KR101200133B1 - 항체 약물 접합체 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 항체-약물 접합체 화합물에 관한 것이다:
<화학식 I>
Figure 112006088990037-pct00055
상기식에서,
하나 이상의 마이탄시노이드 약물 부분 (D)은 L에 의해, ErbB 수용체와 결합하거나 또는 하나 이상의 종양 관련 항원 또는 세포-표면 수용체와 결합하는 항체 (Ab)에 공유적으로 연결된다. 이들 화합물은 암, 및 기타 질병 및 장애의 진단 또는 치료 방법에 사용할 수 있다.
Figure R1020067025240
항체-약물 접합체, 마이탄시노이드 약물, ErbB 수용체와 결합하는 항체, 항암제

Description

항체 약물 접합체 및 방법 {ANTIBODY DRUG CONJUGATES AND METHODS}
본 출원은 2004년 6월 1일자로 출원된 미국 가특허원 제60/576,517호 및 2004년 10월 5일자로 출원된 미국 가특허원 제60/616,098호에 대해 35 USC §119(e) 하에 우선권을 청구하고 있고 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된, 37 CFR §1.53(b) 하에 출원된 비-가출원이다.
본 발명은 일반적으로, 항암 활성을 지닌 화합물, 보다 구체적으로는 화학요법제 마이탄시노이드 (maytansinoid) 약물 또는 독소와 접합된 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 포유류 세포, 또는 관련된 병리적 질환을 시험관내, 계내(in situ) 및 생체 내에서 진단 또는 치료하기 위해 항체-약물 접합체 화합물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
항체 요법은 암, 면역학적 장애 및 혈관형성성 장애가 있는 환자를 표적화 치료하기 위해 확립되었다. 암 치료시 종양 세포를 사멸시키거나 억제시키는 세포독성제 또는 세포증식 억제제, 즉 약물을 국소 전달하기 위해 항체-약물 접합체 (ADC), 즉 면역접합체를 사용하게 되면 [참고: Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Trail et al (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-172; US 4975278], 이론적으로는 상기 약물 부분을 종양에 표적화 전달할 수 있고 종양 내에 약물이 세포내 축적되게 할 수 있는데, 상기 약물 작용제를 접합시키지 않은 채로 전신 투여하게 되면, 제거시키고자 하는 종양 세포 뿐만 아니라 정상 세포에 대해서도 허용 가능하지 않은 수준의 독성이 야기될 수 있다 [참고: Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, "in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds), pp. 475-506]. 따라서, 최소 독성을 나타내면서 최대 효능을 나타내고자 하였다. ADC를 고안하고 개선시키기 위한 노력들은 약물-연결성 및 약물-방출성 뿐만 아니라 모노클로날 항체 (mAbs)의 선택성에 대해서도 초점을 맞추었다. 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체 둘 다가 이들 전략에 유용한 것으로 보고되었다 [참고: Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87]. 이들 방법에 사용된 약물에는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 미토마이신, 네오카르지노스타틴 [참고: Takahashi et al (1988) Cancer 61: 881-888] 및 빈데신 [Rowland et al., (1986) 상기 참고]이 포함된다. 항체-독소 접합체에 사용된 독소에는 세균성 독소, 예를 들어 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어 리신 (ricin) [참고: US 4753894; US 5629197; US 4958009; US 4956453], 소분자 독소, 예를 들어 젤다나마이신 (geldanamycin) [참고: Mandler et al (2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92 (19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791], 마이탄시노이드 [참고: EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623], 및 칼리케아미신 (calicheamicin) [참고: Lode et al (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342]이 포함된다. 독소는 투불린 (tubulin) 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제를 포함한 기전에 의해 자신의 세포독성 및 세포증식 억제 효과를 발휘할 수 있다. 몇몇 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드와 접합될 때 불활성화되거나 덜 활성을 나타내는 경향이 있다.
항체-방사성 동위원소 접합체, 즉 티오우레아 링커-킬레이트제에 의해 결합된 111In 또는 90Y 방사성 동위원소 및 CD20 항원에 대항하여 생성된 뮤린 IgG1 카파 모노클로날 항체로 구성된 ZEVALIN? [이브리투모마브 티욱세탄 (ibritumomab tiuxetan); 공급처: Biogen/Idec]이 승인되었다 [참고: Wiseman et al (2000) Eur. J. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99 (12):4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69]. 칼리케아미신과 연결된 hu CD33 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 MYLOTARG™ [젬투주마브 오조가미신 (gemtuzumab ozogamicin); 공급처: Wyeth Pharmaceuticals]은 주사에 의해 급성 골수성 백혈병을 치료하기 위한 것으로 2000년에 승인되었다 [참고: Drugs of the Future (2000) 25 (7):686; US 4970198; US 5079233; US 5585089; US 5606040; US 5693762; US 5739116; US 5767285; US 5773001]. 디설파이드 링커 SPP를 통하여 마이탄시노이드 약물 부분 DM1에 연결된 huC242 항체로 구성된 항체-약물 접합체인 칸투주마브 메르탄신 [Cantuzumab mertansine (공급처: Immunogen, Inc.)] [참고: Xie et al (2004) J. of Pharm. and Exp. Ther. 308 (3):1073-1082; Tolcher et al (2003) J. Clin. Oncology 21(2):211-222; US 5208020]은, CanAg를 발현하는 암, 예를 들어 결장암, 췌장암, 위암 등을 치료하기 위한 제I상 시험을 진행하였다. MLN-2704 (공급처: Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)는 마이탄시노이드 약물 부분 DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 구성된 항체-약물 접합체로서, 현재 전립선 종양의 잠재적 치료를 위해 개발 중이다. 동일한 마이탄시노이드 약물 부분 DM1은 비-디설파이드 링커인 SMCC를 통하여 마우스 뮤린 모노클로날 항체 TA.1에 연결시켰다 [참고: Chari et al. (1992) Cancer Research 52:127-131]. 이러한 접합체는 상응하는 디설파이드 링커 접합체 보다 200배 정도 덜 효능이 있는 것으로 보고되었다. SMCC 링커는 "절단 가능하지 않은" 것으로 간주되었다 [또한 US 4981979 참고]. SMCC에 의해 DM1에 연결된 HERCEPTIN? (트라스투주마브: trastuzumab)가 보고되었다 [참고: WO 2005/037992].
암 진단 및 치료에 유효한 세포성 표적을 발견하기 위한 시도로, 당해 분야의 연구가들은 하나 이상의 정상적인 비-암성 세포(들)와 비교해서 하나 이상의 특정한 유형의 암 세포 표면 상에서 특이적으로 발현되는 막관통 또는 종양 관련 폴 리펩티드를 확인 (동정)하고자 하였다. 종종, 이러한 종양 관련 폴리펩티드는 비-암성 세포 표면 상과 비교해서 암 세포 표면 상에 더 풍부하게 발현된다. 이러한 종양 관련 세포 표면 항원 폴리펩티드, 즉 종양 관련 항원 (TAA)을 확인 (동정)함으로써, 항체에 의거한 요법을 통하여 파괴시키기 위한 암 세포를 특이적으로 표적화할 수 있는 능력이 야기된다.
모노클로날 항체 요법은 암, 면역학적 장애 및 혈관형성성 장애가 있는 환자를 표적화 치료하기 위해 확립되었다. 성공적인 항체 요법의 한 예는, 세포에 의거한 검정에서 고 친화도 (Kd = 5 nM)로, 인간 표피 성장 인자 수용체 2 단백질 HER2 (ErbB2)의 세포외 도메인과 선택적으로 결합하는 재조합 DNA-유래 인간화 모노클로날 항체인 HERCEPTIN? (트라스투주마브)이다 [참고: US 5821337; US 6054297; US 6407213; US 6639055; Coussens L, et al (1985) Science 230: 1132-9; Slamon DJ, et al (1989) Science 244: 707-12]. 트라스투주마브는 HER2와 결합하는 뮤린 항체 (4D5)의 상보성 결정 영역을 수반하는 인간 골격 영역을 함유하는 IgGl 카파 항체이다. 트라스투주마브는 HER2 항원과 결합하므로, 암성 세포의 성장을 억제한다. 트라스투주마브는 인간화 항체이기 때문에, 환자에게서 어떠한 HAMA 반응도 최소화시킨다. HER2에 대항한 인간화 항체는 포유류 세포 (중국한 햄스터 난소, CHO) 현탁 배양에 의해 생성된다. HER2 (또는 c-erbB2) 원종양형성 유전자는 표피 성장 인자 수용체와 구조적으로 관계가 있는, 185 kDa의 막관통 수용체 단백질을 코딩한다. HER2 단백질 과발현이 원발성 유방암의 25 내지 30%에서 관찰되고, 이는 면역조직화학에 의거하여 고정 종양 블록을 평가함으로써 결정할 수 있다 [참고: Press MF, et al (1993) Cancer Res 53:4960-70]. 트라스투주마브는 시험관내 검정과 동물 둘 다에서, HER2를 과발현하는 인간 종양 세포의 증식을 억제시키는 것으로 밝혀졌다 [참고: Hudziak RM, et al (1989) Mol Cell Biol 9:1165-72; Lewis GD, et al (1993) Cancer Immunol Immunother; 37: 255-63; Baselga J, et al (1998) Cancer Res. 58: 2825-2831]. 트라스투주마브는 항체-의존성 세포성 세포독성, ADCC의 매개제이다 [참고: Hotaling TE, et al (1996) [abstract]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37: 471; Pegram MD, et al (1997) [abstract]. Proc Am Assoc Cancer Res; 38:602; Sliwkowski et al (1999) Seminars in Oncology 26(4), Suppl 12:60-70; Yarden Y. and Sliwkowski, M. (2001) Nature Reviews: Molecular Cell Biology, Macmillan Magazines, Ltd., Vol. 2: 127-137]. HERCEPTIN?은 기존에 광법위한 항암 요법을 받은 적이 있는 ErbB2-과발현성 전이성 유방암 환자에게서 임상적으로 활성이다 [참고: Baselga et al, (1996) J. Clin. Oncol. 14: 737-744]. HERCEPTIN이 기존에 광법위한 항암 요법을 받은 적이 있는 ErbB2-과발현성 유방암 환자를 치료하는데 있어 큰 발전을 가져다 주긴 하지만, 이러한 집단 내의 환자 대다수는 HERCEPTIN 치료에 반응하지 못하거나 불충분한 수준으로만 반응한다. 따라서, 상기 ErbB2-과발현성 종양 환자, 또는 HERCEPTIN 치료에 반응하지 않거나 불충분하게 반응하는 HER2 발현과 연관된 기타 질환이 있는 환자에 대한 추가의 HER2-지향된 암 요법을 개발하는 것이 임상 적으로 상당히 요망된다. HER2 이외에도, 표적화 요법을 이용하여 기타 종양 관련 항원을 활용할 기회는 있다.
요약
본 발명은 암 세포에 대항하여 생물학적 활성을 지닌 신규한 화합물을 제공한다. 이러한 화합물은 포유류에서 종양 성장을 억제할 수 있고, 인간 암 환자를 치료하는데 유용할 수 있다.
본 발명은 치료적 항체-약물 접합체 (ADC) 화합물을 세포 내부에 전달, 수송, 축적 및 체류시키는 것에 관한 것이다. 본 발명은 보다 특히, 암 세포에서 고농도의 활성 대사물 분자를 획득하는 것에 관한 것이다. 세포 내부에 생물학적 활성제를 축적 또는 체류시킬 수 있는 화합물 및 방법에 의해, 세포내 표적화를 달성할 수 있다. 이러한 유효한 표적화를 각종 치료 제제 및 과정에 적용할 수 있다.
마이탄시노이드 약물 부분을 항체에 부착시켜 주는 안정한 비-디설파이드 링커군을 수반한 항체-약물 접합체가 시험관내 효력과 생체내 효능을 증가시킨다는 놀라운 사실이 밝혀졌다. 또한, 이러한 항체-약물 접합체가 특정의 디설파이드 링커 접합체와 비교해서 생체내 안전성이 더 우수하다는 예상치 못한 결과도 밝혀졌다.
항체-약물 접합체 (ADC) 화합물은 특정 링커에 의해 하나 이상의 마이탄시노이드 약물 부분에 공유적으로 부착된 항체를 포함한다. ADC는 하기 화학식 I로써 나타낼 수 있다.
Figure 112006088990037-pct00001
상기식에서,
하나 이상의 마이탄시노이드 약물 부분 (D)은 L에 의해 항체 (Ab)에 공유적으로 연결된다. Ab는 ErbB 수용체와 결합하거나, 또는 하나 이상의 종양 관련 항원 또는 세포-표면 수용체와 결합하는 항체이다. 링커 L은 세포 외부에서, 즉 세포외적으로 안정할 수 있다. 링커 L, 마이탄시노이드 약물 부분 D, 또는 링커와 마이탄시노이드 약물 부분 함께 (L-D)는 디설파이드기를 포함하지 않는다.
한 양태에서, 상당량의 약물 부분은 항체-약물 접합체가 이러한 항체-약물 접합체의 항체에 대해 특이적인 세포-표면 수용체를 수반하는 세포 내로 유입될 때까지 항체로부터 절단되지 않으며, 이러한 항체-약물 접합체가 상기 세포 내로 유입될 때 항체로부터 절단된다.
또 다른 양태에서는, ADC가 ErbB 유전자에 의해 코딩된 수용체, 예를 들어 EGFR, HER2, HER3 및 HER4와 특이적으로 결합한다. ADC는 HER2 수용체의 세포외 도메인과 특이적으로 결합할 수 있다. ADC는 HER2 수용체를 과발현하는 종양 세포의 성장을 억제할 수 있다.
또 다른 양태에서는, 화학식 I의 항체 (Ab)가 인간화 항체, 예를 들어, huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 또는 huMAb4D5-8 (트라스투주마브)이다.
본 발명의 또 다른 국면은 화학식 I 화합물, 또는 그의 제약상 허용 가능한 염 또는 용매화물과, 제약상 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물이다.
또 다른 국면은 화학식 I 화합물과, 항암 특성 또는 기타 치료 효과를 지닌 제2 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 국면에는 본원에 기재된 화합물 및 조성물에 대한 진단 및 치료 용도가 포함된다.
또 다른 국면은 종양 세포 또는 암 세포의 증식을 억제 또는 사멸시키기에 유효한 양의 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용 가능한 염 또는 용매화물로 세포를 처리하는 것을 포함하는, 이러한 종양 세포 또는 암 세포의 증식을 억제 또는 사멸시키는 방법이다.
또 다른 국면은 화학식 I 화합물의 제제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법이다. 한 가지 방법은 포유류에게서 암을 치료하는 것인데, 이러한 암은 ErbB 수용체의 과발현을 특징으로 한다. 이러한 포유류는 접합되지 않은 항-ErbB 항체를 이용한 치료에 반응하지 않거나, 또는 불충분한 수준으로 반응한다. 상기 방법은 포유류에게 치료적 유효량의 항체-약물 접합체 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 국면은 HER2 수용체 및 EGF 수용체로 이루어진 군 중에서 선택된 성장 인자 수용체와 특이적으로 결합하는 항체-약물 접합체 화합물과 화학요법제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 (이러한 항체-약물 접합체 화합물과 화학요법제는 각각, 환자에게서 종양 세포의 성장을 억제시키기에 유효한 양으로 투여한다), 상기 HER2 수용체 및 EGF 수용체로 이루어진 군 중에서 선택된 성장 인자 수용체를 과발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법이다.
또 다른 국면은 화학식 I의 항체-약물 접합체 화합물과 화학요법제를 함께 투여하는 것을 포함하는, ErbB2 수용체의 과발현을 특징으로 하는 장애가 있는 것으로 진단되었거나 이러한 장애에 걸리기 쉬운 (감수성) 인간 환자를 치료하는 방법이다.
또 다른 국면은 세포를 항체-약물 접합체 화합물에 노출시키고, 이러한 항체-약물 접합체 화합물이 상기 세포와 결합하는 정도를 결정하는 것을 포함하는, 암 세포를 검출하는 검정법이다.
또 다른 국면은 HER2의 과발현을 특징으로 하는 질병 또는 장애를 치료하기 위한 ADC 약물 후보를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에는 항체-약물 접합체, 용기, 및 특정 치료를 표시한 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함하는 제조품, 즉 키트가 포함된다.
또 다른 국면에는 항체-약물 접합체 화합물을 사용하여, 특정 환자에게서 HER2의 과발현을 특징으로 하는 질병 또는 장애를 치료하는 방법이 포함된다.
또 다른 국면에는 항체-약물 접합체 화합물의 제조 방법, 합성 방법, 접합 방법 및 정제 방법; 및 이러한 항체-약물 접합체 화합물을 제조, 합성 및 접합하기 위한 중간체가 포함된다.
도 1은 항체-약물 접합체로 처리한 SK-BR-3 세포를 이용한 시험관내 세포 증 식 검정을 도시한 것이다: -□- 트라스투주마브-SPP-DMl, -△-트라스투주마브-SPDP-DM1, 및 -○- 트라스투주마브-SMCC-DM1.
도 2는 항체-약물 접합체로 처리한 BT-474 세포를 이용한 시험관내 세포 증식 검정을 도시한 것이다: -□- 트라스투주마브-SPP-DMl, -△-트라스투주마브-SPDP-DM1, 및 -○- 트라스투주마브-SMCC-DM1.
도 3은 항체-약물 접합체로 처리한 MCF7 세포를 이용한 시험관내 세포 증식 검정을 도시한 것이다: -□- 트라스투주마브-SPP-DMl, -△-트라스투주마브-SPDP-DM1, 및 -○- 트라스투주마브-SMCC-DM1.
도 4는 항체-약물 접합체로 처리한 MDA-MB-468 세포를 이용한 시험관내 세포 증식 검정을 도시한 것이다: -□- 트라스투주마브-SPP-DMl, -△-트라스투주마브-SPDP-DM1, 및 -○- 트라스투주마브-SMCC-DM1.
도 5는 종양을 수반하지 않은 베이지 (beige) 누드 마우스에서 트라스투주마브-SMCC-DMl 대 트라스투주마브-SPP-DM1의 혈청 제거율을 도시한 것인데, 이는 접합체 및 총 항체 혈청 농도를 7일에 걸쳐 6회 (투약 후 5분, 1시간, 6시간, 24시간, 72시간, 168시간) 측정하였다.
도 6은 종양을 수반하지 않은 누드 마우스에서 시간 경과에 따른 접합체: 트라스투주마브-SPDP-DM1, 트라스투주마브-SPP-DM1, 트라스투주마브-SPP-DM3, 트라스투주마브-SPP-DM4, 및 트라스투주마브-SMCC-DMl의 안정성을 도시한 것인데, 이는 혈청 농도를 7일에 걸쳐 6회 (투약 후 5분, 1시간, 6시간, 24시간, 72시간, 168시간) 측정하였다.
도 7은 처치 후 7일 동안, 종양을 수반한 마우스 및 종양을 수반하지 않은 마우스에서 총 트라스투주마브/트라스투주마브-SMCC-DMl, 및 총 트라스투주마브/트라스투주마브-SPP-DMl의 혈청 농도 측정치를 도시한 것이다.
도 8은 4마리의 피검 랫트에게 10 mg/kg의 트라스투주마브-SPP-DM1을 투여한 후 혈장 농도 제거율 연구를 도시한 것이다. 총 항체 및 트라스투주마브-SPP-DM1의 농도를 측정하였다 (tr = 트라스투주마브).
도 9는 4마리의 피검 랫트에게 10 mg/kg의 트라스투주마브-SMCC-DM1을 투여한 후 혈장 농도 제거율 연구를 도시한 것이다. 총 항체 및 트라스투주마브-SMCC-DM1의 농도를 측정하였다.
도 10은 비히클 (PBS pH 6.5), 트라스투주마브-SPP-DMl (370 ㎍ DM1/㎡), 및 트라스투주마브-SMCC-DM1 (330 ㎍ DM1/㎡) (여기서, 용량은 투여된 DM1의 용량을 지칭한다)을 투여한 마우스에서 시간 경과에 따른 평균 종양 용적 변화를 도시한 것이다.
도 11은 0일 째에 비히클 (PBS pH 6.5), 10 mg/kg 트라스투주마브-SIAB-DMl (3.4 DM1/Ab; 168 ㎍ DMl/kg), 및 10 mg/kg 트라스투주마브-SMCC-DM1 (3.2 DM1/Ab; 158 ㎍ DMl/kg) (여기서, 용량은 투여된 항체-약물 접합체의 용량을 지칭한다)을 투여한, Fo5 종양 동종이식편을 수반한 무흉선 누드 마우스에서 시간 경과에 따른 평균 종양 용적 변화를 도시한 것이다.
도 12는 비히클 (PBS pH 6.5), 10 mg/kg 트라스투주마브-SPP-DM1, 10 mg/kg 트라스투주마브-SPP-DM4, 10 mg/kg 트라스투주마브-SPP-DM3, 및 10 mg/kg 트라스투 주마브-SMCC-DMl을 단일 주사함으로써, MMTV-Her2 Fo 5 베이지 누드 마우스 (각 무리당 7마리, 모두 종양이 있음, Ti = 7)에서 시간 경과에 따른 평균 종양 용적 변화를 도시한 것이다.
도 13은 HER2-Fo5 종양에서 비히클 (PBS pH 6.5), 트라스투주마브-SPP-DM1, 트라스투주마브-SPP-DM4, 트라스투주마브-SPP-DM3, 및 트라스투주마브-SMCC-DM1에 대한, 이중 종양 용적으로 되는 시간 및 log 세포 사멸 분석 결과를 도시한 것이다.
도 14는 비히클 (10 mM 나트륨 석시네이트, 100 mg/mL 슈크로스, 0.1% 트윈 (Tween) 20, pH 5.0), 트라스투주마브-SPP-DM1 (1860 ㎍ DM1/㎡), 트라스투주마브-SMCC-DM1 (1860 ㎍ DM1/㎡), 트라스투주마브-SMCC-DMl (3260 ㎍ DM1/㎡), 및 자유 DM1 (650 ㎍/㎡)을 투여한 랫트의 시간 경과에 따른 체중 변화를 도시한 것이다.
도 15는 비히클 (10 mM 나트륨 석시네이트, 100 mg/mL 슈크로스, 0.1% 트윈 20, pH 5.0), 트라스투주마브-SPP-DMl (22.3 mg/kg), 트라스투주마브-SMCC-DMl (10 mg/kg), 트라스투주마브-SMCC-DM1 (25 mg/kg), 트라스투주마브-SMCC-DMl (50 mg/kg), 및 자유 DM1을 투여한 랫트 모델에서, 시간 경과에 따른 AST 단위/L로 측정된 간 기능 시험 결과를 도시한 것이다.
도 16은 비히클 (10 mM 나트륨 석시네이트, 100 mg/mL 슈크로스, 0.1% 트윈 20, pH 5.0), 트라스투주마브-SPP-DMl (22.3 mg/kg), 트라스투주마브-SMCC-DMl (10 mg/kg), 트라스투주마브-SMCC-DM1 (25 mg/kg), 트라스투주마브-SMCC-DMl (50 mg/kg), 및 자유 DM1을 투여한 랫트 모델에서, 시간 경과에 따른 세포 중의 PLT 단 위/L로 측정된 안전성 프로파일을 도시한 것이다.
도 17은 항체-약물 접합체로 처리한 HT1080EphB2 (C8) 세포를 이용한 시험관내 세포 증식 검정을 도시한 것이다: -▲- 항EphB2R 2H9-SPP-DM1, 및 -▼- 항EphB2R 2H9-SMCC-DM1.
본 발명의 특정 양태에 대한 참고가 다음에 상세히 이루어질 것인데, 그의 예들은 수반되는 구조 및 식으로 예시된다. 본 발명이 예시된 양태와 연계해서 기재되긴 하였지만, 본 발명이 이들 양태로 제한되지 않는다는 것을 인지해야 할 것이다. 이와는 달리, 본 발명은 청구의 범위에 규정된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 등가 양태를 포괄한다.
당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 본원에 기재된 바와 유사하거나 등가의 많은 방법 및 물질을 인지할 것이다. 본 발명이 본원에 기재된 방법 및 물질로만 제한되지 않는다.
달리 규정하지 않는 한, 본원에 사용된 기술적 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하는 바와 동일한 의미를 갖고, 다음 문헌에 기재된 바와 부합된다 [참고: Singleton et al., (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed., J. Wiley & Sons, New York, NY; and Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York].
정의
달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 다음 용어 및 문장은 다음 의미를 갖는다:
본원에 상표명이 사용된 경우, 본 출원인은 상표명 제품 제제, 일반 약물, 및 상표명 제품의 활성 제약 성분(들)을 독립적으로 포함시키고자 한다.
본원에서의 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이량체, 다량체, 다중-특이적 항체 (예: 이중-특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편이 포함된다 [참고: Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861]. 항체는 뮤린, 인간, 인간화, 키메라, 또는 기타 종으로부터 유래된 것일 수 있다. 항체는 특이적 항원을 인식하고 이와 결합할 수 있는 면역계에 의해 생성된 단백질이다 [참고: Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York]. 표적 항원은 일반적으로, 다중 항체 상의 CDRs에 의해 인식된 수 많은 결합 부위 (에피토프로 불리우기도 함)를 갖는다. 상이한 에피토프와 특이적으로 결합하는 각 항체는 상이한 구조를 갖는다. 따라서, 하나의 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수도 있다. 항체에는 완전한 길이 면역글로불린 분자 또는 완전한 길이 면역글로불린의 면역학적 활성 부분, 즉 관심있는 표적 항원 (이러한 표적에는 암 세포, 또는 자가면역 질환과 연관된 자가면역 항체를 생성시키는 세포가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다) 또는 그의 일부와 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자가 포함된다. 본원에 기재된 면역글로불린은 면역글로불린 분자의 모든 유형 (예: IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 부류 (예: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 아부류일 수 있다. 면역글로불린은 모든 종으로부터 유래될 수 있다. 그러나, 한 국면에서는 면역글로불린이 인간, 뮤린 또는 토끼 기원이다.
"항체 단편"은 완전한 길이 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합성 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아보디 (diabody); 선형 항체; Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 항-개체특이형 (항-Id) 항체, CDR (상보성 결정 영역), 및 암 세포 항원, 바이러스성 항원 또는 미생물성 항원과 면역특이적으로 결합하는 상기 항체의 에피토프-결합성 단편; 단일 쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원성 부위에 대항하여 발생된다. 더우기, 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 발생된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 발생된다. 모노클로날 항체는 그의 특이성 이외에도, 기타 항체에 의해 오염되지 않은 채로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 나타내고, 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [참고: Kohler et al (1975) Nature, 256: 495]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법 [참고: US 4816567]에 의해 만들 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어 문헌 [참고: Clackson et al (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al (1991) J. Mol.Biol., 222: 581-597]에 기재된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.
본원에서의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 그의 단편이 포함된다 [참고: US 4816567; and Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855]. 본원에서 관심있는 키메라 항체에는 비-인간 영장류 [예: 구세계 원숭이 또는 유인원]로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합성 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체가 포함된다.
본원에서의 "본래 항체(intact antibody)"는 VL 및 VH 도메인 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 본래 서열 불변 도메인 (예: 인간 본래 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 본래 항체는 한 가지 이상의 "효과기 기능"을 지닐 수 있는데, 이는 항체의 Fc 영역 (본래 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예에는 Clq 결합성; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합성; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 포식작용; 및 세포 표면 수용체 (예: B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절이 포함된다.
본래 항체의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 이러한 항체는 상이한 "부류"로 지정될 수 있다. 본래 항체에는 5가지 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 있는데, 이들 중의 몇 개는 "아부류" (이소형)으로 추가 분할될 수 있다: 예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 상이한 부류의 면역글로불린의 소단위체 구조와 3차원적 입체 배치는 널리 공지되어 있다.
"ErbB 수용체"는 세포 성장, 분화 및 생존에 있어 중요한 매개인자인 ErbB 수용체 계열에 속하는 수용체 단백질 티로신 키나제이다. 이러한 ErbB 수용체 계열에는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR, ErbB1, HER1), HER2 (ErbB2 또는 p185 neu ), HER3 (ErbB3) 및 HER4 (ErbB4 또는 tyro2)를 포함한 4가지 별개의 구성원이 포함된다. 인간 유방 종양 세포주 SKBR3을 사용하여, 항-ErbB2 항체 패널을 성상 확인하였다 [참고: Hudziak et al (1989) Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172]. 4D5로 불리우는 항체를 이용한 경우에 최대 억제를 수득하였는데, 이는 세포 증식을 56% 정도 억제하였다. 패널 내의 기타 항체는 본 검정에서 약간 덜한 정도로 세포 증식을 저하시켰다. 항체 4D5는 ErbB2-과발현성 유방 종양 세포주가 TNF-α의 세포독성 효과에 감작되도록 한다는 사실이 추가로 밝혀졌다 [참고: US 5677171]. 상기 (Hudziak et al) 문헌에 논의된 항-ErbB2 항체는 다음 문헌에서 추가로 성상 확인되었다 [참고: Fendly et al (1990) Cancer Research 50: 1550-1558; Kotts et al. (1990) In Vitro 26 (3):59A; Sarup et al. (1991) Growth Regulation 1: 72-82; Shepard et al. J. (1991) Clin. Immunol. 11 (3):117-127; Kumar et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11 (2):979-986; Lewis et al. (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838; Vitetta et al. (1994) Cancer Research 54: 5301-5309; Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269 (20):14661-14665; Scott et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 14300-5; D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91: 7202-7206; Lewis et al. (1996) Cancer Research 56: 1457-1465; and Schaefer et al. (1997) Oncogene 15:1385-1394].
각종 특성을 지닌 기타 항-ErbB2 항체가 다음 문헌에 보고되었다 [참고: Franklin et al (2004) Cancer Cell 5: 317-328; Tagliabue et al (1991) Int. J. Cancer 47: 933-937; McKenzie et al (1989) Oncogene 4: 543-548; Maier et al (1991) Cancer Res. 51: 5361-5369; Bacus et al (1990) Molecular Carcinogenesis 3:350- 362; Stancovski et al (1991) PNAS (USA) 88: 8691-8695; Bacus et al (1992) Cancer Research 52:2580-2589; Xu et al (1993) Int. J. Cancer 53:401-408; W0 94/00136; Kasprzyk et al (1992) Cancer Research 52:2771-2776; Hancock et al (1991) Cancer Res. 51: 4575-4580; Shawver et al (1994) Cancer Res. 54:1367-1373; Arteaga et al (1994) Cancer Res. 54: 3758-3765; Harwerth et al (1992) J. Biol. Chem. 267: 15160-15167; US 5783186; and Klapper et al (1997) Oncogene 14:2099-2109].
서열 실체를 스크리닝한 결과, 2가지 기타 ErbB 수용체 계열 구성원이 확인 (동정)되었다: ErbB3 [참고: US 5,183,884; US 5,480,968; Kraus et al (1989) PNAS (USA) 86: 9193-9197] 및 ErbB4 [참고: EP 599274; Plowman et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750; and Plowman et al (1993) Nature 366: 473-475]. 이들 수용체 둘 다는 적어도 몇몇 유방암 세포주 상에서 발현 증가를 나타낸다.
ErbB 수용체는 일반적으로, ErbB 리간드와 결합할 수 있는 세포외 도메인; 친지성 막관통 도메인; 보존된 세포내 티로신 키나제 도메인; 및 인산화될 수 있는 여러 개의 티로신 잔기를 정착시킨 카복실-말단 신호 전달 도메인을 포함할 것이다. ErbB 수용체는 "본래 서열" ErbB 수용체 또는 그의 "아미노산 서열 변이체"일 수 있다. ErbB 수용체는 본래 서열 인간 ErbB 수용체일 수 있다. 따라서, "ErbB 수용체 계열의 구성원"은 EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3, ErbB4, 또는 현재 공지되어 있거나 앞으로 확인될 기타 모든 ErbB 수용체이다.
용어 "ErbB1", "표피 성장 인자 수용체", "EGFR" 및 "HER1"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 이는 예를 들어, 문헌 [참고: Carpenter et al (1987) Ann. Rev. Biochem. 56:881-914]에 기재된 바와 같은 EGFR을 지칭하는데, 이에는 그의 천연 발생적 돌연변이체 형태, 예를 들어 문헌 [참고: Humphrey et al., (1990) PNAS (USA), 87: 4207-4211]에서와 같은 결실 돌연변이체 EGFR이 포함된다. 용어 erbB1은 EGFR 단백질 생성물을 코딩하는 유전자를 지칭한다. HER1에 대항한 항체가, 예를 들어 문헌 [참고: Murthy et al (1987) Arch. Biochem. Biophys., 252: 549-560 and in WO 95/25167]에 기재되어 있다.
용어 "ERRP", "EGF-수용체 관련 단백질", "EGFR 관련 단백질" 및 "표피 성장 인자 수용체 관련 단백질"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 이는 예를 들어, US 6399743 및 US 2003/0096373에 기재된 바와 같은 ERRP를 지칭한다.
표현 "ErbB2" 및 "HER2"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 이는 예를 들어, 문헌 [참고: Semba et al (1985) PNAS (USA), 82: 6497-6501 and Yamamoto et al (1986) Nature, 319: 230-234]에 기재된 인간 HER2 단백질을 지칭한다 (진뱅크 승인 번호 X03363). 용어 "erbB2"는 인간 ErbB2를 코딩하는 유전자를 지칭하고, "neu"는 랫트 pl85neu를 코딩하는 유전자를 지칭한다.
"ErbB3" 및 "HER3"은, 예를 들어 문헌 [참고: US 5183884; US 5480968; Kraus et al (1989) PNAS (USA) 86: 9193-9197]에 기재된 바와 같은 수용체 폴리펩티드를 지칭한다. ErbB3에 대항한 항체가 당해 분야에 공지되어 있다 [참고: US 5183884; US 5480968; WO 97/35885].
본원에서의 용어 "ErbB4" 및 "HER4"는, 예를 들어 문헌 [참고: EP Pat Appln No 599,274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); and Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993)]에 기재된 바와 같은 수용체 폴리펩티드를 지칭하는데, 이에는 예를 들어, WO 99/19488에 기재된 바와 같은 그의 이소형이 포함된다. HER4에 대항한 항체가, 예를 들어 WO 02/18444에 기재되어 있다.
ErbB 수용체에 대한 항체는 수 많은 공급처 [예: Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA]로부터 시판되고 있다.
"ErbB 리간드"란 ErbB 수용체와 결합하고/하거나 이를 활성화시키는 폴리펩티드를 의미한다. ErbB 리간드는 본래 서열 인간 ErbB 리간드, 예를 들어 표피 성장 인자 (EGF) [참고; Savage et al (1972) J. Biol. Chem., 247: 7612-7621]; 전환 성장 인자 알파 (TGF-α) [참고: Marquardt et al (1984) Science 223: 1079-1082]; 신경초종 (schwanoma) 또는 각질세포 자가분비 성장 인자로서 공지되기도 한 암피레굴린 (amphiregulin) [참고: Shoyab et al (1989) Science 243: 1074-1076; Kimura et al (1990) Nature 348: 257-260; and Cook et al (1991) Mol. Cell. Biol., 11: 2547-2557]; 베타셀룰린 (betacellulin) [참고: Shing et al (1993) Science 259:1604-1607; and Sasada et al (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173]; 헤파린-결합성 표피 성장 인자 (HB-EGF) [참고: Higashiyama et al (1991) Science 251: 936-939]; 에피레굴린 (epiregulin) [참고: Toyoda et al (1995) J. Biol. Chem. 270:7495-7500; and Komurasaki et al (1997) Oncogene 15: 2841-2848]; 헤레굴린 (하기 참고); 뉴레굴린 (neuregulin)-2 (NRG-2) [참고: Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)]; 뉴레굴린-3 (NRG-3) [참고: Zhang et al (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 9562-9567]; 뉴레굴린-4 (NRG-4) [참고: Harari et al (1999) Oncogene, 18: 2681-89] 또는 크립토 (cripto) (CR-1) [참고: Kannan et al (1997) J. Biol. Chem., 272 (6):3330-3335]일 수 있다. EGFR과 결합하는 ErbB 리간드에는 EGF, TGF-α, 암피레굴린, 베타셀룰린, HB-EGF 및 에피레굴린이 포함된다. ErbB3과 결합하는 ErbB 리간드에는 헤레굴린이 포함된다. ErbB4와 결합할 수 있는 ErbB 리간드에는 베타셀룰린, 에피레굴린, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 및 헤레굴린이 포함된다. ErbB 리간드는 또한, 합성 ErbB 리간드일 수 있다. 이러한 합성 리간드는 특정한 ErbB 수용체에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 특정한 ErbB 수용체 복합체를 인식할 수 있다. 합성 리간드의 한 예가 합성 헤레굴린/EGF 키메라 비레굴린 (biregulin)이다 [참고: 예를 들어, Jones et al (1999) FEBS Letters, 447:227-231; 본원에 참고로 도입된다].
"헤레굴린" (HRG)은 문헌 [참고: US 5641869 or Marchionni et al (1993) Nature 362: 312-318]에 기재된 바와 같은 헤레굴린 유전자 생성물에 의해 코딩된 폴리펩티드를 지칭한다. 헤레굴린의 예에는 헤레굴린-α, 헤레굴린-β1, 헤레굴린-β2 및 헤레굴린-β3 [참고: Holmes et al (1992) Science 256: 1205-1210; and US 5641869]; neu 분화 인자 (NDF) [참고: Peles et al (1992) Cell 69:205-216]; 아세틸콜린 수용체-유도 활성 (ARIA) [참고: Falls et al (1993) Cell 72: 801-815]; 신경교 성장 인자 (GGFs) [참고: Marchionni et al (1993) Nature, 362: 312-318]; 감각 및 운동 신경세포 유래 인자 (SMDF) [참고: Ho et al (1995) J. Biol. Chem. 270:14523-14532]; γ-헤레굴린 [참고: Schaefer et al (1997) Oncogene, 15: 1385-1394]이 포함된다. 상기 용어에는 본래 서열 HRG 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편 및/또는 아미노산 서열 변이체, 예를 들어 그의 EGF-유사 도메인 단편 (예: HRGβ1177-244)이 포함된다.
"ErbB 이종-올리고머"는 2개 이상의 상이한 ErbB 수용체를 포함하는 비공유적으로 연합된 올리고머이다. "ErbB 이량체"는 2개의 상이한 ErbB 수용체를 포함하는 비공유적으로 연합된 올리고머이다. 이러한 복합체는 2개 이상의 ErbB 수용체를 발현하는 세포가 ErbB 리간드에 노출되는 경우에 형성될 수 있다. ErbB 올리고머, 예를 들어 ErbB 이량체는 예를 들어, 문헌 [참고: Sliwkowski et al (1994) J. Biol. Chem., 269 (20):14661-14665]에 기재된 바와 같이 면역침전에 의해 분리할 수 있고 SDS-PAGE에 의해 분석할 수 있다. 이러한 ErbB 이종-올리고머의 예에는 EGFR-ErbB2 (HER1/HER2로서 지칭되기도 함), ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3) 및 ErbB3-ErbB4 (HER3/HER4) 복합체가 포함된다. 더우기, ErbB 이종-올리고머는 상이한 ErbB 수용체, 예를 들어 ErbB3, ErbB4 또는 EGFR (ErbB1)와 결합된 2개 이상의 ErbB2 수용체를 포함할 수 있다. 기타 단백질, 예를 들어 사이토킨 수용체 소단위체 (예: gp130)가 이종-올리고머에 포함될 수 있다.
"ErbB 수용체의 리간드 활성화"란 관심있는 ErbB 수용체를 포함하는 ErbB 이종-올리고머에 대한 ErbB 리간드 결합에 의해 매개된 신호 전달 (예를 들어, ErbB 수용체 또는 기질 폴리펩티드 내의 ErbB 수용체 인산화 티로신 잔기의 세포내 키나제 도메인에 의해 유발된 신호 전달)을 의미한다. 일반적으로, 이는 이종-올리고머 내의 하나 이상의 ErbB 수용체의 키나제 도메인을 활성화시키는 ErbB 이종-올리고머에 ErbB 리간드를 결합시킴으로써, 하나 이상의 ErbB 수용체 내의 티로신 잔기를 인산화시키고/시키거나 부가의 기질 폴리펩티드(들) 내의 티로신 잔기를 인산화시킬 것이다. ErbB 수용체 활성화는 각종 티로신 인산화 검정을 이용하여 정량화할 수 있다.
"본래 서열" 폴리펩티드는 천연으로부터 유래된 폴리펩티드 (예: ErbB 수용체 또는 ErbB 리간드)와 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이다. 이러한 본래 서열 폴리펩티드는 천연으로부터 분리할 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성시킬 수 있다. 따라서, 본래 서열 폴리펩티드는 천연 발생적 인간 폴리펩티드, 뮤린 폴리펩티드, 또는 기타 모든 포유류 종으로부터의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
용어 "아미노산 서열 변이체"는 본래 서열 폴리펩티드와는 어느 정도 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 통상적으로, 아미노산 서열 변이체는 본래 ErbB 리간드의 하나 이상의 수용체 결합성 도메인 또는 본래 ErbB 수용체의 하나 이상의 리간드 결합성 도메인과의 서열 동일률이 약 70% 이상이거나, 또는 상기 수용체 또는 리간드 결합성 도메인과의 상동률이 약 80% 이상 또는 약 90% 이상일 것이다. 아미노산 서열 변이체는 본래 아미노산 서열 내의 특정 위치에서 치환, 결실 및/또는 삽입물을 보유하고 있다.
"서열 동일률"은 서열들을 정렬하고, 최대 서열 동일률을 달성하기 위해 필요에 따라 갭을 도입한 후에 동일한 아미노산 서열 변이체 내의 잔기 비율로서 규정된다. 정렬 방법 및 정렬시키기 위한 컴퓨터 프로그램은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램 중의 하나가 "얼라인 (Align) 2"인데, 이는 제넨테크, 인코포레이티드 (Genentech, Inc.)가 1991년 12월 10일자로 미국 저작권국 (the United States Copyright Office, Washington, DC 20559)에 사용자 문서로 출원하였다.
"항체-의존성 세포-매개된 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcRs)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예: 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식 세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 다음, 연속해서 이러한 표적 세포의 용해를 유발시키는 세포-매개성 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는데 있어 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [참고: Ravetch and Kinet, (1991) Annu. Rev. Immunol 9: 457-92]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다 [참고: US 55003621; US 5821337]. 이러한 검정에 유용한 효과기 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [참고: Clynes et al (1998) PNAS (USA) 95: 652-656]에 기재된 바와 같이 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"마이탄시노이드 약물 부분"은 마이탄신 화합물의 구조를 갖는 항체-약물 접합체의 아구조를 의미한다. 마이탄신은 동아프리카산 관목 마이테누스 세라타 (Maytenus serrata)로부터 처음 분리하였다 [참고: US 3896111]. 이어서, 특정 미생물이 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄시놀 및 C-3 마이탄시놀 에스테르를 생성시키는 것으로 밝혀졌다 [참고: US 4151042]. 합성 마이탄시놀 및 마이탄시놀 유사체가 보고되었다 [참고: US 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663; and 4371533, and Kawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull. 3441-3451; 이들 각각은 본원에 참고로 삽입된다].
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합하는 수용체, 예를 들어 본래 서열 인간 FcR을 기재하기 위해 사용된다. FcR은 IgG 항체와 결합할 수 있고 (감마 수용체), 이에는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 아부류의 수용체가 포함되는데, 이에는 이들 수용체의 대립 유전자성 변이체 및 대체 스플라이싱된 형태 또한 포함된다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제성 수용체")가 포함되는데, 이는 그의 세포질성 도메인에 있어서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질성 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제성 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질성 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 [참고: M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)]. FcRs는 다음 문헌에 고찰되었다 [참고: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4: 25-34 (1994); and de Haas et al (1995) J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41]. 기타 FcRs는 앞으로 확인될 것을 포함하여, 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다. 상기 용어에는 또한, 모계 IgGs를 태아에게 전이시키는데 책임이 있는 신생아 수용체 FcRn이 포함된다 [참고: Guyer et al (1976) J. Immunol., 117: 587 and Kim et al (1994) J. Immunol., 24: 249].
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서 표적 세포를 용해시킬 수 있는 특정 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)을, 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예: 항체)와 결합시킴으로써 개시시킨다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [참고: Gazzano-Santoro et al (1996) J. Immunol. Methods 202: 163]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.
"본래 항체"는 통상적으로, 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종-사량체성 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 디설파이드 연쇄 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄들 간에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한, 규칙적으로 이격된 쇄내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH)에 이어 수 많은 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 간의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 간의 서열에 있어 광범위하게 상이하고, 이러한 부분은 특정한 각 항체가 그의 특정한 항원에 대한 특이성과 결합을 위해 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균등한 수준으로 분포되지는 않는다. 이는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다 내에 초가변 영역으로 불리우는 3가지 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분이 골격 영역 (FRs)으로 지칭된다. 본래 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FRs을 포함하는데, 이는 β-시트 구조를 연결하고 몇몇 경우에는 이러한 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 β-시트 입체 배치를 상당 부분 채택하고 있다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 상기 FRs에 의해 아주 근접하게 함께 결합되어 있고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 [참고: Kabat et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]. 불변 영역은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 각종의 효과기 기능, 예를 들어 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체 참여를 나타낸다.
본원에 사용된 경우의 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로, "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 [예를 들면, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (Ll), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3); 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31-35 (Hl), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat et al, 상기 참고] 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 [예를 들면, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (Ll), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3); 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 참고: Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol.. 196: 901-917]를 포함한다. "골격 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 규정된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
항체를 파파인 분해시키면, "Fab" 단편으로 불리우는 2개의 동일한 항원 결합 단편 (각각은 단일 항원 결합 부위를 갖는다)과 잔류성 "Fc" 단편 (이의 명칭은 용이하게 결정화될 수 있는 그의 능력을 반영한다)이 생성된다. 펩신 처리하면, 2개의 항원 결합 부위를 갖고 항원과 여전히 가교 결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생상된다.
"Fv"는 완전한 항체 인식 및 항체 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다. 이러한 입체 배치에서는, 각 가변 도메인의 3개 초가변 영역이 VH-VL 이량체 표면 상에 항원 결합 부위를 명백히 규정하도록 상호 작용한다. 집합적으로, 6개 초가변 영역이 항체에 항원 결합 특이성을 부여해 준다. 그러나, 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화도이긴 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 특정 항원에 대해 특이적인 3개의 초가변 영역 만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다.
Fab 단편은 또한, 경쇄의 불변 도메인과, 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상 시스테인을 포함한 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 수 개의 잔기를 부가한다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 1개 이상의 자유 티올기를 보유하고 있는, Fab'에 대한 본원의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래에는, 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링물이 또한 공지되어 있다.
모든 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 2가지 명백한 별개 유형 [카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭됨] 중의 하나로 지정될 수 있다.
"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 쇄 가변 영역 항체 단편을 의미하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 해주는, VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다 [참고: Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]. 항-ErbB2 항체 scFv 단편이 문헌 [참고: WO 93/16185; US 5571894; US 5587458]에 기재되었다.
용어 "디아보디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 가변 경쇄 도메인 (VL)과 연결된 가변 중쇄 도메인 (VH)을 포함한다 (VH - VL). 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 이들 도메인을 또 다른 쇄의 상보적 도메인와 짝짓기시킴으로써, 2개의 항원-결합 부위를 창출시킨다. 디아보디는, 예를 들어 다음 문헌에 보다 상세히 기재되었다 [참고: EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448].
"인간화" 형태의 비-인간 (예: 설치류) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에는, 인간 면역글로불린의 골격 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 더우기, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정련시키기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FRs는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로, 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 내역에 대해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Jones et al (1986) Nature, 321: 522-525; Reichmann et al (1988) Nature, 332: 323-329; and Presta, (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596].
인간화 항-ErbB2 항체에는 US 5821337 (본원에 참고로 삽입된다)의 표 3에 기재된 바와 같은 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 (HERCEPTIN?, 트라스투주마브); 인간화 520C9 [참고: WO 93/21319] 및 인간화 2C4 항체가 포함된다.
"분리된" 항체는 그의 천연 환경의 특정 구성분으로 확인되어, 이러한 환경으로부터 격리 및/또는 회수시킨 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 수도 있는 물질인데, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질이 포함될 수 있다. 항체를 (1) 로리 (Lowry) 방법에 의해 결정된 바와 같이 항체의 95 중량% 초과, 또는 99 중량% 초과로 정제시키거나, (2) 스피닝 컵 시퀘네이터 (spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제시키거나, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색 (silver stain)을 사용하여 환원성 또는 비환원성 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하도록 정제할 것이다. 분리된 항체에는 재조합 세포 내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 분리된 항체는 한 가지 이상의 정제 단계에 의해 제조할 것이다.
관심있는 항원, 예를 들어 ErbB2 항원과 "결합하는" 항체는 이러한 항체가 상기 항원을 발현하는 세포를 표적화하는데 있어 유용하도록 충분한 친화성으로 항원과 결합할 수 있는 것이다. 항체가 ErbB2와 결합하는 것인 경우에는, 통상적으로 기타 ErbB 수용체와는 달리 ErbB2와 우선적으로 결합할 것이며, 기타 단백질, 예를 들어 EGFR, ErbB3 또는 ErbB4와는 상당히 교차 반응하지 않는 것일 수 있다. 이러한 양태에서는, 항체가 이들 비-ErbB2 단백질과 결합하는 정도 (예를 들어, 내인성 수용체에 대한 세포 표면 결합성)가 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전 (RIA)에 의해 결정된 바와 같이 10% 미만일 것이다. 종종, 항-ErbB2 항체는 문헌 [참고: Schecter et al (1984) Nature 312: 513, and Drebin et al (1984) Nature, 312: 545-548]에 기재된 바와 같이, 랫트 neu 단백질과 상당히 교차 반응하지 않을 것이다.
ErbB 수용체의 리간드 활성화를 "차단"시키는 항체는 이러한 활성화를 저하 또는 방지시키는데, 이 항체는 모노클로날 항체 4D5 보다 실질적으로 더 효과적으로 ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시킬 수 있고, 예를 들어 모노클로날 항체 7F3 또는 2C4 또는 그의 Fab 단편 만큼 효과적으로 차단시킨다. 예를 들어, ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체는 ErbB 이종-올리고머의 형성을 차단시키는데 있어 4D5 보다 약 50 내지 100% 더 효과적인 것일 수 있다. ErbB 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 것은 모든 수단에 의해, 예를 들어 ErbB 수용체에 대한 리간드 결합, ErbB 복합체 형성, ErbB 복합체 내에서 ErbB 수용체의 티로신 키나제 활성 및/또는 ErbB 수용체 내에 있거나 또는 ErbB 수용체에 의한 티로신 키나제 잔기(들)의 인산화를 방해함으로써 일어날 수 있다.
지정된 항체, 예를 들어 2C4 (Omnitarg, 공급처: Genetech, Inc.)로 지정된 모노클로날 항체의 "생물학적 특징"을 지닌 항체는, 이를 동일한 항원 (예: ErbB2)과 결합하는 기타 항체들과 구별시켜 주는 항체의 한 가지 이상 생물학적 특징을 보유하고 있는 것이다. 예를 들어, 2C4의 생물학적 특징을 지닌 항체는 ErbB2 및 ErbB3, ErbB1 또는 ErbB4를 포함하는 ErbB 이종-올리고머의 HRG 활성화를 차단시킬 수 있고/있거나; EGFR 및 ErbB2를 포함하는 ErbB 수용체의 EGF, TGF-α, HB-EGF, 에피레굴린 및/또는 암피레굴린 활성화를 차단시킬 수 있고/있거나; MAPK의 EGF, TGF-α 및/또는 HRG 매개된 활성화를 차단시킬 수 있고/있거나; 2C4에 의해 결합된 바와 동일한, ErbB2의 세포외 도메인 내의 동일한 에피토프와 결합할 수 있다 (예를 들어, ErbB2에 대한 모노클로날 항체 2C4의 결합을 차단시킨다).
달리 지시되지 않는 한, "모노클로날 항체 2C4"란 표현은 다음 실시예의 뮤린 2C4 항체의 항원 결합성 잔기 또는 뮤린 2C4 항체로부터 유래된 항원 결합성 잔기를 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 모노클로날 항체 2C4는 뮤린 모노클로날 항체 2C4, 또는 뮤린 모노클로날 항체 2C4의 항원 결합성 아미노산 잔기를 보유하고 있는 그의 변이체, 예를 들어 인간화 항체 2C4일 수 있다 [참고: WO 01/00245]. 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 경우의 표현 "rhuMAb 2C4"는 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포에 의해 임의로 발현된 인간 경쇄 및 중쇄 IgG1 (비-A 동종이형) 불변 영역 서열과 융합된, 서열 3 및 4의 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 서열을 각각 포함하는 항체를 지칭한다 [참고: WO 01/00245].
달리 지시되지 않는 한, 용어 "모노클로날 항체 4D5"는 뮤린 4D5 항체 (ATCC CRL 10463)의 항원 결합성 잔기 또는 뮤린 4D5 항체로부터 유래된 항원 결합성 잔기를 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 모노클로날 항체 4D5는 뮤린 모노클로날 항체 4D5, 또는 뮤린 모노클로날 항체 4D5의 항원 결합성 잔기를 보유하고 있는 그의 변이체, 예를 들어 인간화 항체 4D5일 수 있다. 인간화 4D5 항체의 예에는 US 5821337에서와 같은, huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 (HERCEPTIN?)이 포함된다.
"성장 억제제"는 특정 세포, 특히 ErbB-발현성 암 세포의 성장을 시험관내 또는 생체 내에서 억제시켜 주는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S 상에서의 ErbB-발현성 세포의 비율을 상당히 감소시켜 주는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예에는 (S 상 이외의 위치에서) 세포-주기 진행을 차단시켜 주는 작용제, 예를 들어 G1 정지 및 M-상 정지를 유도시켜 주는 작용제가 포함된다 [참고: The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p. 13]. "성장 억제성" 항체의 예는 ErbB2와 결합하고, ErbB2를 과발현하는 암 세포의 성장을 억제시켜 주는 것이다. 성장 억제성 항-ErbB2 항체는 약 0.5 내지 30 ㎍/ml의 항체 농도에서, 세포 배양 중인 SK-BR-3 유방 종양 세포의 성장을 20% 초과, 또는 50% 초과 (예를 들어, 약 50% 내지 약 100%) 억제시킬 수 있는데, 이러한 성장 억제는 SK-BR-3 세포를 항체에 노출시킨지 6일 후에 결정한다 [참고: US 5677171].
"세포 사멸을 유도시키는" 항체는 생육 가능한 세포를 생육 불가능한 세포가 되도록 하는 것이다. 이 세포는 일반적으로, ErbB2 수용체를 발현하는 것인데, 특히 상기 세포는 ErbB2 수용체를 과발현한다. 상기 세포는 암 세포, 예를 들어 유방, 난소, 위, 자궁내막, 타액선, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 또는 방광 세포일 수 있다. 시험관 내에서는 상기 세포가 SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 시험관 내에서의 세포 사멸은, 항체 의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 의해 유도된 세포 사멸과 구별하기 위해 보체 및 면역 효과기 세포의 부재 하에서 결정할 수 있다. 따라서, 세포 사멸을 알아보기 위한 검정은 열-불활성화 혈청을 사용하고 (즉, 보체의 부재 하에) 면역 효과기 세포의 부재 하에 수행할 수 있다. 항체가 세포 사멸을 유도시킬 수 있는지를 결정하기 위해, 처치되지 않은 세포와 비교해서 프로피듐 요오드 (PI), 트리판 블루 [참고: Moore et al (1995) Cytotechnology, 17: 1-11] 또는 7AAD의 흡수에 의해 평가된 바와 같은 막 완전성의 상실을 평가할 수 있다. 세포-사멸-유도성 항체는 BT474 세포에서의 PI 흡수 검정에서 PI 흡수를 유도시켜 주는 것이다 (하기 참고).
"아폽토시스를 유도시키는" 항체는 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 내형질 세망의 확장, 세포 단편화 및/또는 막 소포 (아폽토시스체로 불리움)의 형성에 의해 결정된 바와 같은 프로그램된 세포 사멸을 유도시키는 것이다. 세포는 통상적으로, ErbB2 수용체를 과발현하는 것인데, 이에는 종양 세포, 예를 들어 유방, 난소, 위, 자궁내막, 타액선, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 또는 방광 세포가 포함된다. 시험관 내에서는 세포가 SK-BR-3, BT474, Calu 3 세포, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료 (처치)"는 치료적 처치와 예방적 조치 둘 다를 지칭하는데, 이의 목적은 바람직하지 못한 생리적 변화 또는 장애, 예를 들어 암 발생 또는 확산을 느리게 진행시키거나 (경감시키거나) 예방하는 것이다. 본 발명의 목적상, 유리하거나 바람직한 임상 결과에는 증상 완화, 질병 정도 경감, 질병의 안정화된 상태 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 서서히 진행됨, 질병 상태의 완화 또는 고통완화, 및 검출 가능하든지 아니면 검출 가능하지 않든 간에 (부분적 또는 전체적) 차도가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. "치료 (처치)"는 또한, 치료를 받지 않을 경우에 예상되는 생존율과 비교해서 생존율이 연장되는 것을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상체에는 이미 해당 질환이나 장애가 있는 대상체 뿐만 아니라 이러한 질환이나 장애에 걸리기 쉬운 대상체 또는 이를 예방시켜야 하는 대상체가 포함된다.
"장애"는 본 발명의 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 모든 질환이다. 이에는 포유류가 문제의 장애에 걸리기 쉬운 병리적 상태를 포함한, 만성 및 급성 장애 또는 질병이 포함된다. 본원에서 치료하고자 하는 장애의 비-제한적 예에는 양성 및 악성 종양; 백혈병 및 림프계 악성 질환, 특히 유방암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 타액선암, 폐암, 신장암, 결장암, 갑상선암, 췌장암, 전립선암 또는 방광암; 신경세포, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 기타 선상, 대식세포, 상피, 간질성 및 포배강 장애; 및 염증성, 혈관형성성 및 면역학적 장애가 포함된다. 본 발명에 따라서 치료하고자 하는 예시 장애는 고형의 악성 종양이다.
용어 "치료적 유효량"은 포유류에게서 특정 질병 또는 장애를 치료하는데 유효한 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 약물의 치료적 유효량은 (i) 암 세포 수를 감소시키고/시키거나; (ii) 종양 크기를 감소시키고/시키거나; (iii) 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제, 지연, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시키고/시키거나; (iv) 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; (v) 종양 성장을 억제시키고/시키거나; (vi) 암과 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물이 기존의 암 세포의 성장을 방지시키고/시키거나 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지는 이러한 약물이 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 동물 모델에서는, ADC 투여 후 일정 기간 동안 종양를 물리적으로 측정하고, 종양의 부분적 및 완전한 차도를 결정함으로써 효능을 평가할 수 있다. 암 요법의 경우에는, 예를 들어 질병 진행 시간 (TTP)를 평가하고/하거나 반응 속도 (RR)를 결정함으로써 효능을 측정할 수 있다.
용어 "생체내 이용효율"은 환자에게 투여된 소정 량의 약물의 전신 이용효율 (즉, 혈액/혈장 수준)을 지칭한다. 생체내 이용효율은 투여된 투여 형태로부터 일반적인 순환에 도달하는 약물의 시간 (속도)과 총 량 (정도) 둘 다의 측정치를 나타내는 절대 용어이다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에게서의 생리적 상태를 지칭하거나 기재한다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프계 악성 질환이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암 (예: 상피 편평 세포 암), 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비소세포 폐암 ("NSCLC"), 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위암, 예를 들어 위장암, 위장 간질성 종양 (GIST), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 뿐만 아니라 두경부암이 포함된다.
"ErbB-발현성 암"은 그의 세포 표면에 존재하는 ErbB 단백질을 갖는 세포를 포함하는 것이다. "ErbB2-발현성 암"은 그의 세포 표면에 충분한 수준의 ErbB2를 생성시킴으로써, 항-ErbB2 항체가 이와 결합하여 암에 대한 치료 효과를 나타내도록 하는 것이다.
특정 수용체, 예를 들어 ErbB 수용체를 "과발현하는" 암은 동일한 조직 유형의 비-암성 세포와 비교해서, 그의 세포 표면에 상당히 고 수준의 수용체, 예를 들어 ErbB2 수용체를 갖는 것이다. 이러한 과발현은 유전자 증폭에 의해 유발되거나 또는 전사 또는 해독 증가에 의해 유발될 수 있다. ErbB 수용체 과발현은 특정 세포 표면 상에 존재하는 ErbB 단백질의 증가 수준을 평가함으로써 진단 또는 예후 검정 (예: 면역조직화학 검정; IHC)에서 결정할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 예를 들어 형광성 계내 혼성화 [FISH; 참고: WO 1998/45479], 서던 블롯팅 (southern blotting), 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예를 들어 실시간 정량 PCR (RT-PCR)을 통하여 세포 내의 ErbB-코딩 핵산 수준을 측정할 수 있다. ErbB 리간드의 과발현은 환자에게서, 예를 들어 종양 생검에서 상기 리간드 (또는 이를 코딩하는 핵산)의 수준을 평가하거나, 또는 각종 진단 검정, 예를 들어 IHC, FISH, 서던 블롯팅, PCR 또는 상기 언급된 생체내 검정에 의해 진단적으로 결정할 수 있다. 또한, 생물학적 유체, 예를 들어 혈청에서 유출된 (shed) 항원 (예: ErbB 세포외 도메인)을 측정함으로써 ErbB 수용체 과발현을 연구할 수 있다 [참고: 예를 들어, US 4933294; WO 91/05264; US 5401638호; 및 Sias et al (1990) J. Immunol. Methods, 132: 73-80]. 상기 검정 이외에도, 각종 기타 생체내 검정이 당업자에게 이용 가능하다. 예를 들어, 환자 체내 세포를, 검출 가능한 표지, 예를 들어 방사성 동위원소로 임의로 표지시킨 항체에 노출시킬 수 있고, 이러한 환자 내의 세포에 대한 항체 결합을, 예를 들어 방사능에 대한 외부 스캐닝에 의해 또는 항체에 미리 노출시킨 환자로부터 취한 생검을 분석함으로써 평가할 수 있다.
HER2를 과발현하는 종양은 세포당 발현된 HER2 분자의 카피 수에 상응하는 면역조직화학적 스코어에 의해 평가하고, 생화학적으로 결정할 수 있다: 0 = 세포당 0 내지 10,000개 카피; 1+ = 세포당 약 200,000개 이상 카피; 2+ = 세포당 약 500,000개 이상 카피; 3+ = 세포당 약 1 내지 2 x 106개 카피. 티로신 키나제의 리간드-비의존성 활성화 [참고: Hudziak et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7159-7163]를 유발시키는 3+ 수준의 HER2의 과발현은 유방암의 대략 30%에서 일어나고, 이들 환자의 재발 없는 생존율과 전반적인 생존율은 저하된다 [참고: Slamon et al (1989) Science 244: 707-712; Slamon et al (1987) Science, 235:177-182]. 반대로, "ErbB2 수용체의 과발현을 특징으로 하지 않는" 암은 진단 검정에서 동일한 조직 유형의 비암성 세포와 비교해서 정상 수준의 ErbB2 수용체 보다 높게 발현하지 않는 것이다. 뮤린 모노클로날 항-HER2 항체는 HER2를 2+ 및 3+ (세포당 1-2 x 106개 HER2 수용체) 수준으로 과발현하는 유방암 세포주의 성장을 억제시키지만, 이 보다 낮은 수준의 HER2를 발현하는 세포에 대해서는 활성을 전혀 나타내지 않는다 [참고: Lewis et al (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263]. 이러한 관찰 결과에 기초하여, 항체 4D5를 인간화시켰고 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2; 참고: US 5821337; Carter et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-4289], HER2를 과발현하는 종양을 갖고 있지만, 통상적인 화학요법 후에 진행된 유방암 환자에게서 시험하였다 [참고: Cobleigh et al (1999) J. Clin. Oncol. 17: 2639-2648]. 이러한 시험에서 대부분의 환자 종양은 HER2를 3+ 수준으로 발현하였지만, 극히 일부는 2+ 였다.
"호르몬-비의존성" 암은 그의 증식이 암 세포에 의해 발현된 수용체와 결합하는 호르몬의 존재에 의존적이지 않는 것이다. 이러한 암은 종양 내 또는 종양 근처의 호르몬 농도를 감소시키는 약리학적 또는 외과적 전략 투여시 임상적 퇴행을 진행하지 않는다. 호르몬-비의존성 암의 예에는 안드로겐-비의존성 전립선암, 에스트로겐-비의존성 유방암, 자궁내막암, 및 난소암이 포함된다. 이러한 암은 호르몬-의존성 종양으로서 양성일 수 있고, 항호르몬 요법 후 호르몬-민감성 단계에서부터 호르몬-난치성 종양으로 진행할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이 용어에는 방사성 동위원소 (예: 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 60C 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예를 들면, 소분자 독소, 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 (그의 합성 유사체 및 유도체 포함)가 포함된다.
"화학요법제"는 암을 치료하는데 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 에를로티니브 (Erlotinib) (TARCEVA?; 공급처: Genentech/OSI Pharm.), 보르테조미브 (Bortezomib) (VELCADE?; 공급처: Millenium Pharm.), 풀베스트란트 (Fulvestrant) (FASLODEX?; 공급처: Astrazeneca), 수텐트 (Sutent) (SU11248; 공급처: Pfizer), 레트로졸 (Letrozole) (FEMARA?; 공급처: Novartis), 이마티니브 (Imatinib) 메실레이트 (GLEEVEC?; 공급처: Novartis), PTK787/ZK 222584 (공급처: Novartis), 옥살리플라틴 (Oxaliplatin) (Eloxatin?; 공급처: Sanofi), 5-FU (5-플루오로우라실), 류코보린 (Leucovorin), 라파마이신 (Rapamycin) (Sirolimus, RAPAMUNE?; 공급처: Wyeth), 라파티니브 (Lapatinib) (GSK572016; 공급처: GlaxoSmithKline), 로나파르니브 (Lonafarnib) (SCH 66336), 소라페니브 (Sorafenib) (BAY43-9006; 공급처: Bayer Labs.), 및 제피티니브 (Gefitinib) (IRESSA?; 공급처: Astrazeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; 공급처: Sugen), 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 CYTOXAN? 시클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들어, 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성적으로 유사한 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 엔디인 (enediyne) 항생제 [예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 [참고: Agnew, Chem Intl. Ed. Engl. (1994) 33: 183-186]; 디네미신 (디네미신 A 포함); 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 엔디인 항생제 발색단], 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, ADRIAMYCIN? 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 (예: 미토마이신 C), 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK? 다당류 복합체 (공급처: JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 TAXOL? 파클리탁셀 (공급처: Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANE™ 크레모포르-무함유, 파클리탁셀의 알부민-공학 처리시킨 나노입자 제제 (공급처: American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), 및 TAXOTERE? 독세탁셀 (공급처: Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; GEMZAR? 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE? 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 (예: 레티노산); 카페시타빈; 및 상기 언급된 제제의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
상기 "화학요법제"의 정의에는 또한, (i) 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제시키는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어 항에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용제 조정제 (SERMs), 예를 들면, 타목시펜 (예: NOLVADEX? 타목시펜), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 FARESTON·토레미펜; (ii) 부신에서의 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE? 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN? 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, RIVISOR? 보로졸, FEMARA? 레트로졸 및 ARIMIDEX? 아나스트로졸; (iii) 항안드로겐제, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); (iv) 아로마타제 억제제; (v) 단백질 키나제 억제제; (vi) 지질 키나제 억제제; (vii) 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상한 세포 증식에 밀접한 영향을 미치는 신호 전달 경로에 있어 유전자, 예를 들어 PKC-알파, Ralf 및 H-Ras의 발현을 억제시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드; (viii) 리보자임, 예를 들어 VEGF 발현 억제제 (예: ANGIOZYME? 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; (ix) 백신, 예를 들어 유전자 요법 백신, 예를 들면, ALLOVECTIN? 백신, LEUVECTIN? 백신 및 VAXID? 백신; PROLEUKIN? rIL-2; LURTOTECAN? 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX? rmRH; (x) 항혈관신생제, 예를 들어 베바시주마브 (bevacizumab) (AVASTIN?; 공급처: Genentech); 및 (xi) 이들의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
단백질 키나제 억제제는 ErbB 수용체와 같은 티로신 키나제의 티로신 키나제 활성을 어느 정도 억제시키는 티로신 키나제 억제제가 포함된다. 티로신 키나제 억제제의 예에는 EGFR-표적화 약물, 예를 들어 (i) EGFR와 결합하는 항체, 예를 들면, MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) [참고: US 4943533, Mendelsohn et al.] 및 그의 변이체, 예를 들어 키메라화 225 (C225 또는 Cetuximab; ERBITUX?; 공급처: Imclone) 및 다시 만든 인간 225 (H225) [참고: WO96/40210, Imclone Systems Inc.]; 유형 II 돌연변이체 EGFR와 결합하는 항체 [참고: US 5212290]; EGFR과 결합하는 인간화 및 키메라 항체 [참고: US 5891996]; 및 EGFR과 결합하는 인간 항체, 예를 들어 ABX-EGF [참고: WO 98/50433]; (ii) 세포독성제와 접합된 항-EGFR 항체 [참고: EP 659439A2]; 및 EGFR과 결합하는 소분자, 예를 들어 ZD1839 또는 제피티니브 (IRESSA™; 공급처: Astra Zeneca), 에를로티니브 HCl (CP-358774, TARCEVA™; 공급처: Genentech/OSI) 및 AG1478, AG1571 (SU 5271; 공급처: Sugen), 퀴나졸린, 예를 들어 PD 153035, 4-(3-클로로아닐리노) 퀴나졸린, 피리도피리미딘, 피리미도피리미딘, 피롤로피리미딘, 예를 들어 CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706, 및 피라졸로피리미딘, 4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d] 피리미딘, 쿠르쿠민 [디페룰로일 메탄, 4,5-비스 (4-플루오로아닐리노)프탈이미드], 니트로티오펜 부분을 함유하는 티르포스틴; PD-0183805 (공급처: Warner-Lambert); 안티센스 분자 (예를 들어, ErbB-코딩 핵산과 결합하는 분자); 퀴녹살린 [참고: US 5804396]; 트리포스핀 [참고: US 5804396]; ZD6474 (공급처: Astra Zeneca); PTK-787 (공급처: Novartis/Schering AG); 범-ErbB 억제제, 예를 들어 CI-1033 (공급처: Pfizer); 아피니택 (Affinitac) (ISIS 3521; 공급처: Isis/Lilly); 이마티니브 메실레이트 (Gleevac; 공급처: Novartis) ; PKI 166 (공급처: Novartis); GW2016 (공급처: Glaxo SmithKline); CI-1033 (공급처: Pfizer); EKB-569 (공급처: Wyeth); 세막사니브 (Semaxanib) (공급처: Sugen); ZD6474 (공급처: AstraZeneca); PTK-787 (공급처: Novartis/Schering AG); INC-1C11 (공급처: Imclone); 또는 다음 문헌에 기재된 바와 같은 것들이 포함된다 [참고: US 5804396; WO 99/09016 (American Cyanamid); WO 98/43960 (American Cyanamid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, Inc); WO 96/33978 (Zeneca); WO 96/3397 (Zeneca); 및 WO 96/33980 (Zeneca)].
"항혈관신생제"는 혈관의 발생을 어느 정도 차단시키거나 방해하는 화합물을 지칭한다. 항혈관형성 인자는, 예를 들어, 혈관형성을 증진시키는데 관여하는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체와 결합하는 소분자 또는 항체일 수 있다. 예시되는 항혈관신생제는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)와 결합하는 항체, 예를 들어 베바시주마브 [AVASTIN?; 공급처: Genentech]이다.
용어 "사이토킨"은 또 다른 세포 상에서 세포간 매개인자로서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출된 단백질에 대한 일반적 용어이다. 이러한 사이토킨의 예는 림포카인, 모노카인, 및 전통적 폴리펩티드 호르몬이다. 이러한 사이토킨에 포함되는 것은 특히, 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소의 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 및 황체형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 물레리안-억제 물질; 마우스 성선자극호르몬 관련 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판 성장 인자; 전환 성장 인자 (TGFs), 예를 들어 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β 및 -γ; 집락 자극 인자 (CSFs), 예를 들어 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (ILs), 예를 들어 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-α 또는 TNF-β; 및 기타 폴리펩티드 인자 [이에는 LIF 및 kit 리간드 (KL)가 포함된다]이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 사이토킨에는 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질, 및 본래 서열 사이토킨의 생물학적 활성 등가물이 포함된다.
본 출원에 사용된 바와 같은 용어 "프로드럭 (prodrug)"은 모 약물과 비교해서 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고 효소적으로 활성화되거나 보다 더 활성인 모 형태로 전환될 수 있는, 제약상 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다 [참고: 예를 들어 Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]. 본 발명의 프로드럭에는 보다 활성인 세포독성 자유 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트 함유 프로드럭, 티오포스페이트 함유 프로드럭, 설페이트 함유 프로드럭, 펩티드 함유 프로드럭, D-아미노산 변형된 프로드럭, 당화 프로드럭, β-락탐 함유 프로드럭, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 프로드럭 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 프로드럭, 5-플루오로시토신, 및 기타 5-플루오로우리딘 프로드럭이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 프로드럭 형태로 유도체화할 수 있는 세포독성 약물의 예에는 상기 언급된 화학요법제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
"리포솜"은 약물 (예를 들어, 본원에 기재된 항-ErbB2 항체, 및 임의의 화학요법제)을 포유류에게 전달하는데 유용한, 각종 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 리포솜의 구성분은 생체 막의 지질 배열과 유사한, 이층 형성으로 통상 배열된다.
용어 "패키지 삽입물"은 적응증, 활용, 투여량, 투여, 금기사항 및/또는 치료 제품의 사용과 관련한 경고에 관한 정보를 함유하고 있는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 지시사항을 지칭하기 위해 사용된다.
"심장보호제"는 특정 약물, 예를 들어 안트라사이클린 항생제 및/또는 항-ErbB2 항체를 환자에게 투여하는 것과 연관된 심근 기능이상 (즉, 심근병증 및/또는 울혈성 심부전증)을 예방하거나 저하시키는 화합물 또는 조성물이다. 심장보호제는, 예를 들어 자유 라디칼-매개된 심장독성 효과를 차단 또는 저하시킬 수 있고/있거나 산화적-스트레스 손상을 예방 또는 저하시킬 수 있다. 본 발명의 정의에 포괄되는 심장보호제의 예에는 철-킬레이트제 덱스라족산 [dexrazoxane (ICRF-187)] [참고: Seifert et al., The Annals of Pharmacotherapy, 28: 1063-1072 (1994)]; 지질 저하제 및/또는 항산화제, 예를 들어 프로부콜 [참고: Singal et al., J. Mol. Cell Cardiol., 27: 1055-1063 (1995)]; 아미포스틴 (amifostine) {아미노티올 2-[(3-아미노프로필)아미노]에탄티올-디히드로겐 포스페이트 에스테르 (WR-2721로 지칭됨), 및 그의 탈인산화 세포성 흡수 형태 (WR-1065로 지칭됨)} 및 S-3-(3-메틸아미노프로필아미노)프로필포스포로티오산 (WR-151327) [참고: Green et al., Cancer Research, 54: 738-741 (1994)]; 디곡신 (digoxin) [참고: Bristow, M. R. ed. (1980) Drug-Induced Heart Disease (New York: Elsevier 191-215 (1980)]; 베타 차단제, 예를 들어 메토프롤롤 (metoprolol) [참고: Hjalmarson et al (1994) Drugs. 47: Suppl 4:31-9; and Shaddy et al (1995) Am. Heart J., 129: 197-199]; 비타민 E; 아스코르브산 (비타민 C); 자유 라디칼 소거제, 예를 들어 올레아놀산, 우르솔산, 및 N-아세틸시스테인 (NAC); 스핀-트랩핑 화합물, 예를 들어 알파-페닐-3급-부틸 니트론 (PBN) [참고: Paracchini et al (1993) Anticancer Res., 13: 1607-1612]; 유기셀렌 화합물, 예를 들어 P251 (Elbesen) 등이 포함된다.
"분리된" 핵산 분자는 항체 코딩 핵산의 천연 공급원 내에서 통상 연합되는 하나 이상의 오염성 핵산 분자로부터 확인되어 이로부터 격리시킨 핵산 분자이다. 분리된 핵산 분자는 천연에서 발견되는 형태 또는 세팅 이외의 것이다. 따라서, 분리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 바와 같은 핵산 분자와는 구별된다. 그러나, 분리된 핵산 분자에는, 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포와는 상이한 염색체 위치 내에 존재하는 경우에 항체를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자가 포함된다.
"알킬"은 정상, 2급, 3급 또는 사이클릭 탄소 원자를 함유하는 C1-C18 탄화수소이다. 알킬 라디칼의 예에는 C1-C8 탄화수소 부분, 예를 들어 메틸 (Me, -CH3), 에틸 (Et, -CH2CH3), 1-프로필 (n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필 (i-Pr, i-프로필, -CH(CH3)2), 1-부틸 (n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-l-프로필 (i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸 (s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필 (t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸 (n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸 (-CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸 (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸 (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸 (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실 (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실 (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-헥실 (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸 (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸 (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸 (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-디메틸-2-부틸 (-CH(CH3)C(CH3)3)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
"알케닐"은 1개 이상의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp 2 이중 결합을 갖는 정상, 2급, 3급 또는 사이클릭 탄소 원자를 함유하는 C2-C18 탄화수소이다. 알케닐 라디칼의 예에는 C2-C8 탄화수소 부분, 예를 들어 에틸렌 또는 비닐 (-CH=CH2), 알릴 (-CH2CH=CH2), 시클로펜테닐 (-C5H7), 및 5-헥세닐 (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
"알키닐"은 1개 이상의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp 삼중 결합을 갖는 정상, 2급, 3급 또는 사이클릭 탄소 원자를 함유하는 C2-C18 탄화수소이다. 알키닐 라디칼의 예에는 C2-C8 탄화수소 부분, 예를 들어 아세틸렌 (-C≡CH) 및 프로파길 (-CH2C≡CH)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
"알킬렌"은 모 알칸의 동일하거나 상이한 2개의 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거함으로써 유도시킨 2개의 1가 라디칼 중앙을 갖는, 탄소수 1 내지 18의 포화, 측쇄 또는 직쇄 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 알킬렌 라디칼에는 C1-C8 탄화수소 부분, 예를 들어 메틸렌 (-CH2-) 1,2-에틸 (-CH2CH2-), 1,3-프로필 (-CH2CH2CH2-), 1,4-부틸 (-CH2CH2CH2CH2-) 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
"알케닐렌"은 모 알켄의 동일하거나 상이한 2개의 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거함으로써 유도시킨 2개의 1가 라디칼 중앙을 갖는, 탄소수 2 내지 18의 불포화, 측쇄 또는 직쇄 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 알케닐렌 라디칼에는 C2-C8 탄화수소 부분, 예를 들어 1,2-에틸렌 (-CH=CH-)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
"알키닐렌"은 모 알킨의 동일하거나 상이한 2개의 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거함으로써 유도시킨 2개의 1가 라디칼 중앙을 갖는, 탄소수 2 내지 18의 불포화, 측쇄 또는 직쇄 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 알킬렌 라디칼에는 C2-C8 탄화수소 부분, 예를 들어 아세틸렌 (-C≡C-), 프로파길 (-CH2C≡C-), 및 4-펜티닐 (-CH2CH2CH2C≡C-)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
"아릴"은 단독으로 또는 조합하여, 모 방향족 환 시스템의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거함으로써 유도시킨 탄소수 6 내지 20의 1가 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 아릴 라디칼은 1개, 2개 또는 3개 환을 함유할 수 있는데, 이러한 환은 펜던트 방식으로 함께 부착될 수 있거나 (예: 비페닐) 융합될 수 있다 (예: 나프탈렌 또는 안트라센). 몇몇 아릴기는 예시 구조에서 "Ar"로서 나타낸다. 전형적인 아릴기에는 C6-C12 탄화수소 부분, 예를 들어 벤젠, 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 비페닐 등으로부터 유래된 라디칼이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
"아릴알킬"은 탄소 원자, 전형적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자와 결합된 수소 원자들 중의 하나를 아릴 라디칼로 대체시킨 아사이클릭 알킬 라디칼을 지칭한다. 전형적인 아릴알킬기에는 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 2-페닐에텐-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 2-나프틸에텐-1-일, 나프토벤질, 2-나프토페닐에탄-1-일 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 아릴알킬기는 6 내지 20개 탄소 원자를 포함하는데, 예를 들어 아릴알킬기의 알킬 부분 (알카닐, 알케닐 또는 알키닐 기 포함)은 탄소수 1 내지 6이고, 아릴 부분은 탄소수 5 내지 14이다.
"헤테로아릴알킬"은 탄소 원자, 전형적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자와 결합된 수소 원자들 중의 하나를 헤테로아릴 라디칼로 대체시킨 아사이클릭 알킬 라디칼을 지칭한다. 전형적인 헤테로아릴알킬기에는 2-벤즈이미다졸릴메틸, 2-푸릴에틸 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 헤테로아릴알킬기는 6 내지 20개 탄소 원자를 포함하는데, 예를 들어 헤테로아릴알킬기의 알킬 부분 (알카닐, 알케닐 또는 알키닐 기 포함)은 탄소수 1 내지 6이고, 헤테로아릴 부분은 탄소수 5 내지 14이며, 1 내지 3개의 헤테로원자는 N, 0, P, 및 S 중에서 선택된다. 헤테로아릴알킬기의 헤테로아릴 부분은 3 내지 7개 환 구성원 (2 내지 6개 탄소 원자)를 갖는 모노사이클, 또는 7 내지 10개 환 구성원 (4 내지 9개 탄소 원자 및 N, 0, P, 및 S 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자)를 갖는 바이사이클, 예를 들어 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 시스템일 수 있다.
알킬, 알킬렌, 아릴, 아릴알킬 및 헤테로아릴알킬기는 치환시킬 수 있는데, 1개 이상의 수소 원자를 각각 독립적으로 특정 치환체로 대체시킨다. 전형적인 치환체에는 -X, -R, -0--, -OR, -SR, -S--, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -N02, =N2, -N3, -NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -S03 -, -S03H, -S(=O)2R, -OS(=O)20R, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO- 3, -P03H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -C02R, -C02 -, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2 [여기서, X는 각각 독립적으로, 할로겐: F, Cl, Br, 또는 I이고; R은 각각 독립적으로 H, C1-C18 알킬, C6-C20 아릴, C3-C14 헤테로사이클, 보호기 또는 프로드럭 부분이다]이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 언급된 바와 같은 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌기는 또한 유사하게 치환시킬 수 있다.
헤테로사이클 또는 헤테로사이클릴으로서 공지되기도 한 "헤테로아릴"은 1개 이상의 환 원자가 헤테로원자, 예를 들어 질소, 산소 및 황인 환 시스템 라디칼을 지칭한다. 헤테로아릴 라디칼은 5 내지 14개의 탄소 원자, 및 N, 0, P, 및 S 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로아릴은 3 내지 7개 환 구성원 (2 내지 6개 탄소 원자 및 N, 0, P, 및 S 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자)를 갖는 모노사이클, 또는 7 내지 10개 환 구성원 (4 내지 9개 탄소 원자 및 N, 0, P, 및 S 중에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자)를 갖는 바이사이클, 예를 들어 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 시스템일 수 있다. 헤테로아릴 화합물은 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, New York, 1968), particularly Chapters 1, 3, 4, 6, 7, and 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), in particular Volumes 13, 14, 16, 19, and 28; and J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566].
"링커" 또는 "연결하다"는 항체를 약물 부분에 공유적으로 부착시키는 원자의 쇄 또는 공유 결합을 포함하는 화학적 부분을 의미한다. 각종 양태에서는, 링커가 L로서 명시된다. 링커에는 2가 라디칼, 예를 들어 알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, -(CR2)nO(CR2)n- 등의 부분, 알킬옥시의 반복 단위 (예: 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시) 및 알킬아미노의 반복 단위 (예; 폴리에틸렌아미노, Jeffamine™); 및 이산 에스테르 및 아미드, 예를 들어 석시네이트, 석신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트 및 카프로아미드가 포함된다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너의 비-중복성 (superimposability) 특성을 지닌 분자를 지칭하는 반면, "아키랄"은 그들의 거울상 파트너 상에 중복될 수 있는 분자를 지칭한다.
용어 "입체이성체"는 동일한 화학적 구성을 지니고 있지만, 공간 내의 원자 또는 기들의 배열 면에서 상이한 화합물을 지칭한다.
"부분입체이성체"는 2개 이상의 키랄 중심을 갖고 이들 분자가 서로의 거울상이 아닌 입체이성체를 지칭한다. 부분입체이성체는 상이한 물리적 특성, 예를 들어 융점, 비점, 스펙트럼 특성, 및 반응성을 지닌다. 부분입체이성체의 혼합물은 고 분해능 분석 과정, 예를 들어 전기영동 및 크로마토그래피 하에 분리시킬 수 있다.
"에난티오머"는 서로의 비-중복성 거울상인 화합물의 2개 입체이성체를 지칭한다.
본원에 사용된 입체화학적 정의 및 규정들은 일반적으로, 다음 문헌에 따른다 [참고: S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; and Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York]. 많은 유기 화합물은 광학적 활성 형태로 존재하는데, 즉 이들 화합물은 편광 평면을 회전할 수 있는 능력을 지니고 있다. 광학 활성 화합물을 기재하는데 있어서, 접두사 D 및 L, 또는 R 및 S는 그의 키랄 중심(들) 주변 분자의 절대 배위를 나타내기 위해 사용된다. 접두사 d 및 l 또는 (+) 및 (-)는 해당 화합물에 의한 평관 회전 부호를 지정하기 위해 이용되는데, (-) 또는 l은 화합물이 좌선성 (levorotatory)라는 것을 의미한다. 접두사 (+) 또는 d를 붙인 화합물은 우선성 (dextrorotatory)이다. 소정의 화학 구조의 경우에는, 이들 입체이성체가 서로 거울상이란 것을 제외하고는 동일하다. 특이적 입체이성체가 에난티오머로서 지칭될 수 있고, 이러한 이성체의 혼합물은 종종 에탄티오머성 혼합물로 불리운다. 에난티오머의 50:50 혼합물이 라세미 혼합물 또는 라세메이트로서 지칭되는데, 이는 화학적 반응 또는 공정에서 입체선택성 또는 입체특이성이 전혀 없는 경우에 일어날 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세메이트"는 광학 활성이 없는, 2개의 에난티오머성 종의 등몰 혼합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "제약상 허용 가능한 염"은 ADC의 제약상 허용 가능한 유기 또는 무기 염을 지칭한다. 예시되는 염에는 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 니트레이트, 비설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레에이트, 젠티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 삭카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 및 파모에이트 [즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-히드록시-3-나프토에이트)] 염이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 제약상 허용 가능한 염은 또 다른 분자, 예를 들어 아세테이트 이온, 석시네이트 이온 또는 기타 반대이온의 봉입을 포함할 수 있다. 반대이온은 모 화합물 상의 전하를 안정화시키는 모든 유기 또는 무기 부분일 수 있다. 더우기, 제약상 허용 가능한 염은 그의 구조 내에 1개 이상의 전하를 띤 원자를 가질 수 있다. 여러 개의 전하를 띤 원자가 제약상 허용 가능한 염의 일부인 경우에는, 다수 개의 반대 이온을 가질 수 있다. 따라서, 제약상 허용 가능한 염은 1개 이상의 전하를 띤 원자 및/또는 1개 이상의 반대이온을 가질 수 있다.
"제약상 허용 가능한 용매화물"은 1개 이상의 용매 분자와 ADC의 연합물을 지칭한다. 제약상 허용 가능한 용매화물을 형성하는 용매의 예에는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산 및 에탄올아민이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
항체-약물 접합체
본 발명의 화합물에는 항암 활성에 유용한 것이 포함된다. 특히, 이러한 화합물에는 링커에 의해 약물 부분과 접합된, 즉 공유적으로 부착된 항체가 포함되는데, 이러한 약물은 항체와 접합되지 않았을 때 세포독성 또는 세포증식 억제성 효과를 지닌다. 따라서, 약물 부분의 생물학적 활성은 항체와의 접합에 의해 조정된다. 본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)는 유효 용량의 세포독성제를 종양 조직에 선택적으로 전달시켜 줌으로써, 보다 큰 선택도, 즉 보다 적은 유효 용량을 달성할 수 있게 해준다.
한 양태에서는, ADC, 또는 ADC의 세포내 대사물의 생체내 이용효율이 상응하는 마이탄시노이드 화합물 단독과 비교해서 포유류에서 개선된다. 또한, ADC, 또는 ADC의 세포내 대사물의 생체내 이용효율은 상응하는 항체 단독 (약물 부분이나 링커를 수반하지 않은, ADC의 항체)과 비교해서 포유류에서 개선된다.
한 양태에서는, ADC의 마이탄시노이드 약물 부분이, 항체-약물 접합체가 세포 표면 수용체와 결합하거나 또는 이러한 항체-약물 접합체의 항체에 대해 특이적인 세포 표면 수용체를 수반한 세포 내로 유입될 때까지는 항체로부터 절단되지 않는다. 약물 부분은 항체-약물 접합체가 세포 내로 유입된 후에 항체로부터 절단될 수 있다. 마이탄시노이드 약물 부분은 포유류에서, 효소적 작용, 가수분해, 산화 또는 기타 기전에 의해 본 발명의 화합물의 항체로부터 또는 본 발명의 화합물의 세포내 대사물로부터 세포내적으로 절단될 수 있다. 예를 들어, 그리고 본 발명을 특정한 작용 기전으로 제한시키지 않는 방식으로, ADC의 마이탄시노이드 약물 부분의 황 원자를 설폰 또는 설폭사이드기로 산화시킬 수 있다. 이러한 설폰 및 설폭사이드와 결합된 탄소 상의 양성자는 세포 내부에서의 일반적 또는 효소적 촉매 반응 하에 제거할 수 있고, 이로써 약물 부분을 ADC의 항체로부터 절단 및 격리시키는 베타-제거 단편화가 이루어질 수 있다. 또 다른 한편으론, 기타 전자 끄는 기, 예를 들어 링커, 항체 또는 약물 부분 내의 아미드는 세포 내부에서 유사한 단편화/절단 기전을 수행할 수 있다.
항체-약물 접합체 (ADC)는 하기 화학식 I, 또는 그의 제약상 허용 가능한 염 또는 용매화물로써 나타낼 수 있다:
<화학식 I>
Figure 112006088990037-pct00002
상기식에서,
Ab는 ErbB 수용체와 결합하거나, 또는 하기 (1) 내지 (36) 중에서 선택된 하나 이상의 종양 관련 항원 또는 세포 표면 수용체:
(1) BMPR1B (골 형성 단백질 수용체-유형 1B, 진뱅크 승인 번호 NM_001203);
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, 진뱅크 승인 번호 NM_003486);
(3) STEAP1 (전립선의 6개 막관통 상피 항원, 진뱅크 승인 번호 NM_012449);
(4) 0772P (CA125, MUC16, 진뱅크 승인 번호 AF361486);
(5) MPF [MPF, MSLN, SMR, 거대핵세포 증강 인자, 메소텔린 (mesothelin), 진뱅크 승인 번호 NM_005823];
(6) Napi3b [NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 캐리어 패밀리 34 (인산나트륨), 구성원 2, 유형 II 나트륨-의존성 인산염 수송인자 3b, 진뱅크 승인 번호 NM_006424];
(7) Sema 5b [FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 (Semaphorin) 5b Hlog, 세마 도메인, 7개 트롬보스폰딘 반복 서열 (유형 1 및 유형-1 유사), 막관통 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B, 진뱅크 승인 번호 AB040878];
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자, 진뱅크 승인 번호 AY358628);
(9) ETBR [엔도텔린 (Endothelin) 유형 B 수용체, 진뱅크 승인 번호 AY275463];
(10) MSG783 (RNF124, 이론적 단백질 FLJ20315, 진뱅크 승인 번호 NM_017763);
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선 암 관련 유전자 1, 전립선 암 관련 단백질 1, 전립선의 6개 막관통 상피 항원 2, 6개 막관통 전립선 단백질, 진뱅크 승인 번호 AF455138);
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 M, 구성원 4, 진뱅크 승인 번호 NM_017636);
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자, 진뱅크 승인 번호 NP_003203 또는 NM_003212);
(14) CD21 [CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스타인 바 (Epstein Barr) 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792 진뱅크 승인 번호 M26004];
(15) CD79b [CD79B, CD79β, IGb (면역글로불린-관련 베타), B29, 진뱅크 승인 번호 NM_000626];
(16) FcRH2 [IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 도메인 함유 포스파타제 고정 단백질 1a), SPAP1B, SPAPIC, 진뱅크 승인 번호 NM_030764];
(17) HER2 (진뱅크 승인 번호 M11730);
(18) NCA (진뱅크 승인 번호 M18728);
(19) MDP (진뱅크 승인 번호 BC017023);
(20) IL20Rα (진뱅크 승인 번호 AF184971);
(21) 브레비칸 (Brevican) (진뱅크 승인 번호 AF229053);
(22) EphB2R (진뱅크 승인 번호 NM_004442);
(23) ASLG659 (진뱅크 승인 번호 AX092328);
(24) PSCA (진뱅크 승인 번호 AJ297436);
(25) GEDA (진뱅크 승인 번호 AY260763);
(26) BAFF-R (B 세포-활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3, NP_443177.1);
(27) CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 이소형, NP-001762.1);
(28) CD79a (CD79A, CD79α, 면역글로불린 관련 알파; Ig 베타 (CD79B)와 공유적으로 상호 작용하고 표면 상에서 IgM 분자와 복합체를 형성하며, B-세포 분화에 관여하는 신호를 전달하는 B 세포-특이적 단백질; 진뱅크 승인 번호 NP_001774.1);
(29) CXCR5 [버키트 (Burkitt) 림프종 수용체 1; CXCL13 케모카인에 의해 활성화되고, 림프구 이동 및 체액성 방어에 있어 기능하며, HIV-2 감염에 일정 역할을 하고 AIDS, 림프종, 골수종 및 백혈병 발병에 있어 일정 역할을 하는 것으로 추정되는 G 단백질-커플링된 수용체; 진뱅크 승인 번호 NP_001707.1];
(30) HLA-DOB [펩티드와 결합하고 이를 CD4+ T 림프구에 제시하는 MHC 부류 II 분자의 베타 소단위체 (Ia 항원); 진뱅크 승인 번호 NP_002111.1];
(31) P2X5 [퓨린 작동성 수용체 P2X 리간드 개폐형(ligand-gated) 이온 채널 5; 세포외 ATP에 의해 게이트된 이온 채널은 시냅스 전달과 신경발생에 관여할 수 있고, 결핍증은 특발성 배뇨근 불안정의 병태생리학에 기여할 수 있다; 진뱅크 승인 번호 NP_002552.2];
(32) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2, 진뱅크 승인 번호 NP_001773.1);
(33) LY64 [림프구 항원 64 (RP105); 루이신 풍부 반복 서열 (LRR) 패밀리의 유형 I 막 단백질은 B-세포 활성화 및 아폽토시스를 조절하고, 기능 상실은 전신성 홍반성 루푸스 환자에게서 질병 활성 증가와 연관이 있다; 진뱅크 승인 번호 NP_005573.1];
(34) FcRH1 [Fc 수용체-유사 단백질 1; C2 유형 Ig-유사 및 ITAM 도메인을 함유하는 면역글로불린 Fc 도메인에 대한 추정상의 수용체는 B-림프구 분화에 있어 일정 역할을 할 수 있다; 진뱅크 승인 번호 NP_443170.1];
(35) IRTA2 (면역글로불린 슈퍼패밀리 수용체 전좌 관련 2; B 세포 발생과 림프종 발생에 있어 가능한 역할을 하는 추정상의 면역수용체; 전좌에 의한 유전자의 탈제어는 몇몇 B 세포 악성 종양에서 일어난다; 진뱅크 승인 번호 NP_112571.1); 및
(36) TENB2 [성장 인자의 EGF/헤레굴린 계열 및 폴리스타틴 (follistatin)과 관계된 추정상의 막관통 프로테오글리칸; 진뱅크 승인 번호 AF179274]
와 결합하는 항체이고, 단, 이러한 항체는 TA.1은 아니다.
L은 비-디설파이드 링커이다. L에는 하기 구조들이 포함되지만, 그에 제한되지 않으며:
Figure 112006088990037-pct00003
상기 구조에서, 파선은 Ab 및 D에 대한 공유 부착을 나타내고;
X는
Figure 112006088990037-pct00004
이며;
Y는
Figure 112006088990037-pct00005
이고;
R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고; n은 1 내지 12이며;
D는 마이탄시노이드 약물 부분이다. 마이탄시노이드에는 하기 구조가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다:
Figure 112006088990037-pct00006
상기 구조에서,
파선은 L에 대한 공유 부착을 나타내고;
R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;
m은 1, 2 또는 3이다.
약물 대 항체 비 또는 약물 부하비는 화학식 I 화합물에 대해 p로써 나타낸다. 약물 부하비 값 p는 1 내지 8이다. 화학식 I 화합물에는 다양하게 부하되고 부착된 항체-약물 접합체의 모든 혼합물이 포함되는데, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8개 약물 부분이 항체에 공유적으로 부착된다.
또 다른 양태에서는, Ab가 (1) 내지 (16) 및 (18) 내지 (36) 중에서 선택된, 즉 HER2를 포함한 ErbB 수용체가 아닌, 하나 이상의 종양 관련 항원 또는 세포 표면 수용체와 결합하는 항체이다.
항체
화학식 I의 항체 단위 (Ab-)에는 그의 범위 내에, 소정의 표적-세포 집단과 연관된 수용체, 항원 또는 기타 수용적 부분과 결합하거나 반응적으로 연합하거나 또는 복합체를 형성하는 모든 항체 단위가 포함된다. 항체는 치료상 또는 생물학적으로 변형시키고자 하는 세포 집단 부분과 결합하거나, 복합체를 형성하거나 또는 반응하는 모든 단백질 또는 단백질-유사 분자일 수 있다. 한 국면에서는, 항체 단위가 마이탄시노이드 약물 부분을, 항체 단위와 반응하는 특정한 표적 세포 집단에 전달시키는 작용을 한다. 이러한 항체에는 고 분자량 단백질, 예를 들어 완전한 길이 항체 및 항체 단편이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체-약물 접합체를 차지하고 있는 항체는 바람직하게, 그들 본래의 야생형 대응물의 항원 결합 능력을 보유하고 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 항원과 결합할 수 있는데, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 항원에는, 예를 들어 종양 관련 항원 (TAA), 세포 표면 수용체 단백질 및 기타 세포 표면 분자, 세포 생존 조절 인자, 세포 증식 조절 인자, 조직 발생 또는 분화와 연관된 (예를 들어, 이러한 조직 발생 또는 분화에 기능적으로 기여하는 것으로 공지되어 있거나 추정되는) 분자, 림포카인, 사이토킨, 세포 주기 조절에 관여하는 분자, 혈관생성에 관여하는 분자, 및 혈관형성과 연관된 (예를 들어, 이러한 혈관형성에 기능적으로 기여하는 것으로 공지되어 있거나 추정되는) 분자가 포함된다. 종양 관련 항원은 군집 분화 인자 (즉, CD 단백질)일 수 있다. 본 발명의 항체와 결합할 수 있는 항원은 상기 언급된 범주들 중의 하나의 일부 구성원일 수 있는데, 상기 범주들 중의 기타 일부들은 (관심있는 항원과 관련하여) 별개의 특징을 지닌 기타 분자/항원을 포함한다.
한 양태에서는, 항체-약물 접합체 (ADC)의 항체가 ErbB 유전자에 의해 코딩된 수용체와 특이적으로 결합한다. 항체는 EGFR, HER2, HER3 및 HER4 중에서 선택된 ErbB 수용체와 특이적으로 결합할 수 있다. ADC는 HER2 수용체의 세포외 도메인 (ECD)와 특이적으로 결합할 수 있고, HER2 수용체를 과발현하는 종양 세포의 성장을 억제시킬 수 있다. ADC의 항체는 모노클로날 항체, 예를 들어 뮤린 모노클로날 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체일 수 있다. 인간화 항체는 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 또는 huMAb4D5-8 (트라스투주마브)일 수 있다. 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편일 수 있다.
화학식 I 항체-약물 접합체 (ADC) 중의, 암을 치료하는데 유용할 수 있는 항체에는 세포 표면 수용체 및 종양 관련 항원 (TAA)에 대항한 항체가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 종양 관련 항원은 당해 분야에 공지되어 있고, 당해 분야에 널리 공지되어 있는 방법 및 정보를 사용하여 항체를 생성시키는데 사용하기 위해 제조할 수 있다. 암 진단 및 치료에 유효한 세포성 표적을 밝혀내기 위해, 연구가들은 하나 이상의 정상 비-암성 세포(들)와 비교해서 한 가지 이상 특정한 유형의 암 세포 표면 상에 특이적으로 발현되는 막관통 또는 종양 관련 폴리펩티드를 확인 (동정)하고자 하였다. 종종, 이러한 종양 관련 폴리펩티드는 비-암성 세포 표면과 비교해서 암 세포 표면 상에 더 많이 발현된다. 이러한 종양 관련 세포 표면 항원 폴리펩티드를 확인함으로써, 항체에 의거한 요법을 통하여 파괴시키고자 하는 암 세포를 특이적으로 표적화할 수 있는 능력이 유발된다.
TAA의 예에는 다음에 열거된 종양 관련 항원 (1) 내지 (36)이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 편의상, 당해 분야에 모두 공지되어 있는 이들 항원에 관한 정보가 다음에 열거되고, 이에는 명칭, 대체명, 진뱅크 승인 번호 및 주요 참고문헌(들)이 포함되는데, 이는 국립 생물공학 정보 센터 [National Center for Biotechnology Information (NCBI)]의 핵산 및 단백질 서열 확인 협약에 따른 것이다. TAA (1) 내지 (36)에 상응하는 핵산 및 단백질 서열은 공개 데이터베이스 (예: 진뱅크)에서 입수 가능하다. 항체에 의해 표적화된 종양 관련 항원에는 인용된 참고 문헌에서 확인된 서열을 기준으로 하여 약 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 서열 동일률을 나타내거나, 또는 인용된 참고 문헌에서 발견된 서열을 갖는 TAA와 실질적으로 동일한 생물학적 특성 또는 특징을 나타내는 모든 아미노산 서열 변이체 및 이소형이 포함된다. 예를 들어, 변이체 서열을 갖는 TAA는 일반적으로, 열거된 상응하는 서열을 갖는 TAA와 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 구체적으로 인용된 참고 문헌 내의 서열과 설명은 본원에 참고로 삽입된다.
종양 관련 항원 (1) 내지 (36):
(1) BMPR1B (골 형성 단백질 수용체-유형 1B, 진뱅크 승인 번호 NM_001203)
[참고 문헌: ten Dijke, P., et al Science 264 (5155):101-104 (1994), Oncogene 14 (11):1377-1382 (1997); W02004063362 (청구항 2); W02003042661 (청구항 12); US2003134790-A1 (Page 38-39); W02002102235 (청구항 13; Page 296); W02003055443 (Page 91-92); W0200299122 (실시예 2; Page 528-530); W02003029421 (청구항 6); W02003024392 (청구항 2; 도 112); W0200298358 (청구항 1; Page 183); W0200254940 (Page 100-101); W0200259377 (Page 349-350); W0200230268 (청구항 27; Page 376); W0200148204 (실시예; 도 4)];
NP_001194 골 형성 단백질 수용체, 유형 IB/pid=NP_001194.1
교차 참고: MIM:603248; NP_001194.1; AY065994
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, 진뱅크 승인 번호 NM_003486)
[참고 문헌: Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H. W., et al (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267-11273; W02004048938 (실시예 2); W02004032842 (실시예 IV); W02003042661 (청구항 12); W02003016475 (청구항 1); W0200278524 (실시예 2); W0200299074 (청구항 19; Page 127-129); W0200286443 (청구항 27; Pages 222, 393); W02003003906 (청구항 10; Page 293); W0200264798 (청구항 33; Page 93-95); W0200014228 (청구항 5; Page 133-136); US2003224454 (도 3); W02003025138 (청구항 12; Page 150); US 20050107595; US 20050106644];
NP_003477 용질 캐리어 계열 7 (양이온성 아미노산 수송인자, y+ 시스템), 구성원 5/pid=NP_003477.3 - 호모 사피엔스 (Homo sapiens)
교차-참고: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1
(3) STEAP1 (전립선의 6개 막관통 상피 항원, 진뱅크 승인 번호 NM_012449)
[참고 문헌: Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R. S., et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523-14528; W02004065577 (청구항 6); W02004027049 (도 1L); EP1394274 (실시예 11); W02004016225 (청구항 2); W02003042661 (청구항 12); US2003157089 (실시예 5); US2003185830 (실시예 5); US2003064397 (도 2); W0200289747 (실시예 5; Page 618-619); W02003022995 (실시예 9; 도 13A, 실시예 53; Page 173, 실시예 2; 도 2A)];
NP_036581 전립선의 6개 막관통 상피 항원
교차 참고: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1
(4) 0772P (CA125, MUC16, 진뱅크 승인 번호 AF361486)
[참고 문헌: J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001); W02004045553 (청구항 14); W0200292836 (청구항 6; 도 12); W0200283866 (청구항 15; Page 116-121); US2003124140 (실시예 16); US2003091580 (청구항 6); W0200206317 (청구항 6; Page 400-408)];
교차 참고: GI:34501467; AAK74120.3; AF361486_1
(5) MPF [MPF, MSLN, SMR, 거대핵세포 증강 인자, 메소텔린, 진뱅크 승인 번호 NM_005823]
[참고 문헌: Yamaguchi, N., et al Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995); W02003101283 (청구항 14); W02002102235 (청구항 13; Page 287-288); W02002101075 (청구항 4; Page 308-309); W0200271928 (Page 320-321); W09410312 (Page 52-57)];
교차 참고: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1
(6) Napi3b [NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 캐리어 패밀리 34 (인산나트륨), 구성원 2, 유형 II 나트륨-의존성 인산염 수송인자 3b, 진뱅크 승인 번호 NM_006424]
[참고 문헌: J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J. A., et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582; W02004022778 (청구항 2); EP1394274 (실시예 11); W02002102235 (청구항 13; Page 326); EP875569 (청구항 1; Page 17-19); W0200157188 (청구항 20; Page 329); W02004032842 (실시예 IV); W0200175177 (청구항 24; Page 139-140)];
교차 참고: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1
(7) Sema 5b [FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, 세마 도메인, 7개 트롬보스폰딘 반복 서열 (유형 1 및 유형-1 유사), 막관통 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B, 진뱅크 승인 번호 AB040878]
[참고 문헌: Nagase T., et al (2000) DNA Res. 7 (2):143-150; W02004000997 (청구항 1); W02003003984 (청구항 1); W0200206339 (청구항 1; Page 50); W0200188133 (청구항 1; Page 41-43, 48-58); W02003054152 (청구항 20); W02003101400 (청구항 11)];
승인: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC:10737;
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자, 진뱅크 승인 번호 AY358628)
[참고; Ross et al (2002) Cancer Res. 62:2546-2553; US2003129192 (청구항 2); US2004044180 (청구항 12); US2004044179 (청구항 11); US2003096961 (청구항 11); US2003232056 (실시예 5); W02003105758 (청구항 12); US2003206918 (실시예 5); EP1347046 (청구항 1); W02003025148 (청구항 20)];
교차-참고: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1
(9) ETBR [엔도텔린 유형 B 수용체, 진뱅크 승인 번호 AY275463]
[참고 문헌: Nakamuta M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N.A., et al J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, sl-S4, 1992; Tsutsumi M., et al Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R. L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C., et al J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R. M.W., et al Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997; Puffenberger E. G., et al Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al Hum. Mol. Genet. 5:351-354, 1996; Amiel J., et al Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996; Hofstra R. M.W., et al Nat. Genet. 12, 445-447, 1996; Svensson P. J., et al Hum. Genet. 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al Mol. Med. 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al (2002) Hum. Genet. 111, 198-206; W02004045516 (청구항 1); W02004048938 (실시예 2); W02004040000 (청구항 151); W02003087768 (청구항 1); W02003016475 (청구항 1); W02003016475 (청구항 1); W0200261087 (도 1); W02003016494 (도 6); W02003025138 (청구항 12; Page 144); W0200198351 (청구항 1; Page 124-125); EP522868 (청구항 8; 도 2); W0200177172 (청구항 1; Page 297-299); US2003109676; US6518404 (도 3); US5773223 (청구항 la; Col 31-34); W02004001004];
(10) MSG783 (RNF124, 이론적 단백질 FLJ20315, 진뱅크 승인 번호 NM_017763)
[참고 문헌: W02003104275 (청구항 1); W02004046342 (실시예 2); W02003042661 (청구항 12); W02003083074 (청구항 14; Page 61); W02003018621 (청구항 1); W02003024392 (청구항 2; 도 93); W0200166689 (실시예 6)];
교차-참고: LocusID:54894; NP_060233.2; NM_017763_1
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선 암 관련 유전자 1, 전립선 암 관련 단백질 1, 전립선의 6개 막관통 상피 항원 2, 6개 막관통 전립선 단백질, 진뱅크 승인 번호 AF455138)
[참고 문헌: Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002); W02003087306; US2003064397 (청구항 1; 도 1); W0200272596 (청구항 13; Page 54-55); W0200172962 (청구항 1; 도 4B); W02003104270 (청구항 11); W02003104270 (청구항 16); US2004005598 (청구항 22); W02003042661 (청구항 12); US2003060612 (청구항 12; 도 10); W0200226822 (청구항 23; 도 2); W0200216429 (청구항 12; 도 10)];
교차-참고: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 M, 구성원 4, 진뱅크 승인 번호 NM_017636)
[참고 문헌: Xu, X. Z., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003); US2003143557 (청구항 4); W0200040614 (청구항 14; Page 100-103); W0200210382 (청구항 1; 도 9A); W02003042661 (청구항 12); W0200230268 (청구항 27; Page 391); US2003219806 (청구항 4); W0200162794 (청구항 14; 도 lA-D)];
교차-참고: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자, 진뱅크 승인 번호 NP_003203 또는 NM_003212)
[참고 문헌: Ciccodicola, A., et al EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991); US2003224411 (청구항 1); W02003083041 (실시예 1); W02003034984 (청구항 12); W0200288170 (청구항 2; Page 52-53); W02003024392 (청구항 2; 도 58); W0200216413 (청구항 1; Page 94-95,105); W0200222808 (청구항 2; 도 1); US5854399 (실시예 2; Col 17-18); US5792616 (도 2)];
교차-참고: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1
(14) CD21 [CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스타인 바 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792 진뱅크 승인 번호 M26004]
[참고 문헌: Fujisaku et al (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125; Weis J. J., et al J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J. J., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S. K., et al (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320; W02004045520 (실시예 4); US2004005538 (실시예 1); W02003062401 (청구항 9); W02004045520 (실시예 4); W09102536 (도 9.1-9.9); W02004020595 (청구항 1)];
승인: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1.
(15) CD79b [CD79B, CD79β, IGb (면역글로불린-관련 베타), B29, 진뱅크 승인 번호 NM_000626 또는 11038674]
[참고 문헌: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al (1992) Eur. J. Immunol. 22(6):1621-1625; W02004016225 (청구항 2, 도 140); W02003087768, US2004101874 (청구항 1, page 102); W02003062401 (청구항 9); W0200278524 (실시예 2); US2002150573 (청구항 5, page 15); US5644033; W02003048202 (청구항 1, pages 306 and 309); WO 99/558658, US6534482 (청구항 13, 도 17A/B); W0200055351 (청구항 11, pages 1145-1146)];
교차-참고: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1
(16) FcRH2 [IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 도메인 함유 포스파타제 고정 단백질 1a), SPAP1B, SPAPIC, 진뱅크 승인 번호 NM_030764, AY358130]
[참고 문헌: Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M. J., et al (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775; W02004016225 (청구항 2); W02003077836; W0200138490 (청구항 5; 도 18D-1-18D-2); W02003097803 (청구항 12); W02003089624 (청구항 25)];
교차-참고: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1
(17) HER2 (ErbB2, 진뱅크 승인 번호 M11730)
[참고 문헌: Coussens L., et al Science (1985) 230 (4730):1132-1139; T., et al Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J. M., et al J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J. J., et al J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H. -S., et al Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al (1993) Genomics 15, 426-429; W02004048938 (실시예 2); W02004027049 (도 1I); W02004009622; W02003081210; W02003089904 (청구항 9); W02003016475 (청구항 1); US2003118592; W02003008537 (청구항 1); W02003055439 (청구항 29; 도 lA-B); W02003025228 (청구항 37; 도 5C); W0200222636 (실시예 13; Page 95- 107); W0200212341 (청구항 68; 도 7); W0200213847 (Page 71-74); W0200214503 (Page 114-117) ; W0200153463 (청구항 2; Page 41-46); W0200141787 (Page 15); W0200044899 (청구항 52; 도 7); W0200020579 (청구항 3; 도 2); US5869445 (청구항 3; Col 31-38); W09630514 (청구항 2; Page 56-61); EP1439393 (청구항 7); W02004043361 (청구항 7); W02004022709; W0200100244 (실시예 3; 도 4)];
승인: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1. EMBL; M11761; AAA35808.1.
(18) NCA (CEACAM6, 진뱅크 승인 번호 M18728)
[참고 문헌: Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R. L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 16899-16903, 2002; W02004063709; EP1439393 (청구항 7); W02004044178 (실시예 4); W02004031238; W02003042661 (청구항 12); W0200278524 (실시예 2); W0200286443 (청구항 27; Page 427); W0200260317 (청구항 2)];
승인: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728;
(19) MDP (DPEP1, 진뱅크 승인 번호 BC017023)
[참고 문헌: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899-16903 (2002); W02003016475 (청구항 1); W0200264798 (청구항 33; Page 85-87); JP05003790 (도 6-8); W09946284 (도 9)];
교차-참고: MIM:179780; AAH17023.1; BC017023_1
(20) IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7, 진뱅크 승인 번호 AF184971)
[참고 문헌: Clark H. F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A. J., et al Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al (2003) Biochemistry 42: 12617-12624; Sheikh F., et al (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010; EP1394274 (실시예 11); US2004005320 (실시예 5); W02003029262 (Page 74-75); W02003002717 (청구항 2; Page 63); W0200222153 (Page 45-47); US2002042366 (Page 20-21); W0200146261 (Page 57-59); W0200146232 (Page 63-65); W09837193 (청구항1; Page 55-59)];
승인: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1.
(21) 브레비칸 (BCAN, BEHAB, 진뱅크 승인 번호 AF229053)
[참고 문헌: Gary S. C., et al Gene 256, 139-147, 2000; Clark H. F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R. L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; US2003186372 (청구항 11); US2003186373 (청구항 11); US2003119131 (청구항 1; 도 52); US2003119122 (청구항 1; 도 52); US2003119126 (청구항 1); US2003119121 (청구항 1; 도 52); US2003119129 (청구항 1); US2003119130 (청구항 1); US2003119128 (청구항 1; 도 52); US2003119125 (청구항 1); W02003016475 (청구항 1); W0200202634 (청구항 1)];
(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, 진뱅크 승인 번호 NM_004442)
[참고 문헌: Chan, J. and Watt, V. M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21: 309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000); W02003042661 (청구항 12); W0200053216 (청구항 1; Page 41); W02004065576 (청구항 1); W02004020583 (청구항 9); W02003004529 (Page 128-132); W0200053216 (청구항 1; Page 42)];
교차 참고: MIM:600997; NP_004433,2; NM_004442_1
(23) ASLG659 (B7h, 진뱅크 승인 번호 AX092328)
[참고 문헌: US20040101899 (청구항 2); W02003104399 (청구항 11); W02004000221 (도 3); US2003165504 (청구항 1); US2003124140 (실시예 2); US2003065143 (도 60); W02002102235 (청구항 13; Page 299); US2003091580 (실시예 2); W0200210187 (청구항 6; 도 10); W0200194641 (청구항 12; 도 7b); W0200202624 (청구항 13; 도 1A-lB); US2002034749 (청구항 54; Page 45-46); W0200206317 (실시예 2; Page 320-321, 청구항 34; Page 321-322); W0200271928 (Page 468-469); W0200202587 (실시예 1; 도 1); W0200140269 (실시예 3; Pages 190-192); W0200036107 (실시예 2; Page 205-207); W02004053079 (청구항 12); W02003004989 (청구항 1); W0200271928 (Page 233-234, 452-453); WO 0116318];
(24) PSCA (전립선 줄기 세포 항원 전구체, 진뱅크 승인 번호 AJ297436)
[참고 문헌: Reiter R. E., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788; W02004022709; EP1394274 (실시예 11); US2004018553 (청구항 17); W02003008537 (청구항 1); W0200281646 (청구항 1; Page 164); W02003003906 (청구항 10; Page 288); W0200140309 (실시예 1; 도 17); US2001055751 (실시예 1; 도 1b); W0200032752 (청구항 18; 도 1); W09851805 (청구항 17; Page 97); W09851824 (청구항 10; Page 94); W09840403 (청구항 2; 도 lB)];
승인: 043653; EMBL; AF043498; AAC39607.1.
(25) GEDA (진뱅크 승인 번호 AY260763);
AAP14954 지방종 HMGIC 융합-파트너-유사 단백질/pid=AAP14954.1 - 호모 사피엔스 종: 호모 사피엔스 (인간)
[참고 문헌: W02003054152 (청구항 20); W02003000842 (청구항 1); W02003023013 (실시예 3, 청구항 20); US2003194704 (청구항 45)];
교차-참고: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1
(26) BAFF-R (B 세포-활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3, 진뱅크 승인 번호 AF116456);
BAFF 수용체/pid=NP_443177.1 - 호모 사피엔스
[참고 문헌: Thompson, J. S., et al Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); W02004058309; W02004011611; W02003045422 (실시예; Page 32-33); W02003014294 (청구항 35; 도 6B); W02003035846 (청구항 70; Page 615-616); W0200294852 (Col 136-137); W0200238766 (청구항 3; Page 133); W0200224909 (실시예 3; 도 3)];
교차 참고: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1; AF132600
(27) CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 이소형, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, 진뱅크 승인 번호 AK026467);
[참고 문헌: Wilson et al (1991) J. Exp. Med. 173:137-146; W02003072036 (청구항 1; 도 1)];
교차-참고: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1
(28) CD79a (CD79A, CD79α, 면역글로불린 관련 알파; Ig 베타 (CD79B)와 공유적으로 상호 작용하고 표면 상에서 IgM 분자와 복합체를 형성하며, B-세포 분화에 관여하는 신호를 전달하는 B 세포-특이적 단백질) PROTEIN SEQUENCE Full mpggpgv...dvqlekp (1..226; 226 aa), pI: 4.84, MW: 25028 TM: 2[P] 유전자 염색체: 19q13.2, 유전자 은행 승인 번호 NP_001774.10)
[참고 문헌: W02003088808, US20030228319; W02003062401 (청구항 9); US2002150573 (청구항 4, pages 13-14); W09958658 (청구항 13, 도 16); W09207574 (도 1); US5644033; Ha et al (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Mueller et al (1992) Eur. J. Biochem. 22: 1621-1625; Hashimoto et al (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud'homme et al (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141-146; Yu et al (1992) J. Immunol. 148 (2) 637; Sakaguchi et al (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464];
(29) CXCR5 [버키트 림프종 수용체 1; CXCL13 케모카인에 의해 활성화되고, 림프구 이동 및 체액성 방어에 있어 기능하며, HIV-2 감염에 일정 역할을 하고 AIDS, 림프종, 골수종 및 백혈병 발병에 있어 일정 역할을 하는 것으로 추정되는 G 단백질-커플링된 수용체] PROTEIN SEQUENCE Full mnypltl...atslttf (1..372; 372 aa), pI: 8.54 MW: 41959 TM: 7[P] 유전자 염색체: 11q23.3, 진뱅크 승인 번호 NP_001707.1)
[참고 문헌: W02004040000; W02004015426; US2003105292 (실시예 2); US6555339 (실시예 2); W0200261087 (도 1); W0200157188 (청구항 20, page 269); W0200172830 (pages 12-13); W0200022129 (실시예 1, pages 152-153, 실시예 2, pages 254-256); W09928468 (청구항 1, page 38); US5440021 (실시예 2, col 49- 52); W09428931 (pages 56-58); W09217497 (청구항 7, 도 5); Dobner et al (1992) Eur. J. Immunol. 22: 2795-2799; Barella et al (1995) Biochem. J. 309:773-779];
(30) HLA-DOB [펩티드와 결합하고 이를 CD4+ T 림프구에 제시하는 MHC 부류 II 분자의 베타 소단위체 (Ia 항원)] PROTEIN SEQUENCE Full mgsgwvp...vllpqsc (1..273; 273 aa, pI: 6.56 MW: 30820 TM: 1[P] 유전자 염색체: 6p21.3, 진뱅크 승인 번호 NP_002111.1)
[참고 문헌: Tonnelle et al (1985) EMBO J. 4 (11):2839-2847; Jonsson et al (1989) Immunogenetics 29 (6):411-413; Beck et al (1992) J. Mol. Biol. 228: 433-441; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-16903; Servenius et al (1987) J. Biol. Chem. 262: 8759-8766; Beck et al (1996) J. Mol. Biol. 255: 1-13; Naruse et al (2002) Tissue Antigens 59:512-519; W09958658 (청구항 13, 도 15); US6153408 (Col 35-38); US5976551 (col 168-170); US6011146 (col 145-146); Kasahara et al (1989) Immunogenetics 30 (1):66-68; Larhammar et al (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119];
(31) P2X5 [퓨린 작동성 수용체 P2X 리간드 개폐형(ligand-gated) 이온 채널 5; 세포외 ATP에 의해 게이트된 이온 채널은 시냅스 전달과 신경발생에 관여할 수 있고, 결핍증은 특발성 배뇨근 불안정의 병태생리학에 기여할 수 있다] PROTEIN SEQUENCE Full mgqagck...lephrst (1..422; 422 aa), pI: 7.63, MW: 47206 TM: 1[P] 유전자 염색체: 17p13.3, 진뱅크 승인 번호 NP_002552.2)
[참고 문헌: Le et al (1997) FEBS Lett. 418(1-2):195-199; W02004047749; W02003072035 (청구항 10); Touchman et al (2000) Genome Res. 10:165-173; W0200222660 (청구항 20); W02003093444 (청구항 1); W02003087768 (청구항 1); W02003029277 (page 82)];
(32) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2) PROTEIN SEQUENCE Full maeaity...tafrfpd (1..359; 359 aa), pI: 8.66, MW: 40225 TM: 1[P] 게놈 염색체: 9pl3.3, 진뱅크 승인 번호 NP_001773.1)
[참고 문헌: W02004042346 (청구항 65); W02003026493 (pages 51-52, 57-58); W0200075655 (pages 105-106); Von Hoegen et al (1990) J. Immunol. 144 (12):4870-4877; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903];
(33) LY64 [림프구 항원 64 (RP105); 루이신 풍부 반복 서열 (LRR) 패밀리의 유형 I 막 단백질은 B-세포 활성화 및 아폽토시스를 조절하고, 기능 상실은 전신성 홍반성 루푸스 환자에게서 질병 활성 증가와 연관이 있다] PROTEIN SEQUENCE Full mafdvsc...rwkyqhi (1..661; 661 aa), pI: 6.20, MW: 74147 TM: 1[P] 유전자 염색체: 5q12, 진뱅크 승인 번호 NP_005573.1)
[참고 문헌: US2002193567; W09707198 (청구항 11, pages 39-42); Miura et al (1996) Genomics 38 (3):299-304; Miura et al (1998) Blood 92:2815-2822; W02003083047; W09744452 (청구항 8, pages 57-61); W0200012130 (pages 24- 26)];
(34) FcRH1 [Fc 수용체-유사 단백질 1; C2 유형 Ig-유사 및 ITAM 도메인을 함유하는 면역글로불린 Fc 도메인에 대한 추정상의 수용체는 B-림프구 분화에 있어 일정 역할을 할 수 있다] PROTEIN SEQUENCE Full mlprlll...vdyedam (1..429; 429 aa), pI: 5.28, MW: 46925 TM: 1[P] 유전자 염색체: 1q21-1q22, 진뱅크 승인 번호 NP_443170.1)
[참고 문헌: W02003077836; W0200138490 (청구항 6, 도 18E-1-18-E-2); Davis et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98 (17):9772-9777; W02003089624 (청구항 8); EP1347046 (청구항 1); W02003089624 (청구항 7)];
(35) IRTA2 (면역글로불린 슈퍼패밀리 수용체 전좌 관련 2; B 세포 발생과 림프종 발생에 있어 가능한 역할을 하는 추정상의 면역수용체; 전좌에 의한 유전자의 탈제어는 몇몇 B 세포 악성 종양에서 일어난다) PROTEIN SEQUENCE Full mllwvil...assaphr (1..977; 977 aa), pI: 6.88 MW: 106468 TM: 1[P] 유전자 염색체: 1q21, 진뱅크 승인 번호 인간: AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; 마우스: AK089756, AY158090, AY506558; NP_112571.1
[참고 문헌: W02003024392 (청구항 2, 도 97); Nakayama et al (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124-127; W02003077836; W0200138490 (청구항 3, 도 18B-1-18B-2)];
(36) TENB2 [성장 인자의 EGF/헤레굴린 계열 및 폴리스타틴과 관계된, TMEFF2, 토모레굴린 (tomoregulin), TPEF, HPP1, TR, 추정상의 막관통 프로테오글리칸] PROTEIN SEQUENCE Full mvlwesp...rastrli (1..374; 374 aa, NCBI 승인: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq: NP_057276; NCBI 유전자: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; 진뱅크 승인 번호 AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436
[참고 문헌: W02004074320 (서열 810); JP2004113151 (서열 2, 4, 8); W02003042661 (서열 580); W02003009814 (서열 411); EP1295944 (pages 69-70); W0200230268 (page 329); W0200190304 (서열 2706); US2004249130; US2004022727; W02004063355; US2004197325; US2003232350; US2004005563; US2003124579; US 6410506; US 66420061; Horie et al (2000) Genomics 67:146-152; Uchida et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266: 593-602; Liang et al (2000) Cancer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones et al (2001) Int J Cancer. Oct 15; 94(2):178-84].
항체 생성
모노클로날 항체 (MAbs)를 생성하기 위해 각종 방법이 이용되어 왔다. 단일 유형의 항체를 생산하는 클론된 세포주를 지칭하는 하이브리도마 기술은 마우스 (뮤린), 햄스터, 랫트 및 인간을 포함한 각종 종의 세포를 이용한다. MAbs (키메라 및 인간화 항체 포함)를 제조하기 위한 기타 방법은 유전 공학 기술, 즉 재조합 DNA 기술을 이용한다.
폴리클로날 항체는 관련 항원 및 아주반트를 수회 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사함으로써 동물에게서 생성시킬 수 있다. 모노클로날 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득한다.
인간 골수종 및 마우스-인간 이종-골수종 세포주 또한, 인간 모노클로날 항체를 생산하는 것으로 보고되었다 [참고: Kozbor, (1984) J. Immunol., 133: 3001; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]. 하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 대상으로 하여, 항원에 대항하여 발생된 모노클로날 항체의 생성에 대해 검정한다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법, 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들어 방사성 면역검정 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정할 수 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 문헌 [참고: Munson et al (1980) Anal. Biochem. 197:220]의 스카차드 (Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정 (예를 들면, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 사용하여 용이하게 분리 및 서열 분석할 수 있다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공된다. 일단 분리되면, DNA를 발현 벡터 내로 위치시킨 다음, 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포 (이들은 항체 단백질을 생산하지 않는다) 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 획득한다 [참고: US 2005/0048572; US 2004/0229310]. 항체를 코딩하는 DNA를 세균 내에서 재조합 발현시키는 것에 관한 고찰 문헌에는 다음 문헌이 포함된다 [참고: Skerra et al (1993) Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 and Pluckthun (1992) Immunol. Revs., 130: 151-188].
추가의 양태에서는, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 문헌 [참고: McCafferty et al (1990) Nature, 348: 552-554]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파아지 라이브러리로부터 분리시킬 수 있다. 문헌 [참고: Clackson et al (1991) Nature, 352: 624-628; and Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597]에는 파아지 라이브러리를 사용하여 뮤린 및 인간 항체를 각각 분리시키는 방법이 기재되어 있다. 후속 공개 문헌에는 매우 큰 파아지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 [참고: Waterhouse et al (1993) Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266] 뿐만 아니라 연쇄 셔플링 [참고: Marks et al (1992) Bio/Technology, 10: 779-783]에 의해 고 친화성 (nM 범위) 인간 항체를 생성시키는 방법이 기재되어 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체를 분리시키기 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행 가능한 대체 방안이다.
DNA는, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 코딩 서열로 치환시키거나 [참고: US 4816567; Morrison, et al (1984) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81: 6851], 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수도 있다.
전형적으로, 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드가 항체의 불변 도메인을 대신하거나 또는 항체의 하나의 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대신하여, 특정 항원에 대한 특이성을 지닌 하나의 항원 결합 부위와, 상이한 항원에 대한 특이성을 지닌 또 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 창출시킨다.
다음 설명은 본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)에 사용된 항체 (Ab)를 생성하기 위한 예시 기술에 관한 것이다. 항체 생성은 항-ErbB2 항체를 기준으로 하여 예시될 것이지만, ErbB 수용체 계열의 기타 구성원들 뿐만 아니라 기타 모든 수용체 또는 종양 관련 항원 또는 표적에 대한 항체도 유사한 방식으로 생성 및 변형시킬 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
항체를 생성시키기 위해 사용될 ErbB2 항원은, 예를 들어 목적하는 에피토프를 함유하는 ErbB2의 세포외 도메인의 가용성 형태 또는 그의 일부일 수 있다. 또 다른 한편으론, 그의 세포 표면에서 ErbB2를 발현하는 세포, 예를 들어 ErbB2를 과발현하도록 형질전환시킨 NIH-3T3 세포; 또는 암종 세포주, 예를 들어 SK-BR-3 세포 [참고: Stancovski et al (1991) PNAS (USA) 88: 8691-8695]를 사용하여 항체를 생성시킬 수 있다. 항체를 생성시키는데 유용한 기타 형태의 ErbB2는 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 1에는 예시되는 인간화 항-ErbB2 항체의 생성 방법이 기재되어 있다. 이러한 인간화 항체는, 예를 들어 인간 가변 중쇄 도메인 내로 혼입된 비-인간 초가변 영역 잔기를 포함할 수 있고, 다음 문헌에 제시된 가변 도메인 넘버링 시스템을 활용하여 69H, 71H 및 73H로 이루어진 군 중에서 선택된 위치에서 골격 영역 (FR) 치환을 포함할 수 있다 [참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]. 한 양태에서는, 인간화 항체가 위치 69H, 71H 및 73H 중의 2군데 또는 전부에서 FR 치환을 포함한다.
인간화에 대한 대체 방안으로서, 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 면역시 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에 완전한 레퍼토리의 인간 항체를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물 (예: 마우스)를 생산하는 것이 현재 가능하다 [참고: Jakobovits et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551; Jakobovits et al (1993) Nature, 362: 255-258; Bruggermann et al (1993) Year in Immuno., 7: 33; 및 US 5591669; US 5589369; US 5545807]
또 다른 한편, 파아지 디스플레이 기술 [참고: McCafferty et al (1990) Nature 348: 552-553]을 사용하여, 면역시키지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생성시킬 수 있다 [참고: Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J. (1993) Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571]. 면역시키지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 구축할 수 있고, 다양한 항원 (자기 항원 포함) 어레이에 대한 항체는 본질적으로, 문헌 [참고: Marks et al (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597; Griffith et al (1993) EMBO J. 12: 725-734; US 5565332; US 5573905]에 기재된 기술에 따라서 분리시킬 수 있다. 인간 항체는 또한, 시험관내 활성화 B 세포에 의해 생성시킬 수도 있다 [참고: US 5567610; US 5229275]. 인간 항-ErbB2 항체가 US 5772997 및 WO 97/00271에 보고되었다.
항체 단편을 생성시키기 위한 각종 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 본래의 항체를 단백질 분해적 절단시킴으로써 유도되었다 [참고: Morimoto et al (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117; and Brennan et al (1985) Science, 229: 81]. 항체 단편은 또한, 재조합 숙주 세포 및 상기 논의된 항체 파아지 라이브러리에 의해 직접적으로 생성시킬 수 있다. Fab'-SH 단편을 이. 콜라이로부터 직접 회수하고, 이를 화학적으로 커플링시켜 F(ab')2 단편을 형성시킬 수 있다 [참고: Carter et al (1992) Bio/Technology 10: 163-167]. 또 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 분리시킬 수 있다. 항체 단편을 생성시키기 위한 기타 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 기타 양태에서는 선택되는 항체가 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다 [참조: WO 93/16185; US 5571894; US 5587458]. 항체 단편은 예를 들어, US 5641870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수도 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일-특이적 또는 이중-특이적일 수 있다.
적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 지닌 이중-특이적 항체 [참고: Millstein et al (1983), Nature 305: 537-539]는 ErbB2 단백질의 2개의 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 이러한 기타 항체는 ErbB2 결합 부위와 EGFR, ErbB3 및/또는 ErbB4에 대한 결합 부위를 결합시킬 수 있다. 또 다른 한편, 항-ErbB2 암 (arm)을, ErbB2-발현성 세포에 대한 세포성 방어 기전에 집중하도록, 백혈구 상의 촉발성 분자, 예를 들면, T-세포 수용체 분자 (예: CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들면 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)와 결합하는 암과 합할 수 있다. 이중-특이적 항체를 사용하여 세포독성제를, ErbB2을 발현하는 세포에 국재시킬 수도 있다 [참고: WO96/16673; US 5837234; W098/02463; US 5821337]. 이중-특이적 항체에 대한 정제 방법이 다음 문헌에 보고되었다 [참고: WO 93/08829; Traunecker et al (1991) EMBO J. 10: 3655-3659; WO 94/04690; Suresh et al (1986) Methods in Enzymology 121: 210; US 5731168]. 이중-특이적 항체는 루이신 지퍼 [참고: Kostelny et al (1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553], 및 단일 쇄 Fv (sFv) 이량체 [참고: Gruber et al (1994) J. Immunol. 152: 5368]를 사용하여 생성시킬 수 있다.
예를 들어, 본래의 항체를 단백질 분해적으로 절단시켜 F(ab')2 단편을 생성시키는 화학적 연쇄를 이용하여, 항체 단편으로부터 이중-특이적 항체를 생성시키는 기술 또한 보고되었다 [참고: Brennan et al (1985) Science 229: 81]. Fab'-SH 단편을 이. 콜라이로부터 직접 회수하고, 이를 화학적으로 커플링시켜 이중-특이적 항체를 형성시킬 수 있다 [참고: Shalaby et al (1992) J. Exp. Med. 175:217-225]. "디아보디" 기술은 이중-특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대체 방법을 제공한다 [참고: Hollinger et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448].
2가 초과 항체가 고려된다. 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖고 2개 이상의 가변 도메인을 갖는 다가 "옥토퍼스 (octopus)" 항체는 이러한 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산을 재조합 발현시킴으로서 용이하게 생성시킬 수 있다 [참고: US 2002/0004586; WO 01/77342]. 예를 들어, 삼중-특이적 항체를 제조할 수 있다 [참고: Tutt et al (1991) J. Immunol. 147: 60].
항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 종양 관련 항원과 결합하는 항체의 돌연변이체 및 각종 이소형이, 항체의 결합 친화성 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위해 고려된다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오티드 변화를, 항체를 코딩하는 핵산 내로 도입하거나 또는 펩티드 합성에 의해 제조한다. 이러한 변형에는, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 잔기 내로의 치환 및/또는 잔기의 치환이 포함된다. 최종 구조물에 도달하기 위해 어떠한 결실, 삽입 및 치환 조합도 가능한데, 단 이러한 최종 구조물은 목적하는 특징을 보유해야 한다. 아미노산 변화는 항체의 해독 후 프로세스를 변경시킬 수도 있는데, 예를 들어 당화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.
돌연변이 유발시키기에 바람직한 위치인, 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는데 유용한 방법은 문헌 [참고: Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"인데, 여기서는 아미노산 잔기, 또는 표적 잔기 군을 확인하고 (예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu 등의 전하를 띤 잔기), 이를 중성 또는 음전하를 띤 아미노산, 예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌으로 대체시켜, 상기 아미노산과 항원 간의 상호작용을 최적화시킨다. 아미노산 삽입물에는 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입물 뿐만 아니라 1개 잔기부터 수 백개 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지 길이의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합물이 포함된다. 말단 삽입물의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 수반한 항-ErbB2 항체, 또는 세포독성 폴리펩티드와 융합된 항체가 포함된다. 항-ErbB2 항체 분자의 기타 삽입 변이체에는 항-ErbB2 항체의 N- 또는 C-말단과 효소 [예를 들어, ADEPT; 참고: Tietze et al (2003) Current Pharm. Design 9: 2155-2175] 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드, 예를 들어 알부민-결합성 펩티드와의 융합물이 포함된다.
혈장-단백질 결합은 단수명 분자의 약동학적 특성을 개선시키는데 효과적인 수단일 수 있다. 알부민은 혈장 내에 가장 풍부한 단백질이다. 혈청 알부민 결합성 펩티드 (ABP)는 융합된 활성 도메인 단백질의 약력학을 변경시킬 수 있는데, 이에는 조직 흡수, 침투 및 확산의 변경이 포함된다. 이들 약력학적 파라미터는 적당한 혈청 알부민 결합성 펩티드 서열을 특이적으로 선별함으로써 조정할 수 있다 [참고: US 20040001827]. 일련의 알부민 결합성 펩티드를 파아지 디스플레이 스크리닝에 의해 확인하였다 [참고: Dennis et al (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277: 35035-35043; WO01/45746]. 본 발명의 화합물에는 문헌 [참고: (i) Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277: 35035-35043 at Tables III and IV, page 35038; (ii) US 20040001827 at [0076] SEQ ID NOS: 9-22; and (iii) WO01/45746 at pages 12-13, SEQ ID NOS:zl-z14; 이들 모두가 본원에 참고로 삽입된다]에 의해 교시된 ABP 서열이 포함된다.
아미노산 서열은 통상적으로, 기초가 되는 핵산 서열을 변경시킴으로써 변경시킨다. 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 서열은 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조한다. 이들 방법에는 천연 공급원으로부터의 분리 방법 (천연 발생적 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 앞서 제조된 항체의 변이체 또는 비-변이체 버젼의 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 부위-지시된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조 방법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 치환 돌연변이 유발을 위한 가장 큰 관심 부위에는 초가변 영역이 포함되지만, FR 변경물이 또한 고려된다.
항체의 생물학적 활성에 있어서의 실질적인 변경은 (a) 치환 부위에서 폴리펩티드 주쇄의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 입체 형태로 유지하는데 대한 그의 효과, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 대한 그의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 대한 그의 효과 면에서 상당히 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 천연 발생적 잔기는 공통의 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 나눈다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나를 또 다른 부류로 교환시키는 것을 수반할 것이다.
항체의 적당한 입체 형태를 유지하는데 관여하지 않은 시스테인 잔기는 일반적으로 세린으로 치환시켜 분자의 산화적 안정성을 개선시키고 이상한 가교결합을 방지할 수도 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 항체에 가하여 그의 안정헝을 개선시킬 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편 등의 항체 단편인 경우).
항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 US 5739277에 기재된 바와 같이, 재이용 (salvage) 수용체 결합성 에피토프를 항체 (특히, 항체 단편) 내로 혼입시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재이용 수용체 결합성 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는데 책임이 있는 IgG 분자 (예: IgGl, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다 [참고: US 2003/0190311, US6821505; US 6165745; US 5624821; US 5648260; US 6165745; US 5834597].
항체의 당화 변이체는 항체의 당화 패턴을 변경시킨 변이체이다. 변경시킨다는 것은 항체에 발견되는 하나 이상의 탄수화물 부분을 결실시키거나, 항체에 하나 이상의 탄수화물 부분을 부가하거나, 당화 조성 (당화 패턴) 또는 당화 정도를 변화시키는 것을 의미한다.
항체는 그의 불변 영역 내의 보존된 위치 (N-연결되거나 O-연결됨)에서 당화시킬 수 있다 [참고: Hse et al (1997) J. Biol. Chem. 272: 9062-9070; Jefferis and Lund, (1997) Chem. Immunol. 65: 111-128; Wright and Morrison, (1997) TibTECH 15:26-32]. 면역글로불린의 올리고당류 측쇄는 단백질의 기능에 영향을 미치고 [참고: Boyd et al (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318; Wittwe and Howard, (1990) Biochem. 29:4175-4180], 당단백질의 제시된 3차원 표면과 입체 형태에 영향을 미칠 수 있는 당단백질 부분들 간의 분자내 상호 작용에 영향을 미친다 [참고: Hefferis and Lund, 상기 참고; Wyss and Wagner (1996) Current Opin. Biotech. 7: 409-416]. 올리고당류는 또한, 특이적 인식 구조에 기초하여 소정의 당단백질을 특정 분자에 표적화시키는 작용을 할 수 있다 [참고: Malhotra et al (1995) Nature Med. 1: 237-243; Umana et al (1999) Nature Biotech. 17: 176-180]. 올리고당류를 제거하는 것이 항체의 항원 결합성과 기타 특성을 최적화시킬 수도 있다 [참고: Boyd et al (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318].
항체의 재조합 생성 동안 당화에 영향을 미치는 인자에는 성장 방식, 배지 조성, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 도식 등이 포함된다 [참고: US 5047335; US 5510261; US 5278299]. 당화 또는 특정 유형의 당화는, 예를 들어 엔도글리코시다제 H (엔도 H)를 사용하여 당단백질로부터 효소적으로 제거할 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포를 유전 공학적으로 처리할 수 있는데, 예를 들어 특정 유형의 다당류를 처리하는데 있어 결함을 만들 수 있다. 이들 및 유사한 기술이 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
항체의 당화 구조는 통상적인 탄수화물 분석 기술, 예를 들어 렉틴 크로마토그래피, NMR, 질량 분광법, HPLC, GPC, 단당류 조성 분석, 순차적인 효소적 분해, 및 HPAEC-PAD (이는 전하에 기초하여 올리고당류를 격리시키기 위해 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한다)에 의해 용이하게 분석할 수 있다. 분석 목적을 위해 올리고당류를 방출시키는 방법 또한 공지되어 있고, 이에는 효소적 처리 (펩티드-N-글리코시다제 F/엔도-β-갈락토시다제를 사용하여 통상적으로 수행함), 주로 O-연결된 구조를 방출시키기 위해 거친 알칼리성 환경을 이용한 제거, 및 N-연결된 올리고당류와 O-연결된 올리고당류 둘 다를 방출시키기 위해 무수 히드라진을 이용한 화학적 방법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
마이탄시노이드 약물 부분
마이탄신 화합물은 마이크로투불린 (microtubulin) 단백질, 투불린의 중합 억제를 통하여 유사분열 동안 미소관의 형성을 억제함으로써 세포 증식을 억제시킨다 [참고: Remillard et al (1975) Science 189:1002-1005; US 5208020]. 마이탄신과 마이탄시노이드는 고도로 세포독성이지만, 암 요법에 있어서의 그들의 임상적 용도는 상당히 제한되는데, 이는 주로 종양에 대한 선택성 불량으로 인한 중증의 전신 부작용 때문이다. 마이탄신을 이용한 임상 시험은 중추 신경계와 위장계에 대한 심각한 부작용으로 인해 중단되었다 [참고: Issel et al (1978) Can. Treatment. Rev. 5:199-207].
마이탄시노이드 약물 부분은 항체-약물 접합체에 있어 관심을 끄는 약물 부분인데, 이는 이들이 (i) 발효 또는 화학적 변형에 의해, 발효 생성물을 유도체화시킴으로서 제조하기가 비교적 용이하고, (ii) 비-디설파이드 링커를 통하여 항체와 접합시키는데 적합한 관능기를 이용하여 유도체화될 수 있으며, (iii) 혈장 내에서 안정적이고, (iv) 각종 종양 세포주에 대항하여 유효하기 때문이다.
마이탄시노이드 약물 부분으로서 사용하기 적합한 마이탄신 화합물은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 공지된 방법에 따라서 천연 공급원으로부터 분리할 수 있거나, 유전 공학 기술을 사용하여 생성시킬 수 있거나 [참고: Yu et al (2002) PNAS 99: 7968-7973], 또는 마이탄시놀 및 마이탄시놀 유사체를 공지된 방법에 따라서 합성적으로 제조할 수 있다.
예시되는 마이탄시노이드 약물 부분에는 변형된 방향족 환, 예를 들어 C-19-데클로로 [참고: US 4256746] (안사미토신 P2를 수소화리튬 알루미늄 환원시켜 제조함); C-20-히드록시 (또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로 [참고: 미국 특허 제4361650호 및 제4307016호] [스트렙토마이세스 (Streptomyces) 또는 악티노마이세스 (Actinomyces)를 사용하여 탈메틸화하거나 LAH를 사용하여 탈염소화시킴으로써 제조됨]; 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시 (-OCOR), +/- 데클로로 [참고: US 4294757] (아실 클로라이드를 사용하여 아실화시킴으로써 제조됨)를 갖는 것; 및 기타 위치에서의 변형물을 갖는 것이 포함된다.
예시되는 마이탄시노이드 약물 부분에는 또한, 마이탄시놀과 H2S 또는 P2S5 를 반응시켜 제조한 C-9-SH [참고: US 4424219]; C-14-알콕시메틸 (데메톡시/CH2OR) [참고: US 4331598]; 노카르디아 (Nocardia)로부터 제조된 C-14-히드록시메틸 또는 아실옥시메틸 (CH20H 또는 CH20Ac) [참고: US 4450254]; 마이탄시놀을 스트렙토마이세스에 의해 전환시킴으로써 제조된 C-15-히드록시/아실옥시 [참고: US 4364866]; 트레위아 누들플로라 (Trewia nudlflora)로부터 분리한 C-15-메톡시 [참고: US 4313946 및 US 4315929]; 마이탄시놀을 스트렙토마이세스에 의해 탈메틸화시킴으로써 제조된 C-18-N-데메틸 [참고: US 4362663 및 US 4322348]; 및 마이탄시놀을 삼염화티탄/LAH 환원시킴으로써 제조된 4,5-데옥시 [참고: US 4371533] 등의 변형물을 갖는 것이 포함된다.
마이탄신 화합물 상의 많은 위치가 연결 유형에 따라서 연결 위치로서 유용한 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 에스테르 연쇄를 형성하기 위해서는, 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형시킨 C-14 위치, 히드록실기로 변형시킨 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치 모두가 적합하다.
마이탄시노이드 약물 부분 (D)에는 하기 구조를 갖는 것이 포함된다:
Figure 112006088990037-pct00007
상기 구조에서, 파선은 항체-약물 접합체 (ADC)의 링커 (L)에 대한 D의 황 원자의 공유 부착을 나타내고; R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬일 수 있다.
아미드기를 황 원자에 부착시키는 알킬렌 쇄는 메타닐, 에타닐 또는 프로필일 수 있는데, 즉 m이 1, 2 또는 3이다 [참고: US 633410, 5208020, Chari et al (1992) Cancer Res. 52: 127-131; Liu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci 93:8618-8623].
마이탄시노이드 약물 부분의 모든 입체이성체, 즉 D의 키랄 탄소에서 R 배위와 S 배위의 모든 조합물이 본 발명의 화합물에 대해 고려된다. 한 양태에서는, 마이탄시노이드 약물 부분 (D)이 다음 입체 화학을 가질 것이다:
Figure 112006088990037-pct00008
D의 에난티오머에는 다음이 포함된다:
DM1 (N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신) [여기서, (CR2)m은 CH2CH2이다];
Figure 112006088990037-pct00009
DM3 (N2'-데아세틸-N2'-(4-머캅토-1-옥소펜틸)-마이탄신) [여기서, (CR2)m은 CH2CH2CH(CH3)이다];
Figure 112006088990037-pct00010
DM4 (N2'-데아세틸-N2'-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-마이탄신) [여기서, (CR2)m은 CH2CH2C(CH3)2이다];
Figure 112006088990037-pct00011
DM3 및 DM4의 황 원자에 인접한 탄소 상의 알킬기 (예: 메틸기)에 의해 부여된 입체 장애는 ADC의 세포내 절단 속도에 영향을 미칠 수 있다 [참고: US 2004/0235840 Al]. 따라서, 변수 알킬 단위 (CR2)m은 시험관내 및 생체내 효력, 효능 및 안전성/독성에 영향을 미칠 수 있다.
링커
링커 L은 디설파이드기를 포함하지 않는 공유 결합(들)을 통하여 항체를 약물 부분에 부착시켜 준다. 링커는 하나 이상의 약물 부분 (D)과 항체 단위 (Ab)를 연결시켜 화학식 I의 항체-약물 접합체 (ADC)를 형성시키기 위해 사용될 수 있는 이관능성 또는 다관능성 부분이다. 항체-약물 접합체 (ADC)는 약물을 항체에 결합시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 링커를 사용하여 편리하게 제조할 수 있다. 항체 (Ab)의 시스테인 티올, 또는 아민, 예를 들어 N-말단 또는 아미노산 측쇄, 예를 들어 리신은 링커 시약, 약물 부분 또는 약물 부분 시약의 관능기와 결합을 형성할 수 있다.
링커는 바람직하게 세포외적으로 안정하다. 세포 내로 수송 또는 전달되기 전에, 항체-약물 접합체 (ADC)가 안정적이고 본래 상태로 유지되는 것이 바람직한데, 즉 항체가 약물 부분과 연결된 채로 있는 것이 바람직하다. 링커는 표적 세포 외부에서는 안정적이고, 세포 내부에서는 몇몇 효과적인 속도로 절단될 수 있다. 유효한 링커는 (i) 항체의 특이 결합 특성을 유지시켜 주고; (ii) 접합체 또는 약물 부분을 세포내 전달할 수 있게 해주며, (iii) 접합체가 그의 표적화 부위로 전달 또는 수송되기 전까지는 안정적이고 본래 상태 (즉, 절단되지 않은 상태)로 유지시켜 주며; (iv) 마이탄시노이드 약물 부분의 세포독성, 세포-사멸 효과 또는 세포증식 억제 효과를 유지시켜 줄 것이다. ADC의 안정성은 표준 분석 기술, 예를 들어 질량 분광법, HPLC, 및 분리/분석 기술 LC/MS에 의해 측정할 수 있다.
항체와 약물 부분을 공유 부착시키기 위해서는, 2개의 반응성 관능기를 갖는, 즉 반응성 측면에서 2가인 링커가 필요하다. 2개 이상의 관능성 또는 생물학적 활성 부분, 예를 들어 펩티드, 핵산, 약물, 독소, 항체, 합텐 및 리포터 (reporter)기를 부착시키는데 유용한 2가 링커 시약은 공지되어 있고, 이를 사용하여 접합체를 생성시키는 방법이 보고되었다 [참고: Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p234-242].
링커는 다음 중에서 선택된 구조를 가질 수 있다:
Figure 112006088990037-pct00012
상기 구조에서, 파선은 어느 한 배향에서 Ab 및 D에 대한 공유 부착을 나타낸다. X는 어느 한 배향에서 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112006088990037-pct00013
상기 구조에서, R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고; n은 1 내지 12이다. Y는 어느 한 배향에서 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112006088990037-pct00014
상기 구조에서, R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고; n은 1 내지 12이다.
예를 들어, 링커는 SMCC로 명명된 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112006088990037-pct00015
또 다른 양태에서, 링커 (L)는 하기 구조를 갖는다:
Figure 112006088990037-pct00016
상기 구조에서, 파선은 어느 한 배향에서 Ab 및 D에 대한 공유 부착을 나타낸다.
예를 들어, 링커는 SIAB로 명명된 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112006088990037-pct00017
또 다른 양태에서, 링커 (L)는 하기 구조를 갖는다:
Figure 112006088990037-pct00018
또 다른 양태에서, 링커는 용해도 또는 반응성을 조정시키는 기로 치환시킬 수 있다. 예를 들어, 설포네이트 치환체는 시약의 수 용해도를 증가시킬 수 있고 링커 시약과 항체 또는 약물 부분과의 커플링 반응을 촉진시킬 수 있거나, 또는 ADC를 제조하기 위해 이용된 합성 경로에 따라서 Ab-L과 D와의 커플링 반응 또는 D-L과 Ab와의 커플링 반응을 촉진시킬 수 있다.
또 다른 양태에서는, 링커가 항체 상에 존재하는 친전자기와 반응성인 친핵기를 갖는 반응성 관능기를 갖는다. 항체 상의 유용한 친전자기에는 알데히드 및 케톤 카보닐 기가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 링커의 친핵기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자기와 반응할 수 있고, 항체 단위와 공유 결합을 형성할 수 있다. 링커 상의 유용한 친핵기에는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카바존, 히드라진 카복실레이트 및 아릴히드라지드가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 항체 상의 친전자기는 링커에 부착시키기에 편리한 부위를 제공한다.
링커는 하나 이상의 아미노산 단위를 포함하는 펩티드성일 수 있다. 펩티드 링커 시약은 자동화 합성기, 예를 들어 라이닌 심포니 (Rainin Symphony) 펩티드 합성기 (공급처: Protein Technologies, Inc., Tucson, AZ), 또는 모델 433 (공급처: Applied Biosystems, Foster City, CA) 상에서, t-BOC 화학 [참고: Geiser et al "Automation of solid-phase peptide synthesis" in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R. Liss, Inc., 1988, pp. 199-218] 및 Fmoc/HBTU 화학 [참고: Fields, G. and Noble, R. (1990) "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids", Int. J. Peptide Protein Res. 35: 161-214]를 포함하여, 펩티드 화학 분야에 널리 공지되어 있는 고체 상 또는 액체 상 합성 방법 [참고: E. Schroder and K. Lubke, The Peptides, volume 1, pp 76-136 (1965) Academic Press]에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물은 특별히, 가교제 시약: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB (석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트), 및 비스-말레이미드 시약: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEO)3, BM(PEO)4 [공급처: Pierce Biotechnology, Inc., Customer Service Department, P. O. Box 117, Rockford, IL. 61105 U.S.A, U.S.A 1-800-874-3723, International +815-968-0747]을 사용하여 제조된 ADC를 고려하지만, 이에 제한되지 않는다 [참고; pages 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog]. 비스-말레이미드 시약은 항체의 시스테인 잔기의 자유 티올기를 순차적 또는 동시 방식으로, 티올 함유 약물 부분, 표지 또는 링커 중간체에 부착시킬 수 있게 해준다. 항체의 티올기, 마이탄시노이드 약물 부분 또는 링커 중간체와 반응성인, 말레이미드 이외의 기타 관능기에는 요오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디설파이드, 피리딜 디설파이드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트가 포함된다.
Figure 112006088990037-pct00019
DM1이 BMPEO 링커를 통하여 트라스투주마브의 티올기에 연결되는 예시 항체-약물 접합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure 112006088990037-pct00020
상기 구조에서, Tr은 트라스투주마브이고; n은 0, 1 또는 2이며; p는 1, 2, 3, 또는 4이다.
유용한 링커 시약은 또한, 기타 공급처 [예: Molecular Biosciences Inc. (Boulder CO)]를 통하여 수득할 수 있거나 또는 문헌 [참고: Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67: 1866-1872; US 6214345 to Firestone et al; WO02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; and WO 04/032828]에 기재된 과정에 따라서 합성할 수 있다.
링커는 하나 이상의 약물 부분을 분지화 다관능성 링커 부분을 통하여 항체에 공유 부착시키기 위한 수지상 (dendritic) 유형 링커일 수 있다 [참고: Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12: 2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry11: 1761-1768; King et al (2002) Tetrahedron Letters 43: 1987-1990]. 수지상 링커는 ADC의 효력과 관계가 있는 약물 대 항체 몰 비, 즉 부하비를 증가시킬 수 있다. 따라서, 항체가 단지 1개의 반응성 시스테인 티올기를 보유하고 있는 경우에는, 다수의 약물 부분을 수지상 링커를 통하여 부착시킬 수 있다.
다음에 예시되는 수지상 링커 시약 양태는 9개 이하 친핵성 약물 부분 시약이 클로로에틸 질소 머스타드 관능기와의 반응에 의해 접합될 수 있게 해준다:
Figure 112006088990037-pct00021
약물 부하비
약물 부하비는 화학식 I의 분자에 p로 나타내는데, 이는 항체당 평균 마이탄시노이드 약물 수이다. 약물 부하비는 항체 (Ab)당 1 내지 8개 약물 (D) 범위일 수 있는데, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8개의 약물 부분이 항체와 공유적으로 부착된다. 화학식 I의 ADC의 조성에는 1 내지 8개 약물과 접합된 항체 컬렉션이 포함된다. 접합 반응물로부터의 ADC 제제 중의 항체당 평균 약물 수는 통상적인 수단, 예를 들어 질량 분광법, ELISA 검정, 전기영동 및 HPLC에 의해 성상 확인할 수 있다. ADC의 정량적 분포도 (p)를 결정할 수도 있다. ELISA에 의해, ADC의 특별한 제제 중의 p 평균값을 결정할 수 있다 [참고: Hamblett et al (2004) Clinical Cancer Res. 10: 7063-7070; Sanderson et al (2005) Clinical Cancer Res. 11: 843-852]. 그러나, p (약물) 분포값은 ELISA의 항체-항원 결합 및 검출 한계에 의해 식별 가능하지 않다. 또한, 항체-약물 접합체를 검출하기 위한 ELISA 검정은 약물 부분이 항체, 예를 들어 중쇄 또는 경쇄 단편 또는 특정한 아미노산 잔기와 부착되었는지를 결정해주지 않는다. 몇몇 경우에는, 동질적 ADC (여기서, p는 기타 약물 부하비를 나타내는 ADC로부터의 특정 값이다)의 분리, 정제 및 성상 확인이 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다.
몇몇 항체-약물 접합체의 경우에는, p가 항체 상의 부착 부위 수로써 제한될 수 있다. 예를 들어, 부착이 상기 예시 양태에서와 같이 시스테인 티올인 경우에는, 항체가 단지 1개 또는 수 개의 시스테인 티올기를 가질 수 있거나, 또는 링커를 통하여 부착시킬 수 있는 단지 1개 또는 수 개의 충분히 반응성인 티올기를 가질 수 있다. 약물 부하비가 더 클 수록, 예를 들어 p>5이면, 특정 항체-약물 접합체의 세포성 투과성 상실, 응집, 불용성 또는 독성이 유발될 수 있다.
전형적으로는, 이론적 최대 수 보다 적은 수의 약물 부분이 접합 반응 동안 항체와 접합된다. 항체는, 예를 들어 약물-링커 중간체 (D-L) 또는 링커 시약과 반응하지 않는 많은 리신 잔기를 함유할 수 있다. 가장 반응성인 리신 잔기 만이 아민-반응성 링커 시약과 반응할 수 있다. 또한, 가장 반응성인 시스테인 티올기 만이 티올-반응성 링커 시약과 반응할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 부분과 연결될 수 있는 반응성 및 자유 시스테인 티올기를 존재한다 하드라도 많이 함유하지 않는다. 본 발명의 화합물의 항체 내의 대부분의 시스테인 티올 잔기는 디설파이드 브릿지로서 존재하므로, 부분 또는 완전한 환원 조건 하에 환원제, 예를 들어 디티오트레이톨 (DTT) 또는 TCEP로 환원시켜야만 한다. 부가적으로, 항체를 대상으로 하여 변성 조건을 적용시켜 반응성 친핵기, 예를 들어 리신 또는 시스테인을 드러내야만 한다. ADC의 부하비 (약물/항체 비)는 다음을 포함한 몇 가지 상이한 방식으로 제어할 수 있다: (i) 항체와 비교하여 몰 과량의 약물-링커 중간체 (D-L) 또는 링커 시약을 제한하고, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도를 제한하며, (iii) 시스테인 티올 변형에 대한 환원적 조건을 부분적으로 제한한다.
항체의 하나 이상의 친핵기 또는 친전자기가 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응한 다음, 약물 부분 시약과 반응하는 경우에는, 이로써 생성되는 생성물이, 항체와 부착된 일정 분포도의 약물 부분 (예를 들어, 1, 2, 3 등)을 수반한 ADC 화합물의 혼합물이다. 액체 크로마토그래피 방법, 예를 들어 중합성 역상 (PLRP) 및 소수성 상호 반응 (HIC)은 상기 혼합물 중의 화합물을 약물 부하비 값으로써 분리시킬 수 있다. 단일 약물 부하비 값 (p)를 갖는 ADC의 제제를 분리할 수도 있다 [참고: "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Hamblett, K. J., et al, Abstract No. 624, American Association for Cancer Research; 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; "Controlling the Location of Drug Attachment in Antibody-Drug Conjugates", Alley, S. C., et al, Abstract No. 627, American Association for Cancer Research; 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004]. 그러나, 이들 단일 부하비 값 ADCs는 여전히 이질적 혼합물일 수 있는데, 이는 약물 부분이 링커를 통하여 항체 상의 상이한 부위에 부착될 수 있기 때문이다.
항체-약물 접합체의 제조
화학식 I의 ADC는 다음을 포함한, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 이용하여 여러 경로에 의해 제조할 수 있다: (1) 항체의 친핵기 또는 친전자기를 2가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 항체-링커 중간체 Ab-L을 형성시킨 다음, 이를 활성화 약물 부분 D와 반응시키는 방법; 및 (2) 약물 부분의 친핵기 또는 친전자기를 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 약물-링커 중간체 D-L을 형성시킨 다음, 이를 항체의 친핵기 또는 친전자기와 반응시키는 방법. 접합 방법 (1) 및 (2)는 각종 항체, 약물 부분 및 링커로 이용하여 화학식 I의 항체-약물 접합체를 제조할 수 있다.
항체 상의 친핵기에는 (i) N-말단 아민기; (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어 리신; (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어 시스테인; 및 (iv) 당 히드록실 또는 아미노기 (여기서, 항체가 당화된다)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 아민, 티올 및 히드록실기는 친핵성이고, 반응하여 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들면, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들면, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원 가능한 쇄간 디설파이드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체를 환원제 DTT [클레란트 (Cleland) 시약, 디티오트레이톨] 또는 TCEP [트리스(2-카복시에틸)포스핀 히드로클로라이드; 참고: Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273: 73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA]로 처리함으로써, 링커 시약과의 접합을 위해 반응성이 되도록 할 수 있다. 이로써, 각 시스테인 디설파이드 브릿지는 이론적으로, 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 아민을 티올로 전환시켜 주는 리신과 2-아미노티올란 [트라우트 (Traut) 시약]의 반응을 통하여 부가의 친핵기를 항체 내로 도입할 수 있다.
링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 부분을 도입하도록 항체를 변형시킴으로써, 항체-약물 접합체를 또한 생성시킬 수 있다. 당화 항체의 당을, 예를 들어 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화시켜 링커 시약 또는 약물 부분의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 이로써 생성된 이민 쉬프 (Schiff) 염기 기는 안정한 연쇄를 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어, 수소화붕소 시약에 의해 환원시켜 안정한 아민 연쇄를 형성시킬 수 있다. 한 양태에서는, 당화 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물 상의 적당한 기와 반응할 수 있는 단백질 내에 카보닐 (알데히드 및 케톤) 기가 생성될 수 있다 [참고: Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p234-242]. 또 다른 양태에서는, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질을 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 제1 아미노산 대신 알데히드가 생성될 수 있다 [참고: Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3: 138-146; US 5362852]. 이러한 알데히드는 약물 부분 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
마찬가지로, 약물 부분 상의 친핵기에는 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들면, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들면, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성하기 위해 반응할 수 있는, 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카바존, 히드라진 카복실레이트, 및 아릴히드라지드기가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
마이탄신을, 예를 들어 May-SSCH3로 전환시킬 수 있고, 이를 자유 티올 May-SH로 환원시킨 다음, 변형된 항체 [참고: Chari et al (1992) Cancer Research 52:127-131]와 반응시켜 디설파이드 링커를 수반한 마이탄시노이드-항체 면역접합체를 생성시킬 수 있다. 디설파이드 링커를 수반한 항체-마이탄시노이드 접합체가 보고되었다 [참고: WO 04/016801; US 6884874; US2004/039176 Al; WO 03/068144; US 2004/001838 Al; US 6441163; US 5208020; US 5416064; WO 01/024763]. 디설파이드 링커 SPP는 링커 시약 N-석신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트를 이용하여 구축한다. 항체-SPP-DMl 접합체는 하기 구조로써 나타낸다:
디설파이드 (S-S) 링커 항체-약물 접합체를, 본 발명의 비-디설파이드 링커 ADC와 비교할 목적으로 시험하였다. 트라스투주마브-SPP-DMl을 실시예 3에 따라서 제조하였다 [참고: Ranson, M. and Sliwkowski M. (2002) Oncology 63 (suppl 1):17-24]. 디설파이드 항체-약물 접합체: 트라스투주마브-SPDP-DM1, 트라스투주마브-SPP-DM3, 및 트라스투주마브-SPP-DM4를 또한 시험하였고, 이는 하기 구조를 갖는다:
Figure 112006088990037-pct00022
본 발명의 ADC는 Ab-SMCC-DMl로서 나타낸, SMCC 링커 및 DM1 마이탄시노이드 약물 부분을 포함한다:
Figure 112006088990037-pct00023
Ab-SMCC-DM1의 한 양태는 트라스투주마브-SMCC-DMl (여기서, p는 1,2, 3, 또는 4이다) (Ab = 트라스투주마브, Tr, WO 2005/037992). ADC의 또 다른 양태는 하기 구조를 갖는 트라스투주마브-SIAB-DM1 (트라스투주마브 = Tr)이다:
Figure 112006088990037-pct00024
종양 관련 항원 및 세포 표면 수용체에 대항하여 생성된 항체-약물 접합체 (ADC)에 대한 스크리닝
종양 관련 항원 및 세포 표면 수용체, 예를 들어 HER2의 과발현과 연관된 질병 또는 장애의 예방적 또는 치료적 처치로서 효능이 있는 항체-약물 접합체 (ADC)를 스크리닝하는데 있어서 트랜스제닉 동물 및 세포주가 특히 유용하다 [참고: US 6632979]. 유용한 ADC에 대한 스크리닝은 후보 ADC를 일정 용량 범위에 걸쳐 트랜스제닉 동물에게 투여하고, 각종 시점에서 평가되고 있는 질병 또는 장애에 대한 ADC의 효과(들)에 대해 검정하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 적용 가능할 경우 질병 유도인자에 노출시키기에 앞서 또는 노출시키는 것과 동시에 약물을 투여할 수 있다. 후보 ADC를 중간 또는 고 처리능력 스크리닝 포맷 하에 일련으로 및 개별적으로, 또는 나란히 스크리닝할 수 있다. 질병 또는 장애의 예방적 또는 치료적 처치에 대한 유용성을 알아보기 위해 ADC를 스크리닝할 수 있는 속도는 데이터의 검출/측정/분석을 포함한 합성 또는 스크리닝 방법 속도에 의해서만 제한된다.
한 가지 양태는 (a) 안정한 유방암 세포주로부터의 세포를 비-인간 동물에게 이식하는 단계; (b) ADC 약물 후보를 상기 비-인간 동물에게 투여하는 단계; 및 (c) 이식된 세포주로부터의 종양 형성을 억제할 수 있는 후보의 능력을 결정하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이다. 본 발명은 또한, (a) 안정한 유방암 세포주로부터의 세포를 약물 후보와 접촉시키는 단계; 및 (b) 이러한 안정한 세포주의 성장을 억제할 수 있는 ADC 후보의 능력을 평가하는 단계를 포함하여, 수용체 단백질의 과발현을 특징으로 하는 질병 또는 장애의 치료를 알아보기 위해 ADC 후보를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
한 가지 양태는 (a) 안정한 유방암 세포주로부터의 세포를 ADC 약물 후보와 접촉시키는 단계; 및 (b) HER2의 리간드 활성화를 차단시킬 수 있는 ADC 후보의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이다. 또 다른 양태에서는, 헤레굴린 결합을 차단시킬 수 있는 ADC 후보의 능력을 평가한다. 또 다른 양태에서는, 리간드-자극된 티로신 인산화를 차단시킬 수 있는 ADC 후보의 능력을 평가한다.
또 다른 양태는 (a) 안정한 유방암 세포주로부터의 세포를 ADC 약물 후보와 접촉시키는 단계; 및 (b) 세포 사멸을 유도시킬 수 있는 ADC 후보의 능력을 평가하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이다. 한 양태에서는, 아폽토시스를 유도시킬 수 있는 ADC 후보의 능력을 평가한다.
또 다른 양태는 (a) ADC 약물 후보를, 예를 들어 그의 유선 세포 내에 본래의 인간 단백질 (예: HER2) 또는 그의 단편을 과발현하고, 항체 치료, 예를 들어 항-HER2에 대해 반응하지 않거나 불충분하게 반응하는 종양 (예: 유방 종양)이 발생한 트랜스제닉 비-인간 포유류 (이러한 트랜스제닉 포유류는 그의 발현을 지시하는 전사 조절성 서열과 작동적으로 연결된 본래의 인간 단백질 또는 본래의 인간 단백질의 생물학적 활성을 지닌 그의 단편을 코딩하는 핵산 서열이 그의 게놈 내로 안정적으로 통합되었다), 또는 상기 트랜스제닉 비-인간 포유류로부터 이식된 종양을 보유하고 있는 비-인간 포유류에게 투여하는 단계; 및 (b) 표적 질병 또는 장애에 대한 ADC 후보의 효과를 평가하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이다. 제한되지 않지만, 상기 질병 또는 장애는 HER2-과발현성 암, 예를 들어 유방, 난소, 위, 자궁내막, 타액선, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 및 방광암일 수 있다. 암은 HER2가 세포당 약 500,000개 이상 카피, 또는 세포당 약 2,000,000개 이상 카피로 발현된 유방암일 수 있다. ADC 약물 후보는, 예를 들어 당해 분야에 널리 공지되고 다음에 기재되는 바와 같은 검정 방법을 사용하여, 세포 사멸 및/또는 아폽토시스를 유도시킬 수 있는 능력에 대해 평가할 수 있다.
한 양태에서는, 후보 ADC를 일정 용량 범위에 걸쳐 트랜스제닉 동물에게 투여한 다음, 시간 경과에 따른 해당 화합물에 대한 동물의 생리적 반응을 평가함으로써 스크리닝한다. 투여는 평가되는 화합물의 화학적 성질에 따라서 경구 투여하거나 적합하게 주사할 수 있다. 몇몇 경우에는, 해당 화합물을 이러한 화합물의 효능을 증강시킬 수 있는 조인자와 연계해서 투여하는 것이 적당할 수 있다. 피검 트랜스제닉 동물로부터 유래된 세포주를 사용하여, 특정의 종양 관련 항원 단백질 또는 세포 표면 수용체의 과발현, 예를 들어 HER2 과발현과 연관된 각종 장애를 치료하는데 유용한 화합물에 대해 스크리닝하는 경우에는, 시험 화합물을 적당한 시점에 세포 배양 배지에 부가하고, 적당한 생화학적 및/또는 조직학적 검정을 이용하여 화합물에 대한 세포성 반응을 시간 경과에 따라 평가한다. 몇몇 경우에는, 관심있는 화합물을 이러한 화합물의 효능을 증강시킬 수 있는 조인자와 연계해서 배양 배지에 적용하는 것이 적당할 수 있다.
따라서, 본 발명은 과발현된 HER2 단백질 (이의 존재는 비정상적인 세포 기능과 상관이 있고, 이는 유방 종양 발생 원인으로서 관계가 있는 유선의 세포성 증식 및/또는 분화의 발병 기전에 존재한다)을 특이적으로 표적으로 하여 이와 결합하는 ADC를 확인하기 위한 검정을 제공한다.
ErbB (예: ErbB2) 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 ADC를 확인하기 위해, (예를 들어, 관심있는 ErbB 수용체와 ErbB 이종-올리고머를 형성하는 또 다른 ErbB 수용체와 접합하여) ErbB (ErbB2) 수용체를 발현하는 세포에 대한 ErbB 리간드 결합을 차단시킬 수 있는 화합물의 능력을 결정할 수 있다. 예를 들어, HER2를 과발현하는 트랜스제닉 동물로부터 분리시키고, 또 다른 ErbB 수용체 (이와 HER2는 이종-올리고머를 형성한다)를 발현하도록 형질감염시킨 세포를 ADC와 함께 항온 배양 (즉, 배양)한 다음, 표지된 ErbB 리간드에 노출시킬 수 있다. 이어서, ErbB 이종-올리고머에서 ErbB 수용체에 대한 리간드 결합을 차단시킬 수 있는 화합물의 능력을 평가할 수 있다.
예를 들어, 후보 ADC에 의한, HER2를 과발현하고 본원에서 트랜스제닉 비-인간 동물 (예: 마우스)로부터 수립된 유방 종양 세포주에 대한 헤레굴린 (HRG) 결합 억제는 24-웰-판 포맷으로 얼음 상의 단층 배양을 이용하여 수행할 수 있다. 항-ErbB 모노클로날 항체를 각 웰에 가하고 30분 동안 항온 배양할 수 있다. 이어서, 125I-표지시킨 rHRGβ1177-224 (25,000 cpm)을 가하고, 4 내지 16시간 동안 항온 배양을 지속할 수 있다. 용량 반응 곡선을 제조할 수 있고, 관심있는 화합물에 대한 IC50 값을 계산할 수 있다.
또 다른 한편, 또는 부가적으로, ErbB 이종-올리고머에 존재하는 ErbB 수용체의 ErbB 리간드-자극된 티로신 인산화를 차단시킬 수 있는 ADC의 능력을 평가할 수 있다. 예를 들어, 본원의 트랜스제닉 동물로부터 수립된 세포주를 시험용 ADC와 함께 항온 배앙한 다음, 항-포스포티로신 모노클로날 항체 (이는 검출 가능한 표지와 임의로 접합된다)를 사용하여 ErbB 리간드-의존성 티로신 인산화 활성에 대해 검정할 수 있다. US 5766863에 기재된 키나제 수용체 활성화 검정이 또한, ErbB 수용체 활성화를 결정하고 상기 화합물에 의해 이러한 활성을 차단시키는데 이용 가능하다.
한 양태에서는, 본질적으로 다음에 기재된 바와 같이 MCF7 세포에서 p180 티로신 인산화의 HRG 자극을 억제하는 ADC에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, HER2-트랜스제닉 동물로부터 수립된 세포주를 24-웰 판에 도말할 수 있고, 화합물을 각 웰에 가할 수 있으며, 실온에서 30분 동안 항온 배양한 다음; rHRGβ1177-224를 각 웰에 가하여 0.2 nM의 최종 농도로 만들 수 있고, 항온 배양을 약 8분 동안 지속시킬 수 있다. 배지를 각 웰로부터 흡인시킬 수 있고, 100 ㎕의 SDS 샘플 완충액 (5% SDS, 25 mM DTT, 및 25 mM 트리스-HCl, pH 6.8)을 부가함으로써 반응을 중지시킬 수 있다. 각 샘플 (25 ㎕)을 4 내지 12% 구배 겔 (공급처: Novex) 상에서 전기영동시킨 다음, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 전기영동적으로 전이시킬 수있다. 항-포스포티로신 (1 ㎍/ml) 면역블롯을 전개할 수 있고, Mr - 180,000에서 우세한 반응성 밴드 세기를 반사도 밀도측정에 의해 정량화할 수 있다. 수용체 인산화의 억제를 평가하기 위한 대체 방법은 KIRA (키나제 수용체 활성화) 검정이다 [참고: Sadick et al (1998) Jour. of Pharm. and Biomed. Anal. 1-9]. p180 티로신 인산화의 HRG 자극을 억제하는 것으로 공지되어 있는 HER2에 대항하여 널리 확립된 모노클로날 항체 중의 몇몇을 본 검정에서 양성 대조군으로서 사용할 수 있다. 반사도 밀도측정에 의해 결정된 바와 같은, p180 티로신 인산화의 HRG 자극 억제에 대한 용량-반응 곡선을 만들 수 있고, 관심있는 화합물에 대한 IC50을 계산할 수 있다.
HER2-트랜스제닉 동물로부터 유래된 세포주에 대한 시험용 ADC의 성장 억제 효과를 평가할 수도 있다 [참고: Schaefer et al (1997) Oncogene 15:1385-1394]. 이러한 검정에 따라서, 상기 세포를 4일 동안 각종 농도의 시험 화합물로 처리하고, 결정 바이올렛 또는 레독스 염료 알라마르 블루 (redox dye Alamar Blue)로 염색시킬 수 있다. 상기 화합물과 함께 항온 배양하면, 이는 MDA-MB-175 세포 상에서 모노클로날 항체 2C4에 의해 표시된 바와 유사한, 상기 세포주에 대한 성장 억제 효과가 나타날 수 있다 [Schaefer et al., 상기 참고]. 추가 양태에서는, 외인성 HRG가 이러한 억제를 상당히 역전시키지 않을 것이다.
HER2를 특이적으로 표적화하는 성장 억제성 ADC 화합물을 확인하기 위해, 트랜스제닉 동물로부터 유래된 HER2-과발현성 암 세포의 성장을 억제하는 ADC에 대해 스크리닝할 수 있다 [참고: US 5677171]. 이러한 검정에 따라서, HER2 과발현성 세포를, 10% 태아 소 혈청, 글루타민 및 페니실린 스트렙토마이신을 보충시킨 F12 배지와 DMEM 배지의 1:1 혼합물에서 성장시킨다. 상기 세포를 35 mm 세포 배양 디쉬에서 20,000개 세포로 도말하고 (2 mls/35mm 디쉬), 시험 화합물을 각종 농도로 부가한다. 6일 후, 전자 COULTER™ 세포 계수기를 이용하여, 처리되지 않은 세포와 비교한 세포 수를 계수한다. 세포 성장을 약 20 내지 100% 또는 약 50 내지 100% 억제하는 ADC를 성장 억제성 화합물로서 선별할 수 있다.
세포 사멸을 유도하는 ADC를 선별하기 위해, 예를 들어 PI, 트리판 블루 (trypan blue) 또는 7AAD 흡수에 의해 지시된 바와 같은 막 완전성 상실을 대조군과 비교해서 평가할 수 있다. PI 흡수 검정은 트랜스제닉 동물의 유방 종양 조직으로부터 분리된 세포를 이용한다. 이러한 검정에 따라서, 세포를, 10% 열-불활성화 FBS (공급처: Hyclone) 및 2 mM L-글루타민을 보충시킨 둘벡코 변형 이글 (Dulbecco's Modified Eagle) 배지 (D-MEM):햄스 (Ham's) F-12 (50:50)에서 배양한다. 따라서, 상기 검정은 보체 및 면역 효과기 세포의 부재 하에 수행한다. 상기 세포를 100 x 20 mm 디쉬에서 3 x 106개/디쉬 밀도로 시딩하고, 밤새 부착시켜 준다. 이어서, 상기 배지를 꺼내고, 이를 신선한 배지 단독으로 대체시키거나 각종 농도의 화합물을 함유하는 배지로 대체시킨다. 세포를 3일 동안 항온 배양한다. 각 처리 후, 단층을 PBS로 세척하고, 트립신 처리함으로써 박리시킨다. 이어서, 세포를 4℃에서 5분 동안 1200 rpm으로 원심분리시키고, 펠릿을 3 ml의 찬 Ca2+ 결합용 완충액 (10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)에 재현탁시키고, 35-mm 여과기-캡핑된 12 x 75 튜브 (튜브당 1 ml; 처리군 당 3개 튜브) 내로 등분하여 세포 집단 (덩어리)을 제거한다. 이어서, 튜브에 PI (10 ㎍/ml)을 공급한다. FACSCAN™ 세포 유동계수기 및 FACSCONVERT™ CellQuest 소프트웨어 (공급처: Becton Dickinson)를 사용하여 샘플을 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 결정된 바와 같이 통계상 유의적 수준의 세포 사멸을 유도시키는 화합물을 세포 사멸 유도성 화합물로서 선별할 수 있다.
아폽토시스를 유도시키는 화합물을 선별하기 위해, 트랜스제닉 동물의 유방 종양 조직으로부터 수립된 세포를 이용하는 아넥신-결합 검정을 수행한다. 이 세포를 앞서 단락에서 논의된 바와 같이 디쉬에서 배양 및 시딩한다. 이어서, 배지를 꺼내고, 이를 신선한 배지 단독으로 대체시키거나 또는 10 ㎍/ml의 항체-약물 접합체 (ADC)를 함유하는 배지로 대체시킨다. 3일 동안 항온 배양한 후, 단층을 PBS로 세척하고, 트립신 처리함으로써 박리시킨다. 그 다음, 상기 세포-사멸 검정에 대해 논의된 바와 같이, 세포를 원심분리시키고, Ca2+ 결합용 완충액에 재현탁시키고, 튜브 내로 등분한다. 이어서, 튜브에 표지시킨 아넥신 (예: 아넥신 V-FITC) (1 ㎍/ml)을 공급한다. FACSCAN™ 세포 유동계수기 및 FACSCONVERT™ CellQuest 소프트웨어 (공급처: Becton Dickinson)를 사용하여 샘플을 분석할 수 있다. 대조군에 비해 통계상 유의적 수준의 아넥신 결합을 유도시키는 화합물을 아폽토시스 유도성 화합물로서 선별한다.
시험관내 세포 증식 검정
일반적으로, 항체-약물 접합체 (ADC)의 세포독성 또는 세포증식 억제 활성은 종양 관련 항원 또는 수용체 단백질을 갖는 포유류 세포를 세포 배양 배지에서 ADC의 항체에 노출시키고; 이 세포를 약 6시간 내지 약 5일 동안 배양한 다음; 세포 생육성을 측정함으로써 측정한다. 세포에 의거한 시험관내 검정을 사용하여 ADC의 생육성, 즉 증식 (IC50), 세포독성 (EC50), 및 아폽토시스 유도성 (카스파제 활성화)을 측정한다.
항체-약물 접합체의 시험관내 효력을 세포 증식 검정에 의해 측정하였다 (도 1 내지 4). CellTiter-Glo? 발광 세포 생육성 검정은 시판되고 있는 (공급처: Promega Corp., Madison, WI), 콜레오프테라 (Coleoptera) 루시퍼라제의 재조합 발현에 기초한 균질한 검정 방법이다 [참고: US 5583024; US 5674713; US 5700670]. 이러한 세포 증식 검정은 대사적 활성 세포의 지표인, 존재하는 ATP의 정량화에 기초하여 배양 중인 생존 세포수를 결정한다 [참고: Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160: 81-88; US 6602677)]. CellTiter-Glo? 검정을 96 웰 포맷으로 수행하여, 자동화 고-처리능력 스크리닝 (HTS)을 받을 수 있게 하였다 [참고: Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404]. 균질한 검정 과정은 상기 단일 시약 (CellTiter-Glo? 시약)을, 혈청-보충된 배지에서 배양된 세포에 직접 부가하는 것을 포함한다. 세포 세척, 배지 제거 및 다중 피펫팅 단계가 요구되지 않는다. 상기 시스템은 시약을 부가하고 혼합한 후 10분 내에 384-웰 포맷에서 15개 세포/웰 정도로 적은 수를 검출한다.
균질한 "부가-혼합-측정" 포맷으로, 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 신호가 발생하고 세포 용해가 이루어진다. ATP의 양은 배양물에 존재하는 세포수에 정비례한다. CellTiter-Glo? 검정은 사용된 배지와 세포 유형에 따라서, 일반적으로 반감기가 5시간 초과인, 루시퍼라제 반응에 의해 생성된 "글로 (glow)-유형" 발광 신호를 생성시킨다. 생존 세포는 상대 발광 단위 (RLU)로 나타낸다. ATP를 AMP로 전환시키고 광자를 발생시키는 것과 동시에, 기질인 딱정벌레 루시페린 (Beetle Luciferin)을 재조합 개똥벌레 루시퍼라제에 의해 산화적으로 탈카복시화시킨다. 연장된 반감기는 시약 주사기 사용 필요성을 없애 주고, 다중 판을 연속식 또는 배치식 처리하는데 있어 융통성을 제공해준다. 이러한 세포 증식 검정은 각종 다중웰 포맷, 예를 들어 96 또는 384 웰 포맷으로 사용할 수 있다. 발광계 또는 CCD 카메라 영상화 장치를 이용하여 데이터를 기록할 수 있다. 발광 산출량은 시간 경과에 따라 측정한 상대 광 단위 (RLU)로서 제시된다:
Figure 112006088990037-pct00025
3개의 항체-약물 접합체의 항증식 효과를 4가지 상이한 유방 종양 세포주에 대항한 상기 세포 증식, 시험관내 세포 사멸 검정에 의해 측정하였다 (도 1 내지 4). 도 1은 SK-BR-3 (HER2 3+) 유방 종양 세포 상에서 3일간 처리한 후, 증가 농도의 트라스투주마브-SPP-DM1, 트라스투주마브-SPDP-DM1 및 트라스투주마브-SMCC-DMl에서의 효력 측정치를 도시한 것이다. 도 2는 BT-474 (HER2 3+) 유방 종양 세포 상에서 3일간 처리한 후, 증가 농도의 트라스투주마브-SPP-DM1, 트라스투주마브-SPDP-DM1 및 트라스투주마브-SMCC-DMl에서의 효력 측정치를 도시한 것이다. 도 3은 MCF7 (HER2 저) 유방 종양 세포 상에서 3일간 처리한 후, 증가 농도의 트라스투주마브-SPP-DM1, 트라스투주마브-SPDP-DM1 및 트라스투주마브-SMCC-DMl에서의 효력 측정치를 도시한 것이다. 도 4는 MDA-MB-468 (HER2 음성) 유방 종양 세포 상에서 3일간 처리한 후, 증가 농도의 트라스투주마브-SPP-DM1, 트라스투주마브-SPDP-DM1 및 트라스투주마브-SMCC-DMl에서의 효력 측정치를 도시한 것이다.
HER2 수용체 단백질을 과발현하는 것으로 공지되어 있는 SK-BR-3 및 BT-474에 대한 IC50 값을 확립하였다. 트라스투주마브당 2.8 DM1 (약물/Ab)을 수반한 많은 접합체 트라스투주마브-SPP-DM1의 평균 IC50은 SK-BR-3 세포에 대항한 6가지 실험의 경우에는 14.4 ㎍/ml로서 9.1 내지 22.3 ㎍/ml의 범위이고, BT-474 세포에 대항한 4가지 실험의 경우에는 51.7 ㎍/ml로서 28.7 내지 63.1 ㎍/ml의 범위이다. 트라스투주마브당 2.7 DM1 (약물/Ab)을 수반한 많은 접합체 트라스투주마브-SMCC-DM1의 평균 IC50은 SK-BR-3 세포에 대항한 4가지 실험의 경우에는 15.2 ㎍/ml로서 12.6 내지 18.8 ㎍/ml의 범위이고, BT-474 세포에 대항한 2가지 실험의 경우에는 94.9 ㎍/ml로서 75.2 내지 114.6 ㎍/ml의 범위이다. 상기 접합체는 HER2를 과발현하지 않는 세포 MCF7 및 MDA-MB-468에 대항해서는 불활성이었다.
항CD19-SMCC-DM1은 라지 (Raji) 세포를 이용한 경우에 강력한 시험관내 세포 사멸을 나타내었는데 (IC50 = <0.25 ㎍/ml), 있는 그대로의 항체 (노출된) 및 대조군 ADC, 트라스투주마브-SMCC-DM1는 전혀 효과를 나타내지 않았다. 항CD79a-SMCC-DMl 및 항CD79b-SMCC-DM1은 라모스 (Ramos) 세포를 이용한 경우에 강력한 시험관내 세포 사멸을 나타내었는데 (IC50 = <0.25 ㎍/ml), 있는 그대로의 항체 및 대조군 ADC, 트라스투주마브-SMCC-DM1는 전혀 효과를 나타내지 않았다.
도 17은 항EphB2R 2H9 항체-약물 접합체: 2H9-SPP-DM1 (IC50 80 ng/ml), 및 2H9-SMCC-DM1 (IC50 50 ng/ml)로 처리한 HT1080EphB2 (C8) 세포를 이용한 시험관내 세포 증식 검정 (실시예 5)을 도시한 것이다.
마우스에서 생체내 혈청 제거율 및 안정성
ADC의 혈청 제거율과 안정성은 타고난 본래의 (외인성 이식체로써 공급된 종양을 수반하지 않음) 누드 마우스에서 연구 조사하였다. 도 5는 종양을 수반하지 않은 베이지 누드 마우스에서 트라스투주마브-SMCC-DMl 대 트라스투주마브-SPP-DM1의 혈청 제거율을 도시한 것인데, 이는 접합체 및 총 항체 혈청 농도를 7일에 걸쳐 6회 측정하였다. 총 항체와 ADC의 양에 있어 차이가 나는 것은 링커가 절단되어 항체가 그의 DM1 부분으로부터 격리되었다는 것을 나타낸다. 7일째에 접합된 항체 혈청 농도가 보다 높다는 사실로써 예시되는 바와 같이, SMCC-연결된 ADC는 SPP-연결된 접합체 보다 생체 내에서 더 장시간 동안 본래 상태를 유지하였다.
도 6은 종양을 수반하지 않은 누드 마우스에서 시간 경과에 따른 접합체: 트라스투주마브-SPDP-DM1, 트라스투주마브-SPP-DM1, 트라스투주마브-SPP-DM3, 트라스투주마브-SPP-DM4, 및 트라스투주마브-SMCC-DMl의 안정성을 도시한 것인데, 이는 혈청 농도를 7일에 걸쳐 6회 측정하였다. SMCC 링커를 수반한 ADC는 SPP 또는 SPDP에 의해 연결된 접합체 보다 생체내에서 더 안정적이었지만, 트라스투주마브-SMCC-DMl은 가장 장애된 디설파이드 접합체 트라스투주마브-SPP-DM4와 거의 동일한 안정성을 나타내었다.
도 5 및 6에 도시된 실험은 종양을 수반하지 않은 누드 마우스에서 수행하였다. 그러나, SMCC-연결된 접합체는 종양을 수반한 누드 마우스에서 SPP-연결된 접합체와 비교해서 동일한 안정성 증가를 나타내었다. 도 7에 도시된 바와 같이, 초기 트라스투주마브-SMCC-DM1의 대략 72%가 처리한지 7일 후에도 접합체로서 유지된 반면, 초기 트라스투주마브-SPP-DMl의 대략 10% 만이 처리한지 7일 후에 접합체로서 유지되었는데, 이는 종양을 수반한 누드 마우스에서는 비-효소적으로 절단 가능한 트라스투주마브-SMCC-DM1 접합체의 안정성이 개선되었다는 것을 예시해준다.
랫트에서 생체내 혈청 제거율 및 안정성
도 8 및 9는 랫트에서 디설파이드 링커 ADC (트라스투주마브-SPP-DMl)와 비-디설파이드 링커 ADC (트라스투주마브-SMCC-DMl)의 비교되는 안정성 및 제거율 프로파일을 도시한 것이다. 연구 파라미터에는 다음이 포함된다.
Figure 112006088990037-pct00026
비-디설파이드 링커 ADC인 트라스투주마브-SMCC-DM1 (도 9)이 디설파이드 링커 ADC인 트라스투주마브-SPP-DM1 (도 8) 보다 랫트 혈청에서의 안정성이 더 우수한 것으로 밝혀졌다.
생체내 효능
본 발명의 항체-약물 접합체의 효능은 암 세포의 동종이식편 또는 이종이식편을 설치류에 이식하고 종양을 ADC로 처리함으로써, 생체 내에서 측정할 수 있다. 세포주, 암 세포 상에 존재하는 수용체에 대한 ADC의 항체 결합 특이성, 투여 섭생 및 기타 요인들에 따라서 다양한 결과가 예상되어야 한다. 항-HER2 ADC의 생체내 효능은 고 발현성 HER2 트랜스제닉 외식편 마우스 모델에 의해 측정하였다. HERCEPTIN 요법에 반응하지 않거나, 또는 불충분하게 반응하는 Fo5 mmtv 트랜스제닉 마우스로부터 동종이식편을 증식시켰다. 대상체를 ADC로 처치하고, 3 내지 6주에 걸쳐 모니터링하여 종양 배가 (이중) 시간, log 세포 사멸 및 종양 수축을 측정하였다. 추가의 용량 반응 및 다중-용량 실험을 수행하였다.
HER2의 랫트 상동체인 neu의 돌연변이적 활성화 형태를 발현하는 트랜스제닉 마우스에서는 종양이 용이하게 발생되지만, 유방암에서 과발현되는 HER2는 돌연변이되지 않고 종양 형성은 돌연변이되지 않은 HER2를 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서 훨씬 덜 왕성하다 [참고: Webster et al (1994) Semin. Cancer Biol. 5:69-76].
돌연변이되지 않은 HER2를 이용한 종양 형성을 개선시키기 위해, HER2의 하단 본래의 개시 코돈으로부터 해독 개시 빈도를 감소시킬 수도 있는 상단 ATG 코돈에서의 해독 개시를 방지시키기 위해 이러한 상단 ATG를 결실시킨 HER2 cDNA 플라스미드를 사용하여 트랜스제닉 마우스를 생성하였다 [참고: 예를 들어, Child et al (1999) J. Biol. Chem. 274: 24335-24341]. 부가적으로, 키메라 인트론을 5' 말단에 부가하였는데, 이는 기존 문헌에 보고된 바와 같이 [참고: Neuberger and Williams (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6713; Buchman and Berg (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 4395; Brinster et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836] 발현 수준을 또한 증강시켜야 한다. 키메라 인트론은 프로메가 (Promega) 벡터, pCI-neo 포유류 발현 벡터로부터 유래되었다 (bp 890-1022). cDNA 3'-말단을 인간 성장 호르몬 엑손 4 및 5, 및 폴리아데닐화 서열에 의해 플랭킹하였다. 더우기, FVB 마우스를 사용하였는데, 이는 이러한 균주에게서 종양이 발생되기 쉽기 때문이다. MMTV-LTR로부터의 프로모터를 사용하여 유선에서 조직-특이적 HER2 발현을 보장하였다. 동물에게 AIN 76A 식이를 공급하여, 종양 형성에 대한 감수성을 증가시켰다 [참고: Rao et al (1997) Breast Cancer Res. and Treatment 45:149-158].
도 10 내지 13은 ADC가, MMTV-HER2 트랜스제닉 마우스에서 최초로 발생된 HER2 양성 종양 (Fo5)의 동종이식편에서 강력한 항종양 활성을 지니고 있다는 것을 도시한 것이다. 항체 단독 (예: 트라스투주마브)은 이러한 모델에서 상당한 항종양 활성을 나타내지 못한다 [참고: Erickson et al US 6632979]. 도 10 및 11에 예시된 바와 같이, 종양 성장은 대조군 (비히클) 수준의 성장과 비교해서 ADC로 처리한 경우에 지연되었다. 종양 성장은 트라스투주마브-SMCC-DM1 및 트라스투주마브-SIAB-DMl 접합체로 처리한 경우에 대부분 느려졌다. 도 10, 12 및 13에 도시된 바와 같이, 트라스투주마브-SMCC-DM1 접합체는 누드 마우스에서 종양 배가 시간으로서 측정되었든지 아니면 도시된 배가 시간 측정치에 상응하는 log 세포 사멸로서 측정되었든지 간에, SPP 링커를 수반한 접합체 보다 종양 성장을 더 지연시켰는데, 즉 더 많은 효력을 나타내었다 (도 13).
항-CD22 ADC의 생체내 효능은 마우스 종양 이종이식편 모델을 사용하여 측정하였다. 마우스당 2천만개의 Bjab-luc (루시퍼라제 발현성 Bjab 세포) 이종이식편 종양 세포를 수반한 8마리 SCID 마우스 그룹에게, 항-CD22 항체-약물 접합체 또는 있는 그래로의 항체를 1일 째에 1회 (특별히 언급된 경우 제외) 투여하였다 (실시예 8).
Figure 112006088990037-pct00027
종양 크기가 2배로 되는 시간을 측정하였다 (MTD, 평균 종양 배가 시간). 3개의 있는 그대로의 항-CD22 항체는 비-특이적 결합성 ADC (트라스투주마브-SMCC-DM1)에 비해 본질적으로 어떠한 효능도 나타내지 않았다. 상응하는 접합체 모두는 종양 성장을 상당히 지연시키는 효과를 나타내었다. RFB4-SMCC-DMl을 사용하여 복수회 투여 효과를 확립하였는데, 1회 투여된 마우스에 대한 MTD는 18일인 반면, 1일, 7일 및 14일 째에 3회 투여된 마우스에 대한 MTD는 55일이었다. 3회 투여된 그룹의 8마리 마우스 모두에게서 종양의 완전한 차도가 발생하였다. 항체 12F7, 9A8, 8C9, 8G10, 3F11, 10D2, 6C9, 14D1, 및 11H10을 수반한 기타 항CD22-SMCC-DMl 접합체는 마우스당 2천만개의 Bjab-luc 이종이식편 종양 세포를 수반한 SCID 마우스에게 단일 용량 (400 ㎍ DM1/m2)을 투여한지 7일 후에, 대조군 (트라스투주마브-SMCC-DMl)과 비교하여 초기 종양 용적의 수축이나 종양 성장 지연을 나타내었다. 항CD22 접합체인 RFB4-SMCC-DM1, 5E8-SMCC-DM1, 및 7A2-SMCC-DM1 또한, 마우스당 5백만개의 라모스 RA1 이종이식편 종양 세포를 수반한 SCID 마우스에게 단일 용량 (200 ㎍ DM1/m2)을 투여한지 11일 후에, 대조군 (트라스투주마브-SMCC-DMl)과 비교하여 종양 성장을 지연시키는데 유효하였다.
접합체 RFB4-SMCC-DMl은, Bjab-luc 이종이식편을 수반한 10마리 SCID 마우스 그룹에 대한 3가지 상이한 약물 부하비로 연구하였다 (실시예 8). 낮은 수준 (1.95) 및 중간 수준 (3.7)으로 약물 부하된 접합체 각각은 종양 성장을 상당히 지연시키는 효과를 나타내었는데, MTD는 약 15일이었다. 높은 수준으로 부하된 (6.75) 접합체는 대조군 접합체 GP120-SMCC-DMl, 또는 있는 그대로의 항체 RFB4 보다 상당히 상이한 효과를 나타내지 않았다.
Figure 112006088990037-pct00028
항CD19-SMCC-DM1 및 항CD22-SMCC-DMl 접합체는 라지 세포 마우스 종양 이종이식편 모델에서 생체내 활성을 나타내지 못하였다. 기타 항CD19 및 항CD22 접합체는 기타 암 세포 종양 모델에 대항하여 생체내 활성을 지닐 수 있다.
항-CD79a (알파) 및 항-CD79b (베타) ADC의 생체내 효능은 마우스 종양 이종이식편 모델을 이용하여 측정하였다. 마우스당 2천만개의 Bjab-luc 이종이식편 종양 세포를 수반한 8마리 SCID 마우스 그룹에게 다음 표에 기재되고 실시예 8에 따르는 샘플을 1일 째에 투여하였다.
Figure 112006088990037-pct00029
접합체 SN8 항CD79b-SMCC-DM1, 17A7 항CD79b-SMCC-DM1, 및 8H9 항CD79a-SMCC-DM1은 모두, 7일 후에 초기 종양 용적의 수축을 나타내었다 (평균 160 mm3). 8마리 마우스 그룹에서, 접합체 SN8 항CD79b-SMCC-DM1은 4마리 동물에게 부분 차도 (PR)를 제공하였고, 2마리 동물에게 완전한 차도 (CR)를 제공하였다. 접합체 17A7 항CD79b-SMCC-DMl은 1마리 동물에게 CR을 제공하였다. 접합체 8H9 항CD79a-SMCC-DM1은 2마리 동물에게 PR을 제공하고 1마리 동물에게 CR을 제공하였다. 항체 2F2, 5C3, 7H7, 8D11, 15E4, 및 16C11을 수반한 기타 항CD79b-SMCC-DM1 접합체는 마우스당 2천만개의 Bjab-luc 이종이식편 종양 세포를 수반한 CB17 ICR SCID 마우스에게 단일 용량 (192 ㎍ DM1/m2)을 투여한지 8일 후에, 대조군 (트라스투주마브-SMCC-DMl)과 비교하여 초기 종양 용적의 수축이나 종양 성장 지연을 나타내었다.
항CD79b-SMCC-DM1을 투여한 마우스에 대한 용량 반응 효과를 측정하였다. 마우스당 2천만개의 Bjab-luc 이종이식편 종양 세포를 수반한 8마리 SCID 마우스 그룹에게 다음 표에 기재된 샘플을 1일 째에 투여하였다 (실시예 8). 항CD79b-SMCC-DMl을 0.5, 2.0, 및 3.64 mg Ab/kg 마우스 수준으로 투여하였다.
Figure 112006088990037-pct00030
항TENB2 ADC의 생체내 효능은 마우스 종양 이종이식편 모델을 이용하여 측정하였다. TENB2는 인간 전립선에서만 거의 독점적으로 발현되고 인간 전립선 종양에서 과발현되는 것으로 밝혀진 종양 항원이다 [참고: Glynne-Jones et al (2001) Int J Cancer. Oct 15; 94(2):178-84]. PC3-TVA-919cvl:5는 고수준의 TENB2를 발현하는 인간 전립선 암 세포주이다.
무흉선 누드 마우스에게 5백만개 PC3-TVA-919 고 발현인자 또는 중간 발현인자 세포를 마우스당 0.2 ml 용적으로 피하 주사하였다. 세포를 HBSS에 현탁시켰다. 평균 종양 크기가 100 내지 200 ㎣에 도달하면, 마우스를 무작위로 8개 그룹 (각각 8 내지 10마리 마우스)으로 나누고, 다음 샘플을 1회 정맥내 투여한다 (실시예 8).
Figure 112006088990037-pct00031
뮤린 항-TENB2-DMl 접합체는 음성 대조군 및 비히클 대조군과 비교해서 PC3-TENB2 종양에 대항한 항종양 효능을 나타내었다. 뮤린 10H1 항NaPi3b-SMCC-DM1 접합체는 음성 대조군 및 비히클 대조군과 비교해서 PC3-NaPi3b 종양에 대항한 항종양 효능을 전혀 나타내지 않았다. 항NaPi3b 접합체의 기타 항체 변이체는 PC3-NaPi3b 종양 또는 기타 암 세포주에 대항하여 생체내 활성을 지닐 수 있다.
설치류 독성
항체-약물 접합체 및 ADC-마이너스 대조군 "비히클"을 급성 독성 랫트 모델에서 평가하였다. 암컷 스프라그-돌리 (Sprague-Dawley) 랫트를 ADC로 처치하고, 각종 기관에 대한 효과를 후속 검사 및 분석함으로써 ADC의 독성을 연구 조사하였다. 총괄적인 관찰 결과 (체중), 임상 병리학 파라미터 (혈청 화학 및 혈액학) 및 조직병리학에 기초하여, ADC의 독성을 관찰, 성상 확인 및 측정할 수 있다. 등가 용량 수준에서, 트라스투주마브-SMCC-DM1이 트라스투주마브-SPP-DM1 보다 덜 급성인 독성과 연관이 있었다는 사실이 밝혀졌다.
트라스투주마브-SMCC-DMl (2회 용량: 1860 및 3260 ㎍ DM1/㎡), 비교용 디설파이드 ADC, 트라스투주마브-SPP-DM1 (2회 용량: 1860 및 3260 ㎍ DM1/㎡), 자유 DM1 마이탄시노이드 (티올) 및 대조군 비히클 (0일째)을 단일 주사함으로써, 한창 왕성한 암컷 랫트 (100 내지 125 gm)에게서 5일 급성 독성 연구를 수행하였다. 체중을 매일 측정하였다. 임상 화학, 혈청 효소 및 혈액학적 연구를 3일 및 5일 째에 수행하였고; 조직병리적 평가를 이용하여 완전히 부검함으로써 종결하였다. 독성 신호에는 임상적 체중 손실 관찰 결과가 포함되었다.
ADC를 투여한 후의 동물에게서, 비히클 만을 투여한 동물과 비교한 체중 손실 또는 체중 변화는 전신 또는 국소 독성의 거시적이면서 일반적인 지표이다. 도 14는 5일간에 걸친 체중 (그램) 변화를 도시한 것이다. 디설파이드 ADC인 트라스투주마브-SPP-DM1이 투여된 랫트는 현저한 용량-의존성 독성을 나타내었는데, 이는 보다 고 용량에서는 치사율을 지시하고 보다 저 용량에서는 체중 감소를 지시한다. 이와는 달리, 트라스투주마브-SMCC-DM1이 투여된 랫트는 위약 비히클이 투여된 랫트와 비교해서 체중 증가를 나타냈는데, 보다 저 용량이 투여된 랫트는 체중 증가율 상의 감소를 전혀 나타내지 않았다. 보다 고 수준의 트라스투주마브-SMCC-DM1이 투여된 랫트 역시, 자유 DM1 세포독소에 필적하는 체중 증가를 나타내었다.
간독성은 간 효소 상승, 핵분열 및 아폽토시스성 형상 및 간세포 괴사 수 증가로써 측정하였다. 혈액림프계 독성은 백혈구, 주로 과립구 (호중구) 및/또는 혈소판의 고갈, 및 림프계 기관 병발, 즉 위축 또는 아폽토시스 활성으로써 관찰하였다. 독성은 또한, 위장관 병변, 예를 들어 핵분열 및 아폽토시스 형상 수의 증가 및 변성 소장결장염으로써 인지되었다.
연구되어 온 간 손상을 시사하는 효소에는 다음이 포함된다:
AST (아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제)
-국재: 세포질; 간, 심장, 골격근, 신장
-간: 혈장 비 7000:1
-Tl/2: 17 시간
ALT (알라닌 아미노트랜스퍼라제)
-국재: 세포질; 간, 신장, 심장, 골격근
-간: 혈장 비 3000:1
-Tl/2: 42 시간; 일내 변동 (하루 변이)
GGT (g-글루타밀 트랜스퍼라제)
-국재: 고 분비성 또는 흡수 능력을 지닌 세포의 혈장 막; 간, 신장, 장
- 간 손상의 불량한 예측인자: 담관 장애시 흔히 상승됨.
상기 측정된 3가지 효소 중의 어느 것도 간-특이적이지 않다. 본 발명의 ADC는 간 효소 ALT 및 AST의 일시적인 약간의 상승을 유발시켜 일시적인 망상적혈구 감소증을 가져다 주었다 (도 15). 말초혈 과립구 또는 혈소판에 대해서는 어떠한 상당한 효과도 관찰되지 않았다 (도 16).
도 15 및 16은 22.3 mg/kg 트라스투주마브-SPP-DM1에 노출된 랫트 (그룹 2)가, 5일 급성 독성 연구에서 가장 중증의 임상 독성을 나타내었다는 것을 도시하고 있다. 이들 동물은 가장 현저한 체중 손실, 간 기능 시험치 상승, 백혈구감소증 및 저혈소판증, 및 혈액림프계 조직에 대항한 독성의 형태학적 증거를 나타내었다. 독성 정도는 25 mg/kg의 용량을 사용한 앞서의 연구에서 발생된 것과 유사하였다. 이와는 달리, 트라스투주마브-SMCC-DMl를 각각 10 및 25 mg/kg씩 투여한 그룹 3 및 4의 동물은 임상 병리학과 체중 데이터를 기초로 하여, 비히클-처리된 동물과 구별 가능하지 않았다. 형태상으로, 이들 동물은 간 내에서의 핵분열 형상 수의 약간의 증가를 나타내었지만, 말초 림프계 및 조혈 조직은 정상 한계치 내였다.
50 mg/kg 트라스투주마브-SMCC-DM1이 투여된 그룹 5 동물은 명백한 독성을 나타내었다. 그러나, 1개의 간 기능 시험 (ALT)을 제외하고는, 독성 중증도가 트라스투주마브-SPP-DMl와 동일한 약물 용량의 50%가 투여된 동물 (그룹 2)보다 낮았다. 대략 동일한 용량에서는, 트라스투주마브-SMCC-DM1 (그룹 4, 22.3 mg/kg)이 트라스투주마브-SPP-DM1 (그룹 2, 25 mg/kg)의 AST 수준의 약 25%를 나타내었다. 본 연구 5일째에는, 그룹 5 동물이 체중 증가 (3일 및 4일 동안의 일시적 감소를 수반함), 혈청 빌리루빈 (bilirubin) 감소 및 혈소판 계수치 상승을 나타내었다 (도 15).
자유 마이탄시노이드 DM1에 노출된 동물 (그룹 6)은 트라스투주마브 접합체로 처치된 동물과 동일한 독성 패턴을 나타낸다. 자유 DM1의 용량은 앞서 연구에서 10 mg/kg 트라스투주마브-SPP-DMl 용량으로서 제공된 약물 양에 상응한다. 그룹 6 동물의 독성 중증도는 그룹 2 동물에게서 관찰된 것 보다는 낮았지만, 앞서 10 mg/kg 트라스투주마브-SPP-DMl로 처리된 동물에게서 관찰된 것 보다는 높았다. 회복은 오히려 신속한 것으로 나타났다: 비장 절편은 자유 마이탄시노이드로 처리된 동물에게서 미성숙 조혈 요소 수 증가를 나타내었고; 또한, LFTs 및 임상 혈액학 파라미터는 5일째에 그룹 6 동물에게서 정상화될려는 경향이 강하다는 것을 보여주었다.
시노몰구스 (cynomolgus) 원숭이 독성/안전성
시노몰구스 원숭이에게 투여된 ADC의 독성 및 안정성을 평가할 수 있다. 항체-약물 접합체인 트라스투주마브-SMCC-DM1의 독성/안전성 연구를 시노몰구스 원숭이에서 수행하였다.
대조군 (비히클)과 비교해서 단계적 상승 용량으로 정맥내 주사 투여된 트라스투주마브-SMCC-DM1의 독성을 평가하기 위해 3가지 그룹의 원숭이를 연구하였다. 그룹 1 (4마리 대상체)에는 1일 및 22일 째에 비히클 (PBS, pH 6.5, 즉 ADC가 없는 제제) 만을 투여한 다음, 36일 째에 부검하였다. 그룹 2 (4마리 대상체)에게는 1일 및 22일 째에 트라스투주마브-SMCC-DM1 4900 ㎍/㎡을 투여하였다. 그룹 3 (4마리 대상체)에게는 22일 째에 트라스투주마브-SMCC-DM1 7200 ㎍/㎡을 투여하였다.
간 독성은 설치류 독성 연구로부터의 상승된 간 효소를 측정함으로써 추정하였다. 시노몰구스 원숭이에게 비히클 (그룹 1) 및 트라스투주마브-SMCC-DM1 (그룹 2: 4900 ㎍/㎡; 그룹 3: 7200 ㎍/㎡)을 투여하였다. 간 효소 AST, 혈소판 계수치, 백혈구, 절대 호중구, 적혈구, 망상적혈구, 및 2회 정맥내 용량 섭생 비교를 시노몰구스 원숭이에게서 트라스투주마브-SMCC-DM1에 대해 측정하였다 (실시예 10).
항체-약물 접합체 제약 제제의 투여
치료적 항체-약물 접합체 (ADC)는 치료하고자 하는 질환에 적당한 어떠한 경로로든 투여할 수 있다. ADC는 전형적으로, 비경구, 즉 주입, 피하, 근육내, 정맥내, 피내, 수막강내, 거환, 종양내 주사 또는 경막 투여할 것이다 [참고: Shire et al (2004) J. Pharm. Sciences 93 (6):1390-1402]. 치료적 항체-약물 접합체 (ADC)의 제약 제제는 전형적으로, 제약상 허용 가능한 비경구 비히클을 수반한 비경구 투여용의 단위 투여 주사용 형태로 제조한다. 목적하는 순도를 갖는 항체-약물 접합체 (ADC)는 임의로, 제약상 허용 가능한 희석제, 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여, 동결건조된 제제 또는 수성 용제 형태로 제공된다 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed.].
허용 가능한 비경구 비히클, 희석제, 담체, 부형제 및 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 이에는 완충제, 예를 들어 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀; 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물 (예: Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다. 예를 들어, 동결건조된 항-ErbB2 항체 제제가 WO 97/04801 (본원에 참고로 삽입된다)에 기재되어 있다. 트라스투주마브-SMCC-DMl과 같은 ADC의 예시 제제는 약 100 mg/ml의 트레할로스 (2-(히드록시메틸)-6-[3,4,5-트리히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시-테트라히드로피란-3,4,5-트리올; C12H22011; CAS 번호 99-20-7) 및 약 0.1% TWEEN™ 20 (폴리솔베이트 20; 도데카노산 2-[2-[3,4-비스(2-히드록시에톡시)테트라히드로푸란-2-일]-2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에틸 에스테르; C26H50O10; CAS 번호 9005-64-5) (대략 pH 6)을 함유한다.
치료적 항체-약물 접합체 (ADC)의 제약 제제는 ADC의 제조 공정에서 과량의 시약, 불순물 및 부산물의 불완전한 정제 및 분리; 및/또는 벌크 ADC 또는 제제화된 ADC 조성물의 저장시 시간/온도 가수분해 또는 분해에 따른 결과로서의, 특정 양의 반응되지 않은 약물 부분 (D), 항체-링커 중간체 (Ab-L), 및/또는 약물-링커 중간체 (D-L)를 함유할 수 있다. 예를 들어, ADC인 트라스투주마브-SMCC-DM1의 제제는 검출 가능한 양의 자유 약물 DM1을 함유할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 이는 검출 가능한 양의 약물-링커 중간체 DM1-SMCC을 함유할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 이는 검출 가능한 양의 항체 트라스투주마브를 함유할 수 있다. 트라스투주마브-SMCC-DMl의 예시 양태는 10% 이하 몰 당량의 DM1-SMCC를 함유할 수 있다. 예상치 못하게도, DM1-SMCC (IC50 0.05 μM)이, SK-BR-3 및 BT-474 유방암 세포에 대항하여 자유 약물 DM1 (IC50 0.0045 μM) 보다 세포 사멸에 있어 약 20배 정도 덜 강력하다는 사실이 시험관내 세포성 증식 검정 (실시예 5)에 의해 결정되었다.
활성 제약 성분을 또한, 예를 들어 액적형성 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐 [예를 들면, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐]; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 ADC를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들면, 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리락티드 [참고: US 3773919], L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테애트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면, LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.
생체내 투여에 사용하고자 하는 제제는 멸균성이어야만 하는데, 이는 멸균성 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성된다.
제제에는 전술된 투여 경로에 적합한 것들이 포함된다. 제제는 편리하게는 단위 투여 형태로 제시될 수 있고, 조제학 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 제제화 기술 및 제제는 일반적으로, 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA)]에 보고되었다. 이러한 방법은 활성 성분을, 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 함께 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분을 액상 담체 또는 미세하게 나눠진 고형 담체, 또는 이들 둘 다와 균일하고도 친밀하게 연합시킨 다음, 필요한 경우 생성물을 성형시킴으로써 제조한다.
수성 현탁제는 활성 물질 (ADC)을, 수성 현탁제 제조에 적합한 부형제와 혼합하여 함유한다. 이러한 부형제에는 현탁제, 예를 들어 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 크로스카멜로스, 포비돈, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 나트륨 알지네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸드 검 및 아카시아 검, 및 분산 또는 습윤제, 예를 들어 천연 발생적 포스파티드 (예: 레시틴), 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 생성물 (예: 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물 (예: 헵타데카에틸렌옥시세타놀), 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르와의 축합 생성물 (예: 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레에이트)가 포함된다. 수성 현탁제는 하나 이상의 방부제, 예를 들어 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시 벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제 및 하나 이상의 감미제, 예를 들어 슈크로스 또는 삭카린을 함유할 수도 있다.
ADC의 제약 조성물은 멸균성 주사제, 예를 들어 멸균성 주사용 수성 또는 유지성 현탁제 형태일 수 있다. 이러한 현탁제는 상기 언급된 바와 같은 적합한 현탁제 또는 습윤제, 및 현탁제를 사용하여 당해 분야에 공지된 기술에 따라서 제제화할 수 있다. 멸균성 주사제는 또한, 비-독성의 비경구적으로 허용 가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균성 주사용 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄-디올 중의 용액일 수 있거나 또는 동결건조된 분말로서 제조될 수도 있다. 이용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매는 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 멸균성 고정유가 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 이용될 수 있다. 이를 위해, 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함한 모든 블랜드 고정유를 이용할 수 있다. 또한, 올레산 등의 지방산을 주사제의 제조에 사용할 수도 있다.
단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 숙주 및 특정한 투여 방식에 따라서 다양할 것이다. 예를 들어, 정맥내 주입용 수성 용제는 약 30 mL/hr의 속도로 적합한 용적이 주입될 수 있도록 하기 위해 용제 1밀리리터당 약 3 내지 500 ㎍의 활성 성분을 함유할 수 있다. 피하 (거환) 투여는 약 1.5 ml 이하의 총 용적과 약 100 mg ADC/ml의 농도를 이용하여 수행할 수 있다. ADC를 자주 장기적으로 투여해야 하는 경우에는, 예를 들어 예비-충진된 주사기 또는 자동주사기 기술에 의해 피하 경로를 이용할 수 있다.
일반적 제안으로서, 1회분당 투여되는 ADC의 초기 제약상 유효량은 1일 약 0.01 내지 100 mg/환자 체중 kg, 즉 약 0.1 내지 20 mg/kg의 범위이고, 사용된 화합물의 전형적인 초기 범위는 1일 0.3 내지 15 mg/kg이다. 예를 들어, 인간 환자에게는 초기에 환자 체중 kg당 약 1.5 mg ADC을 투여할 수 있다. 이 용량은 최대 관용 용량 (MTD)으로 단계적으로 상승시킬 수 있다. 투여 스케쥴은 약 3주마다 수행할 수 있지만, 진단된 질환 또는 반응에 따라서 더 자주 투여하거나 투여 횟수를 줄일 수 있다. 용량은 치료 과정 동안 MTD 수준으로 또는 그 이하로 추가로 조정할 수 있는데, 이는 복수회 주기, 예를 들어 약 4회 이상 안전하게 투여할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제제에는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제제를 의도한 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균성 주사 용제; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균성 현탁제가 포함된다.
단백질 치료제를 경구 투여하는 것이 일반적으로, 소화관에서의 제한된 흡수, 가수분해 또는 변성로 인한 생체내 이용효율 불량으로 인해 선호되지 않긴 하지만, 경구 투여용으로 적합한 ADC 제제는 별개의 단위, 예를 들어 예정량의 ADC를 각각 함유하는 캅셀제, 교갑 또는 정제로서 제조할 수 있다.
제제는 단위-용량 또는 복수회-용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰풀 및 바이알에 패키징할 수 있고, 사용 직전에 투여하기 위한 멸균성 액상 담체 (예: 물)의 부가 만을 요구하는 동결-건조 (동결건조) 조건 하에 저장할 수 있다. 즉석 주사 용제 및 현탁제는 앞서 언급된 종류의 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조한다. 예시되는 단위 투여 제제는 활성 성분의 1일 용량 또는 단위 1일 아용량, 또는 그의 적당한 분획을 함유한다.
본 발명은 추가로, 상기 규정된 바와 같은 하나 이상의 활성 성분을 이에 적합한 수의용 (veterinary) 담체와 함께 포함하는 수의용 조성물을 제공한다. 수의용 담체는 해당 조성물을 투여하는데 유용한 물질이고, 이는 수의학 분야에서 불활성이거나 허용 가능하고 활성 성분과 화합성인 고형, 액상 또는 기상 물질일 수 있다. 이들 수의용 조성물은 비경구, 경구, 또는 기타 모든 바람직한 경로로 투여될 수 있다.
항체-약물 접합체 치료
본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)를 사용하여 각종 질병 또는 장애, 예를 들어 암 및 자가면역 질환을 치료할 수 있는 것으로 고려된다. 예시되는 질환 또는 장애에는 양성 또는 악성 종양; 백혈병 및 림프계 악성 질환; 기타 장애, 예를 들어 신경세포, 신경교, 성상세포, 시상하부, 선상, 대식세포, 상피, 간질성, 포배강, 염증, 혈관형성성 및 면역학적 장애가 포함된다. ADC 치료에 대해 감수성인 암에는 특정 종양 관련 항원 또는 세포 표면 수용체, 예를 들어 HER2의 과발현을 특징으로 하는 암이 포함된다.
동물 모델 및 세포에 의거한 검정에서 확인된 ADC 화합물을, 종양-보유 고등 영장류 및 인간 임상 시험에서 추가로 시험할 수 있다. 인간 임상 시험은 문헌 [참고: Baselga et al. (1996) J. Clin. Oncol. 14: 737-744]에 보고된 바와 같이 광범위한 선행 항암 요법이 투여된 HER2 과발현성 전이성 유방암 환자에게서 항-HER2 모노클로날 항체 HERCEPTIN의 효능을 시험하는 임상 시험과 유사하게 고안할 수 있다. 이러한 임상 시험은 공지된 치료 섭생, 예를 들어 방사선 및/또는 화학요법 (공지된 화학요법제 및/또는 세포독성제와 관련됨)과 병용한 ADC의 효능을 평가하도록 고안할 수 있다 [참고: Pegram et al (1999) Oncogene 18:2241-2251].
일반적으로, 치료하고자 하는 질병 또는 장애는 암이다. 본원에서 치료하고자 하는 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프계 악성 질환이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암 (예: 상피 편평 세포 암), 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 페의 선암종 및 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위암, 예를 들어 위장암, 위장 간질성 종양 (GIST), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 뿐만 아니라 두경부암이 포함된다.
본원에서 치료하고자 하는 암은 ErbB 수용체, 예를 들어 HER2의 과도한 활성화를 특징으로 하는 것일 수 있다. 이러한 과도한 활성화는 ErbB 수용체 또는 ErbB 리간드의 과발현 또는 생성 증가에 기인될 수 있다. 한 양태에서는, 환자의 암이 ErbB 수용체의 과도한 활성화를 특징으로 하는지를 결정하기 위한 진단 또는 예후 검정을 수행할 것이다. 예를 들어, 암에서 ErbB 유전자 증폭 및/또는 ErbB 수용체의 과발현을 결정할 수 있다. 이러한 증폭/과발현을 결정하기 위한 각종 검정이 당해 분야에서 이용 가능하고, 이에는 상기 언급된 IHC, FISH 및 유출된 항원 검정이 포함된다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 종양 내에 있거나 종양과 연합된 ErbB 리간드, 예를 들어 TGF-알파의 수준은 공지된 과정에 따라서 결정할 수 있다. 이러한 검정은 시험하고자 하는 샘플 중의 단백질 및/또는 이를 코딩하는 핵산을 검출할 수 있다. 한 양태에서는, 종양 내의 ErbB 리간드 수준을, 면역조직화학 (IHC)을 이용하여 결정할 수 있다 [참고: 예를 들어, Scher et al. (1995) Clin. Cancer Research 1: 545-550]. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 예를 들어 FISH, 서던 블롯팅, 또는 PCR 기술을 통하여, 시험하고자 하는 샘플 중의 ErbB 리간드-코딩 핵산 수준을 평가할 수 있다. 한 양태에서는, 예를 들어 HERCEPTEST (공급처: Dako)를 사용하여 IHC에 의해 ErbB2 과발현을 분석할 수 있다. 종양 생검으로부터의 파라핀 봉매된 조직 박편을 대상으로 하여 IHC 검정을 수행할 수 있는데, 이는 다음과 같은 ErbB2 단백질 염색 세기 기준에 따른다: 스코어 0, 염색이 전혀 관찰되지 않거나 또는 막 염색이 종양 세포의 10% 미만에서 관찰된다; 스코어 1+, 희미하게 인지 가능한 수준의 막 염색이 종양 세포의 10% 초과에서 검출되고, 세포는 그들 막의 일부에서만 염색된다; 스코어 2+, 약하거나 중간 수준의 완전한 막 염색이 종양 세포의 10% 초과에서 관찰된다; 스코어 3+, 중간 내지 강력한 완전한 막 염색이 종양 세포의 10% 초과에서 관찰된다. ErbB2 과발현 평가에 대한 0 또는 1+ 스코어를 나타내는 종양은 ErbB2를 과발현하지 않는 것으로서 특징지워질 수 있는 반면, 2+ 또는 3+ 스코어를 나타내는 종양은 ErbB2를 과발현하는 것으로서 특징지워질 수 있다.
또 다른 한편, 또는 부가적으로, FISH 검정, 예를 들어 INFORM™ (공급처: Ventana Co., Ariz.) 또는 PATHVISION™ (공급처: Vysis, Ill.)은 포르말린-고정되고 파라핀-봉매된 종양 조직 상에서 수행하여 이러한 종양 내에서의 ErbB2 과발현 정도 (존재하는 경우)를 결정할 수 있다.
더우기, ErbB 수용체 또는 ErbB 리간드 과발현 또는 증폭은 생체내 진단 검정을 사용하여, 예를 들어 검출하고자 하는 분자와 결합하고 검출 가능한 표지 (예: 방사성 동위원소)로 태그화시킨 분자 (예: 항체)를 투여하고, 이러한 표지의 국재화를 알아보기 위해 환자를 외부적으로 스캐닝함으로써 평가할 수 있다.
질병을 예방 또는 치료하는데 적당한 ADC 투여량은 상기 규정된 바와 같은 치료하고자 하는 질병 유형, 분자가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되든지 간에 질병의 중중도 및 과정, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 의해 좌우될 것이다. 분자는 환자에게 1회 투여하거나 치료 전 기간에 걸쳐 투여하는 것이 적합하다. 질병의 유형과 중증도에 따라서, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여에 의해서든 아니면 연속식 주입에 의해서든지 간에, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예: 0.1 내지 20 mg/kg)의 분자가 환자에게 투여하기 위한 초기 투여량 후보이다. 전형적인 1일 투여량 범위는 상기 언급된 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상일 수 있다. 환자에게 투여될 ADC의 예시 투여량은 약 0.1 내지 약 10 mg/환자 체중 kg의 범위이다.
상태에 따라서 수일에 걸쳐 반복 투여하는 경우의 치료는 질병 증상이 목적하는 수준으로 억제될 때까지 지속한다. 예시되는 투여 섭생은 항-ErbB2 항체 약 4 mg/kg의 초기 부하 용량을 투여한 다음, 매주 약 2 mg/kg의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 기타 투여량 섭생도 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링한다.
병용 요법
항체-약물 접합체 (ADC)는 병용 요법으로서의 투여 섭생 또는 제약 병용 제제에서, 항암 특성을 지닌 제2 화합물과 병용할 수 있다. 제약 병용 제제 또는 투여 섭생의 제2 화합물은 해당 병용물의 ADC에 대한 상보적 활성을 지녀, 이들이 서로 불리한 영향을 미치지 않도록 하는 것이 바람직하다.
제2 화합물은 화학요법제, 세포독성제, 사이토킨, 성장 억제제, 항호르몬제, 아로마타제 억제제, 단백질 키나제 억제제, 지질 키나제 억제제, 항안드로겐, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 유전자 요법 백신, 항혈관신생제 및/또는 심장보호제일 수 있다. 이러한 분자는 의도하는 목적에 대해 유효한 양으로 함께 존재하는 것이 적합하다. ADC를 함유하는 제약 조성물은 또한, 치료적 유효량의 화학요법제, 예를 들어 투불린-형성 억제제, 토포이소머라제 억제제 또는 DNA 결합제일 수 있다.
또 다른 한편, 또는 부가적으로, 제2 화합물은 ErbB2와 결합하고 ErbB2 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 항체일 수 있다. 제2 항체는 모노클로날 항체 2C4 또는 인간화 2C4 "옴니타르그 (Omnitarg)"일 수 있다 [참고: WO01/00245]. 제2 항체를 세포독성제 또는 화학요법제, 예를 들어 마이탄시노이드, 아우리스타틴, 칼리케아미신 또는 1,8-비스-나프탈리미드 부분과 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 하나의 제제 또는 투여 섭생에 EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, 또는 혈관 내피 인자 (VEGF)와 결합하는 항체를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
기타 치료적 섭생을 본 발명에 따라서 확인된 항암제의 투여와 병용할 수 있다. 이러한 병용 요법은 동시 또는 순차적 섭생으로서 투여할 수 있다. 순차적으로 투여되는 경우에는, 병용물을 2회 이상 투여물로 투여할 수 있다. 병용 투여에는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하여 동시-투여하는 것과, 어느 한 순서로 순차적으로 투여하는 것 [2개 (또는 모든) 활성제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 데에는 일정 시간이 소요된다]이 포함된다.
한 양태에서는, 본 발명의 ADC를 이용한 치료가 본원에서 확인된 항암제와, 하나 이상의 화학요법제 또는 성장 억제제의 병용 투여 (이에는 상이한 화학요법제의 칵테일을 동시-투여하는 것이 포함된다)를, 임의로 항-ErbB2 항체 (예: 트라스투주마브)를 이용한 치료와 함께 수행하는 것을 포함한다. 화학요법제에는 에를로티니브 HCl (CP-358774, TARCEVA™; Genentech/OSI), 탁산 (예: 파클리탁셀 및 도세탁셀) 및/또는 안트라사이클린 항생제가 포함된다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케쥴은 제조업자의 지시에 따라서 또는 전문의에 의해 실험적으로 결정된 바와 같이 사용할 수 있다. 상기 화학요법에 대한 제조 및 투여 스케쥴은 또한 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Chemotherapy Service, Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)].
항암제를 항-호르몬 화합물, 예를 들어 항-에스트로겐 화합물, 예를 들면, 타목시펜; 항-프로게스테론, 예를 들면, 오나프리스톤 (onapristone) [참고: EP 616 812]; 또는 항-안드로겐, 예를 들면, 플루타미드와 이러한 분자에 대해 공지된 투여량으로 병용할 수 있다. 치료하고자 하는 암이 호르몬-비의존성 암인 경우에는, 환자에게 이미 항-호르몬 요법을 적용했었을 수 있고, 암이 호르몬 비의존성이 된 후에, 항-ErbB2 항체 (및 본원에 기재된 바와 같은 임의의 기타 작용제)를 환자에게 투여할 수 있다. 또한, 심장 보호제 (상기 요법과 연관된 심근 기능이상을 예방하거나 저하시키기 위함) 또는 하나 이상의 사이토킨을 환자에게 동시 투여하는 것이 유익할 수 있다. 상기 치료적 섭생 이외에도, 환자에게 암 세포의 외과적 제거 및/또는 방사선 요법을 적용할 수 있다.
상기 동시 투여되는 작용제에 대한 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 양이며, 이는 새로이 확인된 작용제와 기타 화학요법제 또는 치료의 병용 작용 (상승 작용)으로 인해 낮아질 수 있다.
병용 요법은 "상승 작용"을 제공해줄 수 있고, "상승적"인 것으로 입증되었는데, 즉 활성 성분들을 함께 사용한 경우에 달성된 효과는 화합물을 개별적으로 사용하여 얻은 효과들의 합 보다 크다. 상승적 효과는 활성 성분들을 (1) 병용된 단위 투여 제제으로 동시-제제화하고 투여하거나 동시에 전달하거나; (2) 별개의 제제으로서 교대로 또는 나란히 전달하거나; 또는 (3) 몇몇 기타 섭생에 의할 경우에 획득할 수 있다. 교대 (대체) 요법으로 전달한 경우에는, 화합물을, 예를 들어 별개의 주사기로 상이한 주사제에 의해 순차적으로 투여 또는 전달할 경우에는 획득될 수 있다. 일반적으로, 교대 요법에서는 각 활성 성분의 유효 투여량을 순차적으로, 즉 일련으로 투여하는 반면, 병용 요법에서는 2가지 이상 활성 성분의 유효 투여량을 함께 투여한다.
항체-약물 접합체의 대사물
본원에 기재된 ADC 화합물의 생체내 대사 생성물이 선행 기술에 비해 신규하고 독특한 한도 내에서, 이러한 생체내 대사 생성물이 본 발명의 범위 내에 또한 속한다. 이러한 생성물은, 예를 들어 투여된 화합물의 산화, 환원, 가수분해, 아미드화, 에스테르화, 효소적 절단 등으로부터 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물을 그의 대사 생성물을 산출시키기에 충분한 시간 동안 포유류와 접촉시키는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된 신규하고도 독특한 화합물을 포함한다.
대사 생성물은 방사성 표지된 (예: 14C 또는 3H) ADC를 제조하고; 이를 랫트, 마우스, 기니아 피그, 원숭이 등의 동물 또는 인간에게 검출 가능한 용량 (예: 약 0.5 mg/kg 초과 용량)으로 비경구 투여하며; 대사가 일어나기에 충분한 시간 (전형적으로 약 30초 내지 30시간)을 허용한 다음; 그의 전환 생성물을 뇨, 혈액 또는 기타 생물학적 샘플로부터 분리시킴으로써 확인할 수 있다. 이들 생성물은 표지시켰기 때문에 용이하게 분리한다 (다른 것들은 대사물 내에 살아있는 에피토프와 결합할 수 있는 항체를 사용함으로써 분리한다). 대사물 구조는 통상적인 방식, 예를 들어 MS, LC/MS 또는 NMR 분석에 의해 결정한다. 일반적으로, 대사물 분석은 당업자에게 널리 공지된 통상적인 약물 대사 연구와 동일한 방식으로 수행한다. 전환 생성물이 생체 내에서 발견되지 않는 한은, ADC 화합물의 치료적 투여에 대한 진단 검정에 유용하다.
대사물에는 약물 부분을 항체에 연결시키는 모든 결합의 절단이 일어나는 ADC의 생체내 절단 생성물이 포함된다. 따라서, 대사적 절단으로 인해, 있는 그대로의 항체 또는 항체 단편이 생성될 수 있다. 항체 대사물을 링커의 일부 또는 전부에 연결시킬 수 있다. 대사적 절단으로 인해, 약물 부분 또는 그의 일부가 생성될 수도 있다. 약물 부분 대사물을 링커의 일부 또는 전부에 연결시킬 수 있다.
제조품
또 다른 양태에서는, ADC 및 상기 언급된 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조품 또는 "키트"가 제공된다. 본 발명의 제조품은 용기, 및 이러한 용기와 연합되거나 그 위의 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 또는 블리스터 팩 (blister pack)이 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 용기는 상기 질환을 치료하는데 유효한 항체-약물 접합체 (ADC) 조성물을 보유하고 있고 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 한 가지 이상 활성제가 ADC이다. 상기 라벨 또는 패키지 삽입물은 해당 조성물이 선택된 질환, 예를 들어 암을 치료하는데 사용된다는 것을 지시한다. 한 양태에서는, 라벨 또는 패키지 삽입물이 ErbB2와 결합하는 항체를 포함하는 조성물을 사용하여 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), ErbB2, ErbB3 및 ErbB4로 이루어진 군 중에서 선택된 ErbB 수용체를 발현하는 암을 치료할 수 있다는 것을 지시한다. 또한, 라벨 또는 패키지 삽입물은 치료하고자 하는 환자가 EGFR, ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4 중에서 선택된 ErbB 수용체의 과도한 활성화를 특징으로 하는 암을 지닌 환자라는 것을 지시할 수 있다. 예를 들어, 암은 이들 수용체 중의 하나를 과발현하고/하거나 ErbB 리간드 (예: TGF-α)를 과발현하는 것일 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 해당 조성물을 사용하여 암을 치료할 수 있다는 것을 지시할 수 있는데, 이러한 암은 ErbB 수용체의 과발현을 특징으로 나타내지 않는다. 기타 양태에서는, 패키지 삽입물이 ADC 조성물을 사용하여 호르몬-비의존성 암, 전립선암, 결장암, 결장직장암을 치료할 수 있다는 것을 지시할 수 있다.
본 발명의 제조품은 (a) 본원에 함유된 화합물을 수반하는 제1 용기 (이러한 화합물은 본 발명의 ADC를 포함하고, 이러한 ADC의 항체는 ErbB2와 결합하고 ErbB2를 과발현하는 암 세포의 성장을 억제시키는 제1 항체이다)와 (b) 본원에 함유된 화합물을 수반하는 제2 용기 (이러한 화합물은 ErbB2와 결합하고, ErbB2 수용체의 리간드 활성화를 차단시키는 제2 항체, 또는 이러한 제2 항체와 마이탄시노이드와의 접합체를 포함한다)를 포함할 수 있다. 이러한 양태에서의 제조품은 암을 치료하기 위해 상기 제1 조성물과 제2 조성물을 사용할 수 있다는 것을 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 본 발명의 제조품은 제약상 허용 가능한 완충제, 예를 들어 제균성 주사용 수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 재료, 예를 들면, 기타 완충액, 희석제, 충진제, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
실시예 1 - 항-ErbB2 모노클로날 항체 4D5의 생성, 성상 확인 및 인간화
ErbB2의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 뮤린 모노클로날 항체 4D5를 문헌 [참고: Fendly et al (1990) Cancer Research 50: 1550-1558]에 기재된 바와 같이 생성시켰다. 간략하게 언급하면, 문헌 [참고: Hudziak et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 7158-7163]에 기재된 바와 같이 생성시킨 NIH 3T3/HER2-3400 세포 (세포당 대략 1 x 105개 ErbB2 분자를 발현함)을, 25 mM EDTA를 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 수거하고, BALB/c 마우스를 면역시키는데 사용하였다. 이 마우스에게 0, 2, 5 및 7주 째에 0.5 ml PBS 중의 107개 세포를 복강내 주사하였다. 32P-표지시킨 ErbB2를 면역침전시킨 항혈청을 수반한 마우스에게, 9주 및 13주 째에 밀 배 (germ) 응집소-세파로스 (WGA) 정제된 ErbB2 막 추출물을 복강내 주사하였다. 이어서, 0.1 ml의 ErbB2 제제를 정맥내 주사하고, 비장세포를 마우스 골수종 주 X63-Ag8.653과 융합시켰다. 하이브리도마 상등액을 대상으로 하여, ELISA 및 방사성 면역침전에 의해 ErbB2-결합성에 대해 스크리닝하였다.
뮤린 모노클로날 항체 4D5를 US 5821337 (그의 전문이 본원에 참고로 삽입된다)에 기재된 바와 같은 "유전자 전환 돌연변이 유발" 전략을 이용하여 인간화시켰다. 다음 실험에 사용된 인간화 모노클로날 항체 4D5가 huMAb4D5-8로 명명되었다. 이러한 항체는 IgGl 이소형의 항체이다.
실시예 2 - 트라스투주마브의 정제
440 mg HERCEPTIN? (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, US 5821337) 항체를 함유하는 1개 바이알을 50 mL MES 완충액 (25 mM MES, 50 mM NaCl, pH 5.6)에 용해시키고, 동일한 완충액으로 평형시킨 양이온 교환 칼럼 (세파로스 S, 15 cm x 1.7 cm) 상에 부하하였다. 이어서, 이 칼럼을 동일한 완충액으로 세척하였다 (5 칼럼 용적). 완충액의 NaCl 농도를 200 mM까지 상승시킴으로써 트라스투주마브를 용출시켰다. 항체를 함유하는 분획을 모으고, 10 mg/mL가 되도록 희석시킨 다음, 50 mm 인산 칼륨, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6.5를 함유하는 완충액 내로 투석시켰다.
실시예 3 - 항체-약물 접합체: 트라스투주마브-SPP-DM1의 제조:
Figure 112006088990037-pct00032
정제된 트라스투주마브를 N-석신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트로 유도체화시켜 디티오피리딜기를 도입하였다. NaCl (50 mM) 및 EDTA (1 mM)를 함유하는 44.7 mL의 50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 6.5) 중의 트라스투주마브 (376.0 mg, 8 mg/mL)를 SPP (2.3 mL 에탄올 중의 5.3 몰 당량)으로 처리하였다. 주위 온도 아르곤 하에서 90분 동안 항온 배양한 후, 35 mM 나트륨 시트레이트, 154 mM NaCl, 2 mM EDTA로 평형시킨 세파덱스 G25 칼럼을 통하여 반응 혼합물을 겔 여과시켰다. 항체 함유 분획을 모으고 검정하였다. 항체의 변형 정도를 상기 언급된 바와 같이 결정하였다. 변형된 항체 (트라스투주마브-SPP-Py)의 회수율은 337 mg (89.7%)이고, 항체당 (p') 4.5개의 방출 가능한 2-티오피리딘기가 연결되었다.
트라스투주마브-SPP-Py (337.0 mg, 9.5 μmols의 방출 가능한 2-티오피리딘기)를 상기 35 mM 나트륨 시트레이트 완충액 (pH 6.5)으로 희석시켜 최종 농도 2.5 mg/mL가 되도록 하였다. 이어서, 3.0 mM 디메틸아세트아미드 (DMA, 최종 반응 혼합물 중의 3% v/v) 중의 DM1 (N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이틴신) (그의 구조가 도 1에 도시되어 있다) (1.7 당량, 16.1 μmols)을 항체 용액에 가하였다. 반응을 아르곤 하 주위 온도에서 20시간 동안 진행시켰다.
반응물을, 35 mM 나트륨 시트레이트, 154 mM NaCl, pH 6.5로 평형시킨 세파크릴 S300 겔 여과 칼럼 (5.0 cm x 90.0 cm, 1.77 L) 상에 부하하였다. 유속은 5.0 mL/min이고, 65개 분획 (각 20.0 mL)을 수집하였다. 주요 피크는 분획 번호 47 주변에 집중되었다 (도 3). 주요 피크는 단량체성 트라스투주마브-SPP-DM1을 포함한다. 분획 44 내지 51을 모으고 검정하였다. 항체 분자당 연결된 DM1 약물 분자의 수 (p')는, 252 nm 및 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정하였는데, 항체 분자당 3.7개 약물 분자가 연결된 것으로 밝혀졌다.
실시예 4 - 항체-약물 접합체: 트라스투주마브-SMCC-DM1의 제조
Figure 112012033925065-pct00081
정제된 트라스투주마브를 (석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산온-1-카복실레이트, SMCC, 공급처: Pierce Biotechnology, Inc)로 유도체화시켜 SMCC 링커를 도입하였다. 트라스투주마브를 실시예 2에서와 같이 HERCEPTIN?로부터 정제하고, 50 mM 인산칼륨/50 mM 염화나트륨/2 mM EDTA, pH 6.5 중의 20 mg/mL에서 7.5 내지 10 몰 당량의 SMCC [DMSO 또는 DMA (디메틸아세트아미드) 중의 20 mM, 6.7 mg/mL]으로 완충제-교환 처리하였다. 아르곤하 주위 온도에서 2 내지 4시간 동안 교반시킨 후, 50 mM 인산칼륨/50 mM 염화나트륨/2 mM EDTA, pH 6.5으로 평형시킨 세파덱스 G25 칼럼을 통하여 반응 혼합물을 여과시켰다. 또 다른 한편으론, 반응 혼합물을 30 mM 시트레이트 및 150 mM 염화나트륨 (pH 6)으로 겔 여과시켰다. 항체 함유 분획을 모으고 검정하였다. 트라스투주마브-SMCC의 회수율은 88%였다.
상기로부터의 약물-링커 중간체인 트라스투주마브-SMCC를 50 mM 인산칼륨/50 mM 염화나트륨/2 mM EDTA, pH 6.5으로 희석시켜 최종 농도 10 mg/ml가 되도록 하 고, 이를 디메틸아세트아미드 중의 DM1의 10 mM 용액 (1.7 당량은 5 SMCC/트라스투주마브로 추정됨, 7.37 mg/ml)과 반응시켰다. 이 반응물을 아르곤하 주위 온도에서 4 내지 약 16시간 동안 교반시켰다. 접합 반응 혼합물을 1 x PBS (pH 6.5)을 수반한 세파덱스 G25 겔 여과 칼럼 (1.5 x 4.9 cm) 내로 여과시켰다. 또 다른 한편, 반응 혼합물을 10 mM 석시네이트 및 150 mM 염화나트륨 (pH 5)으로 겔 여과시켰다. 252 nm에서의 흡광도 및 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정된 바와 같은 DMl/트라스투주마브 비 (p)는 3.1이었다. 약물 대 항체 비 (p) 또한 질량 분광법으로 측정할 수 있다. 접합은 또한, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 모니터링할 수 있다. 응집은 레이저 광 산란 분석에 의해 평가할 수 있다.
항체-SMCC-DMl 접합체:
이러한 프로토콜에 따라서, SMCC 링커와 DM1 약물 부분을 수반한 기타 항체-약물 접합체를 제조하였는데, 이에는 다음이 포함된다.
Figure 112006088990037-pct00034
Figure 112006088990037-pct00035
Figure 112006088990037-pct00036
항체-BMPEO-DM1 접합체:
시스테인 접합을 위해, 항체를 EDTA의 존재 하에 환원제, 예를 들어 디티오트레이톨 (DTT) 또는 TCEP로 환원시킬 수 있다. 37℃에서 약 1시간 동안 항온 배양한 후, 100 mM 인산칼륨을 사용하여 pH를 약 7로 조정하였다. 이와 같이 환원된 항체를 비스-말레이미드 시약 BM(PEO)4 (공급처: Pierce Chemical)에 의해 변형시키면, 항체 표면 상에 반응되지 않은 말레이미도기가 잔존한다. 이는 BM(PEO)4를 50% 에탄올/물 혼합물에 용해시켜 10 mM 농도로 만들고, 10배 몰 과량을 대략 1.6 mg/ml (10 μM) 농도로 인산염 완충 식염수 중의 항체를 함유하는 용액에 가한 다음, 이를 1시간 동안 반응시켜 Ab-BMPEO를 형성시킴으로써 수행할 수 있다. 과량의 BM(PEO)4를 150 mM NaCl 완충제를 수반한 30 mM 시트레이트 (pH 6) 중에서 겔 여과 (HiTrap 칼럼, 공급처: Pharmacia)함으로써 제거하였다. 대략 10배 몰 과량의 DM1을 디메틸 아세트아미드 (DMA)에 용해시키고, Ab-BMPEO 중간체에 가하였다. 디메틸 포름아미드 (DMF)를 또한 이용하여 약물 부분 시약을 용해시킬 수 있다. 반응 혼합물을 밤새 반응시켜 둔 후, 겔 여과 또는 PBS 내로 투석시켜 반응되지 않은 DM1을 제거하였다. PBS 중의 S200 칼럼 상에서 겔 여과하여 고분자량 응집체를 제거하고, 정제된 Ab-BMPEO-DM1을 공급하였다.
이러한 프로토콜에 따라서, BMPEO 링커와 DM1 약물 부분을 수반한 기타 항체-약물 접합체를 제조하였는데, 이에는 다음이 포함된다:
Figure 112006088990037-pct00037
실시예 5 - 시험관내 세포 증식 검정
다음 프로토콜을 이용하는 세포 증식 검정에 의해 ADC의 효능을 측정하였다 [참고: Promega Corp. Technical Bulletin TB288; 참고: Mendoza et al (2002) Cancer Res. 62:5485-5488]:
1. 배지 중에 약 104개 세포 (SKBR-3, BT474, MCF7 또는 MDA-MB-468)을 함유하는 100 ㎕ 분취량의 세포 배양물을 96-웰, 불투명 벽의 판의 각 웰에 침착시켰다.
2. 배지를 함유하고 세포를 수반하지 않는 대조군 웰을 제조하였다.
3. ADC를 실험용 웰에 가하고, 3 내지 5일 동안 항온 배양하였다.
4. 상기 판을 대략 30분 동안 실온으로 평형시켰다.
5. 각 웰에 존재하는 세포 배양 배지 용적에 등가인 용적의 CellTiter-Glo 시약을 가하였다.
6. 내용물을 궤도 진탕기 상에서 2분 동안 혼합하였다.
7. 판을 실온에서 10분 동안 항온 배양하여 발광 신호를 안정화시켰다.
8. 발광을 기록하고 RLU = 상대 발광 단위로서 그래프에 보고하였다.
실시예 6 - 마우스에서의 혈청 제거율 및 안정성
4마리 동물로 이루어진 6가지 그룹의 베이지 돌연변이, 누드, 타고난 본래의 (종양을 수반하지 않음) 마우스를 연구하였다. 0일 째에, 각 마우스에게 200 ㎕ 수성 담체 중의 단일 2 mg/kg 용량의 ADC를 투여하였는데, 단 비히클 그룹에는 담체 만을 투여하였다. 투여 후 각 시점 (5분, 1시간, 6시간, 24시간, 72시간 및 168시간)에서 마취 하에 심장 천자에 의해 혈액을 수집하였다. 혈청을 분리하고 항체와 ADC를 측정하였다.
그룹 1: 비히클 (PBS, pH 6.5, ADC 없음)
그룹 2: 트라스투주마브-SMCC-DMl
그룹 3: 트라스투주마브-SPP-DMl
그룹 4: 트라스투주마브-SPDP-DM1
그룹 5: 트라스투주마브-SPP-DM3
그룹 6: 트라스투주마브-SPP-DM4
실시예 7 - 랫트에서의 혈청 안정성
투여군당 6마리 스프라그-돌리 랫트 (각 100 내지 125 gm)를 수반한 6가지 투여군을 연구하였다. 0일 째에, 동물에게 단일 정맥내 용량의 비히클, 10 mg/kg 트라스투주마브-SPP-DMl, 또는 10 mg/kg 트라스투주마브-SMCC-DMl을, 측부 꼬리 정맥을 통하여 10 ml/kg의 용량 용적으로 투여하였다. 대략 300 ㎕ 전혈을 각 시점에서 수집하였다: 0 (투여전), 투여 후 10, 및 30분; 1, 2, 4, 8, 24 및 36시간; 및 2, 3, 4, 7, 14, 21, 28일.
실시예 8 - 종양 용적 생체내 효능
고 발현성 HER2 트랜스제닉 외식편 마우스:
트랜스제닉 실험용으로 적합한 동물을 표준 시판 공급원 [예: Taconic (Germantown, N.Y.)]으로부터 수득할 수 있다. 많은 균주가 적합하지만, FVB 암컷 마우스가 종양 형성에 대한 보다 높은 감수성을 지니고 있기 때문에 바람직하다. FVB 암컷을 짝짓기 (교배)에 사용하고, 정관절제 수술을 한 CD.1 연구를 이용하여 거짓임신을 자극하였다. 정관절제 수술시킨 마우스는 모든 상업적 공급체로부터 수득할 수 있다. 창시물을 FVB 마우스 또는 129/BL6 x FVB p53 이형접합성 마우스와 함께 번식시켰다. p53 대립 유전자에서 이형접합성을 나타내는 마우스를 사용하여 종양 형성을 잠재적으로 증가시켰다. 그러나, 이는 불필요한 것으로 입증되었다. 따라서, 몇몇 Fl 종양은 혼합 균주의 것이다. 창시 종양은 FVB 만의 것이다. 새끼를 배지 않은, 몇몇 발생하는 종양을 수반한 6개 창시물을 수득하였다.
종양이 있는 동물 (Fo5 mmtv 트랜스제닉 마우스로부터 증식된 동종이식편)에게, 트라스투주마브-DMl 마이탄시노이드 접합체 (10 mg/kg 용량)를 1회 주사하고, 주사 후 20일에 걸쳐 종양 용적을 평가하였다.
Bjab-luc 이종이식편 SCID 마우스:
마우스당 2천만개의 Bjab-luc 이종이식편 종양 세포를 수반한 8 내지 10마리 SCID 마우스 그룹에게 항체-약물 접합체, 또는 있는 그대로의 (노출된) 항체를 1일 째에 투여하였다. 8마리 마우스 그룹을 항-CD22 ADC, 있는 그대로의 항-CD22 항체 및 대조군으로 각각 시험하였다. 대조군 ADC (트라스투주마브-SMCC-DMl; 부하비: DM1/트라스투주마브 = 3.2)은 특이적 결합제가 아니고, 이는 200 ㎍ DMl/m2, 4.2 트라스투주마브/마우스 kg으로 투여하였으며, 평균 종양 배가 시간은 약 3일이었다. 항-CD22 접합체 7A2-SMCC-DM1 (부하비: DM1/Ab = 3.6), 5E8-SMCC-DM1 (부하비: DM1/Ab = 3.6), 및 RFB4-SMCC-DMl (부하비: DM1/Ab = 4.3). 있는 그대로의 항체 7A2, 5E8, 및 RFB4는 4 mg/마우스 kg으로 투여하였다.
실시예 9 - 랫트 독성
트라스투주마브-SPP-DMl (디설파이드 링커)의 급성 독성 프로파일을 자유 DM1 및 트라스투주마브-SMCC-DMl (비-디설파이드 링커)의 급성 독성 프로파일과 비교하여 평가하였다. 1일 째에 동물에게 주사하고, 기선, 3일 및 5일 째에 완전한 화학 및 혈액학 프로파일을 수득하고, 5일 째에 완전한 부검을 수행하였다. 각 그룹에 대한 3마리 무작위 동물에 대해 다음 조직을 대상으로 하여 통상적인 조직학을 수행하였다: 흉골, 간, 신장, 흉선, 비장, 대장 및 소장. 실험 그룹은 다음과 같다:
그룹 1: 비히클 (10 mM 나트륨 석시네이트, 100 mg/mL 슈크로스, 0.1% Tween 20, pH 5.0)
그룹 2: 트라스투주마브-SPP-DM1, 22.3 mg/kg
그룹 3: 트라스투주마브-SMCC-DM1, 10 mg/kg
그룹 4: 트라스투주마브-SMCC-DMl, 25 mg/kg
그룹 5: 트라스투주마브-SMCC-DM1, 50 mg/kg
그룹 6: 자유 DM1, 160 ㎍/kg
실시예 10 - 시노몰구스 원숭이 독성/안전성
4마리 (2마리는 암컷이고 2마리 숫컷이다) 타고난 본래의 모카카 파스시쿨라리스 (Macaca fascicularis) (시노몰구스 원숭이)로 구성된 3가지 그룹을 연구하였다:
그룹 1: (4마리 동물)에게 1일 및 22일 째에 비히클 (PBS, pH 6.5, 즉 ADC가 없는 제제) 만을 투여한 다음, 35일 째에 부검하였다.
그룹 2: (4마리 동물)에게 1일 및 22일 째에 트라스투주마브-SMCC-DMl 4900 ㎍/m2을 투여하였다.
그룹 3: (4마리 동물)에게 22일 째에 트라스투주마브-SMCC-DMl 7200 ㎍/m2을 투여하였다.
투여량는 기타 종과 관계되도록 동물의 표면적으로 표현하였는데, 즉 투여량 (㎍/m2)은 종과는 독립적으므로, 종들 간에 비교 가능하다. 그룹 2 및 그룹 3 연구용의 트라스투주마브-SMCC-DMl 제제는 PBS, 5.4 mM 인산나트륨, 4.2 mM 인산칼륨, 140 mM 염화나트륨, pH 6.5을 함유하였다.
제1 투여에 앞서 (새 환경 순응 기간), 제1 투여 후 3, 7, 11, 및 14일 째에 (그룹 1 및 2), 및 제2 투여 후 3, 7, 11, 14, 및 21일 째에 (그룹 1, 2 및 3) 혈 액 분석을 위해 혈액을 수집하였다. 적혈구 (RBC) 및 혈소판 (PLT) 계수치를 광산란 방법에 의해 측정하였다. 백혈구 (WBC) 계수치는 퍼옥시다제/호염기구 방법에 의해 측정하였다. 망상적혈구 계수치는 양이온성 염료를 이용하는 광산란 방법에 의해 측정하였다. 세포 계수치는 아드비아 (Advia) 120 장치 상에서 측정하였다. ALT (알라닌 아미노트랜스퍼라제) 및 AST (아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제)는 UV/NADH에 의해 U/L에서 측정하였고; IFCC 방법론은 올림푸스 (Olympus) AU400 장치 상에서, 총 Ab ELISA - ECD/GxhuFc-HRP. Conj. Ab ELISA -xDM1/ECD-Bio/SA-HRP 시험을 사용하여 측정하였다.
본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 특허, 특허원 및 참고 문헌은 특별히 본원에 참고로 삽입된다.

Claims (67)

  1. 하기 구조를 갖는 항체-약물 접합체 화합물.
    Figure 112012033925065-pct00082
    상기 구조에서, Ab는 트라스투주마브(trastuzumab)이고, p는 1, 2, 3 또는 4이다.
  2. 제1항의 항체-약물 접합체 화합물 또는 그의 제약상 허용 가능한 염, 및 제약상 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는, 유방암의 치료를 위한 제약 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 치료적 유효량의 에를로티니브(Erlotinib), 보르테조미브(Bortezomib), 풀베스트란트(Fulvestrant), 수텐트(Sutent), 레트로졸(Letrozole), 이마티니브(Imatinib) 메실레이트, PTK787/ZK 222584, 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 5-FU, 류코보린(Leucovorin), 라파마이신(Rapamycin), 라파티니브(Lapatinib), 로나파르니브(Lonafarnib), 소라페니브(Sorafenib) 및 제피티니브(Gefitinib) 중에서 선택된 화학요법제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 치료적 유효량의 항혈관신생제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 치료적 유효량의 베바시주마브(bevacizumab)를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 유방암이 ErbB2를 2+ 수준 이상으로 과발현하는 것인 제약 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 환자에게 투여되는 항체-약물 접합체 화합물의 양이 1회분당 0.1 내지 10 mg/환자 체중 kg의 범위인 제약 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 항체-약물 접합체 화합물이 3주 간격으로 투여되는 것인 제약 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 항체-약물 접합체 화합물이 주입에 의해 투여되는 것인 제약 조성물.
  10. 제2항에 있어서, 항체-약물 접합체 화합물이 제약상 허용 가능한 비경구 비히클과 함께 제제화된 것인 제약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 항체-약물 접합체 화합물이 단위 투여 주사제 형태로 제제화된 것인 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 항체-약물 접합체 화합물이 정맥내 투여되는 것인 제약 조성물.
  13. 제2항에 있어서, 항체-약물 접합체 화합물과의 조합으로 성장 억제성 항체를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  14. 제1항의 항체-약물 접합체 화합물;
    용기; 및
    상기 화합물이 ErbB 수용체의 과발현을 특징으로 하는 유방암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 표시한 패키지 삽입물 또는 라벨
    을 포함하는 제조품.
  15. 항체 Ab를 하기 링커 시약 SMCC와 반응시켜 항체-링커 중간체 Ab-L을 형성시킨 다음, Ab-L을 하기 약물 부분 DM1과 반응시켜 제1항의 항체-약물 접합체를 형성시키는 것을 포함하는,
    제1항의 항체-약물 접합체 화합물의 제조 방법.
    <SMCC>
    Figure 112012033925065-pct00083
    <DM1>
    Figure 112012033925065-pct00084
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