優選包含序列SEQ ID NO：1的多肽，更優選由SEQ ID NO：1組成的多肽，經鼻內給藥；並且其中第二成分優選為抑制T細胞活化的蛋白的拮抗劑，更優選為抗PD-1或抗CTLA-4，甚至更優選為抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體，經全身給藥，優選經腸胃外給藥，甚至更優選腹膜內給藥。在一個優選的實施方案中，第一組分每週給藥四次。在一個優選的實施方案中，第二組分每週給藥一次。在更優選的實施方案中，第一組分每週給藥四次，並且第二組分每週給藥一次。在一個優選的實施方案中，治療持續至少四個週。在一個優選的實施方案中，第一組分和第二組分在不同天給藥。
在一個優選的實施方案中，用於治療和/或預防癌症的組合或藥物組合物用於治療肺癌，優選NSCLC，更優選Kras驅動的癌症，甚至更優選KRASG12D 驅動的癌症，優選KRASG12D /p53-驅動的癌症，其中第一組分優選包含序列SEQ ID NO：1的多肽，更優選由SEQ ID NO：1組成的多肽，經靜脈給藥；並且其中第二組分優選為抑制T細胞活化的蛋白質的拮抗劑，更優選為抗PD-1或抗CTLA-4，甚至更優選為抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體，甚至更優選為抗PD-1抗體，經全身給藥，優選經腸胃外給藥，甚至更優選經腹膜內給藥。在一個優選的實施方案中，第一組分每週給藥兩次。在一個優選的實施方案中，第二組分每週給藥一次。在更優選的實施方案中，第一組分每週給藥兩次，並且第二組分每週給藥一次。在另一個實施方案中，第一組分和第二組分同時給藥，優選每週一次。在一個優選的實施方案中，治療至少持續三周，優選是至少四周。在一個優選的實施方案中，第一組分和第二組分在不同天給藥。在更優選的實施方案中，第一組分在給藥第二組分前的一段時間期間（優選地至少5天、至少10天、至少15天、更優選地10天）進行給藥。
本發明組合的所有實施方案也適用於本發明的治療方法。
製品和套組
本公開還提供了在一個或多個容器中的包含本文公開的組合或藥物組合物中的任何一種的製品。在一些實施方案中，製品包括例如指導用戶（例如，分銷商或最終使用者）組合和/或使用製品的組合物以預防和/或治療癌症的手冊、印刷說明書、標籤或包裝插頁。
在一些實施方案中，製品包括例如瓶、小瓶，藥筒、盒、注射器（syringe）、注射器（injector）、或其任何組合。在一些實施方案中，標籤是指根據本文公開的方法使用或給藥製品中的組合或藥物組合物。在一些方面，標籤建議例如使用方案，治療、預防或改善癌症的方案。
在本申請中可能被引用的所有引用的參考文獻（包括參考文獻、專利、專利申請和網站）的內容以及其中引用的參考文獻，出於任何目的，在此明確地以引用的方式整體併入本申請中。
除非另有說明，否則本文所用的所有術語應以本領域已知的普通含義來理解。在本申請中使用的某些術語的其他更具體的定義如下所述，並且旨在在整個說明書和發明申請專利範圍中統一應用，除非另外明確列出的定義提供了更廣泛的定義。在整個說明書和發明申請專利範圍中，單詞“包括”和單詞的變體並不旨在排除其他技術特徵、添加物、組分或步驟。此外，單詞“包括”涵蓋“由……組成”的情況。通過閱讀說明書，本發明的其他目的、優點和特徵對於本領域技術人員將變得顯而易見，或者可以通過實施本發明而獲悉。此外，本發明涵蓋本文描述的具體和特定實施方案的所有可能的組合。
在本說明書和附隨的發明申請專利範圍中，單數形式的不定冠詞術語（"a", "an"）和定冠詞術語（“the”）包括複數指示物。上下文另有明確指示除外。不定冠詞術語"a"（或"an"）以及術語“一個或多個”和“至少一個”在本文可以互換使用。此外，在本文使用的“和/或”應被視為明確公開兩個指定的特徵或組分中的每個具有或不具有另一個。因此，在本文中短語中所使用的術語“和/或”（例如，“A和/或B”）旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”（單獨）和“B”（單獨）。同樣地，在短語中使用的術語“和/或”（例如，“A、B和/或C”）旨在涵蓋以下方面中的每個：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A（單獨）；B（單獨）；和C（單獨）。在整個說明書和發明申請專利範圍中結合數值使用的術語“約”表示本領域技術人員熟悉並可接受的精度區間。通常，這種精度區間為±15％。除非另外限定，本文所使用的所有技術和科學術語都具有與本公開涉及的技術領域的普通技術人員通常理解的含義相同的含義。單位、首碼和符號以其國際單位制（Système International de Unites）（SI）接受的形式表示。數字範圍包括定義範圍的數字。除非另有說明，否則氨基酸序列以氨基至羧基的方向從左至右書寫。本文提供的標題不是對本公開的各個方面或方面的限制，其可以通過參考整個說明書作為一個整體來獲得。因此，通過參考整個說明書更完整地定義了下面直接定義的術語。
將通過以下實施例描述本發明，這些實施例應被認為僅僅是說明性的，而不是對本發明範圍的限制。
實施例
Omomyc 的生產和純化
使用由J.-F. Naud等人，2003. J Mol Biol, 326:1577-1595；F.-O.和Mcduff等人，2009. J Mol Recognit, 22:261-269中描述的Max°純化方案的改進方案，將在N末端包含甲硫氨酸的Omomyc肽序列SEQ ID NO：4進行逆轉錄，優化密碼子以在大腸桿菌E.coli中表達，在pET3a表達載體（Novagen）中克隆，並由BL21（DE3）阿拉伯糖-可誘導型（Invitrogen®）細菌菌株純化。獲得的純化的構建體是SEQ ID NO：4的多肽。每個純化的構建體的身份通過質譜和蛋白質印跡分析來確認。通過陽離子交換色譜法純化Omomyc，並通過質譜分析、SDS-PAGE和UV光譜法確認純度。對於體內給藥，使用ToxinEraser™ Endotoxin Removal Kit（Genscript）進行額外的純化步驟以去除內毒素。使用Pierce®LAL Chromogenic Endotoxin Quantification Kit（Thermo Scientific）定量內毒素濃度。緩衝液交換是在Amicon Ultra-15（MerckMillipore）中進行的，排阻限為3kDa。
Omomyc 鼻內治療增加了 T 淋巴細胞特異性向腫瘤部位的募集
通過Transnetyx對KRasLSL-G12D/+ 小鼠進行基因分型，並按照先前的描述（Jackson, E.L. 等人，Genes Dev, 2001. 15(24): 第3243-8頁），在雄性和雌性中產生肺部腫瘤。使動物保持在混合的C57BL/6J × FVBN背景中。每個時間點和病況下至少5只小鼠被隨機分組，並一旦這些小鼠出現通過micro-CT可檢測到的腫瘤，在Adeno-Cre感染後14至16周開始治療。在一周至四週期間，通過吸入異氟烷（AbbVie Farmaceutica S.L.U.）麻醉動物，並每週四次（1101100）經鼻內用30µL總體積的Omomyc多肽（2.4 mg/kg）或載體（10mM乙酸鈉，pH 6.5）處理動物。
在終點，對小鼠實施安樂死，切除肺部並通過氣管灌注4％PFA，固定過夜，轉移到70％乙醇中，包埋在石蠟中，並切成4µm的切片。對於CD3免疫螢光，通過在400 W的微波中於0.01M檸檬酸鹽緩衝液（pH 6.0）中加熱20分鐘來進行抗原修復。在3％BSA加0.05％Tween20中封閉1小時後，將切片與用Dako即用型稀釋劑（Dako S2022）以1/100稀釋的抗CD3（Dako A0452）在4°C孵育過夜。PBS洗滌後，將切片與山羊抗兔IgG（H+L）–AlexaFluor®488綴合物（Thermo Fisher Scientific A-11008）一起孵育，並用1/10000稀釋的DAPI（Life Technologies D1306）染色，用PBS洗滌，並用螢光封片劑（Dako S3023）固定。使用尼康C2+共聚焦顯微鏡和NIS-elements軟體拍攝圖像。每只小鼠拍攝五張代表性腫瘤的照片，並顯示了每區域CD3+ 細胞的平均值。
用抗CD3進行免疫染色顯示，Omomyc治療最早在治療開始後1周就增加了T淋巴細胞特異性向腫瘤部位的募集，並且在整個治療過程中T細胞都保留在那裡（圖1A），表明Omomyc多肽作用機制的一部分可能是免疫貢獻。
Omomyc 鼻內治療將活化的 CD4 T 細胞募集到腫瘤部位
實驗模型和Omomyc處理與先前描述的相同。
在終點，對小鼠實施安樂死，並使用Mouse Tumor Dissociation Kit（Miltenyi）將肺部切除並分離，並用綴合抗體染色，以通過流式細胞術分析免疫細胞的含量。染色之前，按照製造商的說明，用Fixable Viability Stain 510（BD Biosciences 564406）對死亡細胞進行染色。然後，通過與抗CD16/32抗體在室溫下孵育10分鐘來封閉非特異性結合。對於表面染色，將細胞與抗體在黑暗中於4ºC孵育20分鐘。表1列出了使用的抗體。對於FoxP3的細胞內染色，按照製造商的說明使用FoxP3 Transcription Buffer Set（eBioscience 00-5523-00）。使用CytoFlex cytometer（Beckman Coulter）採集細胞，並使用CytoExpert 2.0 software（Beckman Coulter）分析數據。
圖1B顯示了FACS分析，表明Omomyc誘導CD4 T細胞募集至腫瘤並且被活化。實際上，這些細胞顯示出更高水準的PD-1和PD-1 Tim-3分子，這表明Omomyc誘導了抗腫瘤免疫反應。另外，Omomyc還誘導T調節細胞（Tregs）的擴增。
全身給藥 Omomyc 將 T 細胞募集到腫瘤部位
對於使用Kras/p53同源模型進行的研究，將1x106 MuH-163細胞經皮下接種到7周齡雌性C57BL/6小鼠（JANVIER LABS）的背側。一旦形成腫瘤並達到約100 mm3 的體積，將小鼠隨機分為兩組，每週一次用載體（PBS pH 7.0）或Omomyc（32 mg/kg）經靜脈處理。處理三周後，對小鼠實施安樂死，切除腫瘤並將其切成兩部分。然後將一半的腫瘤用4％PFA固定過夜，轉移到70％乙醇中，包埋在石蠟中，並切成4 µm的切片。對於CD3免疫螢光，通過在400 W的微波中於0.01 M檸檬酸鹽緩衝液（pH 6.0）中加熱20分鐘來進行抗原修復。在3％BSA加0.05％Tween20中封閉1小時後，將切片與用Dako即用型稀釋劑（Dako S2022）以1/100稀釋的抗CD3（Dako A0452）在4°C孵育過夜。PBS洗滌後，將切片與山羊抗兔IgG（H+L）–AlexaFluor®488綴合物（Thermo Fisher Scientific A-11008）一起孵育，並用1/10000稀釋的DAPI（Life Technologies D1306）染色，用PBS洗滌，並用螢光封片劑（Dako S3023）固定。使用機械的尼康Tie螢光顯微鏡和NIS-elements軟體拍攝圖像。每只小鼠拍攝四張腫瘤的代表性區域的照片，並顯示了每領域CD3+ 細胞的平均值。
對於流式細胞術分析，使用Mouse Tumor Dissociation Kit（Miltenyi）分離另一半的腫瘤，並用綴合抗體染色，以通過流式細胞術分析免疫細胞的含量。染色之前，按照製造商的說明，用Fixable Viability Stain 510（BD Biosciences 564406）對死亡細胞進行染色。然後，通過與抗CD16/32抗體在室溫下孵育10分鐘來封閉非特異性結合。對於表面染色，將細胞與抗體在黑暗中於4ºC孵育20分鐘。表1列出了使用的抗體。使用CytoFlex cytometer（Beckman Coulter）採集細胞，並使用CytoExpert 2.0 software（Beckman Coulter）分析資料。
給藥Omomyc誘導T細胞向腫瘤部位募集(圖2A)。Omomyc將更多的CD8 T細胞募集到腫瘤部位，同時表達PD-1和Tim-3分子兩者的CD4和CD8 T細胞明顯增多(圖2B)。
Omomyc 與抗 PD-1 的組合將 CD4+ PD-1+ Tim-3- T 細胞募集到腫瘤中
通過Transnetyx對KRasLSL-G12D/+ 小鼠進行基因分型，並按照先前的描述（Jackson, E.L. 等人，Genes Dev, 2001. 15(24):第3243-8頁），在雄性和雌性中產生肺部腫瘤。使動物保持在純的C57BL/6背景中。每個時間點和病況下至少5只小鼠被隨機分組，並一旦這些小鼠出現通過micro-CT可檢測到的腫瘤，在Adeno-Cre感染後14-16周開始治療。將小鼠隨機分為4組：載體+同型大鼠IgG2a,k、Omomyc+同型大鼠IgG2a,k、載體+抗PD-1和Omomyc +抗PD-1。對於Omomyc處理，通過吸入異氟烷（AbbVie Farmaceutica S.L.U.）麻醉動物，並每週四次（1101100）經鼻內用30μL總體積的Omomyc多肽（2.4mg/kg）或載體（PBS，pH=7）處理動物。在四週內，每週一次 (0010000) 經腹膜內給藥劑量為200µg/小鼠的抗PD-1（BioXCell BE0146）或其同型大鼠IgG2a,k（BioXCell BE0089）。
在終點，對小鼠實施安樂死，並使用Mouse Tumor Dissociation Kit（Miltenyi）將肺部切除並分離，並用綴合抗體染色，以通過流式細胞術分析免疫細胞的含量。染色之前，按照製造商的說明，用Fixable Viability Stain 510（BD Biosciences 564406）對死亡細胞進行染色。通過與抗CD16/32抗體在室溫下孵育10分鐘來封閉非特異性相互作用。對於表面染色，將細胞與抗體在黑暗中於4ºC孵育20分鐘。表1列出了使用的抗體。使用CytoFlex cytometer（Beckman Coulter）採集細胞，並使用CytoExpert 2.0 software（Beckman Coulter）分析數據。
與載體和僅抗PD-1治療組兩者相比，Omomyc和抗PD-1療法的組合顯著增加了表達PD-1但不表達Tim-3的CD4+ T細胞向腫瘤部位的募集（圖3）。該發現表明Omomyc與抗PD-1的組合協同促進了抗腫瘤免疫應答。最近的發現表明，PD-1在腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）上的表達準確地識別出克隆擴增的腫瘤反應性細胞的所有組成成分（Gros A等人, J Clin Invest (2014) 124(5): 2246–2259）。按照這種思路，儘管在與其配體（PD-L1和PD-L2）連接時會產生抑制信號，但現在很清楚的是，PD-1表達是T細胞活化和特異性針對腫瘤抗原的高親和力TIL的首要標誌物（參見Simon S和Labarriere N.，OncoImmunology (2018). 7:1, e1364828）。
Omomyc 與抗 PD-1 的組合誘導 IFN- γ的產生
實驗模型、Omomyc和抗PD-1處理與先前描述的相同。
在終點，對小鼠實施安樂死，並使用Mouse Tumor Dissociation Kit（Miltenyi）將肺部切除並分離，並用綴合抗體染色，以通過流式細胞術分析免疫細胞的含量。染色之前，按照製造商的說明，用Fixable Viability Stain 510（BD Biosciences 564406）對死亡細胞進行染色。通過與抗CD16/32抗體在室溫下孵育10分鐘來封閉非特異性相互作用。對於表面染色，將細胞與抗體在黑暗中於4ºC孵育20分鐘。表1列出了使用的抗體。對於IFN-γ 染色，在莫能菌素（monensin）和貝菲德林（befeldrin）A（均來自BD Biosciences）的存在下，用PMA加ionomicin（均來自Sigma-Aldrich）刺激收穫和分離的腫瘤細胞12小時。然後收穫細胞並染色以進行流式細胞術分析。對於IFN-γ 的細胞內染色，按照製造商的說明使用BD Cytofix/Cytoperm buffer set（BD Biosciences 554722）。使用CytoFlex cytometer（Beckman Coulter）採集細胞，並使用CytoExpert 2.0 software（Beckman Coulter）分析數據。
這些實驗表明，與它們的載劑對照相比，Omomyc加抗PD-1的組合療法顯著誘導了通過CD4+輔助細胞和CD8+細胞毒性腫瘤內T細胞產生幹擾素-γ （IFN-γ ）（圖4），這一事實在Omomyc或抗PD-1處理組中都沒有觀察到。
在最近幾年中，已經積累了大量證據，證明IFN-γ 在促進腫瘤排斥和清除中起關鍵作用。該細胞因子主要由活化的T細胞和NK細胞產生，並通過直接誘導對於腫瘤細胞的抗增殖、促凋亡和促壞死作用，並通過誘導主要組織相容性分子上調來增強免疫原性，從而發揮其抗腫瘤作用（更多內容參見Castro F等人，Front. Immunol. (2018). 9:847和Ikeda H等人，Cytokine & Growth Factors Reviews (2002)13，95-109）。 此外，該細胞因子還影響腫瘤微環境，通過抑制腫瘤周圍的內皮細胞的增殖和存活從而損害血管生成，並因此誘導腫瘤部位的局部缺血，這是導致腫瘤排斥的重要機制（Beatty G和Paterson Y. J Immunol (2001) 166:2276–82, Kammertoens T等人，Nature (2017) 545:98–102和Briesemeister D等人，Int J Cancer (2011) 128:371–8）。此外，由Th1 CD4+ 和CD8+ T細胞產生的IFN-γ 增強了腫瘤清除，因為這種細胞因子對於T和NK細胞向腫瘤部位的轉移至關重要（Melero I等人，Cancer Discov (2014) 4:522–6）。此外，IFN-γ 在活化巨噬細胞和促進其殺腫瘤活性方面也起著關鍵作用（Celada A等人，J Exp Med (1984) 160:55–74）。重要的是，升高水準的IFN-γ 是回應於化學療法和放射療法以及抗PD-1和CLTA-4免疫療法兩者的預測性生物標誌物（Karachaliou N等人，Ther Adv Med Oncol (2018) 10:1758834017749748和Mo X等人，Cancer Res (2018) 78:436–50）。一致地，最近的臨床試驗已經有了顯示出產生IFN-γ 的效應T細胞與腫瘤生長抑制之間的關聯的有希望的結果（Liakou CI等人，Proc Natl Acad Sci U S A (2008) 105:14987–92, Peng W等人，Cancer Res (2012) 72:5209–18和Overacre-Delgoffe AE等人，Cell (2017) 169:1130–41.e11）。
抗體 螢光染料 克隆 製造商 產品目錄號
CD16/32 - 93 Biolegend 101302
CD45 BV605 30-F11 Biolegend 103140
CD3e FITC 145-2C11 eBioscience 11-0031
CD4 PerCP-eFluor710 RM4-5 eBioscience 46-0042
CD8a APC-H7 53-6.7 BD Biosciences 560182
PD-1 BV421 29F.1A12 Biolegend 135218
Tim-3 PE-CY7 RMT3-23 eBioscience 25-5870
IFN- γ APC XMG1.2 BD Bioscience 554413
表 1 ：用於流式細胞術分析的抗小鼠抗體
Omomyc 與抗 PD-1 抗體的組合協同地增加健康肺部的比例，並將 T 細胞募集到腫瘤部位。
通過Transnetyx對KRasLSL-G12D/+ 小鼠進行基因分型，並按照先前的描述（Jackson, E.L.等人，Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev, 2001. 15(24): 第3243-8頁），在雄性和雌性中產生肺部腫瘤。使動物保持在純的C57BL/6背景中。在Adeno-Cre感染後14至16周後，一旦小鼠出現通過micro-CT可檢測到的腫瘤，就將它們隨機分為4組，按以下方式治療4周：載體+同型大鼠IgG2a,k、Omomyc+同型大鼠IgG2a,k、載體+抗PD-1和Omomyc+抗PD-1。對於Omomyc治療，通過吸入異氟烷（AbbVie Farmaceutica S.L.U.）麻醉動物，並每週四次（1101100）經鼻內用30μL總體積的Omomyc多肽（3.75mg/kg）或載體（PBS，pH=7）處理動物。在四周內，每週一次 (0010000) 經腹膜內給藥5mg/kg的抗PD-1（BioXCell BE0146）或其同型大鼠IgG2a，k（BioXCell BE0089）。
使用Quantum FX成像系統（Perkin Elmer.940 Winter St. Waltham，Massachusetts.EEUU）獲得了microCT研究，圖像重建基於Feldkamp方法。對於胸腔容積，使用Quantum FX分析軟體。首先，在脊水準（carina level）處測量側肋骨之間的距離（r2）。第二個測量定義為從脊水準到橫隔膜的杯狀部的最大距離（h）。最後一個測量是胸腔高度，其定義為橫隔膜的杯狀部水準處的胸骨與下腰肌之間的距離（r1）。使用這三個值，使用以下數學公式計算出截錐的體積：
體積=高度*π/3*(r13-r23)/(r1-r2)
利用AMIDE軟體（Amide©Andreas Loening）使用閾值方法計算肺部健康組織。此閾值選擇強度值包括在-950/-350灰度範圍內的圖像中的全部體素量。在進行了不同的研究後，手動選擇了此灰度範圍。
最終，基於維持完整胸腔容積的意圖，計算出健康的肺部體積/胸腔容積比，而隨著病理學進展逐漸減少健康的肺部體積。與單獨的載體和治療相比，用Omomyc與抗PD-1的組合治療的動物呈現出健康肺部的的比例增加（圖 5A 和 5B ）。
在終點，對小鼠實施安樂死，並使用Mouse Tumor Dissociation Kit（Miltenyi）將肺部切除並分離，並用綴合抗體染色，以通過流式細胞術分析免疫細胞的含量。染色之前，按照製造商的說明，用Fixable Viability Stain 510（BD Biosciences 564406）對死亡細胞進行染色。通過與抗CD16/32抗體在室溫下孵育10分鐘來封閉非特異性交叉反應。對於表面染色，將細胞與抗體在黑暗中於4ºC孵育20分鐘。表2列出了使用的抗體。
抗體 螢光染料 克隆 製造商 產品目錄號
CD16/32 - 93 Biolegend 101302
CD45 BV605 30-F11 Biolegend 103140
CD3e FITC 145-2C11 eBioscience 11-0031
CD4 PerCP-eFluor710 RM4-5 eBioscience 46-0042
CD8a APC-H7 53-6.7 BD Biosciences 560182
PD-1 BV421 29F.1A12 Biolegend 135218
Tim-3 PE-CY7 RMT3-23 eBioscience 25-5870
IFN- γ APC XMG1.2 BD Bioscience 554413
IL-17 PE TC11-18H10 BD Bioscience 559502
表 2 ：用於流式細胞術分析的抗小鼠抗體
對於IFN-γ 和IL-17染色，在莫能菌素和貝菲德林A（均來自BD Biosciences）的存在下，用PMA加ionomicin（均來自Sigma-Aldrich）刺激收穫和分離的腫瘤細胞12小時。然後收穫細胞並染色以進行流式細胞術分析。對於IFN-γ 的細胞內染色，按照製造商的說明使用BD Cytofix/Cytoperm buffer set（BD Biosciences 554722）。使用CytoFlex cytometer（Beckman Coulter）採集細胞，並使用CytoExpert 2.0 software（Beckman Coulter）分析數據。
圖5C表明，聯合給藥Omomyc和抗PD-1誘導T細胞募集到腫瘤部位，特別是CD4T細胞和Th1/Th17細胞。表3示出了所獲得的效果是協同的。當感興趣的免疫細胞群的增加高於單獨治療的增加的總和時，被認為是協同作用。
Figure 02_image003
表3：每個免疫細胞群的平均值
Omomyc 與抗 CTLA-4 抗體的組合協同地減少腫瘤生長，並將抗腫瘤 T 細胞募集到腫瘤部位
實驗模型、micro-CT掃描和FACS染色與圖5中所示的相同。
在Adeno-Cre感染後14-16周後，一旦小鼠出現通過micro-CT可檢測到的腫瘤，就將它們隨機分為4組，按以下方式處理4周：載體+同型敘利亞倉鼠（Syrian hamster）IgG、Omomyc+同型敘利亞倉鼠IgG、載體+抗CTLA-4、和Omomyc+抗CTLA-4。對於Omomyc處理，通過吸入異氟烷（AbbVie Farmaceutica S.L.U.）麻醉動物，並每週四次（1101100）經鼻內用30μL總體積的Omomyc多肽（3.75 mg/kg）或載體（PBS，pH=7）處理動物。在四周內，每週一次 (0010000) 經腹膜內給藥10mg/kg的抗CTLA-4（BioXCell BE0131）或其同型敘利亞倉鼠IgG（BioXCell BE0087）。
圖6A表明與單獨的載體和治療相比，用Omomyc與抗CTLA-4的組合治療的動物出現減少的腫瘤生長。圖6B表明聯合給藥Omomyc和抗CTLA-4誘導T細胞募集到腫瘤部位，特別是CD4T細胞和CD4與CD8 PD-1+ T細胞二者。表4示出了所獲得的效果是協同的。當感興趣的免疫細胞群的增加高於單獨治療的增加的總和時，被認為是協同作用。
Figure 02_image005
表4：每個免疫細胞群的平均值
依序經靜脈給藥 Omomyc 與抗 PD-1 抗體的組合協同地將抗腫瘤 T 細胞募集到腫瘤部位。
實驗模型、micro-CT掃描和FACS染色與圖5中所示的相同。
在Adeno-Cre感染後14-16周後，一旦小鼠出現通過micro-CT可檢測到的腫瘤，就將它們隨機分為4組，按以下方式處理4周：載體、Omomyc、載體+抗PD-1、和Omomyc+抗PD-1。對於Omomyc處理，每週兩次用Omomyc多肽（50mg/kg）或用載體（NaAc 24mM + 150mM NaCl）（0100100）經靜脈對動物進行處理，持續10天。接受該組合的組，在Omomyc處理10天后，開始每週一次（0010000）經腹膜內接受2.5mg/kg的抗PD-1（BioXCell BE0146），直到實驗結束。
圖7顯示依序用Omomyc、然後用抗PD-1處理誘導T細胞募集到腫瘤部位，特別是表達PD-1和Tim-3分子二者的CD4 T細胞以及表達PD-1的Th1/Th17 T細胞。表5示出了所獲得的效果是協同的。當感興趣的免疫細胞群的增加高於單獨治療的增加的總和時，被認為是協同作用。
Figure 02_image006
表5：每個免疫細胞群的平均值
經靜脈給藥 Omomyc 和抗 PD-1 抗體的組合協同地將 T 細胞募集到腫瘤部位
將極具侵襲性的Kras/p53突變的NSCLC MuH-163細胞系(1x106 細胞)經皮下接種到C57/BL6同源小鼠中。一旦腫瘤形成後，將小鼠隨機分為4組: 載體、Omomyc、載體+抗PD-1、和Omomyc+抗PD-1。Omomyc處理是以50mg/kg（0010000）經靜脈給藥，伴隨著以5mg/kg經腹膜內給藥抗PD-1抗體，每週一次，共3周。每週兩次監測小鼠，通過卡尺測量來監測腫瘤的生長。
在終點處收集腫瘤，將其中一半用4％PFA固定並包埋在石蠟中用於IHC分析，而另一半使用Mouse Tumor Dissociation Kit（Miltenyi）進行消化，並用綴合抗體染色以通過流式細胞儀分析免疫細胞含量。如圖5所示進行FACS染色和分析。
對於CD3免疫螢光，通過使用設置在400 W的微波在0.01 M檸檬酸鹽緩衝液（pH 6.0）中加熱20分鐘進行抗原修復。在3％BSA中封閉45分鐘並在PBS中洗滌後，將切片與用Dako即用型稀釋劑（Dako S2022）以1/100稀釋的抗CD3（Dako A0452）在4°C孵育過夜。PBS洗滌後，將切片與以1/200稀釋的山羊抗兔IgG（H+L）–AlexaFluor®488綴合物（Thermo Fisher Scientific A-11008）一起孵育，並用1/10000稀釋的DAPI（Life Technologies D1306）染色，用水洗滌一次，並用螢光封片劑（Dako S3023）固定。CD3陽性是通過每只動物在20倍放大下捕獲的5張具有代表性的螢光顯微鏡圖像來檢測的。
圖8示出了Omomyc和抗PD-1的聯合治療將T細胞顯著地募集到腫瘤部位。表6示出了所獲得的效果是協同的。當感興趣的免疫細胞群的增加高於單獨治療的增加的總和時，被認為是協同作用。
Figure 02_image008
表6：每個免疫細胞群的平均值
CD3 、 CD4 、 IL-17 和 IFN- γ的高表達與更高的存活率相關
Kaplan-Meier繪圖使用線上軟體Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)進行。為此，選擇了肺癌患者數據庫。NSCLC的所有組織學類型、所有分期、所有分級均納入分析。
圖9示出了CD3、CD4、IL-17和IFN-γ的高表達與NSCLC患者中更高的存活率相關。
討論
與單獨的Omomyc（0.86）和抗PD-1（0.92）療法所顯示的改善相比，鼻內Omomyc與抗PD-1抗體的組合協同增加了在總胸腔容積中健康肺部的比例（平均值7.969） （圖 5A 和 5B ）。另外，聯合給藥的處理顯著誘導T細胞募集到腫瘤部位，特別是CD4 T細胞和Th1/Th17細胞，已知它們發揮有效的抗腫瘤作用（Chatterjee, S.等人，CD38-NAD(+)Axis Regulates Immunotherapeutic Anti-Tumor T Cell Response. Cell Metab, 2018. 27(1): p. 85-100 e8）（圖 5C ）。
與這些結果一致，與載體（3.85）和兩種單獨給藥的處理（Omomyc：2.3；a-CTLA-4：3.0）相比，鼻內Omomyc與抗CTLA-4的組合也顯示出減少的腫瘤生長（1.11）（圖 6A ）。
除了對腫瘤生長的直接影響外，該治療組合還協同誘導T細胞募集到腫瘤部位，尤其是CD4 T細胞以及表達PD-1分子的CD4和CD8 T細胞二者（已知可識別腫瘤特異性T細胞的細胞（Gros, A.等人，PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest, 2014. 124(5): 第2246-59頁）（圖 6B ）。總之，經鼻內給藥Omomyc與抗PD-1或抗CTLA-4的組合減少了腫瘤生長，並協同將抗腫瘤T細胞募集到腫瘤部位。
此外，使用相同的小鼠模型（KrasG12D 驅動的NSCLC），發明人已證明經靜脈的Omomyc與抗PD-1的組合的依次給藥（先是Omomyc，然後是抗PD-1抗體）也協同並誘導T細胞募集到腫瘤部位，尤其是同時表達PD-1和Tim-3分子的腫瘤特異性CD4和Th1/Th17抗腫瘤T細胞（圖 7 ）。
為了在另一個模型中驗證這種協同作用，作者在由Kras和p53二者突變驅動的另一個非常極具侵襲性的NSCLC模型中將Omomyc和抗PD-1結合使用。同樣，兩種藥物都協同地，並顯著地募集更多的T細胞至腫瘤部位（圖 8A ），還募集了更多的整體免疫細胞（圖 8B ）。
總之，作者得出的結論是，將Omomyc處理與抗PD-1和CTLA-4療法聯合能夠減少腫瘤生長，並協同將抗腫瘤T細胞募集到腫瘤部位。使用不同的給藥途徑、不同的Omomyc劑量以及不同劑量的抗PD-1和CTLA-4都觀察到了這種治療效果。
這種免疫細胞募集對NSCLC癌症患者具有明顯的治療效果，因為分泌IFN-g和IL-17的總CD3 T細胞、CD4和T細胞的比例增加與存活率增加相關（圖 9 ）。該證據強調了發現上述有關Omomyc與腫瘤免疫劑的組合的重要性。相同的結論可以推論到其他類型的癌症，其中基於免疫特徵（signature）的資料已經建立，強大的免疫細胞組分可預測乳腺癌中對化學療法的良好反應，而高的腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）與對新輔助治療的更高的反應率相關。在結直腸癌的肝轉移中，CD8+ T細胞的高度滲透預示了對化學療法的更好反應和更長的生存期。在黑色素瘤中，免疫特徵的表達（即Th1細胞和與細胞毒性相關的基因的高表達）與使用黑色素瘤相關的抗原3（MAGEA3）對治療性疫苗的良好臨床反應相關（Fridman, W.H.等人的描述，The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nat Rev Clin Oncol, 2017. 14(12): p.717-734）。
在過去的幾年中，已經積累了大量的證據，這些證據表明TIL對於消滅腫瘤和腫瘤免疫療法的功效都起著至關重要的作用。實際上，對腫瘤免疫療法的耐藥性的主要因素是缺乏腫瘤T細胞浸潤，這就是所謂的“冷腫瘤”的特徵。用腫瘤免疫劑處理這種免疫惰性腫瘤面臨著巨大的挑戰，因為它們沒有針對腫瘤的任何適應性免疫反應，並且無法對這種類型的療法產生反應（Bonaventura, P.等人，Cold Tumors: A Therapeutic Challenge for Immunotherapy. Front Immunol, 2019. 10: p. 168）。
在PD-1/PD-L1阻斷後從未表現出臨床反應或疾病穩定的患者被稱為對治療具有“原發性耐藥性”。相反，來自臨床試驗的早期資料表明，在腫瘤及其周圍存在預先存在的TIL，以及在T細胞和腫瘤細胞上共定位的PD-1和PD-L1表達預測對抗PD-1治療的治療反應（Nowicki, T. S., S. Hu-Lieskovan, 和A. Ribas,Mechanisms of Resistance to PD-1 and PD-L1 Blockade . Cancer J, 2018. 24(1): p. 47-53）。 在同一條證據上，Pembrolizumab（抗PD-1）的功效與腫瘤內T細胞的存在和PD-1/PD-L1的表達相關，這是有效的抗腫瘤反應（Tumeh, P.C.等人，PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature, 2014. 515(7528): p. 568-71）和抗PD-1試劑的功效（Ribas, A.,Tumor immunotherapy directed at PD-1. N Engl J Med, 2012. 366(26): p. 2517-9）的要求。
考慮到所有這些證據，表明協同誘導T細胞浸潤和刺激的Omomyc與腫瘤免疫劑的組合最終會提高對腫瘤免疫療法的臨床反應率。
無
圖 1. Omomyc 鼻內給藥將 T 細胞募集到腫瘤部位。 每週4次用Omomyc經鼻內處理荷KRasG12D 驅動的NSCLC的小鼠，持續4周。（A）最早在處理開始後1周，給藥Omomyc誘導T細胞募集到腫瘤部位，並且T細胞在整個處理中均停留在那裡。*p＜0.05；**p＜0.01。（B）FACS分析顯示，Omomyc誘導CD4 T細胞募集到腫瘤，特別是活化的CD4 T細胞，所述CD4 T細胞顯示更高水準的PD-1和PD-1 Tim-3分子。Omomyc還誘導T調節細胞（Treg）的擴增。
圖 2. Omomyc 全身給藥將 T 細胞募集到腫瘤部位。 將Kras/p53突變的NSCLC MuH-163細胞系經皮下接種至同源小鼠。小鼠用Omomyc全身處理3周。與其載體對照相比，Omomyc將更多的CD3+ T細胞募集到腫瘤部位（A），同時表達PD-1和Tim-3分子的CD4和CD8 T細胞明顯增多（B）。**p＜0.01。
圖 3. Omomyc 與抗 PD-1 的組合將 CD4+ PD-1+ Tim-3- T 細胞募集到腫瘤。 每週4次用Omomyc經鼻內、每週一次用抗PD-1（250μg）經腹膜內處理荷KRasG12D 驅動的NSCLC的小鼠，持續4周。Omomyc與抗PD-1的組合誘導CD4+ PD-1+ Tim-3- T細胞募集到腫瘤部位。
圖 4. Omomyc 與抗 PD-1 的組合誘導 IFN- γ 的產生。 Omomyc和抗PD-1的組合處理誘導腫瘤內CD4（A）和CD8（B）T細胞產生IFN-γ 。
圖 5. Omomyc 與抗 PD-1 抗體的組合協同地增加健康肺的比例，並將 T 細胞募集到腫瘤部位。 每週4次用Omomyc經鼻內、每週一次用抗PD-1抗體經腹膜內處理荷KRasG12D 驅動的NSCLC的小鼠。（A）與載體和單獨的處理相比，用Omomyc與抗PD-1的組合處理的動物出現了健康肺部的比例增加。（B）在處理開始和終點時從每個實驗組獲得的代表性橫向平面CT圖像。深色區域對應于健康的肺部，灰色區域對應於受影響的肺部。（C）FACS分析表明，組合給藥Omomyc和抗PD-1誘導T細胞募集到腫瘤部位，特別是CD4 T細胞和Th1/Th17細胞。*p＜0.05; **p＜0.01; *** p＜0.0001。
圖 6. Omomyc 與抗 CTLA-4 抗體的組合協同地減少腫瘤生長，並將抗腫瘤 T 細胞募集到腫瘤部位。 每週4次用Omomyc經鼻內、每週一次用抗CTLA-4抗體經腹膜內處理荷KRasG12D 驅動的NSCLC的小鼠。（A）與載體和單獨的處理相比，用Omomyc與抗CTLA-4的組合處理的動物表現出減少的腫瘤生長。表中顯示了每個處理組的腫瘤生長的平均值。（B）FACS分析表明，Omomyc和抗CTLA-4組合給藥誘導T細胞募集到腫瘤部位，特別是CD4 T細胞以及CD4 PD-1+ T細胞與CD8 PD-1+ T細胞二者。*p＜0.05; **p＜0.01; *** p＜0.0001。
圖 7. Omomyc 與抗 PD-1 抗體的依序組合協同地將抗腫瘤 T 細胞募集到腫瘤部位。 每隔4天，用Omomyc經靜脈處理荷KRasG12D 驅動的NSCLC的小鼠，持續10天，然後每週一次用抗PD-1抗體經腹膜內處理荷KRasG12D 驅動的NSCLC的小鼠。FACS分析顯示依序用Omomyc、然後用抗PD-1的處理誘導T細胞募集到腫瘤部位，特別是表達PD-1和Tim-3分子二者的CD4 T細胞以及表達PD-1的Th1/Th17 T細胞。*p＜0.05；**p＜0.01。
圖 8. Omomyc 與抗 PD-1 抗體的組合協同地將 T 細胞募集到腫瘤部位。 每週一次用Omomyc（經靜脈）和抗PD-1（經腹膜）聯合（concomitantly）處理荷KRasG12D /p53驅動的NSCLC的小鼠。（A）IHC染色表明，Omomyc和抗PD-1的聯合處理顯著地將T細胞向腫瘤部位募集。（B）FACS分析表明，用Omomyc和抗PD-1的處理誘導全部免疫細胞募集到腫瘤部位。*p＜0.05；**p＜0.01。
圖 9. CD3 、 CD4 、 IL-17 和 IFN- γ 的高表達與更高的存活率相關。 考慮CD3、CD4、IL-17和IFN-γ 表達的NSCLC患者的代表性Kaplan-Meier曲線。圖下的表顯示了上四分位數（upper quartile）的存活率。用Kaplan-Meier繪圖器繪製圖形http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Figure 12_A0101_SEQ_0025

Claims (19)

  1. 一種組合，其包括： i)第一組分，其選自由以下組成的群組： a)包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體， b)綴合物，包含：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體，以及促進細胞攝取所述多肽或所述其功能等效變體的化學部分， c)多核苷酸，編碼a）的所述多肽或b）的所述綴合物， d)載體，包含根據c）的所述多核苷酸，以及 e)細胞，能夠將根據a）的所述多肽或根據b）的所述綴合物分泌至培養基中； 以及 ii)第二組分，其是腫瘤免疫劑。
  2. 根據請求項1所述的組合，其中，SEQ ID NO: 1的所述功能等效變體選自由以下構成的群組：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
  3. 根據請求項1或請求項2中任一項所述的組合，其中所述促進細胞攝取所述多肽或所述其功能等效變體的化學部分是細胞穿透肽序列，並且其中所述細胞穿透肽序列與所述多肽或所述其功能等效變體形成融合蛋白。
  4. 根據請求項3所述的組合，其中，所述細胞穿透肽序列選自由GRKKRRQRRR（SEQ ID NO：37）和RRRRRRLR（SEQ ID NO：38）構成的群組。
  5. 根據請求項1-4中任一項所述的組合，其中，所述綴合物更包含另外的核定位信號。
  6. 根據請求項1-5中任一項所述的組合，前提條件是所述腫瘤免疫劑不是細胞因子。
  7. 根據請求項1-6中任一項所述的組合，其中所述腫瘤免疫劑是抑制T細胞活化的蛋白質的拮抗劑、或免疫檢查點抑制劑。
  8. 根據請求項7所述的組合，其中所述抑制T細胞活化的蛋白質的拮抗劑選自抗PD-1和抗CTLA-4。
  9. 根據請求項8所述的組合，其中所述抑制T細胞活化的蛋白質的拮抗劑是抗PD-1。
  10. 根據請求項8或請求項9中任一項所述的組合，其中所述拮抗劑是拮抗性抗體。
  11. 一種藥物組合物，包含藥學有效量的根據請求項1至請求項10中任一項所述的組合和藥學上可接受的賦形劑。
  12. 一種根據請求項1至請求項10中任一項所述的組合或根據請求項11所述的藥物組合物用於藥物之用途。
  13. 一種根據請求項1至請求項10中任一項所述的組合或根據請求項11所述的藥物組合物在製備用於預防和/或治療癌症之藥物的用途。
  14. 一種根據請求項1所述的組合的第一組分在製備與腫瘤免疫劑組合使用以用於預防和/或治療癌症之藥物的用途。
  15. 一種腫瘤免疫劑在製備與根據請求項1所述的組合的第一組分組合使用以用於預防和/或治療癌症組合藥物的用途。
  16. 根據請求項13至請求項15中任一項所述的用途，其中所述癌症是肺癌。
  17. 根據請求項12至請求項16中任一項所述的用途，其中，所述藥物經全身給藥或經鼻內給藥。
  18. 根據請求項17所述的用途，其中通過滴注或鼻吸入進行鼻內給藥。
  19. 根據請求項13至請求項18中任一項所述的用途，其中所述多肽或所述其功能等效變體、或所述綴合物在治療癌症中與所述腫瘤免疫劑協同相互作用。
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