CN115960230A - 靶向分子的抗原结合构建体 - Google Patents

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简·古达斯
托弗·奥拉夫森
道列特·卡帝勒·萨特帕耶夫
迈克尔·尤里·托尔戈夫
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Abstract

本申请提供了靶向分子的抗原结合构建体。公开了结合至所期望的靶标的抗原结合构建体，例如，本文描述了抗体，包括抗体片段(如scFv和微抗体)，其结合至靶标分子并且具有一个或多个所公开的铰链。本文描述了使用方法。

Description

靶向分子的抗原结合构建体
本申请是申请日为2016年8月4日的题为“靶向分子的抗原结合构建体”的中国专利申请No.201680058341.1的分案申请。
相关申请的引用
本申请主张2015年8月7日提交的美国临时申请No.62/202,665的权益，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
对序列表的参考
本申请连同电子形式的序列表一起提交。作为标题为IGNAB030WOSEQUENCE.TXT的文件提供序列表，该序列表是2016年8月3日创建和最后修改的，其大小为270,446字节。电子序列表中的信息以其全部内容作为参考并入本文。
技术领域
本文所述的实施方式一般地涉及抗原结合构建体(如任何scFv融合蛋白，如微抗体)中的铰链结构、以及抗原结合构建体本身、以及它们的使用方法。
背景技术
本领域中已知多种抗原结合构建体。这些构建体通常在它们的CDR段中序列改变，而在它们的框架区和抗体的其它部分(如CH3和铰链区)中不经常变化。
发明内容
本发明提供一种氨基酸铰链区，其包含SEQ ID NO：1(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)的序列，其中Xn1可以是不天然形成共价交联键的任何氨基酸，其中Xn2是以下中的一个：A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，并且其中Xn5可以是任何氨基酸。
优选地，其中Xn1不与另一种氨基酸形成共价交联键(SEQ ID NO：191)。
优选地，其中Xn1不是半胱氨酸(SEQ ID NO：192)。
优选地，其中Xn1是以下中的一个：A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V(SEQ ID NO：193)。
优选地，其中Xn2是P、V或E(SEQ ID NO：194)。
优选地，其中Xn2是P或V(SEQ ID NO：195)。
优选地，其中Xn4是P、V或E(SEQ ID NO：196)。
优选地，其中Xn4是P或V(SEQ ID NO：197)。
优选地，其中Xn3是P或E(SEQ ID NO：198)。
优选地，其中Xn5是P或E(SEQ ID NO：199)。
优选地，其中Xn3是P或E(SEQ ID NO：200)。
优选地，其中Xn2Xn3是VE(SEQ ID NO：201)。
优选地，其中Xn2Xn3是PP(SEQ ID NO：202)。
优选地，其中Xn4Xn5是VE(SEQ ID NO：203)。
优选地，其中Xn4Xn5是PP(SEQ ID NO：204)。
优选地，其中Xn2Xn3是VE并且Xn4Xn5是PP(SEQ ID NO：205)。
优选地，其中Xn2Xn3是PP并且Xn4Xn5是PP或VE(SEQ ID NO：206)。
优选地，其中Xn2Xn3是VE并且Xn4Xn5是VE或PP(SEQ ID NO：207)。
优选地，所述的氨基酸铰链区还包含SEQ ID NO：1中最后一个半胱氨酸C末端的延伸序列或下部铰链序列。
优选地，其中所述延伸序列或下部铰链序列包含S、G、A、P或V中的至少一个。
优选地，其中所述延伸序列包含至少GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：59)。
优选地，所述的氨基酸铰链区包含含有至少APPVAGP的接头序列(SEQ ID NO：60)。
优选地，其中所述的铰链区是核心铰链区的部分。
优选地，所述的氨基酸铰链区还包含邻近于所述核心铰链区的上部铰链区。
优选地，所述的氨基酸铰链区还包含邻近于所述核心铰链区的下部铰链或延伸区。
优选地，所述的氨基酸铰链区还包含邻近于所述核心铰链区的上部铰链区。
优选地，其中Xn1包含丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸(SEQ ID NO：209)。
优选地，其中Xn1包含丝氨酸(SEQ ID NO：210)。
优选地，其中Xn1包含丙氨酸(SEQ ID NO：211)。
优选地，其中所述氨基酸铰链区包含以下序列中的至少一个：SCVECPPCP(SEQ IDNO：56)或TCPPCPPC(SEQ ID NO：166)。
优选地，其中所述氨基酸铰链区包含以下序列中的至少一个：ERKSCVECPPCP(SEQID NO：167)、EPKSSDKTHT(SEQ ID NO：46)和CPPCPPC(SEQ ID NO：52)。
优选地，其中所述氨基酸铰链区包含以下序列中的至少一个：ERKSCVECPPCPGGGSSGGGSG(SEQ ID NO：34)或ERKSCVECPPCPAPPVAGP(SEQ ID NO：33)或EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG(SEQ ID NO：26)或EPKSSDKTHTCPPCPPCAPELLGGP(SEQ IDNO：25)。
本发明还提供一种氨基酸铰链区，其包含SEQ ID NO：2(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)的序列，其中Xn1可以是任何m个氨基酸，其中m是任意数目的任何类型的氨基酸，其中Xn2可以是任何氨基酸，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，其中Xn5可以是任何氨基酸，其中Xn6可以是除半胱氨酸以外的任何氨基酸，其中Xn7可以是任何氨基酸，其中Xn8可以是任何氨基酸，其中Xn9可以是任何氨基酸，并且其中Xn10可以是任何氨基酸。
优选地，其中Xn1不是半胱氨酸(SEQ ID NO：213)。
优选地，其中Xn2不是半胱氨酸(SEQ ID NO：214)。
优选地，其中Xn2是D(SEQ ID NO：215)。
优选地，其中Xn3是K(SEQ ID NO：216)。
优选地，其中Xn4是T(SEQ ID NO：217)。
优选地，其中Xn5是H(SEQ ID NO：218)。
优选地，其中Xn6是T(SEQ ID NO：219)。
优选地，其中Xn7是P或V(SEQ ID NO：220)。
优选地，其中Xn8是P或E(SEQ ID NO：221)。
优选地，其中Xn9是P或V(SEQ ID NO：222)。
优选地，其中Xn10是P或E(SEQ ID NO：223)。
优选地，所述的氨基酸铰链区还包含位于Xn1前方的CXXC(SEQ ID NO：224)或CXXC(SEQ ID NO：225)基序。
优选地，所述的氨基酸铰链区还包含紧密连接至SEQ ID NO：1中C末端半胱氨酸的Xn11Xn12C序列，其中Xn11可以是任何氨基酸，并且其中Xn12可以是任何氨基酸(SEQ ID NO：244)。
优选地，其中Xn11是P或V，并且其中Xn12是P或E(SEQ ID NO：227)。
优选地，其中Xn1是丝氨酸，Xn2是D，Xn3是K，Xn4是T，Xn5是H，Xn6是T，Xn7是P，Xn8是P，Xn9是P，并且Xn10是P(SEQ ID NO：228)。
优选地，其中所述铰链区包含以下序列中的至少一个：CPPCPPC(SEQ ID NO：52)、CPPCVECPPC(SEQ ID NO：53)或CPPCPPCPPC(SEQ ID NO：54)。
优选地，其中所述铰链区包含以下序列中的至少一个：EPKSSDKTHTCPPCPPC(SEQID NO：168)、EPKSSDKTHTCPPCVECPPC(SEQ ID NO：169)或EPKSSDKTHTCPPCPPCPPC(SEQ IDNO：170)。
优选地，其中所述铰链区包含以下序列中的至少一个：EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG(SEQ ID NO：26)、EPKSSDKTHTCPPCVECPPCGGGSSGGGSG(SEQID NO：28)或EPKSSDKTHTCPPCPPCPPCGGGSSGGGSG(SEQ ID NO：30)。
本发明还提供一种氨基酸铰链区，其包含：
以下中至少一个的核心铰链序列：CVECPPCP(SEQ ID NO：57)、CPPCPPC(SEQ IDNO：52)、或CPPCPPCPPC(SEQ ID NO：54)、或CPPCVECPPC(SEQ ID NO：53)，其连接至；
ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：48)或EPKSSDKTHT(SEQ ID NO：46)的上部铰链序列。
本发明提供一种抗体的氨基酸铰链区，其包含：
上部铰链区，其不含能够与相应氨基酸交联的氨基酸；和
连接到所述上部铰链区C-末端的核心铰链区，其中所述核心铰链区每条链包含至少3个半胱氨酸。
优选地，其中所述氨基酸铰链区还包含所述核心铰链区C末端连接的下部铰链或延伸区，其中所述下部铰链或延伸区是以下中的至少一个：APPVAGP(SEQ ID NO：60)、APELLGGP(SEQ ID NO：58)和/或GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：59)。
优选地，其中所述上部铰链区不含在所述上部铰链区内交联的半胱氨酸。
优选地，其中所述上部铰链区不含半胱氨酸。
优选地，所述的氨基酸铰链区还包含下部铰链或延伸区。
优选地，其中所述下部铰链或延伸区包含以下中的至少一个：GGGSSGGGSG(SEQ IDNO：59)或APPVAGP(SEQ ID NO：60)或APELLGGP(SEQ ID NO：58)。
优选地，其中当位于微抗体内时，并且其中当将所述微抗体施用于人受试者时，所述微抗体从所述受试者的清除主要通过肝脏发生。
优选地，其中当位于微抗体内时，并且其中当将所述微抗体施用于人受试者时，所述微抗体从所述受试者的清除不是主要通过肾脏发生。
优选地，其中所述铰链区在抗体内。
优选地，其中所述铰链区在抗体结合片段内。
优选地，其中所述铰链区在微抗体内。
优选地，其中所述铰链区在单特异性抗体内。
优选地，其中所述铰链区每条链包含至少3个半胱氨酸。
优选地，其中所述铰链区每条链包含至少4个半胱氨酸。
优选地，其中所述铰链区每条链包含至少5个半胱氨酸。
优选地，其中半胱氨酸以重复CXX或CXY基序遍及所述氨基酸铰链区分布。
优选地，其中所述铰链区在双特异性抗体内。
优选地，其中所述双特异性抗体以1:1的比值组装。
优选地，其中所述双特异性抗体包含抗体片段。
优选地，其中所述双特异性抗体是微抗体。
本发明还提供一种药物组合物，包含本发明以上所述的氨基酸铰链区，其中所述组合物中存在小于5％的抗体聚集。
本发明还提供一种药物组合物，包含本发明以上所述的氨基酸铰链区。
优选地，所述的药物组合物存在至少1微克至100mg所述抗体。
本发明提供一种包含核心铰链区的微抗体，其中所述核心铰链区每条链包含至少3个半胱氨酸，在所述核心铰链区内形成至少3个二硫键。
优选地，其中所述核心区的第一残基是丝氨酸。
优选地，其中所述核心铰链区包含SCVECPPCP(SEQ ID NO：56)。
本发明提供一种微抗体，包含序列Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C(SEQ ID NO：3)，其中SEQ IDNO：3作为所述微抗体的核心铰链区定位，并且其中Xn1可以是任何氨基酸或者是无氨基酸，Xn2可以是任何氨基酸，Xn3可以是任何氨基酸，Xn4可以是任何氨基酸并且Xn5可以是任何氨基酸。
优选地，其中Xn1是除半胱氨酸以外的任何氨基酸(SEQ ID NO：229)。
优选地，其中Xn1是丝氨酸(SEQ ID NO：229)。
本发明提供一种变体微抗体铰链，其包含：
第一改变的氨基酸位置，其中第一改变的位置是在天然抗体铰链中为半胱氨酸的氨基酸，并且已在所述第一改变的位置中改变，从而它不形成二硫键；和
在所述第一改变的氨基酸位置C末端的每条链至少3个半胱氨酸。
优选地，其中所述铰链区由SEQ ID NO：1组成。
优选地，其中SEQ ID NO：1是核心铰链区，并且其中所述核心铰链区基本由SEQ IDNO：1组成。
优选地，其中所述核心铰链区由SEQ ID NO：1组成。
在一些方面，提供了包含SEQ ID NO：1(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)的序列的氨基酸铰链区。Xn1可以是不天然形成共价交联键的任何氨基酸。Xn2是以下中的一个：A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。Xn3可以是任何氨基酸。Xn4可以是任何氨基酸。Xn5可以是任何氨基酸。
在一些方面，Xn1不与另一种氨基酸形成共价交联键(SEQ ID NO：191)。在一些方面，Xn1不是半胱氨酸(SEQ ID NO：192)。在一些方面，Xn1是以下中的一个：A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V(SEQ ID NO：193)。在一些方面，Xn2是P、V或E(SEQ ID NO：194)。在一些方面，Xn2是P或V(SEQ ID NO：195)。在一些方面，Xn4是P、V或E(SEQ ID NO：196)。在一些方面，Xn4是P或V(SEQ ID NO：197)。在一些方面，Xn3是P或E(SEQ ID NO：198)。在一些方面，Xn5是P或E(SEQ ID NO：199)。在一些方面，Xn3是P或E(SEQ ID NO：200)。在一些方面，Xn2Xn3是VE(SEQ ID NO：201)。在一些方面，Xn2Xn3是PP(SEQ ID NO：202)。在一些方面，Xn4Xn5是VE(SEQ ID NO：203)。在一些方面，Xn4Xn5是PP(SEQ ID NO：204)。在一些方面，Xn2Xn3是VE和Xn4Xn5是PP(SEQ ID NO：205)。在一些方面，Xn2Xn3是PP和Xn4Xn5是PP或VE(SEQ ID NO：206)。在一些方面，Xn2Xn3是VE和Xn4Xn5是VE或PP(SEQ ID NO：207)。在一些方面，所述铰链还包含在Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C(SEQ ID NO：1)中最后一个半胱氨酸C末端的延伸或下部铰链序列(lowerhinge sequence)。在一些方面，所述延伸或下部铰链序列包含S、G、A、P或V中的至少一个。在一些方面，所述延伸序列包含至少GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：59)。在一些方面，所述接头序列包含至少APPVAGP(SEQ ID NO：60)。在一些方面，根据权利要求1所述的铰链区是核心铰链区的一部分。在一些方面，所述铰链还包含邻近于所述核心铰链区的上部铰链区(upperhinge region)。在一些方面，所述铰链还包含邻近于所述核心铰链区的下部铰链或延伸区。在一些方面，它还包含邻近于所述核心铰链区的上部铰链区。在一些方面，Xn1包含丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸(SEQ ID NO：209)。在一些方面，Xn1包含丝氨酸(SEQ ID NO：210)。在一些方面，Xn1包含丙氨酸(SEQ ID NO：211)。在一些方面，所述氨基酸铰链区包含以下序列中的至少一个：SCVECPPCP(SEQ ID NO：56)或TCPPCPPC(SEQ ID NO：166)。在一些方面，所述氨基酸铰链区包含以下序列中的至少一个：ERKSCVECPPCP(SEQ ID NO：167)、EPKSSDKTHT(SEQID NO：46)和CPPCPPC(SEQ ID NO：52)。在一些方面，所述氨基酸铰链区包含以下序列中的至少一个：ERKSCVECPPCPGGGSSGGGSG(SEQ ID NO：34)或ERKSCVECPPCPAPPVAGP(SEQ ID NO：33)或EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG(SEQ ID NO：26)或EPKSSDKTHTCPPCPPCAPELLGGP(SEQID NO：25)。
在一些方面，提供了氨基酸铰链区。所述氨基酸铰链区包含SEQ ID NO：2的序列(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)。Xn1可以是任意m个氨基酸(其中m是任意数目的任何类型的氨基酸)。Xn2可以是任何氨基酸。Xn3可以是任何氨基酸。Xn4可以是任何氨基酸。Xn5可以是任何氨基酸。Xn6可以是半胱氨酸以外的任何氨基酸。Xn7可以是任何氨基酸。Xn8可以是任何氨基酸。Xn9可以是任何氨基酸。Xn10可以是任何氨基酸(参见，例如，SEQ ID NO：212)。在一些方面，Xn1不是半胱氨酸(参见，例如，SEQ ID NO：213)。在一些方面，Xn2不是半胱氨酸(参见，例如，SEQ ID NO：214)。在一些方面，Xn2是D(参见，例如，SEQ ID NO：215)。在一些方面，Xn3是K(参见，例如，SEQ ID NO：216)。在一些方面，Xn4是T(参见，例如，SEQ ID NO：217)。在一些方面，Xn5是H(参见，例如，SEQ ID NO：218)。在一些方面，Xn6是T(参见，例如，SEQ ID NO：219)。在一些方面，Xn7是P或V(参见，例如，SEQ ID NO：220)。在一些方面，Xn8是P或E(参见，例如，SEQ ID NO：221)。在一些方面，Xn9是P或V(参见，例如，SEQ ID NO：222)。在一些方面，Xn10是P或E(参见，例如，SEQ ID NO：223)。在一些方面，所述氨基酸铰链区还包含CXXC(参见，例如，SEQ ID NO：224)或者CXXC(参见，例如，SEQ ID NO：225)基序，其位于Xn1的前方。在一些方面，所述氨基酸铰链区还包含紧密连接至SEQ ID NO：2中C末端半胱氨酸的Xn11Xn12C序列，其中Xn11可以是任何氨基酸，并且其中Xn12可以是任何氨基酸(参见，例如，SEQ ID NO：226)。在一些方面，Xn11是P或V，并且Xn12是P或E(参见，例如，SEQ ID NO：227)。在一些方面，Xn1是丝氨酸，Xn2是D，Xn3是K，Xn4是T，Xn5是H，Xn6是T，Xn7是P，Xn8是P，Xn9是P，并且Xn10是P(参见，例如，SEQ ID NO：228)。在一些方面，所述铰链区包含以下序列中的至少一个：CPPCPPC(SEQ ID NO：52)、CPPCVECPPC(SEQ ID NO：53)或CPPCPPCPPC(SEQ ID NO：54)。在一些方面，所述铰链区包含以下序列中的至少一个：EPKSSDKTHTCPPCPPC(SEQ ID NO：168)、EPKSSDKTHTCPPCVECPPC(SEQ ID NO：169)或EPKSSDKTHTCPPCPPCPPC(SEQ ID NO：170)。在一些方面，所述铰链区包含以下序列中的至少一个：EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG(SEQ IDNO：26)、EPKSSDKTHTCPPCVECPPCGGGSSGGGSG(SEQ ID NO：28)或EPKSSDKTHTCPPCPPCPPCGGGSSGGGSG(SEQ ID NO：30)。
在一些方面，提供了氨基酸铰链区。所述铰链区包含以下中至少一个的核心铰链序列：CVECPPCP(SEQ ID NO：57)、CPPCPPC(SEQ ID NO：52)或CPPCPPCPPC(SEQ ID NO：54)，或者CPPCVECPPC(SEQ ID NO：53)，其连接至ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：48)或EPKSSDKTHT(SEQ ID NO：46)的上部铰链序列。
在一些方面，提供了抗体的氨基酸铰链区，它可以包含不含能够与相应氨基酸交联的氨基酸的上部铰链区；和连接到所述上部铰链区的C-末端的核心铰链区，其中所述核心铰链区每条链包含至少三个半胱氨酸。在一些方面，所述氨基酸铰链区还包含所述核心铰链区C末端连接的下部铰链或延伸区，其中所述下部铰链或延伸序列是以下中的至少一个：APPVAGP(SEQ ID NO：60)、APELLGGP(SEQ ID NO：58)和/或GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：59)。在一些方面，所述上部铰链区不含在所述上部铰链区内交联的半胱氨酸。在一些方面，所述上部铰链区不含半胱氨酸。在一些方面，它还包含下部铰链或延伸区。在一些方面，所述下部铰链或延伸区包含以下序列中的至少一个：GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：59)或APPVAGP(SEQID NO：60)或APELLGGP(SEQ ID NO：58)。在一些方面，当位于微抗体内时，并且其中当将所述微抗体施用于人受试者时，所述微抗体从所述受试者中的清除主要通过肝脏发生。在一些方面，当位于微抗体内时，并且其中当将所述微抗体施用于人受试者时，所述微抗体从所述受试者中的清除不是主要通过肾脏发生的。在一些方面，所述铰链区在抗体内。在一些方面，所述铰链区在抗体结合片段内。在一些方面，所述铰链区在微抗体内。在一些方面，所述铰链区在单特异性抗体内。在一些方面，所述铰链区每条链包含至少三个半胱氨酸。在一些方面，所述铰链区每条链包含至少4个半胱氨酸。在一些方面，所述铰链区每条链包含至少5个半胱氨酸。在一些方面，半胱氨酸以重复CXX或CXY基序在整个氨基酸铰链区中分布。在一些方面，所述铰链区在双特异性抗体内。在一些方面，所述双特异性抗体以1：1的比值组装。在一些方面，所述双特异性抗体包含抗体片段。在一些方面，所述双特异性抗体是微抗体。
在一些方面，提供了药物组合物。所述药物组合物可以包含本文所公开的那些中任一个的氨基酸铰链区。在一些实施方式中，这导致所述组合物中存在小于5％的抗体聚集。
在一些方面，提供了包含本文提供的那些中的任一个的氨基酸铰链区的药物组合物。在一些方面，存在至少1微克至100mg所述抗体。
在一些方面，提供了包含核心铰链区的微抗体。所述核心铰链区每条链包含至少3个半胱氨酸，从而在所述核心铰链区内形成至少3个二硫键。在一些方面，所述核心区的第一残基是丝氨酸。在一些方面，所述核心铰链区包含SCVECPPCP(SEQ ID NO：56)。
在一些方面，提供了微抗体。所述微抗体可以包含序列Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C(SEQ IDNO：3)。该序列可以作为所述微抗体的核心铰链区定位。Xn1可以是任何氨基酸或者是无氨基酸。Xn2可以是任何氨基酸。Xn3可以是任何氨基酸。Xn4可以是任何氨基酸。Xn5可以是任何氨基酸。在一些方面，Xn1是除半胱氨酸以外的任何氨基酸(SEQ ID NO：229)。在一些方面，Xn1是丝氨酸(SEQ ID NO：230)。
在一些方面，提供了变体微抗体铰链。所述变体铰链可以包含第一改变的氨基酸位置。所述第一改变的位置是在天然抗体铰链中将为半胱氨酸的氨基酸，并且它已在所述第一改变的位置中改变，从而它不形成二硫键。所述变体铰链还可以在所述第一改变的氨基酸位置C末端每条链包含至少3个半胱氨酸。在一些方面，所述铰链区由SEQ ID NO：1组成。在一些方面，SEQ ID NO：1是核心铰链区，并且其中所述核心铰链区基本由SEQ ID NO：1组成。在一些方面，所述核心铰链区由SEQ ID NO：1组成。
在一些方面，提供了微抗体。所述微抗体结合至靶标抗原，其中所述靶标抗原为CD3、CD8、5T4、PSMA或PSCA中的至少一个。所述微抗体包含含有下列的多肽：结合至靶标抗原的单链可变区片段(scFv)，所述scFv包含连接可变轻链(VL)域的可变重链(VH)域；和在所述铰链的每条链上包含至少3个半胱氨酸的变体铰链区。
在一些方面，所述微抗体还包含人IgG CH3序列。在一些方面，所述微抗体还包含可检测标志物，其选自放射性物质、染料、造影剂、荧光化合物、生物发光化合物、酶、增强剂和纳米颗粒。
在一些方面，所述微抗体包含：如本文所公开的HCDR1的HCDR1；如本文所公开的HCDR2的HCDR2；如本文所公开的HCDR3的HCDR3；如本文所公开的LCDR1的LCDR1；如本文所公开的LCDR2的LCDR2；和如本文所公开的LCDR3的LCDR3。
在一些方面，所述可变重链(VH)域和可变轻链(VL)域是人序列。
在一些方面，提供了编码如本文所公开的微抗体的核酸。
在一些方面，提供了生产如本文所公开的微抗体的细胞系。
在一些方面，提供了包含任何本文所提供的微抗体和可检测标志物的试剂盒。
在一些方面，提供了检测靶标抗原是否存在的方法。所述靶标抗原为CD3、CD8、5T4、PSMA或PSCA中的至少一个。所述方法包括将如本文所公开的微抗体应用于样品；和检测其抗原结合构建体与靶标抗原的结合或未结合。
在一些方面，所述微抗体包含可检测标志物，其选自放射性物质、染料、造影剂、荧光化合物、生物发光化合物、酶、增强剂和纳米颗粒。在一些方面，应用所述微抗体包括将所述微抗体施用于受试者。在一些方面，检测其微抗体与靶标抗原的结合或未结合包括正电子发射断层成像术(positron emission tomography)。在一些方面，所述方法还包括将第二抗体或其片段应用于样品，其中所述第二抗体或其片段特异性结合至所述微抗体。在一些方面，将其微抗体与样品培育不超过1小时。
在一些方面，提供了将治疗剂靶向靶标抗原的方法。所述靶标抗原为CD3、CD8、5T4、PSMA或PSCA中的至少一个。所述方法包括将如本文所公开的微抗体施用于受试者，其中将所述微抗体结合至治疗剂。
在一些方面，提供了中和对其有需要的受试者中B或T淋巴细胞的方法。所述方法包括向所述受试者施用如本文所公开的结合至CD8和/或CD3的微抗体。在一些方面，所述受试者患有如本文所提及的病症中的至少一种。
在一些方面，提供了结合至靶标抗原(如CD3、CD8、5T4、PSMA、PSCA)的抗体和/或微抗体。所述抗体和/或微抗体包含铰链区，其中所述铰链区包括以下中的至少一种：
a)包含SEQ ID NO：1(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)的序列的氨基酸铰链区，其中Xn1可以是不天然形成共价交联键的任何氨基酸，其中Xn2是以下中的一个：A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，并且其中Xn5可以是任何氨基酸；
b)包含SEQ ID NO：2(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)的序列的氨基酸铰链区，其中Xn1可以是任何m个氨基酸(其中m是任意数目的任何类型的氨基酸)，其中Xn2可以是任何氨基酸，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，其中Xn5可以是任何氨基酸，其中Xn6可以是除半胱氨酸以外的任何氨基酸，其中Xn7可以是任何氨基酸，其中Xn8可以是任何氨基酸，其中Xn9可以是任何氨基酸，并且其中Xn10可以是任何氨基酸；
c)以下中至少一个的核心铰链序列：CVECPPCP(SEQ ID NO：57)、CPPCPPC(SEQ IDNO：52)或CPPCPPCPPC(SEQ ID NO：54)，或者CPPCVECPPC(SEQ ID NO：53)，其连接至；ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：48)或EPKSSDKTHT(SEQ ID NO：46)的上部铰链序列。
d)不含能够与相应氨基酸交联的氨基酸的上部铰链区；和连接到所述上部铰链区的C-末端的核心铰链区，其中所述核心铰链区每条链包含至少3个半胱氨酸；
e)包含核心铰链区的抗体和/或微抗体，其中所述核心铰链区每条链包含至少3个半胱氨酸，从而在所述核心铰链区内形成至少3个二硫键；或者
f)第一改变的氨基酸位置，其中所述第一改变的位置是在天然抗体铰链中将为半胱氨酸的氨基酸，并且它已在所述第一改变的位置中改变，从而它不形成二硫键；和在所述第一改变的氨基酸位置C末端的每条链的至少3个半胱氨酸。
在一些方面，作为替代，本文所提供的任何微抗体可以形成全长抗体。在一些实施方式中，所述微抗体(minibody body)包含人源化的氨基酸序列。
在一些方面，制备本文所提供的微抗体的方法包括在细胞系中表达所述微抗体。
在一些方面，提供了治疗对其有需要的受试者中病况的方法。所述方法包括向所述受试者施用本文所提供的微抗体中的任何一种或多种以治疗本文所提供的CD3、CD8、PSCA、PSMA和/或5T4病症中的任何一种或多种。
附图说明
图1显示了工程设计的微抗体(Mb)的图示。
图2显示了基于人IgG1(γ1EH1顶部，和γ1EH2底部)的Mb铰链的多种实施方式的图示。
图3显示了基于人IgG2(γ2EH1顶部，和γ2EH2底部)的Mb铰链的多种实施方式的图示。
图4显示了基于人IgG2(γ2NH1顶部，和γ2NH2底部)的其它Mb铰链的多种实施方式的图示。
图5A显示了IAB2M铰链变体的非还原SDS-PAGE分析的图像。
图5B显示了IAB2Mγ1EH1的一些实施方式的蛋白序列信息。
图5C显示了IAB2Mγ1EH2的一些实施方式的蛋白序列信息。
图5D显示了IAB2Mγ2EH2的一些实施方式的蛋白序列信息。
图5E显示了IAB2M-γ2EH1的一些实施方式的蛋白序列信息。
图6A显示了IAB2Mγ1EH1变体的完整分子量分析(intact mass analysis)。上部部分显示了反相条件下的总离子色谱图。中间部分显示了确认半分子(half molecule)存在的去卷积完整分子量(deconvoluted intact mass)，并且下部部分显示了确认的完整尺寸的分子量(完整尺寸质量，full size mass)。
图6B显示了IAB2Mγ2EH1变体的完整分子量分析。上部部分显示了反相条件下的总离子色谱图。中间部分显示了确认半分子存在的去卷积完整分子量，并且下部部分显示了确认的完整尺寸的分子量。
图6C显示了IAB2Mγ1EH2变体的完整分子量分析。上部部分显示了反相条件下的总离子色谱图。中间部分显示了确认半分子存在的去卷积完整分子量，并且下部部分显示了确认的完整尺寸的分子量。
图6D显示了IAB2Mγ2EH2变体的完整分子量分析。上部部分显示了总离子色谱图。下部部分显示了确认完整尺寸分子量分子存在的去卷积完整分子量。未检测到半分子。
图7A显示了使用LNCaP-AR细胞，通过FACS确定的IAB2M工程设计的铰链变体的结合曲线和EC50结合值。
图7B显示了使用C4-2 XCL细胞，通过FACS确定的IAB2M工程设计的铰链变体的结合曲线和EC50结合值。
图7C显示了无规范信号序列(经典信号序列，canonical signal sequence)的IAB2Mγ1EH3的一些实施方式的蛋白序列信息。
图7D显示了无规范信号序列的IAB2Mγ1EH3的一些实施方式的蛋白序列信息。
图7E显示了无规范信号序列的IAB2Mγ1EH3的DNA序列信息。
图8显示了IAB2Mγ1EH1二聚体内鉴别的含有二硫键的肽(disulfide-containingpeptide)的列表。
图9显示了指示形成误配对半胱氨酸的位置的IAB2Mγ1EH1的二硫键图谱的图示。
图10显示了表明不存在误配对半胱氨酸的IAB2Mγ2EH1的二硫键图谱的图示。
图11A显示了在具有22Rv1(PSMA+)肿瘤异种移植的裸鼠中89Zr-Df-IAB2Mγ1EH1的PET/CT扫描图像。
图11B显示了裸鼠中89Zr-Df-IAB2Mγ1EH1的生物分布图。
图12A显示了在具有22Rv1(PSMA+)肿瘤异种移植的裸鼠中89Zr-Df-IAB2Mγ1EH2的PET/CT扫描图像。
图12B显示了裸鼠中89Zr-Df-IAB2Mγ1EH2的生物分布图。
图13A显示了在具有22Rv1(PSMA+)肿瘤异种移植的裸鼠中89Zr-Df-IAB2Mγ2EH2的PET/CT扫描图像。
图13B显示了裸鼠中89Zr-Df-IAB2Mγ2EH2的生物分布图。
图14A显示了IAB22Mγ2EH1变体的完整分子量分析。上部部分显示了总离子色谱图。中间部分显示了确认半分子存在的去卷积完整分子量，并且下部部分显示了确认的完整尺寸的分子量。
图14B显示了IAB22Mγ2EH1的一些实施方式的蛋白序列信息。
图15A显示了IAB22γ2EH2变体的完整分子量分析。在反相条件下分离蛋白质。上部部分显示了全分子量范围扫描。放大的完整尺寸分子量区域强调了完整的，即二硫键-桥连蛋白的存在(中间部分)，而放大的半分子区域显示基本不存在半分子(下部部分)。
图15B显示了IAB22Mγ2EH2变体的一些实施方式的蛋白序列信息。
图16A显示了具有HPB-ALL(CD8+)肿瘤异种移植的小鼠的PET/CT扫描图像，从而将89Zr-Df-IAB22M微抗体与人IgG1和人IgG2来源的铰链序列相比较。
图16B显示了IAB22Mγ1EH1的一些实施方式的蛋白序列信息。
图16C显示了IAB22Mγ2NH1的一些实施方式的蛋白序列信息。
图16D显示了IAB22Mγ2NH2的一些实施方式的蛋白序列信息。
图17显示了PET/CT扫描图像，从而将NOD-SCID小鼠中89Zr-Df-IAB22Mγ1EH1的吸收与抗原-阳性HPB-ALL肿瘤和抗原-阴性Daudi肿瘤相比较(仅右侧部分)。
图18显示了具有抗原-阳性HPB-ALL肿瘤和抗原-阴性Daudi肿瘤的小鼠中89Zr-Df-IAB22Mγ1EH1的生物分布图。右侧显示了数量。
图19是表3中所列的铰链变体的一些实施方式的图示(γ1EH1顶部，γ1EH3中间，γ1EH4底部)。
图20A显示了总结如通过质谱所确定的存在于IAB2M的不同铰链变体中的半分子的百分比的图。
图20B显示了总结如通过质谱所确定的存在于IAB22M的不同铰链变体中的半分子的百分比的图。
图20C显示了IAB22Mγ1EH3的一些实施方式的蛋白序列信息。
图20D显示了IAB22Mγ1EH5的一些实施方式的蛋白序列信息。
图20E显示了IAB22Mγ3/γ1EH6的一些实施方式的蛋白序列信息。
图20F显示了IAB22Mγ3/γ1EH7的一些实施方式的蛋白序列信息。
图20G显示了IAB22Mγ3/γ1EH8的一些实施方式的蛋白序列信息。
图21A显示了IAB2M铰链Mb变体的非还原SDS-PAGE分析图(左侧部分)和通过密度测定法定量的半分子百分比图(右侧部分)。
图21B显示了IAB2Mγ1EH5的一些实施方式的蛋白序列信息。
图21C显示了IAB2Mγ3/γ1EH6的一些实施方式的蛋白序列信息。
图21D显示了IAB2Mγ3/γ1EH7的一些实施方式的蛋白序列信息。
图21E显示了IAB2Mγ3/γ1EH8的一些实施方式的蛋白序列信息。
图22A显示了IAB22M铰链Mb变体的非还原SDS-PAGE分析图(左侧部分)和通过密度测定法定量的半分子百分比图(右侧部分)。
图22B显示了IAB22Mγ1EH2的一些实施方式的蛋白序列信息。
图23显示了IAB22Mγ1EH1变体的完整分子量分析。上部部分显示了总离子色谱图。中间部分显示了确认半分子存在的去卷积完整分子量，并且下部部分显示了确认的完整尺寸的分子量。
图24显示了IAB22Mγ1EH3变体的完整分子量分析。在反相条件下分离蛋白质。上部部分显示了全分子量范围扫描。放大的完整尺寸分子量区域强调了完整蛋白的存在(中间部分)。放大的半分子区域显示基本不存在半分子(下部部分)。
图25A和25B显示了IAB22Mγ2铰链变体的完整分子量分析。图25A显示了在反相条件下IAB22Mγ2EH1变体(图14B)的总离子色谱图(上部部分)。中间部分显示了确认半分子存在的去卷积完整分子量，并且下部部分显示了确认的完整尺寸的分子量。注意，由于末端赖氨酸剪切产生了不均一性。图25B显示IAB22Mγ2EH2变体(图15B)的去卷积全范围扫描(上部部分)鉴别了m/z为79053.1Da的唯一物质。在中间部分显示了放大的完整尺寸分子量，并且所述半分子具有低丰度且刚好高于噪音水平(底部部分)。
图26显示了使用C4-2 XCL细胞，通过FACS确定的IAB2M工程设计的铰链变体的结合曲线和EC50结合值。
图27显示了使用HPB-ALL细胞，通过FACS确定的IAB22M工程设计的铰链变体的结合曲线和EC50结合值。
图28A显示了IAB20M铰链Mb变体的非还原SDS-PAGE分析图(左侧部分)和通过密度测定法定量的半分子百分比图(右侧部分)。
图28B显示了IAB20Mγ1EH1的一些实施方式的蛋白序列信息。
图28C显示了IAB20Mγ1EH3的一些实施方式的蛋白序列信息。
图28D显示了IAB20Mγ1EH2的一些实施方式的蛋白序列信息。
图28E显示了IAB20Mγ1EH5的一些实施方式的蛋白序列信息。
图29A显示了IAB1M铰链Mb变体的非还原SDS-PAGE分析图(左侧部分)和通过密度测定法定量的半分子百分比图(右侧部分)。
图29B显示了IAB1Mγ1EH1的一些实施方式的蛋白序列信息。
图29C显示了IAB1Mγ2EH2的一些实施方式的蛋白序列信息。
图29D显示了IAB1Mγ1EH3的一些实施方式的蛋白序列信息。
图30显示了PET/CT扫描图像，从而在左肩具有抗原阳性HPB-ALL异种移植的NOD-SCID小鼠中对具有不同铰链序列的89Zr放射性标记的IAB22 Mb的吸收进行比较。
图31显示了在左肩具有抗原阳性HPB-ALL异种移植的NOD-SCID小鼠中，89Zr放射性标记的具有不同铰链序列的IAB22 Mb生物分布数据图。
图32显示了IAB20Mγ2EH2的一些实施方式的蛋白序列信息。
图33显示了ΙΑΒ25Μ-γ2EH2的一些实施方式的蛋白序列信息。
图34A显示了编码IAB2M Mb的一些实施方式的DNA序列。
图34B显示了编码IAB2M Mb的一些实施方式的DNA序列。
图34C显示了编码IAB2M Mb的一些实施方式的DNA序列。
图34D显示了编码IAB2M Mb的一些实施方式的DNA序列。
图34E显示了编码IAB2M Mb的一些实施方式的DNA序列。
图34F显示了编码IAB2M Mb的一些实施方式的DNA序列。
图35A显示了IAB2M Mb铰链变体的蛋白序列信息。
图35B显示了IAB2M Mb铰链变体的蛋白序列信息。
图35C显示了IAB2M Mb铰链变体的蛋白序列信息。
图36A显示了具有不同抗原特异性的Mb的VL和VH域的蛋白序列信息。
图36B显示了具有不同抗原特异性的Mb的VL和VH域的蛋白序列信息。
图36C显示了具有不同抗原特异性的Mb的VL和VH域的蛋白序列信息。
图36D显示了具有不同抗原特异性的Mb的VL和VH域的蛋白序列信息。
图36E显示了具有不同抗原特异性的Mb的VL和VH域的蛋白序列信息。
图37显示了接头序列的多种实施方式的蛋白序列信息。
图38显示了铰链区的多种实施方式的蛋白序列信息。
图39显示了CH3域的多种实施方式的蛋白序列信息。
图40显示了IAB22Mγ1EH1(M1)和IAB22Mγ1EH3(M1)中每一个的实施方式的蛋白序列比对。方框中显示了序列差异。
图41显示了IAB22Mγ1EH3(M1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。方框中显示了信号、CDR、接头和铰链序列。
图42显示了IAB22Mγ1EH5(M1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图43显示了IAB22Mγ1EH7(M1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图44显示了IAB22Mγ1EH8(M1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图45显示了IAB22Mγ2EH2(M1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图46显示了具有VH-K67R多态性的IAB22Mγ2EH2(M1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图47显示了IAB2Mγ1EH1(M2)和IAB2Mγ1EH3(M2)中每一个的实施方式的蛋白序列比对。方框中显示了序列差异。
图48显示了IAB2Mγ1EH3(M2)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。方框中显示了信号、CDR、接头和铰链序列。
图49显示了IAB2Mγ1EH3(M2)(G1m1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图50显示了IAB2Mγ1EH5(M2)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图51显示了IAB2Mγ1EH7(M2)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图52显示了IAB2Mγ1EH8(M2)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图53显示了IAB2Mγ1EH3(M1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图54显示了具有VL-Q79E、V83E；VH-Q1E、Q6E多态性的IAB20Mγ1EHl(M2)和IAB20Mγ1EH3(M2)中每一个的实施方式的蛋白序列比对。方框中显示了序列差异。
图55显示了具有VL-Q79E、V83E；VH-Q1E、Q6E多态性的IAB20Mγ1EH3(M2)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。方框中显示了信号、CDR、接头和铰链序列。
图56显示了IAB20Mγ1EH3(M2)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图57显示了具有VL-A9D、T10S、S12A、P15L、L21I、S22N；VH-Q1E、Q6E多态性的IAB20Mγ1EH3(M2)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图58显示了具有VL-Q79E、V83E；VH-Q1E、Q6E多态性的IAB20Mγ1EH5(M2)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图59显示了具有VL-A9D、T10S、S12A、P15L、L21I、S22N；VH-Q1E、Q6E多态性的IAB20Mγ1EH5(M2)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图60显示了IAB1Mγ1EH1(M1)和IAB1Mγ1EH3(M1)中每一个的实施方式的蛋白序列比对。方框中显示了序列差异。
图61显示了IAB1Mγ1EH3(M1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。方框中显示了信号、CDR、接头和铰链序列。
图62显示了IAB1Mγ2EH2(M1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图63显示了IAB1Mγ1EH5(M1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图64显示了IAB1Mγ1EH7(M1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图65A显示了IAB1Mγ1EH8(M1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图65B显示了IAB25Mγ2NH(M1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图65C显示了IAB25Mγ2EH(M1)的实施方式的DNA和翻译的蛋白序列。
图66显示了IAB22M VH域的实施方式的蛋白序列。
图67显示了IAB20 VL域的一些实施方式的蛋白序列。
图68显示了IAB20 VH域的实施方式的蛋白序列。
图69显示了抗CD3 VL和VH域的一些实施方式的蛋白序列。
图70显示了来自智人(Homo sapiens)的PSMA(前列腺-特异性膜抗原，也称为谷氨酸羧肽酶2)的实施方式的蛋白序列。
图71显示了来自智人(Homo sapiens)的PSCA(前列腺干细胞抗原)的实施方式的蛋白序列。
图72显示了来自智人(Homo sapiens)的5T4癌胚滋养母细胞糖蛋白(oncofetaltrophoblast glycoprotein)的实施方式的蛋白序列。
图73显示了来自智人(Homo sapiens)的T细胞表面糖蛋白CD8α链的实施方式的蛋白序列。
图74显示了来自智人(Homo sapiens)的T细胞表面糖蛋白CD8β链的实施方式的蛋白序列。
图75显示了来自智人(Homo sapiens)的T细胞表面糖蛋白CD3δ链的实施方式的蛋白序列。
图76显示了来自智人(Homo sapiens)的T细胞表面糖蛋白CD3γ链的实施方式的蛋白序列。
图77显示了来自智人(Homo sapiens)的T细胞表面糖蛋白CD3ε链的实施方式的蛋白序列。
图78显示了来自智人(Homo sapiens)的T细胞表面糖蛋白CD3ξ链的实施方式的蛋白序列。
图79显示了IAB25M-γ2EH2的一些实施方式的蛋白序列信息。
图80显示了IAB20M-γ2EH2的一些实施方式的蛋白序列信息。
具体实施方式
本文描述了抗原结合构建体的组分，其包括结合至靶标分子的抗体及其片段，如微抗体。在一些实施方式中，这些组分是新型铰链序列和/或与所述铰链序列有关的序列和/或所述铰链序列的一部分。这些铰链序列可以提供多种益处。本文还提供了抗原结合构建体(如抗体、微抗体等)，其包括本文所提供的铰链序列或子序列中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体可以用于将治疗剂靶向表达所述靶标分子的细胞。在一些实施方式中，提供了使用抗原结合构建体(包括抗体，以及构建体，如微抗体)检测靶标分子(或“靶标”)是否存在的方法。在一些实施方式中，提供了出于治疗目的使用所述抗原结合构建体的方法。
在一些实施方式中，scFv和微抗体抗体对于快速诊断成像可以具有优良的药物动力学性质，同时维持了亲本抗体的结合特异性和亲合力。当前的技术使用通过全长抗体成像，由于全抗体(完整抗体，intact antibody)缓慢的血清清除，其通常需要显著更长的时间(注射后～7-8天)以产生对比度强的图像。本文所提供的微抗体的一些实施方式提供了当天或次日成像的机会。当天或次日成像还为面对从较远地方过来接受治疗/诊断的众多患者的问题提供了后勤解决方案，这是因为当相对于全抗体，使用微抗体成像时，将消除旅行期间的居住或一周后返回的需要。
如以下详细说明的，在一些实施方式中，所述抗原结合构建体用于诊断。当用适当的放射性核素(例如，用于PET成像的正电子发射体碘-124、铜-64、氟-18、镓-68和/或锆-89)或者荧光团(用于荧光成像)标记时，所述抗体片段可以在患者中用于如本文所示的临床前成像和用于临床成像。通过简单地将所述放射性标记改变为单光子发射放射性核素，如铟-111、碘-123和镥-177，这些抗原结合构建体还可以用作潜在的SPECT成像剂。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体可以是人中的临床成像剂(PET/SPECT)。因此，在一些实施方式中，抗原结合构建体可以用于这些病症的靶向诊断检测。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体可以用作治疗剂。
定义和多种实施方式
术语“铰链”表示抗原结合构建体，如抗体或微抗体的铰链区的至少一部分。铰链区可以包含上部铰链、核心(或中间)铰链和下部铰链区的组合。在一些实施方式中，根据任何抗体铰链的定义来定义铰链。天然IgG1、IgG2和IgG4抗体具有铰链区，所述铰链区具有12-15个氨基酸。IgG3具有延伸铰链区，其具有62个氨基酸，包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸。根据结晶学研究推断，天然存在的抗体的功能铰链区从IgG1 H链的氨基酸残基216-237延伸(EU编号；ref.12)并且在下部铰链中包含CH2域N末端的一小部分，其中下部铰链是CH2域的N末端。铰链可以分成三个区域：“上部铰链”、“核心”和“下部铰链”。
当修饰铰链(或其子部分)时，术语“人工的”或“非天然的”表示处于上述状态的所讨论的序列天然不存在。在本发明的背景中，所述铰链已从其天然状态改变，从而它们的序列不再是野生型抗体中所存在的那些。如本领域技术人员将理解的，微抗体在自然界中天然不存在，并因此作为微抗体构建体的任何构建体同样是天然不存在的。这同样适用于本文所提供的任何铰链序列表格(例如，表0.2)中所存在的和/或引入本文所提供的任何铰链序列表格的序列的至少一些构建体。在一些实施方式中，表0.1中的任何铰链子部分或完全铰链序列可以是人工铰链序列，只要所述序列(或铰链所得的组合)天然不存在。
术语“完全铰链区”或“完整铰链区”表示作为单一构建体整个上部、核心和下部铰链区的存在。所述上部、核心和下部区可以彼此紧密相邻布置，或者可以在所述区域间或者在N-或C-末端添加其它残基。在一些实施方式中，天然下部铰链可以替换为延伸序列。在一些实施方式中，可以将天然下部铰链与延伸序列组合。在一些实施方式中，可以在上部和/或核心序列之后添加延伸或其它序列组。
短语“有效铰链区”表示存在足够量的上部、核心和下部铰链区中至少一种的一部分以使得所述铰链区对于其预期目的是有效的。因此，所述短语涵盖了铰链区的变体和多个铰链区的片段。在一些实施方式中，铰链区的功能为以下中的一种或多种：将scFv与CH3域连接，为两个scFv提供灵活性和空间以适当结合至靶标，将两个半分子连接在一起，为所述分子提供总体稳定性和/或由于其溶剂暴露，提供用于位点特异性结合的位点。在一些实施方式中，所述铰链应接近于天然，以降低潜在的免疫原性。在一些实施方式中，所述上部铰链为scFv提供了灵活性(在天然IgG中从残基216开始)，所述中间铰链提供了稳定性，并且下部铰链介导了对CH3的灵活性(在天然IgG中从残基231开始)。
术语“上部铰链”表示从scFv末端起始的铰链的第一部分。上部铰链区的实例可见于表0.1。上部铰链包含从scFv末端至(但不包含)如表0.1中所示的核心铰链的第一半胱氨酸残基的氨基酸。如上所述，术语“有效的上部铰链”表示存在足够的序列以允许所述部分起到上部铰链的功能；所述术语涵盖了所指示的铰链部分的功能变体和片段。
术语“核心铰链”表示上部铰链C末端的铰链区第二部分。核心铰链区的实例可见于表0.1。核心铰链含有链间二硫桥键和高含量的脯氨酸。如上所述，术语“有效的核心铰链”表示存在足够的序列以允许所述部分起到核心铰链的功能；所述术语涵盖了所指示的铰链部分的功能变体和片段。
术语“下部铰链”表示所述核心铰链C-末端的铰链区第三部分。下部铰链区的实例可见于表0.1。在微抗体或抗体片段的背景中，下部铰链连接至CH3域Mb。如上所述，术语“有效的下部铰链”表示存在足够的序列以允许所述部分起到下部铰链的功能；所述术语涵盖了所指示的铰链部分的功能变体和片段。如本文所使用的术语“下部铰链”可以涵盖多种氨基酸序列，其包括天然存在的IgG下部铰链序列和人工延伸序列，其彼此替代或处于本文所提供的它们的组合中。在一些实施方式中，多种延伸可以认为其全部是下部铰链区或者是替换。
术语病况的“治疗(treating)”或“处理(treatment)”可以表示预防病况、延缓病况的发生和/或发展速度、降低出现病况的风险、防止和/或延迟与病况有关的症状的发展、减少或终止与病况有关的症状、产生病况的完全或部分消退或其一些组合。术语“防止”不要求所述病症或疾病的绝对阻止。
“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是在受试者中产生所期望的治疗效果的量，如预防、治疗目标病况、延缓病症和/或症状的发生和/或减轻与病况有关的症状。该量将基于多种因素改变，其包括(但不限于)治疗化合物的特征(包含活性、药物动力学、药效学和生物利用度)、受试者的生理条件(包含年龄、性别、疾病类型和阶段、一般物理状态、对给定剂量的反应性和药物治疗类型)、制剂中一种或多种药物可用载体的性质和/或施用途径。考虑本发明公开，临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验，例如，通过监控受试者对化合物施用的反应并据此调节剂量来确定治疗有效量。对于其它指导，参见Remington:TheScience and Practice of Pharmacy，第21版，Univ.of Sciences in Philadelphia(USIP),Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,2005。
术语“抗原结合构建体”包括所有抗体的变体，包括其结合片段。还包括包含1、2、3、4、5和/或6个CDR的构建体。在一些实施方式中，可以提供串联scFv(tandem scFv)，其可以提供具有二价结合的两个臂。在一些实施方式中，这些CDR可以在常规抗体中在它们适当的框架区之间分布。在一些实施方式中，所述CDR可以包含在重链和/或轻链可变区内。在一些实施方式中，所述CDR可以在重链和/或轻链内。在一些实施方式中，所述CDR可以在单一肽链内。除非在本文中另外指明，否则本文所述的抗原结合构建体结合至所提及的靶标分子。术语“靶标”或“靶标分子”表示抗原结合构建体所结合的蛋白质。靶标蛋白的实例在本领域中是已知的并且包括，例如，PSMA(如FOLH1)(图70；SEQ ID NO：131)、PSCA(图71；SEQID NO：132)、5T4(如TPBG)(图72；SEQ ID NO：133)、CD8(如α-链)(图73；SEQ ID NO：134)、CD8(如β-链)(图74；SEQ ID NO：135)、CD3(如δ-链)(图75；SEQ ID NO：136)、CD3(如γ-链)(图76；SEQ ID NO：137)、CD3(如ε-链)(图77；SEQ ID NO：138)、CD3(如ζ-链)(图78；SEQ IDNO：139)。
术语“抗体”包括(但不限于)免疫球蛋白的基因工程或另外的修饰形式，如胞内抗体(intrabody)、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体、抗体片段、scFv和异源结合抗体(heteroconjugate antibody)(例如，双特异性抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体等)。术语“抗体”包括scFv和微抗体。因此，除非另外明确指明，否则还将本文所提供的关于“抗体”的各个且每一个实施方式设想为scFv和/或微抗体实施方式。术语“抗体”包括免疫球蛋白家族的多肽或者包含能够非共价、可逆地和以特异性方式结合相应抗原的免疫球蛋白的片段的多肽。示例性抗体结构单元包括四聚物。在一些实施方式中，全长抗体可以由两个相同的多肽链对组成，每个对具有一个“轻链”和一个“重链”(通过二硫键连接)。所识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε、铰链和μ恒定区基因以及多种免疫球蛋白可变区基因。对于全长链，将轻链分类为κ或λ。对于全长链，将重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其反过来分别定义了免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每条链的N-末端定义了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别表示轻链和重链的这些区域。如本发明申请中所使用的，“抗体”涵盖了抗体及其片段的所有变化。因此，全长抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体(scFv)、Fab、Fab'和具有相同结合特异性的这些片段的多聚体形式(例如，F(ab')2)在本概念的范围内。在一些实施方式中，所述抗体特异性结合至所期望的靶标。
术语“互补决定域”或“互补决定区(“CDR”)”可互换地表示VL和VH的高变区。CDR是对该靶标分子具有特异性的抗体链的靶标分子结合位点。在一些实施方式中，在每个VL和/或VH中存在3种CDR(CDR1-3，从N-末端顺序编号)，其构成了约15-20％的可变域。CDR与靶标分子表位在结构上互补，并因此直接负责结合特异性。VL或VH剩余的延伸是所谓的框架区(FR)，其在氨基酸序列中显示出较少的变化(Kuby,Immunology,第4版,第4章,W.H.Freeman&Co.,New York,2000)。
可以使用本领域中多种熟知的定义确定CDR和框架区的位置，例如，Kabat(Wu,T.T.等人,"An analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jonesproteins and myeloma light chains and their implications for antibodycomplementarity,"J.Exp.Med.,132卷,No.2,211-250页,1970；Kabat,E.A.等人,"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"第5版,NIH Publication No.91-3242,Bethesda,MD,1991；Chothia C.等人,"Canonical structures for thehypervariable regions of immunoglobulins,"J.Mol.Biol.,196卷,No.4,901-917页,1987；Chothia C.等人,"Conformations of immunoglobulin hypervariable regions,"Nature,342卷,No.6252,877-883页,1989；Chothia C.等人,"Structural repertoire ofthe human VH segments,"J.Mol.Biol.,227卷,No.3,799-817页,1992；Al-Lazikani B.等人,"Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins,"J.Mol.Biol.,273卷,No.4,927-748页,1997)、ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(在imgt.org/的万维网上)(Giudicelli,V.等人,"IMGT/LIGM-DB,thecomprehensivedatabase of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences,"NucleicAcids Res.,34卷(Database Issue),D781-D784页,2006；Lefranc,M.P.等人,"IMGTunique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains andIg superfamily V-like domains,"Dev.Comp.Immunol.,27卷,No.1,55-77页,2003；Brochet,X.等人,"IMGT/V-QUEST:the highly customized and integrated system forIG and TR standardized V-Jand V-D-J sequence analysis,"Nucleic Acids Res.,36卷(Web Server Issue)，W503-508页,2008)、AbM(Martin,A.C.等人,"Modeling antibodyhypervariable loops:a combined algorithm,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86卷,No.23,9268-9272页,1989)、接触定义(MacCallum,R.M.等人,"Antibody-antigeninteractions:contact analysis and binding site topography,"J.Mol.Biol.,Vol.262,No.5,pp.732-745,1996)和/或自动建模和分析工具(Honegger,A.等人，在万维网bioc.uzh.ch/plueckthun/antibody/Numbering/上可获取)。
术语“结合特异性决定簇”或“BSD”可互换地表示决定抗体结合特异性所必需的互补决定区内最小邻接或非邻接氨基酸序列。最小结合特异性决定簇可以在一个或多个CDR序列内。在一些实施方式中，最小结合特异性决定簇存在于所述抗体的重链和轻链的CDR3序列的部分或全长内(即，仅通过它们确定)。在一些实施方式中，重链可变区的CDR3对于抗原结合构建体的特异性来说是足够的。
如本文所使用的“抗体可变轻链”或“抗体可变重链”分别是指包含VL或VH的多肽。基因节段V(可变区)和J(连接区)编码内源VL，V、D(多样性)和J编码内源VH。VL或VH中的每一个包含CDR以及框架区。在本发明申请中，抗体可变轻链和/或抗体可变重链有时可以统称为“抗体链”。这些术语涵盖了含有不破坏VL或VH的基本结构的突变的抗体链，如本领域技术人员将易于辨别的。在一些实施方式中，考虑了全长重链和/或轻链。在一些实施方式中，仅考虑重链和/或轻链的可变区是存在的。
抗体可以作为完整免疫球蛋白存在，或者作为通过各个肽酶消化所产生的一些片段存在。因此，例如，胃蛋白酶酶切消化铰链区中二硫键下方的抗体以产生F(ab)'2，即本身是通过二硫键结合成VH-CH1的轻链(VL-CL)的Fab的二聚体。可以在温和条件下还原F(ab)'2以断裂铰链区中的二硫键，借此将F(ab)'2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体是具有部分铰链区的Fab。(Paul,W.E.,"Fundamental Immunology,"第3版,New York:Raven Press,1993)。尽管就全抗体的酶切消化而言定义了多种抗体片段，但是技术人员将理解可以通过化学方法或通过使用重组DNA方法从头合成这些片段。因此，如本文所使用的术语“抗体”还包括通过全抗体修饰产生的抗体片段，或者使用重组DNA方法从头合成的那些(例如，单链Fv)或者使用噬菌体展示文库鉴别的那些(参见，例如，McCafferty,J.等人,"Phageantibodies:filamentous phage displaying antibody variable domains,"Nature,348卷,No.66301,552-554页,1990)。
对于单克隆或多克隆抗体的制备，可以使用本领域中已知的任何技术(参见，例如，Kohler,G.等人,"Continuous cultures of fused cells secreting antibody ofpredefined specificity,"Nature,256卷,No.5517,495-497页,1975；Kozbor,D.等人,"The production of monoclonal antibodies from human lymphocytes,"ImmunologyToday,4卷,No.3,72-79页,1983；Cole,等人,"Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,"Alan R.Liss,Inc.,77-96页,1985；Wang,S.,"Advances in the production ofhuman monoclonal antibodies,"Antibody Technology Journal,1卷,1-4页,2011；Sharon,J.等人,"Recombinant polyclonal antibodies for cancer therapy,"J.CellBiochem.,96卷,No.2,305-313页,2005；Haurum,J.S.,"Recombinant polyclonalantibodies:the next generation of antibody therapeutics？"Drug Discov.Today,11卷,No.13-14,655-660页,2006)。用于生产单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778)可适应于生产抗本发明多肽的抗体。另外，转基因小鼠或其它生物，如其它哺乳动物可以用于充分表达人单克隆抗体。作为另外一种选择，噬菌体展示技术可以用于鉴别所选抗原的高亲合力结合剂(参见，例如，McCafferty等人,同上；Marks,J.D.等人,"By-passingimmunization:building high affinity human antibodies by chain shuffling,"Biotechnology(N.Y.),10卷,No.7,779-783页,1992)。
用于将非人抗体人源化或灵长类源化(primatizing)的方法在本领域中是熟知的。通常，人源化抗体可以具有来自非人来源的引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称作输入残基，所述残基通常取自输入可变区。在一些实施方式中，可以使用术语“供体”和“受体”序列。基本可以按照Winter及其同事的方法，通过用一种或多种啮齿类CDR序列取代人抗体的相应序列进行人源化(参见，例如，Jones,P.T.等人,"Replacing the complementarity-determining regions in a human antibodywiththose from a mouse,"Nature,321卷,No.6069,522-525页,1986；Riechmann,L.等人,"Reshaping human antibodies for therapy,"Nature,332卷,No.6162,323-327页,1988；Verhoeyen,M.等人,"Reshaping human antibodies:grafting an antilysozymeactivity,"Science,239卷,No.4847,1534-1536页,1988；Presta,L.G.,"Antibodyengineering",Curr.Op.Struct.Biol.,2卷,No.4,593-596页,1992)。因此，这类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中来自非人物种的相应序列取代了基本小于完整的人可变域。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些互补决定区(“CDR”)残基和可能的一些框架(“FR”)残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基取代。
“嵌合抗体”是抗体分子，其中(a)恒定区或其部分改变、替换或更换，从而所述抗原结合位点(可变区)连接至具有不同或改变的种类、效应因子功能和/或物种的恒定区，或者赋予所述嵌合抗体新性质的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子和药物；或者(b)可变区或其部分改变、替换或更换为具有不同或改变的抗原特异性的可变区。
抗体还包括化学结合至具有其它蛋白质的融合蛋白或者作为所述融合蛋白表达的一个或多个免疫球蛋白链。它还包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体。
本发明的其它抗原结合片段或抗体部分包括双特异性scFv抗体，其中所述抗体分子识别两个不同的表位、单一结合域(sdAb或纳米抗体)和微抗体。
术语“抗体片段”包括(但不限于)单独或与其它分子结合的抗体的一个或多个抗原结合片段，其包括(但不限于)Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG(还原型IgG)、scFv片段、单域片段(纳米抗体)、肽体、微抗体。术语“scFv”是指单链Fv(“片段可变区”)抗体，其中常规双链抗体的重链和轻链的可变域已连接形成一条链。
药物可用的载体可以是参与将所关心的化合物从一个组织、器官或身体部分携带或输送至另一个组织、器官或身体部分的药物可用的材料、组合物或媒介物。例如，所述载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，或者它们的一些组合。所述载体的每个组分是“药物可用的”，其中它与所述制剂的其他成分相容。它还必须适合于与它可能遭遇的任何组织、器官或身体部分接触，这表示它不得具有过分超过其治疗益处的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或任何其它并发症的风险。可以通过任何适合的施用途径施用本文所述的药物组合物。施用途径可以表示本领域中已知的任何施用途径，其包括(但不限于)气溶胶、肠内、鼻、眼、口服、肠胃外、直肠、透皮(例如，局部乳膏剂或软膏剂、贴片)或阴道施用。“透皮”施用可以使用局部乳膏剂或软膏剂或者通过透皮贴片完成。“肠胃外”是指通常与注射有关的施用途径，其包括眶下、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、被膜下、皮下、经粘膜或经气管施用。在一些实施方式中，在干预或切除期间，可以作为局部施用，术中递送抗原结合构建体。
术语“靶标分子依赖性病症”或“靶标分子相关病症”包括其中所述靶标分子在病症本身中起作用的任何病症。在一些实施方式中，这表示所述靶标分子的过表达。在一些实施方式中，所述病症可以包括本文所讨论的任何病症。在一些实施方式中，所述病症可以是对其来说，存在可以通过结合靶向的靶标分子，且它们的结合将导致所述病症的检测和/或治疗的任何病症。无限制地，所述靶标分子可以是(例如)CD8、CD3、5T4、PSMA和/或PSCA。
微抗体是分子量比全长抗体小，同时维持了对抗原的二价结合性质的抗体形式。由于其尺寸较小，缺少结合Fc-γ和FcRN受体的CH2域、缺少糖基化作用，因此当靶向肿瘤组织时，微抗体从系统清除的速度更快且渗透性潜在提高。对于延长循环时间可以导致不利的患者剂量施用和剂量学，具有强烈靶向结合快速清除能力的微抗体对于诊断成像和放射性有效负荷(payload)的递送是有利的。在一些实施方式中，由于上述特征，如肿瘤渗透性和更快速的清除，其对于细胞毒性有效负荷的递送也可以是有利的。如本文所述的“微抗体”包括同型二聚体，其中每个单体是通过铰链序列与人IgG CH3域连接的单链可变区片段(scFv)。在一些实施方式中，微抗体是二价或双特异性的共价结合的～80kDa的同型二聚体。在一些实施方式中，每个单体(半分子)由通过约15-18个氨基酸的富含Gly-Ser的接头序列连接至相应可变轻链(VL)域的可变重链(VH)域组成。
在一些实施方式中，通过铰链序列将每个单链可变区片段(scFv)连接至人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3域。
在一些实施方式中，下部铰链/延伸序列可以是天然IgG1、2、3或4下部铰链，和/或(G3)Sn或者(G4)Sn(n可以是任何数目的S；在一些实施方式中，它是1或2)和/或无下部铰链和/或任何氨基酸的组合(不必须是G和S)。在一些实施方式中，下部铰链/延伸序列可以包含GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：59)。
在一些实施方式中，接头可以是任何将起作用的接头。在一些实施方式中，接头序列可以包括基序，所述基序是(G3)Sn或者(G4)Sn(n可以是任何数目的S；在一些实施方式中，它是1或2)。在一些实施方式中，所述接头可以包含GSTSGGGSGGGSGGGGSS(SEQ ID NO：62)。
当在描述抗原，例如，蛋白质与抗体或抗体来源的结合剂之间的相互作用的背景中使用时，短语“特异性(或选择性)结合”是指对于在非均一蛋白群体和其它生物学中，例如，在生物样品，例如，血液、血清、血浆或组织样品中对于抗原的存在起决定性作用的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，在一些实施方式中，具有特定结合特异性的抗体或结合剂以背景至少两倍结合至特定抗原，并且基本上不以显著的量结合样品中存在的其它抗原。在这些条件下，与抗体或结合剂的特异性结合可能需要针对特定蛋白质的特异性选择抗体或试剂。多种免疫测定形式可以用于选择对特定蛋白具有特异性免疫活性的抗体。例如，固相ELISA免疫测定通常用于选择对蛋白质具有特异性免疫活性的抗体(参见，例如，Harlow,E.&Lane D.,"Using Antibodies,A Laboratory Manual,"Cold Spring HarborLaboratory Press,1998，对于可以用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述)。通常，特异性或选择性结合反应将产生相对于背景信号至少两倍高的信号，并且更通常地，相对于背景至少10至100倍高的信号。
术语“平衡解离常数(KD，M)”是指解离速率常数(kd，时间-1)除以结合速率常数(ka，时间-1M-1)。可以使用本领域中任何已知的方法测量平衡解离常数。本发明所述的抗体通常将具有小于约10-7或10-8M，例如，小于约10-9M或10-10M，在一些实施方式中，小于约10- 11M、10-12M或10-13M的平衡解离常数。
当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示所述核酸或蛋白质基本不含在自然状态中与之相联系的其它细胞组分。在一些实施方式中，它可以处于干燥或水溶液中。可以使用分析化学技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或者高效液相色谱法确定纯度和均一性。作为主要物质存在于制剂中的蛋白质是基本纯化的。具体地，除了所关心的基因以外，将分离的基因与侧接基因和编码蛋白质的开放阅读框分离。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶上产生基本一条带。在一些实施方式中，这可以表示所述核酸或蛋白质是在体内条件下存在的至少85％纯的，更优选地至少95％纯的，并且最优选地至少99％纯的分子。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)以及它们处于单链或双链形式的聚合物。除非具体限制，否则该术语涵盖了含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸类似的结合性质并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另外说明，否则具体的核酸序列还隐含地涵盖了其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源基因(ortholog)、SNP和互补序列以及明确指明的序列。具体地，可以通过产生其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧次黄嘌呤核苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer,M.A.等人,"Enhanced evolutionary PCR using oligonucleotides with inosine at the 3'-terminus,"Nucleic Acid Res.,19卷,No.18,5081页,1991；Ohtsuka,E.等人,"Analternative approach to deoxyoligonucleotides as hybridization probes byinsertion of deoxyinosine at ambiguous codon positions,"J.Biol.Chem.,260卷,No.5,2605-2608页,1985；Rossolini,G.M.等人,"Use of deoxyinosine-containingprimers vs degenerate primers for polymerase chain reaction based onambiguous sequence information,"Mol.Cell.Probes,8卷,No.2,91-98页,1994)。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以表示氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是遗传密码子所编码的那些，以及随后修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如，结合至氢、羧基、氨基和R基的α-碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍(methioninemethyl sulfonium)。这些类似物具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列二者。对于特定核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在用密码子表示丙氨酸的每个位置，可以将密码子改变为任何相应的所述密码子而不改变编码多肽。这种核酸变化为“沉默变化”，它是保守性修饰变化的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列还描述了核酸的每一种可能的沉默变化。技术人员将承认可以改变核酸中的每个密码子(除通常作为蛋氨酸的唯一密码子的AUG和通常作为色氨酸唯一密码子的TGG之外)以获得功能上相同的分子。因此，在每个所述序列中编码多肽的核酸的每一种沉默变化是隐性的(implicit)。
对于氨基酸序列，技术人员将承认造成编码序列中单个氨基酸或少部分氨基酸的改变、添加或缺失的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中所述变化导致用化学类似的氨基酸取代氨基酸。提供功能类似氨基酸的保守取代表在本领域中是熟知的。这类保存性修饰的变体是本发明多态性变体、种间同系物和等位基因的补充并且不排除它们。
以下八组分别含有对于另一个来说是保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天门冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(参见，例如，Creighton,T.E.,"Proteins-Structures and Molecular Properties,"W.H.Freeman&Co.Ltd.,1984)。
可以通过将两个最佳比对的序列对于比较窗进行比较来确定术语“序列同一性百分比”，其中与对于两条序列的最优比对来说，不包含添加或缺失的参考序列(例如，本发明的多肽)相比，所述比较窗中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即缺口)。通过以下方法计算百分比：确定两条序列中存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以获得匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗中的位置总数，并将结果乘以100以获得序列同一性百分比。
在两个或更多个核酸或多肽序列的背景中，术语“相同的”或“同一性”百分比表示作为相同序列的两个或更多个序列或子序列。如使用以下序列比较算法之一或者通过手动比对和目视检查所测量的，当对于比较窗或指定区域比较和比对最大对应性时，如果两条序列具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域或者当未指明时，在参考序列的整个序列上，具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，则两条序列是“基本相同的”。本文所提供的一些实施方式提供了分别与本文举例说明的多肽或多核苷酸(例如，在表0.1、0.2、1、2或3和图5B-5E、7C、7D、14B、15B、16B-16D、20C-20G、21B-21E、22B、28B-28E、29B-29D、32、33、35A-35C、36A-36E、40-69、79、80中的任一个中举例说明的任何一个或多个可变区和在图7E、34A-34F、41-46、48-53、55-59、61-64、65A、65B和65C中的任一个中中举例说明的任何一个或多个核酸序列)基本相同的多肽或多核苷酸。任选地，同一性存在于长度至少约15、25或50个核苷酸的区域内，或者更优选地存在于长度为100至500或1000或更多个核苷酸的区域内，或者在参考序列的全长内。对于氨基酸序列，同一性或基本同一性可以存在于长度至少5、10、15或20个氨基酸的区域内，任选地长度至少约25、30、35、40、50、75或100个氨基酸，任选地长度至少约150、200或250个氨基酸，或在参考序列的全长内。对于较短的氨基酸序列，例如，具有20个或更少氨基酸的氨基酸序列，在一些实施方式中，当根据本文所定义的保守取代，一个或两个氨基酸残基保守取代时，存在基本同一性。
在一些实施方式中，同一性百分比是对于本文所提及的铰链区(所述铰链区和/或其上部、核心和下部铰链区的子部分)。在这些情况下，可以单独从其余的蛋白或核酸序列鉴别铰链区或其子部分的同一性百分比。因此，两个铰链区(或者上部、核心和/或下部区)可以具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域或者当未指明时，在参考序列的整个序列上，具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，同时使得剩余的蛋白与对比蛋白保持100％相同，或者同时还使得剩余的蛋白还具有指定同一性百分比的变化。
对于序列比较，通常一条序列用作参考序列，将测试序列与该序列比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如有必要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或者可以指定替换参数。然后，基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所使用的“比较窗”包括参考具有选自20至600，通常约50至约200，更通常地约100至约150的邻接位置数中的任一个的部分，其中可以在两序列最优比对后，将序列与具有相同邻接位置数的参考序列相比较。将用于比较的序列进行比对的方法在本领域中是熟知的。可以通过以下方法进行用于比较的序列的最优比对，例如，通过局部同源性算法，Smith and Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c，通过同源比对算法，Needleman,S.B.等人,"A general method applicable to the search for similarities in theamino acid sequence of two proteins,"J.Mol.Biol.,48卷,No.3,443-453页,1970，通过搜索相似性方法，Pearson,W.R.等人,"Improved tools for biological sequencecomparison,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85卷,No.8,2444-2448页,1988，通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics软件包，Genetics Computer Group,575ScienceDr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者通过手动比对和目视检查(参见，例如，Ausubel,F.M.等人,Current Protocols in Molecular Biology,增刊(Supplement),1995)。
适合于确定序列同一性百分比和序列相似度的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul,S.F.等人,"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration of protein database searchprograms,"Nucleic Acids Res.,25卷,No.17,3389-3402页,1977和Altschul,S.F.等人,"Basic local alignment search tool,"J.Mol.Biol.,215卷,No.3,403-410页,1990。实施BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开可用。该算法包括首先通过在询问序列中鉴别长度W的短字来鉴别高分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，其匹配或满足一些正值阈值得分T。Τ被称为相邻字得分阈值(neighborhoodword score threshold)(Altschul,S.F.等人,同上)。将这些初始的匹配相邻字作为种子以用于起始搜索，从而找到含有它们的更长的HSP。将匹配字(word hit)沿着每条序列，在累积比对得分可以增加的情况下尽量远地向两个方向延伸。对于核苷酸序列，利用参数Μ(对匹配残基对的奖励得分；始终>0)和N(错配残基的罚分；始终<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当累积比对得分从它达到的最大值下降数量X时；由于一个或多个得负分的残基比对的累积，累积得分达到零以下时；或者到达序列末端时，停止匹配字在每个方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)作为缺省使用字长(W)＝11、期望值(E)＝10、M＝5、N＝-4和双链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序作为缺省使用字长＝3、期望值(E)＝10、BLOSUM62评分矩阵(参见，Henikoff,S.等人,"Amino acid substitution matrices from proteinblocks,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89卷,No.22,10915-10919页,1992)、比对(B)＝50、预期值(E)＝10、M＝5、N＝-4和双链比较。
BLAST算法还进行两条序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin,S.等人,"Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecularsequences,"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90卷,No.12,5873-5787页,1993)。通过BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小总和概率小于约0.2，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸类似于参考序列。
两条核酸序列或多肽基本相同的指示是如下所述，通过第一核酸编码的多肽与抗第二核酸所编码的多肽的抗体免疫交叉反应。因此，在一些实施方式中，多肽通常基本相同于第二多肽，例如，其中两个肽差异仅在于保守取代。两条核酸序列基本相同的另一个指示是如下所述，两个分子或它们的补体在严格条件下彼此杂交。两条核酸序列基本相同的另一个指示是相同引物可以用于扩增序列。
术语“受试者”、“患者”和“个体”可互换地表示要检查和/或治疗的实体。这可以包括，例如，哺乳动物，例如，人或非人灵长类哺乳动物。所述哺乳动物还可以是实验室哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠。在一些实施方式中，所述哺乳动物可以是农用哺乳动物(例如，马、羊、牛、猪、骆驼科动物)或家养哺乳动物(例如，狗、猫)。
术语“共施用”是指在个体血液中或者在测试样品中施用两种活性剂。可以同时或顺序递送共施用的活性剂。
抗原结合构建体
在本文中，应理解铰链区内的序列可以对于多种抗原结合构建体具有特别的相关性。在一些实施方式中，铰链区的价值可以特别高，如在微抗体排布中。所述铰链内的序列可以包含二硫键，其对于铰链功能有用，但是当改变时，可以具有不同的结果。如本文所公开的、并且如以下实施例中所示出的，在一些实施方式中，可以配置所述铰链区序列以防止和/或降低与所述蛋白质其它区域中存在的半胱氨酸残基进行不期望的二硫键混杂(scrambling)和/或以含有足够数目的半胱氨酸对以维持体内二聚体的完整性，防止多联体(concatamer)形成和/或允许与配对半胱氨酸之一进行位点特异性结合。
在一些实施方式中，微抗体二聚体的体内稳定性可以归因于CH3域间天然范德华力结合、铰链区内二硫键的形成和/或VH和VL之间的相互作用。到目前为止，已使用人IgG1上部和核心铰链区与连接至人IgG1 CH3域的延伸序列工程设计了大部分微抗体。除了以上提及的变化外，由于构建体取向还可以改变它们的特性(如以下实施例中所示)，本文提供和鉴别了微抗体的两种取向(例如，VL-VH(M1)和VH-VL(M2)SCFV变体)。
一些上述铰链(例如，huIgG1铰链-延伸或γ1EH1)在上部铰链中包含天然huIgG1(图2)。基于通过LC/MS的二硫键图谱、SDS-PAGE分析和体内生物分布数据，如Kabat所定义的和通过第一环所指明的，在人IgG1的背景中，位置245处的这一半胱氨酸产生了微抗体形式中蛋白不均一和稳定性的问题。如以下实例所示，在一些实施方式中，Cys245可以突变成丝氨酸，从而导致产生了如本文所述的人工铰链或“EH2铰链”。因此，从链中除去该半胱氨酸(如以下实例所示)导致产生了改善的铰链区。在一些实施方式中，所得构建体(其在铰链区中缺少第一半胱氨酸)不够稳固，以通过两个剩余的二硫桥键来维持微抗体二聚体的体内稳定性(就γ1EH/EH2来说)。因此，如以下实例所示，每条链可以引入第三个或更多数目的半胱氨酸(例如，在核心区内)以产生改善的构建体。在一些实施方式中，在铰链中提供第3个(或更多个)半胱氨酸(每条链相对于IgG1天然铰链来说是额外的半胱氨酸)将增加二硫键和提高蛋白质稳定性。在一些实施方式中，通过增加铰链区中的二硫键所提供的额外的稳定性允许位点特异性结合至一个或多于一个的半胱氨酸，以维持完整的二聚体。在一些实施方式中，IAB2M、20M、1M和IAB22M的huIgG2微抗体包括连接至huIgG2 CH3域的人IgG2(huIgG2)铰链/延伸序列。因此，在一些实施方式中，所述CH3域可以是huIgG2 CH3域。在一些实施方式中，可以使用在两条肽链之间产生共价键的任何选择来替代用于形成二硫键的半胱氨酸。
在本发明申请中，当提及引入半胱氨酸时(除非另作说明)，它表示每条铰链(包括两条链)引入半胱氨酸。因此，链内的3、4、5或6个半胱氨酸将表示铰链内的6、8、10或12个半胱氨酸，并且存在3、4、5或6个可能的二硫键(当然，除非指明，否则二硫键的数目可以是不同的，如一些可以用于标记和其它用途)。
在一些实施方式中，所述IgG2铰链/延伸-γ2EH1-导致聚集增加，其中反应性第一铰链半胱氨酸负责ΙΑΒ2Μ-γ2EH1形式中多联体的形成。在这些实施方式中，可以使用天然huIgG2的上部铰链。
接着，在发展铰链构建体的一些实施方式的第二配置中考虑以上方面。在该第二排布中，将第一铰链半胱氨酸(与天然抗体中κ轻链配对的半胱氨酸)突变成导致产生IgG2EH2(γ2EH2)的丝氨酸。该构建体良好表达并且具有优良的体内稳定性，具有正确形成的全部3个二硫键，如通过完整分子量分析所示，并且具有IAB2M和IAB22M构建体所示的稳定性(如以下实施例所示)。因此，在一些实施方式中，本文提供了其中第一半胱氨酸已改变的IgG2人工或修饰铰链，并且将其提供用于改善的微抗体构建体。
如以下实施例所示，结果表明将IgG1和IgG2铰链的第一铰链半胱氨酸突变是有利的，以防止半胱氨酸错配。如以下实施例所示，结果表明每条链在核心铰链区中具有超过2个半胱氨酸残基是有利的，以维持蛋白质的结构完整性。如以下实施例所示，结果表明IgG2铰链提供了提高体内稳定性的解决方案。因此，本文提供了抗原结合构建体，如微抗体更高的体内稳定性。
在一些实施方式中，可以使用IgG2铰链。在一些实施方式中，可以使用IgG2铰链，其中将所述第一铰链半胱氨酸突变。在一些实施方式中，Mb构建体中末端赖氨酸(K)的突变不影响蛋白质表达，但是的确产生了具有更均一电荷的蛋白质。
如实施例中所讨论的，基于上部IgG3铰链和修饰的IgG1核心铰链序列(其中每条链在核心铰链区中存在至少3个半胱氨酸残基)，评价了其它Mb变体。如以下实施例所列，评价了IAB2M、IAB22M和IAB20M构建体以证明所述发现在具有不同取向和不同靶标的多个构建体之间的普遍性。结果表明本文对于本发明所公开的铰链所述的优势将是可用的并且具体地适用于任何和全部抗原结合构建体和微抗体。
在一些实施方式中，所述铰链可以是肽铰链和/或编码肽铰链的核酸序列。有关本文所提供的铰链的肽形式的所有讨论还表示编码所述肽的核酸序列的相应结构和功能。在一些实施方式中，可以将所述铰链引入抗原结合构建体，如抗体，如微抗体。可以将任何铰链或铰链的子部分(如上部铰链、核心铰链和/或下部铰链区)引入到本文所提供的任何抗原结合构建体，其包括(但不限于)：表0.1、0.2、1、2或3和图5B-5E、7C、7D、14B、15B、16B-16D、20C-20G、21B-21E、22B、28B-28E、29B-29D、32、33、35A-35C、36A-36E、40-69、79、80中的那些和在图7E、34A-34F、41-46、48-53、55-59、61-64、65A、65B和65C中举例说明的任何一个或多个核酸序列。在一些实施方式中，所述铰链可以包括表0.1中所示的任何一个或多个序列或子部分。在一些实施方式中，然后可以将任何下部铰链直接或间接连接至CH3域。
表0.1
铰链变体(图38)
在一些实施方式中，所述铰链包含以上表0.1中的任何序列，由其组成或者基本由其组成。在一些实施方式中，所述铰链由表0.1中指明的上部、核心和下部铰链区中的每一个组成。在一些实施方式中，还可以作为其变体提供以上子部分中的任一个(如上部、核心和/或下部铰链)。在一些实施方式中，所述变体与以上序列具有基本的同一性。在一些实施方式中，所述变体与以上提及的序列具有1、2或3个氨基酸差异。在一些实施方式中，所述变体与以上提及的序列具有1、2或3个氨基酸差异并且所述差异是保守性差异。
在一些实施方式中，核心区中的CPPC(SEQ ID NO：50)基序可以改变为任何其它有效的核心基序，只要充分替换了上表中存在的共价键的数目和/或有效性。
在一些实施方式中，提供了抗体的肽铰链区。所述铰链区可以包含上部铰链区，其不含能够与相应氨基酸交联的氨基酸。所述氨基酸铰链区还可以包含所述上部铰链区C末端连接的核心铰链区。在一些实施方式中，所述核心铰链区在所述铰链的每一侧包含至少3个半胱氨酸(所以，对于组装的结构包含至少6个半胱氨酸)。在一些实施方式中，所述氨基酸铰链区还包含所述核心铰链区C末端连接的下部铰链或延伸区。在一些实施方式中，所述下部铰链或延伸区可以包含以下中的至少一种：APPVAGP(SEQ ID NO：60)、APELLGGP(SEQID NO：58)或GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：59)。
在一些实施方式中，所述上部铰链区不含在所述上部铰链区内交联的半胱氨酸。在一些实施方式中，所述上部铰链区不含半胱氨酸。在一些实施方式中，所述氨基酸铰链区还包含下部铰链区。在一些实施方式中，这些构建体是非天然存在的构建体。
在一些实施方式中，提供了变体微抗体铰链区。所述变体微抗体铰链区包含第一改变的氨基酸位置。所述第一改变的氨基酸位置是在天然抗体铰链中将为半胱氨酸的氨基酸，并且它已在所述第一改变的位置中改变，从而它不形成二硫键。所述变体微抗体铰链区每条链还包含在所述第一改变的氨基酸位置C-末端的至少3个半胱氨酸。在一些实施方式中，每条链可以存在4、5、6或更多个半胱氨酸在所述第一改变的氨基酸位置的C-末端。在一些实施方式中，这些其它半胱氨酸充分包含在所述铰链的核心区内(当然，所述核心铰链可以修饰并扩展至野生型序列之外，从而可以添加其它半胱氨酸)。在一些实施方式中，所述铰链区由SEQ ID NO：1(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)组成。在一些实施方式中，SEQ ID NO：1是核心铰链区，并且所述核心铰链区基本由SEQ ID NO：1组成。在一些实施方式中，所述核心铰链区由SEQ ID NO：1组成。在以上提及的描述中，半胱氨酸的数目与肽链单一铰链区中半胱氨酸的数目有关。将理解铰链二聚体形式中半胱氨酸的数目(其中肽链彼此交联)将是2倍多，这是因为所提及的半胱氨酸是包括两个半胱氨酸的二硫键的每个部分。
在一些实施方式中，Mb构建体含有具有不同接头长度的抗原结合scFv，其可以处于VL-VH或者VH-VL取向中的任一个。本文所提供的有关一种取向的任何发明公开还考虑了相反取向和两种取向。在一些实施方式中，表0.1中所述的任何铰链序列可以增加至scFv的C末端。在一些实施方式中，来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的任何CH3域可以增加至scFv和适当铰链的C末端。在一些实施方式中，为了确保适当的二硫键合，将第一铰链半胱氨酸(通常与天然IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体中的轻链配对的半胱氨酸)突变为丝氨酸或丙氨酸或者其它适当的氨基酸以防止二硫键混杂(二硫键错配，disulfide scrambling)和/或多联体化(concatemerization)。在一些实施方式中，为了减少半分子的存在或者防止半分子的形成并确保最优的体内稳定性，所述铰链区可以含有至少3个二硫键，在一些实施方式中，它可以具有更多二硫键。在一些实施方式中，至少3个二硫键存在于铰链中，其彼此之间位于适当的距离，并且包含这些二硫键以防止不正确的二硫键形成和保证正确的二硫键形成。在一些实施方式中，铰链中的3个二硫键彼此之间位于适当的距离，并且包含这些二硫键以用于蛋白质体内稳定性和通过肝脏清除，而不是肾脏清除。在一些实施方式中，在铰链中提供了至少3个二硫键(例如，4个或更多)，从而在所述二硫键温和还原后，提供使用半胱氨酸作为药物、金属螯合剂、放射性核素、放射性同位素、螯合剂的位点特异性结合(然后将放射性同位素连接至螯合剂)或荧光染料(使用半胱氨酸作为连接位点)的连接柄(handle)。如本领域技术人员所理解的，每个单一二硫键的存在表示存在两个半胱氨酸，铰链的每条肽序列上存在一个。
在一些实施方式中，构建Mb以包含本文所提供的任何铰链部分并保留与亲代抗体类似(或相同的)亲合力。在一些实施方式中，可以将如上所述构建的Mb工程设计以包含两个不同的抗原结合域。
在一些实施方式中，可以通过除去铰链区中的第一半胱氨酸获得对于抗原结合构建体优良的铰链，如以上表0.1和以下实施例中所提及的。因此，在一些实施方式中，可以提供其中除去该半胱氨酸(其否则将存在于天然铰链中)或将其改变为另一种残基(例如，不能形成共价键的残基)的铰链区。在一些实施方式中，在人IgG1背景中，或者在表0.1中所提及的位置包含半胱氨酸的任何其它铰链区中(例如，在γ2EH2中改变的γ2EH1(Cys至Ser)和在γ2NH2中改变的γ2NH1(Cys至Ser))做出这种调整。
在一些实施方式中，提供了氨基酸铰链区，其包含SEQ ID NO：1的序列(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)。Xn1可以是不形成共价交联键的任何氨基酸。在一些实施方式中，Xn2是以下中的任一个：A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。Xn3可以是任何氨基酸。Xn4是任何氨基酸。Xn5是任何氨基酸。在一些实施方式中，Xn1包含丝氨酸或丙氨酸(SEQ ID NO：235)。在一些实施方式中，Xn1包含丝氨酸(SEQ ID NO：210)。在一些实施方式中，Xn1包含丙氨酸(SEQ ID NO：211)。在一些实施方式中，Xn1包含T(SEQ ID NO：236)。在一些实施方式中，SEQ ID NO：1中改变的第一半胱氨酸是γ2域中的半胱氨酸。在一些实施方式中，所述氨基酸铰链区还在SEQ ID NO：1(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)之前包含其它氨基酸。
在Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C(SEQ ID NO：1)的一些实施方式中，Xn1不与另一种氨基酸形成共价交联键(SEQ ID NO：191)。在一些实施方式中，Xn1不是半胱氨酸(SEQ ID NO：192)。在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，Xn1是以下中的一个：A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V(SEQ ID NO：193)。在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，Xn2是P、V或E(SEQ ID NO：194)。在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，Xn4是P、V或E(SEQ ID NO：196)。在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，Xn4是P或V(SEQ ID NO：197)。在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，Xn2是P或V(SEQ ID NO：195)。在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，Xn3是P或E(SEQ ID NO：198)。在SEQID NO：1的一些实施方式中，Xn5是P或E(SEQ ID NO：199)。在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，Xn3是P或E，并且Xn5是P或E(SEQ ID NO：237)。在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，Xn2Xn3是VE(SEQ ID NO：201)。在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，Xn2Xn3是PP(SEQ ID NO：202)。在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，Xn4Xn5是VE(SEQ ID NO：203)。在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，Xn4Xn5是PP(SEQ ID NO：204)。在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，Xn2Xn3是VE和Xn4Xn5是PP(SEQ ID NO：205)。在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，Xn2Xn3是VE或PP(SEQ ID NO：238)。在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，Xn2Xn3是VE(SEQ ID NO：239)。
在一些实施方式中，任何以上提及的铰链区还包含Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C(SEQ ID NO：1)中最后一个半胱氨酸C末端的下部铰链或延伸序列。在一些实施方式中，可以使用任何下部铰链区。在一些实施方式中，任何以上提及的铰链区还包含Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C(SEQ IDNO：1)中最后一个半胱氨酸C末端的延伸或下部铰链序列。
在一些实施方式中，SEQ ID NO：1和/或2的铰链区是核心铰链区。在一些实施方式中，所述铰链还包含邻近于所述核心铰链区的上部铰链区。在一些实施方式中，所述铰链还包含邻近于所述核心铰链区的下部铰链或延伸区。在一些实施方式中，所述氨基酸铰链区还包含邻近于所述核心铰链区的上部铰链区。
在一些实施方式中，所述氨基酸铰链区包含以下序列：SCVECPPCP(SEQ ID NO：56)。在一些实施方式中，所述氨基酸铰链区包含以下序列：ERKSCVECPPCP(SEQ ID NO：167)。在一些实施方式中，所述氨基酸铰链区包含以下序列：EPKSSDKTHTCPPCPPC(SEQ IDNO：168)。在一些实施方式中，所述氨基酸铰链区包含以下序列中的至少一个：ERKSCVECPPCPGGGSSGGGSG(SEQ ID NO：34)或ERKSCVECPPCPAPPVAGP(SEQ ID NO：33)。在一些实施方式中，所述氨基酸铰链区包含至少TCPPCPPC(SEQ ID NO：166)。在一些实施方式中，所述氨基酸铰链区包含至少EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG(SEQ ID NO：26)或EPKSSDKTHTCPPCPPCAPELLGGP(SEQ ID NO：25)。
在一些实施方式中，如表0.1和3所示(例如，γ1EH1至γ1EH2)，通过除去分别负责连接IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链和轻链的铰链半胱氨酸，可以提供优良的铰链。此外，在一些实施方式中，使用每条链具有至少3个半胱氨酸(例如，γ1EH3、γ1EH4和γ1EH5)的核心区可以导致产生优良的构建体。在一些实施方式中，如表0.1和3所示(例如，γ1EH1至γ1EH2)，可以通过从上部铰链区除去半胱氨酸提供铰链。
在一些实施方式中，这些构建体可以描述为包含SEQ ID NO：2的序列(Xn1Xn2Xn3Xn 4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)的氨基酸铰链区，其中Xn1是不与另一种氨基酸形成共价交联键的任何氨基酸，其中Xn2是任何氨基酸，其中Xn3是任何氨基酸，其中Xn4是任何氨基酸，其中Xn5是任何氨基酸，其中Xn6是任何氨基酸，其中Xn7是任何氨基酸，其中Xn8是任何氨基酸，其中Xn9是任何氨基酸，并且其中Xn10是任何氨基酸(SEQ ID NO：240)。
在一些实施方式中，这些构建体可以描述为包含SEQ ID NO：2的序列(Xn1Xn2Xn3Xn 4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)的氨基酸铰链区，其中Xn1可以是任何氨基酸，其中Xn2可以是任何氨基酸，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，其中Xn5可以是任何氨基酸，其中Xn6可以是除半胱氨酸以外的任何氨基酸除，其中Xn7可以是任何氨基酸，其中Xn8可以是任何氨基酸，其中Xn9可以是任何氨基酸，并且其中Xn10可以是任何氨基酸(SEQ ID NO：241)。
在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，Xn1不是半胱氨酸(SEQ ID NO：213)。在SEQ IDNO：2的一些实施方式中，Xn1是丝氨酸或丙氨酸(SEQ ID NO：242)。在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，Xn2不是半胱氨酸(SEQ ID NO：214)。在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，Xn2是D(SEQ ID NO：215)。在一些实施方式中，Xn3是K(SEQ ID NO：216)。在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，Xn4是T(SEQ ID NO：217)。在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，Xn5是H(SEQ ID NO：218)。在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，Xn6是T(SEQ ID NO：219)。在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，Xn7是P或V(SEQ ID NO：220)。在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，Xn8是P或E(SEQID NO：221)。在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，Xn9是P或V(SEQ ID NO：222)。在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，Xn10是P或E(SEQ ID NO：223)。在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，Xn2是D，Xn3是K，Xn4是T，Xn5是H，Xn6是T，Xn7是P或V，Xn8是P或E并且Xn9是P或V(SEQ ID NO：243)。
在一些实施方式中，所述氨基酸铰链区还包含Xn11Xn12C序列。在一些实施方式中，这可以紧密连接至SEQ ID NO：1(SEQ ID NO：244)或SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：245)中的C末端半胱氨酸。在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，Xn11可以是任何氨基酸，并且Xn12可以是任何氨基酸(SEQ ID NO：245)。在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，Xn11是P或V，并且其中Xn12是P或E(SEQ ID NO：246)。在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，Xn1是丝氨酸，Xn2是D，Xn3是K，Xn4是T，Xn5是H，Xn6是T，Xn7是P，Xn8是P，Xn9是P，并且Xn10是P(SEQ ID NO：247)。
在一些实施方式中，在任何铰链序列之前可以有任何数目的初始氨基酸。因此，可以在所提及的序列(如SEQ ID NO：1和/或NO：2)之前，将其它氨基酸接头或间隔子加入所述分子。在一些实施方式中，在任何铰链序列之后可以有任何数目的其它氨基酸。因此，可以在所提及的序列(如SEQ ID NO：1和/或NO：2)之后，将其它氨基酸接头或间隔子加入所述分子。
在一些实施方式中，所述铰链区包含以下序列中的至少一个：CPPCPPC(SEQ IDNO：52)、CPPCVECPPC(SEQ ID NO：53)或CPPCPPCPPC(SEQ ID NO：54)。在一些实施方式中，所述铰链区包含以下序列中的至少一个：ERKSCVECPPCPGGGSSGGGSG(SEQ ID NO：34)、EPKSSDKTHTCPPCPPC(SEQ ID NO：168)、EPKSSDKTHTCPPCVECPPC(SEQ ID NO：169)或EPKSSDKTHTCPPCPPCPPC(SEQ ID NO：170)。在一些实施方式中，所述铰链区包含以下序列中的至少一个：EPKSSDKTHTCPPCPPCGGGSSGGGSG(SEQ ID NO：26)、EPKSSDKTHTCPPCVECPPCGGGSSGGGSG(SEQ ID NO：28)或EPKSSDKTHTCPPCPPCPPCGGGSSGGGSG(SEQ ID NO：30)。
在一些实施方式中，所述下部铰链区/序列可以是延伸序列(例如，8-25个氨基酸，如8-20、10-25、10-22、12-20、14-16、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸)。表0.1和表3显示了下部铰链的实施例。在一些实施方式中，所述下部铰链可以是来自γ1、γ2、γ3或γ4的天然下部铰链。在一些实施方式中，可以具有天然铰链序列并且添加一个或多个间隔子氨基酸(例如，1、2、3、4或更多个氨基酸，如G或S)。
在一些实施方式中，氨基酸铰链区包含以下中至少一个的核心铰链序列：CVECPPCP(SEQ ID NO：57)、CPPCPPC(SEQ ID NO：52)、CPPCPPCPPC(SEQ ID NO：54)，或者CPPCVECPPC(SEQ ID NO：53)，其连接至ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：48)或EPKSSDKTHT(SEQID NO：46)的上部铰链序列。
在一些实施方式中，可以对本文所述的任何实施方式修改或添加以下选择中的任何一个或多个。
在一些实施方式中，所述铰链区包含至少3个半胱氨酸(在每条链上，在二聚体铰链构建体中在两条链之间总计至少6个半胱氨酸)。在一些实施方式中，所述铰链区包含至少4个半胱氨酸(在每条链上)。在一些实施方式中，所述铰链区包含至少5个半胱氨酸(在每条链上)。在一些实施方式中，存在6、7、8、9、10或更多个半胱氨酸(在每条链上)。在一些实施方式中，所述铰链区总体上具有以上提及的数目的半胱氨酸(在每条链上和/或在二聚体构建体中)。在一些实施方式中，在所述核心铰链区中存在所有提及的半胱氨酸。在一些实施方式中，在所述核心铰链区中存在所有提及的半胱氨酸，并且在上部铰链区和/或下部铰链区中不存在其它半胱氨酸。在一些实施方式中，所述半胱氨酸以重复“CXX”基序(如CXXCXXCXX(SEQ ID NO：171)或CXXCXX(SEQ ID NO：172)或CXXCXXCXXCXX(SEQ ID NO：173))在整个氨基酸铰链区中分布。在一些实施方式中，所述半胱氨酸以重复CXX基序在整个核心铰链区中分布。在一些实施方式中，所述基序重复1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。在一些实施方式中，每个X可以是P、V或E(SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173)。在一些实施方式中，X不是半胱氨酸(SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：250)。
在一些实施方式中，所述核心铰链区每条链包含至少3个半胱氨酸，从而在所述核心铰链区内形成至少3个二硫键。在一些实施方式中，所述构建体在哺乳动物细胞中的表达要好得多，并且提供了更高的滴度以及较少的聚集和更均一的产物。在一些实施方式中，存在于所述核心铰链区中的每个半胱氨酸可以与其在铰链中的配对的链上的相应半胱氨酸形成二硫键。在一些实施方式中，所述二硫键在两个单独的蛋白链(分别为铰链区)上相应的半胱氨酸之间。在一些实施方式中，形成至少3个二硫键，例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。在一些实施方式中，能够形成至少3个二硫键，例如，可以在所述结构内同时形成3、4、5、6、7、8、9、10或更多个二硫键。
在一些实施方式中，所述核心铰链区的第一残基是丝氨酸。在一些实施方式中，所述核心铰链区包含SCVECPPCP(SEQ ID NO：56)。
在一些实施方式中，对于任何构建体的CH3域可以来自γ1、γ2或γ3及其任何天然存在的等位基因。如本文所使用的，“γ”是伽马的缩写。
在一些实施方式中，所述延伸或下部铰链区包含S、G、A、P或V中的至少一个。在一些实施方式中，所述延伸序列包含至少GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：59)。在一些实施方式中，所述延伸或下部铰链区包含至少APPVAGP(SEQ ID NO：60)。在一些实施方式中，所述下部铰链区包含以下序列中的至少一个：GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：59)或APPVAGP(SEQ ID NO：60)。在一些实施方式中，所述下部铰链序列可以是GS接头、延伸序列和/或来自γ1、γ2、γ3和γ4的任何天然下部铰链区。
性质
在一些实施方式中，本文所提供的铰链可以使得在任何微抗体或其它抗原结合构建体组合物中形成和/或存在较低百分比的半分子。例如：小于7％的所述组合物可以是半分子，包括以下范围，如小于6、5、4、3、2、1和/或0.5％的组合物是半分子。
在一些实施方式中，当所述铰链位于微抗体内时，并且当将所述微抗体施用于人受试者时，所述微抗体从所述受试者中的清除可以通过肝脏和/或肾脏发生。在一些实施方式中，通过肝脏的清除为至少10％或更高，例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99或100％。在一些实施方式中，当位于微抗体内时，并且当将所述微抗体施用于人受试者时，所述微抗体从所述受试者中的清除可以主要通过肾脏发生。在一些实施方式中，通过肾脏清除了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍的所述抗体。
在一些实施方式中，在微抗体组合物中存在小于30％的微抗体聚集。在一些实施方式中，在微抗体组合物中存在小于20％的微抗体聚集。在一些实施方式中，在微抗体组合物中存在小于10％的微抗体聚集。在一些实施方式中，在微抗体组合物中存在小于5％的微抗体聚集。在一些实施方式中，在微抗体组合物中存在小于1％的微抗体聚集。
当所述微抗体作为二聚体在体内循环中存在时，那么预测蛋白质清除主要通过肝脏发生。相反，当存在半分子时，那么它的清除将通过肾。因此，在一些实施方式中，以上清除方面是表征受试者体内存在的所得半分子的量的方法，从而允许确定所施用的全分子是否在体内仍为全分子，或者它是否分解为半分子。在一些实施方式中，所述微抗体组合物是其中与通过肾脏的清除相比，通过肝脏的清除相对较高，并且所述微抗体的肿瘤吸收相对较高的组合物。在一些实施方式中，肾脏与肝脏的比值小于1。在一些实施方式中，通过肝脏所发生的吸收比通过肾脏的多至少1％，例如，通过肝脏所发生的吸收比通过肾脏的多至少1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多。在一些实施方式中，肾脏与肝脏的吸收为0.9：1、1：10、1：100、1：1000、1：10,000等。在一些实施方式中，本文所提供的多种铰链构建体具有比来自IgG1的EH1铰链更低的肾脏清除。
在一些实施方式中，IgG1铰链区(γ1EH2)中第一铰链半胱氨酸向丝氨酸突变以预防与其它不成对的半胱氨酸的不期望的相互作用，从而产生了具有更好体外谱(体外分布)的蛋白质。然而，与肝脏相比，通过肾脏的高清除可以指示蛋白质体内的不稳定性和向半分子的解离。在一些实施方式中，提供了具有IgG2铰链的微抗体，其中所述第一铰链半胱氨酸突变为丝氨酸(γ2EH2等)，并且具有如对约80kDa的蛋白质所预测的，通过肝脏清除的性质。这表示所述分子在体内保持完整。在一些实施方式中，所述分子保持48小时或更长时间完整。
在一些实施方式中，由于不成对的第一铰链半胱氨酸，本文所提供的铰链构建体具有小于9％的半分子。在一些实施方式中，第一半胱氨酸突变为丝氨酸的IgG2铰链具有大于99％的完整二聚体蛋白质，如具有γ2EH2。在一些实施方式中，γ2铰链变体导致较低的肾脏吸收。在一些实施方式中，由huIgGI铰链(γ1EH1)所制备的Mb通过肾脏快速清除，从而导致较低的肿瘤靶向。在一些实施方式中，由作为延伸铰链(γ2EH2)或天然铰链(γ2NH1)中任一个的huIgG2铰链变体所制备的Mb显示出较大的体内稳定性，其具有高肿瘤靶向和较低的肾脏清除。
在一些实施方式中，具有EH2铰链的γ1微抗体正确组装成完整的二聚体分子，但是仅包含2个半胱氨酸导致获得了具有较大量半分子的蛋白。在一些实施方式中，具有EH3铰链的γ1微抗体正确组装成完整的二聚体分子，并且每条链中第3个半胱氨酸的加入导致获得了具有极低水平半分子的蛋白。在一些实施方式中，所述半分子的水平小于15％，例如，存在小于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或小于1％的半分子。
在一些实施方式中，即使所述铰链区已改变并且不同于过去所述的铰链区，但是所述微抗体的CDR、VH/VL或完整氨基酸序列仍以和具有上述式样铰链的抗体(如微抗体)相同的亲合力结合至靶标分子。因此，在一些实施方式中，如本文所提供的铰链的存在不改变或不利地影响所述抗原结合构建体的结合亲合力，同时仍提供一种或多种本文所提供的益处和/或结构。
在一些实施方式中，提供了包含序列Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C(SEQ ID NO：3)的微抗体。在一些实施方式中，SEQ ID NO：3作为所述微抗体的核心铰链区出现。在一些实施方式中，Xn1可以是任何氨基酸或者是无氨基酸，Xn2可以是任何氨基酸，Xn3可以是任何氨基酸，Xn4可以是任何氨基酸，并且Xn5可以是任何氨基酸。在一些实施方式中，Xn1不可以是半胱氨酸，Xn2不可以是半胱氨酸，Xn3不可以是半胱氨酸，Xn4不可以是半胱氨酸，和/或Xn5不可以是半胱氨酸(SEQ ID NO：251)。在一些实施方式中，Xn1是除半胱氨酸以外的任何氨基酸(SEQ ID NO：229)。在一些实施方式中，Xn1是丝氨酸(SEQ ID NO：230)。
在一些实施方式中，提供了包含序列Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5CXn6(SEQ ID NO：4)的微抗体。在一些实施方式中，SEQ ID NO：4作为所述微抗体的核心铰链区出现。在一些实施方式中，Xn1可以是任何氨基酸或者是无氨基酸，Xn2可以是任何氨基酸，Xn3可以是任何氨基酸，Xn4可以是任何氨基酸，并且Xn5可以是任何氨基酸(SEQ ID NO：252)。在一些实施方式中，Xn1不可以是半胱氨酸，Xn2不可以是半胱氨酸，Xn3不可以是半胱氨酸，Xn4不可以是半胱氨酸，和/或Xn5不可以是半胱氨酸(SEQ ID NO：253)。在一些实施方式中，Xn1是除半胱氨酸以外的任何氨基酸(SEQ ID NO：254)。在一些实施方式中，Xn1是丝氨酸(SEQ ID NO：255)。在一些实施方式中，Xn6可以是任何氨基酸，无氨基酸或P(SEQ ID NO：256)。
在一些实施方式中，本文所提供的任何氨基酸铰链区或完整铰链在抗体内。在一些实施方式中，本文所提供的任何氨基酸铰链区或完整铰链在抗体结合片段内。在一些实施方式中，本文所提供的任何氨基酸铰链区或完整铰链在微抗体内。
在一些实施方式中，本文所提供的任何氨基酸铰链区或完整铰链在单特异性抗体内。
在一些实施方式中，本文所提供的任何氨基酸铰链区或完整铰链在双特异性抗体内。在一些实施方式中，本文所提供的任何氨基酸铰链区或完整铰链以1:1的比值组装。在一些实施方式中，本文所提供的任何氨基酸铰链区或完整铰链是作为双特异性构建体的抗体片段的一部分。在一些实施方式中，所述双特异性抗体是微抗体。
特异性抗原结合构建体
本文描述了结合至靶标的抗原结合构建体。抗原结合构建体是包含特异性结合至靶标分子或者与靶标分子免疫反应的免疫球蛋白或免疫球蛋白-相关分子的一个或多个部分的分子。在一些实施方式中，本文所提供的任何铰链实施方式可以应用于任何所期望的抗原结合构建体。在一些实施方式中，本文所提供的任何铰链实施方式可以应用于微抗体。在一些实施方式中，本文所提供的任何铰链实施方式可以应用于结合至CD8、CD3、5T4、PSCA或PSMA的微抗体。图70显示了PSMA抗原的非限制性实施方式。图71显示了PSCA抗原的非限制性实施方式。图72显示了5T4抗原的非限制性实施方式。图73和74显示了CD8抗原的一些非限制性实施方式。图75-78显示了CD3抗原的一些非限制性实施方式。在一些实施方式中，本文所提供的任何铰链实施方式可以应用于特异性和/或选择性结合至CD8、CD3、5T4、PSCA或PSMA的微抗体。在一些实施方式中，表0.1或3中所提供的任何铰链实施方式可以应用于结合至CD8、CD3、5T4、PSCA或PSMA的微抗体。在一些实施方式中，任何完整铰链实施方式可以应用于结合至CD8、CD3、5T4、PSCA或PSMA的微抗体。在一些实施方式中，任何上部铰链实施方式可以应用于结合至CD8、CD3、5T4、PSCA或PSMA的微抗体。在一些实施方式中，任何核心铰链实施方式可以应用于结合至CD8、CD3、5T4、PSCA或PSMA的微抗体。在一些实施方式中，任何下部铰链实施方式可以应用于结合至CD8、CD3、5T4、PSCA或PSMA的微抗体。在一些实施方式中，任何上部和核心铰链实施方式可以应用于结合至CD8、CD3、5T4、PSCA或PSMA的微抗体。在一些实施方式中，任何核心和下部铰链实施方式可以应用于结合至CD8、CD3、5T4、PSCA或PSMA的微抗体。在一些实施方式中，任何上部和下部铰链实施方式可以应用于结合至CD8、CD3、5T4、PSCA或PSMA的微抗体。
以下提供了其它抗体片段，如微抗体。所述抗体片段可以用于(例如)成像或治疗目的。在附图中显示了和/或在下表0.2中列出了示例性微抗体的示意图(以M1取向或M2取向)。
表0.2微抗体(N-末端至C-末端)-M1结构取向
表0.2(续)微抗体(N-至C-末端)-M2结构取向
表0.2中显示了可以在微抗体中使用的单体的序列排布(表0.2)。该表的每一行代表单体构建体的序列，其从左至右表示从N-末端至C-末端。在一些实施方式中，所显示的每个单体构建体的序列直接彼此连接。因此，在一些实施方式中，所述构建体可以包含表0.2中单行上的任何构建体。在一些实施方式中，所述构建体可以包含表0.2中的任意组合。在一些实施方式中，例如，第一行第3列中的第一项可以与第一行第4列至第一行第5列、至第一行第6-8列、至第一行第9列组合。在一些实施方式中，第3列和第5列可以彼此交换。在一些实施方式中，第一行第3列中的第一项可以与第一行第4列至第二行第5列、至第二行第6-8列、至第二行第9列组合。因此，表格代表了单行内和不同行内(并且具有列交换)的所有可能的组合，
在一些实施方式中，抗CD8的抗原结合构建体包含SEQ ID NO：75中HCDR1的重链CDR1(HCDR1)；SEQ ID NO：76中HCDR2的重链CDR2(HCDR2)；SEQ ID NO：77中HCDR3的重链CDR3(HCDR3)；SEQ ID NO：78中LCDR1的轻链CDR1(LCDR1)；SEQ ID NO：79中LCDR2的轻链CDR2(LCDR2)；和/或SEQ ID NO：80中LCDR3的轻链CDR3(LCDR3)。在一些实施方式中，抗PSMA的抗原结合构建体包含SEQ ID NO：81中HCDR1的重链CDR1(HCDR1)；SEQ ID NO：82中HCDR2的重链CDR2(HCDR2)；SEQ ID NO：83中HCDR3的重链CDR3(HCDR3)；SEQ ID NO：84中LCDR1的轻链CDR1(LCDR1)；SEQ ID NO：85中LCDR2的轻链CDR2(LCDR2)；和/或SEQ ID NO：86中LCDR3的轻链CDR3(LCDR3)。在一些实施方式中，抗5T4的抗原结合构建体包含SEQ ID NO：87中HCDR1的重链CDR1(HCDR1)；SEQ ID NO：88中HCDR2的重链CDR2(HCDR2)；SEQ ID NO：89中HCDR3的重链CDR3(HCDR3)；SEQ ID NO：90中LCDR1的轻链CDR1(LCDR1)；SEQ ID NO：91中LCDR2的轻链CDR2(LCDR2)；和/或SEQ ID NO：92中LCDR3的轻链CDR3(LCDR3)。在一些实施方式中，抗PSCA的抗原结合构建体包含SEQ ID NO：93中HCDR1的重链CDR1(HCDR1)；SEQ IDNO：94中HCDR2的重链CDR2(HCDR2)；SEQ ID NO：95中HCDR3的重链CDR3(HCDR3)；SEQ ID NO：96中LCDR1的轻链CDR1(LCDR1)；SEQ ID NO：97中LCDR2的轻链CDR2(LCDR2)；和/或SEQ IDNO：98中LCDR3的轻链CDR3(LCDR3)。在一些实施方式中，抗CD3的抗原结合构建体包含图65B或65C中HCDR1的重链CDR1(HCDR1)；图65B或65C中HCDR2的重链CDR2(HCDR2)；图65B或65C中HCDR3的重链CDR3(HCDR3)；图65B或65C中LCDR1的轻链CDR1(LCDR1)；图65B或65C中LCDR2的轻链CDR2(LCDR2)；和/或图65B或65C中LCDR3的轻链CDR3(LCDR3)。表8中显示了可以与本文所提供的任何一种或多种铰链序列一起使用的CDR序列的一些实施方式。
表8CDR序列
这些构建体可以处于本文所提供的任何形式，包括微抗体、scFv等。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体包含6、5、4、3、2或1个上述CDR(在图41、48、55、61、65B或65C中显示了CDR的一些实施方式)。在一些实施方式中，本文所提供的任何铰链部分可以与本文所提供的任何CDR组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何上部铰链部分可以与本文所提供的任何CDR组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何核心铰链部分可以与本文所提供的任何CDR组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何下部铰链部分可以与本文所提供的任何CDR组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何完整铰链部分可以与本文所提供的任何CDR组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何上部和核心铰链部分可以与本文所提供的任何CDR组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何核心和下部铰链部分可以与本文所提供的任何CDR组合。在一些实施方式中，任何基于这些CDR的实施方式可以是微抗体的一部分。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体包含重链CDR3(HCDR3)。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体特异性结合至靶标分子。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体与具有本文所提供的CDR的一个或多个抗体竞争结合。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体包含至少3个本文所提及的重链CDR。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体包含重链CDR3。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体还包含本文所提供的重链CDR2序列中的任一个。在一些实施方式中，任何这些实施方式可以应用于结合至CD8、CD3、5T4、PSCA或PSMA的微抗体。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体是人或人源化的。当在微抗体背景中使用时，术语人不表示所述构建体与在人中天然所发现的那些相同，而是所述构建体具有人序列。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体包含至少一个人框架区(例如，在图41、48、55、61、65B或65C中所示的CDR之前、之间和之后显示的那些部分)或者与人框架区具有至少约80％序列同一性，例如，至少约80％、85％、90％、93％、95％、97％或99％的同一性的框架区。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体包含8、7、6、5、4、3、2或1个所列的FR。在一些实施方式中，本文所提供的任何铰链部分可以与本文所提供的任何FR组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何上部铰链部分可以与本文所提供的任何FR组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何核心铰链部分可以与本文所提供的任何FR组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何下部铰链部分可以与本文所提供的任何FR组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何完整铰链部分可以与本文所提供的任何FR组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何上部和核心铰链部分可以与本文所提供的任何FR组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何核心和下部铰链部分可以与本文所提供的任何FR组合。在一些实施方式中，任何基于这些FR的实施方式可以是微抗体的一部分。在一些实施方式中，任何这些实施方式可以应用于结合至CD8、CD3、5T4、PSCA或PSMA的微抗体。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体具有SEQ ID NO：14(PSMA)、16或99(CD8)、18或102(5T4)、68(PSCA)或者20或104(或者图65B和65C)(CD3)中的重链可变区的重链可变区。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体具有重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：14(PSMA)、16或99(CD8)、18或102(5T4)、68(PSCA)或者20或104(或者图65B和65C)(CD3)具有至少约80％同一性，例如，至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体具有包含SEQ ID NO：13(PSMA)、15(CD8)、17或100或101(5T4)、67(PSCA)或者19或103(或者图65B和65C)(CD3)的轻链可变区。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体具有轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：13(PSMA)、15(CD8)、17或100或101(5T4)、67(PSCA)或者19或103(或者图65B和65C)(CD3)具有至少约80％同一性，例如，至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体是人抗原结合构建体并且具有重链可变区、轻链可变区或者重链和轻链(至少与至少以上提及的重链和/或轻链可变序列相同)。在一些实施方式中，以上实施方式中的任一个与本文所提供的铰链实施方式的任一个组合，包括，例如，在微抗体背景中。在一些实施方式中，本文所提供的任何铰链部分可以与本文所提供的任何VH和VL对组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何上部铰链部分可以与本文所提供的任何VH和VL对组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何核心铰链部分可以与本文所提供的任何VH和VL对组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何下部铰链部分可以与本文所提供的任何VH和VL对组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何完整铰链部分可以与本文所提供的任何VH和VL对组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何上部和核心铰链部分可以与本文所提供的任何VH和VL对组合。在一些实施方式中，本文所提供的任何核心和下部铰链部分可以与本文所提供的任何VH和VL对组合。在一些实施方式中，任何基于这些VH和VL对的实施方式可以是微抗体的一部分。在一些实施方式中，任何这些实施方式可以应用于结合至CD8、CD3、5T4、PSCA或PSMA的微抗体。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体包含可检测标志物。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体包含治疗剂。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体是二价的。二价抗原结合构建体可以包含至少第一抗原结合域，例如，第一scFv，和至少第二抗原结合域，例如，第二scFv。在一些实施方式中，二价抗原结合构建体是包含至少两个单体，例如，至少2、3、4、5、6、7或8个单体的多聚体，每个单体具有抗原结合域。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体是微抗体。在一些实施方式中，在所述二价构建体中包含了本文所提供的铰链的一个或多个子部分。所述微抗体可以包含本文所提供的任何CDR和重链可变区和/或轻链可变区实施方式(例如图41、48、55、61、65B或65C中所提供的CDR序列)。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体是一价scFv。在一些实施方式中，提供了一价scFv，其包含图41、48、55、61、65B或65C的HCDR1中的重链CDR1(HCDR1)、图41、48、55、61、65B或65C的HCDR2中的重链CDR2(HCDR2)，图41、48、55、61、65B或65C的HCDR3中的HCDR3，图41、48、55、61、65B或65C的LCDR1中的轻链CDR1(LCDR1)、图41、48、55、61、65B或65C的LCDR2中的轻链CDR2(LCDR2)和图41、48、55、61、65B或65C的LCDR3中的轻链CDR3(LCDR3)。在一些实施方式中，所述一价scFv包含图36A、36B、36C、36D、36E、65B或65C中的重链可变区的重链可变区。在一些实施方式中，所述一价scFv包含图36A、36B、36C、36D、36E、65B或65C中的轻链可变区的轻链可变区。在一些实施方式中，所述一价scFv包含图66、68或69中重链可变区的重链可变区，和图67或69中的轻链可变区的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体是双特异性的。双特异性构建体可以包含至少第一结合域，例如，特异性结合至第一表位的scFv，和至少第二结合域，例如，特异性结合至第二表位的scFv。因此，双特异性抗原结合构建体可以结合至两个或更多个表位。在一些实施方式中，所述第一表位和所述第二表位是相同抗原的一部分，并且因此所述双特异性抗原结合构建体可以结合至相同抗原的两个表位。在一些实施方式中，所述第一表位是第一抗原的一部分，并且所述第二表位是第二抗原的一部分，并且因此所述双特异性抗原结合构建体可以结合至两个不同抗原。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体同时结合至两个表位。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体具有SEQ ID NO：14、16、18、20、68、99、102或104中重链可变区的重链可变区和/或图65B和65C中的序列。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体具有重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：14、16、18、20、68、99、102或104和/或图65B和65C中的序列具有至少约80％同一性，例如，至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体具有轻链可变区，其包含SEQ ID NO：13、15、17、19、67、100、101或103和/或图65B和65C中的序列。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体具有轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：13、15、17、19、67、100、101或103和/或图65B和65C中的序列具有至少约80％同一性，例如，至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体是人抗原结合构建体并且具有重链可变区、轻链可变区或者重链和轻链(至少与至少以上提及的重链和/或轻链可变序列相同)。
本文所提供的一些实施方式包含与本文所提供的一个或多个抗原结合构建体竞争结合靶标分子的抗原结合构建体，并且包含一个或多个本文所提供的铰链子部分(如表0.1中)。在一些实施方式中，竞争抗原结合构建体结合至靶标分子上的表位(与参考抗原结合构建体相同)。在一些实施方式中，所述参考抗原结合构建体结合至靶标分子的第一表位，并且所述竞争抗原结合构建体结合至靶标分子的第二表位，但是干扰所述参考抗原结合构建体与靶标分子的结合，例如，通过所述参考抗原结合构建体的空间阻断结合，或者通过在靶标分子中引起构象变化。在一些实施方式中，所述第一表位与所述第二表位重叠。
在一些实施方式中，所述scFv和/或微抗体形式对诊断成像和特定治疗应用具有有利的药物动力学特征，同时维持了亲本抗体的高结合亲合力和特异性。与使用全长亲本抗体成像相比，对于这些片段，药物动力学是更期望的，因为它们能够靶向抗原，然后快速清除系统以用于快速高对比度成像。在一些实施方式中，微抗体较短的循环半衰期允许在微抗体注射后约6-48 72小时的时间范围内最优成像(取决于清除和抗原“库(sink)”水平以及螯合至Mb的同位素的半衰期)。快速血液清除以及更好的组织渗透可以使得能够在同一天成像，相对于患者护理管理，这可以在临床上提供重要的优势。
在一些实施方式中，所述抗体片段可以包含来自PSCA、5T4、PSMA、CD3或CD8抗体的1、2或3个可变轻链区CDR和/或1、2或3个可变重链区CDR。例如，抗体片段可以含有鼠科形式的PSCA、5T4、PSMA、CD3或CD8抗体的1、2或3个可变区CDR和/或1、2或3个可变重链区CDR。在一些实施方式中，抗体片段包含来自人源化PSCA、5T4、PSMA、CD3或CD8抗体的可变重链或轻链区的一个或多个CDR区。
在一些实施方式中，结合PSCA抗原的抗原结合构建体可以是抗体、微抗体和/或其片段，如scFv。图29B-29D、36E、60(SEQ ID NO：125和126)、61(SEQ ID NO：126)、62(SEQ IDNO：127)、63(SEQ ID NO：128)、64(SEQ ID NO：129)、65A(SEQ ID NO：130)中显示了抗PSCA的抗原结合构建体的一些非限制性实施方式。在一些实施方式中，结合5T4抗原的抗原结合构建体可以是抗体、微抗体和/或其片段，如scFv。图28B-28E、32、36C、54(SEQ ID NO：119和120)、55(SEQ ID NO：120)、56(SEQ ID NO：121)、57(SEQ ID NO：122)、58(SEQ ID NO：123)、59(SEQ ID NO：124)、67、68中显示了抗5T4的抗原结合构建体的一些非限制性实施方式。在一些实施方式中，结合PSMA抗原的抗原结合构建体可以是抗体、微抗体和/或其片段，如scFv。在图5B-5E、7C-7E、21B-21E、34A-34F、35A-35C、36A、47(SEQ ID NO：112和113)、48(SEQ ID NO：113)、49(SEQ ID NO：114)、50(SEQ ID NO：115)、51(SEQ ID NO：116)、52(SEQID NO：117)、53(SEQ ID NO：118)中显示了抗PSMA的抗原结合构建体的一些非限制性实施方式。在一些实施方式中，结合CD3抗原的抗原结合构建体可以是抗体、微抗体和/或其片段，如scFv。图33、36D、69、65B和65C中显示了抗CD3的抗原结合构建体的一些非限制性实施方式。在一些实施方式中，结合CD8抗原的抗原结合构建体可以是抗体、微抗体和/或其片段，如scFv。图14B、15B、16B-16D、20C-20G、22B、36B、40(SEQ ID NO：105和106)、41(SEQ IDNO：106)、42(SEQ ID NO：107)、43(SEQ ID NO：108)、44(SEQ ID NO：109)、45(SEQ ID NO：110)、46(SEQ ID NO：111)和66中显示了抗CD8的抗原结合构建体的一些非限制性实施方式。
接头的选择
在一些实施方式中，对于单个抗原结合构建体，可以以不同的方式结合重链和轻链可变域。为此，VH和VL域之间不同的接头长度的使用赋予了构象灵活性和移动范围以确保二硫键的形成。
在一些实施方式中，两种接头长度可以是约1至50个氨基酸，例如，2至15、2至14、3至13、4至10或5个氨基酸至8个氨基酸之间(并且包含端点)的某个值。在一些实施方式中，对于微抗体配对内每个接头可以具有相同长度。在一些实施方式中，配对内每个接头可以具有不同的长度。在一些实施方式中，可以使用接头长度配对的任意组合，只要它们允许和/或促进所期望的组合。在一些实施方式中，可以使用修饰的氨基酸。
表0.2提供了微抗体变体。变体表达和结合的产生和测试使得能够鉴别每种新型微抗体的蛋白质产生所需的形式。
在一些实施方式中，所述接头是GlySer接头。所述GlySer接头可以是富含Gly和/或Ser残基的多肽。在一些实施方式中，所述GlySer接头中至少约40％的氨基酸残基是Gly、Ser或Gly和Ser的组合，例如，至少约40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方式中，所述GlySer接头的长度为至少约2个氨基酸，例如，至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40个氨基酸。在一些实施方式中，所述接头基序可以是(G3)Sn或者(G4)Sn(n可以是任何数目的S；并且在一些实施方式中，是1或2)。例如，a)GGGGS5个aa，(SEQ ID NO：66)；b)GGGGSGGGGS 10个aa，(SEQ ID NO：65)；c)GGGGSGGGGSGGGGS 15个aa，(SEQ ID NO：64)；d)GSTSGGGSGGGS 12个aa，(SEQ ID NO：63)；或者e)GSTSGGGSGGGSGGGGSS 18个aa(SEQ ID NO：62)。在一些实施方式中，所述接头包含至少1个苏氨酸。
表0.1和0.2显示了可以在scFv和/或微抗体的一些实施方式中使用的多种任选的序列。在一些实施方式中，所述scFv可以是本文所提供的那些中的任一个，但是具有表0.1中所提供的任何序列。在一些实施方式中，所述微抗体可以是本文所提供的那些中的任一个，但是具有表0.1中整行所提供的任何序列。在一些实施方式中，本文所提供的任何抗原结合构建体可以包含表0.1中所提供的任何铰链序列的子部分。
如本文所述的“微抗体”包括同型二聚体，其中每个单体是通过铰链序列与人CH3域连接的单链可变区片段(scFv)。在一些实施方式中，所述铰链序列是人IgG1铰链序列。在一些实施方式中，所述铰链序列是本文所提供的任何一个或多个铰链序列，如本文所述的和/或表0.1中的那些中的任一个(包括任何子部分或其子部分的组合)。
在一些实施方式中，所述铰链序列是人工铰链序列。在一些实施方式中，所述铰链序列可以是来自四类IgG铰链中任何一个或多个的天然或人工IgG铰链或其子部分或子部分的组合。
在一些实施方式中，所述微抗体序列可以包括CDR和/或FR，和/或类似于本文所述的序列(例如，附图或表0.2中的序列)的可变区序列。在一些实施方式中，所述微抗体具有与本文所述的微抗体的scFv相同的序列(一个CDR、多个CDR、完整一组6个CDR、重链可变区、轻链可变区、重链和轻链可变区等)。
在一些实施方式中，所述单体的多肽包括如表0.2中所示的序列。在一些实施方式中，所述单体的多肽包括与如表0.2所示的VLVH微抗体单体序列具有至少约80％的同一性，例如，至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的序列。
在一些实施方式中，所述微抗体具有与SEQ ID NO：14、16、18、20、68、99、102或104中的重链序列(和/或图65B或65C中的相关序列)和/或SEQ ID NO：13、15、17、19、67、100、101或103中的轻链序列(和/或图65B或65C中的序列)具有至少约80％的同一性，例如，至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93、94、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的可变链区(重链、轻链或者重链和轻链可变区)。
所述scFv可以具有VHVL或VLVH取向。在一些实施方式中，所述VH和VL通过氨基酸接头序列彼此连接在一起。所述氨基酸接头可以是如本文所述的接头。在一些实施方式中，所述接头是富含Gly-Ser的并且长度为约15-20个氨基酸。在另一个实施方式中，所述接头是富含GlySer的并且长度为18个氨基酸。在一些实施方式中，所述接头长度在约1至50个氨基酸，例如，2至30、3至20、4至15或5个氨基酸至8个氨基酸之间(并且包含端点)改变。在一些实施方式中，所述接头是GSTSGGGSGGGSGGGGSS(SEQ ID NO.62)。在一些实施方式中，所述微抗体scFv具有与本文所述的scFv具有至少约80％的同一性，例如，至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93、94、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的序列。所述scFv可以具有VHVL或VLVH取向。
在一些实施方式中，所述微抗体的每个单体从N-末端至C-末端包括以下元件：(a)包含连接至VL域的VH域并且结合至靶标分子的scFv序列，(b)铰链域(例如，与下部铰链和/或延伸区组合的上部铰链和核心铰链区)和(c)人IgG CH3序列。在一些实施方式中，所述微抗体的每个单体包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3域。在一些实施方式中，通过可以由细胞、细胞系或如本文所述的其它适合的表达系统表达的核酸编码所述微抗体。因此，当在细胞或细胞系中表达时，可以将信号序列融合至scFv的N-末端以使得所述微抗体能够分泌。在一些实施方式中，可以使用其它信号序列，如人血清白蛋白(SEQ ID NO：70)。在一些实施方式中，基于用于表达的环境和细胞系，不同的信号序列可以改善分泌。在一些实施方式中，可以使用人免疫球蛋白κ轻链信号序列(SEQ ID NO：69)和/或可以将其包含在编码本文所提供的氨基酸序列的核酸中。在一些实施方式中，基于用于表达的环境和细胞系，可以从表7所示的列表中选择单一序列。
表7信号肽序列
在一些实施方式中，提供了结合至靶标分子的嵌合微抗体。在一些实施方式中，所述嵌合微抗体包含VLVH形式的单体，并且包含含有SEQ ID NO：13、15、17、19、67、100、101或103(和/或图65B或65C中的相关序列)的轻链可变区序列和含有SEQ ID NO：14、16、18、20、68、99、102或104(和/或图65B或65C中的序列)的重链可变区序列或者表0.2中所示的单体，或者与之具有至少约80％同一性，例如，与之具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的序列。在一些实施方式中，所述嵌合微抗体包含VHVL形式的单体，并且包含含有SEQ ID NO：13、15、17、19、67、100、101或103(和/或图65B或65C中的相关序列)的轻链可变区序列和含有SEQ ID NO：14、16、18、20、68、99、102或104(和/或图65B或65C中的相关序列)的重链可变区序列或者表0.2中所示的单体，或者与之具有至少约80％同一性，例如，与之具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的序列。在一些实施方式中，所述微抗体包含图41、48、55、61、65B或65C中所列的一个或多个CDR。在一些实施方式中，所述微抗体包含图36A、36B、36C、36D、36E、66、67、68、69、65B或65C或者表0.2中的一个或多个可变区。
在一些实施方式中，所述微抗体包含图36A、36B、36C、36D、36E、66、68、69、65B或65C中所列的重链可变区。在一些实施方式中，所述微抗体包含图36A、36B、36C、36D、36E、67、69、65B或65C中所列的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述微抗体包含图41、48、55、61、65B或65C中所提供的一个或多个CDR。
核酸
在一些实施方式中，可以通过核酸编码抗原结合构建体的多肽并且可以体内或体外表达，或者可以化学合成这些肽。因此，在一些实施方式中，提供了编码抗原结合构建体的核酸。在一些实施方式中，所述核酸编码微抗体或其它抗原结合构建体的一部分或单体。在一些实施方式中，所述核酸编码两个或更多个单体，例如，至少2个单体。编码多个单体的核酸可以在至少两个单体之间包含核酸切割位点，可以编码两个或更多个单体之间的转录或翻译起始位点和/或可以编码两个或更多个单体之间的蛋白水解靶位点。
在一些实施方式中，表达载体含有编码如本文所公开的抗原结合构建体的核酸。在一些实施方式中，表达载体包括用于哺乳动物表达的pcDNA3.1/myc-His(-)Version A载体(Invitrogen,Inc.)或其变体。pcDNA3.1表达载体的特征在于用于哺乳动物表达的CMV启动子以及哺乳动物(新霉素)和细菌(氨苄西林)选择标志物。在一些实施方式中，表达载体包括质粒。在一些实施方式中，所述载体包括病毒载体，例如，反转录病毒或腺病毒载体。在实施方式中，所述载体包括粘粒、YAC或BAC。
在一些实施方式中，编码至少一种微抗体单体的核苷酸序列包含本文所提供的SEQ ID NO：中的至少一种，其包括本文所公开的结合至CD3、CD8、5T4、PSMA和PSCA的那些，或者对其具有至少约80％同一性，例如，约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93、94、95％、96％、97％、98％、99％或更大的同一性的序列。
细胞系
在一些实施方式中，提供了表达本文所述的至少一种抗原结合构建体的细胞系(其可以包括至少本文所提供的铰链的子部分)。在一些实施方式中，哺乳动物细胞系(例如，CHO-K1细胞系)是表达系统以产生如本文所述的微抗体、scFv或其它抗体。在一些实施方式中，本文所述的微抗体、scFv及其它抗体或抗体片段是非糖基化的，并且不需要哺乳动物表达系统，照此不需要翻译后修饰。因此，在一些实施方式中，将多种哺乳动物或非哺乳动物表达系统中的一种或多种用于产生本文所公开的抗原结合构建体(例如，微抗体)，其包括(但不限于)哺乳动物表达系统(例如，CHO-K1细胞)、细菌表达系统(例如，大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、酵母表达系统(例如，毕赤氏酵母(Pichia)、酿酒酵母(S.cerevisiae))或者任何其它已知的表达系统。其它系统可以包括昆虫细胞和/或植物细胞。
抗原结合构建体修饰
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体包含至少一种修饰。示例性修饰包括(但不限于)已通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割和连接至细胞配体或其它蛋白质修饰的抗原结合构建体。可以通过已知的技术，包括(但不限于)特异性化学切割、乙酰化和衣霉素的代谢合成来进行任何多种化学修饰。在一些实施方式中，所述衍生物可以含有一种或多种非天然氨基酸。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体结合至另一种物质以形成抗靶标结合物。可以通过将抗原结合构建体与脂质、碳水化合物、蛋白质或其它原子和分子连接的已知方法制备本文所述的结合物。在一些实施方式中，使用适合的连接或键，通过位点特异性结合形成结合物。位点-特异性结合更可能保持抗原结合构建体的结合活性。可以将物质通过硫醚键形成结合或连接在还原的抗原结合构建体的铰链区。在一些实施方式中，可以使用酪氨酸结合。用于形成结合物的其它连接或键可以包括(但不限于)共价键、非共价键、二硫键、腙键、酯键、酰胺键、氨基键、亚氨基键、缩氨基硫脲键(thiosemicarbazone linkage)、半卡巴腙键(semicarbazone linkage)、肟键和碳-碳键。在一些实施方式中，在抗原结合构建体中无需包含半胱氨酸或其它连接方面。
可检测标志物
在一些实施方式中，将修饰的抗原结合构建体结合至可检测标志物。如本文所使用的，“可检测标志物”包括在诊断、检测或显像靶标分子、细胞、组织、器官等的位置和/或量中有用的原子、分子或化合物。可以根据本文中的实施方式使用的可检测标志物包括(但不限于)放射性物质(例如，放射性同位素、放射性核素、放射性标记或放射性示踪剂)、染料、造影剂、荧光化合物或分子、生物发光化合物或分子、酶和增强剂(例如，顺磁离子)。另外，一些纳米颗粒，例如量子点和金属纳米颗粒(如下所述)可以适合用作检测剂。在一些实施方式中，所述可检测标志物是吲哚菁绿(ICG)、锆-89、IR800和/或另一种近红外染料。
根据本文的实施方式可以用作可检测标志物的示例性放射性物质包括(但不限于)18F、18F-FAC、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、75Sc、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、90Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111In、123I、124I、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154-158Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra和225Ac。可以用作可检测标志物的示例性顺磁离子物质包括(但不限于)过渡金属和镧系金属的离子(例如，原子序数为6至9、21-29、42、43、44或57-71的金属)。这些金属包括Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的离子。
当所述可检测标志物是放射性金属或顺磁离子时，在一些实施方式中，所述标志物可以与具有长尾(long tail)的试剂反应，所述长尾具有连接至所述长尾用于结合这些离子的一个或多个螯合基团。在一些实施方式中，所述试剂可以具有设计以共价连接抗体片段链的反应基团。所述长尾可以是聚合物，如聚赖氨酸、多糖、聚乙二醇(PEG)或者其它衍生化或可衍生化链，其具有可以结合至用于结合所述离子的螯合基团的侧基(pendantgroup)。根据本文的实施方式可以使用的螯合基团的实例包括(但不限于)乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、DOTA、NOTA、NODAGA、NETA、去铁胺(Df，其还可以被称为DFO)、卟啉、聚胺、冠醚、双-缩氨基硫脲、聚肟等基团。当与非放射性金属，如锰、铁和钆络合时，当与本文所述的抗原结合构建体和载体一起使用时，相同螯合物对于MRI是有用的。大环螯合物，如NOTA、NODAGA、DOTA和TETA分别与多种金属和放射金属(包括但不限于镓、钇和铜的放射性核素)一起是有用的。可以使用其它环状螯合物，如大环聚醚，其对于稳定结合放射性核素，如用于RAIT的镭-223是令人感兴趣的。在某些实施方式中，螯合部分可以用于将PET成像剂，如铝-18F或锆-89复合物，连接至靶标分子以用于在PET分析中使用。
根据本发明公开的实施方式，可以用作可检测标志物的示例性造影剂包括(但不限于)钡、二乙酰氨基三碘苯甲酸盐(泛影酸盐，diatrizoate)、乙碘油(ethiodized oil)、柠檬酸镓、碘卡酸、碘西他酸、碘达胺、胆影酸(iodipamide)、碘沙酸(iodoxamic acid)、碘古酰胺(iogulamide)、iohexyl、碘帕醇(iopamidol)、碘番酸(iopanoic acid)、碘普西酸(ioprocemic acid)、碘西法酸(iosefamic acid)、碘丝酸(ioseric acid)、碘砜葡胺(iosulamide meglumine)、碘琥酸(iosemetic acid)、碘酞硫(iotasul)、碘替酸(iotetricacid)、碘他拉酸(iothalamic acid)、碘曲西酸(iotroxic acid)、碘克沙酸(ioxaglicacid)、羟泛影酸(ioxotrizoic acid)、碘泊酸盐(ipodate)、葡甲胺(meglumine)、甲泛葡胺(metrizamide)、甲泛影酸(metrizoate)、丙碘酮(propyliodone)、氯化亚铊(thallouschloride)或其组合。
根据本发明公开的实施方式，可以用作可检测标志物的生物发光和荧光化合物或分子和染料包括(但不限于)荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、OREGON GREENTM、罗丹明、德克萨斯红、四罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)、Cy3、Cy5等，荧光标志物(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、藻红蛋白(phycoerythrin)等)、通过肿瘤-相关蛋白酶激活的自淬灭荧光化合物、酶(例如，荧光素酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、纳米颗粒、生物素、地高辛(洋地黄毒苷，digoxigenin)或其组合。
根据本发明公开的实施方式，可以用作可检测标志物的酶包括(但不限于)辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶或者β-内酰胺酶。这些酶可以与发色团、荧光化合物或发光化合物组合使用以产生可检测信号。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体结合至纳米颗粒。术语“纳米颗粒”是指以纳米度量其尺寸的微观粒子，例如，至少一个尺寸小于约100nm的粒子。纳米颗粒可以用作可检测物质，这是因为它们足够小以散射可见光而不是吸收可见光。例如，金纳米颗粒具有显著的可见光消光性并且在溶液中显示出深红至黑色。因此，包含结合至纳米颗粒的抗原结合构建体的组合物可以在受试者中用于T细胞的体内成像。在尺寸范围较小的一端，纳米颗粒经常被称为簇。已形成了金属、电介质和半导体纳米颗粒，以及杂化结构(例如，核壳纳米颗粒)。纳米球、纳米棒和纳米杯是几个已生长出的形状。半导体量子点和纳米晶体是其它纳米颗粒类型的实例。当结合至抗原结合构建体时，这些纳米尺度的颗粒可以用作如本文所述的T细胞体内检测的成像剂。
在一些实施方式中，具有稳定铰链将赋予靶向试剂稳定性。在一些实施方式中，这导致了更好的生物分布，更高的灵敏度和/或降低的肾清除率。因此，这些构建体可以更适合于更高度的特定活性。在一些实施方式中，这赋予了显著改善的灵敏度，而对放射敏感性器官的肾脏无高剂量。在一些实施方式中，出于相同的原因—低肾脏吸收，这些构建体更适合于RIT。在一些实施方式中，现在可以使用对半胱氨酸的位点特异性结合，这是因为温和条件下的化学还原将断裂1或2个二硫键以将这些用作柄(handle)，但同时保持其余的二硫键完整。在一些实施方式中，这将保持微抗体结合物的完整性。
治疗剂和组合物
在一些实施方式中，所述药物组合物还可以包含药物可用的载体。药物可用的载体可以是参与将所关心的化合物从一个组织、器官或身体部分携带或输送至另一个组织、器官或身体部分的药物可用的材料、组合物或媒介物。例如，所述载体可以是液体或固体填充剂(填料，filler)、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，或者它们的一些组合。所述载体的每个组分是“药物可用的”，其中它与所述制剂的其他成分相容。它还适合于与它可以遭遇的任何组织、器官或身体部分接触，这表示理想地，它将不具有过分超过其治疗益处的显著的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或任何其它并发症的风险。
可以通过任何适合的施用途径施用本文所述的药物组合物。施用途径可以表示本领域中已知的任何施用途径，其包括(但不限于)气溶胶、肠内、鼻、眼、口服、肠胃外、直肠、透皮(例如，局部乳膏剂或软膏剂、贴片)或阴道施用。“透皮”施用可以使用局部乳膏剂或软膏剂或者通过透皮贴片完成。“肠胃外”是指通常与注射有关的施用途径，其包括眶下、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、被膜下、皮下、经粘膜或经气管施用。在一些实施方式中，在干预或切除期间，可以作为局部施用在术中(外科手术期间)递送抗原结合构建体。
在一些实施方式中，将抗原结合构建体结合至治疗剂。如本文所使用的“治疗剂”是在与靶标分子有关的病症的治疗中有用的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括(但不限于)药物、化疗剂、治疗抗体和抗体片段、毒素、放射性同位素、酶(例如，在抗原结合构建体结合位点将前药切割成细胞毒性试剂的酶)、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、螯合剂、硼化合物、光活性试剂和染料，以及纳米颗粒。病症的实例包括与一个或多个靶标分子有关的那些。在一些实施方式中，所述靶标分子可以是以下中的一个或多个：CD8、CD3、PSMA、PSCA和5T4。
化疗剂在本质上通常是细胞毒性或细胞抑制的，并且可以包括烷化剂、抗代谢剂、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、激素疗法、靶向治疗剂和免疫治疗剂。在一些实施方式中，根据本发明公开的实施方式，可以用作可检测标志物的化疗剂包括(但不限于)13-顺式-视黄酸、2-氯代脱氧腺苷酸、5-阿扎胞苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、放线菌素-D、亚德里亚霉素(阿霉素，adriamycin)、阿地白介素(aldesleukin)、阿仑珠单抗、阿利维A酸(alitretinoin)、全反式维甲酸、α干扰素、六甲蜜胺、氨甲蝶呤、氨磷汀、阿那格雷、阿那曲唑、阿拉伯糖胞嘧啶、三氧化二砷、安吖啶、氨基喜树碱、氨鲁米特、门冬酰胺酶、氮杂胞苷、卡介苗(BCG)、苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、硼替佐米、博来霉素、白消安、甲酰四氢叶酸钙、嗜橙菌因子(citrovorum factor)、卡培他滨、卡纽替尼、卡铂、卡莫司汀、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、可的松、环磷酰胺、阿糖胞苷、达贝泊汀α、达沙替尼、道诺霉素、地西他滨、地尼白介素-毒素连接物(denileukindiftitox)、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松磷酸钠(dexasone)、右雷佐生、放线菌素、柔红霉素、氨烯咪胺(decarbazine)、多西他赛、多柔比星、去氧氟尿苷、恩尿嘧啶、表柔比星、阿法依伯汀、厄洛替尼、依维莫司、依西美坦、雌莫司汀、依托泊苷、非格司亭、氟甲睾酮、氟维司群、黄酮吡醇(flavopiridol)、氮尿苷(floxuridine)、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗奥唑米星、戈舍瑞林、粒性白细胞-集落刺激因子、粒性白细胞巨噬细胞-集落刺激因子、六甲三聚氰胺、氢化可的松羟基脲、替伊莫单抗、干扰素α、白细胞介素-2、白介素-11、异维A酸、伊沙匹隆、伊达比星、伊马替尼甲磺酸盐、异环磷酰胺、伊立替康、拉帕替尼、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、亮脯利特、脂质体阿糖胞苷、洛莫司汀、氮芥、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、甲泼尼龙、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、奈拉滨、尼鲁米特、奥曲肽、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、培美曲唑、帕尼单抗、PEG干扰素、培门冬酶、聚乙二醇化非格司亭、PEG-L-天冬酰胺酶、喷司他丁、普卡霉素、泼尼松龙、泼尼松、丙卡巴肼、雷洛昔芬、利妥昔单抗、罗米司亭(romiplostim)、雷替曲塞、沙帕他滨(sapacitabine)、沙格司亭、沙铂、索拉非尼、舒尼替尼、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替西罗莫司、替莫唑胺、替尼泊苷、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维甲酸、曲美沙特、alrubicin、长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、伏立诺他或唑来膦酸。
根据本发明公开的实施方式，可以使用的毒素包括(但不限于)奥瑞他汀E、奥瑞他汀F、尾海兔素10、尾海兔素(Dolastatin)15、考布他丁和它们的类似物、美登素、卡里奇霉素(calicheamicin)、α-鹅膏菌素(alpha-amanitin)、吡咯并苯二氮卓二聚体、埃博霉素、倍癌毒素(duocarmycin)和它们的类似物、tubulysin D、basillistatins、篦麻毒素、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、脱氧核糖核酸酶I、葡萄球菌肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、白树毒素(gelonin)、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。
在一些实施方式中，当结合至抗原结合构建体时，在治疗应用中作为药物载体使用纳米颗粒，所述纳米颗粒将化疗剂、激素治疗剂、放疗剂、毒素或本领域中已知的任何其它细胞毒性剂或抗癌剂递送至在细胞表面上过表达所述靶标的癌性细胞。
本文所述的任何抗原结合构建体还可以与一个或多个其它治疗剂、可检测标志物、纳米颗粒、载体或其组合结合。例如，可以用碘-131放射性标记抗原结合构建体并且可以将所述抗原结合构建体结合至脂质载体，从而所述抗靶标分子-脂质结合物形成胶束。所述胶束可以引入一种或多种治疗剂或可检测标志物。作为另外一种选择，除载体外，可以用碘-131I放射性标记所述抗原结合构建体(例如，在酪氨酸残基)并将所述抗原结合构建体结合至药物(例如，在赖氨酸残基的ε氨基)，并且所述载体可以引入其它治疗剂或可检测标志物。
在一些实施方式中，将抗原结合构建体结合至治疗剂。尽管与全长抗体相比，这些抗原结合构建体可以具有较短的循环半衰期，但是在一些实施方式中，这些形式可以基于它们较小的尺寸而显示出改善的肿瘤渗透性并且当适当配备细胞毒性药物或放射性同位素时，这些形式可以是治疗有效的。在一些实施方式中，可以使用抗体药物-结合物方式。在一些实施方式中，治疗方法包括通过连接适当的放射性标记，如碘-131、β-发射体，如钇-90、镥-177、铜-67、砹-211、铅-212/铋-212、锕-225/铋-213和钍的放射免疫疗法，其可以将细胞破坏和死亡递送至靶标组织。在一些实施方式中，使用配备细胞毒性药物或放射性核素的这些片段的治疗导致较低的非特异性毒性，这是因为它们将更快速地从身体清除。
在一些实施方式中，可以将所述抗原结合构建体连接到治疗剂以治疗与所述靶标分子表达有关的病症。
在一些实施方式中，在与所述靶标分子表达有关的病症的治疗中，将靶标分子抗原结合构建体用作独立药剂(例如，不存在治疗剂的抗原结合构建体)。
在一些实施方式中，提供了药物组合物，其包含本文所提供的任何实施方式的氨基酸铰链区。在一些实施方式中，在所述组合物中存在小于30％的微抗体聚集(或高分子量构建体)，例如，小于20、10、5或1％的聚集。
在一些实施方式中，提供了药物组合物，其包含本文所提供的任何构建体的氨基酸铰链区。在一些实施方式中，可以使用1微克至100mg的量。在一些实施方式中，与不具有所提及的铰链排布的构建体相比，这种组合物可以具有低水平的聚集。
在一些实施方式中，所述病症是与5T4、CD8、CD3、PSCA或PSMA有关的病症。然而，本文所公开的多种铰链可以应用于任何靶标分子或者包含铰链的抗原结合构建体。
试剂盒
在一些实施方式中，提供了试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包含如本文所述的抗原结合构建体。在一些实施方式中，所述试剂盒包含编码如本文所述的抗原结合构建体的核酸。在一些实施方式中，所述试剂盒包含生产如本文所述的抗原结合构建体的细胞系。在一些实施方式中，所述试剂盒包含如本文所述的可检测标志物。在一些实施方式中，所述试剂盒包含如本文所述的治疗剂。在一些实施方式中，所述试剂盒包含缓冲液。在一些实施方式中，所述试剂盒包含阳性对照，例如，靶标特异性细胞或其片段。在一些实施方式中，所述试剂盒包含阴性对照，例如，基本不含靶标的表面或溶液。在一些实施方式中，所述试剂盒包含包装。在一些实施方式中，所述试剂盒包含说明书。
检测靶标分子是否存在的方法
抗原结合构建体可以用于体内和/或体外检测靶标分子是否存在。因此，一些实施方式包括检测靶标是否存在的方法。所述方法可以包括将抗原结合构建体应用于样品。所述方法可以包括检测所述抗原结合构建体与靶标分子结合或不结合。在一些实施方式中，可以通过本文所提供的选择检测任何靶标分子。在一些实施方式中，要检测的靶标分子是5T4、CD8、CD3、PSCA或PSMA中的一个或多个。在一些实施方式中，使用附图和/或表，如表0.2中所提供的一种或多种微抗体排布(或者至少使用表0.1中所列的铰链排布)检测靶标分子。
本文提供了检测靶标分子是否存在的方法。将理解可以以任何顺序实施以下过程，和/或可以任选地重复和/或消除以下过程，并且可以任选地将其它步骤添加至所述方法。在一些实施方式中，可以将如本文所述的抗原结合构建体应用于样品。在一些实施方式中，可以实施任选的清洗。任选地，可以将第二抗原结合构建体应用于样品。可以实施任选的清洗。在一些实施方式中，可以检测所述抗原结合构建体与靶标分子结合或不结合。
在一些实施方式中，将如本文所述的抗原结合构建体体内应用于样品。所述抗原结合构建体可以施用于受试者。在一些实施方式中，所述受试者是人。在一些实施方式中，所述受试者是非人哺乳动物，例如，大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、兔、狗、猫、母牛、马、山羊、绵羊、驴、猪、猴或猿。在一些实施方式中，将所述抗原结合构建体输注至受试者。在一些实施方式中，所述输注是静脉内的。在一些实施方式中，所述输注是腹膜内的。在一些实施方式中，将所述抗原结合构建体表面或局部(如在介入性或术中应用的情况下)应用于受试者。在一些实施方式中，将含有所述抗原结合构建体的胶囊应用于受试者，例如，口服或腹膜内应用。在一些实施方式中，选择所述抗原结合构建体以降低受试者免疫原性反应的风险。例如，对于人受试者，可以如本文所述将所述抗原结合构建体人源化。在一些实施方式中，在所述抗原结合构建体的体内应用后，从宿主除去样品或样品部分。在一些实施方式中，体内应用所述抗原结合构建体，将所述抗原结合构建体体内培育如本文所述的一段时间，并且除去样品以用于体外检测，例如，如本文所述体外检测结合至靶标分子或未结合的抗原结合构建体。
在一些实施方式中，将所述抗原结合构建体体外应用于样品。在一些实施方式中，所述样品新鲜收获自受试者，例如，活组织检查。在一些实施方式中，在从受试者收获后，培育样品。在一些实施方式中，固定样品。在一些实施方式中，所述样品包括完整的器官和/或组织。在一些实施方式中，所述样品包括一个或多个完整的细胞。在一些实施方式中，所述样品来自于细胞提取物，例如，裂解液。在一些实施方式中，将溶液中的抗原结合构建体加入至所述样品中的溶液。在一些实施方式中，将溶液中的抗原结合构建体加入至不含溶液的样品，例如，冻干样品，从而复原所述样品。在一些实施方式中，将冻干的抗原结合构建体加入至含有溶液的样品，从而复原所述抗原结合构建体。
在一些实施方式中，将所述抗原结合构建体任选地与样品培育。所述抗原结合构建体可以培育不超过约14天，例如，不超过约14天、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天，或者不超过约23小时，例如，不超过约23小时、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5、0.25或0.1小时的一段时间，包括所列值中任意两个之间的范围。在一些实施方式中，在施用所述抗原结合构建体的受试者中进行培育。在一些实施方式中，所述培育在培育箱内进行。在一些实施方式中，所述培育箱维持在固定温度，例如，约21℃、室温、25℃、29℃、34℃、37℃或40℃。
在一些实施方式中，任选地从样品除去未结合至所述靶标的抗原结合构建体。在一些实施方式中，清洗样品。清洗样品可以包括除去含有未结合的抗原结合构建体的溶液，和加入不含抗原结合构建体的溶液，例如，缓冲溶液。在一些实施方式中，例如，通过吸出、用移液器移出、泵出或排放含有未结合的抗原结合构建体的溶液并加入不含抗原结合构建体的溶液，清洗体外样品。在一些实施方式中，例如，通过向受试者施用不含抗原结合构建体的溶液或者通过清洗抗原结合构建体局部施用位点，清洗体内样品。在一些实施方式中，清洗进行至少2次，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20次。在一些实施方式中，清洗一次或多次后，从样品除去至少约50％未结合的抗体，例如，至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多未结合的抗体。
在一些实施方式中，从样品除去未结合的抗原结合构建体。在将所述抗原结合构建体应用于样品后，结合至靶标的抗原结合构建体与未结合至靶标的抗原结合构建体达到平衡，从而在应用所述抗原结合构建体之后一定时间，结合至靶标的抗原结合构建体的量基本不提高。在此之后，可以消除至少部分未结合至靶标的抗原结合构建体的量。在一些实施方式中，通过抗体或片段所递送至的受试者的代谢或其它身体过程消除未结合的抗原结合构建体。在一些实施方式中，通过添加破坏未结合的抗原结合构建体或使其不稳定的试剂，例如，蛋白酶或中和抗体消除未结合的抗原结合构建体。在一些实施方式中，在应用所述抗原结合构建体后1天，至少约30％所应用的抗原结合构建体已消除，例如，至少约30％、40％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.9％。在一些实施方式中，在应用所述抗原结合构建体后2天，至少约40％所应用的抗原结合构建体已消除，例如，至少约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.9％。
在一些实施方式中，检测靶标分子是否存在。可以基于样品中抗原结合构建体是否存在来检测靶标是否存在。在从样品除去和/或消除所述抗原结合构建体之后，例如，通过清洗和/或代谢消除，样品中剩余的抗原结合构建体可以指示靶标的存在，而样品中抗原结合构建体的不存在则可以指示靶标的不存在。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体包含如本文所述的可检测标志物。因此，可以通过检测可检测标志物来推断所述抗原结合构建体的存在。
在一些实施方式中，将第二抗原结合构建体用于检测抗原结合构建体。所述第二抗原结合构建体可以特异性结合至所述抗原结合构建体。例如，所述第二抗原结合构建体可以包含抗所述抗体的宿主类型或抗所述抗原结合构建体本身的多克隆或单克隆抗体、双链抗体、微抗体等。所述第二抗原结合构建体可以结合至如本文所述的可检测标志物。可以将第二抗原结合构建体应用于样品。在一些实施方式中，以与所述抗原结合构建体基本相同的方式，将所述第二抗原结合构建体应用于样品。例如，如果将所述抗原结合构建体输注至受试者，则还可以将所述第二抗原结合构建体输注至受试者。
在一些实施方式中，通过以下中至少一种检测所述抗原结合构建体的结合或未结合：正电子发射断层成像术(PET)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、磁共振成像(NMR)或荧光发射的检测。PET可以包括(但不限于)小动物PET成像。在一些实施方式中，通过两种或更多种形式的成像检测所述抗原结合构建体的结合或未结合。在一些实施方式中，可以通过近红外(NIR)和/或契伦科夫辐射(Cerenkov)进行检测。
在一些实施方式中，任何成像方式的组合是可能的，其包括，举例来说，PET+NIR、PET+SPECT等。
将治疗剂靶向细胞的方法
抗原结合构建体可以用于将治疗分子，例如，细胞毒素，靶向靶标阳性细胞，如表达所述靶标分子的细胞。因此，一些实施方式包括将治疗剂靶向靶标阳性细胞的方法。所述方法可以包括将如本文所述的抗原结合构建体施用于受试者。所述受试者可以是有需要的受试者，例如，需要消除或中和至少一些靶标阳性细胞的受试者。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体包含至少一种如本文所述的治疗剂。在一些实施方式中，所述治疗剂可以通过共价键，如二硫键直接结合至抗原结合构建体。在一些实施方式中，所述受试者可以受益于靶标分子阳性细胞向另一种细胞或试剂的定位。
任选地，在包含至少一种治疗剂的抗原结合构建体的施用之前和/或之后，确定患者靶标阳性细胞的数目和/或定位。例如，在施用前，确定靶标阳性细胞的数目和/或定位可以指示患者是否可能受益于靶标阳性细胞的中和和/或去除。在施用后，确定靶标阳性细胞的数目和/或定位可以指示是否除去了患者中的靶标阳性细胞。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体可以作为独立构建体(例如，无结合其上的毒素)用作治疗剂。尽管与全抗体相比，片段具有较短的半衰期，这对于疗法来说是不太理想的，但是这些形式基于它们较小的尺寸可以显示出改善的肿瘤渗透，并且当适当配备细胞毒性药物或放射性同位素时，这些形式可以是治疗有效的。
在一些实施方式中，另一种治疗方法是通过连接适当的放射性标记，如碘-131、β-发射体，如钇-90、镥-177、铜-67、砹-211、铅-212/铋-212、锕-225/铋-213和钍的放射免疫疗法，其可以导致细胞破坏和死亡。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体用于靶向表达所述靶标分子的细胞。在一些实施方式中，所述治疗剂适合于与以下中至少一种有关的一种或多种病症：例如，CD8、CD3、PSMA、PSCA或5T4。在一些实施方式中，所述治疗剂适合于治疗以下病症中的一种或多种：
特异性靶标/构建体
在一些实施方式中，本文所提供的任何组合物、方法(例如，治疗方法、制备方法、检测方法等)、试剂盒、试剂、抗原结合构建体修饰、细胞系、核酸等可以用于任何靶标分子。在一些实施方式中，所述靶标分子可以是与癌症免疫疗法有关的分子。在一些实施方式中，所述靶标分子可以是CD8、CD3、5T4、PSCA或PSMA(包括其变体)中的一个或多个。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体，如微抗体中的一个或多个可以用于治疗患有靶标分子相关病症的受试者。在一些实施方式中，所述靶标分子可以是任何靶标分子，对于所述靶标分子，其具有将结合的抗原结合构建体。在一些实施方式中，所述靶标分子可以是以下中的至少一种：CD8、CD3、PSMA、PSCA或5T4，并因此，要治疗的病症可以是与以下中至少一种相关的病症：CD8、CD3、PSMA、PSCA或5T4。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体，如微抗体中的一个或多个可以用于诊断受试者是否患有靶标分子相关病症。
如本文所使用的，术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，其包括(但不限于)人、非人灵长类、啮齿类、狗、猪等。
以下每个部分列出了本文所提供的多种抗原结合构建体中的一些的多种实施方式。作为抗原结合构建体(包括微抗体和scFv)的多种形式提供所有这些实施方式。以下部分明确提供用于靶标特异性实施方式；然而，将它们考虑作为与本说明书其它处所提供的任何适当选择可组合的方面。因此，本发明的实施方式不排除其他实施方式，而是作为替代，可以与本文所提供的任何其他实施方式组合的选择。例如，可以在任何一种或多种所提及的构建体和/或方法中使用本文所提供的任何铰链排布。类似地，对于CD8、CD3、PSMA、PSCA或5T4这5个靶标中的任一个来说，以下所列的多种实施方式还可以与其他所提及的靶标交换。因此，尽管对PSCA的讨论涉及PSCA，但是将理解所述实施方式还可以应用于CD8、CD3、PSMA或5T4构建体。类似地，对CD8的公开内容还可以应用于(例如)CD3、PSMA、PSCA或5T4。
在一些实施方式中，可以与本文所提供的CD8、CD3、PSMA、PSCA或5T4构建体中的任何一个或多个一起使用化疗剂。化疗剂在本质上通常是细胞毒性或细胞抑制的，并且可以包括烷化剂、抗代谢剂、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、激素疗法、靶向治疗剂和免疫治疗剂。在一些实施方式中，根据本发明公开的实施方式，可以用作诊断试剂的化疗剂包括(但不限于)13-顺式-视黄酸、2-氯代脱氧腺苷酸、5-阿扎胞苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、放线菌素-D、亚德里亚霉素、阿地白介素、阿仑珠单抗、阿利维A酸、全反式维甲酸、α干扰素、六甲蜜胺、氨甲蝶呤、氨磷汀、阿那格雷、阿那曲唑、阿拉伯糖胞嘧啶、三氧化二砷、安吖啶、氨基喜树碱、氨鲁米特、门冬酰胺酶、氮杂胞苷、卡介苗(BCG)、苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、硼替佐米、博来霉素、白消安、甲酰四氢叶酸钙、嗜橙菌因子、卡培他滨、卡纽替尼、卡铂、卡莫司汀、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、可的松、环磷酰胺、阿糖胞苷、达贝泊汀α、达沙替尼、道诺霉素、地西他滨、地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox)、地塞米松、地塞米松磷酸钠、右雷佐生、放线菌素、柔红霉素、氨烯咪胺、多西他赛、多柔比星、去氧氟尿苷、恩尿嘧啶、表柔比星、阿法依伯汀、厄洛替尼、依维莫司、依西美坦、雌莫司汀、依托泊苷、非格司亭、氟甲睾酮、氟维司群、黄酮吡醇(flavopiridol)、氮尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗奥唑米星、戈舍瑞林、粒性白细胞-集落刺激因子、粒性白细胞巨噬细胞-集落刺激因子、六甲三聚氰胺、氢化可的松羟基脲、替伊莫单抗、干扰素α、白细胞介素-2、白介素-11、异维A酸、伊沙匹隆、伊达比星、伊马替尼甲磺酸盐、异环磷酰胺、伊立替康、拉帕替尼、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、亮脯利特、脂质体阿糖胞苷、洛莫司汀、氮芥、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、甲泼尼龙、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、奈拉滨、尼鲁米特、奥曲肽、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、培美曲唑、帕尼单抗、PEG干扰素、培门冬酶、聚乙二醇化非格司亭、PEG-L-天冬酰胺酶、喷司他丁、普卡霉素、泼尼松龙、泼尼松、丙卡巴肼、雷洛昔芬、利妥昔单抗、罗米司亭(romiplostim)、雷替曲塞、沙帕他滨(sapacitabine)、沙格司亭、沙铂、索拉非尼、舒尼替尼、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替西罗莫司、替莫唑胺、替尼泊苷、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维甲酸、曲美沙特、alrubicin、长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、伏立诺他或唑来膦酸。
在一些实施方式中，可以通过所述铰链中的一个或多个半胱氨酸将构建体，例如，CD8、CD3、PSMA、PSCA或5T4抗原结合构建体中的任何一个或多个连接至本文所述的螯合剂、药物或任何其他组分。
PSCA-IAB1M
前列腺干细胞抗原(PSCA)是在正常人前列腺和膀胱中表达的细胞表面糖蛋白，并且在前列腺癌(40％原发肿瘤和60-100％的淋巴结和骨髓转移)中过表达。它还在膀胱移行细胞癌和胰腺癌中高度表达。SEQ ID NO：132显示了PSCA蛋白的实例。IG8是对PSCA特异的抗-PSCA小鼠单克隆抗体，其显示出体内抗肿瘤靶向活性(Gu,Z.等人,"Anti-prostatestem cell antigen monoclonal antibody 1G8 induces cell death in vitro andinhibits tumor growth in vivo via a Fc-independent mechanism,"Cancer Res.,65卷,No.20,9495-9500页,2005)。通过移植至人框架区将该抗体人源化(曲妥珠单抗)并命名为2B3(Olafsen,T.等人,"Targeting,imaging,and therapy using a humanizedantiprostate stem cell antigen(PSCA)antibody,"Immunotherapy,30卷,No.4,396-405页,2007)。
在一些实施方式中，涉及结合PSCA的抗原结合构建体的实施方式可以提供具有靶向表达PSCA的肿瘤和使其成像的适当药物动力学性质的试剂。在本领域中，以灵敏度和特异性使癌症(特别是早期肿瘤或者通过常规方式无法成像的具有早期转移的肿瘤)成像的有效试剂是有价值的。由于大部分前列腺、膀胱和胰腺肿瘤高度表达PSCA，因此它是这些癌症的检测、诊断、预后和治疗中有价值的靶标。本文所提供的一些实施方式提供了具有肿瘤成像和靶向特征的构建体。它们还可以用于基因疗法的肿瘤靶向、放射性疗法，并且它们本身可以具有治疗应用。
本文提供了工程设计的抗原结合构建体，其以高亲合力识别前列腺及其它癌症中新型的细胞表面标志物。可以特异性地调整这些基因工程设计的抗原结合构建体以用于体内靶向和检测使用。大部分前列腺、膀胱和胰腺肿瘤高度表达PSCA，并且PSCA是有希望的靶标。本文所提供的实施方式描述了具有最佳肿瘤成像特性的创新型分子。它还可以用于基因疗法的肿瘤靶向、放射性或者它本身可以具有治疗应用。
在一些实施方式中，通过抗-PSCA抗体所靶向的PSCA是人PSCA。在一些实施方式中，所述免疫结合物可以用于将效应因子部分靶向PSCA-阳性细胞，具体地，过表达PCSA蛋白的细胞。在一些实施方式中，通过抗-PSCA微抗体所靶向的PSCA是人PSCA。
在一些实施方式中，本文所提供的构建体可以提供具有靶向表达PSCA的肿瘤和使其成像的适当药物动力学性质的试剂。在一些实施方式中，所述微抗体提供了以灵敏度和特异性使癌症(特别是早期肿瘤或者通过常规方式无法成像的具有早期转移的肿瘤)成像的有效试剂。
在一些实施方式中，结合PSCA抗原的抗原结合构建体可以是抗体、微抗体和/或抗体的其它片段，如scFv。图29B-29D、36E、60(SEQ ID NO：125和126)、61(SEQ ID NO：126)、62(SEQ ID NO：127)、63(SEQ ID NO：128)、64(SEQ ID NO：129)和65A(SEQ ID NO：130)中显示了抗PSCA的抗原结合构建体的一些非限制性实施方式。
在一些实施方式中，在转移性疾病的早期诊断或诊断中，所述构建体允许癌症成像。具体地，使前列腺癌成像以用于检测和分期(staging)的更好的试剂是有价值的。对于骨转移成像和评价对治疗的反应，PSCA抗原结合构建体成像将非常有用。在一些实施方式中，提供了检测胰腺癌的方法。在一些实施方式中，调整高亲合力、高特异性的工程设计的微抗体以用于前列腺癌、膀胱癌和胰腺癌患者中PSCA的体内靶向和检测。在一些实施方式中，“PSCA依赖性病症(PSCA dependent disorder)”可以包括前列腺肿瘤、前列腺癌、膀胱肿瘤、膀胱移行细胞癌、胰腺肿瘤、胰腺癌、与PSCA表达有关的任何肿瘤、与PSCA表达有关的任何癌或者与PSCA表达有关的任何病症。
在一些实施方式中，提供了可以在过表达PSCA的癌症的治疗和检测中使用的高亲合力PSCA抗原结合构建体。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体还可以连接至治疗剂或可检测标志物。在一些实施方式中，所述治疗剂是细胞毒性试剂。例如，所述试剂可以是篦麻毒素、篦麻毒素A-链、多柔比星、柔红霉素、红豆杉醇(紫杉酚，taxol)、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲素(modeccin)A链、α-八叠球菌素(alpha-sarcin)、白树毒素、丝裂吉菌素(mitogellin)、局限曲霉素(retstrictocin)、酚霉素、伊诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡里奇霉素(calicheamicin)、肥皂草(Sapaonaria offcinalis)抑制剂、美登木素生物碱(maytansinoid)或糖皮质激素蓖麻毒素(glucocorticoidricin)。在其它实施方式中，所述治疗剂是放射性同位素。所述放射性同位素可以选自(例如)212Bi、131I、111In、90Y和186Re。在其它实施方式中，将所述构建体连接至能够将前药转化为其活性形式的抗癌前药激活酶。
在一些实施方式中，用可检测标志物标记所述抗-PSCA构建体。所述标志物可以是(例如)放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。多种放射性核素可以用作成像标记物，其无限制地包括124I、86Y、18F、94mTc等。本领域技术人员将了解特别适合于在本发明实施方式中使用的其它放射性核素。在一些实施方式中，所述方法可以杀死癌细胞。在一些实施方式中，所述构建体识别并结合如以下所示从氨基酸位置22的亮氨酸开始至氨基酸位置99的丙氨酸结束的PSCA蛋白质。在其它实施方式中，所述方法还包括施用化学治疗药物、放射疗法。在一些实施方式中，用激素消融疗法或激素拮抗疗法治疗所述受试者。
在一些实施方式中，可以通过静脉内、腹膜内、肌内、瘤内或皮内将所述治疗给予患者或受试者。在一些实施方式中，接触包括将所述构建体直接施用于前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌或其转移癌。
在一些实施方式中，提供了通过将癌细胞与具有可检测标志物的构建体接触检测受试者中癌性细胞的方法。所述方法可以用于筛选高癌症风险患者或者监控对疗法的反应或者发展癌症(例如，前列腺、膀胱或胰腺癌)预后。所述方法在检测癌症转移中是特别有利的。本文提供了具有肿瘤靶向/成像能力的微抗体片段。在一些实施方式中，对于本文所提供的构建体，存在以下前提条件：所述构建体包含与相应域或2B3抗体不相同的VH或VL域。
在一些实施方式中，将所述抗原结合构建体结合至“效应因子(效应子，effector)”部分。所述效应因子部分可以是多种分子，其包括标记物部分，如放射性标记物或荧光标记物，或者可以是治疗性部分。在一个方面，所述抗体调控所述蛋白的活性。这些效应因子部分包括(但不限于)抗肿瘤药物、毒素、放射性试剂、细胞因子、第二抗体或酶。此外，本文提供了其中将所述抗原结合构建体连接至将前药转化为细胞毒性试剂的酶的实施方式。细胞毒性试剂的实例包括(但不限于)篦麻毒素、多柔比星、柔红霉素、红豆杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白和糖皮质激素及其它化疗剂和放射性同位素。适合的可检测标志物包括(但不限于)放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。
在一些实施方式中，所述抗原结合蛋白构建体可以单独全身性用于治疗癌症或者可以与效应因子部分结合使用。结合有毒性剂，如篦麻毒素的PSCA-靶向构建体以及非结合抗体可以是天然靶向具有PSCA癌细胞的有用治疗剂。这些构建体可以在阻断侵袭中使用。
在一些实施方式中，所述抗原-结合蛋白构建体可以用于治疗癌症。在这种情况下，将所述构建体连接至至少第二蛋白的功能活性部分或者具有治疗活性的毒性分子。所述第二蛋白可以包括(但不限于)酶、淋巴激活素(lymphokine)、制瘤素(oncostatin)或毒素。适合的毒素包括多柔比星、柔红霉素、红豆杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、篦麻毒素、相思豆毒蛋白、糖皮质激素和放射性同位素。
在一些实施方式中，治疗通常将包括通过可接受的施用途径，如静脉注射(N)，以有效剂量重复施用所述构建体和它们的免疫结合物。剂量将取决于本领域技术人员通常将理解的多种因素，其无限制地包括癌症类型和癌症的严重程度、等级或阶段、所使用试剂的结合亲合力和半衰期、所期望的稳态抗体浓度水平、治疗频率以及与本文所提供的实施方式的治疗方法组合使用的化疗剂的影响。典型的日剂量可以在约0.1至100mg/kg的范围内。每周10-500mg所述构建体或它们的免疫结合物的范围内的剂量可以是有效且良好耐受的，尽管更高的周剂量可能是适当的和/或良好耐受的。确定适当剂量的主要决定因素是在特定背景中对治疗有效所必需的特定试剂的量。为了实现肿瘤抑制或消退，可能需要重复施用。初始加载剂量可以较高。可以作为输注施用初始加载剂量。可以类似地施用定期维持剂量，只要所述初始剂量是良好耐受的。
在一些实施方式中，所述构建体的直接施用也是可能的并且可以在特定背景中具有优势。例如，对于膀胱癌的治疗，可以将所述试剂直接注射至膀胱。
在一些实施方式中，可以施用所述组合物以用于治疗性或预防性治疗。在治疗应用中，以“治疗有效剂量”将组合物施用于患有疾病(例如，癌症)的患者。对这种用途有效的量将取决于疾病的严重程度和患者健康的一般状况。基于患者所需和耐受的剂量和频率，可以单次或多次施用所述组合物。可以与本文所提供的方法组合使用其它已知的癌症疗法。例如，本文提供的组合物还可以用于将细胞靶向其它癌症治疗剂或使细胞对其敏化，所述癌症治疗剂如5FU、长春碱、放线菌素D、顺铂、甲氨蝶呤等。
在其它实施方式中，可以与其它癌症疗法(例如，根治性前列腺切除术)、放射疗法(外束或近距疗法)、激素治疗(例如，睾丸切除术、LHRH-类似物疗法以抑制睾酮产生、抗雄激素疗法)或化疗一起实践所述方法。
在一些实施方式中，提供了通过施用抗体，如本文所提供的微抗体使癌细胞或肿瘤体内成像的方法。在一个实施方式中，提供了使癌细胞体内成像的方法，所述方法包括将标记的抗-PSCA抗体施用至哺乳动物并且使所述抗体体内成像。所述方法可以用于使哺乳动物中癌细胞成像，其无限制地包括小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猪、人等。
在一些实施方式中，本文提供了治疗患有癌症的受试者或抑制表达前列腺干细胞抗原(PSCA)蛋白的前列腺癌细胞生长的方法，其包括将所述癌细胞(例如，前列腺、膀胱、胰腺癌细胞)与对于抑制所述癌细胞生长有效的量的如本文所提供的构建体接触。在一些实施方式中，所述方法在过表达PSCA的癌症，例如，前列腺、胰腺和膀胱癌的诊断、预后和治疗中具有具体的应用。在某些实施方式中，将所述方法应用于激素难治性或疗法耐受性癌症。在某些实施方式中，将所述方法应用于转移性癌症。
在一些实施方式中，提供了结合至PSCA的微抗体。所述微抗体包含含有下列的多肽：结合至PSCA的单链可变区片段(scFv)，所述scFv包含连接可变轻链(VL)域的可变重链(VH)域；和在所述铰链的每条链上包含至少3个半胱氨酸的变体铰链区。在一些实施方式中，所述微抗体还包含人IgG CH3序列。在一些实施方式中，所述微抗体还包含可检测标志物，其选自放射性物质、染料、造影剂、荧光化合物、生物发光化合物、酶、增强剂和纳米颗粒。
在一些实施方式中，本文所提供的微抗体包含：SEQ ID NO：93中HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO：94中HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO：95中HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO：96中LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO：97中LCDR2的LCDR2；和SEQ ID NO：98中LCDR3的LCDR3。在本文所提供的微抗体的一些实施方式中，所述可变重链(VH)域和所述可变轻链(VL)域是人序列。
在一些实施方式中，提供了编码本文所述的任何实施方式的抗体的核酸。在一些实施方式中，提供了产生本文所述的任何微抗体实施方式的细胞系。在一些实施方式中，提供了包含本文所述的微抗体的任何实施方式和可检测标志物的试剂盒。
在一些实施方式中，提供了检测PSCA是否存在的方法。所述方法包括将本文所提供的任何微抗体实施方式应用于样品；和检测其抗原结合构建体与PSCA的结合或未结合。在所述方法一些实施方式中，所述微抗体包含可检测标志物，其选自放射性物质、染料、造影剂、荧光化合物、生物发光化合物、酶、增强剂和纳米颗粒。在所述方法的一些实施方式中，应用所述微抗体包括施用所述微抗体至受试者。在所述方法的一些实施方式中，检测其微抗体与靶标抗原的结合或未结合包括正电子发射断层成像术。在一些实施方式中，所述方法还包括将第二抗体或其片段应用于样品，其中所述第二抗体或其片段特异性结合至所述微抗体。在所述方法的一些实施方式中，将其微抗体与样品培育不超过1小时。
在一些实施方式中，提供了将治疗剂靶向PSCA的方法。所述方法包括将本文所提供的微抗体的任何实施方式施用于受试者，其中将所述微抗体结合至治疗剂。
在一些实施方式中，提供了在对其有需要的受试者中靶向PSCA的方法。所述方法包括向所述受试者施用本文所提供的任一个实施方式的微抗体。在所述方法的一些实施方式中，所述受试者患有以下中的至少一种或多种：前列腺肿瘤、前列腺癌、膀胱肿瘤、膀胱移行细胞癌、胰腺肿瘤、胰腺癌、与PSCA表达有关的任何肿瘤、与PSCA表达有关的任何癌或者与PSCA表达有关的任何病症。
在一些实施方式中，提供了结合至PSCA的抗原结合构建体(如微抗体或scFv)，所述抗原结合构建体(如微抗体或scFv)包含铰链区，其中所述铰链区包含以下中的至少一种：a)SEQ ID NO：1(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)的肽序列，其中Xn1可以是不形成共价交联键的任何氨基酸，其中Xn2是以下中的一个：A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，并且其中Xn5可以是任何氨基酸；b)SEQ IDNO：2(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)的肽序列，其中Xn1可以是不与另一种相同的氨基酸形成共价交联键的任何氨基酸，其中Xn2可以是任何氨基酸，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，其中Xn5可以是任何氨基酸，其中Xn6可以是任何氨基酸，其中Xn7可以是任何氨基酸，其中Xn8可以是任何氨基酸，其中Xn9可以是任何氨基酸，并且其中Xn10可以是任何氨基酸(SEQ ID NO：208)；c)以下中至少一个的核心铰链序列：CVECPPCP(SEQ IDNO：57)、CPPCPPC(SEQ ID NO：52)或CPPCPPCPPC(SEQ ID NO：54)，其连接至ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：48)的上部铰链序列；或者d)不含能够与相应氨基酸交联的氨基酸的上部铰链区，和连接到所述上部铰链区的C-末端的核心铰链区，其中所述核心铰链区包含至少3个半胱氨酸。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体是全长抗体。在一些实施方式中，所述抗体是微抗体。在所述抗原结合构建体(如微抗体或scFv)的一些实施方式中，除铰链区外，所述抗原结合构建体(如微抗体或scFv)包含人源化的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体(如微抗体或scFv)包含：SEQ ID NO：93中HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO：94中HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO：95中HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO：96中LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO：97中LCDR2的LCDR2；和SEQ ID NO：98中LCDR3的LCDR3。
在一些实施方式中，提供了编码本文所述的任何抗原结合构建体(如微抗体或scFv)的实施方式的铰链区的核酸。在所述核酸的一些实施方式中，除编码所述铰链区的序列外，所述核酸包含人序列。在一些实施方式中，提供了表达所述核酸所编码的抗原结合构建体(如微抗体或scFv)的细胞系。
在一些实施方式中，提供了产生本文所述的任何实施方式的抗原结合构建体(如微抗体或scFv)的方法，所述方法包括在细胞系中表达所述抗体。
在一些实施方式中，提供了治疗对其有需要的受试者中病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所提供的任何实施方式的抗体。
PSMA-IAB2M
已发展了靶向PSMA的全长抗体，其中一些处于临床前和临床开发的各个阶段。PSMA最初定义为鼠科抗体(mAb)7E11，其识别PSMA的胞内表位(Olson,W.C.等人.,"Clinical trials of cancer therapies targeting prostate-specific membraneantigen,"Rev.Recent Clin.Trials,2卷,No.3,182-190页,2007)。随后，7E11 mAb被发展为FDA-批准的SPECT成像剂(称为Prostascint)以用于软组织中前列腺癌的检测和成像。然而，由于7E11识别胞内表位，因此Prostascint是相对较差的成像剂，其限制于检测坏死的肿瘤组织(Olson,W.C.等人,2007)。由于具有全长抗体的药物动力学性质，因此Prostascint在注射和成像之间同样需要很长的一段时间。此外，Prostascint是鼠科抗体，其引起防止多次剂量施用的强烈的免疫反应(Olson,W.C.等人,2007)。
发现了另一个靶向PSMA的全长抗体J591并随后将其去免疫化，所述去免疫化的形式被称为huJ591(Liu,H.等人,"Monoclonal antibodies to the extracellular domainof prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascularendothelium",Cancer Research,57卷,No.17,3629-3634页,1997；Bander,N.H.等人,"Targeting Metastatic Prostate Cancer with Radiolabeled Monoclonal AntibodyJ591 to the Extracellular Domain of Prostate Specific Membrane Antigen,"J.Urol.,170卷,No.5,1717-1721页,2003)。去免疫化的huJ591是抗人PSMA抗体，其识别并结合PSMA上的胞外表位(Bander,N.H.等人,2003)。作为前列腺癌的潜在放射免疫疗法试剂，正在开发huJ591抗体。在I期临床试验中，用γ发射同位素铟-111和镥-177标记的DOTA-结合的huJ591抗体显示了对转移性位点优良的靶向、无免疫原性并且对多次剂量良好耐受(Bander,N.H.等人,2003,Milowsky,M.I.等人,"Phase I Trial of yttrium-90-labeledanti-prostate-specific membrane antigen monoclonal antibody J591 forandrogen-independent prostate cancer,"J.Clin.Oncol.,22卷,No.13,2522-2531页,2004；Bander,N.H.等人,"Phase I trial of 177Lutetium-labeled J591,a monoclonalantibody to prostate-specific membrane antigen,in patients with androgen-independent prostate cancer,"J.Clin.Oncol.,23卷,No.21,4591-4601页,2005；Olson,W.C.等人,2007)。除前列腺癌外，使用111In-DOTA huJ591的I期研究表明了对晚期实体瘤的肿瘤新生血管的特异性靶向(Milowsky,M.I.等人,"Vascular targeted therapy withanti-prostate-specific membrane antigen monoclonal antibody J591 in advancedsolid tumors,"J.Clin.Oncol.,25卷,No.5,540-547页,2007)。
在一些实施方式中，结合PSMA抗原的抗原结合构建体可以是抗体、微抗体和/或抗体的其它片段，如scFv。在图5B-5E、7C-7E、21B-21E、34A-34F、35A-35C、36A、47(SEQ ID NO：112和113)、48(SEQ ID NO：113)、49(SEQ ID NO：114)、50(SEQ ID NO：115)、51(SEQ ID NO：116)、52(SEQ ID NO：117)、53(SEQ ID NO：118)中显示了抗PSMA的抗原结合构建体的一些非限制性实施方式。
前列腺特异性膜抗原(PSMA)是与前列腺癌有关的细胞表面生物标志物(Slovin,S.F.,"Targeting novel antigens for prostate cancer treatment:focus onprostate-specific membrane antigen,"Expert Opin.Ther.Targets,9卷,No.3,561-570页,2005)，它是具有谷氨酸羧肽酶活性的单次II型跨膜蛋白，尽管PSMA的功能作用尚未完全理解(Olson,W.C.等人,2007)。PSMA的表达在前列腺以外的正常组织，包括脑、小肠、肝脏、近端肾小管和唾液腺中相对有限(Olson,W.C.等人,2007)。通过SEQ ID NO：131显示了PSMA蛋白的实例。
在一些实施方式中，本文提供了靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)的抗原结合构建体，如微抗体。其PSMA抗原结合构建体可以结合至以下物质，如诊断试剂、治疗剂或纳米颗粒以形成抗-PSMA结合物。还公开了包括PSMA抗原结合构建体或抗-PSMA结合物用于诊断、显像、监控或治疗与PSMA过表达有关的癌症或其它病况的使用的方法。
根据本文所述的实施方式，本文提供了PSMA抗原结合构建体。PSMA抗原结合构建体是包含特异性结合至PSMA或者与PSMA免疫反应的免疫球蛋白或免疫球蛋白-相关分子的一个或多个部分的分子。
所述PSMA抗原结合构建体或抗-PSMA结合物可以用于靶向PSMA阳性细胞，如过表达PSMA的癌细胞。
在一些实施方式中，提供了诊断受试者中与PSMA表达有关的癌症的方法。该方法包括将结合至诊断试剂的抗-PSMA微抗体施用至患有或怀疑患有与PSMA表达有关的癌症的受试者；将所述受试者暴露于成像方法以使标记的微抗体体内显像；和当所述标记微抗体定位至肿瘤位点时，确定所述受试者患有与PSMA表达有关的癌症。
在一些实施方式中，提供了治疗受试者中与PSMA表达有关的癌症的方法。一些实施方式包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述组合物包含抗-PSMA微抗体。在一些实施方式中，所述抗-PSMA微抗体结合至治疗剂。
在一些实施方式中，所述抗-PSMA结合物可以包含结合至治疗剂的PSMA抗原结合构建体(如微抗体或scFv)。如本文所使用的“治疗剂”是在与PSMA有关的癌症或其它病况的治疗中有用的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括(但不限于)药物、化疗剂、治疗性抗原结合构建体、毒素、放射性同位素、酶(例如，在肿瘤位点将前药切割成细胞毒性试剂的酶)、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、螯合剂、硼化合物、光活性试剂和染料。
化疗剂在本质上通常是细胞毒性或细胞抑制的，并且可以包括烷化剂、抗代谢剂、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、激素疗法、靶向治疗剂和免疫治疗剂。在一些实施方式中，根据本发明公开的实施方式，可以用作诊断试剂的化疗剂包括(但不限于)13-顺式-视黄酸、2-氯代脱氧腺苷酸、5-阿扎胞苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、放线菌素-D、亚德里亚霉素、阿地白介素、阿仑珠单抗、阿利维A酸、全反式维甲酸、α干扰素、六甲蜜胺、氨甲蝶呤、氨磷汀、阿那格雷、阿那曲唑、阿拉伯糖胞嘧啶、三氧化二砷、安吖啶、氨基喜树碱、氨鲁米特、门冬酰胺酶、氮杂胞苷、卡介苗(BCG)、苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、硼替佐米、博来霉素、白消安、甲酰四氢叶酸钙、嗜橙菌因子、卡培他滨、卡纽替尼、卡铂、卡莫司汀、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、可的松、环磷酰胺、阿糖胞苷、达贝泊汀α、达沙替尼、道诺霉素、地西他滨、地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox)、地塞米松、地塞米松磷酸钠、右雷佐生、放线菌素、柔红霉素、氨烯咪胺、多西他赛、多柔比星、去氧氟尿苷、恩尿嘧啶、表柔比星、阿法依伯汀、厄洛替尼、依维莫司、依西美坦、雌莫司汀、依托泊苷、非格司亭、氟甲睾酮、氟维司群、黄酮吡醇(flavopiridol)、氮尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗奥唑米星、戈舍瑞林、粒性白细胞-集落刺激因子、粒性白细胞巨噬细胞-集落刺激因子、六甲三聚氰胺、氢化可的松羟基脲、替伊莫单抗、干扰素α、白细胞介素-2、白介素-11、异维A酸、伊沙匹隆、伊达比星、伊马替尼甲磺酸盐、异环磷酰胺、伊立替康、拉帕替尼、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、亮脯利特、脂质体阿糖胞苷、洛莫司汀、氮芥、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、甲泼尼龙、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、奈拉滨、尼鲁米特、奥曲肽、奥普瑞白介素、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、培美曲唑、帕尼单抗、PEG干扰素、培门冬酶、聚乙二醇化非格司亭、PEG-L-天冬酰胺酶、喷司他丁、普卡霉素、泼尼松龙、泼尼松、丙卡巴肼、雷洛昔芬、利妥昔单抗、罗米司亭(romiplostim)、雷替曲塞、沙帕他滨(sapacitabine)、沙格司亭、沙铂、索拉非尼、舒尼替尼、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替西罗莫司、替莫唑胺、替尼泊苷、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维甲酸、曲美沙特、alrubicin、长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、伏立诺他或唑来膦酸。
根据本发明公开的实施方式，可以用作诊断试剂的治疗性抗体和其功能性片段包括(但不限于)阿仑珠单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、依决洛单抗、吉妥珠单抗、替伊莫单抗替坦(tiuxetan)、帕尼单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗和曲妥珠单抗。
所述PSMA抗原结合构建体或抗-PSMA结合物可以用于靶向PSMA阳性细胞，如过表达PSMA的癌细胞。因此，诊断、检测、显像、监控或治疗与PSMA表达有关的癌症或其它病况的方法可以包括将PSMA抗原结合构建体或抗-PSMA结合物施用至患有或怀疑患有与PSMA表达有关的癌症或其它病况的受试者。
在一些实施方式中，提供了治疗与PSMA过表达有关的癌症或其它病况的方法。这些方法包括向受试者施用治疗有效量的包含如本文所述的PSMA抗原结合构建体的药物组合物。在一个实施方式中，所述PSMA抗原结合构建体是微抗体，其来源于J591抗体，如本文所述的那些J591微抗体。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以包含治疗性抗-PSMA结合物，其中所述结合物包括结合至如本文所述的一种或多种治疗剂的PSMA抗原结合构建体。在一些实施方式中，所述PSMA抗原结合构建体来源于J591抗体，如本文所述的那些J591微抗体。例如，可以在放射免疫疗法中使用本文所述的J591微抗体，其中用适合的β-发射放射性标记，如钇-90放射性标记一个或多个J591微抗体。放射性标记的一个或多个J591微抗体可以用于将细胞破坏和死亡递送至表达PSMA的局部癌性组织。此外，与放射性标记的全长亲代huJ591抗体相比，放射性标记的J591微抗体的使用将可能显示出改善的肿瘤渗透性。
所述治疗性抗-PSMA结合物可以结合至本文所述的一种或多种其它物质，如诊断性抗-PSMA结合物(本文所述的)、未结合的诊断试剂、造影溶液、载体脂质或纳米颗粒，或者与之联合。
前列腺癌中PSMA的表达随肿瘤侵袭性而升高，并且在高级别肿瘤、转移性病变和不依赖于雄激素的疾病中最高(Olson,W.C.等人,2007)。因此，PSMA是作为成像剂所靶向的优良候选物的癌症生物标志物。PSMA的表达还在多种非前列腺实体瘤(包含肺、结肠、乳腺、肾、肝和胰腺癌以及肉瘤和黑素瘤)的新生血管中上调(Olson,W.C.等人,2007)。
受试者中与PSMA表达有关的癌症可以是肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌(乳癌)、肾癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌或黑素瘤。因此，在一些实施方式中，“PSMA依赖性病症”可以包括：肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌或黑素瘤。
此外，“PSMA依赖性病症”还可以包括与PSMA表达有关的那些癌症，其包括具有过表达PSMA的癌症肿瘤组织的那些(例如，前列腺癌)或者具有过表达PSMA的实体瘤新生血管的那些(例如，前列腺癌、肺癌、结肠(或结肠直肠)癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、膀胱癌和胰腺癌以及肉瘤和黑素瘤)。大部分实体瘤新生血管表达PSMA，从而使得PSMA成为新生血管生物标志物。因此，除表达PSMA的癌细胞外，与PSMA表达有关的癌症可以包括具有新生血管的任何癌症组织，其包括(但不限于)，癌，如前列腺癌、肺癌、结肠(或结肠直肠)癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、膀胱癌和胰腺癌以及肉瘤和黑素瘤。
在一些实施方式中，提供了结合至PSMA的微抗体。所述微抗体包含含有下列的多肽：结合至PSMA的单链可变区片段(scFv)，所述scFv包含连接可变轻链(VL)域的可变重链(VH)域；和在所述铰链的每条链上包含至少3个半胱氨酸的变体铰链区。在一些实施方式中，所述微抗体还包含人IgG CH3序列。在一些实施方式中，所述微抗体还包含可检测标志物，其选自放射性物质、染料、造影剂、荧光化合物、生物发光化合物、酶、增强剂和纳米颗粒。
在一些实施方式中，本文所提供的微抗体包含：SEQ ID NO：81中HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO：82中HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO：83中HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO：84中LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO：85中LCDR2的LCDR2；和SEQ ID NO：86中LCDR3的LCDR3。在本文所提供的微抗体的一些实施方式中，所述可变重链(VH)域和所述可变轻链(VL)域是人序列。
在一些实施方式中，提供了编码本文所述的任何实施方式的抗体的核酸。在一些实施方式中，提供了产生本文所述的任何微抗体实施方式的细胞系。在一些实施方式中，提供了包含本文所述的微抗体的任何实施方式和可检测标志物的试剂盒。
在一些实施方式中，提供了检测PSMA是否存在的方法。所述方法包括：将本文所提供的任何微抗体实施方式应用于样品；和检测其抗原结合构建体与PSMA的结合或未结合。在所述方法的一些实施方式中，所述微抗体包含可检测标志物，其选自放射性物质、染料、造影剂、荧光化合物、生物发光化合物、酶、增强剂和纳米颗粒。在所述方法的一些实施方式中，应用所述微抗体包括施用所述微抗体至受试者。在所述方法的一些实施方式中，检测其微抗体与靶标抗原的结合或未结合包括正电子发射断层成像术。在一些实施方式中，所述方法还包括将第二抗体或其片段应用于样品，其中所述第二抗体或其片段特异性结合至所述微抗体。在所述方法的一些实施方式中，将其微抗体与样品培育不超过1小时。
在一些实施方式中，提供了将治疗剂靶向PSMA的方法。所述方法包括将本文所提供的微抗体的任何实施方式施用于受试者，其中将所述微抗体结合至治疗剂。
在一些实施方式中，提供了在对其有需要的受试者中靶向PSMA的方法。所述方法包括向所述受试者施用本文所提供的任一个实施方式的微抗体。在所述方法的一些实施方式中，所述受试者患有前列腺、脑、小肠、肝脏、近端肾小管、唾液腺的肿瘤或癌症或病症中的至少一种。在一些实施方式中，提供了在晚期实体瘤的肿瘤新生血管中靶向PSMA的方法。
在一些实施方式中，提供了结合至PSMA的抗体。所述抗体包含铰链区，其中所述铰链区包括以下中的至少一种：a)SEQ ID NO：1(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)的肽序列，其中Xn1可以是不形成共价交联键的任何氨基酸，其中Xn2是以下中的一个：A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，并且其中Xn5可以是任何氨基酸；b)SEQ ID NO：2(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)的肽序列，其中Xn1可以是不与另一种相同的氨基酸形成共价交联键的任何氨基酸，其中Xn2可以是任何氨基酸，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，其中Xn5可以是任何氨基酸，其中Xn6可以是任何氨基酸，其中Xn7可以是任何氨基酸，其中Xn8可以是任何氨基酸，其中Xn9可以是任何氨基酸，并且其中Xn10可以是任何氨基酸(SEQ ID NO：208)；c)以下中至少一个的核心铰链序列：CVECPPCP(SEQ ID NO：57)、CPPCPPC(SEQ ID NO：52)或CPPCPPCPPC(SEQ ID NO：54)，其连接至ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：48)的上部铰链序列；或者d)不含能够与相应氨基酸交联的氨基酸的上部铰链区，和连接到所述上部铰链区的C-末端的核心铰链区，其中所述核心铰链区包含至少3个半胱氨酸。在一些实施方式中，所述抗体是全长抗体。在一些实施方式中，所述抗体是微抗体。在所述抗体的一些实施方式中，除铰链区外，所述抗体包含人源化的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体包含：SEQ ID NO：81中HCDR1的HCDR1；SEQ IDNO：82中HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO：83中HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO：84中LCDR1的LCDR1；SEQID NO：85中LCDR2的LCDR2；和SEQ ID NO：86中LCDR3的LCDR3。
在一些实施方式中，提供了编码本文所述的任何抗体的实施方式的铰链区的核酸。在所述核酸的一些实施方式中，除编码所述铰链区的序列外，所述核酸包含人序列。在一些实施方式中，提供了表达所述核酸所编码的抗体的细胞系。
在一些实施方式中，提供了产生本文所述的任何实施方式的抗体的方法，所述方法包括在细胞系中表达所述抗体。
在一些实施方式中，提供了治疗对其有需要的受试者中病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所提供的任何实施方式的抗体。
CD8-IAB22M
CD8(分化抗原簇8)是跨膜糖蛋白，它是T细胞(包括细胞毒性T细胞)亚类的特异性标志物。CD8的表达还出现在一些自然杀伤细胞和树突状细胞上以及一些T细胞淋巴瘤亚群(subset，亚组)上。CD8作为CD8α和CD8β亚基的杂二聚体或者作为CD8α同型二聚体组装。组装的二聚体CD8复合物与T细胞受体(TCR)一同起到共受体的作用以识别通过MHC I型细胞的抗原递呈。CD8在T细胞发育和成熟T细胞激活中起作用。T细胞定位的变化可以反映免疫应答的进行并且可以随时间发生。通过SEQ ID NO：134和135显示了CD8亚基的实例。
本文描述了抗原结合构建体，其包括结合至靶标分子CD8的抗体及其片段，如微抗体。在一些实施方式中，结合CD8抗原的抗原结合构建体可以是抗体、微抗体和/或抗体的其它片段，如scFv。图14B、15B、16B-16D、20C-20G、22B、36B、40(SEQ ID NO：105和106)、41(SEQID NO：106)、42(SEQ ID NO：107)、43(SEQ ID NO：108)、44(SEQ ID NO：109)、45(SEQ IDNO：110)、46(SEQ ID NO：111)和66中显示了抗CD8的抗原结合构建体的一些实施方式。
本文所提供的一些实施方式涉及将治疗剂靶向CD8的方法。所述方法可以包括向受试者施用如本文所述的抗原结合构建体，例如，CD8抗原结合构建体。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体结合至治疗剂。
抗原结合构建体可以用于检测靶标分子(CD8和/或CD8+细胞，例如，某些种类的T细胞)的存在、定位和/或量。这些抗原结合构建体还可以用于将治疗剂靶向表达所述靶标分子的细胞。在一些实施方式中，提供了使用抗原结合构建体(包括抗体，以及构建体，如微抗体)检测靶标分子(或“靶标”)是否存在的方法。在一些实施方式中，提供了出于治疗目的使用所述抗原结合构建体的方法。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体使得能够检测人CD8，它是存在于T细胞亚群表面上用于免疫系统诊断成像的特异性生物标志物。CD8的成像使得能够体内检测T细胞定位。T细胞定位的变化可以反映免疫应答的进行并且由于多种治疗性治疗或甚至疾病状态而可以随时间发生。
另外，CD8在激活对细胞溶解性T细胞的激活重要的下游信号通路中起作用，所述细胞溶解性T细胞起到清除病毒病原体和提供对肿瘤的免疫性的作用。CD8阳性T细胞可以识别抗原递呈细胞的MHCI蛋白内出现的短肽。在一些实施方式中，抗CD8的工程设计片段可以强化通过T细胞受体的信号传导，并提高受试者清除病毒病原体和对肿瘤抗原应答的能力。因此，在一些实施方式中，本文所提供的抗原结合构建体可以是激动剂并且可以激活CD8靶标。
在一些实施方式中，检测靶标CD8是否存在。可以基于样品中抗原结合构建体是否存在来检测靶标是否存在。在从样品除去和/或消除所述抗原结合构建体之后，例如，通过清洗和/或代谢消除，样品中剩余的抗原结合构建体可以指示靶标的存在，而样品中抗原结合构建体的不存在可以指示靶标的不存在。
一些实施方式包括检测人CD8，它是存在于T细胞亚群表面上用于免疫系统诊断成像的特异性生物标志物。靶标分子的成像可以使得能够体内检测T细胞定位。T细胞定位的变化可以反映免疫应答的进行并且由于多种治疗性治疗或甚至疾病状态而可以随时间发生。例如，在免疫疗法中，使T细胞定位成像可以是有用的。过继免疫疗法是一种疗法形式，其中体外操控患者自身的T细胞并将其再引入所述患者。对于这种治疗形式，T细胞成像对于监控和/或确定治疗状态可以是有用的。因此，在一些实施方式中，监控靶标分子定位可以在药物开发过程中用于分析作用机制、效力和/或安全性和/或可以帮助疾病的临床控制。
本文所提供的一些实施方式涉及将治疗剂靶向CD8的方法。所述方法可以包括向受试者施用如本文所述的抗原结合构建体，例如，CD8抗原结合构建体。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体结合至治疗剂。
根据本发明公开的实施方式，可以用作可检测标志物的毒素包括(但不限于)篦麻毒素、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、脱氧核糖核酸酶I、葡萄球菌肠毒素-A、商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。
在一些实施方式中，当结合至抗原结合构建体时，在治疗应用中作为药物载体使用纳米颗粒，所述纳米颗粒将化疗剂、激素治疗剂、放疗剂、毒素或本领域中已知的任何其它细胞毒性剂或抗癌剂递送至在细胞表面上过表达所述靶标的癌性细胞。
抗原结合构建体可以用于将治疗分子，例如，细胞毒素，靶向靶标阳性细胞，如表达CD8的细胞。因此，一些实施方式包括将治疗剂靶向靶标阳性细胞的方法。所述方法可以包括将如本文所述的抗原结合构建体施用于受试者。所述受试者可以是需要的受试者，例如，需要消除或中和至少一些靶标阳性细胞的受试者。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体包含至少一种如本文所述的治疗剂。在一些实施方式中，所述治疗剂可以通过共价键，如二硫键直接结合至抗原结合构建体。在一些实施方式中，所述受试者可以受益于CD8阳性细胞向另一种细胞或试剂的定位。
任选地，在包含至少一种治疗剂的抗原结合构建体施用之前和/或之后，确定患者靶标阳性细胞的数目和/或定位。例如，在施用前，确定靶标阳性细胞的数目和/或定位可以指示患者是否可能受益于靶标阳性细胞的中和和/或去除。在施用后，确定靶标阳性细胞的数目和/或定位可以指示是否除去了患者中的靶标阳性细胞。
术语“CD8依赖性病症”包括对其存在免疫学组分(包括对癌症免疫疗法的应答)的癌症、自身免疫病、炎症病症等。
在一些实施方式中，提供了结合至CD8的微抗体。所述微抗体包含含有下列的多肽：结合至CD8的单链可变区片段(scFv)，所述scFv包含连接可变轻链(VL)域的可变重链(VH)域；和在所述铰链的每条链上包含至少3个半胱氨酸的变体铰链区。在一些实施方式中，所述微抗体还包含人IgG CH3序列。在一些实施方式中，所述微抗体还包含可检测标志物，其选自放射性物质、染料、造影剂、荧光化合物、生物发光化合物、酶、增强剂和纳米颗粒。
在一些实施方式中，本文所提供的微抗体包含：SEQ ID NO：75中HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO：76中HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO：77中HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO：78中LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO：79中LCDR2的LCDR2；和SEQ ID NO：80中LCDR3的LCDR3。在本文所提供的微抗体的一些实施方式中，所述可变重链(VH)域和所述可变轻链(VL)域是人序列。
在一些实施方式中，提供了编码本文所述的任何实施方式的抗体的核酸。在一些实施方式中，提供了产生本文所述的任何微抗体实施方式的细胞系。在一些实施方式中，提供了包含本文所述的微抗体的任何实施方式和可检测标志物的试剂盒。
在一些实施方式中，提供了检测CD8是否存在的方法。所述方法包括：将本文所提供的任何微抗体实施方式应用于样品；和检测其抗原结合构建体与CD8的结合或未结合。在所述方法的一些实施方式中，所述微抗体包含可检测标志物，其选自放射性物质、染料、造影剂、荧光化合物、生物发光化合物、酶、增强剂和纳米颗粒。在所述方法的一些实施方式中，应用所述微抗体包括施用所述微抗体至受试者。在所述方法的一些实施方式中，检测其微抗体与CD8的结合或未结合包括正电子发射断层成像术。在一些实施方式中，所述方法还包括将第二抗体或其片段应用于样品，其中所述第二抗体或其片段特异性结合至所述微抗体。在所述方法的一些实施方式中，将其微抗体与样品培育不超过1小时。
在一些实施方式中，提供了将治疗剂靶向CD8的方法。所述方法包括将本文所提供的微抗体的任何实施方式施用于受试者，其中将所述微抗体结合至治疗剂。
在一些实施方式中，提供了在对其有需要的受试者中靶向表达CD8的T淋巴细胞的方法。所述方法包括向所述受试者施用本文所提供的任一个实施方式的微抗体。在一些实施方式中，提供了中和表达CD8的T淋巴细胞的方法。在一些实施方式中，所述受试者具有以下中的至少一种：无能CD8 T细胞(anergic CD8 T cells)、功能缺陷型CD8 T细胞、自身反应性CD8 T细胞、过度反应性CD8 T细胞(over-reactive CD8 T cells)、抑制性CD8 T细胞、误定位CD8 T细胞(mislocalized CD8 T cells)或CD8 T细胞淋巴瘤。在一些实施方式中，所述受试者具有与以下中至少一种有关的CD8 T细胞：类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、全身性红斑狼疮、自身免疫、炎性病况、信号传导缺陷或共刺激缺陷。
在一些实施方式中，提供了结合至CD8的抗体。所述抗体包含铰链区，其中所述铰链区包括以下中的至少一种：a)SEQ ID NO：1(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)的肽序列，其中Xn1可以是不形成共价交联键的任何氨基酸，其中Xn2是以下中的一个：A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，并且其中Xn5可以是任何氨基酸；b)SEQ ID NO：2(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)的肽序列，其中Xn1可以是不与另一种相同的氨基酸形成共价交联键的任何氨基酸，其中Xn2可以是任何氨基酸，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，其中Xn5可以是任何氨基酸，其中Xn6可以是任何氨基酸，其中Xn7可以是任何氨基酸，其中Xn8可以是任何氨基酸，其中Xn9可以是任何氨基酸，并且其中Xn10可以是任何氨基酸(SEQ ID NO：208)；c)以下中至少一个的核心铰链序列：CVECPPCP(SEQ ID NO：57)、CPPCPPC(SEQ ID NO：52)或CPPCPPCPPC(SEQ ID NO：54)，其连接至ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：48)的上部铰链序列；或者d)不含能够与相应氨基酸交联的氨基酸的上部铰链区，和连接到所述上部铰链区的C-末端的核心铰链区，其中所述核心铰链区包含至少3个半胱氨酸。在一些实施方式中，所述抗体是全长抗体。在一些实施方式中，所述抗体是微抗体。在所述抗体的一些实施方式中，除铰链区外，所述抗体包含人源化的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体包含：SEQ ID NO：75中HCDR1的HCDR1；SEQ IDNO：76中HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO：77中HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO：78中LCDR1的LCDR1；SEQID NO：79中LCDR2的LCDR2；和SEQ ID NO：80中LCDR3的LCDR3。
在一些实施方式中，提供了编码本文所述的任何抗体的实施方式的铰链区的核酸。在所述核酸的一些实施方式中，除编码所述铰链区的序列外，所述核酸包含人序列。在一些实施方式中，提供了表达所述核酸所编码的抗体的细胞系。
在一些实施方式中，提供了产生本文所述的任何实施方式的抗体的方法，所述方法包括在细胞系中表达所述抗体。
在一些实施方式中，提供了治疗对其有需要的受试者中病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所提供的任何实施方式的抗体。
5T4-IAB20M
5T4是癌胚糖蛋白，其在所选择的成年组织中弱表达，但在多种类型的癌，包括结肠直肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌和前列腺癌中强烈表达。5T4的表达存在于原发性和转移性癌症中，并且表达水平与疾病发展相关，从而使5T4成为非常有前景的生物标志物。通过SEQ ID NO：133显示了5T4蛋白的实例。
5T4-特异性成像剂可以在特异性方面提供优于其它成像剂，如FDG(基于代谢变化检测)的显著优势。此外，在开发靶向5T4的疗法期间，特异性靶向5T4的成像剂可以是有价值的工具。例如，在靶向5T4的疗法治疗后，所述成像剂可以用于监控患者。就前列腺癌来说，FDA批准的SPECT成像剂以Prostascint为商品名上市销售，但是具有大量限制，这是因为所述全抗体是鼠科的(重复施用的免疫原性问题)并且表位是生物标志物PSMA的内部表位(准确度有限)。本发明的5T4抗原结合构建体可以具有显著优于Prostascint的优势，因为它们可以结合5T4的胞外表位，对于成像具有优化的药物动力学，并且是人源化的。
5T4蛋白也称为滋养母细胞糖蛋白或TPBG。5T4蛋白的实例在本领域中是已知的，并且包括(例如)SEQ ID NO：133的5T4蛋白。
抗人5T4靶标的治疗性抗体和抗体融合蛋白已在开发，其包括鼠科抗体“H8”。另外，目前Oxford Biomedica针对5T4抗原的名为Trovax的癌症疫苗正处于临床开发。
5T4-特异性成像剂可以在特异性方面提供优于基于代谢变化检测的其它成像剂(如FDG)的显著优势。此外，在开发靶向5T4的疗法期间，特异性靶向5T4的成像剂可以是有价值的工具。例如，在靶向5T4的疗法治疗后，所述成像剂可以用于监控患者。就前列腺癌来说，FDA批准的SPECT成像剂以Prostascint为商品名上市销售，但是具有大量限制，这是因为所述全抗体是鼠科的(重复施用的免疫原性问题)并且表位是生物标志物PSMA的内部表位(准确度有限)。本发明的抗原结合构建体可以具有显著优于Prostascint的优势，因为它们可以结合5T4的胞外表位，对于成像具有优化的药物动力学，并且是人源化的。
在一些实施方式中，结合5T4抗原的抗原结合构建体可以是抗体、微抗体和/或抗体的其它片段，如scFv。图28B-28E、32、36C、54(SEQ ID NO：119和120)、55(SEQ ID NO：120)、56(SEQ ID NO：121)、57(SEQ ID NO：122)、58(SEQ ID NO：123)、59(SEQ ID NO：124)、67、68中显示了抗5T4的抗原结合构建体的一些非限制性实施方式。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体可以连接至治疗剂以治疗一种形式的癌症，其包括(但不限于)结肠直肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌和/或前列腺癌。
在一些实施方式中，所述5T4抗原结合构建体可以作为独立构建体(例如，无结合其上的毒素)用作治疗剂。尽管与全抗体相比，片段具有较短的半衰期，这对于疗法来说是不太理想的，但是这些形式基于它们较小的尺寸可以显示出改善的肿瘤渗透，并且当适当配备细胞毒性药物或放射性同位素时，这些形式可以是治疗有效的。
5T4是快速内化抗原，这使其适合于抗体药物-结合物方法。在一些实施方式中，另一种治疗方法是通过连接适当的放射性标记，如β-发射体钇-90的放射免疫疗法，其可以将细胞破坏和死亡递送至局部癌性组织。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体用于靶向表达5T4抗原的细胞，其包括(例如)结肠直肠癌细胞、肾癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞和/或前列腺癌细胞。
在治疗之前和期间，对于抗体靶标的存在使患者整个身体成像的能力提供了用于个性化患者管理的有价值的信息。在测试抗体疗法的安全性和效力期间，它是有用的，从而能够选择和测试对表达抗体靶标(作为他们疾病发展的一部分)的患者的治疗。
5T4在多种不同的癌，包括结肠直肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌和前列腺癌中过表达。已证明成像剂，如FDG-PET对于检测多种这些癌症类型是相当有效的，但是目前的成像实践对卵巢癌和前列腺癌不足够准确。在一些实施方式中，可以诊断和/或用本文所提供的多种5T4构建体治疗任何这些病症。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体可以是人中的临床成像剂(PET/SPECT)。由于5T4在多种癌症类型(包括结肠直肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌和前列腺癌)中过表达，因此这些5T4抗原结合构建体可以用于这些癌症的靶向诊断检测。在一些实施方式中，这可以用于检测卵巢癌和/或前列腺癌。
术语“5T4依赖性病症”包括其中5T4在病症本身中起作用的任何病症。在一些实施方式中，这表示5T4的过表达。所述病症的实例包括多种癌症类型，如，例如，结肠直肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌和前列腺癌。
在一些实施方式中，提供了结合至5T4的微抗体。所述微抗体包含含有下列的多肽：结合至5T4的单链可变区片段(scFv)，所述scFv包含连接可变轻链(VL)域的可变重链(VH)域；和在所述铰链的每条链上包含至少3个半胱氨酸的变体铰链区。在一些实施方式中，所述微抗体还包含人IgG CH3序列。在一些实施方式中，所述微抗体还包含可检测标志物，其选自放射性物质、染料、造影剂、荧光化合物、生物发光化合物、酶、增强剂和纳米颗粒。
在一些实施方式中，本文所提供的微抗体包含：SEQ ID NO：87中HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO：88中HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO：89中HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO：90中LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO：91中LCDR2的LCDR2；和SEQ ID NO：92中LCDR3的LCDR3。在本文所提供的微抗体的一些实施方式中，所述可变重链(VH)域和所述可变轻链(VL)域是人序列。
在一些实施方式中，提供了编码本文所述的任何实施方式的抗体的核酸。在一些实施方式中，提供了产生本文所述的任何微抗体实施方式的细胞系。在一些实施方式中，提供了包含本文所述的微抗体的任何实施方式和可检测标志物的试剂盒。
在一些实施方式中，提供了检测5T4是否存在的方法。所述方法包括：将本文所提供的任何微抗体实施方式应用于样品；和检测其抗原结合构建体与5T4的结合或未结合。在所述方法的一些实施方式中，所述微抗体包含可检测标志物，其选自放射性物质、染料、造影剂、荧光化合物、生物发光化合物、酶、增强剂和纳米颗粒。在所述方法的一些实施方式中，应用所述微抗体包括施用所述微抗体至受试者。在所述方法的一些实施方式中，检测微抗体与靶标抗原的结合或未结合包括正电子发射断层成像术。在一些实施方式中，所述方法还包括将第二抗体或其片段应用于样品，其中所述第二抗体或其片段特异性结合至所述微抗体。在所述方法的一些实施方式中，将其微抗体与样品培育不超过1小时。
在一些实施方式中，提供了将治疗剂靶向5T4的方法。所述方法包括将本文所提供的微抗体的任何实施方式施用于受试者，其中将所述微抗体结合至治疗剂。
在一些实施方式中，提供了在对其有需要的受试者中靶向5T4的方法。所述方法包括向所述受试者施用本文所提供的任一个实施方式的微抗体。在所述方法的一些实施方式中，所述受试者患有以下病症中的至少一种：结肠直肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌和前列腺癌肿瘤或癌症。在一些实施方式中，所述受试者患有原发性癌或转移性癌中的至少一种。在一些实施方式中，所述受试者患有早期病症。在一些实施方式中，所述受试者患有中期病症。在一些实施方式中，所述受试者患有晚期病症。
在一些实施方式中，提供了结合至5T4的抗体。所述抗体包含铰链区，其中所述铰链区包括以下中的至少一种：a)SEQ ID NO：1(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)的肽序列，其中Xn1可以是不形成共价交联键的任何氨基酸，其中Xn2是以下中的一个：A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，并且其中Xn5可以是任何氨基酸；b)SEQ ID NO：2(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)的肽序列，其中Xn1可以是不与另一种相同的氨基酸形成共价交联键的任何氨基酸，其中Xn2可以是任何氨基酸，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，其中Xn5可以是任何氨基酸，其中Xn6可以是任何氨基酸，其中Xn7可以是任何氨基酸，其中Xn8可以是任何氨基酸，其中Xn9可以任何氨基酸，并且其中Xn10可以是任何氨基酸(SEQ ID NO：208)；c)以下中至少一个的核心铰链序列：CVECPPCP(SEQ ID NO：57)、CPPCPPC(SEQ ID NO：52)或CPPCPPCPPC(SEQ ID NO：54)，其连接至ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：48)的上部铰链序列；或者d)不含能够与相应氨基酸交联的氨基酸的上部铰链区，和连接到所述上部铰链区的C-末端的核心铰链区，其中所述核心铰链区包含至少3个半胱氨酸。在一些实施方式中，所述抗体是全长抗体。在一些实施方式中，所述抗体是微抗体。在所述抗体的一些实施方式中，除铰链区外，所述抗体包含人源化的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗体包含：SEQ ID NO：87中HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO：88中HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO：89中HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO：90中LCDR1的LCDR1；SEQ IDNO：91中LCDR2的LCDR2；和SEQ ID NO：92中LCDR3的LCDR3。
在一些实施方式中，提供了编码本文所述的任何抗体的实施方式的铰链区的核酸。在所述核酸的一些实施方式中，除编码所述铰链区的序列外，所述核酸包含人序列。在一些实施方式中，提供了表达所述核酸所编码的抗体的细胞系。
在一些实施方式中，提供了产生本文所述的任何实施方式的抗体的方法。所述方法包括在细胞系中表达所述抗体。
在一些实施方式中，提供了治疗对其有需要的受试者中病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所提供的任何实施方式的抗体。
CD3-IAB25M
CD3(分化抗原簇3)与单克隆抗体OKT3同时发现。起初，发现OKT3结合至所有成熟的外周T细胞，并且随后，作为TCR-CD3复合物的一部分确定CD3ε亚基是OKT3所结合的细胞表面抗原(Kung,P.等人,"Monoclonal antibodies defining distinctive human T cellsurface antigens,"Science,206卷,No.4416,347-349页,1979)。通过SEQ ID NO：136-139显示了CD3亚基的实例。随后，作为移植排斥的免疫抑制剂测试了OKT3，初期试验研究了急性肾同种异体移植排斥(Cosimi,A.B.等人,"Treatment of acute renal allograftrejection with OKT3 monoclonal antibody,"Transplantation,32卷,No.6,535-539页,1981)。
在一些实施方式中，提供了抗原结合构建体，其包括结合至靶标分子CD3的抗体及其片段，如微抗体。这些抗原结合构建体可以用于检测靶标分子(CD3和/或CD3+细胞)的存在、定位和/或量。这些抗原结合构建体还可以用于调控免疫细胞上与CD3表达有关的生物活性和用于将治疗剂靶向表达CD3蛋白的细胞。在一些实施方式中，提供了使用抗原结合构建体(包括抗体，以及构建体，如微抗体)检测靶标分子(或“靶标”)是否存在的方法。在一些实施方式中，提供了出于治疗目的使用所述抗原结合构建体的方法。
本文所公开的CD3微抗体的一些实施方式还可以用作治疗性微抗体，例如，通过由TCR复合物的CD3ε域中和T细胞和通过FOXP3上调来上调T调控细胞，从而调控免疫系统反应(Saruta,M.等人,"Characterization of FOXP3+CD4+regulatory T cells in Crohn'sdisease,"Clin.Immunol.,125卷,No.3,281-290页,2007)。这些治疗剂不但在治疗组织/器官同种移植，而且在治疗自体免疫疾病，如，举例来说，类风湿性关节炎、多发性硬化、1型糖尿病和红斑狼疮中具有应用。
已通过非来源于OKT3的人源化抗-CD3抗体Visilizumab实施了初始概念验证(proof-of-concept)临床前成像(Malviya，G.等人,"Radiolabeled humanized anti-CD3monoclonal antibody Visilizumab for imaging human T-lymphocytes,"50卷,No.10,1683-1691页,2009)。CD3+T细胞的成像对于抗-CD3疗法是有用的，这是因为如果所关心的器官已彻底被CD3+T细胞浸润，则所述治疗是有效的。潜在的CD3成像剂将允许选择患者和监控治疗的方法。使用全长抗体成像通常在注射后需要比本文所提供的片段更长的时间以用于最优成像。
在一些实施方式中提供了抗-CD3抗原结合构建体，如微抗体。所述抗原结合构建体可以用于(例如)成像和用于治疗多种涉及免疫系统的病症。
在一些实施方式中，结合CD3抗原的抗原结合构建体可以是抗体、微抗体和/或抗体的其它片段，如scFv。图33、36D、69中显示了抗CD3的抗原结合构建体的一些非限制性实施方式。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体可以用作治疗剂而无需连接至另一种分子，如毒素(参见，例如，Chatenoud,L.等人,"CD3-specific antibodies:a portal to thetreatment of autoimmunity,"Nat.Rev.Immunol.,7卷,No.8,622-632页,2007)。这些抗原结合构建体还可以用于调控免疫细胞上与CD3表达有关的生物活性以治疗多种疾病，包括癌症、糖尿病、自身免疫病况和炎性病况。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体单独可以用作免疫抑制剂并且显示出抑制CD3信号传导的活性。
本文所公开的CD3抗原结合构建体还可以用作治疗性抗原结合构建体，例如，通过由TCR复合物的CD3ε域中和T细胞和通过FOXP3上调来上调T调控细胞，从而调控免疫系统反应(Saruta,M.等人,2007)。这些治疗剂不但在治疗组织/器官同种异体移植，而且在治疗自体免疫疾病，如，举例来说，类风湿性关节炎、多发性硬化、1型糖尿病和红斑狼疮中具有应用。
在一些实施方式中，抗原结合构建体，如微抗体可以含有来自Teplizumab的重链可变区和轻链可变区的一个或多个CDR。
在一些实施方式中，本文所提供的一个或多个抗原结合构建体可以与其它免疫细胞靶向试剂，如抗OX40、CD134、CD40、CD154、CD80、CD86、ICOS、CD137的抗体和/或IL-1受体拮抗剂组合。在一些实施方式中，抗CD3的微抗体降低免疫应答并且无需将其它治疗剂结合至所述抗原结合构建体。因此，在一些实施方式中，提供微抗体用于治疗自身免疫性糖尿病或涉及T细胞的其它自身免疫病况，所述微抗体未结合至或包含治疗剂。
在一些实施方式中，通过由TCR复合物的CD3ε域来刺激和耐受T细胞和/或通过由FOXP3上调来上调T调控细胞，所述CD3抗原结合构建体可以用作治疗性抗原结合构建体以调控免疫系统反应(Saruta,M.等人,2007)。这些治疗剂不但可以用于治疗组织/器官同种异体移植，而且还可以用于治疗自体免疫疾病，如类风湿性关节炎、多发性硬化、1型糖尿病、红斑狼疮等。
在一些实施方式中，所述抗原结合构建体可以用作治疗剂而无需连接至另一种分子，如毒素(参见，例如，Chatenoud,L.等人,2007)。这些抗原结合构建体还可以用于调控免疫细胞上与CD3表达有关的生物活性以治疗多种疾病，包括癌症、糖尿病、自身免疫病况和炎性病况。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体单独可以用作免疫抑制剂并且显示出抑制CD3信号传导的活性。
不受任何一项理论的限制，在一些实施方式中，双特异性抗原结合构建体结合至靶标阳性细胞上的靶标，并且结合至第一细胞上的第一抗原(其可以不同于CD3)，并因此使所述靶标阳性细胞接近所述第一细胞。例如，可以使CD3+细胞接近癌细胞，并且可以有利于对该癌细胞的免疫应答。
在一些实施方式中，所述微抗体可以结合至治疗剂以用于CD3依赖性病症的治疗。
所述受试者可以患有任何一些CD3依赖性病症，其(例如)可以是类风湿性关节炎、多发性硬化、1型糖尿病或红斑狼疮。
在一些实施方式中，如本文所提供的抗原结合构建体使得不期望的副作用显著减少，其包括(但不限于)促炎细胞因子释放、T细胞激活和/或细胞增殖。
在一些实施方式中，提供了治疗方法，其中所述受试者可以受益于抗CD3的抗原结合构建体的应用，但是作为替代，施用微抗体，而不是全长构建体，从而在抗原结合构建体体内结合至CD3之后，导致免疫细胞激活的较低刺激。
在一些实施方式中，药物组合物中微抗体的量大于另外对于全长构建体(例如，全长OKT3)所施用的量。在一些实施方式中，如果已作为全长构建体施用所述量，则所施用的量将在受试者中引起细胞因子风暴(cytokine storm)。在一些实施方式中，可以施用而不导致细胞因子风暴或细胞因子释放综合征(CRS)的量为至少10微克/m2，例如，可以施用至少10、17、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或至少1000微克/m2所述微抗体形式。在一些实施方式中，该量不会导致细胞因子释放综合征。在一些实施方式中，该量不会导致1级和/或2级细胞因子释放综合征。在一些实施方式中，这量不会导致以下症状中的一种或多种：皮疹、头痛、恶心、呕吐和/或寒战/寒颤/发热。在一些实施方式中，如果使用全长抗体，则这些症状通常将在剂量施用的第1天或者第5或6天发生，而如果使用微抗体，则这些症状将不会出现。
在一些实施方式中，提供了治疗需要CD3封闭疗法的个体的方法，并且其中所述个体还具有发生和/或经受细胞因子风暴的风险。在一些实施方式中，所述方法包括向具有经受细胞因子风暴风险的受试者施用全长抗体的微抗体构建体；然而，所述微抗体形式将使得如果将全长抗体施用于所述受试者，则将会发生的任何免疫细胞激活的强度降低。在一些实施方式中，所述微抗体可以共有相同的CDR(或者类似的CDR)和/或相同的重链和轻链可变区(或者类似的重链和轻链可变区)。在一些实施方式中，微抗体的施用使得在发生与CD3的结合之后免疫细胞激活的刺激降低。在一些实施方式中，所述微抗体的施用使得在发生与CD3的结合之后所释放的细胞因子的水平降低。在一些实施方式中，所述微抗体的施用使得与如果使用全长构建体相比，在结合至CD3之后所发生的激活的量降低。
在一些实施方式中，可以施用CD3疗法而无需施用对抗疗法(counter therapy)，其中所述对抗疗法将设计以降低或阻断细胞因子风暴。在一些实施方式中，这包括向受试者施用微抗体抗原结合构建体，而不是全长构建体。
在一些实施方式中，提供了降低细胞因子风暴的强度和/或可能性的方法，所述方法可以包括鉴别接受结合CD3的抗原结合构建体的受试者，和向所述受试者施用有效量的结合至CD3的微抗体。在一些实施方式中，所述构建体是本文所提供的那些中的一个或多个。
如本文所述，对于结合至CD3的抗原结合构建体，降低和/或避免细胞因子风暴(或者其它方面，如降低激活和/或增殖)的能力可以是特别相关的。在一些实施方式中，避免这些问题的方法(例如，使用微抗体形式)可以用于其它靶标蛋白，例如，对其来说抗体与靶标的结合导致细胞因子风暴或激活/增殖的任何靶标蛋白。在一些实施方式中，所述方法可以用于允许避免受试者中不适当的和/或破坏性的激活，其中所述激活响应二价抗原结合蛋白而发生。在一些实施方式中，可以使用结合至CD28的CD28抗原结合蛋白(例如，微抗体)，而不是CD3抗原结合蛋白。
在一些实施方式中，CD3微抗体的使用允许受试者接受足够水平的抗原结合构建体，从而允许治疗CD3依赖性病症。在一些实施方式中，所述受试者可以接受CD3结合分子，无需同时和/或随后接受胰岛素注射。在一些实施方式中，CD3微抗体构建体的使用使得能够减弱CD3驱动的反应，而不会在该过程中破坏过多的B细胞。在一些实施方式中，降低的激活/增殖包括T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞的激活和/或增殖。
在一些实施方式中，向需要的受试者提供抗原结合构建体包括提供有效量的抗CD3的抗原结合构建体，其中所述抗原结合构建体结合至CD3，但不导致细胞因子释放、激活或增殖中至少一种的量显著升高。
在一些实施方式中，提供了对免疫细胞施用结合CD3的治疗剂的方法。所述方法包括向需要降低CD3的量的受试者提供如本文所提供的抗原结合构建体(例如，任何抗CD3的微抗体)。所述抗原结合构建体结合至CD3；然而，如通过本文所提供的数据所显示的，所述抗原结合构建体不导致细胞因子释放、激活或增殖中至少一种的大量升高。在一些实施方式中，CD3的降低表示可用的游离CD3蛋白的量降低。在一些实施方式中，CD3的降低表示表达CD3蛋白的细胞减少。
在一些实施方式中，所述构建体不导致处于将不可接受地损害受试者的水平的细胞因子风暴。
在一些实施方式中，提供了治疗患有CD3依赖性病症的受试者的方法。所述方法包括向受试者提供有效量的抗原结合构建体。所述抗原结合构建体是结合至CD3的微抗体。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体结合至治疗剂。在一些实施方式中，所述抗原结合构建体包含含有第一结合位点和第二结合位点的二价排布，其中所述第一结合位点结合至CD3，并且其中所述第二结合位点结合至CD3。有效量是以不同形式—具体地，以全抗体形式(例如，OKT3)施用的抗原结合构建体的摩尔量，所述摩尔量将以使其对于治疗目的不可接受的强度引起细胞因子风暴。然而，当所述抗原结合构建体是微抗体时，该相同的摩尔量对于基于CD3的疗法仍有效，但是不引起不可接受水平的细胞因子风暴。
在一些实施方式中，由于本发明的构建体可以用于疗法，因此即使它们是二价的并且结合至CD3，仍可以使用CD3抗原结合构建体的治疗性构建体。在一些实施方式中，提供了抗原结合构建体，其体内结合至CD3，但不导致显著量的细胞因子释放、激活或增殖中的至少一种。
术语“CD3依赖性病症”包括类风湿性关节炎、多发性硬化、1型糖尿病、红斑狼疮、炎症性肠病、糖尿病、器官移植排斥、自体免疫疾病、过敏症以及其中T和/或自然杀伤(NK)细胞在病理学中起作用的其它病症。
“细胞因子风暴”也称为“细胞因子级联”或者“高细胞因子血症”，它是潜在致死的免疫反应，其涉及细胞因子和免疫细胞之间的正反馈环，多个细胞因子的水平高度提高。细胞因子风暴的症状是高烧、肿胀和发红、极度疲劳和恶心。在一些情况下，所述免疫反应可以是致死的。通常，一定水平的细胞因子释放是可接受的并且是例如抵抗感染时所必需的。当患有与流感有关的发热、寒战时，这些症状是免疫系统抵抗病毒的结果，因此这种水平是可接受的并且不是“细胞因子风暴”。然而，当过度刺激激活臂且其与抑制信号不平衡时，这些细胞因子可以导致器官和组织损伤并最终导致死亡。在一些实施方式中，本文所提供的构建体可以用于避免和/或最大程度减少细胞因子释放综合征，并因此可以应用于其中可以另外使用抗-T细胞全长抗体的情况。在一些实施方式中，本文所提供的任何针对细胞因子风暴的方法还可以应用于细胞因子释放综合征。
在一些实施方式中，所述受试者患有炎性和/或自身免疫病况。在一些实施方式中，所述病况选自以下中的至少一种：类风湿性关节炎、多发性硬化、1型糖尿病或红斑狼疮。
在一些实施方式中，所述细胞因子是参与由全长OKT3抗体施用所引起的细胞因子风暴的那些。在一些实施方式中，所述细胞因子包括IFNγ、IL-2、TNF-α或IL-17中的至少一种。
在一些实施方式中，提供了结合至CD3的微抗体。所述微抗体包含含有下列的多肽：结合至CD3的单链可变区片段(scFv)，所述scFv包含连接可变轻链(VL)域的可变重链(VH)域；和在所述铰链的每条链上包含至少3个半胱氨酸的变体铰链区。在一些实施方式中，所述微抗体还包含人IgG CH3序列。在一些实施方式中，所述微抗体还包含可检测标志物，其选自放射性物质、染料、造影剂、荧光化合物、生物发光化合物、酶、增强剂和纳米颗粒。
在一些实施方式中，提供了编码本文所述的任何实施方式的抗体的核酸。在一些实施方式中，提供了产生本文所述的任何微抗体实施方式的细胞系。在一些实施方式中，提供了包含本文所述的微抗体的任何实施方式和可检测标志物的试剂盒。
在一些实施方式中，提供了检测CD3是否存在的方法。所述方法包括：将本文所提供的任何微抗体实施方式应用于样品；和检测其抗原结合构建体与CD3的结合或未结合。在所述方法一些实施方式中，所述微抗体包含可检测标志物，其选自放射性物质、染料、造影剂、荧光化合物、生物发光化合物、酶、增强剂和纳米颗粒。在所述方法的一些实施方式中，应用所述微抗体包括施用所述微抗体至受试者。在所述方法的一些实施方式中，检测其微抗体与靶标抗原的结合或未结合包括正电子发射断层成像术。在一些实施方式中，所述方法还包括将第二抗体或其片段应用于样品，其中所述第二抗体或其片段特异性结合至所述微抗体。在所述方法的一些实施方式中，将其微抗体与样品培育不超过1小时。
在一些实施方式中，提供了将治疗剂靶向CD3的方法。所述方法包括将本文所提供的微抗体的任何实施方式施用于受试者，其中将所述微抗体结合至治疗剂。
在一些实施方式中，提供了在对其有需要的受试者中靶向表达CD3的T淋巴细胞的方法。所述方法包括向所述受试者施用本文所提供的任一个实施方式的微抗体。在一些实施方式中，提供了中和表达CD3的T淋巴细胞的方法。在一些实施方式中，所述受试者具有以下中的至少一种：无能CD3 T细胞、功能缺陷型CD3 T细胞、自身反应性CD3 T细胞、过度反应性CD3 T细胞、抑制性CD3 T细胞、误定位CD3 T细胞或CD3 T细胞淋巴瘤。在一些实施方式中，所述受试者具有与以下中至少一种有关的CD3 T细胞：类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、全身性红斑狼疮、自身免疫、炎性病况、信号传导缺陷或共刺激缺陷。
在一些实施方式中，提供了结合至CD3的抗体。所述抗体包含铰链区，其中所述铰链区包括以下中的至少一种：a)SEQ ID NO：1(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)的肽序列，其中Xn1可以是不形成共价交联键的任何氨基酸，其中Xn2是以下中的一个：A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，并且其中Xn5可以是任何氨基酸；b)SEQ ID NO：2(Xn1Xn2Xn3Xn4Xn5Xn6CXn7Xn8CXn9Xn10C)的肽序列，其中Xn1可以是不与另一种相同的氨基酸形成共价交联键的任何氨基酸，其中Xn2可以是任何氨基酸，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，其中Xn5可以是任何氨基酸，其中Xn6可以是任何氨基酸，其中Xn7可以是任何氨基酸，其中Xn8可以是任何氨基酸，其中Xn9可以是任何氨基酸，并且其中Xn10可以是任何氨基酸(SEQ ID NO：208)；c)以下中至少一个的核心铰链序列：CVECPPCP(SEQ ID NO：57)、CPPCPPC(SEQ ID NO：52)或CPPCPPCPPC(SEQ ID NO：54)，其连接至ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：48)的上部铰链序列；或者d)不含能够与相应氨基酸交联的氨基酸的上部铰链区，和连接到所述上部铰链区的C-末端的核心铰链区，其中所述核心铰链区包含至少3个半胱氨酸。在一些实施方式中，所述抗体是全长抗体。在一些实施方式中，所述抗体是微抗体。在所述抗体的一些实施方式中，除铰链区外，所述抗体包含人源化的氨基酸序列。
在一些实施方式中，对于CD3，所述抗体包含：表8的SEQ ID NO：174中HCDR1的HCDR1；表8的SEQ ID NO：175中HCDR2的HCDR2；表8的SEQ ID NO：176中HCDR3的HCDR3；表8的SEQ ID NO：177中LCDR1的LCDR1；表8的SEQ ID NO：97中LCDR2的LCDR2；和表8的SEQ ID NO：178中LCDR3的LCDR3。
在一些实施方式中，所述抗体包含：图65B或65C中HCDR1的HCDR1；图65B或65C中HCDR2的HCDR2；图65B或65C中HCDR3的HCDR3；图65B或65C中LCDR1的LCDR1；图65B或65C中LCDR2的LCDR2；和图65B或65C中LCDR3的LCDR3。
在一些实施方式中，结合CD3抗原的抗原结合构建体可以是抗体、微抗体和/或抗体的其它片段，如scFv。图65B和65C中显示了抗CD3的抗原结合构建体的一些非限制性实施方式。
在一些实施方式中，所述微抗体包含：图65B或65C中HCDR1的HCDR1；图65B或65C中HCDR2的HCDR2；图65B或65C中HCDR3的HCDR3；图65B或65C中LCDR1的LCDR1；图65B或65C中LCDR2的LCDR2；和图65B或65C中LCDR3的LCDR3。在本文所提供的微抗体的一些实施方式中，所述可变重链(VH)域和所述可变轻链(VL)域是人序列。
在一些实施方式中，提供了编码本文所述的任何抗体实施方式的铰链区的核酸。在所述核酸的一些实施方式中，除编码所述铰链区的序列外，所述核酸包含人序列。在一些实施方式中，提供了表达所述核酸所编码的抗体的细胞系。
在一些实施方式中，提供了产生本文所述的任何实施方式的抗体的方法。所述方法包括在细胞系中表达所述抗体。
在一些实施方式中，提供了治疗对其有需要的受试者中病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所提供的任何实施方式的抗体。
其它实施方式
在一些实施方式中，scFv或微抗体对于诊断成像具有优良的药物动力学性质。当前的技术使用通过全长抗体成像，由于全长抗体缓慢的血清清除，其需要显著更长的时间(注射后～7天)以产生对比度强的图像。微抗体提供了当天或次日成像的机会。对于患有快速发展疾病的患者，每一天都是至关重要的，并且在较早的时间点鉴别正确治疗方法的能力具有改善患者存活的潜力。当天或次日成像还为面对从较远地方过来接受治疗/诊断的众多患者的问题提供了后勤解决方案，这是因为当相对于全长抗体，使用微抗体成像时，将消除旅行期间的居住或一周后返回的需要。在一些实施方式中，暴露于较低剂量辐射使得个体能够成像多次并随时间跟踪疾病发展。
另外，在一些实施方式中，所述微抗体组分单体含有形成二硫键的铰链半胱氨酸残基。可以通过温和化学还原打开这些共价结合的半胱氨酸残基以提供用于半胱氨酸特异性结合的活性硫醇基团，同时维持二聚体微抗体分子的完整性。当前的化学结合方法包括以下位点特异性平台：在抗体的F(ab)'2区引入半胱氨酸，例如，Thio-Mabs(Roche)；Fc中位置239处的半胱氨酸(DISH-Mab,Seattle Genetics)、用于烷氧基胺接头形成的非天然氨基酸，如酮-苯丙氨酸(Ambrx)、用于点击-环加成的苯丙氨酸叠氮甲烷(Sutro)、用于转谷氨酰胺酶-依赖性结合的Fc区中的谷氨酰胺(Rinat-Pfizer)。mAb中的铰链-半胱氨酸提供了用于非位点-特异性硫醇-结合化学的化学处理。结合至赖氨酸也是非位点-特异的或者是随机的并且导致最高的非均一性。在一些实施方式中，可以在本文所提供的scFv、框架或抗原结合构建体的另一部分中引入位点特异的半胱氨酸。
在治疗之前和期间，对于抗体靶标的存在使患者整个身体成像的能力提供了用于个性化患者管理的有价值的信息。在测试抗体疗法的安全性和效力期间，它是有用的，从而能够选择和测试对于表达抗体靶标(作为他们疾病发展的一部分)的患者的治疗。
在一些实施方式中，与可用的抗体疗法匹配的scFv或微抗体诊断片段允许患者的疾病状态与适当的抗体疗法相匹配。
在一些实施方式中，提供了靶向靶标分子阳性细胞上第一抗原的方法。所述方法可以包括将双特异性抗原结合构建体应用于样品。所述双特异性抗原结合构建体可以包含如本文所述的抗原结合构建体。所述双特异性抗体或其片段可以包含结合至第一抗原的抗原结合构建体，例如，1、2、3、4、5或6个CDR、scFv或微抗体的单体。在一些实施方式中，所述双特异性抗体包含如本文所述的抗原结合构建体的1、2或3个HCDR和/或如本文所述的抗原结合构建体的1、2或3个LCDR。在一些实施方式中，所述双特异性抗原结合构建体包含如本文所述的抗原结合构建体的scFv。在一些实施方式中，所述双特异性抗原结合构建体包含如本文所述的VH或VL序列。在一些实施方式中，所述双特异性抗原结合构建体包含如本文所述的微抗体单体。在一些实施方式中，将所述双特异性抗原结合构建体体内应用于样品，例如，受试者的器官或组织。在一些实施方式中，将所述双特异性抗原结合构建体应用于体外样品。不受任何一项理论的限制，在一些实施方式中，双特异性抗原结合构建体结合至靶标阳性细胞上的靶标，并且结合至第一细胞上的第一抗原(其可以不同于第一靶标分子)，并因此使所述靶标阳性细胞接近所述第一细胞。例如，可以使第一靶标分子+细胞接近癌细胞，并且可以有利于对该癌细胞的免疫应答。在一些实施方式中，由第一靶标分子和第二靶标分子片段组成的双特异性抗原结合构建体可以使细胞毒性T细胞接近表达激活的第一靶标分子的免疫细胞或者表达第一靶标分子的肿瘤细胞以导致杀死所述靶细胞。在一些实施方式中，可以靶向任何免疫细胞(NK或B细胞或树突状细胞)并使其达到抗原表达细胞，如通过第二scFv的特异性所确定的。
微抗体构建体含有具有不同接头长度的抗原结合scFv，其可以处于VL-VH或VH-VL取向中的任一种。scFv可以连接至如表0.1所述的12个铰链序列中的任一个。scFv和适当的铰链可以与来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的CH3域连接。在一些实施方式中，通常与天然IgG1、IgG2和IgG3抗体中轻链配对的第一铰链半胱氨酸应突变至丝氨酸或丙氨酸或者其它适当的氨基酸以防止二硫键混杂和/或多联体化。为了减少半分子的存在或减少半分子的形成并提高体内稳定性，所述铰链区应含有至少3个半胱氨酸，从而与另一个单体形成至少3个二硫键。以适当距离彼此相距布置的铰链中每条链的3个半胱氨酸是有用的以允许适当的二硫键形成(表3)。以适当距离彼此相距布置的微抗体内铰链中的3个二硫键对于体内蛋白质稳定性和通过肝脏而不是肾脏清除的清除是有用的。铰链中至少3个(或更多)二硫键对于药物、螯合剂或荧光染料的位点特异性结合是有益的。如上所述构建的Mb保留了与亲代抗体类似的亲合力。在一些实施方式中，对于IgG1构建体，第一cys可以保持完整并且它似乎不是特别不利。
在一些实施方式中，可以通过组合如表3所示的任一个上部铰链、任一个核心铰链和任一个下部铰链序列产生包含上部铰链、核心铰链和下部铰链的微抗体或双特异性微抗体的铰链。
在一些实施方式中，所述铰链中的第一半胱氨酸残基可以改变为任何氨基酸。在一些实施方式中，所述上部铰链中的一个半胱氨酸残基可以改变为任何氨基酸。在一些实施方式中，所述核心铰链中的一个半胱氨酸残基可以改变为任何氨基酸。在一些实施方式中，所述核心铰链中的2个半胱氨酸残基可以改变为任何氨基酸。在一些实施方式中，所述上部铰链中的一个半胱氨酸残基和所述核心铰链中的一个半胱氨酸残基可以改变为任何氨基酸。在一些实施方式中，所述上部铰链中的一个半胱氨酸和所述核心铰链中的2个半胱氨酸残基可以改变为任何氨基酸。
根据情况，在以下实施例部分中讨论了所述实施例的构建体序列，并且还在表0.2中提供了所述构建体序列。
实施例1-微抗体结构
所述微抗体是～80kDa的二价共价结合的同型二聚体。每个单体(半分子)由通过约15-18个氨基酸的富含Gly-Ser的接头序列连接至相应可变轻链(VL)域的可变重链(VH)域组成。通过铰链序列将每个单链可变区片段(scFv)连接至人IgG CH3域。
包含所述铰链的二硫键的序列是重要的并且设计以防止与所述蛋白其它区域中存在的半胱氨酸残基之间不期望的二硫键混杂并且含有足够数目的半胱氨酸对以维持二聚体的体内完整性并且还作为位点特异性结合的可能位点。
到目前为止，如图1所示，已使用天然人IgG1的上部和核心铰链区以及连接至人IgG1 CH3域的延伸序列工程设计了大部分微抗体。如以下实施例所列，通常对于多种靶标分子评价具有两种取向-VL-VH(M1)和VH-VL(M2)-的scFv变体。
基于人IgG1的工程设计
在上述铰链(例如，γ1EH1)中，所述铰链中的第一半胱氨酸(图2顶部)产生了导致蛋白质不均一性的问题，如通过使用LC/MS的完整分子量分析结果所证明的。尽管半胱氨酸在铰链区中的重要性十分清楚，但是仍决定将该半胱氨酸突变为丝氨酸，从而导致产生了γ1EH2铰链(图2底部)。然而，由于似乎所述核心铰链中的2个剩余的半胱氨酸残基之间所形成的两个二硫键(图2底部)不足以维持二聚体的体内稳定性，因此确定这种铰链构建体未实现某些所期望的方面。
克服IgG1铰链序列问题的IgG2 Mb
为了解决以上提及的新引入的方面，进一步工程设计了微抗体。基于huIgG2，具有延伸序列的工程设计的微抗体在核心铰链中提供了第三半胱氨酸(相对于IgG1天然核心铰链，额外的半胱氨酸)以增加二硫键和提高蛋白质稳定性。使用连接至huIgG2 CH3域的人IgG2(huIgG2)铰链序列，工程设计了IAB2M和IAB22M的HuIgG2微抗体。
在与作为下部铰链的延伸序列组合的天然IgG2上部和核心铰链序列(γ2EH1)中，观察到聚集增加。反应性半胱氨酸(图3顶部；铰链的第一半胱氨酸)负责在IAB2M-γ2EH1形式中与huIgG2天然铰链(图3顶部)形成多联体，如通过图5A中所示的SDS-PAGE分析所观察到的。
因此，与对于IgG1铰链(γ1EH1)所做的类似，将铰链中的第一半胱氨酸(与轻链配对)突变成丝氨酸，从而导致产生了IgG2 EH2(γ2EH2)(图3底部)。具有该铰链的抗原结合构建体(γ2EH2)表达良好并且具有优良的体内稳定性。如通过质谱所检测的，在核心铰链中所有3个二硫键正确形成。通过具有γ2EH2的两个IAB2M和IAB22M构建体证明了稳定性。
评价了第一半胱氨酸改变为丝氨酸以及具有天然上部和下部铰链序列(γ2NH2)的进一步工程设计的huIgG2微抗体，并且发现所述蛋白质是体内稳定的(图4底部)。
实施例2-IAB2M的体外数据
表1显示了IAB2M变体的概要(图5B-5E中显示了SEQ ID NO)。图47-53中显示了IAB2M变体的其它实施方式。
表1
具有铰链变体γ1EHl、γ1EH2以及γ2EHl和γ2EH2的IAB2M的SDS-PAGE分析(图5A)显示通过EH2变体中第一铰链半胱氨酸的突变，所述半分子与二聚体的比值大大改善(半分子可以从20-30％减少至小于1％)。与γ2EH1相比，γ2EH2形式具有正确的二硫键并且无多联体(图5B-5E中的SEQ ID NO.)。由于核心铰链中额外的半胱氨酸的存在(3个，而不是2个)，与γ1EH2铰链变体相比，所述γ2EH2铰链变体显示出改善的稳定性并且具有较少的半分子。
通过完整分子量分析确认半分子的存在。在反相条件下，使用TSKgel Phenyl-5PW柱(2×75mm，Tosoh Biosciences)在60℃分离蛋白质样品并通过Agilent ESI-QTOF 6538型分析。图6A显示了IAB2Mγ1EH1变体的完整分子量分析。在顶部部分中显示了分离的半分子和全长分子的总离子色谱图。通过峰值积分，使用UV280迹线(未显示)定量微抗体变体中存在的半分子的百分比。将去卷积分子量用于分配并确认半分子的特性(identity)(中间部分)以及完整尺寸的分子量(下部部分)。图6B显示了IAB2Mγ2EH1变体的完整分子量分析。上部部分显示了反相条件下的总离子色谱图。中间部分显示了确认半分子存在的去卷积完整分子量，并且下部部分显示了确认的完整尺寸的分子量。图6C显示了IAB2Mγ1EH2变体的完整分子量分析。上部部分显示了反相条件下的总离子色谱图。中间部分显示了确认半分子存在的去卷积完整分子量，并且下部部分显示了确认的完整尺寸的分子量。图6D显示了IAB2Mγ2EH2变体的完整分子量分析。上部部分显示了总离子色谱图。下部部分显示了确认完整尺寸分子量分子存在的去卷积完整分子量。未检测到半分子。
IAB2M变体的FAC分析(图7A和7B)显示从先前使用的标准铰链γ1EH1改变铰链不会影响对LNCap-AR细胞(图5B、5C、5D)或C4-2 XCL细胞(图5B、5C、5E、7C)上表达的靶标抗原的结合亲合力。
对于帮助理解半分子形成的二硫键图谱绘制，通过用Tris pH 7.5中的6M盐酸胍使蛋白质变性制备了样品。向其中加入4-乙烯吡啶至30mM的浓度，然后在黑暗中培育1小时从而对游离半胱氨酸加帽(cap)。将该溶液稀释，使胍的浓度达到1M，然后使用胰蛋白酶/Lys-C消化。使消化在37℃过夜进行。分离前，将样品冷冻并干透。在此之后进行LC/MS，其中在0.05％的TFA水溶液中以0.05％TFA在90％乙腈中的梯度，使用梯度在Waters XbridgeBEH130 C18 4.6×150mm柱上分离肽混合物，并且使用ESI-QTOT质谱仪6538(Agilent)以阳离子模式鉴别分子量，并使用Agilent Mass Hunter软件去卷积。图8中显示了IAB2Mγ1EH1二聚体中鉴别的含有二硫键的肽。
IAB2Mγ1EH1的二硫键图谱显示了铰链区中正确形成的，例如，预期的二硫键的存在，并且还检测到了二硫键混杂。图8显示了所鉴别的二硫键的表，而图9显示了所述结果的说明。在预期的半胱氨酸残基之间(SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：184的半胱氨酸；SEQ IDNO：183和SEQ ID NO：185；SEQ ID NO：186的半胱氨酸)以及所述蛋白其它区域中存在的意外的半胱氨酸残基之间发生了二硫键(图8)。假设铰链中未配对的半胱氨酸可以引起二硫键混杂，由此常规二硫键的形成(实线)是受阻的(图9)。此外，未观察到VH二硫键(虚线)，推测这是由于质谱中胰蛋白酶水解的二硫键合肽未电离(并因此未检测到)所造成的。
形式改变为huIgG2 EH1(γ2EH1)不会改善IAB2M的稳定性。图10显示了所鉴别的二硫化物的图示。通过SDS-PAGE(图5A)，对于γ2EH1观察到明显的多联体形成。如在IAB2Mγ1EH1中，未观察到VH二硫键(虚线)，推测这是由于胰蛋白酶水解的二硫键合肽未有效电离并因此未在质谱中检测到所致。IAB2Mγ2EH1(图5D)显示出>10％的半分子(通过LC/MS，39,469.5Da)(图10和图6B)。如图10的部分(A)和(B)中所示，在色谱图中观察到了显著的半分子(峰1)。图6A(上部部分)显示出ΙΑΒ2Μγ1EH1的总离子流(TIC)色谱图，其中峰1和2分别是半分子和完整尺寸的分子。图6A的中间部分显示了具有峰值积分的UV280通道，从而允许确定半分子的百分比为11.1％。图6A(下部部分)显示了包含峰2的分子量。
实施例3-IAB2M的体内数据
在裸鼠中实施89Zr-Df-IAB2M-γ1EH1的PET/CT和生物分布(图5B)。在图11A中显示了在施用89Zr-Df-IAB2M-γ1-EH1后24h和48h，在右肩具有PSMA阳性22RVL异种移植的裸鼠的MIP PET/CT图像。将在48h来自3只小鼠的组织中的平均放射性吸收表示为注射剂量/克(ID/g)的百分比(图11B)。肿瘤吸收相对较低(6.1+1.2％ID/g)而肾吸收较高(23.3±6.2％ID/g)；几乎比肝脏吸收(14.1±1.6％ID/g)高2-倍。如果所述微抗体体内仍保持为二聚体，则预期蛋白质清除将通过肝脏发生。肾脏信号大于肝脏信号表明了不稳定性和半分子的体内形成。
在裸鼠中实施89Zr-Df-IAB2M-γ1EH2的PET/CT和生物分布(图5C)。在图12A中显示了在施用89Zr-Df-IAB2M-γ1-EH2后24h和47h，在右肩具有PSMA阳性22RVL异种移植的裸鼠的MIP PET/CT图像。将在47h来自2只小鼠的组织中的放射性吸收表示为注射剂量/克(ID/g)的百分比(图12B)。再次，在肾脏中观察到2-至3-倍更高的放射性吸收。如上所述，肾脏信号大于肝脏信号表明了不稳定性和半分子的体内形成。
在裸鼠中实施89Zr-Df-IAB2M-γ2EH2的PET/CT和生物分布(图5D)。在图13A中显示了在施用89Zr-Df-IAB2M-γ2EH2后24h和47h，在右肩具有PSMA阳性22RVL异种移植的裸鼠的MIP PET/CT图像。将在47h来自2只小鼠的组织中的放射性吸收表示为注射剂量/克(ID/g)的百分比(图13B)。获得了低肾脏吸收以及肾脏与肝脏的比值<1，这表明γ1EH2是稳定蛋白。
实施例4-IAB2M体内研究的总结(表2)
通过来源于IgG1的铰链区的铰链序列制备的微抗体显示出通过肾脏的高清除，从而表明了蛋白质体内的不稳定性和向半分子的解离(图11)。
将IgG1铰链区(γ1EH2)中第一铰链半胱氨酸向丝氨酸突变以预防与其它不成对的半胱氨酸的不期望的相互作用，从而产生了具有更好体外谱(体外分布)的蛋白质(例如，图5的SDS-PAGE数据)。然而，通过肾脏的高清除表明了蛋白质体内的不稳定性和向半分子的解离(图12)。
通过其中第一铰链半胱氨酸突变为丝氨酸(γ2EH2(图5D)和其它氨基酸(表3，提供了铰链区的概要))的IgG2铰链制备的微抗体通过肝脏清除，如对80kDa的蛋白质所预测的并且表明该分子体内保持完整(图13A和13B)。表2还显示了结果。
表2
表3
实施例5-IAB22M IGG2微抗体的体外数据
通过质谱实施IAB22M-γ2EH1变体(图14B)的完整分子量分析(图14A)。具有γ2EH1铰链的IAB22M具有潜在不成对的第一铰链半胱氨酸，其导致产生了～9.2％的半分子(图20B)。对于IAB22Mγ2EH1的完整分子量分析，通过反相色谱柱(TSKgel Phenyl-5PW(Tosoh,2×75mm))在60℃分离样品并通过Agilent ESI-QTOF质谱仪分析。图14A在顶部部分中显示了分离的半分子和全长分子的总离子色谱图。通过峰值积分，使用UV280迹线(未显示)定量微抗体变体中存在的半分子的百分比。将去卷积分子量用于分配并确认半分子的特性(identity)(中间部分)以及完整尺寸的分子量(下部部分)。
然而，IgG2铰链中第一半胱氨酸突变为丝氨酸的ΙΑΒ22Μ1-γ2EH2变体(图15B)的完整分子量分析(图15A)显示了大于99％的完整的具有γ2EH2的二聚体蛋白(理论MW＝79051.2；所得MW 79052)。对于IAB22M1γ2EH2的完整分子量分析，通过由：配备有与WatersnanoAcquity UPLC连接的Trizaic nanoESI源的Waters Synapt G2 HDMS组成的LC/MS分析蛋白质样品。以0.1％甲酸的水溶液和0.1％甲酸的乙腈溶液作为流动相，使用以3μl/min操作的反相C4 nanotile柱(150μmID×50mm，Waters)分离蛋白质。图15A上部部分显示了全范围扫描，其显示了完整尺寸的微抗体的单一主要分子量。图15A的中间部分显示了二聚体，例如，完整尺寸的蛋白质的放大区域。图15A的下部部分显示了半分子的放大区域。检测到了半分子，但是其相对丰度比完整尺寸的蛋白质小几乎3个数量级。
实施例6-IAB22M IGG2 MBS的体内数据
通过89Zr-Df-IAB22M变体的PET/CT实施具有huIgG1和huIgG2来源的铰链序列的IAB22M Mb的比较。图16A中显示了施用89Zr-Df-IAB22M-γ1-EH1(图16B)、-γ2NH1(图16C)和-γ2EH2(图15B)变体后，在左肩具有CD8阳性HPB-ALL异种移植的NOD-SCID小鼠的MIPPET/CT图像。γ2铰链变体导致了较低的肾脏吸收。
通过huIgG1铰链(γ1EH1)制备的IAB22M Mb(图16B)通过肾脏快速清除，从而导致了低肿瘤靶向。通过huIgG2铰链变体(延伸铰链(γ2EH2)(图15B)或者天然铰链(γ2NH1)(图16C))制备的IAB22M Mb显示出具有高肿瘤靶向的较大的体内稳定性和较低的肾清除(图16A)
对89Zr-Df-IAB22M-γl EH1实施了HPB-ALL肿瘤的PET/CT(图16B)。图17中显示了在4、24和41小时，1只具有抗原-阳性HPB-ALL肿瘤的小鼠的连续冠状图像。在24和41小时，在肿瘤中清楚地观察到了放射性吸收。在抗原阴性Daudi肿瘤中同样观察到了一些背景活性。腹部存在高背景活性，从而表明了不期望的通过肾脏的清除。
在HPB-ALL肿瘤中，对89Zr-Df-IAb22M-γ1EH1(图16B)实施了生物分布分析(图18)。HPB-ALL中的肿瘤吸收比Daudi(Daudi肿瘤不表达靶标抗原)高～6-倍。HPB-ALL肿瘤和血液之间的生物分布比值为13.5，Daudi肿瘤和血液之间的生物分布比值为3.5。肾脏信号高于肝脏信号，表明通过肾脏的清除更高(图18)并且构建体在体内不太稳定。
从初始构建体学习经验用于工程优化的微抗体
以上结果显示重要的是突变第一铰链半胱氨酸以防止半胱氨酸误配对。然而，在铰链区中大于2个半胱氨酸残基是有益的以维持蛋白质的结构完整性。使用IgG2铰链提供了提高体内稳定性的解决方案。Mb构建体中末端赖氨酸(K)的突变不影响蛋白质表达，但是的确产生了具有更均一电荷的蛋白质。
基于IgG3和IgG1铰链序列的修饰评价了其它Mb变体，其中将第一铰链半胱氨酸突变并且所述铰链区中存在至少3个半胱氨酸残基。表3显示了铰链变体列表。铰链序列中第一天然半胱氨酸可以突变为丝氨酸或丙氨酸或者任何其它氨基酸。所述下部铰链序列可以是延伸序列(8-25个氨基酸)或来自γ1、γ2、γ3或γ4的天然下部铰链。任何构建体的CH3域可以来自γ1、γ2或γ3或γ4及其任何天然存在的等位基因。图19中显示了一些铰链变体的图示。评价了IAB2M、IAB22M、IAB20M和IAB1M构建体以证明发现的普遍性。
实施例7-IAB2M、IAB22M、IAB20M和IAB1M的铰链变体的体外数据
对IAB2M(图20A)铰链变体实施完整分子量分析(图5B、5C、7C、5E、5D)。还对IAB22M(图20B)铰链变体(图14B、15B、20C、20D、20E、20F、20G)实施完整分子量分析。以0.1％甲酸的水溶液和0.1％甲酸的乙腈溶液作为缓冲液，使用配备有连接至Waters nanoAcquityUPLC Waters C4 nanotile柱(150μm ID×50mm长)的Trizaic nanoESI源的Waters SynaptG2 HDMS，以3μl/min运行，通过LC/MS分析具有工程设计的铰链(EH)的表达微抗体的完整分子量和半分子的量(图20A和20B)。对于一些分子，通过反相色谱柱(TSKgel Phenyl-5PW(Tosoh,2×75mm)分离样品，并通过Agilent ESI-QTOF质谱仪分析。
实施了IAB2M铰链Mb变体(图5C、7C、21B、21C、21D、21E)和IAB22M铰链Mb变体(图16B、15B、20C、20D、20E、20F、20G)的SDS-PAGE分析。图21A和22A显示了所得数据。
实施质谱分析以获得支持图21A和22A的SDS-PAGE分析数据的数据。使用质谱评价2个IAB22M构建体以确认准确的分子量、半分子的量和翻译后修饰，例如，C末端赖氨酸剪切。所述蛋白构建体包括具有来源于IgG1序列的工程设计的铰链EH2、EH3(γ1EH2(22B)和γ1EH3(图20C))的微抗体。具有EH2铰链的γ1微抗体适当组装成完整二聚体分子，但是仅包含2个半胱氨酸，获得了具有较大量半分子的蛋白质。具有EH3铰链的γ1微抗体适当组装成完整二聚体分子并且第三个半胱氨酸的添加获得了具有极低半分子水平的蛋白质。
图23显示了通过ΙΑΒ22Μ-γ1EH1(图16B)质谱的完整分子量分析。所获得的分子量表明了C末端剪切。在本发明的3种物质(MW 79318.9、79450.1和79575.1)中，仅有1个符合79576的预测MW。所得分子量表明了C末端剪切。在本发明的3种物质中(MW 79318.9、79450.1和79575.1)，仅有1个符合79576的预测MW。其余是具有任一个或两个C末端赖氨酸剪切的微抗体。在铰链中仅有2个二硫键所构建的Mb产生了高水平的半分子(～15％)。对于IAB22Mγ1EH1的完整分子量分析，通过反相色谱柱(TSKgel Phenyl-5PW(Tosoh,2×75mm)分离样品，并使用Agilent ESI-QTOF质谱仪分析。图23显示了分离的半分子和全长分子的总离子色谱图(顶部部分)。通过峰值积分，使用UV280迹线(未显示)定量微抗体变体中存在的半分子的百分比。将去卷积分子量用于分配并确认半分子的特性(identity)(中间部分)以及完整尺寸的分子量(下部部分)。
图24显示了通过ΙΑΒ22Μ-γ1EH3变体(图20C)质谱的完整分子量分析。理论MW为79946，其匹配所得的79946的MW。在铰链中通过3个二硫键构建的修饰的IgG1铰链获得了具有大于99％的完整尺寸蛋白的微抗体。对于完整分子量分析，通过由配备有TrizaicnanoESI源(连接至Waters nanoAcquity UPLC)的Waters Synapt G2 HDMS组成的LC/MS分析乙酸盐缓冲液中的蛋白样品。以0.1％甲酸的水溶液和0.1％甲酸的乙腈溶液作为流动相，使用反相C4 nanotile柱(150μm ID×50mm，Waters)，以3μl/min运行，分离蛋白质。图24(顶部部分)显示了全分子量范围扫描。中间部分显示了放大区域，其显示了完整分子量。底部部分显示了放大区域，其显示了半分子。
表9显示了列表，其总结了5个IAB2M铰链变体(顶部；图5B-5E、7C)和7个IAB22M铰链变体(底部；图14B、15B、20C、20D；20E、43、44)的理论预测分子量(MW)和通过完整分子量分析所得的MW质量以及各自的半分子含量。除了其中C末端赖氨酸残基剪切导致MW不均一外，蛋白质的实际分子量与它们的理论计算分子量相匹配(图6、14A、15A、23和24)。
表9通过IAB2M和IAB22M的完整分子量分析所得的半分子含量(＊C-末端赖氨酸剪切导致不均一性)
对IAB2M铰链变体(图5E、7C、7D、21B、21C、21D、21E)实施FAC分析。所有微抗体铰链变体均以类似的亲合力结合至C4-2 XCL细胞上表达的靶标抗原(图26)。
对IAB22M铰链变体(图15B、20C、20D、20E、20F和20G)实施FAC分析。通过相同的scFv和CH3域但不同的铰链所制备的微抗体均以类似的亲合力结合至HPB-ALL细胞上的细胞表面CD8(图27)。
对IAB20M铰链Mb变体(图28B-28E)实施SDS-PAGE分析(图28A)，其进一步确认本文所提及的铰链区的方面可以应用于广泛的靶标分子(例如，它对抗不同靶标分子的多种微抗体起作用)。图54-59中显示了IAB20M变体的其它实施方式。
对IAB1M铰链Mb变体(图29B-29D)实施SDS-PAGE分析(图29A)，其进一步确认本文所提及的铰链区的方面可以应用于广泛的靶标分子(例如，它对抗不同靶标分子的多种微抗体起作用)。图60-65A、65B和65C中显示了IAB1M变体的其它实施方式。
实施例8-IAB22M铰链变体的体内数据
在NOD-SCID小鼠中实施89Zr放射性标记的具有不同铰链序列的IAB22 Mb(图15B、20C、20D、20F、20G)的PET/CT分析。图30显示了在施用89Zr-标记的Df-IAB22M铰链变体后24h，在左肩具有CD8阳性HPB-ALL异种移植的NOD-SCID小鼠的MIP PET/CT图像。所有新的铰链变体导致了较低的肾脏吸收。对所有铰链变体获得了在17-28％ID/g范围内的优良的肿瘤靶向。总的来说，肝脏信号类似于肾脏信号。
对图30的89Zr放射性标记的具有不同铰链变体的IAB22 Mb实施了生物分布分析(图31)。对于IAB22M铰链变体观察到了类似的生物分布。与γ1EH1相比，检测到了优良的肿瘤靶向和吸收。基于本文对于仍保持为二聚体的Mb所提供的数据，如所预测的，观察到了通过肝脏的高清除。
实施例9
来自表0.2的PSCA微抗体通过微抗体上的半胱氨酸残基与相关螯合剂结合，并随后用In-111(或者替代地，锆-89或铜-64)的同位素放射性标记。作为另外一种选择，可以通过酪氨酸残基直接用碘放射性标记来放射性标记所述微抗体。
将所述微抗体静脉内输注至健康人受试者。输注后，将所述微抗体在人受试者中培育10分钟。在培育当天，通过PET扫描或外部闪烁系统检测微抗体的定位。
微抗体的定位用于确定受试者中PSCA水平升高的定位。
实施例10
来自表0.2的PSMA微抗体通过微抗体上的半胱氨酸残基与相关螯合剂结合，并随后用In-111(或者替代地，锆-89或铜-64)的同位素放射性标记。作为另外一种选择，可以通过酪氨酸残基直接用碘放射性标记来放射性标记所述微抗体。
将所述微抗体静脉内输注至健康人受试者。输注后，将所述微抗体在人受试者中培育10分钟。在培育当天，通过PET扫描或外部闪烁系统检测微抗体的定位。
微抗体的定位用于确定受试者中PSMA水平升高的定位。
实施例11
一旦通过来自表0.2的PSMA微抗体对PSMA阳性肿瘤成功成像，则可以根据本发明公开的实施方式研究所述微抗体的生物分布。这些生物分布研究可以考察在注射后，所述微抗体相对于其它所选组织随时间在肿瘤位点的定位。这些研究可以用于显示高肿瘤与背景的比值。当对过表达PSMA的肿瘤，如前列腺癌成像时，微抗体的使用将可能产生高肿瘤与背景的比值。来自这些成像和生物分布实验的阳性结果可以引起临床研究准备中的毒理学实验。
此外，可以通过癌症患者中的临床试验证明通过PET成像研究微抗体在体内靶向人PSMA的能力。简要地，可以将放射性标记的微抗体静脉内注射至患有已知过表达PSMA的癌症形式的癌症患者。在注射后的具体时间点，可以通过PET顺序扫描每位患者。在最终扫描后，可以通过CT扫描患者以用于解剖学参考。然后，可以分析每位患者的PET和CT图像以评价肿瘤靶向和特异性。
实施例12
来自表0.2的5T4微抗体通过微抗体上的半胱氨酸残基与相关螯合剂结合，并随后用In-111(或者替代地，锆-89或铜-64)的同位素放射性标记。作为另外一种选择，可以通过酪氨酸残基直接用碘放射性标记来放射性标记所述微抗体。
将所述微抗体静脉内输注至健康人受试者。输注后，将所述微抗体在人受试者中培育10分钟。在培育当天，通过PET扫描或外部闪烁系统检测微抗体的定位。
微抗体的定位用于确定受试者中5T4水平升高的定位。
实施例13
提供了表0.2的5T4微抗体。在受试者中以足以结合至足够水平的5T4的量将所述微抗体静脉内输注至患有结肠直肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌和/或前列腺癌的受试者以提供在所述受试者中结肠直肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌和/或前列腺癌症状的减轻。
实施例14
来自表0.2的CD8微抗体通过微抗体上的半胱氨酸残基与相关螯合剂结合，并随后用In-111(或者替代地，锆-89或铜-64)的同位素放射性标记。作为另外一种选择，可以通过酪氨酸残基直接用碘放射性标记来放射性标记所述微抗体。
将所述微抗体静脉内输注至健康人受试者。输注后，将所述微抗体在人受试者中培育10分钟。在培育当天，通过PET扫描或外部闪烁系统检测微抗体的定位。
微抗体的定位用于确定受试者中CD8的定位。
实施例15
提供了表0.2的CD8微抗体。将所述微抗体静脉内输注至健康人受试者。
输注后，将所述微抗体在人受试者中培育1小时。提供了第二抗体，它是特异性结合至CD8微抗体并结合至33P的人源化微抗体。在培育当天，将所述第二抗体输注至受试者。将所述第二抗体培育1小时。通过所述第二抗体上的标志物，通过PET成像检测所述微抗体的定位。
微抗体的定位用于确定受试者中CD8的定位。
实施例16
提供了表0.2的CD8微抗体。在受试者中以足以结合至足够水平的CD8的量将所述微抗体静脉内输注至患有CD8相关病症的受试者以提供所述CD8相关病症症状的减轻。所述微抗体结合至钇-90。
实施例17
提供了表0.2的CD8微抗体。将所述微抗体注射至已用传染性疾病的抗原或者用肿瘤相关抗原接种疫苗的患者。针对CD8的片段增强了免疫应答并且提高了CD8表达T细胞的溶胞活性。
实施例18
提供了表0.2的CD8微抗体。在受试者中以足以结合至足够水平的CD8的量将所述微抗体静脉内输注至患有CD8相关病症的受试者以提供所述CD8相关病症症状的减轻。将所述微抗体结合至Lu-177。所述CD8微抗体结合至表达CD8的细胞并且Lu-177导致所述细胞被杀死。
结果表明所述构建体仍结合至细胞人CD8。
实施例19
来自表0.2的CD3微抗体通过微抗体上的半胱氨酸残基与相关螯合剂结合，并随后用In-111(或者替代地，锆-89或铜-64)的同位素放射性标记。作为另外一种选择，可以通过酪氨酸残基直接用碘放射性标记来放射性标记所述微抗体。
将所述微抗体静脉内输注至健康人受试者。输注后，将所述微抗体在人受试者中培育10分钟。在培育当天，通过PET扫描或外部闪烁系统检测微抗体的定位。
微抗体的定位用于确定受试者中CD3水平升高的定位。
实施例20
提供了来自表0.2的CD3微抗体。在受试者中以足以结合至足够水平的CD3的量将所述微抗体静脉内输注至患有类风湿性关节炎的受试者以提供所述受试者中类风湿性关节炎症状的减轻。
实施例21
鉴别了由于OKT3的施用具有出现不可接受地强烈细胞因子风暴的风险的受试者。由于受试者患有CD3依赖性病症，因此所述受试者在其系统中具有降低CD3蛋白水平的需要。选择本文所提供的抗CD3微抗体中的一种，并将其以对于与CD3发生足够结合有效但不发生细胞因子风暴的水平施用于受试者。
实施例22
提供了表0.2的人源化CD3微抗体。将所述微抗体静脉内输注至健康人受试者。输注后，将所述微抗体在人受试者中培育1小时。提供了第二抗体，它是特异性结合至CD3微抗体并结合至33P的人源化微抗体。培育1小时后立即将所述第二抗体输注至受试者。将所述第二抗体培育1小时。在所述第二抗体培育1小时后立即通过PET成像检测所述微抗体的定位。
微抗体的定位用于确定受试者中CD3的定位。
实施例23
鉴别了由于OKT3的施用具有出现不可接受地强烈细胞因子风暴的风险的受试者。由于受试者患有CD3依赖性病症，因此所述受试者在其系统中具有降低CD3蛋白水平的需要。选择来自本文实施例的一种微抗体或多种微抗体中的一种，并将其以对于与CD3发生足够结合有效但不发生细胞因子风暴的水平施用于受试者。
如果需要，可以将所述一种或多种微抗体结合至治疗剂以用于CD3依赖性病症的治疗。
所述受试者可以患有任何一些具体的CD3依赖性病症，其作为替代分别可以是类风湿性关节炎、多发性硬化、1型糖尿病或红斑狼疮。
实施例24
提供了表0.2的PSCA微抗体。在受试者中以足以结合至足够水平的PSCA的量将所述微抗体静脉内输注至患有PSCA相关病症的受试者以提供所述PSCA相关病症症状的减轻。所述微抗体结合至钇-90。
实施例25
提供了表0.2的PSMA微抗体。在受试者中以足以结合至足够水平的PSMA的量将所述微抗体静脉内输注至患有PSMA相关病症的受试者以提供所述PSMA相关病症症状的减轻。所述微抗体结合至钇-90。
在本发明申请中，除非另外具体说明或者除非如本领域技术人员根据本发明公开将理解的，单数是唯一的功能实施方式，否则单数的使用可以包括复数。因此，例如，“一个”可以表示多于一个，并且“一个实施方式”可以表示该描述适用于多个实施方式。
本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等以及它们其中所引用的参考文献以它们尚未的程度，以其全部内容作为参考并入本文。如果所引入的文献和类似材料中的一个或多个不同于或相悖于本发明申请，包括(但不限于)定义的术语、术语用法、所述技术等，则以本发明申请为准。
以上描述和实施例详细描述了某些实施方式。然而，将理解无论在本文中可能出现的以上描述有多详细，可以以多种方式实践本发明并且本发明应根据所附权利要求及其任何等价形式解释。

Claims (10)

1.一种氨基酸铰链区，其包含SEQ ID NO：1(Xn1CXn2Xn3CXn4Xn5C)的序列，其中Xn1可以是不天然形成共价交联键的任何氨基酸，其中Xn2是以下中的一个：A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V，其中Xn3可以是任何氨基酸，其中Xn4可以是任何氨基酸，并且其中Xn5可以是任何氨基酸。
2.根据权利要求1所述的氨基酸铰链区，其中Xn1不与另一种氨基酸形成共价交联键(SEQ ID NO：191)。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的氨基酸铰链区，其中Xn1不是半胱氨酸(SEQ ID NO：192)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的氨基酸铰链区，其中Xn1是以下中的一个：A、R、N、D、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V(SEQ ID NO：193)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的氨基酸铰链区，其中Xn2是P、V或E(SEQ ID NO：194)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的氨基酸铰链区，其中Xn2是P或V(SEQ ID NO：195)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的氨基酸铰链区，其中Xn4是P、V或E(SEQ ID NO：196)。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的氨基酸铰链区，其中Xn4是P或V(SEQ ID NO：197)。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的氨基酸铰链区，其中Xn3是P或E(SEQ ID NO：198)。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的氨基酸铰链区，其中Xn5是P或E(SEQ ID NO：199)。
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US (2) US11254744B2 (zh)
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RU (1) RU2765242C2 (zh)
SG (1) SG10201913625XA (zh)
WO (1) WO2017027325A1 (zh)
ZA (1) ZA201801391B (zh)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2915412A1 (en) * 2012-06-14 2013-12-19 Therapix Biosciences Ltd. Humanized antibodies to cluster of differentiation 3 (cd3)
CN112175911B (zh) 2014-05-15 2023-10-13 新加坡国立大学 经修饰的自然杀伤细胞及其用途
MX2018001566A (es) 2015-08-07 2019-04-25 Imaginab Inc Construcciones de union a antigeno para moleculas diana.
EP3747462A1 (en) * 2015-10-06 2020-12-09 City of Hope Chimeric antigen receptors targeted to psca
WO2017165683A1 (en) * 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
EP3510047A1 (en) 2016-09-07 2019-07-17 Yissum Research and Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Anti-nkp46 antibodies and therapeutic use of same
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
US11896616B2 (en) 2017-03-27 2024-02-13 National University Of Singapore Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells
CA3056439A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 National University Of Singapore Truncated nkg2d chimeric receptors and uses thereof in natural killer cell immunotherapy
AU2018243114C1 (en) * 2017-03-29 2022-05-05 Cytoarm Co., Ltd. Antigen-specific T cells and uses thereof
CN114989305A (zh) * 2017-03-31 2022-09-02 北京智仁美博生物科技有限公司 新型双特异性抗体及其用途
US20210054409A1 (en) * 2018-02-09 2021-02-25 National University Of Singapore Adhesion Receptor Constructs and Uses Thereof in Natural Killer Cell Immunotherapy
CN109161532A (zh) * 2018-05-31 2019-01-08 华东师范大学 同时靶向psma和pd-l1的工程化免疫细胞
CN112533633A (zh) 2018-06-08 2021-03-19 伊麦吉纳博公司 Cd4的抗原结合构建体
WO2021000018A1 (en) * 2019-07-02 2021-01-07 Telix International Pty Ltd Antibodies for binding psma with reduced affinity for the neonatal fc receptor
US20230211024A1 (en) * 2019-12-05 2023-07-06 Imaginab, Inc. Methods of imaging using multiple imaging agents
WO2023287861A2 (en) * 2021-07-13 2023-01-19 Generation Bio Co. Single chain variable fragment (scfv) modified lipid nanoparticle compositions and uses thereof
WO2023043955A1 (en) * 2021-09-16 2023-03-23 Gt Biopharma, Inc. B7-h3 targeting fusion proteins and methods of use thereof
CN115724978A (zh) * 2022-08-17 2023-03-03 北京美康基免生物科技有限公司 一种抗psma单链抗体及与其相关的嵌合抗原受体和应用

Family Cites Families (382)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4281061A (en) 1979-07-27 1981-07-28 Syva Company Double antibody for enhanced sensitivity in immunoassay
US4709015A (en) 1979-12-04 1987-11-24 Ortho Pharmaceutical Corporation Monoclonal antibody to human suppressor T cells
US5292668A (en) 1981-12-21 1994-03-08 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JP2501190B2 (ja) 1985-12-18 1996-05-29 株式会社日立製作所 内燃機関用の吸入空気流量制御装置
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
FR2604092B1 (fr) 1986-09-19 1990-04-13 Immunotech Sa Immunoreactifs destines a cibler les cellules animales pour leur visualisation ou leur destruction in vivo
CA1335879C (en) 1987-07-27 1995-06-13 Bruce Andrew Cornell Receptor membranes
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US4943525A (en) 1987-11-02 1990-07-24 Bioventures, Inc. Simultaneous immunoassay for the determination of antigens and antibodies
US5869053A (en) 1988-03-04 1999-02-09 Cancer Research Campaign Technology, Ltd. 5T4 antigen from human trophoblasts
US4892824A (en) 1988-03-15 1990-01-09 Synbiotics Corporation Fast track method for producing monoclonal bi-specific immunoglobulins
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US5851527A (en) 1988-04-18 1998-12-22 Immunomedics, Inc. Method for antibody targeting of therapeutic agents
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5980896A (en) 1989-06-30 1999-11-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies reactive with human carcinomas
US5332567A (en) 1989-08-24 1994-07-26 Immunomedics Detection and treatment of infections with immunoconjugates
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
US6197298B1 (en) 1991-04-19 2001-03-06 Tanox, Inc. Modified binding molecules specific for T lymphocytes and their use as in vivo immune modulators in animals
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
DE4134982A1 (de) 1991-10-23 1993-04-29 Kernforschungsz Karlsruhe Verwendung von antikoerper enthaltenden praeparationen zur immunsuppression
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
DE4140142A1 (de) 1991-12-05 1993-06-09 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim, De Multivalentes dextranreagenz zum einsatz in praezipitationstests
JPH08503121A (ja) 1991-12-10 1996-04-09 デイナ・フアーバー・キヤンサー・インステイテユート 中和反応性ヒト抗−ｇｐ１２０組換え抗体、それをコードするｄｎａおよびその使用
CA2507749C (en) 1991-12-13 2010-08-24 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US6096289A (en) 1992-05-06 2000-08-01 Immunomedics, Inc. Intraoperative, intravascular, and endoscopic tumor and lesion detection, biopsy and therapy
ZA936260B (en) 1992-09-09 1994-03-18 Smithkline Beecham Corp Novel antibodies for conferring passive immunity against infection by a pathogen in man
US20080152586A1 (en) 1992-09-25 2008-06-26 Avipep Pty Limited High avidity polyvalent and polyspecific reagents
JPH08504320A (ja) 1992-09-25 1996-05-14 コモンウエルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガニゼーション 標的結合性ポリペプチド
WO1994008038A1 (en) 1992-10-02 1994-04-14 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
DE69232604T2 (de) * 1992-11-04 2002-11-07 City Of Hope Duarte Antikörperkonstrukte
US7105159B1 (en) 1992-11-05 2006-09-12 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Antibodies to prostate-specific membrane antigen
US7070782B1 (en) 1992-11-05 2006-07-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen
US6953668B1 (en) 1992-11-05 2005-10-11 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen
ATE342356T1 (de) 1992-11-05 2006-11-15 Sloan Kettering Inst Cancer Prostata-spezifisches membranantigen
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US5376249A (en) 1992-11-25 1994-12-27 Perseptive Biosystems, Inc. Analysis utilizing isoelectric focusing
GB9225453D0 (en) 1992-12-04 1993-01-27 Medical Res Council Binding proteins
DK0672142T3 (da) 1992-12-04 2001-06-18 Medical Res Council Multivalente og multispecifikke bindingsproteiner samt fremstilling og anvendelse af disse
DE69327229T2 (de) 1992-12-11 2000-03-30 Dow Chemical Co Multivalente einkettige Antikörper
US5861156A (en) 1993-01-08 1999-01-19 Creative Biomolecules Methods of delivering agents to target cells
US5705614A (en) 1993-04-09 1998-01-06 Chiron Corporation Methods of producing antigen forks
US6491916B1 (en) 1994-06-01 2002-12-10 Tolerance Therapeutics, Inc. Methods and materials for modulation of the immunosuppresive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US20030108548A1 (en) 1993-06-01 2003-06-12 Bluestone Jeffrey A. Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US5912122A (en) 1993-06-04 1999-06-15 Sibia Neurosciences, Inc. Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6
US6001581A (en) 1993-06-04 1999-12-14 Sibia Neurosciences, Inc. Cation-based bioassay using human metabotropic glutamate receptors
US5521297A (en) 1993-06-04 1996-05-28 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors
KR100398819B1 (ko) 1993-09-02 2004-02-05 트러스티스 오브 다트마우스 칼리지 gp39길항제를포함하는약제조성물
US5869049A (en) 1993-09-02 1999-02-09 Trustees Of Dartmouth College Methods of inducing T cell unresponsiveness to bone marrow with gp39 antagonists
HUT74247A (en) 1993-09-20 1996-11-28 Ciba Geigy Ag Human metabotropic glutamate receptor subtypes (hmr4, hmr6, hmr7) and related dna compounds
US5935818A (en) 1995-02-24 1999-08-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecule encoding alternatively spliced prostate-specific membrane antigen and uses thereof
US6569432B1 (en) 1995-02-24 2003-05-27 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen and uses thereof
GB9324807D0 (en) 1993-12-03 1994-01-19 Cancer Res Campaign Tech Tumour antibody
US7435802B2 (en) 1994-01-25 2008-10-14 Elan Pharaceuticals, Inc. Humanized anti-VLA4 immunoglobulins
WO1995022609A2 (en) 1994-02-21 1995-08-24 The Wellcome Foundation Limited Human glutamate receptor proteins
DE4421391C1 (de) 1994-06-18 1995-11-30 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verwendung von Antikörpern gegen T-Zellen zur verlängerten Immunsuppression
US5559099A (en) 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US5688690A (en) 1994-09-16 1997-11-18 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Human cytotoxic lymphocyte signal transduction surface protein (P38) and monoclonal antibodies thereto
ATE317435T1 (de) 1995-02-24 2006-02-15 Sloan Kettering Inst Cancer Prostataspezifisches membranes antigen und seine anwendungen
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
GB9504344D0 (en) 1995-03-03 1995-04-19 Unilever Plc Antibody fragment production
US5747035A (en) 1995-04-14 1998-05-05 Genentech, Inc. Polypeptides with increased half-life for use in treating disorders involving the LFA-1 receptor
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
AUPO591797A0 (en) 1997-03-27 1997-04-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High avidity polyvalent and polyspecific reagents
US5773292A (en) 1995-06-05 1998-06-30 Cornell University Antibodies binding portions, and probes recognizing an antigen of prostate epithelial cells but not antigens circulating in the blood
US5830478A (en) 1995-06-07 1998-11-03 Boston Biomedical Research Institute Method for delivering functional domains of diphtheria toxin to a cellular target
EP2258726A1 (en) 1995-06-14 2010-12-08 The Regents of the University of California High affinity human antibodies to c-erbB-2
WO1997014719A1 (en) 1995-10-16 1997-04-24 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
AU7394296A (en) 1995-10-19 1997-05-07 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibody br110 and uses thereof
US6084084A (en) 1996-02-21 2000-07-04 Nps Pharmaceuticals, Inc. Human metabotropic glutamate receptor
US20040253246A1 (en) 1996-02-23 2004-12-16 Israeli Ron S. Prostate-specific membrane antigen and uses thereof
US6384205B1 (en) 1996-03-12 2002-05-07 Eli Lilly And Company Metabotropic glutamate receptor 4 nucleic acid
US6150508A (en) 1996-03-25 2000-11-21 Northwest Biotherapeutics, Inc. Monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen
WO1997035616A1 (en) 1996-03-25 1997-10-02 Pacific Northwest Cancer Foundation Monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate specific membrane antigen
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US6107090A (en) 1996-05-06 2000-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains
CA2254108C (en) 1996-05-23 2008-07-22 Unilever Plc Improvements in or relating to specific binding assays
ATE465257T1 (de) 1996-07-03 2010-05-15 Genentech Inc Agonisten für den rezeptor des hepatozyten- wachstumsfaktors und deren anwendungen
US6221609B1 (en) 1996-07-03 2001-04-24 Eli Lilly And Company Isolate nucleic acid encoding human MGLUR8
GB9712818D0 (en) 1996-07-08 1997-08-20 Cambridge Antibody Tech Labelling and selection of specific binding molecules
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
US6083477A (en) 1996-10-17 2000-07-04 Immunomedics, Inc. Non-antigenic toxin-conjugate and fusion protein of internalizing receptor system
US6083763A (en) 1996-12-31 2000-07-04 Genometrix Inc. Multiplexed molecular analysis apparatus and method
US6541212B2 (en) 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
AU6914098A (en) 1997-04-03 1998-10-30 Universite Laval Transgenic expression in genital tract and sexual accessory glands
CN104231078A (zh) 1997-04-07 2014-12-24 基因技术股份有限公司 抗-血管内皮生长因子的抗体
DE19721700C1 (de) 1997-05-23 1998-11-19 Deutsches Krebsforsch Mutierter OKT3-Antikörper
WO1999002567A2 (en) 1997-07-08 1999-01-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for producing homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells
US6977074B2 (en) 1997-07-10 2005-12-20 Mannkind Corporation Method of inducing a CTL response
US6994851B1 (en) 1997-07-10 2006-02-07 Mannkind Corporation Method of inducing a CTL response
JP3992923B2 (ja) 1997-09-03 2007-10-17 イムノメディクス， インコーポレイテッド Ｆ−１８陽電子放出トモグラフィー用のタン白及びペプチドのフッ素化方法
GB9720054D0 (en) 1997-09-19 1997-11-19 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6030792A (en) 1997-11-13 2000-02-29 Pfizer Inc Assays for measurement of protein fragments in biological media
US6709844B1 (en) 2000-11-16 2004-03-23 Mannkind Corporation Avoidance of undesirable replication intermediates in plasmid propagation
DE19911329A1 (de) 1998-03-27 2000-09-21 Benes Ivan Friedrich Humantherapeutisch anwendbares Radioimmunkonjugat und Verfahren zu seiner Herstellung
US7262280B1 (en) 1998-04-03 2007-08-28 Nps Pharmaceuticals, Inc. G-protein fusion receptors and constructs encoding same
HUP9900956A2 (hu) 1998-04-09 2002-04-29 Aventis Pharma Deutschland Gmbh. Egyláncú, több antigéntkötőhely kialakítására képes molekulák, előállításuk és alkalmazásuk
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6200765B1 (en) 1998-05-04 2001-03-13 Pacific Northwest Cancer Foundation Non-invasive methods to detect prostate cancer
US6071490A (en) 1998-05-07 2000-06-06 Immunomedics, Inc. Position emission tomography using gallium-68 chelates
EP1079862B1 (en) 1998-05-20 2010-07-07 Immunomedics, Inc. Therapeutics using a bispecific anti-hla class ii invariant chain x anti-pathogen antibody
WO1999062941A2 (en) 1998-06-01 1999-12-09 Urogenesys, Inc. Serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof
US6833438B1 (en) 1999-06-01 2004-12-21 Agensys, Inc. Serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof
US20060052321A1 (en) 2002-04-05 2006-03-09 Raitano Arthur B Nucleic acid and corresponding protein entitled 98P4B6 useful in treatment and detection of cancer
US20040141975A1 (en) 1998-06-01 2004-07-22 Raitano Arthur B. Nucleic acid and corresponding protein entitled 98P4B6 useful in treatment and detection of cancer
US20030149531A1 (en) 2000-12-06 2003-08-07 Hubert Rene S. Serpentine transmembrane antigens expressed in human cancers and uses thereof
NZ508873A (en) 1998-07-13 2003-10-31 Univ Texas Cancer treatment methods using therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
US6103524A (en) 1998-07-30 2000-08-15 Eli Lilly And Company Metabotropic glutamate receptor protein and nucleic acid
AU5815699A (en) 1998-09-08 2000-03-27 Urocor, Inc. Prostate specific promoter and regulation of gene expression
US6361774B1 (en) 1999-09-17 2002-03-26 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for increasing the target-specific toxicity of a chemotherapy drug
CA2344655A1 (en) 1998-09-29 2000-04-06 The Uab Research Foundation Immunomodulation by genetic modification of dendritic cells and b-cells
WO2000034461A2 (en) 1998-12-10 2000-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of modulating cholesterol metabolism
WO2000062063A1 (en) 1999-04-13 2000-10-19 Northwest Biotherapeutics, Inc. Methods for the diagnosis and treatment of metastatic prostate tumors
EP1185559A2 (en) 1999-04-28 2002-03-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
US20090087878A9 (en) 1999-05-06 2009-04-02 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules associated with plants
WO2001009303A2 (en) 1999-07-30 2001-02-08 Vical Inc. Flt-3 LIGAND-ENCODING POLYNUCLEOTIDE AS A POLYNUCLEOTIDE-BASED VACCINE ENHANCER
NZ523206A (en) 1999-08-31 2004-12-24 Genentech Inc Antibodies that bind to tumor gene sequences
US20040209314A1 (en) 1999-09-06 2004-10-21 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale France Means for detection and purification of CD8+ T lymphocyte populations specific to peptides presented in the context of HLA
US6342587B1 (en) 1999-10-22 2002-01-29 Ludwig Institute For Cancer Research A33 antigen specific immunoglobulin products and uses thereof
US6824780B1 (en) 1999-10-29 2004-11-30 Genentech, Inc. Anti-tumor antibody compositions and methods of use
WO2001068708A2 (en) 2000-03-17 2001-09-20 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Human and humanized fap-alpha-specific antibodies
PL358215A1 (en) 2000-03-24 2004-08-09 Micromet Ag Multifunctional polypeptides comprising a binding site to an epitope of the nkg2d receptor complex
US6608176B2 (en) 2000-03-31 2003-08-19 University Of Miami Taste receptor for umami (monosodium glutamate) taste
US6573096B1 (en) 2000-04-01 2003-06-03 The Research Foundation At State University Of New York Compositions and methods for inhibition of cancer invasion and angiogenesis
WO2001074905A1 (en) 2000-04-03 2001-10-11 Antisoma Research Limited Compounds for targeting
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
US6861234B1 (en) 2000-04-28 2005-03-01 Mannkind Corporation Method of epitope discovery
ATE474931T1 (de) 2000-04-28 2010-08-15 Mannkind Corp Epitop-synchronisierung in antigen präsentierenden zellen
US7834146B2 (en) 2000-05-08 2010-11-16 Monsanto Technology Llc Recombinant polypeptides associated with plants
US8106174B2 (en) 2000-05-08 2012-01-31 Monsanto Technology Llc Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
US6375991B1 (en) 2000-09-08 2002-04-23 Albemarle Corporation Production of concentrated biocidal solutions
DE10045591A1 (de) 2000-09-15 2002-04-04 Klaus Pfizenmaier Ortsspezifische, antikörpervermittelte Aktivierung proapoptotischer Zytokine - AMAIZe (Antibody-Mediated Apoptosis Inducing Zytokine)
JP4619651B2 (ja) 2001-06-01 2011-01-26 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド 前立腺特異的膜抗原に対する修飾抗体およびその使用
US7514078B2 (en) 2001-06-01 2009-04-07 Cornell Research Foundation, Inc. Methods of treating prostate cancer with anti-prostate specific membrane antigen antibodies
US7666414B2 (en) 2001-06-01 2010-02-23 Cornell Research Foundation, Inc. Methods for treating prostate cancer using modified antibodies to prostate-specific membrane antigen
US20030235833A1 (en) 2001-06-18 2003-12-25 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Guanosine triphosphate-binding protein coupled receptors
US20030143668A1 (en) 2001-06-18 2003-07-31 National Institute Of Advanced Industrial Guanosine triphosphate-binding protein coupled receptors
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED CELL CYTOTOXICITY DEPENDENT OF ANTIBODIES
CN1142183C (zh) 2001-08-23 2004-03-17 北京大学人民医院 抗独特型微抗体及其制备方法和应用
AU2002336446B2 (en) 2001-09-06 2008-03-06 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled STEAP-1 useful in treatment and detection of cancer
US7494646B2 (en) 2001-09-06 2009-02-24 Agensys, Inc. Antibodies and molecules derived therefrom that bind to STEAP-1 proteins
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
AU2002305767B2 (en) 2001-09-20 2008-04-10 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and compositions for treating and preventing skin disorders using binding agents specific for PSMA
EP1445314B1 (en) 2001-10-23 2011-09-14 Ajinomoto Co., Inc. Novel glutamic acid receptor and utilization thereof
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
GB0126378D0 (en) 2001-11-02 2002-01-02 Oxford Biomedica Ltd Antigen
CN1313617C (zh) 2001-11-07 2007-05-02 曼康公司 编码靶相关抗原表位的表达载体及其设计方法
US20040018519A1 (en) 2001-11-16 2004-01-29 Wright ,Jr. George L Methods and devices for quantitative detection of prostate specific membrane antigen and other prostatic markers
WO2003062375A2 (en) 2001-12-19 2003-07-31 Genentech, Inc. Stabilizing polypeptides which have been exposed to urea
US6870034B2 (en) 2002-02-05 2005-03-22 Genentech, Inc. Protein purification
JP2006502091A (ja) 2002-03-01 2006-01-19 イミューノメディクス、インコーポレイテッド クリアランス速度を高めるための二重特異性抗体点変異
ATE477276T1 (de) 2002-03-01 2010-08-15 Immunomedics Inc Internalisierung von anti cd74 monoklonalen antikörpern und deren verwendungen
WO2003089575A2 (en) 2002-04-15 2003-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to tl5
WO2003089930A1 (en) 2002-04-22 2003-10-30 Georgetown University Peripheral-type benzodiazepine receptor expression level as an index of organ damage and regeneration
CA2478925C (en) 2002-04-26 2016-06-07 Robert Lee Fahrner Non-affinity purification of proteins
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
US7563433B2 (en) 2007-01-11 2009-07-21 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
US7993626B2 (en) 2007-01-11 2011-08-09 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
US7597876B2 (en) 2007-01-11 2009-10-06 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for improved F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
EP1534331B1 (en) 2002-06-21 2014-10-29 Johns Hopkins University School of Medicine Membrane associated tumor endothelium markers
US20080260744A1 (en) 2002-09-09 2008-10-23 Omeros Corporation G protein coupled receptors and uses thereof
US20060134109A1 (en) 2002-09-09 2006-06-22 Nura Inc. G protein coupled receptors and uses thereof
US9809654B2 (en) 2002-09-27 2017-11-07 Vaccinex, Inc. Targeted CD1d molecules
US7820166B2 (en) 2002-10-11 2010-10-26 Micromet Ag Potent T cell modulating molecules
US9701754B1 (en) 2002-10-23 2017-07-11 City Of Hope Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof
US7888479B2 (en) 2002-11-27 2011-02-15 Biogen Idec Ma Inc. Humanized antibodies against monocyte chemotactric proteins
US7534427B2 (en) 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
WO2004065576A2 (en) 2003-01-15 2004-08-05 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of urological disorder using differential expressed polypeptides
NZ603037A (en) 2003-01-22 2014-05-30 Roche Glycart Ag Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
MXPA05008222A (es) 2003-01-31 2005-10-05 Immunomedics Inc Metodos y composiciones para administrar agentes terapeuticos y de diagnostico.
CA2522786A1 (en) 2003-03-19 2004-09-30 Isogenis, Inc. Gene therapy vectors having reduced immunogenicity based on cd8 alpha-chain
WO2004088279A2 (en) 2003-03-28 2004-10-14 Iowa State University Research Foundation, Inc. Allosteric probes and methods
GB0308988D0 (en) 2003-04-17 2003-05-28 Univ Singapore Molecule
NZ578591A (en) 2003-05-30 2011-01-28 Agensys Inc Prostate stem cell antigen (PSCA) variants and subsequences thereof, namely SEQ ID NO: 6554
US7595379B2 (en) 2003-05-30 2009-09-29 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to PSCA proteins
US7541442B2 (en) 2003-05-30 2009-06-02 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to PSCA proteins
WO2004106380A2 (en) 2003-05-31 2004-12-09 Micromet Ag Human-anti-human cd3 binding molecules
WO2004106383A1 (en) 2003-05-31 2004-12-09 Micromet Ag Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody for epcam
EP1658095A4 (en) 2003-06-02 2006-06-14 Alexion Pharma Inc ANTI-CD3 ANTIBODY DESIMMUNISE
NZ544924A (en) 2003-06-27 2009-03-31 Biogen Idec Inc Modified binding molecules comprising connecting peptides
AU2004265253B2 (en) 2003-07-28 2011-09-01 Genentech, Inc. Reducing protein A leaching during protein A affinity chromatography
GB0321805D0 (en) 2003-09-18 2003-10-15 Univ Wales Medicine Human tumour growth patterns
US20060134105A1 (en) * 2004-10-21 2006-06-22 Xencor, Inc. IgG immunoglobulin variants with optimized effector function
US20060150283A1 (en) 2004-02-13 2006-07-06 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US7569389B2 (en) 2004-09-30 2009-08-04 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and polypeptides encoded thereby useful for modifying plant characteristics
US20120159672A1 (en) 2004-02-06 2012-06-21 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US7524813B2 (en) 2003-10-10 2009-04-28 Novo Nordisk Health Care Ag Selectively conjugated peptides and methods of making the same
DK1673398T3 (da) 2003-10-16 2011-04-18 Micromet Ag Multispecifikke, deimmuniserede CD3-bindere
US20050176028A1 (en) 2003-10-16 2005-08-11 Robert Hofmeister Deimmunized binding molecules to CD3
EP2633866A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
ITPD20030264A1 (it) 2003-10-30 2005-04-30 Xeptagen Spa Metodo di diagnosi altamente specifico per neoplasie
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
ES2384940T3 (es) 2004-01-16 2012-07-16 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Inmunoquinasas
US20060235212A1 (en) 2004-12-22 2006-10-19 Nickolai Alexandrov Nucleic acid sequences encoding zinc finger proteins
AU2005212830B2 (en) 2004-02-16 2011-06-02 Amgen Research (Munich) Gmbh Less immunogenic binding molecules
AU2005216251B2 (en) 2004-02-23 2011-03-10 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
EP1610818A4 (en) 2004-03-03 2007-09-19 Millennium Pharm Inc MODIFIED ANTIBODIES AGAINST A PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANE-ANTIGEN AND USE THEREOF
US7273608B2 (en) 2004-03-11 2007-09-25 City Of Hope Humanized anti-CEA T84.66 antibody and uses thereof
US7662936B2 (en) 2004-04-07 2010-02-16 Genentech, Inc. Mass spectrometry of antibody conjugates
ES2443996T3 (es) 2004-04-22 2014-02-21 Agensys, Inc. Anticuerpos y moléculas derivadas de los mismos que se unen a proteínas STEAP-1
DE102004023187A1 (de) 2004-05-11 2005-12-01 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
NZ579482A (en) 2004-06-01 2011-02-25 Genentech Inc Antibody drug conjugates and methods
US20080227736A1 (en) 2004-06-03 2008-09-18 Regents Of The University Of California, Targeting Pseudotyped Retroviral Vectors
US20050281740A1 (en) 2004-06-16 2005-12-22 Glen Gong Imaging damaged lung tissue
US20060159689A1 (en) 2004-06-17 2006-07-20 Chih-Sheng Chiang Combinations of tumor-associated antigens in diagnostics for various types of cancers
WO2006008096A1 (en) 2004-07-16 2006-01-26 Micromet Ag Expression-enhanced polypeptides
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
WO2006049599A1 (en) 2004-10-28 2006-05-11 The General Hospital Corporation Methods of detection and therapy for atheromatous plaques using immune modulation
US20080260650A1 (en) 2004-10-28 2008-10-23 The General Hospital Corporation Methods of Detection and Therapy of Inflamed Tissues Using Immune Modulation
US20070134243A1 (en) 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
US7947839B2 (en) 2004-12-01 2011-05-24 Genentech, Inc. Heterocyclic-substituted bis-1,8 naphthalimide compounds, antibody drug conjugates, and methods of use
US7335760B2 (en) 2004-12-22 2008-02-26 Ceres, Inc. Nucleic acid sequences encoding zinc finger proteins
CA2491067A1 (en) 2004-12-24 2006-06-24 Stichting Katholieke Universiteit Mrna rations in urinary sediments and/or urine as a prognostic marker for prostate cancer
JP2008528668A (ja) 2005-02-03 2008-07-31 アンチトープ リミテッド ヒト抗体及びタンパク質
EP1869084A2 (en) 2005-03-04 2007-12-26 Biogen Idec MA Inc. Methods of humanizing immunoglobulin variable regions through rational modification of complementarity determining residues
CN1854295A (zh) 2005-04-25 2006-11-01 上海新生源医药研究有限公司 卵巢癌抗独特型微抗体的生产方法
JO3058B1 (ar) 2005-04-29 2017-03-15 Applied Molecular Evolution Inc الاجسام المضادة لمضادات -اي ال-6,تركيباتها طرقها واستعمالاتها
GB2426581A (en) 2005-05-27 2006-11-29 Univ Nottingham Immunoassay methods
JP2007014267A (ja) 2005-07-07 2007-01-25 Toyama Univ Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原に対するモノクローナル抗体、それに関連する遺伝子およびペプチド、並びにＢ型肝炎ウイルスの検定方法、Ｂ型肝炎の診断方法、治療方法
SG163615A1 (en) 2005-07-11 2010-08-30 Macrogenics Inc Methods for the treatment of autoimmune disorders using immunosuppressive monoclonal antibodies with reduced toxicity
US20080279850A1 (en) 2005-07-25 2008-11-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. B-Cell Reduction Using CD37-Specific and CD20-Specific Binding Molecules
SI2298815T1 (sl) 2005-07-25 2015-08-31 Emergent Product Development Seattle, Llc Zmanjšanje števila celic b z uporabo molekul, ki se specifično vežejo na cd37 in cd20
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1942944A2 (en) 2005-10-31 2008-07-16 Genentech, Inc. Macrocyclic depsipeptide antibody-drug conjugates and methods
CA2640661A1 (en) 2006-02-01 2007-08-09 Arana Therapeutics Limited Domain antibody construct
US20070212331A1 (en) 2006-03-07 2007-09-13 Baldassare Joseph J Methods and compositions for selectively killing cells
JP2009531324A (ja) 2006-03-20 2009-09-03 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌標的化のための操作された抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体
KR20080110833A (ko) 2006-03-21 2008-12-19 와이어쓰 아밀로이드 형성 질환의 예방 및 치료 방법
WO2007112316A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Morton Donald L Mycobacterial immunotherapy for cancer treatment
ES2776100T3 (es) 2006-03-31 2020-07-29 Massachusetts Inst Technology Sistema para el suministro dirigido de agentes terapéuticos
US7566276B2 (en) 2006-04-14 2009-07-28 Dogleg Right Corporation Multi-piece putter head having an insert
US20110052697A1 (en) 2006-05-17 2011-03-03 Gwangju Institute Of Science & Technology Aptamer-Directed Drug Delivery
CA2660286A1 (en) 2006-08-09 2008-02-21 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
CN101632020B (zh) 2006-09-13 2013-11-27 昂西免疫有限公司 改进的免疫测定方法
EP2076292A2 (en) 2006-10-25 2009-07-08 Koninklijke Philips Electronics N.V. Contrast agents for detecting prostate cancer
WO2008079280A1 (en) 2006-12-21 2008-07-03 Millipore Corporation Purification of proteins
US8362217B2 (en) 2006-12-21 2013-01-29 Emd Millipore Corporation Purification of proteins
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
CA2675202C (en) 2007-01-11 2014-09-16 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for improved f-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
US8709382B2 (en) 2007-01-11 2014-04-29 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for improved F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
US8545809B2 (en) 2007-01-11 2013-10-01 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for improved 18F labeling of proteins, peptides and other molecules
US8202509B2 (en) 2007-01-11 2012-06-19 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for improved F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
US20150086482A1 (en) 2007-01-11 2015-03-26 Immunomedics, Inc. Dye Conjugated Peptides for Fluorescent Imaging
US8889100B2 (en) 2007-01-11 2014-11-18 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for improved F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
US20160045626A1 (en) 2007-01-11 2016-02-18 Immunomedics, Inc. Methods and Compositions for Improved Labeling of Targeting Peptides
US8163279B2 (en) 2007-04-13 2012-04-24 Stemline Therapeutics, Inc. IL3Rα antibody conjugates and uses thereof
CA2682605A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Zymogenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
CA2687117A1 (en) 2007-05-14 2008-11-27 Biogen Idec Ma Inc. Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
BRPI0812248B8 (pt) 2007-06-01 2021-05-25 Gliknik Inc estradômero agrupado
WO2009017823A2 (en) 2007-08-01 2009-02-05 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health Of Human Services, National Institutes Of Health A fold-back diabody diphtheria toxin immunotoxin and methods of use
JP6126773B2 (ja) 2007-09-04 2017-05-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌のターゲッティングおよび検出のための高親和性抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体
RU2526512C2 (ru) 2007-09-26 2014-08-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Модифицированная константная область антитела
EP2767591A1 (en) 2007-10-17 2014-08-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method and composition for crystallizing G protein-coupled receptors
CA2702586C (en) 2007-10-18 2017-08-01 Bn Immunotherapeutics Inc. Use of mva to treat prostate cancer
JP2011501946A (ja) 2007-10-25 2011-01-20 ヴィヴェンティア バイオテクノロジーズ インコーポレーティッド 変異体ＨｎＲＮＰＧの癌関連エピトープに対する抗体およびその使用法
US20100322861A1 (en) 2007-11-27 2010-12-23 Gambhir Sanjiv S Engineered cells, imaging report gene/probe systems, and methods of imaging
US9107858B2 (en) 2007-12-05 2015-08-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Dendritic cell targeting compositions and uses thereof
EP2250201B1 (en) 2008-01-29 2014-04-30 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Membrane transporter napi2b (slc34a2) epitope for antibody therapy, antibodies directed thereto, and target for cancer therapy
ES2547552T3 (es) 2008-02-01 2015-10-07 Genentech, Inc. Metabolito de nemorrubicina y reactivos análogos, conjugados anticuerpo-fármaco y métodos
US8043830B2 (en) 2008-02-01 2011-10-25 The Regents Of The University Of California Biotin-ligase system for secretion of biotinylated protein
ITTO20080313A1 (it) 2008-04-22 2009-10-23 Marco Colombatti Anticorpo monoclonale isolato o suo frammento legante l'antigene specifico di membrana della prostata, suoi coniugati e suoi usi
TW200947474A (en) 2008-05-05 2009-11-16 Ren-Huan Pan Manufacturing equipment and method of quadratic arc alignment dua-turret formation center, and miniature milliohm current sensors manufactured thereof
WO2009140242A1 (en) 2008-05-13 2009-11-19 Genentech, Inc. Analysis of antibody drug conjugates by bead-based affinity capture and mass spectrometry
WO2010003118A1 (en) 2008-07-02 2010-01-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Tgf-b antagonist multi-target binding proteins
EA201170028A1 (ru) 2008-07-02 2011-12-30 Эмерджент Продакт Дивелопмент Сиэтл, Ллс СВЯЗЫВАЮЩИЕ НЕСКОЛЬКО МИШЕНЕЙ БЕЛКИ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ TNF-α
CA2729521A1 (en) 2008-07-02 2010-01-07 Assistance Publique Hopitaux De Paris A method for predicting clinical outcome of patients with non-small cell lung carcinoma
EP2303332B1 (en) 2008-07-15 2014-12-31 Genentech, Inc. Anthracycline conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds
US20100069616A1 (en) 2008-08-06 2010-03-18 The Regents Of The University Of California Engineered antibody-nanoparticle conjugates
JP5309775B2 (ja) 2008-08-07 2013-10-09 セイコーエプソン株式会社 放電灯の駆動装置および駆動方法、光源装置並びに画像表示装置
EP2328615A2 (en) 2008-08-20 2011-06-08 Centocor Ortho Biotech Inc. Engineered anti-il-13 antibodies, compositions, methods and uses
BRPI0918587B1 (pt) 2008-09-08 2020-10-13 Conocophillips Company processo e instalação para liquefazer um fluxo de gás natural
EP2334642B1 (en) 2008-09-16 2014-01-01 The Regents Of The University Of California Simplified one-pot synthesis of [18f]sfb for radiolabeling
WO2010037397A1 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Dako Denmark A/S Mhc multimers in cmv immune monitoring
JP5840494B2 (ja) 2008-10-02 2016-01-06 エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル， エルエルシー Ｃｄ８６アンタゴニストの多標的結合タンパク質
NZ592611A (en) 2008-10-10 2013-01-25 Emergent Product Dev Seattle A single chain fusion protein that binds to tcr complex and does not induce or induces a minimally detectable cytokine release
CN102216779B (zh) 2008-10-13 2013-11-27 泽普塔根股份公司 免疫缀合物的制备方法及其应用
BRPI0919882A8 (pt) 2008-10-30 2017-09-19 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings Métodos para avaliar padrões de rna
CN102301002A (zh) 2008-11-12 2011-12-28 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 使用外来体来确定表现型的方法和系统
EP2358390A1 (en) 2008-11-13 2011-08-24 Emergent Product Development Seattle, LLC Cd37 immunotherapeutic combination therapies and uses thereof
US20100143353A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Mosser David M POLYPEPTIDES COMPRISING Fc FRAGMENTS OF IMMUNOGLOBULIN G (lgG) AND METHODS OF USING THE SAME
CN102256993A (zh) 2008-12-16 2011-11-23 米利波尔公司 蛋白的纯化
WO2010073462A1 (ja) 2008-12-25 2010-07-01 東海ゴム工業株式会社 流体封入式防振装置
CN102482347B (zh) 2009-01-12 2017-04-26 希托马克斯医疗有限责任公司 修饰抗体组合物及其制备和使用方法
CA2749966A1 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
CA2752510C (en) 2009-02-17 2024-01-23 Neil Bander Methods and kits for diagnosis of cancer and prediction of therapeutic value
WO2010102195A2 (en) 2009-03-06 2010-09-10 The Johns Hopkins University Annexin a11 and associated genes as biomarkers for cancer
JP5923035B2 (ja) 2009-03-24 2016-05-24 バイオセプト インコーポレイティッド 細胞の捕捉および解析のデバイスおよび方法
KR20120018762A (ko) 2009-04-08 2012-03-05 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 제어된 혈청 약동학적 특성을 갖는 인간 단백질 스캐폴드
EP2424567B1 (en) 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
US20100303821A1 (en) 2009-05-28 2010-12-02 Glaxo Group Limited Immunoglobulins
JP2012528112A (ja) 2009-05-28 2012-11-12 グラクソ グループ リミテッド 抗原結合タンパク質
EP2448966B1 (en) 2009-07-03 2018-11-14 Avipep Pty Ltd Immuno-conjugates and methods for producing them
WO2011003171A1 (en) 2009-07-08 2011-01-13 Smart Technologies Ulc Three-dimensional widget manipulation on a multi-touch panel
TWM383852U (en) 2009-07-13 2010-07-01 Speedtech Corp An improvement of the universal serial bus connector
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
JPWO2011043061A1 (ja) 2009-10-05 2013-03-04 キヤノン株式会社 光音響イメージング用造影剤、及び、それを用いた光音響イメージング方法
JP2013512664A (ja) 2009-12-02 2013-04-18 ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ 味覚受容体の潜在的モジュレーター化合物をスクリーニングする改善された方法
US8772459B2 (en) 2009-12-02 2014-07-08 Imaginab, Inc. J591 minibodies and Cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (PSMA) and methods for their use
KR101961495B1 (ko) 2009-12-23 2019-03-22 아비펩 피티와이 리미티트 면역-컨쥬게이트 및 그 제조방법 ２
EP2519544A1 (en) 2009-12-29 2012-11-07 Emergent Product Development Seattle, LLC Polypeptide heterodimers and uses thereof
EP2531853B1 (en) * 2010-02-04 2015-06-10 Agency For Science, Technology And Research Use of novel markers of pluripotent stem cells
US20130137975A1 (en) 2010-02-09 2013-05-30 OSI Pharmaceuticals, LLC Pet imaging
EP2542696B1 (en) 2010-03-01 2016-09-28 Caris Life Sciences Switzerland Holdings GmbH Biomarkers for theranostics
UA108227C2 (xx) 2010-03-03 2015-04-10 Антигензв'язуючий білок
US9812638B2 (en) 2010-03-19 2017-11-07 Globalfoundries Inc. Backend of line (BEOL) compatible high current density access device for high density arrays of electronic components
GB201014033D0 (en) 2010-08-20 2010-10-06 Ucb Pharma Sa Biological products
WO2012030735A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Confometrx, Inc. Method and composition for crystallizing a family c gpcr
ES2495430T3 (es) 2010-10-28 2014-09-17 Avicenna Research Institute Una forma de PRELP de 38 KDA como nuevo diagnóstico y objetivo terapéutico
EP2471543A1 (en) 2010-12-02 2012-07-04 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Tolerance induction or immunosupression to prevent in particular Graft-versus-Host-Disease (GvHD) by short-term pre-incubation of transplanted cell suspensions, tissues or organs coated with ligands to cell surface molecules
US20120144110A1 (en) 2010-12-02 2012-06-07 Lsi Corporation Methods and structure for storage migration using storage array managed server agents
EP2476754A1 (en) 2011-01-14 2012-07-18 Bundesrepublik Deutschland, Letztvertreten Durch Den Präsidenten Des Paul-Ehrlich-Instituts Methods for the identification and repair of amino acid residues destabilizing single-chain variable fragments (scFv)
EP2663647A4 (en) 2011-01-14 2015-08-19 Redwood Bioscience Inc POLYPEPTIDE IMMUNOGLOBULINS WITH ALDEHYDIC MARKING AND THEIR USE METHOD
WO2012143524A2 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
CN104114186B (zh) 2011-08-03 2017-05-03 儿童医疗中心有限公司 识别流行性感冒血凝素的受体‑结合袋状结构的广泛中和人类抗体
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
GB201203071D0 (en) 2012-02-22 2012-04-04 Ucb Pharma Sa Biological products
GB201203051D0 (en) 2012-02-22 2012-04-04 Ucb Pharma Sa Biological products
JP2015508903A (ja) 2012-02-28 2015-03-23 コーネル ユニヴァーシティー 前立腺癌におけるアンドロゲン活性のバイオマーカーとしてのｐｓｍａ
US10501513B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
EP3786183A3 (en) 2012-06-15 2021-06-09 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to cd3
PL3495387T3 (pl) 2012-07-13 2022-01-10 Roche Glycart Ag Dwuswoiste przeciwciała anty-VEGF/anty-ANG-2 i ich zastosowanie w leczeniu chorób naczyniowych oka
US20150191543A1 (en) 2012-08-06 2015-07-09 The Regents Of The University Of California Engineered antibody fragments for targeting and imaging cd8 expression in vivo
JP2016510755A (ja) * 2013-03-06 2016-04-11 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 抗Ｃ−ＭＥＴタンデムＦｃ二重特異性抗体
CA2904969A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to cd8
US9168300B2 (en) * 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
EP2970422B1 (en) * 2013-03-15 2018-04-18 F.Hoffmann-La Roche Ag Il-22 polypeptides and il-22 fc fusion proteins and methods of use
RU2019108429A (ru) 2013-04-29 2019-05-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Модифицированные асимметричные антитела, связывающие fc-рецептор, и способы их применения
PL2992012T3 (pl) 2013-04-29 2019-12-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Zmodyfikowane ludzkie przeciwciała wiążące FcRn i sposoby ich zastosowania
RU2730592C2 (ru) 2014-01-15 2020-08-24 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Варианты fc-области с модифицированными способностями связываться с fcrn
CA2931986A1 (en) 2014-01-15 2015-07-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn- and maintained protein a-binding properties
MX2016008782A (es) 2014-01-15 2016-09-08 Hoffmann La Roche Variantes de region fc con union mejorada de la proteina a.
AU2015259533B2 (en) 2014-05-10 2019-11-28 Sorrento Therapeutics, Inc. Chemically-locked bispecific antibodies
EP2966085A1 (en) 2014-07-11 2016-01-13 Boehringer Ingelheim International GmbH Antibody IgG1 with a modified heavy chain constant region
WO2016016299A1 (en) 2014-07-29 2016-02-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
EP3875477A1 (en) 2015-04-17 2021-09-08 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins with tunable affinities
EP3288570A4 (en) 2015-04-29 2018-11-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified stem cells and uses thereof
US20180355318A1 (en) 2015-04-29 2018-12-13 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified hematopoietic stem/progenitor and non-t effector cells, and uses thereof
WO2016179518A2 (en) 2015-05-06 2016-11-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate specific membrane antigen (psma) bispecific binding agents and uses thereof
US20160362473A1 (en) * 2015-06-12 2016-12-15 Ubi Pharma Inc Immunoglobulin fusion proteins and uses thereof
US11820807B2 (en) * 2015-06-12 2023-11-21 Ubi Pharma Inc Immunoglobulin fusion proteins and uses thereof
CA2984630A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Immunomedics, Inc. Improved methods of imaging with ga-68 labeled molecules
MX2018001566A (es) 2015-08-07 2019-04-25 Imaginab Inc Construcciones de union a antigeno para moleculas diana.
WO2017048878A1 (en) 2015-09-14 2017-03-23 Alpine Immune Sciences, Inc. Tunable variant immunoglobulin superfamily domains and engineered cell therapy
EP4218833A1 (en) 2015-10-01 2023-08-02 Whitehead Institute for Biomedical Research Labeling of antibodies
US20190262396A1 (en) 2016-02-15 2019-08-29 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Fõrderung Der Angeewandten Forschung E.V. Prevention of graft rejection by prior use of modified grafts
CN109476721B (zh) 2016-04-04 2022-06-28 英蒂分子公司 Cd8-特异性捕获剂、组合物及使用和制备方法
WO2017180587A2 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
WO2017186928A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Curevac Ag Rna encoding an antibody
EP3452101A2 (en) 2016-05-04 2019-03-13 CureVac AG Rna encoding a therapeutic protein
EP3266465A1 (en) 2016-07-06 2018-01-10 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Immune complexes
WO2018053328A1 (en) 2016-09-16 2018-03-22 Duke University Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
WO2018111973A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Janssen Biotech, Inc. Cd8a-binding fibronectin type iii domains
MA47325A (fr) 2017-01-20 2019-11-27 Juno Therapeutics Gmbh Conjugués de surface cellulaire et compositions cellulaires et méthodes associées
WO2018147960A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
WO2018187215A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific 4-1bb agonist molecules
KR102455340B1 (ko) 2017-05-10 2022-10-18 더 위스타 인스티튜트 오브 아나토미 앤드 바이올로지 최적화된 핵산 항체 작제물
JP2020522266A (ja) * 2017-06-05 2020-07-30 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 非対称なｃｈ２−ｃｈ３領域の変異を有する、操作された多重特異性抗体及び他の多量体タンパク質
CA3067351A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 Nai-Kong Cheung Anti-l1-cam antibodies and uses thereof
WO2019012147A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 Institut Gustave-Roussy RADIOMY-BASED IMAGING TOOL FOR MONITORING INFILTRATION AND TUMOR LYMPHOCYTE AND RESULTS IN CANCER PATIENTS TREATED WITH ANTI-PD-1 / PD-L1 AGENTS
MY197688A (en) 2017-07-24 2023-07-05 Regeneron Pharma Anti-cd8 antibodies and uses thereof
CN111511763A (zh) 2017-08-09 2020-08-07 奥里尼斯生物科学有限公司 Cd8结合剂
AU2018316343A1 (en) 2017-08-11 2020-02-13 Genentech, Inc. Anti-CD8 antibodies and uses thereof
WO2019040740A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 Wayne State University IMMUNO IMAGING IN VIVO OF INTERFERON GAMMA
CN111372590A (zh) 2017-09-23 2020-07-03 纪念斯隆-凯特林癌症中心 A33抗体组合物及在放射免疫疗法中使用其的方法
AU2019222550B2 (en) 2018-02-16 2022-10-27 Kite Pharma, Inc. Modified pluripotent stem cells and methods of making and use
KR20200131846A (ko) 2018-03-14 2020-11-24 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 항-폴리시알산 항체 및 그 용도
CN112533633A (zh) 2018-06-08 2021-03-19 伊麦吉纳博公司 Cd4的抗原结合构建体
WO2020069433A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Imaginab, Inc. Cd8 imaging constructs and methods of use thereof

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Publication number Publication date
BR112018002451A2 (pt) 2018-09-18
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MX2018001566A (es) 2019-04-25
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EP3331564A1 (en) 2018-06-13
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EP3331564A4 (en) 2019-05-22
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JP2022095755A (ja) 2022-06-28
KR20180050321A (ko) 2018-05-14
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WO2017027325A1 (en) 2017-02-16
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