KR20180050321A - 분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체 - Google Patents

분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체 Download PDF

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KR20180050321A
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치오 무이 찬
진 구다스
토브 올라프센
다울렛 카딜 사트파예프
마이클 유리 토고브
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이미지냅 인코포레이티드
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    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Abstract

목적하는 표적에 결합하는 항원 결합 구조체가 개시되어 있다. 예를 들어, 표적 분자에 결합하고 본원에 개시된 하나 이상의 힌지를 갖는 항체 단편(예를 들어, scFv 및 미니바디)을 포함하는 항체가 본원에 개시되어 있다. 사용 방법이 본원에 개시되어 있다.

Description

분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체
관련 출원서에 대한 상호 참조
본 출원서는 2015년 08월 07일자로 출원된 미국 가출원 제 62/202,665 호의 이점을 주장하며, 이는 본원에서 그 전체가 참고로 인용된다.
서열 목록에 대한 인용
본 출원서는 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출되어 있다. 상기 서열 목록은 IGNAB030WO서열.TXT의 표제를 갖는 파일로서 제공되며, 상기 파일은 2016년 08월 03일자로 생성되고 마지막으로 변경되었으며, 이의 크기는 270,446바이트이다. 상기 전자 서열 목록 내의 정보는 본원에서 그 전체가 참고로 인용된다.
본원에 개시된 실시형태는 일반적으로는 항원 결합 구조체 자체(예를 들어, 미니바디(minobody)와 같은 임의의 scFv 융합 단백질)뿐만 아니라 상기 항원 결합 구조체 내의 힌지 구조 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
당해 기술분야에 공지된 매우 다양한 항원 결합 구조체가 존재한다. 이 같은 구조체들은 종종 이들의 CDR 절편 내의 서열에 따라 변경되며, 덜 빈번하지만 이들의 골격 영역 및 항체의 다른 절편(예를 들어, CH3 및 힌지 영역)에서 변경된다.
몇몇 양태에서, 서열번호 1의 서열(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)을 포함하는 아미노산 힌지 영역이 제공된다. Xn1은 자연적으로는 공유성 가교 결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산일 수 있다. Xn2는 A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V 중 하나이다. Xn3은 임의의 아미노산일 수 있다. Xn4는 임의의 아미노산일 수 있다. Xn5는 임의의 아미노산일 수 있다.
몇몇 양태에서, Xn1은 다른 아미노산과 함께 공유성 가교결합을 형성하지 않는다(서열번호 191). 몇몇 양태에서, Xn1은 시스테인이 아니다(서열번호 192). 몇몇 양태에서, Xn1은 A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V 중 하나이다(서열번호 193). 몇몇 양태에서, Xn2는 P, V 또는 E이다(서열번호 194). 몇몇 양태에서, Xn2는 P 또는 V이다(서열번호 195). 몇몇 양태에서, Xn4는 P, V 또는 E이다(서열번호 196). 몇몇 양태에서, Xn4는 P 또는 V이다(서열번호 197). 몇몇 양태에서, Xn3은 P 또는 E이다(서열번호 198). 몇몇 양태에서, Xn5는 P 또는 E이다(서열번호 199). 몇몇 양태에서, Xn3은 P 또는 E이다(서열번호 200). 몇몇 양태에서, Xn2Xn3은 VE이다(서열번호 201). 몇몇 양태에서, Xn2Xn3은 PP이다(서열번호 202). 몇몇 양태에서, Xn4Xn5는 VE이다(서열번호 203). 몇몇 양태에서, Xn4Xn5는 PP이다(서열번호 204). 몇몇 양태에서, Xn2Xn3은 VE이고 Xn4Xn5는 PP이다(서열번호 205). 몇몇 양태에서, Xn2Xn3은 PP이고 Xn4Xn5는 PP 또는 VE이다(서열번호 206). 몇몇 양태에서, Xn2Xn3은 VE이고 Xn4Xn5는 VE 또는 PP이다(서열번호 207). 몇몇 양태에서, 상기 힌지는 Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C(서열번호 1)에서 마지막 시스테인에 대해 C-말단에 있는 연장 또는 하부 힌지 서열을 더 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 연장 또는 하부 힌지 서열은 S, G, A, P 및 V 중 적어도 하나를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 연장 서열은 적어도 GGGSSGGGSG(서열번호 59)를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 링커 서열은 적어도 APPVAGP(서열번호 60)를 포함한다. 몇몇 양태에서, 특허청구범위 제 1 항의 힌지 영역은 코어 힌지 영역의 일부이다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지는 상기 코어 힌지 영역에 인접한 상부 힌지 영역을 더 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지는 상기 코어 힌지 영역에 인접한 하부 힌지 또는 연장 영역을 더 포함한다. 몇몇 양태에서, 이는 상기 코어 힌지 영역에 인접한 상부 힌지 영역을 더 포함한다. 몇몇 양태에서, Xn1은 세린, 트레오닌 또는 알라닌을 포함한다(서열번호 209). 몇몇 양태에서, Xn1은 세린을 포함한다(서열번호 210). 몇몇 양태에서, Xn1은 알라닌을 포함한다(서열번호 211). 몇몇 양태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 하기 서열, 즉 SCVECPPCP(서열번호 56) 및 TCPPCPPC(서열번호 166) 중 적어도 하나를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 하기 서열, 즉 ERKSCVECPPCP(서열번호 167), EPKSSDKTHT(서열번호 46) 및 CPPCPPC(서열번호 52) 중 적어도 하나를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 하기 서열, 즉 ERKSCVECPPCPGGGSSGGGSG(서열번호 34), ERKSCVECPPCPAPPVAGP(서열번호 33), EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG(서열번호 26) 및 EPKSSDKTHTCPPCPPCAPELLGGP(서열번호 25) 중 적어도 하나를 포함한다.
몇몇 양태에서, 아미노산 힌지 영역이 제공된다. 상기 아미노산 힌지 영역은 서열번호 2의 서열(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)을 포함한다. Xn1은 임의의 m개의 아미노산(여기서 m은 임의의 유형의 아미노산의 임의의 개수임)일 수 있다. Xn2는 임의의 아미노산일 수 있다. Xn3은 임의의 아미노산일 수 있다. Xn4는 임의의 아미노산일 수 있다. Xn5는 임의의 아미노산일 수 있다. Xn6은 시스테인이 아닌 임의의 아미노산일 수 있다. Xn7은 임의의 아미노산일 수 있다. Xn8은 임의의 아미노산일 수 있다. Xn9는 임의의 아미노산일 수 있다. Xn10은 임의의 아미노산일 수 있다(예를 들어, 서열번호 212 참조). 몇몇 양태에서, Xn1은 시스테인이 아니다(예를 들어, 서열번호 213 참조). 몇몇 양태에서, Xn2는 시스테인이 아니다(예를 들어, 서열번호 214 참조). 몇몇 양태에서, Xn2는 D이다(예를 들어, 서열번호 215 참조). 몇몇 양태에서, Xn3은 K이다(예를 들어, 서열번호 216 참조). 몇몇 양태에서, Xn4는 T이다(예를 들어, 서열번호 217 참조). 몇몇 양태에서, Xn5는 H이다(예를 들어, 서열번호 218 참조). 몇몇 양태에서, Xn6은 T이다(예를 들어, 서열번호 219 참조). 몇몇 양태에서, Xn7은 P 또는 V이다(예를 들어, 서열번호 220 참조). 몇몇 양태에서, Xn8은 P 또는 E이다(예를 들어, 서열번호 221 참조). 몇몇 양태에서, Xn9는 P 또는 V이다(예를 들어, 서열번호 222 참조). 몇몇 양태에서, Xn10은 P 또는 E이다(예를 들어, 서열번호 223 참조). 몇몇 양태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 Xn1 전방에 위치한 CXXC(예를 들어, 서열번호 224 참조) 또는 CXXC(예를 들어, 서열번호 225 참조) 모티프를 더 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 서열번호 2에서 C-말단 시스테인에 바로 부착된 Xn11Xn12C를 더 포함하되, Xn11은 임의의 아미노산일 수 있고 Xn12는 임의의 아미노산일 수 있다(예를 들어, 서열번호 226 참조). 몇몇 양태에서, Xn11은 P 또는 V이고 Xn12는 P 또는 E이다(예를 들어, 서열번호 227 참조). 몇몇 양태에서, Xn1은 세린이고, Xn2는 D이고, Xn3은 K이고, Xn4는 T이고, Xn5는 H이고, Xn6은 T이고, Xn7은 P이고, Xn8은 P이고, Xn9은 P이고, Xn10은 P이다(예를 들어, 서열번호 228 참조). 몇몇 양태에서, 상기 힌지 영역은 하기 서열, 즉 CPPCPPC(서열번호 52), CPPCVECPPC(서열번호 53) 및 CPPCPPCPPC(서열번호 54) 중 적어도 하나를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지 영역은 하기 서열, 즉 EPKSSDKTHTCPPCPPC(서열번호 168), EPKSSDKTHTCPPCVECPPC(서열번호 169) 및 EPKSSDKTHTCPPCPPCPPC(서열번호 170) 중 적어도 하나를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지 영역은 하기 서열, 즉 EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG(서열번호 26), EPKSSDKTHTCPPCVECPPCGGGSSGGGSG(서열번호 28) 및 EPKSSDKTHTCPPCPPCPPCGGGSSGGGSG(서열번호 30) 중 적어도 하나를 포함한다.
몇몇 양태에서, 아미노산 힌지 영역이 제공된다. 상기 힌지 영역은 ELKTPLGDTTHT(서열번호 48) 또는 EPKSSDKTHT(서열번호 46)의 상부 힌지 서열에 연결된 CVECPPCP(서열번호 57), CPPCPPC(서열번호 52), CPPCPPCPPC(서열번호 54) 및 CPPCVECPPC(서열번호 53) 중 적어도 하나를 갖는 코어 힌지 서열을 포함한다.
몇몇 양태에서, 항체에 대한 아미노산 힌지 영역이 제공되며, 이는 상응하는 아미노산과 가교 결합할 수 있는 아미노산을 포함하지 않은 상부 힌지 영역; 및 상기 상부 힌지 영역의 C-말단에 연결된 코어 힌지 영역을 포함할 수 있되, 상기 코어 힌지 영역은 가닥 당 적어도 3개의 시스테인을 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 상기 코어 힌지 영역에 대해 C-말단에 연결된 하부 힌지 또는 연장 영역을 더 포함하되, 상기 하부 힌지 또는 연장 서열은 APPVAGP(서열번호 60), APELLGGP(서열번호 58) 및/또는 GGGSSGGGSG(서열번호 59) 중 적어도 하나이다. 몇몇 양태에서, 상기 상부 힌지 영역은 상기 상부 힌지 영역 내에서 가교 결합하는 시스테인을 포함하지 않는다. 몇몇 양태에서, 상기 상부 힌지 영역은 시스테인을 포함하지 않는다. 몇몇 양태에서, 이는 하부 힌지 또는 연장 영역을 더 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 하부 힌지 또는 연장 영역은 GGGSSGGGSG(서열번호 59), APPVAGP(서열번호 60) 및 APELLGGP(서열번호 58) 중 적어도 하나를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지 영역이 미니바디(minibody) 내에 위치하고 상기 미니바디를 인간 개체에 투여하는 경우, 상기 개체로부터 상기 미니바디의 제거는 주로 간을 통해 일어난다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지 영역이 미니바디 내에 위치하고 상기 미니바디를 인간 개체에 투여하는 경우, 상기 개체로부터 상기 미니바디의 제거는 주로 신장을 통해 일어나지 않는다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지 영역은 항체 내에 있다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지 영역은 항체 결합 단편 내에 있다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지 영역은 미니바디 내에 있다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지 영역은 단일 특이성 항체 내에 있다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지 영역은 가닥 당 적어도 3개의 시스테인을 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지 영역은 가닥 당 적어도 4개의 시스테인을 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지 영역은 가닥 당 적어도 5개의 시스테인을 포함한다. 몇몇 양태에서, 시스테인은 상기 아미노산 힌지 영역 전역에서 반복 CXX 또는 CXY 모티프 내에 분포되어 있다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지 영역은 이중 특이성 항체 내에 있다. 몇몇 양태에서, 상기 이중 특이성 항체는 1:1의 비율로 조립된다. 몇몇 양태에서, 상기 이중 특이성 항체는 항체 단편을 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 이중 특이성 항체는 미니바디이다.
몇몇 양태에서, 약학 조성물이 제공된다. 상기 약학 조성물은 본원에서 개시된 임의의 힌지 영역과 동일한 아미노산 힌지 영역을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이로 인해 항체의 5% 미만의 집성체가 상기 조성물 내에 존재하게 한다.
몇몇 양태에서, 본원에서 제공된 임의의 힌지 영역과 동일한 아미노산 힌지 영역을 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 몇몇 양태에서, 상기 항체는 적어도 1마이크로그램(㎍) 내지 100㎎으로 존재한다.
몇몇 양태에서, 코어 힌지 영역을 포함하는 미니바디가 제공된다. 상기 코어 힌지 영역은 가닥 당 적어도 3개의 시스테인을 포함하며, 이때 상기 시스테인은 상기 코어 힌지 영역 내에서 적어도 3개의 이황화 결합을 형성한다. 몇몇 양태에서, 상기 코어 영역의 첫 번째 잔기는 세린이다. 몇몇 양태에서, 상기 코어 힌지 영역은 SCVECPPCP(서열번호 56)을 포함한다.
몇몇 양태에서, 미니바디가 제공된다. 상기 미니바디는 Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C의 서열(서열번호 3)을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 상기 미니바디의 코어 힌지 영역으로서 위치할 수 있다. Xn1은 임의의 아미노산일 수 있거나 아미노산이 아닐 수 있다. Xn2는 임의의 아미노산일 수 있다. Xn3은 임의의 아미노산일 수 있다. Xn4는 임의의 아미노산일 수 있다. Xn5는 임의의 아미노산일 수 있다. 몇몇 양태에서, Xn1은 시스테인이 아닌 임의의 아미노산이다(서열번호 229). 몇몇 양태에서, Xn1은 세린이다(서열번호 230).
몇몇 양태에서, 변이체 미니바디 힌지가 제공된다. 상기 변이체 힌지는 제 1 변경 아미노산 위치를 포함할 수 있다. 상기 제 1 변경 위치는 천연 항체 힌지에서 시스테인일 수 있는 아미노산이고, 이황화 결합을 형성하지 않도록 상기 제 1 변경 위치에서 변경되어 있다. 상기 변이체 힌지는 또한 상기 제 1 변경 아미노산 위치에 대해 C-말단에 있는 가닥 당 적어도 3개의 시스테인을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 힌지 영역은 서열번호 1로 이루어져 있다. 몇몇 양태에서, 서열번호 1은 코어 힌지 영역이며, 이때 상기 코어 힌지 영역은 본질적으로는 서열번호 1로 이루어져 있다. 몇몇 양태에서, 상기 코어 힌지 영역은 서열번호 1로 이루어져 있다.
몇몇 양태에서, 미니바디가 제공된다. 상기 미니바디는 표적 항원에 결합하며, 이때 상기 표적 항원은 CD3, CD8, 5T4, PSMA 및 PSCA 중 적어도 하나이다. 상기 미니바디는 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 상기 표적 항원에 결합하는 단일 사슬 가변 단편(scFv); 및 변이체 힌지 영역을 포함하되, 상기 scFv는 가변 경쇄(VL) 도메인에 연결된 가변 중쇄(VH) 도메인을 포함하고, 상기 변이체 힌지 영역은 상기 힌지의 각각의 가닥 상에 적어도 3개의 시스테인을 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 미니바디는 인간 IgG CH3 서열을 더 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 미니바디는 방사성 물질, 염료, 조영제, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 효소, 증강제 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 가능한 마커를 더 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 미니바디는 본원에서 개시된 바와 같은 HCDR1과 동일한 HCDR1; 본원에서 개시된 바와 같은 HCDR2와 동일한 HCDR2; 본원에서 개시된 바와 같은 HCDR3과 동일한 HCDR3; 본원에서 개시된 바와 같은 LCDR1과 동일한 LCDR1; 본원에서 개시된 바와 같은 LCDR2와 동일한 LCDR2; 및 본원에서 개시된 바와 같은 LCDR3과 동일한 LCDR3을 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인은 인간 서열이다.
몇몇 양태에서, 본원에서 개시된 바와 같은 미니바디를 암호화하는 핵산이 제공된다.
몇몇 양태에서, 본원에서 개시된 바와 같은 미니바디를 생산하는 세포주가 제공된다.
몇몇 양태에서, 본원에서 제공된 임의의 미니바디 및 검출 가능한 마커를 포함하는 키트가 제공된다.
몇몇 양태에서, 표적 항원의 존재 유무를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 표적 항원은 CD3, CD8, 5T4, PSMA 및 PSCA 중 적어도 하나이다. 상기 방법은 본원에서 개시된 바와 같은 미니바디를 시료에 적용하는 단계; 및 상기 표적 항원에 대한 항원 결합 구조체의 결합 또는 이의 결합의 부재를 검출하는 단계를 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 미니바디는 방사성 물질, 염료, 조영제, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 효소, 증강제 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 가능한 마커를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 미니바디를 적용하는 단계는 상기 미니바디를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 표적 항원에 대한 상기 미니바디의 결합 또는 이의 결합의 부재를 검출하는 단계는 양전자 방출 단층촬영을 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 이차 항체 또는 이의 단편을 상기 시료에 적용하든 단계를 더 포함하되, 상기 이차 항체 또는 이의 단편은 상기 미니바디에 특이적으로 결합한다. 몇몇 양태에서, 이의 미니바디는 1시간 이내로 상기 시료와 함께 배양된다.
몇몇 양태에서, 치료제를 표적 항원에 표적화하는 방법이 제공된다. 상기 표적 항원은 CD3, CD8, 5T4, PSMA 및 PSCA 중 적어도 하나이다. 상기 방법은 본원에서 개시된 바와 같은 미니바디를 개체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 미니바디는 치료제에 접합되어 있다.
몇몇 양태에서, B 또는 T 림프구 세포를 이를 필요로 하는 개체에서 중화시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 개시된 바와 같은 미니바디를 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 미니바디는 CD8 및/또는 CD3에 결합한다. 몇몇 양태에서, 상기 개체는 본원에 언급된 바와 같은 질환들 중 적어도 하나를 앓고 있다.
몇몇 양태에서, 표적 항원(예를 들어, CD8, CD3, 5T4, PSMA, PSCA)에 결합하는 항체 및/또는 미니바디가 제공된다. 상기 항체 및/또는 미니바디는 힌지 영역을 포함하되, 상기 힌지 영역은 하기 서열들 중 적어도 하나를 포함한다:
a) 서열번호 1의 서열(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)을 포함하되, Xn1은 자연적으로는 공유성 가교결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn2는 A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V 중 하나이고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있는 아미노산 힌지 영역;
b) 서열번호 2의 서열(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)을 포함하되, Xn1은 임의의 m개의 아미노산(여기서 m은 임의의 유형의 아미노산의 임의의 개수임)일 수 있고, Xn2는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn6은 시스테인이 아닌 임의의 아미노산일 수 있고, Xn7은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn8은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn9는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn10은 임의의 아미노산일 수 있는 아미노산 힌지 영역;
c) ELKTPLGDTTHT(서열번호 48) 또는 EPKSSDKTHT(서열번호 46)의 상부 힌지 서열에 연결된 CVECPPCP(서열번호 57), CPPCPPC(서열번호 52), CPPCPPCPPC(서열번호 54) 및 CPPCVECPPC(서열번호 53) 중 적어도 하나를 갖는 코어 힌지 서열;
d) 상응하는 아미노산과 가교 결합할 수 있는 아미노산을 포함하지 않는 상부 힌지 영역; 및 상기 상부 힌지 영역의 C-말단에 연결된 코어 힌지 영역(여기서, 상기 코어 힌지 영역은 가닥 당 적어도 3개의 시스테인을 포함함);
e) 코어 힌지 영역을 포함하는 항체 및/또는 미니바디(여기서, 상기 코어 힌지 영역은 가닥 당 적어도 3개의 시스테인을 포함하며, 이때 상기 시스테인은 상기 코어 힌지 영역 내에 적어도 3개의 이황화 결합을 형성함); 및
f) 제 1 변경 아미노산 위치(여기서, 상기 제 1 변경 위치는 천연 항체 힌지에서 시스테인일 수 있는 아미노산이고, 이황화 결합을 형성하지 않도록 상기 제 1 변경 위치에서 변경되어 있음); 및 제 1 변경 아미노산 위치에 대해 C-말단에 있는 가닥 당 적어도 3개의 시스테인.
몇몇 양태에서, 본원에서 제공된 임의의 미니바디는 대신에 전장 항체로서 포맷팅(formatting)될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 인간화 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 양태에서, 본원에서 제공된 미니바디를 제조하는 방법은 상기 미니바디를 세포주에서 발현하는 단계를 포함한다.
몇몇 양태에서, 치료를 필요로 하는 개체에서 병태를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 CD3, CD8, PSCA, PSMA 및/또는 5T4 질환들 중 임의의 하나 이상을 치료하기 위해 상기 개체에 본원에서 제공된 미니바디들 중 임의의 하나 이상을 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 조작된 미니바디(Mb)의 예시도를 나타낸다.
도 2는 인간 IgG1(상단: γ1 EH1 및 하단: γ1 EH2)에 기초한 Mb 힌지의 다양한 실시형태의 예시도를 나타낸다.
도 3은 인간 IgG2(상단: γ2 EH1 및 하단: γ2 EH2)에 기초한 Mb 힌지의 다양한 실시형태의 예시도를 나타낸다.
도 4는 인간 IgG2(상단: γ2 NH1 및 하단: γ2 NH2)에 기초한 부가적인 Mb 힌지의 다양한 실시형태의 예시도를 나타낸다.
도 5a는 IAB2M 힌지 변이체들의 비환원 SDS-PAGE 분석 이미지를 나타낸다.
도 5b는 IAB2M γ1 EH1의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 5c는 IAB2M γ1 EH2의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 5d는 IAB2M γ2 EH2의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 5e는 IAB2M-γ2 EH1의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 6a는 IAB2M γ1 EH1 변이체의 원형 질량 분석을 나타낸다. 상부 패널은 역상 조건 하에서의 총 이온 크로마토그램(total ion chromatogram)을 나타낸다. 중간 패널은 반분자(half molecule)의 존재를 확인한 탈회선(deconvolution)된 원형 질량을 나타내고, 하부 패널은 상기 확인된 실치수 질량(full size mass)을 나타낸다.
도 6b는 IAB2M γ2 EH1 변이체의 원형 질량 분석을 나타낸다. 상부 패널은 역상 조건 하에서의 총 이온 크로마토그램을 나타낸다. 중간 패널은 반분자의 존재를 확인한 탈회선된 원형 질량을 나타내고, 하부 패널은 상기 확인된 실치수 분자 질량을 나타낸다.
도 6c는 IAB2M γ1 EH2 변이체의 원형 질량 분석을 나타낸다. 상부 패널은 역상 조건 하에서의 총 이온 크로마토그램을 나타낸다. 중간 패널은 반분자의 존재를 확인한 탈회선된 원형 질량을 나타내고, 하부 패널은 상기 확인된 실치수 분자 질량을 나타낸다.
도 6d는 IAB2M γ2 EH2 변이체의 원형 질량 분석을 나타낸다. 상부 패널은 총 이온 크로마토그램을 나타낸다. 하부 패널은 실치수 질량 분자들의 존재를 확인한 탈회선된 원형 질량을 나타낸다. 반분자는 검출되지 않았다.
도 7a는 LNCaP-AR 세포를 이용하여 FACS에 의해 결정된 IAB2M-조작된 힌지 변이체들의 결합 곡선 및 EC50 결합 값들을 나타낸다.
도 7b는 C4-2 XCL 세포를 이용하여 FACS에 의해 결정된 IAB2M-조작된 힌지 변이체들의 결합 곡선 및 EC50 결합 값들을 나타낸다.
도 7c는 표준 신호 서열이 없는 IAB2M γ1 EH3의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 7d는 표준 신호 서열이 없는 IAB2M γ1 EH3의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 7e는 표준 신호 서열이 없는 IAB2M γ1 EH3에 대한 DNA 서열 정보를 나타낸다.
도 8은 IAB2M γ1 EH1 이량체 내에서 확인된 이황화물 함유 펩티드들의 목록을 나타낸다.
도 9는 미스페어링(mispairing)된 시스테인이 형성되는 장소를 나타내는 IAB2M γ1 EH1의 이황화 결합의 지도 제작의 예시도를 나타낸다.
도 10은 미스페어링된 시스테인의 부재를 제시하는 IAB2M γ2 EH1의 이황화 결합의 지도 제작의 예시도를 나타낸다.
도 11a는 22Rv1(PSMA+) 종양 이종 이식편을 갖고 있는 누드 마우스에서 89Zr-Df-IAB2M γ1 EH1의 PET/CT 스캔 이미지를 나타낸다.
도 11b는 누드 마우스에서 89Zr-Df-IAB2M γ1 EH1의 생물 분포에 대한 그래프를 나타낸다.
도 12a는 22Rv1(PSMA+) 종양 이종 이식편을 갖고 있는 누드 마우스에서 89Zr-Df-IAB2M γ1 EH2의 PET/CT 스캔 이미지를 나타낸다.
도 12b는 누드 마우스에서 89Zr-Df-IAB2M γ1 EH2의 생물 분포에 대한 그래프를 나타낸다.
도 13a는 22Rv1(PSMA+) 종양 이종 이식편을 갖고 있는 누드 마우스에서 89Zr-Df-IAB2M γ2 EH2의 PET/CT 스캔 이미지를 나타낸다.
도 13b는 누드 마우스에서 89Zr-Df-IAB2M γ2 EH2의 생물 분포에 대한 그래프를 나타낸다.
도 14a는 IAB22M γ2 EH1 변이체의 원형 질량 분석을 나타낸다. 상부 패널은 총 이온 크로마토그램을 나타낸다. 중간 패널은 반분자의 존재를 확인한 탈회선된 원형 질량을 나타내고, 하부 패널은 상기 확인된 실치수 질량을 나타낸다.
도 14b는 IAB22M γ2 EH1의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 15a는 IAB22 γ2 EH2 변이체의 원형 질량 분석을 나타낸다. 단백질은 역상 조건 하에서 분리되었다. 상부 패널은 전체 질량 범위의 스캔을 나타낸다. 확대된 실치수 질량 영역은 온전한 단백질, 즉 이황화 브릿지 결합된 단백질의 존재를 강조하는 반면(중간 패널), 확대된 반분자 영역은 반분자가 본질적으로 존재하지 않는다는 것을 나타낸다(하부 패널).
도 15b는 IAB22M γ2 EH2 변이체의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 16a는 인간 IgG1-유래 및 인간 IgG2-유래 힌지 서열을 갖는 89Zr-Df-IAB22M 미니바디를 비교한, HPB-ALL (CD8+) 종양 이종 이식편을 갖고 있는 마우스들의 PET/CT 스캔 이미지를 나타낸다.
도 16b는 IAB22M γ1 EH1의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 16c는 IAB22M γ2 NH1의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 16d는 IAB22M γ2 NH2의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 17은 항원-양성 HPB-ALL 종양 및 항원-음성 다우디 종양(Daudi tumor)(우측 패널 단독)을 갖는 NOD-SCID 마우스에서 89Zr-Df-IAB22M γ1 EH1의 흡수를 비교한 PET/CT 스캔 이미지를 나타낸다.
도 18은 항원-양성 HPB-ALL 종양 및 항원-음성 다우디 종양을 갖는 마우스들에서 89Zr-Df-IAB22M γ1 EH1의 생물 분포에 대한 그래프를 나타낸다. 숫자는 우측에 나타나 있다.
도 19는 표 3에 나열된 힌지 변이체의 몇몇 실시형태의 예시도이다(상단: γ1 EH1, 중간: γ1 EH3 및 하단: γ1 EH4).
도 20a는 질량 분광분석법에 의해 결정할 때 IAB2M에 대한 상이한 힌지 변이체에 존재하는 반분자의 비율(%)을 요약한 그래프를 나타낸다.
도 20b는 질량 분광분석법에 의해 결정할 때 IAB22M에 대한 상이한 힌지 변이체에 존재하는 반분자의 비율(%)을 요약한 그래프를 나타낸다.
도 20c는 IAB22M γ1 EH3의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 20d는 IAB22M γ1 EH5의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 20e는 IAB22M γ3/γ1 EH6의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 20f는 IAB22M γ3/γ1 EH7의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 20g는 IAB22M γ3/γ1 EH8의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 21a는 밀도 측정법에 의해 정량화된 IAB2M 힌지 Mb 변이체들의 비환원 SDS-PAGE 분석 이미지(좌측 패널) 및 반분자의 비율(%)(우측 패널)을 나타낸다.
도 21b는 IAB2M γ1 EH5의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 21c는 IAB2M γ3/γ1 EH6의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 21d는 IAB2M γ3/γ1 EH7의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 21e는 IAB2M γ3/γ1 EH8의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 22a는 밀도 측정법에 의해 정량화된 IAB22M 힌지 Mb 변이체들의 비환원 SDS-PAGE 분석 이미지(좌측 패널) 및 반분자의 비율(%)(우측 패널)을 나타낸다.
도 22b는 IAB22M γ1 EH2의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 23은 IAB22M γ1 EH1 변이체의 원형 질량 분석을 나타낸다. 상부 패널은 총 이온 크로마토그램을 나타낸다. 중간 패널은 반분자의 존재를 확인한 탈회선된 원형 질량을 나타내고, 하부 패널은 상기 확인된 실치수 질량을 나타낸다.
도 24는 IAB22M γ1 EH3 변이체의 원형 질량 분석을 나타낸다. 단백질은 역상 조건 하에서 분리되었다. 상부 패널은 전체 질량 범위의 스캔을 나타낸다. 확대된 실치수 질량 영역은 온전한 단백질의 존재를 강조한다(중간 패널). 확대된 반분자 영역은 반분자가 본질적으로 존재하지 않는다는 것을 나타낸다(하부 패널).
도 25a 및 도 25b는 IAB22M γ2 힌지 변이체들의 원형 질량 분석을 나타낸다. 도 25a는 역상 조건 하에서의 IAB22M γ2 EH1 변이체(도 14b)의 총 이온 크로마토그램을 나타낸다(상부 패널). 중간 패널은 반분자의 존재를 확인한 탈회선된 원형 질량을 나타내고, 하부 패널은 상기 확인된 실치수 질량을 나타낸다. 이종성(heterogeneity)은 말단 리신 클리핑(clipping)으로부터 유래한다는 것을 주목한다. 도 25b는 IAB22M γ2 EH2 변이체(도 15b)의 탈회선된 전체 범위 스캔(상부 패널)에서 79053.1Da의 m/z를 갖는 유일 종이 확인된다는 것을 나타낸다. 확대된 실치수 분자량은 중간 패널 상에 나타나 있고, 반분자는 낮은 빈도로 존재하고 잡음 수준 바로 위에 있다(하단 패널).
도 26은 C4-2 XCL 세포를 이용하여 FACS에 의해 결정된 IAB2M-조작된 힌지 변이체들의 결합 곡선 및 EC50 결합 값을 나타낸다.
도 27은 HPB-ALL 세포를 이용하여 FACS에 의해 결정된 IAB22M-조작된 힌지 변이체들의 결합 곡선 및 EC50 결합 값을 나타낸다.
도 28a는 밀도 측정법에 의해 정량화된 IAB20M 힌지 Mb 변이체들의 비환원 SDS-PAGE 분석 이미지(좌측 패널) 및 반분자의 비율(%)(우측 패널)을 나타낸다.
도 28b는 IAB20M γ1 EH1의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 28c는 IAB20M γ1 EH3의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 28d는 IAB20M γ1 EH2의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 28e는 IAB20M γ1 EH5의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 29a는 밀도 측정법에 의해 정량화된 IAB1M 힌지 Mb 변이체들의 비환원 SDS-PAGE 분석 이미지(좌측 패널) 및 반분자의 비율(%)(우측 패널)을 나타낸다.
도 29b는 IAB1M γ1 EH1의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 29c는 IAB1M γ2 EH2의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 29d는 IAB1M γ1 EH3의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 30은 좌측 어깨 상에 항원-양성 HPB-ALL 이종 이식편을 갖고 있는 NOD-SCID 마우스들에서 상이한 힌지 서열을 갖는 89Zr-방사성 표지된 IAB22 Mb의 흡수를 비교한 PET/CT 스캔 이미지를 나타낸다.
도 31은 좌측 어깨 상에 항원-양성 HPB-ALL 이종 이식편을 갖고 있는 NOD-SCID 마우스들에서 상이한 힌지 서열을 갖는 89Zr-방사성 표지된 IAB22 Mb의 생물 분포 데이터에 대한 그래프를 나타낸다.
도 32는 IAB20M γ2 EH2의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 33은 IAB25M-γ2 EH2의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 34a는 IAB2M Mb의 몇몇 실시형태를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다.
도 34b는 IAB2M Mb의 몇몇 실시형태를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다.
도 34c는 IAB2M Mb의 몇몇 실시형태를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다.
도 34d는 IAB2M Mb의 몇몇 실시형태를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다.
도 34e는 IAB2M Mb의 몇몇 실시형태를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다.
도 34f는 IAB2M Mb의 몇몇 실시형태를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다.
도 35a는 IAB2M Mb 힌지 변이체들의 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 35b는 IAB2M Mb 힌지 변이체들의 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 35c는 IAB2M Mb 힌지 변이체들의 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 36a는 상이한 항원 특이성을 갖는 Mb의 VL 및 VH 도메인의 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 36b는 상이한 항원 특이성을 갖는 Mb의 VL 및 VH 도메인의 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 36c는 상이한 항원 특이성을 갖는 Mb의 VL 및 VH 도메인의 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 36d는 상이한 항원 특이성을 갖는 Mb의 VL 및 VH 도메인의 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 36e는 상이한 항원 특이성을 갖는 Mb의 VL 및 VH 도메인의 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 37은 링커 서열의 다양한 실시형태의 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 38은 힌지 영역의 다양한 실시형태의 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 39는 CH3 도메인의 다양한 실시형태의 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 40은 IAB22M γ1 EH1(M1) 및 IAB22M γ1 EH3(M1)의 실시형태 각각의 단백질 서열의 정렬을 나타낸다. 서열의 차이는 박스 안에 나타나 있다.
도 41은 IAB22M γ1 EH3(M1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다. 신호, CDR, 링커 및 힌지 서열들은 박스 안에 나타나 있다.
도 42는 IAB22M γ1 EH5(M1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 43은 IAB22M γ1 EH7(M1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 44는 IAB22M γ1 EH8(M1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 45는 IAB22M γ2 EH2(M1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 46은 VH-K67R 다형성(polymorphism)을 갖는 IAB22M γ2 EH2(M1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 47은 IAB2M γ1 EH1(M2) 및 IAB2M γ1 EH3(M2)의 실시형태 각각의 단백질 서열의 정렬을 나타낸다. 서열의 차이는 박스 안에 나타나 있다.
도 48은 IAB2M γ1 EH3(M2)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다. 신호, CDR, 링커 및 힌지 서열들은 박스 안에 나타나 있다.
도 49는 IAB2M γ1 EH3 (M2)(G1m1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 50은 IAB2M γ1 EH5(M2)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 51은 IAB2M γ1 EH7(M2)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 52는 IAB2M γ1 EH8(M2)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 53은 IAB2M γ1 EH3(M1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 54는 VL-Q79E, V83E; VH-Q1E, Q6E 다형성을 갖는 IAB20M γ1 EH1(M2) 및 IAB20M γ1 EH3(M2)의 실시형태 각각의 단백질 서열의 정렬을 나타낸다. 서열의 차이는 박스 안에 나타나 있다.
도 55는 VL-Q79E, V83E; VH-QIE, Q6E 다형성을 갖는 IAB20M γ1 EH3(M2)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다. 신호, CDR, 링커 및 힌지 서열들은 박스 안에 나타나 있다.
도 56은 IAB20M γ1 EH3(M2)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 57은 VL-A9D, T10S, S12A, P15L, L21I, S22N; VH-Q1E, Q6E 다형성을 갖는 IAB20M γ1 EH3(M2)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 58은 VL-Q79E, V83E; VH-Q1E, Q6E 다형성을 갖는 IAB20M γ1 EH5(M2)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 59는 VL-A9D, T10S, S12A, P15L, L21I, S22N; VH-Q1E, Q6E 다형성을 갖는 IAB20M γ1 EH5(M2)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 60은 IAB1M γ1 EH1(M1) 및 IAB1M γ1 EH3(M1)의 실시형태 각각의 단백질 서열의 정렬을 나타낸다. 서열의 차이는 박스 안에 나타나 있다.
도 61은 IAB 1M-γ1 EH3(M1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다. 신호, CDR, 링커 및 힌지 서열들은 박스 안에 나타나 있다.
도 62는 IAB1M γ2 EH2(M1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 63은 IAB1M γ1 EH5(M1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 64는 IAB1M γ1 EH7(M1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 65a는 IAB1M γ1 EH8(M1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 65b는 IAB25M γ2 NH(M1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 65c는 IAB25M γ2 EH(M1)의 실시형태의 DNA 및 번역된 단백질 서열을 나타낸다.
도 66은 IAB22M VH 도메인의 실시형태의 단백질 서열을 나타낸다.
도 67은 IAB20 VL 도메인의 몇몇 실시형태의 단백질 서열을 나타낸다.
도 68은 IAB20 VH 도메인의 실시형태의 단백질 서열을 나타낸다.
도 69는 항-CD3 VL 및 VH 도메인의 몇몇 실시형태의 단백질 서열을 나타낸다.
도 70은 호모 사피엔스(Homo sapiens)에서 유래한 글루타메이트 카르복시펩티다아제 2로도 공지된 PSMA(전립선-특이적 막항원)의 실시형태의 단백질 서열을 나타낸다.
도 71은 호모 사피엔스에서 유래한 PSCA(전립선 줄기세포 항원)의 실시형태의 단백질 서열을 나타낸다.
도 72는 호모 사피엔스에서 유래한 5T4 종양 태아성 영양막 당단백질(5T4 oncofetal trophoblast glycoprotein)의 실시형태의 단백질 서열을 나타낸다.
도 73은 호모 사피엔스에서 유래한 T 세포 표면 당단백질 CD8 알파 사슬의 실시형태의 단백질 서열을 나타낸다.
도 74는 호모 사피엔스에서 유래한 T 세포 표면 당단백질 CD8 베타 사슬의 실시형태의 단백질 서열을 나타낸다.
도 75는 호모 사피엔스에서 유래한 T 세포 표면 당단백질 CD3 델타 사슬의 실시형태의 단백질 서열을 나타낸다.
도 76은 호모 사피엔스에서 유래한 T 세포 표면 당단백질 CD3 감마 사슬의 실시형태의 단백질 서열을 나타낸다.
도 77은 호모 사피엔스에서 유래한 T 세포 표면 당단백질 CD3 엡실론 사슬의 실시형태의 단백질 서열을 나타낸다.
도 78은 호모 사피엔스에서 유래한 T 세포 표면 당단백질 CD3 제타 사슬의 실시형태의 단백질 서열을 나타낸다.
도 79는 IAB25M-γ2 EH2의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
도 80은 IAB20M-γ2 EH2의 몇몇 실시형태에 대한 단백질 서열 정보를 나타낸다.
항원 결합 구조체를 위한 구성성분들이 본원에 개시되어 있으며, 상기 구성성분들로는 표적 분자에 결합하는 미니바디와 같은 항체 및 이의 단편들을 들 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이들 구성성분은 신규한 힌지 서열 및/또는 상기 힌지 서열과 연관되고/되거나 상기 힌지 서열의 일부와 연관된 서열이다. 이들 힌지 서열은 다양한 이점을 제공할 수 있다. 본원에서 제공된 힌지 서열 또는 부분 서열들 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 구조체(예를 들어, 항체, 미니바디 등)들이 또한 본원에서 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체들은 표적 분자를 발현하는 세포에 대해 치료제를 표적화하는데 유용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항원 결합 구조체(항체, 및 미니바디와 같은 구조체를 포함함)들을 이용하여 표적 분자(또는 "표적")의 존재 유무를 검출하기 위한 방법들이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 치료 목적으로 상기 항원 결합 구조체를 이용하기 위한 방법들이 제공된다.
몇몇 실시형태에서, scFv 및 미니바디 항체는 부모 항체의 결합 특이성 및 친화도를 유지하면서도 보다 신속한 진단용 이미징을 위한 우수한 약동학적 특성을 가질 수 있다. 현재 기술은 전장 항체를 이용한 이미징을 이용하며, 이때 상기 이미징은 종종 온전한 항체의 느린 혈청 제거로 인해 고대비 이미지를 생성하기 위해서는 훨씬 더 긴 시간(주사 후 약 7 내지 8일)을 요구한다. 본원에서 제공된 미니바디의 몇몇 실시형태는 당일 또는 다음날 이미징을 위한 기회를 제공한다. 당일 또는 다음날 이미징은 또한 치료/진단을 받기 위해 상당한 거리를 이동하는 많은 환자들이 직면하는 문제점에 대한 논리적 해결안을 제공하는데, 이는 온전한 항체에 대한 미니바디를 사용하여 이미징하는 경우 이동/숙박 기간 또는 1주일 후에 되돌아올 필요성이 해소될 수 있기 때문이다.
하기에 설명된 바와 같이, 몇몇 실시형태에서 상기 항원 결합 구조체들은 진단용이다. 적절한 방사성 핵종(예를 들어, PET 이미징을 위한 양전자 에미터인 요오드-124, 구리-64, 불소-18, 갈륨-68 및/또는 지르코늄-89) 또는 형광단(fluorophore; 형광 이미징용)으로 표지되는 경우, 상기 항체 단편들은 본원에 나타낸 바와 같은 전임상적 이미징용으로 사용될 수 있고, 환자에서 임상적 이미징용으로 사용될 수 있다. 이들 항원 결합 구조체들은 또한 방사선 표지를 인듐-111, 요오드-123 및 루테튬-177과 같은 단일 광자 방출 방사성 핵종으로 단순히 변경함으로써 잠재적인 SPECT 이미징제(imaging agent)로서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체들은 인간에서 임상적 이미징제(PET/SPECT)일 수 있다. 따라서 몇몇 실시형태에서 항원 결합 구조체들은 이들 질환에 대한 표적화된 진단 검출용으로 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 치료제로서 사용될 수 있다.
정의 및 다양한 실시형태
"힌지"란 용어는 항체 또는 미니바디와 같은 항원 결합 구조체를 위한 힌지 영역의 적어도 일부분을 나타낸다. 힌지 영역은 상부 힌지, 코어(또는 중간) 힌지 및 하부 힌지 영역의 조합을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지는 상기 항체 힌지에 대한 임의의 정의에 따라 정의된다. 천연 IgG1, IgG2 및 IgG4 항체는 12 내지 15개의 아미노산을 갖는 힌지 영역을 갖는다. IgG3은 21개의 프롤린 및 11개의 시스테인을 포함한 62개의 아미노산을 갖는 연장된 힌지 영역을 갖는다. 결정학 연구로부터 유도된 자연적으로 발생하는 항체의 작용성 힌지 영역은 IgG1 중쇄의 216번 내지 237번째 아미노산 잔기들로부터 연장되고(EU 넘버링(EU numbering); 참고문헌 12), 하부 힌지에 CH2 도메인의 N 말단의 작은 분절을 포함하며, 이때 상기 하부 힌지는 CH2 도메인의 N 말단이다. 상기 힌지는 3개의 영역, 즉 "상부 힌지," "코어" 및 "하부 힌지"로 분할될 수 있다.
힌지(또는 이의 서브파트(subpart))를 개질하는 경우 "인공적인" 또는 "비자연적인"이란 용어는 당해 서열이 자연에서 상술한 상태로 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명의 문맥에서, 상기 힌지들은 이들의 천연 상태로부터 변경되어 있어, 이들의 서열은 야생형 항체에서는 더 이상 발견되는 것이 아니다. 당해 기술분야의 숙련자에 의해 인지되는 바와 같이, 미니바디는 자연에서 자연적으로 발생하지 않으며, 따라서 미니바디 구조체인 임의의 구조체는 또한 자연에서 발견되지 않는다. 이는 또한 본원에서 제공된 임의의 힌지 서열 표(예를 들어, 표 0.2)에서 발견되는 구조체 및/또는 상기 표에 있는 서열들을 혼입한 구조체들 중 적어도 일부분에 적용된다. 몇몇 실시형태에서, 표 0.1에 있는 임의의 힌지 서브파트 또는 전체 힌지 서열들은 상기 서열(또는 상기 힌지에 대한 결과적인 조합)이 자연에서 발생하지 않는 한 인공적인 힌지 서열일 수 있다.
"전체 힌지 영역" 또는 "힌지 영역 전체"란 용어는 단일 구조체로서 상부, 코어, 및 하부 힌지 영역 전체의 존재를 나타낸다. 상기 상부, 코어 및 하부 영역은 서로에 대해 바로 인접하게 위치할 수 있거나, 부가적인 잔기들이 상기 영역들 사이에 부가되거나 상기 영역의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 천연 하부 힌지는 연장 서열로 치환될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 당업자라면 천연 하부 힌지를 상기 연장 서열과 조합할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 연장 서열 또는 기타 서열 세트는 상부 및/또는 코어 서열 다음에 부가될 수 있다.
"유효 힌지 영역"이란 문구는 상기 힌지 영역이 이의 의도된 목적으로 인해 유효성이 있도록 하기 위해 상기 상부, 코어 및 하부 힌지 영역 중 적어도 하나의 일부가 적절한 양으로 존재한다는 것을 의미한다. 따라서 상기 문구는 힌지 영역의 변이체 및 다양한 힌지 영역의 단편들을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 영역의 기능으로는 하나 이상의 하기 기능이 있다: CH3 도메인과 scFv를 연결하기, 표적과 적절히 결합하기 위해 2개의 scFv를 위한 가요성(flexibility) 및 간격(spacing)을 제공하기, 2개의 반분자를 함께 연결하기, 분자에 대한 전체 안정성을 제공하기, 및/또는 이의 용매 노출로 인한 부위-특이적 접합을 위한 부위를 제공하기. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지는 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위해 천연에 가까워야 한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 상부 힌지는 scFv(천연 IgG에서는 216번째 잔기에서 시작함)에 대한 가요성을 제공하고, 상기 중간 힌지는 안정성을 제공하며, 상기 하부 힌지는 CH3(천연 IgG에서는 213번째 잔기에서 시작함)에 대한 가요성을 중재한다.
"상부 힌지"란 용어는 scFv의 말단에서 시작하는 힌지의 첫 번째 부분을 나타낸다. 상부 힌지 영역의 예는 표 0.1에서 찾아볼 수 있다. 상기 상부 힌지는 상기 scFv의 말단으로부터 표 0.1에 나타낸 바와 같은 코어 힌지 내의 첫 번째 시스테인 잔기에 이르기까지의 아미노산을 포함하지만, 상기 첫 번째 시스테인 잔기를 포함하지 않는다. 상기와 같이, "유효 상부 힌지"란 용어는 상기 절편이 상부 힌지로서 기능을 하도록 하기 위해 상기 서열이 충분한 양으로 존재한다는 것을 의미하며, 이때 상기 용어는 상기 지정된 힌지 절편의 작용성 변이체 및 단편들을 포함한다.
"코어 힌지"란 용어는 상기 상부 힌지에 대해 C-말단에 있는 힌지 영역의 두 번째 부분을 나타낸다. 코어 힌지 영역의 예는 표 0.1에서 찾아볼 수 있다. 상기 코어 힌지는 사슬간 이황화 브릿지(inter chain disulfide bridge) 및 높은 함량의 프롤린을 함유한다. 상기와 같이, "유효 코어 힌지"란 용어는 상기 절편이 코어 힌지로서 기능을 하도록 하기 위해 상기 서열이 충분한 양으로 존재한다는 것을 의미하며, 이때 상기 용어는 상기 지정된 힌지 절편의 작용성 변이체 및 단편들을 포함한다.
"하부 힌지"란 용어는 상기 코어 힌지에 대해 C-말단에 있는 힌지 영역의 제 3의 부분을 나타낸다. 하부 힌지 영역의 예는 표 0.1에서 찾아볼 수 있다. 미니바디 또는 항체 단편의 문맥에서, 상기 하부 힌지는 CH3 도메인 Mb에 결합된다. 상기와 같이, "유효 하부 힌지"란 용어는 상기 절편이 하부 힌지로서 기능을 하도록 하기 위해 상기 서열이 충분한 양으로 존재한다는 것을 의미하며, 이때 상기 용어는 상기 지정된 힌지 절편의 작용성 변이체 및 단편들을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "하부 힌지"란 용어는 본원에서 제공된 자연적으로 발생하는 IgG 하부 힌지 서열 및 인공적인 연장 서열(서로에 대해 대신함) 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 아미노산 서열들을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 다양한 연장은 그 전체 또는 교체부분에서 하부 힌지 영역인 것으로 고려될 수 있다.
병태의 "치료하기" 또는 "치료"란 용어는 상기 병태의 예방, 상기 병태의 발병 및/또는 진행율의 감속, 상기 병태의 발병 위험성의 감소, 상기 병태와 연관된 증상의 발병의 예방 및/또는 지연, 상기 병태와 연관된 증상의 감소 또는 종식, 상기 병태의 완전 또는 부분적인 퇴행의 발생 또는 이들의 몇몇 조합을 지칭할 수 있다. "예방"이란 용어는 질환 또는 질병의 절대적인 금지를 요구하지 않는다.
"치료학적 유효량" 또는 "치료학적 유효 투여량"은 표적 병태를 예방하고 치료하기, 질환 및/또는 증상의 발병을 연기하기, 및/또는 상기 병태와 연관된 증상들을 완화하기와 같이 개체에서 목적하는 치료 효과를 발휘하는 양이다. 이러한 양은 치료용 화합물의 특성(활성, 약동학, 약역학 및 생체 이용 가능성을 포함함), 개체의 생리학적 조건(나이, 성별, 질병의 유형 및 단계, 전신 상태, 주어진 투여량에 대한 반응성 및 투약 유형을 포함함), 제형 내 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 담체들의 본성 및/또는 투여 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 인자에 따라 다를 것이다. 임상 및 약학 분야에서의 숙련자라면, 예를 들어 본 발명의 개시내용을 고려할 때, 예를 들어 화합물의 투여에 대한 개체의 반응을 모니터링하고 이에 따라 투여량을 조절함으로써 통상의 실험을 통해 치료학적 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 부가적인 지침을 위해 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st Edition, Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005]을 참고한다.
"항원 결합 구조체"란 용어는 매우 다양한 항체(이의 결합 단편들을 포함함)를 포함한다. 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 및/또는 6개의 CDR을 포함하는 구조체들이 더 포함된다. 몇몇 실시형태에서, 탠덤(tandem) scFv가 제공될 수 있으며, 이때 상기 탠덤 scFv는 2개의 암(arm)에 2가 결합을 제공할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이들 CDR은 통상의 항체에서 이들의 적절한 골격 영역 사이에 분포할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 CDR은 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 내에 포함될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 CDR은 중쇄 및/또는 경쇄 내에 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 CDR은 단일 펩티드 사슬 내에 있을 수 있다. 본원에서 달리 언급하지 않는 한, 본원에 개시된 항원 결합 구조체들은 상술한 표적 분자에 결합한다. "표적" 또는 "표적 분자"란 용어는 항원 결합 구조체가 결합하는 단백질을 나타낸다. 표적 단백질의 예는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 PSMA(예를 들어, FOLH1)(도 70; 서열번호 131), PSCA(도 71; 서열번호 132), 5T4(예를 들어, TPBG)(도 72; 서열번호 133), CD8(예를 들어, α 사슬)(도 73; 서열번호 134), CD8(예를 들어, β 사슬)(도 74; 서열번호 135), CD3(예를 들어, δ 사슬)(도 75; 서열번호 136), CD3(예를 들어, γ 사슬)(도 76; 서열번호 137), CD3(예를 들어, ε 사슬)(도 77; 서열번호 138), CD3(예를 들어, ζ 사슬)(도 78; 서열번호 139)을 들 수 있다.
"항체"란 용어는 인트라바디(intrabody), 키메라 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체, 항체 단편, scFv 및 이형 접합 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체, 다이바디(diabody), 트리바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 등)와 같이 면역 글로불린의 유전적으로 조작되거나 그렇지 않는 경우에 개질된 형태를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "항체"란 용어는 scFv 및 미니바디를 포함한다. 따라서 "항체"와 관련하여 본원에서 제공된 실시형태 각각 및 이들 모두는 달리 명백하게 언급하지 않는 한 scFv 및/또는 미니바디의 실시형태로서 구현된다. "항체"란 용어는 면역 글로불린 패밀리(family)의 폴리펩티드 또는 상응하는 항원과 비공유적 및 가역적으로 결합하고 특정 방식으로 결합할 수 있는 면역 글로불린의 단편들을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 전장 항체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성될 수 있으며, 각각의 쌍은 1개의 "경쇄" 및 1개의 "중쇄"(이황화 결합을 통해 결합됨)를 갖는다. 상기 알려진 면역 글로불린 유전자들은 매우 다양한 면역 글로불린 가변 영역 유전자들뿐만 아니라 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 힌지 및 뮤(mu) 불변 영역 유전자들을 포함한다. 전장 사슬에 있어서, 경쇄는 카파 및 람다 중 하나로 분류된다. 전장 사슬에 있어서, 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되며, 이어 이는 각각 면역 글로불린 부류인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 한정한다. 각각 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식에 책임이 있는 약 100개 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산으로 이루어진 가변 영역을 한정한다. 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)란 용어들은 각각 이들 경쇄 및 중쇄의 영역을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "항체"는 매우 다양한 항체 및 이들의 단편을 포함한다. 따라서 전장 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일 사슬 항체(scFv), Fab, Fab', 및 동일한 결합 특이성을 갖는 이들 단편의 다중 결합 버전(multimeric version; 예를 들어, F(ab')2)이 이러한 개념의 범주 내에 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 목적하는 표적에 특이적으로 결합한다.
"상보성 결정 도메인" 또는 "상보성 결정 영역("CDR")"이란 용어는 VL 및 VH의초가변 영역들을 상호 교환 가능하게 지칭한다. 상기 CDR은 이 같은 표적 분자에 대한 특이성을 갖는 항체 사슬들의 표적 분자 결합 부위이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 가변 도메인의 약 15 내지 20%를 구성하는 VL 및/또는 VH 각각에는 3개의 CDR(CDR1 내지 CDR3; N-말단으로부터 연속적으로 넘버링됨)이 존재한다. 상기 CDR은 상기 표적 분자의 에피토프(epitope)에 대해 구조적으로 상보적이며, 따라서 결합 특이성에 직접적으로 책임이 있다. 상기 VL 또는 VH의의 나머지 영역, 소위 골격 영역(FR)은 보다 적은 아미노산 서열에서의 변이를 나타낸다(문헌[Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., NewYork, 2000]).
상기 CDR 및 골격 영역의 위치는 당해 기술분야에 널리 공지된 다양한 정의, 예를 들어 카바트(Kabat)(문헌[Wu, T. T. 등, "An analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity," J. Exp. Med., Vol. 132, No. 2, pp. 211-250, 1970]; 문헌[Kabat, E. A. 등, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed., NIH Publication No. 91??3242, Bethesda, MD, 1991], 문헌[Chothia C. 등, "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins," J. Mol. Biol., Vol. 196, No. 4, pp. 901-917, 1987]; 문헌[Chothia C. 등, "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions," Nature, Vol. 342, No. 6252, pp. 877-883, 1989]; 문헌[Chothia C. 등, "Structural repertoire of the human VH segments," J. Mol. Biol., Vol. 227, No. 3, pp. 799-817, 1992]; 문헌[Al-Lazikani B. 등, "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins," J. Mol. Biol., Vol. 273, No. 4, pp. 927-748, 1997]), 이뮤노제네틱스(ImMunoGeneTics) 데이터베이스(IMGT)(www.imgt.org/상)(문헌[Giudicelli, V. 등, "IMGT/LIGM-DB, the IMGTㄾ comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences," Nucleic Acids Res., Vol. 34 (Database Issue), pp. D781-D784, 2006]; 문헌[Lefranc, M. P. 등, "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev. Comp. Immunol., Vol. 27, No. 1, pp. 55-77, 2003]; 문헌[Brochet, X. 등, "IMGT/V-QUEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis," Nucleic Acids Res., Vol. 36 (Web Server Issue), pp. W503-508, 2008]; AbM(문헌[Martin, A. C. 등, "Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm,"Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 86, No. 23, pp. 9268-9272, 1989]); 접촉 정의(contact definition)(문헌[MacCallum, R. M. 등, "Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol., Vol. 262, No. 5, pp. 732-745, 1996]), 및/또는 자동 모델링 및 분석 도구(Honegger, A. 등, www/bioc.uzh.ch/plueckthun/antibody/Numbering/상에서 접속 가능함)를 이용하여 결정될 수 있다.
"결합 특이성 결정인자" 또는 "BSD"란 용어는 항체의 결합 특이성을 결정하기 위해 필요한 상보성 결정 영역 내의 최소의 인접하거나 인접하지 않은 아미노산 서열을 상호 교환 가능하게 지칭한다. 최소의 결합 특이성 결정인자는 하나 이상의 CDR 서열 내에 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 최소의 결합 특이성 결정인자들은 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR3 서열의 일부분 또는 전체(즉, 이들에 의해서만 결정됨) 내에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 중쇄 가변 영역의 CDR3은 항원 결합 구조체 특이성을 위해 충분하다.
본원에서 사용된 바와 같은 "항체 가변 경쇄" 또는 "항체 가변 중쇄"는 VL 또는 VH 각각을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 내생성 VL은 유전자 분절인 V(가변) 및 J(접합)에 의해 암호화되고, 내생성 VH는 V, D(다양성) 및 J에 의해 암호화된다. VL 또는 VH 각각은 골격 영역뿐만 아니라 CDR을 포함한다. 본 명세서에서, 항체 가변 경쇄 및/또는 항체 가변 중쇄는 때때로 총괄하여 "항체 사슬"로 지칭될 수 있다. 이들 용어들은 당해 기술분야의 숙련자가 용이하게 인지하는 바와 같이 VL 또는 VH의 기본 구조를 파괴하지 않는 돌연 변이를 함유한 항체 사슬들을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 전장 중쇄 및/또는 경쇄가 고려된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역만이 존재하는 것으로 고려된다.
항체는 온전한 면역 글로불린으로서 존재할 수 있거나 다양한 펩티다아제에 의한 분해(digestion)에 의해 생성된 다수의 단편으로서 존재할 수 있다. 따라서, 예를 들어 펩신은 힌지 영역 내의 이황화 연결 하부에서 항체를 분해하여 F(ab)'2를 생성하며, 이때 상기 F(ab)'2는 그 자체가 이황화 결합에 의해 VH-CH1에 접합된 경쇄(VL-CL)인 Fab'의 이량체이다. 상기 F(ab)'2는 상기 힌지 영역 내의 이황화 연결을 파괴하기 위한 온화한 조건 하에서 환원될 수 있으며, 그 결과 F(ab)'2 이량체는 Fab' 단량체로 변환된다. 상기 Fab' 단량체는 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab이다(문헌[Paul, W. E., "Fundamental Immunology," 3d Ed., New York: Raven Press, 1993]). 다양한 항체 단편들이 온전한 항체의 분해와 관련하여 정의될지라도 숙련자라면 이 같은 단편들이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 신생 합성될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서 본원에서 사용된 바와 같은 "항체"이란 용어는 또한 항체 전체의 개질에 의해 생성된 항체 단편들을 포함하거나, 재조합 DNA 방법론을 이용하여 신생 합성된 항체 단편(예를 들어, 단일 사슬 Fv) 또는 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library)를 이용하여 확인된 항체 단편을 포함한다(예를 들어, 문헌{McCafferty, J. 등, "Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains," Nature, Vol. 348, No. 66301, pp. 552-554, 1990] 참조).
단클론성 또는 다클론성 항체의 제조를 위해, 당해 기술분야에 공지된 임의의 기법이 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kohler, G. 등, "Continuous cultures of fused cells secreting antigen of predefined specificity," Nature, Vol. 256, No. 5517, pp. 495-497, 1975]; 문헌[Kozbor, D. 등, "The production of monoclonal antibodies from human lymphocytes," Immunology Today, Vol. 4, No. 3, pp. 72-79, 1983]; 문헌[Cole, 등, "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy," Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985]; 문헌[Wang, S., "Advances in the production of human monoclonal antibodies," Antibody Technology Journal, Vol. 1, pp. 1-4, 2011]; 문헌[Sharon, J. 등, "Recombinant polyclonal antibodies for cancer therapy," J. Cell Biochem., Vol. 96, No. 2, pp. 305-313, 2005]; 문헌[Haurum, J. S., "Recombinant polyclonal antibodies: the next generation of antibody therapeutics?," Drug Discov. Today, Vol. 11, No. 13-14, pp. 655-660, 2006] 참조). 단일 사슬 항체의 제조를 위한 기법(미국 특허 제 4,946,778 호)들은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체를 생성하기 위해 조정될 수 있다. 또한 형질전환 마우스, 또는 기타 포유동물들과 같은 기타 유기체들은 완전 인간 단클론성 항체를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로는, 파지 디스플레이 기술은 선택된 항원에 대한 고친화도 결합체를 확인하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[McCafferty 등, 상기와 동일]; 문헌[Marks, J. D. 등, "By-passing immunization: building high affinity human antibodies by chain shuffling," Biotechnology (N. Y.), Vol. 10, No. 7, pp. 779-783, 1992] 참조).
비인간 항체를 인간화하거나 영장류화(primatization)하기 위한 방법들이 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간인 공급원으로부터 그 내부로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기들은 종종 외래 잔기(import residue)로서 지칭되며, 상기 외래 잔기는 전형적으로 외래 가변 도메인으로부터 인출된다. 몇몇 실시형태에서, "도너(donor)" 및 "수용체(acceptor)" 서열이란 용어들이 사용될 수 있다. 인간화는 본질적으로는 인간 항체의 상응하는 서열을 대신하여 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 치환함으로써 윈터(Winter)와 그 동료들에 의한 상기 방법에 따라 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Jones, P. T. 등, "Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse," Nature, Vol. 321, No. 6069, pp. 522-525, 1986]; 문헌[Riechmann, L. 등, "Reshaping human antibodies for therapy," Nature, Vol. 332, No. 6162, pp. 323-327, 1988]; 문헌[Verhoeyen, M. 등, "Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity," Science, Vol. 239, No. 4847, pp. 1534-1536, 1988]; 문헌[Presta, L. G., "Antibody engineering,", Curr. Op. Struct. Biol., Vol. 2, No. 4, pp. 593-596, 1992] 참조). 따라서 이 같은 인간화 항체들은 키메라 항체(미국 특허 제 4,816,567)이며, 여기서 실질적으로 보다 적은 온전한 인간 가변 도메인이 비인간 종에서 유래한 상응하는 서열에 의해 치환된다. 실제로는, 인간화 항체는 전형적으로는 몇몇 상보성 결정 영역("CDR") 잔기 및 가능하게는 몇몇 골격("FR") 잔기들이 설치류 항체 내 유사한 부위에서 유래한 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
"키메라 항체"는, (a) 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이하거나 변경된 부류, 작동자(effector) 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 상기 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자 및 약물에 연결되도록 불변 영역 또는 이의 일부분이 변경, 교체 또는 교환된 항체 분자; 또는 (b) 가변 영역 또는 이의 일부분이 상이하거나 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역에 의해 변경, 교체 또는 교환된 항체 분자이다.
항체는 기타 단백질과의 융합 단백질에 화학적으로 접합되어 있거나 상기 융합 단백질로서 발현되는 하나 이상의 면역 글로불린 사슬을 더 포함한다. 이는 또한 이중 특이성 항체를 포함한다. 이중 특이성 또는 이작용성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공적인 하이브리드 항체이다.
본 발명의 기타 항원 결합 단편 또는 항체 부분들은 이중 특이성 scFv 항체를 포함하며, 여기서 항체 분자는 2개의 상이한 에피토프, 단일 결합 도메인(sdAb 또는 나노바디(nanobody)) 및 미니바디를 인식한다.
"항체 단편"이란 용어는 항체의 하나 이상의 항원 결합 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이때 상기 항체는 단독 또는 Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rlgG(환원된 IgG), scFv 단편, 단일 도메인 단편(나노바디), 펩티바디(peptibody), 미니바디를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기타 분자들과 함께 포함된다. "scFv"란 용어는 통상 2개의 사슬 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들이 연결되어 하나의 사슬을 형성하는 단일 사슬 Fv("단편 가변") 항체를 지칭한다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물, 또는 당해 화합물을 하나의 조직, 기관 또는 신체의 일부분으로부터 다른 조직, 기관 또는 신체의 일부분으로 이송하거나 전달하는 것과 관련이 있는 비히클(vehicle)일 수 있다. 예를 들어, 상기 담체는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매, 봉지재 또는 이들의 몇몇 조합일 수 있다. 상기 담체의 구성성분 각각은 제형의 기타 성분들과 양립할 수 있도록 "약학적으로 허용 가능"하다. 이는 또한 상기 구성성분이 우연히 접할 수 있는 임의의 조직, 기관 또는 신체의 일부분과의 접촉에 적합해야 하며, 이는 상기 구성성분이 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성, 또는 이의 치료학적 이점을 지나치게 능가하는 임의의 기타 조합의 위험성을 갖지 않는다는 것을 의미한다. 본원에 개시된 약학 조성물들은 임의의 적합한 투여 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 당해 기술분야에 공지된 임의의 투여 경로를 지칭할 수 있으며, 이때 상기 투여 경로는 에어로졸, 장관, 비강, 안구, 경구, 비경구, 직장, 경피(예를 들어, 국소용 크림 또는 연고, 패치), 또는 질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "경피" 투여는 국소용 크림 또는 연고를 사용하거나 경피 패치에 의해 달성될 수 있다. "비경구"는 일반적으로 주사와 연관된 투여 경로를 지칭하며, 이때 상기 투여 경로로는 안와하(infraorbital), 주입, 동맥 내, 낭 내, 심장 내, 진피 내, 근육 내, 복강 내, 폐 내, 척수 내, 흉골 내, 척수강 내, 자궁 내, 정맥 내, 지주막하(subarachnoid), 피막하(subcapsular), 피하, 경점막(transmucosal) 또는 경기관(transtracheal)을 들 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 중재시술 또는 절제 도중에 국부 투여로서 외과적 수술에 의해 전달될 수 있다.
"표적 분자 의존 질환" 또는 "표적 분자 연관 질환"이란 용어는 상기 표적 분자가 질환 그 자체에서 역할을 하는 임의의 질환을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 이는 상기 표적 분자의 과발현을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 상기 질환으로는 본원에서 토의된 임의의 질환들을 들 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 질환은 결합에 의해 표적화될 수 있는 표적 분자가 존재하는 임의의 질환일 수 있으며, 이러한 결합은 상기 질환의 검출 및/또는 치료를 초래할 것이다. 상기 표적 분자는, 예를 들어 CD8, CD3, 5T4, PSMA 및/또는 PSCA일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
미니바디는 항원에 대한 2가 결합 특성을 유지하면서 전장 항체보다 작은 분자량을 갖는 항체 포맷(antibody format)이다. 이의 보다 작은 크기, Fc-감마 및 FcRN 수용체를 결합시키는 CH2 도메인의 부재, 글리코실화의 부재로 인해, 상기 미니바디는 종양 조직을 표적화하는 경우에 상기 시스템으로부터의 보다 신속한 제거 및 잠재적으로 증강된 침투를 나타낸다. 강력한 표적화 능력이 신속한 제거와 결합되는 경우, 상기 미니바디는 진단용 이미징 및 방사성 탑재물(payload)의 전달에 유리하며, 이로 인해 순환 시간의 연장이 환자 투약 및 투약 측정(dosimetry)에서의 어려움을 초래할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이는 또한 종양 침투 및 보다 신속한 제거와 같은 상술한 특징으로 인해 세포 독성 탑재물의 전달에 유리할 수도 있다. 본원에 개시된 "미니바디"는 동종 이량체를 포함하며, 여기서 단량체 각각은 힌지 서열에 의해 인간 IgG CH3 도메인에 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)이다. 몇몇 실시형태에서, 미니바디는 80kDa의 2가 또는 이중 특이성의 공유 결합된 동종 이량체이다. 몇몇 실시형태에서, 단량체(반분자) 각각은 대략 15개 내지 18개의 아미노산으로 이루어진 Gly-Ser-풍부 링커 서열에 의해 상응하는 가변 경쇄(VL) 도메인에 연결된 가변 중쇄(VH)로 구성되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 단일 사슬 가변 단편(scFv) 각각은 힌지 서열에 의해 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 CH3 도메인에 연결되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 하부 힌지/연장 서열은 천연 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하부 힌지, 및/또는 (G3)Sn 또는 (G4)Sn(n은 S의 임의의 개수일 수 있고; 몇몇 실시형태에서 이는 1 또는 2임)일 수 있고/있거나 하부 힌지가 아닐 수도 있고/있거나, 아미노산(G 및 S이어서는 안됨)의 임의의 조합일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 하부 힌지/연장 서열은 GGGSSGGGSG(서열번호 59)를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 링커는 기능을 나타내는 임의의 링커일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 링커 서열은 (G3)Sn 또는 (G4)Sn(n은 S의 임의의 개수일 수 있고; 몇몇 실시형태에서 이는 1 또는 2임)인 모티프를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 링커는 GSTSGGGSGGGSGGGGSS(서열번호 62)를 포함할 수 있다.
항체 또는 항체-유래 결합제에 대한 항원, 예를 들어 단백질과의 상호작용을 설명하는 문맥에서 사용되는 경우에 "특이적으로(또는 선택적으로) 결합하기"란 용어는 단백질 및 기타 생물제제의 이종성 개체에서의 항원의 존재, 예를 들어 생물 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 또는 조직 시료에서의 항원의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서 몇몇 실시형태에서 지정된 면역 검정 조건 하에 특정한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 결합제들은 배경에 비해 적어도 2배 정도 특정 항원에 결합하고, 상기 시료에 존재하는 기타 항원에 대해 실질적으로는 유의한 양으로 결합하지 않는다. 이 같은 조건 하에 항체 또는 결합제에 대한 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 이의 특이성으로 인해 선택되어야 하는 상기 항체 또는 결합제를 필요로 할 수 있다. 다양한 면역 검정 포맷은 특정 단백질과 특이적으로 면역 반응하는 항체를 선별하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역 검정은 단백질과 특이적으로 면역 반응하는 항체를 선별하기 위해 통상 사용된다(예를 들어, 특이적 면역 반응성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 면역 검정 포맷 및 조건의 설명을 위해 문헌{Harlow, E. & Lane D., "Using Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998} 참고). 전형적으로는, 특이적 또는 선택적 결합 반응은 배경 신호에 대해 적어도 2배, 보다 전형적으로는 상기 배경에 대해 적어도 10배 내지 100배 이상으로 신호를 생성할 것이다.
"평행 해리 상수(KD, M)"란 용어는 결합 속도 상수(ka, 시간-1M-1)로 나눈 해리 속도 상수(kd, 시간-1)를 지칭한다. 평행 해리 상수는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 본 발명의 항체는 일반적으로는 약 10-7 또는 10-8M 미만, 예를 들어 약 10-9M 또는 10-10M 미만의 평행 해리 상수를 가질 것이며, 몇몇 실시형태에서 약 10-11M, 10-12M 또는 10-13M 미만의 평행 해리 상수를 가질 것이다.
핵산 또는 단백질에 적용하는 경우에 "단리된"이란 용어는 천연 상태에서 핵산 또는 단백질이 결합하는 기타 세포성 구성성분이 상기 핵산 또는 단백질에는 본질적으로 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 이는 건조 용액이거나 수용액 일 수 있다. 순도 및 동종성은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기법들을 이용하여 결정될 수 있다. 제제 내에 존재하는 우점종인 단백질이 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 유전자는 상기 유전자 옆에 있고 당해 유전자가 아닌 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 분리된다. "정제된"이란 용어는 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에 본질적으로 하나의 밴드를 생성한다는 것을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 이는 상기 핵산 또는 단백질은 생체 내(in vivo) 조건 하에 존재하는 분자의 경우에 적어도 85% 순수하고, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수하고, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수하다는 것을 의미할 수 있다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"란 용어는 단일 가닥 형태이거나 이중 가닥 형태인 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이의 중합체를 지칭한다. 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는 기준 핵산으로서 유사한 결합 특성을 갖고 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사 작용하는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 표시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 상기 명백히 나타낸 서열뿐만 아니라 이의 보존적으로 개질된 변이체(예를 들어, 동의 코돈 치환(degenerate codon substitution)), 대립 유전자, 오솔로그(ortholog), SNP 및 상보성 서열을 내재적으로 포함한다. 특히, 동의 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 구현될 수 있다(문헌[Batzer, M. A. 등, "Enhanced evolutionary PCR using oligonucleotides with inosine at the 3'-terminus," Nucleic Acid Res., Vol. 19, No. 18, pp. 5081, 1991]; 문헌[Ohtsuka, E. 등, "An alternative approach to deoxyoligonucleotides as hybridization probes by insertion of deoxyinosine at ambiguous codon positions," J. Biol. Chem., Vol. 260, No. 5, pp. 2605-2608, 1985]; 문헌[Rossolini, G. M. 등, "Use of deoxyinosine-containing primers vs degenerate primers for polymerase chain reaction based on ambiguous sequence information," Mol. Cell. Probes, Vol. 8, No. 2, pp. 91-98, 1994])
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 상기 용어는 자연적으로 발생하는 아미노산 중합체 및 비자연적으로 발생하는 아미노산 중합체들에 적용될 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인공적인 화학 모방체인 아미노산 중합체에 적용된다.
"아미노산"이란 용어는 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능을 하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 아미노산 및 합성 아미노산을 지칭한다. 자연적으로 발생하는 아미노산으로는 추후에 개질되는 이들 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린뿐만 아니라, 유전자 코드에 의해 암호화된 아미노산이 있다. 아미노산 유사체는 자연적으로 발생하는 아미노산, 예를 들어 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R 기에 결합된 알파-탄소, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌설폭시드, 메티오닌메틸설포늄과 동일한 기본적인 화학 구조를 갖는 화합물을 지칭한다. 이 같은 유사체는 개질된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 개질된 펩티드 백본(backbone)을 갖지만 자연적으로 발생하는 아미노산과 동일한 기본적인 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 상이한 구조를 갖지만 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능을 하는 화학적 화합물을 지칭한다.
"보존적으로 개질된 변이체"란 용어는 아미노산 및 핵산 서열 둘 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 개질된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 이들 핵산을 지칭하거나, 상기 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우에 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 상기 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해, 대다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들어, GCA, GCC, GCG 및 GCU 코돈 모두는 알라닌이란 아미노산을 암호화한다. 따라서 코돈에 의해 알라닌이 지정되는 모든 위치에서 상기 코돈은 상기 암호화된 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 개시된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이 같은 핵산 변이는 "침묵 변이"이며, 이는 보존적으로 개질된 하나의 변이종이다. 폴리펩티드를 암호화하는 본원에 개시된 모든 핵산 서열은 또한 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 설명한다. 숙련자라면 핵산 내의 코돈 각각(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG 및 보통 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG은 제외함)은 기능적으로 동일한 분자를 수득하기 위해 개질될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 침묵 변이 각각은 상술한 서열 각각에 내포되어 있다.
아미노산 서열에 관련하여, 숙련자라면 상기 암호화된 서열 내의 단일 아미노산 또는 낮은 비율(%)의 아미노산들을 변경, 부가 또는 결실하는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 개질된 변이체"이며, 여기서 상기 변이가 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 초래한다는 것을 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표가 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이 같은 보존적으로 개질된 변이체들은 본 발명의 다형성 변이체, 종간 동종체 및 대립 유전자에 추가된 것이고, 이들을 제외하지 않는다.
하기 8개의 그룹 각각은 서로에 대해 보존적으로 치환된 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이노류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들어, 문헌[Creighton, T. E., "Proteins - Structures and Molecular Properties," W. H. Freeman & Co. Ltd., 1984] 참조).
"서열 동일성의 비율(%)"이란 용어는 비교창 위에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정될 수 있으며, 여기서 상기 비교창 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부분은 상기 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 부가 또는 결실을 포함하지 않는 참고 서열(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드)과 비교할 때 부가 또는 결실(즉, 간극)을 포함할 수 있다. 상기 비율(%)은 매칭된 위치의 개수를 산출하기 위해 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 상기 서열 둘 모두에서 나타나는 위치의 개수를 결정하고, 상기 매칭된 위치의 개수를 비교창 내의 전체 위치의 개수로 나누고, 서열 동일성의 비율(%)을 산출하기 위해 상기 결과를 100으로 곱함으로써 산정된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 "동일한" 또는 "동일성" 비율이란 용어는은 동일한 서열인 2개 이상의 서열 또는 부분 서열을 지칭한다. 2개의 서열이 소정의 비율(%)의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는 경우에 상기 2개의 서열은 "실질적으로 동일"하며, 이때 상기 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드는 하기 서열 비교 알고리즘들 중 하나를 이용하여 측정하거나 수동 정렬 및 시각 검사에 의해 측정할 때 비교창 상의 최대 상응성(maximum correspondence)을 위해 비교하고 정렬하거나 지정된 영역에 대해 비교하고 정렬하는 경우에 동일(예를 들어, 소정의 영역, 또는 지정되지 않는 경우에 참고 서열의 서열 전체에 대한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성)하다. 본원에서 제공된 몇몇 실시형태는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 이때 상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 본원에서 각각 예시된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 표 0.1, 표 0.2, 표 1, 표 2 또는 표 3 및 도 5b 내지 도 5e, 도 7c, 도 7d, 도 14b, 도 15b, 도 16b 내지 도 16d, 도 20c 내지 도 20g, 도 21b 내지 도 21e, 도 22b, 도 28b 내지 도 28e, 도 29b 내지 도 29d, 도 32, 도 33, 도 35a 내지 도 35c, 도 36a 내지 도 36e, 도 40 내지 도 69, 도 79 및 도 80 중 임의의 하나에 예시된 가변 영역들 중 임의의 하나 이상, 및 도 7e, 도 34a 내지 도 34f, 도 41 내지 도 46, 도 48 내지 도 53, 도 55 내지 59, 도 61 내지 64, 도 65a, 도 65b 및 도 65c 중 임의의 하나에 예시된 핵산 서열들 중 임의의 하나 이상)와 실질적으로 동일하다. 임의적으로는, 적어도 약 15개, 25개 또는 50개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 보다 바람직하게는 100개 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 영역에 대해 동일성이 존재하거나, 상기 참고 서열의 전장에 대해 동일성이 존재한다. 아미노산 서열들과 관련하여, 적어도 5개, 10개, 15개 또는 20개의 아미노산의 길이, 임의적으로는 적어도 약 25개, 30개, 35개, 40개, 50개, 75개 또는 100개의 아미노산의 길이, 또는 임의적으로는 적어도 약 150개, 200개 또는 250개의 아미노산의 길이를 갖는 영역에 대해 동일성 또는 실질적인 동일성이 존재할 수 있거나, 상기 참고 서열의 전장에 대해 동일성 또는 실질적인 동일성이 존재할 수 있다. 보다 짧은 아미노산 서열, 예를 들어 20개 이하의 아미노산을 갖는 아미노산 서열들과 관련하여, 몇몇 실시형태에서 하나 또는 2개의 아미노산 잔기가 본원에서 개시된 보존적 치환에 의해 보존적으로 치환되는 경우에 실질적인 동일성이 존재한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 동일성 비율은 본원에 언급된 힌지 영역(상부, 코어, 및 하부 힌지 영역들과 동일한 힌지 영역 및/또는 이의 서브파트들)을 초과한다. 이 같은 상황에서, 상기 힌지 영역 또는 이의 서브파트의 동일성 비율은 상기 단백질 또는 핵산 서열의 나머지로부터 개별적으로 확인될 수 있다. 따라서 2개의 힌지 영역(또는 상부, 코어 및/또는 하부 영역)은 상기 단백질의 나머지가 비교 단백질에 대해 100% 동일하게 유지하거나 또한 상기 단백질의 나머지가 소정의 동일성 비율로 또한 변이를 갖도록 하면서 동일(예를 들어, 소정의 영역, 또는 지정되지 않는 경우에 참고 서열의 서열 전체에 대한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성)한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드들의 소정의 비율을 가질 수 있다.
서열의 비교를 위해, 전형적으로는 하나의 서열은 참고 서열로서 작용하며, 이때 상기 참고 서열과 시험 서열들을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 시험 및 참고 서열들은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우 부분 서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수들이 지정된다. 디폴트(default) 프로그램 매개변수들이 사용될 수 있거나, 대안적인 매개변수들이 지정될 수 있다. 이어 상기 서열 비교 알고리즘은 상기 프로그램 매개변수들에 기초하여 참고 서열 대비 시험 서열들에 대한 서열 동일성 비율을 산정한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비교창"은 20개 내지 600개, 일반적으로는 약 50개 내지 약 200개, 보다 일반적으로는 약 100개 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 인접한 위치들의 개수 중 임의의 하나를 갖는 분절에 대한 참고를 포함하며, 이러한 위치에서 2개의 서열이 최적으로 정렬된 이후에 하나의 서열은 인접한 위치의 동일한 개수의 참고 서열과 비교된다. 비교용 서열들을 정렬하는 방법이 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 비교용 서열들에 대한 최적의 정렬은, 예를 들어 스미스(Smith) 및 워터먼(Waterman)의 국부 상동성 알고리즘(문헌[Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]), 니들만(Needleman, S. B.) 등의 상동성 정렬 알고리즘(문헌[Needleman, S. B. 등, "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins," J. Mol. Biol., Vol. 48, No. 3, pp. 443-453, 1970]), 피어슨(Pearson, W. R.) 등의 유사성 방법(문헌[Pearson, W. R. 등, "Improved tools for biological sequence comparison," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 85, No. 8, pp. 2444-2448, 1988])의 검색, 이들 알고리즘(위스콘신 주 매디슨, 575 사이언스 디알 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)의 전산화 실행, 또는 수동 정렬 및 시각 검사(예를 들어, 문헌[Ausubel, F. M. 등, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement, 1995] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 비율을 결정하기에 적합한 알고리즘의 2개의 예로는 문헌[Altschul, S. F. 등, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," Nucleic Acids Res., Vol. 25, No. 17, pp. 3389-3402, 1977] 및 문헌]Altschul, S. F. 등, "Basic local alignment search tool," J. Mol. Biol., Vol. 215, No. 3, pp. 403-410, 1990]에 각각 개시되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저 질의 서열(query sequence) 내의 길이(W)의 약어를 확인함으로써 고득점 서열 쌍(HSP)을 확인하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 질의 서열은 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어로 정렬되는 경우에 몇몇 양의 값의 임계값 점수(T)와 일치하거나 이를 만족시킨다. T는 인근 단어 점수 임계값(neighborhood word score threshold)으로 지칭된다(Altschul, S. F. 등 상기와 동일 참조). 이들 초기 인근 단어 히트(word hit)들은 이들을 포함하는 보다 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하는 시드(seed)로 작용한다. 단어 히트는 누적 정렬 점수(cumulative alignment score)가 증가할 수 있는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대한 매개변수(M)(매칭 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 0 초과) 및 매개변수(N)(미스매칭 잔기에 대한 벌칙 점수; 항상 0 미만)를 이용하여 산정된다. 아미노산 서열에 있어서, 점수 행렬(scoring matrix)은 누적 점수를 산정하기 위해 사용된다. 각 방향에서 단어 히트의 연장은 하기와 같은 경우에 중단된다: 상기 누적 정렬 점수가 이의 최대 성취값으로부터 X의 양만큼 떨어질 때: 상기 누적 점수가 하나 이상의 음성 점수 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하까지 떨어져 있을 때; 또는 각 서열의 말단에 도달할 때. BLAST 알고리즘 매개변수(W, T 및 X)는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 11의 단어길이(W), 기대치(E) 또는 10, M = 5, N = 4 및 양 가닥의 비교치를 사용한다. 아미노산 서열에 있어서, 상기 BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어 길이 및 10의 기대치(E)를 이용하고, 50의 BLOSUM62 점수 행렬(문헌[Henikoff, S. 등, "Amino acid substitution matrices from protein blocks," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 89, No. 22, pp. 10915-10919, 1992] 참고) 정렬(B), 10의 기대치(E), M = 5, N = 4 및 양 가닥의 비교치를 사용한다.
상기 BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin, S. 등, "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 90, No. 12, pp. 5873-5787, 1993] 참고). 상기 BLAST 알고리즘에 의해 제공된 하나의 유사성 척도는 최소 합계 확률(P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 짝이 우연히 나타날 수 있는 가능성의 지표를 제공한다. 예를 들어, 기준 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 핵산은 참고 서열과 유사한 것으로 고려된다.
2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 지표는, 후술한 바와 같이 첫 번째 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드가 두 번째 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드에 대한 항체와 면역학적으로 교차 반응한다는 것이다. 따라서 몇몇 실시형태에서 폴리펩티드는 전형적으로는 제 2 폴리펩티드, 예를 들어 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 다르게 되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 지표는, 후술한 바와 같이 2개의 분자 또는 이들의 보체들이 엄격한 조건 하에 서로 교배(hybridization)한다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 동일한 프라이머(primer)가 상기 서열을 증폭하기 위해 사용될 수 있다는 것이다.
"개체", "환자" 및 "개인"이란 용어는 검진 및/또는 치료 중인 실체(entity)를 상호 교환 가능하게 지칭한다. 이는, 예를 들어 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 비인간 영장류를 포함할 수 있다. 상기 포유동물은 또한 실험용 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 햄스터일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 포유동물은 농업용 포유동물(예를 들어, 말, 양, 소, 돼지, 낙타) 또는 애완용 포유동물(예를 들어, 개, 고양이)일 수 있다.
"공-투여"란 용어는 개인의 혈액 또는 시험될 시료 중의 2개의 활성제의 투여를 지칭한다. 공-투여되는 활성제들은 동시에 또는 연속적으로 전달될 수 있다.
항원 결합 구조체
힌지 영역 내의 서열들이 다양한 항원 결합 구조체들과 특별히 관련이 있을 수 있는 것으로 본원에서 인지된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 영역의 값은 미니바디 배열에서와 같이 특히 높을 수 있다. 상기 힌지 내의 서열들은 힌지 기능에 있어서 유용하지만 변경되는 경우에 다양한 결과를 초래할 수 있는 이황화 결합을 포함할 수 있다. 본원에서 개시되고 하기 실시예에서 나타낸 바와 같이, 몇몇 실시형태에서 상기 힌지 영역 서열들은 상기 단백질의 기타 영역에 존재하는 시스테인 잔기들과의 바람직하지 못한 이황화물 스크램블링(disulfide scrambling)을 방지 및/또는 감소시키고/시키거나 생체 내에서 이량체 완전성을 유지하기 위해 충분한 개수의 시스테인 쌍을 함유하도록 구성될 수 있으며, 콘카테머(concatemer)가 쌍을 이룬 시스테인들 중 하나에 대한 부위 특이적 접합을 형성하고/하거나 이를 허용하는 것을 방지할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 미니바디 이량체의 생체 내 안정성은 CH3 도메인 사이의 천연 반데르발스 결합(Van-der-Waals association), 힌지 영역 내의 이황화 결합의 형성 및/또는 VH과 VL 사이의 상호작용에 기여할 수 있다. 지금까지 대부분의 미니바디는 인간 IgG1 CH3 도메인에 연결된 연장 서열과 함께 인간 IgG1 상부 및 코어 힌지 영역을 이용하여 조작되었다. 상술한 변수 이외에도, 상기 구조체들의 배향이 이들의 특성을 변경할 수 있기 때문에 미니바디의 양쪽 배향(예를 들어, VL-VH(M1) 및 VH-VL(M2) SCFV 변이체)이 본원에서 제공되고 특성화된다(하기 실시예에 나타낸 바와 같음).
몇몇 이전의 힌지(예를 들어, huIgG1 힌지-연장 또는 γ1 EH1)는 상부 힌지 내에 천연 huIgG1을 포함하고 있었다(도 2). 카바츠에 의해 한정되고 첫 번째 원으로 표시된 바와 같이 인간 IgG1의 문맥에서 245번째 위치에 있는 이러한 시스테인은 LC/MS, SDS-PAGE 분석 및 생체 내 생물 분포 데이터에 의한 이황화 매핑(disulfide mapping)에 기초하여 미니바디 포맷에서 단백질 이종성 및 안정성 둘 모두에 대한 문제점을 유발한다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 몇몇 실시형태에서 Cys245는 세린으로 돌연 변이될 수 있으며, 그 결과 본원에 개시된 바와 같이 인공적인 힌지 또는 "EH2 힌지"를 초래할 수 있다. 따라서 가닥(하기 실시예에 나타낸 바와 같음)에서 이러한 시스테인의 제거는 힌지 영역의 개선을 초래하였다. 몇몇 실시형태에서, 상기 얻어진 구조체(힌지 영역에서 첫 번째 시스테인이 없음)는 (γ1 EH/EH2 관련하여) 2개의 나머지 이황화 브릿지와 함께 생체 내에서 미니바디 이량체의 안정성을 유지하기에 충분히 강하지 않다. 따라서, 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 개선된 구조체를 만들기 위해 가닥 당 제 3 또는 그 이상의 개수의 시스테인의 도입이 이루어질 수 있다(예를 들어, 코어 영역 내부). 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 내의 세 번째(또는 그 이상의) 시스테인(가닥 당 IgG1 천연 힌지에 대한 부가적인 시스테인)을 제공하면 이황화 결합이 증가하고 단백질 안정성이 증가한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 영역에서의 이황화 결합을 증가시킴으로서 제공된 안정성 증가는 온전한 이량체를 유지하면서 상기 시스테인들 중 하나 이상에 대한 부위 특이적 접합을 가능케 한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 IAB2M, IAB20M, IAB1M 및 IAB22M의 huIgG2 미니바디들은 huIgG2 CH3 도메인에 연결된 인간 IgG2(huIgG2) 힌지/연장 서열을 갖는다. 따라서 몇몇 실시형태에서 상기 CH3 도메인은 huIgG2 CH3 도메인일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 펩티드의 2개의 가닥 사이의 공유결합을 생성하기 위한 임의의 옵션(option)은 이황화 결합을 형성하기 위한 시스테인 대신 이용될 수 있다.
본 명세서에서, 시스테인의 도입을 인용하는 경우(달리 언급하지 않음), 이는 상기 힌지(2개의 가닥을 포함함)의 가닥 당 시스테인의 도입을 의미한다. 따라서 하나의 가닥 내의 3개, 4개, 5개 또는 6개의 시스테인은 힌지 내의 6개, 8개, 10개 또는 12개의 시스테인을 의미할 것이며, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 가능한 이황화 결합이 존재한다(물론 달리 언급하지 않는 한, 일부가 표지 및 기타 용도로 사용될 수 있기 때문에 이황화 결합의 개수는 서로 다를 수 있음).
몇몇 실시형태에서, 상기 IgG2 힌지/연장(γ2 EH1)은 집성체의 증가를 초래하며, 여기서 첫 번째 반응성 힌지 시스테인은 IAB2M-γ2 EH1 포맷에서 콘카테머의 형성에 책임이 있다. 이 같은 실시형태에서, 상기 천연 huIgG2 상부 힌지가 이용될 수 있다.
이어 상술한 양태들은 힌지 구조체의 실시형태들 중 일부에 대한 제 2 구성을 전개할 때 고려되었다. 이러한 제 2 배열에서, 상기 첫 번째 힌지 시스테인(천연 항원에서 카파 경쇄와 쌍을 이루는 시스테인)은 세린으로 돌연 변이되었으며, 그 결과 IgG2 EH2(γ2 EH2)를 초래하였다. 이러한 구조체는 잘 발현되고, 양호한 생체 내 안정성을 갖고, 원형 질량 분석에 의해 나타낸 바와 같이 적절히 형성된 3개의 이황화 결합 모두를 가지며, IAB2M 및 IAB22M 구조체 둘 모두에 의해 증명된 안정성을 가졌다(하기 실시예에서 나타낸 바와 같음). 따라서 몇몇 실시형태에서 첫 번째 시스테인이 변경되어 있는 인공적이거나 개질된 IgG2 힌지가 본원에서 제공되며, 개선된 미니바디 구조체를 제공한다.
하기 실시예에서 증명된 바와 같이, 상기 결과에 따르면 시스테인 미스페어링을 예방하기 위해 IgG1 및 IgG2 힌지의 첫 번째 시스테인을 돌연 변이시키는 것이 유리한 것으로 나타났다. 하기 실시예에서 증명된 바와 같이, 상기 결과에 따르면 단백질의 구조적 완전성을 유지하기 위해 가닥 당 코어 힌지 영역 내에 2개 이상의 시스테인 잔기를 갖는 것이 유리한 것으로 나타났다. 하기 실시예에서 증명된 바와 같이, 상기 결과에 따르면 상기 IgG2 힌지는 생체 내 안정성을 증가시키기 위해 하나의 해결안을 제공하는 것으로 나타났다. 따라서 미니바디와 같이 보다 높은 생체 내 안정성을 나타내는 항원 결합 구조체들이 본원에서 제공된다.
몇몇 실시형태에서, IgG2 힌지가 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, IgG2 힌지가 이용될 수 있으며, 여기서 첫 번째 힌지 시스테인이 돌연 변이되어 있다. 몇몇 실시형태에서, Mb 구조체에서 말단 리신(K)의 돌연 변이는 단백질 발현에 영향을 미치지 않았지만, 보다 균일한 전하를 갖는 단백질을 생성하였다.
실시예에 토의된 바와 같이, 부가적인 Mb 변이체들은 상부 IgG3 힌지 및 개질된 IgG1 코어 힌지 서열에 의해 평가되었으며, 이때 상기 코어 힌지 영역 내에는 가닥 당 적어도 3개의 시스테인 잔기가 존재하였다. 하기 실시예에서 나열된 바와 같이, IAB2M, IAB22M 및 IAB20M 구조체들은 상이한 배향 및 상이한 표적을 갖는 다양한 구조체 전반에 걸쳐 발견 보편성(universality of finding)을 증명하기 위해 평가되었다. 상기 결과에 따르면 본 발명에 개시된 힌지와 관련하여 본원에 개시된 이점은 특히 임의의 모든 항원 결합 구조체 및 미니바디들에 이용 및 적용 가능한 것으로 나타난다.
몇몇 실시형태에서, 상기 힌지들은 펩티드 힌지들을 암호화하는 펩티드 힌지 및/또는 핵산 서열들일 수 있다. 본원에서 제공된 힌지들의 펩티드 형태와 관련한 모든 토의에는 상기 펩티드들을 암호화하는 핵산 서열들에 대한 상응하는 구조 및 기능이 나타나 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지들은 항체, 예를 들어 미니바디와 같은 항원 결합 구조체 내로 혼입될 수 있다. 임의의 힌지 또는 힌지의 서브파트(예를 들어, 상부 힌지, 코어 힌지 및/또는 하부 힌지 영역)는 본원에서 제공된 임의의 항원 결합 구조체 내로 혼입될 수 있으며, 이들로는 표 0.1, 표 0.2, 표 1, 표 2 또는 표 3 및 도 5b 내지 도5e, 도 7c, 도 7d, 도 14b, 도 15b, 도 16b 내지 도 16d, 도 20c 내지 도 20g, 도 21b 내지 도 21e, 도 22b, 도 28b 내지 도 28e, 도 29b 내지 도 29d, 도 32, 도 33, 도 35a 내지 도 35c, 도 36a 내지 도 36e, 도 40 내지 도 69, 도 79 또는 도 80에 나타낸 것을 들 수 있지만 이에 제한되지 않으며, 도 7e, 도 34a 내지 도 34f, 도 41 내지 도 46, 도 48 내지 도 53, 도 55 내지 도 59, 도 61 내지 도 64, 도 65a, 도 65b 및 도 65c 중 임의의 하나에 예시된 핵산 서열들 중 임의의 하나 이상을 들 수 있지만 이에 제한되지 않다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지는 표 0.1에 나타낸 서열 또는 서브파트들 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 임의의 하부 힌지들은 이어서 CH3 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
몇몇 실시형태에서, 상기 힌지는 상기 표 0.1의 임의의 서열들을 포함하거나, 상기 서열들로 이루어지거나, 본질적으로는 상기 서열들로 이루어져 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지는 표 0.1의 지정된 상부, 코어 및 하부 힌지 영역 각각으로 이루어져 있다. 몇몇 실시형태에서, 상술한 서브파트(예를 들어, 상부, 코어 및/또는 하부 힌지)들 중 임의의 하나는 이의 변이체로서 제공될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 변이체들은 상술한 서열들에 대해 실질적인 동일성을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 변이체들은 상술한 서열들에 대해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 차이를 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 변이체들은 상술한 서열들에 대해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 차이를 가지며, 상기 차이는 보존적 차이이다.
몇몇 실시형태에서, 상기 코어 영역 내의 CPPC(서열번호 50) 모티프는 상기 표에 나타낸 공유결합의 개수 및/또는 유효성이 적절히 교체되는 한 임의의 기타 유효 코어 모티프로 변경될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항체에 대한 펩티드 힌지 영역이 제공된다. 상기 힌지 영역은 상응하는 아미노산과 가교 결합할 수 있는 아미노산을 포함하지 않는 상부 힌지 영역을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 힌지 영역은 상기 상부 힌지 영역에 대해 C-말단에 연결된 코어 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 코어 힌지 영역은 상기 힌지의 각 측면 상에 적어도 3개의 시스테인(그 결과로 조립된 구조에 대해 적어도 6개의 시스테인)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 상기 코어 힌지 영역에 대해 C-말단에 연결된 하부 힌지 또는 연장 영역을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 하부 힌지 또는 연장 영역은 APPVAGP(서열번호 60), APELLGGP(서열번호 58) 및 GGGSSGGGSG(서열번호 59) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 상부 힌지 영역은 상기 상부 힌지 영역 내에서 가교 결합하는 시스테인을 포함하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 상부 힌지 영역은 시스테인을 포함하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 하부 힌지 영역을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 이들 구조체는 비자연적으로 발생하는 구조체이다.
몇몇 실시형태에서, 변이체 미니바디 힌지 영역이 제공된다. 상기 변이체 미니바디 힌지 영역은 제 1 변경 아미노산 위치를 포함한다. 상기 제 1 변경 아미노산 위치는 천연 항체 힌지에서 시스테인일 수 있는 아미노산이고, 이황화 결합을 형성하지 않도록 상기 제 1 변경 위치에 변경되어 있다. 상기 변이체 미니바디 힌지 영역은 가닥 당 상기 제 1 변경 아미노산 위치에 대해 C-말단에 있는 적어도 3개의 시스테인을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 시스테인이 가닥 당 상기 제 1 변경 아미노산 위치에 대해 C-말단에 존재할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이들 부가적인 시스테인은 전적으로 상기 힌지의 코어 영역 내에 포함된다(물론, 상기 코어 힌지는 부가적인 시스테인이 부가될 수 있도록 개질될 수 있고 야생형 서열을 초과하여 확장될 수 있음). 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 영역은 서열번호 1(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)로 이루어져 있다. 몇몇 실시형태에서, 서열번호 1은 코어 힌지 영역이고, 상기 코어 힌지 영역은 본질적으로는 서열번호 1로 이루어져 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 코어 힌지 영역은 서열번호 1로 이루어져 있다. 상술한 설명에서, 상기 시스테인의 개수는 펩티드 사슬의 단일 힌지 영역의 시스테인의 개수와 관련이 있다. 상기 힌지(여기서 상기 펩티드 사슬들은 서로 가교 결합되어 있음)의 이량체 형태 내의 시스테인의 개수는 상술한 시스테인이 각각 2개의 시스테인을 포함한 이황화결합의 일부이기 때문에 적어도 2배일 것으로 이해될 것이다.
몇몇 실시형태에서, Mb 구조체들은 VL-VH 또는 VH-VL 배향으로 있을 수 있는 가변 링커 길이를 갖는 항원 결합 scFv를 함유한다. 하나의 배향과 관련하여 본원에서 제공된 임의의 개시내용에서는 또한 역 배향 및 양쪽 배향이 고려된다. 몇몇 실시형태에서, 표 0.1에 개시된 임의의 힌지 서열은 scFv에 대해 C-말단에 부가될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체로부터의 임의의 CH3 도메인은 scFv 및 적절한 힌지에 대해 C-말단에 부가될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 적절한 이황화 결합을 확보하기 위해 상기 첫 번째 힌지 시스테인(일반적으로는 천연 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 항체에서 경쇄와 쌍을 이룬 시스테인)은 이황화 스크램블링 및/또는 콘카테머화(concatemerization)를 예방하기 위해 세린 또는 알라닌 또는 기타 적절한 아미노산으로 돌연 변이된다. 몇몇 실시형태에서, 반분자의 존재를 감소시키거나 이의 형성을 예방하고 생체 내 최적의 안정성을 확보하기 위해 상기 힌지 영역은 적어도 3개의 이황화 결합을 함유할 수 있고, 몇몇 실시형태에서 이는 그 이상의 이황화 결합을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 내에 존재하는 적어도 3개의 이황화 결합은 서로에 대해 적절한 거리에 위치하며, 부적절한 이황화 결합이 형성되는 것을 예방하고 적절한 이황화 결합 형성을 보장하기 위해 포함된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 내의 3개의 이황화 결합은 서로에 대해 적절한 거리에 위치하며, 생체 내 단백질 안정성 및 신장 제거가 아닌 간을 통한 제거를 위해 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 내의 적어도 3개(예를 들어, 4개 이상)의 이황화 결합은 핸들(handle)로서의 시스테인의 사용을 제공하기 위해 제공된 후, 약물, 금속 킬레이터(metal chelator), 방사성 핵종, 방사성 동위원소의 이황화물의 온화한 감소, 킬레이터의 부위 특이적 접합 후 부착 부위로서 시스테인을 이용한 킬레이터 또는 형광 염료에 대한 방사성 동위원소의 부착이 이어진다. 당해 기술분야의 숙련자에 의해 인지된 바와 같이, 단일 이황화 결합 각각의 존재는 2개의 시스테인의 존재를 나타내며, 상기 힌지의 펩티드 서열 상에 각각 하나씩 있다.
몇몇 실시형태에서, Mb는 본원에서 제공된 임의의 힌지 구성성분들을 포함하고 부모 항체에 대한 유사한(또는 동일한) 친화도를 유지하도록 구성된다. 몇몇 실시형태에서, 상술한 바와 같이 구성된 Mb는 2개의 상이한 항원 결합 도메인을 함유하도록 조작될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항원 결합 구조체를 위한 보다 우수한 힌지들은 상기 표 0.1에서 언급되고 하기 실시예에서 언급된 바와 같이 상기 힌지 영역 내의 첫 번째 시스테인을 제거함으로써 수득될 수 있다. 따라서 몇몇 실시형태에서 이러한 시스테인(다르게는 상기 천연 힌지 내제 존재할 수 있음)이 제거되거나 다른 잔기(예를 들어, 공유결합을 형성할 수 없는 잔기)로 변경된 힌지 영역이 제공될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 조절은 인간 IgG1 문맥 내에서 이루어지거나, 표 0.1에서 상술한 위치에서의 시스테인을 포함하는 임의의 기타 힌지 영역 내에서 이루어진다(예를 들어, γ2 EH2 내에서 변경된 γ2 EH1(Cys에서 Ser로의 변경) 및 γ2 NH2에서 변경된 γ2 NH1(Cys에서 Ser로의 변경)).
몇몇 실시형태에서, 서열번호 1의 서열(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)을 포함하는 아미노산 힌지 영역이 제공된다. Xn1은 공유성 가교결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, Xn2는 A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V 중 임의의 하나이다. Xn3은 임의의 아미노산일 수 있다. Xn4는 임의의 아미노산이다. Xn5는 임의의 아미노산이다. 몇몇 실시형태에서, Xn1은 세린 또는 알라닌을 포함한다(서열번호 235). 몇몇 실시형태에서, Xn1은 세린을 포함한다(서열번호 210). 몇몇 실시형태에서, Xn1은 알라닌을 포함한다(서열번호 211). 몇몇 실시형태에서, Xn1은 T를 포함한다(서열번호 236). 몇몇 실시형태에서, 변경된 서열번호 1에서의 첫 번째 시스테인은 γ2 도메인 내의 시스테인이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 서열번호 1(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)의 앞부분에 부가적인 아미노산을 더 포함한다.
Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C(서열번호 1)의 몇몇 실시형태에서, Xn1은 다른 아미노산과 공유성 가교결합을 형성하지 않는다(서열번호 191). 몇몇 실시형태에서, Xn1은 시스테인이 아니다(서열번호 192). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn1은 A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V 중 하나이다(서열번호 193). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn2는 P, V 또는 E이다(서열번호 194). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn4는 P, V 또는 E이다(서열번호 196). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn4는 P 또는 V이다(서열번호 197). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn2는 P 또는 V이다(서열번호 195). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn3은 P 또는 E이다(서열번호 198). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn5는 P 또는 E이다(서열번호 199). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn3은 P 또는 E이고, Xn5는 P 또는 E이다(서열번호 237). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn2Xn3은 VE이다(서열번호 201). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn2Xn3은 PP이다(서열번호 202). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn4Xn5는 VE이다(서열번호 203). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn4Xn5는 PP이다(서열번호 204). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn2Xn3은 VE이고, Xn4Xn5는 PP이다(서열번호 205). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn2Xn3은 VE 또는 PP이다(서열번호 238). 서열번호 1의 몇몇 실시형태에서, Xn2Xn3은 VE이다(서열번호 239).
몇몇 실시형태에서, 임의의 상술한 힌지 영역들은 Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C(서열번호 1) 내의 마지막 시스테인에 대해 C-말단에 있는 하부 힌지 또는 연장 서열을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 하부 힌지 영역이 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 상술한 힌지 영역들은 Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C(서열번호 1) 내의 마지막 시스테인에 대해 C-말단에 있는 연장 또는 하부 힌지 서열을 더 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 힌지 영역은 코어 힌지 영역이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지는 상기 코어 힌지 영역에 인접한 상부 힌지 영역을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지는 상기 코어 힌지 영역에 인접한 하부 힌지 또는 연장 영역을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 상기 코어 힌지 영역에 인접한 상부 힌지 영역을 더 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 하기 서열, 즉 SCVECPPCP(서열번호 56)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 하기 서열, 즉 ERKSCVECPPCP(서열번호 167)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 하기 서열, 즉 EPKSSDKTHTCPPCPPC(서열번호 168)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 하기 서열, 즉 ERKSCVECPPCPGGGSSGGGSG(서열번호 34) 및 ERKSCVECPPCPAPPVAGP(서열번호 33) 중 적어도 하나를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 적어도 TCPPCPPC(서열번호 166)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 적어도 EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG(서열번호 26) 또는 EPKSSDKTHTCPPCPPCAPELLGGP(서열번호 25)를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 표 0.1 및 표 3(예를 들어, γ1 EH1 내지 γ1 EH2)에 나타낸 바와 같이 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 중쇄 및 경쇄를 각각 연결하는데 책임이 있는 힌지 시스테인을 제거함으로써 보다 우수한 힌지들이 제공될 수 있다. 더욱이, 몇몇 실시형태에서 가닥 당 적어도 3개의 시스테인(예를 들어, γ1 EH3, γ1 EH4 및 γ1 EH5)을 갖는 코어 영역을 이용하면 보다 우수한 구조체를 초래할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 표 0.1 및 표 3(예를 들어, γ1 EH1 내지 γ1 EH2)에 나타낸 바와 같이 상부 힌지 영역으로부터 시스테인을 제거함으로써 힌지가 제공될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 이 같은 구조체들은 서열번호 2의 서열(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)을 포함하는 아미노산 힌지 영역으로서 개시될 수 있으며, 여기서 Xn1은 다른 아미노산과 공유성 가교결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산이고, Xn2는 임의의 아미노산이고, Xn3은 임의의 아미노산이고, Xn4는 임의의 아미노산이고, Xn5는 임의의 아미노산이고, Xn6은 임의의 아미노산이고, Xn7은 임의의 아미노산이고, Xn8은 임의의 아미노산이고, Xn9는 임의의 아미노산이고, Xn10은 임의의 아미노산이다(서열번호 240).
몇몇 실시형태에서, 이 같은 구조체들은 서열번호 2의 서열(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)을 포함하는 아미노산 힌지 영역으로서 개시될 수 있으며, 여기서 Xn1은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn2는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn6은 시스테인이 아닌 임의의 아미노산일 수 있고, Xn7은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn8은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn9는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn10은 임의의 아미노산일 수 있다(서열번호 241).
서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn1은 시스테인이 아니다(서열번호 213). 서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn1은 세린 또는 알라닌이다(서열번호 242). 서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn2는 시스테인이 아니다(서열번호 214). 서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn2는 D이다(서열번호 215). 몇몇 실시형태에서, Xn3은 K이다(서열번호 216). 서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn4는 T이다(서열번호 217). 서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn5는 H이다(서열번호 218). 서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn6은 T이다(서열번호 219). 서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn7은 P 또는 V이다(서열번호 220). 서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn8은 P 또는 E이다(서열번호 221). 서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn9는 P 또는 V이다(서열번호 222). 서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn10은 P 또는 E이다(서열번호 223). 서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn2는 D이고, Xn3은 K이고, Xn4는 T이고, Xn5는 H이고, Xn6은 T이고, Xn7은 P 또는 V이고, Xn8은 P 또는 E이고, Xn9는 P 또는 V이다(서열번호 243).
몇몇 실시형태에서, 상기 아미노산 힌지 영역은 Xn11Xn12C 서열을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 이는 서열번호 1(서열번호 244) 또는 서열번호 2(서열번호 245)에서 C-말단 시스테인에 바로 부착될 수 있다. 서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn11은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn12는 임의의 아미노산일 수 있다(서열번호 245). 서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn11은 P 또는 V이고, Xn12는 P 또는 E이다(서열번호 246). 서열번호 2의 몇몇 실시형태에서, Xn1은 세린이고, Xn2는 D이고, Xn3은 K이고, Xn4는 T이고, Xn5는 H이고, Xn6은 T이고, Xn7은 P이고, Xn8은 P이고, Xn9는 P이고, Xn10은 P이다(서열번호 247).
몇몇 실시형태에서, 임의의 상기 힌지 서열들에는 임의의 개수의 초기 아미노산이 선행할 수 있다. 따라서 부가적인 아미노산의 링커 또는 스페이서(spacer)들은 상술한 서열(예를 들어, 서열번호 1 및/또는 서열번호 2) 앞에 있는 분자에 부가될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 상기 힌지 서열들 다음에는 임의의 개수의 부가적인 아미노산이 존재할 수 있다. 따라서 부가적인 아미노산의 링커 또는 스페이서들은 상술한 서열(예를 들어, 서열번호 1 및/또는 서열번호 2) 다음에 있는 분자에 부가될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 영역은 하기 서열, 즉 CPPCPPC(서열번호 52), CPPCVECPPC(서열번호 53) 및 CPPCPPCPPC(서열번호 54) 중 적어도 하나를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 영역은 하기 서열, 즉 ERKSCVECPPCPGGGSSGGGSG(서열번호 34), EPKSSDKTHTCPPCPPC(서열번호 168), EPKSSDKTHTCPPCVECPPC(서열번호 169) 및 EPKSSDKTHTCPPCPPCPPC(서열번호 170) 중 적어도 하나를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 영역은 하기 서열, 즉 EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG(서열번호 26), EPKSSDKTHTCPPCVECPPCGGGSSGGGSG(서열번호 28) 및 EPKSSDKTHTCPPCPPCPPCGGGSSGGGSG(서열번호 30) 중 적어도 하나를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 하부 힌지 영역/서열은 연장 서열(예를 들어, 8개 내지 25개의 아미노산, 예를 들어 8개 내지 20개, 10개 내지 25개, 10개 내지 22개, 12개 내지 20개, 14개 내지 16개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 아미노산을 가짐)일 수 있다. 상기 하부 힌지의 예는 표 0.1 및 표 3에 나타나 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 하부 힌지는 γ1, γ2, γ3 또는 γ4로부터 유래한 천연 하부 힌지일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 하나는 천연 힌지 서열을 가질 수 있고, 하나 이상의 스페이서 아미노산(예를 들어, G 또는 S와 같은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 아미노산)을 부가할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 아미노산 힌지 영역은 ELKTPLGDTTHT(서열번호 48) 또는 EPKSSDKTHT(서열번호 46)의 상부 힌지 서열에 연결된 CVECPPCP(서열번호 57), CPPCPPC(서열번호 52), CPPCPPCPPC(서열번호 54) 및 CPPCVECPPC(서열번호 53) 중 적어도 하나를 갖는 코어 힌지 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태들은 하기 옵션들 중 임의의 하나 이상에 의해 개질되거나 보완될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 영역은 적어도 3개의 시스테인(각 사슬에 대해: 상기 이량체성 힌지 구조체 내의 2개의 가닥 사이에 적어도 총 6개의 시스테인)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 영역은 적어도 4개의 시스테인(각 사슬에 대해)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 영역은 적어도 5개의 시스테인(각 사슬에 대해)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 시스테인(각 사슬에 대해)이 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 영역은 (각 사슬에 대해 및/또는 상기 이량체성 구조체 내에) 전체로서 상술한 개수의 시스테인을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상술한 시스테인 모두는 상기 코어 힌지 영역 내에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 상술한 시스테인 모두는 상기 코어 힌지 영역 내에 존재하며, 상기 상부 힌지 영역 및/또는 하부 힌지 영역 내에 존재하는 부가적인 시스테인은 없다. 몇몇 실시형태에서, 상기 시스테인은 상기 아미노산 힌지 영역 전역에서 반복 "CXX" 모티프(예를 들어, CXXCXXCXX(서열번호 171) 또는 CXXCXX(서열번호 172) 또는 CXXCXXCXXCXX(서열번호 173) 내에 분포되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 시스테인은 상기 코어 힌지 영역 전역에서 반복 CXX 모티프 내에 분포되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 모티프는 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 이상 반복한다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 X는 P, V 또는 E일 수 있다(서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173). 몇몇 실시형태에서, X는 시스테인이 아니다(서열번호 248, 서열번호 249, 서열번호 250).
몇몇 실시형태에서, 상기 코어 힌지 영역은 상기 코어 힌지 영역 내에 적어도 3개의 이황화 결합을 형성하는 가닥 당 적어도 3개의 시스테인을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 구조체들은 포유동물 세포에 훨씬 양호하게 발현하며, 보다 낮은 집성체 및 보다 균일한 생성물뿐만 아니라 보다 높은 역가(titer)를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 코어 힌지 영역에 존재하는 시스테인 각각은 상기 힌지 내에 쌍을 이룬 이의 사슬 상에서 상응하는 시스테인과 이황화 결합을 형성할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 이황화 결합은 2개의 별도의 단백질 사슬 상에 있는 상응하는 시스테인 사이에 존재하며, 이때 상기 단백질 사슬 각각은 힌지 영역이다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 3개의 이황화 결합, 예를 들어 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 이황화 결합이 형성된다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 3개의 이황화 결합이 형성될 수 있으며, 예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 이황화 결합이 상기 구조 내에 동시에 형성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 코어 힌지 영역의 첫 번째 잔기는 세린이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 코어 힌지 영역은 SCVECPPCP(서열번호 56)를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 임의의 구조체를 위한 CH3 도메인은 γ1, γ2 또는 γ3 및 이의 임의의 자연적으로 발생하는 대립 유전자로부터 유래할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "γ"는 감마에 대한 약어이다.
몇몇 실시형태에서, 상기 연장 또는 하부 힌지 영역은 S, G, A, P 및 V 중 적어도 하나를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 연장 서열은 적어도 GGGSSGGGSG(서열번호 59)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 연장 또는 하부 힌지 영역은 적어도 APPVAGP(서열번호 60)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 하부 힌지 영역은 GGGSSGGGSG(서열번호 59) 및 APPVAGP(서열번호 60) 중 적어도 하나를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 하부 힌지 서열은 GS 링커, 연장 서열, 및/또는 γ1, γ2, γ3 및 γ4로부터 유래하는 임의의 천연 하부 힌지 영역일 수 있다.
특성
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 힌지들은 보다 낮은 비율(%)의 반분자가 형성되도록 할 수 있고/있거나 임의의 미니바디 또는 기타 항원 결합 구조체 조성물 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물의 7% 미만이 반분자일 수 있으며, 이때 이러한 범위는 상기 반분자가 조성물의 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만 및/또는 0.5% 미만인 범위를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 힌지가 미니바디 내에 위치하고 상기 미니바디가 인간 개체에 투여되는 경우, 상기 개체로부터 미니바디의 제거는 간 및/또는 신장을 통해 일어날 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 간을 통한 제거는 적어도 10% 이상이고, 예를 들어 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지가 미니바디 내에 위치하고 상기 미니바디가 인간 개체에 투여되는 경우, 상기 개체로부터 미니바디의 제거는 주로 신장을 통해 일어날 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항체의 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 그 이상이 신장을 통해 제거된다.
몇몇 실시형태에서, 미니바디의 30% 미만의 집성체가 미니바디 조성물 내에 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 미니바디의 20% 미만의 집성체가 미니바디 조성물 내에 존재하다. 몇몇 실시형태에서, 미니바디의 10% 미만의 집성체가 미니바디 조성물 내에 존재하다. 몇몇 실시형태에서, 미니바디의 5% 미만의 집성체가 미니바디 조성물 내에 존재하다. 몇몇 실시형태에서, 미니바디의 1% 미만의 집성체가 미니바디 조성물 내에 존재하다.
상기 미니바디가 생체 내 순환 중인 이량체로서 잔류하는 경우, 단백질 제거는 주로 간을 통해 일어나는 것으로 예상된다. 이에 반해, 상기 반분자가 존재하는 경우 이의 제거는 신장을 통해 일어날 것이다. 따라서 몇몇 실시형태에서 상술한 제거 양태가 생체 내에서 개체에 존재하는 상기 얻어진 반분자의 양을 생체 내에서 특성화하는 방법으로, 당업자가 상기 투여된 온전한 분자가 생체 내에서 온전한 분자로 잔류하거나 상기 반분자로 분해되는지를 결정하도록 한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디 조성물은 상기 간을 통한 제거가 상기 신장을 통한 제거에 비해 상대적으로 높고 상기 미니바디의 종양 흡수가 상대적으로 높은 조성물이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 간에 대한 신장의 비율은 1 미만이다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 1% 이상의 흡수가 신장이 아닌 간을 통해 일어나며, 예를 들어, 적어도 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상의 흡수가 신장을 통해서가 아닌 간을 통해서 일어난다. 몇몇 실시형태에서, 간에 대한 신장의 흡수 비율은 0.9:1, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000 등이다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 다양한 힌지 구조체들은 IgG1로부터 유래한 EH1 힌지가 아닌 신장을 통한 보다 낮은 제거율을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, 기타 쌍을 이루지 않은 시스테인과의 원하지 않은 상호작용을 예방하기 위해 IgG1 힌지 영역(γ1 EH2)에서 첫 번째 힌지 시스테인의 세린으로의 돌연 변이로 인해 시험관 내(in vitro)에서 보다 양호한 프로파일(profile)을 갖는 단백질이 생성된다. 그러나 간과 비교하여 신장을 통한 높은 제거는 생체 내 단백질 불안정 및 반분자로의 해리를 나타낼 수 있다. 몇몇 실시형태에서, IgG2 힌지를 갖는 미니바디가 제공되며, 여기서 첫 번째 힌지 시스테인이 세린으로 돌연 변이되어 있고(γ2 EH2 등), 대략 80kDa의 단백질에 대해 예상되는 바와 같이 간을 통해 제거되는 특성을 갖는다. 이는 상기 분자가 생체 내에서 온전하게 잔류한다는 것을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 상기 분자는 48시간 이상 동안 온전하게 잔류한다.
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 힌지 구조체는 쌍을 이루지 않은 첫 번째 힌지 시스테인으로 인해 반분자가 9% 미만으로 존재한다. 몇몇 실시형태에서, 첫 번째 시스테인이 세린으로 돌연 변이된 IgG2 힌지는 γ2 EH2에서와 같이 온전한 이량체 단백질이 99% 초과로 존재한다. 몇몇 실시형태에서, γ2 힌지 변이체는 신장 흡수의 감소를 초래한다. 몇몇 실시형태에서, huIgG1 힌지(γ1 EH1)에 의해 제조된 Mb는 신장을 통해 신속하게 제거되며, 그 결과 낮은 종양 표적화를 초래한다. 몇몇 실시형태에서, huIgG2 힌지 변이체, 즉 연장된 힌지(γ2 EH2) 또는 천연 힌지(γ2 NH1)에 의해 제조된 Mb는 높은 종양 표적화 및 보다 낮은 신장 제거와 더불어 보다 높은 생체 내 안정성을 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, EH2 힌지를 갖는 γ1 미니바디는 온전한 이량체성 분자로 적절히 조립되지만, 단지 2개의 시스테인이 포함되면 많은 양의 반분자를 갖는 단백질이 수득된다. 몇몇 실시형태에서, EH3 힌지를 갖는 γ1 미니바디는 온전한 이량체성 분자로 적절히 조립되고, 가닥 당 세 번째 시스테인이 부가되면 매우 낮은 수준의 반분자를 갖는 단백질이 수득된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 반분자의 수준은 15% 미만이며, 예를 들어 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만의 반분자가 존재한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 영역이 변경되고 종래에 개시된 영역과 상이할지라도 상기 미니바디의 CDR, VH/VL 또는 전체 아미노산 서열은 이전 유형의 힌지를 갖는 항체(예를 들어, 미니바디)와 동일한 친화도로 상기 표적 분자에 여전히 결합한다. 따라서 몇몇 실시형태에서 본원에서 제공된 힌지의 존재가 항원 결합 구조체의 결합 친화도를 변경하지 않거나 이에 악영향을 미치지 않는 반면, 본원에서 제공된 이점 및/또는 구조들 중 하나 이상을 여전히 제공한다.
몇몇 실시형태에서, Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C의 서열(서열번호 3)을 포함하는 미니바디가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 서열번호 3은 상기 미니바디의 코어 힌지 영역으로서 위치한다. 몇몇 실시형태에서, Xn1은 임의의 아미노산이거나 아미노산이 아닐 수 있고, Xn2는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, Xn1은 시스테인이 아닐 수 있고, Xn2는 시스테인이 아닐 수 있고, Xn3은 시스테인이 아닐 수 있고, Xn4는 시스테인이 아닐 수 있고/있거나, Xn5는 시스테인이 아닐 수 있다(서열번호 251). 몇몇 실시형태에서, Xn1은 시스테인이 아닌 임의의 아미노산이다(서열번호 229). 몇몇 실시형태에서, Xn1은 세린이다(서열번호 230).
몇몇 실시형태에서, Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5CXn6의 서열(서열번호 4)을 포함하는 미니바디가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 서열번호 4는 상기 미니바디의 코어 힌지 영역으로서 위치한다. 몇몇 실시형태에서, Xn1은 임의의 아미노산이거나 아미노산이 아닐 수 있고, Xn2는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있다(서열번호 252). 몇몇 실시형태에서, Xn1은 시스테인이 아닐 수 있고, Xn2는 시스테인이 아닐 수 있고, Xn3은 시스테인이 아닐 수 있고, Xn4는 시스테인이 아닐 수 있고/있거나, Xn5는 시스테인이 아닐 수 있다(서열번호 253). 몇몇 실시형태에서, Xn1은 시스테인이 아닌 임의의 아미노산이다(서열번호 254). 몇몇 실시형태에서, Xn1은 세린이다(서열번호 255). 몇몇 실시형태에서, Xn6은 임의의 아미노산이거나 아미노산이 아닐 수 있거나, P일 수 있다(서열번호 256).
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 아미노산 힌지 영역 또는 전체 힌지들은 항체 내에 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 아미노산 힌지 영역 또는 전체 힌지들은 항체 결합 단편 내에 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 아미노산 힌지 영역 또는 전체 힌지들은 미니바디 내에 있다.
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 아미노산 힌지 영역 또는 전체 힌지들은 단일 특이성 항체 내에 있다.
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 아미노산 힌지 영역 또는 전체 힌지들은 이중 특이성 항체 내에 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 아미노산 힌지 영역 또는 전체 힌지들은 1:1의 비율로 조립된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 아미노산 힌지 영역 또는 전체 힌지들은 이중 특이성 구조체인 항체 단편의 일부이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 이중 특이성 항체는 미니바디이다.
특정 항원 결합 구조체
표적에 결합하는 항원 결합 구조체들이 본원에 개시되어 있다. 항원 결합 구조체는 표적 분자에 특이적으로 결합하거나 상기 표적 분자와 면역학적으로 반응성을 갖는 면역 글로불린 또는 면역 글로불린 관련 분자의 하나 이상의 부분을 포함하는 분자이다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 힌지 는 임의의 목적하는 항원 결합 구조체에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 힌지는 미니바디에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 힌지는 CD8, CD3, 5T4, PSCA 또는 PSMA에 결합하는 미니바디에 적용될 수 있다. PSMA 항원의 비제한적인 실시형태가 도 70에 도시되어 있다. PSCA 항원의 비제한적인 실시형태가 도 71에 도시되어 있다. 5T4 항원의 비제한적인 실시형태가 도 72에 도시되어 있다. 상기 CD8 항원의 몇몇 비제한적인 실시형태가 도 73 및 도 74에 도시되어 있다. 상기 CD3 항원의 몇몇 비제한적인 실시형태가 도 75 내지 도 78에 도시되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 힌지는 CD8, CD3, 5T4, PSCA 또는 PSMA에 특이적 및/또는 선택적으로 결합하는 미니바디에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 표 0.1 또는 표 3에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 힌지는 CD8, CD3, 5T4, PSCA 또는 PSMA에 결합하는 미니바디에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 상기 실시형태의 전체 힌지는 CD8, CD3, 5T4, PSCA 또는 PSMA에 결합하는 미니바디에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 상기 실시형태의 상부 힌지는 CD8, CD3, 5T4, PSCA 또는 PSMA에 결합하는 미니바디에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 상기 실시형태의 코어 힌지는 CD8, CD3, 5T4, PSCA 또는 PSMA에 결합하는 미니바디에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 상기 실시형태의 하부 힌지는 CD8, CD3, 5T4, PSCA 또는 PSMA에 결합하는 미니바디에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 상기 실시형태의 상부 및 코어 힌지는 CD8, CD3, 5T4, PSCA 또는 PSMA에 결합하는 미니바디에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 상기 실시형태의 코어 및 하부 힌지는 CD8, CD3, 5T4, PSCA 또는 PSMA에 결합하는 미니바디에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 상기 실시형태의 상부 및 하부 힌지는 CD8, CD3, 5T4, PSCA 또는 PSMA에 결합하는 미니바디에 적용될 수 있다.
미니바디와 같은 부가적인 항체 단편들이 하기에 제공된다. 상기 항체 단편들은, 예를 들어 이미징 또는 치료 목적으로 사용될 수 있다. 예시적인 미니바디의 개략적인 도해가 도면에 나타나 있고/있거나 하기 표 0.2에 나열되어 있다(M1 배향 및 M2 배향 중 하나).
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
표 0.2에는 미니바디에 사용될 수 있는 단량체에 대한 서열들의 배열이 나열되어 있다(표 0.2). 표의 각각의 행은 단량체 구조체의 서열을 나타내며, 이때 N-말단 내지 C-말단을 좌우로 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 단량체 구조체 각각의 나열된 서열들은 서로에 대해 직접 연결되어 있다. 따라서 몇몇 실시형태에서 상기 구조체는 표 0.2에서 단일 행 상의 임의의 상기 구조체들을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 구조체들은 표 0.2에서의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 제 1 행의 제 3 열에 있는 제 1 항목은 제 1 행의 제 4 열 내지 제 1 행의 제 5 열, 제 1 행의 제 6 열 내지 제 8 열, 제 1 행의 제 9 열과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제 3 열 내지 제 5 열은 서로 교체될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제 1 행의 제 3 열에 있는 제 1 항목은 제 1 행의 제 4 열 내지 제 2 행의 제 5 열, 제 2 행의 제 6 열 내지 제 8 열, 제 2 행의 제 9 열과 조합될 수 있다. 따라서 상기 표에는 단일 행 내의 조합 및 다양한 행을 통한 조합(및 열은 교체 가능함) 둘 모두를 포함한 모든 가능한 조합이 나타나 있다.
몇몇 실시형태에서, CD8에 대한 항원 결합 구조체는 서열번호 75로 표시된 HCDR 1과 동일한 중쇄 CDR1(HCDR1); 서열번호 76으로 표시된 HCDR2와 동일한 중쇄 CDR2(HCDR2); 서열번호 77로 표시된 HCDR3과 동일한 중쇄 CDR3(HCDR3); 서열번호 78로 표시된 LCDR1과 동일한 경쇄 CDR1(LCDR1); 서열번호 79로 표시된 LCDR2와 동일한 경쇄 CDR2(LCDR2); 및/또는 서열번호 80으로 표시된 LCDR3과 동일한 경쇄 CDR3(LCDR3)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, PSMA에 대한 항원 결합 구조체는 서열번호 81로 표시된 HCDR 1과 동일한 중쇄 CDR1(HCDR1); 서열번호 82로 표시된 HCDR2와 동일한 중쇄 CDR2(HCDR2); 서열번호 83으로 표시된 HCDR3과 동일한 중쇄 CDR3(HCDR3); 서열번호 84로 표시된 LCDR1과 동일한 경쇄 CDR1(LCDR1); 서열번호 85로 표시된 LCDR2와 동일한 경쇄 CDR2(LCDR2); 및/또는 서열번호 86으로 표시된 LCDR3과 동일한 경쇄 CDR3(LCDR3)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 5T4에 대한 항원 결합 구조체는 서열번호 87로 표시된 HCDR1과 동일한 중쇄 CDR1(HCDR1); 서열번호 88로 표시된 HCDR2와 동일한 중쇄 CDR2(HCDR2); 서열번호 89로 표시된 HCDR3과 동일한 중쇄 CDR3(HCDR3); 서열번호 90으로 표시된 LCDR1과 동일한 경쇄 CDR1(LCDR1); 서열번호 91로 표시된 LCDR2와 동일한 경쇄 CDR2(LCDR2); 및/또는 서열번호 92로 표시된 LCDR3과 동일한 경쇄 CDR3(LCDR3)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, PSCA에 대한 항원 결합 구조체는 서열번호 93으로 표시된 HCDR1과 동일한 중쇄 CDR1(HCDR1); 서열번호 94로 표시된 HCDR2와 동일한 중쇄 CDR2(HCDR2); 서열번호 95로 표시된 HCDR3과 동일한 중쇄 CDR3(HCDR3); 서열번호 96으로 표시된 LCDR1과 동일한 경쇄 CDR1(LCDR1); 서열번호 97로 표시된 LCDR2와 동일한 경쇄 CDR2(LCDR2); 및/또는 서열번호 98로 표시된 LCDR3과 동일한 경쇄 CDR3(LCDR3)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, CD3에 대한 항원 결합 구조체는 도 65b 또는 도 65c에 도시된 HCDR1과 동일한 중쇄 CDR1(HCDR1); 도 65b 또는 도 65c에 도시된 HCDR2와 동일한 중쇄 CDR2(HCDR2); 도 65b 또는 도 65c에 도시된 HCDR3과 동일한 중쇄 CDR3(HCDR3); 도 65b 또는 도 65c에 도시된 LCDR1과 동일한 경쇄 CDR1(LCDR1); 도 65b 또는 도 65c에 도시된 LCDR2와 동일한 경쇄 CDR2(LCDR2); 및/또는 도 65b 또는 도 65c에 도시된 LCDR3과 동일한 경쇄 CDR3(LCDR3)을 포함한다. 본원에서 제공된 상기 힌지 서열들 중 임의의 하나 이상과 함께 사용될 수 있는 CDR 서열들의 몇몇 실시형태가 표 8에 나타나 있다.
CDR 서열
IAB22M(CD8) IAB2M(PSMA) IAB20M(5T4) IAB1M(PSCA) IAB25M(CD3)
HCDR1 GFNIKDT
(서열번호 75)		 GYTFTEY
(서열번호 81)		 GYSFTGY
(서열번호 87)		 GFNIKDY
(서열번호 93)		 GYTFTRY
(서열번호 174)
HCDR2 DPANDN
(서열번호 76)		 NINPNNGG
(서열번호 82)		 NPNNGV
(서열번호 88)		 DPENGD
(서열번호 94)		 NPSRGY
(서열번호 175)
HCDR3 GYGYYVFDH
(서열번호 77)		 GWNFDY
(서열번호 83)		 STMITNYVMDY
(서열번호 89)		 GGF
(서열번호 95)		 YYDDHYSLDY
(서열번호 176)
LCDR1 RTSRSISQYLA
(서열번호 78)		 KASQDVGTAVD
(서열번호 84)		 KASQSVSNDVA
(서열번호 90)		 SASSSVRFIH
(서열번호 96)		 SASSSVSYMN
(서열번호 177)
LCDR2 SGSTLQS
(서열번호 79)		 WASTRHT
(서열번호 85)		 YTSSRYA
(서열번호 91)		 DTSKLAS
(서열번호 97)		 DTSKLAS
(서열번호 97)
LCDR3 QQHNENPLT
(서열번호 80)		 QQYNSYPLT
(서열번호 86)		 QQDYNSPPT
(서열번호 92)		 QQWGSSPFT
(서열번호 98)		 QQWSSNPFT
(서열번호 178)
이들 구조체들은 본원에서 제공된 임의의 형태일 수 있으며, 이들로는 미니바디, scFv 등이 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 상술한 CDR을 포함한다(상기 CDR의 몇몇 실시형태가 도 41, 도 48, 도 55, 도 61, 도 65b 또는 도 65c에 나타나 있음). 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 상기 CDR과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 상부 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 상기 CDR과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 코어 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 상기 CDR과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 하부 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 상기 CDR과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 전체 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 상기 CDR과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 상부 및 코어 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 상기 CDR과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 코어 및 하부 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 상기 CDR과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 이들 CDR 기반 실시형태는 미니바디의 일부일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 중쇄 CDR3(HCDR3)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 표적 분자에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 본원에서 제공된 CDR을 갖는 항체들 중 하나 이상과의 결합을 위해 경쟁한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 적어도 상술한 3개 중쇄 CDR을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 중쇄 CDR3을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 본원에서 제공된 중쇄 CDR2 서열들 중 임의의 하나를 더 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 이들 실시형태는 CD8, CD3, 5T4, PSCA 또는 PSMA에 결합하는 미니바디에 적용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 인간이거나 인간화된다. 미니바디의 문맥에서 사용되는 경우, 인간이란 용어는 구조체가 인간에서 자연적으로 발견되는 구조체와 동일하다는 것을 의미하지 않지만, 오히려 상기 구조체가 인간의 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 적어도 하나의 인간 골격 영역(예를 들어, 도 41, 도 48, 도 55, 도 61, 도 65b 또는 도 65c에 도시된 CDR 이전, 사이 및 이후에 나타낸 이들 절편) 또는 인간 골격 영역에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성, 예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97% 또는 99%의 동일성을 갖는 골격 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 상술한 FR를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 상기 FR과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 상부 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 상기 FR과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 코어 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 상기 FR과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 하부 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 상기 FR과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 전체 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 상기 FR과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 상부 및 코어 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 상기 FR과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 코어 및 하부 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 상기 FR과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 이들 FR 기반 실시형태는 미니바디의 일부일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 이들 실시형태는 CD8, CD3, 5T4, PSCA 또는 PSMA에 결합하는 미니바디에 적용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 서열번호 14(PSMA), 서열번호 16 또는 서열번호 99(CD8), 서열번호 18 또는 서열번호 102(5T4), 서열번호 68(PSCA), 또는 서열번호 20 또는 서열번호 104(또는 도 65b 및 도 65c)(CD3)로 표시된 중쇄 가변 영역과 동일한 중쇄 가변 영역을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 서열번호 14(PSMA), 서열번호 16 또는 서열번호 99(CD8), 서열번호 18 또는 서열번호 102(5T4), 서열번호 68(PSCA), 또는 서열번호 20 또는 서열번호 104(또는 도 65b 및 도 65c)(CD3)에 대해 적어도 약 80% 동일성, 예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 서열번호 13(PSMA), 서열번호 15(CD8), 서열번호 17 또는 서열번호 100 또는 서열번호 101(5T4), 서열번호 67(PSCA), 또는 서열번호 19 또는 서열번호 103(또는 도 65b 및 도 65c)(CD3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 서열번호 13(PSMA), 서열번호 15(CD8), 서열번호 17 또는 서열번호 100 또는 서열번호 101(5T4), 서열번호 67(PSCA), 또는 서열번호 19 또는 서열번호 103(또는 도 65b 및 도 65c)(CD3)에 대해 적어도 약 80%의 동일성, 예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 인간 항원 결합 구조체이고, 상기에서 나열한 적어도 중쇄 및/또는 경쇄 가변 서열과 적어도 동일한 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 및 경쇄를 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상술한 실시형태들 중 임의의 하나는 본원에서 제공된 힌지 실시형태들 중 임의의 하나와 조합되며, 이들은, 예를 들어 미니바디의 문맥에서 포함된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 VH과 VL 쌍과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 상부 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 VH과 VL 쌍과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 코어 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 VH과 VL 쌍과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 하부 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 VH과 VL 쌍과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 전체 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 VH과 VL 쌍과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 상부 및 코어 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 VH과 VL 쌍과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 코어 및 하부 힌지 절편들은 본원에서 제공된 임의의 VH과 VL 쌍과 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 이들 VH과 VL 쌍 기반 실시형태는 미니바디의 일부일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 이들 실시형태는 CD8, CD3, 5T4, PSCA 또는 PSMA에 결합하는 미니바디에 적용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 검출 가능한 마커를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 치료제를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 2가이다. 2가 항원 결합 구조체는 적어도 제 1 항원 결합 도메인, 예를 들어 제 1 scFv 및 적어도 제 2 항원 결합 도메인, 예를 들어 제 2 scFv를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 2가 항원 결합 구조체는 적어도 2개의 단량체, 예를 들어 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 단량체를 포함하는 다량체이며, 상기 단량체 각각은 항원 결합 도메인을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 미니바디이다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 힌지의 하나 이상의 서브파트는 상기 2가 구조체에 포함된다. 상기 미니바디는 본원에서 제공된 임의의 CDR 및 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역의 실시형태들을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 41, 도 48, 도 55, 도 61, 도 65b 또는 도 65c에 제공된 CDR 서열). 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 1가 scFv이다. 몇몇 실시형태에서, 1가 scFv가 제공되며, 이때 상기 1가 scFv는 도 41, 도 48, 도 55, 도 61, 도 65b 또는 도 65c의 HCDR1에서의 중쇄 CDR1(HCDR1), 도 41, 도 48, 도 55, 도 61, 도 65b 또는 도 65c의 HCDR2에서의 중쇄 CDR2(HCDR2), 도 41, 도 48, 도 55, 도 61, 도 65b 또는 도 65c의 HCDR3에서의 HCDR3, 도 41, 도 48, 도 55, 도 61, 도 65b 또는 도 65c의 LCDR1에서의 경쇄 CDR1(LCDR1), 도 41, 도 48, 도 55, 도 61, 도 65b 또는 도 65c의 LCDR2에서의 경쇄 CDR2(LCDR2), 및 도 41, 도 48, 도 55, 도 61, 도 65b 또는 도 65c의 LCDR3에서의 경쇄 CDR3(LCDR3)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 1가 scFv는 도 36a, 도 36b, 도 36c, 도 36d, 도 36e, 도 65b 또는 도 65c에 도시된 중쇄 가변 영역과 동일한 중쇄 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 1가 scFv는 도 36a, 도 36b, 도 36c, 도 36d, 도 36e, 도 65b 또는 도 65c에 도시된 경쇄 가변 영역과 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 1가 scFv는 도 66, 도 68 또는 도 69에 도시된 중쇄 가변 영역과 동일한 중쇄 가변 영역, 및 도 67 또는 도 69에 도시된 경쇄 가변 영역과 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 이중 특이적이다. 이중 특이성 구조체들은 적어도 제 1 결합 도메인, 예를 들어 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 scFv, 및 적어도 제 2 결합 도메인, 예를 들어 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함할 수 있다. 따라서 이중 특이성 항원 결합 구조체들은 2개 이상의 에피토프에 결합할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 제 1 에피토프 및 제 2 에피토프는 동일한 항원의 일부이고, 따라서 상기 이중 특이성 항원 결합 구조체는 동일한 항원의 2개의 에피토프에 결합할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 제 1 에피토프는 제 1 항원의 일부이고, 상기 제 2 에피토프는 제 2 항원의 일부이며, 따라서 상기 이중 특이성 항원 결합 구조체는 2개의 상이한 항원에 결합할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 2개의 에피토프에 동시에 결합한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 68, 서열번호 99, 서열번호 102 또는 서열번호 104로 표시된 중쇄 가변 영역과 동일한 중쇄 가변 영역, 및/또는 도 65b 및 도 65c에 나타낸 서열들을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 68, 서열번호 99, 서열번호 102 또는 서열번호 104에 대해 적어도 약 80%의 동일성, 예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 도 65b 및 도 65c에 도시된 서열들을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 67, 서열번호 100, 서열번호 101 또는 서열번호 103을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 도 65b 및 도 65c에 도시된 서열들을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 67, 서열번호 100, 서열번호 101 또는 서열번호 103에 대해 적어도 약 80%의 동일성, 예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 도 65b 및 도 65c에 도시된 서열들을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 인간 항원 결합 구조체이고, 적어도 상술한 중쇄 및/또는 경쇄 가변 서열과 적어도 동일한 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 및 경쇄를 갖는다.
본원에서 제공된 몇몇 실시형태는 본원에서 제공된 하나 이상의 항원 결합 구조체를 갖는 표적 분자에 대한 결합을 위해 경쟁하는 항원 결합 구조체를 포함하고, 본원에서 제공된 힌지 서브파트(예를 들어, 표 0.1에서와 같음)들 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 경쟁하는 항원 결합 구조체는 참고 항원 결합 구조체와 동일한 표적 분자 상의 에피토프에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 참고 항원 결합 구조체는 상기 표적 분자의 제 1 에피토프에 결합하고, 상기 경쟁하는 항원 결합 구조체는 상기 표적 분자의 제 2 에피토프에 결합하지만, 예를 들어 상기 참고 항원 결합 구조체의 결합을 입체적으로 차단하거나 상기 표적 분자에서 형태 변화를 유도함으로써 상기 표적 분자에 대한 참고 항원 결합 구조체의 결합을 방해한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 제 1 에피토프는 상기 제 2 에피토프와 중첩한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 scFv 및/또는 미니바디 포맷은 부모 항체의 높은 결합 친화도 및 특이성을 유지하면서 진단용 이미징 및 특정 치료적 적용을 위한 유리한 약동학적 특징을 갖는다. 전장 부모 항체를 이용한 이미징과 비교하여 약동학은 이들이 항원을 표적화한 후 신속한 고대비 이미징을 위한 시스템을 신속하게 제거할 수 있다는 점에서 이들 단편에 있어서 더욱 바람직하다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디에 대한 보다 짧은 순환 반감기는 상기 미니바디에 대한 주사 이후 대략 6시간 내지 48시간 내지 72시간(항원 "싱크(sink)"의 제거율 및 수준 및 Mb에 킬레이팅되는 동위원소의 반감기에 의존함)의 시간 범위에 걸쳐 최적의 이미징을 가능케 한다. 보다 양호한 조직 침투와 함께 신속한 혈액 제거는 당일 이미징을 가능케 할 수 있으며, 상기 이미징은 환자 치료 관리에 대해 임상에서 유의한 이점을 제공할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항체 단편들은 PSCA, 5T4, PSMA, CD3 또는 CD8 항체로부터 유래한 가변 경쇄 영역 CDR들 중 1개, 2개 또는 3개 및/또는 가변 중쇄 영역 CDR들 중 1개, 2개 또는 3개를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 PSCA, 5T4, PSMA, CD3 또는 CD8 항체의 쥐 버전의 가변 영역 CDR들 중 1개, 2개 또는 3개 및/또는 가변 중쇄 영역 CDR들 중 1개, 2개 또는 3개를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항체 단편은 인간화 PSCA, 5T4, PSMA, CD3 또는 CD8 항체의 가변 중쇄 또는 경쇄 영역으로부터 유래한 하나 이상의 CDR 영역을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, PSCA 항원에 결합하는 항원 결합 구조체들은 항체, 미니바디 및/또는 이들의 단편, 예를 들어 scFv일 수 있다. PSCA에 대한 항원 결합 구조체의 몇몇 비제한적인 실시형태는 도 29b 내지 도 29d, 도 36e, 도 60(서열번호 125 및 서열번호 126), 도 61(서열번호 126), 도 62(서열번호 127), 도 63(서열번호 128), 도 64(서열번호 129), 도 65a(서열번호 130)에 도시되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 5T4 항원에 결합하는 항원 결합 구조체들은 항체, 미니바디, 및/또는 scFv와 같은 이들의 단편들일 수 있다. 5T4에 대한 항원 결합 구조체의 몇몇 비제한적인 실시형태는 도 28b 내지 도 28e, 도 32, 도 36c, 도 54(서열번호 119 및 서열번호120), 도 55(서열번호 120), 도 56(서열번호 121), 도 57(서열번호 122), 도 58(서열번호 123), 도 59(서열번호 124), 도 67, 도 68에 도시되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 PSMA 항원과 결합하는 항원 결합 구조체들은 항체, 미니바디, 및/또는 scFv와 같은 이들의 단편들일 수 있다. PSMA에 대한 항원 결합 구조체의 몇몇 비제한적인 실시형태는 도 5b 내지 도 5e, 도 7c 내지 도 7e, 도 21b 내지 도 21e, 도 34a 내지 도 34f, 도 35a 내지 도 35c, 도 36a, 도 47(서열번호 112 및 서열번호 113), 도 48(서열번호 113), 도 49(서열번호 114), 도 50(서열번호 115), 도 51(서열번호 116), 도 52(서열번호 117), 도 53(서열번호 118)에 도시되어 있다. 몇몇 실시형태에서, CD3 항원과 결합하는 항원 결합 구조체들은 항체, 미니바디, 및/또는 scFv와 같은 이들의 단편들일 수 있다. CD3에 대한 항원 결합 구조체의 몇몇 비제한적인 실시형태는 도 33, 도 36d, 도 69, 도 65b 및 도 65c에 도시되어 있다. 몇몇 실시형태에서, CD8 항원과 결합하는 항원 결합 구조체들은 항체, 미니바디, 및/또는 scFv와 같은 이들의 단편들일 수 있다. CD8에 대한 항원 결합 구조체의 몇몇 비제한적인 실시형태는 도 14b, 도 15b, 도 16b 내지 도 16d, 도 20c 내지 도 20g, 도 22b, 도 36b, 도 40(서열번호 105 및 서열번호 106), 도 41(서열번호 106), 도 42(서열번호 107), 도 43(서열번호 108), 도 44(서열번호 109), 도 45(서열번호 110), 도 46(서열번호 111) 및 도 66에 도시되어 있다.
링커 옵션
몇몇 실시형태에서, 개개의 항원 결합 구조체들에 있어서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 서로 다른 방식으로 연결될 수 있다. 이로 인해, 상기 VH와 VL 도메인 사이의 상이한 링커 길이의 사용은 이황화 결합의 형성을 보장하기 위해 구조적 가요성 및 움직임 범위를 가능케 한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 2개의 링커 길이는 대략적으로 약 1개 내지 50개의 아미노산, 예를 들어, 2개 내지 15개, 2개 내지 14개, 3개 내지 13개, 4개 내지 10개 또는 5개의 아미노산 내지 8개 아미노산의 범위(이들 수치를 포함함)일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 미니바디를 위한 쌍 내의 링커 각각은 동일한 길이일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 쌍 내의 링커 각각은 상이한 길이일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 링커 길이 쌍의 임의의 조합은 이들이 목적하는 조합을 허용하고/허용하거나 조장하는 한 사용 가능하다. 몇몇 실시형태에서, 개질된 아미노산이 사용될 수 있다.
표 0.2에는 미니바디 변이체들이 제공된다. 상기 변이체들의 생성 및 이들 발현 및 결합에 대한 시험은 새로운 미니바디를 위한 단백질 생성을 위한 목적하는 포맷의 확인을 가능케 한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 링커는 GlySer 링커이다. 상기 GlySer 링커는 Gly 및/또는 Ser 잔기가 풍부한 폴리펩티드일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 GlySer 링커의 아미노산 잔기들 중 적어도 약 40%, 예를 들어 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 Gly, Ser, 또는 Gly와 Ser의 조합이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 GlySer 링커는 적어도 약 2개 아미노산 길이를 가지며, 예를 들어 적어도 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개 또는 40개의 아미노산 길이를 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 링커 모티프는 (G3)Sn 또는 (G4)Sn(n은 S의 임의의 개수일 수 있고; 및 몇몇 실시형태에서는 1 또는 2임)일 수 있다. 예를 들어, a) 5개의 아미노산(GGGGS; 서열번호 66); b) 10개의 아미노산(GGGGSGGGGS; 서열번호 65); c) 15개의 아미노산(GGGGSGGGGSGGGGS; 서열번호 64); d) 12개의 아미노산(GSTSGGGSGGGS; 서열번호 63); 또는 e) 18개의 아미노산(GSTSGGGSGGGSGGGGSS; 서열번호 62)일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 링커는 적어도 하나의 트레오닌을 포함한다.
표 0.1 및 표 0.2에는 scFv 및/또는 미니바디의 몇몇 실시형태에서 사용될 수 있는 다양한 선택적인 서열들이 나타나 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 scFv는 본원에서 제공되는 임의의 것일 수 있지만, 임의의 상기 서열들은 표 0.1에 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 본원에서 제공되는 임의의 것일 수 있지만, 임의의 상기 서열들은 표 0.1에서 전체 행에 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 항원 결합 구조체들은 표 0.1에서 제공된 임의의 상기 힌지 서열 서브파트를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 "미니바디"는 동종 이량체를 포함하며, 이때 단량체 각각은 힌지 서열에 의해 인간 CH3 도메인에 연결된 단일 사슬 가변 단편(scFv)이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 서열은 인간 IgG1 힌지 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 서열은 본원에 개시되고/되거나 표 0.1에 나타낸 임의의 힌지 서열(임의의 서브파트 또는 이들 서브파트들의 조합을 포함함)과 같이 본원에서 제공된 상기 힌지 서열들 중 임의의 하나 이상이다.
몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 서열은 인공적인 힌지 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 서열은 IgG 힌지의 4개의 부류 중 임의의 하나 이상으로부터 유래한 천연 또는 인공적인 IgG 힌지, 또는 서브파트 또는 이의 서브파트들의 조합일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디 서열은 CDR 및/또는 FR, 및/또는 가변 영역 서열들을 포함할 수 있으며, 상기 서열들은 본원에 개시된 서열과 유사하다(예를 들어, 도면 또는 표 0.2에서 발견되는 바와 같음). 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 본원에 개시된 미니바디의 scFv와 적어도 동일한 서열 (CDR, CDR들, 6개의 CDR 전체 세트, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 등)을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, 상기 단량체의 폴리펩티드는 표 0.2에 나타낸 바와 같은 서열들을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 단량체의 폴리펩티드는 표 0.2에 나타낸 VLVH 미니바디 단량체의 서열에 대해 적어도 약 80%의 동일성, 예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 중쇄 서열 in 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 68, 서열번호 99, 서열번호 102 또는 서열번호 104로 표시된 중쇄 서열(및/또는 도 65b 또는 도 65c에 도시된 적절한 서열) 및/또는 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 67, 서열번호 100, 서열번호 101 또는 서열번호 103으로 표시된 경쇄 서열(및/또는 도 65b 또는 도 65c에 도시된 서열)에 대해 적어도 약 80% 동일한 가변 사슬 영역(중쇄, 경쇄 또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역), 예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 가변 사슬 영역을 갖는다.
상기 scFv는 VH-VL 또는 VL-VH 배향을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 VH 및 VL은 아미노산 링커 서열에 의해 서로 연결된다. 상기 아미노산 링커는 본원에 개시된 바와 같은 링커일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 링커는 Gly-Ser 잔기가 풍부하고, 대략 15개 내지 20개의 아미노산 길이를 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 링커는 GlySer이 풍부하고, 18개의 아미노산 길이를 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 링커 길이는 약 1개 내지 50개 아미노산, 예를 들어, 2개 내지 30개, 3개 내지 20개, 4개 내지 15개, 또는 5개의 아미노산 내지 8개의 아미노산(이들 수치를 포함함) 사이에서 다양하다. 몇몇 실시형태에서, 상기 링커는 GSTSGGGSGGGSGGGGSS(서열번호 62)이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디 scFv는 본원에 개시된 scFv에 대해 적어도 약 80% 동일한 서열, 예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 상기 scFv는 VH-VL 또는 VL-VH 배향을 가질 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디의 단량체 각각은 N-말단에서 C-말단으로 이어진 하기 성분들을 포함한다: (a) VL 도메인에 연결된 VH 도메인을 포함하고 표적 분자에 결합하는 scFv 서열, (b) 힌지 도메인(예를 들어, 하부 힌지 및/또는 연장 영역과 조합된 상부 및 코어 힌지 영역) 및 (c) 인간 IgG CH3 서열. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디의 단량체 각각은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 CH3 도메인을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 본원에 개시된 바와 같은 세포, 세포주 또는 기타 적합한 발현 시스템에 의해 발현될 수 있는 핵산에 의해 암호화된다. 따라서 신호 서열은 상기 세포 또는 세포주에서 발현되는 경우에 상기 미니바디의 분비를 가능케 하기 위해 상기 scFv의 N-말단에 융합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 인간 혈청 알부민(서열번호 70)과 같은 기타 신호 서열들이 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상이한 신호 서열들은 문맥 및 발현을 위해 사용된 세포주에 따라 분비를 향상시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 인간 면역 글로불린 카파 경쇄 신호 서열(서열번호 69)이 사용될 수 있고/있거나 본원에서 제공된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 내에 포함될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 단일 서열은 문맥 및 발현을 위해 사용된 세포주에 따라 표 7에 나타낸 목록으로부터 선택될 수 있다.
신호 펩티드 서열
신호 펩티드 공급원 신호 펩티드 서열
마우스 Ig 카파 경쇄 METDTLLLWVLLLWVPGSTG(서열번호 69)
인간 혈청 알부민(HSA) MKWVTFISLLFLFSSAYS(서열번호 70)
인간 아즈로시딘(HAZ) MTRLTVLALLAGLLASSRA(서열번호 71)
프로락틴 RLLLLLWSNLLLCQGWS(서열번호 72)
LCMV-GPC MGQIVTMFEALPHIIDEVININVIIVLlIITSIKAVYNFATCGILALVSFLFLAGRSCG(서열번호 73)
MMTV-Rem MPNHQSGSPTGSSDLLLSGKKQRPHLALRRKRRREMRKINRKVRRMNLAPIKEKTAWQHLQALISEAEEVLKTSQTPQNSLTLFLALLSVLGPPPVTG(서열번호 74)
포유동물 www.signalpeptide.de/index.php?m=listspdb_mammalia 상에서 접속 가능함**
초파리 www.signalpeptide.de/index.php?m=listspdb_drosophila 상에서 접속 가능함**
박테리아 www.signalpeptide.de/index.php?m=listspdb_bacteria 상에서 접속 가능함**
바이러스 www.signalpeptide.de/index.php?m=listspdb_viruses 상에서 접속 가능함**
** 상기에서 인용된 월드와이드웹 상에서 지칭된 신호 펩티드들은 신호 펩티드 데이터베이스에 개시되어 있으며, 상기 데이터베이스는 상기 하이퍼링크를 통해 www.signalpeptide.de 상에서 접속될 수 있고, 그 전체가 본원에서 참고로 인용된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 표적 분자와 결합하는 키메라 미니바디가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키메라 미니바디는 상기 VL-VH 포맷에서 단량체를 포함하고, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 67, 서열번호 100, 서열번호 101 또는 서열번호 103을 포함하는 경쇄 가변 영역의 서열(및/또는 도 65b 또는 도 65c에 도시된 관련 서열) 및 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 68, 서열번호 99, 서열번호 102 또는 서열번호 104를 포함하는 중쇄 가변 영역의 서열(및/또는 도 65b 또는 도 65c에 도시된 서열), 또는 표 0.2에 나열된 바와 같은 단량체 또는 이에 대해 적어도 약 80%의 동일성을 갖는 서열, 예를 들어 이에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키메라 미니바디는 상기 VH-VL 포맷에서 단량체를 포함하고, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 67, 서열번호 100, 서열번호 101 또는 서열번호 103을 포함하는 경쇄 가변 영역의 서열(및/또는 도 65b 또는 도 65c에 도시된 관련 서열) 및 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 68, 서열번호 99, 서열번호 102 또는 서열번호 104를 포함하는 중쇄 가변 영역의 서열(및/또는 도 65b 또는 도 65c에 도시된 관련 서열), 또는 표 0.2에 나타낸 바와 같은 단량체 또는 이에 대해 적어도 약 80%의 동일성을 갖는 서열, 예를 들어 이에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 도 41, 도 48, 도 55, 도 61, 도 65b 또는 도 65c에 나타낸 CDR들 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 도 36a, 도 36b, 도 36c, 도 36d, 도 36e, 도 66, 도 67, 도 68, 도 69, 도 65b 또는 도 65c 또는 표 0.2에 나타낸 가변 영역들 중 하나 이상을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 도 36a, 도 36b, 도 36c, 도 36d, 도 36e, 도 66, 도 68, 도 69, 도 65b 또는 도 65c에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 도 36a, 도 36b, 도 36c, 도 36d, 도 36e, 도 67, 도 69, 도 65b 또는 도 65c에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 도 41, 도 48, 도 55, 도 61, 도 65b 또는 도 65c에 도시된 CDR로 제공된 CDR들 중 하나 이상을 포함한다.
핵산
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체들의 폴리펩티드는 핵산에 의해 암호화될 수 있고 생체 내 또는 시험관 내에서 발현될 수 있거나, 이들 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 따라서 몇몇 실시형태에서 항원 결합 구조체를 암호화하는 핵산이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 핵산은 미니바디 또는 기타 항원 결합 구조체의 하나의 부분 또는 단량체를 암호화한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 핵산은 2개 이상의 단량체, 예를 들어 적어도 2개의 단량체를 암호화한다. 다중 단량체를 암호화하는 핵산은 적어도 2개의 단량체들 사이에 핵산 절단 부위를 포함할 수 있고, 2개 이상의 단량체들 사이에 전사 또는 번역 개시 부위를 암호화할 수 있고/있거나 2개 이상의 단량체들 사이에 단백질 분해용 표적 부위를 암호화할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 발현 벡터는 본원에서 개시된 바와 같은 항원 결합 구조체를 암호화하는 핵산을 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 발현 벡터는 포유동물 발현용 pcDNA3.1TM/myc-His(-) 버젼 A 벡터(인비트로젠(Invitrogen, Inc.)사) 또는 이의 변이체를 포함한다. 상기 pcDNA3.1 발현 벡터는 포유동물 발현용 CMV 프로모터 및 포유동물(네오마이신(Neomycin)) 및 박테리아(암피실린(Ampicillin)) 선별 마커 둘 모두용 CMV 프로모터를 특징으로 한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 발현 벡터는 플라스미드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 실시형태에서, 상기 벡터는 코스미드, YAC 또는 BAC를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디 단량체들 중 적어도 하나를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 CD3, CD8, 5T4, PSMA 및 PSCA에 결합하기 위한 본원에서 개시된 서열 또는 이에 대해 적어도 약 80%의 동일성을 갖는 서열, 예를 들어 이에 대해 약 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하여 본원에서 제공된 서열번호들 중 적어도 하나를 포함한다.
세포주
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 항원 결합 구조체들 중 적어도 하나(본원에서 제공된 힌지의 적어도 서브파트를 포함할 수 있음)를 발현하는 세포주가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 포유동물 세포주(예를 들어, CHO-K1 세포주)는 본원에 개시된 바와 같이 미니바디, scFv 또는 기타 항체를 생성하기 위한 발현 시스템이다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 미니바디, scFv 및 기타 항체 또는 이들의 항체 단편들은 비-글리코실화되어 있으며, 번역후 개질이 불필요함에 따라 포유동물 발현 시스템이 요구되지 않는다. 따라서 몇몇 실시형태에서 매우 다양한 포유동물 또는 비-포유동물 발현 시스템들 중 하나 이상은 본원에서 개시된 항원 결합 구조체들(예를 들어, 미니바디)을 생성하기 위해 사용되며, 상기 발현 시스템들로는 포유동물 발현 시스템(예를 들어, CHO-K1 세포), 박테리아 발현 시스템(예를 들어, 대장균(E. coli), 고초균(B. subtilis)), 효모 발현 시스템(예를 들어, 피치아(Pichia), 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)) 또는 임의의 기타 공지된 발현 시스템을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 기타 시스템은 곤충 세포 및/또는 식물 세포를 포함할 수 있다.
항원 결합 구조체의 개질
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 적어도 하나의 개질을 포함한다. 예시적인 개질로는 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화(derivatization), 단백질 분해 절단 및 세포성 리간드 또는 기타 단백질에 대한 연결에 의해 개질되었던 항원 결합 구조체들을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 임의의 다수의 화학적 개질은 공지된 기법에 의해 수행될 수 있으며, 상기 기법으로는 특정 화학적 절단, 아세틸화 및 튜니카마이신(tunicamycin)의 대사적 합성을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 유도체는 하나 이상의 비자연적인 아미노산을 함유할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 항-표적 접합체를 형성하기 위해 다른 물질에 접합된다. 본원에 개시된 접합체들은 항원 결합 구조체를 지질, 탄수화물, 단백질 또는 기타 원자 및 분자들과 연결하는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 접합체는 적합한 연결 또는 결합을 이용하는 부위-특이적 접합에 의해 형성된다. 부위-특이적 접합은 항원 결합 구조체의 결합 활성을 보존할 가능성이 더욱 높다. 상기 물질은 티오에테르 결합 형성을 통해 환원된 항원 결합 구조체의 힌지 영역에 접합되거나 부착될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 티로신 접합이 이용될 수 있다. 상기 접합체를 형성하기 위해 사용된 기타 연결 또는 결합들로는 공유결합, 비공유결합, 이황화 결합, 히드라존 결합, 에스테르 결합, 아미도 결합 및 아미노 결합, 이미노 결합, 티오세미카바존 결합, 세미카바존 결합, 옥심 결합 및 탄소-탄소 결합을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 어떠한 시스테인 또는 기타 연결 양태도 상기 항원 결합 구조체에 포함될 필요가 없다.
검출 가능한 마커
몇몇 실시형태에서, 개질된 항원 결합 구조체는 검출 가능한 마커에 접합된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "검출 가능한 마커"는 표적 분자, 세포, 조직, 기관 등의 위치 및/또는 양을 진단하거나, 검출하거나 시각화하는데 유용한 원자, 분자, 또는 화합물을 포함한다. 본원의 실시형태에 따라 사용될 수 있는 검출 가능한 마커들로는 방사성 물질(예를 들어, 방사성 동위원소, 방사성 핵종, 방사선 표지 또는 방사선 트레이서(radiotracer)), 염료, 조영제, 형광 화합물 또는 분자, 생물 발광 화합물 또는 분자, 효소 및 증강제(예를 들어, 상자성 이온)를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 게다가, 몇몇 나노입자, 예를 들어 양자점 및 금속 나노입자(후술됨)는 검출제(detection agent)로서 사용하기에 적합할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 검출 가능한 마커는 인도시아닌 그린(ICG), 지르코늄-89, IR800, 및/또는 다른 근적외선 염료이다.
본원의 실시형태에 따라 검출 가능한 마커로서 사용될 수 있는 예시적인 방사성 물질들로은 18F, 18F-FAC, 32P, 33P, 45Ti, 47Sc, 52Fe, 59Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 75Sc, 77As, 86Y, 90Y, 89Sr, 89Zr, 94Tc, 94Tc, 99mTc, 99Mo, 105Pd, 105Rh, 111Ag, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 153Sm, 154-158Gd, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 169Er, 175Lu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 194Ir, 198Au, 199Au, 211At, 211Pb, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 223Ra 및 225Ac를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 검출 가능한 마커로서 사용될 수 있는 예시적인 상자성 이온 물질들은 전이 금속 및 란탄족 금속(예를 들어, 6 내지 9, 21 내지 29, 42, 43, 44 또는 57 내지 71의 원자 번호를 갖는 금속)의 이온을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 금속은 Cr, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb 및 Lu 이온을 포함한다.
상기 검출 가능한 마커가 방사성 금속 또는 상자성 이온인 경우, 몇몇 실시형태에서 상기 마커는 하나 이상의 킬레이트기를 함유한 롱테일(long tail)을 갖는 시약과 반응할 수 있으며, 상기 킬레이트기는 이들 이온을 결합시키기 위한 롱테일에 부착되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 시약은 항체 단편 사슬을 공유결합적으로 묶도록 설계된 반응기를 함유할 수 있다. 상기 롱테일은 폴리리신, 다당류, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 또는 상기 이온을 결합시키기 위한 킬레이트기에 결합될 수 있는 펜던트기(pendant group)를 갖는 기타 유도체화되거나 유도체화 가능한 사슬과 같은 중합체일 수 있다. 본원의 실시형태에 따라 사용될 수 있는 킬레이트기의 예로는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), DOTA, NOTA, NODAGA, NETA, 데페록사민(deferoxamine(Df); DFO로도 지칭될 수 있음), 포르피린류, 폴리아민류, 크라운 에테르류, 비스-티오세미카바존류, 폴리옥심류 및 유사한 기를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비방사성 금속과 복합체를 형성하는 경우에 동일한 킬레이트 화합물은 본원에 개시된 항원 결합 구조체 및 담체들과 함께 사용되는 경우에 MRI용으로 유용하다. NOTA, NODAGA, DOTA 및 TETA와 같은 거대 고리형 킬레이트 화합물들은 다양한 금속 및 방사성 금속과 함께 사용되며, 이때 상기 방사성 금속으로는 갈륨, 이트륨 및 구리 각각의 방사성 핵종을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. RAIT용 라듐-223과 같이 방사성 핵종을 안정하게 결합시키는데 관심이 있는 거대 고리형 폴리에테르류와 같은 기타 고리형 킬레이트 화합물들이 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 킬레이트 모이어티(chelating moiety)는 알루미늄-18F 또는 지르코늄-89 복합체와 같은 PET 이미징제를 PET 분석에 사용하기 위한 표적화 분자에 부착하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 실시형태에 따라 검출 가능한 마커로서 사용될 수 있는 예시적인 조영제들로는 바륨, 디아트리조에이트(diatrizoate), 에틸요오드 오일, 시트르산갈륨, 이오카르믹산(iocarmic acid), 이오세타믹산(iocetamic acid), 이오다미드(iodamide), 이오디파미드(iodipamide), 요오드옥사민산, 이오글라미드(iogulamide), 이오헥실(iohexyl), 이오파미돌(iopamidol), 요오파노산(iopanoic acid), 이오프로세믹산(ioprocemic acid), 이오세파민산(iosefamic acid), 이오세린산(ioseric acid), 이오술아미드 메글루민(iosulamide meglumine), 이오세메트산(iosemetic acid), 이오타술(iotasul), 이오테트르산(iotetric acid), 이오탈라민산(iothalamic acid), 이오트록시산(iotroxic acid), 이오자갈르산(ioxaglic acid), 이옥소트리조산(ioxotrizoic acid), 이포데이트(ipodate), 메글루민, 메트리자미드(metrizamide), 메트리조에이트(metrizoate), 프로필리돈(propyliodone), 염화제일탈륨 또는 이들의 조합을 들 수가 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시형태에 따라 검출 가능한 마커로서 사용될 수 있는 생물 발광 및 형광 화합물 또는 분자 및 염료들로는 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시안산염(FITC), OREGON GREENTM, 로다민, 텍사스레드(Texas red), 테트라로다민 이소티오시안산염(TRITC), Cy3, Cy5 등, 형광 마커(예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP), 피코에리트린(phycoerythrin) 등), 종양 관련 프로테아제에 의해 활성화된 자가-켄칭(autoquenching)된 형광 화합물, 효소(예를 들어, 루시페라아제(luciferase), 고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등), 나노입자, 비오틴, 디곡시게닌(digoxigenin) 또는 이들의 조합을 들 수가 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시형태에 따라 검출 가능한 마커로서 사용될 수 있는 효소로는 고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 산 포스파타아제, 글루코오스 옥사다아제, β-갈락토시다아제, β-글루쿠로니다아제 또는 β-락탐아제를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이 같은 효소들은 검출 가능한 신호를 생성하기 위해 색원체(chromogen), 형광 발생 화합물 또는 발광 화합물과 함께 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 나노입자에 접합된다. "나노입자"란 용어는 크기가 나노미터 단위로 측정되는 미세한 입자, 예를 들어 약 100㎚ 미만의 적어도 단일 치수를 갖는 입자를 지칭한다. 나노입자는 가시광선을 흡수하기보다는 이를 산란시키기에 충분히 작기 때문에 이들은 검출 가능한 물질로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 금 나노입자는 유의한 가시광선 감쇄 특성을 나타내며, 용액에서 심홍색 내지 흑색으로 보인다. 그 결과, 나노입자에 접합된 항원 결합 구조체를 포함하는 조성물들은 개체 내에서 T 세포의 생체 내 이미징을 위해 사용될 수 있다. 크기 범위의 스몰엔드(small end)에서, 나노입자는 종종 클러스터(cluster)로서 지칭된다. 하이브리드 구조(예를 들어, 코어-쉘 나노입자)뿐만 아니라 금속, 유전체 및 반도체 나노입자가 형성되어 있다. 나노스피어(nanosphere), 나노로드(nanorod) 및 나노컵(nanocup)은 계속 성장해온 일부 형상이다. 반도체 양자점 및 나노결정은 부가적인 유형의 나노입자의 예이다. 이 같은 나모 규모의 입자는 항원 결합 구조체에 접합되는 경우에 본원에 개시된 바와 같이 T 세포의 생체 내 검출을 위한 이미징제로서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 안정한 힌지를 가지면 표적화제(targeting agent)에 안정성을 부여할 것이다. 몇몇 실시형태에서, 이는 보다 양호한 생물 분포, 보다 높은 민감도 및/또는 신장 제거의 감소를 초래한다. 따라서 이들 구조체는 보다 높은 특정 활성 수준을 위해 보다 적용 가능할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이는 방사선 감수성 기관인 신장에 대한 높은 투여 없이도 실질적으로 개선된 민감도를 부여한다. 몇몇 실시형태에서, 이들 구조체는 동일한 이유(낮은 신장 흡수)로 인해 RIT용으로 보다 적합하다. 몇몇 실시형태에서, 온화한 조건 하에서의 화학적 환원으로 인해 1개 또는 2개의 이황화 결합이 파괴되어 이들을 핸들로서 사용하지만 나머지 이황화물이 온전하게 유지될 것이기 때문에 현재 시스테인에 대한 부위-특이적 접합이 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이는 미니바디 접합체의 완전성을 보존할 것이다.
치료제 및 조성물
몇몇 실시형태에서, 약학 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물, 또는 당해 화합물을 하나의 조직, 기관 또는 신체의 일부분으로부터 다른 조직, 기관 또는 신체의 일부분으로 이송하거나 전달하는 것과 관련이 있는 비히클일 수 있다. 예를 들어, 상기 담체는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 봉지재, 또는 이들의 몇몇 조합일 수 있다. 상기 담체의 구성성분 각각은 제형의 기타 성분들과 양립 가능하다는 점에서 "약학적으로 허용 가능"하다. 이는 또한 상기 구성성분이 우연히 만나게 되는 임의의 조직, 기관 또는 신체의 일부분과의 접촉을 위해 적합하며, 이는 상기 구성성분이 이상적으로는 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성, 또는 이의 치료학적 이점을 지나치게 능가하는 임의의 기타 합병증의 위험성을 갖지 않는다는 것을 의미한다.
본원에 개시된 약학 조성물들은 임의의 적합한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는 당해 기술분야에 공지된 임의의 투여 경로를 지칭할 수 있으며, 상기 투여 경로로는 에어로졸, 장관, 비강, 안구, 경구, 비경구, 직장, 경피(예를 들어, 국소용 크림 또는 연고, 패치) 또는 질을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. "경피" 투여는 국소용 크림 또는 연고를 사용하거나 경피 패치에 의해 달성될 수 있다. "비경구"는 일반적으로 주사와 연관된 투여 경로를 지칭하며, 이때 상기 투여 경로로는 안와하, 주입, 동맥 내, 낭 내, 심장 내, 진피 내, 근육 내, 복강 내, 폐 내, 척수 내, 흉골 내, 척수강 내, 자궁 내, 정맥 내, 지주막하, 피막하, 피하, 경점막 또는 경기관을 들 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 중재시술 또는 절제 도중에 국부 투여로서 외과적 수술에 의해 전달될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항원 결합 구조체는 치료제에 접합된다. 본원에서 사용된 바와 같이 "치료제"는 표적 분자와 관련된 질환의 치료에 유용한 원자, 분자 또는 화합물이다. 치료제의 예로는 약물, 화학 치료제, 치료용 항체 및 항체 단편, 독소, 방사성 동위원소, 효소(예를 들어, 상기 항원 결합 구조체 결합 부위에서 프로드러그(prodrug)를 세포 독성제로 절단하기 위한 효소), 뉴클레아제(nuclease), 호르몬, 면역 조절제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제 및 염료, 및 나노입자를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 질환의 예로는 하나 이상의 표적 분자와 관련된 질환을 들 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 표적 분자는 CD8, CD3, PSMA, PSCA 및 5T4 중 하나 이상일 수 있다.
화학 치료제는 종종 자연에서 세포 독성 또는 세포 증식 억제성을 나타내고, 알킬화제, 대사 길항 물질, 항-종양 항생제, 토포이소머라아제(topoisomerase) 억제제, 유사분열 억제제, 호르몬 요법제, 표적화 치료제 및 면역 치료제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 실시형태에 따라 검출 가능한 마커로서 사용될 수 있는 화학 치료제들로는 13-시스-레티노산, 2-클로로데옥시아데노신, 5-아자시티딘(5-azacitidine), 5-플루오로우라실, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 악티노마이신-D, 아드리아마이신(adriamycin), 알데스류킨(aldesleukin), 알렘투주맙(alemtuzumab), 알리트레티노인(alitretinoin), 전트랜스형 레티노산, 알파 인터페론, 알트레타민(altretamine), 아메톱테린(amethopterin), 아미포스틴(amifostine), 아나그렐리드(anagrelide), 아나스트로졸(anastrozole), 아라비노실시토신(arabinosylcytosine), 3산화 비소, 암사크린(amsacrine), 아미노캠프토세신(aminocamptothecin), 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 아스파라기나아제(asparaginase), 아자시티딘(azacytidine), 바실러스 칼메테 구에린(BCG), 벤다무스틴(bendamustine), 베바시주맙(bevacizumab), 벡사로텐(bexarotene), 비칼루타미드(bicalutamide), 보르테조밉(bortezomib), 블레오마이신(bleomycin), 부설판(busulfan), 류코보린 칼슘(calcium leucovorin), 시트로보룸(citrovorum) 인자, 카페시타빈(capecitabine), 카넬티닙(canertinib), 카르보플라틴(carboplatin), 카르무스틴(carmustine), 세툭시맙(cetuximab), 클로람부실(chlorambucil), 시스플라틴(cisplatin), 클라드리빈(cladribine), 코르티손(cortisone), 사이클로포스파미드, 시타라빈(cytarabine), 다르베포에틴알파(darbepoetin alfa), 다사티닙(dasatinib), 다우노마이신(daunomycin), 데시타빈(decitabine), 데니류킨 디프티톡스(denileukin diftitox), 덱사메타손(dexamethasone), 덱사손(dexasone), 덱스라족산(dexrazoxane), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 다카르바진(decarbazine), 도세탁셀(docetaxel), 독소루비신(doxorubicin), 독시플루리딘(doxifluridine), 에닐우라실(eniluracil), 에피루비신(epirubicin), 에포에틴알파, 얼로티닙(erlotinib), 에베롤리무스(everolimus), 엑스메스탄(exemestane), 에스트라무스틴(estramustine), 에토포시드(etoposide), 필그라스팀(filgrastim), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 풀베스트란트(fulvestrant), 플라보피리돌(flavopiridol), 플록슈리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 플루오로우라실, 플루타미드(flutamide), 제피티닙(gefitinib), 젬시타빈(gemcitabine), 젬투주맙 오조가마이신(gemtuzumab ozogamicin), 고세렐린(goserelin), 과립구-콜로니 자극 인자, 과립구 마크로파지-콜로니 자극 인자, 헥사메틸멜라민, 하이드로코르티손 하이드록시우레아, 이브리투모맙(ibritumomab), 인터페론 알파, 인터류킨-2, 인터류킨-11, 이소트레티노인(isotretinoin), 익사베필론(ixabepilone), 이다루비신(idarubicin), 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate), 이포스파미드(ifosfamide), 이리노테칸(irinotecan), 라파티닙(lapatinib), 레날리도미드(lenalidomide), 레트로졸(letrozole), 류코보린(leucovorin), 류프로라이드(leuprolide), 리포좀성 Ara-C, 로무스틴(lomustine), 메클로르에타민(mechlorethamine), 메게스트롤(megestrol), 멜팔란(melphalan), 메르캅토푸린, 메스나(mesna), 메토트렉세이트(methotrexate), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 마이토마이신 C, 마이토테인(mitotane), 미톡산트론(mitoxantrone), 넬라라빈(nelarabine), 닐루타미드(nilutamide), 옥트레오타이드(octreotide), 오프레베킨(oprelvekin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 파미드론산염(pamidronate), 페메트렉세드(pemetrexed), 파니투무맙(panitumumab), PEG 인터페론, 페가스파르가제(pegaspargase), 페그필그라스팀(pegfilgrastim), PEG-L-아스파라기나아제, 펜토스타틴(pentostatin), 플리카마이신(plicamycin), 프레드니솔론(prednisolone), 프레드니손(prednisone), 프로카바진(procarbazine), 랄록시펜(raloxifene), 리툭시맙(rituximab), 로미플로스팀(romiplostim), 랄리트렉세드(ralitrexed), 사파시타빈(sapacitabine), 사그라모스팀(sargramostim), 사트라플라틴(satraplatin), 소라페닙(sorafenib), 수니티닙(sunitinib), 세무스틴(semustine), 스트렙토조신(streptozocin), 타목시펜(tamoxifen), 테가푸르(tegafur), 테가푸르-우라실, 템시롤리무스(temsirolimus), 테모졸라미드(temozolamide), 테니포사이드(teniposide), 탈리도마이드(thalidomide), 티오구아닌, 티오테파(thiotepa), 토포테칸(topotecan), 토레미펜(toremifene), 토시투모맙(tositumomab), 트라스투주맙(trastuzumab), 트레티노인(tretinoin), 트리미트렉세이트(trimitrexate), 알루비신(alrubicin), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 빈데스틴(vindestine), 비노렐빈(vinorelbine), 보리노스타트(vorinostat) 또는 졸레드론산을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시형태에 따라 사용될 수 있는 독소들로는 아우리스타틴 E(Auristatin E), 아우리스타틴 F, 도라스타틴 10(Dolastatin 10), 도라스타틴 15, 콤브레타스타틴(combretastatin) 및 이들의 유사체, 메이탄시노이드(maytansinoid), 칼키아마이신(calicheamicin), 알파-아미니틴(α-amanitin), 피롤로벤조디아제핀 이량체, 에포틸론(epothilone)류, 두오카마이신(duocarmycin) 및 이들의 유사체, 튜부리신 D(tubulysin D), 바실리스타틴(basillistatin)류, 리신(ricin), 아브린(abrin), 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 포도상구균 장독소-A, 미국자리공 항바이러스성 단백질, 겔로닌(gelonin), 디프테리아 독소, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 및 슈도모나스 내독소를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 나노입자는 항원 결합 구조체에 접합되는 경우에 화학 치료제, 호르몬 치료제, 방사선 치료제, 독소, 또는 당해 기술분야에 공지된 임의의 기타 세포 독성제 또는 항암제를 세포 표면 상에 표적을 과발현시키는 암세포로 전달하는 약물 담체로서의 치료적 적용에 사용된다.
본원에 개시된 임의의 상기 항원 결합 구조체들은 하나 이상의 부가적인 치료제, 검출 가능한 마커, 나노입자, 담체 또는 이들의 조합과 추가로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 구조체는 항-표적 분자-지질 접합체가 미셀(micelle)을 형성하도록 요오드-131로 방사성 표지되고 지질 담체에 접합될 수 있다. 상기 미셀은 하나 이상의 치료용 마커 또는 검출 가능한 마커를 혼입할 수 있다. 대안적으로는, 상기 담체 이외에도 상기 항원 결합 구조체는 요오드-131(예를 들어, 티로신 잔기에서)로 방사성 표지되고 약물 (예를 들어, 리신 잔기의 엡실론 아미노기에서)에 접합될 수 있으며, 상기 담체는 부가적인 치료용 마커 또는 검출 가능한 마커를 혼입할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항원 결합 구조체들은 치료제에 접합된다. 이들 항원 결합 구조체가 전장 항체와 비교해서 보다 짧은 순환 반감기를 가질 수 있을지라도 몇몇 실시형태에서 이들 포맷은 이들의 보다 작은 크기에 기초하여 개선된 종양 침투를 나타낼 수 있고, 세포 독성 약물 또는 방사성 동위원소로 적절히 장착되는 경우에 치료학적으로 효과적일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항원 약물-접합체 접근법이 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 치료적 접근법은 표적 조직에 대한 요오드-131, 베타-에미터(예를 들어, 이트륨-90, 루테튬-177, 구리-67, 아스타틴-211, 납-212/비스무트-212, 악티늄-225/비스무트-213) 및 토륨과 같은 적절한 방사선 표지의 부착을 통한 방사성 면역요법을 포함하며, 상기 방사선 표지는 세포 손상 및 사멸을 야기할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 세포 독성 약물 또는 방사성 핵종으로 장착된 이들 단편에 의한 처리는 상기 단편이 신체로부터 보다 신속하게 제거될 것이기 때문에 비특이적 독성의 감소를 초래한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 상기 표적 분자의 발현과 연관된 질환에 대한 치료제와 결합될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 표적 분자 항원 결합 구조체들은 상기 표적 분자의 발현과 연관된 질환의 치료에서 독립형 약제(예를 들어, 치료제가 없는 항원 결합 구조체)로서 사용된다.
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 아미노산 힌지 영역을 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 미니바디의 30% 미만의 집성체(또는 고분자량 구조체), 예를 들어, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만의 집성체가 상기 조성물 내에 존재한다.
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 구조체의 아미노산 힌지 영역을 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 1마이크로그램 내지 100㎎의 양이 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이 같은 조성물은 상술한 힌지 배열이 없는 구조체들과 비교하여 감소된 수준의 집성체를 가질 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 질환은 5T4, CD8, CD3, PSCA 또는 PSMA와 연관된 질환이다. 그러나 본원에서 개시된 다양한 힌지들은 한지를 포함하는 임의의 표적 분자 또는 항원 결합 구조체에 적용될 수 있다.
키트
몇몇 실시형태에서, 키트가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 본원에 개시된 항원 결합 구조체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 본원에 개시된 항원 결합 구조체를 암호화하는 핵산을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 본원에 개시된 바와 같은 항원 결합 구조체를 생산하는 세포주를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 본원에 개시된 바와 같은 검출 가능한 마커를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 본원에 개시된 바와 같은 치료제를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 완충액을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 양성 대조군, 예를 들어 표적 특이적 세포 또는 이들의 단편을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 음성 대조군, 예를 들어 실질적으로 표적이 없는 표면 또는 용액을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 포장재를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 키트는 지침서를 포함한다.
표적 분자의 존재 유무를 검출하는 방법
항원 결합 구조체들은 생체 내 및/또는 시험관 내에서 표적 분자의 존재 유무를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 몇몇 실시형태는 상기 표적의 존재 유무를 검출하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 항원 결합 구조체를 시료에 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 표적 분자에 대한 상기 항원 결합 구조체의 결합 또는 상기 결합의 부재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 표적 분자는 본원에서 제공된 옵션을 통해 검출될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 검출될 표적 분자는 5T4, CD8, CD3, PSCA 및 PSMA 중 하나 이상이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 표적 분자는 도면 및/또는 표 0.2(또는 표 0.1에 나타낸 바와 같이 적어도 힌지 배열을 이용함)와 같은 표에서 제공된 미니바디 배열들 중 하나 이상을 이용하여 검출된다.
상기 표적 분자의 존재 유무를 검출하는 방법들이 본원에서 제공된다. 하기 공정들은 임의의 순서로 수행될 수 있고/있거나 임의적으로 반복 및/또는 소거될 수 있는 것으로 인지될 것이며, 부가적인 단계는 상기 방법에 임의적으로 부가될 수 있는 것을 인지될 것이다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 항원 결합 구조체는 시료에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 선택적인 세척이 수행될 수 있다. 임의적으로는, 이차 항원 결합 구조체이 상기 시료에 적용될 수 있다. 선택적인 세척이 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 표적 분자의 항원 결합 구조체에 대한 결합 또는 상기 결합의 부재는 검출될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 항원 결합 구조체는 생체 내에서 시료에 적용된다. 상기 항원 결합 구조체는 개쳉 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 인간이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 비인간 포유동물, 예를 들어 래트, 마우스, 기니피그, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 염소, 양, 당나귀, 돼지, 원숭이 또는 유인원이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 개체에 주입된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 주입은 정맥 내로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 상기 주입은 복강 내로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 상기 개체에 국소적 또는 국부적으로 적용된다(중재적 또는 수술적 적용의 경우와 같음). 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체를 함유하는 캡슐은, 예를 들어 경구 또는 복강 내로 상기 개체에 적용된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 개체에 의한 면역원성 반응의 위험성을 줄이기 위해 선택된다. 예를 들어, 인간 개체에 있어서 상기 항원 결합 구조체는 본원에 개시된 바와 같이 인간화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체의 생체 내 적용 이후 시료 또는 상기 시료의 일부분은 숙주로부터 제거된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 생체 내로 적용되고, 본원에 개시된 바와 같이 소정의 시간 동안 생체 내에서 배양하고, 상기 시료는 시험관 내 분석, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같이 상기 표적 분자에 결합된 항원 결합 구조체의 시험관 내 검출 또는 이의 부재에 대한 검출을 위해 제거된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 시험관 내에서 시료에 적용된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 시료는 개체, 예를 들어 생검(biopsy)으로부터 신선하게 수확된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 시료는 개체로부터의 수확 이후에 배양된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 시료는 고정된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 시료는 기관 및/또는 조직 전체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 시료는 하나 이상의 세포 전체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 시료는 세포 추출물, 예를 들어 용해물로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 용해된 상태의 항원 결합 구조체는 상기 시료 중의 용액에 첨가된다. 몇몇 실시형태에서, 용해된 상태의 항원 결합 구조체는 용액을 함유하지 않는 시료, 예를 들어 동결 건조된 시료에 첨가되며, 따라서 상기 시료가 복원된다. 몇몇 실시형태에서, 동결 건조된 항원 결합 구조체는 용액을 함유하는 시료에 첨가되며, 따라서 상기 항원 결합 구조체가 복원된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 임의적으로는 상기 시료와 함께 배양된다. 상기 항원 결합 구조체는 약 14일 미만의 기간, 예를 들어 약 14일 미만, 13일 미만, 12일 미만, 11일 미만, 10일 미만, 9일 미만, 8일 미만, 7일 미만, 6일 미만, 5일 미만, 4일 미만, 3일 미만, 2일 미만 또는 1일 미만의 기간 동안 배양될 수 있거나, 약 23시간 미만의 기간, 예를 들어 약 23시간 미만, 22시간 미만, 21시간 미만, 20시간 미만, 19시간 미만, 18시간 미만, 17시간 미만, 16시간 미만, 15시간 미만, 14시간 미만, 13시간 미만, 12시간 미만, 11시간 미만, 10시간 미만, 9시간 미만, 8시간 미만, 7시간 미만, 6시간 미만, 5시간 미만, 4시간 미만, 3시간 미만, 2시간 미만, 1시간 미만, 0.75시간 미만, 0.5시간 미만, 0.25시간 미만 또는 0.1시간 미만의 시간 동안 배양될 수 있으며, 이때 상기 나열된 값들 중 임의의 2개의 값 사이의 범위를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 배양은 상기 항원 결합 구조체가 투여된 개체 내에서 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 상기 배양은 배양기 내에서 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 상기 배양기는 고정 온도, 예를 들어 약 21℃, 실온, 25℃, 29℃, 34℃, 37℃ 또는 40℃로 유지된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 표적에 결합되지 않은 항원 결합 구조체는 임의적으로는 상기 시료로부터 제거된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 시료는 세척된다. 시료의 세척은 결합하지 않은 항원 결합 구조체를 함유하는 용액을 제거하는 단계 및 항원 결합 구조체를 함유하지 않는 용액, 예를 들어 완충 용액을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 결합하지 않은 항원 결합 구조체를 함유하는 용액을 흡입, 피펫팅(pipetting), 펌핑 또는 배수하고 항원 결합 구조체를 함유하지 않는 용액을 첨가함으로써 시험관 내 시료를 세척한다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 항원 결합 구조체를 함유하지 않는용액을 상기 개체에 투여하거나 항원 결합 구조체 국소 투여 부위를 세척함으로써 생체 내 시료를 세척한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 세척은 적어도 2회, 예를 들어 적어도 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 15회 또는 20회 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 세척 또는 세척들 이후에 결합하지 않은 항체의 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상은 상기 시료로부터 제거된다.
몇몇 실시형태에서, 결합되지 않은 항원 결합 구조체는 상기 시료로부터 소거된다. 상기 시료에 대한 항원 결합 구조체의 적용 이후, 상기 표적에 결합된 항원 결합 구조체는 상기 표적에 결합되지 않은 항원 결합 구조체와의 평행에 도달하여, 상기 항원 결합 구조체의 적용 이후 어느 시점에 상기 표적에 결합된 항원 결합 구조체의 양이 실질적으로 증가하지 않게 된다. 이러한 시간 이후, 상기 표적에 결합되지 않은 항원 결합 구조체의 양의 적어도 일부분은 소거될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 결합되지 않은 항원 결합 구조체는 상기 항체 또는 단편이 전달되는 개체의 대사과정 또는 기타 신체 진행 과정에 의해 소거된다. 몇몇 실시형태에서, 결합되지 않은 항원 결합 구조체는 상기 결합되지 않은 항원 결합 구조체를 파괴하거나 불안정하게 하는 약제, 예를 들어 프로테아제 또는 중화 항체의 부가에 의해 소거된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체의 적용 1일 후에는 상기 적용된 항원 결합 구조체의 적어도 약 30%, 예를 들어 적어도 약 30%, 40%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9%가 소거되었다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체의 적용 2일 후에는 상기 적용된 항원 결합 구조체의 적어도 약 40%, 예를 들어 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9%가 소거되었다.
몇몇 실시형태에서, 상기 표적 분자의 존재 유무가 검출된다. 상기 표적의 존재 유무는 상기 시료 중의 항원 결합 구조체의 존재 유무에 기초하여 검출될 수 있다. 예를 들어 세척 및/또는 대사적 소거에 의한 상기 시료로부터 항원 결합 구조체의 제거 및/또는 소거 이후, 상기 시료 중의 잔류 항원 결합 구조체는 상기 표적의 존재를 나타낼 수 있는 반면, 상기 시료 중의 항원 결합 구조체의 부재는 상기 표적의 부재를 나타낼 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 본원에 개시된 바와 같이 검출 가능한 마커를 포함한다. 따라서 상기 항원 결합 구조체의 존재는 상기 검출 가능한 마커를 검출함으로써 추론될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 이차 항원 결합 구조체는 상기 항원 결합 구조체를 검출하기 위해 사용된다. 상기 이차 항원 결합 구조체는 상기 항원 결합 구조체에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 상기 이차 항원 결합 구조체는 항체의 숙주 형태 또는 상기 항원 결합 구조체 자체에 대한 다클론성 또는 단클론성 항체, 다이바디, 미니바디 등을 포함할 수 있다. 상기 이차 항원 결합 구조체는 본원에 개시된 바와 같은 검출 가능한 마커에 접합될 수 있다. 상기 이차 항원 결합 구조체는 상기 시료에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 이차 항원 결합 구조체는 상기 항원 결합 구조체와 실질적으로 동일한 방식으로 상기 시료에 적용된다. 예를 들어, 상기 항원 결합 구조체가 개체에 주입되는 경우, 상기 이차 항원 결합 구조체는 또한 상기 개체에 주입될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체의 결합 또는 상기 결합의 부재는 양전자 방출 단층촬영(PET), 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT), 자기 공명 이미징(NMR) 및 형광 방출의 검출 중 적어도 하나를 통해 검출된다. PET는 소형 동물 PET 이미징을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체의 결합 또는 상기 결합의 부재는 2개 이상의 이미징 형태를 통해 검출된다. 몇몇 실시형태에서, 근적외선(NIR) 및/또는 체렌코프(Cerenkov) 방사선를 통해 검출이 이루어질 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 예를 들어 PET + NIR, PET + SPECT 등을 포함한 임의의 이미징 양식의 조합이 가능하다.
치료제를 세포에 표적화하는 방법
항원 결합 구조체들은 치료용 분자, 예를 들어 세포 독소를 상기 표적 분자를 발현하는 세포와 같이 표적-양성 세포에 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 몇몇 실시형태는 치료제를 표적-양성 세포에 표적화하는 방법들을 포함한다. 상기 방법은 본원에 개시된 바와 같은 항원 결합 구조체를 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 개체는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어 적어도 몇몇 표적-양성 세포의 소거 또는 중화를 필요로 하는 개체일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 치료제를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 치료제는 이황화 결합과 같은 공유결합을 통해 상기 항원 결합 구조체에 직접 접합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 다른 세포 또는 약제에 대한 표적 분자-양성 세포의 국부화(localization)로부터 이익을 얻을 수 있다.
임의적으로는, 적어도 하나의 치료제를 포함하는 상기 항원 결합 구조체의 투여 이전 및/또는 이후, 상기 환자의 표적-양성 세포의 개수 및/또는 국부화가 결정된다. 예를 들어, 투여 이전에 상기 표적-양성 세포의 개수 및/또는 국부화를 결정하는 것은 상기 환자가 상기 표적-양성 세포의 중화 및/또는 소거로부터 이익을 얻을 가능성이 있는지를 나타낼 수 있다. 투여 이후에 상기 표적-양성 세포의 개수 및/또는 국부화의 결정은 상기 표적-양성 세포가 환자에서 소거되었는지를 나타낼 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 독립형 구조체(예를 들어, 이에 접합된 독소가 없음)로서의 치료제로서 사용될 수 있다. 상기 단편들이 치료에 대해 덜 최적일 수 있는 온전한 항체에 비해 짧은 반감기를 가질지라도 이들 포맷은 이들의 보다 작은 크기에 기초하여 개선된 종양 침투를 나타낼 수 있고, 세포 독성 약물 또는 방사성 동위원소로 적절히 장착되는 경우에 치료학적으로 효과적일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 다른 치료적 접근법은 요오드-131, 베타-에미터(예를 들어, 이트륨-90, 루테튬-177, 구리-67, 아스타틴-211, 납-212/비스무트-212, 악티늄-225/비스무트-213) 및 토륨과 같은 적절한 방사선 표지의 부착을 통한 방사성 면역요법이며, 상기 방사선 표지는 세포 손상 및 사멸을 야기할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 상기 표적 분자를 발현하는 세포를 표적화하기 위해 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 치료제는, 예를 들어 CD8, CD3, PSMA, PSCA 및 5T4 중 적어도 하나와 연관된 하나 이상의 질환을 치료하는데 적절하다. 몇몇 실시형태에서, 상기 치료제는 하기 질환들 중 하나 이상을 치료하는데 적절하다.
특정 표적/구조체
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 임의의 상기 조성물, 방법(예를 들어, 치료 방법, 제조 방법, 검출 방법 등), 키트, 약제, 항원 결합 구조체 개질, 세포주, 핵산 등은 임의의 표적 분자용으로 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 표적 분자는 암 면역요법과 연관된 분자일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 표적 분자는 CD8, CD3, 5T4, PSCA 및 PSMA(이의 변이체를 포함함) 중 하나 이상일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디와 같은 항원 결합 구조체들 중 하나 이상은 표적 분자 연관 질환을 앓고 있는 개체의 치료를 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 표적 분자는 하나의 분자가 결합할 항원 결합 구조체를 갖는 임의의 표적 분자일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 표적 분자는 CD8, CD3, PSMA, PSCA 및 5T4 중 적어도 하나일 수 있고, 따라서 상기 치료될 질환은 CD8, CD3, PSMA, PSCA 및 5T4 중 적어도 하나와 관련된 질환일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디와 같은 항원 결합 구조체들 중 하나 이상은 이들이 표적 분자 연관 질환을 앓고 있는지의 여부에 관해 개체의 진단을 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "개체"란 용어는 인간, 비인간 영장류, 설치류, 개, 돼지 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 동물(예를 들어, 포유동물)을 지칭한다.
하기 섹션 각각에는 본원에서 제공된 몇몇 다양한 항원 결합 구조체들을 위한 다양한 실시형태가 서술되어 있다. 모든 이들 실시형태는 미니바디 및 scFv를 포함한 항원 결합 구조체의 다양한 형태로서 제공된다. 하기 섹션은 명백히 표적 특이적 실시형태를 위해 제공되지만, 이들은 본 명세서의 다른 부분에서 제공되는 임의의 적절한 옵션들과 양립 가능한 양태로서 고려된다. 따라서 본 발명의 실시형태는 기타 실시형태를 배제하지 않지만, 대신에 본원에서 제공된 임의의 기타 실시형태와 조합될 수 있는 옵션들이다. 예를 들어, 본원에서 제공된 임의의 상기 힌지 배열들은 상술한 구조체 및/또는 방법들 중 임의의 하나 이상에서 사용될 수 있다. 유사하게는, CD8, CD3, PSMA, PSCA 또는 5T4라는 5개의 표적들 중 임의의 하나와 관련하여 하기에 서술된 다양한 실시형태는 또한 기타 상술한 표적과 교체될 수 있다. 따라서 PSCA에 대한 토의가 PSCA에 관한 것일지라도 상기 실시형태들은 또한 CD8, CD3, PSMA 또는 5T4 구조체에 적용될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 유사하게는, CD8에 대한 개시내용은, 예를 들어 CD3, PSMA, PSCA 또는 5T4에 또한 적용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 화학 치료제들은 본원에서 제공된 CD8, CD3, PSMA, PSCA 및 5T4 구조체들 중 임의의 하나 이상과 함께 사용될 수 있다. 화학 치료제들은 종종 자연에서 세포 독성 또는 세포 증식 억제성을 나타내며, 알킬화제, 대사 길항 물질, 항-종양 항생제, 토포이소머라아제 억제제, 유사분열 억제제, 호르몬 요법제, 표적화 치료제 및 면역 치료제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 실시형태에 따라 진단제로서 사용될 수 있는 화학 치료제들로는 13-시스-레티노산, 2-클로로데옥시아데노신, 5-아자시티딘, 5-플루오로우라실, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 악티노마이신-D, 아드리아마이신, 알데스류킨, 알렘투주맙, 알리트레티노인, 전트랜스형 레티노산, 알파 인터페론, 알트레타민, 아메톱테린, 아미포스틴, 아나그렐리드, 아나스트로졸,아라비노실시토신, 3산화 비소, 암사크린, 아미노캠프토세신, 아미노글루테티미드, 아스파라기나아제, 아자시티딘, 바실러스 칼메테 구에린(BCG), 벤다무스틴, 베바시주맙, 벡사로텐, 비칼루타미드, 보르테조밉, 블레오마이신, 부설판, 류코보린 칼슘, 시트로보룸 인자, 카페시타빈, 카넬티닙, 카르보플라틴, 카르무스틴, 세툭시맙, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티손, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다르베포에틴알파, 다사티닙, 다우노마이신, 데시타빈, 데니류킨 디프티톡스, 덱사메타손, 덱사손, 덱스라족산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 다카르바진, 도세탁셀, 독소루비신, 독시플루리딘, 에닐우라실, 에피루비신, 에포에틴알파, 얼로티닙, 에베롤리무스, 엑스메스탄, 에스트라무스틴, 에토포시드, 필그라스팀, 플루옥시메스테론, 풀베스트란트, 플라보피리돌, 플록슈리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루타미드, 제피티닙, 젬시타빈, 젬투주맙 오조가마이신, 고세렐린, 과립구-콜로니 자극 인자, 과립구 마크로파지-콜로니 자극 인자, 헥사메틸멜라민, 하이드로코르티손 하이드록시우레아, 이브리투모맙, 인터페론 알파, 인터류킨-2, 인터류킨-11, 이소트레티노인, 익사베필론, 이다루비신, 이마티닙 메실레이트, 이포스파미드, 이리노테칸, 라파티닙, 레날리도미드, 레트로졸, 류코보린, 류프로라이드, 리포좀성 Ara-C, 로무스틴, 메클로르에타민, 메게스트롤, 멜팔란, 메르캅토푸린, 메스나, 메토트렉세이트, 메틸프레드니솔론, 마이토마이신 C, 마이토테인, 미톡산트론, 넬라라빈, 닐루타미드, 옥트레오타이드, 오프레베킨, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드론산염, 페메트렉세드, 파니투무맙, PEG 인터페론, 페가스파르가제, 페그필그라스팀, PEG-L-아스파라기나아제, 펜토스타틴, 플리카마이신, 프레드니솔론, 프레드니손, 프로카바진, 랄록시펜, 리툭시맙, 로미플로스팀, 랄리트렉세드, 사파시타빈, 사그라모스팀, 사트라플라틴, 소라페닙, 수니티닙, 세무스틴, 스트렙토조신, 타목시펜, 테가푸르, 테가푸르-우라실, 템시롤리무스, 테모졸라미드, 테니포사이드, 탈리도마이드, 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레티노인, 트리미트렉세이트, 알루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데스틴, 비노렐빈, 보리노스타트 또는 졸레드론산을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 상기 구조체, 예를 들어 CD8, CD3, PSMA, PSCA 및 5T4 항원 결합 구조체들 중 임의의 하나 이상은 상기 힌지 내의 하나 이상의 시스테인을 통해 본원에 개시된 킬레이터, 약물 또는 임의의 기타 구성성분들에 연결될 수 있다.
PSCA-IAB1M
전립선 줄기세포 항원(PSCA)은 정상적인 인간 전립선 및 방광에서 발현되는 세포 표면 당단백질이고, 전립선암에서 과발현된다(40%의 원발성 종양 및 60% 내지 100%의 림프절 및 골수 전이). 이는 또한 방광의 이행성 암종 및 췌장 암종에서 고도로 발현된다. PSCA 단백질의 일례는 서열번호 132로 나타나 있다. PSCA에 대해 특이적인 항-PSCA 마우스 단클론성 항체인 IG8은 생체 내 항-종양 표적화 활성을 증명하였다(문헌[Gu, Z. 등, "Anti-prostate stem cell antigen monoclonal antibody 1G8 induces cell death in vitro and inhibits tumor growth in vivo via a Fc-independent mechanism," Cancer Res., Vol. 65, No. 20, pp. 9495-9500, 2005]). 이러한 항체는 인간 골격(트라스투주맙) 상의 이식에 의해 인간화되었으며, 2B3으로 명명되었다(문헌[Olafsen, T. 등, "Targeting, imaging, and therapy using a humanized antiprostate stem cell antigen (PSCA) antibody," Immunotherapy, Vol. 30, No. 4, pp. 396-405, 2007]).
몇몇 실시형태에서, PSCA에 대한 항원 결합 구조체를 포함하는 실시형태는 PSCA를 발현하는 종양을 표적화하고 이미징하기 위해 적절한 약역학 특성을 갖는 약제를 제공할 수 있다. 민감하고 특이적으로 암을 이미징하기 위한 유효 약제, 특히 통상의 수단에 의해 이미징할 수 없는 초기 단계의 종양 또는 초기 전이의 종양을 이미징하기 위한 유효 약제에 대한 분야에서의 가치가 존재한다. PSCA가 대부분의 전립선, 방광 및 췌장 종양에 의해 고도로 발현됨에 따라 이는 이들 암의 검출, 진단, 예후 및 치료에서 귀중한 표적이다. 본원에서 제공된 몇몇 실시형태는 종양 이미징 및 표적화를 위한 특징을 갖는 구조체를 제공한다. 이들은 또한 유전자 요법 및 방사능 요법의 종양 표적화를 위해 사용될 수 있고, 그 자체로 치료적 용도를 가질 수 있다.
전립선 및 기타 암에서 신규한 세포 표면 마커를 높은 친화도로 인식하는 조작된 항원 결합 구조체들이 본원에서 제공된다. 이들 유전적으로 조작된 항원 결합 구조체들은 표적화 및 검출용으로 생체 내에서 사용하기 위해 특이적으로 재단될 수 있다. PSCA는 대부분의 전립선, 방광 및 췌장 종양에 의해 고도로 발현되고, 이는 유망한 표적이다. 본원에서 제공된 실시형태에는 종양 이미징을 위한 최적의 특징을 갖는 획기적인 분자가 개시되어 있다. 이는 또한 유전자 요법 및 방사능 요법의 종양 표적화에 유용할 수 있으며, 그 자체로 치료적 용도를 가질 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항-PSCA 항체에 의해 표적화되는 PSCA는 인간 PSCA이다. 몇몇 실시형태에서, 면역 접합체는 PSCA-양성 세포, 특히 PCSA 단백질을 과발현하는 세포에 대해 작동자 모이어티를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항-PSCA 미니바디에 의해 표적화되는 PSCA는 인간 PSCA이다.
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 구조체들은 PSCA를 발현하는 종양을 표적화하고 이미징하기 위해 적절한 약역학 특성을 갖는 약제를 제공할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 민감하고 특이적으로 암을 이미징하기 위한 유효 약제, 특히 통상의 수단에 의해 이미징할 수 없는 초기 단계의 종양 또는 초기 전이의 종양을 이미징하기 위한 유효 약제를 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 PSCA 항원과 결합하는 항원 결합 구조체들은 항체, 미니바디, 및/또는 scFv와 같은 항체의 기타 단편들일 수 있다. PSCA에 대한 항원 결합 구조체의 몇몇 비제한적인 실시형태는 도 29b 내지 도 29d, 도 36e, 도 60(서열번호 125 및 서열번호 126), 도 61(서열번호 126), 도 62(서열번호 127), 도 63(서열번호 128), 도 64(서열번호 129) 및 도 65a(서열번호 130)에 도시되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 구조체는 전이성 질병의 조기 진단 또는 진단에서 암의 이미징을 가능케 한다. 특히, 검출 및 병기(staging)용 전립선암의 이미징하기 위한 보다 양호한 약제에서의 가치가 존재한다. PSCA 항원 결합 구조체 이미징은 뼈 전이를 이미징하고 치료에 대한 반응을 평가하는데 매우 유용할 것이다. 몇몇 실시형태에서, 췌장암의 검출 방법이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 높은 친화도 및 높은 특이성을 갖는 조작된 미니바디는 전립선암, 방광암 및 췌장암 환자에서 PSCA의 생체 내 표적화 및 검출을 위해 재단된다. 몇몇 실시형태에서, "PSCA 의존 질환"으로는 전립선 종양, 전립선암, 방광 종양, 방광의 이행성 암종, 췌장 종양, 췌장 암종, PSCA 발현과 연관된 임의의 종양, PSCA 발현과 연관된 임의의 암, 또는 PSCA 발현과 연관된 임의의 질환을 들 수 있다.
몇몇 실시형태에서, PSCA를 과발현하는 암의 치료 및 검출에 사용될 수 있는 고친화도 PSCA 항원 결합 구조체가 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 또한 치료제 또는 검출 가능한 마커들에 연결될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 치료제는 세포 독성제이다. 예를 들어, 상기 약제로는 리신, 리신 A-사슬, 독소루비신, 다우노루비신, 택솔(taxol), 에티디움브로마이드, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포사이드(tenoposide), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친(colchicine), 디하이드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 악티노마이신 D, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소(PE) A, PE40, 아브린, 아르빈 A 사슬(arbrin A chain), 모데신 A 사슬(modeccin A chain), 알파-사르신(α-sarcin), 겔로닌, 미토젤린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin), 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 칼키아마이신, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 메이탄시노이드류 또는 글루코코티코이드리신(glucocorticoidricin)이 있다. 기타 실시형태에서, 상기 치료제는 방사성 동위원소이다. 상기 방사성 동위원소는, 예를 들어 212Bi, 131I, 111In, 90Y 및 186Re로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 기타 실시형태에서, 상기 구조체는 프로드러그를 활성 형태로 전환할 수 있는 항-암 프로드러그 활성화 효소에 연결된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항-PSCA 구조체는 검출 가능한 마커로 표지된다. 상기 마커는, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소일 수 있다. 많은 방사성 핵종은 124I, 86Y, 18F, 94mTc 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이미징 표지로서 사용될 수 있다. 당해 기술분야의 숙련자라면 특히 본 발명의 실시형태에서 사용하기에 매우 적합한 기타 방사성 핵종에 대해 알 것이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법에서는 암세포가 살해될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 구조체는 22번째 아미노산 위치에서 류신으로 시작해서 99번째 아미노산 위치에서 알라닌으로 끝나는 하기에 나타낸 PSCA 단백질을 인식하고 결합한다. 부가적인 실시형태에서, 상기 방법은 화학 치료 약물, 방사선 요법에 대한 투여를 더 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 또한 호르몬 절제 요법 또는 호르몬 길항제 요법으로 치료된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 치료는 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 종양 내 또는 진피 내 투여에 의해 환자 또는 개체에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 접촉은 전립선암, 방광암, 췌장암 또는 이들의 전이 내로 상기 구조체를 직접 투여하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 검출 가능한 마커를 갖는 구조체와 암세포를 접촉시킴으로써 개체에서 암세포를 검출하는 방법들이 제공된다. 상기 방법들은 암의 위험성이 증가된 환자를 스크리닝(screening)하는데 사용될 수 있거나, 요법에 대한 반응을 모니터링하거나 암(예를 들어, 전립선, 방광, 또는 췌장암)에 대한 예후를 밝혀내기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법들은 상기 암의 전이를 검출하는데 특히 유리하다. 종양 표적화/이미징 경향을 갖는 미니바디 단편들이 본원에서 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 구조체들과 관련하여 상기 구조체가 상응하는 도메인과 동일하지 않는 VH 또는 VL 도메인 또는 2B3 항체를 포함한다는 하나의 단서가 존재한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 "작동자" 모이어티에 접합된다. 상기 작동자 모이어티는 방사성 표지 또는 형광 표지와 같은 표지 모이어티를 포함하는 임의의 개수의 분자일 수 있거나, 치료용 모이어티일 수 있다. 일 양태에서, 상기 항체는 단백질의 활성을 조절한다. 이 같은 작동자 모이어티로는 항-종양 약물, 독소, 방사능제, 사이토카인, 이차 항체 또는 효소를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 게다가, 상기 항원 결합 구조체가 프로드러그를 세포 독성제로 전환하는 효소에 연결되어 있는 실시형태들이 본원에서 제공된다. 세포 독성제의 예로는 방사성 동위원소들 뿐만 아니라 리신, 독소루비신, 다우노루비신, 택솔, 에티디움브로마이드, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디하이드록시 안트라신 디온, 악티노마이신 D, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소(PE) A, PE40, 아브린 및 글루코코티코이드, 및 기타 화학 치료제들을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 검출 가능한 마커들로는 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 단백질 구조체들은 단독으로 또는 작동자 모이어티와 접합되는 경우에 암을 체계적으로 치료하기 위해 사용될 수 있다. 접합되지 않은 항체뿐만 아니라 리신과 같은 독성제와 접합된 PSCA-표적화 구조체들은 암세포를 갖고 있는 PSCA에 자연적으로 표적화되는 유용한 치료제일 수 있다. 이 같은 구조체들은 침습성(invasiveness)을 차단하는데 유용할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 단백질 구조체들은 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이 같은 상황에서, 상기 구조체는 치료 활성을 갖는 제 2 단백질 또는 독성 분자의 적어도 기능적 활성 부분에 연결된다. 상기 제 2 단백질로는 효소, 림포카인, 온코스타틴(oncostatin) 또는 독소를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 독소로는 독소루비신, 다우노루비신, 택솔, 에티디움브로마이드, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디하이드록시 안트라신 디온, 악티노마이신 D, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소(PE) A, PE40, 리신, 아브린, 글루코코티코이드 및 방사성 동위원소를 들 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 치료는 일반적으로는 정맥 내 주사(N)와 같은 허용 가능한 투여 경로를 통해 상기 구조체 및 이들의 면역 접합체를 유효 투여량으로 반복적으로 투여하는 것을 포함할 것이다. 투여량은 당해 기술분야의 숙련자에 의해 일반적으로 인지되는 다양한 인자에 의존할 것이며, 이때 상기 인자로는 암의 유형, 암의 중증도, 정도 또는 단계, 사용된 약제의 결합 친화도 및 반감기, 항체의 목적하는 안정 상태 농도 수준, 치료의 빈도, 및 본원에서 제공된 실시형태에 따른 치료 방법과 함께 사용되는 화학 치료제의 영향을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 전형적인 1일 투여량은 약 0.1 내지 100㎎/㎏ 범위일 수 있다. 훨씬 더 높은 주 당 투여량이 적절하고/하거나 충분히 용인될 수 있을지라도 상기 구조체 또는 이들의 면역 접합체의 주 당 10 내지 500㎎ 범위의 투여량은 효과적이며 충분히 용인될 수 있다. 적절한 투여량을 한정하는데 있어 주요한 결정 인자는 특정한 문맥에서 치료학적으로 유효할 필요가 있는 특정 약제의 양이다. 반복된 투여는 종양 억제 또는 퇴행을 달성하기 위해 요구될 수 있다. 초기 부하량(initial loading dose)은 보다 높을 수 있다. 상기 초기 부하량은 주입으로서 투여될 수 있다. 주기적인 유지량은 초기 투여량이 충분히 용인된다면 유사하게 투여될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 구조체의 직접적인 투여가 또한 가능하며, 특정 문맥에서의 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 방광 암종의 치료를 위해 상기 약제들은 방광에 직접 주사될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 조성물들은 치료적 또는 예방적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적 적용 시, 조성물은 질병(예를 들어, 암)을 앓고 있는 환자에 "치료학적 유효 투여량"으로 투여된다. 이러한 용도에 있어서의 유효량은 질병의 중증도 및 일반적인 환자의 건강 상태에 의존할 것이다. 상기 조성물의 단일 또는 다중 투여는 환자에 의해 요구되고 용인된 바와 같은 투여량 및 빈도에 따라 투여될 수 있다. 기타 공지된 암 요법들이 본원에서 제공된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공된 조성물들은 또한 5FU, 빈블라스틴, 악티노마이신 D, 시스플라틴, 메토트렉세이트 등과 같은 기타 암 치료제에 대해 세포를 표적화하거나 감응(sensitization)시키기 위해 사용될 수 있다.
기타 실시형태에서, 상기 방법들은 기타 암 요법(예를 들어, 라디칼 전립선 절제술), 방사선 요법(외부 광선 또는 근접치료(brachytherapy)), 호르몬 요법(예를 들어, 고환 절제술(orchiectomy), 테스토스테론(testosterone) 생성을 억제하기 위한 LHRH-유사체 요법, 항-안드로겐 요법) 또는 화학 요법과 함께 실시될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 미니바디와 같은 항체의 투여를 통해 생체 내에서 암세포 또는 종양을 이미징하는 방법들이 제공된다. 일 실시형태에서, 생체 내 암세포를 이미징하는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 표지된 항-PSCA 항체를 포유동물에 투여하는 단계, 및 생체 내에서 상기 항체를 이미징하는 단계를 포함한다. 상기 방법들은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 돼지, 인간 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물에서 암세포를 이미징하기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 암을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법, 또는 전립선 줄기세포 항원(PSCA) 단백질을 발현하는 전립선 암세포의 성장을 억제하기 위한 방법이 본원에서 제공되며, 이때 상기 방법은 상기 암세포의 성장을 억제하기에 효과적인 양으로 암세포(예를 들어, 전립선, 방광, 췌장 암세포)를 본원에서 제공된 바와 같은 구조체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법에서는 PSCA를 과발현하는 암, 예를 들어, 전립선암, 췌장암 및 방광암의 진단, 예후 및 치료에서의 특정한 응용이 발견된다. 특정 실시형태에서, 상기 방법들은 호르몬 무반응 암 또는 요법 내성 암에 적용된다. 특정 실시형태에서, 상기 방법들은 전이성 암에 적용된다.
몇몇 실시형태에서, PSCA에 결합하는 미니바디가 제공된다. 상기 미니바디는 PSCA에 결합하는 단일 사슬 가변 단편(scFv)를 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 이때 상기 scFv는 가변 경쇄(VL) 도메인에 연결된 가변 중쇄(VH) 도메인; 및 상기 힌지의 각 가닥 상에 적어도 3개의 시스테인을 포함하는 변이체 힌지 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 인간 IgG CH3 서열을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 방사성 물질, 염료, 조영제, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 효소, 증강제 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 가능한 마커를 더 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 미니바디는 서열번호 93으로 표시된 HCDR1과 동일한 HCDR1; 서열번호 94로 표시된 HCDR2와 동일한 HCDR2; 서열번호 95로 표시된 HCDR3과 동일한 HCDR3;서열번호 96으로 표시된 LCDR1과 동일한 LCDR1; 서열번호 97로 표시된 LCDR2와 동일한 LCDR2; 및 서열번호 98로 표시된 LCDR3과 동일한 LCDR3을 포함한다. 본원에서 제공된 미니바디의 몇몇 실시형태에서, 상기 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인은 인간 서열이다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 실시형태의 항체를 암호화하는 핵산이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 미니바디 실시형태를 생성하는 세포주가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 미니바디의 임의의 실시형태 및 검출 가능한 마커를 포함하는 키트가 제공된다.
몇몇 실시형태에서, PSCA의 존재 유무를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 상기 미니바디 실시형태를 시료에 적용하는 단계; 및 PSCA에 대한 상기 항원 결합 구조체의 결합 또는 이의 결합의 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 방사성 물질, 염료, 조영제, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 효소, 증강제 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 가능한 마커를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디를 적용하는 단계는 상기 미니바디를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 표적 항원에 대한 상기 미니바디의 결합 또는 이의 결합의 부재를 검출하는 단계는 양전자 방출 단층촬영을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 이차 항체 또는 이의 단편을 시료에 적용하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 이차 항체 또는 이의 단편은 상기 미니바디에 특이적으로 결합한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 이의 미니바디는 1시간 미만 동안 시료와 함께 배양된다.
몇몇 실시형태에서, PSCA에 대해 치료제를 표적화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 미니바디의 임의의 상기 실시형태를 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 미니바디는 치료제에 접합된다.
몇몇 실시형태에서, 이를 필요로 하는 개체에 PSCA를 표적화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 하나의 실시형태의 미니바디를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 전립선 종양, 전립선암, 방광 종양, 방광의 이행성 암종, 췌장 종양, 췌장 암종, PSCA 발현과 연관된 임의의 종양, PSCA 발현과 연관된 임의의 암, 및 PSCA 발현과 연관된 임의의 질환 중 적어도 하나 이상을 앓고 있다.
몇몇 실시형태에서, PSCA에 결합하는 항원 결합 구조체(예를 들어, 미니바디 또는 scFv)가 제공된다. 상기 항원 결합 구조체(예를 들어, 미니바디 또는 scFv)는 힌지 영역을 포함하며, 여기서 상기 힌지 영역은 하기 서열들 중 적어도 하나를 포함한다: a) 서열번호 1의 펩티드 서열(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)로서, Xn1은 공유성 가교결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn2는 A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V 중 하나이고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있는 펩티드 서열; b) 서열번호 2의 펩티드 서열(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)로서, Xn1은 다른 동일한 아미노산과 공유성 가교결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn2는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn6은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn7은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn8은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn9는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn10은 임의의 아미노산일 수 있는 펩티드 서열(서열번호 208); c) ELKTPLGDTTHT(서열번호 48)의 상부 힌지 서열에 연결된 CVECPPCP(서열번호 57), CPPCPPC(서열번호 52) 및 CPPCPPCPPC(서열번호 54) 중 적어도 하나의 코어 힌지 서열; 또는 d) 상응하는 아미노산과 가교 결합할 수 있는 아미노산을 포함하지 않는 상부 힌지 영역 및 상기 상부 힌지 영역의 C-말단에 연결된 코어 힌지 영역(여기서, 상기 코어 힌지 영역은 적어도 3개의 시스테인을 포함함). 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 전장 항체이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 미니바디이다. 상기 힌지 영역을 제외한 항원 결합 구조체(예를 들어, 미니바디 또는 scFv)의 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체(예를 들어, 미니바디 또는 scFv)는 인간화 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체(예를 들어, 미니바디 또는 scFv)는 서열번호 93으로 표시된 HCDR1과 동일한 HCDR1; 서열번호 94로 표시된 HCDR2와 동일한 HCDR2; 서열번호 95로 표시된 HCDR3과 동일한 HCDR3; 서열번호 96으로 표시된 LCDR1과 동일한 LCDR1; 서열번호 97로 표시된 LCDR2와 동일한 LCDR2; 및 서열번호 98로 표시된 LCDR3과 동일한 LCDR3을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 항원 결합 구조체(예를 들어, 미니바디 또는 scFv)의 힌지 영역을 암호화하는 핵산이 제공된다. 상기 힌지 영역을 암호화하는 서열을 제외한 핵산의 몇몇 실시형태에서, 상기 핵산은 인간 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 핵산에 의해 암호화된 항원 결합 구조체(예를 들어, 미니바디 또는 scFv)를 발현하는 세포주가 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 항원 결합 구조체(예를 들어, 미니바디 또는 scFv)를 제조하는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 세포주에서 상기 항체를 발현하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 이를 필요로 하는 개체에서 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
PSMA-IAB2M
PSMA를 표적화하는 전장 항체가 개발되었으며, 이들 중 일부는 다양한 전임상적 및 임상적 개발 단계에 있다. PSMA는 PSMA의 세포 내 에피토프를 인식하는 쥐 항체(mAb)인 7E11에 의해 최초로 한정되었다(문헌[Olson, W. C. 등, "Clinical trials of cancer therapies targeting prostate-specific membrane antigen," Rev. Recent Clin. Trials, Vol. 2, No. 3, pp. 182-190, 2007]). 상기 7E11 mAb는 추후에 연조직에서의 전립선암의 검출 및 이미징을 위한 프로스타신트(Prostascint)로 지칭되는 FDA-승인 SPECT 이미징제로 개발되었다. 그러나 7E11이 세포 내 에피토프를 인식하기 때문에 프로스타신트는 괴사성 종양 조직의 검출에 제한되는 상대적으로 빈약한 이미징제이다(문헌[Olson, W. C. 등, 2007]). 전장 항체의 약동학적 특성을 갖는 프로스타신트는 또한 주입과 이미징 사이의 긴 시간을 필요로 한다. 더욱이, 프로스타신트는 다중 투여를 방지하는 강력한 면역 반응을 유도하는 쥐 항체이다(문헌[Olson, W. C. 등, 2007]).
PSMA를 표적화하는 다른 전장 항체인 J591이 발견되고 후속적으로 역면역화되었으며, 이는 huJ591로 공지된 역면역화 버전이다(문헌[Liu, H. 등, "Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium", Cancer Research, Vol. 57, No. 17, pp. 3629-3634, 1997]; 문헌[Bander, N. H. 등, "Targeting Metastatic Prostate Cancer with Radiolabeled Monoclonal Antibody J591 to the Extracellular Domain of Prostate Specific Membrane Antigen," J. Urol., Vol. 170, No. 5, pp. 1717-1721, 2003]). 상기 역면역화 huJ591은 PSMA 상의 세포 외 에피토프를 인식하고 이에 결합하는 항-인간 PSMA 항체이다(문헌[Bander, N. H. 등, 2003]). 상기 huJ591 항체는 전립선암에 대한 잠재적인 방사성 면역요법제로서 개발되고 있다. 단계 I 시험에서, 감마 방출 동위원소인 인듐-111 및 루테튬-177로 표지된 DOTA-접합된 huJ591 항체는 전이 부위에 대한 우수한 표적화를 증명하고 면역원성이 없음을 증명하였으며, 다중 투여량은 충분히 용인되었다(문헌[Bander, N. H. 등, 2003], 문헌[Milowsky, M. I. 등, "Phase I Trial of yttrium-90-labeled anti-prostate-specific membrane antigen monoclonal antibody J591 for androgen-independent prostate cancer," J. Clin. Oncol., Vol. 22, No. 13, pp. 2522-2531, 2004]; 문헌[Bander, N. H. 등, "Phase I trial of 177 Lutetium-labeled J591, a monoclonal antibody to prostate-specific membrane antigen, in patients with androgen-independent prostate cancer," J. Clin. Oncol., Vol. 23, No. 21, pp. 4591-4601, 2005]; 문헌[Olson, W. C. 등, 2007]). 전립선암을 뛰어 넘어 111In-DOTA huJ591을 이용한 단계 I 연구에 따르면 진행된 고체 종양의 종양 신생혈관(neovasculature)의 특정 표적화가 증명되었다(문헌[Milowsky, M. I. 등, "Vascular targeted therapy with anti-prostate-specific membrane antigen monoclonal antibody J591 in advanced solid tumors," J. Clin. Oncol., Vol. 25, No. 5, pp. 540-547, 2007]).
몇몇 실시형태에서, PSMA 항원과 결합하는 항원 결합 구조체들은 항체, 미니바디, 및/또는 scFv와 같은 항체의 기타 단편들일 수 있다. PSMA에 대한 항원 결합 구조체의 몇몇 비제한적인 실시형태는 도 5b 내지 도 5e, 도 7c 내지 7e, 도 21b 내지 도 21E, 도 34a 내지 34f, 도 35a 내지 35c, 도 36a, 도 47(서열번호 112 및 서열번호 113), 도 48(서열번호 113), 도 49(서열번호 114), 도 50(서열번호 115), 도 51(서열번호 116), 도 52(서열번호 117), 도 53(서열번호 118)에 도시되어 있다.
전립선암과 연관된 세포 표면 생물 마커(문헌[Slovin, S. F., "Targeting novel antigens for prostate cancer treatment: focus on prostate-specific membrane antigen," Expert Opin. Ther. Targets, Vol. 9, No. 3, pp. 561-570, 2005])인 전립선 특이적 막항원(PSMA)은 PSMA의 기능적 역할이 충분히 이해되지 않을지라도 글루타메이트 카르복시펩티다아제 활성을 나타내는 단일 통과 II형 막 관통 단백질이다(문헌[Olson, W. C. 등, 2007]). PSMA의 발현은 전립선을 제외하고 뇌, 소장, 간, 근위 신장 세뇨관 및 침샘을 포함한 정상 조직에서 비교적 제한된다(문헌[Olson, W. C. 등, 2007]). PSMA 단백질의 일례가 서열번호 131로 나타나 있다.
몇몇 실시형태에서, 전립선 특이적 막항원(PSMA)을 표적화하는 미니바디와 같은 항원 결합 구조체들이 본원에서 제공된다. 이의 PSMA 항원 결합 구조체는 항-PSMA 접합체를 형성하기 위해 진단제, 치료제 또는 나노입자와 같은 물질에 접합될 수 있다. PSMA의 과발현과 연관된 암 또는 기타 병태들을 진단, 시각화, 모니터링 또는 치료하기 위한 PSMA 항원 결합 구조체 또는 항-PSMA 접합체의 사용을 포함하는 방법들이 또한 개시되어 있다.
PSMA 항원 결합 구조체들은 본원에 개시된 실시형태에 따라 본원에서 제공된다. PSMA 항원 결합 구조체는 PSMA와 특이적으로 결합하거나 면역학적으로 반응하는 면역 글로불린 또는 면역 글로불린 관련 분자의 하나 이상의 부분을 포함하는 분자이다.
상기 PSMA 항원 결합 구조체 또는 항-PSMA 접합체는 PSMA를 과발현하는 암세포와 같은 PSMA-양성 세포를 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 개체에서 PSMA 발현과 연관된 암을 진단하기 위한 방법이 제공된다. 이 같은 방법은 진단제에 접합된 항-PSMA 미니바디를 PSMA 발현과 연관된 암을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 개체에 투여하는 단계; 상기 표지된 미니바디를 생체 내에서 시각화하기 위해 상기 개체를 이미징 방법에 노출시키는 단계; 및 상기 표지된 미니바디가 종양 부위에 국부화되는 경우에 상기 개체가 PSMA 발현과 연관된 암을 앓고 있는지를 결정하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 개체에서 PSMA 발현과 연관된 암을 치료하기 위한 방법이 제공된다. 몇몇 실시형태는 상기 개체에 치료학적 유효량의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 조성물은 항-PSMA 미니바디를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항-PSMA 미니바디는 치료제에 접합된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항-PSMA 접합체는 치료제에 접합된 PSMA 항원 결합 구조체(예를 들어, 미니바디 또는 scFv)를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "치료제"는 PSMA와 연관된 암 또는 기타 병태의 치료에 유용한 원자, 분자 또는 화합물이다. 치료제의 예로는 약물, 화학 치료제, 치료용 항원 결합 구조체, 독소, 방사성 동위원소, 효소(예를 들어, 종양의 부위에서 프로드러그를 세포 독성제로 절단하기 위한 효소), 뉴클레아제, 호르몬, 면역 조절제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제 및 염료를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
화학 치료제들은 종종 자연에서 세포 독성 또는 세포 증식 억제성을 나타내며, 알킬화제, 대사 길항 물질, 항-종양 항생제, 토포이소머라아제 억제제, 유사분열 억제제, 호르몬 요법제, 표적화 치료제 및 면역 치료제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 실시형태에 따라 진단제로서 사용될 수 있는 화학 치료제들로는 13-시스-레티노산, 2-클로로데옥시 아데노신, 5-아자시티딘, 5-플루오로우라실, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 악티노마이신-D, 아드리아마이신, 알데스류킨, 알렘투주맙, 알리트레티노인, 전트랜스형 레티노산, 알파 인터페론, 알트레타민, 아메톱테린, 아미포스틴, 아나그렐리드, 아나스트로졸,아라비노실시토신, 3산화 비소, 암사크린, 아미노캠프토세신, 아미노글루테티미드, 아스파라기나아제, 아자시티딘, 바실러스 칼메테 구에린(BCG), 벤다무스틴, 베바시주맙, 벡사로텐, 비칼루타미드, 보르테조밉, 블레오마이신, 부설판, 류코보린 칼슘, 시트로보룸 인자, 카페시타빈, 카넬티닙, 카르보플라틴, 카르무스틴, 세툭시맙, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티손, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다르베포에틴알파, 다사티닙, 다우노마이신, 데시타빈, 데니류킨 디프티톡스, 덱사메타손, 덱사손, 덱스라족산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 다카르바진, 도세탁셀, 독소루비신, 독시플루리딘, 에닐우라실, 에피루비신, 에포에틴알파, 얼로티닙, 에베롤리무스, 엑스메스탄, 에스트라무스틴, 에토포시드, 필그라스팀, 플루옥시메스테론, 풀베스트란트, 플라보피리돌, 플록슈리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루타미드, 제피티닙, 젬시타빈, 젬투주맙 오조가마이신, 고세렐린, 과립구-콜로니 자극 인자, 과립구 마크로파지-콜로니 자극 인자, 헥사메틸멜라민, 하이드로코르티손 하이드록시우레아, 이브리투모맙, 인터페론 알파, 인터류킨-2, 인터류킨-11, 이소트레티노인, 익사베필론, 이다루비신, 이마티닙 메실레이트, 이포스파미드, 이리노테칸, 라파티닙, 레날리도미드, 레트로졸, 류코보린, 류프로라이드, 리포좀성 Ara-C, 로무스틴, 메클로르에타민, 메게스트롤, 멜팔란, 메르캅토푸린, 메스나, 메토트렉세이트, 메틸프레드니솔론, 마이토마이신 C, 마이토테인, 미톡산트론, 넬라라빈, 닐루타미드, 옥트레오타이드, 오프레베킨, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드론산염, 페메트렉세드, 파니투무맙, PEG 인터페론, 페가스파르가제, 페그필그라스팀, PEG-L-아스파라기나아제, 펜토스타틴, 플리카마이신, 프레드니솔론, 프레드니손, 프로카바진, 랄록시펜, 리툭시맙, 로미플로스팀, 랄리트렉세드, 사파시타빈, 사그라모스팀, 사트라플라틴, 소라페닙, 수니티닙, 세무스틴, 스트렙토조신, 타목시펜, 테가푸르, 테가푸르-우라실, 템시롤리무스, 테모졸라미드, 테니포사이드, 탈리도마이드, 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레티노인, 트리미트렉세이트, 알루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데스틴, 비노렐빈, 보리노스타트 또는 졸레드론산을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시형태에 따라 진단제로서 사용될 수 있는 치료용 항체 및 이들의 작용성 단편들로는 알렘투주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 에드레콜로맙(edrecolomab), 젬투주맙, 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙 및 트라스투주맙을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 PSMA 항원 결합 구조체 또는 항-PSMA 접합체는 PSMA를 과발현하는 암세포와 같은 PSMA-양성 세포를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 PSMA 발현과 연관된 암 또는 기타 병태를 진단, 검출, 시각화, 모니터링 또는 치료하기 위한 방법들이 PSMA 발현과 연관된 암 또는 기타 병태를 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 의심되는 개체에 상기 PSMA 항원 결합 구조체 또는 항-PSMA 접합체를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, PSMA의 과발현과 연관된 암 또는 기타 병태를 치료하기 위한 방법들이 제공된다. 이 같은 방법은 본원에 개시된 바와 같은 PSMA 항원 결합 구조체를 포함하는 치료학적 유효량의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 PSMA 항원 결합 구조체는 본원에 개시된 이러한 J591 미니바디와 같은 J591 항체로부터 유래한 미니바디이다.
몇몇 실시형태에서, 상기 약학 조성물은 치료용 항-PSMA 접합체를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 접합체는 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 치료제에 접합된 PSMA 항원 결합 구조체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 PSMA 항원 결합 구조체는 본원에 개시된 이들 J591 미니바디와 같은 J591 항체로부터 유래한다. 예를 들어, 본원에 개시된 J591 미니바디는 방사성 면역요법 접근법에 사용될 수 있으며, 여기서 상기 J591 미니바디들 중 하나 이상은 이트륨-90과 같은 적절한 베타 방출 방사선 표지로 방사성 표지된다. 상기 방사성 표지된 J591 미니바디 또는 미니바디들은 PSMA를 발현하는 국부 암조직에 대해 세포 손상 및 사멸을 야기하기 위해 사용될 수 있다. 게다가 상기 방사성 표지된 J591 미니바디의 사용은 방사성 표지된 전장 부모 huJ591 항체와 비교할 때 향상된 종양 침투를 나타낼 가능성이 있을 수 있다.
상기 치료용 항-PSMA 접합체는 진단용 항-PSMA 접합체(본원에 개시되어 있음), 접합되지 않은 진단제, 조영 용액, 담체 지질 또는 나노입자와 같이 본원에 개시된 하나 이상의 부가적인 물질에 접합되거나 상기 부가적인 물질과 연관될 수 있다.
전립선암에서의 PSMA 발현은 종양 공격성과 함께 증가하고, 고등급 종양(high-grade tumor), 전이성 병변 및 안드로겐 비의존 질병에서 가장 높다(문헌[Olson, W. C. 등, 2007]). 따라서 PSMA는 이미징제에 의한 표적화를 위한 양호한 후보인 암 생물 마커이다. PSMA 발현은 또한 육종 및 흑색종뿐만 아니라 폐 암종, 결장 암종, 유방 암종, 신장 암종, 간 암종 및 췌장 암종을 포함한 많은 비전립선 고체 종양의 신생혈관에서 상향 조절된다(문헌[Olson, W. C. 등, 2007]).
상기 개체에서 PSMA 발현과 연관된 암은 폐암, 대장암, 유방암, 신장암, 간암, 방광암, 췌장암 또는 흑색종일 수 있다. 따라서 몇몇 실시형태에서 "PSMA 의존 질환"은 폐암, 대장암, 유방암, 신장암, 간암, 방광암, 췌장암 또는 흑색종을 포함할 수 있다.
더욱이, "PSMA 의존 질환"은 또한 PSMA 발현과 연관된 이들 암을 포함할 수 있으며, 이때 상기 암은 PSMA를 과발현하는 암 종양 조직을 갖는 암(예를 들어, 전립선암) 또는 PSMA를 과발현하는 고체 종양 신생혈관을 갖는 암(예를 들어, 육종 및 흑색종뿐만 아니라 전립선암, 폐암, 결장암(또는 대장암), 유방암, 신장암, 간암, 방광암 및 췌장암)을 포함한다. 대부분의 고체 종양 신생혈관은 PSMA를 발현하며, 이때 상기 PSMA는 신생혈관 생물 마커가 된다. 따라서 PSMA를 발현하는 암세포 이외에도, PSMA 발현과 연관된 암은 신생혈관을 갖는 임의의 암 조직을 포함할 수 있으며, 이때 상기 암으로는 육종 및 흑색종뿐만 아니라 전립선암, 폐암, 결장암(또는 대장암), 유방암, 신장암, 간암, 방광암 및 췌장암과 같은 암종을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 실시형태에서, PSMA에 결합하는 미니바디가 제공된다. 상기 미니바디는 PSMA에 결합하는 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 이때 상기 scFv는 가변 경쇄(VL) 도메인에 연결된 가변 중쇄(VH) 도메인; 및 상기 힌지의 각 가닥 상에 적어도 3개의 시스테인을 포함하는 변이체 힌지 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 인간 IgG CH3 서열을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 방사성 물질, 염료, 조영제, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 효소, 증강제 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 가능한 마커를 더 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 미니바디는 서열번호 81로 표시된 HCDR1과 동일한 HCDR1; 서열번호 82로 표시된 HCDR2와 동일한 HCDR2; 서열번호 83으로 표시된 HCDR3과 동일한 HCDR3; 서열번호 84로 표시된 LCDR1과 동일한 LCDR1; 서열번호 85로 표시된 LCDR2와 동일한 LCDR2; 및 서열번호 86으로 표시된 LCDR3과 동일한 LCDR3을 포함한다. 본원에서 제공된 미니바디의 몇몇 실시형태에서, 상기 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인은 인간 서열이다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 항체를 암호화하는 핵산이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 미니바디를 생산하는 세포주가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 미니바디 및 검출 가능한 마커를 포함하는 키트가 제공된다.
몇몇 실시형태에서, PSMA의 존재 유무를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 미니바디를 시료에 적용하는 단계; 및 PSMA에 대한 상기 항원 결합 구조체의 결합 또는 이의 결합의 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 방사성 물질, 염료, 조영제, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 효소, 증강제 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 가능한 마커를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디를 적용하는 단계는 상기 미니바디를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 표적 항원에 대한 상기 미니바디의 결합 또는 이의 결합의 부재를 검출하는 단계는 양전자 방출 단층촬영을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 이차 항체 또는 이의 단편을 상기 시료에 적용하는 단계를 더 포함하며, 이때 상기 이차 항체 또는 이의 단편은 상기 미니바디에 특이적으로 결합한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 이의 미니바디는 1시간 미만 동안 상기 시료와 함께 배양된다.
몇몇 실시형태에서, PSMA에 대해 치료제를 표적화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 미니바디를 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 미니바디는 치료제에 접합된다.
몇몇 실시형태에서, 이를 필요로 하는 개체에서 PSMA를 표적화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 하나의 실시형태의 미니바디를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 전립선, 뇌, 소장, 간, 근위 신장 세뇨관 및 침샘의 종양 또는 암 또는 질환 중 적어도 하나를 앓고 있다. 몇몇 실시형태에서, 진행된 고체 종양의 종양 신생혈관에서 PSMA를 표적화하는 방법이 제공된다.
몇몇 실시형태에서, PSMA에 결합하는 항체가 제공된다. 상기 항체는 힌지 영역을 포함하며, 이때 상기 힌지 영역은 하기 서열들 중 적어도 하나를 포함한다: a) 서열번호 1의 펩티드 서열(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)로서, Xn1은 공유성 가교결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn2는 A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V 중 하나이고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있는 펩티드 서열; b) 서열번호 2의 펩티드 서열(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)로서, Xn1은 다른 동일한 아미노산과 공유성 가교결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn2는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn6은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn7은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn8은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn9는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn10은 임의의 아미노산일 수 있는 펩티드 서열(서열번호 208); c) ELKTPLGDTTHT(서열번호 48)의 상부 힌지 서열에 연결된 CVECPPCP(서열번호 57), CPPCPPC(서열번호 52) 및 CPPCPPCPPC(서열번호 54) 중 적어도 하나의 코어 힌지 서열; 또는 d) 상응하는 아미노산과 가교 결합할 수 있는 아미노산을 포함하지 않는 상부 힌지 영역 및 상기 상부 힌지 영역의 C-말단에 연결된 코어 힌지 영역(여기서, 상기 코어 힌지 영역은 적어도 3개의 시스테인을 포함함). 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 전장 항체이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 미니바디이다. 상기 힌지 영역을 제외한 항체의 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 인간화 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 81로 표시된 HCDR1과 동일한 HCDR1; 서열번호 82로 표시된 HCDR2와 동일한 HCDR2; 서열번호 83으로 표시된 HCDR3과 동일한 HCDR3; 서열번호 84로 표시된 LCDR1과 동일한 LCDR1; 서열번호 85로 표시된 LCDR2와 동일한 LCDR2; 및 서열번호 86으로 표시된 LCDR3과 동일한 LCDR3을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 항체의 힌지 영역을 암호화하는 핵산이 제공된다. 상기 힌지 영역을 암호화하는 서열을 제외한 핵산의 몇몇 실시형태에서, 상기 핵산은 인간 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 핵산에 의해 암호화된 항체를 발현하는 세포주가 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 세포주에서 상기 항체를 발현하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 이를 필요로 하는 개체에서 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 항체를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
CD8-IAB22M
CD8(분화 클러스터 8)은 세포 독성 T 세포를 포함한 T 세포의 하위부류에 대한 특정 마커인 막 관통 당단백질이다. CD8의 발현은 또한 T 세포 림프종의 하위세트 상에 존재할 뿐만 아니라 몇몇 천연 살해 세포 및 수지상 세포 상에 존재한다. CD8은 CD8 알파 및 CD8 베타 하위단위의 이종 이량체 또는 CD8 알파 동종 이량체로서 조립된다. 상기 조립된 이량체성 CD8 복합체는 MHC I형 세포에 의한 항원 제시를 인식하기 위해 T 세포 수용체(TCR)와 함께 공수용체로서 작용한다. CD8은 T 세포의 발달 및 성숙한 T 세포의 활성화에 역할을 한다. T 세포 국부화에서의 변화는 면역 반응의 진행을 반영할 수 있으며, 시간의 경과와 함께 발생할 수 있다. CD8 하위단위의 예는 서열번호 134 및 서열번호 135로 나타나 있다.
표적 분자인 CD8에 결합하는 미니바디와 같은 항체 및 이의 단편들을 포함한 항원 결합 구조체들이 본원에 개시되어 있다. 몇몇 실시형태에서, CD8 항원과 결합하는 항원 결합 구조체들은 항체, 미니바디, 및/또는 scFv와 같은 항체의 기타 단편들일 수 있다. CD8에 대한 항원 결합 구조체의 몇몇 실시형태는 도 14e, 도 15d, 도 16b 내지 도 16d, 도 20c 내지 도 20g, 도 22b, 도 36b, 도 40(서열번호 105 및 서열번호 106), 도 41(서열번호 106), 도 42(서열번호 107), 도 43(서열번호 108), 도 44(서열번호 109), 도 45(서열번호 110), 도 46(서열번호 11 1), 도 66에 도시되어 있다.
본원에서 제공된 몇몇 실시형태는 CD8에 대해 치료제를 표적화하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본원에 개시된 바와 같은 항원 결합 구조체, 예를 들어 CD8 항원 결합 구조체를 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 치료제에 접합된다.
항원 결합 구조체들은 표적 분자(CD8 및/또는 CD8+ 세포, 예를 들어, 특정 부류의 T 세포)의 존재, 국부화 및/또는 양을 검출하기에 유용할 수 있다. 이 같은 항원 결합 구조체들은 또한 상기 표적 분자를 발현하는 세포에 대해 치료제를 표적화하는데 유용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항원 결합 구조체들(항체, 및 미니바디와 같은 구조체를 포함함)을 이용하여 상기 표적 분자(또는 "표적")의 존재 유무를 검출하기 위한 방법들이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 치료 목적으로 상기 항원 결합 구조체를 이용하기 위한 방법들이 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체들은 면역 시스템의 진단용 이미징을 위한 하위세트의 T 세포의 표면 상에서 발견되는 특정 생물 마커인 인간 CD8의 검출을 가능케 한다. CD8의 이미징은 T 세포 국부화의 생체 내 검출을 가능케 한다. T 세포 국부화에서의 변화는 면역 반응의 진행을 반영할 수 있고, 다양한 치료용 치료 또는 심지어 질병 상태의 결과로서 시간의 경과와 함께 발생할 수 있다.
게다가, CD8은 바이러스 병원균을 제거하고 종양에 면역성을 제공하는 기능을 하는 세포 용해성 T 세포의 활성화를 위해 중요한 하류 신호전달 경로를 활성화하는 역할을 한다. CD8-양성 T 세포는 항원 제시 세포의 MHCI 단백질 내에 제시되는 짧은 펩티드를 인식할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, CD8에 지향하는 조작된 단편들은 T 세포 수용체를 통한 신호전달을 강화시킬 수 있고, 바이러스 병원균를 제거하고 종양 항원에 반응하는 개체의 능력을 증강시킬 수 있다. 따라서 몇몇 실시형태에서 본원에서 제공된 항원 결합 구조체들은 작용제(agonist)일 수 있고, CD8 표적을 활성화시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 표적인 CD8의 존재 유무가 검출된다. 상기 표적의 존재 유무는 상기 시료 중의 항원 결합 구조체의 존재 유무에 기초하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 세척 및/또는 대사적 소거에 의한 상기 시료로부터 항원 결합 구조체의 제거 및/또는 소거 이후, 상기 시료 중의 잔류 항원 결합 구조체는 상기 표적의 존재를 나타낼 수 있고, 상기 시료 중의 항원 결합 구조체의 부재는 상기 표적의 부재를 나타낼 수 있다.
몇몇 실시형태는 면역 시스템의 진단용 이미징을 위한 하위세트의 T 세포의 표면 상에서 발견되는 특정 생물 마커인 인간 CD8의 검출을 포함한다. 상기 표적 분자의 이미징은 T 세포 국부화의 생체 내 검출을 가능케 할 수 있다. T 세포 국부화에서의 변화는 면역 반응의 진행을 반영할 수 있고, 다양한 치료용 치료 또는 심지어 질병 상태의 결과로서 시간의 경과와 함께 발생할 수 있다. 예를 들어, T 세포 국부화를 이미징하는 것이 면역요법에 유용할 수 있다. 입양 면역요법(adoptive immunotherapy)은 환자 자신의 T 세포가 시험관 내에서 조작되고 환자에게 다시 도입되는 요법의 형태이다. 이러한 치료 형태에 있어서, T 세포의 이미징은 상기 치료의 상태를 모니터링 및/또는 결정하는데 유용할 수 있다. 따라서 몇몇 실시형태에서 상기 표적 분자의 국부화를 모니터링하는 것이 약물의 개발에서의 작용기작, 효능 및/또는 안전성을 분석하는데 유용할 수 있고/있거나 질병의 임상적 관리에 도움이 될 수 있다.
본원에서 제공된 몇몇 실시형태는 CD8에 대해 치료제를 표적화하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본원에 개시된 항원 결합 구조체, 예를 들어 CD8 항원 결합 구조체를 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 치료제에 접합된다.
본 발명의 실시형태에 따라 검출 가능한 마커로서 사용될 수 있는 독소로는 리신, 아브린, 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 포도상구균 장독소-A, 미국자리공 항바이러스성 단백질, 겔로닌, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소 및 슈도모나스 내독소를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 나노입자는 약물 담체로서 치료적 적용에 사용되며, 이때 상기 약물 담체는 항원 결합 구조체에 접합되는 경우에 당해 기술분야에 공지된 화학 치료제, 호르몬 치료제, 방사선 치료제, 독소 또는 임의의 기타 세포 독성제 또는 항암제를 세포 표면 상에 상기 표적을 과발현하는 암세포에 전달한다.
항원 결합 구조체들은 CD8을 발현하는 세포와 같은 표적-양성 세포에 대해 치료용 분자, 예를 들어 세포 독소를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 몇몇 실시형태는 표적-양성 세포에 대해 치료제를 표적화하는 방법들을 포함한다. 상기 방법은 본원에 개시된 바와 같은 항원 결합 구조체를 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 개체는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어 적어도 몇몇 표적-양성 세포의 소거 또는 중화를 필요로 하는 개체일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나 치료제를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 치료제는 이황화 결합과 같은 공유결합을 통해 상기 항원 결합 구조체에 직접 접합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 다른 세포 또는 약제에 대한 CD8-양성 세포의 국부화로부터 이익을 얻을 수 있다.
임의적으로는, 적어도 하나 치료제를 포함하는 상기 항원 결합 구조체의 투여 이전 및/또는 이후, 환자의 표적-양성 세포의 개수 및/또는 국부화가 결정된다. 예를 들어, 투여 이전에 표적-양성 세포의 개수 및/또는 국부화를 결정하는 것은 상기 환자가 상기 표적-양성 세포의 중화 및/또는 소거로부터 이익을 얻을 가능성이 있다는 것을 의미할 수 있다. 투여 이후에 상기 표적-양성 세포의 개수 및/또는 국부화를 결정하는 것은 상기 표적-양성 세포가 환자에서 소거되었다는 것을 의미할 수 있다.
"CD8 의존 질환"이란 용어는 면역학적 구성성분(암 면역요법에 대한 반응을 포함함)이 존재하는 암, 자가면역 질환, 염증 질환 등을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, CD8에 결합하는 미니바디가 제공된다. 상기 미니바디는 CD8에 결합하는 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 이때 상기 scFv는 가변 경쇄(VL) 도메인에 연결된 가변 중쇄(VH) 도메인; 및 상기 힌지의 각 가닥 상에 적어도 3개의 시스테인을 포함하는 변이체 힌지 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 인간 IgG CH3 서열을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 방사성 물질, 염료, 조영제, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 효소, 증강제 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 가능한 마커를 더 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 미니바디는 서열번호 75로 표시된 HCDR1과 동일한 HCDR1; 서열번호 76으로 표시된 HCDR2와 동일한 HCDR2; 서열번호 77로 표시된 HCDR3과 동일한 HCDR3; 서열번호 78로 표시된 LCDR1과 동일한 LCDR1; 서열번호 79로 표시된 LCDR2와 동일한 LCDR2; 및 서열번호 80으로 표시된 LCDR3과 동일한 LCDR3을 포함한다. 본원에서 제공된 미니바디의 몇몇 실시형태에서, 상기 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인은 인간 서열이다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 항체를 암호화하는 핵산이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 미니바디를 생성하는 세포주가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 미니바디 및 검출 가능한 마커를 포함하는 키트가 제공된다.
몇몇 실시형태에서, CD8의 존재 유무를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 미니바디를 시료에 적용하는 단계; 및 CD8에 대한 상기 항원 결합 구조체의 결합 또는 이의 결합의 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 방사성 물질, 염료, 조영제, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 효소, 증강제 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 가능한 마커를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디를 적용하는 단계는 상기 미니바디를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 CD8에 대한 상기 미니바디의 결합 또는 이의 결합의 부재를 검출하는 단계는 양전자 방출 단층촬영을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 이차 항체 또는 이의 단편을 상기 시료에 적용하는 단계를 더 포함하며, 이때 상기 이차 항체 또는 이의 단편은 상기 미니바디에 특이적으로 결합한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 이의 미니바디는 1시간 미만 동안 상기 시료와 함께 배양된다.
몇몇 실시형태에서, CD8에 대해 치료제를 표적화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 미니바디를 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 미니바디는 치료제에 접합된다.
몇몇 실시형태에서, 이를 필요로 하는 개체에서 CD8을 발현하는 T 림프구 세포를 표적화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 하나의 실시형태의 미니바디를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, CD8을 발현하는 T 림프구 세포를 중화시키는 방법이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 무반응 CD8 T 세포(anergic CD8 T cell), 기능이상 CD8 T 세포, 자가 반응성 CD8 T 세포, 과반응성 CD8 T 세포, 억제성 CD8 T 세포, 불국소화(mislocalization)된 CD8 T 세포 및 CD8 T 세포 림프종 중 적어도 하나를 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 자가면역, 염증성 병태, 신호전달 결함 및 공-자극 결함 중 적어도 하나와 연관된 CD8 T 세포를 갖는다.
몇몇 실시형태에서, CD8에 결합하는 항체가 제공된다. 상기 항체는 힌지 영역을 포함하며, 이때 상기 힌지 영역은 하기 서열들 중 적어도 하나를 포함한다: a) 서열번호 1의 펩티드 서열(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)로서, Xn1은 공유성 가교결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn2는 A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V 중 하나이고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있는 펩티드 서열; b) 서열번호 2의 펩티드 서열(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)로서, Xn1은 다른 동일한 아미노산과 공유성 가교결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn2는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn6은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn7은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn8은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn9는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn10은 임의의 아미노산일 수 있는 펩티드 서열(서열번호 208); c) ELKTPLGDTTHT(서열번호 48)의 상부 힌지 서열에 연결된 CVECPPCP(서열번호 57), CPPCPPC(서열번호 52) 및 CPPCPPCPPC(서열번호 54) 중 적어도 하나 코어 힌지 서열; 또는 d) 상응하는 아미노산과 가교 결합할 수 있는 아미노산을 포함하지 않는 상부 힌지 영역, 및 상기 상부 힌지 영역의 C-말단에 연결된 코어 힌지 영역(여기서, 상기 코어 힌지 영역은 적어도 3개의 시스테인을 포함함). 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 전장 항체이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 미니바디이다. 상기 힌지 영역을 제외한 항체의 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 인간화 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 75로 표시된 HCDR1과 동일한 HCDR1; 서열번호 76으로 표시된 HCDR2와 동일한 HCDR2; 서열번호 77로 표시된 HCDR3과 동일한 HCDR3; 서열번호 78로 표시된 LCDR1과 동일한 LCDR1; 서열번호 79로 표시된 LCDR2와 동일한 LCDR2; 및 서열번호 80으로 표시된 LCDR3과 동일한 LCDR3을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 항체의 힌지 영역을 암호화하는 핵산이 제공된다. 상기 힌지 영역을 암호화하는 서열을 제외한 핵산의 몇몇 실시형태에서, 상기 핵산은 인간 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 핵산에 의해 암호화된 항체를 발현하는 세포주가 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 세포주에서 상기 항체를 발현하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 이를 필요로 하는 개체에서 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 항체를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
5T4-IAB20M
5T4는 종양 태아성 당단백질로서, 엄선된 성인 조직에서 약한 발현을 나타내지만, 대장암, 신장암, 유방암, 난소암, 위암, 폐암 및 전립선암을 포함한 다양한 유형의 암종에서 강한 발현을 나타낸다. 5T4 발현은 원발성 암 및 전이성 암 둘 모두에서 발견되며, 발현 수준은 질병의 진행과 연관성이 있으며, 그 결과 5T4를 매우 유망한 생물 마커로 만든다. 5T4 단백질의 일례가 서열번호 133로 나타나 있다.
5T4-특이적 이미징제는 물질대사에서의 변화의 검출에 기초하는 FDG와 같은 기타 이미징제에 대해 특이성에서의 유의한 이점을 제공할 수 있다. 더욱이, 5T4를 특이적으로 표적화하는 이미징제들은 5T4를 표적화하는 요법의 개발 동안에 중요한 도구일 수 있다. 예를 들어, 상기 이미징제는 5T4를 표적화하는 요법의 처리 이후에 환자를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 전립선암의 경우, 프로스타신트로 불리는 FDA-승인 SPECT 이미징제가 시판되고 있지만, 온전한 항체가 쥐 유래이고(반복 투여에 의해 면역원성 문제) 에피토프가 생물 마커 PSMA의 내부 에피토프(정확도를 제한함)이기 때문에 상당한 한계를 갖는다. 본 발명의 5T4 항원 결합 구조체들은 이들이 5T4의 세포 외 에피토프와 결합할 수 있고, 이미징을 위한 최적의 약동학을 나타내며, 인간화된다는 점에서 프로스타신트에 대해 유의한 이점을 가질 수 있다.
상기 5T4 단백질은 영양막 당단백질(trophoblast glycoprotein) 또는 TPBG로도 공지된다. 5T4 단백질의 예가 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 서열번호 133의 5T4 단백질을 포함한다.
치료용 항체 및 항체 융합 단백질들은 쥐 항체 "H8"을 포함한 인간 5T4 표적에 대항하여 개발되고 있다. 또한 트로박스(Trovax)로 명명된 암 백신은 옥스포드 바이오메디카(Oxford BioMedica)사에 의해 5T4 항원에 대항하여 현재 개발되고 있다.
5T4-특이적 이미징제는 물질대사에서의 변화의 검출에 기초하는 FDG와 같은 기타 이미징제에 대해 특이성에서의 유의한 이점을 제공할 수 있다. 더욱이, 5T4를 특이적으로 표적화하는 이미징제들은 5T4를 표적화하는 요법의 개발 동안에 중요한 도구일 수 있다. 예를 들어, 상기 이미징제는 5T4를 표적화하는 요법의 처리 이후에 환자를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 전립선암의 경우, 프로스타신트로 불리는 FDA-승인 SPECT 이미징제가 시판되고 있지만, 온전한 항체가 쥐 유래이고(반복 투여에 의해 면역원성 문제) 에피토프가 생물 마커 PSMA의 내부 에피토프(정확도를 제한함)이기 때문에 상당한 한계를 갖는다. 본 발명의 항원 결합 구조체들은 이들이 5T4의 세포 외 에피토프와 결합할 수 있고, 이미징을 위한 최적의 약동학을 나타내며, 인간화된다는 점에서 프로스타신트에 대해 유의한 이점을 가질 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 5T4 항원과 결합하는 항원 결합 구조체들은 항체, 미니바디, 및/또는 scFv와 같은 항체의 기타 단편들일 수 있다. 5T4에 대한 항원 결합 구조체의 몇몇 비제한적인 실시형태는 도 28b 내지 도 28e, 도 32, 도 36c, 도 54(서열번호 119 및 서열번호 120), 도 55(서열번호 120), 도 56(서열번호 121), 도 57(서열번호 122), 도 58(서열번호 123), 도 59(서열번호 124), 도 67, 도 68에 도시되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 대장암, 신장암, 유방암, 난소암, 위암, 폐암 및/또는 전립선암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유형의 암을 치료하는 위해 치료제에 결합될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 5T4 항원 결합 구조체는 독립형 구조체(예를 들어, 이에 접합된 독소가 없음)로서의 치료제로서 사용될 수 있다. 상기 단편들이 치료에 대해 덜 최적일 수 있는 온전한 항체에 비해 짧은 반감기를 가질지라도 이들 포맷은 이들의 보다 작은 크기에 기초하여 개선된 종양 침투를 나타낼 수 있고, 세포 독성 약물 또는 방사성 동위원소로 적절히 장착되는 경우에 치료학적으로 효과적일 수 있다.
5T4는 이를 항체 약물-접합체 접근법에 적합하게 만들 수 있는 신속한 내재화 항원(rapidly internalizing antigen)이다. 몇몇 실시형태에서, 다른 치료적 접근법은 국부 암조직에 대한 베타-에미터 이트륨-90과 같은 적절한 방사선 표지의 부착을 통한 방사성 면역요법이며, 상기 방사선 표지는 세포 손상 및 사멸을 야기할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는, 예를 들어 대장암, 신장암, 유방암, 난소암, 위암, 폐암 및/또는 전립선암 세포를 포함한 5T4 항원을 발현하는 세포를 표적화하기 위해 사용된다.
치료 이전 및 치료 도중에 항체의 표적의 존재를 위해 환자 전신을 이미징하는 능력은 개별화된 환자 관리를 위한 소중한 정보를 제공한다. 항체 요법의 안전성 및 효능에 대한 시험 도중에 환자의 질병 진행의 일부로서 항체의 표적을 발현하는 환자에 대한 치료를 선택하고 시험할 수 있어 유용하다.
5T4는 대장 암종, 신장 암종, 유방 암종, 난소 암종, 위 암종, 폐 암종 및 전립선 암종을 포함한 많은 상이한 암종에 과발현된다. FDG-PET와 같은 이미징제들은 많은 이들 유형의 암을 검출하는데 매우 효과적인 것으로 입증되었지만, 현재 이미징 실습은 난소암 및 전립선암에 대해서는 충분히 정확하지는 않다. 몇몇 실시형태에서, 임의의 이들 질환은 본원에서 제공된 다양한 5T4 구조체를 이용하여 진단 및/또는 치료될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체들은 인간에서의 임상적 이미징제(PET/SPECT)일 수 있다. 5T4가 다양한 유형의 암(대장암, 신장암, 유방암, 난소암, 위암, 폐암 및 전립선암을 포함함)에서 과발현되기 때문에 이들 5T4 항원 결합 구조체는 이들 암에 대한 표적화된 진단 검출용으로 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이는 난소암 및/또는 전립선암의 검출용으로 사용될 수 있다.
"5T4 의존 질환"이란 용어는 5T4가 질환 그 자체에서 역할을 하는 임의의 질환을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 이는 5T4의 과발현을 의미한다. 상기 질환의 예는, 예를 들어 대장암, 신장암, 유방암, 난소암, 위암, 폐암 및 전립선암과 같은 다양한 유형의 암을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 5T4에 결합하는 미니바디가 제공된다. 상기 미니바디는 5T4에 결합하는 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 이때 상기 scFv는 가변 경쇄(VL) 도메인에 연결된 가변 중쇄(VH) 도메인; 및 상기 힌지의 각 가닥 상에 적어도 3개의 시스테인을 포함하는 변이체 힌지 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 인간 IgG CH3 서열을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 방사성 물질, 염료, 조영제, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 효소, 증강제 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 가능한 마커를 더 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 미니바디는 서열번호 87로 표시된 HCDR1과 동일한 HCDR1; 서열번호 88로 표시된 HCDR2와 동일한 HCDR2; 서열번호 89로 표시된 HCDR3과 동일한 HCDR3; 서열번호 90으로 표시된 LCDR1과 동일한 LCDR1; 서열번호 91로 표시된 LCDR2와 동일한 LCDR2; 및 서열번호 92로 표시된 LCDR3과 동일한 LCDR3을 포함한다. 본원에서 제공된 미니바디의 몇몇 실시형태에서, 상기 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인은 인간 서열이다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 항체를 암호화하는 핵산이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 미니바디를 생성하는 세포주가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 미니바디 및 검출 가능한 마커를 포함하는 키트가 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 5T4의 존재 유무를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 미니바디를 시료에 적용하는 단계; 및 5T4에 대한 상기 항원 결합 구조체의 결합 또는 이의 결합의 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 방사성 물질, 염료, 조영제, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 효소, 증강제 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 가능한 마커를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디를 적용하는 단계는 상기 미니바디를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 표적 항원에 대한 상기 미니바디의 결합 또는 상기 결합의 부재를 검출하는 단계는 양전자 방출 단층촬영을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 이차 항체 또는 이의 단편을 상기 시료에 적용하는 단계를 더 포함하며, 이때 상기 이차 항체 또는 이의 단편은 상기 미니바디에 특이적으로 결합한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 이의 미니바디는 1시간 미만 동안 상기 시료와 함께 배양된다.
몇몇 실시형태에서, 5T4에 대해 치료제를 표적화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 미니바디를 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 미니바디는 치료제에 접합된다.
몇몇 실시형태에서, 이를 필요로 하는 개체에서 5T4를 표적화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 하나의 실시형태의 미니바디를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 대장암 또는 종양, 신장암 또는 종양, 유방암 또는 종양, 난소암 또는 종양, 위암 또는 종양, 폐암 또는 종양 및 전립선암 또는 종양 중 하나를 앓고 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 원발성 암 및 전이성 암 중 적어도 하나를 앓고 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 초기 단계의 질환을 앓고 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 중기 단계의 질환을 앓고 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 말기 단계의 질환을 앓고 있다.
몇몇 실시형태에서, 5T4에 결합하는 항체가 제공된다. 상기 항체는 힌지 영역을 포함하며, 이때 상기 힌지 영역은 하기 서열들 중 적어도 하나를 포함한다: a) 서열번호 1의 펩티드 서열(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)로서, Xn1은 공유성 가교결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn2는 A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V 중 하나이고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있는 펩티드 서열; b) 서열번호 2의 펩티드 서열(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)로서, Xn1은 다른 동일한 아미노산과 공유성 가교결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn2는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn6은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn7은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn8은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn9는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn10은 임의의 아미노산일 수 있는 펩티드 서열(서열번호 208); c) ELKTPLGDTTHT(서열번호 48)의 상부 힌지 서열에 연결된 CVECPPCP(서열번호 57), CPPCPPC(서열번호 52) 및 CPPCPPCPPC(서열번호 54) 중 적어도 하나의 코어 힌지 서열; 또는 d) 상응하는 아미노산과 가교 결합할 수 있는 아미노산을 포함하지 않는 상부 힌지 영역 및 상기 상부 힌지 영역의 C-말단에 연결된 코어 힌지 영역(여기서, 상기 코어 힌지 영역은 적어도 3개의 시스테인을 포함함). 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 전장 항체이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 미니바디이다. 상기 힌지 영역을 제외한 항체의 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 인간화 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 87로 표시된 HCDR1과 동일한 HCDR1; 서열번호 88로 표시된 HCDR2와 동일한 HCDR2; 서열번호 89로 표시된 HCDR3과 동일한 HCDR3; 서열번호 90으로 표시된 LCDR1과 동일한 LCDR1; 서열번호 91로 표시된 LCDR2와 동일한 LCDR2; 및 서열번호 92로 표시된 LCDR3과 동일한 LCDR3을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 항체의 힌지 영역을 암호화하는 핵산이 제공된다. 상기 힌지 영역을 암호화하는 서열을 제외한 핵산의 몇몇 실시형태에서, 상기 핵산은 인간 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 핵산에 의해 암호화된 항체를 발현하는 세포주가 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 항체를 제조하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 세포주에서 상기 항체를 발현하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 이를 필요로 하는 개체에서 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 항체를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
CD3-IAB25M
CD3(분화 클러스터 3)은 단클론성 항체 OKT3과 동시에 발견되었다. 처음에 OKT3은 모든 성숙한 말초 T 세포에 결합하는 것으로 밝혀졌으며, 나중에 TCR-CD3 복합체의 일부로서 CD3 엡실론 하위단위는 OKT3에 의해 결합된 세포 표면 항원인 것으로 결정되었다(문헌[Kung, P. 등, "Monoclonal antibodies defining distinctive human T cell surface antigens," Science, Vol. 206, No. 4416, pp. 347-349, 1979]). CD3 하위단위의 예는 서열번호 136 내지 서열번호 139로 나타나 있다. OKT3은 급성 신장 동종이식 거부반응을 연구한 초기 시험과 더불어 이식 거부반응을 위한 면역억제제로서 후속적으로 시험되었다(문헌[Cosimi, A. B. 등, "Treatment of acute renal allograft rejection with OKT3 monoclonal antibody," Transplantation, Vol. 32, No. 6, pp. 535-539, 1981]).
몇몇 실시형태에서, 표적 분자인 CD3에 결합하는 미니바디와 같은 항체 및 이들의 단편을 포함하는 항원 결합 구조체들이 제공된다. 이 같은 항원 결합 구조체들은 표적 분자(CD3 및/또는 CD3+ 세포)의 존재, 국부화 및/또는 양을 검출하는데 유용할 수 있다. 이 같은 항원 결합 구조체들은 또한 면역세포 상의 CD3 발현과 연관된 생물 활성을 조절하고 CD3 단백질을 발현하는 세포에 대해 치료제를 표적화하는데 유용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 항원 결합 구조체(항체, 및 미니바디와 같은 구조체를 포함함)들을 이용하여 표적 분자(또는 "표적")의 존재 유무를 검출하기 위한 방법들이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 치료 목적으로 상기 항원 결합 구조체를 이용하기 위한 방법들이 제공된다.
또한 본원에서 개시된 몇몇 실시형태의 CD3 미니바디는, 예를 들어 TCR 복합체의 CD3 엡실론 도메인을 통해 T 세포를 중화시키고 FOXP3의 상향 조절을 통해 T 조절 세포를 상향 조절함으로써 면역 시스템 반응을 조정하기 위해 치료용 미니바디로서 사용될 수 있다(문헌[Saruta, M. 등, "Characterization of FOXP3+CD4+ regulatory T cells in Crohn's disease," Clin. Immunol., Vol. 125, No. 3, pp. 281-290, 2007]). 이 같은 요법들은 몇 가지 예를 들자면 조직/기관 동종이식편을 치료할 뿐만 아니라 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병 및 홍반성 낭창과 같은 자가면역 질병을 치료하는데 유용성을 갖는다.
초기 개념 입증 전임상적 이미징은 OKT3으로부터 유래하지 않는 인간화 항-CD3 항체인 비실리주맙(Visilizumab)을 이용하여 수행되어 왔다(문헌[Malviya, G. 등, "Radiolabeled humanized anti-CD3 monoclonal antibody Visilizumab for imaging human T-lymphocytes," Vol. 50, No. 10, pp. 1683-1691, 2009]). CD3+ T 세포의 이미징은 당해 기관이 CD3+ T 세포로 완전히 침습되는 경우에 치료가 효과적이기 때문에 항-CD3 요법에 있어서 유용하다. 잠재적인 CD3 이미징제는 환자의 선별을 가능케 할 수 있고, 또한 치료를 모니터링하기 위한 방법을 가능케 한다. 전장 항체를 이용한 이미징은 전형적으로는 본원에서 제공된 단편들을 이용한 이미징과 비교하여 최적의 이미징을 위한 보다 긴 주사 후 시간을 요구한다.
몇몇 실시형태에서 미니바디와 같은 항-CD3 항원 결합 구조체들이 제공된다. 상기 항원 결합 구조체들은, 예를 들어 면역 시스템 관련 다양한 질환을 이미징 하고 치료하기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, CD3 항원에 결합하는 항원 결합 구조체들은 항체, 미니바디, 및/또는 scFv와 같은 항체의 기타 단편들 일 수 있다. CD3에 대한 항원 결합 구조체의 몇몇 비제한적인 실시형태는 도 33, 도 36d, 도 69에 도시되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 독소와 같은 다른 분자에 대한 연결 없이 치료제로서 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Chatenoud, L. 등, "CD3-specific antibodies: a portal to the treatment of autoimmunity," Nat. Rev. Immunol., Vol. 7, No. 8, pp. 622-632, 2007] 참조). 이 같은 항원 결합 구조체들은 또한 암, 당뇨병, 자가면역 및 염증성 병태를 포함한 다양한 질병을 치료하기 위해 면역세포 상의 CD3 발현과 연관된 생물 활성을 조절하는데 유용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 면역억제제로서 단독으로 사용될 수 있고, CD3 신호전달을 억제하기 위한 활성을 나타낸다.
또한 본원에서 개시된 CD3 항원 결합 구조체들은, 예를 들어 TCR 복합체의 CD3 엡실론 도메인을 통해 T 세포를 중화시키고 FOXP3의 상향 조절을 통해 T 조절 세포를 상향 조절함으로써 면역 시스템 반응을 조절하기 위해 치료용 항원 결합 구조체로서 사용될 수 있다(문헌[Saruta, M. 등, 2007]). 이 같은 요법들은 몇 가지 예를 들자면 조직/기관 동종이식편을 치료할 뿐만 아니라 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병 및 홍반성 낭창과 같은 자가면역 질병을 치료하는데 유용성을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, 미니바디와 같은 항원 결합 구조체는 테플리주맙(Teplizumab)의 가변 중쇄 또는 경쇄 영역으로부터 유래한 하나 이상의 CDR을 함유할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 항원 결합 구조체들 중 하나 이상은 OX40, CD134, CD40, CD154, CD80, CD86, ICOS, CD137 및/또는 IL-1 수용체 길항제에 지향하는 항체와 같은 기타 면역세포 표적화제와 조합될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 CD3에 지향하는 미니바디는 면역 반응을 감소시키며, 어떠한 부가적인 치료제도 상기 항원 결합 구조체에 접합될 필요가 없다. 따라서 몇몇 실시형태에서 치료제에 접합되지 않거나 치료제를 포함하는 T 세포와 연관이 있는 자가면역 당뇨병 또는 기타 자가면역 병태의 치료를 위한 미니바디가 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 CD3 항원 결합 구조체들은 TCR 복합체의 CD3 엡실론 도메인을 통해 T 세포를 자극 및 관용유도(tolerization)하고/하거나 FOXP3의 상향 조절을 통해 T 조절 세포를 상향 조절함으로써 면역 시스템 반응을 조정하기 위해 치료용 항원 결합 구조체로서 사용될 수 있다(문헌[Saruta, M. 등, 2007]). 이 같은 요법들은 조직/기관 동종이식편을 치료할 뿐만 아니라 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 홍반성 낭창 등과 같은 자가면역 질병을 치료하는데 유용할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 독소와 같은 다른 분자에 대한 연결 없이 치료제로서 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Chatenoud, L. 등, 2007] 참조). 이 같은 항원 결합 구조체들은 또한 암, 당뇨병, 자가면역 및 염증성 병태를 포함한 다양한 질병을 치료하기 위해 면역세포 상의 CD3 발현과 연관된 생물 활성을 조절하는데 유용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 면역억제제로서 단독으로 사용될 수 있으며, CD3 신호전달을 억제하기 위한 활성을 나타낸다.
임의의 하나의 이론에 제한되지 않는 채, 몇몇 실시형태에서 이중 특이성 항원 결합 구조체는 표적-양성 세포 상의 표적에 결합하고, 제 1 세포 상의 제 1 항원(이는 CD3과 상이할 수 있음)에 결합하며, 따라서 상기 표적-양성 세포를 제 1 세포와 인접하게 한다. 예를 들어, CD3+ 세포는 암세포와 인접하게 될 수 있으며, 이러한 암세포에 대한 면역 반응을 조장할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 CD3 의존 질환의 치료를 위한 치료제에 접합된다.
상기 개체는 임의의 다수의 CD3 의존 질환을 앓고 있을 수 있으며, 상기 질환은, 예를 들어 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병 또는 홍반성 낭창일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 바와 같은 항원 결합 구조체는 전염증성 사이토카인 방출, T 세포 활성화 및/또는 세포 증식을 포함하지만 이에 제한되지 않는 바람직하지 못한 부작용의 유의한 감소를 가능케 한다.
몇몇 실시형태에서, 치료 방법이 제공되며, 이에 의해 상기 개체는 CD3 지향 항원 결합 구조체들의 적용으로부터 이익을 얻을 수 있지만, 생체 내에서 CD3에 대한 항원 결합 구조체의 결합 이후 면역세포 활성화의 보다 낮은 자극을 초래하기 위해 전장 구조체가 아닌 미니바디가 대신 투여된다.
몇몇 실시형태에서, 약학 조성물 중의 미니바디의 양은 전장 구조체(예를 들어, 전장 OKT3)에 대해 달리 투여될 수 있는 양보다 많다. 몇몇 실시형태에서, 투여된 양이 전장 구조체로서 투여되었다면 상기 양은 개체에서 사이토카인 폭풍을 유도할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 사이토카인 폭풍 또는 사이토카인 방출 증후군(CRS)을 야기하지 않으면서도 투여될 수 있는 양은 적어도 10마이크로그램/㎡이고, 예를 들어 적어도 10마이크로그램/㎡, 17마이크로그램/㎡, 20마이크로그램/㎡, 30마이크로그램/㎡, 40마이크로그램/㎡, 50마이크로그램/㎡, 60마이크로그램/㎡, 70마이크로그램/㎡, 80마이크로그램/㎡, 90마이크로그램/㎡, 100마이크로그램/㎡, 200마이크로그램/㎡, 300마이크로그램/㎡, 400마이크로그램/㎡, 500마이크로그램/㎡, 600마이크로그램/㎡, 700마이크로그램/㎡, 800마이크로그램/㎡, 900마이크로그램/㎡ 또는 적어도 1000마이크로그램/㎡의 상기 미니바디 포맷이 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 양은 사이토카인 방출 증후군을 야기하지 않을 것이다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 양은 1등급 및/또는 2등급 사이토카인 방출 증후군을 야기하지 않을 것이다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 양은 하기 증상들 중 하나 이상을 야기하지 않을 것이다: 발진, 두통, 메스꺼움, 구토 및/또는 한기/오한/발열. 몇몇 실시형태에서, 전장 항체를 사용하면 투여 1일 또는 5일 또는 6일째 날에 정상적으로 나타날 수 있는 이들 증상은 미니바디를 사용하면 존재하지 않을 것이다.
몇몇 실시형태에서, CD3의 차단 요법을 필요로 하는 개인의 치료를 위한 방법이 제공되며, 이때 상기 개인은 또한 사이토카인 폭풍을 발생하고/하거나 이를 경험할 위험성을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 전장 항체의 미니바디 구조체를 사이토카인 폭풍을 경험할 위험성을 갖는 개체에 투여하는 단계를 포함하지만; 전장 항체가 상기 개체에 투여되었을 때 상기 미니바디 포맷은 그렇지 않는 경우에 일어날 수 있는 임의의 면역세포의 활성화 강도에서의 감소를 가능케 할 것이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 동일한 CDR(또는 유사한 CDR) 및/또는 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역(또는 유사한 중쇄 및 경쇄 가변 영역)들을 공유할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디의 투여는 CD3에 대한 결합이 일어난 이후에 면역세포 활성화의 보다 낮은 자극을 가능케 한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디의 투여는 CD3에 대한 결합이 일어난 이후에 방출된 사이토카인의 수준에서의 감소를 가능케 한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디의 투여는 전장 구조체를 사용하였을 때와 비교하여 CD3에 대한 결합 이후에 발생할 보다 낮은 양의 활성화를 가능케 한다.
몇몇 실시형태에서, 당업자라면 반대 요법(counter therapy)을 투여할 필요 없이 CD3 요법을 투여할 수 있으며, 이때 상기 반대 요법은 사이토카인 폭풍을 감소시키거나 차단하도록 설계될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이는 전장 구조체 대신에 상기 개체에 미니바디 항원 결합 구조체를 투여하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 사이토카인 폭풍의 강도 및/또는 가능성을 감소시키는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 CD3에 결합할 항원 결합 구조체를 수용해야 하는 개체를 확인하는 단계, 및 CD3에 결합하는 유효량의 미니바디를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 구조체는 본원에서 제공된 구조체들 중 하나 이상이다.
본원에 개시된 바와 같이, 사이토카인 폭풍을 감소시키고/시키거나 피하는 능력(또는 사이토카인 활성화 및/또는 증식을 감소시키는 능력과 같은 기타 양태)은 CD3에 결합하는 항원 결합 구조체들에 있어서 특히 적절할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이 같은 문제를 피하는 상기 과정(예를 들어, 미니바디 포맷을 이용함)이 기타 표적 단백질, 예를 들어 상기 표적에 대한 항체의 결합이 사이토카인 폭풍 또는 활성화/증식을 야기하는 임의의 표적 단백질에 대해 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 당업자가 개체에서 부적절하고/하거나 해로운 활성화를 피하도록 하기 위해 이용될 수 있으며, 이때 상기 활성화는 2가 항원 결합 단백질에 반응하여 나타난다. 몇몇 실시형태에서, 당업자라면 CD3 항원 결합 단백질이 아닌 CD28 항원 결합 단백질(예를 들어, CD28에 결합하는 미니바디)을 이용할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, CD3 미니바디의 사용은 CD3 의존 질환의 치료를 가능케 하기 위해 개체가 적절한 수준의 항원 결합 구조체를 수용하도록 한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 또한 인슐린 주사를 맞지 않고/않거나 후속적으로 인슐린 주사를 맞으면서도 CD3 결합 분자를 수용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, CD3 미니바디 구조체의 사용은 당업자가 상기 과정에서 너무나도 많은 B 세포를 파괴하지 않으면서도 CD3 주도 반응을 약화시키게 한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 감소된 활성화/증식으로는 T 세포 및/또는 천연 살해(NK) 세포의 활성화 및/또는 증식을 들 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 이를 필요로 하는 개체에 항원 결합 구조체를 제공하는 단계는 유효량의 항원 결합 구조체를 CD3에 제공하는 단계를 포함하며, 이때 상기 항원 결합 구조체는 CD3에 결합하지만, 사이토카인 방출량, 활성화량 및 증식량 중 적어도 하나에서 유의한 증가를 초래하지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 면역세포 상의 CD3과 결합하는 치료제를 투여하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 바와 같은 항원 결합 구조체를 CD3의 양의 감소를 필요로 하는 개체에 제공하는 단계(예를 들어, 임의의 상기 미니바디를 CD3에 제공하는 단계)를 포함한다. 상기 항원 결합 구조체는 CD3에 결합하지만, 본원에서 제공된 데이터에 나타낸 바와 같이 상기 항원 결합 구조체는 사이토카인 방출량, 활성화량 및 증식량 중 적어도 하나에서 유의한 증가를 초래하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 CD3의 감소는 이용 가능한 유리 CD3 단백질의 양의 감소를 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 CD3의 감소는 CD3 단백질을 발현하는 세포의 감소를 의미한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 구조체는 상기 개체에 대해 받아들이기 어려울 정도로 유해할 수 있는 수준으로 사이토카인 폭풍을 야기하지 않는다.
몇몇 실시형태에서, CD3 의존 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 유효량의 항원 결합 구조체를 상기 개체에 제공하는 단계를 포함한다. 상기 항원 결합 구조체는 CD3에 결합하는 미니바디이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 치료제에 접합된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항원 결합 구조체는 제 1 결합 부위 및 제 2 결합 부위를 포함하는 2가 배열을 포함하며, 이때 상기 제 1 결합 부위는 CD3에 결합하고, 상기 제 2 결합 부위는 CD3에 결합한다. 상기 유효량은 서로 다른 포맷, 특히 전장 항체 포맷(예를 들어, OKT3)으로 상기 항원 결합 구조체가 투여되었을 경우에 몰량(molar amount)이 치료 목적으로 용인할 수 없는 강도로 사이토카인 폭풍을 유도할 수 있도록 하는 몰량이다. 그러나 상기 항원 결합 구조체가 미니바디인 경우 이러한 동일한 몰량은 CD3 기반 요법에 있어서 여전히 효과적이지만, 용인할 수 없는 수준으로 사이토카인 폭풍을 유도하지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 구조체들이 요법용으로 사용될 수 있기 때문에 비록 이들이 2가이고 CD3에 결합할지라도 상기 CD3 항원 결합 구조체들 중 치료용 구조체들이 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 생체 내에서 CD3과 결합하지만 유의한 사이토카인 방출량, 활성화량 및 증식량 중 적어도 하나의 증가를 초래하지 않는 항원 결합 구조체가 제공된다.
"CD3 의존 질환"이란 용어는 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 홍반성 낭창, 염증성 장질환, 당뇨병, 기관 이식 거부반응, 자가면역 질병, 알레르기, 및 T 세포 및/또는 천연 살해(NK) 세포가 병리학에서 역할을 하는 기타 질환을 포함한다.
"사이토카인 캐스케이드(cascade)" 또는 "사이토카인 과다분비(hypercytokinemia)"로도 공지된 "사이토카인 폭풍"은 사이토카인과 면역세포 사이의 양성 피드백 고리(positive feedback loop)와 연관이 있는 잠재적으로 치명적인 면역 반응으로, 다양한 사이토카인의 수준이 매우 증가되어 있다. 사이토카인 폭풍의 증상들로는 고열, 부기 및 적열 상태, 극도 피로 및 메스꺼움이 있다. 몇몇의 경우, 상기 면역 반응은 치명적일 수 있다. 전형적으로는, 몇몇 사이토카인 방출 수준은, 예를 들어 감염과 싸우는 경우에 허용 가능하고 필요하다. 사람이 독감과 연관된 발열 한기를 앓는 경우 이 같은 증상들은 면역 시스템이 바이러스와 싸운 결과이며, 따라서 이 같은 수준은 허용 가능하며 "사이토카인 폭풍"은 아니다. 그러나 활성화 암(activation arm)이 지나치게 자극되지만 억제성 신호에 의해 균형이 잡히지 않는 경우, 이들 사이토카인은 기관 및 조직의 손상 및 궁극적으로는 사멸을 초래할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에서 제공된 구조체들은 사이토카인 방출 증후군을 회피 및/또는 최소화하는데 유용할 수 있으며, 따라서 그렇지 않는 경우에 항-T 세포 전장 항체가 사용될 수 있는 상황에 적용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 사이토카인 폭풍에 지향하여 본원에서 제공된 임의의 상기 방법들은 또한 사이토카인 방출 증후군에 적용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 염증성 및/또는 자가면역 병태를 앓고 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 병태는 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병 및 홍반성 낭창 중 적어도 하나로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 사이토카인은 전장 OKT3 항체 투여로부터 유도된 사이토카인 폭풍과 연관된 사이토카인이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 사이토카인은 IFNγ, IL-2, TNF-α 및 IL-17 중 적어도 하나를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, CD3에 결합하는 미니바디가 제공된다. 상기 미니바디는 CD3에 결합하는 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 scFv는 가변 경쇄(VL) 도메인에 연결된 가변 중쇄(VH) 도메인; 및 상기 힌지의 각 가닥 상에 적어도 3개의 시스테인을 포함하는 변이체 힌지 영역을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 인간 IgG CH3 서열을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 방사성 물질, 염료, 조영제, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 효소, 증강제 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 가능한 마커를 더 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 항체를 암호화하는 핵산이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 미니바디를 생산하는 세포주가 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 미니바디 및 검출 가능한 마커를 포함하는 키트가 제공된다.
몇몇 실시형태에서, CD3의 존재 유무를 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 미니바디를 시료에 적용하는 단계; 및 CD3에 대한 상기 항원 결합 구조체의 결합 또는 이의 결합의 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 방사성 물질, 염료, 조영제, 형광 화합물, 생물 발광 화합물, 효소, 증강제 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 검출 가능한 마커를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디를 적용하는 단계는 상기 미니바디를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 상기 표적 항원에 대한 상기 미니바디의 결합 또는 이의 결합의 부재를 검출하는 단계는 양전자 방출 단층촬영을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 이차 항체 또는 이의 단편을 상기 시료에 적용하는 단계를 더 포함하며, 이때 상기 이차 항체 또는 이의 단편은 상기 미니바디에 특이적으로 결합한다. 상기 방법의 몇몇 실시형태에서, 이의 미니바디는 1시간 미만 동안 시료와 함께 배양된다.
몇몇 실시형태에서, CD3에 대해 치료제를 표적화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 미니바디를 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 미니바디는 치료제에 접합된다.
몇몇 실시형태에서, 이를 필요로 하는 개체에서 CD3을 발현하는 T 림프구 세포를 표적화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 하나의 실시형태의 미니바디를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, CD3을 발현하는 T 림프구 세포를 중화시키는 방법이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 무반응 CD3 T 세포, 기능이상 CD3 T 세포, 자가 반응성 CD3 T 세포, 과반응성 CD3 T 세포, 억제성 CD3 T 세포, 불국소화된 CD3 T 세포 및 CD3 T 세포 림프종 중 적어도 하나를 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 상기 개체는 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 자가면역, 염증성 병태, 신호전달 결함 및 공-자극 결함 중 적어도 하나와 연관된 CD3 T 세포를 갖는다.
몇몇 실시형태에서, CD3에 결합하는 항체가 제공된다. 상기 항체는 힌지 영역을 포함하며, 이때 상기 힌지 영역은 하기 서열들 중 적어도 하나를 포함한다: a) 서열번호 1의 펩티드 서열(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)로서, Xn1은 공유성 가교결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn2는 A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V 중 하나이고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있는 펩티드 서열; b) 서열번호 2의 펩티드 서열(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)로서, Xn1은 다른 동일한 아미노산과 공유성 가교결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn2는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn6은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn7은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn9는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn10은 임의의 아미노산일 수 있는 펩티드 서열(서열번호 208); c) ELKTPLGDTTHT(서열번호 48)의 상부 힌지 서열에 연결된 CVECPPCP(서열번호 57), CPPCPPC(서열번호 52) 및 CPPCPPCPPC(서열번호 54) 중 적어도 하나의 코어 힌지 서열; 또는 d) 상응하는 아미노산과 가교 결합할 수 있는 아미노산을 포함하지 않는 상부 힌지 영역 및 상기 상부 힌지 영역의 C-말단에 연결된 코어 힌지 영역(여기서, 상기 코어 힌지 영역은 적어도 3개의 시스테인을 포함함). 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 전장 항체이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 미니바디이다. 상기 힌지 영역을 제외한 항체의 몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 인간화 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 CD3에 대해 표 8의 서열번호 174로 표시된 HCDR1과 동일한 HCDR1; 표 8의 서열번호 175로 표시된 HCDR2와 동일한 HCDR2; 표 8의 서열번호 176으로 표시된 HCDR3과 동일한 HCDR3; 표 8의 서열번호 177로 표시된 LCDR1과 동일한 LCDR1; 표 8의 서열번호 97로 표시된 LCDR2와 동일한 LCDR2; 및 표 8의 서열번호 178로 표시된 LCDR3과 동일한 LCDR3을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 항체는 도 65b 또는 도 65c에 도시된 HCDR1과 동일한 HCDR1; 도 65b 또는 도 65c에 도시된 HCDR2와 동일한 HCDR2; 도 65b 또는 도 65c에 도시된 HCDR3과 동일한 HCDR3; 도 65b 또는 도 65c에 도시된 LCDR1과 동일한 LCDR1; 도 65b 또는 도 65c에 도시된 LCDR2와 동일한 LCDR2; 및 도 65b 또는 도 65c에 도시된 LCDR3과 동일한 LCDR3을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, CD3 항원에 결합하는 항원 결합 구조체들은 항체, 미니바디, 및/또는 scFv와 같은 항체의 기타 단편일 수 있다. CD3에 대한 항원 결합 구조체의 몇몇 비제한적인 실시형태는 도 65b 및 도 65c에 도시되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 미니바디는 도 65b 또는 도 65c에 도시된 HCDR1과 동일한 HCDR1; 도 65b 또는 도 65c에 도시된 HCDR2와 동일한 HCDR2; 도 65b 또는 도 65c에 도시된 HCDR3과 동일한 HCDR3; 도 65b 또는 도 65c에 도시된 LCDR1과 동일한 LCDR1; 도 65b 또는 도 65c에 도시된 LCDR2와 동일한 LCDR2; 및 도 65b 또는 도 65c에 도시된 LCDR3과 동일한 LCDR3을 포함한다. 본원에서 제공된 미니바디의 몇몇 실시형태에서, 상기 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인은 인간 서열이다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 항체의 힌지 영역을 암호화하는 핵산이 제공된다. 상기 힌지 영역을 암호화하는 서열을 제외한 핵산의 몇몇 실시형태에서, 상기 핵산은 인간 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 핵산에 의해 암호화된 항체를 발현하는 세포주가 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 상기 실시형태의 항체를 제조하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 세포주에서 상기 항체를 발현하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 이를 필요로 하는 개체에서 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 본원에서 제공된 임의의 상기 실시형태의 항체를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
부가적인 실시형태
몇몇 실시형태에서, 상기 scFv 또는 미니바디는 진단용 이미징에 대해 우수한 약동학적 특성을 갖는다. 현재 기술은 전장 항체의 느린 혈청 제거로 인해 고대비 이미지를 생성하기 위해 훨씬 더 긴 시간(주사 후 약 7일)이 요구되는 온전한 항체를 사용한 이미징을 이용한다. 상기 미니바디는 당일 또는 다음날 이미징을 위한 기회를 제공한다. 공격적으로 진행되는 질병을 앓고 있는 환자에게 있어서 매일 매일이 중요하며, 보다 앞선 시점에 적절한 치료적 접근법을 확인하는 능력은 환자의 생존을 향상시키는 잠재성을 갖는다. 당일 또는 다음날 이미징은 또한 치료/진단을 받기 위해 상당한 거리를 이동하는 많은 환자들이 직면하는 문제점에 대한 논리적 해결안을 제공하는데, 이는 전장 항체에 대한 미니바디를 사용하여 이미징하는 경우 이동/숙박 기간 또는 1주일 후에 되돌아올 필요성이 해소될 수 있기 때문이다. 몇몇 실시형태에서, 보다 낮은 방사선량에 대한 노출은 당업자가 수 회 이미징을 하고 시간의 경과에 따른 질병의 진행을 추적하게 한다.
부가적으로는, 몇몇 실시형태에서 상기 미니바디 구성성분 단량체들은 이황화 결합을 형성하는 힌지 시스테인 잔기들을 함유한다. 이들 공유결합된 시스테인 잔기들은 이량체성 미니바디 분자의 완전성을 유지하면서 시스테인-특이적 접합을 위한 활성 티올기를 제공하기 위해 약한 화학적 환원을 통해 개방될 수 있다. 현재의 화학적 접합 방법들은 하기 부위-특이적 플랫폼을 포함한다: 항체, 예를 들어 Thio-Mabs(로슈(Roche))의 F(ab)'2 영역 내의 시스테인; Fc(DISH-Mab, 시태들 제네틱스(Seattle Genetics)) 내의 239번째 위치의 시스테인, 알콕시아민 링커 형성을 위한 케토-페닐알라닌(Ambrx)과 클릭-사이클로부가(click-cycloaddition)를 위한 페닐알라닌아지도메탄(슈트로(Sutro))과 같은 비자연적인 아미노산, 및 트랜스글루타미나아제(transglutaminase)-의존성 접합(린냇-파이자(Rinat-Pfizer))을 위한 Fc 영역 내의 글루타민을 도입하기. mAb 내 힌지 시스테인들은 비-부위-특이적 티올 접합 화학을 위해 화학적 핸들을 제공한다. 리신에 대한 접합은 또한 비-부위-특이적이거나 무작위이며, 가장 높은 이종성을 초래한다. 몇몇 실시형태에서, 당업자라면 본원에서 제공된 상기 항원 결합 구조체의 scFv, 골격 또는 다른 부분 내에 부위-특이적 시스테인을 도입할 수 있다.
치료 이전 및 치료 도중에 항체의 표적의 존재에 대해 환자 전신을 이미징하는 능력은 개별화된 환자 관리를 위한 소중한 정보를 제공하다. 항체 요법의 안전성 및 효능에 대한 시험 도중에 이는 환자의 질병 진행의 일부로서 항체의 표적을 발현하는 환자에 대한 치료를 선택하고 시험할 수 있어 유용하다.
몇몇 실시형태에서, 이용 가능한 항체 요법과 매칭(matching)되는 scFv 또는 미니바디의 진단용 단편들은 적절한 항체 요법과 환자의 질병 상태의 매칭을 가능케 한다.
몇몇 실시형태에서, 표적 분자-양성 세포 상의 제 1 항원을 표적화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 이중 특이성 항원 결합 구조체를 시료에 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 이중 특이성 항원 결합 구조체는 본원에 개시된 바와 같은 항원 결합 구조체를 포함할 수 있다. 상기 이중 특이성 항체 또는 이의 단편은 제 1 항원과 결합하는 항원 결합 구조체, 예를 들어 미니바디의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR, scFv 또는 단량체를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 이중 특이성 항체는 본원에 개시된 바와 같은 항원 결합 구조체의 1개, 2개 또는 3개의 HCDR 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 항원 결합 구조체의 1개, 2개 또는 3개의 LCDR을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 이중 특이성 항원 결합 구조체는 본원에 개시된 바와 같은 항원 결합 구조체의 scFv를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 이중 특이성 항원 결합 구조체는 본원에 개시된 바와 같은 VH 또는 VL 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 이중 특이성 항원 결합 구조체는 본원에 개시된 바와 같은 미니바디 단량체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 이중 특이성 항원 결합 구조체는 생체 내에서 시료, 예를 들어 개체의 기관 또는 조직에 적용된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 이중 특이성 항원 결합 구조체는 시험관 내 시료에 적용된다. 임의의 하나의 이론에 제한되지 않는 채, 몇몇 실시형태에서 상기 이중 특이성 항원 결합 구조체는 상기 표적-양성 세포 상의 표적에 결합하고, 상기 제 1 세포 상의 제 1 항원(이는 제 1 표적 분자와는 상이할 수 있음)에 결합하며, 따라서 상기 표적-양성 세포가 상기 제 1 세포에 인접하게 된다. 예를 들어, 제 1 표적 분자+ 세포는 암세포에 인접하게 될 수 있으며, 이러한 암세포에 대한 면역 반응을 조장할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자 단편으로 구성된 이중 특이성 항원 결합 구조체는 세포 독성 T 세포를 면역세포를 발현하는 활성화된 제 1 표적 분자 또는 표적 세포의 살해를 야기하기 위해 종양 세포를 발현하는 제 1 표적 분자와 인접하게 할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 당업자라면 상기 제 2 scFv의 특이성을 결정할 때 임의의 면역세포(NK 또는 B 세포 또는 수지상 세포)를 표적화할 수 있고, 이를 항원 발현 세포에 브리징(bridging)할 수 있다.
미니바디 구조체들은 VL-VH 또는 VH-VL 배향으로 있을 수 있는 가변 링커 길이를 갖는 항원 결합 scFv를 함유한다. scFv는 표 0.1 상에 개시된 바와 같이 임의의 12개 힌지 서열에 연결될 수 있다. scFv 및 적절한 힌지들은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체로부터 유래한 CH3 도메인과 연결될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 일반적으로 천연 IgG1, IgG2 및 IgG3 항체 내의 경쇄와 쌍을 이루는 첫 번째 힌지 시스테인은 이황화 스크램블링 및/또는 콘카테머화를 예방하기 위해 세린 또는 알라닌 또는 기타 적절한 아미노산으로 돌연 변이될 수 있다. 반분자의 존재를 감소시키거나 반분자의 형성을 감소시키고 생체 내 안정성을 증가시키기 위해, 상기 힌지 영역은 기타 단량체와 적어도 3개의 이황화 결합을 형성하도록 적어도 3개의 시스테인을 함유해야 한다. 서로에 대해 적절한 거리에 위치한 상기 힌지 내 가닥 당 3개의 시스테인은 적절한 이황화 결합의 형성을 허용하는데 유용하다(표 3). 서로에 대해 적절한 거리에 위치한 상기 미니바디 내의 힌지 중의 3개의 이황화 결합은 생체 내 단백질 안정성 및 신장 제거가 아닌 간을 통한 제거에 유용하다. 상기 힌지 중의 적어도 3개(또는 그 이상)의 이황화물은 약물, 킬레이터 또는 형광 염료의 부위-특이적 접합에 유리하다. 상술한 바와 같이 구성된 Mb는 부모 항체에 대해 유사한 친화도를 보유한다. 몇몇 실시형태에서, IgG1 구조체와 관련하여 첫 번째 cys는 온전하게 남아있을 수 있고, 이는 그렇게 해롭게 보이지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 상부 힌지, 코어 힌지 및 하부 힌지를 포함하는 미니바디 또는 이중 특이성 미니바디의 힌지는 표 3에 나타낸 바와 같이 상부 힌지 서열들 중 임의의 하나, 코어 힌지 서열들 중 임의의 하나 및 하부 힌지 서열들 중 임의의 하나를 조합함으로써 생성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 힌지 내의 첫 번째 시스테인 잔기는 임의의 아미노산으로 변경될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 상부 힌지 내의 하나의 시스테인 잔기는 임의의 아미노산으로 변경될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 코어 힌지 내의 하나의 시스테인 잔기는 임의의 아미노산으로 변경될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 코어 힌지 내의 2개의 시스테인 잔기는 임의의 아미노산으로 변경될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 상부 힌지 내의 하나의 시스테인 잔기 및 상기 코어 힌지 내의 하나의 시스테인 잔기는 임의의 아미노산으로 변경될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 상부 힌지 내의 하나의 시스테인 및 상기 코어 힌지 내의 2개의 시스테인 잔기는 임의의 아미노산으로 변경될 수 있다.
실시예를 위한 구조체의 서열들은 하기 실시예 부분에서 적절하게 토의되어 있으며, 표 0.2에 또한 제공된다.
실시예 1: 미니바디 구조
미니바디는 약 80kDa의 2가의 공유결합된 동종 이량체이다. 단량체(반분자) 각각은 대략 15개 내지 18개의 아미노산으로 이루어진 Gly-Ser-풍부 링커 서열에 의해 상기 상응하는 가변 경쇄(VL) 도메인에 연결된 가변 중쇄(VH) 도메인으로 구성된다. 단일 사슬 가변 단편(scFv) 각각은 힌지 서열에 의해 인간 IgG CH3 도메인에 연결된다.
상기 힌지의 이황화 결합을 포함하는 서열들은 중요하며, 생체 내에서 이량체 완전성을 유지하기 위해 그리고 부위-특이적 접합을 위해 가능한 부위로서 충분한 개수의 시스테인 쌍을 함유할 뿐만 아니라 단백질의 기타 영역에 존재하는 시스테인 잔기와의 바람직하지 못한 이황화 스크램블링을 예방하기 위해 설계되었다.
최근까지, 대부분의 미니바디는 도 1에 도시된 바와 같이 인간 IgG1 CH3 도메인에 연결된 연장 서열을 갖는 천연 인간 IgG1 상부 및 코어 힌지 영역을 사용하여 조작되었다. 하기 실시예에서 나열된 바와 같이, VL-VH(M1) 및 VH-VL(M2) 배향 둘 모두를 갖는 scFv 변이체들은 종종 다양한 표적 분자에 대해 평가되었다.
인간 IgG1에 기초한 조작
이전의 힌지(예를 들어, γ1 EH1)에서, 상기 힌지(도 2의 상단) 내의 첫 번째 시스테인은 문제를 야기하며, 이러한 문제는 LC/MS를 이용한 원형 질량 분석 결과에 의해 증명된 바와 같이 단백질 이종성을 초래하였다. 상기 힌지 영역 내의 시스테인의 명백한 중요성에도 불구하고, 이러한 시스테인을 세린으로 돌연 변이시키기로 결정되었으며, 그 결과 γ1 EH2 힌지(도 2의 하단)를 초래하였다. 그러나 상기 코어 힌지(도 2의 하단) 내의 2개의 나머지 시스테인 잔기 사이에 형성된 2개의 이황화 결합이 생체 내에서 이량체 안정성을 유지하는데 적절하지 않은 것으로 나타났기 때문에 이러한 힌지 구조체는 특정 목적하는 양태를 구현하지 못한 것으로 확인되었다.
IgG1 힌지 서열에 의한 문제점을 극복하기 위한 IgG2 Mb
새롭게 도입된 상술한 양태를 제시하기 위해, 상기 미니바디는 추가로 조작된다. 연장 서열을 갖는 huIgG2에 기초한 조작된 미니바디는 이황화 결합을 증가시키고 단백질 안정성을 증가시키기 위해 상기 코어 힌지 내의 세 번째 시스테인(IgG1 천연 코어 힌지에 대한 부가적인 시스테인)을 제공하였다. IAB2M 및 IAB22M의 HuIgG2 미니바디는 상기 huIgG2 CH3 도메인에 연결된 인간 IgG2(huIgG2) 힌지 서열을 이용하여 조작되었다.
상기 하부 힌지(γ2 EH1)로서 연장 서열과 조합된 천연 IgG2 상부 및 코어 힌지 서열들에서, 집성체의 증가가 관측되었다. 반응성 시스테인(도 3의 상단; 상기 힌지의 첫 번째 시스테인)은 도 5a에 도시된 SDS-PAGE 분석에 의해 관측할 때 huIgG2 천연 힌지(도 3의 상단)와 함께 형성된 IAB2M-γ2 EH1 포맷에서의 콘카테머 형성에 책임이 있었다.
따라서 IgG1 힌지(γ1 EH1)에 대해 수행되었던 바와 유사하게, 상기 힌지 내의 첫 번째 시스테인(이는 경쇄와 쌍을 이룸)은 세린으로 돌연 변이되었으며, 그 결과 IgG2 EH2(γ2 EH2)(도 3의 하단)를 초래하였다. 이러한 힌지(γ2 EH2)를 갖는 항원 결합 구조체들은 잘 발현되며, 양호나 생체 내 안정성을 나타냈다. 상기 코어 힌지 내의 3개의 이황화 결합 모두는 질량 분광분석법에 의해 검출할 때 적절히 형성하였다. 안정성은 γ2 EH2를 갖는 IAB2M 및 IAB22M 구조체 둘 모두를 이용하여 증명되었다.
세린으로 변경된 첫 번째 시스테인을 갖고 천연 상부 및 하부 힌지 서열(γ2 NH2)을 갖는 추가로 조작된 huIgG2 미니바디가 평가되었으며, 단백질은 생체 내에서 안정한 것으로 밝혀졌다(도 4의 하단).
실시예 2: IAB2M에 대한 시험관 내 데이터
표 1에는 IAB2M 변이체(서열번호는 도 5b 내지 도 5e에 도시되어 있음)들의 개요가 나타나 있다. IAB2M 변이체들의 부가적인 실시형태는 도 47 내지 도 53에 도시되어 있다.
명칭 Cys-Ser 힌지 돌연 변이 말단 Lys의 제거 N-말단 내지 C-말단(서열번호)
IAB2M-γ1 EH1 아니오 아니오 VL(서열번호 13); 링커(서열번호 62); VH(서열번호 14); 전체 힌지(서열번호 22)[상부 힌지(서열번호 45), 코어 힌지(서열번호 50), 하부 힌지(서열번호 59)]; IgG1 CH3(서열번호 40 또는 서열번호 41)
IAB2M-γ1 EH2 예 예 VL(서열번호 13); 링커(서열번호 62); VH(서열번호 14); 전체 힌지(서열번호 24)[상부 힌지(서열번호 46), 코어 힌지(서열번호 50), 하부 힌지(서열번호 59)]; IgG1 CH3(서열번호 40 또는 서열번호 41)
IAB2M-γ2 EH1 예 예 VL(서열번호 13); 링커(서열번호 62); VH(서열번호 14); 전체 힌지(서열번호 32)[상부 힌지(서열번호 47), 코어 힌지(서열번호 55), 하부 힌지(서열번호 59)]; IgG2 CH3(서열번호 42)
IAB2M-γ2 EH2 예 예 VL(서열번호 13); 링커(서열번호 62); VH(서열번호 14); 전체 힌지(서열번호 34)[상부 힌지(서열번호 47), 코어 힌지(서열번호 56), 하부 힌지(서열번호 59)]; IgG2 CH3(서열번호 42)
힌지 변이체인 γ1 EH1, γ1 EH2 및 γ2 EH1 및 γ2 EH2를 갖는 IAB2M의 SDS-PAGE 분석(도 5a)에 따르면 반분자 대 이량체 비율은 상기 EH2 변이체 내의 첫 번째 힌지 시스테인의 돌연 변이와 함께 상당히 향상된 것으로 나타났다(반분자는 20% 내지 30%에서 1% 미만으로 감소할 수 있음). 상기 γ2 EH2 버전은 적절한 이황화 결합을 갖지만 γ2 EH1(도 5b 내지 도 5e에 도시된 서열번호)에 비해 콘카테머를 갖지 않았다. 상기 코어 힌지 내의 부가적인 시스테인(2개가 아닌 3개)의 존재로 인해, 상기 γ2 EH2 힌지 변이체는 향상된 안정성을 나타냈으며, 상기 γ1 EH2 힌지 변이체와 비교하여 보다 적은 반분자가 존재하였다.
반분자의 존재에 대한 확인은 원형 질량 분석에 의해 이루어졌다. 단백질 시료들은 60℃에서 TSKgel 페닐-5PW 칼럼(2 x 75㎜, 토쇼 바이오사이언시스(Tosoh Biosciences))을 이용하여 역상 조건 하에서 분리되고, 애질런트(Agilent) ESI-QTOF 모델 6538에 의해 분석되었다. 도 6a는 IAB2M γ1 EH1 변이체의 원형 질량 분석을 나타낸다. 상기 분리된 반분자 및 실치수 분자의 총 이온 크로마토그램은 상부 패널에 나타나 있다. UV280 트레이스(trace; 미도시)는 피크 통합(peak integration)에 의해 미니바디 변이체 내에 존재하는 반분자의 비율(%)을 정량화하기 위해 사용되었다. 탈회선된 질량은 배치를 위해 사용되었으며, 반분자(중간 패널)의 동일성 및 실치수 질량(하부 패널)의 동일성을 확인하였다. 도 6b는 IAB2M γ2 EH1 변이체의 원형 질량 분석을 나타낸다. 상부 패널은 역상 조건 하의 총 이온 크로마토그램을 나타낸다. 중간 패널은 반분자의 존재를 확인한 탈회선된 원형 질량을 나타내고, 하부 패널은 확인된 실치수 분자 질량을 나타내다. 도 6c는 IAB2M γ1 EH2 변이체의 원형 질량 분석을 나타낸다. 상부 패널은 역상 조건 하의 총 이온 크로마토그램을 나타낸다. 중간 패널은 반분자의 존재를 확인한 탈회선된 원형 질량을 나타내고, 하부 패널은 확인된 실치수 분자 질량을 나타낸다. 도 6d는 IAB2M γ2 EH2 변이체의 원형 질량 분석을 나타낸다. 상부 패널은 총 이온 크로마토그램을 나타낸다. 하부 패널은 실치수 질량 분자의 존재를 확인한 탈회선된 원형 질량을 나타낸다. 어떠한 반분자도 검출되지 않았다.
IAB2M 변이체의 FAC 분석(도 7a 및 도 7b)에 따르면 이전에 사용된 표준 힌지인 γ1 EH1로부터 상기 힌지를 변경하여도 LNCap-AR 세포(도 5b, 도 5c, 도 5d) 및 C4-2 XCL 세포(도 5b, 도 5c, 도 5e, 도 7c) 중 하나 상에 발현된 표적 항원에 대한 결합 친화도에 영향을 미치지 않았다.
반분자 형성에 대한 이해를 도와주는 이황화물 매핑에 있어서, 트리스(pH 7.5) 중의 6M 구아니딘 HCl로 단백질을 변성시킴으로써 시료를 제조하였다. 여기에 4-비닐피리딘을 30mM의 농도까지 첨가한 후, 암실에서 1시간 동안 배양하여 유리 시스테인을 캡핑(capping)하였다. 상기 용액을 희석하여 구아니딘의 농도를 1M로 만든 후, 트립신/Lys-C를 이용하여 분해하였다. 상기 분해는 37℃에서 하룻밤 동안 진행되도록 하였다. 상기 시료를 냉동시키고, 분리 이전에 습기를 제거하였다. 이 다음에는 펩티드 혼합물이 원터스 엑스브릿지(Waters Xbridge) BEH130 C18 4.6 x 150㎜ 칼럼 상의 구배를 이용하여 90% 아세토니트릴 중의 0.05% TFA의 구배로 0.05% 수성 TFA 내에서 분리되는 LC/MS가 수행되었으며, 질량은 양성 모드로 ESI-QTOT 질량 분광계 6538(애질런트)을 이용하여 확인되었으며, 애질런트 매스헌터(Agilent Mass Hunter) 소프트웨어를 이용하여 탈회선되었다. IAB2M γ1 EH1 이량체 내에서 확인된 이황화물 함유 펩티드는 도 8에 도시되어 있다.
IAB2M γ1 EH1의 이황화물 매핑에서는 상기 힌지 영역 내의 적절히 형성된 이황화물, 예를 들어 예상 이황화물의 존재가 증명되었으며, 또한 이황화 스크램블링이 검출되었다. 도 8은 확인된 이황화물의 표를 나타내는 반면, 도 9는 상기 결과의 예시도를 나타낸다. 상기 이황화물(도 8)은 예상 시스테인 잔기(서열번호 183 및 서열번호 184의 시스테인; 서열번호 183 및 서열번호 185; 서열번호 186의 시스테인)들 사이에서 나타났으며, 상기 단백질의 기타 도메인에 존재하는 예상치 못한 시스테인 잔기들 사이에서 나타났다. 상기 힌지 내의 쌍을 이루지 못한 시스테인은 이황화 스크램블링을 야기하며, 이로 인해 통상적인 이황화물 형성(실선)이 이루어지지 않는 것으로 가정되었다(도 9). 더욱이, VH 이황화물은 아마도 트립신성 이황화 결합 펩티드의 비이온화로 인해 질량 분광계에서 관측되지 않았다(점선)(그리고 이로 인해 검출되지 않음)(도 9).
huIgG2 EH1(γ2 EH1)에 대한 재포맷팅은 IAB2M의 안정성을 향상시키지 않았다. 도 10은 상기 확인된 이황화물의 그래프 도면을 나타낸다. γ2 EH1에 대해 유의한 콘카테머 형성이 SDS-PAGE에 의해 관측되었다(도 5a). IAB2M γ1 EH1에서와 같이, 상기 VH 이황화물은 아마도 트립신성 이황화 결합 펩티드의 비효율적인 이온화로 인해 관측되지 않았으며(점선), 따라서 질량 분광계에서 검출되지 않았다. IAB2M γ2 EH1(도 5d)은 10% 초과의 반분자(39,469.5Da: LC/MS에 의한 측정)를 나타냈다(도 10 및 도 6b). 우세한 반분자(1번 피크)는 도 10의 패널(A) 및 패널(B) 상에 나타낸 바와 같이 크로마토그램으로 나타냈다. 도 6a(상부 패널)는 1번 및 2번 피크가 각각 반분자 및 실치수 분자인 IAB2Mγ1 EH1의 총 이온 전류(TIC) 크로마토그램을 나타낸다. 도 6a의 중간 패널은 피크 통합에 의한 UV280 채널을 나타내며, 이는 반분자의 비율(%)이 11.1%임을 결정하는 것을 가능케 한다. 도 6a(하부 패널)는 2번 피크를 포함하는 분자 질량을 나타낸다.
실시예 3: IAB2M에 대한 생체 내 데이터
89Zr-Df-IAB2M-γ1 EH1(도 5b)의 PET/CT 및 생물 분포는 누드 마우스에서 수행되었다. 24시간 및 48시간에 89Zr-Df-IAB2M-γ1 EH1의 투여 이후에 우측 어깨 상에 PSMA-양성 22Rv1 이종 이식편을 갖고 있는 누드 마우스의 MIP PET/CT 이미지는 도 11a에 도시되어 있다. 48시간에 3마리의 마우스로부터 유래한 조직에서의 평균 방사성 흡수는 그램 당 주사량(ID/g)의 비율(%)로서 나타낸다(도 11b). 종양 흡수는 상대적으로 낮고(6.1±1.2%ID/g), 신장 흡수는 높았으며(23.3±6.2%ID/g); 간 흡수(14.1±1.6%ID/g)에 비해 거의 2배 높았다. 상기 미니바디가 생체 내에서 이량체로 잔류하는 경우, 단백질 제거는 간을 통해 일어날 수 있는 것으로 예상될 수 있다. 신장 신호가 간 신호보다 높다는 것은 생체 내 불안정 및 반분자 형성을 암시하였다.
89Zr-Df-IAB2M-γ1 EH2(도 5c)의 PET/CT 및 생물 분포는 누드 마우스에서 수행되었다. 24시간 및 47시간에 89Zr-Df-IAB2M-γ1 EH2의 투여 이후에 우측 어깨 상에 PSMA-양성 22Rv1 이종 이식편을 갖고 있는 누드 마우스의 MIP PET/CT 이미지는 도 12a에 도시되어 있다. 47시간에 2마리의 마우스로부터 유래한 조직에서의 방사성 흡수는 그램 당 주사량(ID/g)의 비율(%)로서 나타낸다(도 12b). 또한 2배 내지 3배 더 높은 방사성 흡수가 신장에서 나타났다. 상기와 같이, 신장 신호가 간 신호보다 높다는 것은 생체 내 불안정 및 반분자 형성을 암시하였다.
89Zr-Df-IAB2M-γ2 EH2(도 5d)의 PET/CT 및 생물 분포는 누드 마우스에서 수행되었다. 24시간 및 47시간에 89Zr-Df-IAB2M-γ2 EH2의 투여 이후에 우측 어깨 상에 PSMA-양성 22Rv1 이종 이식편을 갖고 있는 누드 마우스의 MIP PET/CT 이미지는 도 13a에 도시되어 있다. 47시간에 2마리의 마우스로부터 유래한 조직에서의 방사성 흡수는 그램 당 주사량(ID/g)의 비율(%)로서 나타낸다(도 13b). 1 미만의 신장 대 간 비율과 함께 낮은 신장 흡수가 수득되었으며, 이는 γ1 EH2가 안정한 단백질임을 나타냈다.
실시예 4: IAB2M 생체 내 연구에 대한 요약(표 2)
IgG1의 힌지 영역으로부터 유래한 힌지 서열을 이용하여 제조된 미니바디들은 신장을 통해 높은 제거율을 나타냈으며, 이는 단백질의 생체 내 불안정 및 반분자로의 해리를 암시하였다(도 11).
기타 쌍을 이루지 못한 시스테인과의 원하지 않은 상호작용을 예방하기 위해 상기 IgG1 힌지 영역(γ1 EH2)(도 5c)에서 첫 번째 힌지 시스테인의 세린으로의 돌연 변이로 인해 시험관 내에서 보다 양호한 프로파일을 갖는 단백질이 생성되었다(예를 들어, 도 5의 SDS-PAGE 데이터). 그러나 상기 신장을 통한 높은 제거는 단백질의 생체 내 불안정 및 반분자로의 해리를 암시하였다(도 12).
첫 번째 힌지 시스테인이 세린으로 돌연 변이된 IgG2 힌지(γ2 EH2(도 5d) 등(힌지 영역에 대한 요약이 나타나 있는 표 3))를 이용하여 제조된 미니바디는 약 80kDa의 단백질에 대해 예상된 바와 같이 간을 통해 제거되었으며, 이는 상기 분자가 생체 내에서 온전하게 잔류한다는 것을 나타냈다(도 13a 및 도 13b). 그 결과는 또한 표 2에 나타나 있다.
접합 전략 종양 모델 마우스 계통 시간 종양(%ID/g) 신장(%ID/g) 간(%ID/g) N-말단 내지 C-말단(서열번호)
IAB2M-γ1 EH1 89Zr-Df- Lys 22Rv1 누드 48시간 6.1% 23.3% 14% VL(서열번호 13); 링커(서열번호 62); VH(서열번호 14); 전체 힌지(서열번호 22)[상부 힌지(서열번호 45), 코어 힌지(서열번호 50), 하부 힌지(서열번호 59)]; IgG1 CH3(서열번호 40 또는 서열번호 41)
IAB2M-γ1 EH1 89Zr-Df- Lys 22Rv1 누드 48시간 9.3% 26% 16.3% VL(서열번호 13); 링커(서열번호 62); VH(서열번호 14); 전체 힌지(서열번호 22)[상부 힌지(서열번호 45), 코어 힌지(서열번호 50), 하부 힌지(서열번호 59)]; IgG1 CH3(서열번호 40 또는 서열번호 41)
IAB2M-γ1 EH2 89Zr-Df- Lys 22Rv1 누드 48시간 9.4% 23.5% 9.9% VL(서열번호 13); 링커(서열번호 62); VH(서열번호 14); 전체 힌지(서열번호 24)[상부 힌지(서열번호 46), 코어 힌지(서열번호 50), 하부 힌지(서열번호 59)]; IgG1 CH3(서열번호 40 또는 서열번호 41)
IAB2M-γ2 EH2 89Zr-Df- Lys 22Rv1 누드 48시간 7.8% 3.6% 5.1% VL(서열번호 13); 링커(서열번호 62); VH(서열번호 14); 전체 힌지(서열번호 34)[상부 힌지(서열번호 47), 코어 힌지(서열번호 56), 하부 힌지(서열번호 59)]; IgG2 CH3(서열번호 42)
N-말단 내지 C-말단
힌지 명칭 전체 힌지 CH3 도메인
상부 힌지 코어 힌지 하부 힌지
γ1 EH1 전체 힌지(서열번호 22) γ1(서열번호 40 또는 서열번호 41) 천연 상부 및 코어 IgG1 힌지
EPKSCDKTHT(서열번호 45) CPPC(서열번호 50) GGGSSGGGSG(서열번호 59)
γ1 EH2 전체 힌지(서열번호 24) γ1(서열번호 40 또는 서열번호 41) C → S
EPKSSDKTHT(서열번호 46) CPPC(서열번호 50) GGGSSGGGSG(서열번호 59)
γ1 EH3 전체 힌지(서열번호 26) γ1(서열번호 40 또는 서열번호 41) C → S
EPKSSDKTHT(서열번호 46) CPPCPPC(서열번호 52) GGGSSGGGSG(서열번호 59)
γ1 EH4 전체 힌지(서열번호 28) γ1(서열번호 40 또는 서열번호 41) C → S
EPKSSDKTHT(서열번호 46) CPPCVECPPC(서열번호 53) GGGSSGGGSG(서열번호 59)
γ1 EH5 전체 힌지(서열번호 30) γ1(서열번호 40 또는 서열번호 41) C → S
EPKSSDKTHT(서열번호 46) CPPCPPCPPC(서열번호 54) GGGSSGGGSG(서열번호 59)
γ2 EH1 전체 힌지(서열번호 32) γ2(서열번호 42) 천연 상부 및 코어 IgG2 힌지
ERK(서열번호 47) CCVECPPCP(서열번호 55) GGGSSGGGSG(서열번호 59)
γ2 EH2 전체 힌지(서열번호 34) γ2(서열번호 42) C → S
ERK(서열번호 47) SCVECPPCP(서열번호 56) GGGSSGGGSG(서열번호 59)
γ2 EH2 전체 힌지(서열번호 34) γ2(서열번호 181) T26S, L28A, M57V
ERK(서열번호 47) SCVECPPCP(서열번호 56) GGGSSGGGSG(서열번호 59)
γ2 EH2 전체 힌지(서열번호 34) γ2(서열번호 182) T26W
ERK(서열번호 47) SCVECPPCP(서열번호 56) GGGSSGGGSG(서열번호 59)
γ2 NH1 전체 힌지(서열번호 31) γ2(서열번호 42) 천연 IgG2 힌지
ERK(서열번호 47) CCVECPPCP(서열번호 55) APPVAGP(서열번호 60)
γ2 NH2 전체 힌지(서열번호 33) γ2(서열번호 42) C → S
ERK(서열번호 47) SCVECPPCP(서열번호 56) APPVAGP(서열번호 60)
γ3/γ1 EH6 전체 힌지(서열번호 35) γ1(서열번호 40 또는 서열번호 41) 천연 γ3 상부 힌지
ELKTPLGDTTHT(서열번호 48) CVECPPCP(서열번호 57) GGGSSGGGSG(서열번호 59)
γ3/γ1 EH7 전체 힌지(서열번호 36) γ1(서열번호 40 또는 서열번호 41) 천연 γ3 상부 힌지
ELKTPLGDTTHT(서열번호 48) CPPCPPC(서열번호 52) GGGSSGGGSG(서열번호 59)
γ3/γ1 EH8 전체 힌지(서열번호 37) γ1(서열번호 40 또는 서열번호 41) 천연 γ3 상부 힌지
ELKTPLGDTTHT(서열번호 48) CPPCPPCPPC(서열번호 54) GGGSSGGGSG(서열번호 59)
γ1 NH11
NH1		 EPKSCDKTHT(서열번호 45) CPPC(서열번호 50) APELLGGP(서열번호 58) γ1(서열번호 40 또는 서열번호 41) 천연 γ1 힌지
γ3 NH13
NH1		 ELKTPLGDTTHT(서열번호 48) CPRCP
(EPKSCDTPPPCPRCP)3(서열번호 256)		 APELLGGP(서열번호 58) γ3(서열번호 43) 천연 γ3 힌지
실시예 5: IAB22M IGG2 미니바디에 대한 시험관 내 데이터
IAB22M-γ2 EH1 변이체(도 14b)의 원형 질량 분석(도 14a)은 질량 분광분석법에 의해 수행되었다. γ2 EH1 힌지를 갖는 IAB22M은 잠재적인 쌍을 이루지 못한 첫 번째 힌지 시스테인을 가졌으며, 이는 약 9.2%의 반분자를 초래하였다(도 20b). IAB22M γ2 EH1의 원형 질량 분석에 있어서, 시료들은 60℃에서 역상 크로마토그래피 칼럼(TSKgel 페닐-5PW(토쇼, 2 x 75㎜)에 의해 분리되었으며, 애질런트 ESI-QTOF 질량 분광계에 의해 분석되었다. 도 14a는 상부 패널에서 상기 분리된 반분자 및 실치수 분자의 총 이온 크로마토그램을 나타낸다. UV280 트레이스(미도시)는 피크 통합에 의해 상기 미니바디 변이체에 존재하는 반분자의 비율(%)을 정량화하기 위해 사용되었다. 탈회선된 질량은 배치를 위해 사용되었으며, 반분자(중간 패널)의 동일성 및 실치수 질량(하부 패널)의 동일성을 확인하였다.
그러나 상기 IgG2 힌지 내의 첫 번째 시스테인이 세린으로 돌연 변이된 IAB22M1-γ2 EH2 변이체(도 15b)의 원형 질량 분석(도 15a)에 따르면 γ2 EH2를 갖는 99% 초과의 온전한 이량체성 단백질(이론적 MW = 79051.2; 수득된 MW = 79,052)이 나타났다. IAB22M1 γ2 EH2의 원형 질량 분석에 있어서, 단백질 시료는 원터스 나노액커티(Waters nanoAcquity) UPLC에 결합된 트리자익 나노ESI(Trizaic nanoESI) 소스가 구비된 워터스 시냅트(Waters Synapt) G2 HDMS로 이루어진 LC/MS에 의해 분석되었다. 상기 단백질은 물 중의 0.1% 포름산 및 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산을 이동상으로 사용하여 3㎕/분으로 작동하는 역상 C4 나노틸 칼럼(Nanotile column; 150㎛ ID x 50㎜, 워터스)을 이용하여 분리되었다. 도 15a의 상부 패널은 실치수 미니바디의 단일의 우세한 분자 질량을 나타낸 전체 범위 스캔을 나타낸다. 도 15a의 중간 패널은 이량체, 예를 들어 실치수 단백질의 확대 영역을 나타낸다. 도 15a의 하부 패널은 반분자들의 확대 영역을 나타낸다. 반분자가 검출되지만, 이의 상대적인 빈도는 상기 실치수 단백질보다 거의 세 자릿수 정도 낮다.
실시예 6: IAB22M IGG2 MB에 대한 생체 내 데이터
huIgG1 및 huIgG2 유래 힌지 서열들과 IAB22M Mb의 비교는 89Zr-Df-IAB22M 변이체의 PET/CT에 의해 수행되었다. 89Zr-Df-IAB22M-γl-EH1(도 16b), -γ2 NH1(도 16c) 및 -γ2 EH2(도 15b) 변이체들의 투여 이후 좌측 어깨 상에 CD8-양성 HPB-ALL 이종 이식편을 갖고 있는 NOD-SCID 마우스의 MIP PET/CT 이미지는 도 16a에 도시되어 있다. 상기 γ2 힌지 변이체는 보다 낮은 신장 흡수를 초래하였다.
huIgG1 힌지(γ1 EH1)(도 16b)를 이용하여 제조된 IAB22M Mb는 신장을 통해 신속하게 제거되었으며, 그 결과 종양 표적화의 감소를 초래하였다. huIgG2 힌지 변이체, 즉 연장된 힌지(γ2 EH2)(도 15b) 또는 천연 힌지(γ2 NH1)(도 16c)에 의해 제조된 IAB22M Mb는 높은 종양 표적화 및 보다 낮은 신장 제거와 함께 보다 높은 생체 내 안정성을 나타냈다(도 16a).
89Zr-Df-IAb22M-γl EH1(도 16b)에 대해 HPB-ALL 종양의 PET/CT가 수행되었다. 4시간, 24시간 및 41시간에 항원-양성 HPB-ALL 종양을 갖는 한 마리의 마우스에 대한 일련의 관상 이미지는 도 17에 도시되어 있다. 방사성 흡수는 24시간 및 41시간에 상기 종양에서 명확히 관찰되었다. 일부 배경 활성이 또한 항원 음성 다우디 종양에서 관측되었다. 높은 배경 활성은 복부 영역에 존재하였으며, 이는 신장을 통한 원하지 않은 제거를 암시하였다.
HPB-ALL 종양(도 18)에서 89Zr-Df-IAb22M-γ1 EH1(도 16b)에 대해 생물 분포 분석을 수행하였다. 상기 HPB-ALL에서의 종양 흡수는 다우디(다우디 종양은 표적 항원을 발현하지 않음)에 비해 약 6배 높았다. HPB-ALL 종양과 혈액 사이의 생물 분포 비율은 13.5이고, 다우디 종양과 혈액 사이의 생물 분포 비율은 3.5이었다. 신장 신호는 간 신호보다 높았으며, 이는 신장을 통한 보다 높은 제거(도 18) 및 덜 안정한 생체 내 구조체를 암시하였다.
최적화된 미니바디를 조작하기 위해 사용된 초기 구조체로부터 학습된 교훈
상기 결과에 따르면 시스테인 미스페어링을 예방하기 위해 첫 번째 힌지 시스테인을 돌연 변이시키는 것이 중요한 것으로 나타났다. 그러나 상기 힌지 영역 내에 2개 초과의 시스테인 잔기는 단백질의 구조적 완전성을 유지하는데 유리하다. IgG2 힌지를 이용하면 생체 내 안정성을 증가시키기 위한 해결안이 제공된다. 상기 Mb 구조체 내의 말단 리신(K)의 돌연 변이는 단백질 발현에 영향을 미치지 않았지만, 더욱 균일한 전하를 갖는 단백질을 생성하였다.
부가적인 Mb 변이체들은 첫 번째 힌지 시스테인이 돌연 변이되고 적어도 3개의 시스테인 잔기가 상기 힌지 영역 내에 존재하는 IgG3 및 IgG1 힌지 서열의 개질에 기초하여 평가되었다. 표 3에는 힌지 변이체들의 목록이 나타나 있다. 상기 힌지 서열 내의 첫 번째 천연 시스테인은 세린 또는 알라닌 또는 임의의 기타 아미노산으로 돌연 변이될 수 있다. 상기 하부 힌지 서열은 γ1, γ2, γ3 또는 γ4로부터 유래한 연장 서열(8개 내지 25개의 아미노산) 또는 천연 하부 힌지일 수 있다. 임의의 구조체에 대한 CH3 도메인은 γ1, γ2 또는 γ3 또는 γ4 및 이들의 임의의 자연적으로 발생하는 대립 유전자로부터 유래할 수 있다. 몇몇 힌지 변이체의 예시도는 도 19에 도시되어 있다. IAB2M, IAB22M, IAB20M 및 IAB1M 구조체들은 발견 보편성을 증명하기 위해 평가되었다.
실시예 7: IAB2M, IAB22M, IAB20M 및 IAB1M의 힌지 변이체에 대한 시험관 내 데이터
IAB2M(도 20a)의 힌지 변이체(도 5b, 도 5c, 도 7c, 도 5e, 도 5d)들에 대해 원형 질량 분석을 수행하였다. 또한 IAB22M(도 20b)의 힌지 변이체(도 14b, 도 15b, 도 20c, 도 20d, 도 20e, 도 20f, 도 20g)들에 대한 원형 질량 분석을 수행하였다. 조작된 힌지(EH)를 갖는 발현된 미니바디는 물 중의 0.1% 포름산 및 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산을 완충액으로 사용하여 3㎕/분으로 작동하는 역상 C4 나노틸 칼럼(150㎛ ID x 50㎜ 길이)을 이용한 원터스 나노액커티 UPLC에 결합된 트리자익 나노ESI 소스가 구비된 워터스 시냅트 G2 HDMS로 이루어진 LC/MS에 의해 상기 반분자의 원형 질량 및 양에 대해 분석하였다(도 20a 및 도 20b). 몇몇 분자에 있어서, 상기 시료는 역상 크로마토그래피 칼럼(TSKgel 페닐-5PW (토쇼, 2 x 75㎜)에 의해 분리되었으며, 애질런트 ESI-QTOF 질량 분광계에 의해 분석되었다.
IAB2M 힌지 Mb 변이체(도 5c, 도 7c, 도 21b, 도 21c, 도 21d, 도 21e) 및 IAB22M 힌지 Mb 변이체(도 16b, 도 15b, 도 20c, 도 20d, 도 20e, 도 20f, 도 20g)들에 대한 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 상기 얻어진 데이터는 도 21a 및 도 22a에 나타나 있다.
도 21a 및 도 22a의 SDS-PAGE 분석 데이터를 지지하기 위해 수득된 데이터에 대해 질량 분광분석법 분석을 수행하였다. 2개의 IAB22M 구조체는 반분자의 정확한 분자량 및 양, 및 번역후 개질, 예를 들어 C-말단 리신 클리핑을 확인하기 위해 질량 분광분석법을 이용하여 평가되었다. 상기 단백질 구조체들은 IgG1 서열(γ1 EH2(도 22b) 및 γ1 EH3(도 20c))로부터 유래한 조작된 힌지 EH2 및 EH3을 갖는 미니바디를 포함하고 있었다. EH2 힌지를 갖는 γ1 미니바디는 온전한 이량체성 분자로 적절히 조립되었지만, 단지 2개의 시스테인이 포함되면 다량의 반분자를 갖는 단백질이 수득되었다. EH3 힌지를 갖는 γ1 미니바디는 온전한 이량체성 분자로 적절히 조립되었으며, 세 번째 시스테인을 부가하면 매우 낮은 수준의 반분자를 갖는 단백질이 수득되었다.
질량 분광분석법에 의한 IAB22M-γ1 EH1(도 16b)의 원형 질량 분석은 도 23에 나타나 있다. 상기 수득된 분자 질량은 C-말단 클리핑을 나타냈다. 존재하는 3개의 종(MW:79,318.9, 79,450.1 및 79,575.1) 중 오직 하나만이 79,576의 예상 MW와 일치하였다. 상기 수득된 분자 질량은 C-말단 클리핑을 나타냈다. 존재하는 3개의 종(MW: 79,318.9, 79,450.1 및 79,575.1) 중 오직 하나만이 79,576의 예상 MW와 일치하였다. 나머지는 1개의 C-말단 리신 또는 2개의 C-말단 리신 모두가 클리핑된 미니바디였다. 상기 힌지 내에 단지 2개의 이황화물을 이용하여 구성된 Mb는 높은 수준의 반분자(약 15%)를 생성하였다. IAB22M γ1 EH1의 원형 질량 분석에 있어서, 상기 시료들은 역상 크로마토그래피 칼럼(TSKgel 페닐-5PW (토쇼, 2 x 75㎜)에 의해 분리되었으며, 애질런트 ESI-QTOF 질량 분광계를 이용하여 분석되었다 도 23은 상기 분리된 반분자 및 실치수 분자의 총 이온 크로마토그램을 나타낸다(상부 패널). UV280 트레이스(미도시)는 피크 통합에 의해 상기 미니바디 변이체에 존재하는 반분자의 비율(%)을 정량화하기 위해 사용되었다. 탈회선된 질량은 배치를 위해 사용되었으며, 반분자(중간 패널)의 동일성 및 실치수 질량(하부 패널)의 동일성을 확인하였다.
질량 분광분석법에 의한 IAB22M-γ1 EH3 변이체(도 20c)의 원형 질량 분석은 도 24에 나타나 있다. 이론적 MW는 79,946으로서, 79,946의 수득된 MW와 일치하였다. 개질된 IgG1 힌지를 상기 힌지 내의 3개의 이황화 결합을 이용하여 구성하면 99% 초과의 실치수 단백질을 갖는 미니바디가 수득되었다. 원형 질량 분석에 있어서, 아세테이트 완충액 내의 단백질 시료는 원터스 나노액커티 UPLC에 결합된 트리자익 나노ESI가 구비된 워터스 시냅트 G2 HDMS로 이루어진 LC/MS에 의해 분석되었다. 상기 단백질은 물 중의 0.1% 포름산 및 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산을 이동상으로 사용하여 3㎕/분으로 작동하는 역상 C4 나노틸 칼럼(150㎛ ID x 50㎜, 워터스)을 이용하여 분리되었다. 도 24(상부 패널)에는 전체 질량 범위 스캔을 나타낸다. 중간 패널을 온전한 분자 질량을 나타내는 확대 영역을 나타낸다. 하부 패널은 반분자를 나타내는 확대 영역을 나타낸다.
표 9에는 5개의 IAB2M 힌지 변이체(상단: 도 5b 내지 도 5e, 도 7c) 및 7개의 IAB22M 힌지 변이체(하단: 도 14b, 도 15b, 도 20c, 도 20d; 도 20e, 도 43, 도 44)에 대한 이론적 예상 분자량(MW) 질량 및 원형 질량 분석에 의해 수득된 MW 질량, 및 반분자의 개개의 함량이 요약된 목록이 나타나 있다. 단백질의 실제 질량은 C-말단 리신 잔기들이 클리핑되고, 그 결과 MW 이종성이 초래되었다는 것을 제외하고는 이들의 이론적 산정 분자 질량과 일치하였다(도 6, 도 14a, 도 15a, 도 23 및 도 24).
IAB2M 및 IAB22M의 원형 질량 분석에 의해 수득된 반분자 함량
(*C-말단 리신 클리핑이 이종성을 야기함)
미니바디 구조체 예상 질량 수득 질량 반분자 비율(%)
IAB2M IAB2M-γ1 EH1 79433.6 79176.6,* 79304, 79433.1 7.6
IAB2M-γ2 EH1 79197.6 78938.7, 79069.7, 79195.9 11.1
IAB2M-γ1 EH2 79145 79148 7.1
IAB2M2-γ2 EH2 78909 78909.2 0.5 미만
IAB2M2-γ1 EH3 79739.8 79741.8 0.5 미만
IAB22M IAB22M-γ2 EH1 79576 79318.9, 79450.1, 79575.1 9.2
IAB22M1-γ2 EH2 79051.5 79053 0.5 미만
IAB22M1-γ1 EH3 79946.4 79947.5 0.1 미만
IAB22M1-γ1 EH5 80541.2 80540 0.1 미만
IAB22M1-γ3/γ1 EH6 80575.2 80576 0.5 미만
IAB22M1-γ1 EH7 80312.8 80313.3 0.5 미만
IAB22M1-γ1 EH8 80907.6 80907 0.5 미만
IAB2M 힌지 변이체들(도 5e, 도 7c, 도 7d, 도 21b, 도 21c, 도 21d, 도 21e)에 대한 FAC 분석을 수행하였다. 미니바디 힌지 변이체 모두는 C4-2 XCL 세포 상에서 발현된 표적 항원에 대해 유사한 친화도로 결합되었다(도 26).
IAB22M 힌지 변이체들(도 15b, 도 20c, 도 20d, 도 20e, 도 20f 및 도 20g)에 대한 FAC 분석을 수행하였다. 미니바디는 동일한 scFv 및 CH3 도메인으로 제조되지만, 상이한 힌지 모두는 HPB-ALL 세포 상의 세포 표면 CD8에 유사한 친화도로 결합되었다(도 27).
IAB20M 힌지 Mb 변이체(도 28b 내지 도 28e)에 대한 SDS-PAGE 분석(도 28a)을 수행하였으며, 그 결과 본원에 언급된 힌지 영역의 양태는 광범위한 표적 분자(예를 들어, 이는 상이한 표적 분자들에 지향하는 다양한 미니바디를 위해 작용함) 전반에 적용될 수 있는 것으로 추가로 확인되었다. IAB20M 변이체들의 부가적인 실시형태가 도 54 내지 도 59에 도시되어 있다.
IAB1M 힌지 Mb 변이체(도 29b 내지 도 29d)에 대한 SDS-PAGE 분석(도 29a)을 수행하였으며, 그 결과 본원에 언급된 힌지 영역의 양태는 광범위한 표적 분자(예를 들어, 이는 상이한 표적 분자들에 지향하는 다양한 미니바디를 위해 작용함) 전반에 적용될 수 있는 것으로 추가로 확인되었다. IAB1M 변이체들의 부가적인 실시형태는 도 60 내지 도 65a, 도 65b 및 도 65c에 도시되어 있다.
실시예 8: IAB22M의 힌지 변이체에 대한 생체 내 데이터
상이한 힌지 서열(도 15b, 도 20c, 도 20d, 도 20f, 도 20g)을 갖는 89Zr-방사성 표지된 IAB22 Mb의 PET/CT 분석은 NOD-SCID 마우스에서 수행되었다. 24시간에 89Zr-표지된 Df-IAB22M 힌지 변이체의 투여 이후에 좌측 어깨 상에 CD8-양성 HPB-ALL 이종 이식편을 갖는 NOD-SCID 마우스의 MIP PET/CT 이미지들이 도 30에 도시되어 있다. 모든 새로운 힌지 변이체들은 보다 낮은 신장 흡수를 초래하였다. 17 내지 28%ID/g 범위의 양호한 종양 표적화는 힌지 변이체 모두에서 수득되었다. 전반적으로, 간 신호는 신장 신호와 유사하였다.
도 30의 상이한 힌지 변이체를 갖는 89Zr-방사성 표지된 IAB22 Mb에 대한 생물 분포 분석(도 31)이 수행되었다. 상기 IAB22M 힌지 변이체들에 대해 유사한 생물 분포가 관측되었다. 우수한 종양 표적화 및 흡수는 γ1 EH1과 비교하여 검출되었다. 이량체로 잔류하는 Mb에 대해 본원에서 제공된 데이터에 기초하여 예상되는 바와 같이 간을 통한 높은 제거가 관측되었다.
실시예 9
표 0.2에 나타낸 PSCA 미니바디는 상기 미니바디 상의 시스테인 잔기를 통해 적절한 킬레이트제에 접합되고, 후속적으로 In-111(또는 대안으로 지르코늄-89 또는 구리-64)의 동위원소로 방사성 표지된다. 대안적으로는, 상기 미니바디는 티로신 잔기를 통해 요오드로 직접 방사선 표지함으로써 방사성 표지될 수 있다.
상기 미니바디는 건강한 인간 개체에 정맥 내로 주입된다. 상기 미니바디는 주입 후 10분 동안 인간 개체 내에서 배양된다. 상기 배양과 동일한 날에 상기 미니바디의 국부화는 PET 스캔 또는 외부 섬광 시스템을 통해 검출된다.
미니바디의 국부화는 상기 개체에서 증가된 수준의 PSCA의 국부화를 결정하기 위해 사용된다.
실시예 10
표 0.2에 나타낸 PSMA 미니바디는 상기 미니바디 상의 시스테인 잔기를 통해 적절한 킬레이트제와 접합되고, 후속적으로 In-111(또는 대안으로 지르코늄-89 또는 구리-64)의 동위원소로 방사성 표지된다. 대안적으로는, 상기 미니바디는 티로신 잔기를 통해 요오드로 직접 방사선 표지함으로써 방사성 표지될 수 있다.
상기 미니바디는 건강한 인간 개체에 정맥 내로 주입된다. 상기 미니바디는 주입 후 10분 동안 인간 개체 내에서 배양된다. 상기 배양과 동일한 날에 상기 미니바디의 국부화는 PET 스캔 또는 외부 섬광 시스템을 통해 검출된다.
미니바디의 국부화는 상기 개체에서 증가된 수준의 PSMA의 국부화를 결정하기 위해 사용된다.
실시예 11
표 0.2에 나타낸 PSMA 미니바디에 의한 PSMA-양성 종양의 성공적인 이미징 시에 상기 미니바디의 생물 분포는 본 발명의 실시형태에 따라 검토될 수 있다. 이들 생물 분포 연구에서는 주사 이후에 시간의 흐름에 따른 기타 선택된 조직 대비 종양 부위에서의 상기 미니바디의 국부화가 조사될 수 있다. 이들 연구는 높은 종양 대 배경 비율을 증명하기 위해 사용될 수 있다. 미니바디의 사용은 전립선암과 같이 PSMA를 과발현하는 종양을 이미징하는 경우에 높은 종양 대 배경 비율을 야기할 가능성이 있을 수 있다. 이들 이미징 및 생물 분포 실험으로부터의 양의 결과는 임상연구를 위한 준비에서 독성학 실험으로 이어질 수 있다.
게다가, PET 이미징 연구에 의해 생체 내에서 인간 PSMA를 표적화하는 미니바디의 능력은 암 환자들에서 임상시험을 통해 증명될 수 있다. 간단히 말하면, 방사성 표지된 미니바디는 PSMA를 과발현하는 것으로 알려진 형태의 암을 앓고 있는 암 환자들에 정맥 내로 주사될 수 있다. 주사 후 특정 시점에 환자 각각은 PET에 의해 연속적으로 스캐닝될 수 있다. 최종 스캔 이후, 환자들은 해부학적 참고를 위해 CT에 의해 스캐닝될 수 있다. 이어 환자 각각에 대한 PET 및 CT 이미지는 종양 표적화 및 특이성을 평가하기 위해 분석될 수 있다.
실시예 12
표 0.2에 나타낸 5T4 미니바디는 상기 미니바디 상의 시스테인 잔기를 통해 적절한 킬레이트제와 접합되고, 후속적으로는 In-111(또는 대안으로 지르코늄-89 또는 구리-64)의 동위원소로 방사성 표지된다. 대안적으로는, 상기 미니바디는 티로신 잔기를 통해 요오드로 직접 방사선 표지함으로써 방사성 표지될 수 있다.
상기 미니바디는 건강한 인간 개체에 정맥 내로 주입된다. 상기 미니바디는 주입 후 10분 동안 인간 개체 내에서 배양된다. 상기 배양과 동일한 날에 상기 미니바디의 국부화는 PET 스캔 또는 외부 섬광 시스템을 통해 검출된다.
미니바디의 국부화는 상기 개체에서 증가된 수준의 5T4의 국부화를 결정하기 위해 사용된다.
실시예 13
표 0.2의 5T4 미니바디가 제공된다. 상기 미니바디는 개체에서 대장암, 신장암, 유방암, 난소암, 위함, 폐암 및/또는 전립선암의 증상의 완화를 제공하기 위해 상기 개체에서 충분한 수준의 5T4와 결합하기에 적절한 양으로 대장암, 신장암, 유방암, 난소암, 위함, 폐암 및/또는 전립선암을 앓고 있는 개체에 정맥 내로 주입된다.
실시예 14
표 0.2에 나타낸 CD8 미니바디는 상기 미니바디의 시스테인 잔기를 통해 적절한 킬레이터와 접합되고, 후속적으로 In-111(또는 대안으로 지르코늄-89 또는 구리-64)의 동위원소로 방사성 표지된다. 대안적으로는, 상기 미니바디는 티로신 잔기를 통해 요오드로 직접 방사선 표지함으로써 방사성 표지될 수 있다.
상기 미니바디는 건강한 인간 개체에 정맥 내로 주입된다. 상기 미니바디는 주입 후 10분 동안 인간 개체 내에서 배양된다. 상기 배양과 동일한 날에 상기 미니바디의 국부화는 PET 스캔 또는 외부 섬광 시스템을 통해 검출된다.
미니바디의 국부화는 상기 개체에서 CD8의 국부화를 결정하기 위해 사용된다.
실시예 15
표 0.2의 CD8 미니바디가 제공된다. 상기 미니바디는 건강한 인간 개체에 정맥 내로 주입된다.
상기 미니바디는 주입 후 1시간 동안 상기 인간 개체 내에서 배양된다. 상기 CD8 미니바디에 특이적으로 결합하고 33P에 접합된 인간화 미니바디인 이차 항체가 제공된다. 상기 배양과 동일한 날에 상기 이차 항체는 개체에 주입된다. 상기 이차 항체는 1시간 동안 배양된다. 상기 미니바디의 국부화는 상기 이차 항체 상의 마커를 이용하여 PET 이미징을 통해 검출된다.
미니바디의 국부화는 상기 개체에서 CD8의 국부화를 결정하기 위해 사용된다.
실시예 16
표 0.2의 CD8 미니바디가 제공된다. 상기 미니바디는 CD8 관련 질환의 증상의 완화를 제공하기 위해 개체에서 충분한 수준의 CD8과 결합하기에 적절한 양으로 CD8 관련 질환을 앓고 있는 개체에 정맥 내로 주입된다. 상기 미니바디는 이트륨-90에 접합된다.
실시예 17
표 0.2의 CD8 미니바디가 제공된다. 상기 미니바디는 전염병에 대한 항원으로 예방 접종하거나 종양 연관 항원으로 예방 접종한 환자에게 주입된다. CD8 지향 단편들은 면역 반응을 증가시키고, T 세포를 발현하는 CD8의 세포 용해 활성을 증강시킨다.
실시예 18
표 0.2의 CD8 미니바디가 제공된다. 상기 미니바디는 CD8 관련 질환의 증상의 완화를 제공하기 위해 개체에서 충분한 수준의 CD8과 결합하기에 적절한 양으로 CD8 관련 질환을 앓고 있는 개체에 정맥 내로 주입된다. 상기 미니바디는 Lu-177에 접합된다. 상기 CD8 미니바디는 CD8을 발현하는 세포와 결합하고, 상기 Lu-177은 상기 세포의 살해를 초래한다.
상기 결과에 따르면, 상기 구조체들은 세포성 인간 CD8에 여전히 결합되어 있는 것으로 나타났다.
실시예 19
표 0.2로부터의 CD3 미니바디는 상기 미니바디 상의 시스테인 잔기들을 통해 적절한 킬레이트제와 접합되며, 후속적으로 In-111(또는 대안으로 지르코늄-89 또는 구리-64)의 동위원소로 방사성 표지된다. 대안적으로는, 상기 미니바디는 티로신 잔기를 통해 요오드로 직접 방사선 표지함으로써 방사성 표지될 수 있다.
상기 미니바디는 건강한 인간 개체에 정맥 내로 주입된다. 상기 미니바디는 주입 후 10분 동안 인간 개체 내에서 배양된다. 배양하는 날과 동일한 날에 상기 미니바디의 국부화는 PET 스캔 또는 외부 섬광 시스템을 통해 검출된다.
미니바디의 국부화는 상기 개체에서 증가된 수준의 CD3의 국부화를 결정하기 위해 사용된다.
실시예 20
표 0.2로부터의 CD3 미니바디가 제공된다. 개체에서 류머티스성 관절염의 증상의 완화를 제공하기 위해 상기 개체에서 충분한 수준의 CD3에 결합하기에 적합한 양으로 상기 미니바디를 류머티스성 관절염을 앓고 있는 개체에 정맥 내로 주입된다.
실시예 21
OKT3의 투여로 인해 받아들이기 어려울 정도로 강렬한 사이토카인 폭풍을 야기할 위험성이 있는 개체를 확인한다. 상기 개체가 CD3 의존 질환을 앓고 있기 때문에 상기 개체는 자신의 시스템에서 CD3 단백질의 수준을 감소시킬 필요성이 있다. 본원에서 제공된 CD3에 대한 미니바디들 중 하나가 선택되고, 사이토카인 폭풍이 발생하지 않으면서도 CD3에 대한 적절한 결합이 일어나기에 효과적인 수준으로 상기 개체에 투여된다.
실시예 22
표 0.2의 인간화 CD3 미니바디가 제공된다. 상기 미니바디는 건강한 인간 개체에 정맥 내로 주입된다. 상기 미니바디는 주입 후 1시간 동안 인간 개체 내에서 배양된다. CD3 미니바디에 특이적으로 결합하고 33P에 접합된 인간화 미니바디인 이차 항체가 제공된다. 1시간 동안의 배양 직후, 상기 이차 항체는 개체 내로 주입한다. 상기 이차 항체는 1시간 동안 배양된다. 상기 이차 항체의 1시간 동안의 배양 직후, 상기 미니바디의 국부화는 PET 이미징을 통해 검출된다.
미니바디의 국부화는 상기 개체에서 CD3 국부화를 결정하기 위해 사용된다.
실시예 23
OKT3의 투여로 인해 받아들이기 어려울 정도로 강렬한 사이토카인 폭풍을 야기할 위험성이 있는 개체를 확인한다. 상기 개체가 CD3 의존 질환을 앓고 있기 때문에 상기 개체는 자신의 시스템에서 CD3 단백질의 수준을 감소시킬 필요성이 있다. 본원의 실시예로부터 미니바디 또는 미니바디들 중 하나가 선택되고, 사이토카인 폭풍이 발생하지 않으면서도 CD3에 대한 적절한 결합이 일어나기에 효과적인 수준으로 상기 개체에 투여된다.
필요한 경우, 상기 미니바디 또는 미니바디들은 CD3 의존 질환의 치료를 이해 치료제에 접합될 수 있다.
상기 개체는 임의의 다수의 특정 CD3 의존 질환을 앓고 있을 수 있으며, 대안으로 각각은 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병 또는 홍반성 낭창일 수 있다.
실시예 24
표 0.2의 PSCA 미니바디가 제공된다. PSCA 관련 질환의 증상의 완화를 제공하기 위해 개체에서 충분한 수준의 PSCA에 결합하기에 적합한 양으로 상기 미니바디를 상기 PSCA 관련 질환을 앓고 있는 개체에 정맥 내로 주입된다. 상기 미니바디는 이트륨-90에 접합되어 있다.
실시예 25
표 0.2의 PSMA 미니바디가 제공된다. PSMA 관련 질환의 증상의 완화를 제공하기 위해 개체에서 충분한 수준의 PSMA에 결합하기에 적합한 양으로 상기 미니바디를 상기 PSMA 관련 질환을 앓고 있는 개체에 정맥 내로 주입된다. 상기 미니바디는 이트륨-90에 접합되어 있다.
본 명세서에서 단수의 사용은 본원에서 달리 구체적으로 언급하지 않는 한 복수를 포함할 수 있으며, 본 발명을 고려하여 당해 기술분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 단수는 단지 기능적인 실시형태이다. 따라서 예를 들어 "하나"는 하나 이상을 의미할 수 있고, "일 실시형태"는 상기 설명이 다수의 실시형태에 적용된다는 것을 의미할 수 있다.
특허, 특허 명세서, 논문, 교과서 등을 포함한 본원에 인용된 모든 참고문헌, 및 이들이 아직까지 공개되지 않는 정도까지 본원에서 인용된 참고문헌들은 그 전체가 본원에서 참고로 인용된다. 상기 인용된 문헌 및 유사한 재료들 중 하나 이상은 본 출원서와 상이하거나 모순되는 경우에 본 명세서에 의해 제한되는 한정된 용어, 용어의 용례, 개시된 기법 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
상술한 상세한 설명 및 실시예에서는 특정 실시형태들이 개시되어 있다. 그러나 본문에서 상술한 내용이 얼마나 상세하게 나타나 있을 수 있든지 간에 본 발명은 많은 방식으로 실시될 수 있으며, 본 발명은 첨부된 특허청구범위 및 이의 임의의 등가물에 따라 구성되어야 하는 것으로 인지될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> ImaginAb, Inc. Chan, Chio Mui Gudas, Jean M. Olafsen, Tove Satpayev, Daulet Kadyl Torgov, Michael Yuri <120> ANTIGEN BINDING CONSTRUCTS TO TARGET MOLECULES <130> MPI18-002 <150> 62/202665 <151> 2015-08-07 <160> 256 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of: A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 1 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond with another amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2-6, 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = any amino acid <400> 2 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG1 CH3 (nG1m1 allotype) <400> 41 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG2 CH3 <400> 42 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr 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44 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG4 CH3 <400> 44 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Upper hinge <400> 45 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Upper hinge <400> 46 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 47 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Upper hinge <400> 47 Glu Arg Lys 1 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Leu Gly Gly Pro 1 5 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 1 5 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 1 5 <210> 62 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 62 Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ser <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 63 Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 64 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 65 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 66 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 67 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IAB1M (A11) variable light sequence <400> 67 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Phe Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Gly Ser Ser Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 68 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IAB1M (A11) variable heavy sequence <400> 68 Glu Val Gln Leu Val Glu Tyr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly 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Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 IAB2M (PSMA) <400> 83 Gly Trp Asn Phe Asp Tyr 1 5 <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 IAB2M (PSMA) <400> 84 Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Asp 1 5 10 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 IAB2M (PSMA) <400> 85 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 IAB2M (PSMA) <400> 86 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 IAB20M (5T4) <400> 87 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 1 5 <210> 88 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 IAB20M (5T4) <400> 88 Asn Pro Asn Asn Gly Val 1 5 <210> 89 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 IAB20M (5T4) <400> 89 Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 IAB20M (5T4) <400> 90 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala 1 5 10 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 IAB20M (5T4) <400> 91 Tyr Thr Ser Ser Arg Tyr Ala 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 IAB20M (5T4) <400> 92 Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr 1 5 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 IAB1M (PSCA) <400> 93 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 1 5 <210> 94 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 IAB1M (PSCA) <400> 94 Asp Pro Glu Asn Gly Asp 1 5 <210> 95 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 IAB1M (PSCA) <400> 95 Gly Gly Phe 1 <210> 96 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 IAB1M (PSCA) <400> 96 Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Phe Ile His 1 5 10 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 IAB1M (PSCA) <400> 97 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 IAB1M (PSCA) <400> 98 Gln Gln Trp Gly Ser Ser Pro Phe Thr 1 5 <210> 99 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IAB22M variable heavy (VH-K67R) sequence <400> 99 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Phe Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 100 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IAB20M variable light (VL-Q79E, V83E) <400> 100 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 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<220> <223> IAB20M variable heavy (VH-Q1E, Q6E) <400> 102 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 103 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 variable light (VL, R62S) sequence <400> 103 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro 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ctgcagccgg aagattttgc ggattatttt 660 tgccagcagt ataacagcta tccgctgacc tttggcggcg gcaccaaact ggaaattaaa 720 gaaccgaaaa gcagcgataa aacccatacc tgcccgccgt gcccgccgtg cggcggcggc 780 agcagcggcg gcggcagcgg cggccagccg cgcgaaccgc aggtgtatac cctgccgccg 840 agccgcgaag aaatgaccaa aaaccaggtg agcctgacct gcctggtgaa aggcttttat 900 ccgagcgata ttgcggtgga atgggaaagc aacggccagc cggaaaacaa ctataaaacc 960 accccgccgg tgctggatag cgatggcagc ttttttctgt atagcaaact gaccgtggat 1020 aaaagccgct ggcagcaggg caacgtgttt agctgcagcg tgatgcatga agcgctgcat 1080 aaccattata cccagaaaag cctgagcctg agcccgggc 1119 <210> 166 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys 1 5 <210> 167 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 168 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro 1 5 10 15 Cys <210> 169 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 169 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Val Glu 1 5 10 15 Cys Pro Pro Cys 20 <210> 170 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro 1 5 10 15 Cys Pro Pro Cys 20 <210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 5, 6, 8, 9 <223> Xaa = P, V, or E <400> 171 Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 <210> 172 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 5, 6 <223> Xaa = P, V, or E <400> 172 Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 <210> 173 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = P, V, or E <400> 173 Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 10 <210> 174 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 174 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 1 5 <210> 175 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 175 Asn Pro Ser Arg Gly Tyr 1 5 <210> 176 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 176 Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 177 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 177 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 178 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 178 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 1 5 <210> 179 <211> 742 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 179 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln 145 150 155 160 Asp Val Gly Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro 180 185 190 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr 210 215 220 Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 225 230 235 240 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 260 265 270 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 275 280 285 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 290 295 300 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 305 310 315 320 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 325 330 335 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 340 345 350 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 355 360 365 Pro Gly Lys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 370 375 380 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe 385 390 395 400 Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu 405 410 415 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn 420 425 430 Gln Lys Phe Glu Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser 435 440 445 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 450 455 460 Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 465 470 475 480 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 485 490 495 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 500 505 510 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys 515 520 525 Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 530 535 540 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 545 550 555 560 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 565 570 575 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys 580 585 590 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 595 600 605 Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 610 615 620 Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu 625 630 635 640 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 645 650 655 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 660 665 670 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 675 680 685 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 690 695 700 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 705 710 715 720 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 725 730 735 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 740 <210> 180 <211> 738 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 180 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Glu Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln 145 150 155 160 Asp Val Gly Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro 180 185 190 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr 210 215 220 Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 225 230 235 240 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 260 265 270 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 275 280 285 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 290 295 300 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu 305 310 315 320 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 325 330 335 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 340 345 350 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 355 360 365 Lys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 370 375 380 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu 385 390 395 400 Tyr Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp 405 410 415 Ile Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys 420 425 430 Phe Glu Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala 435 440 445 Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 450 455 460 Cys Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 465 470 475 480 Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 485 490 495 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 500 505 510 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 515 520 525 Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 530 535 540 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val 545 550 555 560 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 565 570 575 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln 580 585 590 Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 595 600 605 Lys Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly 610 615 620 Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 625 630 635 640 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 645 650 655 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 660 665 670 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 675 680 685 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 690 695 700 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 705 710 715 720 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 725 730 735 Gly Lys <210> 181 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 182 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 182 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 183 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5 forms a disulfide bond with C27 of SEQ ID 184; C5 forms a disulfide bond with C34 of SEQ ID 185 <400> 183 Val Thr Ile Thr Cys Lys 1 5 <210> 184 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C27 forms a disulfide bond with C5 of SEQ ID 183 <400> 184 Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 1 5 10 15 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser 20 25 30 Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 35 40 <210> 185 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C34 forms a disulfide bond with C5 of SEQ ID 183 <400> 185 His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 1 5 10 15 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Asp Tyr 20 25 30 Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 35 40 45 Lys <210> 186 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C4 forms a disulfide bond with C4 of SEQ ID 186; C7 forms a disulfide bond with C7 of SEQ ID 186 <400> 186 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gln Pro Arg 20 <210> 187 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C2 forms a disulfide bond with C7 of SEQ ID 188 <400> 187 Ser Cys Asp Lys 1 <210> 188 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C7 forms a disulfide bond with C2 of SEQ ID 187; C7 forms a disulfide bond with C9 of SEQ ID 189; C7 forms a disulfide bond with C11 of SEQ ID 190; Alkylation of C7 <400> 188 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 1 5 10 <210> 189 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C9 forms a disulfide bond with C7 of SEQ ID 188; Alkylation of C9 <400> 189 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 1 5 10 15 His Asn His Tyr Thr Gln Lys 20 <210> 190 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C11 forms a disulfide bond with C7 of SEQ ID 188 <400> 190 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 1 5 10 15 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 20 25 <210> 191 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa does not form a covalent crosslinking bond with another amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of: A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 191 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 192 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa is not a cysteine <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of: A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 192 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 193 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 193 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 194 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = P, V, or E <220> <221> VARIANT <222> 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 194 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 195 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = P or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 195 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 196 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 7 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = P, V, or E <400> 196 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 197 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 7 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = P or V <400> 197 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 198 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> P or E <220> <221> VARIANT <222> 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 198 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 199 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 6 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa = P or E <400> 199 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 200 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = P or E <220> <221> VARIANT <222> 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 200 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 201 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3, 4 <223> Xaa = VE <220> <221> VARIANT <222> 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 201 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 202 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3, 4 <223> Xaa = PP <220> <221> VARIANT <222> 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 202 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 203 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6, 7 <223> Xaa = VE <400> 203 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 204 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6, 7 <223> Xaa = PP <400> 204 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 205 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3, 4 <223> Xaa = VE <220> <221> VARIANT <222> 6, 7 <223> Xaa = PP <400> 205 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 206 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3, 4 <223> Xaa = PP <220> <221> VARIANT <222> 6, 7 <223> Xaa = PP or VE <400> 206 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 207 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3, 4 <223> Xaa = VE <220> <221> VARIANT <222> 6, 7 <223> Xaa = VE or PP <400> 207 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 208 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Minibody <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond with another identical amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2-6, 8-9, 11-12 <223> Xaa = any amino acid <400> 208 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 209 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = serine, threonine, or alanine <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 209 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 210 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = serine <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 210 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 211 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = alanine <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 211 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 212 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <400> 212 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 213 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids and is not a cysteine <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <400> 213 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 214 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = not a cysteine <220> <221> VARIANT <222> 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <400> 214 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 215 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = D <220> <221> VARIANT <222> 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <400> 215 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 216 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = K <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <400> 216 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 217 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 5, 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = T <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <400> 217 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 218 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = H <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <400> 218 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 219 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = T <400> 219 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 220 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 5, 9, 11, 12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa = a P or a V <400> 220 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 221 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 5, 8, 11, 12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = a P or a E <400> 221 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 222 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 5, 8, 9, 12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = a P or a V <400> 222 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 223 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = a P or a E <400> 223 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 224 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 7, 8, 9, 12, 13, 15, 16 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid residue other than a cysteine <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <400> 224 Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Cys <210> 225 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 2, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 15, 16 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any amino acids other than the amino acid at position 2 <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <400> 225 Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Cys <210> 226 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 15 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <400> 226 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 227 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = a P or a V <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = a P or an E <400> 227 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 228 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = serine <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = D <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = K <220> <221> VARIANT <222> 4, 6 <223> Xaa = T <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = H <220> <221> VARIANT <222> (7)...(10) <223> Xaa = P <400> 228 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 229 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Core hinge region of the minibody <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <220> <221> VARIANT <222> 3, 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 229 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 230 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Core hinge region of the minibody <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa - = serine <220> <221> VARIANT <222> 3, 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 230 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 231 <211> 1167 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IAB25M gamma 2 NH (M1) <400> 231 atggaaaccg acaccctgct gctgtgggtg ctgctgctct gggtcccagg ctccaccggt 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgaact ggtaccaaca gaaacctggc 180 caggctccca ggctcctcat ctatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcac 240 ttcaggggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa 300 gattttgcag tttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cattcacgtt cggccaaggg 360 accaaggtgg aaatcaaagg ctccacatcc ggcggaggct ctggcggtgg atctggcgga 420 ggcggctcat cccaggtgca gctggtgcag tctggggctg aggtgaagaa gcctggggcc 480 tcagtgaagg tctcctgcaa ggcttctgga tacaccttca ccaggtacac gatgcactgg 540 gtgcgacagg cccctggaca agggcttgag tggatgggat acattaatcc tagccgtggt 600 tatactaatt acaatcagaa gttcaaggac agggtcacca tgaccacaga cacgtccatc 660 agcacagcct acatggagct gagcaggctg agatctgacg acacggccgt gtattactgt 720 gcgagatatt atgatgatca ttactcactt gactactggg gccagggcac cctggtcacc 780 gtctcctcag agcgcaaatg ttgtgtcgag tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca 840 ggaccggggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 900 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 960 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccatgctg 1020 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1080 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1140 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1167 <210> 232 <211> 389 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IAB25M gamma 2 NH (M1) <400> 232 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser 35 40 45 Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His 65 70 75 80 Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser 100 105 110 Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser 115 120 125 Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 145 150 155 160 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 165 170 175 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 180 185 190 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 210 215 220 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro 260 265 270 Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Gly Gln Pro Arg Glu Pro 275 280 285 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 290 295 300 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 305 310 315 320 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 325 330 335 Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 340 345 350 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 355 360 365 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 370 375 380 Leu Ser Pro Gly Lys 385 <210> 233 <211> 1176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IAB25M gamma 2 EH (M1) <400> 233 atggagaccg acaccctcct cctgtgggtc ctgctgctgt gggtgcctgg aagcaccggc 60 gagattgtgc tgacccagtc ccctgccacc ctgagcctgt cccctggaga aagagccaca 120 ctgagctgtt ccgcctcctc cagcgtgagc tacatgaact ggtaccagca gaagcccgga 180 caggctccca ggctgctcat ctacgacaca agcaagctgg ctagcggcgt gcccgctcat 240 ttcagaggca gcggaagcgg cacagatttt accctgacca tttcctccct ggagcctgag 300 gacttcgccg tgtattactg ccagcagtgg agctccaacc ccttcacatt cggccagggc 360 accaaggtgg aaatcaaggg atccacaagc ggaggcggca gcggcggcgg cagcggaggc 420 ggaggcagca gccaggtgca actggtgcag agcggagccg aggtgaagaa gcccggagcc 480 agcgtgaagg tgtcctgcaa agcctccgga tacaccttca ccaggtacac aatgcactgg 540 gtgaggcagg ctcccggcca gggcctggag tggatgggat acatcaaccc cagcaggggc 600 tacaccaact ataaccagaa gttcaaggac agggtgacca tgaccaccga caccagcatt 660 tccaccgctt atatggagct cagcagactg aggtccgacg acaccgccgt gtactactgc 720 gccaggtatt acgacgacca ctacagcctg gactactggg gccagggaac actcgtgacc 780 gtgtccagcg agaggaagtg ctgcgtggaa tgtccccctt gtcctggagg cggaagctcc 840 ggaggaggat ccggcggaca gcccagggaa cctcaggtgt acaccctgcc ccccagcagg 900 gaggagatga caaagaacca ggtgagcctg acctgtctgg tgaagggctt ctaccccagc 960 gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcctgaga acaactacaa gacaaccccc 1020 cctatgctgg atagcgacgg cagcttcttc ctgtactcca agctcaccgt ggataagagc 1080 aggtggcagc agggaaacgt ctttagctgt tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1140 tacacccaga agagcctctc cctgtccccc ggcaag 1176 <210> 234 <211> 392 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IAB25M gamma 2 EH (M1) <400> 234 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser 35 40 45 Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His 65 70 75 80 Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser 100 105 110 Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser 115 120 125 Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 145 150 155 160 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 165 170 175 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 180 185 190 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 210 215 220 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro 260 265 270 Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro 275 280 285 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 290 295 300 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 305 310 315 320 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 325 330 335 Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 340 345 350 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 355 360 365 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 370 375 380 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 <210> 235 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = a serine or an alanine <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 235 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 236 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = T <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 236 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 237 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 7 <223> Xaa = P or E <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid <400> 237 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 238 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3, 4 <223> Xaa = VE or PP <220> <221> VARIANT <222> 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 238 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 239 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3, 4 <223> Xaa = VE <220> <221> VARIANT <222> 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <400> 239 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 240 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond with another amino acid <220> <221> VARIANT <222> 2-6, 8-9, 11-12 <223> Xaa = any amino acid <400> 240 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 241 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1-5, 8-9, 11-12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <400> 241 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 242 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = serine or alanine <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <400> 242 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 243 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = D <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = K <220> <221> VARIANT <222> 4, 6 <223> Xaa = T <220> <221> VARIANT <222> 8, 11 <223> Xaa = P or V <220> <221> VARIANT <222> (5)...(5) <223> Xaa = H <220> <221> VARIANT <222> (9)...(9) <223> Xaa = P or E <220> <221> VARIANT <222> (12)...(12) <223> Xaa = any amino acid <400> 243 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 244 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid that does not form a covalent crosslinking bond <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = any one of A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, or V <220> <221> VARIANT <222> 4, 6, 7, 9, 10 <223> Xaa = any amino acid <400> 244 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 245 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12, 14, 15 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <400> 245 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 246 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any m amino acids where m is any number of amino acids of any type <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 4, 5, 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <220> <221> VARIANT <222> 14 <223> Xaa = P or V <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa = P or E <400> 246 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 247 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = serine <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = D <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa = K <220> <221> VARIANT <222> 4, 6 <223> Xaa = T <220> <221> VARIANT <222> 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = P <220> <221> VARIANT <222> (5)...(5) <223> Xaa = H <400> 247 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 248 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 5, 6, 8, 9 <223> Xaa = not a cysteine <400> 248 Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 <210> 249 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 5, 6 <223> Xaa = not a cysteine <400> 249 Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 <210> 250 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge region <220> <221> VARIANT <222> 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12 <223> Xaa = not a cysteine <400> 250 Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 1 5 10 <210> 251 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Minibody <220> <221> VARIANT <222> 1, 3, 4, 6, 7 <223> Xaa = cannot be a cysteine <400> 251 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 252 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Minibody <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid or no amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3, 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = any amino acid, no amino acid, or P <400> 252 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 <210> 253 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Minibody <220> <221> VARIANT <222> 1, 3, 4, 6, 7 <223> Xaa = cannot be a cysteine <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = any amino acid, no amino acid, or P <400> 253 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 <210> 254 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Minibody <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = any amino acid other than a cysteine <220> <221> VARIANT <222> 3, 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = any amino acid, no amino acid, or P <400> 254 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 <210> 255 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Minibody <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Serine <220> <221> VARIANT <222> 3, 4, 6, 7 <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa = any amino acid, no amino acid, or P <400> 255 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 <210> 256 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 256 Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro 20 25 30 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 35 40 45 Cys Pro 50

Claims (85)

  1. 서열번호 1의 서열(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)을 포함하는 아미노산 힌지 영역으로서,
    여기서 Xn1은 자연적으로는 공유성 가교결합을 형성하지 않는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn2는 A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V 중 하나이고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있는 아미노산 힌지 영역.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 Xn1은 다른 아미노산과 공유성 가교결합을 형성하지 않는 것(서열번호 191)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 Xn1은 시스테인이 아닌 것(서열번호 192)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn1은 A, R, N, D, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 및 V 중 하나인 것(서열번호 193)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn2는 P, V 또는 E인 것(서열번호 194)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn2는 P 또는 V인 것(서열번호 195)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn4는 P, V 또는 E인 것(서열번호 196)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn4는 P 또는 V인 것(서열번호 197)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn3은 P 또는 E인 것(서열번호 198)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn5는 P 또는 E인 것(서열번호 199)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 Xn3은 P 또는 E인 것(서열번호 200)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn2Xn3은 VE인 것(서열번호 201)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 Xn2Xn3은 PP인 것(서열번호 202)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn4Xn5는 VE인 것(서열번호 203)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn4Xn5는 PP인 것(서열번호 204)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  16. 제 1 항 내지 제 12 항 및 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn2Xn3은 VE이고 Xn4Xn5는 PP인 것(서열번호 205)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  17. 제 1 항 내지 제 11 항, 제 13 항 및 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn2Xn3은 PP이고 Xn4Xn5는 PP 또는 VE인 것(서열번호 206)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  18. 제 1 항 내지 제 12 항, 제 14 항 및 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn2Xn3은 VE이고 Xn4Xn5는 VE 또는 PP인 것(서열번호 207)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1에서 마지막 시스테인에 대해 C-말단에 있는 연장 또는 하부 힌지 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 연장 또는 하부 힌지 서열은 S, G, A, P 및 V 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 상기 연장 서열은 적어도 GGGSSGGGSG(서열번호 59)를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 APPVAGP(서열번호 60)를 포함하는 링커 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 항의 힌지 영역은 코어 힌지 영역의 일부인 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 코어 힌지 영역에 인접한 상부 힌지 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  25. 제 23 항에 있어서, 상기 코어 힌지 영역에 인접한 하부 힌지 또는 연장 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 코어 힌지 영역에 인접한 상부 힌지 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn1은 세린, 트레오닌 또는 알라닌을 포함하는 것(서열번호 209)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  28. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn1은 세린을 포함하는 것(서열번호 210)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  29. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn1은 알라닌을 포함하는 것(서열번호 211)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  30. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 힌지 영역은 하기 서열, 즉 SCVECPPCP(서열번호 56) 및 TCPPCPPC(서열번호 166) 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 힌지 영역은 하기 서열, 즉 ERKSCVECPPCP(서열번호 167), EPKSSDKTHT(서열번호 46) 및 CPPCPPC(서열번호 52) 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 힌지 영역은 하기 서열, 즉 ERKSCVECPPCPGGGSSGGGSG(서열번호 34), ERKSCVECPPCPAPPVAGP(서열번호 33), EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG(서열번호 26) 및 EPKSSDKTHTCPPCPPCAPELLGGP(서열번호 25) 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  33. 서열번호 2의 서열(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)을 포함하는 아미노산 힌지 영역으로서,
    여기서 Xn1은 임의의 m개의 아미노산일 수 있으며, 여기서 m은 임의의 유형의 아미노산의 임의의 개수이고, Xn2는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn6은 시스테인이 아닌 임의의 아미노산일 수 있고, Xn7은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn8은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn9는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn10은 임의의 아미노산일 수 있는 아미노산 힌지 영역.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 Xn1은 시스테인이 아닌 것(서열번호 213)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  35. 제 33 항 또는 제 34 항에 있어서, 상기 Xn2는 시스테인이 아닌 것(서열번호 214)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  36. 제 33 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn2는 D인 것(서열번호 215)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  37. 제 33 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn3은 K인 것(서열번호 216)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  38. 제 33 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn4는 T인 것(서열번호 217)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  39. 제 33 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn5는 H인 것(서열번호 218)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  40. 제 33 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn6은 T인 것(서열번호 219)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  41. 제 33 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn7은 P 또는 V인 것(서열번호 220)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  42. 제 33 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn8은 P 또는 E인 것(서열번호 221)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  43. 제 33 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn9는 P 또는 V인 것(서열번호 222)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  44. 제 33 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn10은 P 또는 E인 것(서열번호 223)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  45. 제 45 항에 있어서, 상기 Xn1 전방에 위치한 CXXC(서열번호 224) 또는 CXXC(서열번호 225) 모티프를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  46. 제 46 항에 있어서, 서열번호 1에서 C-말단 시스테인에 바로 부착된 Xn11Xn12C 서열을 더 포함하되, Xn11은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn12는 임의의 아미노산일 수 있는 것(서열번호 244)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 Xn11은 P 또는 V이고, 상기 Xn12는 P 또는 E인 것(서열번호 227)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  48. 제 33 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Xn1은 세린이고, 상기 Xn2는 D이고, 상기 Xn3은 K이고, 상기 Xn4는 T이고, 상기 Xn5는 H이고, 상기 Xn6은 T이고, 상기 Xn7은 P이고, 상기 Xn8은 P이고, 상기 Xn9는 P이고, 상기 Xn10은 P인 것(서열번호 228)을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  49. 제 33 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 하기 서열, 즉 CPPCPPC(서열번호 52), CPPCVECPPC(서열번호 53) 및 CPPCPPCPPC(서열번호 54) 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  50. 제 33 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 하기 서열, 즉 EPKSSDKTHTCPPCPPC(서열번호 168), EPKSSDKTHTCPPCVECPPC(서열번호 169) 및 EPKSSDKTHTCPPCPPCPPC(서열번호 170) 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  51. 제 33 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 하기 서열, 즉 EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG(서열번호 26), EPKSSDKTHTCPPCVECPPCGGGSSGGGSG(서열번호 28) 및 EPKSSDKTHTCPPCPPCPPCGGGSSGGGSG(서열번호 30) 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  52. 아미노산 힌지 영역으로서,
    ELKTPLGDTTHT(서열번호 48) 또는 EPKSSDKTHT(서열번호 46)의 상부 힌지 서열에 연결된 CVECPPCP(서열번호 57), CPPCPPC(서열번호 52), CPPCPPCPPC(서열번호 54) 및 CPPCVECPPC(서열번호 53) 중 적어도 하나를 갖는 코어 힌지 서열을 포함하는 아미노산 힌지 영역.
  53. 항체용 아미노산 힌지 영역으로서,
    상응하는 아미노산과 가교 결합할 수 있는 아미노산을 포함하지 않은 상부 힌지 영역; 및
    상기 상부 힌지 영역의 C-말단에 연결된 코어 힌지 영역을 포함하되, 상기 코어 힌지 영역은 가닥 당 적어도 3개의 시스테인을 포함하는 항체용 아미노산 힌지 영역.
  54. 제 52 항 또는 제 53 항에 있어서, 상기 아미노산 힌지 영역은 상기 코어 힌지 영역에 대해 C-말단에 연결된 하부 힌지 또는 연장 영역을 더 포함하되, 상기 하부 힌지 또는 연장 서열은 APPVAGP(서열번호 60), APELLGGP(서열번호 58) 및/또는 GGGSSGGGSG(서열번호 59) 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  55. 제 52 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상부 힌지 영역은 상기 상부 힌지 영역 내에서 가교 결합하는 시스테인을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  56. 제 52 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상부 힌지 영역은 시스테인을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  57. 제 52 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 하부 힌지 또는 연장 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  58. 제 52 항 또는 제 53 항에 있어서, 상기 하부 힌지 또는 연장 영역은 GGGSSGGGSG(서열번호 59), APPVAGP(서열번호 60) 및 APELLGGP(서열번호 58) 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  59. 제 1 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역이 미니바디(minibody) 내에 위치하고 상기 미니바디를 인간 개체에 투여하는 경우, 상기 개체로부터 상기 미니바디의 제거는 주로 간을 통해 일어나는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  60. 제 1 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역이 미니바디 내에 위치하고 상기 미니바디를 인간 개체에 투여하는 경우, 상기 개체로부터 상기 미니바디의 제거는 주로 신장을 통해 일어나지 않는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  61. 제 1 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 항체 내에 있는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  62. 제 1 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 항체 결합 단편 내에 있는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  63. 제 1 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 미니바디 내에 있는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  64. 제 1 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 단일 특이성 항체 내에 있는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  65. 제 1 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 가닥 당 적어도 3개의 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  66. 제 1 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 가닥 당 적어도 4개의 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  67. 제 1 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 가닥 당 적어도 5개의 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  68. 제 61 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스테인은 아미노산 힌지 영역 전역에서 반복 CXX 또는 CXY 모티프 내에 분포하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  69. 제 1 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 이중 특이성 항체 내에 있는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  70. 제 69 항에 있어서, 상기 이중 특이성 항체는 1:1의 비율로 조립되는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  71. 제 69 항에 있어서, 상기 이중 특이성 항체는 항체 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  72. 제 71 항에 있어서, 이중 특이성 항체는 미니바디인 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  73. 제 1 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 따른 아미노산 힌지 영역을 포함하는 약학 조성물로서,
    항체의 5% 미만의 집성체가 상기 조성물 내에 존재하는 약학 조성물.
  74. 제 1 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 따른 아미노산 힌지 영역을 포함하는 약학 조성물.
  75. 제 73 항 또는 제 74 항에 있어서, 상기 항체는 적어도 1마이크로그램(㎍) 내지 100㎎으로 존재하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  76. 코어 힌지 영역을 포함하는 미니바디로서,
    상기 코어 힌지 영역은 가닥 당 적어도 3개의 시스테인을 포함하며, 이때 상기 시스테인은 상기 코어 힌지 영역 내에 적어도 3개의 이황화 결합을 형성하는 미니바디.
  77. 제 76 항에 있어서, 상기 코어 영역의 첫 번째 잔기는 세린인 것을 특징으로 하는 미니바디.
  78. 제 76 항 또는 제 77 항에 있어서, 상기 코어 힌지 영역은 SCVECPPCP(서열번호 56)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미니바디.
  79. Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C의 서열(서열번호 3)을 포함하는 미니바디로서,
    서열번호 3은 상기 미니바디의 코어 힌지 영역으로서 위치하고, Xn1은 임의의 아미노산일 수 있거나 아미노산이 아닐 수 있고, Xn2는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn3은 임의의 아미노산일 수 있고, Xn4는 임의의 아미노산일 수 있고, Xn5는 임의의 아미노산일 수 있는 미니바디.
  80. 제 79 항에 있어서, 상기 Xn1은 시스테인이 아닌 임의의 아미노산인 것(서열번호 229)을 특징으로 하는 미니바디.
  81. 제 79 항에 있어서, 상기 Xn1은 세린인 것(서열번호 229)을 특징으로 하는 미니바디.
  82. 변이체 미니바디 힌지로서,
    제 1 변경 아미노산 위치; 및
    상기 제 1 변경 아미노산 위치에 대해 C-말단에 있는 가닥 당 적어도 3개의 시스테인을 포함하되,
    상기 제 1 변경 위치는 천연 항체 힌지에서 시스테인일 수 있는 아미노산이고, 이황화 결합을 형성하지 않도록 상기 제 1 변경 위치에서 변경되어 있는 변이체 미니바디 힌지.
  83. 제 1 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 서열번호 1로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  84. 제 1 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열번호 1은 코어 힌지 영역이고, 상기 코어 힌지 영역은 본질적으로 서열번호 1로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
  85. 제 84 항에 있어서, 상기 코어 힌지 영역은 서열번호 1로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 아미노산 힌지 영역.
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